JP2021070634A - Enterovirus vaccine - Google Patents

Abstract

To provide a vaccine for enteroviruses.SOLUTION: In view of the structure of enteroviruses, particularly VP0 cleaving into VP2 and VP4, it is discovered that the cleaving affects immunogenicity, i.e., it is assumed that designing a vaccine including a large amount of VP2 and VP4 as polypeptides which exhibit immunogenicity leads to providing a vaccine which exhibits high immunogenicity. Polypeptides including VP1, VP2, VP3 and VP4 derived from an enterovirus are produced, and it is confirmed that these polypeptides have a high effect as an immunogen against enteroviruses.SELECTED DRAWING: Figure 5

Description

本発明は、エンテロウイルスに対するワクチンに関するものである。 The present invention relates to a vaccine against enterovirus.

エンテロウイルスは、ピコルナウイルス科に属する一本鎖ＲＮＡウイルスであり、人に感染するものとしてエンテロウイルスＡ〜Ｄの群が挙げられる。エンテロウイルスにはポリオウイルス、コクサッキーウイルスＡ群、コクサッキーウイルスＢ群、エコーウイルス及びその他のエンテロウイルスが含まれる。
エンテロウイルスＡ群にはコクサッキーウイルスＡ２〜８、１０、１２、１４、１６及びエンテロウイルス７１（以下、ＥＶ７１）が含まれる。エンテロウイルスＢ群にはコクサッキーウイルスＡ９、コクサッキーウイルスＢ１〜６、エコーウイルス１〜３３及びエンテロウイルス６９が含まれる。エンテロウイルスＣ群にはポリオウイルス、コクサッキーウイルスＡ１、１１、１３、１５、１７〜２２及び２４が含まれる。エンテロウイルスＤ群にはエンテロウイルス６８及び７０が含まれる。
エンテロウイルスが様々な疾患を引き起こすことはよく知られており、かかる疾患の代表的なものとしては手足口病、ヘルパンギーナ、無菌性髄膜炎などが挙げられる。エンテロウイルスの中でもとりわけＥＶ７１及びコクサッキーウイルスＡ群は、手足口病の主要な原因ウイルスとして知られている。また、エンテロウイルスの中でもとりわけコクサッキーウイルスＡ群、ＥＶ７１、コクサッキーウイルスＢ群及びエコーウイルスは、ヘルパンギーナの主要な原因ウイルスとして知られている。無菌性髄膜炎は、エコーウイルス、コクサッキーウイルスＡ群、Ｂ群及びＥＶ７１などのエンテロウイルスのほか、寄生虫など幅広い病原体によって引き起こされる。 Enterovirus is a single-stranded RNA virus belonging to the family Picornavirus, and examples of those that infect humans include enteroviruses A to D. Enteroviruses include poliovirus, coxsackievirus A group, coxsackievirus B group, echovirus and other enteroviruses.
Enterovirus A group includes Coxsackievirus A2-8, 10, 12, 14, 16 and enterovirus 71 (hereinafter, EV71). The enterovirus B group includes coxsackievirus A9, coxsackievirus B1-6, echovirus 1-33, and enterovirus 69. Enterovirus group C includes poliovirus, coxsackievirus A1, 11, 13, 15, 17-22 and 24. Enterovirus D group includes enteroviruses 68 and 70.
It is well known that enteroviruses cause various diseases, and typical such diseases include hand-foot-and-mouth disease, herpangina, and aseptic meningitis. Among enteroviruses, EV71 and Coxsackievirus A group are known as major causative viruses of hand-foot-and-mouth disease. Among the enteroviruses, Coxsackievirus A group, EV71, Coxsackievirus B group and echovirus are known as major causative viruses of herpangina. Aseptic meningitis is caused by a wide range of pathogens such as echoviruses, coxsackievirus groups A, B and EV71, as well as parasites.

コクサッキーウイルスＡ群には例えばＡ１〜２２型及び２４型が含まれており、それぞれ異なる疾患及び症状を引き起こしうる。コクサッキーウイルスＢ群には例えば１〜６型が含まれる。エコーウイルスにはエコー１〜７型、９型、１１〜２７型、２９〜３１型が含まれる。その他のエンテロウイルスにはエンテロウイルス６８〜７１型が含まれる。それぞれの遺伝子型にはさらにサブ遺伝子型が含まれ、例えばＥＶ７１にはプロトタイプ株であるＢｒＣｒのみからなるＡ型、Ｃ１〜Ｃ５型及びＢ１〜Ｂ５型が知られている。 Coxsackievirus A group includes, for example, types A1 to 22 and 24, which can cause different diseases and symptoms, respectively. The Coxsackievirus B group includes, for example, types 1 to 6. Echoviruses include echo types 1-7, 9 type, 11-27 type, and 29-31 type. Other enteroviruses include enterovirus types 68-71. Each genotype further includes a sub-genotype. For example, EV71 is known to have A type, C1 to C5 type, and B1 to B5 type consisting only of the prototype strain BrCr.

手足口病は、一般的には、手、足、口などに水疱性の発疹があらわれる軽症疾患として知られており、小児が夏頃に発症することが多い。手足口病の主な感染経路は、飛沫感染及び糞口感染である。手足口病は東アジアを中心に報告されており、例えば、中国では２０１６年に約２００万人、日本では２０１５年に約５０万人の患者が報告されている。ほとんどの手足口病患者の予後は良好であるが、まれに中枢神経合併症、例えば無菌性髄膜炎、急性脳炎又は肺水腫などが生じて、重症化又は死亡する例もみられる。このような合併症が生じるのは、ＥＶ７１によって引き起こされた手足口病である場合が多い。また、小児だけでなく成人の手足口病も報告されており、成人の場合には重症化することが多い。しかしながら、手足口病に対する治療方法はいまだ確立されておらず、ワクチンによる予防が東アジア各国を中心に検討又は実施されている。日本でも、手足口病の予防に有効なワクチンは、公衆衛生上の問題として厚生科学審議会で開発優先度の高いワクチンの一つとして指定されている。 Hand-foot-and-mouth disease is generally known as a mild disease in which a bullous rash appears on the hands, feet, mouth, etc., and often develops in children in the summer. The main transmission routes for hand-foot-and-mouth disease are droplet infection and fecal-oral infection. Hand-foot-and-mouth disease has been reported mainly in East Asia. For example, in China, about 2 million cases were reported in 2016, and in Japan, about 500,000 cases were reported in 2015. Most patients with hand-foot-and-mouth disease have a good prognosis, but in rare cases, central nervous system complications such as aseptic meningitis, acute encephalitis, or pulmonary edema occur, resulting in severe or death. Such complications often occur in hand-foot-and-mouth disease caused by EV71. In addition, hand-foot-and-mouth disease has been reported not only in children but also in adults, and it often becomes severe in adults. However, a treatment method for hand-foot-and-mouth disease has not yet been established, and vaccine prevention is being investigated or implemented mainly in East Asian countries. In Japan as well, vaccines that are effective in preventing hand-foot-and-mouth disease have been designated as one of the high-priority development vaccines by the Health Science Council as a public health issue.

ヘルパンギーナは、一般的には、発熱と口腔粘膜にあらわれる水疱性の発疹を特徴とした急性のウイルス性咽頭炎として知られており、乳幼児を中心に夏季に流行することが多い。ヘルパンギーナの主な感染経路は、飛沫感染及び糞口感染である。ヘルパンギーナに対する治療方法もいまだ確立されておらず、ワクチンなどによる予防が期待されている。 Herpangina is generally known as acute viral pharyngitis characterized by fever and a bullous rash that appears on the oral mucosa, and is often prevalent in summer, especially in infants. The main transmission routes of Herpangina are droplet infection and fecal-oral infection. A treatment method for herpangina has not yet been established, and prevention with vaccines is expected.

無菌性髄膜炎は、発熱、頭痛、嘔吐のいわゆる３主徴をみとめ、後部硬直、Ｋｅｒｎｉｇ徴候などの髄膜刺激徴候が存在すること、髄液一般検査で定型的な所見を得ること、髄液の塗抹、細菌培養で細菌を検出しないことにより診断がなされる症候群である。エンテロウイルス以外の様々なウイルスなどによっても無菌性髄膜炎が引き起こされることが知られているものの、主たる原因は、エンテロウイルス、特にエコーウイルス及びコクサッキーウイルスである。感染経路や疫学的性質は病原体に依存するが、エンテロウイルスに起因する無菌性髄膜炎の場合には、手足口病などと同様に、夏頃に小児を中心に、飛沫感染及び糞口感染により流行する。無菌性髄膜炎に対する有効な治療方法はいまだ確立されておらず、ワクチンなどによる予防が期待されている。 Aseptic meningitis has the so-called three main signs of fever, headache, and vomiting, the presence of signs of meningism such as posterior stiffness and Kernig's sign, the presence of typical findings on a general cerebrospinal fluid test, and the spinal cord. It is a syndrome that is diagnosed by not detecting bacteria by smearing fluid or culturing bacteria. Although it is known that aseptic meningitis is caused by various viruses other than enterovirus, the main cause is enterovirus, particularly echovirus and coxsackievirus. The infection route and epidemiological properties depend on the pathogen, but in the case of aseptic meningitis caused by enterovirus, as in the case of hand-foot-and-mouth disease, droplet infection and fecal-oral infection occur mainly in children around summer. It becomes popular. An effective treatment method for aseptic meningitis has not yet been established, and prevention with a vaccine or the like is expected.

ウイルス性疾患に対する予防法としてのワクチンの有効性は、ポリオウイルスに対するワクチンなどの前例から、広く認められている。ワクチンの候補としては、一般的には、弱毒化株、全粒子を初めとする不活化ウイルス、ウイルス様粒子（Ｖｉｒｕｓ Ｌｉｋｅ Ｐａｒｔｉｃｌｅ、以下「ＶＬＰ」）、組換えタンパク質、組換えベクター及びペプチドなどが知られている。エンテロウイルスに対するワクチンについても、すでに様々な研究及び報告がなされている。例えば、非特許文献１及び非特許文献２にはエンテロウイルスをホルマリンで不活化したワクチンが報告されている。特許文献１にはエンテロウイルスのＶＰ０〜４を含むＶＬＰが報告されている。特許文献２にはエンテロウイルス粒子及びその製造法が報告されている。特許文献３にはエンテロウイルスを含む多様なウイルスのＶＬＰの製造法が報告されている。非特許文献３にはＥＶ７１のＦ粒子の免疫原性が報告されている。非特許文献４にはＥＶ７１不活化ワクチン投与後の、ＥＶ７１遺伝子型間の交差性が報告されている。非特許文献５にはＥＶ７１のＶＰ１〜３を含むＶＬＰがエンテロウイルスに対するワクチンとして報告されている。 The effectiveness of vaccines as a preventative measure against viral diseases has been widely recognized from precedents such as vaccines against poliovirus. Vaccine candidates generally include attenuated strains, inactivated viruses including whole particles, virus-like particles (hereinafter referred to as "VLP"), recombinant proteins, recombinant vectors and peptides. Are known. Various studies and reports have already been made on vaccines against enteroviruses. For example, Non-Patent Document 1 and Non-Patent Document 2 report vaccines in which enterovirus is inactivated with formalin. Patent Document 1 reports a VLP containing VPs 0 to 4 of enterovirus. Patent Document 2 reports enterovirus particles and a method for producing the same. Patent Document 3 reports a method for producing VLPs of various viruses including enterovirus. Non-Patent Document 3 reports the immunogenicity of EV71 F particles. Non-Patent Document 4 reports cross-reactivity between EV71 genotypes after administration of EV71 inactivated vaccine. Non-Patent Document 5 reports VLP containing EV71 VP1 to 3 as a vaccine against enterovirus.

ＥＶ７１は、直径２０〜３０ｎｍの非エンベロープウイルスカプシドの内部に約７．４ｋｂの一本鎖ＲＮＡが封入された構造を有しており、該カプシドは４つの異なる構造タンパク質（ＶＰ１〜４）のコピー６０個からなる。４つの構造タンパク質がアセンブルしてプロトマーを形成し、５つのプロトマーがアセンブルしてペンタマーを形成し、１２個のペンタマーとウイルスゲノムがビリオンを構成する。ＥＶ７１のサブ遺伝子型は、主にＶＰ１における変異などによって定められている（非特許文献６）。 EV71 has a structure in which a single-stranded RNA of about 7.4 kb is encapsulated inside a non-enveloped virus capsid having a diameter of 20 to 30 nm, and the capsid is a copy of four different structural proteins (VP1 to 4). It consists of 60 pieces. Four structural proteins assemble to form a protomer, five protomers assemble to form a pentamer, and twelve pentamers and the viral genome make up a virion. The sub-genotype of EV71 is mainly determined by mutations in VP1 (Non-Patent Document 6).

特表２０１４−５３２６９１号公報Special Table 2014-532691 特表２０１７−５１７５７１号公報Special Table 2017-517571 特表２０１５−５２８２８５号公報Special Table 2015-528285

Ｌｅｅ ＭＳ， ｅｔ ａｌ．， Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ Ｖａｃｃｉｎｅｓ ９： １４９−１５６， ２０１０Lee MS, et al. , Expert Rev Vaccines 9: 149-156, 2010 Ｘｕ Ｊ， ｅｔ ａｌ．， Ｖａｃｃｉｎｅ ２８： ３５１６−３５２１， ２０１０Xu J, et al. , Vaccine 28: 3516-3521, 2010 Ｃｈｉａ−Ｃｈｙｉ Ｌｉｕ， ｅｔ ａｌ．， ＰＬＯＳ ｏｎｅ， Ｖｏｌ６， Ｉｓｓｕｅ ５， Ｍａｙ ２０１１Chia-Chyi Liu, et al. , PLOS one, Vol6, Issue 5, May 2011 Ｌｏｎｇｄｉｎｇ Ｌｉｕ， ｅｔ ａｌ．， ＢＭＣ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， ２０１５， １３：２２６Londoning Liu, et al. , BMC Medicine, 2015, 13: 226 Ｘｉａｏｌｉ Ｗａｎｇ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ｄｏｉ：１０．１１２８／ＪＶＩ．０１３３０−１７， ２０１７Xiaoli Wang, et al. , J. Virol. doi: 10.1128 / JVI. 01330-17, 2017 Ｅｕｎ−Ｊｅ Ｙｉ， ｅｔ ａｌ．， Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｒｅｓ ２０１７；６：４−１４En-Je Yi, et al. , Clin Exp Vaccine Res 2017; 6: 4-14

本発明は、エンテロウイルスに対するワクチンに関する。具体的には、本発明は、エンテロウイルスに対して免疫原性を示すポリペプチド、当該ポリペプチドの製造方法、当該ポリペプチドを含むエンテロウイルスに対するワクチン及び当該ポリペプチドを用いたエンテロウイルス関連疾患の予防方法を提供する。より具体的には、本発明のポリペプチドは、エンテロウイルス由来のＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３及びＶＰ４を含むポリペプチドである。 The present invention relates to a vaccine against enterovirus. Specifically, the present invention describes a polypeptide exhibiting immunogenicity against enterovirus, a method for producing the polypeptide, a vaccine against enterovirus containing the polypeptide, and a method for preventing enterovirus-related diseases using the polypeptide. provide. More specifically, the polypeptide of the present invention is a polypeptide containing VP1, VP2, VP3 and VP4 derived from enterovirus.

ワクチンの有効性は、一般に、免疫原性によって評価される。すでに実用化されているＥＶ７１に対するワクチンとして、例えばＳｉｎｏｖａｃ社のＩｎｌｉｖｅが挙げられる。しかしながら手足口病を初めとするエンテロウイルスによって引き起こされる疾患の流行状況を鑑みると、エンテロウイルスに対して高い免疫原性を示すことが求められている。加えて、実用的なワクチンとしては、マウスモデルなどを用いた動物実験で高い感染予防効果が示されることがより望ましい。 Vaccine efficacy is generally assessed by immunogenicity. Examples of vaccines against EV71 that have already been put into practical use include Inlive from CoronaVac. However, in view of the epidemic situation of diseases caused by enteroviruses such as hand-foot-and-mouth disease, it is required to show high immunogenicity against enteroviruses. In addition, as a practical vaccine, it is more desirable that a high infection-preventing effect is shown in animal experiments using a mouse model or the like.

本発明者らは、上記の課題に鑑みて、高い免疫原性を有するワクチンを製造した。具体的には、エンテロウイルスの構造、特にＶＰ０がＶＰ２とＶＰ４に開裂することに着目し、当該開裂が免疫原性に影響を与えることを見出した。すなわち、免疫原性を示すポリペプチドとしてＶＰ２とＶＰ４を多く含むワクチンを設計することが、高い免疫原性を示すワクチンの提供につながると考えた。エンテロウイルス由来のＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３及びＶＰ４を含むポリペプチドを製造し、このポリペプチドがエンテロウイルスに対する免疫原として高い効果を有することを確認して、本発明をなした。 In view of the above problems, the present inventors have produced a vaccine having high immunogenicity. Specifically, we focused on the structure of enterovirus, in particular, that VP0 cleaves into VP2 and VP4, and found that the cleaving affects immunogenicity. That is, it was considered that designing a vaccine containing a large amount of VP2 and VP4 as a polypeptide showing immunogenicity would lead to the provision of a vaccine showing high immunogenicity. A polypeptide containing VP1, VP2, VP3 and VP4 derived from enterovirus was produced, and it was confirmed that this polypeptide has a high effect as an immunogen against enterovirus, and the present invention was made.

以下に本発明の詳細な説明をするが、本明細書において用いられる用語は、微生物学、生化学、分子生物学、医学及び薬学分野における一般的な定義に従って理解される。ただし、本明細書において特に説明又は定義されている用語については、本明細書における説明又は定義が優先する。また、本明細書中に引用されている文献については、参照により本明細書の一部とする。 Although the present invention will be described in detail below, the terms used herein are understood according to general definitions in the fields of microbiology, biochemistry, molecular biology, medicine and pharmacy. However, with respect to terms specifically explained or defined herein, the description or definition herein supersedes. References cited herein are incorporated herein by reference.

第一の態様において、本発明は、エンテロウイルス由来のＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３及びＶＰ４を含むポリペプチドであって、当該ＶＰ２とＶＰ４の結合部位にプロテアーゼが認識するアミノ酸配列を含むことを特徴とするポリペプチドを提供する。 In a first aspect, the present invention is a polypeptide containing VP1, VP2, VP3 and VP4 derived from enterovirus, wherein the binding site between VP2 and VP4 contains an amino acid sequence recognized by a protease. Provides peptides.

エンテロウイルスには、ポリオウイルス、コクサッキーウイルスＡ群、コクサッキーウイルスＢ群、エコーウイルス及びその他のエンテロウイルスが含まれるが、とりわけ本発明においては、エンテロウイルスであるＡ〜Ｄ群エンテロウイルス、特にＡ群エンテロウイルスを主題とする。本発明は、特に手足口病、ヘルパンギーナ及び無菌性髄膜炎などのエンテロウイルス関連疾患の原因であるウイルス、例えば、コクサッキーウイルスＡ群、コクサッキーウイルスＢ群、エコーウイルス及びＥＶ７１を主題としている。より具体的には、本発明は、手足口病の原因であるエンテロウイルス、例えばコクサッキーウイルスＡ群及びＥＶ７１、とりわけコクサッキーウイルスＡ６、１０及び１６及びＥＶ７１に関する。さらに本発明は、ヘルパンギーナの原因であるエンテロウイルス、例えばコクサッキーウイルスＡ群、ＥＶ７１、コクサッキーウイルスＢ群及びエコーウイルス、特にコクサッキーウイルスＡ群、例えばコクサッキーウイルスＡ２、３、４、５、６及び１０に関する。特に本発明は、近年日本において手足口病の主たる原因となっているＥＶ７１Ｂ型、例えばＥＶ７１Ｂ５型に関する。 Enteroviruses include poliovirus, coxsackievirus A group, coxsackievirus B group, echovirus and other enteroviruses, and in particular, in the present invention, enteroviruses A to D group enteroviruses, particularly group A enteroviruses are the subjects. The present invention is particularly focused on viruses responsible for enterovirus-related diseases such as hand-foot-and-mouth disease, herpangina and aseptic meningitis, such as coxsackievirus group A, coxsackievirus group B, echovirus and EV71. More specifically, the present invention relates to enteroviruses responsible for hand-foot-and-mouth disease, such as coxsackievirus group A and EV71, especially coxsackievirus A6, 10 and 16 and EV71. Furthermore, the present invention relates to enteroviruses that cause herpangina, such as coxsackievirus A group, EV71, coxsackievirus B group and echovirus, especially coxsackievirus A group, such as coxsackievirus A2, 3, 4, 5, 6 and 10. In particular, the present invention relates to EV71B type, for example, EV71B5 type, which has been a major cause of hand-foot-and-mouth disease in Japan in recent years.

エンテロウイルスには、図１に示すようにＰ１と呼ばれる構造たん白質をコードする領域とＰ２及びＰ３と呼ばれる非構造たん白質をコードする領域が存在する。例えばＥＶ７１は、約７．４ｋｂのＲＮＡゲノム長を有する。Ｐ１はウイルスカプシドに該当し、当該領域はウイルスプロテアーゼによるプロセシングを受けることで、ＶＰ０〜４のウイルスたん白質に開裂する。エンテロウイルスのカプシドは、プロカプシドと呼ばれるＶＰ０、１及び３の構造タンパク質から形成される場合やＶＰ０がＶＰ２と４に開裂し、ＶＰ１〜４の構造タンパク質から形成される場合がある。本明細書において、前者を不完全粒子形状のウイルス、後者を完全粒子形状のウイルスと呼ぶ。 As shown in FIG. 1, the enterovirus has a region encoding a structural protein called P1 and a region encoding a non-structural protein called P2 and P3. For example, EV71 has an RNA genome length of about 7.4 kb. P1 corresponds to a viral capsid, and the region is cleaved into viral proteins of VP0-4 by being processed by a viral protease. Enterovirus capsids may be formed from structural proteins of VP0, 1 and 3 called procapsids, or VP0 may be cleaved into VP2 and 4 and formed from structural proteins of VP1-4. In the present specification, the former is referred to as an incomplete particle-shaped virus, and the latter is referred to as a perfect particle-shaped virus.

エンテロウイルスのＶＰ０、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３及びＶＰ４のアミノ酸配列及びそれらをコードする塩基配列は既知であり、ＤＮＡ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ ｏｆ Ｊａｐａｎ（ＤＤＢＪ）、ＥＭＢＬ−Ｂａｎｋ／ＥＢＩ、ＧｅｎＢａｎｋ／Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（以下、ＮＣＢＩ）などのデータベースから容易に入手可能である。例えばＥＶ７１のＢｒＣｒの配列情報は、ＮＣＢＩ登録番号Ｕ２２５２１から入手可能である。 The amino acid sequences of VP0, VP1, VP2, VP3 and VP4 of the enterovirus and the base sequences encoding them are known, and DNA Data Bank of Japan (DDBJ), EMBL-Bank / EBI, GenBank / National Center for Biotechnology Information , NCBI) and the like. For example, the sequence information of BrCr of EV71 can be obtained from NCBI registration number U22521.

本発明において、用語「由来の」とは、対象物が元のウイルスと免疫学的な相同性を有すること、又は元のウイルスのアミノ酸配列と一定の相同性を示すことを意味し、製造方法に縛られるものではないと理解すべきである。免疫学的な相同性とは、元のウイルスに対する免疫反応が対象物に対しても同様に惹起されることを示す。免疫学的な相同性を確認する方法は、当業者に利用可能なあらゆる手段であってよく、これらに限定されない。一般的には、対象物が発現を誘導する抗体が元のウイルスを中和しうるかどうか、すなわち対象物が発現を誘導する中和抗体を測定することで確認することができる。例えばエンテロウイルス「由来の」との記載は、エンテロウイルスに対する免疫反応が対象物に対しても同様に惹起されること、又はエンテロウイルスのアミノ酸配列と一定の相同性、例えばエンテロウイルスとして微生物学上理解される程度の相同性を有することを意味する。アミノ酸配列と一定の相同性とは、典型的には８０％以上、好ましくは９０％以上、例えば９５％以上、好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、最適には９９％以上の相同性を有することを意味する。相同性の検定には当業者が通常利用可能なあらゆる検定方法を利用可能であるが、例えばＢＬＡＳＴを初期設定のパラメーターで用いることができる。 In the present invention, the term "derived" means that the object has immunological homology with the original virus or shows a certain homology with the amino acid sequence of the original virus, and the production method. It should be understood that it is not tied to. Immunological homology indicates that an immune response to the original virus is elicited to the subject as well. Methods of confirming immunological homology may be, but are not limited to, any means available to those of skill in the art. In general, it can be confirmed whether the antibody whose expression is induced by the object can neutralize the original virus, that is, by measuring the neutralizing antibody whose expression is induced by the object. For example, the description of enterovirus "derived" means that an immune response to enterovirus is similarly elicited to an object, or a certain degree of homology with the amino acid sequence of enterovirus, for example, to the extent that it is microbiologically understood as enterovirus. It means having the homology of. The amino acid sequence and constant homology are typically 80% or higher, preferably 90% or higher, for example 95% or higher, preferably 96% or higher, more preferably 97% or higher, still more preferably 98% or higher, optimal. Means having 99% or more homology. Any test method commonly available to those of skill in the art can be used for the test of homology, for example BLAST can be used with the default parameters.

一例をあげると、エンテロウイルス由来のＶＰ１であるといえるためには、まず、問題となっているポリペプチドのアミノ酸配列が、ＮＣＢＩから取得したいずれかのエンテロウイルスのＶＰ１のアミノ酸配列と初期設定パラメーターを用いたＢＬＡＳＴで一定の相同性、例えばエンテロウイルスとして微生物学上理解される程度の相同性を有することを意味し、典型的には８０％以上、好ましくは９０％以上、例えば９５％以上、好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、最適には９９％以上の相同性を有することを意味する。 To give an example, in order to be able to say that it is VP1 derived from enterovirus, first, the amino acid sequence of the polypeptide in question uses the amino acid sequence of VP1 of any enterovirus obtained from NCBI and the initial setting parameters. It means that it has a certain degree of homology in BLAST, for example, a degree of homology that is microbiologically understood as an enterovirus, and is typically 80% or more, preferably 90% or more, for example 95% or more, preferably 96. It means that it has a homology of% or more, more preferably 97% or more, further preferably 98% or more, and optimally 99% or more.

あるアミノ酸を、同様の疎水性指数を有する他のアミノ酸により置換して、そして依然として同様の生物学的機能を有するタンパク質（例えば、酵素活性において等価なタンパク質。以下、「生物学的等価体」）を生じさせ得ることが当該分野で周知である。このようなアミノ酸置換において、疎水性指数が±２以内であることが好ましく、±１以内であることがより好ましく、±０．５以内であることがさらにより好ましい。疎水性に基づくこのようなアミノ酸の置換は効率的であることが当該分野において理解される。親水性指標もまた、生物学的等価体の作製において考慮される。米国特許第４、５５４、１０１号に記載されるように、以下の親水性指数がアミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０±１）；グルタミン酸（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；スレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；トリプトファン（−３．４）。このようなアミノ酸置換において、親水性指数が±２以内であることが好ましく、±１以内であることがより好ましく、±０．５以内であることがさらにより好ましい。 A protein in which one amino acid is replaced by another amino acid having a similar hydrophobicity index and still has a similar biological function (eg, a protein equivalent in enzymatic activity; hereinafter, "biological equivalent"). Is well known in the art. In such amino acid substitutions, the hydrophobicity index is preferably within ± 2, more preferably within ± 1, and even more preferably within ± 0.5. It is understood in the art that such substitutions of amino acids based on hydrophobicity are efficient. Hydrophilicity indicators are also considered in the production of bioequivalents. The following hydrophilicity indices are assigned to amino acid residues as described in US Pat. Nos. 4,554,101: arginine (+3.0); lysine (+3.0); aspartic acid (+3. 0 ± 1); glutamic acid (+3.0 ± 1); serine (+0.3); aspartic acid (+0.2); glutamine (+0.2); glycine (0); threonine (-0.4); proline ( -0.5 ± 1); alanin (-0.5); histidine (-0.5); cysteine (-1.0); methionine (-1.3); valine (-1.5); leucine (-1.5) -1.8); isoleucine (-1.8); tyrosine (-2.3); phenylalanine (-2.5); tryptophan (-3.4). In such amino acid substitutions, the hydrophilicity index is preferably within ± 2, more preferably within ± 1, and even more preferably within ± 0.5.

したがって、本発明において、ポリペプチドは保存的置換されていてもよい。保存的置換とは、元のアミノ酸と置換されるアミノ酸との親水性指数及び／又は疎水性指数が上記のように類似している置換をいう。保存的置換の例は、当業者に周知であり、例えば、次の各グループ内での置換：アルギニンとリジン；グルタミン酸とアスパラギン酸；セリンとスレオニン；グルタミンとアスパラギン；バリン、ロイシン、及びイソロイシン、などが挙げられるが、これらに限定されない。かかる保存的置換もまた、本発明において、「由来の」なる用語の範囲に含まれる。 Therefore, in the present invention, the polypeptide may be conservatively substituted. Conservative substitution refers to a substitution in which the hydrophilicity index and / or the hydrophobicity index of the original amino acid and the amino acid to be replaced are similar as described above. Examples of conservative substitutions are well known to those skilled in the art and include, for example, substitutions within each of the following groups: arginine and lysine; glutamic acid and aspartic acid; serine and threonine; glutamine and aspartic acid; valine, leucine, and isoleucine, etc. However, it is not limited to these. Such conservative substitutions are also included in the present invention within the scope of the term "derived".

本発明において、プロテアーゼは、アミノ酸間のペプチド結合を分解するあらゆる酵素を意味し、その対象がタンパク質、高分子ペプチド又は低分子ペプチドのいずれであるかを問わない。本発明において好ましいプロテアーゼとしては、ＶＰ２とＶＰ４の結合部位を特異的に認識可能であって他のペプチド結合に影響しないことが望ましいことから、基質特異性の高いもの、例えばシステインプロテアーゼ、３Ｃプロテアーゼ、３ＣＤプロテアーゼなどが挙げられる。 In the present invention, a protease means any enzyme that breaks a peptide bond between amino acids, regardless of whether the target is a protein, a high molecular weight peptide, or a low molecular weight peptide. As the preferred protease in the present invention, since it is desirable that the binding site of VP2 and VP4 can be specifically recognized and does not affect the binding of other peptides, those having high substrate specificity, such as cysteine protease and 3C protease, are preferable. Examples thereof include 3CD protease.

本発明において、プロテアーゼは、無作為にペプチド結合を分解するものではなく、それぞれ特定のアミノ酸配列を認識して特異的にペプチド結合を切断する。したがって、１種のプロテアーゼを選択すれば、そのプロテアーゼが認識可能なアミノ酸配列は一意に決定できる。あるプロテアーゼがどのようなアミノ酸配列を認識するかは、各種文献、例えばプロテアーゼを販売する事業者の説明書などに記載されている。３Ｃプロテアーゼ又は３ＣＤプロテアーゼの場合、認識するアミノ酸配列はＸ−Ｘ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｘであり、Ｇｌｎ−Ｇｌｙ間で切断が生じる。例えばＨＲＶ３Ｃプロテアーゼの場合、フナコシ社の提供する説明書から、認識するアミノ酸配列がＬｅｕ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏであり、Ｇｌｎ−Ｇｌｙ間で切断が生じることが理解可能である。なお、Ｘは任意のアミノ酸を示す。 In the present invention, the protease does not randomly break the peptide bond, but recognizes a specific amino acid sequence and specifically cleaves the peptide bond. Therefore, if one type of protease is selected, the amino acid sequence recognizable by that protease can be uniquely determined. What kind of amino acid sequence a protease recognizes is described in various documents, for example, a manual of a business operator who sells the protease. In the case of 3C protease or 3CD protease, the recognized amino acid sequence is X-X-Gln-Gly-X, and cleavage occurs between Gln-Gly. For example, in the case of HRV3C protease, it can be understood from the instruction manual provided by Funakoshi that the amino acid sequence to be recognized is Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln-Gly-Pro and cleavage occurs between Gln-Gly. Is. In addition, X represents an arbitrary amino acid.

本発明において、プロテアーゼが認識するアミノ酸配列は、プロテアーゼに依存して決定されるものである。エンテロウイルスのＲＮＡには３Ｃプロテアーゼ又は３ＣＤプロテアーゼをコードする塩基配列が含まれていることから、本発明のポリペプチドにおいて、当該プロテアーゼが認識するアミノ酸配列としてＸ−Ｘ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｘというグルタミン及びグリシンが連続した配列が好ましい。例えば、本発明のポリペプチドにおいて、３Ｃプロテアーゼ又は３ＣＤプロテアーゼでＶＰ２とＶＰ４の結合部位が基質特異的に切断された結果、ＶＰ２のＮ末端はグリシンが、ＶＰ４のＣ末端はグルタミンとなる。かかるプロテアーゼが認識するアミノ酸配列は、野生型のアミノ酸配列と比較したときに置換、挿入、欠失、又は付加のいずれの変異があってもよい。 In the present invention, the amino acid sequence recognized by the protease is determined depending on the protease. Since the RNA of enterovirus contains a base sequence encoding a 3C protease or a 3CD protease, glutamine called X-X-Gln-Gly-X and the amino acid sequence recognized by the protease in the polypeptide of the present invention are used. A sequence of continuous glycine is preferred. For example, in the polypeptide of the present invention, the binding site between VP2 and VP4 is substrate-specifically cleaved by 3C protease or 3CD protease, and as a result, the N-terminal of VP2 becomes glycine and the C-terminal of VP4 becomes glutamine. The amino acid sequence recognized by such a protease may have any of the substitution, insertion, deletion, or addition mutations when compared to the wild-type amino acid sequence.

したがって、好ましい態様において、本発明は、エンテロウイルス、例えばＡ〜Ｄ群エンテロウイルス、好ましくはＡ群エンテロウイルス由来のＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３及びＶＰ４を含むポリペプチドであって、当該ＶＰ２とＶＰ４の結合部位にプロテアーゼが認識するアミノ酸配列を含むことを特徴とするポリペプチドを提供する。 Therefore, in a preferred embodiment, the present invention is a polypeptide containing VP1, VP2, VP3 and VP4 derived from an enterovirus, for example, group A to D enterovirus, preferably group A enterovirus, and a protease at the binding site between VP2 and VP4. Provided is a polypeptide comprising an amino acid sequence recognized by.

より好ましい態様において、本発明は、エンテロウイルス、例えばＡ〜Ｄ群エンテロウイルス、好ましくはＡ群エンテロウイルス由来のＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３及びＶＰ４を含むポリペプチドであって、当該ＶＰ２とＶＰ４の結合部位に３Ｃプロテアーゼ又は３ＣＤプロテアーゼが認識するアミノ酸配列を含むことを特徴とするポリペプチドを提供する。 In a more preferred embodiment, the present invention is a polypeptide containing VP1, VP2, VP3 and VP4 derived from an enterovirus such as group A to D enterovirus, preferably group A enterovirus, and a 3C protease at the binding site of the VP2 and VP4. Alternatively, a polypeptide characterized by containing an amino acid sequence recognized by a 3CD protease is provided.

より好ましい態様において、本発明は、エンテロウイルス、例えばＡ〜Ｄ群エンテロウイルス、好ましくはＡ群エンテロウイルス由来のＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３及びＶＰ４を含むポリペプチドであって、当該ＶＰ２とＶＰ４とがグルタミン及びグリシンが連続した配列を介して連結していることを特徴とするポリペプチドを提供する。 In a more preferred embodiment, the present invention is a polypeptide containing VP1, VP2, VP3 and VP4 derived from enteroviruses such as group A to D enteroviruses, preferably group A enteroviruses, wherein the VP2 and VP4 are glutamine and glycine. Provided are a polypeptide characterized by being linked via a contiguous sequence.

別の好ましい態様において、本発明は、エンテロウイルス、例えばＡ〜Ｄ群エンテロウイルス、好ましくはＡ群エンテロウイルス由来のＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３及びＶＰ４を含むポリペプチドであって、当該ＶＰ２のＮ末端にグリシンを、当該ＶＰ４のＣ末端にグルタミンを含むことを特徴とするポリペプチドを提供する。 In another preferred embodiment, the present invention is a polypeptide containing VP1, VP2, VP3 and VP4 derived from enteroviruses such as group A to D enteroviruses, preferably group A enteroviruses, wherein glycine is added to the N-terminus of the VP2. Provided is a polypeptide characterized by containing glutamine at the C-terminal of the VP4.

さらに本発明者らは、天然のエンテロウイルスには完全粒子形状と不完全粒子形状のウイルスが混在していることを鑑み、エンテロウイルスから完全粒子形状のウイルスを抽出することで、不完全粒子形状のウイルスよりも高い免疫原性を有する抗原を設計しうることを見出した。したがって、さらなる態様において、本発明は、エンテロウイルス由来のＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３及びＶＰ４を含むポリペプチドであって、エンテロウイルスＶＰ０を実質的に含まないことを特徴とするポリペプチドを提供する。ＶＰ０は、約３６ｋＤａのポリペプチドであり、約２８ｋＤａのＶＰ２と約８ｋＤａのＶＰ４を含む。 Furthermore, in view of the fact that natural enteroviruses contain both perfect particle-shaped and incomplete-particle-shaped viruses, the present inventors have extracted the perfect-particle-shaped virus from enteroviruses to obtain incomplete-particle-shaped viruses. We have found that it is possible to design antigens with higher immunogenicity. Therefore, in a further aspect, the present invention provides a polypeptide comprising enterovirus-derived VP1, VP2, VP3 and VP4, characterized in that it is substantially free of enterovirus VP0. VP0 is a polypeptide of about 36 kDa and contains about 28 kDa VP2 and about 8 kDa VP4.

本発明において、用語「実質的に含まない」とは、定量的に測定した場合にその含有量が主成分と比較して３０％以下、２０％以下、１０％以下、好ましくは５％以下、より好ましくは３％以下、最も好ましくは１％以下であることを意味する。ここでの「主成分」は単に量的に主たる成分を意味し、性質的に主であることを意図するものではない。定量的測定に利用可能な手段は当業者が通常選択可能ないずれかの方法であってよく、含有量はその測定方法が提供する通常の定量単位を用いて把握される。例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法を用いて検出したＶＰ０のバンドの強度が、ＶＰ２のバンドの強度と比較して、３０％以下、２０％以下、１０％以下、好ましくは５％以下、より好ましくは３％以下、最も好ましくは１％以下である場合に、ＶＰ０を「実質的に含まない」ものと理解される。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法はゲルに添加したタンパク質混合物を電気泳動によって分子量に従って分離し、染色及び脱色後にバンド強度を分析するものであり、使用するゲル、試薬、メンブレン、スタンダード及び装置などは当業者であれば適宜選択できる。 In the present invention, the term "substantially free" means that the content thereof, when measured quantitatively, is 30% or less, 20% or less, 10% or less, preferably 5% or less, as compared with the main component. It means that it is more preferably 3% or less, and most preferably 1% or less. The "main component" here simply means the main component quantitatively, and is not intended to be the main component in nature. The means available for quantitative measurement may be any method usually selectable by those skilled in the art, and the content is grasped using the usual quantitative units provided by the measurement method. For example, the intensity of the VP0 band detected using the SDS-PAGE method is 30% or less, 20% or less, 10% or less, preferably 5% or less, more preferably 3 as compared with the intensity of the VP2 band. VP0 is understood to be "substantially free" when it is less than or equal to%, most preferably less than or equal to 1%. The SDS-PAGE method separates the protein mixture added to the gel according to the molecular weight by electrophoresis, and analyzes the band intensity after staining and bleaching. The gel, reagents, membranes, standards, devices, etc. used may be those of those skilled in the art. Can be selected as appropriate.

好ましい態様において、本発明は、エンテロウイルス、例えばＡ〜Ｄ群エンテロウイルス、好ましくはＡ群エンテロウイルス由来のＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３及びＶＰ４を含むポリペプチドであって、エンテロウイルスＶＰ０を実質的に含まないことを特徴とするポリペプチドを提供する。 In a preferred embodiment, the present invention is characterized in that it is a polypeptide containing enteroviruses such as group A to D enteroviruses, preferably group A enteroviruses VP1, VP2, VP3 and VP4, which is substantially free of enterovirus VP0. To provide a polypeptide.

本発明のポリペプチドは、当業者が通常利用可能なペプチド、ポリペプチド及びタンパク質製造方法のいずれかを用いて製造することができる。かかる方法は、これらに限定されるものではないが、化学合成、ウイルス不活化及び細胞発現系を含む。具体的な製造方法やそこで使用される試薬、条件及び装置等は、当業者であれば、容易に選択することができる。例えば市販のタンパク質発現キットを、当該キットに添付の説明書に従って、利用することができる。 The polypeptides of the invention can be produced using any of the peptides, polypeptides and protein production methods commonly available to those skilled in the art. Such methods include, but are not limited to, chemical synthesis, viral inactivation and cell expression systems. A person skilled in the art can easily select a specific production method, reagents, conditions, devices and the like used therein. For example, a commercially available protein expression kit can be used according to the instructions attached to the kit.

好ましい本発明のポリペプチドの製造方法は、ウイルス不活化又は細胞発現系を用いた方法である。エンテロウイルスを増殖しうる細胞として、Ｖｅｒｏ細胞、ＲＤ細胞（Ｒｈａｂｄｏｍｙｓａｒｃｏｍａ細胞）、ＲＤ−Ａ細胞、ＲＤ−１８Ｓ細胞などが挙げられる。ウイルス不活化はワクチンにおいて通常使用されるホルマリン処理等のあらゆる方法によって行うことができる。一方でＡ群エンテロウイルスは、細胞を用いたウイルス培養時の増殖において課題があるため、量及びコストの観点より、細胞発現系によるＶＬＰの作製がより好ましい。
細胞発現系を用いた方法としては、利用可能な発現ベクター及び細胞には特に制限はないが、例えば、市販のベクター及び細胞を、当該製品に添付の説明書に従って、利用することができる。かかるベクターには、これらに限定されないが、例えば、ＨａｌｏＴａｇベクター、ｐＨＥＫ２９３ベクター、ＢａｃＰＡＫベクター、ｐＲＩ１０１ＤＮＡベクター、バキュロウイルスベクター、ｐｃＤＮＡベクター、ｐＣＨＯ１．０ベクター等が含まれ、使用する細胞に応じて適宜選択される。利用可能な細胞としては、これらに限定されないが、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＭＤＣＫ細胞、大腸菌細胞、カイコ細胞、タバコ葉細胞等が含まれる。当該細胞発現系によって作製されるポリペプチドとして、例えばＶＬＰが挙げられる。 A preferred method for producing the polypeptide of the present invention is a method using a virus inactivation or a cell expression system. Examples of cells capable of multiplying enterovirus include Vero cells, RD cells (Rhabdomyosarcoma cells), RD-A cells, RD-18S cells and the like. Virus inactivation can be performed by any method such as formalin treatment commonly used in vaccines. On the other hand, since group A enterovirus has a problem in proliferation during virus culture using cells, it is more preferable to prepare VLP by a cell expression system from the viewpoint of quantity and cost.
The method using the cell expression system is not particularly limited in the expression vectors and cells that can be used, but for example, commercially available vectors and cells can be used according to the instructions attached to the product. Such vectors include, but are not limited to, for example, HaloTag vector, pHEK293 vector, BacPAK vector, pRI101DNA vector, baculovirus vector, pcDNA vector, pCHO1.0 vector and the like, and are appropriately selected according to the cells to be used. To. Available cells include, but are not limited to, CHO cells, HEK293 cells, HeLa cells, Vero cells, MDCK cells, Escherichia coli cells, silkworm cells, tobacco leaf cells and the like. Examples of the polypeptide produced by the cell expression system include VLP.

本発明のポリペプチドは、ヒトに投与することが意図されていることから、哺乳類細胞を用いた発現系が好ましい。他の細胞、例えば大腸菌、植物及び昆虫細胞を用いた発現系でも本発明のポリペプチドを製造することは可能であるが、翻訳後修飾の観点から、哺乳類細胞を用いることが好ましい。本発明のポリペプチドを製造するのに好適な哺乳類細胞としては、例えば、ＣＨＯ細胞が挙げられる。当該細胞を用いた発現系としては、当業者に利用可能なあらゆる手段であってよく、これらに限定されないが、例えば、プラスミドのトランスフェクションによる一過性発現系でもよく、安定的に目的のポリペプチドを発現する宿主細胞（以下、安定発現細胞）を構築してもよい。 Since the polypeptide of the present invention is intended to be administered to humans, an expression system using mammalian cells is preferable. Although it is possible to produce the polypeptide of the present invention in an expression system using other cells such as Escherichia coli, plants and insect cells, it is preferable to use mammalian cells from the viewpoint of post-translational modification. Mammalian cells suitable for producing the polypeptide of the present invention include, for example, CHO cells. The expression system using the cells may be any means available to those skilled in the art, and is not limited to these, but may be, for example, a transient expression system by transfection of a plasmid, and is a stable target poly. A host cell expressing the peptide (hereinafter, stable expression cell) may be constructed.

一例として、本発明のポリペプチドを製造するためにウイルス不活化方法を用いる場合、次の工程に従って製造できる：
・細胞培養にてエンテロウイルスを増殖させる工程
・ウイルス液をろ過処理する工程
・処理後ウイルス液をショ糖密度勾配遠心法にて完全粒子に該当するウイルス画分を取得する工程
・当該ウイルス画分を不活化することで、目的のポリペプチドを取得する工程
を含む方法を提供する。 As an example, when the virus inactivating method is used to produce the polypeptide of the invention, it can be produced according to the following steps:
-Step of growing enterovirus in cell culture-Step of filtering virus solution-Step of obtaining virus fraction corresponding to complete particles by sucrose density gradient centrifugation after treatment-The virus fraction Provided is a method comprising the step of obtaining the polypeptide of interest by inactivating.

一例として、本発明のポリペプチドを製造するために細胞発現系を用いる場合、次の工程に従って製造できる：
・エンテロウイルスからＲＮＡを抽出するか、又は人工合成によりＲＮＡをデザインする工程
・ＲＴ−ＰＣＲにてＲＮＡよりＤＮＡ断片を合成及び増幅し、当該ＤＮＡ断片を発現用プラスミドにライゲーションする工程
・得られたプラスミドを細胞にトランスフェクションする工程
・トランスフェクションした細胞を増殖させる工程、又は安定発現細胞を選抜及び増殖する工程
・増殖した細胞から本発明のポリペプチドを回収する工程。 As an example, when a cell expression system is used to produce the polypeptide of the invention, it can be produced according to the following steps:
-Step of extracting RNA from enterovirus or designing RNA by artificial synthesis-Step of synthesizing and amplifying a DNA fragment from RNA by RT-PCR and ligating the DNA fragment into an expression plasmid-The obtained plasmid -Step of proliferating the transfected cells, or step of selecting and proliferating stable expressing cells-Step of recovering the polypeptide of the present invention from the proliferated cells.

上記製造方法のいずれの工程においても、当業者であれば、試薬、条件、装置等について、容易に選択可能である。また、各工程において、意図した結果が得られているかを確認するための工程を適宜挿入することができる。かかる確認工程としては、例えば、抽出したＲＮＡの配列を適当なシークエンス法、例えばサイクルシークエンス法やパイロシークエンス法等で確認することや、得られたポリペプチドをウェスタンブロット法（WB）等によって確認することが含まれる。 In any of the steps of the above manufacturing method, those skilled in the art can easily select reagents, conditions, devices and the like. Further, in each step, a step for confirming whether or not the intended result is obtained can be appropriately inserted. As such a confirmation step, for example, the sequence of the extracted RNA is confirmed by an appropriate sequencing method, for example, a cycle sequencing method, a pyrosequence method, or the like, or the obtained polypeptide is confirmed by Western blotting (WB) or the like. Is included.

ＶＰ０をプロテアーゼによって開裂させてＶＰ２とＶＰ４とするために、プロテアーゼが認識するアミノ酸配列をコードする塩基配列となるように変異を導入することができる。変異を導入するために元の塩基配列を置換、挿入、欠失、又は付加してもよいが、これらに限定されない。エンテロウイルスからＲＮＡを抽出した後、ＲＴ−ＰＣＲにてＲＮＡよりＤＮＡ断片を合成及び増幅させ、当該ＤＮＡ断片を発現用プラスミドにライゲーションする工程において、変異導入は、ライゲーション時に行ってもよいし、ライゲーションの前又は後に行ってもよい。挿入又は置換されるプロテアーゼが認識するアミノ酸配列をコードする塩基配列は、コドン表を用いて容易に決定することができる。例えば、３Ｃプロテアーゼ又は３ＣＤプロテアーゼを用いる場合には、当該プロテアーゼが認識するＧｌｎ−Ｇｌｙをコードする塩基配列、例えばＣＡＡＧＧＵが用いられる。変異導入の具体的方法は、当業者に利用可能なあらゆる手段であってよく、これらに限定されないが、例えば、インバースＰＣＲ法、相補的プライマー法等を含む。例えば、市販の変異導入キットを当該キットに添付の説明書に従って使用することができる。 In order to cleave VP0 with a protease to obtain VP2 and VP4, mutations can be introduced so as to have a base sequence encoding the amino acid sequence recognized by the protease. The original base sequence may be replaced, inserted, deleted, or added to introduce a mutation, but is not limited thereto. In the step of extracting RNA from enterovirus, synthesizing and amplifying a DNA fragment from RNA by RT-PCR, and ligating the DNA fragment to an expression plasmid, mutation introduction may be performed at the time of ligation, or ligation. It may be done before or after. The base sequence encoding the amino acid sequence recognized by the protease to be inserted or replaced can be easily determined using the codon table. For example, when a 3C protease or a 3CD protease is used, a base sequence encoding Gln-Gly recognized by the protease, for example, CAAGGU is used. Specific methods of mutagenesis may be any means available to those of skill in the art and include, but are not limited to, inverse PCR methods, complementary primer methods and the like. For example, a commercially available mutagenesis kit can be used according to the instructions attached to the kit.

したがって、ある態様において、本発明は、本発明のポリペプチドを製造する方法であって、
・エンテロウイルスからＲＮＡを抽出する工程
・ＲＴ−ＰＣＲにてＲＮＡよりＤＮＡ断片を合成及び増幅し、当該ＤＮＡ断片を発現用プラスミドにライゲーションする工程
・ライゲーションした発現用プラスミドに、プロテアーゼが認識するアミノ酸配列をコードする塩基配列を変異導入する工程
・得られたプラスミドを細胞にトランスフェクションする工程
・トランスフェクションされた細胞を増殖させる工程、又は安定発現細胞を選抜及び増殖する工程
・増殖した細胞から本発明のポリペプチドを回収する工程
を含む方法を提供する。 Therefore, in some embodiments, the present invention is a method of producing the polypeptide of the present invention.
-Step of extracting RNA from enterovirus-Step of synthesizing and amplifying a DNA fragment from RNA by RT-PCR and ligating the DNA fragment to an expression plasmid-The amino acid sequence recognized by the protease is added to the ligated expression plasmid. The step of introducing a mutation into the encoding base sequence, the step of transfecting the obtained plasmid into cells, the step of proliferating the transfected cells, or the step of selecting and proliferating stable-expressing cells, and the step of proliferating the cells of the present invention. Provided is a method including a step of recovering a polypeptide.

また、別の態様において、本発明は、本発明のポリペプチドを製造する方法であって、
・エンテロウイルスからＲＮＡを抽出する工程
・抽出したＲＮＡに、プロテアーゼが認識するアミノ酸配列をコードする塩基配列を変異導入する工程
・ＲＴ−ＰＣＲにてＲＮＡよりＤＮＡ断片を合成及び増幅し、当該ＤＮＡ断片を発現用プラスミドにライゲーションする工程
・得られたプラスミドを細胞にトランスフェクションする工程
・トランスフェクションされた細胞を増殖させる工程、又は安定発現細胞を選抜及び増殖する工程
・増殖した細胞から本発明のポリペプチドを回収する工程
を含む方法を提供する。 In another aspect, the present invention is a method for producing the polypeptide of the present invention.
-Step of extracting RNA from enterovirus-Step of mutating and introducing a base sequence encoding an amino acid sequence recognized by a protease into the extracted RNA-Synthesis and amplification of a DNA fragment from RNA by RT-PCR and producing the DNA fragment A step of ligating to an expression plasmid, a step of transfecting the obtained plasmid into cells, a step of proliferating the transfected cells, or a step of selecting and proliferating stable expression cells-the polypeptide of the present invention from the proliferated cells. Provided is a method including a step of recovering the plasmid.

さらに別の態様において、本発明は、本発明のポリペプチドを製造する方法であって、
・エンテロウイルス由来のＶＰ１〜４をコードする塩基配列を含むＲＮＡであって、ＶＰ４をコードする塩基配列とＶＰ２をコードする塩基配列との間に、プロテアーゼが認識するアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むＲＮＡを合成する工程
・ＲＴ−ＰＣＲにてＲＮＡよりＤＮＡ断片を合成及び増幅し、当該ＤＮＡ断片を発現用プラスミドにライゲーションする工程
・得られたプラスミドを細胞にトランスフェクションする工程
・トランスフェクションされた細胞を増殖させる工程、又は安定発現細胞を選抜及び増殖する工程
・増殖した発現細胞から本発明のポリペプチドを回収する工程
を含む方法を提供する。 In yet another embodiment, the invention is a method of producing the polypeptide of the invention.
-It is an RNA containing a base sequence encoding VP1 to VP1 to 4 derived from enterovirus, and contains a base sequence encoding an amino acid sequence recognized by a protease between the base sequence encoding VP4 and the base sequence encoding VP2. Step of synthesizing RNA ・ Step of synthesizing and amplifying a DNA fragment from RNA by RT-PCR and ligating the DNA fragment to an expression plasmid ・ Step of transfecting the obtained plasmid into cells ・ Transfected cells Provided is a method including a step of proliferating, or a step of selecting and proliferating stable expressing cells, and a step of recovering the polypeptide of the present invention from the proliferated expressing cells.

このようにして製造された本発明のポリペプチドは、リン酸化やグリコシル化等の修飾を受けうる。かかる修飾を受けたポリペプチドもなお、本発明のポリペプチドに含まれる。修飾には、例えば、発現細胞の翻訳後修飾が含まれる。 The polypeptide of the present invention produced in this manner can undergo modifications such as phosphorylation and glycosylation. Such modified polypeptides are still included in the polypeptides of the invention. Modifications include, for example, post-translational modifications of expressing cells.

また、本発明のポリペプチドは、様々な相互作用によって、いずれかの三次又は四次構造をとりうる。例えば、本発明のポリペプチド内のイオン結合、水素結合、ジスルフィド結合等によってＶＰ１〜４の各サブユニットの折り畳みが生じて三次構造を形成し、次いでＶＰ１〜４の各サブユニットがアセンブルして、四次構造を形成しうる。かかる高次構造は、一般的に、天然のウイルス粒子に構造上近似しているほど、高い免疫原性を示す。本発明においては、更に完全粒子形状に構造上近似しているほど、高い免疫原性を示す。したがって、好ましい態様において本発明のポリペプチドは、完全粒子形状のＶＬＰ又は不活化ウイルスである。 In addition, the polypeptide of the present invention may have any tertiary or quaternary structure through various interactions. For example, ionic bonds, hydrogen bonds, disulfide bonds, etc. in the polypeptide of the present invention cause folding of each subunit of VP1 to 4 to form a tertiary structure, and then each subunit of VP1 to 4 is assembled. It can form a quaternary structure. Such higher-order structures generally exhibit higher immunogenicity as they are structurally similar to natural viral particles. In the present invention, the more structurally close to the perfect particle shape, the higher the immunogenicity. Therefore, in a preferred embodiment, the polypeptide of the invention is a VLP or inactivated virus in full particle form.

さらに、本発明は、本発明のポリペプチドを製造するための発現カセットを提供する。発現カセットは、目的遺伝子と当該目的遺伝子の転写を開始するために操作可能に結合したプロモーターの組み合わせであり、ベクターに導入して使用する。本発明において、エンテロウイルス、例えばＡ〜Ｄ群エンテロウイルス、好ましくはＡ群エンテロウイルス由来のＶＰ１〜４、プロテアーゼ及び当該プロテアーゼが認識するアミノ酸配列をコードする核酸及び当該核酸の転写を開始するプロモーターを含む発現カセットもまた、意図される。 Furthermore, the present invention provides an expression cassette for producing the polypeptide of the present invention. An expression cassette is a combination of a target gene and a promoter operably linked to initiate transcription of the target gene, and is introduced into a vector for use. In the present invention, an expression cassette containing an enterovirus, for example, group A to D enterovirus, preferably VPs 1 to 4 derived from group A enterovirus, a protease, a nucleic acid encoding an amino acid sequence recognized by the protease, and a promoter that initiates transcription of the nucleic acid. Is also intended.

本発明者らは、本発明のポリペプチドがエンテロウイルスに対する高い免疫原性を有することを見出した。したがって、本発明は、エンテロウイルス、例えばＡ〜Ｄ群エンテロウイルス、好ましくはＡ群エンテロウイルス、より好ましくはＥＶ７１、コクサッキーウイルスＡ６、コクサッキーウイルスＡ１０又はコクサッキーウイルスＡ１６、さらに好ましくはＥＶ７１Ｂ型、例えばＥＶ７１Ｂ５型に対するワクチンであって、本発明のポリペプチドを抗原として含むことを特徴とする、ワクチンを提供する。 The present inventors have found that the polypeptide of the present invention has high immunogenicity against enterovirus. Therefore, the present invention is a vaccine against enteroviruses such as group A to D enteroviruses, preferably group A enteroviruses, more preferably EV71, coxsackievirus A6, coxsackievirus A10 or coxsackievirus A16, and even more preferably EV71B type, eg EV71B5 type. Provided is a vaccine comprising the polypeptide of the present invention as an antigen.

本発明において、用語「ワクチン」は、特定の病原体、例えばウイルス、細菌等に対する免疫力を高めることができる抗原を含む医薬製剤を意味する。予防ワクチンと治療ワクチンのいずれであるかを問わないが、本発明においては、とりわけ予防ワクチンが意図される。予防ワクチンは、いまだ罹患していない対象にワクチンを投与して、特定の病原体に対する免疫応答を体内で誘発させて、病原体に対する免疫力を高めることによって、その病原体への感染や重症化を予防するための医薬製剤である。ワクチンの投与経路は、これらに限定されないが、例えば、皮下投与、皮内投与、筋肉内投与、経鼻投与、経皮投与、経口投与などがありうる。 In the present invention, the term "vaccine" means a pharmaceutical preparation containing an antigen capable of enhancing immunity against a specific pathogen such as a virus or a bacterium. It does not matter whether it is a prophylactic vaccine or a therapeutic vaccine, but in the present invention, a prophylactic vaccine is particularly intended. Prophylactic vaccines prevent infection and aggravation of a particular pathogen by administering the vaccine to an unaffected subject to elicit an immune response against the pathogen in the body and boost immunity to the pathogen. It is a pharmaceutical preparation for. The route of administration of the vaccine is not limited to these, and may include, for example, subcutaneous administration, intradermal administration, intramuscular administration, nasal administration, transdermal administration, oral administration, and the like.

本発明において、疾患は、エンテロウイルス関連疾患、例えばエンテロウイルスＡ〜Ｄ群関連疾患、典型的にはＡ群エンテロウイルス関連疾患を指し、具体的には、例えば手足口病、ヘルパンギーナ及び無菌性髄膜炎、とりわけ手足口病及びヘルパンギーナである。 In the present invention, the disease refers to an enterovirus-related disease, for example, enterovirus group A to D-related disease, typically group A enterovirus-related disease, specifically, for example, hand-foot-and-mouth disease, herpangina and aseptic meningitis. Especially hand-foot-and-mouth disease and herpangina.

本発明のワクチンは、抗原の他に、ワクチンで通常使用される添加物を含んでいてよい。かかる添加物には、担体、防腐剤及びアジュバント等が含まれる。例えば、担体には、水又は生理食塩水が含まれる。例えば、防腐剤には、フェノール、塩化ベンゼトニウム、２−フェノキシエタノール、チメロサール等が含まれる。例えば、アジュバントには、アルミニウム塩、リン酸アルミニウム、塩化アルミニウム、水酸化アルミニウム、硫酸アルミニウム、リン酸カルシウム、Ｔｏｌｌ様レセプター（ＴＬＲ）リガンド分子、ｄｓＲＮＡ、ＩＬ−１２等が含まれる。これらの添加物は、当業者であれば、投与経路等の様々な要因を考慮して、適宜選択可能である。 In addition to the antigen, the vaccine of the present invention may contain additives commonly used in vaccines. Such additives include carriers, preservatives, adjuvants and the like. For example, the carrier includes water or saline. For example, preservatives include phenol, benzethonium chloride, 2-phenoxyethanol, thimerosal and the like. For example, adjuvants include aluminum salts, aluminum phosphate, aluminum chloride, aluminum hydroxide, aluminum sulphate, calcium phosphate, Toll-like receptor (TLR) ligand molecules, dsRNA, IL-12 and the like. Those skilled in the art can appropriately select these additives in consideration of various factors such as the route of administration.

本発明のワクチンの対象は、エンテロウイルスに感染しうる動物、例えば哺乳類、例えばヒト、サル、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ等が含まれる。典型的な対象は、ヒトであり、とりわけエンテロウイルスに感染しやすい５歳未満のヒトであるが、これに限定されない。 The target of the vaccine of the present invention includes animals that can be infected with enterovirus, such as mammals, such as humans, monkeys, cows, horses, pigs, and sheep. Typical subjects are humans, especially those under the age of 5 who are susceptible to enterovirus infection, but are not limited to this.

本発明のポリペプチドは、エンテロウイルスに対する高い免疫原性を有するのみならず、動物試験において高い感染予防効果が示される。本発明のポリペプチドの免疫原性を確認するために、本発明者らは、抗原たん白質としてＶＰ１〜４を含むポリペプチドを製造し、動物への免疫を行い、中和抗体価を測定した。また、比較対象として抗原たん白質としてＶＰ０、１及び３を含むポリペプチドを製造し、同様に中和抗体価を測定した。さらに、マウスチャレンジ試験を行い、エンテロウイルスに対する感染予防効果を確認した。 The polypeptide of the present invention not only has high immunogenicity against enterovirus, but also shows a high infection-preventing effect in animal tests. In order to confirm the immunogenicity of the polypeptide of the present invention, the present inventors produced a polypeptide containing VP1 to VP1 as an antigen protein, immunized an animal, and measured the neutralizing antibody titer. .. Moreover, as a comparison target, a polypeptide containing VP0, 1 and 3 as an antigen protein was produced, and the neutralizing antibody titer was measured in the same manner. Furthermore, a mouse challenge test was conducted to confirm the effect of preventing infection against enterovirus.

詳細な手法及び結果は実施例に譲るが、本発明のポリペプチド、すなわちＶＰ１〜４を含むポリペプチドは、ＶＰ０、１及び３を含むポリペプチドと比較して、高い中和抗体誘導能を有する。したがって、本発明のポリペプチドは、エンテロウイルスに対する高い免疫原性を有し、エンテロウイルスに対するワクチンの抗原として有用である。 Although the detailed method and result are left to Examples, the polypeptide of the present invention, that is, the polypeptide containing VP1 to VP4, has a high neutralizing antibody-inducing ability as compared with the polypeptide containing VP0, 1 and 3. .. Therefore, the polypeptide of the present invention has high immunogenicity against enterovirus and is useful as a vaccine antigen against enterovirus.

エンテロウイルスの遺伝子構造を示す。The gene structure of enterovirus is shown. 不活化ワクチンのショ糖密度勾配遠心（１０〜４０％）画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びWBの結果を示す。The results of SDS-PAGE and WB of the sucrose density gradient centrifugation (10-40%) fraction of the inactivated vaccine are shown. 不活化ワクチンの中和抗体価を示す。The neutralizing antibody titer of the inactivated vaccine is shown. 不活化ワクチンのチャレンジ試験マウス生存率を示す。Challenge test of inactivated vaccine The survival rate of mice is shown. ＥＶ７１のＶＰ１〜４、２Ａ自己開裂配列、３ＣＤプロテアーゼ及びＣＭＶプロモーターを含む、ＥＶ７１のＶＬＰ発現カセットを示す。The VLP expression cassette of EV71 containing VP1-4, 2A self-cleaving sequences of EV71, 3CD protease and CMV promoter is shown. 精製済みＶＬＰのＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びWBの結果を示す。The results of SDS-PAGE and WB of purified VLP are shown. ＣＨＯ細胞発現系を用いて製造したＥＶ７１のＶＰ１〜４を含むＶＬＰのＴＥＭイメージを示す。A TEM image of a VLP containing VPs 1 to 4 of EV71 produced using a CHO cell expression system is shown. ＥＶ７１のＶＰ１〜４を含むＶＬＰ及びＥＶ７１のＶＰ０、１及び３を含む不完全粒子の中和抗体価を示す。The neutralizing antibody titers of VLPs containing VPs 1 to 4 of EV71 and incomplete particles containing VP0, 1 and 3 of EV71 are shown.

（実施例１）ＥＶ７１の不活化ウイルスの作製及び評価
１．ＥＶ７１の完全粒子形状及び不完全粒子形状の不活化ウイルスの作製
ＲＤ−Ａ細胞を用いてＥＶ７１を培養した（セルスタック、１０チャンバー、Ｃｏｒｎｉｎｇ社）。培養液中の細胞を破砕して、ウイルス液を取得した。ウイルス液を遠心分離し、濾過（０．４５μｍ→０．２２μｍ）して細胞残渣を除去した。濾液をＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社のＡＫＴＡ ｆｌｕｘ ｓ（分子量カットオフ値５００ｋDa）を用いて、限外濾過濃縮した。Ｈｉｔａｃｈｉ社の超遠心分離機ＣＰ８０ｗｘを用いてウイルス粒子のペレットを作製した。ペレットをＰＢＳ中に一晩懸濁させて再浮遊させた。次いで、懸濁液を超遠心分離機ＣＰ８０ｗｘによるショ糖密度勾配遠心法（１０〜４０％）を用いて画分を得た。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＷＢによって、完全粒子及び不完全粒子画分を確認した。結果を図２に示す。完全粒子画分は３５％前後（約１．１５ｇ／ｍＬ）の、不完全粒子画分は２５％前後（約１．１１ｇ／ｍＬ）のショ糖密度勾配に収束した。完全粒子及び不完全粒子画分をＭｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社のＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａを用いて濃縮した。ホルマリンを用いてウイルスの不活化を行い、不活化したウイルス液をＲＤ−Ａ細胞に感染させ、ＣＰＥの有無を測定することで不活化の確認を行った。 (Example 1) Preparation and evaluation of EV71 inactivated virus 1. Preparation of inactivated virus in complete and incomplete particle shape of EV71 EV71 was cultured using RD-A cells (cell stack, 10 chambers, Corning Inc.). The cells in the culture medium were crushed to obtain a virus solution. The virus solution was centrifuged and filtered (0.45 μm → 0.22 μm) to remove cell residues. The filtrate was subjected to ultrafiltration concentration using aketa flux s (molecular weight cutoff value 500 kDa) manufactured by GE Healthcare. A pellet of virus particles was prepared using a Hitachi ultracentrifuge CP80wx. The pellet was suspended overnight in PBS and resuspended. The suspension was then fractionated using a sucrose density gradient centrifugation method (10-40%) with a supercentrifuge CP80wx. Complete and incomplete particle fractions were confirmed by SDS-PAGE and WB. The results are shown in FIG. The complete particle fraction converged to a sucrose density gradient of around 35% (about 1.15 g / mL) and the incomplete particle fraction to a sucrose density gradient of around 25% (about 1.11 g / mL). Complete and incomplete particle fractions were concentrated using Amicon Ultra from Merck Millipore. The virus was inactivated using formalin, the inactivated virus solution was infected with RD-A cells, and the presence or absence of CPE was measured to confirm the inactivation.

２．ＥＶ７１の完全粒子及び不完全粒子画分の不活化ウイルスの評価
２−１． 免疫原性の評価
ＥＶ７１の完全粒子又は不完全粒子画分を含む不活化ウイルスでＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫し、血清を採取して中和抗体価を測定した。具体的には、４週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスに完全粒子画分を含む不活化ウイルス又は不完全粒子画分を含む不活化ウイルスを０．１μｇ注射してそれぞれ免疫し、６週齢及び８週齢でそれぞれ同量追加免疫した。１０週齢で全採血を行い、約０．８ｍＬの血清を得た。マウス血清を２倍段階希釈して１／２〜１／４０９６の希釈系列を作製し、各希釈系列に５×１０^３ＰＦＵ／ｍＬに調製したＥＶ７１ウイルス液を添加した後、３７℃、５％ＣＯ_２で４時間反応させてウイルスを中和した。マウス血清を含まないものをネガティブコントロールとした。前日に播種しておいたＲＤ−Ａ細胞（６ウェルプレート）に中和反応液を添加し、３７℃で、１時間、１５分おきにプレートを振盪して、ウイルスを細胞に感染させた。ウイルス液を吸引除去した後、メチルセルロースを添加して重層した。３７℃、５％ＣＯ_２で５日間培養し、メチルセルロースを吸引除去した後、１０倍希釈したホルムアルデヒド液で細胞を固定した。クリスタルバイオレットで細胞を染色して、プラーク数をカウントした。ネガティブコントロールのプラーク数を１００％として、中和反応液を添加したウェルのプラーク数が２０％以下となった最大希釈率を抗体価として算出した。結果を図３に示す。図３において、完全粒子画分の不活化ウイルスをＤ−ａｎｔｉｇｅｎ、不完全粒子画分の不活化ウイルスをＣ−ａｎｔｉｇｅｎと示す。図３より、完全粒子画分の不活化ウイルスを抗原として用いることで、不完全粒子画分の不活化ウイルスよりも高い中和抗体誘導能を有することがわかった。 2. Evaluation of inactivated viruses in the complete and incomplete particle fractions of EV71 2-1. Evaluation of immunogenicity BALB / c mice were immunized with an inactivated virus containing a complete or incomplete particle fraction of EV71, and serum was collected to measure the neutralizing antibody titer. Specifically, 4-week-old BALB / c mice were immunized with 0.1 μg of an inactivated virus containing a complete particle fraction or an inactivated virus containing an incomplete particle fraction, and immunized at 6 weeks and 8 weeks, respectively. The same amount of booster immunization was given at each week of age. All blood was collected at 10 weeks of age to obtain approximately 0.8 mL of serum. Mouse serum was serially diluted 2-fold to prepare a dilution series of 1/2 to 1/4096, and EV71 virus solution prepared at ^{5 × 10 3 PFU / mL was added to each dilution series at 37 ° C. and 5%.} The virus was neutralized by reacting with _{CO 2 for 4 hours.} Those containing no mouse serum were used as negative controls. The neutralization reaction solution was added to the RD-A cells (6-well plate) seeded the day before, and the plate was shaken at 37 ° C. for 1 hour every 15 minutes to infect the cells with the virus. After removing the virus solution by suction, methyl cellulose was added and layered. After culturing at 37 ° C. and 5% CO ₂ for 5 days, methyl cellulose was removed by suction, and then the cells were fixed with a 10-fold diluted formaldehyde solution. Cells were stained with crystal violet and the number of plaques was counted. The maximum dilution rate at which the number of plaques in the well to which the neutralization reaction solution was added was 20% or less was calculated as the antibody titer, assuming that the number of plaques in the negative control was 100%. The results are shown in FIG. In FIG. 3, the inactivated virus of the complete particle fraction is shown as D-antigen, and the inactivated virus of the incomplete particle fraction is shown as C-antigen. From FIG. 3, it was found that by using the inactivated virus of the complete particle fraction as an antigen, it has a higher neutralizing antibody-inducing ability than the inactivated virus of the incomplete particle fraction.

２−２． チャレンジ試験マウス生存率の評価
ＥＶ７１の完全粒子形状を含む不活化ウイルス及び不完全粒子形状を含む不活化ウイルスでｈＳＣＡＲＢ２発現Ｔｇ−マウスを免疫した後、ＥＶ７１を接種し、マウスの生存率を測定した。上記ｈＳＣＡＲＢ２発現Ｔｇ−マウスは、Ｋｅｎ Ｆｕｊｉｉ， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ， ２０１３ Ｓｅｐ ３；１１０（３６）：１４７５３−８に記載の手法で取得した。４週齢のｈＳＣＡＲＢ２発現Ｔｇ−マウスに完全粒子形状を含む不活化ウイルス及び不完全粒子形状を含む不活化ウイルスを０．１μｇ注射してそれぞれ免疫し、６週齢及び８週齢でそれぞれ同量追加免疫した。１０週齢で１０^６ ＣＣＩＤ_５０ のウイルスをマウス腹腔内に接種した。腹腔内接種から２週間後のマウスの生存率を図４に示す。図４において、完全粒子画分の不活化ウイルスをＤ−ａｎｔｉｇｅｎ、不完全粒子画分の不活化ウイルスをＣ−ａｎｔｉｇｅｎとした。図４より、完全粒子画分の不活化ウイルスを抗原として用いることで、不完全粒子画分の不活化ウイルスよりも高い生存率を示すことがわかった。 2-2. Challenge test Evaluation of mouse survival rate After immunizing hSCARB2-expressing Tg-mice with an inactivated virus containing a complete particle shape of EV71 and an inactivated virus containing an incomplete particle shape, EV71 was inoculated and the survival rate of the mouse was measured. .. The hSCARB2-expressing Tg-mice are described in Ken Fujii, et al. , Proc Natl Acad Sci USA, 2013 Sep 3; 110 (36): 14753-8. 4-week-old hSCARB2-expressing Tg-mice were immunized with 0.1 μg of inactivated virus containing complete particle shape and inactivated virus containing incomplete particle shape, respectively, and the same amount was obtained at 6 and 8 weeks of age, respectively. I was boosted. ¹⁰ of 6 CCID ₅₀ virus was inoculated intraperitoneally to a mouse at 10 weeks of age. The survival rate of mice 2 weeks after intraperitoneal inoculation is shown in FIG. In FIG. 4, the inactivated virus of the complete particle fraction was designated as D-antigen, and the inactivated virus of the incomplete particle fraction was designated as C-antigen. From FIG. 4, it was found that by using the inactivated virus of the complete particle fraction as an antigen, the survival rate was higher than that of the inactivated virus of the incomplete particle fraction.

（比較例１）ＥＶ７１のＶＬＰの作製及び評価（変異なし）
１．細胞発現系によるＥＶ７１のＶＬＰの作製と確認
Ｒｏｃｈｅ社のＨｉｇｈ Ｐｕｒｅ Ｖｉｒａｌ ＲＮＡ Ｋｉｔを添付の説明書に従って、ＥＶ７１からＲＮＡを抽出した。得られたＲＮＡのＰ１領域及びプロテアーゼ領域を、ＴａＫａＲａ社のＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＩＩ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＲＴ−ＰＣＲ Ｋｉｔを添付の説明書に従って、ＲＴ−ＰＣＲによって増幅した。得られた増幅ＤＮＡ断片を発現用プラスミドｐｃＤＮＡ３．４にライゲーションした。ＴａＫａＲａ社のＥ． ｃｏｌｉ ＪＭ１０９ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｃｅｌｌｓに、添付の説明書に従って、作製したプラスミドをトランスフォーメーションした後、細胞を培地に播種して増殖させた。得られた大腸菌細胞から、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のＰｌａｓｍｉｄ ＤＮＡ Ｍｉｄｉｐｒｅｐ ｋｉｔを添付の説明書に従って、ＶＬＰ発現用プラスミドを抽出した。得られたプラスミド中のＥＶ７１のＶＬＰ発現カセットを図５に示す。ＶＬＰ発現カセットには、ＥＶ７１のＰ１、２Ａ自己開裂配列、３ＣＤプロテアーゼ及びＣＭＶプロモーターが含まれる。 (Comparative Example 1) Preparation and evaluation of EV71 VLP (no mutation)
1. 1. Preparation and Confirmation of VLP of EV71 by Cell Expression System RNA was extracted from EV71 according to the attached instruction manual for High Pure Virus RNA Kit of Roche. The P1 region and protease region of the obtained RNA were amplified by RT-PCR of TaKaRa's PrimeScript II High Fidelity RT-PCR Kit according to the attached instructions. The obtained amplified DNA fragment was ligated to the expression plasmid pcDNA3.4. TaKaRa's E.I. The prepared plasmid was transformed into E. coli JM109 Competent Cells according to the attached instructions, and then the cells were seeded in a medium and grown. From the obtained Escherichia coli cells, a plasmid for expressing VLP was extracted from Invitrogen's plasmid DNA Midiprep kit according to the attached instructions. The VLP expression cassette of EV71 in the obtained plasmid is shown in FIG. The VLP expression cassette contains a P1, 2A self-cleaving sequence of EV71, a 3CD protease and a CMV promoter.

Ｔｈｅｒｍｏ社のＥｘｐｉＣＨＯ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍを使用して、ＶＬＰを作製した。具体的には、ＥｘｐｉＣＨＯ−Ｓ細胞をＥｘｐｉＣＨＯ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍで所定の細胞密度に達するまで培養した。培養したＥｘｐｉＣＨＯ−Ｓ細胞にＯｐｔｉＰＲＯ ＳＦＭ Ｃｏｍｐｌｅｘａｔｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍで希釈したＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ ＣＨＯ Ｒｅａｇｅｎｔ及びＶＬＰ発現用プラスミドを加えて、トランスフェクションした。トランスフェクションした細胞をＥｘｐｉＣＨＯ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍで培養し、ＥｘｐｉＣＨＯ Ｆｅｅｄ及びＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ ＣＨＯ Ｅｎｈａｎｃｅｒを添加し、さらに培養を続けた。培養期間中、細胞生存率を確認し、トランスフェクションから８日後に、培養を停止し、回収した。得られた培養液を遠心分離して細胞と上清を分離し、上清を回収して、フィルター濾過した（０．２２μｍ）。得られた上清を、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社のＡＫＴＡ ｆｌｕｘ ｓを分子量カットオフ値５００ｋDaで用いて、限外濾過濃縮した。Ｈｉｔａｃｈｉ社の超遠心分離機ＣＰ８０ｗｘを用いてＶＬＰのペレットを作製した。 VLPs were made using Thermo CHO Expression System. Specifically, ExpiCHO-S cells were cultured in ExpiCHO Expression Medium until a predetermined cell density was reached. The cultured ExpiCHO-S cells were transfected with ExpiFectamine CHO Reagent diluted with OptiPRO SFM Transfection Medium and a plasmid for VLP expression. Transfected cells were cultured in ExpiCHO Expression Medium, ExpiCHO Feed and ExpiFectamine CHO Enhancer were added, and the culture was continued. During the culture period, cell viability was confirmed, and 8 days after transfection, the culture was stopped and recovered. The obtained culture solution was centrifuged to separate the cells and the supernatant, and the supernatant was collected and filtered by a filter (0.22 μm). The resulting supernatant was ultrafiltered and concentrated using GE Healthcare's AKTA flux s with a molecular weight cutoff value of 500 kDa. VLP pellets were prepared using a Hitachi ultracentrifuge CP80wx.

ＶＬＰのペレットをＰＢＳ中に一晩懸濁させて再浮遊させた。さらに、懸濁液を超遠心分離機ＣＰ８０ｗｘによるショ糖密度勾配遠心（１０〜４０％）にかけて分画を行い、各画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＷＢにかけて、ＶＬＰ画分を確認した。結果を図６のＬａｎｅ２と４に示す。これより、当該ＶＬＰ画分には、開裂前のＶＰ０を多く含むことがわかった。 VLP pellets were suspended overnight in PBS and resuspended. Further, the suspension was subjected to sucrose density gradient centrifugation (10 to 40%) by an ultracentrifuge CP80wx to perform fractionation, and each fraction was subjected to SDS-PAGE and WB to confirm the VLP fraction. The results are shown in Lines 2 and 4 of FIG. From this, it was found that the VLP fraction contained a large amount of VP0 before cleavage.

２．細胞発現系によるＥＶ７１のＶＬＰの免疫原性の評価
作製したＶＬＰを用いて、実施例１の２−１．と同様の手法にて中和抗体価を測定した。結果を図８のＥＶ７１ ＶＬＰ（ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ）に示す。図３と比較すると、作製したＶＬＰは不完全粒子画分と同等程度の中和抗体価を示し、完全形状粒子画分よりも低い中和抗体価を示すことがわかった。 2. Evaluation of Immunogenicity of EV71 VLP by Cell Expression System Using the prepared VLP, Example 1 2-1. The neutralizing antibody titer was measured by the same method as in the above. The results are shown in EV71 VLP (wild type) of FIG. Compared with FIG. 3, it was found that the prepared VLP showed a neutralizing antibody titer equivalent to that of the incomplete particle fraction and a neutralizing antibody titer lower than that of the complete particle fraction.

（実施例２）ＥＶ７１のＶＬＰの作製及び評価（変異あり）
１．細胞発現系によるＥＶ７１のＶＬＰの作製と確認
インバースＰＣＲ法によって、プラスミドにおいて、Ｐ１（ｖｉｒａｌ ｃａｐｓｉｄ）ｒｅｇｉｏｎ内のＶＰ４−ＶＰ２間にＧｌｎ−Ｇｌｙ変異を挿入した。具体的には、EV７１の遺伝子配列情報を元に、当該箇所に変異を挿入するためのプライマーを設計した。ＴａＫａＲａ ＢＩＯ社のＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＩＩ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＲＴ−ＰＣＲ Ｋｉｔを使用して、添付の説明書に従って逆転写反応及びＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応は９８℃（１０ｓｅｃ）→６０℃（１５ｓｅｃ）→６８℃（７．５ｍｉｎ）を３０サイクル繰り返した。変異未導入のプラスミドをDｐｎIを用いて分解した後、ＴａＫａＲａ ＢＩＯ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社のＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔを使用して、添付の説明書に従ってＰＣＲ産物を処理した（５０℃、１５ｍｉｎ）。その後、大腸菌へのトランスフォーメーションを行った。上記以外は比較例１の１．と同様の手法にて、ＶＬＰを作製した。 (Example 2) Preparation and evaluation of VLP of EV71 (with mutation)
1. 1. Preparation and Confirmation of EV71 VLP by Cell Expression System A Gln-Gly mutation was inserted between VP4-VP2 in a P1 (virus capsid) region in a plasmid by inverse PCR. Specifically, based on the gene sequence information of EV71, a primer for inserting a mutation at the site was designed. A reverse transcription reaction and a PCR reaction were carried out using a PrimeScript II High Fidelity RT-PCR Kit manufactured by TakaRa BIO Inc. according to the attached instructions. The PCR reaction was repeated 30 cycles of 98 ° C. (10 sec) → 60 ° C. (15 sec) → 68 ° C. (7.5 min). After degrading the non-mutated plasmid with DpnI, the PCR product was treated with the In-Fusion HD Cloning Kit from TakaRa BIO Cloning, Inc. according to the attached instructions (50 ° C., 15 min). After that, it was transformed into Escherichia coli. Other than the above, 1. A VLP was prepared in the same manner as in the above.

作製したＶＬＰ画分をＭｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社のＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａを用いて濃縮した。透過電子顕微鏡でＶＬＰの粒子構造を確認した（図７）。また、比較例１の１．と同様の手法で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びWBによる確認を行った。結果を図６のＬａｎｅ１と３に示す。図６より、Ｇｌｎ−Ｇｌｙ変異を挿入することでＶＰ０からＶＰ２とＶＰ４への開裂が促進されることを見出した。 The prepared VLP fractions were concentrated using Amicon Ultra from Merck Millipore. The particle structure of the VLP was confirmed with a transmission electron microscope (Fig. 7). In addition, 1. Confirmation by SDS-PAGE and WB was performed by the same method as above. The results are shown in Lanes 1 and 3 of FIG. From FIG. 6, it was found that insertion of the Gln-Gly mutation promotes cleavage from VP0 to VP2 and VP4.

２．細胞発現系によるＥＶ７１のＶＬＰの免疫原性の評価
作製したＶＬＰを用いて、実施例１の２−１．と同様の手法にて中和抗体価を測定した。結果を図８のＥＶ７１ ＶＬＰ（ＶＰ０ 切断型）に示す。これより、変異を導入することで高い中和抗体価が誘導されることを見出した。



2. Evaluation of Immunogenicity of EV71 VLP by Cell Expression System Using the prepared VLP, Example 1 2-1. The neutralizing antibody titer was measured by the same method as in the above. The results are shown in EV71 VLP (VP0 cut type) of FIG. From this, it was found that the introduction of mutation induces a high neutralizing antibody titer.

Claims (17)

エンテロウイルス由来のＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３及びＶＰ４を含むポリペプチドであって、当該ＶＰ２とＶＰ４の結合部位にプロテアーゼが認識するアミノ酸配列を含むポリペプチド。 A polypeptide containing VP1, VP2, VP3 and VP4 derived from enterovirus, which contains an amino acid sequence recognized by a protease at the binding site between VP2 and VP4. 前記プロテアーゼが３Ｃ又は３ＣＤプロテアーゼである、請求項１に記載のポリペプチド。 The polypeptide of claim 1, wherein the protease is a 3C or 3CD protease. 前記プロテアーゼが認識するアミノ酸配列が、グルタミン及びグリシンが連続した配列である、請求項２に記載のポリペプチド。 The polypeptide according to claim 2, wherein the amino acid sequence recognized by the protease is a sequence in which glutamine and glycine are continuous. エンテロウイルス由来のＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３及びＶＰ４を含むポリペプチドであって、ＶＰ２のＮ末端にグリシン及びＶＰ４のＣ末端にグルタミンを含む、請求項１〜３のいずれかに記載のポリペプチド。 The polypeptide according to any one of claims 1 to 3, which is a polypeptide containing VP1, VP2, VP3 and VP4 derived from enterovirus and containing glycine at the N-terminal of VP2 and glutamine at the C-terminal of VP4. ウイルス様粒子である、請求項１〜４のいずれかに記載のポリペプチド。 The polypeptide according to any one of claims 1 to 4, which is a virus-like particle. エンテロウイルス由来のＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３及びＶＰ４を含み、エンテロウイルスＶＰ０を実質的に含まない、ポリペプチド。 A polypeptide comprising VP1, VP2, VP3 and VP4 derived from enterovirus and substantially free of enterovirus VP0. 不活化全粒子である、請求項６に記載のポリペプチド。 The polypeptide of claim 6, which is an inactivated whole grain. エンテロウイルスがＡ〜Ｄ群のいずれかのエンテロウイルスである、請求項１〜７のいずれかに記載のポリペプチド。 The polypeptide according to any one of claims 1 to 7, wherein the enterovirus is any enterovirus of the groups A to D. エンテロウイルスがＡ群エンテロウイルスである、請求項８に記載のポリペプチド。 The polypeptide according to claim 8, wherein the enterovirus is a group A enterovirus. Ａ群エンテロウイルスが、エンテロウイルス７１（ＥＶ７１）又はコクサッキーウイルスＡ６又はコクサッキーウイルスＡ１０又はコクサッキーウイルスＡ１６である、請求項９に記載のポリペプチド。 The polypeptide according to claim 9, wherein the group A enterovirus is enterovirus 71 (EV71) or coxsackievirus A6 or coxsackievirus A10 or coxsackievirus A16. ＥＶ７１が、エンテロウイルスＢ型である、請求項１０に記載のポリペプチド。 The polypeptide according to claim 10, wherein EV71 is enterovirus type B. ＥＶ７１Ｂ型が、ＥＶ７１Ｂ５型である、請求項１１に記載のポリペプチド。 The polypeptide according to claim 11, wherein the EV71B type is the EV71B5 type. エンテロウイルスに対するワクチンであって、請求項１〜１２のいずれかに記載のポリペプチドを抗原として含むワクチン。 A vaccine against enterovirus, which comprises the polypeptide according to any one of claims 1 to 12 as an antigen. Ａ群エンテロウイルスに対するワクチンである、請求項１３に記載のワクチン。 The vaccine according to claim 13, which is a vaccine against group A enterovirus. ＥＶ７１に対するワクチンである、請求項１３に記載のワクチン。 The vaccine according to claim 13, which is a vaccine against EV71. ＥＶ７１Ｂ型に対するワクチンである、請求項１３に記載のワクチン。 The vaccine according to claim 13, which is a vaccine against EV71B type. ＥＶ７１Ｂ５型に対するワクチンである、請求項１３に記載のワクチン。

The vaccine according to claim 13, which is a vaccine against EV71B5 type.

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