JP2021070634A - Enterovirus vaccine - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、エンテロウイルスに対するワクチンに関するものである。 The present invention relates to a vaccine against enterovirus.
エンテロウイルスは、ピコルナウイルス科に属する一本鎖RNAウイルスであり、人に感染するものとしてエンテロウイルスA〜Dの群が挙げられる。エンテロウイルスにはポリオウイルス、コクサッキーウイルスA群、コクサッキーウイルスB群、エコーウイルス及びその他のエンテロウイルスが含まれる。
エンテロウイルスA群にはコクサッキーウイルスA2〜8、10、12、14、16及びエンテロウイルス71(以下、EV71)が含まれる。エンテロウイルスB群にはコクサッキーウイルスA9、コクサッキーウイルスB1〜6、エコーウイルス1〜33及びエンテロウイルス69が含まれる。エンテロウイルスC群にはポリオウイルス、コクサッキーウイルスA1、11、13、15、17〜22及び24が含まれる。エンテロウイルスD群にはエンテロウイルス68及び70が含まれる。
エンテロウイルスが様々な疾患を引き起こすことはよく知られており、かかる疾患の代表的なものとしては手足口病、ヘルパンギーナ、無菌性髄膜炎などが挙げられる。エンテロウイルスの中でもとりわけEV71及びコクサッキーウイルスA群は、手足口病の主要な原因ウイルスとして知られている。また、エンテロウイルスの中でもとりわけコクサッキーウイルスA群、EV71、コクサッキーウイルスB群及びエコーウイルスは、ヘルパンギーナの主要な原因ウイルスとして知られている。無菌性髄膜炎は、エコーウイルス、コクサッキーウイルスA群、B群及びEV71などのエンテロウイルスのほか、寄生虫など幅広い病原体によって引き起こされる。
Enterovirus is a single-stranded RNA virus belonging to the family Picornavirus, and examples of those that infect humans include enteroviruses A to D. Enteroviruses include poliovirus, coxsackievirus A group, coxsackievirus B group, echovirus and other enteroviruses.
Enterovirus A group includes Coxsackievirus A2-8, 10, 12, 14, 16 and enterovirus 71 (hereinafter, EV71). The enterovirus B group includes coxsackievirus A9, coxsackievirus B1-6, echovirus 1-33, and enterovirus 69. Enterovirus group C includes poliovirus, coxsackievirus A1, 11, 13, 15, 17-22 and 24. Enterovirus D group includes
It is well known that enteroviruses cause various diseases, and typical such diseases include hand-foot-and-mouth disease, herpangina, and aseptic meningitis. Among enteroviruses, EV71 and Coxsackievirus A group are known as major causative viruses of hand-foot-and-mouth disease. Among the enteroviruses, Coxsackievirus A group, EV71, Coxsackievirus B group and echovirus are known as major causative viruses of herpangina. Aseptic meningitis is caused by a wide range of pathogens such as echoviruses, coxsackievirus groups A, B and EV71, as well as parasites.
コクサッキーウイルスA群には例えばA1〜22型及び24型が含まれており、それぞれ異なる疾患及び症状を引き起こしうる。コクサッキーウイルスB群には例えば1〜6型が含まれる。エコーウイルスにはエコー1〜7型、9型、11〜27型、29〜31型が含まれる。その他のエンテロウイルスにはエンテロウイルス68〜71型が含まれる。それぞれの遺伝子型にはさらにサブ遺伝子型が含まれ、例えばEV71にはプロトタイプ株であるBrCrのみからなるA型、C1〜C5型及びB1〜B5型が知られている。
Coxsackievirus A group includes, for example, types A1 to 22 and 24, which can cause different diseases and symptoms, respectively. The Coxsackievirus B group includes, for example,
手足口病は、一般的には、手、足、口などに水疱性の発疹があらわれる軽症疾患として知られており、小児が夏頃に発症することが多い。手足口病の主な感染経路は、飛沫感染及び糞口感染である。手足口病は東アジアを中心に報告されており、例えば、中国では2016年に約200万人、日本では2015年に約50万人の患者が報告されている。ほとんどの手足口病患者の予後は良好であるが、まれに中枢神経合併症、例えば無菌性髄膜炎、急性脳炎又は肺水腫などが生じて、重症化又は死亡する例もみられる。このような合併症が生じるのは、EV71によって引き起こされた手足口病である場合が多い。また、小児だけでなく成人の手足口病も報告されており、成人の場合には重症化することが多い。しかしながら、手足口病に対する治療方法はいまだ確立されておらず、ワクチンによる予防が東アジア各国を中心に検討又は実施されている。日本でも、手足口病の予防に有効なワクチンは、公衆衛生上の問題として厚生科学審議会で開発優先度の高いワクチンの一つとして指定されている。 Hand-foot-and-mouth disease is generally known as a mild disease in which a bullous rash appears on the hands, feet, mouth, etc., and often develops in children in the summer. The main transmission routes for hand-foot-and-mouth disease are droplet infection and fecal-oral infection. Hand-foot-and-mouth disease has been reported mainly in East Asia. For example, in China, about 2 million cases were reported in 2016, and in Japan, about 500,000 cases were reported in 2015. Most patients with hand-foot-and-mouth disease have a good prognosis, but in rare cases, central nervous system complications such as aseptic meningitis, acute encephalitis, or pulmonary edema occur, resulting in severe or death. Such complications often occur in hand-foot-and-mouth disease caused by EV71. In addition, hand-foot-and-mouth disease has been reported not only in children but also in adults, and it often becomes severe in adults. However, a treatment method for hand-foot-and-mouth disease has not yet been established, and vaccine prevention is being investigated or implemented mainly in East Asian countries. In Japan as well, vaccines that are effective in preventing hand-foot-and-mouth disease have been designated as one of the high-priority development vaccines by the Health Science Council as a public health issue.
ヘルパンギーナは、一般的には、発熱と口腔粘膜にあらわれる水疱性の発疹を特徴とした急性のウイルス性咽頭炎として知られており、乳幼児を中心に夏季に流行することが多い。ヘルパンギーナの主な感染経路は、飛沫感染及び糞口感染である。ヘルパンギーナに対する治療方法もいまだ確立されておらず、ワクチンなどによる予防が期待されている。 Herpangina is generally known as acute viral pharyngitis characterized by fever and a bullous rash that appears on the oral mucosa, and is often prevalent in summer, especially in infants. The main transmission routes of Herpangina are droplet infection and fecal-oral infection. A treatment method for herpangina has not yet been established, and prevention with vaccines is expected.
無菌性髄膜炎は、発熱、頭痛、嘔吐のいわゆる3主徴をみとめ、後部硬直、Kernig徴候などの髄膜刺激徴候が存在すること、髄液一般検査で定型的な所見を得ること、髄液の塗抹、細菌培養で細菌を検出しないことにより診断がなされる症候群である。エンテロウイルス以外の様々なウイルスなどによっても無菌性髄膜炎が引き起こされることが知られているものの、主たる原因は、エンテロウイルス、特にエコーウイルス及びコクサッキーウイルスである。感染経路や疫学的性質は病原体に依存するが、エンテロウイルスに起因する無菌性髄膜炎の場合には、手足口病などと同様に、夏頃に小児を中心に、飛沫感染及び糞口感染により流行する。無菌性髄膜炎に対する有効な治療方法はいまだ確立されておらず、ワクチンなどによる予防が期待されている。 Aseptic meningitis has the so-called three main signs of fever, headache, and vomiting, the presence of signs of meningism such as posterior stiffness and Kernig's sign, the presence of typical findings on a general cerebrospinal fluid test, and the spinal cord. It is a syndrome that is diagnosed by not detecting bacteria by smearing fluid or culturing bacteria. Although it is known that aseptic meningitis is caused by various viruses other than enterovirus, the main cause is enterovirus, particularly echovirus and coxsackievirus. The infection route and epidemiological properties depend on the pathogen, but in the case of aseptic meningitis caused by enterovirus, as in the case of hand-foot-and-mouth disease, droplet infection and fecal-oral infection occur mainly in children around summer. It becomes popular. An effective treatment method for aseptic meningitis has not yet been established, and prevention with a vaccine or the like is expected.
ウイルス性疾患に対する予防法としてのワクチンの有効性は、ポリオウイルスに対するワクチンなどの前例から、広く認められている。ワクチンの候補としては、一般的には、弱毒化株、全粒子を初めとする不活化ウイルス、ウイルス様粒子(Virus Like Particle、以下「VLP」)、組換えタンパク質、組換えベクター及びペプチドなどが知られている。エンテロウイルスに対するワクチンについても、すでに様々な研究及び報告がなされている。例えば、非特許文献1及び非特許文献2にはエンテロウイルスをホルマリンで不活化したワクチンが報告されている。特許文献1にはエンテロウイルスのVP0〜4を含むVLPが報告されている。特許文献2にはエンテロウイルス粒子及びその製造法が報告されている。特許文献3にはエンテロウイルスを含む多様なウイルスのVLPの製造法が報告されている。非特許文献3にはEV71のF粒子の免疫原性が報告されている。非特許文献4にはEV71不活化ワクチン投与後の、EV71遺伝子型間の交差性が報告されている。非特許文献5にはEV71のVP1〜3を含むVLPがエンテロウイルスに対するワクチンとして報告されている。
The effectiveness of vaccines as a preventative measure against viral diseases has been widely recognized from precedents such as vaccines against poliovirus. Vaccine candidates generally include attenuated strains, inactivated viruses including whole particles, virus-like particles (hereinafter referred to as "VLP"), recombinant proteins, recombinant vectors and peptides. Are known. Various studies and reports have already been made on vaccines against enteroviruses. For example, Non-Patent
EV71は、直径20〜30nmの非エンベロープウイルスカプシドの内部に約7.4kbの一本鎖RNAが封入された構造を有しており、該カプシドは4つの異なる構造タンパク質(VP1〜4)のコピー60個からなる。4つの構造タンパク質がアセンブルしてプロトマーを形成し、5つのプロトマーがアセンブルしてペンタマーを形成し、12個のペンタマーとウイルスゲノムがビリオンを構成する。EV71のサブ遺伝子型は、主にVP1における変異などによって定められている(非特許文献6)。 EV71 has a structure in which a single-stranded RNA of about 7.4 kb is encapsulated inside a non-enveloped virus capsid having a diameter of 20 to 30 nm, and the capsid is a copy of four different structural proteins (VP1 to 4). It consists of 60 pieces. Four structural proteins assemble to form a protomer, five protomers assemble to form a pentamer, and twelve pentamers and the viral genome make up a virion. The sub-genotype of EV71 is mainly determined by mutations in VP1 (Non-Patent Document 6).
本発明は、エンテロウイルスに対するワクチンに関する。具体的には、本発明は、エンテロウイルスに対して免疫原性を示すポリペプチド、当該ポリペプチドの製造方法、当該ポリペプチドを含むエンテロウイルスに対するワクチン及び当該ポリペプチドを用いたエンテロウイルス関連疾患の予防方法を提供する。より具体的には、本発明のポリペプチドは、エンテロウイルス由来のVP1、VP2、VP3及びVP4を含むポリペプチドである。 The present invention relates to a vaccine against enterovirus. Specifically, the present invention describes a polypeptide exhibiting immunogenicity against enterovirus, a method for producing the polypeptide, a vaccine against enterovirus containing the polypeptide, and a method for preventing enterovirus-related diseases using the polypeptide. provide. More specifically, the polypeptide of the present invention is a polypeptide containing VP1, VP2, VP3 and VP4 derived from enterovirus.
ワクチンの有効性は、一般に、免疫原性によって評価される。すでに実用化されているEV71に対するワクチンとして、例えばSinovac社のInliveが挙げられる。しかしながら手足口病を初めとするエンテロウイルスによって引き起こされる疾患の流行状況を鑑みると、エンテロウイルスに対して高い免疫原性を示すことが求められている。加えて、実用的なワクチンとしては、マウスモデルなどを用いた動物実験で高い感染予防効果が示されることがより望ましい。 Vaccine efficacy is generally assessed by immunogenicity. Examples of vaccines against EV71 that have already been put into practical use include Inlive from CoronaVac. However, in view of the epidemic situation of diseases caused by enteroviruses such as hand-foot-and-mouth disease, it is required to show high immunogenicity against enteroviruses. In addition, as a practical vaccine, it is more desirable that a high infection-preventing effect is shown in animal experiments using a mouse model or the like.
本発明者らは、上記の課題に鑑みて、高い免疫原性を有するワクチンを製造した。具体的には、エンテロウイルスの構造、特にVP0がVP2とVP4に開裂することに着目し、当該開裂が免疫原性に影響を与えることを見出した。すなわち、免疫原性を示すポリペプチドとしてVP2とVP4を多く含むワクチンを設計することが、高い免疫原性を示すワクチンの提供につながると考えた。エンテロウイルス由来のVP1、VP2、VP3及びVP4を含むポリペプチドを製造し、このポリペプチドがエンテロウイルスに対する免疫原として高い効果を有することを確認して、本発明をなした。 In view of the above problems, the present inventors have produced a vaccine having high immunogenicity. Specifically, we focused on the structure of enterovirus, in particular, that VP0 cleaves into VP2 and VP4, and found that the cleaving affects immunogenicity. That is, it was considered that designing a vaccine containing a large amount of VP2 and VP4 as a polypeptide showing immunogenicity would lead to the provision of a vaccine showing high immunogenicity. A polypeptide containing VP1, VP2, VP3 and VP4 derived from enterovirus was produced, and it was confirmed that this polypeptide has a high effect as an immunogen against enterovirus, and the present invention was made.
以下に本発明の詳細な説明をするが、本明細書において用いられる用語は、微生物学、生化学、分子生物学、医学及び薬学分野における一般的な定義に従って理解される。ただし、本明細書において特に説明又は定義されている用語については、本明細書における説明又は定義が優先する。また、本明細書中に引用されている文献については、参照により本明細書の一部とする。 Although the present invention will be described in detail below, the terms used herein are understood according to general definitions in the fields of microbiology, biochemistry, molecular biology, medicine and pharmacy. However, with respect to terms specifically explained or defined herein, the description or definition herein supersedes. References cited herein are incorporated herein by reference.
第一の態様において、本発明は、エンテロウイルス由来のVP1、VP2、VP3及びVP4を含むポリペプチドであって、当該VP2とVP4の結合部位にプロテアーゼが認識するアミノ酸配列を含むことを特徴とするポリペプチドを提供する。 In a first aspect, the present invention is a polypeptide containing VP1, VP2, VP3 and VP4 derived from enterovirus, wherein the binding site between VP2 and VP4 contains an amino acid sequence recognized by a protease. Provides peptides.
エンテロウイルスには、ポリオウイルス、コクサッキーウイルスA群、コクサッキーウイルスB群、エコーウイルス及びその他のエンテロウイルスが含まれるが、とりわけ本発明においては、エンテロウイルスであるA〜D群エンテロウイルス、特にA群エンテロウイルスを主題とする。本発明は、特に手足口病、ヘルパンギーナ及び無菌性髄膜炎などのエンテロウイルス関連疾患の原因であるウイルス、例えば、コクサッキーウイルスA群、コクサッキーウイルスB群、エコーウイルス及びEV71を主題としている。より具体的には、本発明は、手足口病の原因であるエンテロウイルス、例えばコクサッキーウイルスA群及びEV71、とりわけコクサッキーウイルスA6、10及び16及びEV71に関する。さらに本発明は、ヘルパンギーナの原因であるエンテロウイルス、例えばコクサッキーウイルスA群、EV71、コクサッキーウイルスB群及びエコーウイルス、特にコクサッキーウイルスA群、例えばコクサッキーウイルスA2、3、4、5、6及び10に関する。特に本発明は、近年日本において手足口病の主たる原因となっているEV71B型、例えばEV71B5型に関する。 Enteroviruses include poliovirus, coxsackievirus A group, coxsackievirus B group, echovirus and other enteroviruses, and in particular, in the present invention, enteroviruses A to D group enteroviruses, particularly group A enteroviruses are the subjects. The present invention is particularly focused on viruses responsible for enterovirus-related diseases such as hand-foot-and-mouth disease, herpangina and aseptic meningitis, such as coxsackievirus group A, coxsackievirus group B, echovirus and EV71. More specifically, the present invention relates to enteroviruses responsible for hand-foot-and-mouth disease, such as coxsackievirus group A and EV71, especially coxsackievirus A6, 10 and 16 and EV71. Furthermore, the present invention relates to enteroviruses that cause herpangina, such as coxsackievirus A group, EV71, coxsackievirus B group and echovirus, especially coxsackievirus A group, such as coxsackievirus A2, 3, 4, 5, 6 and 10. In particular, the present invention relates to EV71B type, for example, EV71B5 type, which has been a major cause of hand-foot-and-mouth disease in Japan in recent years.
エンテロウイルスには、図1に示すようにP1と呼ばれる構造たん白質をコードする領域とP2及びP3と呼ばれる非構造たん白質をコードする領域が存在する。例えばEV71は、約7.4kbのRNAゲノム長を有する。P1はウイルスカプシドに該当し、当該領域はウイルスプロテアーゼによるプロセシングを受けることで、VP0〜4のウイルスたん白質に開裂する。エンテロウイルスのカプシドは、プロカプシドと呼ばれるVP0、1及び3の構造タンパク質から形成される場合やVP0がVP2と4に開裂し、VP1〜4の構造タンパク質から形成される場合がある。本明細書において、前者を不完全粒子形状のウイルス、後者を完全粒子形状のウイルスと呼ぶ。 As shown in FIG. 1, the enterovirus has a region encoding a structural protein called P1 and a region encoding a non-structural protein called P2 and P3. For example, EV71 has an RNA genome length of about 7.4 kb. P1 corresponds to a viral capsid, and the region is cleaved into viral proteins of VP0-4 by being processed by a viral protease. Enterovirus capsids may be formed from structural proteins of VP0, 1 and 3 called procapsids, or VP0 may be cleaved into VP2 and 4 and formed from structural proteins of VP1-4. In the present specification, the former is referred to as an incomplete particle-shaped virus, and the latter is referred to as a perfect particle-shaped virus.
エンテロウイルスのVP0、VP1、VP2、VP3及びVP4のアミノ酸配列及びそれらをコードする塩基配列は既知であり、DNA Data Bank of Japan(DDBJ)、EMBL−Bank/EBI、GenBank/National Center for Biotechnology Information(以下、NCBI)などのデータベースから容易に入手可能である。例えばEV71のBrCrの配列情報は、NCBI登録番号U22521から入手可能である。 The amino acid sequences of VP0, VP1, VP2, VP3 and VP4 of the enterovirus and the base sequences encoding them are known, and DNA Data Bank of Japan (DDBJ), EMBL-Bank / EBI, GenBank / National Center for Biotechnology Information , NCBI) and the like. For example, the sequence information of BrCr of EV71 can be obtained from NCBI registration number U22521.
本発明において、用語「由来の」とは、対象物が元のウイルスと免疫学的な相同性を有すること、又は元のウイルスのアミノ酸配列と一定の相同性を示すことを意味し、製造方法に縛られるものではないと理解すべきである。免疫学的な相同性とは、元のウイルスに対する免疫反応が対象物に対しても同様に惹起されることを示す。免疫学的な相同性を確認する方法は、当業者に利用可能なあらゆる手段であってよく、これらに限定されない。一般的には、対象物が発現を誘導する抗体が元のウイルスを中和しうるかどうか、すなわち対象物が発現を誘導する中和抗体を測定することで確認することができる。例えばエンテロウイルス「由来の」との記載は、エンテロウイルスに対する免疫反応が対象物に対しても同様に惹起されること、又はエンテロウイルスのアミノ酸配列と一定の相同性、例えばエンテロウイルスとして微生物学上理解される程度の相同性を有することを意味する。アミノ酸配列と一定の相同性とは、典型的には80%以上、好ましくは90%以上、例えば95%以上、好ましくは96%以上、より好ましくは97%以上、さらに好ましくは98%以上、最適には99%以上の相同性を有することを意味する。相同性の検定には当業者が通常利用可能なあらゆる検定方法を利用可能であるが、例えばBLASTを初期設定のパラメーターで用いることができる。 In the present invention, the term "derived" means that the object has immunological homology with the original virus or shows a certain homology with the amino acid sequence of the original virus, and the production method. It should be understood that it is not tied to. Immunological homology indicates that an immune response to the original virus is elicited to the subject as well. Methods of confirming immunological homology may be, but are not limited to, any means available to those of skill in the art. In general, it can be confirmed whether the antibody whose expression is induced by the object can neutralize the original virus, that is, by measuring the neutralizing antibody whose expression is induced by the object. For example, the description of enterovirus "derived" means that an immune response to enterovirus is similarly elicited to an object, or a certain degree of homology with the amino acid sequence of enterovirus, for example, to the extent that it is microbiologically understood as enterovirus. It means having the homology of. The amino acid sequence and constant homology are typically 80% or higher, preferably 90% or higher, for example 95% or higher, preferably 96% or higher, more preferably 97% or higher, still more preferably 98% or higher, optimal. Means having 99% or more homology. Any test method commonly available to those of skill in the art can be used for the test of homology, for example BLAST can be used with the default parameters.
一例をあげると、エンテロウイルス由来のVP1であるといえるためには、まず、問題となっているポリペプチドのアミノ酸配列が、NCBIから取得したいずれかのエンテロウイルスのVP1のアミノ酸配列と初期設定パラメーターを用いたBLASTで一定の相同性、例えばエンテロウイルスとして微生物学上理解される程度の相同性を有することを意味し、典型的には80%以上、好ましくは90%以上、例えば95%以上、好ましくは96%以上、より好ましくは97%以上、さらに好ましくは98%以上、最適には99%以上の相同性を有することを意味する。 To give an example, in order to be able to say that it is VP1 derived from enterovirus, first, the amino acid sequence of the polypeptide in question uses the amino acid sequence of VP1 of any enterovirus obtained from NCBI and the initial setting parameters. It means that it has a certain degree of homology in BLAST, for example, a degree of homology that is microbiologically understood as an enterovirus, and is typically 80% or more, preferably 90% or more, for example 95% or more, preferably 96. It means that it has a homology of% or more, more preferably 97% or more, further preferably 98% or more, and optimally 99% or more.
あるアミノ酸を、同様の疎水性指数を有する他のアミノ酸により置換して、そして依然として同様の生物学的機能を有するタンパク質(例えば、酵素活性において等価なタンパク質。以下、「生物学的等価体」)を生じさせ得ることが当該分野で周知である。このようなアミノ酸置換において、疎水性指数が±2以内であることが好ましく、±1以内であることがより好ましく、±0.5以内であることがさらにより好ましい。疎水性に基づくこのようなアミノ酸の置換は効率的であることが当該分野において理解される。親水性指標もまた、生物学的等価体の作製において考慮される。米国特許第4、554、101号に記載されるように、以下の親水性指数がアミノ酸残基に割り当てられている:アルギニン(+3.0);リジン(+3.0);アスパラギン酸(+3.0±1);グルタミン酸(+3.0±1);セリン(+0.3);アスパラギン(+0.2);グルタミン(+0.2);グリシン(0);スレオニン(−0.4);プロリン(−0.5±1);アラニン(−0.5);ヒスチジン(−0.5);システイン(−1.0);メチオニン(−1.3);バリン(−1.5);ロイシン(−1.8);イソロイシン(−1.8);チロシン(−2.3);フェニルアラニン(−2.5);トリプトファン(−3.4)。このようなアミノ酸置換において、親水性指数が±2以内であることが好ましく、±1以内であることがより好ましく、±0.5以内であることがさらにより好ましい。 A protein in which one amino acid is replaced by another amino acid having a similar hydrophobicity index and still has a similar biological function (eg, a protein equivalent in enzymatic activity; hereinafter, "biological equivalent"). Is well known in the art. In such amino acid substitutions, the hydrophobicity index is preferably within ± 2, more preferably within ± 1, and even more preferably within ± 0.5. It is understood in the art that such substitutions of amino acids based on hydrophobicity are efficient. Hydrophilicity indicators are also considered in the production of bioequivalents. The following hydrophilicity indices are assigned to amino acid residues as described in US Pat. Nos. 4,554,101: arginine (+3.0); lysine (+3.0); aspartic acid (+3. 0 ± 1); glutamic acid (+3.0 ± 1); serine (+0.3); aspartic acid (+0.2); glutamine (+0.2); glycine (0); threonine (-0.4); proline ( -0.5 ± 1); alanin (-0.5); histidine (-0.5); cysteine (-1.0); methionine (-1.3); valine (-1.5); leucine (-1.5) -1.8); isoleucine (-1.8); tyrosine (-2.3); phenylalanine (-2.5); tryptophan (-3.4). In such amino acid substitutions, the hydrophilicity index is preferably within ± 2, more preferably within ± 1, and even more preferably within ± 0.5.
したがって、本発明において、ポリペプチドは保存的置換されていてもよい。保存的置換とは、元のアミノ酸と置換されるアミノ酸との親水性指数及び/又は疎水性指数が上記のように類似している置換をいう。保存的置換の例は、当業者に周知であり、例えば、次の各グループ内での置換:アルギニンとリジン;グルタミン酸とアスパラギン酸;セリンとスレオニン;グルタミンとアスパラギン;バリン、ロイシン、及びイソロイシン、などが挙げられるが、これらに限定されない。かかる保存的置換もまた、本発明において、「由来の」なる用語の範囲に含まれる。 Therefore, in the present invention, the polypeptide may be conservatively substituted. Conservative substitution refers to a substitution in which the hydrophilicity index and / or the hydrophobicity index of the original amino acid and the amino acid to be replaced are similar as described above. Examples of conservative substitutions are well known to those skilled in the art and include, for example, substitutions within each of the following groups: arginine and lysine; glutamic acid and aspartic acid; serine and threonine; glutamine and aspartic acid; valine, leucine, and isoleucine, etc. However, it is not limited to these. Such conservative substitutions are also included in the present invention within the scope of the term "derived".
本発明において、プロテアーゼは、アミノ酸間のペプチド結合を分解するあらゆる酵素を意味し、その対象がタンパク質、高分子ペプチド又は低分子ペプチドのいずれであるかを問わない。本発明において好ましいプロテアーゼとしては、VP2とVP4の結合部位を特異的に認識可能であって他のペプチド結合に影響しないことが望ましいことから、基質特異性の高いもの、例えばシステインプロテアーゼ、3Cプロテアーゼ、3CDプロテアーゼなどが挙げられる。 In the present invention, a protease means any enzyme that breaks a peptide bond between amino acids, regardless of whether the target is a protein, a high molecular weight peptide, or a low molecular weight peptide. As the preferred protease in the present invention, since it is desirable that the binding site of VP2 and VP4 can be specifically recognized and does not affect the binding of other peptides, those having high substrate specificity, such as cysteine protease and 3C protease, are preferable. Examples thereof include 3CD protease.
本発明において、プロテアーゼは、無作為にペプチド結合を分解するものではなく、それぞれ特定のアミノ酸配列を認識して特異的にペプチド結合を切断する。したがって、1種のプロテアーゼを選択すれば、そのプロテアーゼが認識可能なアミノ酸配列は一意に決定できる。あるプロテアーゼがどのようなアミノ酸配列を認識するかは、各種文献、例えばプロテアーゼを販売する事業者の説明書などに記載されている。3Cプロテアーゼ又は3CDプロテアーゼの場合、認識するアミノ酸配列はX−X−Gln−Gly−Xであり、Gln−Gly間で切断が生じる。例えばHRV3Cプロテアーゼの場合、フナコシ社の提供する説明書から、認識するアミノ酸配列がLeu−Glu−Val−Leu−Phe−Gln−Gly−Proであり、Gln−Gly間で切断が生じることが理解可能である。なお、Xは任意のアミノ酸を示す。 In the present invention, the protease does not randomly break the peptide bond, but recognizes a specific amino acid sequence and specifically cleaves the peptide bond. Therefore, if one type of protease is selected, the amino acid sequence recognizable by that protease can be uniquely determined. What kind of amino acid sequence a protease recognizes is described in various documents, for example, a manual of a business operator who sells the protease. In the case of 3C protease or 3CD protease, the recognized amino acid sequence is X-X-Gln-Gly-X, and cleavage occurs between Gln-Gly. For example, in the case of HRV3C protease, it can be understood from the instruction manual provided by Funakoshi that the amino acid sequence to be recognized is Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln-Gly-Pro and cleavage occurs between Gln-Gly. Is. In addition, X represents an arbitrary amino acid.
本発明において、プロテアーゼが認識するアミノ酸配列は、プロテアーゼに依存して決定されるものである。エンテロウイルスのRNAには3Cプロテアーゼ又は3CDプロテアーゼをコードする塩基配列が含まれていることから、本発明のポリペプチドにおいて、当該プロテアーゼが認識するアミノ酸配列としてX−X−Gln−Gly−Xというグルタミン及びグリシンが連続した配列が好ましい。例えば、本発明のポリペプチドにおいて、3Cプロテアーゼ又は3CDプロテアーゼでVP2とVP4の結合部位が基質特異的に切断された結果、VP2のN末端はグリシンが、VP4のC末端はグルタミンとなる。かかるプロテアーゼが認識するアミノ酸配列は、野生型のアミノ酸配列と比較したときに置換、挿入、欠失、又は付加のいずれの変異があってもよい。 In the present invention, the amino acid sequence recognized by the protease is determined depending on the protease. Since the RNA of enterovirus contains a base sequence encoding a 3C protease or a 3CD protease, glutamine called X-X-Gln-Gly-X and the amino acid sequence recognized by the protease in the polypeptide of the present invention are used. A sequence of continuous glycine is preferred. For example, in the polypeptide of the present invention, the binding site between VP2 and VP4 is substrate-specifically cleaved by 3C protease or 3CD protease, and as a result, the N-terminal of VP2 becomes glycine and the C-terminal of VP4 becomes glutamine. The amino acid sequence recognized by such a protease may have any of the substitution, insertion, deletion, or addition mutations when compared to the wild-type amino acid sequence.
したがって、好ましい態様において、本発明は、エンテロウイルス、例えばA〜D群エンテロウイルス、好ましくはA群エンテロウイルス由来のVP1、VP2、VP3及びVP4を含むポリペプチドであって、当該VP2とVP4の結合部位にプロテアーゼが認識するアミノ酸配列を含むことを特徴とするポリペプチドを提供する。 Therefore, in a preferred embodiment, the present invention is a polypeptide containing VP1, VP2, VP3 and VP4 derived from an enterovirus, for example, group A to D enterovirus, preferably group A enterovirus, and a protease at the binding site between VP2 and VP4. Provided is a polypeptide comprising an amino acid sequence recognized by.
より好ましい態様において、本発明は、エンテロウイルス、例えばA〜D群エンテロウイルス、好ましくはA群エンテロウイルス由来のVP1、VP2、VP3及びVP4を含むポリペプチドであって、当該VP2とVP4の結合部位に3Cプロテアーゼ又は3CDプロテアーゼが認識するアミノ酸配列を含むことを特徴とするポリペプチドを提供する。 In a more preferred embodiment, the present invention is a polypeptide containing VP1, VP2, VP3 and VP4 derived from an enterovirus such as group A to D enterovirus, preferably group A enterovirus, and a 3C protease at the binding site of the VP2 and VP4. Alternatively, a polypeptide characterized by containing an amino acid sequence recognized by a 3CD protease is provided.
より好ましい態様において、本発明は、エンテロウイルス、例えばA〜D群エンテロウイルス、好ましくはA群エンテロウイルス由来のVP1、VP2、VP3及びVP4を含むポリペプチドであって、当該VP2とVP4とがグルタミン及びグリシンが連続した配列を介して連結していることを特徴とするポリペプチドを提供する。 In a more preferred embodiment, the present invention is a polypeptide containing VP1, VP2, VP3 and VP4 derived from enteroviruses such as group A to D enteroviruses, preferably group A enteroviruses, wherein the VP2 and VP4 are glutamine and glycine. Provided are a polypeptide characterized by being linked via a contiguous sequence.
別の好ましい態様において、本発明は、エンテロウイルス、例えばA〜D群エンテロウイルス、好ましくはA群エンテロウイルス由来のVP1、VP2、VP3及びVP4を含むポリペプチドであって、当該VP2のN末端にグリシンを、当該VP4のC末端にグルタミンを含むことを特徴とするポリペプチドを提供する。 In another preferred embodiment, the present invention is a polypeptide containing VP1, VP2, VP3 and VP4 derived from enteroviruses such as group A to D enteroviruses, preferably group A enteroviruses, wherein glycine is added to the N-terminus of the VP2. Provided is a polypeptide characterized by containing glutamine at the C-terminal of the VP4.
さらに本発明者らは、天然のエンテロウイルスには完全粒子形状と不完全粒子形状のウイルスが混在していることを鑑み、エンテロウイルスから完全粒子形状のウイルスを抽出することで、不完全粒子形状のウイルスよりも高い免疫原性を有する抗原を設計しうることを見出した。したがって、さらなる態様において、本発明は、エンテロウイルス由来のVP1、VP2、VP3及びVP4を含むポリペプチドであって、エンテロウイルスVP0を実質的に含まないことを特徴とするポリペプチドを提供する。VP0は、約36kDaのポリペプチドであり、約28kDaのVP2と約8kDaのVP4を含む。 Furthermore, in view of the fact that natural enteroviruses contain both perfect particle-shaped and incomplete-particle-shaped viruses, the present inventors have extracted the perfect-particle-shaped virus from enteroviruses to obtain incomplete-particle-shaped viruses. We have found that it is possible to design antigens with higher immunogenicity. Therefore, in a further aspect, the present invention provides a polypeptide comprising enterovirus-derived VP1, VP2, VP3 and VP4, characterized in that it is substantially free of enterovirus VP0. VP0 is a polypeptide of about 36 kDa and contains about 28 kDa VP2 and about 8 kDa VP4.
本発明において、用語「実質的に含まない」とは、定量的に測定した場合にその含有量が主成分と比較して30%以下、20%以下、10%以下、好ましくは5%以下、より好ましくは3%以下、最も好ましくは1%以下であることを意味する。ここでの「主成分」は単に量的に主たる成分を意味し、性質的に主であることを意図するものではない。定量的測定に利用可能な手段は当業者が通常選択可能ないずれかの方法であってよく、含有量はその測定方法が提供する通常の定量単位を用いて把握される。例えば、SDS−PAGE法を用いて検出したVP0のバンドの強度が、VP2のバンドの強度と比較して、30%以下、20%以下、10%以下、好ましくは5%以下、より好ましくは3%以下、最も好ましくは1%以下である場合に、VP0を「実質的に含まない」ものと理解される。SDS−PAGE法はゲルに添加したタンパク質混合物を電気泳動によって分子量に従って分離し、染色及び脱色後にバンド強度を分析するものであり、使用するゲル、試薬、メンブレン、スタンダード及び装置などは当業者であれば適宜選択できる。 In the present invention, the term "substantially free" means that the content thereof, when measured quantitatively, is 30% or less, 20% or less, 10% or less, preferably 5% or less, as compared with the main component. It means that it is more preferably 3% or less, and most preferably 1% or less. The "main component" here simply means the main component quantitatively, and is not intended to be the main component in nature. The means available for quantitative measurement may be any method usually selectable by those skilled in the art, and the content is grasped using the usual quantitative units provided by the measurement method. For example, the intensity of the VP0 band detected using the SDS-PAGE method is 30% or less, 20% or less, 10% or less, preferably 5% or less, more preferably 3 as compared with the intensity of the VP2 band. VP0 is understood to be "substantially free" when it is less than or equal to%, most preferably less than or equal to 1%. The SDS-PAGE method separates the protein mixture added to the gel according to the molecular weight by electrophoresis, and analyzes the band intensity after staining and bleaching. The gel, reagents, membranes, standards, devices, etc. used may be those of those skilled in the art. Can be selected as appropriate.
好ましい態様において、本発明は、エンテロウイルス、例えばA〜D群エンテロウイルス、好ましくはA群エンテロウイルス由来のVP1、VP2、VP3及びVP4を含むポリペプチドであって、エンテロウイルスVP0を実質的に含まないことを特徴とするポリペプチドを提供する。 In a preferred embodiment, the present invention is characterized in that it is a polypeptide containing enteroviruses such as group A to D enteroviruses, preferably group A enteroviruses VP1, VP2, VP3 and VP4, which is substantially free of enterovirus VP0. To provide a polypeptide.
本発明のポリペプチドは、当業者が通常利用可能なペプチド、ポリペプチド及びタンパク質製造方法のいずれかを用いて製造することができる。かかる方法は、これらに限定されるものではないが、化学合成、ウイルス不活化及び細胞発現系を含む。具体的な製造方法やそこで使用される試薬、条件及び装置等は、当業者であれば、容易に選択することができる。例えば市販のタンパク質発現キットを、当該キットに添付の説明書に従って、利用することができる。 The polypeptides of the invention can be produced using any of the peptides, polypeptides and protein production methods commonly available to those skilled in the art. Such methods include, but are not limited to, chemical synthesis, viral inactivation and cell expression systems. A person skilled in the art can easily select a specific production method, reagents, conditions, devices and the like used therein. For example, a commercially available protein expression kit can be used according to the instructions attached to the kit.
好ましい本発明のポリペプチドの製造方法は、ウイルス不活化又は細胞発現系を用いた方法である。エンテロウイルスを増殖しうる細胞として、Vero細胞、RD細胞(Rhabdomysarcoma細胞)、RD−A細胞、RD−18S細胞などが挙げられる。ウイルス不活化はワクチンにおいて通常使用されるホルマリン処理等のあらゆる方法によって行うことができる。一方でA群エンテロウイルスは、細胞を用いたウイルス培養時の増殖において課題があるため、量及びコストの観点より、細胞発現系によるVLPの作製がより好ましい。
細胞発現系を用いた方法としては、利用可能な発現ベクター及び細胞には特に制限はないが、例えば、市販のベクター及び細胞を、当該製品に添付の説明書に従って、利用することができる。かかるベクターには、これらに限定されないが、例えば、HaloTagベクター、pHEK293ベクター、BacPAKベクター、pRI101DNAベクター、バキュロウイルスベクター、pcDNAベクター、pCHO1.0ベクター等が含まれ、使用する細胞に応じて適宜選択される。利用可能な細胞としては、これらに限定されないが、CHO細胞、HEK293細胞、HeLa細胞、Vero細胞、MDCK細胞、大腸菌細胞、カイコ細胞、タバコ葉細胞等が含まれる。当該細胞発現系によって作製されるポリペプチドとして、例えばVLPが挙げられる。
A preferred method for producing the polypeptide of the present invention is a method using a virus inactivation or a cell expression system. Examples of cells capable of multiplying enterovirus include Vero cells, RD cells (Rhabdomyosarcoma cells), RD-A cells, RD-18S cells and the like. Virus inactivation can be performed by any method such as formalin treatment commonly used in vaccines. On the other hand, since group A enterovirus has a problem in proliferation during virus culture using cells, it is more preferable to prepare VLP by a cell expression system from the viewpoint of quantity and cost.
The method using the cell expression system is not particularly limited in the expression vectors and cells that can be used, but for example, commercially available vectors and cells can be used according to the instructions attached to the product. Such vectors include, but are not limited to, for example, HaloTag vector, pHEK293 vector, BacPAK vector, pRI101DNA vector, baculovirus vector, pcDNA vector, pCHO1.0 vector and the like, and are appropriately selected according to the cells to be used. To. Available cells include, but are not limited to, CHO cells, HEK293 cells, HeLa cells, Vero cells, MDCK cells, Escherichia coli cells, silkworm cells, tobacco leaf cells and the like. Examples of the polypeptide produced by the cell expression system include VLP.
本発明のポリペプチドは、ヒトに投与することが意図されていることから、哺乳類細胞を用いた発現系が好ましい。他の細胞、例えば大腸菌、植物及び昆虫細胞を用いた発現系でも本発明のポリペプチドを製造することは可能であるが、翻訳後修飾の観点から、哺乳類細胞を用いることが好ましい。本発明のポリペプチドを製造するのに好適な哺乳類細胞としては、例えば、CHO細胞が挙げられる。当該細胞を用いた発現系としては、当業者に利用可能なあらゆる手段であってよく、これらに限定されないが、例えば、プラスミドのトランスフェクションによる一過性発現系でもよく、安定的に目的のポリペプチドを発現する宿主細胞(以下、安定発現細胞)を構築してもよい。 Since the polypeptide of the present invention is intended to be administered to humans, an expression system using mammalian cells is preferable. Although it is possible to produce the polypeptide of the present invention in an expression system using other cells such as Escherichia coli, plants and insect cells, it is preferable to use mammalian cells from the viewpoint of post-translational modification. Mammalian cells suitable for producing the polypeptide of the present invention include, for example, CHO cells. The expression system using the cells may be any means available to those skilled in the art, and is not limited to these, but may be, for example, a transient expression system by transfection of a plasmid, and is a stable target poly. A host cell expressing the peptide (hereinafter, stable expression cell) may be constructed.
一例として、本発明のポリペプチドを製造するためにウイルス不活化方法を用いる場合、次の工程に従って製造できる:
・細胞培養にてエンテロウイルスを増殖させる工程
・ウイルス液をろ過処理する工程
・処理後ウイルス液をショ糖密度勾配遠心法にて完全粒子に該当するウイルス画分を取得する工程
・当該ウイルス画分を不活化することで、目的のポリペプチドを取得する工程
を含む方法を提供する。
As an example, when the virus inactivating method is used to produce the polypeptide of the invention, it can be produced according to the following steps:
-Step of growing enterovirus in cell culture-Step of filtering virus solution-Step of obtaining virus fraction corresponding to complete particles by sucrose density gradient centrifugation after treatment-The virus fraction Provided is a method comprising the step of obtaining the polypeptide of interest by inactivating.
一例として、本発明のポリペプチドを製造するために細胞発現系を用いる場合、次の工程に従って製造できる:
・エンテロウイルスからRNAを抽出するか、又は人工合成によりRNAをデザインする工程
・RT−PCRにてRNAよりDNA断片を合成及び増幅し、当該DNA断片を発現用プラスミドにライゲーションする工程
・得られたプラスミドを細胞にトランスフェクションする工程
・トランスフェクションした細胞を増殖させる工程、又は安定発現細胞を選抜及び増殖する工程
・増殖した細胞から本発明のポリペプチドを回収する工程。
As an example, when a cell expression system is used to produce the polypeptide of the invention, it can be produced according to the following steps:
-Step of extracting RNA from enterovirus or designing RNA by artificial synthesis-Step of synthesizing and amplifying a DNA fragment from RNA by RT-PCR and ligating the DNA fragment into an expression plasmid-The obtained plasmid -Step of proliferating the transfected cells, or step of selecting and proliferating stable expressing cells-Step of recovering the polypeptide of the present invention from the proliferated cells.
上記製造方法のいずれの工程においても、当業者であれば、試薬、条件、装置等について、容易に選択可能である。また、各工程において、意図した結果が得られているかを確認するための工程を適宜挿入することができる。かかる確認工程としては、例えば、抽出したRNAの配列を適当なシークエンス法、例えばサイクルシークエンス法やパイロシークエンス法等で確認することや、得られたポリペプチドをウェスタンブロット法(WB)等によって確認することが含まれる。 In any of the steps of the above manufacturing method, those skilled in the art can easily select reagents, conditions, devices and the like. Further, in each step, a step for confirming whether or not the intended result is obtained can be appropriately inserted. As such a confirmation step, for example, the sequence of the extracted RNA is confirmed by an appropriate sequencing method, for example, a cycle sequencing method, a pyrosequence method, or the like, or the obtained polypeptide is confirmed by Western blotting (WB) or the like. Is included.
VP0をプロテアーゼによって開裂させてVP2とVP4とするために、プロテアーゼが認識するアミノ酸配列をコードする塩基配列となるように変異を導入することができる。変異を導入するために元の塩基配列を置換、挿入、欠失、又は付加してもよいが、これらに限定されない。エンテロウイルスからRNAを抽出した後、RT−PCRにてRNAよりDNA断片を合成及び増幅させ、当該DNA断片を発現用プラスミドにライゲーションする工程において、変異導入は、ライゲーション時に行ってもよいし、ライゲーションの前又は後に行ってもよい。挿入又は置換されるプロテアーゼが認識するアミノ酸配列をコードする塩基配列は、コドン表を用いて容易に決定することができる。例えば、3Cプロテアーゼ又は3CDプロテアーゼを用いる場合には、当該プロテアーゼが認識するGln−Glyをコードする塩基配列、例えばCAAGGUが用いられる。変異導入の具体的方法は、当業者に利用可能なあらゆる手段であってよく、これらに限定されないが、例えば、インバースPCR法、相補的プライマー法等を含む。例えば、市販の変異導入キットを当該キットに添付の説明書に従って使用することができる。 In order to cleave VP0 with a protease to obtain VP2 and VP4, mutations can be introduced so as to have a base sequence encoding the amino acid sequence recognized by the protease. The original base sequence may be replaced, inserted, deleted, or added to introduce a mutation, but is not limited thereto. In the step of extracting RNA from enterovirus, synthesizing and amplifying a DNA fragment from RNA by RT-PCR, and ligating the DNA fragment to an expression plasmid, mutation introduction may be performed at the time of ligation, or ligation. It may be done before or after. The base sequence encoding the amino acid sequence recognized by the protease to be inserted or replaced can be easily determined using the codon table. For example, when a 3C protease or a 3CD protease is used, a base sequence encoding Gln-Gly recognized by the protease, for example, CAAGGU is used. Specific methods of mutagenesis may be any means available to those of skill in the art and include, but are not limited to, inverse PCR methods, complementary primer methods and the like. For example, a commercially available mutagenesis kit can be used according to the instructions attached to the kit.
したがって、ある態様において、本発明は、本発明のポリペプチドを製造する方法であって、
・エンテロウイルスからRNAを抽出する工程
・RT−PCRにてRNAよりDNA断片を合成及び増幅し、当該DNA断片を発現用プラスミドにライゲーションする工程
・ライゲーションした発現用プラスミドに、プロテアーゼが認識するアミノ酸配列をコードする塩基配列を変異導入する工程
・得られたプラスミドを細胞にトランスフェクションする工程
・トランスフェクションされた細胞を増殖させる工程、又は安定発現細胞を選抜及び増殖する工程
・増殖した細胞から本発明のポリペプチドを回収する工程
を含む方法を提供する。
Therefore, in some embodiments, the present invention is a method of producing the polypeptide of the present invention.
-Step of extracting RNA from enterovirus-Step of synthesizing and amplifying a DNA fragment from RNA by RT-PCR and ligating the DNA fragment to an expression plasmid-The amino acid sequence recognized by the protease is added to the ligated expression plasmid. The step of introducing a mutation into the encoding base sequence, the step of transfecting the obtained plasmid into cells, the step of proliferating the transfected cells, or the step of selecting and proliferating stable-expressing cells, and the step of proliferating the cells of the present invention. Provided is a method including a step of recovering a polypeptide.
また、別の態様において、本発明は、本発明のポリペプチドを製造する方法であって、
・エンテロウイルスからRNAを抽出する工程
・抽出したRNAに、プロテアーゼが認識するアミノ酸配列をコードする塩基配列を変異導入する工程
・RT−PCRにてRNAよりDNA断片を合成及び増幅し、当該DNA断片を発現用プラスミドにライゲーションする工程
・得られたプラスミドを細胞にトランスフェクションする工程
・トランスフェクションされた細胞を増殖させる工程、又は安定発現細胞を選抜及び増殖する工程
・増殖した細胞から本発明のポリペプチドを回収する工程
を含む方法を提供する。
In another aspect, the present invention is a method for producing the polypeptide of the present invention.
-Step of extracting RNA from enterovirus-Step of mutating and introducing a base sequence encoding an amino acid sequence recognized by a protease into the extracted RNA-Synthesis and amplification of a DNA fragment from RNA by RT-PCR and producing the DNA fragment A step of ligating to an expression plasmid, a step of transfecting the obtained plasmid into cells, a step of proliferating the transfected cells, or a step of selecting and proliferating stable expression cells-the polypeptide of the present invention from the proliferated cells. Provided is a method including a step of recovering the plasmid.
さらに別の態様において、本発明は、本発明のポリペプチドを製造する方法であって、
・エンテロウイルス由来のVP1〜4をコードする塩基配列を含むRNAであって、VP4をコードする塩基配列とVP2をコードする塩基配列との間に、プロテアーゼが認識するアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むRNAを合成する工程
・RT−PCRにてRNAよりDNA断片を合成及び増幅し、当該DNA断片を発現用プラスミドにライゲーションする工程
・得られたプラスミドを細胞にトランスフェクションする工程
・トランスフェクションされた細胞を増殖させる工程、又は安定発現細胞を選抜及び増殖する工程
・増殖した発現細胞から本発明のポリペプチドを回収する工程
を含む方法を提供する。
In yet another embodiment, the invention is a method of producing the polypeptide of the invention.
-It is an RNA containing a base sequence encoding VP1 to VP1 to 4 derived from enterovirus, and contains a base sequence encoding an amino acid sequence recognized by a protease between the base sequence encoding VP4 and the base sequence encoding VP2. Step of synthesizing RNA ・ Step of synthesizing and amplifying a DNA fragment from RNA by RT-PCR and ligating the DNA fragment to an expression plasmid ・ Step of transfecting the obtained plasmid into cells ・ Transfected cells Provided is a method including a step of proliferating, or a step of selecting and proliferating stable expressing cells, and a step of recovering the polypeptide of the present invention from the proliferated expressing cells.
このようにして製造された本発明のポリペプチドは、リン酸化やグリコシル化等の修飾を受けうる。かかる修飾を受けたポリペプチドもなお、本発明のポリペプチドに含まれる。修飾には、例えば、発現細胞の翻訳後修飾が含まれる。 The polypeptide of the present invention produced in this manner can undergo modifications such as phosphorylation and glycosylation. Such modified polypeptides are still included in the polypeptides of the invention. Modifications include, for example, post-translational modifications of expressing cells.
また、本発明のポリペプチドは、様々な相互作用によって、いずれかの三次又は四次構造をとりうる。例えば、本発明のポリペプチド内のイオン結合、水素結合、ジスルフィド結合等によってVP1〜4の各サブユニットの折り畳みが生じて三次構造を形成し、次いでVP1〜4の各サブユニットがアセンブルして、四次構造を形成しうる。かかる高次構造は、一般的に、天然のウイルス粒子に構造上近似しているほど、高い免疫原性を示す。本発明においては、更に完全粒子形状に構造上近似しているほど、高い免疫原性を示す。したがって、好ましい態様において本発明のポリペプチドは、完全粒子形状のVLP又は不活化ウイルスである。 In addition, the polypeptide of the present invention may have any tertiary or quaternary structure through various interactions. For example, ionic bonds, hydrogen bonds, disulfide bonds, etc. in the polypeptide of the present invention cause folding of each subunit of VP1 to 4 to form a tertiary structure, and then each subunit of VP1 to 4 is assembled. It can form a quaternary structure. Such higher-order structures generally exhibit higher immunogenicity as they are structurally similar to natural viral particles. In the present invention, the more structurally close to the perfect particle shape, the higher the immunogenicity. Therefore, in a preferred embodiment, the polypeptide of the invention is a VLP or inactivated virus in full particle form.
さらに、本発明は、本発明のポリペプチドを製造するための発現カセットを提供する。発現カセットは、目的遺伝子と当該目的遺伝子の転写を開始するために操作可能に結合したプロモーターの組み合わせであり、ベクターに導入して使用する。本発明において、エンテロウイルス、例えばA〜D群エンテロウイルス、好ましくはA群エンテロウイルス由来のVP1〜4、プロテアーゼ及び当該プロテアーゼが認識するアミノ酸配列をコードする核酸及び当該核酸の転写を開始するプロモーターを含む発現カセットもまた、意図される。
Furthermore, the present invention provides an expression cassette for producing the polypeptide of the present invention. An expression cassette is a combination of a target gene and a promoter operably linked to initiate transcription of the target gene, and is introduced into a vector for use. In the present invention, an expression cassette containing an enterovirus, for example, group A to D enterovirus, preferably
本発明者らは、本発明のポリペプチドがエンテロウイルスに対する高い免疫原性を有することを見出した。したがって、本発明は、エンテロウイルス、例えばA〜D群エンテロウイルス、好ましくはA群エンテロウイルス、より好ましくはEV71、コクサッキーウイルスA6、コクサッキーウイルスA10又はコクサッキーウイルスA16、さらに好ましくはEV71B型、例えばEV71B5型に対するワクチンであって、本発明のポリペプチドを抗原として含むことを特徴とする、ワクチンを提供する。 The present inventors have found that the polypeptide of the present invention has high immunogenicity against enterovirus. Therefore, the present invention is a vaccine against enteroviruses such as group A to D enteroviruses, preferably group A enteroviruses, more preferably EV71, coxsackievirus A6, coxsackievirus A10 or coxsackievirus A16, and even more preferably EV71B type, eg EV71B5 type. Provided is a vaccine comprising the polypeptide of the present invention as an antigen.
本発明において、用語「ワクチン」は、特定の病原体、例えばウイルス、細菌等に対する免疫力を高めることができる抗原を含む医薬製剤を意味する。予防ワクチンと治療ワクチンのいずれであるかを問わないが、本発明においては、とりわけ予防ワクチンが意図される。予防ワクチンは、いまだ罹患していない対象にワクチンを投与して、特定の病原体に対する免疫応答を体内で誘発させて、病原体に対する免疫力を高めることによって、その病原体への感染や重症化を予防するための医薬製剤である。ワクチンの投与経路は、これらに限定されないが、例えば、皮下投与、皮内投与、筋肉内投与、経鼻投与、経皮投与、経口投与などがありうる。 In the present invention, the term "vaccine" means a pharmaceutical preparation containing an antigen capable of enhancing immunity against a specific pathogen such as a virus or a bacterium. It does not matter whether it is a prophylactic vaccine or a therapeutic vaccine, but in the present invention, a prophylactic vaccine is particularly intended. Prophylactic vaccines prevent infection and aggravation of a particular pathogen by administering the vaccine to an unaffected subject to elicit an immune response against the pathogen in the body and boost immunity to the pathogen. It is a pharmaceutical preparation for. The route of administration of the vaccine is not limited to these, and may include, for example, subcutaneous administration, intradermal administration, intramuscular administration, nasal administration, transdermal administration, oral administration, and the like.
本発明において、疾患は、エンテロウイルス関連疾患、例えばエンテロウイルスA〜D群関連疾患、典型的にはA群エンテロウイルス関連疾患を指し、具体的には、例えば手足口病、ヘルパンギーナ及び無菌性髄膜炎、とりわけ手足口病及びヘルパンギーナである。 In the present invention, the disease refers to an enterovirus-related disease, for example, enterovirus group A to D-related disease, typically group A enterovirus-related disease, specifically, for example, hand-foot-and-mouth disease, herpangina and aseptic meningitis. Especially hand-foot-and-mouth disease and herpangina.
本発明のワクチンは、抗原の他に、ワクチンで通常使用される添加物を含んでいてよい。かかる添加物には、担体、防腐剤及びアジュバント等が含まれる。例えば、担体には、水又は生理食塩水が含まれる。例えば、防腐剤には、フェノール、塩化ベンゼトニウム、2−フェノキシエタノール、チメロサール等が含まれる。例えば、アジュバントには、アルミニウム塩、リン酸アルミニウム、塩化アルミニウム、水酸化アルミニウム、硫酸アルミニウム、リン酸カルシウム、Toll様レセプター(TLR)リガンド分子、dsRNA、IL−12等が含まれる。これらの添加物は、当業者であれば、投与経路等の様々な要因を考慮して、適宜選択可能である。 In addition to the antigen, the vaccine of the present invention may contain additives commonly used in vaccines. Such additives include carriers, preservatives, adjuvants and the like. For example, the carrier includes water or saline. For example, preservatives include phenol, benzethonium chloride, 2-phenoxyethanol, thimerosal and the like. For example, adjuvants include aluminum salts, aluminum phosphate, aluminum chloride, aluminum hydroxide, aluminum sulphate, calcium phosphate, Toll-like receptor (TLR) ligand molecules, dsRNA, IL-12 and the like. Those skilled in the art can appropriately select these additives in consideration of various factors such as the route of administration.
本発明のワクチンの対象は、エンテロウイルスに感染しうる動物、例えば哺乳類、例えばヒト、サル、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ等が含まれる。典型的な対象は、ヒトであり、とりわけエンテロウイルスに感染しやすい5歳未満のヒトであるが、これに限定されない。 The target of the vaccine of the present invention includes animals that can be infected with enterovirus, such as mammals, such as humans, monkeys, cows, horses, pigs, and sheep. Typical subjects are humans, especially those under the age of 5 who are susceptible to enterovirus infection, but are not limited to this.
本発明のポリペプチドは、エンテロウイルスに対する高い免疫原性を有するのみならず、動物試験において高い感染予防効果が示される。本発明のポリペプチドの免疫原性を確認するために、本発明者らは、抗原たん白質としてVP1〜4を含むポリペプチドを製造し、動物への免疫を行い、中和抗体価を測定した。また、比較対象として抗原たん白質としてVP0、1及び3を含むポリペプチドを製造し、同様に中和抗体価を測定した。さらに、マウスチャレンジ試験を行い、エンテロウイルスに対する感染予防効果を確認した。 The polypeptide of the present invention not only has high immunogenicity against enterovirus, but also shows a high infection-preventing effect in animal tests. In order to confirm the immunogenicity of the polypeptide of the present invention, the present inventors produced a polypeptide containing VP1 to VP1 as an antigen protein, immunized an animal, and measured the neutralizing antibody titer. .. Moreover, as a comparison target, a polypeptide containing VP0, 1 and 3 as an antigen protein was produced, and the neutralizing antibody titer was measured in the same manner. Furthermore, a mouse challenge test was conducted to confirm the effect of preventing infection against enterovirus.
詳細な手法及び結果は実施例に譲るが、本発明のポリペプチド、すなわちVP1〜4を含むポリペプチドは、VP0、1及び3を含むポリペプチドと比較して、高い中和抗体誘導能を有する。したがって、本発明のポリペプチドは、エンテロウイルスに対する高い免疫原性を有し、エンテロウイルスに対するワクチンの抗原として有用である。 Although the detailed method and result are left to Examples, the polypeptide of the present invention, that is, the polypeptide containing VP1 to VP4, has a high neutralizing antibody-inducing ability as compared with the polypeptide containing VP0, 1 and 3. .. Therefore, the polypeptide of the present invention has high immunogenicity against enterovirus and is useful as a vaccine antigen against enterovirus.
(実施例1)EV71の不活化ウイルスの作製及び評価
1.EV71の完全粒子形状及び不完全粒子形状の不活化ウイルスの作製
RD−A細胞を用いてEV71を培養した(セルスタック、10チャンバー、Corning社)。培養液中の細胞を破砕して、ウイルス液を取得した。ウイルス液を遠心分離し、濾過(0.45μm→0.22μm)して細胞残渣を除去した。濾液をGE Healthcare社のAKTA flux s(分子量カットオフ値500kDa)を用いて、限外濾過濃縮した。Hitachi社の超遠心分離機CP80wxを用いてウイルス粒子のペレットを作製した。ペレットをPBS中に一晩懸濁させて再浮遊させた。次いで、懸濁液を超遠心分離機CP80wxによるショ糖密度勾配遠心法(10〜40%)を用いて画分を得た。SDS−PAGE及びWBによって、完全粒子及び不完全粒子画分を確認した。結果を図2に示す。完全粒子画分は35%前後(約1.15g/mL)の、不完全粒子画分は25%前後(約1.11g/mL)のショ糖密度勾配に収束した。完全粒子及び不完全粒子画分をMerck Millipore社のAmicon Ultraを用いて濃縮した。ホルマリンを用いてウイルスの不活化を行い、不活化したウイルス液をRD−A細胞に感染させ、CPEの有無を測定することで不活化の確認を行った。
(Example 1) Preparation and evaluation of EV71
2.EV71の完全粒子及び不完全粒子画分の不活化ウイルスの評価
2−1. 免疫原性の評価
EV71の完全粒子又は不完全粒子画分を含む不活化ウイルスでBALB/cマウスを免疫し、血清を採取して中和抗体価を測定した。具体的には、4週齢のBALB/cマウスに完全粒子画分を含む不活化ウイルス又は不完全粒子画分を含む不活化ウイルスを0.1μg注射してそれぞれ免疫し、6週齢及び8週齢でそれぞれ同量追加免疫した。10週齢で全採血を行い、約0.8mLの血清を得た。マウス血清を2倍段階希釈して1/2〜1/4096の希釈系列を作製し、各希釈系列に5×103PFU/mLに調製したEV71ウイルス液を添加した後、37℃、5%CO2で4時間反応させてウイルスを中和した。マウス血清を含まないものをネガティブコントロールとした。前日に播種しておいたRD−A細胞(6ウェルプレート)に中和反応液を添加し、37℃で、1時間、15分おきにプレートを振盪して、ウイルスを細胞に感染させた。ウイルス液を吸引除去した後、メチルセルロースを添加して重層した。37℃、5%CO2で5日間培養し、メチルセルロースを吸引除去した後、10倍希釈したホルムアルデヒド液で細胞を固定した。クリスタルバイオレットで細胞を染色して、プラーク数をカウントした。ネガティブコントロールのプラーク数を100%として、中和反応液を添加したウェルのプラーク数が20%以下となった最大希釈率を抗体価として算出した。結果を図3に示す。図3において、完全粒子画分の不活化ウイルスをD−antigen、不完全粒子画分の不活化ウイルスをC−antigenと示す。図3より、完全粒子画分の不活化ウイルスを抗原として用いることで、不完全粒子画分の不活化ウイルスよりも高い中和抗体誘導能を有することがわかった。
2. Evaluation of inactivated viruses in the complete and incomplete particle fractions of EV71 2-1. Evaluation of immunogenicity BALB / c mice were immunized with an inactivated virus containing a complete or incomplete particle fraction of EV71, and serum was collected to measure the neutralizing antibody titer. Specifically, 4-week-old BALB / c mice were immunized with 0.1 μg of an inactivated virus containing a complete particle fraction or an inactivated virus containing an incomplete particle fraction, and immunized at 6 weeks and 8 weeks, respectively. The same amount of booster immunization was given at each week of age. All blood was collected at 10 weeks of age to obtain approximately 0.8 mL of serum. Mouse serum was serially diluted 2-fold to prepare a dilution series of 1/2 to 1/4096, and EV71 virus solution prepared at 5 × 10 3 PFU / mL was added to each dilution series at 37 ° C. and 5%. The virus was neutralized by reacting with CO 2 for 4 hours. Those containing no mouse serum were used as negative controls. The neutralization reaction solution was added to the RD-A cells (6-well plate) seeded the day before, and the plate was shaken at 37 ° C. for 1 hour every 15 minutes to infect the cells with the virus. After removing the virus solution by suction, methyl cellulose was added and layered. After culturing at 37 ° C. and 5% CO 2 for 5 days, methyl cellulose was removed by suction, and then the cells were fixed with a 10-fold diluted formaldehyde solution. Cells were stained with crystal violet and the number of plaques was counted. The maximum dilution rate at which the number of plaques in the well to which the neutralization reaction solution was added was 20% or less was calculated as the antibody titer, assuming that the number of plaques in the negative control was 100%. The results are shown in FIG. In FIG. 3, the inactivated virus of the complete particle fraction is shown as D-antigen, and the inactivated virus of the incomplete particle fraction is shown as C-antigen. From FIG. 3, it was found that by using the inactivated virus of the complete particle fraction as an antigen, it has a higher neutralizing antibody-inducing ability than the inactivated virus of the incomplete particle fraction.
2−2. チャレンジ試験マウス生存率の評価
EV71の完全粒子形状を含む不活化ウイルス及び不完全粒子形状を含む不活化ウイルスでhSCARB2発現Tg−マウスを免疫した後、EV71を接種し、マウスの生存率を測定した。上記hSCARB2発現Tg−マウスは、Ken Fujii, et al., Proc Natl Acad Sci USA, 2013 Sep 3;110(36):14753−8に記載の手法で取得した。4週齢のhSCARB2発現Tg−マウスに完全粒子形状を含む不活化ウイルス及び不完全粒子形状を含む不活化ウイルスを0.1μg注射してそれぞれ免疫し、6週齢及び8週齢でそれぞれ同量追加免疫した。10週齢で106 CCID50 のウイルスをマウス腹腔内に接種した。腹腔内接種から2週間後のマウスの生存率を図4に示す。図4において、完全粒子画分の不活化ウイルスをD−antigen、不完全粒子画分の不活化ウイルスをC−antigenとした。図4より、完全粒子画分の不活化ウイルスを抗原として用いることで、不完全粒子画分の不活化ウイルスよりも高い生存率を示すことがわかった。
2-2. Challenge test Evaluation of mouse survival rate After immunizing hSCARB2-expressing Tg-mice with an inactivated virus containing a complete particle shape of EV71 and an inactivated virus containing an incomplete particle shape, EV71 was inoculated and the survival rate of the mouse was measured. .. The hSCARB2-expressing Tg-mice are described in Ken Fujii, et al. , Proc Natl Acad Sci USA, 2013
(比較例1)EV71のVLPの作製及び評価(変異なし)
1.細胞発現系によるEV71のVLPの作製と確認
Roche社のHigh Pure Viral RNA Kitを添付の説明書に従って、EV71からRNAを抽出した。得られたRNAのP1領域及びプロテアーゼ領域を、TaKaRa社のPrimeScript II High Fidelity RT−PCR Kitを添付の説明書に従って、RT−PCRによって増幅した。得られた増幅DNA断片を発現用プラスミドpcDNA3.4にライゲーションした。TaKaRa社のE. coli JM109 Competent Cellsに、添付の説明書に従って、作製したプラスミドをトランスフォーメーションした後、細胞を培地に播種して増殖させた。得られた大腸菌細胞から、Invitrogen社のPlasmid DNA Midiprep kitを添付の説明書に従って、VLP発現用プラスミドを抽出した。得られたプラスミド中のEV71のVLP発現カセットを図5に示す。VLP発現カセットには、EV71のP1、2A自己開裂配列、3CDプロテアーゼ及びCMVプロモーターが含まれる。
(Comparative Example 1) Preparation and evaluation of EV71 VLP (no mutation)
1. 1. Preparation and Confirmation of VLP of EV71 by Cell Expression System RNA was extracted from EV71 according to the attached instruction manual for High Pure Virus RNA Kit of Roche. The P1 region and protease region of the obtained RNA were amplified by RT-PCR of TaKaRa's PrimeScript II High Fidelity RT-PCR Kit according to the attached instructions. The obtained amplified DNA fragment was ligated to the expression plasmid pcDNA3.4. TaKaRa's E.I. The prepared plasmid was transformed into E. coli JM109 Competent Cells according to the attached instructions, and then the cells were seeded in a medium and grown. From the obtained Escherichia coli cells, a plasmid for expressing VLP was extracted from Invitrogen's plasmid DNA Midiprep kit according to the attached instructions. The VLP expression cassette of EV71 in the obtained plasmid is shown in FIG. The VLP expression cassette contains a P1, 2A self-cleaving sequence of EV71, a 3CD protease and a CMV promoter.
Thermo社のExpiCHO Expression Systemを使用して、VLPを作製した。具体的には、ExpiCHO−S細胞をExpiCHO Expression Mediumで所定の細胞密度に達するまで培養した。培養したExpiCHO−S細胞にOptiPRO SFM Complexation Mediumで希釈したExpiFectamine CHO Reagent及びVLP発現用プラスミドを加えて、トランスフェクションした。トランスフェクションした細胞をExpiCHO Expression Mediumで培養し、ExpiCHO Feed及びExpiFectamine CHO Enhancerを添加し、さらに培養を続けた。培養期間中、細胞生存率を確認し、トランスフェクションから8日後に、培養を停止し、回収した。得られた培養液を遠心分離して細胞と上清を分離し、上清を回収して、フィルター濾過した(0.22μm)。得られた上清を、GE Healthcare社のAKTA flux sを分子量カットオフ値500kDaで用いて、限外濾過濃縮した。Hitachi社の超遠心分離機CP80wxを用いてVLPのペレットを作製した。 VLPs were made using Thermo CHO Expression System. Specifically, ExpiCHO-S cells were cultured in ExpiCHO Expression Medium until a predetermined cell density was reached. The cultured ExpiCHO-S cells were transfected with ExpiFectamine CHO Reagent diluted with OptiPRO SFM Transfection Medium and a plasmid for VLP expression. Transfected cells were cultured in ExpiCHO Expression Medium, ExpiCHO Feed and ExpiFectamine CHO Enhancer were added, and the culture was continued. During the culture period, cell viability was confirmed, and 8 days after transfection, the culture was stopped and recovered. The obtained culture solution was centrifuged to separate the cells and the supernatant, and the supernatant was collected and filtered by a filter (0.22 μm). The resulting supernatant was ultrafiltered and concentrated using GE Healthcare's AKTA flux s with a molecular weight cutoff value of 500 kDa. VLP pellets were prepared using a Hitachi ultracentrifuge CP80wx.
VLPのペレットをPBS中に一晩懸濁させて再浮遊させた。さらに、懸濁液を超遠心分離機CP80wxによるショ糖密度勾配遠心(10〜40%)にかけて分画を行い、各画分を、SDS−PAGE及びWBにかけて、VLP画分を確認した。結果を図6のLane2と4に示す。これより、当該VLP画分には、開裂前のVP0を多く含むことがわかった。
VLP pellets were suspended overnight in PBS and resuspended. Further, the suspension was subjected to sucrose density gradient centrifugation (10 to 40%) by an ultracentrifuge CP80wx to perform fractionation, and each fraction was subjected to SDS-PAGE and WB to confirm the VLP fraction. The results are shown in
2.細胞発現系によるEV71のVLPの免疫原性の評価
作製したVLPを用いて、実施例1の2−1.と同様の手法にて中和抗体価を測定した。結果を図8のEV71 VLP(wild type)に示す。図3と比較すると、作製したVLPは不完全粒子画分と同等程度の中和抗体価を示し、完全形状粒子画分よりも低い中和抗体価を示すことがわかった。
2. Evaluation of Immunogenicity of EV71 VLP by Cell Expression System Using the prepared VLP, Example 1 2-1. The neutralizing antibody titer was measured by the same method as in the above. The results are shown in EV71 VLP (wild type) of FIG. Compared with FIG. 3, it was found that the prepared VLP showed a neutralizing antibody titer equivalent to that of the incomplete particle fraction and a neutralizing antibody titer lower than that of the complete particle fraction.
(実施例2)EV71のVLPの作製及び評価(変異あり)
1.細胞発現系によるEV71のVLPの作製と確認
インバースPCR法によって、プラスミドにおいて、P1(viral capsid)region内のVP4−VP2間にGln−Gly変異を挿入した。具体的には、EV71の遺伝子配列情報を元に、当該箇所に変異を挿入するためのプライマーを設計した。TaKaRa BIO社のPrimeScript II High Fidelity RT−PCR Kitを使用して、添付の説明書に従って逆転写反応及びPCR反応を行った。PCR反応は98℃(10sec)→60℃(15sec)→68℃(7.5min)を30サイクル繰り返した。変異未導入のプラスミドをDpnIを用いて分解した後、TaKaRa BIO Clontech社のIn−Fusion HD Cloning Kitを使用して、添付の説明書に従ってPCR産物を処理した(50℃、15min)。その後、大腸菌へのトランスフォーメーションを行った。上記以外は比較例1の1.と同様の手法にて、VLPを作製した。
(Example 2) Preparation and evaluation of VLP of EV71 (with mutation)
1. 1. Preparation and Confirmation of EV71 VLP by Cell Expression System A Gln-Gly mutation was inserted between VP4-VP2 in a P1 (virus capsid) region in a plasmid by inverse PCR. Specifically, based on the gene sequence information of EV71, a primer for inserting a mutation at the site was designed. A reverse transcription reaction and a PCR reaction were carried out using a PrimeScript II High Fidelity RT-PCR Kit manufactured by TakaRa BIO Inc. according to the attached instructions. The PCR reaction was repeated 30 cycles of 98 ° C. (10 sec) → 60 ° C. (15 sec) → 68 ° C. (7.5 min). After degrading the non-mutated plasmid with DpnI, the PCR product was treated with the In-Fusion HD Cloning Kit from TakaRa BIO Cloning, Inc. according to the attached instructions (50 ° C., 15 min). After that, it was transformed into Escherichia coli. Other than the above, 1. A VLP was prepared in the same manner as in the above.
作製したVLP画分をMerck Millipore社のAmicon Ultraを用いて濃縮した。透過電子顕微鏡でVLPの粒子構造を確認した(図7)。また、比較例1の1.と同様の手法で、SDS−PAGE及びWBによる確認を行った。結果を図6のLane1と3に示す。図6より、Gln−Gly変異を挿入することでVP0からVP2とVP4への開裂が促進されることを見出した。
The prepared VLP fractions were concentrated using Amicon Ultra from Merck Millipore. The particle structure of the VLP was confirmed with a transmission electron microscope (Fig. 7). In addition, 1. Confirmation by SDS-PAGE and WB was performed by the same method as above. The results are shown in
2.細胞発現系によるEV71のVLPの免疫原性の評価
作製したVLPを用いて、実施例1の2−1.と同様の手法にて中和抗体価を測定した。結果を図8のEV71 VLP(VP0 切断型)に示す。これより、変異を導入することで高い中和抗体価が誘導されることを見出した。
2. Evaluation of Immunogenicity of EV71 VLP by Cell Expression System Using the prepared VLP, Example 1 2-1. The neutralizing antibody titer was measured by the same method as in the above. The results are shown in EV71 VLP (VP0 cut type) of FIG. From this, it was found that the introduction of mutation induces a high neutralizing antibody titer.
Claims (17)
The vaccine according to claim 13, which is a vaccine against EV71B5 type.
Priority Applications (3)
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JP2018060216A JP2021070634A (en) | 2018-03-27 | 2018-03-27 | Enterovirus vaccine |
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Applications Claiming Priority (1)
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JP2018060216A JP2021070634A (en) | 2018-03-27 | 2018-03-27 | Enterovirus vaccine |
Publications (1)
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Family Applications (1)
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---|---|---|---|
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Country | Link |
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2018
- 2018-03-27 JP JP2018060216A patent/JP2021070634A/en active Pending
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