JP2021047170A - 生物学的試料を調製および分析するためのマイクロ流体装置 - Google Patents

生物学的試料を調製および分析するためのマイクロ流体装置 Download PDF

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Abstract

【課題】試料を装置から移動させることなく、従って汚染のリスクなしに、全ての工程を実施することを可能にする、汎用的な装置の提供。【解決手段】生物学的種を含有する生物学的試料を調製および分析するためのマイクロ流体装置であって、少なくとも２つのユニットＵ１、Ｕ２を含み、各ユニットは、単一の剛性支持体中に作製されたチャンバと、前記支持体Ｓ中に形成された第一のチャンバ１０と第二のチャンバ２０との間の流体の転送チャネル２２と、を含む、マイクロ流体装置に関する。この装置は、溶解、培養、および光学的読み取りによる検出などの生物学的試料の調製および分析の工程の一部または全部を行うことを可能にする。【選択図】図２Ｂ

Description

本発明は、生物学的種を含有する生物学的試料を調製および分析するためのマイクロ流体装置に関する。
この装置は、試料の調製および分析の全工程を同一の剛性支持体で行うことを特に可能にする。
ＰＣＲ (「ポリメラーゼ連鎖反応」)およびｑＰＣＲ (「定量ＰＣＲ」)の発明以来、核酸から微生物を検出および同定するための分子生物学を中心とした多数の応用が開発されている。ほとんどの場合、それは所定の標的(血液中のまれな細胞、気道中のウイルス、食物基質中の細菌)に特異的なＤＮＡプライマーを用いるＰＣＲ検出の問題である。検査中の細胞を培養することによる予備増幅の段階は、しばしば、検査が非常に低い濃度を検出するのに十分な感度を常に有しているわけではなく、または、マトリックスおよび試料が位置する細胞(細菌性又はウイルス性)溶解試薬が、検査の阻害剤であるため(例えば、血液、チーズなど)、必要である。次いで、標的細胞またはＤＮＡの希釈をもたらす阻害剤を減少させるために、試料を希釈することが必要である。
現在、公知のアッセイは、３つの主要な段階、すなわち、試料を培養する段階、次いで、ＤＮＡをアクセス可能にするために細胞を溶解する段階、次いで、存在する核酸の精製または希釈の段階、および生体分子増幅の段階で実施される。培養段階は安価であるが、非常に長いことが判明している(８時間から７２時間まで)。その部分では、核酸の増幅のためのＤＮＡ放出および精製/希釈の段階は、多くの操作を必要とし、訓練されていない人による理解を困難にする。もちろん自動的に実行することもできるが、既知の機器はしばしば物々しく高価である。
したがって、生物学的試料中の病原体の検出は、しばしば、現場での迅速な分析には適さない重装備を用いて実験室で行われる。注意すべきこととして、生物学的試料上に前記検出を設定することは、以下の全てのステップを実施することを必要とし得る。
- 培地の濃縮、
- サンプル中に存在する生物学的種を濃縮すること、
- 標的生物学的種の精製、
- 試料中に含まれる生物学的種を溶解して、当該種を破壊し、分析すべき生物学的物質を放出すること、
- 生物学的材料の精製および/または希釈、
- ｑＰＣＲ、ＬＡＭＰ、ＲＰＡタイプ、または生体分子増幅または配列決定による任意の他の検出方法の生体分子増幅、
- 例えば蛍光法、比色法、ホログラフィックイメージング法、比濁法、増幅反応に関連するｐＨ測定法などによる各サイクルにおける増幅の視覚的検出。
ＷＯ２０１５／１８１７４３ Ａ １ ＥＰ３２２２９８９Ｂ１ ＥＰ０５８６１１２Ａ２ ＵＳ６３１２９３０Ｂ１
「Visual detection of isothermal nucleic acid amplification using pH-sensitive dyes」、Nathan A.Tanner et al.-BioTechniques, Vol.58, No.2, Feb 2015, pp.59-68 「Colorimetric detection of loop-mediated isothermal amplification reaction by using hydroxy naphthol blue」、Motoki Goto et al.-BioTechniques, Vol.46, No.3, March 2009, pp.167-172 「Loop-Mediated Isothermal Amplification Assay for Rapid Detection of Common Strains of Escherichia coli」、Hill J, Beriwal S, Chandra I, et al.-Journal of Clinical Microbiology 2008;46 (8) :2800-2804 doi:10.1128/JCM .00152-08 「Visual Detection of Norovirus Genogroup II by Reverse Transcription Loop-Mediated Isothermal Amplification with Hydroxynaphthol Blue Dye」、 Jianming, Ziqian Xu, Kai Nie, Xiong Ding, Li Guan, Ji Wang, Yuying Xian, Xiyang Wu, Xuejun Ma-Food and Environmental Virology, September 2014, Volume 6, Issue 3, pp 196-201
上記の工程のいくつか、特に濃縮、精製および機械的溶解の工程を実施することを可能にする装置は、先行技術から知られている。特許出願ＷＯ２０１５／１８１７４３ Ａ １は、このような装置を特に記載している。後者では、機械的溶解は、２つの壁の間の剪断によって行われ、２つの壁の一方は粗い接触面を有する。このような装置は、本質的に、粉砕を行うことを可能にし、生物学的試料のより完全な分析、すなわち、試料を装置から移した後に行わなければならない視覚的検出による分析を実施するのに適しておらず、これは、試料の汚染をもたらし、結果を歪める可能性がある。
また、比色法や濁度法による増幅や検出によって病原体の存在を検出することを可能にする溶液もある。この種のソリューションは、例えば、次のような文献で説明されている。
-Visual detection of isothermal nucleic acid amplification using pH-sensitive dyes、Nathan A.Tanner et al.-BioTechniques, Vol.58, No.2, Feb 2015, pp.59-68
-Colorimetric detection of loop-mediated isothermal amplification reaction by using hydroxy naphthol blue、Motoki Goto et al.-BioTechniques, Vol.46, No.3, March 2009, pp.167-172
-Loop-Mediated Isothermal Amplification Assay for Rapid Detection of Common Strains of Escherichia coli、Hill J, Beriwal S, Chandra I, et al.-Journal of Clinical Microbiology 2008;46 (8) :2800-2804 doi:10.1128/JCM .00152-08
-Visual Detection of Norovirus Genogroup II by Reverse Transcription Loop-Mediated Isothermal Amplification with Hydroxynaphthol Blue Dye、 Jianming, Ziqian Xu, Kai Nie, Xiong Ding, Li Guan, Ji Wang, Yuying Xian, Xiyang Wu, Xuejun Ma-Food and Environmental Virology, September 2014, Volume 6, Issue 3, pp 196-201
その部分に関して、特許ＥＰ３２２２９８９Ｂ１は、上述の工程のいくつか、特に、濃縮、溶解および光学的読み取りによる検出を行うことを可能にするマイクロ流体装置を記載している。
したがって、この最後に述べた装置は特に完全であるが、上述したすべてのステップを実行することはできない。さらに、特定の工程が依然として任意である場合であっても、試料を装置から移動させることなく、従って汚染のリスクなしに、全ての工程を実施することを可能にする、我々が利用できるより汎用的な装置を有することは有用である。
生物学的試料を調製および分析することを可能にする多様なマイクロ流体装置は、
単一の剛性支持体と、
支持体の壁によって区切られたゼロでない容積の第一のチャンバと、前記第一のチャンバを第一の空間および第二の空間に分離するフィルタと、前記支持体に形成され、一端が前記支持体の表面上に開口し、他端が前記第一の空間内に開口した第一のチャネルと、前記支持体に形成され、一端が前記支持体の表面上に開口し、他端が前記第二の空間内に開口する第二のチャネルと、を含む第一のユニットと、
前記剛性支持体内に形成され、前記支持体の透明の壁によって少なくとも部分的に画定される第二のチャンバと、前記支持体内に形成され、一端が前記支持体の表面上に開口し、他端が前記第二のチャンバ内に開口する第三のチャネルと、を含む第二のユニットと、
第一のチャンバと第二のチャンバとの間の流体移送のための第一のチャネルであって、前記支持体内に形成され、一方では前記第二のチャンバ内へ、他方では第一のバイパスノードで前記第二のチャネル内への開口する第一のチャネルと、
第一のチャンバを、第二のチャネルのみを介して外部のみに接続、または、第一の転送チャネルを介して第二のチャンバのみに接続、を選択するために配置された第一の流れ切替手段と、
を備える。
特定の特徴によれば、第一のユニットは、前記第一のチャンバの底部に形成された粗い接触面を含む。
別の特定の特徴によれば、第一のチャンバは、変形可能な膜によって閉じられる。
別の特定の特徴によれば、第一のユニットは、生物学的試料を調製および分析するための方法の以下のステップのうちの1つ以上を実施するように構成されており、
- 生物学的試料中に存在する生物学的種を濃縮し、
- 洗浄して生物学的種を浄化するために洗浄し、
- 培地を受け取り、
- 生物学的種を培養し、
- 生物学的物質を放出するために生物学的種を溶解し、
- 生物学的物質を分離する。
別の特定の特徴によれば、第二のユニットは、生物学的試料を調製および分析するための方法の以下のステップのうちの1つ以上を実施するように構成されており、
- 生物学的種を培養し、
- 前記培養ステップ中の成長を視覚的に監視し、
- 生体分子増幅により、分離された生物学的物質中の病原体の存在を検出する。
別の特定の特徴によれば、この装置は、第三のチャネルをシールする第一の疎水性膜を含む。
別の特定の特徴によれば、この装置は、
- 前記剛性支持体内に形成され、前記支持体の透明壁によって少なくとも部分的に区切られた第三のチャンバと、前記支持体内に形成され、一端が前記支持体の表面上に開口し、他端が前記第三のチャンバ内に開口する第四のチャネルとを含む第三のユニットを備える。
別の特定の特徴によれば、この装置は、
-第一のチャンバ (１０) と第三のチャンバとの間の流体移送のための第二のチャネルであって、前記支持体内に形成され、一方で前記第三のチャンバ内へ、他方で第二のバイパスノードで前記第一のチャネル内へ開口している第二のチャネルを備える。
別の特定の特徴によれば、この装置は、第一のチャンバを、第一のチャネルのみを介して外部のみに接続、または、第二の転送チャネルを介して第三のチャンバのみに接続、を選択するために配置された第二の流れ切替手段を備える。
別の特定の特徴によれば、第三のユニットは、生物学的試料を調製および分析するための方法の以下のステップを実施するように構成されており、生体分子増幅により、分離された生物学的物質中の病原体の存在を検出する。
別の特定の特徴によれば、この装置は、第四のチャネルをシールする第二の疎水性膜を含む。
ｑＰＣＲ型の反応は、インターカレーターまたはプローブに連結された標的ＤＮＡまたはＲＮＡ配列(特に1つの生物の代表)の増幅からなり、この配列の増幅の際に光学装置によって検出可能な蛍光を生成する。したがって、反応中に蛍光レベルが増加する場合、これは増幅反応が起こり、したがって標的生物のＤＮＡまたはＲＮＡが実際に存在したことを意味する。しかし、反応がない場合には、これが求められている生物の不在によるものであり、偽陰性を生じさせる増幅反応の阻害によるものではないことを確認できる必要がある。増幅反応に関与する酵素は、実際には、分析される試料によって供給される多くの阻害剤に敏感である。
増幅の欠如が実際に標的の欠如を意味することを保証するために、内部反応制御が実施される。ほとんどの場合、目的の試料と同時に増幅される別のＤＮＡ標的を試験に意図的に添加する。したがって、二つの反応を区別できるようにする必要がある。いくつかの戦略が工業的に用いられている。
-1つは、独立した反応として、制御を並行して行うために試料の一部を使用することである。
これは、最初の試料を分画することを必要とし、アッセイの感度/代表性の損失をもたらす。利点は、この制御のために任意の増幅の検出技術を使用することが可能であることである(例:蛍光ＤＮＡインターカレーター)。
-試料の***を避けるために、別の戦略は、標的配列と同じ反応で制御を行う、例えば、標的配列に特異的なＤＮＡプローブおよび制御配列に特異的なＤＮＡプローブを並行して用いる(プローブごとに異なる蛍光色素で)。この溶液は、試料全体をアッセイすることを可能にするが、すべての検出技術、特に、非特異的インターカレート剤、配列、または任意の他の非特異的配列検出方法(比色法、ｐＨ測定等)の使用と適合しない。
特許出願ＥＰ０５８６１１２Ａ２および特許ＵＳ６３１２９３０Ｂ１は、それぞれ、制御標的を追加することによって、偽陰性を除去することを可能にする検出方法を記載している。
したがって、本発明は、内部容積を成形することによって、第二のチャンバに特定の構造を与えることも目的とする。
別の特定の特徴によれば、第二のチャンバは、内部反応制御のための化合物を受容することを意図した少なくとも1つの凹部を含む。
別の特定の特徴によれば、第二のチャンバは、いくつかの重なり合った層からなり、前記凹部は、前記層のうちの1つのみに形成される。
本発明は、また、生物学的種を含有する生物学的試料を調製および分析するための方法であって、上記で定義されたマイクロ流体装置を用いて実施され、その中で:
-第一のユニットは、前記方法の以下のステップのうちの1つ以上を実行するように構成されており、
・生物学的試料中に存在する生物学的種を濃縮し、
・生物学的種を浄化するために洗浄し、
・培地を受け取り、
・生物学的種を培養し、
・生物学的物質を放出するために生物学的種を溶解し、
・生物学的物質を分離し、
-第二のユニットは、前記方法の以下のステップのうちの1つ以上を実行するように構成されおり、
・生物学的種を培養し、
・前記培養ステップ中の成長を視覚的に監視し、
・生体分子増幅により、分離された生物学的物質中の病原体の存在を検出し、
-第三のユニットは、前記方法の次のステップを実行するように構成されており、
・生体分子増幅により、分離された生物学的物質中の病原体の存在を検出する。
その他の特徴および利点は、添付図面を参照して以下に与えられる詳細な説明において明らかにされる。
生物学的種を含有する試料を調製および分析するための方法の種々の可能な構成を示す。 本発明の装置の３つの実施形態を示す。 本発明の装置の３つの実施形態を示す。 本発明の装置の３つの実施形態を示す。 図２Ａの装置を用いて行われる調製および分析の異なる工程を示す。 図２Ａの装置を用いて行われる調製および分析の異なる工程を示す。 図２Ａの装置を用いて行われる調製および分析の異なる工程を示す。 図２Ａの装置を用いて行われる調製および分析の異なる工程を示す。 図２Ｂの装置で実施される調製および分析の異なる工程を示す。 図２Ｂの装置で実施される調製および分析の異なる工程を示す。 図２Ｂの装置で実施される調製および分析の異なる工程を示す。 図２Ｂの装置で実施される調製および分析の異なる工程を示す。 図２Ｂの装置で実施される調製および分析の異なる工程を示す。 図２Ｂの装置で実施される調製および分析の異なる工程を示す。 図２Ｂの装置で実施される調製および分析の異なる工程を示す。 図２Ｂの装置で実施される調製および分析の異なる工程を示す。 図２Ｃの装置で行われる調製および分析の異なる工程を示す。 図２Ｃの装置で行われる調製および分析の異なる工程を示す。 図２Ｃの装置で行われる調製および分析の異なる工程を示す。 図２Ｃの装置で行われる調製および分析の異なる工程を示す。 図２Ｃの装置で行われる調製および分析の異なる工程を示す。 図２Ｃの装置で行われる調製および分析の異なる工程を示す。 図２Ｂの変形例における本発明の装置の一実施形態例を分解図で示す。 本発明の装置において使用され得る増幅チャンバの例を示す。 本発明の装置において使用可能な増幅チャンバの下部層のいくつかの実施形態を示す。 本発明の装置において使用可能な増幅チャンバの下部層のいくつかの実施形態を示す。 本発明の装置において使用可能な増幅チャンバの下部層のいくつかの実施形態を示す。
本発明のマイクロ流体装置は、生物学的試料を分析するためのものである。この生物学的試料は、例えば、調査される生物学的物質を含有する生物学的種を含有する流体の形態である。
「生物学的種」とは、特に、微生物、細胞、胞子、ウイルスなどを意味し「調査すべき生物学的材料」とは、例えば、細胞から得られる核酸分子(ＲＮＡ、ＤＮＡ)、タンパク質、リポ多糖類 (ＬＰＳ) 、リポテイコ酸 (ＬＴＡ) などを意味する。
「流体」とは、特に、液体、気体等を意味する。液体は、異なる粘度を有してもよく、例えば、ペーストまたはゲルの形態であってもよい。
以下の説明において、「下」、「上」、「高い」および「低い」という用語は、垂直な主軸 (Ｘ) を参照するものとして理解されるべきである。
以下の説明において、「外部」、「外側」、「内部」、「内側」という用語は、以下に説明される装置のチャンバに関するものとして理解されなければならない。
図1を参照すると、生物学的試料の完全な分析(カラムＣ０)は、連続的に実施される以下の工程を含み得る。
-Ｅ１:生体試料中に存在する生物学的種の濃縮、
-Ｅ２:精製のための洗浄、培養中の妨害物質の除去、
-Ｅ３:培地の供給、
-Ｅ４:生物学的種の培養、
-Ｅ５:培養中の増殖およびコロニー数の視覚的モニタリング、
-Ｅ６:洗浄、ＰＣＲ阻害物質の除去、
-Ｅ７:サンプル中に存在する生物学的種を機械的に溶解し、そこから調査すべき生物学的物質を抽出すること、
-Ｅ８:調査対象の生物学的材料と存在する汚染物質との分離、
-Ｅ９:ｑＰＣＲ、ＬＡＭＰ、ＲＰＡタイプの生体分子増幅および光学的検出 (例えば、蛍光、比色測定、ホログラフィックイメージング、比濁測定、増幅反応に関連するｐＨ測定) による生物材料中の病原体の存在の検出。
濃縮工程において、生物学的種を含む例えば液体形態の生物学的試料は、フィルタを通過させるためにチャンバ内に注入される。試料の液体部分とフィルタを通過するすべての粒子／分子は、排気チャネルを介して回収され、分析から除去される。次いで、生物学的種をチャンバの空間に濃縮する。
チャンバ内に存在する生物学的種を洗浄するために洗浄／すすぎ溶液を注入してもよい。
培地を注入して生物学的種を培養する。
成長モニタリング工程は、光学的読み取りによって、培養工程中の細胞成長をモニタリングすることを可能にする。
生物学的種の機械的溶解は、粗い接触表面に対して試料中に存在する生物学的種を粉砕するために使用される。機械的な溶解が行われると、例えばＤＮＡ分子や汚染物質のような、研究されるべき生物学的物質が得られる。
被検査生体物質と汚染物質との分離は、被検査生体物質を溶出させるために、増幅試薬を含む液を注入することにより行う。このようにして注入された液体溶液の一部は、例えば、フィルタを通過するＤＮＡ分子などの、検査される生物学的物質を担持する。
汚染物質と調査される生物学的物質との間の分離が一旦行われると、生物学的物質の増幅の反応により、分離された生物学的物質中の病原体の存在を検出することができる。増幅反応は、増幅混合物を添加し、試料が置かれたチャンバを加熱することによって行われる。チャンバが加熱される温度は、使用される増幅反応のタイプに依存する。ＬＡＭＰ (「ループ媒介等温増幅」)、ＰＣＲ (「ポリメラーゼ連鎖反応」)、ＮＡＳＢＡ (「核酸配列に基づく増幅」)、ＲＰＡ (「リコンビナーゼポリメラーゼ増幅」)等、あらゆる増幅反応が可能であり、ＬＡＭＰ型の増幅には、６０℃〜６５℃の温度で加熱することが有利である。この反応により、検出すべき生体物質の分子、例えばＤＮＡ分子を増幅することができる。生体物質の増幅反応では、病原体の有無を検出する。これには、例えば比色法、蛍光法、電気化学法、ｐＨ測定法、濁度測定法などの種々の方法を用いることができる。その他の検出方法も考えられる。ｐＨ測定型の検出方法としては、ｐＨを検出するための電極を装置に集積化することができる。
しかしながら、上記の工程のいくつかは任意であり、したがって、分析方法は、種々の可能な構成を仮定することができる。
第一の構成Ｃ１(図１) において、本方法は、以下のステップを含むことができる。
-Ｅ１:濃縮、
-Ｅ２:洗浄、
-Ｅ３:培地の供給、
-Ｅ４:培養、
-Ｅ５:培養中の増殖およびコロニー数の視覚的モニタリング。
第一の構成のステップＥ１〜Ｅ５を繰り返す構成Ｃ１′では、処理のための細菌を収集するために、ステップＥ５の後にステップＥ５′を加えることができる。
第二の構成Ｃ２(図１)において、本方法は、以下の工程を含むことができる。
-Ｅ１:濃縮、
-Ｅ２:洗浄、
-Ｅ３:培地の供給、
-Ｅ４:培養、
-Ｅ６:洗浄、
-Ｅ７:溶解、
-Ｅ８:分離、
-Ｅ９:増幅による検出。
また、構成Ｃ２のステップＥ１〜Ｅ８を繰り返す構成Ｃ２′において、ステップＥ９に代えてステップＥ ８′を追加してもよい。この工程は、特にＤＮＡ配列決定の観点から、検出／保存のために分離されたＤＮＡを再び取り出すことを含む。
第三の構成Ｃ３(図１)において、本方法は、以下の工程を含むことができる。
-Ｅ１:濃縮、
-Ｅ３:培地の供給、
-Ｅ４＋Ｅ５:培養／増殖のモニタリング、
-Ｅ６:洗浄、
-Ｅ７:溶解、
-Ｅ８:分離、
-Ｅ９:増幅による検出。
最終的な構成Ｃ４では、ステップＥ２〜Ｅ５を省略してもよい。次のようになる。
-Ｅ１:濃縮、
-Ｅ６:洗浄、ＰＣＲ阻害物質の除去、
-Ｅ７:溶解、
-Ｅ８:分離、
-Ｅ９:増幅による検出。
この構成Ｃ４では、放出されたＤＮＡを再び取り出すために、ステップＥ８′を含む変形も考えられる。
本発明は、上記構成のうちの少なくとも２つを実現するように構成されたマイクロ流体装置を提案することを目的とする。
図２Ａ乃至図２Ｃを参照して、マイクロ流体装置は、単一の剛性支持体Ｓを含む。以下に記載される図６は、装置の実施形態例を示す。
この剛性支持体Ｓは、分析方法のステップを実施するのに適したマイクロ流体ネットワークを組み込む。マイクロ流体ネットワークは、使用される分析方法の構成に依存して異なる構造を想定し得ることが分かるであろう。
支持体Ｓは、有利には、平坦な下部壁と、その下部壁上に積み重ねられた、前記主軸に沿っていくつかの重なり合った層を有する構造と、を含む。
装置のマイクロ流体ネットワークは、２つのユニットＵ１、Ｕ２、または３つのユニットＵ１、Ｕ２、Ｕ３を含み、それぞれは、選択される方法の構成に応じて、分析方法の１つ以上のステップを実施するために使用される。
本発明の装置において、生物学的種は、薄い層で培養され、その容量は、例えば、１μ〜１ｍｌの範囲であってもよい。薄層培養の利点は、従来の方法で行った培養よりもはるかに速く(２〜３時間程度の時間)コロニーが見えることである。細胞の濃縮段階と薄層培養を組み合わせることにより、非常に低電荷の細胞試料の分析が可能である。したがって、例えば、汚染レベルを監視する目的で、大量の水を分析することが可能である。
さらに、この装置により、ＤＮＡ分子の精製の全工程を実施し、次いで、希釈工程および汚染のリスクなしに、増幅のためにそれらを別のチャンバに移動させることが可能である。
提案され、図２Ａ乃至図２Ｃに示された３つの実施形態において、第一のユニットＵ１は、前記支持体に形成された第一のチャンバ１０を備える。このチャンバ１０は、非ゼロ容積を有し、支持体Ｓの壁によって区切られている。
第一のユニットＵ1は、流体を第一のチャンバ１０内に注入するため、またはこの第一のチャンバから流体を排出するために、支持体に形成された第一のチャネル１１を含む。第一のチャネル１１は、例えば支持体Ｓの上壁を貫通する開口を含む第一の端部と、第一のチャンバ１０内に開口する第二の端部とを含む。第一のチャネルの第一の端部は、例えば垂直に配置され、その第二の端部は、例えば水平に第一のチャンバ１０内に開口する。
第一のユニットＵ１は、第二のチャネル１２を備える。この第二のチャネル１２は、また、例えば支持体Ｓの上壁を貫通する開口を形成する外部と連通する第一の端部と、第一のチャンバ１０によって形成される空間と連通する第二の端部と、を含む。この第二のチャネル１２を介して、流体を前記第一のチャンバに注入するか、または前記第一のチャンバから流体を排出することも可能である。例えば、第一の端部は垂直に配置され、第二の端部は水平に配置される。第一のチャンバ１０は、第一のチャネル１１と第二のチャネル１２との間に配置される。
第一のチャンバ１０の上部は、可撓性の伸縮可能な膜１３によって閉鎖されてもよい。このように、第一のチャンバのレベルでは、支持体の上壁は、膜１３によって密閉的に覆われた開口を含む。したがって、膜１３は、固定のための任意の適切な溶液、例えば接着によって支持体内に固定される。この膜１３は、例えば、type MicroAmp (３Ｍの登録商標)のフィルムからなり、その定着点に対して、少なくとも第一のチャンバの底部まで、超弾性的に変形するのに適した厚さ、寸法及び構成を有する。
膜１３は、いくつかの構成間で可逆的に変形することができる。これは、支持体Ｓの外部に向かって超弾性変形によって伸長することができ、圧縮によって第一のチャンバ１０の内部に後退することができ、又は休止することができる。「超弾性材料」とは、第一の表面積から第二の表面積に変化することができる表面を有することができる材料を意味し、第二の表面積は、第一の表面積の少なくとも５倍、例えば、第一の表面積の１０倍または５０倍に等しい。
また、第一のユニットＵ１は、横フィルタ１４を有し、横フィルタ１４は第一のチャンバ１０内に配置され、第一のチャンバ１０を二つの空間１００、１０１に分離する。この２つの空間は、例えば重なり合っており、従って、下部空間１００がフィルタ１４の下に位置し、上部空間１０１がフィルタ１４の上に位置するように設計される。このフィルタ１４は、フィルタ１４の孔を介して一方の空間から他方の空間への通過のみを可能にするように、チャンバによって形成された空間内に延伸された薄い可撓性フィルムの形で全体的にまたは部分的に作られることが好ましい。このフィルムは、支持力が作用したときに略垂直方向に伸張する弾性変形性を有し、この弾性変形性は、チャンバ１０の底部に到達するのに十分なレベルである。フィルタ１４の平均孔径は０．２μｍ〜５０μｍ、例えば０．２μｍ〜１μｍであり、微生物を分離する。孔径は、もちろん、試料中に存在する異なる生物学的種間の分離を確実にするように適合される。フィルタ１４は、例えば、その定着点に対してチャンバ１０の底部まで変形するのに適した厚さ、寸法及び構成の膜からなる。それは膜と同じ超弾性特性を含むことができる。
特定の特徴によれば、第一のチャネル１１は第一のチャンバ１０の上部空間１０１に開口し、第二のチャネル１２は第一のチャンバ１０の下部空間１００に開口する。従って、二つのチャネルの口は、チャンバ内に配置されたフィルタ１４によって分離される。
図２Ｂおよび図２Ｃを参照して、第一ユニットＵ１は、有利には、第一のチャンバ１０の底部に配置された粗い接触面１５を含むことができる。この粗い接触面１５は、第一のチャンバの底部の大部分にわたって延びている。それは、０．１μｍと１０μｍとの間、好ましくは０．２μｍと３μｍとの間の平均表面粗さのパラメータを含む。この粗い接触面１５は、装置内に配置された生物学的試料中に存在する生物学的種の機械的溶解を可能にすることを意図している。好ましくは、機械的溶解は、前記生物学的種を粉砕することによって、前記粗い接触表面上の摩耗によって達成される。粉砕操作は、適当な粉砕部材を使用して、粗い接触面に対する生物学的種の摩擦の移動によって行われる。この部材は、例えば、プラスチックまたは金属製のヘラまたはロッドである。この部材は、チャンバ１０の外側から塗布され、その端部が膜１３の外側表面に塗布され、膜１３およびフィルタ１４を第一のチャンバ１０の底部に向かって引き伸ばし、試料中に存在する生物学的種を粗い接触面１５に擦り付ける。
その部分では、装置の第二のユニットＵ２は、支持体Ｓの壁によって区切られたゼロでない容積の第二のチャンバ２０を含む。第二のユニットＵ２は、また、前記支持体に形成された第三のチャネル２１を含む。この第三のチャネル２１は、例えば支持体の上壁を貫通して形成された開口を含む第一の端部と、前記第二のチャンバ２０内にのみ開口する第二の端部と、を含む。この第三のチャネル２１の第一の端部は、例えば垂直に配置され、その第二の端部は、例えば水平に第二のチャンバ２０内に開口している。この第三のチャネルの第一の端部は、例えば、疎水性膜２１０によってシールされており、すなわち、液体に対しては不透過性であるが、空気のようなガスに対しては透過性である。この疎水性膜２１０は、ＰＴＦＥ (ポリテトラフルオロエチレン) 系の材料で形成されていてもよい。
支持体の２つの横断壁、有利には、上部壁２００及び第二のチャンバ２０を部分的に画定する平行な下部壁２０１は、透明材料で作られており、従って、第二のチャンバの内部空間を通して光学的読み取りを行うことを可能にする。「透明な」という用語は、使用される材料が可視光に対して少なくとも部分的に透明であり、その結果、該光の少なくとも８０％が通過することができることを意味する。したがって、チャンバの内部を見るために十分に透明であることが理解されるであろう。下側の壁はガラスでできていてもよく、上側の壁は、上側から前記第二のチャンバを閉じるように接着された取り外し可能な接着剤から形成されていてもよい。
本発明の特定の特徴によれば、装置は、また、前記支持体に形成された第一の転送チャネル２２を含む。この第一の転送チャネル２２は、第一のチャンバ１０、より正確にはその下部空間１００を第二のチャンバ２０に接続することを意図している。
有利には、第一の転送チャネル２２は、第二のチャネル１２に直接開口する第一の端部を含み、従って、この第二のチャネル１２上にバイパスノードを形成する。それは、第二のチャンバに直接開口する第二の端部を含む。
装置は、例えば、第一のチャンバを、第二のチャネルのみを介して外部のみに接続、または、 第一の転送チャネルを通って第二のチャンバにのみに接続、を選択するために、第二のチャネル１２上に配置され得る切替手段をさらに備える。
これらの切替手段は、漏斗状の取り外し可能な中空円錐形１２０から成ることができる。その頂点によって、切替手段は、第二のチャネル１２に挿入されると、外部と第一のチャンバとの間を連通させ、その壁はバイパスノードのレベルで作られる第一の転送チャネル２２の入口をブロックする。切替手段が除去されると、第二のチャネル１２の第一の端部は、例えば、支持体の表面に塗布された接着剤１２１を用いてシールされ得、次いで、第一の転送チャネル２２と第二のチャネル１２との間の接続が開放され、流体が第一のチャンバ１０と第二のチャンバ２０との間を循環することを可能にする。
もちろん、切替手段は他の実施形態に従って構成されてもよい。一般的な原理は、転送チャネルをシールすることによって第一のチャンバへのアクセスを得ることができるか、または、第一のチャンバと第二のチャンバとの間の接続を可能にすることである。したがって、切替手段は、以下のような単純なバルブであってもよい。
- バルブは、バイパスノードのレベルで転送チャネル２２の口をシールすることによって、第一の位置で第二のチャネルへのアクセスを許可することができる。
- バルブは、第二の位置では、第二のチャネル１２と転送チャネル２２との間の接続を開くことができる。
このように、２台のユニットＵ１、Ｕ２のみの構成で、本方法を、上述した第一の構成または第二の構成に従って実施することができる。
図２Ａの装置に実装される方法の第一の構成Ｃ１では、図３Ａ乃至図３Ｄを参照して、工程は次のようになる。
-Ｅ１:液体試料ＥＣＨは、第二のチャネル１２を介して、例えばピペットにより、第一のチャンバ１０に円錐体１２０を介して注入される。円錐体１２０は、バイパスノードのレベルで第一の転送チャネル２２の入口をシールするのに十分な深さで第二のチャネル内に配置される。同時に、第一のチャネル１１は、外部に開放され、第一のチャンバ１０の充填中にベントの役割を果たし、濾過された液体を排出する。注入中、注入圧力の影響下で、試料はフィルタ１４によって濾過される。対象となる生物学的種４は、第一のチャンバ１０の下部空間１００に保持され、残りは第一のチャネル１１を介して装置の外部に排出される。
-Ｅ２:同一の構成で、洗浄工程 (任意) を行う。第二のチャネル１２を介して円錐体を通して洗浄液Ｌを注入し、第一のチャンバ１０の下部空間１００に捕獲された生物学的種４を浄化する。この洗浄液は、第一のチャネル１１を通して排気される。
-Ｅ３:第一のチャネル１１を介して培地ＭＣを注入し、第一のチャンバ１０内に浸透させる。第二のチャネル１２の入口／出口は、接着剤１２１によって閉じられ、第一の転送チャネル２２は、開かれており、汚染の危険なしに、第一のチャンバ１０と第二のチャンバ２０との間の密閉された連通を可能にする。
-Ｅ３:培地ＭＣ中の生物学的種４は、第一の転送チャネル２２を介して第二のチャンバ２０に移送される。移送のために、空気圧Ｐが第一のチャネル１１に加えられてもよい。第三のチャネル２１は疎水性膜２１０によって封止されており、移送中に空気を排気することができ、液体の流出を防止する。培養工程は１６時間かかり、第二のチャンバ２０を３７℃の温度に加熱する。
-Ｅ４〜Ｅ５:光学リーダＬＯを活性化して、第二のチャンバ２０内に存在する生物学的種の培養をモニターする。光学的読み取りは、第二のチャンバ２０を画定する二つの平行な壁２００、２０１の透明性によって可能となる。
図２Ｂの装置に実装された方法の第２の構成Ｃ ２では、図４Ａ乃至図４Ｈを参照して、工程は次の通りである。
-Ｅ１:液体試料ＥＣＨは、第二のチャネル１２を介して、例えばピペットにより、第一のチャンバ１０に円錐体１２０を介して注入される。円錐体は、第二のチャネル１２内に、バイパスノードのレベルで第一の転送チャネル２２の入口をシールするのに十分な深さで配置される。同時に、第一のチャネル１１は、外部に開放され、第一のチャンバ１０の充填中にベントの役割を果たし、濾過された液体を排出する。注入中、注入圧力の影響下で、試料ＥＣＨはフィルタ１４によって濾過される。対象となる生物学的種４は、第一のチャンバ１０の下部空間１００に保持され、残りは第一のチャネル１１を介して外部に排出される。
-Ｅ２:その後、洗浄工程 (任意) を行う。第二のチャネル１２を介して円錐体１２０を介して洗浄液Ｌを注入し、第一のチャンバ１０の下部空間１００に捕獲された生物学的種４を浄化する。この洗浄液Ｌは、第一のチャネル１１を介して外部に排出される。
-Ｅ３:第一のチャネル１１を介して培地ＭＣを注入し、第一のチャンバ１０内に浸透させる。
-Ｅ４:第一のチャンバ１０で培養を行う。培養工程には４時間を要し、第一のチャンバ１０を３７℃の温度に加熱する。
-Ｅ６:第二の流路を介して洗浄液Ｌを注入し、第一のチャンバの下部空間に存在する生物学的種を洗浄する。
-Ｅ７:第一のチャンバで生物学的種４の溶解を行う。この溶解は、生物学的種４を、第一のチャンバ１０の底部に存在する粗い接触面１５に対して粉砕することからなる。
-Ｅ８:２つのチャンバ間の転送チャネル２２が開放される。増幅試薬ＲＡを第一のチャネル１１を介して注入し、溶解後に得られた生体物質４０を溶出させ、目的の液体を第二のチャンバ２０に転送チャネル２２を介して移送する。
-圧力Ｐは、第一のチャネル１１を通して加えられて、対象の液体の第二のチャンバ２０への移送を行うことができる。
-第二のチャンバ内で４５分間増幅反応を行い、第二のチャンバを６０℃に加熱する。光学リーダＬＯを作動させて、第二のチャンバ２０内の病原体の検出を行う。第二のチャンバを画定する二つの平行な壁２００、２０１の透明性により光学的読み取りが可能となる。
図２Ｃを参照すると、装置は、有利には、第三のユニットＵ３を含むことができ、これにより、上述の第三の構成Ｃ３による方法を実施することができる。第三のユニットＵ３は、支持体Ｓと一体化された非ゼロ容積の第三のチャンバ３０を含む。第三のユニットＵ３は、流体を第三のチャンバ３０内に注入するため、またはこの第三のチャンバ３０から流体を排出するために支持体Ｓ内に形成された第四のチャネル３１を含む。第四のチャネル３１は、例えば支持体の上壁３００を貫通する開口を有する第一の端部と、第三のチャンバ３０内に開口する第二の端部とを含む。第四のチャネル３１の第一の端部は、例えば垂直に配置され、その第二の端部は、例えば水平に第三のチャンバ３０内に開口する。この第四のチャネル３１の第一の端部は、例えば、疎水性膜３１０によってシールされており、すなわち、液体に対しては不透過性であるが、空気のようなガスに対しては透過性である。この疎水性膜は、ＰＴＦＥ (ポリテトラフルオロエチレン) タイプの材料で形成することができる。
支持体の２つの壁、有利には、上壁３００及び下壁３０１は、第三のチャンバ３０を画定しており、透明材料で作られているので、この第三のチャンバを通して光学的読み取りを行うことが可能である。「透明な」という用語は、使用される材料が可視光に対して少なくとも部分的に透明であり、この光の少なくとも８０％を通過させることを意味する。したがって、チャンバの内部を見るために十分に透明であることが理解される。下側の壁はガラスでできていてもよく、上側の壁は取り外し可能な接着剤で形成されていて、上側から前記第三のチャンバを閉じるように接着されていてもよい。
本発明の特定の特徴によれば、図２Ｃのこの変形例では、装置は、前記支持体Ｓ内に作られた第二の転送チャネル３２も含む。この第二の転送チャネル３２は、第一のチャンバ１０、より正確にはその上部空間１０１を第三のチャンバ３０に接続することを意図している。
有利には、第二の転送チャネル３２は、第一のチャネル１１に直接開口する第一の端部を含み、従って、この第一のチャネル１１上にバイパスノードを形成する(第一の転送チャネルに対して対称的に)。それは、第三のチャンバ３０内に直接開口する第二の端部を含む。
第一の転送チャネルの場合と同様に、装置は、例えば、第一のチャンバを、 最初のチャネルを介して外部のみに接続、または、 第二の転送チャネルを介して第三のチャンバのみに接続、を選択するために第一のチャネル１１上に配置され得る切替手段をさらに備える。
これらの切換手段は、また、漏斗の形態の取り外し可能な中空円錐体１１０からなっていてもよい。切替手段が第一のチャネル１１に挿入されると、外部と第一のチャンバ１０との間の連通を可能にし、その壁はバイパスノードのレベルで行われる第二の転送チャネル３２の入口をブロックする。切替手段が引き抜かれると、第一のチャネル１１の第一の端部は、例えば支持体の表面に塗布された接着剤１１１を用いてシールされ、次いで、第二の転送チャネル３２と第一のチャネル１１との間の接続が開かれ、流体が第一のチャンバ１０と第三のチャンバ３０との間を循環することを可能にする。
第一の切替手段の場合と同様に、他の手段を使用してもよく、その目的は、第二の転送チャネルを密閉することによって第一のチャンバにアクセスするための解決策を提供すること、または第二の転送チャネルを介して第一のチャンバを第三のチャンバに接続することを可能にすることである。なお、上述した二位置弁方式の切換手段も同様に用いることができる。
図２Ｃの装置に実装された方法の第三の構成Ｃ３において、図５Ａ乃至図５Ｆを参照して、工程は次の通りである。
-Ｅ１:液体試料ＥＣＨは、第二のチャネル１２を介して、例えばピペットを用いて円錐体１２０を介して第一のチャンバ１０に注入される。円錐体１２０は、第二のチャネル１２内に、第一の転送チャネル２２の入口をバイパスノードのレベルでシールするのに十分な深さで配置される。同時に、第一のチャネル１１は、外部に開放され、第一のチャンバ１０の充填中にベントの役割を果たし、濾過された液体を排出する。注入中、注入圧力の影響下で、試料ＥＣＨはフィルタ１４によって濾過される。対象となる生物学的種４は、第一のチャンバ１０の下部空間１００に保持され、残りは第一のチャネル１１を介して外部に排出される。その後、洗浄工程(オプション、非表示)を行う。第二のチャネルを介して円錐体を介して洗浄液を注入し、第一のチャンバの下部空間に捕獲された生物学的種を浄化する。この洗浄液は、第一のチャネルを通って排気される。
-Ｅ３:第一のチャネル１１を介して培地ＭＣを注入し、第一のチャンバ１０内に浸透させる。第二のチャネル１２の入口/出口は接着剤１２１によって閉鎖され、第一の転送チャネル２２は開放され、汚染の危険なしに第一のチャンバ１０と第二のチャンバ２０との間を密閉して連通させることができる。
-Ｅ３:培地ＭＣ中の生物学的種４は、第一の転送チャネル２２を介して第二のチャンバ２０に移送される。移送のために、空気圧Ｐを第一のチャネルに加えてもよい。第三のチャネル２１は疎水性膜２１０によって封止されており、移送中に空気を排気することができ、液体の流出を防止する。
-Ｅ４〜Ｅ５:培養工程は、４時間かかる場合があり、第一のチャンバを３７℃の温度に加熱する。培養の光学的モニタリングは、第二のチャンバ２０を通して、光学リーダＬＯを用いて実施される。この第一読取り工程は、培養が有効であることを保証することを可能にする。例えば、無菌試験の場合、第二のチャンバ２０内で培養しても細菌が検出されなければ、そのまま操作を続けて細菌ＤＮＡの精製増幅を行っても意味がない。この方法は、分析の総コストを最小限に抑えることができる。
-Ｅ６:分析を継続する場合には、第三のチャネル２１を介して洗浄液Ｌを注入し、第二のチャンバ２０内に存在する生物学的種４を洗浄し、第一のチャンバ１０に第一の転送チャネル２２を介して試料を移送する。円錐体１１０は、第三のチャンバ３０へのアクセスを第二の転送チャネル３２を介して閉じるように配置される。
-Ｅ７:生物学的種４の溶解を第一のチャンバ１０で行う。この溶解は、生物学的種４を、第一のチャンバ１０の底部に存在する粗い接触面１５に対して粉砕することからなる。
-Ｅ８:第二の転送チャネル３２を開く。第二のチャネル１２を介して増幅試薬ＲＡを注入し、溶解後に得られた生体物質を溶出させ、第一のチャンバ１０から第三のチャンバ３０に目的の液体を移送する。
-第二のチャネルを通して圧力Ｐを加えて、対象の液体を第三のチャンバに移送することができる。
-第三のチャンバ内で４５分間増幅反応を行い、第二のチャンバを６０℃に加熱する。
光学リーダを作動させて第三のチャンバ内の病原体の検出を行う。第三のチャンバを区切る２つの平行な壁が透明であるため、光学的読み取りが可能である。
本発明のデバイスの汎用性は、それが２つのユニットＵ１、Ｕ２または３つのユニットＵ１、Ｕ２、Ｕ３を有するそのアーキテクチャにあるか否かにかかわらず、よりよく理解される。
要約すると、
-この方法の第一の構成Ｃ１または構成Ｃ１′では、第一のユニットＵ１をステップＥ１、Ｅ２およびＥ３に使用し、第二のユニットＵ２をステップＥ４およびＥ５に使用することができる。
-この方法の第二の構成Ｃ２または構成Ｃ２′では、第一のユニットＵ１をステップＥ１、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４、Ｅ６、Ｅ７およびＥ８に使用し、第二のユニットＵ２をステップＥ９に使用することができる。
-この方法の第三の構成Ｃ３では、ステップＥ１、Ｅ３、Ｅ６、Ｅ７、Ｅ８に第一のユニットＵ１を使用し、ステップＥ４、Ｅ５に第二のユニットＵ２を使用し、ステップＥ９に第三のユニットを使用することができる。
-本方法の構成Ｃ４では、第一のユニットＵ１をステップＥ１、Ｅ６、Ｅ７、Ｅ８に使用し、第二のユニットをステップＥ９に使用することができる。
２つの転送チャネルにより、汚染を回避しながらユニット間を簡単に移動できる。
装置は、例えば、添付図面に示されるように、少なくとも一つの加熱抵抗１９またはペルチェ素子からなる、各チャンバの内部空間を加熱するための手段を有利に組み込むことができる。抵抗は、例えば、ケーシングの下壁の下に固定される。電源２０は、例えば、抵抗１９を供給するために設けられる。電源は、例えば、上記で定義した範囲、すなわち２０℃〜１００℃の温度にチャンバを加熱するのに十分なエネルギーを供給する、一つ以上の電気セルを含むであろう。もちろん、他の加熱手段を使用することも可能であり、例えば、ケーシングの下壁の下に印刷またはスクリーン印刷によって堆積された導電性インクを含む。これらの加熱手段は、生物学的種の培養工程中または増幅反応中にチャンバを所定の温度に加熱するために使用される。
非限定的な態様では、図２Ｂにおけるその変形形態において、装置は、図６に示されるアーキテクチャに従って作製され得る。
図６において、支持体Ｓは、以下の特定の特徴を含む。
-支持体は、例えばＰＭＭＡまたはＣＯＣタイプのガラスまたはプラスチックの薄層５０を含む。
-薄層５０は、第一領域に、その上面の一部に溶解専用の粗い接触面１５を形成する研磨面で覆われている。
-少なくとも１／２の領域では、薄層５０は透明であり、第二のチャンバ２０の透明な下壁２０１を形成し、光学的読み取りを意図している。
-第一のマイクロ流体インプリントを担持する第一の層５１は、第一のチャンバ１０の下部空間１００を画成する第一のキャビティと、第二のチャンバ２０の下部を画成する第二のキャビティと、第三のチャネル２１の下部とを含む。第一のキャビティは、そのエッジが第一の研磨領域の周囲に配置され、第二のキャビティは、そのエッジが第二の読み取り領域の周囲に配置される。
-フィルタ１４は、第一のチャンバの下部空間１００を覆うように第一の層に付着され、疎水性膜２１０は、第三のチャネル２１の下部に付着される。
-第二のマイクロ流体インプリントを有する第二の層５２は、第一の層５１の上面に堆積され、また、フィルタ１４および疎水性膜２１０を覆う。この第二のマイクロ流体インプリントは、第一のチャンバ１０の上部空間１０１を形成するキャビティと、第二のチャンバ２０の中間部分を形成する第二のキャビティと、第三のチャネル２１の上部部分とを含む。
-第三のマイクロ流体インプリントを有する第三の層５３は、第二の層５２の上面に堆積される。この第三のマイクロ流体インプリントは、第一のチャンバ１０の上部および第二のチャンバ２０の上部を含む。
-ガラスまたはプラスチックの層は、第二のチャンバのレベルで第三の層５３の上面を覆うような寸法で、支持体の透明な上壁２００を形成する。
-カバー５４、例えばＰＭＭＡは、第一のチャンバ１０の上方に配置される。カバーは、その下面に、上から第一のチャンバを閉じることを意図した膜１３を含む。
-カバーは、溶解を実施するために、膜１３へのアクセスを可能にする上部軸方向開口を含む。
-カバー５４は、その上面に２つの流体入口／出口を含む。第一の入口／出口は、膜１３および３つの層を通って形成され、第一のチャンバ１０内に開口する第一の軸方向貫通チャネルに接続され、支持体の第一のチャネル１１を形成する。第二の入口／出口は、膜１３および第二および第三の層を通って形成され、疎水性膜２１０の上に開口する第二の軸方向貫通チャネルに接続され、支持体の第三のチャネル２１を形成する。
-支持体は、最終的に、２つのチャンバ１０、２０を互いに接続する第一の転送チャネル２２を形成する２つの他の貫通チャネルを含む。他の２つの層５５、５６は、第二のチャネル１２の入口及び転送チャネル２２の接合部をこの第二のチャネル１２上に形成することを可能にする。
図２Ｃの３つのチャンバを有する変形例では、支持体の構造は同様であり、第三のチャンバ３０及び第二の転送チャネル３２の設計のための原理は、第二のチャンバ２０及び第一の転送チャネル２２の原理に基づいてモデル化される。
好都合なことに、２つのユニットのみを有する変形例における第二のチャンバ２０ (図２Ａおよび図２Ｂ) 、ならびに、３つのユニット(図２Ｃ)を有する変形例における第二のチャンバ２０および/または第三のチャンバ３０は、増幅反応の信頼できる制御を確実にするために、または、いくつかの標的を同時に同定するために、適切な形状の内部容積を有する。後者の場合、チャンバは、複数のターゲットを同時に識別することができるように成形されてもよい。マルチプレックスと呼ばれるこれらのアッセイは、例えば、類似の臨床症状に対応する病原体のグループを検出するため、または細菌だけでなくその潜在的抗生物質耐性遺伝子を検出するために使用される。
以降の説明では、いわゆる増幅チャンバ２５の構造を一般的な方法で説明する。この構造は、上述した本発明の装置の第二のチャンバ２０及び/又は第三のチャンバ３０に適用することができる。
この増幅チャンバは、次のいくつかの目的を満たすように設計されている。
-流体の最適化(気泡の欠如)；
-コンポーネントから空気を押し出すが、液体は保持する;
-環境を汚染しない;
-多重化を許可;
-内部反応制御への対応;
-デッドボリュームを制限する;
-試料を分割しない。
原理は、少なくとも一つの凹部Ａｘ(ｘは１からＮの範囲で、Ｎは凹部の数に対応し、1以上である。)を、増幅チャンバ内に、使用される増幅技術(ＰＣＲ、ＬＡＭＰ ＲＰＡなど)に適合した内部反応制御用の化合物(例えば、選択されたＤＮＡ配列、または、所定のＤＮＡを標的とする増幅プライマー)を収容するために、形成することである。この原理によれば、凹部内でＤＮＡを乾燥させ、その場合、チャンバを介して導入された液体によってプライマーを供給するか、または凹部内でプライマーを乾燥させ、チャンバ内に導入された液体によってＤＮＡを取り込む。
内部反応制御の場合、内部制御化合物を既知の濃度で凹部Ａｘ内に堆積させ、次いでチャンバ内で直接乾燥させることができる。したがって、内部制御化合物は、装置内に永続的に残り、使用できる状態になる。
制御化合物を光学読み取り領域に直接ではなく、後者の外側に堆積させる利点は、さらに、ガス交換のための空間を最適化し、制御増幅を標的増幅と区別することを可能にすることである。制御増幅は、時間的にも空間的にも実質的にシフトされる。
多層装置の構造は、異なる設計の層で増幅チャンバを構築することを可能にする。下部層は、実際には、1つ以上の凹部を含むことができ、チャンバの上部層は、チャンバの全光学読み取り断面を画定する。いくつかの層を有するこの原理を図７に示す。図７は、凹部Ａ１を有する下層Ｓ１と、光学読み取り断面(ここでは非限定的に長方形で示される)を画定する上層Ｓ２とを示す。この場合の凹部Ａ１は半月形状である。この原理から、液体はチャンバ全体に浸透し、いくつかの層によって規定される容積全体に広がることができ、かく乱される光学的読み取りを回避し、上述の空間的および時間的シフトを得ることが可能であることが理解される。
図８Ａ乃至図８Ｃは、増幅チャンバの層の異なる構造を示す。これらの図において、光学読取領域Ｚは灰色で示されている。図８Ａにおいて、下部層Ｓ１は、液体がチャンバに入る点とは反対側の横断面において、チャンバの光学読取り領域Ｚのセクションを越えて延びる凹部Ａ１を形成する***部を含む(図７の設計に対応する)。このオフセット領域は、増幅反応を時間的および空間的にシフトさせることを可能にする。図８Ｂにおいて、下部層Ｓ１は、３つの異なるプライマーを収容するための３つの別個の凹部Ａ１、Ａ２、Ａ３を含む。これらの３つの領域は、光学読取り領域Ｚ内に位置し、多重化原理を用いることができる。図８Ｃは、５つの別個の領域を画定する下部層を示し、４つの凹部Ａ１〜Ａ４はそれぞれキャビティの形態で形成され、メイン領域は第五の凹部Ａ５を有する***部を含む。直上に位置するチャンバの層は、光学読取り領域を規定する。光学読取領域Ｚは、４つの凹部Ａ１〜Ａ４を覆うように、その容積が凹部Ａ１〜Ａ４と流体連通するように設計されている。第五の凹部は、図８Ａの設計におけるように、光学読取り領域Ｚの外側にあってもよい。
上述のように、各プライマーは、乾燥した形態で、チャンバの別々の凹部内に置かれ得る。乾燥を容易にするために、プライマーを酸緩衝液(約ｐＨ６)中に取り込み、それらの薄層のガラスへの結合を容易にすることが推奨される。糖(例えばトレハロース)を用いて液滴の拡散を制限し、乾燥ＤＮＡ配列の安定性を潜在的に増加させることも可能である。
上記の要素から、本発明の装置は、以下を含む多くの利点を提供することが理解されよう。
- 生物学的試料の調製及び分析のための方法の特定の工程又は当該方法の全工程を確実に実施することを可能にする汎用性;
- 簡単に輸送して操作できる装置;
- 全ての工程を単一のマイクロ流体支持体中で実施することを可能にし、試料移動を必要とせず、したがって汚染の危険性もない一体型装置;
- 増幅チャンバの特別な設計により、反応制御のための溶液を提供する装置。

Claims (14)

  1. 生物学的種 (４) を含む生物学的試料を調製および分析するためのマイクロ流体装置であって、前記マイクロ流体装置は、
    単一の剛性の支持体 (Ｓ)と、
    前記支持体の壁で区切られた体積がゼロでない第一のチャンバ (１０) と、前記第一のチャンバ (１０) を第一の空間 (１０１) と第二の空間 (１００) とに分離するフィルタ (１４) と、前記支持体に形成され一端で前記支持体の面に開口し他端で前記第一の空間（１０１）に開口する第一のチャネル（１１）と、前記支持体に形成され、一端が前記支持体の表面に開口し、他端が前記第二の空間（１００）に開口する第二のチャネル（１２）と、を含む、第一のユニット (Ｕ１)と 、
    前記剛性の支持体 (Ｓ) 内に形成され、前記支持体 (Ｓ) の透明の壁(２００、２０１)によって少なくとも部分的に区切られた第二のチャンバ (２０) と、前記支持体 (Ｓ) 内に形成され、一端が前記支持体の表面に開口し、他端が前記第二のチャンバ (２０) に開口する第三のチャネル (２１) と、を含む、第二のユニット (Ｕ２)と、
    前記第一のチャンバ (１０) と前記第二のチャンバ (２０) との間の流体の第一の転送チャネル (２２) であって、前記支持体 (Ｓ) 内に形成され、一方で前記第二のチャンバ (２０) 内に、他方で前記第二のチャネル (１２) 内の第一のバイパスノードで開口している、流体の第一の転送チャネル (２２)と、
    前記第一のチャンバを、第二のチャネルのみを介して外部のみに接続、または、 第一の転送チャネルを通って第二のチャンバのみに接続、を選択するために配置された第一の流れ切替手段と、を備える、マイクロ流体装置。
  2. 前記第一のユニットは、前記第一のチャンバ (１０) の底部に形成された粗い接触面 (１５) を備える、請求項1に記載のマイクロ流体装置。
  3. 前記第一のチャンバは、変形可能な膜 (１３) によって閉じられる、請求項１又は２に記載のマイクロ流体装置。
  4. 前記第三のチャネル (２１) をシールする第一の疎水性膜 (２１０) を備える、請求項１乃至３のうちいずれか１項に記載のマイクロ流体装置。
  5. 前記剛性の支持体 (Ｓ) 内に形成され、前記支持体 (Ｓ) の透明壁(３００、３０１)によって少なくとも部分的に区切られた第三のチャンバ (３０) と、
    前記支持体 (Ｓ) 内に形成され、一端が前記支持体の表面上に開口し、他端が前記第三のチャンバ (３０) 内に開口する第四のチャネル (３１) と、
    を含む、第三のユニットを備える、
    請求項１乃至４のうちいずれか１項に記載のマイクロ流体装置。
  6. 第一のチャンバ (１０) と第三のチャンバ (３０) との間の流体の第二の転送チャネル (３２) であって、前記支持体 (Ｓ) 内に形成され、一方で、前記第三のチャンバ (３０) 内へ、他方で、第二のバイパスノードで、前記第一のチャネル (１１) 内へ開口している第二の転送チャネル（３２）を備える、請求項５に記載のマイクロ流体装置。
  7. 前記第一のチャンバを、前記第一のチャネルのみを介して外部のみに接続、または、前記第二の転送チャネルを介して前記第三のチャンバのみに接続、を選択するために配置された第二の流れ切替手段を備える、請求項６に記載のマイクロ流体装置。
  8. 前記第四のチャネル (３１) をシールする第二の疎水性膜 (３１０) を含む、請求項５乃至７のうちいずれか１項に記載のマイクロ流体装置。
  9. 前記第二のチャンバが、内部反応制御のための化合物を受容することを意図した少なくとも１つの凹部を含む、請求項１乃至８のうちいずれか１項に記載のマイクロ流体装置。
  10. 前記第二のチャンバは、いくつかの重なり合った層から構成され、前記凹部は、前記層のうちの1つのみに形成される、請求項９に記載のマイクロ流体装置。
  11. 請求項５乃至１０のうちのいずれか１項に記載のマイクロ流体装置を用いて実施される、生物学的種を含む生物学的試料を調製および分析するための方法であって、
    前記第一のユニット (Ｕ１) は、前記方法の以下のステップの1つ以上を実施するように構成されており、
    生物学的試料中に存在する生物学的種を濃縮し、
    前記生物学的種を浄化するために洗浄し、
    培地を受け取り、
    前記生物学的種を培養し、
    生物学的物質を放出するために、前記生物学的種を溶解し、
    前記生物学的物質を分離し、
    前記第二のユニット (Ｕ２) は、前記方法の以下のステップのうちの1つ以上を実行するように構成されており、
    生物学的種を培養し、
    前記培養ステップ中の成長を視覚的に監視し、
    生体分子増幅により、分離された生物学的物質中の病原体の存在を検出し、
    第三のユニット (Ｕ３) は、前記方法の次のステップを実行するように構成されており、
    生体分子増幅により、分離された生物学的物質中の病原体の存在を検出する、
    方法。
  12. 前記第一のユニット (Ｕ１)が、請求項１１に記載の生物学的試料を調製および分析するための方法の以下のステップのうちの１つ以上を実施するように構成される、請求項３に記載のマイクロ流体装置の使用であって、
    生物学的試料中に存在する生物学的種を濃縮し、
    前記生物学的種を浄化するために洗浄し、
    培地を受け取り、
    前記生物学的種を培養し、
    生物学的物質を放出するために前記生物学的種を溶解し、
    前記生物学的物質を分離する、
    マイクロ流体装置の使用。
  13. 前記第二のユニット(Ｕ２)が、請求項１１に記載の生物学的試料を調製および分析するための方法の以下のステップのうちの１つ以上を実施するように構成される、請求項３または４に記載のマイクロ流体装置の使用であって、
    前記生物学的種を培養し、
    前記培養ステップ中における成長を視覚的に監視し、
    生体分子増幅により、分離された生物学的物質中の病原体の存在を検出する、
    マイクロ流体装置の使用。
  14. 前記第三のユニット(Ｕ３)が、請求項１１に記載の生物学的試料を調製および分析するための方法の次のステップを実施するように構成される、請求項７に記載のマイクロ流体装置の使用であって、
    生体分子増幅により、分離された生物学的物質中の病原体の存在を検出する、
    マイクロ流体装置の使用。
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