JP2021035353A - 増幅反応チャンバーを含むマイクロ流体デバイス - Google Patents

Abstract

【課題】増幅反応を制御したり、一つの分析中に複数のターゲットを同定したりするための統合的な解決手段を備えたマイクロ流体システムの提供。【解決手段】生物学的種を含有する生物学的試料の分析のために設計されたマイクロ流体システムに関し、デバイスは支持体からなり、以下のように構成されている、増幅反応を行うことができる、いわゆる増幅チャンバー２０、増幅チャンバーに対して開口する流入路、増幅チャンバーは、増幅反応の内部コントロールのための化合物を受容する少なくとも１つの凹部Ａ１を有する。【選択図】図４Ａ

Description

本発明は、マイクロ流体システムに関し、より詳細には、システムのデバイス内に配置され、増幅反応の実施を意図したチャンバーの構造に関する。

ｑＰＣＲ反応は、インターカレーター、又は配列が増幅された場合に光学装置によって検出することができる蛍光を生じるプローブに結合された標的ＤＮＡ又はＲＮＡ配列（特定の生物の代表的なもの）の増幅からなる。したがって、蛍光の増加は、増幅反応が起こっていること、及び標的とする生物のＤＮＡ又はＲＮＡが実際に存在したことを意味する。しかし、反応がない場合、これは標的とする生物の不在によるものであり、偽陰性をもたらす増幅反応の阻害によるものではないことを明らかにしなければならない。実際には、増幅反応に関与する酵素が、試験される試料によって提供される多くの阻害剤に対して感受性を有する。

増幅のないことが標的の不在を意味することを確実にするために、内部反応コントロールが使用される。これらは、ほとんどの場合、目的の試料と同時に増幅される試験において意図的に添加される別のＤＮＡ標的である。したがって、二つの反応を区別できるようにする必要がある。この分野では、いくつかの戦略が使用されている。
− １つは、独立した反応として、試料の一部を用いて並行してコントロール反応を行うことである。これは、最初の試料を分割することを必要とし、その結果、試験の感度／代表性が失われる。利点は、このコントロールのために任意の増幅検出技術を使用することが可能であることである（例えば蛍光ＤＮＡインターカレーション）。
− 試料を分割しないための別の戦略は、標的配列と同じ反応の中でコントロール反応を行うことである。この解決手段は、試料全体の試験を可能にするが、すべての検出技術に対して、特に非特異的インターカレート剤、非特異的配列又は任意の他の非配列特異的検出法（比色法、ｐＨ測定．．．）に対して利用可能なわけではない。
欧州特許出願公開第０５８６１１２号明細書及び米国特許第６３１２９３０号明細書には、それぞれコントロールの標的を追加することで、偽陰性を排除する検出方法が記載されている。

欧州特許出願公開第０５８６１１２号明細書 米国特許第６３１２９３０号明細書

以上を踏まえ、本発明は、増幅反応を制御したり、一つの分析中に複数のターゲットを同定したりするための統合的な解決手段を備えたマイクロ流体システムを提供することを目的とする。

この目的は、生物学的種を含有する生物学的試料の分析のために設計されたマイクロ流体システムによって達成され、前記システムは、以下のように構成されている。
− 光信号を発するように構成された光源と、光信号の読み取りの区域を画定する捕捉面を有する少なくとも１つのセンサーとを含む光学的な検出装置、
− 以下を含むマイクロ流体デバイス：
〇 増幅反応を行うことができる、いわゆる増幅チャンバーが形成された支持体
〇 前記増幅チャンバーに対して開口する流入路、
を備え、
− 前記増幅チャンバーは、前記センサーによる読み取りの区域内に位置する少なくとも１つの第１の区域と、前記増幅反応の内部コントロールのための化合物を受容するように設計され、センサーによる読み取りの区域の外側に位置するように配置されるか、又は前記光信号に対して不透明である凹部を形成している、少なくとも１つの突出部とを含む。

１つの特徴によれば、前記増幅チャンバーは、第１の区画を有する第１のかたまりと、前記第１の区画に対して狭められることで突出部を形成するものとなっている第２の区画を有する第２のかたまりとを備え、前記突出部は前記凹部を形成している。

別の特徴によれば、前記支持体は、複数の重畳された層を含み、前記増幅チャンバーは、上部層及び下部層と呼ばれる前記重畳された層のうちの少なくとも２つによって形成され、前記凹部は、前記２つの層のうちの１つのみに形成されている。

別の特徴によれば、前記凹部を形成する前記突出部は、下部層に形成されている。

別の特徴によれば、増幅チャンバーは、上部層に形成された主たる空洞と、下部層に形成され、それぞれが当該チャンバーの別の凹部を形成する１個又はそれより多い副たる空洞とを含む。

別の特徴によれば、内部反応コントロール化合物は、既知のＤＮＡ配列又は予め定義されたＤＮＡ標的を標的とするＤＮＡプライマーのセットを含み、使用される増幅方法に従ってその増幅を可能にする。

別の特徴によれば、前記チャンバーの第１の区域は、検出装置の光源から供給される光信号を通過させるために透明であり、第２の区域は、前記光信号を通過させないように構成された少なくとも１つの不透明（opaque）部分を有する。

本発明はまた、生物学的種を含有する生物学的試料を分析するための方法に関し、当該方法は、上記で規定され、以下からなるシステムによって実行され、以下のように構成されている。
− 内部反応コントロール化合物を増幅チャンバーの凹部に配置し、
− マイクロ流体デバイスの増幅チャンバー内に流体サンプルを注入し、
− 前記流体サンプルに含まれ、前記増幅チャンバーの第１の区域に位置する標的化合物の存在をセンサーで検出し、
− 増幅チャンバーの第１の区域における内部反応コントロール化合物の存在を検出するのに、時間のずれをつける。
他の特徴及び利点は、添付の図面を参照する以下の詳細な説明で明らかになるであろう。

生体分子増幅による生物学的試料の調製及び分析のための方法の全工程を示す図である。 図１に規定された調製及び分析方法の工程を実施するための２ユニットマイクロ流体デバイスを示す。 図２の装置の実施形態の一例を分解図で示す。 図２の装置において使用され得る増幅チャンバーの実施形態の例を示す。 図２の装置において使用され得る増幅チャンバーの実施形態の例を示す。 増幅チャンバー実施形態の異なる代替実施形態を示す。 増幅チャンバー実施形態の異なる代替実施形態を示す。 増幅チャンバー実施形態の異なる代替実施形態を示す。

本発明のマイクロ流体デバイスは、生物学的試料の分析のためのものである。この生物学的試料は、例えば、調査すべき生物学的物質を含有する生物学的種を含有する液体の形態をしている。

生物学的種とは、特に微生物、細胞、胞子、ウイルス．．．を表す。調査される生物学的物質とは、例えば、細胞由来の核酸分子（ＲＮＡ、ＤＮＡ）、タンパク質、リポ多糖類（ＬＰＳ）、リポテイコ酸（ＬＴＡ）．．．を意味する。

流体とは、液体、気体．．．を意味する。液体は、異なる粘度を有していてもよく、例えば、ペースト状又はゲル状であってもよい。

以下の説明では、「下側」、「上側」、「頂部」及び「底部」という用語は、垂直な主軸 （Ｘ） を参照して理解されるべきである。

以下の説明において、「外部」、「外側」、「内部」及び「内側」という用語は、後述する装置のチャンバーを参照することによって理解されるべきである。

図１を参照すると、上記で定義された生物学的試料の完全な分析は、以下の工程を順番に実施することを含み得る。
− Ｅ１：生物学的試料中に存在する生物学的種の濃縮、
− Ｅ２：精製のための洗浄、培養干渉物質の除去、
− Ｅ３：培地の添加、
− Ｅ４：生物学的種の培養、
− Ｅ５：培養中及びコロニー計数中の光学的な成長モニタリング
− Ｅ６：洗浄、ＰＣＲ阻害物質の除去、
− Ｅ７：調査対象の生物学的物質を抽出するために、サンプル中に存在する生物学的種を機械的に溶解すること。
− Ｅ８：調査対象の生物学的物質と存在する汚染物質との分離、
− Ｅ９：ｑＰＣＲ、ＬＡＭＰ、ＲＰＡ型生体分子増幅による生体物質中の病原体の存在の検出、及び増幅反応に関連した蛍光、比色測定、ホログラフィックイメージング、比濁測定、ｐＨ測定などの光学的検出。

もちろん、この方法は特定の工程に限定されてもよく、これらの工程の全てが必ずしも装置内で実行されるとは限らない。

濃縮工程では、生物学的種を含む例えば液体形態の生物学的試料をチャンバー内に注入して、フィルタを通過させる。サンプルの液体部分及びフィルターを通過する粒子／分子は、排出路を通して収集され、分析から廃棄される。その後、生物学的種はチャンバー内の空間に濃縮される。

洗浄／すすぎ溶液を注入することで、チャンバー内に存在する生物学的種を洗浄できる。

生物学的種を培養するために培地を注入する。

増殖モニタリング工程は、センサーＣを用いた光学的な読み取りにより、培養工程中に細胞増殖をモニタリングすることを可能にする。

生物学的種の機械的な溶解は、試料中に存在する生物学的種を粗い摩砕（bearing）面を用いて粉砕するために使用される。機械的溶解が行われることで、例えばＤＮＡ分子や汚染物質（pollutants）でなどで構成された生物学的物質が調査に利用可能となる。

調査対象の生物学的物質と汚染物質とを互いに分離するために、増幅試薬を含有する溶液を注入して調査対象の生物学的物質を溶出する。このようにして注入された液体溶液の一部が、フィルターを通過するような調査対象の生物学的物質、例えばＤＮＡ分子を保持して分離する。

汚染物質と調査対象の生物学的物質との間で分離が完了次第、生物学的物質の増幅反応によって、分離された生物学的物質中の病原体の存在を検出する。増幅反応は、増幅混合物を添加し、試料が置かれたチャンバーを加熱することによって行われる。チャンバーが加熱される温度は、実際に行う増幅反応の種類に依存する。ここで増幅反応の種類は任意であり、例えば、ループ媒介等温増幅（ＬＡＭＰ）、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）．．．などがある。ＬＡＭＰでは、６０℃から６５℃の間の温度で加熱することが好ましい。この反応により、検出対象となる生物学的物質の分子、例えばＤＮＡ分子を増幅することが可能となる。生物学的物質の増幅反応の間、その目的は、病原体が存在するかどうかを検出することである。これには様々な方法を用いることができ、例えば比色法、蛍光法、電気化学法、ｐＨ測定法、比濁法などが挙げられる。その他の検出方法を考慮してもよい。ｐＨ測定のような検出方法では、ｐＨ検出電極を装置に組み込むことができる。

上記の工程を実施するためのマイクロ流体デバイスを図２に示す。この装置は、単一の剛性支持体Ｓからなる。以下に説明する図３は、この装置の実施形態の例を示す。

この剛性支持体Ｓは、分析方法の工程の実施に適合したマイクロ流体ネットワークを統合する。マイクロ流体ネットワークは、実施される分析方法の構成に応じて異なる構造をとれる。

支持体Ｓは、平坦な底板（bottom wall）と、その底板上に前記主軸に沿って積層された多層構造とを備えることが好ましい。

装置のマイクロ流体ネットワークは、少なくとも２つのユニットＵ１、Ｕ２で構成されている。

第１のユニットＵ１は、前記支持体に形成された第１のチャンバー１０を有する。このチャンバー１０は、ゼロではない容積を有し、支持体Ｓの壁によって区画されている。

第１のユニットＵ１は、支持体内に形成された第１の流路１１を有しており、これが第１のチャンバー１０に流体を注入するか、又は第１のチャンバー１０から流体を排出する。第１の流路１１は、例えば支持体Ｓの天板（top wall）を貫通するように形成された開口を有する第１の端部と、第１のチャンバー１０内に向かって開口する第２の端部とを有する。第１の流路の第１の端部は、例えば垂直方向に配置され、その第２の端部は、例えば水平方向に第１のチャンバー１０内に開口する。

第１のユニットＵ１は、第２の流路１２を有する。この第２の流路１２もまた、外部と連通する第１の端部であって、例えば支持体Ｓの天板を貫通するように形成された開口部を形成しているものと、第１のチャンバー１０によって形成された空間と連通する第２の端部とを有している。この第２の流路１２を介して、第１のチャンバー内に流体が注入され、また第１のチャンバーから流体が排出される。第１の端部は、例えば垂直方向に配置され、第２の端部は水平方向に配置されている。第１のチャンバー１０は、第１の流路１１と第２の流路１２との間に配置されている。

第１のチャンバー１０は、柔軟で伸縮性のある膜１３によって、上部を閉鎖できる。したがって第１のチャンバーの層では、支持体の天板の開口部は、膜１３によって覆われることで密閉されている。このため、膜１３は適切な固定溶液、例えば接着剤によって支持体内に固定される。この膜１３は、例えば、３Ｍ（登録商標）のMicroAmp型の膜で構成され、少なくともその固定点より第１のチャンバーの底部に向かって超弾性的に変形するような厚さ、寸法及び構造を有している。

膜１３は、可逆的に変形することでいくつかの形状をとれる。すなわち、支持体Ｓの外側に向かって超弾性変形によって引き伸ばされ、また圧縮や弛緩によって第１のチャンバー１０の内側に引っ込む。ここで超弾性材料とは、第１の表面積から第２の表面積へと変化可能な表面を有することが可能な材料を意味し、第２の表面積は、第１の表面積の少なくとも５倍、例えば、第１の表面積の１０倍、さらには、第１の表面積の又は５０倍に等しい。

第１のユニットＵ１はまた、第１のチャンバー１０内に配置され、第１のチャンバー１０を２つの空間１００，１０１に分離する横方向フィルター１４を備える。この２つの空間は、例えばフィルター１４の下方に下方空間１００が位置し、フィルター１４の上方に上方空間１０１が位置するように重ね合わされている。このフィルター１４は、その全体又は一部が、薄い可撓性フィルムの形態で形成されていることが好ましく、チャンバーによって形成された空間に引き込まれるとともに、一方の空間から他方の空間へフィルター１４の細孔のみを通って通過できるようになっている。このフィルムは、支持力が略垂直方向に作用したときに伸縮するような弾性変形性を有しており、この弾性変形性の水準は、チャンバー１０の底部に到達するのに十分なものである。フィルター１４は、０．２μｍ〜５０μｍの平均孔径を有し、例えば、微生物の分離のためであれば０．２μｍ〜１μｍである。試料中に存在する異なる生物学的種間で確実に分離できるように孔径を設計する。このフィルター１４は、例えば、その固定点よりチャンバー１０の底部に向かって変形するような厚さ、寸法及び構造を有するフィルムからなる。上記膜と同様の特性を有する超弾性膜であってもよい。

一態様において、第１の流路１１は、第１のチャンバー１０の上部空間１０１内に開口し、第２の流路１２は、第１のチャンバー１０の下部空間１００内に開口する。したがって、２つの流路の口は、チャンバー内に配置されたフィルター１４によって分離される。

図２に示すように、第１のユニットＵ１は、第１のチャンバー１０の底部に配置された粗い摩砕面１５を有することが好ましい。この粗い摩砕面１５は、第１のチャンバーの底部の大部分にわたって延在する。それは、０．１μｍから１０μｍの間の平均表面粗さパラメーターを有し、好ましくは０．２μｍから３μｍの範囲にある。この粗い摩砕面１５は、装置内に配置された生物学的試料中に存在する生物学的種の機械的な溶解を行うように設計される。機械的な溶解では、粗い摩砕面上で生物学的種を摩砕して粉砕することが好ましい。この摩砕作業は、適当な摩砕部材を用いた、粗い摩砕面に対する生物学的種の摩擦運動によって行われる。この摩砕部材は、例えばプラスチック又は金属製のスパチュラ又は棒でもよい。この摩砕部材は、チャンバー１０の外側から入れ、膜１３及びフィルター１４が第１のチャンバー１０の底部に向かって延びるように、その端部をさせ膜１３の外表面に押し付けることで、試料中に存在する生物学的種を粗い摩砕面１５に対して擦り付ける。

装置の他の部分に関し、第２のユニットＵ２は、支持体Ｓの壁によって区切られた容積がゼロではない第２のチャンバー２０からなる。また第２のユニットＵ２は、支持体に形成された第３の流路２１を構成している。この第３の流路２１は、例えば支持体の上壁を貫通して形成された開口部からなる第１の端部と、第２のチャンバー２０に対してのみ開口している第２の端部とで構成されている。この第３の流路２１の第１の端部は、例えば垂直方向に配置され、その第２の端部は、例えば水平方向に前記第２のチャンバー２０内に開口している。この第３の流路の第１の端部は、例えば、疎水性膜２１０、すなわち、液体に対しては不透過性であるが、空気のような気体に対しては透過性である膜によって封止されている。この疎水性膜２１０は、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）のような材料で作製できる。

支持体の２つの横方向の板（transverse wall）が、好ましくは第２のチャンバー２０を部分的に区切る平行な上部板（upper wall）２００及び下部板（lower wall）２０１が、透明な材料で作られており、したがって、第２のチャンバーの大きなかたまりを通じた光学的な読み取りを可能にする。「透明」という用語は、使用される材料が可視光に対して少なくとも部分的に透明であり、その光の少なくとも８０％が通過できることを意味する。これは、チャンバーの内部を視認するのに十分な透明性を有することを意味する。下部板はガラス製であってもよく、上部板は剥がすことのできる接着剤でもよく、接着剤は第２のチャンバーの上側にくっつくことで第２のチャンバーを閉鎖するものでもよい。

本発明の１つの特徴によれば、装置はまた支持体に設けられた第１の移送流路２２を備える。この第１の移送流路２２は、第１のチャンバー１０、より正確にはその下部空間１００を第２のチャンバー２０に接続するように設計されている。

第１の移送流路２２が、第２の流路１２に直接に開口する第１の端部を有することで、この第２の流路１２上に迂回点（bypass node）を形成していることが好ましい。また、第２のチャンバー内に直接開口する第２の端部を有する。

装置はさらに、第１のチャンバーの接続を選択するために、例えば第２の流路１２上に配置される切り替え手段を備える。
− 第２の流路のみを経由して外部に至る、又は
− 第１の移送流路のみを介して第２のチャンバーに至る。

これらの切換手段は、漏斗の形をした中空の取り外し可能なコーン１２０からなるものでもよい。その先端が第２の流路１２に挿入されると、外部と第１のチャンバーとの間が連絡され、その壁は迂回点で作られた第１の移送流路２２への入口を塞ぐ。それが取り外されると、第２の流路１２の第１の端部は、例えば支持体の表面に塗布された接着剤１２１によって閉鎖され、第１の移送流路２２と第２の流路１２との間の接続が開放されるため、第１のチャンバー１０と第２のチャンバー２０との間を流体が流れることができる。

もちろん、切り替え手段は、他の代替的な実施形態においても実施できる。その一般的な原理は、移送流路を閉じることによって第１のチャンバーに到達できるようにするか、又は第１のチャンバーと第２のチャンバーとの間で接続可能にすることである。したがって、次のような単純なバルブとしてもよい。
− 第１の位置では、バイパスノードで移送流路２２の口を塞ぐことにより、第２の流路に到達可能にする。
− 第２の位置では、第２の流路１２と移送流路２２との間の接続を開放する。

限定されるものではないが、装置は、図３に示す構造にしたがって作製できる。

この図３において、支持体Ｓは、以下の特徴を有する。
− 支持体は、例えばガラス製、又はＰＭＭＡ又はＣＯＣといったプラスチック製のスライド５０を有する；
− スライド５０は、第１の区域において研削面で覆われているため、その上面の一部に溶解用の粗い摩砕面１５が形成されている；
− スライド５０は、少なくとも１つの第２の区域において透明であるため、透明な第２のチャンバー２０の底板２０１が透明に形成されており、光学的な読み取りがなされる；
− 第１のマイクロ流路の型抜き（imprint）がなされた第１の層５１がスライド５０の上面に積層しており、この第１の型抜きは、第１のチャンバー１０の下部空間１００を画定する第１の空洞と、第２のチャンバー２０の下部を画定する第２の空洞と、第３の流路２１の下部とからなり；第１の空洞の縁が、第１の研削区域の周りにあり、第２の空洞の縁が、第２の読み取りの区域の周りにある；
− このようにして、フィルター１４は、第１のチャンバーの下部空間１００を覆うように第１の層に付され、第３の流路２１の下部には疎水性膜２１０が付されている；
− 第２のマイクロ流路の型抜きがなされた第２の層５２が、第１の層５１の上に積層され、フィルター１４及び疎水性膜２１０を覆っている。この第２のマイクロ流路の型抜きは、第１のチャンバー１０の上部空間１０１を形成する空洞と、第２のチャンバー２０の中央部を形成する第２の空洞と、第３の流路２１の上部とからなる；
− 第３のマイクロ流路の型抜きがなされた第３の層５３が、第２の層５２の上側に積層され、この第３のマイクロ流路の型抜きは、第１のチャンバー１０の上部と第２のチャンバー２０の上部とからなる；
− ガラス又はプラスチックの帯状の板（strip）は、第２のチャンバーにおける第３の層５３の上側を覆うような寸法を有し、キャリアにおける上部透明板２００を形成している；
− キャップ５４は、例えばＰＭＭＡ製であり、第１のチャンバー１０の上方に配置され、その下面には、第１のチャンバーを上方から閉鎖するように設計された膜１３が設けられている。
− カバーは、溶解のために設けられた膜１３に到達できるように上部軸方向の開口部が設けられている；
− キャップ５４は、その上面に流体用の引き入れ口／引き出し口を２つ有する。第１の引き入れ口／引き出し口は、膜１３と３つの層とを貫通するように形成され、第１のチャンバー１０内に対して開口する第１の軸方向貫通流路に接続されることで、支持体の第１の流路１１を形成している；第２の引き入れ口／引き出し口は、膜１３と第２及び第３の層とを貫通するように形成され、疎水性膜２１０の上方に対して開口する第２の軸方向貫通流路に接続され、支持体の第３の流路２１を形成している。
− 最後に、支持体は、２つのチャンバー１０，２０を接続する第１の移送流路２２を形成する２つの他の貫通流路を有する。
− 他の２つの層５５，５６は、第２の流路１２への流入と、この第２の流路１２上の移送流路２２との接合とを担う。

本発明は、より詳細には第２のチャンバー２０に関するものであり、これは増幅チャンバーとして知られるものである。この増幅チャンバーは、上述の検出工程の実施に相応しい構造を有する。

増幅チャンバーは、増幅反応において信頼できるコントロール実験を行うために、又は同時にいくつかの標的を同定するために、適切な形状の内部容積を有する。後者の場合、チャンバーは、複数の標的を同時に検出できるような形状としてもよい。多重検査として知られるこれらの検査は、例えば、類似の臨床症状に対応する病原体の集団を検出するために用いられ、また細菌だけでなく潜在的な抗生物質耐性遺伝子をも検出するために用いられる。

原理としては、増幅チャンバー内に少なくとも１つの凹部Ａｘ（ｘは１からＮまでの範囲であり、Ｎは凹部の数に対応し、１個又はそれより多い）を形成することで、使用される増幅技術（ＰＣＲ、ＬＡＭＰ、ＲＰＡ．．．）に適合した内部反応コントロール化合物（例えば、選択されたＤＮＡ配列又は予め定義されたＤＮＡを標的とする増幅プライマー）を蓄える。この原理により、ＤＮＡは凹部内で乾燥され、その後、チャンバー内に導かれた液体によってプライマーを運んでくる、又は凹部でプライマーを乾燥させ、チャンバー内に導かれた液体によってＤＮＡを運んでくる。

この凹部Ａｘは、光学的な読み取り専用のチャンバーの区画の外側に形成される。光学的な読み取り専用のチャンバーの区画は、光学的な読み取りの区域Ｚに対応している。光学的な読み取りの区域Ｚは、当該チャンバーにおいてセンサーＣによって視認可能な唯一の区域である。チャンバーは、この光学的な読み取りの区域Ｚの外側に区域を有していてもよく、センサーＣの読み取りの範囲の外側に位置していてもよい。

反応コントロールの場合、内部コントロール化合物を既知の濃度で凹部Ａｘ内に堆積させ、次いでチャンバー内で直接乾燥できる。したがって、デバイス内に永続的に残り、使用できる状態になる。

化合物を光学的な読み取りの区域Ｚ内に直接堆積させず、その外側に堆積させる利点は、ガス交換の空間を最適なものにできることであり、さらにコントロールの増幅と標的の増幅とを区別可能にすることである。実際に、コントロールの増幅は、時間の上でも空間の上でもずらすことができる。

多層デバイス構造とすることで、異なる設計の層で増幅チャンバーを構築できる。下部層は、実際に凹部を１個又はそれより多く有するものでもよく、チャンバーの上部層は、チャンバーの光学的な読み取り断面の全体を画定するものでもよい。

この多層化の原理は、図４Ａおよび４Ｂに示されている。これらの図は、凹部Ａ１を有する下部層Ｓ１と、光学的な読み取りの区域Ｚの断面を画定する上部層Ｓ２とを示している（ここでは例示的に長方形で表される）。凹部Ａ１は、ここでは半月状に形成されている。図４Ａは、増幅チャンバーの立体図を表しており、チャンバーに対するセンサーＣの位置を示しており、センサーＣの表面がチャンバーの光学的な読み取りの区域Ｚを画定している。

図４Ａに示すように、凹部Ａ１は、センサーＣの光学的な読み取りの区域Ｚの外側に配置できる。図４Ｂにおいて、増幅チャンバーは、２つの層Ｓ１、Ｓ２を重ね合わせることによって形成される。この図は、チャンバーへの流入路も示しており、この流入路は下部層Ｓ１に形成されており、第１の移送流路２２に対応する。

図５Ａ〜５Ｃは、増幅チャンバーの下部層の異なる構造を示す。これらの図において、光学的な読み取りの区域Ｚは灰色で示されている。

図５Ａにおいて、下部層Ｓ１は、凹部Ａ１を形成している出っ張りを有しており、凹部Ａ１は、横断面において、チャンバーの光学的な読み取りの区域Ｚの断面を越えて延在しており、それはチャンバー内への液体の進入地点の反対側に位置する（図４Ａ及び４Ｂの設計に対応する）。このオフセット区域は、増幅反応を時間の上でもまた空間の上でもずらすことを可能にする。

図５Ｂにおいて、下部層Ｓ１は、３つの空洞によって形成された３つの異なる凹部Ａ１、Ａ２、Ａ３を有するため、３つの異なるプライマーを収容できる。これらの３つの区域は、光学的な読み取りの区域Ｚに位置し、多重化法を実現可能にする。

図５Ｃは下位概念を表し、５つの別個の区域が画定されており、４つの凹部Ａ１−Ａ４はそれぞれ空洞の形をしており、主たる区画は突出部と５つ目の凹部Ａ５からなる。直上のチャンバーの上部層は、光学的な読み取りの区域を画定する。光学的な読み取りの区域Ｚは、４つの凹部Ａ１〜Ａ４を覆うように設計されており、そのかたまりが流体で連通されるようになっている。第５の凹部は、図５Ａに示されるように、光学的な読み取りの区域Ｚの外側にあってもよい。

上述のように、各プライマーは、乾燥形態でチャンバーの別々の凹部内に配置してもよい。乾燥を容易にするために、酸性緩衝液（約ｐＨ ６）中にプライマーを溶かし、スライドガラスとの結合を容易にすることが好ましい。糖（例えばトレハロース）を用いて液滴の拡散を制限し、乾燥ＤＮＡ配列の安定性を潜在的に高めてもよい。

さらに留意点として、その構造がどのようなものであっても、チャンバー２０は丸みを帯びた角と輪郭とを有しているので、チャンバー内での液体の伝わりを最適なものとし、、気泡の形成を妨げることができる。

上記から、本発明の装置は多くの利点を有することが分かる。本発明の装置の増幅チャンバーによって、いくつかの目標を実現できる。
− 流体の最適化（気泡のないこと）；
− 各部から空気を押し出すが、液体は保持すること；
− 周辺環境を汚染しないこと；
− 多重化を可能にすること；
− 内部反応コントロールを含ませること；
− 無駄な容積（dead volume）を減らすこと；
− サンプルを分割しないこと；

Claims (8)

1. 生物学的種を含有する生物学的試料の分析のためにマイクロ流体システムであって、
   − 光信号を発するように構成された光源と、光信号の読み取りの区域を画定する捕捉面を有する少なくとも１つのセンサーとを含む光学的な検出装置と、
   − 以下を含むマイクロ流体デバイスと：
   〇 増幅反応を行うことができる、いわゆる増幅チャンバーが形成された支持体（２０）、
   〇 前記増幅チャンバーに対して開口する流入路、
   を備え、
   − 前記増幅チャンバーは、前記センサーによる読み取りの区域内に位置する少なくとも１つの第１の区域と、前記増幅反応の内部コントロールのための化合物を受容するように設計され、前記センサーによる読み取りの区域の外側に位置するように配置されるか、又は前記光信号に対して不透明である凹部を形成している、少なくとも１つの突出部（Ａｘ）とを含む、
   システム。
2. 前記増幅チャンバーは、第１の区画を有する第１のかたまりと、前記第１の区画に対して狭められることで突出部を形成するものとなっている第２の区画を有する第２のかたまりとを備え、前記突出部（Ａｘ）は前記凹部を形成している、
   請求項１に記載のシステム。
3. 前記支持体は、複数の重畳された層を含み、前記増幅チャンバーは、上部層（Ｓ１）及び下部層（Ｓ２）と呼ばれる前記重畳された層（Ｓ１，Ｓ２）のうちの少なくとも２つによって形成され、前記凹部は、前記２つの層のうちの１つのみに形成されている、
   請求項１又は２に記載のシステム。
4. 前記凹部（Ａ１）を形成する前記突出部は、前記下部層に形成されている、
   請求項３に記載のシステム。
5. 前記増幅チャンバー（２０）は、前記上部層に形成された主たる空洞と、前記下部層に形成され、それぞれが当該チャンバーの別の凹部を形成する１個又はそれより多い副たる空洞とを備える、
   請求項３又は４に記載のシステム。
6. 前記内部反応コントロール化合物は、既知のＤＮＡ配列又は予め定義されたＤＮＡ標的を標的とするＤＮＡプライマーのセットを含み、前記使用される増幅方法に従ってその増幅を可能にする、
   請求項１〜５のいずれかに記載のシステム。
7. 前記チャンバーの第１の区域は、前記検出装置の光源から供給される光信号を通過させるために透明であり、前記第２の区域は、前記光信号を通過させないように構成された少なくとも１つの不透明部分を有する、
   請求項１〜６のいずれかに記載のシステム。
8. 生物学的種を含有する生物学的試料を分析するための方法であって、請求項１〜７のいずれかに規定されるシステムで実行され、以下を含む：
   − 内部反応コントロール化合物を前記増幅チャンバーの前記凹部内に配置し、
   − 前記マイクロ流体デバイスの前記増幅チャンバーに流体サンプルを注入し、
   − 前記流体サンプルに含まれ、前記増幅チャンバーの前記第１の区域に位置する標的化合物の存在を前記センサーで検出し、
   − 前記増幅チャンバーの前記第１の区域における前記内部反応コントロール化合物の存在を検出するのに、時間のずれをつける。
   方法。

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