JP2021036887A - ヒト化抗ox40抗体及びその使用 - Google Patents
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Abstract
【課題】OX40(CD134;TNFRSF4)アゴニスト療法の抗腫瘍効果を増強するための方法を提供する。【解決手段】特定の配列を有するヒト化抗OX40抗体又はその抗原結合断片であり、ヒトOX40に特異的に結合することができる抗体を開示する。また、かかる抗体の作製方法、及び例えば癌の治療など、使用方法も提供される。【選択図】図1
Description
OX40(CD134;TNFRSF4)は、主に活性化CD4+及びCD8+T細胞、調節性T(Treg)細胞及びナチュラルキラー(NK)細胞に見られる腫瘍壊死因子レセプターである(Croft et al.,2009,Immunol Rev.229:173−91)。OX40は1つの既知の内因性リガンド、OX40リガンド(OX40L;CD152;TNFSF4)を有し、OX40リガンドは三量体形態で存在し、これがOX40をクラスター化すると、T細胞内に強力な細胞シグナル伝達イベントが生じ得る(同上)。活性化CD4+及びCD8+T細胞上のOX40を介したシグナル伝達により、サイトカイン産生、グランザイム及びパーフォリン放出、並びにエフェクター及びメモリーT細胞プールの拡大が増強される(Jensen et al.,2010,Semin Oncol.37:524−32)。加えて、Treg細胞上のOX40シグナル伝達は、Tregの拡大を阻害し、Tregの誘導を終了させ、及びTreg抑制機能を遮断する(Voo et al.,2013,J Immunol.191:3641−50;Vu et al.,2007,Blood.110:2501−10)。
免疫組織化学研究及び初期のフローサイトメトリー解析により、OX40は、幅広い種類のヒト癌に浸潤するT細胞上に発現することが明らかになった(Baruah et al.,2011,Immunobiology 217:668−675;Curti et al,2013,Cancer Res.73:7189−98;Ladanyi et al,2004,Clin Cancer Res.10:521−30;Petty et al,2002,Am J Surg.183:512−8;Ramstad et al,2000,Am J Surg.179:400−6;Sarff et al,2008,Am J Surg.195:621−5;discussion 625;Vetto et al,1997,Am J Surg.174:258−65)。理論によって拘束されることを望むものではないが、腫瘍浸潤リンパ球上のOX40発現は幾つかのヒト癌における長期生存に相関することから、OX40シグナルが抗腫瘍免疫応答の確立において役割を果たし得ることが示唆される(Ladanyi et al.,2004,Clin Cancer Res.10:521−30;Petty et al.,2002,Am J Surg.183:512−8)。
種々の非臨床マウス腫瘍モデルでは、抗体及びOX40リガンド融合タンパク質を含め、OX40のアゴニストの使用が成功を収めており、有望な結果が得られている(Kjaergaard et al.,2000,Cancer Res.60:5514−21;Ndhlovu et al.,2001,J Immunol.167:2991−9;Weinberg et al.,2000,J Immunol.164:2160−9)。OX40を介してT細胞を共刺激すると、抗腫瘍活性が促進され(これは場合によっては耐久性があった)、続く腫瘍チャレンジに対して持続的な保護が提供された(Weinberg et al.,2000,J Immunol.164:2160−9)。OX40アゴニストの腫瘍成長阻害には、Treg細胞阻害及びエフェクターT細胞の共刺激が必須であることが示された(Piconese et al.,2008,J Exp Med.205:825−39)。ワクチン、化学療法、放射線療法、及び免疫療法との併用によってOX40アゴニスト療法の抗腫瘍効果を増強しようと、多くの戦略及び技術が調査されている(Jensen et al.,2010,Semin Oncol.37:524−32;Melero et al.,2013,Clin Cancer Res.19:997−1008)。
Croft et al.,2009,Immunol Rev.229:173−91
Jensen et al.,2010,Semin Oncol.37:524−32
Voo et al.,2013,J Immunol.191:3641−50
Vu et al.,2007,Blood.110:2501−10
Baruah et al.,2011,Immunobiology 217:668−675
Curti et al,2013,Cancer Res.73:7189−98
Ladanyi et al,2004,Clin Cancer Res.10:521−30
Petty et al,2002,Am J Surg.183:512−8
Ramstad et al,2000,Am J Surg.179:400−6
Sarff et al,2008,Am J Surg.195:621−5;discussion 625
Vetto et al,1997,Am J Surg.174:258−65
Kjaergaard et al.,2000,Cancer Res.60:5514−21
Ndhlovu et al.,2001,J Immunol.167:2991−9
Weinberg et al.,2000,J Immunol.164:2160−9
Piconese et al.,2008,J Exp Med.205:825−39
Melero et al.,2013,Clin Cancer Res.19:997−1008
本開示は、OX40、例えばヒトOX40に結合する抗体を提供する。特定の態様において、提供される抗体はヒト化抗体である。例えば、本開示は、ヒト化重鎖可変領域(VH)とヒト化軽鎖可変領域(VL)とを含む抗体又はその抗原結合断片を提供し、ここでVHは、式:
HFW1−HCDR1−HFW2−HCDR2−HFW3−HCDR3−HFW4
[式中、HFW1は配列番号6又は配列番号7であり、HCDR1は配列番号8であり、HFW2は配列番号9(WIRX39HPGKGLEX47X48G;式中、X39はQ又はKであり、X47はW又はYであり、及びX48はI又はMである)であり、HCDR2は、配列番号14、配列番号15又は配列番号16であり、HFW3は配列番号17(RITINX71DTSKNQX78SLQLNSVTPEDTAVYX91CAR;式中、X71はP又はRであり、X78はF又はYであり、及びX91はY又はFである)であり、HCDR3は、配列番号25、配列番号26、又は配列番号27であり、及びHFW4は配列番号28である]を有するアミノ酸配列を含み、VLはアミノ酸配列、配列番号29又は配列番号32を含み;及び抗体又はその断片はヒトOX40に特異的に結合することができる。特定の態様において、HFW2のアミノ酸配列は、配列番号10、配列番号11、配列番号12、又は配列番号1であり、特定の態様において、HFW3のアミノ酸配列は、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、又は配列番号24である。
HFW1−HCDR1−HFW2−HCDR2−HFW3−HCDR3−HFW4
[式中、HFW1は配列番号6又は配列番号7であり、HCDR1は配列番号8であり、HFW2は配列番号9(WIRX39HPGKGLEX47X48G;式中、X39はQ又はKであり、X47はW又はYであり、及びX48はI又はMである)であり、HCDR2は、配列番号14、配列番号15又は配列番号16であり、HFW3は配列番号17(RITINX71DTSKNQX78SLQLNSVTPEDTAVYX91CAR;式中、X71はP又はRであり、X78はF又はYであり、及びX91はY又はFである)であり、HCDR3は、配列番号25、配列番号26、又は配列番号27であり、及びHFW4は配列番号28である]を有するアミノ酸配列を含み、VLはアミノ酸配列、配列番号29又は配列番号32を含み;及び抗体又はその断片はヒトOX40に特異的に結合することができる。特定の態様において、HFW2のアミノ酸配列は、配列番号10、配列番号11、配列番号12、又は配列番号1であり、特定の態様において、HFW3のアミノ酸配列は、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、又は配列番号24である。
特定の態様において、提供される抗体又はその断片のVHは、アミノ酸配列、配列番号33、配列番号35、配列番号37、配列番号39、配列番号41、配列番号43、配列番号45、配列番号47、配列番号49、配列番号51、配列番号53、配列番号55、配列番号57、配列番号59、配列番号61、配列番号63、配列番号65、又は配列番号67を含む。特定の態様において、提供される抗体又はその断片のVLはアミノ酸配列、配列番号29を含み、VHはアミノ酸配列、配列番号59を含む。
特定の態様において、提供される抗体又はその断片は、VLのC末端に融合した軽鎖定常領域又はその断片、例えばヒトκ定常領域又はヒトλ定常領域を更に含む。特定の態様において、提供される抗体又はその断片は、VHのC末端に融合した重鎖定常領域又はその断片、例えば、ヒトIgG1定常領域、ヒトIgG4P定常領域、ヒトIgG1TM定常領域又はマウスIgG1定常領域を更に含む。特定の態様において、重鎖定常領域はヒトIgG1定常領域である。特定の態様において、提供される抗体又はその断片は、重鎖アミノ酸配列、配列番号71と軽鎖アミノ酸配列、配列番号30とを含む。本開示によって提供されるとおりの抗体の抗原結合断片は、例えば、Fv断片、Fab断片、F(ab’)2断片、Fab’断片、dsFv断片、scFv断片、又はsc(Fv)2断片、又はこれらの任意の組み合わせであり得る。
特定の態様において、提供される抗体又はその断片は、ヒト、カニクイザル、又はアカゲザルOX40に特異的に結合することができ、例えば、ヒト、カニクイザル、アカゲザル、又はこれらの任意の組み合わせ由来のジャーカット細胞、初代活性化CD4+又はCD8+T細胞上に発現するとおりのOX40に特異的に結合することができる。特定の態様において、提供される抗体又はその断片はマウス又はラットOX40に結合しない。特定の態様において、提供される抗体又はその断片は関連TNFRSFタンパク質と交差反応しない。
特定の態様において、提供される抗体又はその断片は初代活性化ヒトCD4+T細胞上に発現するヒトOX40に対し、フローサイトメトリーによって計測するとき約250pM〜約370pM、例えば約312pMの結合親和性を有し得る。特定の態様において、提供される抗体又はその断片は、フローサイトメトリーによって計測するとき、初代活性化ヒトCD4+T細胞に対する20%レセプター占有率(EC20)を約63〜約93pMで、初代活性化ヒトCD4+T細胞に対する50%レセプター占有率(EC50)を約250〜約370pMで、及び初代活性化ヒトCD4+T細胞に対する90%レセプター占有率(EC90)を約2290〜約3330pMで実現することができる。例えば、特定の態様において、EC20は約78pMであり、EC50は約312pMであり、及びEC90は約2810pMである。
特定の態様において、提供される抗体又はその断片は、OX40過剰発現ジャーカット細胞上に発現するヒトOX40に対し、フローサイトメトリーによって計測するとき約250pM〜約600pM、例えば約424pMの結合親和性を有し得る。特定の態様において、提供される抗体又はその断片は、フローサイトメトリーによって計測するとき、OX40過剰発現ジャーカット細胞に対するEC20を約60〜約150pMで、OX40過剰発現ジャーカット細胞に対するEC50を約250〜約600pMで、及びOX40過剰発現ジャーカット細胞に対するEC90を約2260〜約4380pMで実現することができる。例えば、特定の態様において、EC20は約106pMであり、EC50は約424pMであり、及びEC90は約3820pMである。
特定の態様において、提供される抗体又はその断片は、初代活性化カニクイザルCD4+T細胞上に発現するカニクイザルOX40に対し、フローサイトメトリーによって計測するとき約340pM〜約820pM、例えば約580pMの結合親和性を有し得る。特定の態様において、提供される抗体又はその断片は、初代活性化アカゲザルCD4+T細胞上に発現するアカゲザルOX40に対し、フローサイトメトリーによって計測するとき約130pM〜約600pM、例えば約370pMの結合親和性を有し得る。
特定の態様において、提供される抗体又はその断片は、プレートベースのアッセイで活性化CD4+T細胞の用量依存的増殖及び初代活性化CD4+T細胞における用量依存的サイトカイン放出を誘導し得る。例えば、特定の態様において、全てフローサイトメトリーによって計測するとき20%最大増殖応答(EC20)は初代活性化ヒトCD4+T細胞において約14pM〜約28pMの抗体濃度で実現することができ、50%最大増殖応答(EC50)は初代活性化ヒトCD4+T細胞において約0.3pM〜約130pMの抗体濃度で実現することができ、及び90%最大増殖応答(EC90)は初代活性化ヒトCD4+T細胞において約50pM〜約90pMの抗体濃度で実現することができる。特定の態様において、EC20は約21pMであり、EC50は約28pMであり、及びEC90は約72pMである。初代活性化ヒトCD4+T細胞における放出サイトカインは、限定なしに、IFNγ、TNFα、IL−5、IL−10、IL−2、IL−4、IL−13、IL−8、IL−12 p70、IL−1β、又はこれらの任意の組み合わせ、例えば、IFNγ、TNFα、IL−5、IL−10、IL−13、又はこれらの任意の組み合わせのうちの1つ、2つ、3つ又はそれ以上であり得る。特定の態様において、提供される抗体又はその断片は、初代活性化カニクイザルCD4+T細胞及び初代活性化アカゲザルCD4+T細胞におけるCD4+T細胞増殖及びサイトカイン放出を実現することができる。
特定の態様において、提供される抗体又はその断片は、FcγR発現細胞の存在下でOX40発現T細胞のNFκB経路を活性化させることができる。例えば、OX40発現T細胞は、NFκBシグナル伝達経路の刺激に応答してルシフェラーゼを産生するOX40過剰発現ジャーカットNFκB−ルシフェラーゼレポーター細胞であり得る。特定の態様において、提供される抗体又はその断片は、OX40発現細胞に対する補体依存性又は抗体依存性細胞傷害を惹起することができる。特定の態様において、提供される抗体又はその断片は、ヒトC1qに結合して、OX40発現細胞に対するNK媒介性抗体依存性細胞傷害を惹起することができる。
特定の態様において、癌治療を必要としている対象に、提供される抗体又はその断片の有効用量を投与すると、対象の腫瘍成長を阻害することができる。例えば、腫瘍成長阻害はT細胞の存在下で実現し得る。特定の態様において、腫瘍成長は、アイソタイプ対応対照抗体又はその断片の投与と比較して少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、又は少なくとも70%阻害される。
本開示は、上記に記載したとおりの抗体又はその断片と担体とを含む組成物を更に提供する。
本開示は、提供される抗体又はその断片をコードするか、或いは提供される抗体又はその断片のポリペプチドサブユニットをコードする核酸を含むポリヌクレオチドを更に提供する。特定の態様において、提供されるポリヌクレオチドは、配列番号60の核酸、配列番号31の核酸、配列番号72の核酸、又はこれらの任意の組み合わせを含む。本開示は、提供されるポリヌクレオチドを含むベクター、及び提供されるポリヌクレオチド又は提供されるベクターを含む宿主細胞を更に提供する。別の態様において、本開示は、抗体又はその断片の作製方法を提供し、この方法は、ポリヌクレオチドによってコードされる抗体又はその断片が発現する条件下で、提供される宿主細胞を培養するステップと、抗体又はその断片を回収するステップとを含む。
更なる態様において、本開示は、活性化T細胞の生存又は増殖を促進する方法を提供し、この方法は、提供される抗体又はその断片を活性化T細胞と接触させるステップを含み、ここで抗体又はその断片は、T細胞の表面上のOX40に特異的に結合することができる。
更なる態様において、本開示は、活性化T細胞からのサイトカイン放出を誘導する方法を提供し、この方法は、提供される抗体又はその断片を活性化T細胞と接触させるステップを含み、ここで抗体又はその断片は、T細胞の表面上のOX40に特異的に結合することができる。特定の態様において、放出されるサイトカインは、限定なしに、IFNγ、TNFα、IL−5、IL−10、IL−2、IL−4、IL−13、IL−8、IL−12 p70、IL−1β、又はこれらの任意の組み合わせ、例えば、IFNγ、TNFα、IL−5、IL−10、IL−13、又はこれらの任意の組み合わせのうちの1つ、2つ、3つ又はそれ以上であり得る。特定の態様において、活性化T細胞は、活性化CD4+T細胞、活性化CD8+T細胞、又はこれらの組み合わせである。特定の態様において、活性化CD4+T細胞は、ヒトCD4+T細胞、カニクイザルCD4+T細胞、アカゲザルCD4+T細胞、又はこれらの組み合わせである。
更なる態様において、本開示は、T細胞活性化を促進する方法を提供し、この方法は、提供される抗体又はその断片をT細胞と接触させるステップを含み、ここで抗体又はその断片は、T細胞の表面上のOX40に特異的に結合することができる。特定の態様において、T細胞活性化は、NFκBシグナル伝達経路の刺激によって計測することができる。特定の態様において、T細胞は、活性化CD4+T細胞、活性化CD8+T細胞、又はこれらの組み合わせである。特定の態様において、活性化CD4+T細胞は、ヒトCD4+T細胞、カニクイザルCD4+T細胞、アカゲザルCD4+T細胞、又はこれらの組み合わせである。特定の態様において、接触させるステップは、対象に抗体又はその断片の有効量を投与するステップを含む。
更なる態様において、本開示は、対象の癌を治療する方法を提供し、この方法は、治療を必要としている対象に、提供される抗体若しくはその断片、又は提供される組成物の有効量を投与するステップを含む。特定の態様において、癌は固形腫瘍である。特定の態様において、抗体若しくはその断片又は組成物の投与は、腫瘍成長を阻害することができるか、腫瘍縮小を促進することができるか、又は両方である。特定の態様において、腫瘍成長阻害はT細胞の存在下で実現する。
更なる態様において、本開示は、対象の免疫応答を増強する方法を提供し、この方法は、それを必要としている対象に、提供される抗体若しくはその断片、又は提供される組成物の治療有効量を投与するステップを含む。
本開示によって提供される治療方法において、治療される対象はヒト対象であり得る。
特定の態様において、提供される抗体又はその断片は、配列番号91のアミノ酸108〜146の範囲内にあるヒトOX40のエピトープに結合することができる。特定の態様において、エピトープは、少なくとも、配列番号91のアミノ酸ロイシン116(L116)及びアラニン126(A126)を含む。特定の態様において、提供される抗体又はその断片は、Q113L突然変異及びV124A突然変異を除いて配列番号92のアミノ酸配列を有するマウスOX40変異体に結合することができる。
本開示は、100アミノ酸以下からなる単離ペプチドを更に提供し、このペプチドには、提供される抗体又はその断片が特異的に結合し得る。特定の態様において、ペプチドは配列番号91のアミノ酸116〜126を含む。特定の態様において、ペプチドは、L116及びA126を除く任意の位置における1、2、3、4、5、又は6個の単一アミノ酸置換、欠失、又は挿入を除いて配列番号91のアミノ酸108〜146を含む。
この発明はまた、以下に関する。
[1]
ヒト化重鎖可変領域(VH)とヒト化軽鎖可変領域(VL)とを含む抗体又はその抗原結合断片であって、
前記VHが、式:
HFW1−HCDR1−HFW2−HCDR2−HFW3−HCDR3−HFW4
(式中、HFW1は配列番号6又は配列番号7であり、HCDR1は配列番号8であり、HFW2は配列番号9であり、HCDR2は配列番号14、配列番号15又は配列番号16であり、HFW3は配列番号17であり、HCDR3は配列番号25、配列番号26、又は配列番号27であり、及びHFW4は配列番号28である)を有するアミノ酸配列を含み、
前記VLがアミノ酸配列、配列番号29又は配列番号32を含み、及び
ヒトOX40に特異的に結合することができる抗体又はその断片。
[2]
前記HFW2のアミノ酸配列が、配列番号10、配列番号11、配列番号12、又は配列番号13である、[1]に記載の抗体又はその断片。
[3]
前記HFW3のアミノ酸配列が、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、又は配列番号24である、[1]又は[2]に記載の抗体又はその断片。
[4]
前記VHがアミノ酸配列、配列番号33、配列番号35、配列番号37、配列番号39、配列番号41、配列番号43、配列番号45、配列番号47、配列番号49、配列番号51、配列番号53、配列番号55、配列番号57、配列番号59、配列番号61、配列番号63、配列番号65、又は配列番号67を含む、[1]〜[3]のいずれか一項に記載の抗体又はその断片。
[5]
前記VLがアミノ酸配列、配列番号29を含み、且つ前記VHがアミノ酸配列、配列番号59を含む、[1]〜[4]のいずれか一項に記載の抗体又はその断片。
[6]
前記VLのC末端に融合した軽鎖定常領域又はその断片を更に含む、[1]〜[5]のいずれか一項に記載の抗体又はその断片。
[7]
前記軽鎖定常領域がヒトκ定常領域である、[6]に記載の抗体又はその断片。
[8]
前記VHのC末端に融合した重鎖定常領域又はその断片を更に含む、[1]〜[7]のいずれか一項に記載の抗体又はその断片。
[9]
前記重鎖定常領域が、ヒトIgG1定常領域、ヒトIgG4P定常領域、ヒトIgG1TM定常領域又はマウスIgG1定常領域である、[8]に記載の抗体又はその断片。
[10]
前記重鎖定常領域がヒトIgG1定常領域である、[9]に記載の抗体又はその断片。[11]
重鎖アミノ酸配列、配列番号71及び軽鎖アミノ酸配列、配列番号30を含む、[1]〜[10]のいずれか一項に記載の抗体又はその断片。
[12]
前記抗原結合断片が、Fv断片、Fab断片、F(ab’)2断片、Fab’断片、dsFv断片、scFv断片、又はsc(Fv)2断片、又はこれらの任意の組み合わせである、[1]〜[11]のいずれか一項に記載の抗体又は断片。
[13]
カニクイザル、又はアカゲザルOX40に特異的に結合することができる、[1]〜[12]のいずれか一項に記載の抗体又はその断片。
[14]
ヒト、カニクイザル、アカゲザル、又はこれらの任意の組み合わせ由来のジャーカット細胞、初代活性化CD4+又はCD8+T細胞上に発現するとおりのOX40に特異的に結合することができる、[13]に記載の抗体又はその断片。
[15]
マウス又はラットOX40に結合しない、[1]〜[14]のいずれか一項に記載の抗体又はその断片。
[16]
関連する腫瘍壊死因子レセプタースーパーファミリー(TNFRSF)タンパク質と交差反応しない、[1]〜[15]のいずれか一項に記載の抗体又はその断片。
[17]
初代活性化ヒトCD4+T細胞上に発現するヒトOX40に対する結合親和性が、フローサイトメトリーによって計測するとき約250pM〜約370pMである、[14]に記載の抗体又はその断片。
[18]
前記結合親和性が約312pMである、[17]に記載の抗体又はその断片。
[19]
フローサイトメトリーによって計測するとき、初代活性化ヒトCD4+T細胞に対する20%レセプター占有率(EC20)を約63〜約93pMで、初代活性化ヒトCD4+T細胞に対する50%レセプター占有率(EC50)を約250〜約370pMで、及び初代活性化ヒトCD4+T細胞に対する90%レセプター占有率(EC90)を約2290〜約3330pMで実現することができる、[17]又は[18]に記載の抗体又はその断片。
[20]
EC20が約78pMであり、EC50が約312pMであり、及びEC90が約2810pMである、[19]に記載の抗体又はその断片。
[21]
OX40過剰発現ジャーカット細胞上に発現するヒトOX40に対する結合親和性が、フローサイトメトリーによって計測するとき約250pM〜約600pMである、[14]に記載の抗体又はその断片。
[22]
前記結合親和性が約424pMである、[21]に記載の抗体又はその断片。
[23]
フローサイトメトリーによって計測するとき、OX40過剰発現ジャーカット細胞に対するEC20を約60〜約150pMで、OX40過剰発現ジャーカット細胞に対するEC50を約250〜約600pMで、及びOX40過剰発現ジャーカット細胞に対するEC90を約2260〜約4380pMで実現することができる、[21]又は[22]に記載の抗体又はその断片。
[24]
EC20が約106pMであり、EC50が約424pMであり、及びEC90が約3820pMである、[23]に記載の抗体又はその断片。
[25]
初代活性化カニクイザルCD4+T細胞上に発現するカニクイザルOX40に対する結合親和性が、フローサイトメトリーによって計測するとき約340pM〜約820pMである、[14]に記載の抗体又はその断片。
[26]
前記結合親和性が約580pMである、[25]に記載の抗体又はその断片。
[27]
初代活性化アカゲザルCD4+T細胞上に発現するアカゲザルOX40に対する結合親和性が、フローサイトメトリーによって計測するとき約130pM〜約600pMである、[14]に記載の抗体又はその断片。
[28]
前記結合親和性が約370pMである、[27]に記載の抗体又はその断片。
[29]
プレートベースのアッセイにおいて活性化CD4+T細胞の用量依存的増殖及び初代活性化ヒトCD4+T細胞における用量依存的サイトカイン放出を誘導することができる、[1]〜[28]のいずれか一項に記載の抗体又はその断片。
[30]
全てフローサイトメトリーによって計測するとき、20%最大増殖応答(EC20)を初代活性化ヒトCD4+T細胞において約14pM〜約28pMの抗体濃度で実現することができ、50%最大増殖応答(EC50)を初代活性化ヒトCD4+T細胞において約0.3pM〜約130pMの抗体濃度で実現することができ、及び90%最大増殖応答(EC90)を初代活性化ヒトCD4+T細胞において約50pM〜約90pMの抗体濃度で実現することができる、[29]に記載の抗体又はその断片。
[31]
EC20が約21pMであり、EC50が約28pMであり、及びEC90が約72pMである、[30]に記載の抗体又はその断片。
[32]
前記サイトカインが、IFNγ、TNFα、IL−5、IL−10、IL−2、IL−4、IL−13、IL−8、IL−12 p70、IL−1β、又はこれらの任意の組み合わせである、[29]〜[31]のいずれか一項に記載の抗体又はその断片。
[33]
前記サイトカインが、IFNγ、TNFα、IL−5、IL−10、IL−13、又はこれらの任意の組み合わせである、[32]に記載の抗体又はその断片。
[34]
初代活性化カニクイザルCD4+T細胞及び初代活性化アカゲザルCD4+T細胞においてCD4+T細胞増殖及びサイトカイン放出を実現することができる、[1]〜[28]のいずれか一項に記載の抗体又はその断片。
[35]
FcγR発現細胞の存在下でOX40発現T細胞のNFκB経路を活性化させることができる、[1]〜[34]のいずれか一項に記載の抗体又はその断片。
[36]
前記OX40発現T細胞が、NFκBシグナル伝達経路の刺激に応答してルシフェラーゼを産生するOX40発現ジャーカットNFκB−ルシフェラーゼレポーター細胞である、[35]に記載の抗体又はその断片。
[37]
OX40発現細胞に対する補体依存性又は抗体依存性細胞傷害を惹起することができる、[1]〜[36]のいずれか一項に記載の抗体又はその断片。
[38]
C1qに結合して、前記OX40発現細胞に対するNK媒介性抗体依存性細胞傷害を惹起することができる、[37]に記載の抗体又はその断片。
[39]
癌治療を必要としている対象に有効用量を投与すると、前記対象の腫瘍成長を阻害することができる、[1]〜[38]のいずれか一項に記載の抗体又はその断片。
[40]
前記腫瘍成長阻害がT細胞の存在下で実現する、[39]に記載の抗体又はその断片。[41]
アイソタイプ対応対照抗体又はその断片の投与と比較して、腫瘍成長が少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、又は少なくとも70%阻害される、[39]又は[40]に記載の抗体又はその断片。
[42]
[1]〜[41]のいずれか一項に記載の抗体又はその断片と担体とを含む組成物。
[43]
[1]〜[41]のいずれか一項に記載の抗体又はその断片、又は[1]〜[41]のいずれか一項に記載の抗体又はその断片のポリペプチドサブユニットをコードする核酸を含むポリヌクレオチド。
[44]
配列番号60の核酸、配列番号31の核酸、配列番号72の核酸、又はこれらの任意の組み合わせを含む、[43]に記載のポリヌクレオチド。
[45]
[43]又は[44]に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
[46]
[43]又は[44]に記載のポリヌクレオチド又は[45]に記載のベクターを含む宿主細胞。
[47]
抗体又はその断片の作製方法であって、前記ポリヌクレオチドによってコードされる前記抗体又はその断片が発現する条件下で[46]に記載の宿主細胞を培養するステップと、前記抗体又はその断片を回収するステップとを含む方法。
[48]
活性化T細胞の生存又は増殖を促進する方法であって、[1]〜[41]のいずれか一項に記載の抗体又はその断片を活性化T細胞と接触させるステップを含み、前記抗体又はその断片が前記T細胞の表面上のOX40に特異的に結合することができる、方法。
[49]
活性化T細胞からのサイトカイン放出を誘導する方法であって、[1]〜[41]のいずれか一項に記載の抗体又はその断片を活性化T細胞と接触させるステップを含み、前記抗体又はその断片が前記T細胞の表面上のOX40に特異的に結合することができる、方法。
[50]
前記サイトカインが、IFNγ、TNFα、IL−5、IL−10、IL−2、IL−4、IL−13、IL−8、IL−12 p70、IL−1β、又はこれらの任意の組み合わせである、[49]に記載の方法。
[51]
前記サイトカインが、IFNγ、TNFα、IL−5、IL−10、IL−13、又はこれらの任意の組み合わせである、[50]に記載の方法。
[52]
前記活性化T細胞が、活性化CD4+T細胞、活性化CD8+T細胞、又はこれらの組み合わせである、[48]〜[51]のいずれか一項に記載の方法。
[53]
前記活性化CD4+T細胞が、ヒトCD4+T細胞、カニクイザルCD4+T細胞、アカゲザルCD4+T細胞、又はこれらの組み合わせである、[52]に記載の方法。
[54]
T細胞活性化を促進する方法であって、[1]〜[41]のいずれか一項に記載の抗体又はその断片をT細胞と接触させるステップを含み、前記抗体又はその断片が前記T細胞の表面上のOX40に特異的に結合することができる、方法。
[55]
NFκBシグナル伝達経路の刺激によってT細胞活性化を計測することができる、[54]に記載の方法。
[56]
前記T細胞が、活性化CD4+T細胞、活性化CD8+T細胞、又はこれらの組み合わせである、[54]又は[55]に記載の方法。
[57]
前記活性化CD4+T細胞が、ヒトCD4+T細胞、カニクイザルCD4+T細胞、アカゲザルCD4+T細胞、又はこれらの組み合わせである、[56]に記載の方法。
[58]
前記接触させるステップが、対象に前記抗体又はその断片の有効量を投与するステップを含む、[54]〜[57]のいずれか一項に記載の方法。
[59]
対象の癌を治療する方法であって、治療を必要としている対象に、[1]〜[41]のいずれか一項に記載の抗体若しくはその断片又は[42]に記載の組成物の有効量を投与するステップを含む方法。
[60]
前記癌が固形腫瘍である、[59]に記載の方法。
[61]
前記抗体若しくはその断片又は組成物の投与により腫瘍成長を阻害することができるか、腫瘍縮小を促進することができるか、又は両方である、[59]又は[60]に記載の方法。
[62]
腫瘍成長阻害がT細胞の存在下で実現する、[61]に記載の方法。
[63]
対象の免疫応答を増強する方法であって、それを必要としている対象に、[1]〜[41]のいずれか一項に記載の抗体若しくはその断片、又は[42]に記載の組成物の治療有効量を投与するステップを含む方法。
[64]
前記対象がヒト対象である、[59]〜[63]のいずれか一項に記載の方法。
[65]
配列番号91のアミノ酸108〜146の範囲内にあるヒトOX40のエピトープに結合する、[1]〜[41]のいずれか一項に記載の抗体又はその断片。
[66]
前記エピトープが少なくとも配列番号91のアミノ酸ロイシン116及びアラニン126を含む、[65]に記載の抗体又はその断片。
[67]
Q113L突然変異及びV124A突然変異を除いて配列番号92を含むマウスOX40変異体に結合する、[1]〜[41]のいずれか一項に記載の抗体。
[68]
100アミノ酸以下からなる単離ペプチドであって、[1]〜[41]のいずれか一項に記載の抗体又はその断片が特異的に結合することのできるペプチド。
[69]
配列番号91のアミノ酸116〜126を含む、[68]に記載のペプチド。
[70]
L116及びA126を除く任意の位置における1、2、3、4、5、又は6個の単一アミノ酸置換、欠失、又は挿入を除いて配列番号91のアミノ酸108〜146を含む、[68]又は[69]に記載のペプチド。
この発明はまた、以下に関する。
[1]
ヒト化重鎖可変領域(VH)とヒト化軽鎖可変領域(VL)とを含む抗体又はその抗原結合断片であって、
前記VHが、式:
HFW1−HCDR1−HFW2−HCDR2−HFW3−HCDR3−HFW4
(式中、HFW1は配列番号6又は配列番号7であり、HCDR1は配列番号8であり、HFW2は配列番号9であり、HCDR2は配列番号14、配列番号15又は配列番号16であり、HFW3は配列番号17であり、HCDR3は配列番号25、配列番号26、又は配列番号27であり、及びHFW4は配列番号28である)を有するアミノ酸配列を含み、
前記VLがアミノ酸配列、配列番号29又は配列番号32を含み、及び
ヒトOX40に特異的に結合することができる抗体又はその断片。
[2]
前記HFW2のアミノ酸配列が、配列番号10、配列番号11、配列番号12、又は配列番号13である、[1]に記載の抗体又はその断片。
[3]
前記HFW3のアミノ酸配列が、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、又は配列番号24である、[1]又は[2]に記載の抗体又はその断片。
[4]
前記VHがアミノ酸配列、配列番号33、配列番号35、配列番号37、配列番号39、配列番号41、配列番号43、配列番号45、配列番号47、配列番号49、配列番号51、配列番号53、配列番号55、配列番号57、配列番号59、配列番号61、配列番号63、配列番号65、又は配列番号67を含む、[1]〜[3]のいずれか一項に記載の抗体又はその断片。
[5]
前記VLがアミノ酸配列、配列番号29を含み、且つ前記VHがアミノ酸配列、配列番号59を含む、[1]〜[4]のいずれか一項に記載の抗体又はその断片。
[6]
前記VLのC末端に融合した軽鎖定常領域又はその断片を更に含む、[1]〜[5]のいずれか一項に記載の抗体又はその断片。
[7]
前記軽鎖定常領域がヒトκ定常領域である、[6]に記載の抗体又はその断片。
[8]
前記VHのC末端に融合した重鎖定常領域又はその断片を更に含む、[1]〜[7]のいずれか一項に記載の抗体又はその断片。
[9]
前記重鎖定常領域が、ヒトIgG1定常領域、ヒトIgG4P定常領域、ヒトIgG1TM定常領域又はマウスIgG1定常領域である、[8]に記載の抗体又はその断片。
[10]
前記重鎖定常領域がヒトIgG1定常領域である、[9]に記載の抗体又はその断片。[11]
重鎖アミノ酸配列、配列番号71及び軽鎖アミノ酸配列、配列番号30を含む、[1]〜[10]のいずれか一項に記載の抗体又はその断片。
[12]
前記抗原結合断片が、Fv断片、Fab断片、F(ab’)2断片、Fab’断片、dsFv断片、scFv断片、又はsc(Fv)2断片、又はこれらの任意の組み合わせである、[1]〜[11]のいずれか一項に記載の抗体又は断片。
[13]
カニクイザル、又はアカゲザルOX40に特異的に結合することができる、[1]〜[12]のいずれか一項に記載の抗体又はその断片。
[14]
ヒト、カニクイザル、アカゲザル、又はこれらの任意の組み合わせ由来のジャーカット細胞、初代活性化CD4+又はCD8+T細胞上に発現するとおりのOX40に特異的に結合することができる、[13]に記載の抗体又はその断片。
[15]
マウス又はラットOX40に結合しない、[1]〜[14]のいずれか一項に記載の抗体又はその断片。
[16]
関連する腫瘍壊死因子レセプタースーパーファミリー(TNFRSF)タンパク質と交差反応しない、[1]〜[15]のいずれか一項に記載の抗体又はその断片。
[17]
初代活性化ヒトCD4+T細胞上に発現するヒトOX40に対する結合親和性が、フローサイトメトリーによって計測するとき約250pM〜約370pMである、[14]に記載の抗体又はその断片。
[18]
前記結合親和性が約312pMである、[17]に記載の抗体又はその断片。
[19]
フローサイトメトリーによって計測するとき、初代活性化ヒトCD4+T細胞に対する20%レセプター占有率(EC20)を約63〜約93pMで、初代活性化ヒトCD4+T細胞に対する50%レセプター占有率(EC50)を約250〜約370pMで、及び初代活性化ヒトCD4+T細胞に対する90%レセプター占有率(EC90)を約2290〜約3330pMで実現することができる、[17]又は[18]に記載の抗体又はその断片。
[20]
EC20が約78pMであり、EC50が約312pMであり、及びEC90が約2810pMである、[19]に記載の抗体又はその断片。
[21]
OX40過剰発現ジャーカット細胞上に発現するヒトOX40に対する結合親和性が、フローサイトメトリーによって計測するとき約250pM〜約600pMである、[14]に記載の抗体又はその断片。
[22]
前記結合親和性が約424pMである、[21]に記載の抗体又はその断片。
[23]
フローサイトメトリーによって計測するとき、OX40過剰発現ジャーカット細胞に対するEC20を約60〜約150pMで、OX40過剰発現ジャーカット細胞に対するEC50を約250〜約600pMで、及びOX40過剰発現ジャーカット細胞に対するEC90を約2260〜約4380pMで実現することができる、[21]又は[22]に記載の抗体又はその断片。
[24]
EC20が約106pMであり、EC50が約424pMであり、及びEC90が約3820pMである、[23]に記載の抗体又はその断片。
[25]
初代活性化カニクイザルCD4+T細胞上に発現するカニクイザルOX40に対する結合親和性が、フローサイトメトリーによって計測するとき約340pM〜約820pMである、[14]に記載の抗体又はその断片。
[26]
前記結合親和性が約580pMである、[25]に記載の抗体又はその断片。
[27]
初代活性化アカゲザルCD4+T細胞上に発現するアカゲザルOX40に対する結合親和性が、フローサイトメトリーによって計測するとき約130pM〜約600pMである、[14]に記載の抗体又はその断片。
[28]
前記結合親和性が約370pMである、[27]に記載の抗体又はその断片。
[29]
プレートベースのアッセイにおいて活性化CD4+T細胞の用量依存的増殖及び初代活性化ヒトCD4+T細胞における用量依存的サイトカイン放出を誘導することができる、[1]〜[28]のいずれか一項に記載の抗体又はその断片。
[30]
全てフローサイトメトリーによって計測するとき、20%最大増殖応答(EC20)を初代活性化ヒトCD4+T細胞において約14pM〜約28pMの抗体濃度で実現することができ、50%最大増殖応答(EC50)を初代活性化ヒトCD4+T細胞において約0.3pM〜約130pMの抗体濃度で実現することができ、及び90%最大増殖応答(EC90)を初代活性化ヒトCD4+T細胞において約50pM〜約90pMの抗体濃度で実現することができる、[29]に記載の抗体又はその断片。
[31]
EC20が約21pMであり、EC50が約28pMであり、及びEC90が約72pMである、[30]に記載の抗体又はその断片。
[32]
前記サイトカインが、IFNγ、TNFα、IL−5、IL−10、IL−2、IL−4、IL−13、IL−8、IL−12 p70、IL−1β、又はこれらの任意の組み合わせである、[29]〜[31]のいずれか一項に記載の抗体又はその断片。
[33]
前記サイトカインが、IFNγ、TNFα、IL−5、IL−10、IL−13、又はこれらの任意の組み合わせである、[32]に記載の抗体又はその断片。
[34]
初代活性化カニクイザルCD4+T細胞及び初代活性化アカゲザルCD4+T細胞においてCD4+T細胞増殖及びサイトカイン放出を実現することができる、[1]〜[28]のいずれか一項に記載の抗体又はその断片。
[35]
FcγR発現細胞の存在下でOX40発現T細胞のNFκB経路を活性化させることができる、[1]〜[34]のいずれか一項に記載の抗体又はその断片。
[36]
前記OX40発現T細胞が、NFκBシグナル伝達経路の刺激に応答してルシフェラーゼを産生するOX40発現ジャーカットNFκB−ルシフェラーゼレポーター細胞である、[35]に記載の抗体又はその断片。
[37]
OX40発現細胞に対する補体依存性又は抗体依存性細胞傷害を惹起することができる、[1]〜[36]のいずれか一項に記載の抗体又はその断片。
[38]
C1qに結合して、前記OX40発現細胞に対するNK媒介性抗体依存性細胞傷害を惹起することができる、[37]に記載の抗体又はその断片。
[39]
癌治療を必要としている対象に有効用量を投与すると、前記対象の腫瘍成長を阻害することができる、[1]〜[38]のいずれか一項に記載の抗体又はその断片。
[40]
前記腫瘍成長阻害がT細胞の存在下で実現する、[39]に記載の抗体又はその断片。[41]
アイソタイプ対応対照抗体又はその断片の投与と比較して、腫瘍成長が少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、又は少なくとも70%阻害される、[39]又は[40]に記載の抗体又はその断片。
[42]
[1]〜[41]のいずれか一項に記載の抗体又はその断片と担体とを含む組成物。
[43]
[1]〜[41]のいずれか一項に記載の抗体又はその断片、又は[1]〜[41]のいずれか一項に記載の抗体又はその断片のポリペプチドサブユニットをコードする核酸を含むポリヌクレオチド。
[44]
配列番号60の核酸、配列番号31の核酸、配列番号72の核酸、又はこれらの任意の組み合わせを含む、[43]に記載のポリヌクレオチド。
[45]
[43]又は[44]に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
[46]
[43]又は[44]に記載のポリヌクレオチド又は[45]に記載のベクターを含む宿主細胞。
[47]
抗体又はその断片の作製方法であって、前記ポリヌクレオチドによってコードされる前記抗体又はその断片が発現する条件下で[46]に記載の宿主細胞を培養するステップと、前記抗体又はその断片を回収するステップとを含む方法。
[48]
活性化T細胞の生存又は増殖を促進する方法であって、[1]〜[41]のいずれか一項に記載の抗体又はその断片を活性化T細胞と接触させるステップを含み、前記抗体又はその断片が前記T細胞の表面上のOX40に特異的に結合することができる、方法。
[49]
活性化T細胞からのサイトカイン放出を誘導する方法であって、[1]〜[41]のいずれか一項に記載の抗体又はその断片を活性化T細胞と接触させるステップを含み、前記抗体又はその断片が前記T細胞の表面上のOX40に特異的に結合することができる、方法。
[50]
前記サイトカインが、IFNγ、TNFα、IL−5、IL−10、IL−2、IL−4、IL−13、IL−8、IL−12 p70、IL−1β、又はこれらの任意の組み合わせである、[49]に記載の方法。
[51]
前記サイトカインが、IFNγ、TNFα、IL−5、IL−10、IL−13、又はこれらの任意の組み合わせである、[50]に記載の方法。
[52]
前記活性化T細胞が、活性化CD4+T細胞、活性化CD8+T細胞、又はこれらの組み合わせである、[48]〜[51]のいずれか一項に記載の方法。
[53]
前記活性化CD4+T細胞が、ヒトCD4+T細胞、カニクイザルCD4+T細胞、アカゲザルCD4+T細胞、又はこれらの組み合わせである、[52]に記載の方法。
[54]
T細胞活性化を促進する方法であって、[1]〜[41]のいずれか一項に記載の抗体又はその断片をT細胞と接触させるステップを含み、前記抗体又はその断片が前記T細胞の表面上のOX40に特異的に結合することができる、方法。
[55]
NFκBシグナル伝達経路の刺激によってT細胞活性化を計測することができる、[54]に記載の方法。
[56]
前記T細胞が、活性化CD4+T細胞、活性化CD8+T細胞、又はこれらの組み合わせである、[54]又は[55]に記載の方法。
[57]
前記活性化CD4+T細胞が、ヒトCD4+T細胞、カニクイザルCD4+T細胞、アカゲザルCD4+T細胞、又はこれらの組み合わせである、[56]に記載の方法。
[58]
前記接触させるステップが、対象に前記抗体又はその断片の有効量を投与するステップを含む、[54]〜[57]のいずれか一項に記載の方法。
[59]
対象の癌を治療する方法であって、治療を必要としている対象に、[1]〜[41]のいずれか一項に記載の抗体若しくはその断片又は[42]に記載の組成物の有効量を投与するステップを含む方法。
[60]
前記癌が固形腫瘍である、[59]に記載の方法。
[61]
前記抗体若しくはその断片又は組成物の投与により腫瘍成長を阻害することができるか、腫瘍縮小を促進することができるか、又は両方である、[59]又は[60]に記載の方法。
[62]
腫瘍成長阻害がT細胞の存在下で実現する、[61]に記載の方法。
[63]
対象の免疫応答を増強する方法であって、それを必要としている対象に、[1]〜[41]のいずれか一項に記載の抗体若しくはその断片、又は[42]に記載の組成物の治療有効量を投与するステップを含む方法。
[64]
前記対象がヒト対象である、[59]〜[63]のいずれか一項に記載の方法。
[65]
配列番号91のアミノ酸108〜146の範囲内にあるヒトOX40のエピトープに結合する、[1]〜[41]のいずれか一項に記載の抗体又はその断片。
[66]
前記エピトープが少なくとも配列番号91のアミノ酸ロイシン116及びアラニン126を含む、[65]に記載の抗体又はその断片。
[67]
Q113L突然変異及びV124A突然変異を除いて配列番号92を含むマウスOX40変異体に結合する、[1]〜[41]のいずれか一項に記載の抗体。
[68]
100アミノ酸以下からなる単離ペプチドであって、[1]〜[41]のいずれか一項に記載の抗体又はその断片が特異的に結合することのできるペプチド。
[69]
配列番号91のアミノ酸116〜126を含む、[68]に記載のペプチド。
[70]
L116及びA126を除く任意の位置における1、2、3、4、5、又は6個の単一アミノ酸置換、欠失、又は挿入を除いて配列番号91のアミノ酸108〜146を含む、[68]又は[69]に記載のペプチド。
抗原によるプライミング中、又はその直後には、T細胞、例えばCD4+T細胞上のOX40レセプターが会合することにより、抗原に対するT細胞、例えばCD4+T細胞の応答が増加する。本開示の文脈では、用語「会合」は、OX40レセプターとの結合及びそれによって媒介される少なくとも1つの活性の刺激を指す。例えば、抗原特異的T細胞、例えばCD4+T細胞上のOX40レセプターの会合により、単独での抗原に対する応答と比較したときT細胞増殖が増加し、サイトカイン産生が増加し得る。抗原に対する応答の上昇は、OX40レセプター会合がない場合と比べて実質的に長い期間維持され得る。このように、OX40レセプターを介した刺激は、抗原、例えば腫瘍抗原のT細胞認識をブーストすることによって抗原特異的免疫応答を増強する。
OX40アゴニストは、抗原によるT細胞のプライミング中、又はその直後に対象に投与されるとき、ヒト対象などの対象の抗原特異的免疫応答を増強し得る。OX40アゴニストには、OX40リガンド(「OX40L」)、例えば可溶性OX40L融合タンパク質及び抗OX40抗体又はその断片が含まれる。具体的な例は、OX40に特異的に結合して、それによりシグナル伝達を惹起するヒト化抗体である。本開示により、一群のヒト化抗OX40モノクローナル抗体が提供される。また、かかる抗体をコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸も記載される。本開示はまた、ヒト化抗OX40モノクローナル抗体を使用して対象の抗原特異的免疫応答を増強する方法も提供する。
定義
用語「一つの(a)」又は「一つの(an)」実体とは、当該の実体の1つ以上を指し;例えば、「一つの結合分子(a binding molecule)」は、1つ以上の結合分子を表すものと理解されることに留意すべきである。従って、用語「一つの(a)」(又は「一つの(an)」)、「1つ以上」、及び「少なくとも1つ」は、本明細書では同義的に用いられ得る。
用語「一つの(a)」又は「一つの(an)」実体とは、当該の実体の1つ以上を指し;例えば、「一つの結合分子(a binding molecule)」は、1つ以上の結合分子を表すものと理解されることに留意すべきである。従って、用語「一つの(a)」(又は「一つの(an)」)、「1つ以上」、及び「少なくとも1つ」は、本明細書では同義的に用いられ得る。
更に、「及び/又は」は、本明細書で使用される場合、2つの指定される特徴又は構成要素の各々の、他方を伴う又は伴わない具体的な開示であると解釈されるべきである。従って、用語「及び/又は」は、本明細書において「A及び/又はB」などの語句で用いられるとき、「A及びB」、「A又はB」、「A」(単独)、及び「B」(単独)を含むことが意図される。同様に、用語「及び/又は」は、「A、B、及び/又はC」などの語句で用いられるとき、以下の実施形態:A、B、及びC;A、B、又はC;A又はC;A又はB;B又はC;A及びC;A及びB;B及びC;A(単独);B(単独);及びC(単独)の各々を包含することが意図される。
特に定義されない限り、本明細書で使用される科学技術用語は、本開示が関係する技術分野の当業者が一般に理解するのと同じ意味を有する。例えば、Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology,Juo,Pei−Show,2nd ed.,2002,CRC Press;The Dictionary of Cell and Molecular Biology,3rd ed.,1999,Academic Press;及びthe Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology,Revised,2000,Oxford University Pressが、本開示で使用される用語の多くの一般的な辞書を当業者に提供する。
単位、接頭辞、及び記号は、それらの国際単位系(SI)で認められている形式で示される。数値範囲は、その範囲を定義する数を含む。特に指示されない限り、アミノ酸配列は左から右にアミノからカルボキシ方向に記載する。本明細書に提供される見出しは、本明細書を全体として参照することによって有され得る様々な態様又は本開示の態様の限定ではない。従って、このすぐ下に定義する用語は、本明細書を全体として参照することによって更に十全に定義される。
本明細書で使用されるとき、用語「天然に存在しない」物質、組成物、実体、及び/又は物質、組成物、若しくは実体の任意の組み合わせ、又はその任意の文法上の変形は、裁判官又は行政若しくは司法機関によって「天然に存在する」と判断又は解釈されるか、又はいかなる時でもそのように判断又は解釈されるであろう形態の物質、組成物、実体、及び/又は物質、組成物、若しくは実体の任意の組み合わせを明示的に除外するが、但しそれらを除外するのみである条件付きの用語である。
本明細書で使用されるとき、用語「ポリペプチド」は、単数形「ポリペプチド」並びに複数形「ポリペプチド」を包含することが意図され、アミド結合(ペプチド結合としても知られる)によって線状に連結されている単量体(アミノ酸)で構成される分子を指す。用語「ポリペプチド」は2つ以上のアミノ酸の任意の1つ又は複数の鎖を指し、特定の長さの産物を指すものではない。従って、2つ以上のアミノ酸の1つ又は複数の鎖を指すために用いられるペプチド、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」、又は任意の他の用語が「ポリペプチド」の定義の範囲内に含まれ、用語「ポリペプチド」はこれらの用語のいずれかの代わりに、又はそれと同義的に用いることができる。用語「ポリペプチド」はまた、限定なしに、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、及び既知の保護基/ブロック基による誘導体化、タンパク質分解切断、又は天然に存在しないアミノ酸による修飾を含め、ポリペプチドの発現後修飾の産物を指すことも意図される。ポリペプチドは生物学的供給源から得られてもよく、又は組換え技術によって作製されてもよいが、必ずしも指定の核酸配列から翻訳されなくてもよい。ポリペプチドは、化学合成によることを含め、任意の方法で作成することができる。
本明細書に開示されるとおりのポリペプチドは、約3以上、5以上、10以上、20以上、25以上、50以上、75以上、100以上、200以上、500以上、1,000以上、又は2,000以上のアミノ酸サイズのものであり得る。ポリペプチドは定義付けられた三次元構造を有し得るが、必ずしもかかる構造を有しなくてもよい。定義付けられた三次元構造を有するポリペプチドは、折り畳まれたと称され、定義付けられた三次元構造を有さず、むしろ多数の異なるコンホメーションをとることのできるポリペプチドは、折り畳まれていないと称される。本明細書で使用されるとき、用語の糖タンパク質は、アミノ酸、例えばセリン又はアスパラギンの酸素含有又は窒素含有側鎖を介してタンパク質に結合している少なくとも1つの炭水化物部分にカップリングしたタンパク質を指す。
「単離」ポリペプチド又はその断片、変異体、若しくは誘導体とは、その自然環境にないポリペプチドが意図される。特別な精製レベルは要求されない。例えば、単離ポリペプチドは、その天然又は自然環境から取り出され得る。宿主細胞において発現した組換え産生ポリペプチド及びタンパク質は、任意の好適な技術によって分離され、分画され、又は部分的若しくは実質的に精製されている天然又は組換えポリペプチドと同じく、本明細書に開示されるとおり単離されていると見なされる。
本明細書で使用されるとき、用語「天然に存在しない」ポリペプチド、又はその任意の文法上の変形は、裁判官又は行政若しくは司法機関によって「天然に存在する」と判断又は解釈されるか、又はいかなる時でもそのように判断又は解釈されるであろう形態のポリペプチドを明示的に除外するが、但しそれらを除外するのみである条件付きの用語である。
本明細書に開示される他のポリペプチドは、前述のポリペプチドの断片、誘導体、類似体、又は変異体、及びこれらの任意の組み合わせである。用語「断片」、「変異体」、「誘導体」及び「類似体」は、本明細書に開示されるとき、対応する天然抗体又はポリペプチドの特性、例えば抗原との特異的結合性の少なくとも一部を保持する任意のポリペプチドを含む。ポリペプチドの断片には、本明細書の他の部分で考察される具体的な抗体断片に加えて、例えば、タンパク質分解性断片、並びに欠失断片が含まれる。例えばポリペプチドの変異体には、上記に記載したとおりの断片が含まれ、また、アミノ酸置換、欠失、又は挿入によって改変されたアミノ酸配列を有するポリペプチドも含まれる。特定の態様において、変異体は天然に存在しないものであってもよい。天然に存在しない変異体は、当該技術分野において公知の突然変異誘発技術を用いて作製することができる。変異ポリペプチドは、保存的又は非保存的アミノ酸置換、欠失又は付加を含み得る。誘導体は、元のポリペプチドに見られない追加的な特徴を呈するように改変されているポリペプチドである。例としては、融合タンパク質が挙げられる。変異ポリペプチドまた、本明細書では「ポリペプチド類似体」とも称される。本明細書で使用されるとき、ポリペプチドの「誘導体」はまた、官能性側基の反応によって化学的に誘導体化された1つ以上のアミノ酸を有する対象ポリペプチドも指し得る。また、「誘導体」としては、20個の標準的なアミノ酸の1つ以上の誘導体を含有するペプチドも含まれる。例えば、4−ヒドロキシプロリンをプロリンに代えることができ;5−ヒドロキシリジンをリジンに代えることができ;3−メチルヒスチジンをヒスチジンに代えることができ;ホモセリンをセリンに代えることができ;及びオルニチンをリジンに代えることができる。
「保存的アミノ酸置換」は、あるアミノ酸が、同様の側鎖を有する別のアミノ酸に置き換えられているものである。同様の側鎖を有するアミノ酸のファミリーは当該技術分野において定義されており、塩基性側鎖(例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン)、酸性側鎖(例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸)、非荷電極性側鎖(例えば、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン)、非極性側鎖(例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン)、β分枝側鎖(例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン)及び芳香族側鎖(例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)が挙げられる。例えば、フェニルアラニンとチロシンの置換は保存的置換である。特定の実施形態では、アミノ酸配列を含有するポリペプチド又は抗体の、その結合分子が結合する抗原との結合性が、本開示のポリペプチド及び抗体の配列中の保存的置換によって無効になることはない。抗原結合性が消失しないヌクレオチド及びアミノ酸保存的置換を同定する方法は、当該技術分野において周知である(例えば、Brummell et al.,Biochem.32:1180−1 187(1993);Kobayashi et al.,Protein Eng.12(10):879−884(1999);及びBurks et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:.412−417(1997)を参照のこと)。
用語「ポリヌクレオチド」は、単数形の核酸並びに複数形の核酸を包含することが意図され、単離核酸分子又はコンストラクト、例えば、メッセンジャーRNA(mRNA)、cDNA、又はプラスミドDNA(pDNA)を指す。ポリヌクレオチドは、従来のリン酸ジエステル結合又は非従来的な結合(例えば、ペプチド核酸(PNA)に見られるようなアミド結合)を含み得る。用語「核酸」又は「核酸配列」は、ポリヌクレオチド中に存在する任意の1つ以上の核酸セグメント、例えばDNA又はRNA断片を指す。
「単離」核酸又はポリヌクレオチドとは、その天然環境から分離されている任意の形態の核酸又はポリヌクレオチドが意図される。例えば、ゲル精製ポリヌクレオチド、又はベクターに含まれるポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドであれば、「単離されている」と見なされる。また、クローニング用の制限部位を有するように操作されているポリヌクレオチドセグメント、例えばPCR産物も、「単離されている」と見なされる。単離ポリヌクレオチドの更なる例としては、異種宿主細胞に維持される組換えポリヌクレオチド、又は緩衝液若しくは生理食塩水などの非天然溶液中の(部分的に若しくは実質的に)精製されたポリヌクレオチドが挙げられる。単離RNA分子には、ポリヌクレオチドのインビボ又はインビトロRNA転写物が含まれ、ここで転写物は自然中に見出されるものではない。単離ポリヌクレオチド又は核酸には、合成的に作製されたかかる分子が更に含まれる。加えて、ポリヌクレオチド又は核酸は、プロモーター、リボソーム結合部位、又は転写ターミネーターなどの調節エレメントであってもよく、又はそれを含んでもよい。
本明細書で使用されるとき、「天然に存在しない」ポリヌクレオチド、又はその任意の文法上の変形は、裁判官又は行政若しくは司法機関によって「天然に存在する」と判断又は解釈されるか、又はいかなる時でもそのように判断又は解釈されるであろう形態のポリヌクレオチドを明示的に除外するが、但しそれらを除外するのみである条件付きの定義である。
本明細書で使用されるとき、「コード領域」は、アミノ酸に翻訳されるコドンからなる核酸の一部分である。「終止コドン」(TAG、TGA、又はTAA)はアミノ酸に翻訳されないものの、コード領域の一部であると見なすことができ、しかし任意のフランキング配列、例えば、プロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、イントロンなどは、コード領域の一部ではない。2つ以上のコード領域が単一のポリヌクレオチドコンストラクト内、例えば単一のベクター上、又は別個のポリヌクレオチドコンストラクト内、例えば別個の(異なる)ベクター上に存在し得る。更に、任意のベクターが単一のコード領域を含有してもよく、又は2つ以上のコード領域を含んでもよく、例えば、単一のベクターが免疫グロブリン重鎖可変領域と免疫グロブリン軽鎖可変領域とを別個にコードすることができる。加えて、ベクター、ポリヌクレオチド、又は核酸は、別のコード領域と融合した又は融合していない異種コード領域を含むことができる。異種コード領域としては、限定なしに、分泌シグナルペプチド又は異種機能ドメインなどの特別なエレメント又はモチーフをコードするものが挙げられる。
特定の実施形態において、ポリヌクレオチド又は核酸はDNAである。DNAの場合、ポリペプチドをコードする核酸を含むポリヌクレオチドは通常、1つ以上のコード領域と作動可能に結合したプロモーター及び/又は他の転写若しくは翻訳制御エレメントを含み得る。遺伝子産物の発現が1つ又は複数の調節配列の影響下又は制御下に置かれるようにして遺伝子産物、例えばポリペプチドのコード領域が1つ以上の調節配列と結合しているときが、作動可能な結合である。2つのDNA断片(ポリペプチドコード領域及びそれと結合したプロモーターなど)は、所望の遺伝子産物をコードするmRNAの転写がプロモーター機能の誘導によってもたらされる場合、及び2つのDNA断片間の連結の性質が、遺伝子産物の発現を導く発現調節配列の能力に干渉しないか、又はDNA鋳型が転写される能力に干渉しない場合、「作動可能に結合している」。従って、プロモーター領域は、そのプロモーターが当該核酸の転写を生じさせる能力を有したならば、ポリペプチドをコードする核酸と作動可能に結合していると言える。プロモーターは、所定の細胞においてDNAの実質的な転写を導く細胞特異的プロモーターであり得る。プロモーターの他に、他の転写制御エレメント、例えば、エンハンサー、オペレーター、リプレッサー、及び転写終結シグナルが、細胞特異的転写を導くためポリヌクレオチドと結合され得る。
種々の転写制御領域が当業者に公知である。それらとしては、限定なしに、脊椎動物細胞において機能する転写制御領域、例えば、限定はされないが、サイトメガロウイルス由来のプロモーター及びエンハンサーセグメント(イントロンAと併せた前初期プロモーター)、シミアンウイルス40(初期プロモーター)、及びレトロウイルス(ラウス肉腫ウイルスなど)が挙げられる。他の転写制御領域としては、アクチン、熱ショックタンパク質、ウシ成長ホルモン及びウサギβ−グロビンなどの脊椎動物遺伝子に由来するもの、並びに真核細胞における遺伝子発現を制御する能力を有する他の配列が挙げられる。更なる好適な転写制御領域としては、組織特異的プロモーター及びエンハンサー並びにリンホカイン誘導性プロモーター(例えば、インターフェロン類又はインターロイキン類によって誘導可能なプロモーター)が挙げられる。
同様に、種々の翻訳制御エレメントが当業者に公知である。それらとしては、限定はされないが、リボソーム結合部位、翻訳開始及び終止コドン、及びピコルナウイルスに由来するエレメント(特に配列内リボソーム進入部位、即ちIRES、別名CITE配列)が挙げられる。
他の実施形態において、ポリヌクレオチドはRNA、例えば、メッセンジャーRNA(mRNA)、トランスファーRNA、又はリボソームRNAの形態のRNAであり得る。
ポリヌクレオチド及び核酸コード領域は、本明細書に開示されるとおりのポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの分泌を導く分泌ペプチド又はシグナルペプチドをコードする更なるコード領域と結合することができる。シグナル仮説によれば、哺乳類細胞によって分泌されるタンパク質はシグナルペプチド又は分泌リーダー配列を有し、これは、粗面小胞体を通じた成長タンパク質鎖の運び出しが始まると、成熟タンパク質から切断される。当業者は、脊椎動物細胞によって分泌されるポリペプチドが、ポリペプチドのN末端に融合したシグナルペプチドを有することができ、それが完成した又は「完全長」ポリペプチドから切断されて分泌形態又は「成熟」形態のポリペプチドが産生されることを認識している。特定の実施形態では、天然シグナルペプチド、例えば免疫グロブリン重鎖又は軽鎖シグナルペプチド、又は作動可能に結合したポリペプチドの分泌を導く能力を保持している当該配列の機能性誘導体が用いられる。或いは、異種哺乳類シグナルペプチド、又はその機能性誘導体が用いられてもよい。例えば、野生型リーダー配列をヒト組織プラスミノーゲンアクチベーター(TPA)又はマウスβ−グルクロニダーゼのリーダー配列に置換することができる。
本明細書には、ある種の結合分子、又はその抗原結合断片、変異体、若しくは誘導体が開示される。具体的にフルサイズの抗体と言及しない限り、用語「結合分子」は、フルサイズの抗体並びにかかる抗体の抗原結合サブユニット、断片、変異体、類似体、又は誘導体、例えば、改変抗体分子、又は抗体分子と同じように抗原と結合するが異なる足場を使用する断片を包含する。
本明細書で使用されるとき、用語「結合分子」は、その広義の意味において、レセプター、例えばエピトープ又は抗原決定基に特異的に結合する分子を指す。本明細書に更に記載するとおり、結合分子は、本明細書に記載される1つ以上の「抗原結合ドメイン」を含み得る。結合分子の非限定的な例は、抗体又は抗原特異的結合を保持しているその断片である。
本明細書で使用されるとき、用語「結合ドメイン」、「レセプター結合ドメイン」、又は「抗原結合ドメイン」は、エピトープに特異的に結合するために必要且つ十分な結合分子の一領域を指す。例えば、「Fv」、例えば2つの別個のポリペプチドサブユニットとしての、或いは単鎖としての、抗体の可変重鎖及び可変軽鎖は、「結合ドメイン」と見なされる。他の結合ドメインとしては、限定なしに、ラクダ科動物種に由来する抗体の可変重鎖(VHH)、又は異種フレームワーク、例えば異なる生殖細胞系列若しくは種、又は異なる足場、例えばフィブロネクチン足場において発現する6つの免疫グロブリン相補性決定領域(CDR)が挙げられる。本明細書に記載されるとおりの「結合分子」は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12個又はそれ以上の「抗原結合ドメイン」を含み得る。
用語「抗体」及び「免疫グロブリン」は、本明細書では同義的に用いられ得る。抗体(又は本明細書に開示されるとおりのその断片、変異体、又は誘導体)は、少なくとも重鎖の可変ドメイン(ラクダ科動物種について)又は少なくとも重鎖及び軽鎖の可変ドメインを含む。脊椎動物系における基本的な免疫グロブリン構造は、比較的十分に理解されている。例えば、Harlow et al.,Antibodies:A Laboratory Manual,(Cold Spring Harbor Laboratory Press,2nd ed.1988)を参照のこと。特に指定しない限り、用語「抗体」は、抗体の小型の抗原結合断片からフルサイズの抗体、例えば2つの完全な重鎖と2つの完全な軽鎖とを含むIgG抗体、4つの完全な重鎖と4つの完全な軽鎖とを含み、且つ任意選択でJ鎖及び/又は分泌成分を含むIgA抗体、又は10若しくは12個の完全な重鎖と10若しくは12個の完全な軽鎖とを含み、且つ任意選択でJ鎖を含むIgM抗体にまで及ぶ任意のものを包含する。
以下で更に詳細に考察するとおり、用語「免疫グロブリン」は、生化学的に区別され得る様々な幅広いクラスのポリペプチドを含む。当業者は、重鎖がガンマ、ミュー、アルファ、デルタ、又はイプシロン(γ、μ、α、δ、ε)に分類され、それらの間に幾つかのサブクラスが含まれる(例えば、γ1〜γ4又はα1〜α2))ことを理解するであろう。抗体の「クラス」をそれぞれIgG、IgM、IgA IgG、又はIgEと決定するのは、この鎖の性質である。免疫グロブリンサブクラス(アイソタイプ)、例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2等は十分に特徴付けられており、機能上の特殊化を付与することが知られている。これらのクラス及びアイソタイプの各々の修飾バージョンは、本開示に鑑みて当業者が容易に識別し得るものであり、従って本開示の範囲内にある。
軽鎖はカッパ又はラムダ(κ、λ)のいずれかに分類される。各重鎖クラスは、カッパ又はラムダ軽鎖のいずれかと結合し得る。一般に、ハイブリドーマ、B細胞又は遺伝子操作宿主細胞のいずれかによって免疫グロブリンを作成したとき、軽鎖と重鎖とは互いに共有結合的に結合しており、且つ2つの重鎖の「テイル」部分が互いに共有結合性のジスルフィド連結又は非共有結合性の連結によって結合している。重鎖では、アミノ酸配列がY構造の分岐の先端にあるN末端から各鎖の最末端にあるC末端まで延在する。ある種の抗体、例えばIgG抗体の基本構造は、本明細書では「H2L2」構造とも称される、ジスルフィド結合を介して共有結合的につながることによって「Y」構造を形成する2つの重鎖サブユニットと2つの軽鎖サブユニットとを含む。
軽鎖及び重鎖は、いずれも構造的及び機能的相同領域に分けられる。機能的には、用語「定常」及び「可変」が用いられる。この点で、可変軽(VL)鎖部分及び可変重(VH)鎖部分の両方の可変ドメインによって抗原認識及び特異性が決まることが理解されるであろう。逆に、軽鎖(CL)及び重鎖(CH1、CH2又はCH3)の定常ドメインは、分泌、経胎盤移動度、Fcレセプター結合、補体結合などの生物学的特性を付与する。慣習上、定常領域ドメインの付番は、抗体の抗原結合部位又はアミノ末端から遠位になる程増える。N末端部分は可変領域であり、C末端部分には定常領域があり;実際にはCH3(又はIgMの場合CH4)及びCLドメインが、それぞれ重鎖及び軽鎖のカルボキシ末端を含む。
上記に指摘したとおり、結合ドメイン、例えば抗体可変領域によって、結合分子が抗原上のレセプター、又はエピトープを選択的に認識し、それに特異的に結合することが可能となる。即ち、結合分子、例えば抗体のVLドメイン及びVHドメイン、又は相補性決定領域(CDR)のサブセットが組み合わせになって、三次元抗原結合部位を規定する可変領域を形成する。より具体的には、抗原結合部位は、VH鎖及びVL鎖の各々にある3つのCDRによって規定される。ある種の抗体は、より大型の構造を形成する。例えば、IgAは、全てがジスルフィド結合を介して共有結合的につながった2つのH2L2単位とJ鎖と分泌成分とを含む分子を形成することができ、IgMは、ジスルフィド結合を介して共有結合的につながった5個又は6個のH2L2単位と任意選択でJ鎖とを含む五量体又は六量体分子を形成することができる。
抗体抗原結合ドメインに存在する6つの「相補性決定領域」又は「CDR」は、抗体が水性環境中でその三次元配置をとるとき特異的な位置取りで結合ドメインを形成するアミノ酸の短い非連続配列である。「フレームワーク」領域又は「FW」領域と称される結合ドメイン中の残りのアミノ酸は、分子間のばらつきがより小さい。フレームワーク領域は概してβシートコンホメーションをとり、CDRは、そのβシート構造をつなぎ合わせ、且つ場合によってはその一部を形成するループを形成する。従って、フレームワーク領域は、鎖間の非共有結合性相互作用によってCDRが正しい配向で置かれるようにするための足場を形成する働きをする。配置されたCDRによって形成される結合ドメインが、免疫反応性抗原上のエピトープと相補的な表面を規定する。この相補的な表面が、抗体とそのコグネイトエピトープとの非共有結合性の結合を促進する。当業者は所与の重鎖又は軽鎖可変領域について、それらが種々の方法で定義されていることに伴い、それぞれCDR及びフレームワーク領域を構成するアミノ酸を容易に同定することができる(“Sequences of Proteins of Immunological Interest”,Kabat,E.,et al.,米国保健社会福祉省(U.S.Department of Health and Human Services),(1983);及びChothia and Lesk,J.Mol.Biol.,196:901−917(1987)(これらは全体として参照により本明細書に援用される)を参照)。
当該技術分野において使用される及び/又は認められている用語に2つ以上の定義がある場合、本明細書で使用されるときのその用語の定義は、反する旨が明記されない限り、かかる意味の全てを含むことが意図される。具体的な例は、重鎖及び軽鎖ポリペプチドの両方の可変領域内に見られる非連続抗原結合部位を記載するための用語「相補性決定領域」(「CDR」)の使用である。これらの特定の領域は、例えば、Kabat et al.,米国保健社会福祉省(U.S.Dept.of Health and Human Services),“Sequences of Proteins of Immunological Interest”(1983)及びChothia et al.,J.Mol.Biol.196:901−917(1987)(これらは参照により本明細書に援用される)によって記載されている。Kabat及びChothiaの定義は、互いに比較したときアミノ酸の重複又はサブセットを含む。それにも関わらず、抗体又はその変異体のCDRを参照するためのいずれの定義(又は当業者に公知の他の定義)の適用も、特に指示されない限り、本明細書において定義及び使用されるとおりの用語の範囲内であることが意図される。比較として、上記に引用した文献の各々によって定義されるとおりのCDRを包含する適切なアミノ酸を以下の表1に記載する。特定のCDRを包含する正確なアミノ酸番号は、CDRの配列及びサイズに応じて異なることになる。当業者は、抗体の可変領域アミノ酸配列を所与として、どのアミノ酸が特定のCDRを含むかをルーチンで決定することができる。
Kabatらはまた、任意の抗体に適用可能な抗体重鎖及び軽鎖、例えば抗体可変ドメイン配列の付番方式も定義した。当業者は、配列それ自体を越えたいかなる実験データにも頼ることなく、この「Kabat付番」方式を任意の可変ドメイン配列に一義的に割り当てることができる。本明細書で使用されるとき、「Kabat付番」は、Kabat et al.,米国保健社会福祉省(U.S.Dept.of Health and Human Services),“Sequence of Proteins of Immunological Interest”(1983)によって示される付番方式を指す。しかしながら、Kabat付番方式の使用が明示的に注記されない限り、本開示の全てのアミノ酸配列について連続番号が用いられる。
結合分子、例えば、抗体又はその抗原結合断片、変異体、若しくは誘導体としては、限定はされないが、ポリクローナル、モノクローナル、ヒト、ヒト化、又はキメラ抗体、一本鎖抗体、エピトープ結合断片、例えば、Fab、Fab’及びF(ab’)2、Fd、Fv、単鎖Fv(scFv)、一本鎖抗体、ジスルフィド結合Fv(sdFv)、VL又はVHドメインのいずれかを含む断片、Fab発現ライブラリによって産生される断片が挙げられる。ScFv分子は当該技術分野において公知であり、例えば米国特許第5,892,019号明細書に記載されている。本開示に包含される免疫グロブリン又は抗体分子は、任意のタイプ(例えば、IgG、IgE、IgM、IgD、IgA、及びIgY)、クラス(例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及びIgA2)又はサブクラスの免疫グロブリン分子であってもよい。
「特異的に結合する」とは、概して、結合分子、例えば、抗体又はその断片、変異体、若しくは誘導体がその抗原結合ドメインを介してエピトープに結合すること、及び結合が抗原結合ドメインとエピトープとの間の何らかの相補性を伴うものであることを意味する。この定義によれば、結合分子は、それがランダムな無関係のエピトープに結合する場合と比べてより容易にその抗原結合ドメインを介して当該のエピトープに結合するとき、エピトープに「特異的に結合する」と言われる。用語「特異性」は、本明細書では、ある種の結合分子がある種のエピトープに結合する相対的親和性を評価するために用いられる。例えば、結合分子「A」は、結合分子「B」と比べて所与のエピトープに対してより高い特異性を有すると見なすことができ、又は結合分子「A」は、それが関連エピトープ「D」に対して有する特異性と比べてより高い特異性でエピトープ「C」に結合すると言うことができる。
本明細書に開示される結合分子、例えば、抗体又はその断片、変異体、若しくは誘導体は、例えば、5×10−2sec−1、10−2sec−1、5×10−3sec−1、10−3sec−1、5×10−4sec−1、10−4sec−1、5×10−5sec−1、又は10−5sec−1 5×10−6sec−1、10−6sec−1、5×10−7sec−1又は10−7sec−1以下のoff速度(k(off))で標的抗原に結合すると言うことができる。
本明細書に開示される結合分子、例えば、抗体又は抗原結合断片、変異体、若しくは誘導体は、例えば、103M−1sec−1、5×103M−1sec−1、104M−1sec−1、5×104M−1sec−1、105M−1sec−1、5×105M−1sec−1、106M−1sec−1、又は5×106M−1sec−1又は107M−1sec−1以上のon速度(k(on))で標的抗原に結合すると言うことができる。
結合分子、例えば、その抗体又は断片、変異体、若しくは誘導体は、それが所与のエピトープに対する参照抗体又は抗原結合断片の結合を何らかの度合いで遮断する程度に当該エピトープに優先的に結合する場合、そのエピトープに対する参照抗体又は抗原結合断片の結合を競合的に阻害すると言われる。競合的阻害は、当該技術分野において公知の任意の方法、例えば競合ELISAアッセイによって決定することができる。結合分子は、所与のエピトープに対する参照抗体又は抗原結合断片の結合を少なくとも90%、少なくとも80%、少なくとも70%、少なくとも60%、又は少なくとも50%競合的に阻害すると言うことができる。
本明細書で使用されるとき、用語「親和性」は、例えば免疫グロブリン分子の1つ以上の結合ドメインとの個々のエピトープの結合強度の尺度を指す。例えば、Harlow et al.,Antibodies:A Laboratory Manual,(Cold Spring Harbor Laboratory Press,2nd ed.1988)の27〜28頁を参照のこと。本明細書で使用されるとき、用語「アビディティ」は、結合ドメインの集団と抗原との間の複合体の全体的な安定性を指す。例えば、Harlowの29〜34頁を参照のこと。アビディティは、特定のエピトープに対する集団中の個々の結合ドメインの親和性と、また免疫グロブリン及び抗原の結合価との両方に関係する。例えば、二価モノクローナル抗体と、ポリマーなど、高度に反復性のあるエピトープ構造を有する抗原との間の相互作用は、高アビディティの一つであり得る。二価モノクローナル抗体と細胞表面上に高密度で存在するレセプターとの間の相互作用もまた、高アビディティであり得る。
本明細書に開示されるとおりの結合分子又はその抗原結合断片、変異体若しくは誘導体はまた、その交差反応性の観点からも記載又は特定することができる。本明細書で使用されるとき、用語「交差反応性」は、ある抗原に特異的な結合分子、例えば、抗体又はその断片、変異体、若しくは誘導体が第2の抗原と反応する能力;2つの異なる抗原性物質の間の関連性の尺度を指す。従って、結合分子は、それがその形成を誘導したもの以外のエピトープに結合する場合、交差反応する。交差反応性エピトープは、概して、誘導エピトープと同じ相補的構造特徴の多くを備え、場合によっては、実に元のエピトープよりも良好に適合し得る。
結合分子、例えば、抗体又はその断片、変異体、若しくは誘導体はまた、抗原へのそれらの結合親和性によっても記述又は特定が可能である。例えば、結合分子は、例えば、5×10−2M、10−2M、5×10−3M、10−3M、5×10−4M、10−4M、5×10−5M、10−5M、5×10−6M、10−6M、5×10−7M、10−7M、5×10−8M、10−8M、5×10−9M、10−9M、5×10−10M、10−10M、5×10−11M、10−11M、5×10−12M、10−12M、5×10−13M、10−13M、5×10−14M、10−14M、5×10−15M、又は10−15M以下の解離定数又はKDで抗原に結合可能である。
一本鎖抗体又は他の結合ドメインを含む抗体断片は、単独で、又は次のもの、すなわち、ヒンジ領域、CH1、CH2、CH3、若しくはCH4ドメイン、J鎖、又は分泌成分の1つ以上との組合せで、存在可能である。また、可変領域と、ヒンジ領域、CH1、CH2、CH3、若しくはCH4ドメイン、J鎖、又は分泌成分の1つ以上と、の任意の組合せを含み得る抗原結合断片も含まれる。結合分子、例えば、抗体又はその抗原結合断片は、トリや哺乳動物をはじめとする任意の動物起源であり得る。抗体は、ヒト、ネズミ、ロバ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ラマ、ウマ、又はニワトリの抗体であり得る。別の実施形態では、可変領域は、軟骨魚(condricthoid)起源(例えばサメ由来)であり得る。本明細書で用いられる場合、「ヒト」抗体は、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体を含み、また、ヒト免疫グロブリンライブラリーから又は1種以上のヒト免疫グロブリンが導入されたトランスジェニック動物から単離された抗体を含み、このトランスジェニック動物の中には、以下に及び例えばKucherlapatiらによる米国特許第5,939,598号明細書に記載されるように、内因性免疫グロブリンを発現可能なものもあればそうでないものもある。
本明細書で用いられる場合、「重鎖サブユニット」という用語は、免疫グロブリン重鎖に由来するアミノ酸配列を含む。結合分子、例えば、重鎖サブユニットを含む抗体は、VHドメイン、CH1ドメイン、ヒンジ(例えば、上側、中間、及び/若しくは下側のヒンジ領域)ドメイン、CH2ドメイン、CH3ドメイン、CH4ドメイン、又はそれらの変異体若しくは断片の少なくとも1つを含む。例えば、結合分子、例えば、抗体又はその断片、変異体、若しくは誘導体は、VHドメインのほかに、CH1ドメイン、CH1ドメインとヒンジとCH2ドメイン、CH1ドメインとCH3ドメイン、CH1ドメインとヒンジとCH3ドメイン、又はCH1ドメインとヒンジドメインとCH2ドメインとCH3ドメインを含み得る。ある特定の態様では、結合分子、例えば、抗体又はその断片、変異体、若しくは誘導体は、VHドメインのほかに、CH3ドメインとCH4ドメイン、又はCH3ドメインとCH4ドメインとJ鎖を含み得る。さらに、本開示で使用するための結合分子は、ある特定の定常領域部分、例えば、CH2ドメインの全部又は一部が欠如し得る。これらのドメイン(例えば、重鎖サブユニット)を元の免疫グロブリン分子とアミノ酸配列が異なるように修飾可能であることは、当業者であれば理解されよう。
結合分子例えば抗体又はその断片の重鎖サブユニットは、異なる免疫グロブリン分子に由来するドメインを含み得る。例えば、ポリペプチドの重鎖サブユニットは、IgG1分子に由来するCH1ドメインとIgG3分子に由来するヒンジ領域とを含み得る。別の例では、重鎖サブユニットは、一部がIgG1分子及び一部がIgG3分子に由来するヒンジ領域を含み得る。別の例では、重鎖サブユニットは、一部がIgG1分子及び一部がIgG4分子に由来するキメラヒンジを含み得る。
本明細書で用いられる場合、「軽鎖サブユニット」という用語は、免疫グロブリン軽鎖に由来するアミノ酸配列を含む。軽鎖サブユニットは、VL又はCL(例えばCκ若しくはCλ)ドメインの少なくとも1つを含む。
結合分子、例えば、抗体又はその抗原結合断片、変異体、若しくは誘導体は、認識されるか又は特異的に結合される抗原のエピトープ又は部分により記述又は特定が可能である。抗体の抗原結合ドメインと特異的に相互作用する標的抗原の部分は、「エピトープ」又は「抗原決定基」である。標的抗原は、単一のエピトープ又は少なくとも2つのエピトープを含み得るとともに、抗原のサイズ、コンフォメーション、及びタイプに依存していずれかの数のエピトープを含み得る。
前述したように、種々の免疫グロブリンクラスの定常領域のサブユニット構造及び三次元配置は周知である。本明細書で用いられる場合、「VHドメイン」という用語は、免疫グロブリン重鎖のアミノ末端可変ドメインを含み、「CH1ドメイン」という用語は、免疫グロブリン重鎖の第1(最もアミノ末端側)の定常領域ドメインを含む。CH1ドメインは、VHドメインに近接し、且つ典型的な免疫グロブリン重鎖分子のヒンジ領域のアミノ末端側にある。
本明細書で用いられる場合、「CH2ドメイン」という用語は、例えば、従来の付番方式を用いてIgG抗体の約アミノ酸244〜アミノ酸360(Kabat付番系ではアミノ酸244〜360及びEU付番系ではアミノ酸231〜340、前掲文献のKabat EA et al.を参照のこと)に延在する重鎖分子の部分を含む。CH3ドメインは、IgG分子のCH2ドメインからC末端まで延在し且つ約108アミノ酸を含む。ある特定の免疫グロブリンクラス例えばIgMは、CH4領域をさらに含む。
明細書で用いられる場合、「ヒンジ領域」という用語は、CH1ドメインをCH2ドメインに連結する重鎖分子の部分を含む。このヒンジ領域は、約25アミノ酸を含み可撓性であるので、2つのN末端抗原結合領域の独立した運動を可能にする。
本明細書で用いられる場合、「ジスルフィド結合」という用語は、2個の硫黄原子間に形成された共有結合を含む。アミノ酸のシステインは、第2のチオール基とジスルフィド結合又は架橋を形成可能なチオール基を含む。ある特定のIgG分子では、ジスルフィド結合によりCH1領域とCL領域とが結合され、且つKabat付番系を用いて239及び242に対応する位置(EU付番系では226又は229の位置)で2つのジスルフィド結合により2つの重鎖が結合される。本明細書に提供されたある特定の態様では、ヒトIgG4 Fcドメインは、2つのヒンジ領域間にジスルフィド結合形成が確保されるようにヒンジ領域で突然変異が可能であり、とくに位置228(EU付番による)でセリンからプロリンへの突然変異が可能である。S228P突然変異を含むヒトIgG4 Fcドメインは、本明細書では「IgG4P Fcドメイン」という。
本明細書で用いられる場合、「Fc−TM領域」とは、Kabatに記載のEUインデックスによる付番でL234F、L235E、及びP331Sのアミノ酸置換を含むヒトIgG Fc領域のことであり、エフェクター(ADCC及び/又はCDC)機能の低減若しくは破壊、Fcレセプターへの結合の低減若しくは破壊、及び/又は毒性の低減若しくは破壊を呈する。例えば、米国特許出願公開第2011/0059078号明細書(その全体が参照により本明細書に組み込まれる)を参照のこと。
本明細書で用いられる場合、「キメラ抗体」という用語は、免疫反応性の領域又は部位が第1の種から得られるか又はそれに由来し且つ定常領域(無傷であり得るか、一部であり得るか、又は修飾され得る)が第2の種から得られる抗体を意味する。いくつかの実施形態では、標的結合の領域又は部位は、非ヒト源(例えば、マウス又は霊長動物)に由来するであろう。また、定常領域はヒト由来である。
「多重特異的抗体」又は「二重特異的抗体」という用語は、単一抗体分子内に2つ以上の異なるエピトープに対する結合ドメインを有する抗体を意味する。他の結合分子は、カノニカル抗体構造のほかに2つの結合特異性をもたせて構築可能である。二重特異的抗体又は多重特異的抗体によるエピトープ結合は、同時であり得るか又は逐次的であり得る。トリオーマ及びハイブリッドハイブリドーマは、二重特異的抗体を分泌可能な細胞系の2つの例である。二重特異的抗体は、組換え手段によっても構築可能である。(Stroehlein and Heiss,Future Oncol.6:1387−94(2010);Mabry and Snavely,IDrugs.13:543−9(2010))。二重特異的抗体はダイアボディーでもあり得る。
本明細書で用いられる場合、「工学操作抗体」という用語は、CDR領域又はフレームワーク領域のいずれかで1アミノ酸以上の少なくとも部分的な置換えにより重鎖及び軽鎖の一方又は両方の可変ドメインが改変された抗体を意味する。ある特定の態様では、既知の特異性の抗体の全CDRを異種抗体のフレームワーク領域にグラフト可能である。代替CDRは、フレームワーク領域の由来源の抗体と同一のクラス又はさらにはサブクラスの抗体に由来し得るが、CDRは、異なるクラスの抗体、例えば、異なる種の抗体にも由来し得る。既知の特異性の非ヒト抗体の1つ以上の「ドナー」CDRをヒト重鎖又は軽鎖のフレームワーク領域にグラフトした工学操作抗体は、本明細書では「ヒト化抗体」という。ある特定の態様では、すべてのCDRがドナーの可変領域の完全CDRで置き換えられるとは限らないが、それでも依然としてドナーの抗原結合能をレシピエントの可変ドメインに導入可能である。例えば、米国特許第5,585,089号明細書、同第5,693,761号明細書、同第5,693,762号明細書、及び同第6,180,370号明細書に示される説明を考慮すれば、ルーチンの実験を行うことにより又は試行錯誤の試験により工学操作又はヒト化された機能性抗体を得ることは、十分に当業者の能力の範囲内であろう。
本明細書で用いられる場合、「工学操作」という用語は、合成手段(例えば、組換え技術、in vitroペプチド合成、ペプチドの酵素的結合若しくは化学的結合、又はこれらの技術のいくつかの組合せ)による核酸分子又はポリペプチド分子の操作を含む。
本明細書で用いられる場合、「結合された」、「融合された」、若しくは「融合」という用語又は他の文法的等価表現は、同義的に用いることが可能である。これらの用語は、化学的コンジュゲーション又は組換え手段を含めてどんな手段を用いるにせよ、さらに2つの要素又は成分を連結一体化することを意味する。「インフレーム融合」とは、元のORFの翻訳リーディングフレームを維持するように2つ以上のポリヌクレオチドオープンリーディングフレーム(ORF)を連結して連続したより長いORFを形成することを意味する。従って、組換え融合タンパク質は、元のORFによりコードされるポリペプチドに対応する2つ以上のセグメントを含有する単一のタンパク質である(それらのセグメントは天然では通常そのように連結されていない)。リーディングフレームは、このように融合セグメント全体を通じて連続した状態で作製されるが、セグメントは、例えば、インフレームリンカー配列により物理的又は空間的に分離可能である。例えば、免疫グロブリン可変領域のCDRをコードするポリヌクレオチドは、インフレームで融合可能であるが、「融合」CDRが連続したポリペプチドの一部として共翻訳される限り、少なくとも1つの免疫グロブリンフレームワーク領域又は追加のCDR領域をコードするポリヌクレオチドにより分離可能である。
ポリペプチドとの関連では、「線状配列」又は「配列」とは、ポリペプチド中におけるアミノ末端からカルボキシル末端方向のアミノ酸の順序のことであり、この場合、配列中で互いに近接するアミノ酸は、ポリペプチドの一次構造中で隣接している。ポリペプチドの別の部分の「アミノ末端側」又は「N末端側」のポリペプチドの部分は、逐次ポリペプチド鎖中でより前にくる部分である。同様に、ポリペプチドの別の部分の「カルボキシ末端側」又は「C末端側」のポリペプチドの部分は、逐次ポリペプチド鎖中でより後にくる部分である。例えば、典型的な抗体では、可変ドメインは定常領域の「N末端側」であり、且つ定常領域は可変ドメインの「C末端側」である。
本明細書で用いられる「発現」という用語は、遺伝子が生化学物質例えばポリペプチドを産生するプロセスを意味する。このプロセスは、限定されるものではないが、遺伝子ノックダウンさらには一過性発現及び安定発現の両方を含めて、細胞内の遺伝子機能の存在の任意の出現を含む。限定されるものではないが、メッセンジャーRNA(mRNA)への遺伝子の転写及びポリペプチドへのかかるmRNAの翻訳を含む。最終的な所望の産物が生化学物質である場合、発現は、その生化学物質及び任意の前駆体の形成を含む。遺伝子の発現により「遺伝子産物」が産生される。本明細書で用いられる場合、遺伝子産物とは、いずれかの核酸、例えば、遺伝子の転写により産生されるメッセンジャーRNA、又は転写物から翻訳されるポリペプチドのことであり得る。本明細書に記載の遺伝子産物はさらに、ポリアデニル化などの翻訳後修飾を受けた核酸、又はメチル化、グリコシル化、脂質の付加、他のタンパク質サブユニットの会合、タンパク質分解切断などの翻訳後修飾を受けたポリペプチドを含む。
「治療」や「軽減」などの用語は、既存の診断された病理学的病態又は障害の症状の治癒、遅延、低減、及び/又はその進行の停止若しくは遅延を行う治療手段を意味する。「予防」、「回避」、「抑止」などの用語は、診断されていない標的の病理学的病態又は障害の発生の予防を行う予防手段を意味する。従って、「治療が必要とされる者」は、すでに障害を有する者、障害を起こしやすい者、及び障害を予防すべき者を含み得る。
OX40又は「OX40レセプター」は、活性化T細胞、例えば、CD4+及びCD8+T細胞の表面上、さらにはFoxp3+CD4+調節性T細胞(Treg)上に発現するタンパク質である(種々の名称があり、CD134、腫瘍壊死因子レセプタースーパーファミリーメンバー4、及びACT−35とも称される)。ナイーブCD4+及びCD8+T細胞はOX40を発現しない(Croft,M.,(2010)Ann Rev Immunol 28:57−78)。
「OX40リガンド」(「OX40L」)(種々の名称があり、腫瘍壊死因子リガンドスーパーファミリーメンバー4、gp34、TAX転写活性化糖タンパク質1、及びCD252とも称される)は、主に抗原提示細胞(APC)上に見いだされ、活性化B細胞、樹状細胞(DC)、ランゲルハンス細胞、形質細胞様DC、及びマクロファージ上に誘導され得る(同上)。活性化T細胞、NK細胞、マスト細胞、内皮細胞、及び平滑筋細胞をはじめとする他の細胞は、炎症性サイトカインに反応してOX40Lを発現可能である(同上)。OX40LはOX40レセプターに特異的に結合する。ヒトタンパク質は、PCT国際公開第95/21915号パンフレットに記載されている。マウスOX40Lは、米国特許第5,457,035号明細書に記載されている。OX40Lは、細胞の表面上に発現され、細胞内、膜貫通、及び細胞外レセプター結合ドメインを含む。機能活性可溶形OX40Lは、例えば、米国特許第5,457,035号明細書及び同第6,312,700号明細書並びに国際公開第95/21915号パンフレット(それらの開示はあらゆる目的で本明細書に組み込まれる)に記載されているように、細胞内ドメイン及び膜貫通ドメインを欠失させることにより産生可能である。機能活性形OX40Lは、OX40に特異的に結合する能力を保持する形態、すなわち、OX40「レセプター結合ドメイン」を有する形態である。OX40に特異的に結合するOX40L分子又は誘導体の能力を決定する方法は以下で考察される。OX40L及びその誘導体(例えば、OX40結合ドメインを含む誘導体)の作製方法及び使用方法は、国際公開第95/21915号パンフレットに記載されている。そこには、ヒト免疫グロブリン(「Ig」)Fc領域などの他のペプチドに結合される可溶形OX40Lを含むタンパク質も記載されている。これは、培養細胞からのOX40リガンドの精製を容易にするために又は哺乳動物へのin vivo投与後の分子の安定性を向上させるために産生可能である(米国特許第5,457,035号明細書及びPCT国際公開第2006/121810号パンフレット(両方ともその全体が参照により本明細書に組み込まれる)も参照されたい)。
「被験体」又は「個体」又は「動物」又は「患者」又は「哺乳動物」とは、診断、予後判定、又は治療が望まれる任意の被験体とくに哺乳動物被験体を意味する。哺乳動物被験体としては、ヒト、家畜、農場動物、及び動物園用、スポーツ用、又はペット用の動物、例えば、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、イノシシ、ウシ、クマなどが挙げられる。
本明細書で用いられる場合、「療法が奏効すると思われる被験体」、「治療が必要とされる動物」などの語句は、ヒト化抗OX40抗体の投与が奏効すると思われる被験体例えば哺乳動物被験体を含む。かかる抗体は、例えば、癌などの疾患の診断手順及び/又は治療若しくは予防のために使用が可能である。
ヒト化抗OX40抗体及びその抗原結合断片
本開示は、OX40に特異的に結合する抗体例えばヒト化抗体に関する。ある特定の態様では、本明細書に提供される抗体又はその断片は単離可能である。ある特定の態様では、本明細書に提供される抗体又はその断片は実質的に純粋であり得る。ある特定の態様では、本明細書に提供される抗体又はその断片は天然に存在しえない。
本開示は、OX40に特異的に結合する抗体例えばヒト化抗体に関する。ある特定の態様では、本明細書に提供される抗体又はその断片は単離可能である。ある特定の態様では、本明細書に提供される抗体又はその断片は実質的に純粋であり得る。ある特定の態様では、本明細書に提供される抗体又はその断片は天然に存在しえない。
ある特定の態様では、本開示は、OX40mAb5、OX40mAb8、OX40mAb10、OX40mAb11、OX40mAb12、OX40mAb13、OX40mAb14、OX40mAb15、OX40mAb16、OX40mAb17、OX40mAb18、OX40mAb19、OX40mAb20、OX40mAb21、OX40mAb22、OX40mAb23、OX40mAb24、OX40mAb25、OX40mAb25a、OX40mAb26、OX40mAb27、OX40mAb28、OX40mAb29、OX40mAb30、OX40mAb31、OX40mAb32、又はOX40mAb37のVH及びVLを含むヒト化抗OX40抗体又はその抗原結合断片を提供する。ある特定の態様では、本開示は、OX40mAb5、OX40mAb8、OX40mAb10、OX40mAb11、OX40mAb12、OX40mAb13、OX40mAb14、OX40mAb15、OX40mAb16、OX40mAb17、OX40mAb18、OX40mAb19、OX40mAb20、OX40mAb21、OX40mAb22、OX40mAb23、OX40mAb24、OX40mAb25、OX40mAb25a、OX40mAb26、OX40mAb27、OX40mAb28、OX40mAb29、OX40mAb30、OX40mAb31、又はOX40mAb32の重鎖及び軽鎖を含むヒト化抗OX40抗体又はその抗原結合断片を提供する。
ある特定の態様では、本開示は、抗体VH及び抗体VLを含むヒト化抗OX40抗体又はその抗原結合断片を提供する。ただし、VLは、参照アミノ酸配列の配列番号29又は配列番号32に対して少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、又は100%同一であるアミノ酸配列を含む。
ある特定の態様では、本開示は、抗体VH及び抗体VLを含むヒト化抗OX40抗体又はその抗原結合断片を提供する。ただし、VLは、配列番号29又は配列番号32を含む。
本開示は、抗体VH及び抗体VLを含むヒト化抗OX40抗体又はその抗原結合断片をさらに提供する。ただし、VHは、VHCDR1アミノ酸配列の配列番号8、VHCDR2アミノ酸配列の配列番号14、配列番号15、若しくは配列番号16、及びVHCDR3アミノ酸配列の配列番号25、配列番号26、若しくは配列番号27と同一であるか又はVH−CDRの1つ以上における8、7、6、5、4、3、2、若しくは1つの単一アミノ酸置換、欠失、若しくは挿入を除いて同一であるVH−CDR1、VH−CDR2、及びVH−CDR3アミノ酸配列を含む。
本開示は、抗体VH及び抗体VLを含むヒト化抗OX40抗体又はその抗原結合断片をさらに提供する。ただし、VHは、式:
HFW1−HCDR1−HFW2−HCDR2−HFW3−HCDR3−HFW4、を有するアミノ酸配列を含む。式中、HFW1は配列番号6又は配列番号7であり、HCDR1は配列番号8であり、HFW2は配列番号9であり、HCDR2は配列番号14、配列番号15、又は配列番号16であり、HFW3は配列番号17であり、HCDR3は配列番号25、配列番号26、又は配列番号27であり、且つHFW4は配列番号28である。ある特定の態様では、HFW2のアミノ酸配列は、配列番号10、配列番号11、配列番号12、又は配列番号13である。ある特定の態様では、HFW3のアミノ酸配列は、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、又は配列番号24である。
HFW1−HCDR1−HFW2−HCDR2−HFW3−HCDR3−HFW4、を有するアミノ酸配列を含む。式中、HFW1は配列番号6又は配列番号7であり、HCDR1は配列番号8であり、HFW2は配列番号9であり、HCDR2は配列番号14、配列番号15、又は配列番号16であり、HFW3は配列番号17であり、HCDR3は配列番号25、配列番号26、又は配列番号27であり、且つHFW4は配列番号28である。ある特定の態様では、HFW2のアミノ酸配列は、配列番号10、配列番号11、配列番号12、又は配列番号13である。ある特定の態様では、HFW3のアミノ酸配列は、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、又は配列番号24である。
さらに、本開示は、抗体VH及び抗体VLを含むヒト化抗OX40抗体又はその抗原結合断片を提供する。ただし、VHは、参照アミノ酸配列の配列番号33、配列番号35、配列番号37、配列番号39、配列番号41、配列番号43、配列番号45、配列番号47、配列番号49、配列番号51、配列番号53、配列番号55、配列番号57、配列番号59、配列番号61、配列番号63、配列番号65、又は配列番号67に対して、少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、又は100%同一であるアミノ酸配列を含む。
一態様では、本開示は、抗体VH及び抗体VLを含むヒト化抗OX40抗体又はその抗原結合断片を提供する。ただし、VLはアミノ酸配列の配列番号29を含み、且つVHはアミノ酸配列の配列番号59を含む。
本明細書に提供されるヒト化抗OX40抗体又はその抗原結合断片は、VH及びVLのほかに、重鎖定常領域又はその断片を含み得る。ある特定の態様では、重鎖定常領域は、ヒト重鎖定常領域、例えば、ヒトIgG定常領域、例えば、ヒトIgG1定常領域又はヒトIgG4定常領域である。ある特定の態様では、本明細書の他の箇所に記載されるように、重鎖定常領域又はその断片、例えば、ヒトIgG定常領域又はその断片は、野生型IgG定常領域に対して1つ以上のアミノ酸置換を含み得るとともに、この修飾IgGは、野生型IgG定常領域と比較して1つ以上の望ましい性質を有する。例えば、ヒトIgG定常領域は、本明細書の他の箇所に記載されるように、IgG4P定常領域又はIgG1−TM定常領域であり得る。
本明細書に提供されるヒト化抗OX40抗体又はその抗原結合断片は、VH及びVLのほかに、任意選択的に、重鎖定常領域又はその断片、軽鎖定常領域又はその断片を含み得る。ある特定の態様では、軽鎖定常領域は、κ又はλ軽鎖定常領域、例えば、ヒトκ定常領域又はヒトλ定常領域である。特定の態様では、軽鎖定常領域はヒトκ定常領域である。
ある特定の態様では、本開示は、抗体重鎖又はその断片と抗体軽鎖又はその断片とを含むヒト化抗OX40抗体又はその抗原結合断片を提供する。ただし、重鎖はアミノ酸配列の配列番号71を含み、且つ軽鎖はアミノ酸配列の配列番号30を含む。
本明細書に提供されるヒト化抗OX40抗体又はその抗原結合断片は、例えば、モノクローナル、ポリクローナル、組換え、多重特異的、又はそれらの任意の組合せであり得る。ヒト化抗OX40抗体又は抗原結合断片は、例えば、Fv断片、Fab断片、F(ab’)2断片、Fab’断片、dsFv断片、scFv断片、sc(Fv)2断片、Fd断片、ジスルフィド結合Fv断片、V−NARドメイン、IgNar、イントラボディー、IgGΔCH2、ミニボディー、F(ab’)3断片、テトラボディー、トリアボディー、ダイアボディー、単一ドメイン抗体、DVD−Ig、Fcab断片、mAb2断片、(scFv)2断片、又はscFv−Fc断片であり得る。
ある特定の態様では、本明細書に提供されるヒト化抗OX40抗体又はその抗原結合断片は、ヒト、カニクイザル、又はアカゲザルOX40に特異的に結合可能である。ある特定の態様では、本明細書に提供されるヒト化抗OX40抗体又はその抗原結合断片は、一次ヒト、カニクイザル、又はアカゲザルCD4 T細胞又はジャーカット細胞の表面に特異的に結合可能である。ある特定の態様では、本明細書に提供されるヒト化抗OX40抗体又はその抗原結合断片は、ヒト、カニクイザル、アカゲザル、又はそれらの任意の組合せに由来する活性化CD4+又はCD8+T細胞上に発現されるOX40に特異的に結合可能である。ある特定の態様では、本明細書に提供されるヒト化抗OX40抗体又はその抗原結合断片は、ヒト、カニクイザル、アカゲザル、又はそれらの任意の組合せに由来する一次活性化CD4+T細胞上に発現されるOX40に特異的に結合可能である。ある特定の態様では、本明細書に提供されるヒト化抗OX40抗体又はその抗原結合断片は、ネズミ又はラットOX40に結合しない。ある特定の態様では、本明細書に提供されるヒト化抗OX40抗体又はその抗原結合断片は、関連TNFRSFタンパク質、例えば、以下の実施例3の表3−1に列挙されたTNFRSFタンパク質と交差反応しない。
本明細書に提供されるヒト化抗OX40抗体又はその抗原結合断片は、ヒト化抗OX40抗体又はその抗原結合断片の生化学的機能、例えば、OX40に特異的に結合してシグナル伝達を惹起する機能を変化させることなくポリペプチド中に変化を引き起こすことが可能であるならば、1つ以上の保存アミノ酸変化、例えば、10までの保存変化(例えば、2つの置換アミノ酸、3つの置換アミノ酸、4つの置換アミノ酸、又は5つの置換アミノ酸など)を含み得る。例えば、OX40への結合能をブロックすることなく、本明細書に提供される抗体のレセプター結合ドメイン中に1つ以上の保存変化を引き起こすことが可能である。
そのほかに、ポリペプチドドメインの一部を欠失させることが可能であるが、それにより機能のすべてが損なわたり排除されたりするわけではない。同様に、以下に記載されるように、機能が損なわたり排除されたりすることなく、挿入又は付加、例えば、エピトープタグの付加をポリペプチド鎖中で行うことが可能である。ポリペプチドの1つ以上の機能が実質的に損なわれることなく行い得る他の修飾としては、例えば、異常アミノ酸が取り込まれるin vivo又はin vitroの化学的及び生化学的な修飾が挙げられる。当業者であれば容易に分かるであろうが、かかる修飾としては、例えば、アセチル化、カルボキシル化、リン酸化、グリコシル化、標識化例えば放射性核種による標識化、及び種々の酵素修飾が挙げられる。ポリペプチドの様々な標識方法及びかかる目的に有用な標識は当該技術分野で周知であり、32Pなどの放射性同位体、フルオロフォア、化学発光剤、酵素、及び抗リガンドが挙げられる。
本明細書に提供されるヒト化抗OX40抗体又はその抗原結合断片は、異種作用剤、例えば、安定化剤、免疫反応調整剤、又は検出可能剤をさらに含み得る。ある特定の態様では、異種作用剤は、ペプチド結合によるポリペプチドサブユニットに融合される1つ以上の追加のポリペプチド配列、例えば、シグナル配列(例えば、分泌シグナル配列)、リンカー配列、アミノ酸タグ若しくは標識、又は精製を容易にするペプチド配列若しくはポリペプチド配列を含む。ある特定の態様では、ドメインの機能特性が維持される限り、重鎖又は軽鎖の抗体サブユニットのいずれか又はその断片のN末端又はC末端に異種ポリペプチドを融合可能である。
ある特定の態様では、異種作用剤は、本明細書に提供されるヒト化抗OX40抗体又はその抗原結合断片に化学的にコンジュゲート可能である。ポリペプチドサブユニットに化学的にコンジュゲート可能な例示的な異種作用剤としては、限定されるものではないが、リンカー、薬剤、毒素、イメージング剤、放射性化合物、有機及び無機のポリマー、並びにポリペプチドサブユニット自体により提供されない所望の活性を提供可能な任意の他の組成物が挙げられる。具体的な作用剤としては、限定されるものではないが、ポリエチレングリコール(PEG)、細胞傷害剤、放射性核種、イメージング剤、ビオチンが挙げられる。
ある特定の態様では、本開示は、対照又は研究ツールとして使用されるある特定の抗OX40抗体を提供する。例えば、本開示は、VH及びVLがそれぞれネズミIgG1重鎖及びネズミκ軽鎖に融合された以上に記載のヒト化抗OX40抗体又はその抗原結合断片を提供する。この「リバースキメラ」は、アカゲザルのin vivo特徴付けに役立つ。別の例では、本明細書に提供されるヒト化抗OX40抗体上のVH領域は、改変されたエフェクター機能を有する種々の重鎖定常領域に装着可能である。例えば、ヒトIgG4P又はヒトIgG1TMが本明細書の他の箇所に記載されている。
本明細書に提供されるヒト化抗OX40抗体又はその抗原結合断片は、一次活性化T細胞、例えば、ヒト、カニクイザル、アカゲザル、又はそれらの任意の組合せに由来する一次活性化CD4+T細胞、一次活性化CD8+T細胞、及び/又は調節性T細胞上に発現されるOX40に特異的に結合可能である。ある特定の態様では、本明細書に提供されるヒト化抗OX40抗体又はその抗原結合断片、例えばOX40mAb24は、すべてフローサイトメトリーにより測定したときに、約0.01pM〜約1nM、例えば約1pM〜約500pM、例えば約100pM〜約400pM、例えば約250pM〜約370pMの結合親和性で、一次活性化ヒトCD4+T細胞上に発現されるヒトOX40に結合可能である。例えば、ヒト化抗OX40抗体又はその抗原結合断片は、すべてフローサイトメトリーにより測定したときに、約0.1pM、約0.5pM、約1pM、約10pM、約50pM、約100pM、約150pM、約200pM、約250pM、約275pM、約300pM、約325pM、約350pM、約370pM、約400pM、約425pM、約450pM、約475pM、約500pM、約550pM、約600pM、約650pM、約700pM、約750pM、又は約1nMの結合親和性で、一次活性化ヒトCD4+T細胞上に発現されるヒトOX40に結合可能である。ある特定の態様では、本明細書に提供されるヒト化抗OX40抗体又はその抗原結合断片は、約312pMの結合親和性で一次活性化ヒトCD4+T細胞上に発現されるヒトOX40に結合可能である。結合親和性は、いくつかの異なる方法及び/又は装置により測定可能であり、当業者によく理解されているように、相対結合親和性は、方法又は装置に依存して異なり得る。
本明細書に提供されるヒト化抗OX40抗体又はその抗原結合断片は、細胞例えば一次活性化ヒトCD4+T細胞の表面上のOX40分子の一部又は全部を占有して架橋することが可能である。ある特定の態様では、本明細書に提供されるヒト化抗OX40抗体又はその抗原結合断片は、フローサイトメトリーにより測定したときに、約0.01pM〜約1nM、例えば約0.1pM〜約500pM、例えば約1pM〜約200pM、例えば約10pM〜約100pM、例えば約50pM〜約100pM、例えば約63pM〜約93pM、例えば約1pM、約10pM、約20pM、約30pM、約40pM、約50pM、約60pM、約70pM、約78pM、約80pM、約90pM、約100pM、又は約150pMの濃度で、一次活性化ヒトCD4+T細胞上に発現されるヒトOX40に結合可能であり、且つ一次活性化ヒトCD4+T細胞上で20%のレセプター占有率を達成可能である(EC20)。ある特定の態様では、本明細書に提供されるヒト化抗OX40抗体又はその抗原結合断片は、フローサイトメトリーにより測定したときに約78pMの濃度で一次活性化ヒトCD4+T細胞上で20%のレセプター占有率を達成可能である(EC20)。ある特定の態様では、本明細書に提供されるヒト化抗OX40抗体又はその抗原結合断片は、すべてフローサイトメトリーにより測定したときに、約0.01pM〜約1nM、例えば約1pM〜約500pM、例えば約100pM〜約400pM、例えば約250pM〜約370pM、例えば約100pM、約150pM、約200pM、約250pM、約275pM、約300pM、約325pM、約350pM、約370pM、約400pM、約425pM、約450pM、約475pM、又は約500pMの濃度で、一次活性化ヒトCD4+T細胞上に発現されるヒトOX40に結合可能であり、且つ一次活性化ヒトCD4+T細胞上で50%のレセプター占有率を達成可能である(EC50)。ある特定の態様では、本明細書に提供されるヒト化抗OX40抗体又はその抗原結合断片は、フローサイトメトリーにより測定したときに約312pMの濃度で一次活性化ヒトCD4+T細胞上で50%のレセプター占有率を達成可能である(EC50)。ある特定の態様では、ヒト化抗OX40抗体又はその抗原結合断片は、フローサイトメトリーにより測定したときに、約100pM〜約100nM、例えば約500pM〜約10nM、例えば約1nM〜約500nM、例えば約2nM〜約4nM、例えば約1nM、約2nM、約3nM、約4nM、又は約5nMの濃度で、一次活性化ヒトCD4+T細胞上に発現されるヒトOX40に結合可能であり、且つ一次活性化ヒトCD4+T細胞上で90%のレセプター占有率を達成可能である(EC90)。ある特定の態様では、本明細書に提供されるヒト化抗OX40抗体又はその抗原結合断片は、フローサイトメトリーにより測定したときに約2290pM〜約3330pM、例えば約2810pMの濃度で一次活性化ヒトCD4+T細胞上で90%のレセプター占有率を達成可能である(EC90)。
ある特定の態様では、本明細書に提供されるヒト化抗OX40抗体又はその抗原結合断片は、フローサイトメトリーにより測定したときに約250pM〜約600pM、例えば約424pMの結合親和性でOX40過剰発現ジャーカット細胞上に発現されるヒトOX40に結合可能である。
ある特定の態様では、ヒト化抗OX40抗体又はその抗原結合断片は、OX40過剰発現ジャーカット細胞上に発現されるヒトOX40に結合可能であり、フローサイトメトリーにより測定したときに約60〜約150pMの濃度のEC20、約250〜約600pMの濃度のEC50、及び約2260〜約4390pMの濃度のEC90を達成可能である。ある特定の態様では、本明細書に提供されるヒト化抗OX40抗体又はその抗原結合断片は、OX40過剰発現ジャーカット細胞上に発現されるヒトOX40に結合可能であり、フローサイトメトリーにより測定したときに約106pMの濃度のEC20、約424pMの濃度のEC50、及び約3820pMの濃度のEC90を達成が可能である。
別の例では、本明細書に提供されるヒト化抗OX40抗体又はその抗原結合断片は、フローサイトメトリーにより測定したときに約340pM〜約820pM、例えば約580pMの結合親和性で一次活性化カニクイザルCD4+T細胞上に発現されるカニクイザルOX40に結合可能である。別の例では、本明細書に提供されるヒト化抗OX40抗体又はその抗原結合断片は、フローサイトメトリーにより測定したときに約130pM〜約600pM、例えば約370pMの結合親和性で一次活性化アカゲザルCD4+T細胞上に発現されるアカゲザルOX40に結合可能である。
ある特定の態様では、本明細書に提供されるヒト化抗OX40抗体又はその抗原結合断片は、プレートベースのアッセイで活性化CD4+T細胞の用量依存性増殖を誘導可能である。例えば、本明細書に提供されるヒト化抗OX40抗体又はその抗原結合断片、例えばOX40mAb24のin vitroアッセイで、すべてフローサイトメトリーにより測定したときに、約14pM〜約28pM、例えば約21pMの抗体濃度で20%最大増殖反応を一次活性化ヒトCD4+T細胞で達成可能であり(EC20)、約0.3pM〜約130pM、例えば約28pMの抗体濃度で50%最大増殖反応を一次活性化ヒトCD4+T細胞で達成することが可能であり(EC50)、且つ約50pM〜約90pM、例えば約72pMの抗体濃度で90%最大増殖反応を一次活性化ヒトCD4+T細胞で達成可能である(EC90)。
ある特定の態様では、本明細書に提供されるヒト化抗OX40抗体又はその抗原結合断片は、活性化CD4+T細胞、例えば、ヒト一次活性化CD4+T細胞からの用量依存性サイトカイン放出を誘導可能である。ある特定の態様では、放出サイトカインは、IFNγ、TNFα、IL−5、IL−10、IL−2、IL−4、IL−13、IL−8、IL−12p70、IL−1β、又はそれらの任意の組合せである。ある特定の態様では、サイトカインは、IFNγ、TNFα、IL−5、IL−10、IL−13、又はそれらの任意の組合せである。同様に、本明細書に提供されるヒト化抗OX40抗体又はその抗原結合断片は、一次活性化カニクイザルCD4+T細胞及び一次活性化アカゲザルCD4+T細胞でCD4+T細胞増殖及びサイトカイン放出を達成可能である。
そのほかの態様では、本明細書に提供されるヒト化抗OX40抗体又はその抗原結合断片は、FcγR発現細胞の存在下でOX40発現T細胞のNFκB経路を活性化可能である。例えば、本明細書に提供されるヒト化抗OX40抗体又はその抗原結合断片は、NFκBシグナル伝達経路の刺激に反応してルシフェラーゼを産生するOX40発現ジャーカットNFκBルシフェラーゼレポーター細胞のNFκB経路を活性化可能である。他の選択肢として、本明細書に提供されるヒト化抗OX40抗体又はその抗原結合断片は、ヒトOX40、カニクイザルOX40、又はアカゲザルOX40を発現する細胞のNFκB経路を活性化可能である。
さらに別の態様では、本明細書に提供されるヒト化抗OX40抗体又はその抗原結合断片は、癌治療が必要とされる被験体に有効用量で投与した場合、例えば、腫瘍成長を遅らせたり、腫瘍成長を停止させたり、又は存在する腫瘍のサイズを低減したりすることにより、癌治療を促進可能である。ある特定の態様では、癌治療の促進はT細胞の存在下で達成可能である。ある特定の態様では、本明細書に提供されるヒト化抗OX40抗体又はその抗原結合断片は、治療が必要とされる被験体に有効用量で投与した場合、アイソタイプマッチ対照抗体の投与と比較して、腫瘍成長を少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、又は少なくとも70%低減可能である。
このほかのさらなる態様では、本明細書に提供されるヒト化抗OX40抗体又はその抗原結合断片は、OX40への結合により活性化OX40発現T細胞の増殖を誘導可能であり、それと同時に、OX40発現T細胞、例えば、活性化CD4+T細胞、活性化CD8+T細胞、及び/又は調節性T細胞に対して補体依存性又は抗体依存性の細胞傷害性を惹起することが可能である。さらに、ある特定の態様では、本明細書に提供されるヒト化抗OX40抗体又はその抗原結合断片は、OX40への結合によりOX40発現T細胞、例えば、活性化OX40発現CD4+、CD8+T細胞、及び/又は調節性T細胞の増殖を誘導可能であり、それと同時にはC1qに結合可能であるか、又はOX40発現T細胞、例えば、活性化CD4+T細胞、活性化CD8+T細胞、及び/又は調節性T細胞のNK細胞媒介抗体依存性細胞傷害性を惹起することが可能である。
ある特定の態様では、本開示は、ネズミ重鎖定常領域に装着されたヒト化VHとネズミ軽鎖定常領域に装着されたヒト化VLとを含む抗OX40抗体又はその断片を提供する。ただし、重鎖は配列番号81を含み、且つ軽鎖は配列番号83を含む。ある特定の態様では、重鎖定常領域は、例えば、ネズミIgG1定常領域であり得る。ある特定の態様では、軽鎖定常領域は、例えば、ネズミκ定常領域であり得る。
ある特定の態様では、本開示は、ラットVH及びラットVLを含むラット抗マウスOX40抗体又はその抗原結合断片を提供する。ただし、VHはアミノ酸配列の配列番号85を含み、且つVLはアミノ酸配列の配列番号88を含む。ある特定の態様では、この抗体又はその断片は、VLのC末端に融合された軽鎖定常領域又はその断片をさらに含む。軽鎖定常領域は、例えば、ネズミκ定常領域であり得る。ある特定の態様では、この抗体又はその断片は、VHのC末端に融合された重鎖定常領域又はその断片をさらに含む。重鎖定常領域は、例えば、ネズミIgG2a定常領域であり得る。ある特定の態様では、このラット抗マウスOX40抗体は、重鎖アミノ酸配列の配列番号86及び軽鎖アミノ酸配列の配列番号89を含む。ある特定の態様では、本明細書に提供されるラット抗マウスOX40抗体又はその断片は、マウスOX40に特異的に結合可能である。ある特定の態様では、本明細書に提供されるラット抗マウスOX40抗体又はその断片を有効用量でマウスに投与することにより、マウスにおいてマウス癌細胞系成長を阻害可能である。
ある特定の態様では、本明細書に提供されるラット抗マウスOX40抗体断片は、例えば、Fv断片、Fab断片、F(ab’)2断片、Fab’断片、dsFv断片、scFv断片、若しくはsc(Fv)2断片、又はそれらの任意の組合せであり得る。
ヒト化抗OX40抗体、断片、又はサブユニットをコードするポリヌクレオチド
本開示は、ヒト化抗OX40抗体又はその抗原結合断片をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドを提供する。例えば、本開示は、ヒト化抗OX40抗体若しくはヒト化抗OX40抗体のサブユニットをコードするか又はかかる抗体の抗原結合断片をコードする核酸配列を含む1種のポリヌクレオチド又は2種以上のポリヌクレオチドを提供する。本開示のポリヌクレオチドは、RNA形又はDNA形であり得る。DNAは、cDNA、ゲノムDNA例えば修飾ゲノムDNA、及び合成DNAを含み、且つ二本鎖又は一本鎖であり得るとともに、一本鎖の場合、コード鎖又は非コード(アンチセンス)鎖であり得る。
本開示は、ヒト化抗OX40抗体又はその抗原結合断片をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドを提供する。例えば、本開示は、ヒト化抗OX40抗体若しくはヒト化抗OX40抗体のサブユニットをコードするか又はかかる抗体の抗原結合断片をコードする核酸配列を含む1種のポリヌクレオチド又は2種以上のポリヌクレオチドを提供する。本開示のポリヌクレオチドは、RNA形又はDNA形であり得る。DNAは、cDNA、ゲノムDNA例えば修飾ゲノムDNA、及び合成DNAを含み、且つ二本鎖又は一本鎖であり得るとともに、一本鎖の場合、コード鎖又は非コード(アンチセンス)鎖であり得る。
ある特定の態様では、ポリヌクレオチドは単離し得る。ある特定の態様では、ポリヌクレオチドは実質的に純粋であり得る。ある特定の態様では、ポリヌクレオチドは天然に存在しえない。ある特定の態様では、ポリヌクレオチドはcDNAであり得るか又はcDNAに由来し得る。ある特定の態様では、ポリヌクレオチドは組換え産生し得る。ある特定の態様では、ポリヌクレオチドは、宿主細胞からのポリペプチドの発現及び分泌を支援するポリヌクレオチド(例えば、細胞からのポリペプチドの輸送を制御するための分泌配列として機能するリーダー配列)に同一のリーディングフレームで融合された、成熟ポリペプチドに対するコード配列を含み得る。リーダー配列を有するポリペプチドはプレタンパク質であり、リーダー配列が宿主細胞により切断されてポリペプチドの成熟形を形成可能である。
ある特定の態様では、本開示は、本明細書に提供されるヒト化抗OX40抗体若しくはその抗原結合断片又は本明細書に提供されるヒト化抗OX40抗体若しくはその抗原結合断片のポリペプチドサブユニットをコードする核酸を含むポリヌクレオチドを提供する。
また、1つ又は少数の欠失、付加、及び/又は置換を含む核酸配列を含むポリヌクレオチドが提供される。かかる変化は隣接可能であるか、又は核酸中の様々な位置に分布可能である。実質的に同一の核酸配列は、例えば、1又は2又は3又は4又はさらにはそれ以上のヌクレオチド欠失、付加、及び/又は置換を有し得る。ある特定の態様では、修飾(「突然変異」)されるが実質的に同一のポリペプチドが核酸の発現時に産生されるように、1つ以上の欠失、付加、及び/又は置換は、ポリヌクレオチド配列によりコードされるリーディングフレームを改変しない。
ある特定の態様では、本開示は、抗体VLをコードする核酸を含む単離されたポリヌクレオチドを提供する。ただし、VLは、参照アミノ酸配列の配列番号29又は配列番号32に対して少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、又は100%同一であるアミノ酸配列を含む。ある特定の態様では、ポリヌクレオチドは、抗体軽鎖をコードし、且つ参照核酸配列の配列番号31に対して少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、又は100%同一であるヌクレオチド配列を含む。
ある特定の態様では、本開示は、抗体VLをコードする核酸を含む単離されたポリヌクレオチドを提供する。ただし、VLは配列番号29又は配列番号32を含む。
本開示は、抗体VHをコードする核酸を含む単離されたポリヌクレオチドをさらに提供する。ただし、VHは、VHCDR1アミノ酸配列の配列番号8、VHCDR2アミノ酸配列の配列番号14、配列番号15、若しくは配列番号16、及びVHCDR3アミノ酸配列の配列番号25、配列番号26、若しくは配列番号27と同一であるか又はVH−CDRの1つ以上における8、7、6、5、4、3、2、若しくは1つの単一アミノ酸置換、欠失、若しくは挿入を除いて同一であるVH−CDR1、VH−CDR2、及びVH−CDR3アミノ酸配列を含む。
本開示は、抗体VHをコードする核酸を含む単離されたポリヌクレオチドをさらに提供する。ただし、VHは、式:
HFW1−HCDR1−HFW2−HCDR2−HFW3−HCDR3−HFW4、を有するアミノ酸配列を含む。式中、HFW1は配列番号6又は配列番号7であり、HCDR1は配列番号8であり、HFW2は配列番号9であり、HCDR2は配列番号14、配列番号15、又は配列番号16であり、HFW3は配列番号17であり、HCDR3は配列番号25、配列番号26、又は配列番号27であり、且つHFW4は配列番号28である。ある特定の態様では、HFW2のアミノ酸配列は、配列番号10、配列番号11、配列番号12、又は配列番号13である。ある特定の態様では、HFW3のアミノ酸配列は、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、又は配列番号24である。
HFW1−HCDR1−HFW2−HCDR2−HFW3−HCDR3−HFW4、を有するアミノ酸配列を含む。式中、HFW1は配列番号6又は配列番号7であり、HCDR1は配列番号8であり、HFW2は配列番号9であり、HCDR2は配列番号14、配列番号15、又は配列番号16であり、HFW3は配列番号17であり、HCDR3は配列番号25、配列番号26、又は配列番号27であり、且つHFW4は配列番号28である。ある特定の態様では、HFW2のアミノ酸配列は、配列番号10、配列番号11、配列番号12、又は配列番号13である。ある特定の態様では、HFW3のアミノ酸配列は、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、又は配列番号24である。
さらに、本開示は、抗体VHをコードする核酸を含む単離されたポリヌクレオチドを提供する。ただし、VHは、参照アミノ酸配列の配列番号33、配列番号35、配列番号37、配列番号39、配列番号41、配列番号43、配列番号45、配列番号47、配列番号49、配列番号51、配列番号53、配列番号55、配列番号57、配列番号59、配列番号61、配列番号63、配列番号65、又は配列番号67に対して少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、又は100%同一であるアミノ酸配列を含む。ある特定の態様では、ポリヌクレオチドは、参照核酸配列の配列番号34、配列番号36、配列番号38、配列番号40、配列番号42、配列番号44、配列番号46、配列番号48、配列番号50、配列番号52、配列番号54、配列番号56、配列番号58、配列番号60、配列番号62、配列番号64、配列番号66、又は配列番号68に対して少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、又は100%同一であるヌクレオチド配列を含む。
ある特定の態様では、本開示は、配列番号60の核酸、配列番号31の核酸、配列番号72の核酸、又はそれらの任意の組合せを含むポリヌクレオチドを提供する。
さらに、以上に記載のポリヌクレオチドを含むベクターが提供される。好適なベクターは本明細書の他の箇所に記載されており、当業者に公知である。
ある特定の態様では、本開示は、以上に記載のポリヌクレオチド又はベクターを含み、任意選択的に1種以上の担体、希釈剤、賦形剤、又は他の添加剤をさらに含む組成物例えば医薬組成物を提供する。
ある特定の態様では、本開示は、VHをコードする核酸を含むポリヌクレオチドとVLをコードする核酸を含むポリヌクレオチドとを含むポリヌクレオチド組成物を提供する。この態様によれば、VL及びVHは、参照アミノ酸配列の配列番号29又は配列番号32に対して少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、又は100%同一であるVLアミノ酸配列と、(a)VHCDR1アミノ酸配列の配列番号8、VHCDR2アミノ酸配列の配列番号14、配列番号15、若しくは配列番号16、及びVHCDR3アミノ酸配列の配列番号25、配列番号26、若しくは配列番号27と同一であるか又はVH−CDRの1つ以上における8、7、6、5、4、3、2、若しくは1つの単一アミノ酸置換、欠失、若しくは挿入を除いて同一であるVH−CDR1、VH−CDR2、及びVH−CDR3アミノ酸配列、(b)式:
HFW1−HCDR1−HFW2−HCDR2−HFW3−HCDR3−HFW4、(式中、HFW1は配列番号6又は配列番号7であり、HCDR1は配列番号8であり、HFW2は配列番号9であり、HCDR2は配列番号14、配列番号15、又は配列番号16であり、HFW3は配列番号17であり、HCDR3は配列番号25、配列番号26、又は配列番号27であり、且つHFW4は配列番号28である)
を有するアミノ酸配列、又は(c)参照アミノ酸配列の配列番号33、配列番号35、配列番号37、配列番号39、配列番号41、配列番号43、配列番号45、配列番号47、配列番号49、配列番号51、配列番号53、配列番号55、配列番号57、配列番号59、配列番号61、配列番号63、配列番号65、又は配列番号67に対して少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、又は100%同一であるアミノ酸配列、を含むVHと、を一体的に含み得る。VH(b)では、HFW2のアミノ酸配列は、配列番号10、配列番号11、配列番号12、若しくは配列番号13であり得るとともに、且つ/又はHFW3のアミノ酸配列は、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、若しくは配列番号24であり得る。
HFW1−HCDR1−HFW2−HCDR2−HFW3−HCDR3−HFW4、(式中、HFW1は配列番号6又は配列番号7であり、HCDR1は配列番号8であり、HFW2は配列番号9であり、HCDR2は配列番号14、配列番号15、又は配列番号16であり、HFW3は配列番号17であり、HCDR3は配列番号25、配列番号26、又は配列番号27であり、且つHFW4は配列番号28である)
を有するアミノ酸配列、又は(c)参照アミノ酸配列の配列番号33、配列番号35、配列番号37、配列番号39、配列番号41、配列番号43、配列番号45、配列番号47、配列番号49、配列番号51、配列番号53、配列番号55、配列番号57、配列番号59、配列番号61、配列番号63、配列番号65、又は配列番号67に対して少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、又は100%同一であるアミノ酸配列、を含むVHと、を一体的に含み得る。VH(b)では、HFW2のアミノ酸配列は、配列番号10、配列番号11、配列番号12、若しくは配列番号13であり得るとともに、且つ/又はHFW3のアミノ酸配列は、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、若しくは配列番号24であり得る。
以上に記載のポリヌクレオチド組成物では、VHをコードする核酸を含むポリヌクレオチド及びVLをコードする核酸を含むポリヌクレオチドは、単一のベクターに存在可能であるか、又は個別の同一でないベクターに存在可能である。それに応じて、本開示は、以上に記載のポリヌクレオチド組成物を含む1種以上のベクターを提供する。
いくつかの場合には、以上に記載のVH及びVLをコードするポリヌクレオチド組成物は、OX40、例えば、ヒトOX40、カニクイザルOX40、及び/又はアカゲザルOX40に特異的に結合可能なヒト化抗体又はその抗原結合断片をコード可能である。
ある特定の態様では、本開示は、ネズミ重鎖定常領域に装着されたヒト化VHとネズミ軽鎖定常領域に装着されたヒト化VLとを含む抗OX40抗体又はその断片をコードする核酸を含む単離されたポリヌクレオチドを提供する。ただし、重鎖は配列番号81を含み、且つ軽鎖は配列番号83を含む。ある特定の態様では、重鎖定常領域は、例えば、ネズミIgG1定常領域であり得る。ある特定の態様では、軽鎖定常領域は、例えば、ネズミκ定常領域であり得る。
ある特定の態様では、本開示は、ラットVH及びラットVLを含むラット抗マウスOX40抗体又はその抗原結合断片をコードする核酸を含む単離されたポリヌクレオチドを提供する。ただし、VHはアミノ酸配列の配列番号85を含み、且つVLはアミノ酸配列の配列番号88を含む。ある特定の態様では、この抗体又はその断片は、VLのC末端に融合された軽鎖定常領域又はその断片をさらに含む。軽鎖定常領域は、例えば、ネズミκ定常領域であり得る。ある特定の態様では、この抗体又はその断片は、VHのC末端に融合された重鎖定常領域又はその断片をさらに含む。重鎖定常領域は、例えば、ネズミIgG2a定常領域であり得る。ある特定の態様では、このラット抗マウスOX40抗体は、重鎖アミノ酸配列の配列番号86及び軽鎖アミノ酸配列の配列番号89を含む。ある特定の態様では、本明細書に提供されるラット抗マウスOX40抗体又はその断片は、マウスOX40に特異的に結合可能である。ある特定の態様では、本明細書に提供されるラット抗マウスOX40抗体又はその断片を有効用量でマウスに投与することにより、マウスにおいてマウス癌細胞系成長を阻害可能である。
本開示は、以上に提供されるポリヌクレオチド、ポリヌクレオチド組成物、又はベクターを含む宿主細胞をさらに提供する。ただし、宿主細胞は、いくつかの場合には、OX40、例えば、ヒトOX40、カニクイザルOX40、又はアカゲザルOX40に特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片を発現可能である。かかる宿主細胞は、本明細書に提供される抗体又はその抗原結合断片の作製方法に利用可能である。この方法は、(a)宿主細胞を培養する工程と、(b)発現された抗体又はその抗原結合断片を宿主細胞から単離する工程と、を含む。
ポリヌクレオチド変異体も提供される。ポリヌクレオチド変異体は、コード領域、非コード領域、又はその両方に改変を含み得る。いくつかの態様では、ポリヌクレオチド変異体は、サイレント置換、付加、又は欠失を生じる改変を含むが、コードポリペプチドの性質や活性を改変しない。いくつかの態様では、ポリヌクレオチド変異体は、遺伝暗号の縮重に基づいてサイレント置換により産生される。ポリヌクレオチド変異体は、様々な理由で、例えば、特定の宿主でコドン発現を最適化するために(ヒトmRNAのコドンを大腸菌(E.coli)などの細菌宿主によるコドンに変化させるために)産生され得る。本明細書に記載のポリヌクレオチドを含むベクター及び細胞も提供される。
いくつかの態様では、ヒト化抗OX40抗体又はその抗原結合断片をコードするDNA配列は、オリゴヌクレオチドシンセサイザーを用いて化学合成により構築可能である。かかるオリゴヌクレオチドは、所望のポリペプチドのアミノ酸配列と、対象の組換えポリペプチドを産生する宿主細胞に有利なコドンの選択と、に基づいて設計可能である。標準的方法を適用して、対象の単離ポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチド配列を合成可能である。例えば、完全アミノ酸配列を用いて逆翻訳遺伝子を構築可能である。さらに、特定の単離ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含有するDNAオリゴマーを合成可能である。例えば、所望のポリペプチドの一部をコードするいくつかの小さなオリゴヌクレオチドを合成してからライゲートすることが可能である。個別のオリゴヌクレオチドは、相補的集合のために5’又は3’オーバーハングを含み得る。
集合させた後(合成、部位指向突然変異誘発、又は別の方法により)、対象の特定の単離ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を発現ベクターに挿入し、所望の宿主でのタンパク質発現に適した発現制御配列に作動的に連結可能である。適正な集合は、例えば、ヌクレオチド配列決定、制限切断マッピング、及び/又は好適な宿主での生物学的活性ポリペプチドの発現により確認可能である。宿主でトランスフェクト遺伝子の高い発現レベルを得るために、選択された発現宿主で機能する転写・翻訳発現制御配列に遺伝子を作動的に連結したり又は関連付けしたりすることが可能である。
ある特定の態様では、組換え発現ベクターは、ヒト化抗OX40抗体又はその抗原結合断片をコードするDNAの増幅及び発現のために使用される。組換え発現ベクターは、哺乳動物、微生物、ウイルス、又は昆虫の遺伝子に由来する好適な転写調節エレメント又は翻訳調節エレメントに作動的に連結された、ヒト化抗OX40抗体又はその抗原結合断片のポリペプチド鎖をコードする合成DNA断片又はcDNA由来DNA断片を有する複製可能なDNA構築物である。一例では、転写ユニットは、以下に詳細に記載されるように、(1)遺伝子エレメント又は遺伝子発現で調節的役割を担うエレメント、例えば、転写プロモーター又はエンハンサーと、(2)構造配列又はmRNAに転写されてタンパク質に翻訳されるコード配列と、(3)適切な転写及び翻訳の開始配列及び終止配列と、の集合を含み得る。かかる調節エレメントは、転写を制御するオペレーター配列を含み得る。宿主での複製能力、例えば、複製起点により付与される複製能力、及びトランスフォーマントの認識を容易にする選択遺伝子は、追加的に組込み可能である。互いに機能的に関連付けられている場合、DNA領域は作動的に連結されている。例えば、ポリペプチドの分泌に関与する前駆体として発現されるのであれば、シグナルペプチド(分泌リーダー)のDNAはポリペプチドのDNAに作動的に連結されており、配列の転写を制御するのであれば、プロモーターはコード配列に作動的に連結されており、又は翻訳を可能にするように配置されているのであれば、リボソーム結合部位はコード配列に作動的に連結されている。酵母発現系に使用することが意図される構造エレメントは、宿主細胞による翻訳タンパク質の細胞外分泌を可能にするリーダー配列を含む。他の選択肢として、組換えタンパク質がリーダー配列や輸送配列を含まずに発現される場合、タンパク質はN末端メチオニンを含み得る。このメチオニンは、任意選択的に、発現された組換えタンパク質から後続的に切り離されて最終生成物を提供可能である。
発現制御配列及び発現ベクターの選択は、宿主の選択に依存するであろう。多種多様な発現宿主/ベクターの組合せを利用可能である。真核宿主に有用な発現ベクターとしては、例えば、SV40、ウシパピローマウイルス、アデノウイルス、及びサイトメガロウイルスに由来する発現制御配列を含むベクターが挙げられる。細菌宿主に有用な発現ベクターとしては、公知の細菌プラスミド、例えば、pCR1、pBR322、pMB9、及びそれらの誘導体を含めて大腸菌(E.coli)由来のプラスミド、より広範な宿主域のプラスミド、例えば、M13及び糸状一本鎖DNAファージが挙げられる。
ヒト化抗OX40抗体又はその抗原結合断片を発現するのに好適な宿主細胞としては、適切なプロモーターの制御下にある原核細胞、酵母細胞、昆虫細胞、又は高等真核細胞が挙げられる。原核生物としては、グラム陰性又はグラム陽性の生物、例えば、大腸菌(E.coli)又は桿菌が挙げられる。高等真核細胞としては、以下に記載の哺乳動物起源の樹立細胞系が挙げられる。細胞フリー翻訳システムを利用することも可能である。抗体産生を含めてタンパク質産生の方法に関する追加情報は、例えば、米国特許出願公開第2008/0187954号明細書、米国特許第6,413,746号明細書及び同第6,660,501号明細書、並びに国際公開第04009823号パンフレット(それぞれその全体が本出願をもって参照により本明細書に組み込まれる)に見いだし得る。
種々の哺乳動物又は昆虫の細胞培養システムを利用してヒト化抗OX40抗体又はその抗原結合断片を発現させることも可能である。タンパク質が一般に適正にフォールディングされ、適切に修飾され、且つ完全に機能することから、哺乳動物細胞での組換えタンパク質の発現を行うことが可能である。好適な哺乳動物宿主細胞系の例としては、HEK−293及びHEK−293T、Gluzman(Cell 23:175,1981)に記載のサル腎細胞のCOS−7系、並びに例えばL細胞、C127、3T3、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)、HeLa、及びBHKの細胞系をはじめとする他の細胞系が挙げられる。哺乳動物発現ベクターは、非転写エレメント、例えば、複製起点、発現される遺伝子に連結された好適なプロモーター及びエンハンサー、並びに他の5’又は3’フランキング非転写配列、さらには5’又は3’非翻訳配列、例えば、リボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナー部位及びスプライスアクセプター部位、並びに転写終止配列を含み得る。昆虫細胞での異種タンパク質の産生に供されるバキュロウイルスシステムは、Luckow and Summers,BioTechnology 6:47(1988)にレビューされている。
トランスフォーム宿主により産生されたヒト化抗OX40抗体又はその抗原結合断片は、任意の好適な方法に従って精製可能である。かかる標準的方法としては、クロマトグラフィー法(例えば、イオン交換、アフィニティー、及びサイズカラムクロマトグラフィー法)、遠心分離法、溶解度差法、又は任意の他の標準的タンパク質精製技術による方法が挙げられる。適切なアフィニティーカラムに通して容易に精製できるように、ヘキサヒスチジン、マルトース結合ドメイン、インフルエンザコート配列、グルタチオン−S−トランスフェラーゼなどのアフィニティータグをタンパク質に装着可能である。単離タンパク質は、タンパク質分解、核磁気共鳴、X線結晶解析などの技術を用いて物理的に特徴付けることも可能である。
例えば、培養培地中に組換えタンパク質を分泌するシステムの上清は、最初に、市販のタンパク質濃縮フィルター、例えば、Amicon又はMillipore Pellicon限外濾過ユニットを用いて濃縮可能である。濃縮工程に続いて、濃縮物を好適な精製マトリックスに適用可能である。他の選択肢として、陰イオン交換樹脂、例えば、ペンダントジエチルアミノエチル(DEAE)基を有するマトリックス又は基材を利用可能である。マトリックスは、アクリルアミド、アガロース、デキストラン、セルロース、又はタンパク質精製に一般に利用される他のタイプであり得る。他の選択肢として、陽イオン交換工程を利用可能である。好適な陽イオン交換体としては、スルホプロピル基又はカルボキシメチル基を含む種々の不溶性マトリックスが挙げられる。最後に、ヒト化抗OX40抗体又はその抗原結合断片をさらに精製するために、疎水性RP−HPLC媒体、例えば、ペンダントメチル基又は他の脂肪族基を有するシリカゲルを利用した1つ以上の逆相高性能液体クロマトグラフィー(RP−HPLC)工程を利用可能である。均一な組換えタンパク質を提供するために、以上の精製工程の一部又は全部を種々の組合せで利用可能である。
細菌培養で産生されたヒト化抗OX40抗体又はその抗原結合断片は、例えば、細胞ペレットからの初期抽出、1回以上の濃縮、塩析、水性イオン交換、又はサイズ排除クロマトグラフィーの工程により、単離可能である。最終精製工程のために高性能液体クロマトグラフィー(HPLC)を使用可能である。組換えタンパク質の発現に利用された微生物細胞は、凍結−解凍サイクル処理、超音波処理、機械的破砕、又は細胞溶解剤の使用をはじめとする任意の便利な方法により破砕可能である。
抗体及び他のタンパク質を精製するための当該技術分野で公知の方法としては、例えば、米国特許出願公開第2008/0312425号明細書、同第2008/0177048号明細書、及び同第2009/0187005号明細書(それぞれその全体が本出願をもって参照により本明細書に組み込まれる)に記載のものも挙げられる。
医薬組成物及び投与方法
本明細書に提供されるヒト化抗OX40抗体又はその抗原結合断片を調製する方法及び必要とされる被験体に、例えば、癌患者で免疫反応を増強するために、例えば、腫瘍成長を阻害又は低減するために投与する方法は、周知であるか又は当業者であれば容易に決定可能である。ヒト化抗OX40抗体又はその抗原結合断片の投与経路は、例えば、経口、非経口、吸入、又は局所であり得る。本明細書で用いられる非経口という用語は、例えば、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、経直腸、又は経膣の投与を含む。これらの投与形態はすべて好適な形態として明確に企図されるが、投与形態の別の例は、とくに静脈内又は動脈内の注射又は点滴に供される注射用の溶液であろう。通常、好適な医薬組成物は、限定されるものではないが、緩衝液(例えば、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、又はクエン酸緩衝液)、界面活性剤(例えば、ポリソルベート)、安定化剤(例えば、ヒトアルブミン)などを含む。本明細書に記載の教示に適合可能な他の方法では、本明細書に提供されるヒト化抗OX40抗体又はその抗原結合断片を有害な細胞集団部位に直接送達することにより治療剤への疾患組織の暴露を増加させることが可能である。
本明細書に提供されるヒト化抗OX40抗体又はその抗原結合断片を調製する方法及び必要とされる被験体に、例えば、癌患者で免疫反応を増強するために、例えば、腫瘍成長を阻害又は低減するために投与する方法は、周知であるか又は当業者であれば容易に決定可能である。ヒト化抗OX40抗体又はその抗原結合断片の投与経路は、例えば、経口、非経口、吸入、又は局所であり得る。本明細書で用いられる非経口という用語は、例えば、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、経直腸、又は経膣の投与を含む。これらの投与形態はすべて好適な形態として明確に企図されるが、投与形態の別の例は、とくに静脈内又は動脈内の注射又は点滴に供される注射用の溶液であろう。通常、好適な医薬組成物は、限定されるものではないが、緩衝液(例えば、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、又はクエン酸緩衝液)、界面活性剤(例えば、ポリソルベート)、安定化剤(例えば、ヒトアルブミン)などを含む。本明細書に記載の教示に適合可能な他の方法では、本明細書に提供されるヒト化抗OX40抗体又はその抗原結合断片を有害な細胞集団部位に直接送達することにより治療剤への疾患組織の暴露を増加させることが可能である。
本明細書に提供されるある特定の医薬組成物は、例えば、カプセル剤、錠剤、水性サスペンジョン剤、又は溶液剤をはじめとする許容可能な剤形で経口投与可能である。ある特定の医薬組成物は、鼻エアロゾル又は吸入による投与も可能である。かかる組成物は、ベンジルアルコール若しくは他の好適な保存剤、生物学的利用率を増強する吸収促進剤、及び/又は他の従来の可溶化剤若しくは分散剤を利用して、生理食塩水中の溶液として調製可能である。
単回投与製剤を作製するために担体材料と組合せ可能なヒト化抗OX40抗体又はその抗原結合断片の量は、治療される被験体及び特定の投与モードに依存して異なるであろう。組成物は、単回用量、複数回用量として、又は確立された注入時間にわたり投与可能である。最適な所望の反応(例えば、治療反応又は予防反応)を提供するために、投与レジメンを調整することも可能である。
「治療上有効な用量若しくは量」又は「有効な量」とは、治療される疾患又は病態を有する患者の治療に対して投与時に陽性治療反応を引き起こすヒト化抗OX40抗体又はその抗原結合断片の量であることが意図される。
キット
本開示は、本明細書に記載のヒト化抗OX40抗体又はその抗原結合断片を含み且つ本明細書に記載の方法を行うために使用可能なキットをさらに提供する。ある特定の実施形態では、キットは、1つ以上の容器内に少なくとも1種の精製されたヒト化抗OX40抗体又はその抗原結合断片を含む。当該技術分野で周知の確立されたキット方式の1つに開示されたヒト化抗OX40抗体を容易に組込み可能であることは、当業者であれば容易に分かるであろう。
本開示は、本明細書に記載のヒト化抗OX40抗体又はその抗原結合断片を含み且つ本明細書に記載の方法を行うために使用可能なキットをさらに提供する。ある特定の実施形態では、キットは、1つ以上の容器内に少なくとも1種の精製されたヒト化抗OX40抗体又はその抗原結合断片を含む。当該技術分野で周知の確立されたキット方式の1つに開示されたヒト化抗OX40抗体を容易に組込み可能であることは、当業者であれば容易に分かるであろう。
免疫アッセイ
ヒト化抗OX40抗体又はその抗原結合断片は、当該技術分野で公知の任意の方法により特異的及び/又は選択的結合に関してアッセイ可能である。使用可能な免疫アッセイとしては、限定されるものではないが、いくつかの例として、ウェスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、ELISA(酵素結合免疫吸着アッセイ)、蛍光フォーカスアッセイ(FFA)、「サンドイッチ」免疫アッセイ、免疫沈降アッセイ、沈降素反応、ゲル内拡散沈降素反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体結合アッセイ、免疫ラジオメトリックアッセイ、蛍光免疫アッセイなどの技術を用いた競合及び非競合アッセイシステムが挙げられる。かかるアッセイはルーチンで行われており、当該技術分野で周知である(例えば、Ausubel et al.,eds,(1994)Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley & Sons,Inc.,NY)Vol.1(その全体が参照により本明細書に組み込まれる)を参照のこと)。
ヒト化抗OX40抗体又はその抗原結合断片は、当該技術分野で公知の任意の方法により特異的及び/又は選択的結合に関してアッセイ可能である。使用可能な免疫アッセイとしては、限定されるものではないが、いくつかの例として、ウェスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、ELISA(酵素結合免疫吸着アッセイ)、蛍光フォーカスアッセイ(FFA)、「サンドイッチ」免疫アッセイ、免疫沈降アッセイ、沈降素反応、ゲル内拡散沈降素反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体結合アッセイ、免疫ラジオメトリックアッセイ、蛍光免疫アッセイなどの技術を用いた競合及び非競合アッセイシステムが挙げられる。かかるアッセイはルーチンで行われており、当該技術分野で周知である(例えば、Ausubel et al.,eds,(1994)Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley & Sons,Inc.,NY)Vol.1(その全体が参照により本明細書に組み込まれる)を参照のこと)。
本明細書に提供されるヒト化抗OX40抗体の結合特性の決定に好適な方法及び試薬は、当該技術分野で公知であり及び/又は入手可能である。かかる速度論的分析用として設計された装置及びソフトウェアは市販されている(例えば、BIAcore(登録商標)、BIAevaluation(登録商標)software、GE Healthcare;KINEXA(登録商標)Software、Sapidyne Instruments)。
免疫増強方法及び治療方法
活性化T細胞、例えば、活性化CD4+T細胞及び/又は活性化CD8+T細胞上のOX40のエンゲージによる被験体(例えば、ヒト被験体などの哺乳動物被験体)における抗原特異的免疫反応の増強は、抗原の活性化時又は活性化後に多種多様な方法を用いて達成可能である。最適な方法は、免疫反応の増強が望まれる抗原のタイプに主に依存するであろう。また、利用可能な種々の方法は、以下で考察される。どんな方法を選択するにせよ、ヒト化抗OX40抗体又はその抗原結合断片は、抗原によるT細胞のプライミング時又はその直後に被験体のT細胞に提示されるように被験体例えばヒト患者に投与可能である。
活性化T細胞、例えば、活性化CD4+T細胞及び/又は活性化CD8+T細胞上のOX40のエンゲージによる被験体(例えば、ヒト被験体などの哺乳動物被験体)における抗原特異的免疫反応の増強は、抗原の活性化時又は活性化後に多種多様な方法を用いて達成可能である。最適な方法は、免疫反応の増強が望まれる抗原のタイプに主に依存するであろう。また、利用可能な種々の方法は、以下で考察される。どんな方法を選択するにせよ、ヒト化抗OX40抗体又はその抗原結合断片は、抗原によるT細胞のプライミング時又はその直後に被験体のT細胞に提示されるように被験体例えばヒト患者に投与可能である。
ある特定の態様では、本開示は、ヒト化抗OX40抗体がT細胞、例えば、活性化CD4+T細胞及び/又は活性化CD8+T細胞の表面上のOX40に特異的に結合可能な条件下で、活性化T細胞、例えば、活性化CD4+T細胞及び/又は活性化CD8+T細胞をヒト化抗OX40抗体又はその抗原結合断片に接触させる工程を含む、活性化T細胞、例えば、活性化CD4+T細胞及び/又は活性化CD8+T細胞の生存又は増殖の促進方法を提供する。ある特定の態様では、接触はin vitroである。ある特定の態様では、接触はin vivoであり、例えば、治療が必要とされる被験体への有効用量のヒト化抗OX40抗体の投与を介する。ある特定の態様では、接触はT細胞活性化例えば抗原活性化と同時に行うことが可能であり、ある特定の態様では、接触はT細胞活性化後に行うことが可能である。
さらなる態様では、本開示は、ヒト化抗OX40抗体が活性化T細胞、例えば、活性化CD4+T細胞及び/又は活性化CD8+T細胞の表面上のOX40に特異的に結合可能な条件下で、活性化T細胞、例えば、活性化CD4+T細胞及び/又は活性化CD8+T細胞を本明細書に提供されるヒト化抗OX40抗体又はその抗原結合断片に接触させる工程を含む、活性化T細胞、例えば、活性化CD4+T細胞及び/又は活性化CD8+T細胞からのサイトカイン放出の誘導方法を提供する。ある特定の態様では、接触はin vitroである。ある特定の態様では、接触はin vivoであり、例えば、治療が必要とされる被験体への有効用量のヒト化抗OX40抗体の投与を介する。ある特定の態様では、接触はT細胞活性化例えば抗原活性化と同時に行うことが可能であり、ある特定の態様では、接触はT細胞活性化後に行うことが可能である。ある特定の態様では、サイトカインは、IFNγ、TNFα、IL−5、IL−10、IL−2、IL−4、IL−13、IL−8、IL−12p70、IL−1β、又はそれらの任意の組合せであり得る。ある特定の態様では、サイトカインは、IFNγ、TNFα、IL−5、IL−10、IL−13、又はそれらの任意の組合せである。
ある特定の態様では、活性化T細胞、例えば、活性化CD4+T細胞及び/又は活性化CD8+T細胞は、ヒトT細胞、カニクイザルT細胞、アカゲザルT細胞、又はそれらの組合せである。
本開示は、ヒト化抗OX40抗体がT細胞の表面上のOX40に特異的に結合可能な条件下でT細胞を本明細書に提供されるヒト化抗OX40抗体に接触させる工程を含む、T細胞活性化の促進方法をさらに提供する。ある特定の態様では、接触は抗原例えば腫瘍抗原の存在下で行われる。ある特定の態様では、この方法は、ヒト化抗OX40抗体のFcドメインと、FcγRを発現する細胞、例えば、B細胞、単球、マクロファージ、骨髄樹状細胞若しくは形質細胞様樹状細胞、濾胞樹状細胞、ランゲルハンス細胞、内皮細胞、NK細胞、活性化T細胞、好中球、好酸球、血小板、マスト細胞、一次ヒト腫瘍若しくは腫瘍流入領域若しくは非流入領域リンパ節に由来するCD45+細胞、他の二次若しくは三次リンパ様構造に由来するCD45+細胞、又はそれらの組合せと、の相互作用をさらに含む。ある特定の態様では、T細胞活性化はNFκBシグナル伝達経路の刺激を介して測定可能である。ある特定の態様では、接触はin vitroである。ある特定の態様では、接触はin vivoであり、例えば、治療が必要とされる被験体への有効用量のヒト化抗OX40抗体の投与を介する。
本開示は、有効量のヒト化抗OX40抗体若しくはその抗原結合断片又はヒト化抗OX40抗体を含む組成物若しくは製剤を治療が必要とされる被験体に投与する工程を含む、被験体における癌の治療方法をさらに提供する。ある特定の態様では、癌は固形腫瘍である。この方法によれば、ヒト化抗OX40抗体又は組成物の投与により腫瘍成長の阻害、腫瘍縮小の促進、又はその両方が可能である。ある特定の態様では、腫瘍成長阻害はT細胞の存在下で達成される。
「癌」、「腫瘍」、「癌性」、及び「悪性」という用語は、典型的には無制御の細胞成長により特徴付けられる哺乳動物における生理学的状態を意味するか又は記述する。癌の例としては、限定されるものではないが、腺癌をはじめとする癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、黒色腫、肉腫、及び白血病が挙げられる。かかる癌のより特定の例としては、扁平上皮細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、胃腸癌、ホジキンリンパ腫及び非ホジキンリンパ腫、膵癌、膠芽細胞腫、神経膠腫、頸癌、卵巣癌、肝癌腫や肝細胞腫などの肝癌、膀胱癌、乳癌(ホルモン媒介乳癌など、例えば、Innes et al.(2006)Br.J.Cancer 94:1057−1065を参照のこと)、結腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌、骨髄腫(例えば多発性骨髄腫)、唾液腺癌、腎細胞癌やウィルムス腫瘍などの腎癌、基底細胞癌、黒色腫、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、精巣癌、食道癌、種々のタイプの頭頸部癌、限定されるものではないが、扁平上皮細胞癌など、並びに粘液起源の癌、例えば、卵巣粘液癌、胆管癌(肝臓)、腎乳頭状癌などが挙げられる。
本開示は、有効量のヒト化抗OX40抗体若しくはその抗原結合断片、ヒト化抗OX40抗体を含む組成物若しくは製剤、又は本明細書に記載のポリヌクレオチド、ベクター、若しくは宿主細胞を被験体に投与する工程を含む、必要とされる被験体における癌の防止方法又は治療方法をさらに提供する。
癌治療のための組成物の有効用量は、投与手段、標的部位、患者の生理学的状態、患者がヒトであるか又は動物であるか、投与される他の医薬、及び治療が予防的であるか又は治療的であるかをはじめとする多種多様な因子に依存して異なる。通常、患者はヒトであるが、トランスジェニック哺乳動物をはじめとする非ヒト哺乳動物も治療可能である。治療投与量は、安全性及び有効性を最適化するように当業者に公知のルーチン法を用いて設定可能である。
本開示の組成物は、任意の好適な方法により、例えば、非経口、脳室内、経口、吸入スプレー、局所、経直腸、経鼻、頬腔内、経腟、又は植込みリザーバーにより投与可能である。本明細書で用いられる「非経口」という用語は、皮下、静脈内、筋肉内、関節内、滑液嚢内、胸骨内、脊髄内、肝臓内、病変内、及び頭蓋内への注射又は注入の技術を含む。
本開示は、治療有効量のヒト化抗OX40抗体若しくはその抗原結合断片又はヒト化抗OX40抗体を含む組成物若しくは製剤を治療が必要とされる被験体に投与する工程を含む、被験体における免疫反応の増強方法をさらに提供する。
治療される被験体は、治療が必要とされる任意の動物例えば哺乳動物であり得るとともに、ある特定の態様では、被験体はヒト被験体である。
最も単純な形態では、被験体に投与される調製物は、本明細書の他の箇所に記載の医薬賦形剤、担体、又は希釈剤と組合せ可能な従来の剤形で投与されるヒト化抗OX40抗体又はその抗原結合断片である。
ヒト化抗OX40抗体又はその抗原結合断片は、本明細書の他の箇所に記載の任意の好適な方法により、例えば、IV注入により投与可能である。ある特定の態様では、ヒト化抗OX40抗体又はその抗原結合断片は、腫瘍中又は腫瘍細胞の近傍に導入可能である。
限定されるものではないが、乳癌、肺癌、膵癌、卵巣癌、腎癌、結腸癌、及び膀胱癌、さらには黒色腫、肉腫、及びリンパ腫を含めてすべてのタイプの腫瘍が、この方法による治療に潜在的に適合可能である。
抗原によるプライミング時又はその直後に活性化T細胞、例えば、活性化CD4+T細胞及び/又は活性化CD8+T細胞上のOX40レセプターのエンゲージメントを行うと、抗原に対する活性化T細胞、例えば、活性化CD4+T細胞及び/又は活性化CD8+T細胞の反応が増加する。本開示との関連では、「エンゲージメント」という用語は、OX40レセプターへの結合及びOX40レセプターにより媒介される少なくとも1つの活性の刺激を意味する。例えば、抗原特異的活性化T細胞、例えば、活性化CD4+T細胞及び/又は活性化CD8+T細胞上のOX40レセプターのエンゲージメントを行うと、抗原単独に対する反応と比較してT細胞増殖が増加し且つサイトカイン産生が増加する。抗原に対する反応の亢進は、OX40レセプターエンゲージメントの不在下よりも実質的に長時間にわたり維持可能である。従って、OX40レセプターを介する刺激を行うと、抗原例えば腫瘍抗原のT細胞認識がブーストされて抗原特異的免疫反応が増強される。
OX40アゴニストは、抗原によるT細胞のプライミング時又はその直後に被験体に投与した場合、被験体例えばヒト被験体における抗原特異的免疫反応を増強可能である。OX40アゴニストは、OX40リガンド(「OX40L」)、例えば、可溶性OX40L融合タンパク質及び抗OX40抗体又はその断片を含む。具体例は、OX40に特異的に結合することによりシグナル伝達を惹起するヒト化抗体である。本開示により一群のヒト化抗OX40モノクローナル抗体が提供される。また、かかる抗体をコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸も記載されている。本開示はまた、ヒト化抗OX40モノクローナル抗体を用いて被験体において抗原特異的免疫反応を増強する方法も提供する。
OX40エピトープ
抗体の抗原結合ドメインと特異的に相互作用する標的分子例えばOX40ポリペプチドの部分は、「エピトープ」又は「抗原決定基」である。標的分子例えばポリペプチドは、単一のエピトープであり得るが、典型的には少なくとも2つのエピトープを含み、標的分子のサイズ、コンフォメーション、及びタイプに依存して任意の数のエピトープを含み得る。
抗体の抗原結合ドメインと特異的に相互作用する標的分子例えばOX40ポリペプチドの部分は、「エピトープ」又は「抗原決定基」である。標的分子例えばポリペプチドは、単一のエピトープであり得るが、典型的には少なくとも2つのエピトープを含み、標的分子のサイズ、コンフォメーション、及びタイプに依存して任意の数のエピトープを含み得る。
抗体により結合可能である標的ポリペプチド上のエピトープの最小サイズは、約4〜5アミノ酸であると考えられる。ペプチド又はポリペプチドのエピトープは、少なくとも7、少なくとも9、少なくとも10、若しくは少なくとも約15アミノ酸以上を含有可能である。抗体は三次形態のポリペプチド抗原を認識可能であるので、エピトープを構成するアミノ酸は隣接している必要はない。本明細書に提供されるOX40例えばヒトOX40のエピトープは、OX40例えばヒトOX40の隣接又は非隣接アミノ酸を少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも25、又は約10〜約30含み得る。ある特定の態様では、本明細書に提供されるOX40例えばヒトOX40のエピトープは、100アミノ酸以下、75アミノ酸以下、50アミノ酸以下、40アミノ酸以下、35アミノ酸以下、30アミノ酸以下、25アミノ酸以下、20アミノ酸以下、又は15アミノ酸以下のペプチドからなり、OX40例えばヒトOX40の隣接又は非隣接アミノ酸を少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも25、又は約10〜約30含み得る。一方、本明細書に提供されるOX40例えばヒトOX40のエピトープは、OX40例えばヒトOX40の隣接又は非隣接アミノ酸を4以下、5以下、6以下、7以下、8以下、9以下、10以下、15以下、20以下、25以下、又は約10〜約30含み得る。
ある特定の態様では、本明細書に提供される抗OX40抗体又はその断片は、OX40の第3のシステインリッチドメイン(CRD3)内、例えば、ヒトOX40のアミノ酸108〜146(配列番号91)内に含まれる、OX40、例えば、ヒトOX40、アカゲザルOX40、若しくはカニクイザルOX40のエピトープに結合するか、又は配列番号91のアミノ酸108〜146に対して少なくとも17%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、若しくは少なくとも100%同一であるペプチドに結合する。OX40のCRD3「内に含まれる」とは、エピトープが、CRD3領域、例えば、配列番号91のアミノ酸108〜146からなるOX40の領域の隣接又は非隣接アミノ酸を4以上、5以上、6以上、7以上、8以上、9以上、10以上、15以上、若しくは30以上含むか、又は配列番号91のアミノ酸108〜146に対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、若しくは少なくとも100%同一であるペプチドを含むことを意味する。
ある特定の態様では、本明細書に提供される抗体に結合するOX40 CRD3ペプチドは、配列番号91のアミノ酸116に対応する位置にロイシン、及び配列番号91のアミノ酸126に対応する位置にアラニンを保持する。例えば、本明細書に提供されるある特定の抗OX40抗体又はその断片は、ヒトOX40に結合するが、マウス又はラットOX40に結合しない。マウスOX40のCRD3領域は、配列番号92の約アミノ酸104〜約アミノ酸144に延在する。マウスOX40配列番号92のアミノ酸Q113は、ヒトOX40配列番号91のアミノ酸L116に対応し、マウスOX40配列番号92のアミノ酸V124は、ヒトOX40配列番号91のアミノ酸A126に対応する。実施例10に示されるように、本明細書に提供されるOX40抗体例えばOX40mAb24は、Q113L突然変異及びV124Aを除いて配列番号92を含むマウスOX40の変異体に結合可能である。
ある特定の態様では、本明細書に提供されるOX40抗体例えばOX40mAb24に特異的に結合するエピトープからなるか又はそれを含むペプチドである単離ペプチドが提供される。ある特定の態様では、ペプチドは、100アミノ酸以下、75アミノ酸以下、50アミノ酸以下、40アミノ酸以下、35アミノ酸以下、30アミノ酸以下、25アミノ酸以下、20アミノ酸以下、又は15アミノ酸以下からなり、OX40のCRD3の隣接又は非隣接アミノ酸を少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも25、又は約10〜約30含み、例えば、配列番号91のアミノ酸108〜146に対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも100%同一であるOX40領域を含む。ある特定の態様では、ペプチドは、配列番号91のアミノ酸116に対応する位置にロイシン及び配列番号91のアミノ酸126に対応する位置にアラニンを保持する。
かかる単離ペプチドは、例えば、OX40に特異的に結合する結合分子に関してライブラリーをスクリーニングするために、又は被験体動物において抗OX40抗体を産生する免疫原として、使用可能である。
本開示では、とくに指定がない限り、当該技術の範囲内にある細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組換えDNA、及び免疫学の従来技術を利用する。かかる技術は、文献に十分に説明されている。例えば、Sambrook et al.,ed.(1989)Molecular Cloning A Laboratory Manual(2nd ed.;Cold Spring Harbor Laboratory Press);Sambrook et al.,ed.(1992)Molecular Cloning:A Laboratory Manual,(Cold Springs Harbor Laboratory,NY);D.N.Glover ed.,(1985)DNA Cloning,Volumes I and II;Gait,ed.(1984)Oligonucleotide Synthesis;Mullis et al.米国特許第4,683,195号明細書;Hames and Higgins,eds.(1984)Nucleic Acid Hybridization;Hames and Higgins,eds.(1984)Transcription And Translation;Freshney(1987)Culture Of Animal Cells(Alan R.Liss,Inc.);Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press)(1986);Perbal(1984)A Practical Guide To Molecular Cloning;専門書、Methods In Enzymology(Academic Press,Inc.,N.Y.);Miller and Calos eds.(1987)Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells,(Cold Spring Harbor Laboratory);Wu et al.,eds.,Methods In Enzymology,Vols.154 and 155;Mayer and Walker,eds.(1987)Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology(Academic Press,London);Weir and Blackwell,eds.,(1986)Handbook Of Experimental Immunology,Volumes I−IV;Manipulating the Mouse Embryo,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,(1986);及びAusubel et al.(1989)Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley and Sons,Baltimore,Md.)を参照のこと。
抗体工学の一般的原理は、Borrebaeck,ed.(1995)Antibody Engineering(2nd ed.;Oxford Univ.Press)に記載されている。タンパク質工学の一般的原理は、Rickwood et al.,eds.(1995)Protein Engineering,A Practical Approach(IRL Press at Oxford Univ.Press,Oxford,Eng.)に記載されている。抗体及び抗体−ハプテン結合の一般的原理は、Nisonoff(1984)Molecular Immunology(2nd ed.;Sinauer Associates,Sunderland,Mass.);及びSteward(1984)Antibodies,Their Structure and Function(Chapman and Hall,New York,N.Y.)に記載されている。そのほかに、とくに記載されていない当該技術分野で公知の免疫学の標準的方法は、一般に、Current Protocols in Immunology,John Wiley & Sons,New York;Stites et al.,eds.(1994)Basic and Clinical Immunology(8th ed;Appleton & Lange,Norwalk,Conn.)及びMishell and Shiigi(eds)(1980)Selected Methods in Cellular Immunology(W.H.Freeman and Co.,NY)に従う。
免疫学の一般的原理が記載されている標準的参照文献としては、Current Protocols in Immunology,John Wiley & Sons,New York;Klein(1982)J.,Immunology:The Science of Self−Nonself Discrimination(John Wiley & Sons,NY);Kennett et al.,eds.(1980)Monoclonal Antibodies,Hybridoma:A New Dimension in Biological Analyses(Plenum Press,NY);Campbell(1984)“Monoclonal Antibody Technology”in Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology,ed.Burden et al.,(Elsevier,Amsterdam);Goldsby et al.,eds.(2000)Kuby Immunology(4th ed.;H.Freemand & Co.);Roitt et al.(2001)Immunology(6th ed.;London:Mosby);Abbas et al.(2005)Cellular and Molecular Immunology(5th ed.;Elsevier Health Sciences Division);Kontermann and Dubel(2001)Antibody Engineering(Springer Verlag);Sambrook and Russell(2001)Molecular Cloning:A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Press);Lewin(2003)Genes VIII(Prentice Hall 2003);Harlow and Lane(1988)Antibodies:A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Press);Dieffenbach and Dveksler(2003)PCR Primer(Cold Spring Harbor Press)が挙げられる。
以上で引用した参考文献はすべて、さらには本明細書で引用した参照文献はすべて、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
例示を目的として以下の実施例を提供するが、これらに限定されるものではない。
略号及び用語の定義を表2に列挙する。
実施例1:抗ヒトOX40ネズミmAb9B12のヒト化
ネズミmAb9B12のCDRを選択されたヒト生殖系列フレームワーク上にグラフトすることによりヒト化した。ネズミmAb9B12の重鎖可変領域(VH)及び軽鎖可変領域(VL)の配列を公共NCBIデータベースで入手可能なヒト抗体生殖系列配列と比較した。最も高い配列相同性に基づいてヒトアクセプターフレームワーク(FR)を特定した。最適アクセプターフレームワークを選択する際、結合に影響を及ぼす可能性があるマッチ残基(バーニアゾーン残基、カノニカルクラス残基、及びVH/VLインターフェース残基)や免疫原性の可能性(低い生殖系列頻度)などのいくつかの基準を考慮した。それぞれ個別のフレームワーク領域に対して最も相同なヒト免疫グロブリン生殖系列セグメントを選択することにより、VH及びVLの最適ハイブリッドヒトアクセプターFR配列を独立して設計した。3つの異なる生殖系列アクセプター配列を組み合わせてヒト化VHフレームワークバックボーンを形成し、一方、VLについては2つの異なる生殖系列アクセプター配列を選択した。VH鎖(9B12VH−hu)に対して選択された完全ヒト生殖系列アクセプターテンプレートは、IGVH4−34*09(FR1)とVH4−39(FR2)とVH6−1(FR3)とJH4(FR4)との組合せであった。VL(9B12VL−hu1)は、O18(FR1)とO18(FR2)とL23(FR3)とJK1(FR4)との組合せであった。ネズミ配列とヒトテンプレートアクセプター配列との間のフレームワーク相同性は、VHでは77%及びVLでは約72%であった。
ネズミmAb9B12のCDRを選択されたヒト生殖系列フレームワーク上にグラフトすることによりヒト化した。ネズミmAb9B12の重鎖可変領域(VH)及び軽鎖可変領域(VL)の配列を公共NCBIデータベースで入手可能なヒト抗体生殖系列配列と比較した。最も高い配列相同性に基づいてヒトアクセプターフレームワーク(FR)を特定した。最適アクセプターフレームワークを選択する際、結合に影響を及ぼす可能性があるマッチ残基(バーニアゾーン残基、カノニカルクラス残基、及びVH/VLインターフェース残基)や免疫原性の可能性(低い生殖系列頻度)などのいくつかの基準を考慮した。それぞれ個別のフレームワーク領域に対して最も相同なヒト免疫グロブリン生殖系列セグメントを選択することにより、VH及びVLの最適ハイブリッドヒトアクセプターFR配列を独立して設計した。3つの異なる生殖系列アクセプター配列を組み合わせてヒト化VHフレームワークバックボーンを形成し、一方、VLについては2つの異なる生殖系列アクセプター配列を選択した。VH鎖(9B12VH−hu)に対して選択された完全ヒト生殖系列アクセプターテンプレートは、IGVH4−34*09(FR1)とVH4−39(FR2)とVH6−1(FR3)とJH4(FR4)との組合せであった。VL(9B12VL−hu1)は、O18(FR1)とO18(FR2)とL23(FR3)とJK1(FR4)との組合せであった。ネズミ配列とヒトテンプレートアクセプター配列との間のフレームワーク相同性は、VHでは77%及びVLでは約72%であった。
親CDRの機能的コンフォメーションに影響を及ぼし得るか又はそれを維持し得るとともにヒト生殖系列配列にマッチしないネズミフレームワーク残基を特定してヒトアクセプターFR中に選択的に再導することにより、9B12の結合親和性及び機能を最もよく保存するようにした。この場合、VH鎖のマウスFR残基27D、39K、47Y、48M、71R、78Y、及び44V並びにVL鎖の91F及び68Rをヒトテンプレートで復帰突然変異させた。ヒト化抗体を生成するために、Kabatにより定義されたCDR残基をVH及びVLの両方の設計されたアクセプターフレームワーク中に融合した。2つのヒト化VH遺伝子(9B12VH−hu及び9B12VH−hu39K71R)並びに2つのVL遺伝子(9B12VL−hu1及び9B12VL−hu2)をGeneART(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA)により合成し、次いで、インハウスpOE IgG1発現ベクター中にクローニングした。
一群のヒト化変異体を作製してT細胞ベースの結合及び増殖アッセイで特徴付けた。重鎖可変領域にマウスFR残基に復帰されたいくつかのフレームワークアミノ酸を含有するヒト化変異体は、9B12と同程度の親和性及び類似の効力(T細胞増殖)で活性化CD4+T細胞上のOX40に結合した。すべてのヒト化VH変異体とペアをなす可変軽鎖は、完全ヒト化フレームワークをコードする。免疫原性のリスクを低減するために、影響しないマウス残基を対応するヒト残基で置き換えることにより、VHヒトFR中のマウス残基の数をさらに低減した。配列ライアビリティーの可能性を除去するために、VH−CDR2のNG脱アミド化部位並びにVH−CDR3のRYDインテグリン結合部位及びDG異性化部位を独立して又は組み合わせて積極的に除去した。ヒトIgG1のFcエフェクター機能により媒介されるADCCを回避するために、ヒト化リードmAbに対してIgG4P及びIgG1TMのFc変異体を作製した。得られたIgG4P及びIgG1TMの変異体は、OX40に対してIgG1変異体と同一の結合活性を呈したが、ネズミmAb9B12に最も類似したADCC活性を有意に低減した。要約すると、ヒト化変異体は、親マウスmAb9B12と同程度の細胞結合親和性及びin vitro効力を呈した。すべてヒト化VLとペアをなすヒト化VH変異体間のアミノ酸差を図1にまとめる。
アカゲザルでin vivo特徴付けを行うためにリバースキメラを工学操作した。簡潔に述べると、ヒト化mAb24のVH及びVLをネズミ9B12の定常重鎖及び定常軽鎖にグラフトした。in vitro特徴付けを行ったところ、リバースキメラのFab部分はmAb24と同程度にヒトOX40に結合することが実証された。
実施例2:活性化されたヒト、非ヒト霊長動物、ラット、及びマウスのT細胞の表面上に発現される天然OX40へのOX40mAb24の結合親和性及びレセプター占有率
2.1 材料
この実施例で使用した材料を表2−1に列挙する。
2.1 材料
この実施例で使用した材料を表2−1に列挙する。
この実施例では、ヒト、非ヒト霊長動物、ラット、及びマウスのT細胞の細胞表面上に発現されるOX40に結合するOX40mAb24の見掛けの親和性を測定するために、細胞ベースの平衡結合アッセイを実施した。そのほかに、平衡結合アッセイを利用して、活性化ヒトCD4+T細胞上で20%、50%、又は90%のヒトOX40レセプター占有率を達成するOX40mAb24の濃度を決定した。
OX40mAb24及び9B12の結合を比較するために、CD4+T細胞の表面上に発現されるヒト及び非ヒト霊長動物のOX40へのOX40mAb24の由来源のネズミ抗ヒトOX40モノクローナル抗体9B12の結合について、20%、50%、又は90%レセプター占有率を達成するのに必要なOX40mAb24濃度も決定した。
2.2 アッセイ
2.2.1 一次ヒトCD4+T細胞及びOX40発現ジャーカットT細胞へのOX40mAb24の結合
ヒトOX40に結合するOX40mAb24の見掛けの平衡結合定数(Kd)及び平衡時に細胞表面ヒトOX40レセプターの20%、50%、又は90%に結合するのに必要な濃度を、OX40発現活性化一次ヒトCD4+T細胞又はヒトOX40過剰発現ジャーカットT細胞へのOX40mAb24の結合曲線から計算した。OX40mAb24値との比較のために、類似の実験を同時に行ってこれらの細胞への9B12の結合を評価した。
2.2.1 一次ヒトCD4+T細胞及びOX40発現ジャーカットT細胞へのOX40mAb24の結合
ヒトOX40に結合するOX40mAb24の見掛けの平衡結合定数(Kd)及び平衡時に細胞表面ヒトOX40レセプターの20%、50%、又は90%に結合するのに必要な濃度を、OX40発現活性化一次ヒトCD4+T細胞又はヒトOX40過剰発現ジャーカットT細胞へのOX40mAb24の結合曲線から計算した。OX40mAb24値との比較のために、類似の実験を同時に行ってこれらの細胞への9B12の結合を評価した。
最初に、RosetteSep CD4+T細胞富化キット(Stem Cell Technologies,Vancouver,BC)及び改良された製造業者のプロトコルを用いて、MedImmune Blood Donor Programにより、健常ドナーから得られたヘパリンナトリウム抗凝固処理全血から一次ヒトCD4+T細胞を単離した。
T細胞を活性化してOX40をアップレギュレートするために、2μg/mLのPHA−L及び20IU/mLのrhIL−2と共に、一次ヒトCD4+T細胞を48時間培養した。続いて、OX40mAb24結合実験で>95%生存可能な活性化T細胞を使用した。ドナーはすべて、ユニークな個体である。すなわち、同一のドナーに由来するCD4+T細胞を用いた繰返し結合実験は行わなかった。
活性化を必要とすることなくヒトOX40過剰発現ジャーカットNFκB−ルシフェラーゼクローン64細胞を結合実験前に完全RPMI+10%FBS中で培養した。
OX40mAb24(10μg/mL)又は9B12(10μg/mL)を17ポイント2倍希釈系列で希釈した。OX40mAb24を100,000細胞(活性化一次CD4+T細胞又はヒトOX40過剰発現ジャーカットNFkB−ルシフェラーゼクローン64細胞)/ウェルで添加して4℃で1時間インキュベートした。バックグラウンド結合を減算するために、二次抗体のみの存在下で細胞をインキュベートした。OX40mAb24又は9B12のOX40結合の特異性を示すために、OX40過剰発現ジャーカットT細胞と共に、それぞれ、対照R347ヒトIgG1モノクローナル抗体及びマウスIgG1アイソタイプクローンMOPC−21を実験に使用した。インキュベーション後、細胞を200μLの冷(4℃)FACS緩衝液で3回洗浄し、10μg/mLのAlexaFluor(登録商標)647標識ヤギ抗ヒトIgG二次抗体(OX40mAb24への結合のために)又は10μg/mLのAlexaFluor(登録商標)488標識ヤギ抗マウスIgG二次抗体(9B12への結合のために)と5μg/mLのヨウ化プロピジウム(PI)とを含有する100μLのFACS緩衝液(PBS+2%の熱不活性化新生仔ウシ血清)と共にインキュベートした。二次抗体インキュベーション後、細胞を洗浄し、以下に記載されるようにBD LSRIIフローサイトメーターを用いてフローサイトメトリー分析を行うために100μLのFACS緩衝液中に懸濁させた。
2.2.2 マウスCD4+T細胞へのOX40mAb24の結合
活性化一次CD4+T細胞上に発現されるマウスOX40への結合に関してOX40mAb24を調べた。OX40mAb24と比較するために、類似の実験を同時に行ってこれらの細胞への9B12の結合を評価した。以下のプロトコルに従って、採取された正常Balb/Cマウス脾臓からマウスCD4+T細胞を単離した。
活性化一次CD4+T細胞上に発現されるマウスOX40への結合に関してOX40mAb24を調べた。OX40mAb24と比較するために、類似の実験を同時に行ってこれらの細胞への9B12の結合を評価した。以下のプロトコルに従って、採取された正常Balb/Cマウス脾臓からマウスCD4+T細胞を単離した。
脾臓を70μMナイロンフィルターに押し付けて潰して脾細胞を放出させ、1mLの完全培地(RPMI−1640+10%FBS、1%抗生物質/抗真菌溶液、及び55μM βメルカプトエタノール[BME])でフィルターを濯いだ。脾細胞をペレット化し、上清を廃棄した。ペレットを5mLのIX赤血球(RBC)溶解緩衝液で処理してインキュベートすることによりRBCを溶解させた。インキュベーション時間の終了時に完全培地の添加によりオスモル濃度を回復した。
細胞をペレット化し、Miltenyi MACS緩衝液(PBS pH7.2+0.5%ウシ血清アルブミン(BSA)+2mMエチレンジアミン四酢酸[EDTA])で洗浄し、そして上清を廃棄した。ペレットを冷MACS緩衝液中に懸濁させ、そしてViCellカウンターでカウントして細胞数及び生存能を決定した。
製造業者の取扱い説明書に従ってMiltenyiプロセスキット(San Diego,CA)を用いてマウスCD4+T細胞の単離を行い、単離細胞を完全培地中に懸濁させた。
2μg/mLの各ハムスター抗マウスCD3及びハムスター抗マウスCD28抗体で被覆された96ウェルプレート中でマウスCD4+T細胞(150,000/ウェル、100μL完全培地中)を一晩培養し、そしてT細胞を活性化してOX40発現を誘導した。インキュベーションプレートから活性化CD4+T細胞を取り出して、結合アッセイのために100,000細胞を非組織培養物処理96ウェル丸底プレートの各ウェルに導入し、そしてFACS緩衝液を用いて1回洗浄した。10点データ曲線が得られるようにFACS緩衝液でそれぞれ3倍段階希釈された10μg/mLのOX40mAb24、9B12、及びラット抗マウスOX40クローンOX86(陽性対照)抗体を用いて、結合を行った。陰性対照では、3点データ曲線が得られるように10μg/mLのR347ヒトIgG1、MOPC−21マウスIgG1、又はRTK2071ラットIgG1を6倍希釈した。OX40mAb24又は抗体を含有するFACS緩衝液(50μL)をデュープリケートでCD4+T細胞に添加してインキュベートした。一次インキュベーション後、細胞を200μLの4℃のFACS緩衝液で洗浄し、10μg/mLのAlexaFluor(登録商標)488標識ヤギ抗ヒト二次抗体、10μg/mLのAlexaFluor(登録商標)488標識ヤギ抗マウス二次抗体、又はAlexaFluor(登録商標)488標識ヤギ抗ラット二次抗体と、5μg/mLのPIと、を含有する50μLのFACS緩衝液と共にインキュベートした。二次抗体インキュベーション後、細胞を4℃のFACS緩衝液(200μL/洗浄)で洗浄し、そして第2.3節に記載されるようにBD LSRIIフローサイトメーターを用いてフローサイトメトリー分析を行うために100μLのFACS緩衝液中に懸濁させた。
2.2.3 ラットCD4+T細胞へのOX40mAb24の結合
活性化一次CD4+T細胞上に発現されるラットOX40への結合に関してOX40mAb24を調べた。OX40mAb24との比較が行えるように、9B12を用いて類似の実験を同時に行った。製造業者の取扱い説明書に従ってR&D Systems Magellectキット(Minneapolis,MN)を用いてラットCD4+T細胞の単離を行ったこと以外は、マウス脾細胞の単離に関連して以上に説明したプロトコルに従って、新たに採取した正常スプラーグドーリーラット脾臓からラットCD4+細胞を単離した。
活性化一次CD4+T細胞上に発現されるラットOX40への結合に関してOX40mAb24を調べた。OX40mAb24との比較が行えるように、9B12を用いて類似の実験を同時に行った。製造業者の取扱い説明書に従ってR&D Systems Magellectキット(Minneapolis,MN)を用いてラットCD4+T細胞の単離を行ったこと以外は、マウス脾細胞の単離に関連して以上に説明したプロトコルに従って、新たに採取した正常スプラーグドーリーラット脾臓からラットCD4+細胞を単離した。
T細胞を活性化してOX40発現を誘導するために、1μg/mLのコンカナバリンA(ConA)及び500IU/mLのIL−2の入ったT75細胞培養フラスコ中でラットCD4+T細胞(1×106/mL完全培地)を一晩培養し、そして一晩インキュベートした。フラスコから活性化CD4+T細胞を取り出して、結合アッセイのために100,000細胞を非組織培養物処理96ウェル丸底プレートの各ウェルに導入し、そしてFACS緩衝液で洗浄した。10点データ曲線が得られるようにFACS緩衝液で3倍段階希釈された10μg/mLのOX40mAb24、9B12、又はマウス抗ラットCD134クローンOX40(陽性対照)抗体を用いて、結合を行った。陰性対照では、3点データ曲線が得られるように10μg/mLのR347ヒトIgG1又はマウスIgG1クローンMOPC−21を6倍段階希釈した。100μLのOX40mAb24対照タンパク質、9B12、又はクローンOX40抗体をデュープリケートでCD4+T細胞に添加してインキュベートした。一次インキュベーション後、細胞を200μL/洗浄の4℃のFACS緩衝液で洗浄し、10μg/mLのAlexaFluor(登録商標)488標識ヤギ及びヒト抗マウス二次抗体又はAlexaFluor(登録商標)488標識ヤギ抗マウス二次抗体と、5μg/mLのPIと、を含有する100μLのFACS緩衝液と共にインキュベートした。二次抗体インキュベーション後、第2.3節に記載されるように細胞を処理してフローサイトメトリーに供した。
2.2.4 カニクイザルCD4+T細胞へのOX40mAb24の結合
活性化一次CD4+T細胞上に発現されるカニクイザル(cyno)OX40への結合に関してOX40mAb24を調べた。OX40mAb24値との比較が行えるように、9B12を用いて類似の実験を同時に行った。以下のプロトコルに従ってWorld Wide Primates(Miami,FL)製の健常カニクイザルドナー(N=2)から得られたヘパリンナトリウム抗凝固処理全血からカニクイザルCD4+T細胞を単離した。
活性化一次CD4+T細胞上に発現されるカニクイザル(cyno)OX40への結合に関してOX40mAb24を調べた。OX40mAb24値との比較が行えるように、9B12を用いて類似の実験を同時に行った。以下のプロトコルに従ってWorld Wide Primates(Miami,FL)製の健常カニクイザルドナー(N=2)から得られたヘパリンナトリウム抗凝固処理全血からカニクイザルCD4+T細胞を単離した。
50mLのコニカル遠心チューブ中の30mLの60%Percoll上に全血を層状化した。血液を遠心分離し、末梢血単核細胞(PBMC)をインターフェースで捕集し、1200RPMで冷(4℃)Miltenyi MACS緩衝液により10分間洗浄した。上清を廃棄し、ペレットを5mLの1×RBC溶解緩衝液で処理し、そしてインキュベートした。インキュベーション時間の終了時に完全培地(10%のFBS及び1%の抗生物質/抗真菌剤を含むRPMI)をペレットに添加して溶解プロセスを停止した。
細胞をペレット化し、20mLの冷(4℃)Miltenyi MACS緩衝液で洗浄した。上清を廃棄し、細胞ペレットを冷(4℃)MACS緩衝液中に懸濁させ、そしてViCellカウンターでカウントして細胞数及び生存能を決定した。
製造業者の取扱い説明書に従ってMiltenyi非ヒト霊長動物キットを用いてカニクイザルCD4+T細胞の単離を行い、次いで、CD4+T細胞をViCellカウンターでカウントし、そして以上に記載の完全培地中に1×106/mLで懸濁させた。
2μg/mLのPHA−L及び20IU/mLのIL−2を含むT75細胞培養フラスコ中でカニクイザルCD4+T細胞(完全培地中1×106/mL)を48時間インキュベートすることにより、T細胞を活性化してOX40発現を誘導した。フラスコから活性化CD4+T細胞を取り出して、結合アッセイのために100,000細胞を非組織培養物処理96ウェル丸底プレートの各ウェルに導入し、そして200μLのFACS緩衝液で洗浄した。11点データ曲線が得られるようにFACS緩衝液で4倍段階希釈した10μg/mLのOX40mAb24若しくは9B12、又は3点データ曲線が得られるように6倍段階希釈したR347ヒトIgG1若しくはマウスIgG1クローンMOPC−21(陰性対照)の両方を用いて結合を行った。OX40mAb24、9B12、又は対照タンパク質をCD4+T細胞に添加してインキュベートした。一次インキュベーション後、細胞を200μL/洗浄の冷(4℃)FACS緩衝液で洗浄し、10μg/mLのAlexaFluor(登録商標)488標識ヤギ抗ヒト二次抗体又は10μg/mLのAlexaFluor(登録商標)488標識ヤギ抗マウス二次抗体と、5μg/mLのPIと、を含有する100μLのFACS緩衝液と共にインキュベートした。二次抗体インキュベーション後、第2.3節に記載されるように細胞を処理してフローサイトメトリーに供した。
2.2.5 アカゲザルCD4+T細胞へのOX40mAb24の結合
活性化一次CD4+T細胞上に発現されるアカゲザルOX40への結合に関してOX40mAb24を調べた。OX40mAb24値との比較が行えるように、9B12を用いて類似の実験を同時に行った。以下のプロトコルに従ってWorld Wide Primates(Miami,FL)製の健常アカゲザルドナー(N=2)から得られたヘパリンナトリウム抗凝固処理全血からアカゲザルCD4+T細胞を単離した。
活性化一次CD4+T細胞上に発現されるアカゲザルOX40への結合に関してOX40mAb24を調べた。OX40mAb24値との比較が行えるように、9B12を用いて類似の実験を同時に行った。以下のプロトコルに従ってWorld Wide Primates(Miami,FL)製の健常アカゲザルドナー(N=2)から得られたヘパリンナトリウム抗凝固処理全血からアカゲザルCD4+T細胞を単離した。
ヘパリン処理アカゲザル血液(20mL)をPBSで1:1希釈し、50mlのコニカル遠心チューブ中の15mlの95%LSM上に層状化した。血液を遠心分離し、PBMCをインターフェースで捕集し、そして30分間にわたり400×gで冷Miltenyi MACS緩衝液を用いて2回洗浄した。上清を廃棄し、ペレットを5mLのIX RBC溶解緩衝液で処理し、そしてインキュベートした。インキュベーション時間の終了時に完全培地(10%のFBS及び1%の抗生物質/抗真菌剤を含むRPMI)をペレットに添加して溶解プロセスを停止した。細胞をペレット化し、20mLの冷Miltenyi MACS緩衝液で洗浄した。上清を廃棄し、ペレットを冷MACS緩衝液中に懸濁させ、そしてViCellカウンターでカウントして細胞数及び生存能を決定した。製造業者の取扱い説明書に従ってMiltenyi非ヒト霊長動物キット(San Diego,CA)を用いてアカゲザルCD4+T細胞の単離を行った。
5μg/mLのCon−A及び1000IU/mLのIL−2を含むT75細胞培養フラスコ中でアカゲザルCD4+T細胞(完全培地中1×106/mL)を48時間培養することにより、T細胞を活性化してOX40発現を誘導した。10点(実験1)又は12点データ曲線(実験2)が得られるようにFACS緩衝液で3倍段階希釈した10μg/mLのOX40mAb24及び9B12を用いて、並びに2データ点(実験1)又は4データ点(実験2)が得られるように6倍希釈した10μg/mLのヒト及びマウスアイソタイプ対照を用いて、100,000活性化アカゲザルCD4+T細胞への結合を行った。AlexaFluor(登録商標)488標識ヤギ抗ヒト二次抗体及びAlexaFluor(登録商標)488標識ヤギ抗マウス二次結合は、カニクイザルCD4+T細胞に対して以上に記載した通りであり、フローサイトメトリーは、第2.3節に記載される通りである。
2.3 フローサイトメトリー
第2.1節に記載のアッセイのフローサイトメトリーは、LSRIIフローサイトメーター(Becton−Dickinson,San Jose,CA)を用いて行った。Flow Joサイトメトリー解析ソフトウェア(TreeStar,Ashland,OR)を用いて細胞へのOX40mAb24、9B12、及び対照タンパク質の結合を決定した。OX40発現細胞(非染色でPIも二次抗体も無し)、AlexaFluor(登録商標)488標識二次抗体試薬若しくはAlexaFluor(登録商標)647標識二次抗体試薬のみに結合される細胞、又は0.1%のサポニンで透過化されて10μg/mLのPIで処理された細胞を含有するウェルを単一染色補償対照として準備した。蛍光補償後、生存(PI陰性)細胞をゲート処理して二次抗体の平均蛍光強度(MFI)を決定した。
第2.1節に記載のアッセイのフローサイトメトリーは、LSRIIフローサイトメーター(Becton−Dickinson,San Jose,CA)を用いて行った。Flow Joサイトメトリー解析ソフトウェア(TreeStar,Ashland,OR)を用いて細胞へのOX40mAb24、9B12、及び対照タンパク質の結合を決定した。OX40発現細胞(非染色でPIも二次抗体も無し)、AlexaFluor(登録商標)488標識二次抗体試薬若しくはAlexaFluor(登録商標)647標識二次抗体試薬のみに結合される細胞、又は0.1%のサポニンで透過化されて10μg/mLのPIで処理された細胞を含有するウェルを単一染色補償対照として準備した。蛍光補償後、生存(PI陰性)細胞をゲート処理して二次抗体の平均蛍光強度(MFI)を決定した。
2.4 計算
2.4.1 見掛けの平衡解離定数(Kd)の決定
Windows用GraphPad Prismバージョン5.01(GraphPad Software,San Diego California USA,www.graphpad.com)を用いてタンパク質濃度(M)に対してOX40mAb24結合のMFIをプロットすることにより結合曲線を作成し、この曲線から見掛けのKdが決定した。ヒト、マウス、ラット、カニクイザル、又はアカゲザルのOX40へのOX40mAb24及び9B12の結合に対する見掛けのKdを決定するために、一部位(特異的)結合に対する非線形回帰(曲線当てはめ)式を利用した。
2.4.1 見掛けの平衡解離定数(Kd)の決定
Windows用GraphPad Prismバージョン5.01(GraphPad Software,San Diego California USA,www.graphpad.com)を用いてタンパク質濃度(M)に対してOX40mAb24結合のMFIをプロットすることにより結合曲線を作成し、この曲線から見掛けのKdが決定した。ヒト、マウス、ラット、カニクイザル、又はアカゲザルのOX40へのOX40mAb24及び9B12の結合に対する見掛けのKdを決定するために、一部位(特異的)結合に対する非線形回帰(曲線当てはめ)式を利用した。
2.4.2 20%、50%、及び90%レセプター占有率値の決定
レセプターに結合されるモノクローナル抗体(mAb)の量は、以下の結合関係式:
式1: レセプター(A)+mAb(B)←→レセプター−mAb複合体(AB)
から推定可能である。
レセプターに結合されるモノクローナル抗体(mAb)の量は、以下の結合関係式:
式1: レセプター(A)+mAb(B)←→レセプター−mAb複合体(AB)
から推定可能である。
それぞれの抗体の結合解離定数(Kd)は、式2:
により表される。式中、[A]及び[B]は、それぞれ、遊離のレセプター及び抗体の濃度を表す。最後に、抗体に結合されるすべてのレセプター分子の占有率、分率(F)は、式3:
により計算可能である。式2を作成して式3に代入すると、式4:
が得られる。式4を単純化すると、式5:
が得られる。従って、すべてのレセプター分子のうち平衡条件で抗体に結合されるものの分率は、遊離mAbの濃度及びそれぞれの抗体の解離定数Kdが既知であれば、計算可能である。Fとして表されるレセプター占有率に必要とされる抗体の濃度を計算する式を導くと、以下の式:
式6:
[B]=F*Kd/(1−F)
が得られる。式中、[B]は、mAbこの場合はOX40mAb24の濃度に等しい。この式(式6)を用いて20、50、及び90%レセプター占有率(F=0.20、0.50、又は0.90)に必要とされるOX40mAb24の濃度を細胞結合実験から計算し、この濃度から以上に記載の一部位(特異的)結合に対する非線形回帰(曲線当てはめ)式を用いてKd値を計算した。
式6:
[B]=F*Kd/(1−F)
が得られる。式中、[B]は、mAbこの場合はOX40mAb24の濃度に等しい。この式(式6)を用いて20、50、及び90%レセプター占有率(F=0.20、0.50、又は0.90)に必要とされるOX40mAb24の濃度を細胞結合実験から計算し、この濃度から以上に記載の一部位(特異的)結合に対する非線形回帰(曲線当てはめ)式を用いてKd値を計算した。
2.5 統計的方法
Graphpad Prismソフトウェアで95%の信頼水準の対応のないスチューデントの両側t検定及び異なる標準偏差を含むデータセットを補正するウェルチ補正を利用し、OX40発現ジャーカットT細胞と対比して活性化一次ヒトCD4T細胞上のOX40へのOX40mAb24結合で決定された見掛けのKd値間又は見掛けのレセプター占有率値間の統計学的有意差を決定した。記述統計量(すなわち、平均値及び平均値の標準誤差)は、まとめた図及び表に示される。
Graphpad Prismソフトウェアで95%の信頼水準の対応のないスチューデントの両側t検定及び異なる標準偏差を含むデータセットを補正するウェルチ補正を利用し、OX40発現ジャーカットT細胞と対比して活性化一次ヒトCD4T細胞上のOX40へのOX40mAb24結合で決定された見掛けのKd値間又は見掛けのレセプター占有率値間の統計学的有意差を決定した。記述統計量(すなわち、平均値及び平均値の標準誤差)は、まとめた図及び表に示される。
2.6 結果
2.6.1 一次ヒトCD4+T細胞へのOX40mAb24の結合
6つの独立したT細胞ドナーを用いたn=6の結合アッセイにおいて、OX40mAb24は活性化ヒトCD4+T細胞に結合し、見掛けのKdの平均は312pMであり、20%、50%、及び90%レセプター占有率値は、それぞれ、78.1、312、及び2810pMであった(図2A及び2B並びに表2−2)。
2.6.1 一次ヒトCD4+T細胞へのOX40mAb24の結合
6つの独立したT細胞ドナーを用いたn=6の結合アッセイにおいて、OX40mAb24は活性化ヒトCD4+T細胞に結合し、見掛けのKdの平均は312pMであり、20%、50%、及び90%レセプター占有率値は、それぞれ、78.1、312、及び2810pMであった(図2A及び2B並びに表2−2)。
それと比較して、9B12は活性化ヒトCD4+T細胞に結合し、平均Kdは669pMであり、20%、50%、及び90%レセプター占有率値は、それぞれ、167、669、及び6020pMであった(図2C及び2D並びに表2−2)。従って、9B12の見掛けのKd値とOX40mAb24の見掛けのKd値との比は2.1〜1であり、ネズミモノクローナル抗体及びヒト化モノクローナル抗体でヒトOX40への類似した結合親和性を反映している。
2.6.2 ヒトOX40を過剰発現するように工学操作されたジャーカットT細胞株へのOX40mAb24の結合
OX40mAb24はOX40発現ジャーカットT細胞に結合し、平均Kdは424pMであり、20%、50%、及び90%レセプター占有率値は、それぞれ、106、424、及び3820pMであった。図3A〜C及び表2−3。活性化一次ヒトCD4+T細胞及びOX40過剰発現ジャーカットT細胞により発現されるOX40へのOX40mAb24の見掛けの結合親和性又はレセプター占有率には統計学的有意差はなかった(p=0.59)。
OX40mAb24はOX40発現ジャーカットT細胞に結合し、平均Kdは424pMであり、20%、50%、及び90%レセプター占有率値は、それぞれ、106、424、及び3820pMであった。図3A〜C及び表2−3。活性化一次ヒトCD4+T細胞及びOX40過剰発現ジャーカットT細胞により発現されるOX40へのOX40mAb24の見掛けの結合親和性又はレセプター占有率には統計学的有意差はなかった(p=0.59)。
それと比較して、9B12はこれらの細胞に結合し、平均Kdは726pMであり、20%、50%、及び90%レセプター占有率値は、それぞれ、182、726、及び6540pMであった(図3D〜F及び表2−3)。従って、9B12の見掛けのKd値とOX40mAb24の見掛けのKd値との比は1.7〜1であり、OX40オン活性化ヒトCD4+T細胞への結合で計算された比に類似していた。
2.6.3 マウス又はラットCD4+T細胞へのOX40mAb24の結合
OX40mAb24及び9B12はいずれも、活性化マウスCD4+T細胞にも活性化ラットCD4+T細胞にも結合しなかった(データは示されていない)。市販の抗マウスOX40抗体及び抗ラットOX40抗体、それぞれ、クローンOX86及びOX40では、活性化マウスCD4+T細胞及び活性化ラットCD4+T細胞の陽性染色が観察された。9B12は活性化マウスCD4+T細胞にも活性化ラットCD4+T細胞にも結合しなかった(データは示されていない)。
OX40mAb24及び9B12はいずれも、活性化マウスCD4+T細胞にも活性化ラットCD4+T細胞にも結合しなかった(データは示されていない)。市販の抗マウスOX40抗体及び抗ラットOX40抗体、それぞれ、クローンOX86及びOX40では、活性化マウスCD4+T細胞及び活性化ラットCD4+T細胞の陽性染色が観察された。9B12は活性化マウスCD4+T細胞にも活性化ラットCD4+T細胞にも結合しなかった(データは示されていない)。
2.6.4 カニクイザル及びアカゲザルCD4+T細胞へのOX40mAb24の結合 OX40mAb24は、581pMの平均Kdで活性化カニクイザル細胞に結合した。カニクイザルKdは、ヒトKdの1.9倍であった(表2−4)。
9B12は、1088pMの平均Kdで活性化カニクイザルCD4+T細胞に結合した(表2−4)。この結果、9B12の見掛けのKd値とOX40mAb24の見掛けのKd値との比は1.9〜1になった。
OX40mAb24は、369pMの平均Kdで活性化アカゲザルCD4+T細胞に結合した(表2−4)。アカゲザルKdは、ヒトKdの1.2倍であった。
9B12は、713pMの平均Kdで活性化アカゲザルCD4+T細胞に結合した(表2−4)。この結果、9B12の見掛けのKd値とOX40mAb24の見掛けのKd値との比は示されていないが2.8〜1になる。
実施例3:ヒトOX40へのOX40mAb24の結合特異性
この実施例では、NGFR(TNFRSF16)、LTβR(TNFRSF3)、TNFR2(TNFRSF1β)、GITR(TNFRSF18)、CD137(TNFRSF9)、及びHVEM(TNFRSF14)を含む関連アミノ酸配列を有する他のヒトTNFRSFメンバーと対比してヒトOX40へのOX40mAb24の特異性を決定するために、フローサイトメトリーベースの細胞結合アッセイを行った。そのほかに、組換えヒトTNFRSFメンバーへのOX40mAb24の結合特異性をELISA方式で試験した。このメンバーには、以上に挙げたもののほか、DR6(TNFRSF21)、オステオプロテゲリン(OPG、TNFRSF11B)、RANK(TNFRSF11A)、FAS(TNFRSF6)、及びCD40(TNFRSF5)が含まれる。
この実施例では、NGFR(TNFRSF16)、LTβR(TNFRSF3)、TNFR2(TNFRSF1β)、GITR(TNFRSF18)、CD137(TNFRSF9)、及びHVEM(TNFRSF14)を含む関連アミノ酸配列を有する他のヒトTNFRSFメンバーと対比してヒトOX40へのOX40mAb24の特異性を決定するために、フローサイトメトリーベースの細胞結合アッセイを行った。そのほかに、組換えヒトTNFRSFメンバーへのOX40mAb24の結合特異性をELISA方式で試験した。このメンバーには、以上に挙げたもののほか、DR6(TNFRSF21)、オステオプロテゲリン(OPG、TNFRSF11B)、RANK(TNFRSF11A)、FAS(TNFRSF6)、及びCD40(TNFRSF5)が含まれる。
3.1 材料
この試験で使用した材料を表3−1に列挙する。
この試験で使用した材料を表3−1に列挙する。
3.2 方法
3.2.1 ヒトOX40に近い配列相同性を有するタンパク質の検索
ヒトOX40とのアミノ酸配列同一性を有するヒトタンパク質を同定するために、OX40のタンパク質配列(CCDS11/UniProt P43489)を用いて、タンパク質配列相同性のBasic Local Alignment Search Tool(BLASTP)検索を行った。19種のTNFRSFファミリーメンバー/アイソフォームを同定した。CCDS及びUniProtデータベース(www.uniprot.org)の両方を用いて、これらのタンパク質の全長配列を検証した。Clone Managerバージョン9ソフトウェアでblosum62スコア行列を用いてヒトOX40参照に対する集合アライメントを行うことにより、ヒトOX40とBLASTP検索で同定されたタンパク質との間のアミノ酸同一性のパーセントを決定した(表3−2)。
3.2.1 ヒトOX40に近い配列相同性を有するタンパク質の検索
ヒトOX40とのアミノ酸配列同一性を有するヒトタンパク質を同定するために、OX40のタンパク質配列(CCDS11/UniProt P43489)を用いて、タンパク質配列相同性のBasic Local Alignment Search Tool(BLASTP)検索を行った。19種のTNFRSFファミリーメンバー/アイソフォームを同定した。CCDS及びUniProtデータベース(www.uniprot.org)の両方を用いて、これらのタンパク質の全長配列を検証した。Clone Managerバージョン9ソフトウェアでblosum62スコア行列を用いてヒトOX40参照に対する集合アライメントを行うことにより、ヒトOX40とBLASTP検索で同定されたタンパク質との間のアミノ酸同一性のパーセントを決定した(表3−2)。
3.2.2 HEK293細胞で発現される他のTNFRSFメンバーと対比したOX40へのOX40mAb24の結合特異性
哺乳動物細胞にトランスフェクトしたときに個別のTNFRSFメンバーの発現を誘導可能なcDNA構築物をOrigene Technologies,Rockville,MDから入手した。一過性トランスフェクションに使用するために、Protein Sciences group,MedImmune,Gaithersburg,MDによりこれらのcDNA構築物の増幅及び精製を行った。TNFRSFメンバーをそれぞれ個別に発現させるために、Lipofectamine 2000に対する製造業者の推奨プロトコルに従って、TNFRSFメンバーの1つをコードする発現ベクターの0.5μgのDNAと組み合わせてLipofectamine 2000(Life Technologies,Carlsbad,CA)を用いて、HEK293細胞をトランスフェクトした。トランスフェクションの48時間後、トリプシン処理により組織培養プレートから細胞を取り出した。血清含有完全培地RPMI−1640+10%FBSの添加、それに続くに細胞のペレット化、及び完全培地による洗浄を行って、トリプシンを中和した。次いで、細胞を冷FACS緩衝液(PBS+2%FBS)中に懸濁させ、96ウェル非組織培養物処理プレートにプレーティングし、TNFRSFメンバー特異的mAb(表3−3)及びOX40mAb24を用いた結合試験に供した。
哺乳動物細胞にトランスフェクトしたときに個別のTNFRSFメンバーの発現を誘導可能なcDNA構築物をOrigene Technologies,Rockville,MDから入手した。一過性トランスフェクションに使用するために、Protein Sciences group,MedImmune,Gaithersburg,MDによりこれらのcDNA構築物の増幅及び精製を行った。TNFRSFメンバーをそれぞれ個別に発現させるために、Lipofectamine 2000に対する製造業者の推奨プロトコルに従って、TNFRSFメンバーの1つをコードする発現ベクターの0.5μgのDNAと組み合わせてLipofectamine 2000(Life Technologies,Carlsbad,CA)を用いて、HEK293細胞をトランスフェクトした。トランスフェクションの48時間後、トリプシン処理により組織培養プレートから細胞を取り出した。血清含有完全培地RPMI−1640+10%FBSの添加、それに続くに細胞のペレット化、及び完全培地による洗浄を行って、トリプシンを中和した。次いで、細胞を冷FACS緩衝液(PBS+2%FBS)中に懸濁させ、96ウェル非組織培養物処理プレートにプレーティングし、TNFRSFメンバー特異的mAb(表3−3)及びOX40mAb24を用いた結合試験に供した。
抗体又はOX40mAb24を結合させるために、HEK細胞をペレット化し、FACS緩衝液を除去し、そして2μg/mLのヨウ化プロピジウム(PI)と、製造業者により推奨された濃度のトランスフェクトTNFRSFメンバーに特異的な蛍光色素標識mAb又は1μg/mLの濃度のOX40mAb24と、を含有するFACS緩衝液中に細胞を懸濁させた。結合対照では、蛍光色素標識アイソタイプ対照抗体と共に細胞を個別にインキュベートした。4℃の暗所で抗体と共に細胞を1時間インキュベートした。その後、蛍光色素標識モノクローナル抗体と共にインキュベートされた細胞を冷FACS緩衝液で洗浄し、次いで、結合イベントを集め、そして第3.2.3節に記載されるように、LSRIIフローサイトメーター(BD Biosciences,San Jose,CA)及びFlowJoソフトウェアを用いてフローサイトメトリーにより解析した。OX40mAb24と共にインキュベートされた細胞を氷冷FACS緩衝液で洗浄し、次いで、25μg/mLのAlexa Fluor(登録商標)647ヤギ抗ヒトIgG(H+L)二次抗体を懸濁させ、そして4℃の暗所でさらに30分間インキュベートした。二次抗体結合対照では、OX40mAb24の不在下で、ただし、蛍光色素標識二次抗体のみの存在下で、細胞をインキュベートした。その後、細胞を洗浄し、冷FACS緩衝液中に懸濁させ、LSRIIフローサイトメーターによる解析に供した。
3.2.3 フローサイトメトリー解析
FlowJoソフトウェア(Ashland,OR)を用いてフローサイトメトリー標準(FCS)データを検査した。mAb結合を解析するために、最初に、細胞を生存(PI陰性)細胞に関してゲート処理し、次いで、イベントの全数に対してイベントの平均蛍光強度(MFI)をプロットして結合ヒストグラムを作成した。バックグラウンド(アイソタイプ対照又は二次抗体単独)に対するMFI倍率を決定できるように、各サンプルについてすべての生存細胞の幾何MFIを決定した。
FlowJoソフトウェア(Ashland,OR)を用いてフローサイトメトリー標準(FCS)データを検査した。mAb結合を解析するために、最初に、細胞を生存(PI陰性)細胞に関してゲート処理し、次いで、イベントの全数に対してイベントの平均蛍光強度(MFI)をプロットして結合ヒストグラムを作成した。バックグラウンド(アイソタイプ対照又は二次抗体単独)に対するMFI倍率を決定できるように、各サンプルについてすべての生存細胞の幾何MFIを決定した。
3.2.4 OX40mAb24結合特異性ELISA
ストックタンパク質をPBSで5μg/mLに希釈した後、8点で各組換えヒトTNFRSFタンパク質の二倍希釈系列を調製した。続いて、50μLの各抗原希釈液をデュープリケートでNunc96ウェルMaxiSorp平底プレートのウェルに導入し、4℃で一晩インキュベートしてタンパク質をプレートに吸着させた。その後、BioTek(登録商標)プレートウォッシャーによりプレートをPBSで3回洗浄して未結合タンパク質を除去した。抗OX40mAb29、9B12、及び対照抗体をPBSで10μg/mLの最終濃度に希釈して50μLのmAbを各ウェルに添加し、そして室温で1時間インキュベートしてmAbをプレート結合タンパク質に結合させた。その後、BioTek(登録商標)プレートウォッシャーを用いてウェルをPBS/0.1%Tween−20(体積/体積)で洗浄した。HRPコンジュゲートのヤギ抗ヒト二次抗体又はヤギ抗マウス二次抗体を10μg/mLで各ウェルに添加し、室温で1時間インキュベートした。PBS/0.1%Tween−20で3回洗浄した後、各ウェルに50μLのTMB基質を添加し、そして室温で5分間インキュベートして比色生成物を形成した。50μLの0.5モルH2SO4をウェルに添加することにより反応を停止させ、その直後、比色生成物を検出するためにEnvision Cプレートリーダーを用いて450nmでプレートを読み取った。Windows用ソフトウェアGraphPad Prismバージョン5.01で結果をグラフで示し、単一部位結合に対する非線形回帰分析を用いて結合曲線を作成した。
ストックタンパク質をPBSで5μg/mLに希釈した後、8点で各組換えヒトTNFRSFタンパク質の二倍希釈系列を調製した。続いて、50μLの各抗原希釈液をデュープリケートでNunc96ウェルMaxiSorp平底プレートのウェルに導入し、4℃で一晩インキュベートしてタンパク質をプレートに吸着させた。その後、BioTek(登録商標)プレートウォッシャーによりプレートをPBSで3回洗浄して未結合タンパク質を除去した。抗OX40mAb29、9B12、及び対照抗体をPBSで10μg/mLの最終濃度に希釈して50μLのmAbを各ウェルに添加し、そして室温で1時間インキュベートしてmAbをプレート結合タンパク質に結合させた。その後、BioTek(登録商標)プレートウォッシャーを用いてウェルをPBS/0.1%Tween−20(体積/体積)で洗浄した。HRPコンジュゲートのヤギ抗ヒト二次抗体又はヤギ抗マウス二次抗体を10μg/mLで各ウェルに添加し、室温で1時間インキュベートした。PBS/0.1%Tween−20で3回洗浄した後、各ウェルに50μLのTMB基質を添加し、そして室温で5分間インキュベートして比色生成物を形成した。50μLの0.5モルH2SO4をウェルに添加することにより反応を停止させ、その直後、比色生成物を検出するためにEnvision Cプレートリーダーを用いて450nmでプレートを読み取った。Windows用ソフトウェアGraphPad Prismバージョン5.01で結果をグラフで示し、単一部位結合に対する非線形回帰分析を用いて結合曲線を作成した。
3.3 結果
ヒトOX40に関するタンパク質配列相同性BLASTP検索により、全長OX40配列に対して15〜27%のアミノ酸配列同一性を共有する19種のヒトTNFRSFタンパク質又はアイソフォームを同定した。タンパク質及びその配列同一性パーセントを表3−2に列挙する。
ヒトOX40に関するタンパク質配列相同性BLASTP検索により、全長OX40配列に対して15〜27%のアミノ酸配列同一性を共有する19種のヒトTNFRSFタンパク質又はアイソフォームを同定した。タンパク質及びその配列同一性パーセントを表3−2に列挙する。
以上の第3.1.3節に記載のフローサイトメトリーにより、ヒトNGFR、LTβR、TNFR2、GITR、CD137、又はHVEMを発現する一過性トランスフェクトHEK293細胞へのOX40mAb24の結合を評価した。各ヒトTNFRSFタンパク質に特異的な市販の抗体を用いて、ヒトNGFR、LTβR、TNFR2、GITR、CD137、及びHVEMの細胞表面発現を確認し、各TNFRSFタンパク質に対するアイソタイプ対照抗体と比較してMFIの増加倍率を表3−3に示す。ヒトNGFR、LTβR、TNFR2、GITR、CD137、又はHVEMを発現するHEK293細胞へのOX40mAb24の結合は、上述の細胞への二次抗体単独の結合で見られたものを実質的に超えない(表3−3、図4A)。これとは対照的に、OX40を構成的に過剰発現するジャーカット細胞系へのOX40mAb24の結合は、平均MFIで蛍光色素標識二次抗体単独の結合の48倍であった(表3−3及び図4B)。
ELISA方式では、OX40mAb24のFabアームを含有するがIgG1 Fcドメインが3つのアミノ酸修飾を含有する抗体(mAb29)の結合は、OX40に特異的であり(図5A)、組換えヒトNGFR(TNFRSF16)、LTβR(TNFRSF3)、TNFR2(TNFRSF1β)、GITR(TNFRSF18)、CD137(TNFRSF9)、HVEM(TNFRSF14)、DR6(TNFRSF21)、オステオプロテゲリン(OPG、TNFRSF11B)、RANK(TNFRSF11A)、FAS(TNFRSF6)、及びCD40(TNFRSF5)へのバックグラウンドを超える特異的結合を示さなかった。OX40mAb24を形成するために「ヒト化」されたマウス抗ヒトOX40IgG1モノクローナル抗体9B12は、これらのTNFRSFタンパク質への結合の類似の欠如を示した(図5B)。
3.4:結論
ヒトOX40へのOX40mAb24及び9B12の結合は特異的であり、関連性の高いTNFRSFタンパク質と交差反応しない。
ヒトOX40へのOX40mAb24及び9B12の結合は特異的であり、関連性の高いTNFRSFタンパク質と交差反応しない。
実施例4:in vitroでOX40を介して一次ヒトCD4+T細胞を共刺激するOX40mAb24の能力
この実施例では、プレートベースのヒトCD4+T細胞増殖及びサイトカイン放出アッセイを用いて、CD3/T細胞レセプター(TCR)複合体を介する活性化と組み合わせてT細胞の活性化を増強するOX40mAb24の能力を評価した。CD3/TCRシグナル伝達の不在下で可溶性OX40mAb24及びプレート結合OX40mAb24の活性を調べたのと同様に、可溶性OX40mAb24の活性も調べた。
この実施例では、プレートベースのヒトCD4+T細胞増殖及びサイトカイン放出アッセイを用いて、CD3/T細胞レセプター(TCR)複合体を介する活性化と組み合わせてT細胞の活性化を増強するOX40mAb24の能力を評価した。CD3/TCRシグナル伝達の不在下で可溶性OX40mAb24及びプレート結合OX40mAb24の活性を調べたのと同様に、可溶性OX40mAb24の活性も調べた。
4.1 材料
この試験で使用した材料を表4−1に列挙する。
この試験で使用した材料を表4−1に列挙する。
4.2 アッセイ
4.2.1 OX40mAb24のプレート固定化バイオ活性
プレートベースの薬剤捕捉アッセイでヒトCD4+T細胞増殖及びサイトカイン産生を測定することによりOX40mAb24のバイオ活性を決定した(図6)。
4.2.1 OX40mAb24のプレート固定化バイオ活性
プレートベースの薬剤捕捉アッセイでヒトCD4+T細胞増殖及びサイトカイン産生を測定することによりOX40mAb24のバイオ活性を決定した(図6)。
製造業者のプロトコルに従ってRosetteSep CD4+T細胞富化キットを用いて健常ドナー全血から富化ヒトCD4+T細胞を単離した。4つの独立したドナーから細胞を用いてアッセイを行った。
CD4+T細胞を完全RPMI培養培地中に懸濁させ、細胞濃度を1.0×106/mLに調整した。最終濃度で2μg/mLのフィトヘマグルチニン−ロイコアグルチニン(PHA−L)及び20IU/mLの組換えヒトIL−2を添加し、そして37℃及び5%CO2の加湿組織培養インキュベーターで細胞を2日間培養することにより、T細胞を活性化してOX40をアップレギュレートした。
2μg/mLのヤギ抗マウスFcγ特異的IgG及び2μg/mLのヤギ抗ヒトFcγ特異的IgGを含む100μLのPBS液で非組織培養処理丸底96ウェルアッセイプレートを被覆した。可溶性OX40mAb24活性のアッセイを意図したウェルにはヤギ抗ヒトIgG捕捉抗体を添加しなかった。プレートを4℃で一晩インキュベートし、200μLのPBSで洗浄し、PBS中1%BSA(1%BSA/PBS)を用いて37℃で90分間ブロックした。プレートをPBSで洗浄し、1%BSA/PBS中に再構成された2ng/mLのマウス抗ヒトCD3クローンOKT3を37℃で90分間にわたりプレートに添加した。プレートをPBSで洗浄して未結合OKT3を除去し、OX40mAb24、R347ヒトIgG1対照mAb、9B12、及びマウスIgG1対照mAbクローンMOPC−21を0.918μg/mL(3.0nM)から開始して1%BSA/PBS中にそれぞれ再構成し、そして3倍希釈系列で段階希釈し、次いでアッセイプレートに添加し、37℃で90分間インキュベートした。
活性化一次ヒトCD4+T細胞を捕集し、完全RPMI培地で洗浄し、そして濃度を1.0×106生存細胞/mLに調整した。推奨された5μMではなく1.25μMのCFSEを使用して37℃で10分間のインキュベートした以外は製造業者の説明書に従って、カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル(CFSE)を用いて細胞を標識した。標識後、細胞を完全RPMI培地中に懸濁させ、濃度を0.5×106/mLに調整した。プレートをPBSで洗浄し、そして200μLのCD4+T細胞(100,000/ウェル)を各ウェルに添加した。可溶性OX40mAb24を含有するウェルでは、OX40mAb24をプレート結合OX40mAb24に使用される最高最終濃度に完全RPMI培地で希釈した。380×gで遠心分離することによりプレート中の細胞をペレットにし、37℃で3日間インキュベートした。72時間のインキュベーション時間の後、40μLの細胞培養上清を取り出してサイトカイン放出測定に供した。CD4+T細胞をペレット化し、2%FBSを含有するPBS(FACS緩衝液)で1回洗浄した。CD4+T細胞を同定するための抗ヒトCD4 eFluor450(登録商標)標識抗体及び生存/非生存細胞を識別するためのヨウ化プロピジウム(PI)を含有する結合ミックス中に細胞を懸濁させ、30分間インキュベートした。インキュベーション後、細胞をFACS緩衝液で洗浄し、FACS緩衝液中に再懸濁させ、そしてLSRIIフローサイトメーター及びフローサイトメトリー標準(FCS)形式データを解析するためにFlowJoソフトウェアを用いてフローサイトメトリーにより解析した。
T細胞増殖を解析するために、FlowJoソフトウェアを用いて生存(PI陰性)イベントをゲート処理し、CFSEの希釈を示すCD4ゲート処理細胞のパーセントを、増殖を起こしている細胞のパーセントの尺度として決定した。
サイトカイン放出を解析するために、MesoScale Discovery(Gaithersburg,MD)製の10プレックスヒトTh1/Th2サイトカイン解析キットを用いて製造業者のプロトコルに従って、培養の72時間後に得られた細胞培養上清をサイトカイン含有率に関して測定した。このキットは、次のヒトサイトカイン、すなわち、IFNγ、IL−2、IL4、IL−5、IL−8、IL−10、IL−12p70、IL−13、及びIL−1βを定量的に測定する電気化学的検出方法を利用する。
Windows用GraphPad Prismバージョン5.01(GraphPad Software,San Diego California USA,www.graphpad.com)を用いて増殖値又はサイトカイン放出値のいずれかに対してmAb濃度の対数をプロットした。OX40mAb24バイオ活性で20%、50%、及び90%最大効果(EC20、EC50、及びEC90)値を生じる有効濃度を、ECAnything機能を用いて用量−反応シグモイドバイオ活性曲線から計算した。
4.3 結果
4つのドナーのそれぞれからの増殖データ及び1つのドナーからのサイトカイン放出データを図7A〜C及び図8A〜Eに示し、ヒト一次CD4+T細胞増殖のEC20、EC50、及びEC90の効力値を表4−2に示し、ヒト一次CD4+T細胞サイトカイン放出アッセイの効力値を表4−3〜表4−7に示し、OX40mAb24及び9B12の平均増殖値及びサイトカイン放出値を表4−8及び表4−9に示す。
4つのドナーのそれぞれからの増殖データ及び1つのドナーからのサイトカイン放出データを図7A〜C及び図8A〜Eに示し、ヒト一次CD4+T細胞増殖のEC20、EC50、及びEC90の効力値を表4−2に示し、ヒト一次CD4+T細胞サイトカイン放出アッセイの効力値を表4−3〜表4−7に示し、OX40mAb24及び9B12の平均増殖値及びサイトカイン放出値を表4−8及び表4−9に示す。
OX40mAb24は、濃度依存的に一次ヒトCD4+T細胞(n=4)の増殖を共刺激し、EC20、EC50、及びEC90値は、それぞれ、21、28、及び72pMであった。9B12は、CD4+T細胞の増殖を共刺激し、EC20、EC50、及びEC90値は、106、218、及び622pMであった。従って、最大増殖反応の50%を誘導するのに必要な9B12濃度とOX40mAb24濃度との比は8〜1であった(表4−2)。
OX40mAb24及び9B12は、一次ヒトCD4+T細胞を共刺激してサイトカインを放出する(n=4)。平均のEC20、EC50、及びEC90値は、増殖値よりも効力が低かった。これらは、表4−8及び表4−9にまとめられている。IL−2、IL−4、IL−8、IL−12p70、及びIL−1βアッセイ結果では、用量−反応シグモイド曲線が不十分に作成されたか又は存在しなかったので、両方のmAbで非線形回帰分析を行なうことができなかった。
非プレート結合可溶性OX40mAb24の活性を決定した。可溶性OX40mAb24は、一次ヒトCD4+T細胞増殖(図7A〜C)又はサイトカイン放出(図8A〜E)のいずれについても、抗CD3抗体単独で又はR347ヒトIgG1対照mAbの存在下で観測されるレベルを超えて誘導することはなかった。プレート結合抗CD3抗体単独では、最小レベル〜中レベルの増殖及びサイトカイン放出を生じた。ここで可溶性OX40mAb24により示された活性の欠如は、OX40媒介NFκBシグナル伝達を測定した2細胞バイオ活性アッセイで細胞ベースの架橋を伴わない可溶性OX40mAb24で観測された活性の不在と一致する(以下の実施例5を参照のこと)。
同様に、OX40mAb24は、プレート表面上に固定されたものでも可溶性未結合タンパク質として添加されたものでも、サブマイトジェニック抗CD3抗体シグナルの不在下で、CD4+T細胞増殖(図7A〜C)もサイトカイン放出(図8A〜E)もほとんど又はまったく誘導しなかった。これらの結果から、この試験では、OX40mAb24は同時CD3/TCRライゲーションの不在下で一次ヒトCD4+T細胞で活性を有していないことが示された。
4.4 結論
OX40mAb24は、ヒト化に用いられた抗体9B12と同じように濃度依存的に一次ヒトCD4+T細胞の増殖及びサイトカイン放出を誘導した(図8A〜E及び図9A〜E)。OX40mAb24は、プレート結合タンパク質として活性を示したが、可溶性タンパク質として活性を示さなかった。さらに、OX40mAb24活性は、CD3/TCRシグナル伝達と同時に生じた。
OX40mAb24は、ヒト化に用いられた抗体9B12と同じように濃度依存的に一次ヒトCD4+T細胞の増殖及びサイトカイン放出を誘導した(図8A〜E及び図9A〜E)。OX40mAb24は、プレート結合タンパク質として活性を示したが、可溶性タンパク質として活性を示さなかった。さらに、OX40mAb24活性は、CD3/TCRシグナル伝達と同時に生じた。
実施例5:ジャーカットNFκBルシフェラーゼレポーターT細胞を用いた2細胞ベースのバイオ活性アッセイでのOX40mAb24のin vitro活性の決定
この実施例では、ヒトOX40を介してシグナル伝達するOX40mAb24及び9B12の能力を一セットの2細胞レポーターバイオ活性アッセイにより評価した。OX40共刺激を介するT細胞活性化の測定は、NFκBシグナル伝達経路の刺激に反応してルシフェラーゼを生成するOX40過剰発現ジャーカットNFκBルシフェラーゼT細胞レポーター系を用いて達成された(図10)。NFκBシグナル伝達は、OX40エンゲージメントの下流に行われることが報告されており、増殖やサイトカイン放出などのT細胞活性化の他の尺度と相関し得る(Croft M,et al.,Immunol Rev.229:173−91(2009))。細胞溶解物にルシフェラーゼ基質を添加して反応生成物により発せられる光をルミノメーターにより測定することにより、ルシフェラーゼの量つまりT細胞活性化を測定した。様々なFcγレセプター補体を発現するように工学操作された細胞を用いて架橋されたOX40mAb24、さらには可溶性非FcγR架橋OX40mAb24のバイオ活性を測定した。
この実施例では、ヒトOX40を介してシグナル伝達するOX40mAb24及び9B12の能力を一セットの2細胞レポーターバイオ活性アッセイにより評価した。OX40共刺激を介するT細胞活性化の測定は、NFκBシグナル伝達経路の刺激に反応してルシフェラーゼを生成するOX40過剰発現ジャーカットNFκBルシフェラーゼT細胞レポーター系を用いて達成された(図10)。NFκBシグナル伝達は、OX40エンゲージメントの下流に行われることが報告されており、増殖やサイトカイン放出などのT細胞活性化の他の尺度と相関し得る(Croft M,et al.,Immunol Rev.229:173−91(2009))。細胞溶解物にルシフェラーゼ基質を添加して反応生成物により発せられる光をルミノメーターにより測定することにより、ルシフェラーゼの量つまりT細胞活性化を測定した。様々なFcγレセプター補体を発現するように工学操作された細胞を用いて架橋されたOX40mAb24、さらには可溶性非FcγR架橋OX40mAb24のバイオ活性を測定した。
5.1 材料
この試験で使用した材料を表5−1に列挙する。
この試験で使用した材料を表5−1に列挙する。
5.2 2細胞バイオ活性アッセイ
5.2.1 一次ヒトCD45+細胞の単離
一次ヒトCD45+細胞をヒト腫瘍から単離した。腫瘍サンプルを輸送媒体から取り出し、無菌ペトリ皿に配置した。ハンク緩衝塩溶液を添加し、目視可能な壊死組織又はなんらかの正常組織を腫瘍サンプルから切除した。組織を小片(約1mm)にミンスし、50mLコニカルチューブに配置し、コラゲナーゼIII酵素ミックス(250IU/mLコラゲナーゼIII、3mM CaCl2、315μg/mL DNAアーゼ1)を添加し、混合し、そしてインキュベートした。消化サンプルを70ミクロンフィルターに通して濾過し、MACS緩衝液で洗浄した。解離細胞をペレット化し、ViCellカウンターを用いて細胞数及び生存能は決定した。細胞をCD45マイクロビーズと共にMACS緩衝液中に懸濁させ、そして氷上でインキュベートした。細胞を洗浄し、MACS緩衝液中に再懸濁させ、LSカラムを用いたCD45+細胞のポジティブ選択に供した。マグネットからカラムを取り出してMACS緩衝液をカラムに添加することにより、ビーズ結合CD45+細胞を溶出させた。細胞をペレット化し、完全RPMI培地中に再懸濁させ、そして以上に記載のバイオ活性アッセイで使用した。
5.2.1 一次ヒトCD45+細胞の単離
一次ヒトCD45+細胞をヒト腫瘍から単離した。腫瘍サンプルを輸送媒体から取り出し、無菌ペトリ皿に配置した。ハンク緩衝塩溶液を添加し、目視可能な壊死組織又はなんらかの正常組織を腫瘍サンプルから切除した。組織を小片(約1mm)にミンスし、50mLコニカルチューブに配置し、コラゲナーゼIII酵素ミックス(250IU/mLコラゲナーゼIII、3mM CaCl2、315μg/mL DNAアーゼ1)を添加し、混合し、そしてインキュベートした。消化サンプルを70ミクロンフィルターに通して濾過し、MACS緩衝液で洗浄した。解離細胞をペレット化し、ViCellカウンターを用いて細胞数及び生存能は決定した。細胞をCD45マイクロビーズと共にMACS緩衝液中に懸濁させ、そして氷上でインキュベートした。細胞を洗浄し、MACS緩衝液中に再懸濁させ、LSカラムを用いたCD45+細胞のポジティブ選択に供した。マグネットからカラムを取り出してMACS緩衝液をカラムに添加することにより、ビーズ結合CD45+細胞を溶出させた。細胞をペレット化し、完全RPMI培地中に再懸濁させ、そして以上に記載のバイオ活性アッセイで使用した。
5.2.2 アッセイプロトコル
2細胞バイオ活性アッセイを用いてOX40mAb24及び9B12のバイオ活性を試験した。ヒトOX40過剰発現ジャーカットNFκBルシフェラーゼレポータークローン64(OX40ジャーカットレポーター)を用いてOX40アゴニズム(NFκB活性)を測定した。第2のFcγR発現細胞系を用いてOX40mAb24架橋を媒介した。この架橋は、OX40ジャーカットレポーター細胞上のOX40をクラスター化及び活性化する(図10)。架橋に使用したFcγR発現細胞系は、RajiヒトB細胞リンパ腫系、CD32A発現HEK293、CD32B発現HEK293、又は一次ヒト腫瘍から単離されたCD45+免疫細胞を含んでいた。
2細胞バイオ活性アッセイを用いてOX40mAb24及び9B12のバイオ活性を試験した。ヒトOX40過剰発現ジャーカットNFκBルシフェラーゼレポータークローン64(OX40ジャーカットレポーター)を用いてOX40アゴニズム(NFκB活性)を測定した。第2のFcγR発現細胞系を用いてOX40mAb24架橋を媒介した。この架橋は、OX40ジャーカットレポーター細胞上のOX40をクラスター化及び活性化する(図10)。架橋に使用したFcγR発現細胞系は、RajiヒトB細胞リンパ腫系、CD32A発現HEK293、CD32B発現HEK293、又は一次ヒト腫瘍から単離されたCD45+免疫細胞を含んでいた。
OX40mAb24の可溶分活性を決定するために、親HEK293細胞(これはFcγRヌルであるのでOX40mAb24を架橋できない)を用いて、又は共存する架橋細胞の不在下で、バイオ活性アッセイを行った。
使用前、OX40ジャーカットレポーター細胞を0.5〜1.5×106/mLの密度で組織培養インキュベーター内の完全RPMI培地中で培養した。バイオアッセイの前日、106細胞/mLの最終密度で細胞を継代した。
OX40ジャーカットレポーター細胞、FcγR発現細胞系、又はHEK親細胞を捕集してペレット化した。一次ヒト腫瘍からCD45+細胞及び正常近接組織を単離するために、組織を解離させ、CD45+細胞を単離し、以下に記載されるようにバイオ活性アッセイの使用に供した。
OX40mAb24、9B12、及び種々の対照抗体を完全RPMI培地で3倍段階希釈した。
OX40ジャーカットレポーター細胞+FcγR発現細胞又はHEK親細胞を100,000細胞/ウェルで96ウェルプレートに添加した。OX40mAb24、9B12、又は対照抗体を10μg/mLの開始濃度で希釈系列で細胞に添加し、組織培養インキュベーター内で37℃でインキュベートした。
16〜24時間のインキュベーション時間後、100μLの再構成Steady−Gloルシフェラーゼアッセイ溶液(Promega,Madison,WI)を各ウェルに添加し、混合して細胞を溶解させ、次いでインキュベートしてルシフェラーゼシグナルを平衡化させた。Steady−Glo/sampleライセート(150μL)を各ウェルから96ウェル白色壁アッセイプレートに導入し、Perkin Elmer Envisionルミネセンスリーダーを用いてルミネセンスを読み取った。
Windows用GraphPad Prismバージョン5.01(GraphPad Software,San Diego,CA)を用いて、ルミネセンスRLU(y軸)に対してOX40mAb24、9B12、R347ヒトIgG1、マウスIgG1クローンMOPC−21の濃度(x軸はタンパク質濃度のlog10である)をプロットした。用量−反応シグモイド(変動傾き)バイオ活性曲線からf=20、f=50、及びf=90でECAnything(ECf)を用いて、バイオ活性のEC20、EC50、及びEC90値を決定した。
5.3 2細胞バイオ活性アッセイの結果
OX40mAb24及び対照抗体のバイオ活性の結果を図11A〜D、図12A〜D、及び表5−2に示す。
OX40mAb24及び対照抗体のバイオ活性の結果を図11A〜D、図12A〜D、及び表5−2に示す。
FcγR発現細胞系(例えば、一次ヒト腫瘍から単離されたCD32A発現HEK293、CD32B発現HEK293、RajiB細胞、又はCD45+細胞)の存在下で、OX40mAb24は、NFκB経路活性化により測定されるようにOX40過剰発現ジャーカットNFκBレポーター細胞の強力な刺激を示した。第2の細胞型の不在下で又は外因的発現FcγRsの欠如したHEK293細胞の存在下で、OX40mAb24は最小のレポーター活性を呈した(図11A〜D)。
2細胞バイオアッセイでの効力値(EC20、EC50、及びEC90)を表5−2にまとめる。すべてのアッセイにわたる平均のEC20、EC50、及びEC90値は、それぞれ、228、751、及び5630pMであった。
9B12及び対照抗体のバイオ活性の結果を図12A〜Dに示し、効力値を表5−3にまとめる。すべてのアッセイの平均のEC20、EC50、及びEC90値は、それぞれ、519、2530、及び41100pMであった。従って、9B12の2細胞バイオ活性(EC50)とOX40mAb24の2細胞バイオ活性(EC50)との比は3.4〜1であると計算された。
5−4:結論
OX40mAb24及び9B12は、OX40過剰発現ジャーカットNFκBルシフェラーゼレポーター細胞系でFκB経路の刺激により測定したときにヒトT細胞の活性化を媒介する。OX40mAb24のFcドメインを介して架橋可能なFcγRsを発現する細胞の不在下では、最小のレポーター細胞系活性が測定された。しかしながら、mAbを架橋可能なFcγRを発現する細胞と、T細胞活性化のリードアウトのためのジャーカット過剰発現NFκBルシフェラーゼレポーター系と、を含む2細胞システムでは、OX40mAb24及び9B12は、それぞれ、751pM及び2530pMの平均EC50値で強力なOX40活性化を媒介した。従って、2細胞アッセイシステムでのOX40mAb24のバイオ活性は、9B12に類似していた。
OX40mAb24及び9B12は、OX40過剰発現ジャーカットNFκBルシフェラーゼレポーター細胞系でFκB経路の刺激により測定したときにヒトT細胞の活性化を媒介する。OX40mAb24のFcドメインを介して架橋可能なFcγRsを発現する細胞の不在下では、最小のレポーター細胞系活性が測定された。しかしながら、mAbを架橋可能なFcγRを発現する細胞と、T細胞活性化のリードアウトのためのジャーカット過剰発現NFκBルシフェラーゼレポーター系と、を含む2細胞システムでは、OX40mAb24及び9B12は、それぞれ、751pM及び2530pMの平均EC50値で強力なOX40活性化を媒介した。従って、2細胞アッセイシステムでのOX40mAb24のバイオ活性は、9B12に類似していた。
実施例6:惹起エフェクター機能に対するOX40mAb24の能力
この実施例では、Fcエフェクター機能を惹起するOX40mAb24の能力、すなわち、高レベルのOX40を発現する一次ヒトCD4+T細胞に対してヒトナチュラルキラー(NK)細胞媒介抗体依存性細胞傷害性(ADCC)を惹起するOX40mAb24の能力、又は補体古典経路による補体依存性細胞傷害性(CDC)の前提条件としてC1qに結合するOX40mAb24の能力に関して、評価した。ヒトIgG4P Fcドメインを含有するOX40mAb24の形態(mAb28)又はIgG1 FcドメインにFcγRIIIa結合を低減する三重突然変異を含有するOX40mAb24の形態(mAb29)を利用して、ADCC活性を媒介するOX40mAb24 IgG1 Fcドメインの寄与を評価した。また、OX40mAb24のエフェクター機能と、OX40mAb24を形成するためにヒト化されたマウス抗ヒトOX40 IgG1モノクローナル抗体9B12と、を比較した。抗CD20抗体リツキシマブは、CD20を発現するB細胞に結合するので、陽性対照としてADCC実験に使用した。一次活性化ヒトCD4+T細胞はCD20を発現しないので、ADCCアッセイシステムで使用されるNK細胞の活性を検証するために、CD20を発現するToledo B細胞系を用いた独立したアッセイを行った。
この実施例では、Fcエフェクター機能を惹起するOX40mAb24の能力、すなわち、高レベルのOX40を発現する一次ヒトCD4+T細胞に対してヒトナチュラルキラー(NK)細胞媒介抗体依存性細胞傷害性(ADCC)を惹起するOX40mAb24の能力、又は補体古典経路による補体依存性細胞傷害性(CDC)の前提条件としてC1qに結合するOX40mAb24の能力に関して、評価した。ヒトIgG4P Fcドメインを含有するOX40mAb24の形態(mAb28)又はIgG1 FcドメインにFcγRIIIa結合を低減する三重突然変異を含有するOX40mAb24の形態(mAb29)を利用して、ADCC活性を媒介するOX40mAb24 IgG1 Fcドメインの寄与を評価した。また、OX40mAb24のエフェクター機能と、OX40mAb24を形成するためにヒト化されたマウス抗ヒトOX40 IgG1モノクローナル抗体9B12と、を比較した。抗CD20抗体リツキシマブは、CD20を発現するB細胞に結合するので、陽性対照としてADCC実験に使用した。一次活性化ヒトCD4+T細胞はCD20を発現しないので、ADCCアッセイシステムで使用されるNK細胞の活性を検証するために、CD20を発現するToledo B細胞系を用いた独立したアッセイを行った。
6.1 材料
この試験で使用した材料を表7−1に列挙する。
この試験で使用した材料を表7−1に列挙する。
6.2 アッセイ
6.2.1 抗体依存性細胞傷害性
エフェクターとして富化一次ヒトNK細胞及び標的としてOX40発現一次ヒトCD4+T細胞を用いて、9B12と対比して及びIgG4P Fcドメイン又は三重突然変異体(TM)ヒトIgG1 Fcドメインのいずれかと共にOX40mAb24のFabアームを含有するモノクローナル抗体と対比して、OX40mAb24のADCC活性を試験した。陽性対照として、Toledo B細胞系のリツキシマブ指向性死滅を用いて各NK細胞調製物の活性を試験した。
6.2.1 抗体依存性細胞傷害性
エフェクターとして富化一次ヒトNK細胞及び標的としてOX40発現一次ヒトCD4+T細胞を用いて、9B12と対比して及びIgG4P Fcドメイン又は三重突然変異体(TM)ヒトIgG1 Fcドメインのいずれかと共にOX40mAb24のFabアームを含有するモノクローナル抗体と対比して、OX40mAb24のADCC活性を試験した。陽性対照として、Toledo B細胞系のリツキシマブ指向性死滅を用いて各NK細胞調製物の活性を試験した。
一次ヒトCD4+T細胞を単離するために、MedImmune Blood Donor Programを介して健常ドナーから得られたヘパリン抗凝固処理全血を次のプロトコルに従って処理した。20mLの全血に対してStem Cell Technologies RosetteSep CD4T細胞単離キット抗体ミックス(1mL、Stem Cell Technologies,Vancouver,BC Canada)を添加し、混合し、室温(RT)で20分間(mm)インキュベートした。血液を無菌室温FACS緩衝液(PBS、pH7.2 + 2%熱不活性化新生仔ウシ血清)で1:1希釈し、DM−L培地上に層状化し、続いて20分間遠心分離した。遠心分離後、ヒトCD4+T細胞を含有するバフィーコートを取り出し、細胞をRT FACS緩衝液で1回洗浄し、さらにRT完全RPMI培地で1回洗浄した。ViCellカウンターにより細胞をカウントして細胞数及び生存能を決定し、CD4+T細胞を1.0×106/mLの濃度で完全RPMI培地中に懸濁させた。
37℃及び5%CO2の加湿組織培養インキュベーター内で2μg/mLのPHA−L及び20IU/mLのrhIL−2と共に一次ヒトCD4+T細胞(完全RPMI培地中1.0×106/mL)を48時間培養することによりT細胞を活性化してOX40をアップレギュレートし、続いて、OX40mAb24 ADCCアッセイに使用した。以下で参照される図中のドナーはすべて、ユニークな個体を表す。すなわち、CD4+T細胞は、繰返しADCC実験のために同一のドナーから単離されたものではない。
細胞傷害性アッセイで標的T細胞又は培養Toledo B細胞と精製ヒトNK細胞とを識別するために、Vybrant DiO細胞標識溶液を用いて蛍光色素DiOを標的細胞の細胞膜に組み込んだ(サスペンジョン細胞標識のための製造業者のプロトコルに従って)。1mLのRosetteSep CD4+T細胞単離キット抗体ミックスの代わりに1mLのRosetteSep NK細胞単離キット抗体ミックスを使用した以外は、ヒトCD4+T細胞のための以上と同一のプロトコルを用いて、一次ヒトCD4+T細胞及びToledo B細胞の活性化及びDiO標識化の後、MedImmune Blood Donor Programからのヘパリンナトリウム抗凝固処理血液からエフェクターNK細胞を単離した。単離された一次ヒトNK細胞を暖かいRPMI培地(10%FBS+RPMI−1640)で2回洗浄し、次いで、2.67×106/mLの濃度で完全RPMI中に懸濁させた。同様に、活性化一次ヒトCD4+T細胞を暖かい完全RPMIで2回洗浄し、2.67×105/mLの濃度で懸濁させた。その後、75μLの一次ヒトNK細胞(200,000)及び75μLの活性化一次ヒトCD4+T細胞(20,000)を無菌非組織培養処理丸底96ウェルプレートのウェルにエフェクターと標的との比を10:1として添加した。いくつかの実験では、10μg/mLの最終濃度を与えるように、OX40mAb24又は対照mAbを含有する完全RPMI培地(50μL)を添加した。他の実験では、67nMの最終濃度が得られるようにOX40mAb24若しくは対照mAbの3倍希釈系列を含有する完全RPMI(50μL)、又は67nMから出発して9B12若しくはR347ヒトIgG1の27倍希釈系列を含有する完全RPMI(50μL)を、プレーティングされた細胞に添加した。活性化CD4+T細胞はCD20を発現しないので、OX40発現活性化一次ヒトCD4+T細胞の代わりにDiO標識CD20発現Toledo B細胞を含有するウェルで、リツキシマブ(10μg/mL、対照抗体)を陽性対照として使用した。RTで遠心分離することによりADCCアッセイの細胞を穏やかにペレット化し、続いて24時間にわたり培養した。
インキュベーション時間の終了時、遠心分離により細胞をペレット化し、10μg/mLのヨウ化プロピジウム(PT)を含有するFACS緩衝液中に懸濁させてBD LSRIIフローサイトメーターによるフローサイトメトリー解析に供した。蛍光補償後、FlowJoソフトウェアを用いてDiO陽性標的CD4+T細胞のうち非生存(PT陽性)細胞又はToledo B細胞を識別した。
平均値及び平均値の標準誤差の決定を含めてNK細胞ADCCアッセイのデータのグラフ図は、Windows用GraphPad Prismバージョン5.01を用いて作成した。
6.2.2 C1qに結合するOX40mAb24
ProteOn XPR36装置を用いて表面プラズモン共鳴により、OX40mAb24又は9B12に対してプールヒト血清から精製されたヒト補体タンパク質C1qへのOX40mAb24又は9B12の結合を決定した。標準的なアミンカップリングを用いてGLCバイオセンサーチップの表面にOX40mAb24又は9B12を固定した。ヒトC1qを26nM〜1.6nMの範囲内の5つの濃度でPBS/0.005%Tween20、pH7.4中に懸濁させた。サンプルを30μL/minで200秒間注入し、続いて600秒間の解離段階を設けた。1:1フィッティングを用いてProteOn Manager 2.1ソフトウェア(Bio−Rad)によりセンサーグラムデータを処理した。
ProteOn XPR36装置を用いて表面プラズモン共鳴により、OX40mAb24又は9B12に対してプールヒト血清から精製されたヒト補体タンパク質C1qへのOX40mAb24又は9B12の結合を決定した。標準的なアミンカップリングを用いてGLCバイオセンサーチップの表面にOX40mAb24又は9B12を固定した。ヒトC1qを26nM〜1.6nMの範囲内の5つの濃度でPBS/0.005%Tween20、pH7.4中に懸濁させた。サンプルを30μL/minで200秒間注入し、続いて600秒間の解離段階を設けた。1:1フィッティングを用いてProteOn Manager 2.1ソフトウェア(Bio−Rad)によりセンサーグラムデータを処理した。
6.3 結果
NK細胞及びOX40発現標的細胞の同種異系及び自己由来の両方の混合物を用いて、OX40結合の飽和しレベル(10μg/mL[67nM])(実施例2参照)で、ADCCを媒介するOX40mAb24、9B12、並びにOX40mAb24のヒトIgG4P型(mAb28)及びIgG1−TM型(mAb29)の能力を試験した(図13A及び図14A)。OX40mAb24は、活性化ヒトCD4+T細胞に対する測定可能なADCC活性を示した。これとは対照的に、9B12、mAb28、及びmAb29は、陰性対照のADCC活性を超える活性を示さなかった。ヒトCD20に対する陽性対照抗体(リツキシマブ)は、同一のNK細胞を用いてADCC活性を示したことから、NK細胞はすべて、ロバストなADCC活性が可能であることが示される(図13B及び図14B)。
NK細胞及びOX40発現標的細胞の同種異系及び自己由来の両方の混合物を用いて、OX40結合の飽和しレベル(10μg/mL[67nM])(実施例2参照)で、ADCCを媒介するOX40mAb24、9B12、並びにOX40mAb24のヒトIgG4P型(mAb28)及びIgG1−TM型(mAb29)の能力を試験した(図13A及び図14A)。OX40mAb24は、活性化ヒトCD4+T細胞に対する測定可能なADCC活性を示した。これとは対照的に、9B12、mAb28、及びmAb29は、陰性対照のADCC活性を超える活性を示さなかった。ヒトCD20に対する陽性対照抗体(リツキシマブ)は、同一のNK細胞を用いてADCC活性を示したことから、NK細胞はすべて、ロバストなADCC活性が可能であることが示される(図13B及び図14B)。
用量−反応実験では、OX40mAb24は、活性化ヒトCD4+T細胞に対する濃度依存性ADCC活性を示した(図15A〜D、図16A〜D、図17A〜B及び表6−2)。これとは対照的に、9B12は、なんら検出可能なADCC活性を示さなかった。そのほかに、R347ヒトIgG1対照mAbは、なんら検出可能なADCC活性を示さなかったことから、OX40mAb24により媒介されるADCC活性は、標的細胞上のOX40とのエンゲージメントに依存することが確認される。ヒトCD20に対する陽性対照抗体もまた、CD20発現B細胞リンパ腫細胞系に対するADCCを示した(図13Bと図14B)、これはアッセイの妥当性を支持する。まとめると、これらの実験の結果から、OX40mAb24は、細胞表面OX40の発現を刺激することがすでに示されている条件下で培養された標的細胞に対するADCCが可能であることが確認された。
ヒト補体成分C1qに結合するOX40mAb24の可能性を表面プラズモン共鳴アッセイを用いて評価した。このアッセイでは、Clqへの結合を補体依存性細胞傷害性アッセイの活性のサロゲートとして使用した(Dall’Acqua et al.,J.Immunol 177:1129−1138(2006))。9B12は陰性対照抗体として使用した。OX40mAb24は、精製ヒトClqタンパク質への濃度依存性結合能を示した(図18A)。これとは対照的に、9B12は、C1qタンパク質への検出可能な結合をなんら示さなかった(図18B)。
6.4 結論
OX40mAb24は、C1qに結合し、活性化CD4+T細胞に対するNK媒介ADCCを惹起する。
OX40mAb24は、C1qに結合し、活性化CD4+T細胞に対するNK媒介ADCCを惹起する。
実施例7:OX40mAb24並びにカニクイザル細胞及びアカゲザルT細胞を用いたin vitro比較試験
この実施例では、カニクイザル(cyno)/アカゲザルOX40を発現するジャーカットNFκBルシフェラーゼT細胞レポーター系を含む2細胞レポーターバイオ活性アッセイを用いて、T細胞の活性化を増強するOX40mAb24の能力を調べた。Fcγレセプター媒介薬剤架橋は、アカゲザルB細胞系又は赤血球溶解後全血サンプル中のアカゲザルFcγレセプター発現細胞により媒介された。OX40活性化は、一次ヒトT細胞活性化の下流のNFκBシグナル伝達経路の刺激に反応して増加するルシフェラーゼ活性として測定した。NFκBシグナル伝達は、十分に研究されているOX40シグナル伝達の下流イベントであり、増殖やサイトカイン放出などのT細胞活性化の他の尺度と相関がある(Croft M,et al.,Immunol Rev.229:173−91(2009))。そのほかに、CD4+T細胞増殖が評価されるプレートベースのバイオ活性アッセイを用いて、アカゲザルT細胞のT細胞レセプター媒介活性化(共刺激)を増強するOX40mAb24の能力を試験した。アイソタイプ対照(NIP228 IgG1)を用いて特異的OX40エンゲージメントを示した。
この実施例では、カニクイザル(cyno)/アカゲザルOX40を発現するジャーカットNFκBルシフェラーゼT細胞レポーター系を含む2細胞レポーターバイオ活性アッセイを用いて、T細胞の活性化を増強するOX40mAb24の能力を調べた。Fcγレセプター媒介薬剤架橋は、アカゲザルB細胞系又は赤血球溶解後全血サンプル中のアカゲザルFcγレセプター発現細胞により媒介された。OX40活性化は、一次ヒトT細胞活性化の下流のNFκBシグナル伝達経路の刺激に反応して増加するルシフェラーゼ活性として測定した。NFκBシグナル伝達は、十分に研究されているOX40シグナル伝達の下流イベントであり、増殖やサイトカイン放出などのT細胞活性化の他の尺度と相関がある(Croft M,et al.,Immunol Rev.229:173−91(2009))。そのほかに、CD4+T細胞増殖が評価されるプレートベースのバイオ活性アッセイを用いて、アカゲザルT細胞のT細胞レセプター媒介活性化(共刺激)を増強するOX40mAb24の能力を試験した。アイソタイプ対照(NIP228 IgG1)を用いて特異的OX40エンゲージメントを示した。
併行して、非ヒト霊長動物OX40に対するOX40mAb24及び9B12の活性の比較を行うために、OX40mAb24の由来源のネズミ抗OX40モノクローナル抗体9B12のバイオ活性を測定した。
7.1 材料
この試験で使用した材料を表7.1に列挙する。
この試験で使用した材料を表7.1に列挙する。
7.2 アッセイ
7.2.1 カニクイザル/アカゲザル2細胞バイオ活性アッセイ
2細胞レポーターアッセイを用いてOX40mAb24をバイオ活性に関して試験した。カニクイザル及びアカゲザルは同一のOX40アミノ酸配列を共有するので、OX40アゴニズム(NFκB活性)のリードアウト用としてカニクイザル/アカゲザルOX40発現ジャーカットNFκBルシフェラーゼレポーター細胞系(クローンB2)を使用した。ジャーカットレポーター細胞上のOX40mAb24架橋つまりOX40クラスタリングを媒介するために、FcγR発現細胞を含有する正常アカゲザルの全血に由来するFcγレセプター発現アカゲザルB細胞系、LCL8664、又は白血球を使用した。OX40mAb24を添加しない場合さらにはFcγR発現細胞の不在下の場合の両方でバックグラウンドバイオ活性を評価した。レポーター細胞上のOX40エンゲージメントの役割を示すために、OX40mAb24の代わりにアイソタイプ対照を使用した。
7.2.1 カニクイザル/アカゲザル2細胞バイオ活性アッセイ
2細胞レポーターアッセイを用いてOX40mAb24をバイオ活性に関して試験した。カニクイザル及びアカゲザルは同一のOX40アミノ酸配列を共有するので、OX40アゴニズム(NFκB活性)のリードアウト用としてカニクイザル/アカゲザルOX40発現ジャーカットNFκBルシフェラーゼレポーター細胞系(クローンB2)を使用した。ジャーカットレポーター細胞上のOX40mAb24架橋つまりOX40クラスタリングを媒介するために、FcγR発現細胞を含有する正常アカゲザルの全血に由来するFcγレセプター発現アカゲザルB細胞系、LCL8664、又は白血球を使用した。OX40mAb24を添加しない場合さらにはFcγR発現細胞の不在下の場合の両方でバックグラウンドバイオ活性を評価した。レポーター細胞上のOX40エンゲージメントの役割を示すために、OX40mAb24の代わりにアイソタイプ対照を使用した。
次のプロトコルに従ってLCL8664を用いたOX40mAb24 2細胞バイオ活性アッセイを行った。
使用前日、カニクイザル/アカゲザルOX40発現ジャーカットNFκBルシフェラーゼレポータークローンB2及びLCL8664を完全RPMI培地(10%ウシ胎仔血清[FBS]及び1%抗生物質/抗真菌剤を有するRPMI)中で培養し、それぞれ、約5×106細胞/mL及び4×105細胞/mLの細胞密度を達成した。翌日、OX40ジャーカットレポーター細胞及びLCL8664をペレット化し、完全培地中に懸濁させ、ViCellカウンターを用いてカウントし、その後、両方の細胞系の細胞濃度を完全培地で2.5×106に調整した。
クローンB2及びLCL8664細胞を100,000細胞/ウェルで96ウェル丸底非組織培養処理プレートに添加した。30μg/mLから開始して最終濃度まで3倍増分希釈で、OX40mAb24を完全RPMI培地中の細胞に添加した。同様に、R347IgG1(アイソタイプ対照)を10μg/mLの最終濃度で6倍増分希釈で使用した。同様にして、9B12及びMOPC−21(アイソタイプ対照)を希釈した。プレートを加湿5%CO2雰囲気の37℃のインキュベーターに導入した。
16時間のインキュベート時間の後、100μLの再構成Steady−Gloルシフェラーゼアッセイ溶液を各ウェルに添加し、混合して細胞を溶解させ、次いでインキュベートしてルシフェラーゼシグナルを平衡化させた。Steady−Glo/sampleライセート(150μL)を各ウェルから96ウェル白色壁アッセイプレートに導入し、Perkin Elmer Envisionルミネセンスリーダーを用いてルミネセンスを読み取った。
次のプロトコルを用いて、健常インド起源アカゲザルから得られたヘパリンナトリウム抗凝固処理全血からRBC溶解アカゲザル細胞を取得した。
新鮮全血(5mL)を50mLコニカルチューブに添加し、45mLの塩化アンモニウム溶液を添加した。細胞混合物を氷上で10分間インキュベートし、次いで、ペレット化し、完全RPMI培地で洗浄し、その後、細胞は2細胞バイオ活性アッセイに使用できる状態であった。
LCL8664アカゲザルB細胞系で記載したように、アカゲザルRBC溶解全血細胞を用いた2細胞バイオ活性アッセイを行ったが、陰性対照抗体として10μg/mLのNIP228IgG1を使用した。
7.2.2 アカゲザルCD4 T細胞増殖アッセイ
次のプロトコルに従って、活性化一次アカゲザルCD4+T細胞及びプレート捕捉薬剤を用いて、CD4+T細胞増殖アッセイでOX40mAb24のバイオ活性を決定した。世界的霊長動物の健常アカゲザル(n=2)から得られたヘパリンナトリウム抗凝固処理全血から単離されたアカゲザルCD4+T細胞を反応細胞源として使用した。
次のプロトコルに従って、活性化一次アカゲザルCD4+T細胞及びプレート捕捉薬剤を用いて、CD4+T細胞増殖アッセイでOX40mAb24のバイオ活性を決定した。世界的霊長動物の健常アカゲザル(n=2)から得られたヘパリンナトリウム抗凝固処理全血から単離されたアカゲザルCD4+T細胞を反応細胞源として使用した。
新鮮ヘパリン処理アカゲザル血液を室温(RT)でPBSで希釈1:1した。次いで、20mLの希釈全血を50mLコニカル遠心チューブ中の15mLの95%リンパ球分離培地(LSM)上に重畳した。無制動、室温、400×gで血液を30分間遠心分離した。末梢血単核細胞をインターフェースで捕集し、Miltenyi MACS緩衝液で2回洗浄し、そしてペレット化した。細胞ペレットを赤血球溶解緩衝液で5分間処理し、完全RPMI培地を添加して溶解緩衝液を不活性化した。細胞を洗浄し、MACS緩衝液中に懸濁させ、そしてViCellカウンターでカウントして細胞数及び生存能を決定した。
製造業者の取扱い説明書に従ってMiltenyi非ヒト霊長動物キットを用いてアカゲザルCD4+T細胞を単離した。次いで、CD4+T細胞をViCellカウンターでカウントし、51μg/mLのコンカナバリンA及び1000IU/mLのIL−2を含む完全RPMI培地中に1×106細胞/mLで懸濁させ、37℃及び5%CO2の加湿インキュベーター中で2日間培養することにより、T細胞を活性化してOX40発現を誘導した。2μg/mLのヤギ抗マウスFcγ特異的IgG及び2μg/mLのヤギ抗ヒトFcγ特異的IgGを含む100μLのPBS液で非組織培養処理丸底96ウェルアッセイプレートを被覆した。可溶性OX40mAb24活性のアッセイを意図したウェルにはヤギ抗ヒトIgG捕捉抗体を添加しなかった。プレートを4℃で一晩インキュベートし、200μLのPBSで洗浄し、PBS中1%BSA(1%BSA/PBS)を用いて37℃で90分間ブロックした。プレートをPBSで洗浄し、1%BSA/PBS中に再構成した2ng/mLの抗CD3(クローンSP34−2)を37℃で90分間にわたりプレートに添加した。プレートをPBSで洗浄して未結合分を除去し、OX40mAb24、R347ヒトIgG1対照mAb、9B12、及びマウスIgG1対照mAb(クローンMOPC−21)をそれぞれ1.01μg/mL(6.67nM、実験1)又は1.5μg/mL(10.0nM、実験2)から開始して3倍希釈系列で段階希釈して1%BSA/PBS中に再構成し、次いで、アッセイプレートに添加された、そして37℃で90分間インキュベートした。
活性化一次アカゲザルCD4+T細胞を捕集し、完全RPMI培地で洗浄し、そして濃度を1.0×106生存細胞/mLに調整した。推奨の5μMの代わりに1.25μMのCFSEを用いて37℃で10分間のインキュベーションを行った以外は製造業者の説明書に従ってカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル(CFSE)で細胞を標識した。標識後、細胞を完全RPMI中に懸濁させ、濃度を1.0×106/mLに調整した。プレートをPBSで洗浄し、200μLのCD4+T細胞(200,000/ウェル)を各ウェルに添加した。次いで、プレートを37℃で3日間インキュベートした。
72時間のインキュベーション時間の後、CD4+T細胞をペレット化し、2%FBSを含有するPBS(FACS緩衝液)で1回洗浄した。CD4+T細胞を同定するための抗CD4 V450R標識抗体と生存/非生存細胞の識別のためのヨウ化プロピジウム(PI)とを含有する結合ミックス中に細胞を懸濁させ、30分間インキュベートした。インキュベーション後、細胞をFACS緩衝液で洗浄し、FACS緩衝液中に再懸濁させ、そしてLSRIIフローサイトメーター及びフローサイトメトリー標準(FCS)形式データを解析するためにFlowJoソフトウェアを用いてフローサイトメトリーにより解析した。
一次アカゲザルCD4+T細胞を用いて2つの独立した実験でアッセイを繰り返した。
細胞増殖を評価するために、FlowJoソフトウェアを用いて生存イベント(ヨウ化プロピジウム陰性)をゲート処理し、CFSEの希釈を示すCD4+ゲート処理細胞のパーセントを決定した。抗CD3抗体+OX40mAb24に反応してCSFEの希釈を示すCD4+ゲート処理細胞のパーセントから抗CD3単独に反応してCFSEの希釈を示すCD4+ゲート処理細胞のパーセントを減算することにより、OX40mAb24の比活性を計算した。
GraphPad Prism、バージョン5.01(San Diego,CA)で非線形回帰分析(log用量−反応、4パラメーターフィッティング曲線)を用いて、ジャーカットNFκBレポーターアッセイ及び一次アカゲザルCD4+T細胞アッセイで半値(EC50)反応を達成したOX40mAb24の濃度を決定した。
7.3 結果
7.3.1 カニクイザル/アカゲザル2細胞バイオ活性アッセイ
カニクイザル/アカゲザル2細胞バイオ活性アッセイの結果を表7−2、図19A〜B、図20A〜B及び図21A〜Bに示す。OX40mAb24は、1450pMの平均EC50(n=2実験)を有して、アカゲザルB細胞系LCL8664の存在下でカニクイザル/アカゲザルOX40発現ジャーカットT細胞でNFκBシグナル伝達により測定されるようにOX40シグナル伝達経路を活性化した。表7−2に示されるように、カニクイザル/アカゲザル2細胞アッセイでのOX40mAb24活性のEC50値は、Raji B細胞系を用いたヒト2細胞アッセイでの値の1.3倍であり、一方、9B12は、カニクイザル/アカゲザル2細胞アッセイで限られた活性を有し、EC50値を決定できなかった。
7.3.1 カニクイザル/アカゲザル2細胞バイオ活性アッセイ
カニクイザル/アカゲザル2細胞バイオ活性アッセイの結果を表7−2、図19A〜B、図20A〜B及び図21A〜Bに示す。OX40mAb24は、1450pMの平均EC50(n=2実験)を有して、アカゲザルB細胞系LCL8664の存在下でカニクイザル/アカゲザルOX40発現ジャーカットT細胞でNFκBシグナル伝達により測定されるようにOX40シグナル伝達経路を活性化した。表7−2に示されるように、カニクイザル/アカゲザル2細胞アッセイでのOX40mAb24活性のEC50値は、Raji B細胞系を用いたヒト2細胞アッセイでの値の1.3倍であり、一方、9B12は、カニクイザル/アカゲザル2細胞アッセイで限られた活性を有し、EC50値を決定できなかった。
そのほかに、表7−2に示されるように、OX40mAb24は、550pMのEC50(n=1実験)を有して、Fcγレセプター発現細胞を含有すると予想されるアカゲザルRBC溶解全血の存在下でジャーカットT細胞でOX40シグナル伝達経路を活性化した。同様に表7−2に示されるように、同一のアッセイで9B12のEC50値は6052pMであり、Raji B細胞系を用いたヒト2細胞アッセイで4680pMであった。
7.3.2 アカゲザル一次C細胞増殖アッセイ
アカゲザル一次T細胞増殖アッセイの結果を表7−3、表7−4、及び図22A〜Dに示す。OX40mAb24は、436pMの平均EC50を有して一次アカゲザルCD4+T細胞の増殖を誘導した(表7−3、n=2実験)。表7−5に示されるように、9B12のEC50値は110pMであった(表7−4、n=2実験)。OX40mAb24は、類似のアッセイ方式で28pMの平均EC50を有して活性化一次ヒトCD4+T細胞の増殖を誘導した((表7−5、実施例4のデータ)。
アカゲザル一次T細胞増殖アッセイの結果を表7−3、表7−4、及び図22A〜Dに示す。OX40mAb24は、436pMの平均EC50を有して一次アカゲザルCD4+T細胞の増殖を誘導した(表7−3、n=2実験)。表7−5に示されるように、9B12のEC50値は110pMであった(表7−4、n=2実験)。OX40mAb24は、類似のアッセイ方式で28pMの平均EC50を有して活性化一次ヒトCD4+T細胞の増殖を誘導した((表7−5、実施例4のデータ)。
7.4 結論
OX40mAb24は、アカゲザルB細胞又はRBC溶解アカゲザル全血内に含有されるFcγレセプター発現細胞の存在下でカニクイザル/アカゲザルOX40発現ジャーカットT細胞NFκBレポーター細胞系でOX40シグナル伝達経路を活性化した。そのほかに、OX40mAb24は一次アカゲザルCD4+T細胞の増殖を誘導した。
OX40mAb24は、アカゲザルB細胞又はRBC溶解アカゲザル全血内に含有されるFcγレセプター発現細胞の存在下でカニクイザル/アカゲザルOX40発現ジャーカットT細胞NFκBレポーター細胞系でOX40シグナル伝達経路を活性化した。そのほかに、OX40mAb24は一次アカゲザルCD4+T細胞の増殖を誘導した。
実施例8:ヒト癌のマウスモデルにおけるOX40mAb24の活性
この実施例は、OX40mAb24が癌を治療するための単一作用剤療法として有効であるかを決定するために設計された。この試験は、免疫無防備非肥満糖尿病/重症複合免疫不全(NOD/SCID)マウスにおいてアロ反応性ヒトT細胞と混合されたヒト癌の異種移植モデルで行われた。
この実施例は、OX40mAb24が癌を治療するための単一作用剤療法として有効であるかを決定するために設計された。この試験は、免疫無防備非肥満糖尿病/重症複合免疫不全(NOD/SCID)マウスにおいてアロ反応性ヒトT細胞と混合されたヒト癌の異種移植モデルで行われた。
8.1 材料
この試験で使用した材料及びそれらの供給元を表8−1に列挙する。
この試験で使用した材料及びそれらの供給元を表8−1に列挙する。
8.2 実験プロトコル
8.2.1 試験動物
5〜9週齢の雌NOD/SCIDマウスをHarlan Laboratories,Inc.から入手した。動物は、MedImmuneのLaboratory Animal Resourcesの施設、Association for Animal Accreditation of Laboratory Animal Care及び米国農務省(United States Department of Agriculture)の許可を得た施設で、Iristithtional Animal Care and Use Committeeにより認可されたプロトコルに従って、人道的に処置及び飼育された。動物は、無菌の寝具及び食品並びに不断給餌の酸性化飲料水を備えた無菌マイクロアイソレーターユニットに維持された。環境条件は標準化した(室温:20℃±1℃、相対湿度:50%±10%、12時間の明暗周期)。動物は、有害な臨床徴候に関して毎日及び体重に関して毎週モニターした。
8.2.1 試験動物
5〜9週齢の雌NOD/SCIDマウスをHarlan Laboratories,Inc.から入手した。動物は、MedImmuneのLaboratory Animal Resourcesの施設、Association for Animal Accreditation of Laboratory Animal Care及び米国農務省(United States Department of Agriculture)の許可を得た施設で、Iristithtional Animal Care and Use Committeeにより認可されたプロトコルに従って、人道的に処置及び飼育された。動物は、無菌の寝具及び食品並びに不断給餌の酸性化飲料水を備えた無菌マイクロアイソレーターユニットに維持された。環境条件は標準化した(室温:20℃±1℃、相対湿度:50%±10%、12時間の明暗周期)。動物は、有害な臨床徴候に関して毎日及び体重に関して毎週モニターした。
8.2.2 異種移植の確立
ヒト黒色腫細胞系に由来するヒト癌性A375細胞はATCCから入手した。細胞は、5%CO2下37℃の加湿インキュベーター内で10%FCSを有するDMEM中に成長させた。次いで、それを採取し、PBSで1回洗浄し、次いで、PBS中に再懸濁させた。
ヒト黒色腫細胞系に由来するヒト癌性A375細胞はATCCから入手した。細胞は、5%CO2下37℃の加湿インキュベーター内で10%FCSを有するDMEM中に成長させた。次いで、それを採取し、PBSで1回洗浄し、次いで、PBS中に再懸濁させた。
ヒト癌性A375細胞は細胞培養物から採取した。それをPBS中に再懸濁させた。続いて、動物への移植前に、A375細胞をA375腫瘍細胞系に対してアロ反応性のCD4+及びCD8+T細胞系と混合した。
CD4+及びCD8+T細胞系を生成するために、全血20mL当たり1mLのRosetteSep T細胞富化製品を添加することにより、健常ドナー由来のヒト末梢血単核細胞(PBMC)をCD4+又はCD8+T細胞に関して富化した。この後、20分間インキュベートし、続いて、RosetteSep DM−L密度媒体を用いて密度勾配遠心分離を行うことにより単離した。遠心分離後、細胞を2%ウシ胎仔血清(FBS)が追加されたPBSで3回洗浄し、10%FBSが追加されたRPMI1640培地中に再懸濁させた。富化CD4+及びCD8+T細胞は、組換えヒトインターロイキン2(rhIL−2)が追加された培地中で7〜10日間個別に培養し、そしてそれぞれマイトマイシンC処理A375細胞と組み合わせた。T細胞は、採取してから、rhIL−2が追加された培地中で7〜10日間個別に培養し、そしてマイトマイシンC処理A375細胞と組み合わせた。CD4+及びCD8+T細胞は採取してから2:1の比で組み合わせた。
CD4+及びCD8+T細胞に関して富化されたA375細胞及びPMBCは、移植直前にA375細胞6対T細胞1の比で混合した。
異種移植は、動物の右側腹部で3.5×106細胞(ヒトT細胞は1:6のエフェクター対標的(E:T)の比でA375細胞と混合し、200μLのPBS中に懸濁させた)の皮下(SC)注射により確立した。
8.2.3 ランダム化、群指定、及び用量レベル
細胞のSC注射前に6匹の動物を各実験群にランダムに帰属した。動物の入替えはしなかった。各実験に対する群指定及び用量レベルを表8−2、表8−3及び表8−4に列挙する。試験抗体及び対照抗体はPBSで適切な濃度に希釈し、200μLの全体積で腹腔内(IP)投与した。試験抗体及び対照抗体の初回用量は、癌/エフェクターT細胞の移植後3日目又は4日目に投与した。動物は、図に示される通り及び対応する図の説明に示される通りさらに3回まで試験抗体及び対照抗体の投与を受けた。各動物で腫瘍の形成が週1回又は2回観察された。この試験の主要エンドポイントは、2000mm3の腫瘍体積又は全体的腫瘍壊死のいずれかであった。
細胞のSC注射前に6匹の動物を各実験群にランダムに帰属した。動物の入替えはしなかった。各実験に対する群指定及び用量レベルを表8−2、表8−3及び表8−4に列挙する。試験抗体及び対照抗体はPBSで適切な濃度に希釈し、200μLの全体積で腹腔内(IP)投与した。試験抗体及び対照抗体の初回用量は、癌/エフェクターT細胞の移植後3日目又は4日目に投与した。動物は、図に示される通り及び対応する図の説明に示される通りさらに3回まで試験抗体及び対照抗体の投与を受けた。各動物で腫瘍の形成が週1回又は2回観察された。この試験の主要エンドポイントは、2000mm3の腫瘍体積又は全体的腫瘍壊死のいずれかであった。
8.2.4 腫瘍の測定
各実験に対する図及び表に示される間隔でカリパスにより腫瘍を測定し、次式:
V(mm3)=(長さ[mm]×幅[mm]×[幅mm])/2
により腫瘍体積(V)を計算した。
各群に対して結果を算術平均で報告する。抗腫瘍効果は、腫瘍成長阻害パーセント(%TGI)で表した。これは次のように計算した。
%TGI=(1−[治療群の平均腫瘍V]÷[対照群の平均腫瘍V])×100
各実験に対する図及び表に示される間隔でカリパスにより腫瘍を測定し、次式:
V(mm3)=(長さ[mm]×幅[mm]×[幅mm])/2
により腫瘍体積(V)を計算した。
各群に対して結果を算術平均で報告する。抗腫瘍効果は、腫瘍成長阻害パーセント(%TGI)で表した。これは次のように計算した。
%TGI=(1−[治療群の平均腫瘍V]÷[対照群の平均腫瘍V])×100
8.3 統計的方法
OX40mAb24治療動物又は9B12治療動物とアイソタイプ対照治療動物との間で比較を行って、マン・ホイットニー順位和検定による統計的有意性で群間差を解析した。
OX40mAb24治療動物又は9B12治療動物とアイソタイプ対照治療動物との間で比較を行って、マン・ホイットニー順位和検定による統計的有意性で群間差を解析した。
マン・ホイットニー順位和検定から得られた有意なp値は、算術平均値及び平均値の標準偏差に近接してまとめの表及び図に示される。
8.4 結果
この試験ではヒト癌のマウスモデルにおける腫瘍の成長に対するOX40mAb24の活性を調べた。ヒト癌細胞系をアロ反応性ヒトCD4+及びCD8+T細胞系と混合して免疫不全NOD/SCID雌動物に移植した。CD4+及びCD8+T細胞は、健常ヒトドナーから単離されたPBMCに由来するものであった。異種移植の3日後又は4日後に動物に試験抗体及び対照抗体の最初の投与を行い、適応があれば試験抗体及び対照抗体の追加投与を行った。
この試験ではヒト癌のマウスモデルにおける腫瘍の成長に対するOX40mAb24の活性を調べた。ヒト癌細胞系をアロ反応性ヒトCD4+及びCD8+T細胞系と混合して免疫不全NOD/SCID雌動物に移植した。CD4+及びCD8+T細胞は、健常ヒトドナーから単離されたPBMCに由来するものであった。異種移植の3日後又は4日後に動物に試験抗体及び対照抗体の最初の投与を行い、適応があれば試験抗体及び対照抗体の追加投与を行った。
3つの個別の実験で、OX40mAb24+アロ反応性ヒトT細胞は、アイソタイプ対照群と比較してA375細胞の成長を有意に最大85%阻害した(表8−2、表8−3、及び表8−4;図23A、図24A、及び図25)。対照9B12+アロ反応性ヒトT細胞もまた、アイソタイプ対照群と比較してA375細胞の成長を有意に最大77%阻害した(表8−2〜8−4、図23B及び図24B)。
8.5 結論
OX40mAb24は、アロ反応性ヒトT細胞と混合されたヒト癌のマウスモデルにおいて強力な抗腫瘍活性を示した。OX40mAb24の抗腫瘍活性は、9B12の抗腫瘍活性に類似していた。これらの結果は、OX40mAb24がT細胞浸潤物を有する癌の患者の治療に単一作用剤療法として有効であり得ることを示す証拠となる。
OX40mAb24は、アロ反応性ヒトT細胞と混合されたヒト癌のマウスモデルにおいて強力な抗腫瘍活性を示した。OX40mAb24の抗腫瘍活性は、9B12の抗腫瘍活性に類似していた。これらの結果は、OX40mAb24がT細胞浸潤物を有する癌の患者の治療に単一作用剤療法として有効であり得ることを示す証拠となる。
実施例9:ラット/マウス抗マウスOX40IgG2aキメラ抗体クローンOX86は、同種同系モデルにおいてマウス癌細胞系の成長を阻害する
OX40mAb24は、マウス(m)OX40に交差反応しない(実施例2参照)。従って、免疫能のあるマウスモデルにおいてその活性を試験することはできない。OX86は、mOX40に特異的に結合してそのシグナル伝達を惹起するラット抗mOX40IgG1抗体であり(al−Shamkhani et al.,Eur.J.Immunol.26:1695−1699(1996))、癌の免疫能のあるマウスモデルにおいて抗腫瘍活性を有する(Weinberg AD,et al.,J.Immunol.164:2160−2169(2000))。OX40mAb24に類似した機能上の性質を有するマウスサロゲート抗体を用いてOX40アゴニズムの効果をより完全に調べるために、ラット/マウス抗mOX40IgG2aキメラ抗体(OX86mIgG2a、ラット抗OX40軽鎖及び重鎖の可変領域とマウスIgG2a定常領域とを有する)をOX86から作製した。この実施例では、癌の3つのマウスモデルにおいてOX86mIgG2aの単一作用剤抗腫瘍活性を評価する。
OX40mAb24は、マウス(m)OX40に交差反応しない(実施例2参照)。従って、免疫能のあるマウスモデルにおいてその活性を試験することはできない。OX86は、mOX40に特異的に結合してそのシグナル伝達を惹起するラット抗mOX40IgG1抗体であり(al−Shamkhani et al.,Eur.J.Immunol.26:1695−1699(1996))、癌の免疫能のあるマウスモデルにおいて抗腫瘍活性を有する(Weinberg AD,et al.,J.Immunol.164:2160−2169(2000))。OX40mAb24に類似した機能上の性質を有するマウスサロゲート抗体を用いてOX40アゴニズムの効果をより完全に調べるために、ラット/マウス抗mOX40IgG2aキメラ抗体(OX86mIgG2a、ラット抗OX40軽鎖及び重鎖の可変領域とマウスIgG2a定常領域とを有する)をOX86から作製した。この実施例では、癌の3つのマウスモデルにおいてOX86mIgG2aの単一作用剤抗腫瘍活性を評価する。
9.1 材料
この試験で使用した材料及びそれらの供給元を表9−1に列挙する。
この試験で使用した材料及びそれらの供給元を表9−1に列挙する。
9.2 実験プロトコル
9.2.1 試験動物
6〜8週齢のBALB/c及びC57BL/6マウスをMedImmune from Harlan Laboratories,Inc.(Indianapolis,IN)で入手し、試験開始前の3日間にわたり気候順化を行った。その後、マウスの腫瘍移植部位を剃毛し、同定のためにマイクロチップトランスポンダーと共に移植した。
9.2.1 試験動物
6〜8週齢のBALB/c及びC57BL/6マウスをMedImmune from Harlan Laboratories,Inc.(Indianapolis,IN)で入手し、試験開始前の3日間にわたり気候順化を行った。その後、マウスの腫瘍移植部位を剃毛し、同定のためにマイクロチップトランスポンダーと共に移植した。
動物は、MedImmuneのLaboratory Animal Resourcesの施設、Association for Animal Accreditation of Laboratory Animal Care及び米国農務省(United States Department of Agriculture)の許可を得た施設で、Institutional Animal Care and Use Committeeにより認可されたプロトコルに従って、飼育した。動物は、無菌の寝具及び食品並びに不断給餌の酸性化飲料水を備えた無菌マイクロアイソレーターユニットに維持された。環境条件は標準化した(室温:20℃±1℃、相対湿度:50%±10%、12時間の明暗周期)。動物は、有害な臨床徴候に関して毎日及び体重に関して隔週でモニターした。後肢麻痺、呼吸窮迫、20%体重損失、又は2000mm3超の腫瘍体積が認められた場合、動物はCO2で窒息させて人道的にただちに屠殺した。
9.2.2 同系腫瘍の確立及び移植
CT26及び4T1は、Manassas,VAのATCCから入手した。MCA205細胞は、Providence Cancer Center,Portland,ORから入手した。細胞はすべて、10%FBSが追加されたRPMI1640細胞培養培地で培養し、37℃、5%CO2の加湿組織培養チャンバー内で成長させ、次いで採取し、FBSで1回洗浄し、次いでPBS中に再懸濁させた。
CT26及び4T1は、Manassas,VAのATCCから入手した。MCA205細胞は、Providence Cancer Center,Portland,ORから入手した。細胞はすべて、10%FBSが追加されたRPMI1640細胞培養培地で培養し、37℃、5%CO2の加湿組織培養チャンバー内で成長させ、次いで採取し、FBSで1回洗浄し、次いでPBS中に再懸濁させた。
アロ移植は、0.1mLのPBS中に懸濁された5.0×105 CT26細胞又は1.0×105 4T1細胞の皮下(SC)注射を7〜9週齢のBALB/cマウスの右側腹部内に行って確立し、一方、0.1mLのリン酸緩衝生理食塩水中に懸濁された2.5×105 MCA205細胞は、7〜9週齢のC57BL/6マウスの右側腹部に注射した。
9.2.3 ランダム化、群指定、及び用量レベル
この試験ではBALB/c(合計216匹)及びC57BL/6(合計70匹)雌マウスを使用した。CT26腫瘍細胞が移植されたBALB/cマウスは、腫瘍が平均体積120mm3/コホートに成長した後(移植の9日後)又は200mm3/コホートに成長した後(移植の13日後)はランダムに帰属した。4T1腫瘍細胞が移植されたBALB/cマウスは、腫瘍が平均体積120mm3に成長した後(移植の13日後)にランダムに帰属した。C57BL/6マウスは、腫瘍が平均体積95mm3/コホートに成長した後(移植の11日後)にランダムに帰属した。群指定、動物数、用量レベル、及び投与スケジュールを表9−2、表9−3、表9−4及び表9−5に示す。試験抗体及び対照抗体はすべて、腹腔内(IP)注射により投与した。動物の入替えはしなかった。
この試験ではBALB/c(合計216匹)及びC57BL/6(合計70匹)雌マウスを使用した。CT26腫瘍細胞が移植されたBALB/cマウスは、腫瘍が平均体積120mm3/コホートに成長した後(移植の9日後)又は200mm3/コホートに成長した後(移植の13日後)はランダムに帰属した。4T1腫瘍細胞が移植されたBALB/cマウスは、腫瘍が平均体積120mm3に成長した後(移植の13日後)にランダムに帰属した。C57BL/6マウスは、腫瘍が平均体積95mm3/コホートに成長した後(移植の11日後)にランダムに帰属した。群指定、動物数、用量レベル、及び投与スケジュールを表9−2、表9−3、表9−4及び表9−5に示す。試験抗体及び対照抗体はすべて、腹腔内(IP)注射により投与した。動物の入替えはしなかった。
腫瘍体積が約2000mm3に達成した場合又は腫瘍が潰瘍化若しくは壊死した場合、各群の動物を屠殺した。
9.2.4 腫瘍の測定
腫瘍はカリパスにより週2回測定し、次式:
腫瘍体積(V)=[長さ(mm)×幅(mm)2]/2
を用いて腫瘍体積を計算した。式中、長さはより長い辺であり、幅は長さに垂直なより短い辺として定義した。
腫瘍はカリパスにより週2回測定し、次式:
腫瘍体積(V)=[長さ(mm)×幅(mm)2]/2
を用いて腫瘍体積を計算した。式中、長さはより長い辺であり、幅は長さに垂直なより短い辺として定義した。
各群の抗腫瘍効果は腫瘍成長阻害(TGI)として表現され、次のように計算した。
%TGI=(1−[治療群の平均V]÷[対照群の平均V]×100)
測定可能な腫瘍がなかった場合、腫瘍成長反応は完全反応(CR)として分類した。
%TGI=(1−[治療群の平均V]÷[対照群の平均V]×100)
測定可能な腫瘍がなかった場合、腫瘍成長反応は完全反応(CR)として分類した。
9.3 統計的方法
一元配置ANOVAを用いて平均腫瘍体積差を決定した。有意なF検定では、ダネット又はシダックの多重比較検定を利用した(適切な場合)。適用可能な場合、異分散性を考慮して腫瘍体積にlog10変換を施した。p値<0.05は有意であるとみなした。
一元配置ANOVAを用いて平均腫瘍体積差を決定した。有意なF検定では、ダネット又はシダックの多重比較検定を利用した(適切な場合)。適用可能な場合、異分散性を考慮して腫瘍体積にlog10変換を施した。p値<0.05は有意であるとみなした。
9.4 結果
OX86mIgG2aによるマウスの治療は、未治療又は陰性又はアイソタイプの対照抗体で治療されたマウス対照と比較してCT26及びMCA205の腫瘍細胞の成長の有意な低減をもたらす(表9−6、表9−7、及び表9−8;図26A、図27A及び図28A)。OX86mIgG2aによるマウスの治療は、未治療又はアイソタイプの対照抗体と比較して4T1腫瘍細胞の成長の遅延又は低減をもたらす(表9−9及び図29A)。
OX86mIgG2aによるマウスの治療は、未治療又は陰性又はアイソタイプの対照抗体で治療されたマウス対照と比較してCT26及びMCA205の腫瘍細胞の成長の有意な低減をもたらす(表9−6、表9−7、及び表9−8;図26A、図27A及び図28A)。OX86mIgG2aによるマウスの治療は、未治療又はアイソタイプの対照抗体と比較して4T1腫瘍細胞の成長の遅延又は低減をもたらす(表9−9及び図29A)。
同種同系モデルでは、多くの場合、混合反応が現れるが、OX86mIgG2aによる治療の劇的な反応は、個別の動物の腫瘍成長グラフからより明らかである(図26B、図27B、図28B及び図29B)。OX86mIgG2aにより治療されたマウスでは、TGIに基づいて(表9−6、表9−7、表9−8、及び表9−9;図26A、図27A、図28A及び図29A)、又は完全反応を呈する動物数の増加に基づいて(表9−6、表9−7、表9−8及び表9−9)、用量反応は観察されなかった。
9−5 結論
腫瘍を有するマウスにOX86mIgG2aにより単一作用剤治療を施すと、未治療、陰性、及び/又はアイソタイプの対照治療群と比較して、多発性腫瘍の成長を有意に低減する抗腫瘍活性がもたらされる。
腫瘍を有するマウスにOX86mIgG2aにより単一作用剤治療を施すと、未治療、陰性、及び/又はアイソタイプの対照治療群と比較して、多発性腫瘍の成長を有意に低減する抗腫瘍活性がもたらされる。
実施例10:OX40mAb24のエピトープの特徴付け
この実施例では、一連のヒト/マウスOX40キメラ変異体を用いてOX40mAb24のエピトープを調べる。
この実施例では、一連のヒト/マウスOX40キメラ変異体を用いてOX40mAb24のエピトープを調べる。
10.1 この試験で使用した材料及びそれらの供給元を表10−1に列挙する。
10.2 ヒト/マウスキメラ変異体の作製
OX40mAb24は、ヒトOX40(配列番号91)に特異的に結合し、アミノ酸(aa)配列が60%の同一性を共有するにもかかわらずマウスOX40(配列番号92)を認識しない(図30)。ヒトOX40とマウスOX40との間で細胞外ドメインの一部を交換するように工学操作してヒト/マウスキメラOX40変異体を作製した。オーバーラップ伸長PCRでヒト及びマウスOX40のcDNA構築物を鋳型として用いて、組換えタンパク質の細胞表面発現のために膜貫通ドメインを有するキメラ変異体を構築した。OX40は、3つの完全システインリッチドメイン(CRD)及び1つのトランケートシステインリッチドメインを有する約45kDaのタンパク質である。構造はTNFRスーパーファミリーに特有である。
OX40mAb24は、ヒトOX40(配列番号91)に特異的に結合し、アミノ酸(aa)配列が60%の同一性を共有するにもかかわらずマウスOX40(配列番号92)を認識しない(図30)。ヒトOX40とマウスOX40との間で細胞外ドメインの一部を交換するように工学操作してヒト/マウスキメラOX40変異体を作製した。オーバーラップ伸長PCRでヒト及びマウスOX40のcDNA構築物を鋳型として用いて、組換えタンパク質の細胞表面発現のために膜貫通ドメインを有するキメラ変異体を構築した。OX40は、3つの完全システインリッチドメイン(CRD)及び1つのトランケートシステインリッチドメインを有する約45kDaのタンパク質である。構造はTNFRスーパーファミリーに特有である。
ヒトOX40の細胞外ドメインの以下の残基を対応するマウスOX40のaa又はアラニンと置き換えることにより13種のキメラノックアウト(KO/機能喪失)変異体を構築した(図31):
・ ・CRD1(ヒトOX40 aa29〜65をマウスのカウンターパートで置き換えた)、
・ ・CRD2(ヒトOX40 aa66〜107をマウスのカウンターパートで置き換えた)、
・ ・CRD3(ヒトOX40 aa108〜146をマウスのカウンターパートで置き換えた)、
・ ・CRD4の+リンカー(ヒトOX40 aa147〜214をマウスのカウンターパートで置き換えた)、
・ ・CRD3+4(ヒトOX40 aa108〜167をマウスのカウンターパートで置き換えた)、
・ ・A111(ヒトOX40 aaアラニン111をマウスのカウンターパートのプロリンで置き換えた)、
・ ・L116(ヒトOX40 aaロイシン116をマウスのカウンターパートのグルタミンで置き換えた)、
・ ・P121(ヒトOX40 aaプロリン121をマウスのカウンターパートのロイシンで置き換えた)、
・ ・A126(ヒトOX40 aaアラニン126をマウスのカウンターパートのバリンで置き換えた)、
・ ・D137(ヒトOX40 aaアスパラギン酸137をマウスのカウンターパートのアスパラギンで置き換えた)、
・ ・A111P121D137(ヒトOX40 aa Ala111、Pro121、及びAsp137をマウスのカウンターパートで置き換えた)、
・ ・L116A126(ヒトOX40 aa Leu116及びAla126をマウスのカウンターパートで置き換えた)、
並びに
・ ・D117S118(ヒトOX40の aa Asp117及びSer118をAla突然変異で置き換えた)。
・ ・CRD1(ヒトOX40 aa29〜65をマウスのカウンターパートで置き換えた)、
・ ・CRD2(ヒトOX40 aa66〜107をマウスのカウンターパートで置き換えた)、
・ ・CRD3(ヒトOX40 aa108〜146をマウスのカウンターパートで置き換えた)、
・ ・CRD4の+リンカー(ヒトOX40 aa147〜214をマウスのカウンターパートで置き換えた)、
・ ・CRD3+4(ヒトOX40 aa108〜167をマウスのカウンターパートで置き換えた)、
・ ・A111(ヒトOX40 aaアラニン111をマウスのカウンターパートのプロリンで置き換えた)、
・ ・L116(ヒトOX40 aaロイシン116をマウスのカウンターパートのグルタミンで置き換えた)、
・ ・P121(ヒトOX40 aaプロリン121をマウスのカウンターパートのロイシンで置き換えた)、
・ ・A126(ヒトOX40 aaアラニン126をマウスのカウンターパートのバリンで置き換えた)、
・ ・D137(ヒトOX40 aaアスパラギン酸137をマウスのカウンターパートのアスパラギンで置き換えた)、
・ ・A111P121D137(ヒトOX40 aa Ala111、Pro121、及びAsp137をマウスのカウンターパートで置き換えた)、
・ ・L116A126(ヒトOX40 aa Leu116及びAla126をマウスのカウンターパートで置き換えた)、
並びに
・ ・D117S118(ヒトOX40の aa Asp117及びSer118をAla突然変異で置き換えた)。
そのほかに、KO構築物(図31)に対して以上に記載したのと同一の方法を用いてヒトOX40の以下の残基をマウスOX40内にグラフトすることにより5種のノックイン(KI/機能獲得)変異体を構築した:
・CRD3(ヒトOX40 aa108〜146を対応するマウス領域にグラフトした)、
・A111(ヒトOX40 aaアラニン111を対応するマウス位置にグラフトした)、
・L116(ヒトOX40 aaロイシン116を対応するマウス位置にグラフトした)、
・A126(ヒトOX40 aaアラニン126を対応するマウス位置にグラフトした)、
・L116A126(ヒトOX40 aaロイシン116及びアラニン126を対応するマウス位置にグラフトした)。
・CRD3(ヒトOX40 aa108〜146を対応するマウス領域にグラフトした)、
・A111(ヒトOX40 aaアラニン111を対応するマウス位置にグラフトした)、
・L116(ヒトOX40 aaロイシン116を対応するマウス位置にグラフトした)、
・A126(ヒトOX40 aaアラニン126を対応するマウス位置にグラフトした)、
・L116A126(ヒトOX40 aaロイシン116及びアラニン126を対応するマウス位置にグラフトした)。
得られたキメラDNAは、一過性哺乳動物発現用の哺乳動物発現ベクターpEBNA中に導入した。293F細胞は、0.7×106細胞/mLの密度でトランスフェクションの前日に接種した。製造業者の説明書に従って5μLの293fectinトランスフェクション試薬を用い3.5μgの発現ベクターを5mLのHEK293F細胞にトランスフェクトした。
10.3 キメラOX40変異体へのOX40mAb24の結合の特徴付け
トランスフェクションの48時間後、1μg/mLのOX40mAb24を含むPBS中、氷上でHEK293F細胞を1時間インキュベートした。結合されたOX40mAb24をフローサイトメトリーにより検出するために、細胞を冷PBSで3回洗浄し、1μg/mLのAlexa480コンジュゲート抗ヒトIgG抗体と共に氷上で1時間インキュベートし、次いでLSRIIフローサイトメーターを用いて解析した。
トランスフェクションの48時間後、1μg/mLのOX40mAb24を含むPBS中、氷上でHEK293F細胞を1時間インキュベートした。結合されたOX40mAb24をフローサイトメトリーにより検出するために、細胞を冷PBSで3回洗浄し、1μg/mLのAlexa480コンジュゲート抗ヒトIgG抗体と共に氷上で1時間インキュベートし、次いでLSRIIフローサイトメーターを用いて解析した。
すべてのキメラOX40変異体の発現レベルもフローサイトメトリーによりモニターした。PBS中でヒツジ抗ヒトOX40とヤギ抗マウスOX40ポリクローナル抗体との混合物と共に1μg/mLで細胞を氷上で1時間インキュベートした。細胞を冷PBSで3回洗浄し、次いでAlexa480コンジュゲート抗ヤギ及び抗ヒツジIgGポリクローナル抗体の混合物と共にインキュベートした。冷PBSで3回洗浄した後、細胞をLSRIIフローサイトメーターで解析した。
10.4 結果
キメラヒト/マウス変異体を用いてOX40mAb24のエピトープの特徴付けを行った。ヒトOX40及びマウスOX40は、aa配列が60%の同一性を共有する(図30)。とはいえ、OX40mAb24は、ヒトOX40に特異的に結合するがマウスOX40を認識しない。この特異性を利用してOX40mAb24のエピトープを同定した。マウスOX40の細胞外ドメインの様々なドメインをヒトOX40中に(KO/機能喪失変異体)又はヒトOX40の様々なドメインをマウスOX40中に(KI/機能獲得変異体)スワップイン又はスワップアウトすることにより18種のキメラ変異体を構築した(図31)。変異体はすべて、キメラタンパク質の細胞表面発現用の膜貫通ドメインをコードしていた。これらの変異体へのOX40mAb24の結合特性をフローサイトメトリーにより解析した。
キメラヒト/マウス変異体を用いてOX40mAb24のエピトープの特徴付けを行った。ヒトOX40及びマウスOX40は、aa配列が60%の同一性を共有する(図30)。とはいえ、OX40mAb24は、ヒトOX40に特異的に結合するがマウスOX40を認識しない。この特異性を利用してOX40mAb24のエピトープを同定した。マウスOX40の細胞外ドメインの様々なドメインをヒトOX40中に(KO/機能喪失変異体)又はヒトOX40の様々なドメインをマウスOX40中に(KI/機能獲得変異体)スワップイン又はスワップアウトすることにより18種のキメラ変異体を構築した(図31)。変異体はすべて、キメラタンパク質の細胞表面発現用の膜貫通ドメインをコードしていた。これらの変異体へのOX40mAb24の結合特性をフローサイトメトリーにより解析した。
ヒトOX40とマウスOX40との間で個別のドメインをスワッピングすることによりOX40mAb24のエピトープをヒトOX40のCRD3ドメインにマッピングした。ヒトCRD3ドメインをマウスのカウンターパートに置き換えた場合(KO_CRD3及びKO_CRD3−4)、ヒトOX40へのOX40mAb24の結合が消失した(図32A〜C)。他のヒトCRDドメインをマウス領域で置換えても、OX40mAb24の結合に影響しなかった(KO_CRD1、KO_CRD2、及びKO_CRD4+リンカー)。さらに、ヒトCRD3ドメインをマウスOX40中にグラフトしたところ、OX40mAb24の結合をもたらした(KI_CRD3)。抗ヒト及び抗マウスOX40ポリクローナル抗体によりモニターしたところ、すべての変異体が発現された(図32A〜C)。OX40mAb24の親mAb(9B12)も結合試験で特徴付けを行った。9B12は、これらの変異体に対してOX40mAb24と同一の結合プロファイルを示したことから、両方のIgGがCRD3ドメインの同一のエピトープを認識することが示唆される。
さらに、ヒト及びマウスのOX40間で異なるアミノ酸を突然変異することにより、きわめて重要なエピトープ残基Leu116及びAla126をCRD3ドメインで同定した。ヒトCRD3ドメインのAla111、Leu116、Pro121、Ala126、及びAsp137を含む5つのアミノ酸(図30)を個別のアミノ酸又は様々な組合せとして対応するマウス残基又はAlaに突然変異させた(図31)。ヒト残基Leu116及びAla126をマウスのカウンターパートに置き換えた場合(KO_L116+A126)、OX40mAb24の結合が消失した。さらに、KI/機能獲得変異体からこれらの2つのきわめて重要な残基の重要性が確認された。マウスOX40中へのLeu116、Ala126、又は組合せのグラフトは、OX40mAb24の結合をもたらした。
10.5 結論
きわめて重要な残基Leu116及びAla126を含めてヒト/マウスキメラ変異体を用いてエピトープOX40mAb24をヒトOX40のCRD3ドメインにマッピングした。OX40mAb24及びその親9B12との間ですべての変異体への結合プロファイルが同一であることから、それらはヒトOX40上の同一のエピトープを認識することが示唆される。
きわめて重要な残基Leu116及びAla126を含めてヒト/マウスキメラ変異体を用いてエピトープOX40mAb24をヒトOX40のCRD3ドメインにマッピングした。OX40mAb24及びその親9B12との間ですべての変異体への結合プロファイルが同一であることから、それらはヒトOX40上の同一のエピトープを認識することが示唆される。
実施例11:ナイーブマウス及び同系腫瘍を有するびマウスにおけるラット/マウス抗マウスOX40IgG2aキメラ抗体クローンOX86の薬力学的活性
OX86は、MOX40に特異的に結合してMOX40のシグナル伝達を惹起するラット抗mOX40IgG1抗体であり(al−Shamkhani et al,1996)、癌の免疫能のあるマウスモデルにおいて抗腫瘍活性を有する(Weinberg et al,2000)。OX40mAb24に類似した機能上の性質を有するマウスサロゲート抗体を用いてOX40アゴニズムの効果をより完全に調べるために、この実施例では実施例9に記載のラット/マウス抗mOX40IgG2aキメラ抗体OX86を利用する。しかしながら、種間でいくつかの類似点を導くことは可能である。例えば、mIgG2a及びヒトIgG1は、多くの場合、機能的に等価であるとみなされる。なぜなら、両方のアイソタイプが複数のFcγレセプターに結合可能であり、高親和性Fcγレセプター結合が可能であり、ADCCを惹起することが可能であり、しかも補体古典経路による補体依存性細胞傷害性(CDC)の前提条件であるヒトC1qへの結合を行うからである(Stewart et al.2014、Dall’Acqua et al,2006))。OX86mIGg2aはマウスOX40に結合するので(実施例9参照)、サロゲートマウスOX40アゴニスト抗体としてOX40mAb24に使用した。
OX86は、MOX40に特異的に結合してMOX40のシグナル伝達を惹起するラット抗mOX40IgG1抗体であり(al−Shamkhani et al,1996)、癌の免疫能のあるマウスモデルにおいて抗腫瘍活性を有する(Weinberg et al,2000)。OX40mAb24に類似した機能上の性質を有するマウスサロゲート抗体を用いてOX40アゴニズムの効果をより完全に調べるために、この実施例では実施例9に記載のラット/マウス抗mOX40IgG2aキメラ抗体OX86を利用する。しかしながら、種間でいくつかの類似点を導くことは可能である。例えば、mIgG2a及びヒトIgG1は、多くの場合、機能的に等価であるとみなされる。なぜなら、両方のアイソタイプが複数のFcγレセプターに結合可能であり、高親和性Fcγレセプター結合が可能であり、ADCCを惹起することが可能であり、しかも補体古典経路による補体依存性細胞傷害性(CDC)の前提条件であるヒトC1qへの結合を行うからである(Stewart et al.2014、Dall’Acqua et al,2006))。OX86mIGg2aはマウスOX40に結合するので(実施例9参照)、サロゲートマウスOX40アゴニスト抗体としてOX40mAb24に使用した。
この実施例では、ナイーブマウス及び腫瘍を有するマウスでT細胞を誘導するOX86mIgG2aの能力、細胞周期に入る能力、及び増殖する能力。さらに、OX40アゴニスト活性の可能性のあるバイオマーカーとしてK167とICOSを評価し、調べた。T細胞増殖活性及び抗腫瘍活性を癌の2つの同種同系マウスモデルで決定した。さらに最後に、OX86mIgG2aのin vivo活性で活性化(FcγレセプターI、III、及びIV)及び/又は阻害(CfγレセプターIIb)Fcγレセプターの果たす役割を決定した。
11.1 材料及び方法
11.1.1 動物の受領及び同定
6〜8週齢の野生型Fcgr2b−/−又はFcer1g−/−BALB/c、及びFcgr2b−/−又はFcer1g−/−C57BL/6マウスは、MedImmune from Harlan Laboratories,Inc.(Indianapolis,IN又はCharles River Laboratories(UK))で受領し、試験開始前に15日間以下で気候順化させた。その後、個別のマウスを同定するためにマウスにマイクロチップトランスポンダーを移植した。
11.1.1 動物の受領及び同定
6〜8週齢の野生型Fcgr2b−/−又はFcer1g−/−BALB/c、及びFcgr2b−/−又はFcer1g−/−C57BL/6マウスは、MedImmune from Harlan Laboratories,Inc.(Indianapolis,IN又はCharles River Laboratories(UK))で受領し、試験開始前に15日間以下で気候順化させた。その後、個別のマウスを同定するためにマウスにマイクロチップトランスポンダーを移植した。
11.1.2 飼育
動物は、Laboratory Animal Resources facility(USA)and Biological Sciences Unit(UK)at MedImmune,an Association for Animal Accreditation of Laboratory Animal Care及び米国農務省(United States Department of Agriculture)の許可を得た施設で、Institutional Animal Care and Use Committee(USA)and Home Office(UK)により認可されたプロトコルに従って、人道的に処置及び飼育された。動物は、無菌の寝具及び食品並びに不断給餌の酸性化飲料水(USA)又は上水(UK)を備えた無菌マイクロアイソレーターユニットに維持された。環境条件は標準化した(室温:20℃±1℃(USA)又は21℃±1℃(UK)、相対湿度:50%±10%(USA)又は55±10%(UK)、12時間の明暗周期)。動物は、有害な臨床徴候に関して毎日及び体重に関して隔週でモニターした。後肢麻痺、呼吸窮迫、20%体重損失、又は2000mm3超の腫瘍体積が認められた場合、動物は頸椎脱臼又はCO2窒息により人道的にただちに屠殺した。
動物は、Laboratory Animal Resources facility(USA)and Biological Sciences Unit(UK)at MedImmune,an Association for Animal Accreditation of Laboratory Animal Care及び米国農務省(United States Department of Agriculture)の許可を得た施設で、Institutional Animal Care and Use Committee(USA)and Home Office(UK)により認可されたプロトコルに従って、人道的に処置及び飼育された。動物は、無菌の寝具及び食品並びに不断給餌の酸性化飲料水(USA)又は上水(UK)を備えた無菌マイクロアイソレーターユニットに維持された。環境条件は標準化した(室温:20℃±1℃(USA)又は21℃±1℃(UK)、相対湿度:50%±10%(USA)又は55±10%(UK)、12時間の明暗周期)。動物は、有害な臨床徴候に関して毎日及び体重に関して隔週でモニターした。後肢麻痺、呼吸窮迫、20%体重損失、又は2000mm3超の腫瘍体積が認められた場合、動物は頸椎脱臼又はCO2窒息により人道的にただちに屠殺した。
11.1.3 同系腫瘍の確立
CT26細胞系(マウス結腸癌)はATCC,Manassas,VAから入手し、細胞系MCA205(化学誘導マウス軟組織肉腫)はProvidence Cancer Center,Portland,ORから入手した。両方の細胞系を37℃、5%CO2でRPMI1640培地+10%FBS中に維持した。
CT26細胞系(マウス結腸癌)はATCC,Manassas,VAから入手し、細胞系MCA205(化学誘導マウス軟組織肉腫)はProvidence Cancer Center,Portland,ORから入手した。両方の細胞系を37℃、5%CO2でRPMI1640培地+10%FBS中に維持した。
105CT26細胞の皮下(SC)注射を7〜9週齢の野生型Fcgr2b−/−又はFcer1g−/−BALB/cマウスの右側腹部に行って確立した。アロ移植はまた、0.1mLのPBS中に再懸濁された2.5×105MCA205細胞のSC注射を7〜9週齢の野生型Fcgr2b−/−又はFcer1g−/−C57BL/6マウスの右側腹部中に行って確立した。
11.1.4 ランダム化、群指定、及び用量レベル
この試験では野生型(n=70)、Fcgr2b−/−(n=36)、又はFcer1g−/−(n=36)BALB/c、及びFcgr2b−/−(n=36)又はFcer1g−/−C57BL/6雌マウス(n=36)を使用した。マウスはすべて、治療群にランダムに帰属した。群指定、動物数、用量レベル、及び投与スケジュールを表11−1、表11−2及び表11−3に示す。試験品及び対照品はすべて、腹腔内に投与した(IP)。動物の入替えはしなかった。
この試験では野生型(n=70)、Fcgr2b−/−(n=36)、又はFcer1g−/−(n=36)BALB/c、及びFcgr2b−/−(n=36)又はFcer1g−/−C57BL/6雌マウス(n=36)を使用した。マウスはすべて、治療群にランダムに帰属した。群指定、動物数、用量レベル、及び投与スケジュールを表11−1、表11−2及び表11−3に示す。試験品及び対照品はすべて、腹腔内に投与した(IP)。動物の入替えはしなかった。
腫瘍体積が約2000mm3に達した場合又は腫瘍が潰瘍化又は壊死した場合、各群の動物を屠殺した。
11.1.5 腫瘍の測定
腫瘍はカリパスにより週2回測定し、次式:
腫瘍体積(V)=[長さ(mm)×幅(mm)2]/2
を用いて腫瘍体積を計算した。式中、長さはより長い辺であり、幅は長さに垂直なより短い辺として定義した。
腫瘍はカリパスにより週2回測定し、次式:
腫瘍体積(V)=[長さ(mm)×幅(mm)2]/2
を用いて腫瘍体積を計算した。式中、長さはより長い辺であり、幅は長さに垂直なより短い辺として定義した。
各群の抗腫瘍効果は腫瘍成長阻害(TGI)として表現され、次のように計算した。
%TGI=(1−[治療群の平均腫瘍V]÷[対照群の平均腫瘍V]×100)
%TGI=(1−[治療群の平均腫瘍V]÷[対照群の平均腫瘍V]×100)
11.1.6 組織採取および単細胞の単離
11.1.6.1 フローサイトメトリー解析のためのマウス血液細胞の調製
赤血球溶解(RBCL)緩衝液(2mL)を血液(50μL)に添加し、5分間インキュベートした。インライフ採血から得られた体積は、20μL〜50μLの範囲内であった。最終採血は50μLであった。RPMI+10%ウシ胎仔血清(FBS)(8mL)を各サンプルに添加した。各サンプルの細胞をペレット化し(300×g、5min)次いで0.3mLのフロー緩衝液中で再懸濁させた。細胞懸濁液(200μL)を96ウェル丸底プレートの各ウェルに添加して蛍光抗体による染色に供した。非染色対照、単一抗体染色対照、アイソタイプ染色対照、及び蛍光マイナスオン(FMO)抗体染色対照に対して、プール群サンプルを使用した。
11.1.6.1 フローサイトメトリー解析のためのマウス血液細胞の調製
赤血球溶解(RBCL)緩衝液(2mL)を血液(50μL)に添加し、5分間インキュベートした。インライフ採血から得られた体積は、20μL〜50μLの範囲内であった。最終採血は50μLであった。RPMI+10%ウシ胎仔血清(FBS)(8mL)を各サンプルに添加した。各サンプルの細胞をペレット化し(300×g、5min)次いで0.3mLのフロー緩衝液中で再懸濁させた。細胞懸濁液(200μL)を96ウェル丸底プレートの各ウェルに添加して蛍光抗体による染色に供した。非染色対照、単一抗体染色対照、アイソタイプ染色対照、及び蛍光マイナスオン(FMO)抗体染色対照に対して、プール群サンプルを使用した。
11.1.6.2 マウス流入領域リンパ節及び脾臓の単離並びにフローサイトメトリー解析用の単細胞浮遊液の作製
脾臓を10mLのRPMI+1Pen/Strep溶液中に配置し、40μm細胞ストレーナーに通した。サンプルをペレット化し(300×g、5min)、次いで1mLのRBCL緩衝液中に3分間再懸濁させた。RPMI+FBS10%(9mL)を各サンプルに添加した。細胞懸濁液をペレット化し、1mLのフロー緩衝液中に再懸濁させた(300×g、5min)。細胞懸濁液(100μL)を96ウェル丸底プレートの各ウェルに添加し、蛍光抗体による染色に供した。プール基サンプルは使用された、非染色対照、単一抗体染色対照、アイソタイプ対照、及びFMO抗体染色対照に対して、プール群サンプルを使用した。
脾臓を10mLのRPMI+1Pen/Strep溶液中に配置し、40μm細胞ストレーナーに通した。サンプルをペレット化し(300×g、5min)、次いで1mLのRBCL緩衝液中に3分間再懸濁させた。RPMI+FBS10%(9mL)を各サンプルに添加した。細胞懸濁液をペレット化し、1mLのフロー緩衝液中に再懸濁させた(300×g、5min)。細胞懸濁液(100μL)を96ウェル丸底プレートの各ウェルに添加し、蛍光抗体による染色に供した。プール基サンプルは使用された、非染色対照、単一抗体染色対照、アイソタイプ対照、及びFMO抗体染色対照に対して、プール群サンプルを使用した。
11.1.6.3 フローサイトメトリー解析用のマウス腫瘍の単細胞浮遊液の調製
結合組織又は皮膚を採取しないように注意して安楽死マウスから無菌状態で腫瘍を摘出し、6ウェルディッシュ中のハンクス平衡塩溶液で希釈されたコラゲナーゼ中に配置した。酵素消化プロセスの効率を向上させるために、各腫瘍は、スカルペル又は小さな鋭いハサミを用いてより小さな小片にミンスした。ミンスされた腫瘍を15mLコニカルチューブ中に導入し、振盪プラットフォーム上に配置して37℃で20〜30分間インキュベートした。コラゲナーゼを脱活性化させて免疫細胞の生存能を維持するために5mLのRPMI+10%FBSを各サンプルに添加した。サンプルを70μM細胞ストレーナーに通して、50mLコニカルチューブ中に配置した。各サンプルのアリコートをカウントのために取り出した。残りのサンプルを330×gの遠心分離機でペレット化し、1×107細胞/mLの濃度でFACS緩衝液(PBS+2%FBS)中に再懸濁させた。
結合組織又は皮膚を採取しないように注意して安楽死マウスから無菌状態で腫瘍を摘出し、6ウェルディッシュ中のハンクス平衡塩溶液で希釈されたコラゲナーゼ中に配置した。酵素消化プロセスの効率を向上させるために、各腫瘍は、スカルペル又は小さな鋭いハサミを用いてより小さな小片にミンスした。ミンスされた腫瘍を15mLコニカルチューブ中に導入し、振盪プラットフォーム上に配置して37℃で20〜30分間インキュベートした。コラゲナーゼを脱活性化させて免疫細胞の生存能を維持するために5mLのRPMI+10%FBSを各サンプルに添加した。サンプルを70μM細胞ストレーナーに通して、50mLコニカルチューブ中に配置した。各サンプルのアリコートをカウントのために取り出した。残りのサンプルを330×gの遠心分離機でペレット化し、1×107細胞/mLの濃度でFACS緩衝液(PBS+2%FBS)中に再懸濁させた。
11.1.7 フローサイトメトリー解析
11.1.7.1 腫瘍のないマウス由来の組織の解析
血液又は脾臓細胞の単細胞浮遊液をペレット化し(300×g、5min)、50μLのFcブロック溶液(1:50)中に再懸濁させ、eBiosciences Flow Bufferで希釈し、氷上で10分間インキュベートした。50マイクロリットルの蛍光標識抗体(2×ストック溶液)を各サンプルに添加した(最終体積100μL)。単一抗体染色溶液(細胞外)を1μL/ウェルで添加し、細胞/抗体混合物を氷上で30分間インキュベートした。細胞をペレット化し(300×g、5min)、2回洗浄し(200μLフロー緩衝液/ウェル、300×g、5min)、50μLのFix/Penn緩衝液(3部の希釈液に対して1部の濃縮物)、次いで、4℃の暗所で一晩インキュベートした。
11.1.7.1 腫瘍のないマウス由来の組織の解析
血液又は脾臓細胞の単細胞浮遊液をペレット化し(300×g、5min)、50μLのFcブロック溶液(1:50)中に再懸濁させ、eBiosciences Flow Bufferで希釈し、氷上で10分間インキュベートした。50マイクロリットルの蛍光標識抗体(2×ストック溶液)を各サンプルに添加した(最終体積100μL)。単一抗体染色溶液(細胞外)を1μL/ウェルで添加し、細胞/抗体混合物を氷上で30分間インキュベートした。細胞をペレット化し(300×g、5min)、2回洗浄し(200μLフロー緩衝液/ウェル、300×g、5min)、50μLのFix/Penn緩衝液(3部の希釈液に対して1部の濃縮物)、次いで、4℃の暗所で一晩インキュベートした。
処理細胞を1×透過化緩衝液(水希釈)で2回洗浄した。細胞内標識抗体を透過化緩衝液(100μL/ウェル)中に希釈して細胞に添加し、次いで、暗所で室温で30分間インキュベートした。単一マーカー染色用の抗体(細胞内)を1μL/ウェルで細胞に添加して100μLの透過化緩衝液中に導入し、暗所で氷上で30分間インキュベートした。細胞を透過化緩衝液で1回洗浄し、3.7%のホルムアルデヒド溶液(100μL)中に再懸濁させ、その後、Canto IIフローサイトメーター(BD Biosciences,San Jose,CA)による解析に供した。
11.1.7.2 腫瘍を有するマウス由来の組織の解析
11.1.7.2.1 細胞表面染色
ペレット化細胞の各サンプルをFACS緩衝液中に再懸濁させた。FACS緩衝液中の蛍光抗体混合物を適切なウェルに添加し、4℃の暗所で20〜30分間インキュベートした。細胞をFACS緩衝液で2回洗浄し、FACS緩衝液中に再懸濁させ、LSRIIフローサイトメーター(BD Biosciences,San Jose,CA)で解析した。
11.1.7.2.1 細胞表面染色
ペレット化細胞の各サンプルをFACS緩衝液中に再懸濁させた。FACS緩衝液中の蛍光抗体混合物を適切なウェルに添加し、4℃の暗所で20〜30分間インキュベートした。細胞をFACS緩衝液で2回洗浄し、FACS緩衝液中に再懸濁させ、LSRIIフローサイトメーター(BD Biosciences,San Jose,CA)で解析した。
11.1.7.2.2 細胞内染色(固定及び透過化された細胞)
ペレット化細胞の各サンプルを、生存/非生存細胞の識別のための蛍光固定青色染料の50μLの1:500希釈液中に再懸濁させ、4℃の暗所で15分間インキュベートした。細胞をFACS緩衝液で1回洗浄し、Fcブロックを含有する30μLのPBS+4%正常マウス血清中に再懸濁させ、室温で15分間インキュベートした。FACS緩衝液中の蛍光抗体混合物を適切なウェルに添加し、4℃の暗所で20〜30分間インキュベートした。細胞をFACS緩衝液で2回洗浄し、新たに調製された150μLのFoxP3 Fix/Penn作用液中に再懸濁させ、暗所で室温で30分間インキュベートした。細胞を1×透過化緩衝液で2回洗浄し、抗体を含有する100μLの1×透過化緩衝液中に再懸濁させて細胞内抗原を染色し、暗所で室温で30分間インキュベートした。細胞を1×透過化緩衝液で1回洗浄し、FACS緩衝液中に再懸濁させ、LSRIIフローサイトメーターで解析した。
ペレット化細胞の各サンプルを、生存/非生存細胞の識別のための蛍光固定青色染料の50μLの1:500希釈液中に再懸濁させ、4℃の暗所で15分間インキュベートした。細胞をFACS緩衝液で1回洗浄し、Fcブロックを含有する30μLのPBS+4%正常マウス血清中に再懸濁させ、室温で15分間インキュベートした。FACS緩衝液中の蛍光抗体混合物を適切なウェルに添加し、4℃の暗所で20〜30分間インキュベートした。細胞をFACS緩衝液で2回洗浄し、新たに調製された150μLのFoxP3 Fix/Penn作用液中に再懸濁させ、暗所で室温で30分間インキュベートした。細胞を1×透過化緩衝液で2回洗浄し、抗体を含有する100μLの1×透過化緩衝液中に再懸濁させて細胞内抗原を染色し、暗所で室温で30分間インキュベートした。細胞を1×透過化緩衝液で1回洗浄し、FACS緩衝液中に再懸濁させ、LSRIIフローサイトメーターで解析した。
11.1.8 統計的方法
一元配置ANOVAを用いてKi67+又はICOS+細胞の平均腫瘍体積差及び平均パーセントを決定した。有意なF検定では、ダネット又はシダックの多重比較検定を利用した(適切な場合)。適用可能な場合、異分散性を考慮してlog10変換を施した。p値<0.05は有意であるとみなした。線形回帰分析にGraphPad Prism 6.0を利用することにより、XからYの最良予測が行われた最良当てはめ線、線の統計的有意水準、及び決定された最良当てはめ線の適合度(r2)を得た。
一元配置ANOVAを用いてKi67+又はICOS+細胞の平均腫瘍体積差及び平均パーセントを決定した。有意なF検定では、ダネット又はシダックの多重比較検定を利用した(適切な場合)。適用可能な場合、異分散性を考慮してlog10変換を施した。p値<0.05は有意であるとみなした。線形回帰分析にGraphPad Prism 6.0を利用することにより、XからYの最良予測が行われた最良当てはめ線、線の統計的有意水準、及び決定された最良当てはめ線の適合度(r2)を得た。
11.1.9 材料
この試験で使用した材料及びそれらの供給元を表11−4及び表11−5に列挙する。
この試験で使用した材料及びそれらの供給元を表11−4及び表11−5に列挙する。
11.2 結果
抗OX40抗体OX86マウスIgG2a(OX86 mIgG2a)でナイーブマウスの腹腔内治療を行ったところ、対照品で治療されたマウスと比較して、血中のKi67+CD4+及びICOS+CD4+T細胞のパーセントの有意な用量依存性且つ一過性の増加が経時的に得られた(図33A及びC)。Ki67+CD4+及びICOS+CD4+T細胞の最大パーセントは10日目に検出された。Ki67+CD4+及びICOS+CD4+T細胞のパーセントの有意な増加は、対照品で治療されたマウスと比較して、OX86mIgG2aの投与後の10日目のマウスの脾臓中で測定した(図33B及びD)。Ki67+CD4+T細胞のパーセントとICOS+CD4+T細胞のパーセントとの間の統計的に有意な強い相関は、10日目の血液及び脾臓は同定された(図34A及び34B)。
抗OX40抗体OX86マウスIgG2a(OX86 mIgG2a)でナイーブマウスの腹腔内治療を行ったところ、対照品で治療されたマウスと比較して、血中のKi67+CD4+及びICOS+CD4+T細胞のパーセントの有意な用量依存性且つ一過性の増加が経時的に得られた(図33A及びC)。Ki67+CD4+及びICOS+CD4+T細胞の最大パーセントは10日目に検出された。Ki67+CD4+及びICOS+CD4+T細胞のパーセントの有意な増加は、対照品で治療されたマウスと比較して、OX86mIgG2aの投与後の10日目のマウスの脾臓中で測定した(図33B及びD)。Ki67+CD4+T細胞のパーセントとICOS+CD4+T細胞のパーセントとの間の統計的に有意な強い相関は、10日目の血液及び脾臓は同定された(図34A及び34B)。
OX86mIgG2aによるナイーブマウスの治療でも、対照品で治療されたマウスと比較して、血中のKi67+CD8+T細胞のパーセントの有意且つ一過性の増加が経時的に得られた(図35A)。血中のICOS+CD8+T細胞のパーセントの経時的増加(図35C)及び0日目の脾臓中のKi67+CD8+T細胞のパーセント(図35B)は、OX86mIgG2aによる治療後に検出されたが、対照品による治療と比較して統計的に有意でなかった。OX86mIgG2aによるナイーブマウスの治療は、対照品で治療されたマウスと比較して、10日目の脾臓中のICOS+CD8+T細胞のパーセントの有意且つ用量依存性の増加を誘導した(図35D)。血中及び脾臓中のKi67+CD8+T細胞のパーセントとICOS+CD8+T細胞のパーセントとの間には中程度であるが有意な相関が見られた(図36A及び36B)。
OX86mIgG2aによる腫瘍を有する野生型マウスの単一作用剤治療は、未治療群及びアイソタイプ対照治療群と比較して2つの組織学的に異なる腫瘍の成長を低減する抗腫瘍活性をもたらした(実施例9参照)。OX86mIGg2aによる治療は、阻害FcγレセプターIIB(Fcgr2b−/−マウス)の発現が欠如するように遺伝子工学操作されたC57BL/6マウスにおける対照品による治療と比較して、20日目にMCA205腫瘍の成長の有意な低減をもたらした(図38A、表11−7)。CT26腫瘍を有するマウスの同等な治療は、Fcgr2b−/BALB/cマウスにおける対照品による治療と比較して腫瘍の成長の低減をもたらしたが18日目に統計的有意性に達しなかった(図37A、表11−6)。活性化Fcγレセプターの発現が欠如するように遺伝子工学操作された腫瘍を有するBalb/c及びC57BL/6マウスでは、いずれの作用剤による成長阻害も観察されなかった(Fcer1g−/−マウス、図37C、図38C)。混合反応は、多くの場合、同種同系モデルで観察される。しかしながら、Fcγレセプターノックアウトマウスの2つの異なる株のOX86mIgG2aによる治療後の抗腫瘍反応が、個別の動物腫瘍成長グラフから識別可能であり(図37B及びD、図38B及びD)、OX86mIgG2aによる治療は、CT26及びMCA205腫瘍成長の阻害をもたらし、いくつかの場合にはFcgr2b−/−マウスで完全反応を誘導した(図37B、図38B)。
並行薬力学試験では、対照品と比較されるOX86mIgG2aによる治療は、脾臓のKi67+CD4+T細胞(図39A)並びに末梢血及び脾臓のKi67+CD8+T細胞のパーセントの有意な増加を引き起こしたが、CT26腫瘍を有するFcgr2b−/−Balb/cマウスの腫瘍ではそうではなかった(図40A)。対照品と比較して、OX86mIgG2aによる治療後、CT26腫瘍を有するFcer1g−/−Balb/cマウスの血液、脾臓、又は腫瘍で、Ki67+CD4+又はCD8+T細胞の増加は検出されなかった(図39B、図40B)。
そのほかに、並行研究では、対照品と比較されるOX86mIgG2aによる治療は、MCA205腫瘍を有するFcgr2b−/−C57BL/6マウスの流入領域リンパ節、脾臓、及び腫瘍のKi67+CD4+T細胞(図41A)並びに流入領域リンパ節及び脾臓のKi67+CD8+T細胞(図42A)のパーセントの有意な増加を引き起こした。MCA205腫瘍を有するFcgr2b−/−C57BL/6マウスの腫瘍のKi67+CD8+T細胞のパーセントの増加は、統計的に有意でなかった(図42A)。対照品と比較されるOX86mIgG2aによる治療はまた、MCA205腫瘍を有するFcer1g−/−C57BL/6マウスの流入領域リンパ節及び脾臓のKi67+CD4+T細胞のパーセントの有意な増加を誘導した(図41B)。これらのマウスの脾臓のKi67+CD8+T細胞のパーセントの有意な増加も観察された(図42B)。MCA205腫瘍を有するFcgr2b−/−C57BL/6マウスの腫瘍のKi67+CD4+T細胞のパーセントの有意な増加検出されが(図42B)、流入領域リンパ節又は腫瘍のKi67+CD8+T細胞は検出されなかった(図42B)。
11.3 結論
ナイーブマウスにおける単回用量のOX86mIgG2aは、ICOS及びKi67の発現の増加により測定したとき、それぞれT細胞活性化及び増殖の一過性の増加を誘導した。CD4+及びCD8+T細胞上のICOS及びKi67のパーセントの有意な直線相関が見いだされた。CT26及びMCA205の腫瘍の成長の阻害として測定されるOX86mIgG2aの抗腫瘍活性は、阻害FcγレセプターIIBではなく活性化FcγレセプターI、III、及びIVの発現に依存した。活性化Fcγレセプターを発現する腫瘍を有するマウスにおける並行薬力学的実験では、末梢血、流入領域リンパ節、及び/又は脾臓のT細胞増殖の増加(Ki67)が観測され、阻害Fcγレセプターのみを発現するマウスにおいて、いくつかのT細胞増殖が観察された。理論により拘束されることを望むものではないが、ナイーブマウスからの薬力学的結果と合わせると、OX86mIgG2a抗腫瘍活性の可能性のある機構は、末梢及び腫瘍内のT細胞増殖(Ki67)である。さらに、OX86mIgG2aのin vivo抗腫瘍活性はFcγレセプターの活性化の発現時に生じる。
ナイーブマウスにおける単回用量のOX86mIgG2aは、ICOS及びKi67の発現の増加により測定したとき、それぞれT細胞活性化及び増殖の一過性の増加を誘導した。CD4+及びCD8+T細胞上のICOS及びKi67のパーセントの有意な直線相関が見いだされた。CT26及びMCA205の腫瘍の成長の阻害として測定されるOX86mIgG2aの抗腫瘍活性は、阻害FcγレセプターIIBではなく活性化FcγレセプターI、III、及びIVの発現に依存した。活性化Fcγレセプターを発現する腫瘍を有するマウスにおける並行薬力学的実験では、末梢血、流入領域リンパ節、及び/又は脾臓のT細胞増殖の増加(Ki67)が観測され、阻害Fcγレセプターのみを発現するマウスにおいて、いくつかのT細胞増殖が観察された。理論により拘束されることを望むものではないが、ナイーブマウスからの薬力学的結果と合わせると、OX86mIgG2a抗腫瘍活性の可能性のある機構は、末梢及び腫瘍内のT細胞増殖(Ki67)である。さらに、OX86mIgG2aのin vivo抗腫瘍活性はFcγレセプターの活性化の発現時に生じる。
実施例12:ヒト造血幹細胞が移植された免疫無防備マウスにおけるOX40mAb24療法に反応するT細胞薬力学的変化
この実施例では、再構成ヒト免疫系を有する免疫無防備マウスにおいてOX40mAb24がヒトCD4+及びCD8+記憶T細胞を活性化し増大し得るか又はヒトTregを低減し得るかを調べる。薬剤がヒトT細胞に対して免疫調節作用を有するか決定するために、ヒト免疫細胞で再構成されたin vivoマウスモデルシステムにおいてOX40mAb24を試験した。
この実施例では、再構成ヒト免疫系を有する免疫無防備マウスにおいてOX40mAb24がヒトCD4+及びCD8+記憶T細胞を活性化し増大し得るか又はヒトTregを低減し得るかを調べる。薬剤がヒトT細胞に対して免疫調節作用を有するか決定するために、ヒト免疫細胞で再構成されたin vivoマウスモデルシステムにおいてOX40mAb24を試験した。
12.1 材料及び方法
12.1.1 試験動物
Nod.Cg−PrkdcscidIl2rgtm1Wy/SzJ(NSG)マウス(n=14、23〜26週齢)をJackson Laboratoryから入手した。動物は、MedImmuneのLaboratory Animal Resourcesの施設、Association for Animal Accreditation of Laboratory Animal Care及びUnited States Department of Agricultureの許可を得た施設で、Instithtional Animal Care and Use Committeeにより認可されたプロトコルに従って、人道的に処置及び飼育された。動物は、無菌の寝具及び食品並びに不断給餌の酸性化飲料水を備えた無菌マイクロアイソレーターユニットに維持された。環境条件は標準化した(室温:20℃±1℃、相対湿度:50%±10%、12時間の明暗周期)。動物は、試験期間中、有害な臨床徴候に関して毎日モニターした。
12.1.1 試験動物
Nod.Cg−PrkdcscidIl2rgtm1Wy/SzJ(NSG)マウス(n=14、23〜26週齢)をJackson Laboratoryから入手した。動物は、MedImmuneのLaboratory Animal Resourcesの施設、Association for Animal Accreditation of Laboratory Animal Care及びUnited States Department of Agricultureの許可を得た施設で、Instithtional Animal Care and Use Committeeにより認可されたプロトコルに従って、人道的に処置及び飼育された。動物は、無菌の寝具及び食品並びに不断給餌の酸性化飲料水を備えた無菌マイクロアイソレーターユニットに維持された。環境条件は標準化した(室温:20℃±1℃、相対湿度:50%±10%、12時間の明暗周期)。動物は、試験期間中、有害な臨床徴候に関して毎日モニターした。
12.1.2 HSC移植(ヒト化)マウスにおけるOX40mAb24の薬力学
12.1.2.1 ヒトHSC移植マウスの確立
ヒトCD34+HSC移植マウスをJackson Laboratoryから入手した。次のようにマウスを作製した。複数の臍帯血ドナー由来のプールヒトCD34+細胞を単離し、Nod.Cg−Prkdcscid112rgtm1Wy/SzJ(NSG)マウスのテール静脈に静脈内注射した。移植の12週間後、マウス末梢血をサンプリングし、Pharm Lyse赤血球溶解緩衝液で溶解し、次いで、ヒトCD45、CD19、及びCD3陽性細胞に関してフローサイトメトリーにより解析し、マウスにおけるヒト免疫細胞移植の程度を決定した。続いて、全生存可能血液細胞のうち25%以上のCD45+ヒト免疫細胞がうまく移植されたマウスをMedImmuneに輸送した。
12.1.2.1 ヒトHSC移植マウスの確立
ヒトCD34+HSC移植マウスをJackson Laboratoryから入手した。次のようにマウスを作製した。複数の臍帯血ドナー由来のプールヒトCD34+細胞を単離し、Nod.Cg−Prkdcscid112rgtm1Wy/SzJ(NSG)マウスのテール静脈に静脈内注射した。移植の12週間後、マウス末梢血をサンプリングし、Pharm Lyse赤血球溶解緩衝液で溶解し、次いで、ヒトCD45、CD19、及びCD3陽性細胞に関してフローサイトメトリーにより解析し、マウスにおけるヒト免疫細胞移植の程度を決定した。続いて、全生存可能血液細胞のうち25%以上のCD45+ヒト免疫細胞がうまく移植されたマウスをMedImmuneに輸送した。
12.1.2.2 ヒトHSC移植マウスの抗原チャレンジ及びOX40mAb24治療 ヒトCD34細胞の注射の22週間後にフローサイトメトリーによりNSGマウスへのヒト免疫細胞の持続的移植を確認し、23週間後に未治療状態又は治療された状態の3群のマウスに分けた(表12−1)。実験開始の22週前に最終的治療群間のヒトCD45+細胞移植の平均パーセントに統計学的有意差はなかった。群1は4匹のマウスからなり、皮下(SC)キーホールリンペットヘモシニアン(KLH)免疫化も抗体投与も受けなかった。群2は5匹のマウスからなり、2つの独立した注射SC部位で300μg/50μLのKLH及び50μLの完全フロイントアジュバント(CFA)の投与を受けた。この群のマウスはまた、KLH免疫化の1日後、腹腔内(IP)に2mg/kgのhIgG1アイソタイプ対照抗体の投与を受けた。群3は5匹のマウスからなり、以上に記載のKLH/CFA SC免疫化を受けた。そのほかに、マウスはまた、1日後に単回IP用量の2mg/kgのOX40mAb24の投与を受けた。KLH/CFA SC免疫化の当日、免疫化前(治療前)、及び7日後(治療後)、眼窩後方採血により全血を取得し、細胞の免疫表現型を調べ、フローサイトメトリーによりカウントした。
12.1.2.3 フローサイトメトリーによる免疫細胞解析
全血抗体結合プロトコルを用いてフローサイトメトリーにより細胞の免疫表現型を調べた。簡潔に述べると、一定体積のEDTA抗凝固処理全血をディープウェルプレートのウェルに添加し、T細胞染色マスターミックスを細胞に添加して細胞表面抗原に結合させた。FACS緩衝液(PBS、pH7.2+2%熱不活性化新生仔ウシ血清)で洗浄した後、1×RBC溶解緩衝液を用いて赤血球(RBC)を溶解し、EBiosciences Fix及びPerm kitを用いて製造業者のプロトコルに従って細胞の固定及び透過化を行った。続いて、抗FoxP3mAb及び抗Ki67mAbを細胞に結合させた。1×固定及び透過化緩衝液を用いて細胞を洗浄し、FACS緩衝液中に再懸濁させ、LSRIIフローサイトメーターを用いてイベントを解析した。生のフローサイトメトリー標準(FCS)データはFlowJoソフトウェアを用いて解析され、且つ細胞集団が、生存/死亡細胞の識別、及び二重線と細胞デブリの除去後に同定された。CD4+及びCD8+T細胞集団をゲート処理した後、CD45RA及びCCR7発現プロファイルにより記憶T細胞を決定した。ナイーブT細胞はCD45RA+/CCR7+として、エフェクターT細胞(Teff)はCD45RA+/CCR7−として、エフェクター記憶T細胞(Tem)はCD4SRA−/CCR7−として、及び中枢記憶T細胞(Tcm)はCD45RA−/CCR7+として定義した。TregはCD4+/FoxP3+細胞として定義した。
全血抗体結合プロトコルを用いてフローサイトメトリーにより細胞の免疫表現型を調べた。簡潔に述べると、一定体積のEDTA抗凝固処理全血をディープウェルプレートのウェルに添加し、T細胞染色マスターミックスを細胞に添加して細胞表面抗原に結合させた。FACS緩衝液(PBS、pH7.2+2%熱不活性化新生仔ウシ血清)で洗浄した後、1×RBC溶解緩衝液を用いて赤血球(RBC)を溶解し、EBiosciences Fix及びPerm kitを用いて製造業者のプロトコルに従って細胞の固定及び透過化を行った。続いて、抗FoxP3mAb及び抗Ki67mAbを細胞に結合させた。1×固定及び透過化緩衝液を用いて細胞を洗浄し、FACS緩衝液中に再懸濁させ、LSRIIフローサイトメーターを用いてイベントを解析した。生のフローサイトメトリー標準(FCS)データはFlowJoソフトウェアを用いて解析され、且つ細胞集団が、生存/死亡細胞の識別、及び二重線と細胞デブリの除去後に同定された。CD4+及びCD8+T細胞集団をゲート処理した後、CD45RA及びCCR7発現プロファイルにより記憶T細胞を決定した。ナイーブT細胞はCD45RA+/CCR7+として、エフェクターT細胞(Teff)はCD45RA+/CCR7−として、エフェクター記憶T細胞(Tem)はCD4SRA−/CCR7−として、及び中枢記憶T細胞(Tcm)はCD45RA−/CCR7+として定義した。TregはCD4+/FoxP3+細胞として定義した。
12.1.2.4 統計的方法
データのグラフ化及び統計解析のためにWindows用GraphPad Prismソフトウェア(バージョン6.03)を使用した。
データのグラフ化及び統計解析のためにWindows用GraphPad Prismソフトウェア(バージョン6.03)を使用した。
テューキーの検定後解析を用いた一元配置ANOVA多重比較を用いて実験群平均間の差を比較した。有意F検定では、シダックの多重比較を利用した。0.05未満のp値は有意であるとみなした。
12.1.3 材料
この試験で使用した材料及びそれらの供給元を表12−2に列挙する。
この試験で使用した材料及びそれらの供給元を表12−2に列挙する。
12.2 結果
KLHによる免疫化の1日後にOX40mAb24又はhuIgG1対照抗体を投与した。OX40mAb24は、huIgG1アイソタイプ対照抗体が投与された群と比較して6日間後の末梢血中のTregのパーセントの統計的に有意な低減にもたらした(p=0.019、一元配置ANOVA、図43A及び43B)。治療群間のTregのパーセントの差は免疫化及び抗体投与の前に観察されなかった。
KLHによる免疫化の1日後にOX40mAb24又はhuIgG1対照抗体を投与した。OX40mAb24は、huIgG1アイソタイプ対照抗体が投与された群と比較して6日間後の末梢血中のTregのパーセントの統計的に有意な低減にもたらした(p=0.019、一元配置ANOVA、図43A及び43B)。治療群間のTregのパーセントの差は免疫化及び抗体投与の前に観察されなかった。
末梢血Tregのパーセントの有意な減少のほかに、huIgG1アイソタイプマッチ対照と比較してOX40mAb24による治療後にCD4+Tem:Treg比に統計的に有意な増加が見られ(p=0.042)、且つ全CD4+:Treg比(p=0.051)、CD4+Teff:Treg比(p=0.10)、及びCD4+Tem:Treg比(p=0.069)が有意な増加傾向を示した(図44A〜D)。同様に、huIgG1アイソタイプ対照で治療されたマウスと比較して、有意性への傾向はOX40mAb24で治療されたマウスの末梢血でCD8+Teff:Treg比の有意な増加傾向(p=0.064)が観察された(図45A〜B)。
活性化後にCD25(IL−2レセプター)がT細胞上でアップレギュレートされたことから、活性化されたばかりのT細胞のマーカーであると考えられる。huIgG1治療群と比較してOX40mAb24治療群でCD25陽性CD8+T細胞のパーセントの増加が、全CD8+T細胞(p=0.038)、エフェクターCD8+T細胞(p=0.076)、及びエフェクターメモリーCD8+T細胞(p=0.040)として観察され(図46A〜C)。従って、OX40mAb24によるOX40のアゴニズムにより対照抗体と比較して活性化CD8+T細胞が活性化された。
12.3 結論
ヒト免疫細胞が移植されたマウスでは、抗原免疫化後のOX40mAb24による治療は、ヒトIgG1対照抗体の投与を受けたマウスと比較して末梢Treg細胞の減少をもたらした。同様に、Treg細胞に対する全エフェクター・記憶CD4+T細胞の比及びエフェクターCD8+T細胞の比もまた、huIgG1対照抗体の投与を受けたものと比較して、OX40mAb24の投与を受けたマウスの末梢血で増加した。最後に、細胞表面上にCD25を発現するCD8+T細胞のパーセントがOX40mAb24治療後に増加したことから、末梢CD8+T細胞活性化のOX40誘発が示唆される。
ヒト免疫細胞が移植されたマウスでは、抗原免疫化後のOX40mAb24による治療は、ヒトIgG1対照抗体の投与を受けたマウスと比較して末梢Treg細胞の減少をもたらした。同様に、Treg細胞に対する全エフェクター・記憶CD4+T細胞の比及びエフェクターCD8+T細胞の比もまた、huIgG1対照抗体の投与を受けたものと比較して、OX40mAb24の投与を受けたマウスの末梢血で増加した。最後に、細胞表面上にCD25を発現するCD8+T細胞のパーセントがOX40mAb24治療後に増加したことから、末梢CD8+T細胞活性化のOX40誘発が示唆される。
Claims (70)
- ヒト化重鎖可変領域(VH)とヒト化軽鎖可変領域(VL)とを含む抗体又はその抗原結合断片であって、
前記VHが、式:
HFW1−HCDR1−HFW2−HCDR2−HFW3−HCDR3−HFW4
(式中、HFW1は配列番号6又は配列番号7であり、HCDR1は配列番号8であり、HFW2は配列番号9であり、HCDR2は配列番号14、配列番号15又は配列番号16であり、HFW3は配列番号17であり、HCDR3は配列番号25、配列番号26、又は配列番号27であり、及びHFW4は配列番号28である)を有するアミノ酸配列を含み、
前記VLがアミノ酸配列、配列番号29又は配列番号32を含み、及び
ヒトOX40に特異的に結合することができる抗体又はその断片。 - 前記HFW2のアミノ酸配列が、配列番号10、配列番号11、配列番号12、又は配列番号13である、請求項1に記載の抗体又はその断片。
- 前記HFW3のアミノ酸配列が、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、又は配列番号24である、請求項1又は2に記載の抗体又はその断片。
- 前記VHがアミノ酸配列、配列番号33、配列番号35、配列番号37、配列番号39、配列番号41、配列番号43、配列番号45、配列番号47、配列番号49、配列番号51、配列番号53、配列番号55、配列番号57、配列番号59、配列番号61、配列番号63、配列番号65、又は配列番号67を含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載の抗体又はその断片。
- 前記VLがアミノ酸配列、配列番号29を含み、且つ前記VHがアミノ酸配列、配列番号59を含む、請求項1〜4のいずれか一項に記載の抗体又はその断片。
- 前記VLのC末端に融合した軽鎖定常領域又はその断片を更に含む、請求項1〜5のいずれか一項に記載の抗体又はその断片。
- 前記軽鎖定常領域がヒトκ定常領域である、請求項6に記載の抗体又はその断片。
- 前記VHのC末端に融合した重鎖定常領域又はその断片を更に含む、請求項1〜7のいずれか一項に記載の抗体又はその断片。
- 前記重鎖定常領域が、ヒトIgG1定常領域、ヒトIgG4P定常領域、ヒトIgG1TM定常領域又はマウスIgG1定常領域である、請求項8に記載の抗体又はその断片。
- 前記重鎖定常領域がヒトIgG1定常領域である、請求項9に記載の抗体又はその断片。
- 重鎖アミノ酸配列、配列番号71及び軽鎖アミノ酸配列、配列番号30を含む、請求項1〜10のいずれか一項に記載の抗体又はその断片。
- 前記抗原結合断片が、Fv断片、Fab断片、F(ab’)2断片、Fab’断片、dsFv断片、scFv断片、又はsc(Fv)2断片、又はこれらの任意の組み合わせである、請求項1〜11のいずれか一項に記載の抗体又は断片。
- カニクイザル、又はアカゲザルOX40に特異的に結合することができる、請求項1〜12のいずれか一項に記載の抗体又はその断片。
- ヒト、カニクイザル、アカゲザル、又はこれらの任意の組み合わせ由来のジャーカット細胞、初代活性化CD4+又はCD8+T細胞上に発現するとおりのOX40に特異的に結合することができる、請求項13に記載の抗体又はその断片。
- マウス又はラットOX40に結合しない、請求項1〜14のいずれか一項に記載の抗体又はその断片。
- 関連する腫瘍壊死因子レセプタースーパーファミリー(TNFRSF)タンパク質と交差反応しない、請求項1〜15のいずれか一項に記載の抗体又はその断片。
- 初代活性化ヒトCD4+T細胞上に発現するヒトOX40に対する結合親和性が、フローサイトメトリーによって計測するとき約250pM〜約370pMである、請求項14に記載の抗体又はその断片。
- 前記結合親和性が約312pMである、請求項17に記載の抗体又はその断片。
- フローサイトメトリーによって計測するとき、初代活性化ヒトCD4+T細胞に対する20%レセプター占有率(EC20)を約63〜約93pMで、初代活性化ヒトCD4+T細胞に対する50%レセプター占有率(EC50)を約250〜約370pMで、及び初代活性化ヒトCD4+T細胞に対する90%レセプター占有率(EC90)を約2290〜約3330pMで実現することができる、請求項17又は18に記載の抗体又はその断片。
- EC20が約78pMであり、EC50が約312pMであり、及びEC90が約2810pMである、請求項19に記載の抗体又はその断片。
- OX40過剰発現ジャーカット細胞上に発現するヒトOX40に対する結合親和性が、フローサイトメトリーによって計測するとき約250pM〜約600pMである、請求項14に記載の抗体又はその断片。
- 前記結合親和性が約424pMである、請求項21に記載の抗体又はその断片。
- フローサイトメトリーによって計測するとき、OX40過剰発現ジャーカット細胞に対するEC20を約60〜約150pMで、OX40過剰発現ジャーカット細胞に対するEC50を約250〜約600pMで、及びOX40過剰発現ジャーカット細胞に対するEC90を約2260〜約4380pMで実現することができる、請求項21又は22に記載の抗体又はその断片。
- EC20が約106pMであり、EC50が約424pMであり、及びEC90が約3820pMである、請求項23に記載の抗体又はその断片。
- 初代活性化カニクイザルCD4+T細胞上に発現するカニクイザルOX40に対する結合親和性が、フローサイトメトリーによって計測するとき約340pM〜約820pMである、請求項14に記載の抗体又はその断片。
- 前記結合親和性が約580pMである、請求項25に記載の抗体又はその断片。
- 初代活性化アカゲザルCD4+T細胞上に発現するアカゲザルOX40に対する結合親和性が、フローサイトメトリーによって計測するとき約130pM〜約600pMである、請求項14に記載の抗体又はその断片。
- 前記結合親和性が約370pMである、請求項27に記載の抗体又はその断片。
- プレートベースのアッセイにおいて活性化CD4+T細胞の用量依存的増殖及び初代活性化ヒトCD4+T細胞における用量依存的サイトカイン放出を誘導することができる、請求項1〜28のいずれか一項に記載の抗体又はその断片。
- 全てフローサイトメトリーによって計測するとき、20%最大増殖応答(EC20)を初代活性化ヒトCD4+T細胞において約14pM〜約28pMの抗体濃度で実現することができ、50%最大増殖応答(EC50)を初代活性化ヒトCD4+T細胞において約0.3pM〜約130pMの抗体濃度で実現することができ、及び90%最大増殖応答(EC90)を初代活性化ヒトCD4+T細胞において約50pM〜約90pMの抗体濃度で実現することができる、請求項29に記載の抗体又はその断片。
- EC20が約21pMであり、EC50が約28pMであり、及びEC90が約72pMである、請求項30に記載の抗体又はその断片。
- 前記サイトカインが、IFNγ、TNFα、IL−5、IL−10、IL−2、IL−4、IL−13、IL−8、IL−12 p70、IL−1β、又はこれらの任意の組み合わせである、請求項29〜31のいずれか一項に記載の抗体又はその断片。
- 前記サイトカインが、IFNγ、TNFα、IL−5、IL−10、IL−13、又はこれらの任意の組み合わせである、請求項32に記載の抗体又はその断片。
- 初代活性化カニクイザルCD4+T細胞及び初代活性化アカゲザルCD4+T細胞においてCD4+T細胞増殖及びサイトカイン放出を実現することができる、請求項1〜28のいずれか一項に記載の抗体又はその断片。
- FcγR発現細胞の存在下でOX40発現T細胞のNFκB経路を活性化させることができる、請求項1〜34のいずれか一項に記載の抗体又はその断片。
- 前記OX40発現T細胞が、NFκBシグナル伝達経路の刺激に応答してルシフェラーゼを産生するOX40発現ジャーカットNFκB−ルシフェラーゼレポーター細胞である、請求項35に記載の抗体又はその断片。
- OX40発現細胞に対する補体依存性又は抗体依存性細胞傷害を惹起することができる、請求項1〜36のいずれか一項に記載の抗体又はその断片。
- C1qに結合して、前記OX40発現細胞に対するNK媒介性抗体依存性細胞傷害を惹起することができる、請求項37に記載の抗体又はその断片。
- 癌治療を必要としている対象に有効用量を投与すると、前記対象の腫瘍成長を阻害することができる、請求項1〜38のいずれか一項に記載の抗体又はその断片。
- 前記腫瘍成長阻害がT細胞の存在下で実現する、請求項39に記載の抗体又はその断片。
- アイソタイプ対応対照抗体又はその断片の投与と比較して、腫瘍成長が少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、又は少なくとも70%阻害される、請求項39又は40に記載の抗体又はその断片。
- 請求項1〜41のいずれか一項に記載の抗体又はその断片と担体とを含む組成物。
- 請求項1〜41のいずれか一項に記載の抗体又はその断片、又は請求項1〜41のいずれか一項に記載の抗体又はその断片のポリペプチドサブユニットをコードする核酸を含むポリヌクレオチド。
- 配列番号60の核酸、配列番号31の核酸、配列番号72の核酸、又はこれらの任意の組み合わせを含む、請求項43に記載のポリヌクレオチド。
- 請求項43又は請求項44に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
- 請求項43又は請求項44に記載のポリヌクレオチド又は請求項45に記載のベクターを含む宿主細胞。
- 抗体又はその断片の作製方法であって、前記ポリヌクレオチドによってコードされる前記抗体又はその断片が発現する条件下で請求項46に記載の宿主細胞を培養するステップと、前記抗体又はその断片を回収するステップとを含む方法。
- 活性化T細胞の生存又は増殖を促進する方法であって、請求項1〜41のいずれか一項に記載の抗体又はその断片を活性化T細胞と接触させるステップを含み、前記抗体又はその断片が前記T細胞の表面上のOX40に特異的に結合することができる、方法。
- 活性化T細胞からのサイトカイン放出を誘導する方法であって、請求項1〜41のいずれか一項に記載の抗体又はその断片を活性化T細胞と接触させるステップを含み、前記抗体又はその断片が前記T細胞の表面上のOX40に特異的に結合することができる、方法。
- 前記サイトカインが、IFNγ、TNFα、IL−5、IL−10、IL−2、IL−4、IL−13、IL−8、IL−12 p70、IL−1β、又はこれらの任意の組み合わせである、請求項49に記載の方法。
- 前記サイトカインが、IFNγ、TNFα、IL−5、IL−10、IL−13、又はこれらの任意の組み合わせである、請求項50に記載の方法。
- 前記活性化T細胞が、活性化CD4+T細胞、活性化CD8+T細胞、又はこれらの組み合わせである、請求項48〜51のいずれか一項に記載の方法。
- 前記活性化CD4+T細胞が、ヒトCD4+T細胞、カニクイザルCD4+T細胞、アカゲザルCD4+T細胞、又はこれらの組み合わせである、請求項52に記載の方法。
- T細胞活性化を促進する方法であって、請求項1〜41のいずれか一項に記載の抗体又はその断片をT細胞と接触させるステップを含み、前記抗体又はその断片が前記T細胞の表面上のOX40に特異的に結合することができる、方法。
- NFκBシグナル伝達経路の刺激によってT細胞活性化を計測することができる、請求項54に記載の方法。
- 前記T細胞が、活性化CD4+T細胞、活性化CD8+T細胞、又はこれらの組み合わせである、請求項54又は55に記載の方法。
- 前記活性化CD4+T細胞が、ヒトCD4+T細胞、カニクイザルCD4+T細胞、アカゲザルCD4+T細胞、又はこれらの組み合わせである、請求項56に記載の方法。
- 前記接触させるステップが、対象に前記抗体又はその断片の有効量を投与するステップを含む、請求項54〜57のいずれか一項に記載の方法。
- 対象の癌を治療する方法であって、治療を必要としている対象に、請求項1〜41のいずれか一項に記載の抗体若しくはその断片又は請求項42に記載の組成物の有効量を投与するステップを含む方法。
- 前記癌が固形腫瘍である、請求項59に記載の方法。
- 前記抗体若しくはその断片又は組成物の投与により腫瘍成長を阻害することができるか、腫瘍縮小を促進することができるか、又は両方である、請求項59又は60に記載の方法。
- 腫瘍成長阻害がT細胞の存在下で実現する、請求項61に記載の方法。
- 対象の免疫応答を増強する方法であって、それを必要としている対象に、請求項1〜41のいずれか一項に記載の抗体若しくはその断片、又は請求項42に記載の組成物の治療有効量を投与するステップを含む方法。
- 前記対象がヒト対象である、請求項59〜63のいずれか一項に記載の方法。
- 配列番号91のアミノ酸108〜146の範囲内にあるヒトOX40のエピトープに結合する、請求項1〜41のいずれか一項に記載の抗体又はその断片。
- 前記エピトープが少なくとも配列番号91のアミノ酸ロイシン116及びアラニン126を含む、請求項65に記載の抗体又はその断片。
- Q113L突然変異及びV124A突然変異を除いて配列番号92を含むマウスOX40変異体に結合する、請求項1〜41のいずれか一項に記載の抗体。
- 100アミノ酸以下からなる単離ペプチドであって、請求項1〜41のいずれか一項に記載の抗体又はその断片が特異的に結合することのできるペプチド。
- 配列番号91のアミノ酸116〜126を含む、請求項68に記載のペプチド。
- L116及びA126を除く任意の位置における1、2、3、4、5、又は6個の単一アミノ酸置換、欠失、又は挿入を除いて配列番号91のアミノ酸108〜146を含む、請求項68又は69に記載のペプチド。
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