JP2021019550A - Prove for detecting human braf v600 mutation and method for detecting v600 mutation in human braf - Google Patents

Prove for detecting human braf v600 mutation and method for detecting v600 mutation in human braf Download PDF

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Abstract

To provide a probe for detecting a BRAF gene mutation, which can detect V600 mutations including V600E mutations in a melting curve analyzing method but does not show cross-reactivity with K601E mutations.SOLUTION: A probe for detecting a V600 mutation in human BRAF comprises a specific base sequence in which adenine located at position 19 from the 5' end is replaced with a base that is not complementary to cytosine or thymine; and cytosine at the 3'end is a fluorescently labeled oligonucleotide that is labeled with a fluorescent dye.SELECTED DRAWING: Figure 1

Description

本開示は、ヒトＢＲＡＦのＶ６００変異検出用プローブ及びヒトＢＲＡＦのＶ６００変異の検出方法に関する。 The present disclosure relates to a probe for detecting V600 mutations in human BRAF and a method for detecting V600 mutations in human BRAF.

ＢＲＡＦ（ｖ−ｒａｆ ｍｕｒｉｎｅ ｓａｒｃｏｍａ ｖｉｒａｌ ｏｎｃｏｇｅｎｅ ｈｏｍｏｌｏｇ Ｂ１）遺伝子は、肺癌の重要なドライバー遺伝子である。このＢＲＡＦ遺伝子変異は肺癌のみならず悪性黒色腫や大腸癌など様々な悪性腫瘍で起こることが知られている。これらの悪性腫瘍においては、ＢＲＡＦ遺伝子に様々な変異が生じることが知られており、主なものとして、たとえば、コドン６００のバリンに生ずる変異（Ｖ６００変異）が挙げられる。Ｖ６００変異には、バリンが、グルタミン酸に置換されるＶ６００Ｅ変異、リジンに置換されるＶ６００Ｋ変異、アルギニンに置換されるＶ６００Ｒ変異、アスパラギン酸に置換されるＶ６００Ｄ変異などがある。 The BRAF (v-raf sarcoma sarcoma viral oncogene homolog B1) gene is an important driver gene for lung cancer. It is known that this BRAF gene mutation occurs not only in lung cancer but also in various malignant tumors such as malignant melanoma and colorectal cancer. It is known that various mutations occur in the BRAF gene in these malignant tumors, and the main ones include, for example, mutations in valine at codon 600 (V600 mutation). V600 mutations include V600E mutations in which valine is replaced with glutamic acid, V600K mutations in which lysine is replaced, V600R mutations in which arginine is replaced, and V600D mutations in which valine is replaced with aspartic acid.

特に、Ｖ６００変異が生じている悪性黒色腫や肺癌には治療効果の高い分子標的薬がある。したがって、このような分子標的薬の適用の可否を判断するためにも、ＢＲＡＦ遺伝子のＶ６００変異を検出する必要があり、様々な測定技術が実用化されている。たとえば、下記非特許文献１に挙げられているように、ダイレクトシークエンス法、アリル特異的ＰＣＲ法及び次世代シークエンス（ＮＧＳ）法がＶ６００変異検出に利用されている。 In particular, there are molecular-targeted drugs having a high therapeutic effect on malignant melanoma and lung cancer in which the V600 mutation has occurred. Therefore, in order to determine the applicability of such a molecular-targeted drug, it is necessary to detect the V600 mutation of the BRAF gene, and various measurement techniques have been put into practical use. For example, as listed in Non-Patent Document 1 below, a direct sequence method, an allyl-specific PCR method, and a next-generation sequence (NGS) method are used for V600 mutation detection.

ダイレクトシークエンス法は測定対象の塩基配列を決定することが可能な方法で、Ｖ６００Ｅ変異以外のＶ６００変異を検出することができるが、検出感度が低いことが問題である。 The direct sequence method is a method capable of determining the base sequence to be measured, and can detect V600 mutations other than the V600E mutation, but has a problem of low detection sensitivity.

アリル特異的ＰＣＲ法は検出したい変異型アリルに特異的なプライマーを利用して変異配列の増幅の有無を確認する方法であり、検出感度は高いが検出可能な変異の種類が少ないことが問題である。たとえば、下記特許文献１及び２ではＰＣＲ法にてＶ６００Ｅ変異の検出が試みられている。 The allyl-specific PCR method is a method for confirming the presence or absence of amplification of a mutant sequence using a primer specific to the mutant allyl to be detected, and has a problem that the detection sensitivity is high but the number of detectable mutations is small. is there. For example, in Patent Documents 1 and 2 below, detection of V600E mutation is attempted by the PCR method.

次世代シーケンス法はダイレクトシーケンス法と同様に測定対象の塩基配列を決定することが可能な方法で、Ｖ６００Ｅ変異以外のＶ６００変異も検出でき検出感度も高いが、高価な装置が必要で操作も非常に煩雑であることが問題である。 The next-generation sequencing method is a method that can determine the base sequence to be measured in the same way as the direct sequencing method. It can detect V600 mutations other than V600E mutations and has high detection sensitivity, but it requires an expensive device and is very difficult to operate. The problem is that it is complicated.

ＣＮ １０８２７７２６３ ＡCN 108277263 A ＣＮ １０４６１１４０６ ＡCN 104611406 A

日本肺癌学会 バイオマーカー委員会「肺癌患者におけるＢＲＡＦ遺伝子変異検査の手引き」第１．０版、https://www.haigan.gr.jp/uploads/files/photos/1620.pdf、２０１８年４月５日Japan Lung Cancer Society Biomarker Committee "Guide for BRAF Gene Mutation Testing in Lung Cancer Patients" 1.0th Edition, https://www.haigan.gr.jp/uploads/files/photos/1620.pdf, April 2018 5th

Ｖ６００Ｅ変異以外のＶ６００変異を感度よく簡便に検出可能な技術として融解曲線解析法が挙げられる。融解曲線解析法は二本鎖ＤＮＡの解離温度の違いを利用して変異を検出する方法である。融解曲線解析法は検出感度が良好で操作も簡便であり、変異検出に利用する核酸プローブの配列を野生型配列と完全一致するように設計することでＶ６００Ｅ変異だけでなくＶ６００Ｅ変異以外のＶ６００変異も検出可能となる。 A melting curve analysis method can be mentioned as a technique capable of detecting V600 mutations other than the V600E mutation with high sensitivity and convenience. The melting curve analysis method is a method for detecting mutations by utilizing the difference in dissociation temperature of double-stranded DNA. The melting curve analysis method has good detection sensitivity and is easy to operate, and by designing the sequence of the nucleic acid probe used for mutation detection to completely match the wild-type sequence, not only the V600E mutation but also the V600 mutation other than the V600E mutation Can also be detected.

しかしながら、核酸プローブの配列を野生型配列と完全一致するように設計すると、測定対象にＶ６００変異以外の変異が存在した場合、交差反応による偽陽性を示すおそれがある。特に、肺癌を対象としたＢＲＡＦ遺伝子変異検出の場合、Ｖ６００変異以外の変異でＶ６００の近傍に位置するＫ６０１Ｅ変異（コドン６０１のリジンがグルタミン酸に置換）は頻度も高く、Ｖ６００変異との交差反応が問題となる。 However, if the sequence of the nucleic acid probe is designed to completely match the wild-type sequence, if a mutation other than the V600 mutation is present in the measurement target, a false positive due to a cross reaction may be shown. In particular, in the case of BRAF gene mutation detection in lung cancer, the K601E mutation (lysine of codon 601 is replaced with glutamic acid), which is a mutation other than the V600 mutation and is located in the vicinity of V600, is frequent and cross-reactivity with the V600 mutation. It becomes a problem.

そこで本発明の実施態様は、融解曲線解析法において、Ｖ６００Ｅ変異を含むＶ６００変異を検出可能としつつ、Ｋ６０１Ｅ変異との交差反応を示さないＢＲＡＦ遺伝子変異検出用プローブの提供を課題とする。 Therefore, an embodiment of the present invention is to provide a probe for detecting a BRAF gene mutation that does not show a cross-reactivity with a K601E mutation while enabling detection of a V600 mutation including a V600E mutation in a melting curve analysis method.

本開示の実施態様のヒトＢＲＡＦのＶ６００変異検出用プローブは、配列番号１に示す塩基配列において、５’末端から数えて１９番目に位置するアデニンが、シトシンともチミンとも相補的でない塩基に置換されているとともに、３’末端のシトシンが蛍光色素で標識されている蛍光標識オリゴヌクレオチドである。好ましくは、配列番号２又は配列番号３に示す塩基配列を有する。 In the human BRAF V600 mutation detection probe according to the embodiment of the present disclosure, in the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1, adenine located at the 19th position counting from the 5'end is replaced with a nucleotide that is not complementary to cytosine or thymine. At the same time, it is a fluorescently labeled oligonucleotide in which cytosine at the 3'end is labeled with a fluorescent dye. Preferably, it has the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3.

本発明の実施態様のヒトＢＲＡＦのＶ６００変異検出用プローブは、融解曲線解析法において、Ｖ６００Ｅ変異を含むＶ６００変異を検出可能としつつ、Ｋ６０１Ｅ変異との交差反応は示さない。 The probe for detecting the V600 mutation of human BRAF according to the embodiment of the present invention can detect the V600 mutation including the V600E mutation in the melting curve analysis method, but does not show a cross-reaction with the K601E mutation.

プローブＰ１と各相補鎖との間の乖離曲線である。It is a deviation curve between the probe P1 and each complementary strand. プローブＰ１と各相補鎖との間の塩基対の対応を示す。The base pair correspondence between the probe P1 and each complementary strand is shown. プローブＰ３と各相補鎖との間の乖離曲線である。It is a deviation curve between the probe P3 and each complementary strand. プローブＰ３と各相補鎖との間の塩基対の対応を示す。The base pair correspondence between the probe P3 and each complementary strand is shown. プローブＰ４と各相補鎖との間の乖離曲線である。It is a deviation curve between the probe P4 and each complementary strand. プローブＰ４と各相補鎖との間の塩基対の対応を示す。The base pair correspondence between the probe P4 and each complementary strand is shown. プローブＰ１と各種Ｖ６００変異ＢＲＡＦ遺伝子の相補鎖との間の乖離曲線である。It is a deviation curve between the probe P1 and the complementary strand of various V600 mutant BRAF genes.

以下、本開示を実施するための形態について説明する。ただし、本開示は以下の実施形態に限定されるものではない。 Hereinafter, modes for carrying out the present disclosure will be described. However, the present disclosure is not limited to the following embodiments.

本開示において、検出対象となる試料中の試料核酸、本開示のプローブ及びプライマーを含む本明細書に記載される全ての核酸配列又はヌクレオチド配列への言及は、特に断らない限り、それらの相補配列、及び当該核酸配列又はヌクレオチド配列とその相補配列とから形成される二本鎖についても言及できるものとする。 In the present disclosure, references to all nucleic acid sequences or nucleotide sequences described herein, including sample nucleic acids in samples to be detected, probes and primers of the present disclosure, are complementary sequences thereof unless otherwise specified. , And the double strand formed from the nucleic acid sequence or nucleotide sequence and its complementary sequence.

本開示において、「核酸」とは、全ての種類のＤＮＡ及びＲＮＡを意味する。本開示において、「核酸」と「ヌクレオチド」とは、互換的に使用する場合がある。 In the present disclosure, "nucleic acid" means all types of DNA and RNA. In the present disclosure, "nucleic acid" and "nucleotide" may be used interchangeably.

本開示において「Ｔｍ」又は「Ｔｍ値」とは、二本鎖ＤＮＡの５０％が解離して一本鎖ＤＮＡになる温度をいい、一般に、２６０ｎｍにおける吸光度が吸光度全上昇分の５０％に達した時点の温度と定義される。二本鎖核酸、例えば二本鎖ＤＮＡを含む溶液を加熱していくと、２６０ｎｍにおける吸光度が上昇する。これは、二本鎖ＤＮＡにおける両鎖間の水素結合が加熱によってほどけ、一本鎖ＤＮＡに解離（ＤＮＡの融解）することが原因である。そして、全ての二本鎖ＤＮＡが解離して一本鎖ＤＮＡになると、その吸光度が加熱開始時の吸光度（二本鎖ＤＮＡのみの吸光度）の約１．５倍程度を示し、これによって解離が完了したと判断できる。Ｔｍ値は、この現象に基づき設定される。 In the present disclosure, "Tm" or "Tm value" means a temperature at which 50% of double-stranded DNA is dissociated to become single-stranded DNA, and generally, the absorbance at 260 nm reaches 50% of the total increase in absorbance. It is defined as the temperature at that time. As the solution containing a double-stranded nucleic acid, for example, double-stranded DNA is heated, the absorbance at 260 nm increases. This is because the hydrogen bonds between the two strands in the double-stranded DNA are unwound by heating and dissociated into the single-stranded DNA (melting of the DNA). Then, when all the double-stranded DNA is dissociated into a single-stranded DNA, the absorbance thereof shows about 1.5 times the absorbance at the start of heating (the absorbance of only the double-stranded DNA), which causes dissociation. It can be judged that it is completed. The Tm value is set based on this phenomenon.

本開示において、Ｔｍ値は、以下に詳細を説明する蛍光標識オリゴヌクレオチドを用いて測定することができる。 In the present disclosure, the Tm value can be measured using fluorescently labeled oligonucleotides, which are described in detail below.

本明細書においてＴｍ値を算出する場合、得られたＴｍ値は、特に断らない限り、ソフトウェア「Ｍｅｌｔｃａｌｃ ９９ ｆｒｅｅ」（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｅｌｔｃａｌｃ．ｃｏｍ／）を用い、設定条件：Ｏｌｉｇｏｃｏｎｃ［μＭ］０．２、Ｎａ ｅｑ．［ｍＭ］５０の条件で算出した値とする。このソフトウェアは、当業界で公知のものであり、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｖｏｌ.５４, Ｎｏ.６, ｐｐ.９９０-９９９ （２００８）等でもプローブの設計に使用されている。 When calculating the Tm value in the present specification, the obtained Tm value is set by using the software "Meltical 99 free" (http://www.meltcalc.com/) unless otherwise specified. Setting condition: Oligoconc [μM] ] 0.2, Na eq. [Mm] The value calculated under the condition of 50. This software is well known in the art and is also used in probe design in Clinical Chemistry Vol.54, No.6, pp.990-999 (2008) and the like.

本開示において、「５’末端から数えてＮ番目（ただし、Ｎは自然数）」という場合、ヌクレオチド配列の５’末端にある塩基を１番目として数える。 In the present disclosure, when the term "Nth counting from the 5'end (where N is a natural number)" is used, the base at the 5'end of the nucleotide sequence is counted as the first base.

また、本開示において、たとえば「ヒトＢＲＡＦ遺伝子のコード領域のＮ番目の塩基（ただし、Ｎは自然数）」とは、ヒトＢＲＡＦのタンパク質をコードする１番目の塩基から数えてＮ番目の塩基を意味する。これは、コード領域（すなわち、エキソン）がイントロンによって分断されていても同様に適用される。すなわち、イントロンが存在していたとしても、ヒトＢＲＡＦタンパク質をコードする塩基配列のみを数え上げてＮ番目に位置すれば足りることを意味する。それゆえ、たとえば「ヒトＢＲＡＦ遺伝子のコード領域のＮ番目の塩基」は、ｃＤＮＡ配列又はｍＲＮＡ配列のみならず、スプライシング前の塩基配列や、ゲノム配列おいても同様に適用され、ヒトＢＲＡＦタンパク質をコードする配列のみを数え上げてＮ番目に位置することを意味する。 Further, in the present disclosure, for example, "the Nth base in the coding region of the human BRAF gene (where N is a natural number)" means the Nth base counting from the first base encoding the protein of human BRAF. To do. This applies even if the coding region (ie, exon) is divided by an intron. That is, even if an intron is present, it is sufficient to count only the base sequence encoding the human BRAF protein and position it at the Nth position. Therefore, for example, "the Nth base in the coding region of the human BRAF gene" is applied not only to the cDNA sequence or mRNA sequence, but also to the base sequence before splicing and the genomic sequence, and encodes the human BRAF protein. It means that it is located at the Nth position by counting only the sequences to be used.

なお、本明細書において、塩基配列の文脈で使用される「コード領域」とは、タンパク質に翻訳される塩基配列の領域をいう。 In addition, in this specification, a "coding region" used in the context of a base sequence means a region of a base sequence translated into a protein.

本開示において、「オリゴヌクレオチド」の構成単位としては、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、人工核酸等が挙げられる。前記人工核酸としては、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＲＮＡアナログであるＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）；ペプチド核酸であるＰＮＡ（Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）；架橋化核酸であるＢＮＡ（Ｂｒｉｄｇｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）等が挙げられる。 In the present disclosure, examples of the constituent unit of the "oligonucleotide" include ribonucleotides, deoxyribonucleotides, artificial nucleic acids and the like. Examples of the artificial nucleic acid include LNA (Locked Nucleic Acid) which is an analog of DNA, RNA and RNA; PNA (Peptide Nucleic Acid) which is a peptide nucleic acid; and BNA (Bridged Nucleic Acid) which is a crosslinked nucleic acid.

前記オリゴヌクレオチドは、前記構成単位のうち、一種類の構成単位から構成されてもよいし、複数種類の構成単位から構成されてもよい。 The oligonucleotide may be composed of one type of structural unit among the structural units, or may be composed of a plurality of types of structural units.

本開示においてハイブリダイゼーションは、公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ３ｒｄ（Ｊ． Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ． Ｐｒｅｓｓ， ２００１）に記載の方法等に従って行うことができる。この文献は、参照により本明細書に組み入れられるものとする。 In the present disclosure, hybridization can be performed according to a known method or a method similar thereto, for example, the method described in Molecular Cloning 3rd (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 2001). This document is incorporated herein by reference.

本明細書において、「変異」とは、野生型の塩基配列の一部の塩基が置換、欠失、重複又は挿入されることによって生じる新たな塩基配列を意味する。 As used herein, the term "mutation" means a new base sequence resulting from the substitution, deletion, duplication or insertion of a part of the base of the wild-type base sequence.

本開示において、「ヒトＢＲＡＦ」とは、ヒト由来のＢＲＡＦを意味し、ヒト由来のＢＲＡＦのゲノム配列、ｍＲＮＡ配列、ｃＤＮＡ配列、及びタンパク質の全てを包含する概念である。より具体的には、ヒトＢＲＡＦのゲノム配列は、アクセッションナンバー：ＮＧ＿００７８７３．３（ＲＥＧＩＯＮ: ５００１．．１９５７５３）で表され、ヒトＢＲＡＦ遺伝子のｍＲＮＡ配列は、アクセッションナンバー：ＮＭ＿００４３３３．６で表され、ヒトＢＲＡＦのｃＤＮＡ配列は、アクセッションナンバー：ＣＣＤＳ５８６３．１で表され、ヒトＢＲＡＦのタンパク質のアミノ酸配列は、アクセッションナンバー：００４３２４．２で表される。 In the present disclosure, "human BRAF" means human-derived BRAF, and is a concept including all of the genomic sequence, mRNA sequence, cDNA sequence, and protein of human-derived BRAF. More specifically, the genome sequence of human BRAF is represented by accession number: NG_007873.3 (REGION: 5001 ..195753), and the mRNA sequence of the human BRAF gene is represented by accession number: NM_0043333.6. , The cDNA sequence of human BRAF is represented by accession number: CCDS5863.1, and the amino acid sequence of the protein of human BRAF is represented by accession number: 004324.2.

本開示において、「ヒトＢＲＡＦのＶ６００Ｅ変異」とは、野生型のヒトＢＲＡＦのアミノ酸配列の６００番目のアミノ酸であるバリン（Ｖ）がグルタミン酸（Ｅ）に置換された変異をいう。この変異は、野生型のヒトＢＲＡＦのｃＤＮＡ配列のコード領域における１７９９番目の塩基であるチミン（Ｔ）がアデニン（Ａ）に置換された変異（Ｔ１７９９Ａ変異）に起因するものである。 In the present disclosure, the "V600E mutation of human BRAF" refers to a mutation in which valine (V), which is the 600th amino acid of the amino acid sequence of wild-type human BRAF, is replaced with glutamic acid (E). This mutation is due to a mutation (T1799A mutation) in which thymine (T), the 1799th base in the coding region of the wild-type human BRAF cDNA sequence, is replaced with adenine (A).

本開示において、「ヒトＢＲＡＦのＫ６０１Ｅ変異」とは、野生型のヒトＢＲＡＦのアミノ酸配列の６０１番目のアミノ酸であるリジン（Ｋ）がグルタミン酸（Ｅ）に置換された変異をいう。この変異は、野生型のヒトＢＲＡＦのｃＤＮＡ配列のコード領域における１８０１番目の塩基であるアデニン（Ａ）がグアニン（Ｇ）に置換された変異（Ａ１８０１Ｇ変異に起因するものである。 In the present disclosure, the "K601E mutation of human BRAF" refers to a mutation in which lysine (K), which is the 601st amino acid in the amino acid sequence of wild-type human BRAF, is replaced with glutamic acid (E). This mutation is due to a mutation (A1801G mutation) in which adenine (A), which is the 1801st base in the coding region of the cDNA sequence of wild-type human BRAF, is replaced with guanine (G).

本開示において、「ヒトＢＲＡＦのＶ６００Ｅ２変異」とは、野生型のヒトＢＲＡＦのアミノ酸配列の６００番目のアミノ酸であるバリン（Ｖ）がグルタミン酸（Ｅ）に置換された変異をいう。この変異は、野生型のヒトＢＲＡＦのｃＤＮＡ配列のコード領域における１７９９番目の塩基であるチミン（Ｔ）及び１８００番目の塩基であるグアニン（Ｇ）がいずれもアデニン（Ａ）に置換された変異（ＴＧ１７９９＿１８００ＡＡ変異）に起因するものである。 In the present disclosure, the "V600E2 mutation of human BRAF" refers to a mutation in which valine (V), which is the 600th amino acid of the amino acid sequence of wild-type human BRAF, is replaced with glutamic acid (E). This mutation is a mutation in which both thymine (T), which is the 1799th base, and guanine (G), which is the 1800th base, are replaced with adenine (A) in the coding region of the cDNA sequence of wild-type human BRAF. It is due to TG1799_1800AA mutation).

本開示において、「ヒトＢＲＡＦのＶ６００Ｋ変異」とは、野生型のヒトＢＲＡＦのアミノ酸配列の６００番目のアミノ酸であるバリン（Ｖ）がリジン（Ｋ）に置換された変異をいう。この変異は、野生型のヒトＢＲＡＦのｃＤＮＡ配列のコード領域における１７９８番目の塩基であるグアニン（Ｇ）及び１７９９番目の塩基であるチミン（Ｔ）がいずれもアデニン（Ａ）に置換された変異（ＧＴ１７９８＿１７９９ＡＡ変異）に起因するものである。 In the present disclosure, the "V600K mutation of human BRAF" refers to a mutation in which valine (V), which is the 600th amino acid of the amino acid sequence of wild-type human BRAF, is replaced with lysine (K). This mutation is a mutation in which both guanine (G), which is the 1798th base, and thymine (T), which is the 1799th base, are replaced with adenine (A) in the coding region of the cDNA sequence of wild-type human BRAF. It is due to the GT1798-1799AA mutation).

本開示において、「ヒトＢＲＡＦのＶ６００Ｒ変異」とは、野生型のヒトＢＲＡＦのアミノ酸配列の６００番目のアミノ酸であるバリン（Ｖ）がアルギニン（Ｒ）に置換された変異をいう。この変異は、野生型のヒトＢＲＡＦのｃＤＮＡ配列のコード領域における１７９８番目の塩基であるグアニン（Ｇ）及び１７９９番目の塩基であるチミン（Ｔ）がそれぞれアデニン（Ａ）及びグアニン（Ｇ）に置換された変異（ＧＴ１７９８＿１７９９ＡＧ変異）に起因するものである。 In the present disclosure, the "V600R mutation of human BRAF" refers to a mutation in which valine (V), which is the 600th amino acid of the amino acid sequence of wild-type human BRAF, is replaced with arginine (R). In this mutation, guanine (G), which is the 1798th base, and thymine (T), which is the 1799th base, are replaced with adenine (A) and guanine (G), respectively, in the coding region of the cDNA sequence of wild-type human BRAF. It is due to the mutation (GT1798-1799AG mutation).

本開示において、「ヒトＢＲＡＦのＶ６００Ｄ変異」とは、野生型のヒトＢＲＡＦのアミノ酸配列の６００番目のアミノ酸であるバリン（Ｖ）がアスパラギン酸（Ｄ）に置換された変異をいう。この変異は、野生型のヒトＢＲＡＦのｃＤＮＡ配列のコード領域における１７９９番目の塩基であるチミン（Ｔ）及び１８００番目の塩基であるグアニン（Ｇ）がそれぞれアデニン（Ａ）及びチミン（Ｔ）に置換された変異（ＴＧ１７９９＿１８００ＡＴ変異）に起因するものである。 In the present disclosure, the "V600D mutation of human BRAF" refers to a mutation in which valine (V), which is the 600th amino acid of the amino acid sequence of wild-type human BRAF, is replaced with aspartic acid (D). In this mutation, the 1799th base thymine (T) and the 1800th base guanine (G) in the coding region of the cDNA sequence of wild-type human BRAF are replaced with adenine (A) and thymine (T), respectively. It is due to the mutation (TG1799_1800AT mutation).

なお、本開示において、「Ｖ６００変異」とは、上記したＶ６００Ｅ変異、Ｖ６００Ｅ２変異、Ｖ６００Ｋ変異、Ｖ６００Ｒ変異及びＶ６００Ｄ変異の総称である。 In the present disclosure, the "V600 mutation" is a general term for the above-mentioned V600E mutation, V600E2 mutation, V600K mutation, V600R mutation and V600D mutation.

本開示において、「ｃＤＮＡ」とは、ｍＲＮＡの相補ＤＮＡ鎖（一本鎖）、ｍＲＮＡの相補ＤＮＡ鎖の相補ＤＮＡ鎖（一本鎖）、及びｍＲＮＡの相補ＤＮＡ鎖とｍＲＮＡの相補ＤＮＡ鎖の相補ＤＮＡ鎖とにより形成される二本鎖、のいずれを指称することもできる。ｃＤＮＡは、公知の方法で、ｍＲＮＡから逆転写することにより得ることができる。 In the present disclosure, "cDNA" means a complementary DNA strand of mRNA (single strand), a complementary DNA strand of a complementary DNA strand of mRNA (single strand), and a complementary DNA strand of mRNA and a complementary DNA strand of mRNA. Any of the double strands formed by the DNA strand can be referred to. The cDNA can be obtained by reverse transcription from the mRNA by a known method.

典型的には、「コード領域」を含む文脈において使用される「ｃＤＮＡ」は、ｍＲＮＡの相補ＤＮＡ鎖の相補ＤＮＡ鎖（一本鎖）を意味する。 Typically, as used in the context of including a "coding region," "cDNA" means a complementary DNA strand (single strand) of a complementary DNA strand of mRNA.

＜ヒトＢＲＡＦのＶ６００変異検出用プローブ＞
本開示のヒトＢＲＡＦのＶ６００変異検出用プローブは、配列番号１に示す塩基配列において、５’末端から数えて１９番目に位置するアデニンが、シトシンともチミンとも相補的でない塩基に置換されているとともに、３’末端のシトシンが蛍光色素で標識されている蛍光標識オリゴヌクレオチドである。このヒトＢＲＡＦのＶ６００変異検出用プローブは、好ましくは配列番号２又は配列番号３に示す塩基配列を有する。 <Probe for detecting V600 mutations in human BRAF>
In the human BRAF V600 mutation detection probe of the present disclosure, in the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, adenine located at the 19th position counting from the 5'end is replaced with a base that is not complementary to cytosine or thymine. A fluorescently labeled oligonucleotide in which cytosine at the 3'end is labeled with a fluorescent dye. This human BRAF V600 mutation detection probe preferably has the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3.

本開示において、配列番号１に示す塩基配列は「tttggtctagctacagTgAaatc」である。 In the present disclosure, the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 is "tttggtctagctacagTgAaatc".

配列番号１に示す塩基配列は、野生形ヒトＢＲＡＦのｃＤＮＡ配列のコード領域における１７８３番目〜１８０５番目の２３塩基である。この塩基配列の５’末端から数えて１７番目に大文字で示すチミン（Ｔ）は野生形ヒトＢＲＡＦのｃＤＮＡ配列のコード領域における１７９９番目の塩基である。また、この塩基配列の５’末端から数えて１９番目に大文字で示すアデニン(Ａ）は野生形ヒトＢＲＡＦのｃＤＮＡ配列のコード領域における１８０１番目の塩基である。本開示のヒトＢＲＡＦのＶ６００変異検出用プローブにおいては、このアデニン（Ａ）がシトシンともチミンとも相補的でない塩基、たとえばシトシン（Ｃ）若しくはチミン（Ｔ）、若しくはシトシン（Ｃ）及びチミン（Ｔ）の混合塩基、又はその他シトシン及びチミンと水素結合を形成し得ない塩基（たとえば、シトシン若しくはチミンの修飾塩基又はイノシン）に置換されている。このような、本開示のヒトＢＲＡＦのＶ６００変異検出用プローブの塩基配列を以下、「置換配列」と総称する。 The base sequence shown in SEQ ID NO: 1 is the 23 bases of 1783 to 1805 in the coding region of the cDNA sequence of wild human BRAF. Thymine (T), which is indicated by the 17th capital letter counting from the 5'end of this base sequence, is the 1799th base in the coding region of the cDNA sequence of wild human BRAF. In addition, adenine (A) indicated by the 19th capital letter counting from the 5'end of this base sequence is the 1801st base in the coding region of the cDNA sequence of wild human BRAF. In the human BRAF V600 mutation detection probe of the present disclosure, a base in which this adenine (A) is neither cytosine nor thymine complementary, such as cytosine (C) or thymine (T), or cytosine (C) and thymine (T). Is replaced with a mixed base of cytosine or other base that cannot form a hydrogen bond with cytosine and thymine (for example, a modified base of cytosine or thymine or inosin). Such a base sequence of the human BRAF V600 mutation detection probe of the present disclosure is hereinafter collectively referred to as a “substitution sequence”.

本開示において、配列番号２に示す塩基配列は「tttggtctagctacagTgCaatc」である。 In the present disclosure, the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2 is "tttggtctagctacagTgCaatc".

本開示において、配列番号３に示す塩基配列は「tttggtctagctacagTgTaatc」である。 In the present disclosure, the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3 is "tttggtctagctacagTgTaatc".

配列番号２及び配列番号３に示す塩基配列はいずれも、上記した置換配列の例であり、ヒトＢＲＡＦのｃＤＮＡ配列のコード領域における１７８３番目〜１８０５番目の２３塩基（すなわち、配列番号１の塩基配列）を基にしているが、１８０１番目が本来アデニン（Ａ）であるところ、配列番号２では大文字で示すシトシン（Ｃ）に置換され、また、配列番号３では３’末端側の大文字で示すチミン（Ｔ）に置換されている。なお、配列番号２及び配列番号３において、各々の塩基配列の５’末端から数えて１７番目に大文字で示すチミン（Ｔ）は、配列番号１と同様、いずれも野生型ヒトＢＲＡＦのｃＤＮＡ配列のコード領域における１７９９番目の塩基である。 The base sequences shown in SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 3 are both examples of the above-mentioned substitution sequences, and are the 23 bases of positions 1783 to 1805 in the coding region of the cDNA sequence of human BRAF (that is, the base sequence of SEQ ID NO: 1). ) Is based on, but the 1801st is originally adenine (A), but in SEQ ID NO: 2, it is replaced with cytosine (C) indicated by an upper letter, and in SEQ ID NO: 3, thymine indicated by an upper letter on the 3'end side. It has been replaced with (T). In SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 3, thymine (T) indicated by the 17th capital letter counting from the 5'end of each base sequence is the cDNA sequence of wild-type human BRAF, as in SEQ ID NO: 1. It is the 1799th base in the coding region.

ここで、野生型ヒトＢＲＡＦでは、上記したように、ｃＤＮＡ配列のコード領域の１７９９番目の塩基はチミン（Ｔ）であり、１８０１番目の塩基はアデニン（Ａ）である。よって、上記した置換配列、たとえば、配列番号２及び配列番号３の塩基配列を有するプローブはいずれも、野生型のヒトＢＲＡＦとは１８０１番目の１塩基のみがミスマッチである。 Here, in the wild-type human BRAF, as described above, the 1799th base in the coding region of the cDNA sequence is thymine (T), and the 1801st base is adenine (A). Therefore, in each of the above-mentioned substitution sequences, for example, the probes having the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 3, only the 1801st base is mismatched with the wild-type human BRAF.

また、ヒトＢＲＡＦのＶ６００Ｅ変異では、上記したように、ｃＤＮＡ配列のコード領域の１７９９番目の塩基はアデニン（Ａ）に置換されているが、１８０１番目の塩基はアデニン（Ａ）のままである。よって、上記した置換配列、たとえば、配列番号２及び配列番号３の塩基配列を有するプローブはいずれも、Ｖ６００Ｅ変異のヒトＢＲＡＦとは１７９９番目及び１８０１番目の２塩基がミスマッチである。 Further, in the V600E mutation of human BRAF, as described above, the 1799th base in the coding region of the cDNA sequence is replaced with adenine (A), but the 1801st base remains adenine (A). Therefore, in each of the above-mentioned substitution sequences, for example, the probes having the base sequences of SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 3, the two bases 1799 and 1801 are mismatched with the human BRAF of the V600E mutation.

そして、ヒトＢＲＡＦのＫ６０１Ｅ変異では、上記したように、ｃＤＮＡ配列のコード領域の１７９９番目の塩基はチミン（Ｔ）のままであるが、１８０１番目の塩基はグアニン（Ｇ）に置換されている。よって、上記した置換配列、たとえば、配列番号２及び配列番号３の塩基配列を有するプローブは、野生型のヒトＢＲＡＦとは１８０１番目の１塩基のみがミスマッチである。 Then, in the K601E mutation of human BRAF, as described above, the 1799th base in the coding region of the cDNA sequence remains thymine (T), but the 1801st base is replaced with guanine (G). Therefore, the probe having the above-mentioned substitution sequences, for example, the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 3, is mismatched with the wild-type human BRAF only at the 1801st base.

つまり、上記した置換配列、たとえば、配列番号２及び配列番号３の塩基配列を有するプローブはいずれも、野生型ヒトＢＲＡＦ及びＫ６０１Ｅ変異ＢＲＡＦとは１塩基ミスマッチであるが、Ｖ６００Ｅ変異ＢＲＡＦとは２塩基ミスマッチとなる。 That is, the above-mentioned substitution sequences, for example, probes having the base sequences of SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 3 all have a 1-base mismatch with the wild-type human BRAF and the K601E mutant BRAF, but have 2 bases with the V600E mutant BRAF. It will be a mismatch.

すなわち、上記した置換配列、たとえば、配列番号２及び配列番号３の塩基配列を有するプローブは、Ｖ６００Ｅ変異ＢＲＡＦよりも、野生型ヒトＢＲＡＦ及びＫ６０１Ｅ変異ＢＲＡＦに対してよりパーフェクトマッチに近い。これにより、上記した置換配列、たとえば、配列番号２及び配列番号３の塩基配列を有するプローブは、野生型ヒトＢＲＡＦ及びＫ６０１Ｅ変異ＢＲＡＦとの間ではより結合力が強くＴｍ値がより高くなるのに対し、Ｖ６００Ｅ変異ＢＲＡＦとの間ではより結合力が弱くＴｍ値がより低くなる。本開示は、このＴｍ値の差異に基づき、操作が簡便で、高価な装置を必要とせず、かつ高感度でＢＲＡＦ遺伝子のＶ６００Ｅ変異を、野生型及びＫ６０１Ｅ変異と峻別することを可能としている。 That is, the above-mentioned substitution sequences, for example, probes having the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 3 are closer to a perfect match for wild-type human BRAF and K601E mutant BRAF than for V600E mutant BRAF. As a result, the above-mentioned substitution sequences, for example, probes having the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 3 have stronger binding force and higher Tm value between wild-type human BRAF and K601E mutant BRAF. On the other hand, the binding force with the V600E mutant BRAF is weaker and the Tm value is lower. Based on this difference in Tm value, the present disclosure makes it possible to distinguish the V600E mutation of the BRAF gene from the wild type and the K601E mutation with simple operation, no need for an expensive device, and high sensitivity.

なお、上記した置換配列の例として、配列番号２及び配列番号３の塩基配列を有するプローブを任意の比率で混合したものも本開示のヒトＢＲＡＦのＶ６００変異検出用プローブとして使用可能である。 As an example of the above-mentioned substitution sequence, a probe having the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 3 mixed at an arbitrary ratio can also be used as the probe for detecting V600 mutation of human BRAF of the present disclosure.

ここで、本開示のヒトＢＲＡＦのＶ６００変異検出用プローブの合成は、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製ＤＮＡ合成機ｍｏｄｅｌ ３８０Ｂを使用し、ホスホアミダイト法を用いて（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ（１９８１），２２，１８５９参照）、常法に従って合成することができ、あるいは、プライマー合成を受託する企業（例えば、株式会社日本遺伝子研究所など）に合成を依頼することもできる。 Here, in the synthesis of the probe for detecting the V600 mutation of human BRAF of the present disclosure, for example, a DNA synthesizer model 380B manufactured by Applied Biosystems is used, and a phosphoramidite method is used (see Tetrahedron Letters (1981), 22, 1859). ), It can be synthesized according to a conventional method, or it is also possible to request the synthesis from a company that outsources primer synthesis (for example, Japan Genetic Research Institute Co., Ltd.).

オリゴヌクレオチドの３’末端を蛍光色素で標識する方法は、例えば、過剰量の蛍光標識したヌクレオチドを基質としてＰＣＲのポリメラ−ゼ反応溶液に含有させる方法などが挙げられる。あるいは、蛍光標識オリゴヌクレオチドは、蛍光標識オリゴヌクレオチド合成を受託する企業（例えば、Ｊ−Ｂｉｏ２１センター（日鉄住金環境株式会社）など）に合成を依頼することもできる。 Examples of the method of labeling the 3'end of the oligonucleotide with a fluorescent dye include a method of incorporating an excess amount of the fluorescently labeled nucleotide as a substrate in the polymerase reaction solution of PCR. Alternatively, the fluorescently labeled oligonucleotide can be synthesized by a company that outsources the synthesis of the fluorescently labeled oligonucleotide (for example, J-Bio21 Center (Nittetsu Sumikin Environmental Co., Ltd.)).

本開示の蛍光色素は、特に制限されないが、例えば、フルオレセイン、リン光体、ローダミン及びその誘導体、並びにポリメチン色素誘導体からなる群から選択される蛍光色素が挙げられる。市販の蛍光色素としては、例えば、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ（登録商標、モレキュラープローブ社製）、ＴＡＭＲＡ（登録商標、モレキュラープローブ社製）、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ（登録商標、モレキュラープローブ社製）、ＦｌｕｏｒｅＰｒｉｍｅ（商品名、アマシャムファルマシア社製）、Ｃｙ３及びＣｙ５（商品名、アマシャムファルマシア社製）、Ｆｌｕｏｒｅｄｉｔｅ（商品名、ミリポア社製）、ＦＡＭ（登録商標、ＡＢＩ社製）等が挙げられる。 The fluorescent dyes of the present disclosure are not particularly limited, and examples thereof include fluorescent dyes selected from the group consisting of fluorescein, phosphorescent substances, rhodamine and derivatives thereof, and polymethine dye derivatives. Examples of commercially available fluorescent dyes include Pacific Blue (registered trademark, manufactured by Molecular Probe), TAMRA (registered trademark, manufactured by Molecular Probe), BODIPY FL (registered trademark, manufactured by Molecular Probe), and FluorePrime (trade name, manufactured by Amasham). Examples thereof include Cy3 and Cy5 (trade name, manufactured by Amasham Pharmacia), Fluoredite (trade name, manufactured by Millipore), FAM (registered trademark, manufactured by ABI) and the like.

上記したローダミンの誘導体は、５−カルボキシテトラメチルローダミンであることが望ましい。この５−カルボキシテトラメチルローダミンとは、上記したＴＡＭＲＡの一般名称である。上記したＴＡＭＲＡのような蛍光標識オリゴヌクレオチドは、相補配列にハイブリダイズしていない場合には蛍光を発し、相補配列にハイブリダイズしてハイブリッドを形成した場合には蛍光が減少（例えば、消光）する。 The above-mentioned derivative of rhodamine is preferably 5-carboxytetramethylrhodamine. The 5-carboxytetramethylrhodamine is the general name of TAMRA described above. Fluorescently labeled oligonucleotides such as TAMRA described above fluoresce when not hybridized to a complementary sequence, and decrease (eg, quench) when hybridized to a complementary sequence to form a hybrid. ..

このような蛍光消光現象（Ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ ｐｈｅｎｏｍｅｎｏｎ）を利用したプローブは、一般に蛍光消光プローブと称される。蛍光消光プローブは、オリゴヌクレオチドの３’末端又は５’末端の塩基が蛍光色素で標識化され、標識化される塩基は、シトシン（Ｃ）である。この場合、蛍光消光プローブがハイブリダイズする検出目的配列において、蛍光消光プローブの末端塩基Ｃと対をなす塩基又は当該対をなす塩基から１〜３塩基離れた塩基がグアニン（Ｇ）となるように、蛍光消光プローブの塩基配列を設計することが好ましい。このような蛍光消光プローブは、一般にグアニン消光プローブと称され、いわゆるＱ Ｐｒｏｂｅ（登録商標）としても知られている。 A probe utilizing such a fluorescence quenching phenomenon (Quenching quenching phenomenon) is generally referred to as a fluorescence quenching probe. In the fluorescent quenching probe, the base at the 3'end or 5'end of the oligonucleotide is labeled with a fluorescent dye, and the labeled base is cytosine (C). In this case, in the detection target sequence in which the fluorescent quenching probe hybridizes, the base paired with the terminal base C of the fluorescent quenching probe or the base 1 to 3 bases away from the paired base becomes guanine (G). , It is preferable to design the base sequence of the fluorescent quenching probe. Such a fluorescent quenching probe is generally referred to as a guanine quenching probe, and is also known as a so-called Q Probe (registered trademark).

このようなグアニン消光プローブが検出目的配列にハイブリダイズすると、蛍光色素で標識化された末端のシトシン（Ｃ）が検出目的配列におけるグアニン（Ｇ）に近づくことによって、蛍光色素の発光が弱くなる（蛍光強度が減少する）という現象を示す。このようなグアニン消光プローブを使用すれば、シグナルの変動に基づき、グアニン消光プローブが標的配列とハイブリダイズしているか解離しているかを容易に確認することができる。蛍光色素は、通常、ヌクレオチドのリン酸基に結合することができる。 When such a guanine quenching probe hybridizes to the detection target sequence, the fluorescent dye-labeled terminal cytosine (C) approaches the guanine (G) in the detection target sequence, thereby weakening the emission of the fluorescent dye ( Fluorescence intensity decreases). By using such a guanine quenching probe, it is possible to easily confirm whether the guanine quenching probe is hybridized or dissociated from the target sequence based on the fluctuation of the signal. Fluorescent dyes can usually be attached to the phosphate groups of nucleotides.

従って、蛍光標識オリゴヌクレオチドを用いて形成されたハイブリッドの蛍光のシグナル（例えば、蛍光強度）を解析することにより、二本鎖であるハイブリッドが一本鎖へ解離した割合、及びＴｍ値などを測定することができる。 Therefore, by analyzing the fluorescence signal (for example, fluorescence intensity) of the hybrid formed by using the fluorescently labeled oligonucleotide, the rate at which the double-stranded hybrid is dissociated into a single strand, the Tm value, and the like are measured. can do.

蛍光色素は、特定の波長で発光するため、そのような波長を蛍光強度の検出に利用することができる。例えば、下記の蛍光色素において好ましい検出波長は、以下の通りである。Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ（検出波長：４５０ｎｍ〜４８０ｎｍ）、ＴＡＭＲＡ（検出波長：５８５ｎｍ〜７００ｎｍ）、及びＢＯＤＩＰＹ ＦＬ（検出波長：５１５ｎｍ〜５５５ｎｍ）。 Since the fluorescent dye emits light at a specific wavelength, such a wavelength can be used for detecting the fluorescence intensity. For example, the preferred detection wavelengths of the following fluorescent dyes are as follows. Pacific Blue (detection wavelength: 450 nm to 480 nm), TAMRA (detection wavelength: 585 nm to 700 nm), and BODIPY FL (detection wavelength: 515 nm to 555 nm).

なお、本開示のヒトＢＲＡＦのＶ６００変異検出用プローブは、このＶ６００変異が生ずる部位を含んだ塩基配列をＰＣＲ反応によって増幅することが可能なフォワードプライマー及びリバースプライマーと組み合わせたキットとして提供することもできる。 The human BRAF V600 mutation detection probe of the present disclosure may be provided as a kit in combination with a forward primer and a reverse primer capable of amplifying the base sequence containing the site where the V600 mutation occurs by a PCR reaction. it can.

＜ヒトＢＲＡＦのＶ６００変異の検出方法＞
本開示のヒトＢＲＡＦのＶ６００変異の検出方法は、上記したヒトＢＲＡＦのＶ６００変異検出用プローブを試料中の一本鎖核酸と接触させて、前記ヒトＢＲＡＦのＶ６００変異検出用プローブと前記一本鎖核酸とのハイブリッドを形成させる工程、前記ハイブリッドを含む試料溶液の温度を変化させることにより、前記ハイブリッドを解離させ、前記ハイブリッドの解離に基づくシグナルの変動を測定する工程、前記シグナルの変動に基づいて、前記ハイブリッドのＴｍ値を決定する工程、及び、前記Ｔｍ値に基づいて、前記試料中の一本鎖核酸における、ヒトＢＲＡＦ遺伝子の変異の存在を検出する工程、を含む。 <Method for detecting V600 mutation in human BRAF>
In the method for detecting a V600 mutation in human BRAF of the present disclosure, the above-mentioned probe for detecting V600 mutation in human BRAF is brought into contact with a single-stranded nucleic acid in a sample, and the probe for detecting V600 mutation in human BRAF and the single-stranded one are used. A step of forming a hybrid with a nucleic acid, a step of dissociating the hybrid by changing the temperature of a sample solution containing the hybrid, and measuring a signal variation based on the dissociation of the hybrid, based on the signal variation. , A step of determining the Tm value of the hybrid, and a step of detecting the presence of a mutation in the human BRAF gene in the single-stranded nucleic acid in the sample based on the Tm value.

前記試料としては、たとえば、生体から採取した固形組織、血液、喀痰、気管支洗浄液又は胸水である。生体から採取した固形組織としては、たとえば、患者より切除した患部又は生検した固形組織が挙げられる。このような試料から核酸を単離して、本開示のヒトＢＲＡＦのＶ６００変異の検出方法に供される。試料からの核酸の単離は定法に従って行うことができる。 Examples of the sample are solid tissue, blood, sputum, bronchial lavage fluid or pleural effusion collected from a living body. Examples of the solid tissue collected from the living body include an affected area excised from a patient or a biopsied solid tissue. Nucleic acids are isolated from such samples and used in the methods of detecting V600 mutations in human BRAF of the present disclosure. Isolation of nucleic acid from a sample can be performed according to a conventional method.

また、生体試料に含まれるＤＮＡを遺伝子増幅法により増幅させた増幅産物を試料として用いてもよい。あるいは、生体試料に含まれるＲＮＡから逆転写ＰＣＲ反応によりｃＤＮＡを生成し、このｃＤＮＡを遺伝子増幅法により増幅させた増幅産物を試料として用いてもよい。 In addition, an amplification product obtained by amplifying DNA contained in a biological sample by a gene amplification method may be used as a sample. Alternatively, a cDNA may be generated from RNA contained in a biological sample by a reverse transcription PCR reaction, and an amplification product obtained by amplifying this cDNA by a gene amplification method may be used as a sample.

核酸増幅法は、特に制限されない。核酸増幅法としては、ＰＣＲ法、ＮＡＳＢＡ（Nucleic Acid Sequence Based Amplification）法、ＴＭＡ（Transcription-Mediated Amplification）法、ＳＤＡ（Strand Displacement Amplification）法等が挙げられ、中でもＰＣＲ法が好ましい。 The nucleic acid amplification method is not particularly limited. Examples of the nucleic acid amplification method include a PCR method, a NASBA (Nucleic Acid Sequence Based Amplification) method, a TMA (Transcription-Mediated Amplification) method, an SDA (Strand Displacement Amplification) method, and the like, and the PCR method is particularly preferable.

核酸の増幅において、増幅反応液における試料の添加割合は特に制限されない。具体例として、上記試料が生体試料（例えば、全血試料）の場合、添加割合の下限は、０．０１体積％以上であることが好ましく、０．０５体積％以上であることがより好ましく、０．１体積％以上であることがさらに好ましい。また、上記試料が生体試料（例えば、全血試料）の場合、添加割合の上限は、２体積％以下であることが好ましく、１体積％以下であることがより好ましく、０．５体積％以下であることがさらに好ましい。 In the amplification of nucleic acid, the addition ratio of the sample in the amplification reaction solution is not particularly limited. As a specific example, when the sample is a biological sample (for example, a whole blood sample), the lower limit of the addition ratio is preferably 0.01% by volume or more, more preferably 0.05% by volume or more. It is more preferably 0.1% by volume or more. When the sample is a biological sample (for example, a whole blood sample), the upper limit of the addition ratio is preferably 2% by volume or less, more preferably 1% by volume or less, and 0.5% by volume or less. Is more preferable.

また、ヒトＢＲＡＦのＶ６００変異検出用プローブを用いた光学的検出を行う場合、上記反応液における生体試料の添加割合は、例えば、０．１体積％〜０．５体積％に設定することが好ましい。この範囲であれば、例えば、変性による沈殿物等の発生による影響を十分に防止でき、光学的手法による測定精度を向上できる。また、生体試料中の夾雑物によるＰＣＲの阻害も十分に抑制されるため、増幅効率をより一層向上できることも期待される。 Further, when performing optical detection using a probe for detecting a V600 mutation of human BRAF, the addition ratio of the biological sample in the reaction solution is preferably set to, for example, 0.1% by volume to 0.5% by volume. .. Within this range, for example, the influence of the generation of precipitates due to denaturation can be sufficiently prevented, and the measurement accuracy by the optical method can be improved. In addition, since the inhibition of PCR by impurities in the biological sample is sufficiently suppressed, it is expected that the amplification efficiency can be further improved.

また、核酸増幅反応の開始前に、上記反応液にさらにアルブミンを添加することが好ましい。このようなアルブミンの添加によって、例えば、沈殿物又は濁りの発生による影響をより一層低減でき、かつ、増幅効率もさらに向上する。 Further, it is preferable to further add albumin to the above reaction solution before starting the nucleic acid amplification reaction. By adding albumin in this way, for example, the influence of the generation of precipitate or turbidity can be further reduced, and the amplification efficiency is further improved.

上記反応液におけるアルブミンの添加割合は、例えば、０．０１質量％〜２質量％であり、好ましくは０．１質量％〜１質量％であり、より好ましくは０．２質量％〜０．８質量％である。アルブミンとしては、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ヒト血清アルブミン、ラット血清アルブミン、ウマ血清アルブミン等が挙げられ、特に制限されない。これらのアルブミンはいずれか１種類を使用してもよく、２種類以上を併用してもよい。 The addition ratio of albumin in the above reaction solution is, for example, 0.01% by mass to 2% by mass, preferably 0.1% by mass to 1% by mass, and more preferably 0.2% by mass to 0.8%. It is mass%. Examples of albumin include bovine serum albumin (BSA), human serum albumin, rat serum albumin, horse serum albumin, and the like, and are not particularly limited. Any one of these albumins may be used, or two or more of these albumins may be used in combination.

核酸増幅法としてのＰＣＲ法については、このＶ６００変異が生ずる部位を含んだ塩基配列をＰＣＲ反応によって増幅することが可能なフォワードプライマー及びリバースプライマーを適宜設計した上で合成し、定法に従って行うことができる。 Regarding the PCR method as a nucleic acid amplification method, a forward primer and a reverse primer capable of amplifying the base sequence containing the site where the V600 mutation occurs can be appropriately designed and synthesized, and the method can be performed according to a conventional method. it can.

以下、増幅についてＰＣＲ法を例に挙げて説明するが、本開示は、この例に制限されない。 Hereinafter, amplification will be described by taking the PCR method as an example, but the present disclosure is not limited to this example.

まず、鋳型（テンプレート）核酸、本開示のヒトＢＲＡＦのＶ６００変異が生ずる部位を含んだ塩基配列を増幅可能なフォワードプライマー及びリバースプライマーを含むＰＣＲ反応液を調製する。 First, a PCR reaction solution containing a template nucleic acid and a forward primer and a reverse primer capable of amplifying a base sequence containing a site where a V600 mutation of the human BRAF of the present disclosure occurs is prepared.

ＰＣＲ反応液における各種プライマーの添加割合は、特に制限されない。フォワードプライマー及びリバースプライマーの合計の添加割合は、０．０１μｍｏｌ／Ｌ〜５０μｍｏｌ／Ｌであることが好ましく、０．５μｍｏｌ／Ｌ〜５μｍｏｌ／Ｌであることがより好ましい。 The addition ratio of various primers in the PCR reaction solution is not particularly limited. The total addition ratio of the forward primer and the reverse primer is preferably 0.01 μmol / L to 50 μmol / L, and more preferably 0.5 μmol / L to 5 μmol / L.

また、フォワードプライマー及びリバースプライマー添加割合は、いずれも０．０５μｍｏｌ／Ｌ〜５０μｍｏｌ／Ｌであることが好ましく、０．５μｍｏｌ／Ｌ〜５μｍｏｌ／Ｌであることがより好ましい。 The addition ratio of the forward primer and the reverse primer is preferably 0.05 μmol / L to 50 μmol / L, and more preferably 0.5 μmol / L to 5 μmol / L.

ＰＣＲ反応液におけるフォワードプライマーセット及びリバースプライマーの含有比率は特に限定されない。増幅効率及び野生型又は変異型への特異性を高くする観点から、フォワードプライマー及びリバースプライマーの合計モル量に対する比は、１：１〜１：１０であることが好ましく、１：２〜１：５であることがより好ましく、１：３〜１：４．５であることがさらに好ましい。 The content ratio of the forward primer set and the reverse primer in the PCR reaction solution is not particularly limited. From the viewpoint of increasing amplification efficiency and specificity to the wild type or mutant type, the ratio of the forward primer and the reverse primer to the total molar amount is preferably 1: 1 to 1:10, preferably 1: 2 to 1: 1. It is more preferably 5 and even more preferably 1: 3 to 1: 4.5.

ＰＣＲ反応液におけるその他の組成成分は、特に制限されず、従来公知の成分が挙げられ、その割合も特に制限されない。他の組成成分としては、ＤＮＡポリメラーゼ、ヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）等のヌクレオチド、溶媒等が挙げられる。ＰＣＲ反応液において、各組成成分の添加順序は何ら制限されない。 The other composition components in the PCR reaction solution are not particularly limited, and conventionally known components may be mentioned, and the proportion thereof is not particularly limited. Examples of other composition components include DNA polymerase, nucleotides such as nucleoside triphosphate (dNTP), solvents and the like. In the PCR reaction solution, the order of addition of each composition component is not limited in any way.

ＤＮＡポリメラーゼは特に制限されない。例えば、従来公知の耐熱性細菌由来のポリメラーゼが使用できる。具体例としては、テルムス・アクアティカス（Thermus aquaticus）由来ＤＮＡポリメラーゼ（米国特許第４８８９８１８号明細書及び米国特許第５０７９３５２号明細書を参照）（Ｔａｑポリメラーゼ（商品名））、テルムス・テルモフィラス（Thermus thermophilus）由来ＤＮＡポリメラーゼ（国際公開第９１／０９９５０号を参照）（rTth DNA polymerase）、ピロコッカス・フリオサス（Pyrococcus furiosus）由来ＤＮＡポリメラーゼ（国際公開第９２／９６８９号を参照）（Pfu DNA polymerase；Strategene社製）、テルモコッカス・リトラリス（Thermococcus litoralis）由来ＤＮＡポリメラーゼ（欧州特許第０４５５４３０号明細書を参照）（Ｖｅｎｔ（商標）；New England Biolabs社製）等が商業的に入手可能である。中でも、テルムス・アクアティカス（Thermus aquaticus）由来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが好ましい。 DNA polymerase is not particularly limited. For example, a conventionally known polymerase derived from a thermostable bacterium can be used. Specific examples include DNA polymerase derived from Thermus aquaticus (see US Pat. No. 4,888,818 and US Pat. No. 5,079,352) (Taq polymerase (trade name)), Thermus thermophilus. ) Derived DNA polymerase (see International Publication No. 91/09950) (rTth DNA polymerase), DNA polymerase derived from Pyrococcus furiosus (see International Publication No. 92/9689) (Pfu DNA polymerase; manufactured by Strategene) ), DNA polymerase derived from Thermus aquaticus litoralis (see European Patent No. 0455430) (Vent ™; manufactured by New England Biolabs) and the like are commercially available. Of these, a thermostable DNA polymerase derived from Thermus aquaticus is preferable.

ＰＣＲ反応液中のＤＮＡポリメラーゼの添加割合は、目的核酸を増幅する目的で当業界において通常用いられる割合であればよい。 The addition ratio of the DNA polymerase in the PCR reaction solution may be any ratio usually used in the art for the purpose of amplifying the target nucleic acid.

ヌクレオシド三リン酸としては、通常、ｄＮＴＰ（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＵＴＰ等）が挙げられる。ＰＣＲ反応液中のｄＮＴＰの添加割合は、目的核酸を増幅する目的で当業界において通常用いられる割合であればよい。 The nucleoside triphosphate usually includes dNTPs (eg, dATP, dGTP, dCTP, dTTP, dUTP, etc.). The addition ratio of dNTP in the PCR reaction solution may be any ratio usually used in the art for the purpose of amplifying the target nucleic acid.

溶媒としては、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、ＭＥＳ（2-morpholinoethanesulfonic acid）、ＭＯＰＳ（3-morpholinopropanesulfonic acid）、ＨＥＰＥＳ（4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid）、ＣＡＰＳ（N-cyclohexyl-3-aminopropanesulfonic acid）等の緩衝液が挙げられ、典型的な実施態様においては、市販のＰＣＲ用緩衝液やＰＣＲキットに付属の緩衝液等をそのまま使用すればよい。 Examples of the solvent include Tris-HCl, Tricine, MES (2-morpholinoethanesulfonic acid), MOPS (3-morpholinopropanesulfonic acid), HEPES (4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazineethanesulfonic acid), and CAPS (N-cyclohexyl-3-). A buffer solution such as aminopropanesulfonic acid) can be mentioned, and in a typical embodiment, a commercially available buffer solution for PCR, a buffer solution attached to a PCR kit, or the like may be used as it is.

また、ＰＣＲ反応液には、グリセロール、ヘパリン、ベタイン、ＮａＮ３、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＭｇＳＯ４等が含まれていてもよい。 Further, the PCR reaction solution may contain glycerol, heparin, betaine, NaN3, KCl, MgCl2, 00544 and the like.

ＰＣＲは、通常、二本鎖核酸の一本鎖核酸への解離（解離工程）、プライマーの鋳型核酸へのアニーリング（アニーリング工程）、ＤＮＡポリメラーゼによるプライマーからの核酸配列の伸長（伸長工程）の３工程を含む。各工程の条件は特に制限されない。解離工程の条件は、例えば、９０℃〜９９℃、１秒間〜１２０秒間が好ましく、９２℃〜９５℃、１秒間〜６０秒間がより好ましい。アニーリング工程の条件は、例えば、４０℃〜７０℃、１秒間〜３００秒間が好ましく、５０℃〜７０℃、５秒間〜６０秒間がより好ましい。また、伸長工程の条件は、例えば、５０℃〜８０℃、１秒間〜３００秒間が好ましく、５０℃〜８０℃、５秒間〜６０秒間がより好ましい。サイクル数も特に制限されない。３工程を１サイクルとして、例えば、３０サイクル以上が好ましい。上限は特に制限されない。 PCR usually involves dissociation of a double-stranded nucleic acid into a single-stranded nucleic acid (dissociation step), annealing of a primer to a template nucleic acid (annealing step), and extension of a nucleic acid sequence from a primer by DNA polymerase (extension step). Includes steps. The conditions of each step are not particularly limited. The conditions of the dissociation step are, for example, preferably 90 ° C. to 99 ° C. for 1 second to 120 seconds, and more preferably 92 ° C. to 95 ° C. for 1 second to 60 seconds. The conditions of the annealing step are, for example, preferably 40 ° C. to 70 ° C. for 1 second to 300 seconds, and more preferably 50 ° C. to 70 ° C. for 5 seconds to 60 seconds. The conditions of the stretching step are, for example, preferably 50 ° C. to 80 ° C. for 1 second to 300 seconds, and more preferably 50 ° C. to 80 ° C. for 5 seconds to 60 seconds. The number of cycles is not particularly limited. With 3 steps as one cycle, for example, 30 cycles or more are preferable. The upper limit is not particularly limited.

例えば、合計１００サイクル以下、好ましくは７０サイクル以下、より好ましくは５０サイクル以下である。各工程の温度変化は、例えば、サーマルサイクラー等を用いて自動的に制御すればよい。なお、アニーリング工程と伸長工程とを同じ温度条件とし、２工程でＰＣＲを行ってもよい。 For example, the total is 100 cycles or less, preferably 70 cycles or less, and more preferably 50 cycles or less. The temperature change in each step may be automatically controlled by using, for example, a thermal cycler or the like. The annealing step and the extension step may be set to the same temperature condition, and PCR may be performed in two steps.

以上のようにして、ヒトＢＲＡＦのＶ６００変異が生ずる部位を含んだ塩基配列についての増幅産物を得ることができる。 As described above, an amplification product for a base sequence containing a site where a V600 mutation of human BRAF occurs can be obtained.

このようにして得られた増幅産物は、本開示のヒトＢＲＡＦのＶ６００変異検出用プローブとハイブリダイズさせて、ハイブリッドを形成させることができる。 The amplification product thus obtained can be hybridized with the V600 mutation detection probe of the human BRAF of the present disclosure to form a hybrid.

ハイブリッド形成工程では、上記増幅工程で得られた増幅産物の一本鎖増幅核酸と、ヒトＢＲＡＦのＶ６００変異が生ずる部位を含んだ塩基配列にハイブリダイズ可能な本開示のヒトＢＲＡＦのＶ６００変異検出用プローブとのハイブリッドを形成させる。上記一本鎖増幅核酸は、例えば、反応液を加熱し、上記増幅工程で得られた増幅産物である二本鎖増幅核酸を解離することで調製することができる。 In the hybrid forming step, for detecting the V600 mutation of the human BRAF of the present disclosure, which can hybridize to the base sequence containing the single-stranded amplified nucleic acid of the amplification product obtained in the amplification step and the site where the V600 mutation of human BRAF occurs. Form a hybrid with the probe. The single-stranded amplified nucleic acid can be prepared, for example, by heating the reaction solution and dissociating the double-stranded amplified nucleic acid which is the amplification product obtained in the amplification step.

本開示のヒトＢＲＡＦのＶ６００変異検出用プローブを反応液に添加するタイミングは特に制限されない。例えば、増幅工程前、増幅工程の開始時、増幅工程の途中、及び増幅工程後のいずれであってもよい。中でも、増幅工程前又は増幅工程の開始時に添加することが、増幅反応とハイブリダイゼーションとを連続的に行うことができるため好ましい。すなわち、上記増幅工程と上記ハイブリッド形成工程とが同時に進行することが、処理効率の観点から好ましい。 The timing of adding the human BRAF V600 mutation detection probe of the present disclosure to the reaction solution is not particularly limited. For example, it may be before the amplification step, at the start of the amplification step, during the amplification step, or after the amplification step. Above all, it is preferable to add it before the amplification step or at the start of the amplification step because the amplification reaction and hybridization can be continuously performed. That is, it is preferable that the amplification step and the hybrid forming step proceed at the same time from the viewpoint of processing efficiency.

上記反応液におけるヒトＢＲＡＦのＶ６００変異検出用プローブの添加割合は特に制限されない。例えば、ヒトＢＲＡＦのＶ６００変異検出用プローブを１０ｎｍｏｌ／Ｌ〜４００ｎｍｏｌ／Ｌの範囲となるように添加することが好ましく、２０ｎｍｏｌ／Ｌ〜２００ｎｍｏｌ／Ｌの範囲となるように添加することがより好ましい。 The addition ratio of the human BRAF V600 mutation detection probe to the above reaction solution is not particularly limited. For example, it is preferable to add the human BRAF V600 mutation detection probe in the range of 10 nmol / L to 400 nmol / L, and more preferably in the range of 20 nmol / L to 200 nmol / L.

上記一本鎖増幅核酸とヒトＢＲＡＦのＶ６００変異検出用プローブとのハイブリダイゼーションの手法及び条件には、特に制限はない。二本鎖増幅核酸を解離して一本鎖増幅核酸にすること、一本鎖核酸同士をハイブリダイズすることを目的として当業界で既知の条件をそのまま適用すればよい。 There are no particular restrictions on the method and conditions for hybridization of the above-mentioned single-strand amplified nucleic acid with the probe for detecting V600 mutations in human BRAF. Conditions known in the art may be applied as they are for the purpose of dissociating the double-stranded amplified nucleic acid into a single-stranded amplified nucleic acid and hybridizing the single-stranded nucleic acids with each other.

例えば、解離における加熱温度は、上記増幅産物が解離できる温度であれば特に制限されないが、例えば、８５℃〜９５℃である。加熱時間も特に制限されないが、通常、１秒間〜１０分間であり、好ましくは１秒間〜５分間である。また、解離した一本鎖増幅核酸と本開示のヒトＢＲＡＦのＶ６００変異検出用プローブとのハイブリダイズは、例えば、解離後、解離における加熱温度を降下させることによって行うことができる。温度条件は、例えば４０℃〜５０℃である。 For example, the heating temperature in dissociation is not particularly limited as long as the amplification product can be dissociated, but is, for example, 85 ° C. to 95 ° C. The heating time is also not particularly limited, but is usually 1 second to 10 minutes, preferably 1 second to 5 minutes. Further, the hybridization of the dissociated single-stranded amplified nucleic acid and the probe for detecting the V600 mutation of the human BRAF of the present disclosure can be performed, for example, by lowering the heating temperature in the dissociation after the dissociation. The temperature conditions are, for example, 40 ° C to 50 ° C.

ここで、上記増幅工程において、本開示のヒトＢＲＡＦのＶ６００変異検出用プローブと、上記したフォワードプライマー及びリバースプライマーとを共存させる場合であっても、本開示のヒトＢＲＡＦのＶ６００変異検出用プローブの３’末端のシトシンが蛍光色素で標識されているため、本開示のヒトＢＲＡＦのＶ６００変異検出用プローブ自体がＤＮＡポリメラーゼの反応対象となって伸長することはない。 Here, even when the human BRAF V600 mutation detection probe of the present disclosure and the forward primer and the reverse primer of the present disclosure coexist in the amplification step, the human BRAF V600 mutation detection probe of the present disclosure can be used. Since the cytosine at the 3'end is labeled with a fluorescent dye, the human BRAF V600 mutation detection probe itself of the present disclosure does not become a reaction target of DNA polymerase and extend.

また、本開示のヒトＢＲＡＦのＶ６００変異検出用プローブと同じ配列を有するが蛍光標識されていないプローブを併用してもよい。これにより、例えば、検出する蛍光強度を調節することができる等の利点が得られる。このような未標識プローブは、その３’末端にリン酸基が付加されていてもよい。 In addition, a probe having the same sequence as the human BRAF V600 mutation detection probe of the present disclosure but not fluorescently labeled may be used in combination. This has the advantage that, for example, the fluorescence intensity to be detected can be adjusted. Such an unlabeled probe may have a phosphate group added to its 3'end.

次に、ハイブリッドを含む試料溶液の温度を変化させることにより、ハイブリッドを解離させ、ハイブリッドの解離に基づくシグナルの変動を測定する。 Next, the hybrid is dissociated by changing the temperature of the sample solution containing the hybrid, and the fluctuation of the signal based on the dissociation of the hybrid is measured.

ハイブリッドの解離状態を示すシグナルの測定は、２６０ｎｍの吸光度測定でもよいが、標識した蛍光色素の波長に応じて適宜設定することが好ましい。標識した蛍光色素に応じた波長とすることで、検出感度を高めることができる。例えば、蛍光色素として、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅを用いる場合には、検出波長が４５０ｎｍ〜４８０ｎｍであることが好ましく、ＴＡＭＲＡを用いる場合には、検出波長が５８５ｎｍ〜７００ｎｍであることが好ましく、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ用いる場合には、検出波長が５１５ｎｍ〜５５５ｎｍであることが好ましい。 The measurement of the signal indicating the dissociated state of the hybrid may be the absorbance measurement at 260 nm, but it is preferably set appropriately according to the wavelength of the labeled fluorescent dye. The detection sensitivity can be increased by setting the wavelength according to the labeled fluorescent dye. For example, when Pacific Blue is used as the fluorescent dye, the detection wavelength is preferably 450 nm to 480 nm, and when TAMRA is used, the detection wavelength is preferably 585 nm to 700 nm, and when BODIPY FL is used. The detection wavelength is preferably 515 nm to 555 nm.

上記ハイブリッドの解離状態に基づくシグナルの変動は、反応液の温度を変化させて行う。例えば、一本鎖増幅核酸と本開示のヒトＢＲＡＦのＶ６００変異検出用プローブとのハイブリッドを含む上記反応液を加熱し、温度上昇に伴うシグナルの変動を測定する。前述のように、例えば、末端のＣ塩基が標識化された標識化プローブ（グアニン消光プローブ）を使用した場合、一本鎖増幅核酸とハイブリダイズした状態では蛍光が減少（又は消光）し、解離した状態では蛍光を発する。したがって、例えば、蛍光が減少（又は消光）しているハイブリッドを徐々に加熱し、温度上昇に伴う蛍光強度の増加を測定することにより、解離に基づくシグナルの変動を測定することができる。 The fluctuation of the signal based on the dissociation state of the hybrid is performed by changing the temperature of the reaction solution. For example, the reaction solution containing the hybrid of the single-stranded amplified nucleic acid and the V600 mutation detection probe of the human BRAF of the present disclosure is heated, and the fluctuation of the signal with increasing temperature is measured. As described above, for example, when a labeled probe (guanine quenching probe) labeled with a C base at the terminal is used, fluorescence is reduced (or quenched) and dissociated in a state of hybridizing with a single-stranded amplified nucleic acid. In this state, it emits fluorescence. Therefore, for example, the variation of the signal based on dissociation can be measured by gradually heating the hybrid whose fluorescence is decreasing (or quenching) and measuring the increase in fluorescence intensity with increasing temperature.

シグナルの変動を測定する際の温度範囲は、特に制限されないが、例えば、開始温度が室温〜８５℃、好ましくは２５℃〜７０℃であってよく、終了温度が４０℃〜１０５℃であってよい。また、温度の上昇速度は、特に制限されないが、例えば０．１℃／秒〜２０℃／秒であってよく、好ましくは０．３℃／秒〜５℃／秒である。 The temperature range for measuring the variation of the signal is not particularly limited, and for example, the start temperature may be room temperature to 85 ° C., preferably 25 ° C. to 70 ° C., and the end temperature may be 40 ° C. to 105 ° C. Good. The rate of temperature rise is not particularly limited, but may be, for example, 0.1 ° C./sec to 20 ° C./sec, preferably 0.3 ° C./sec to 5 ° C./sec.

なお、以上の説明では、上記蛍光強度測定工程においてハイブリッドを加熱し、温度上昇に伴う蛍光強度変動を測定するものとしたが、ハイブリッド形成時における蛍光強度の変動を測定するようにしてもよい。つまり、本開示のヒトＢＲＡＦのＶ６００変異検出用プローブを含む反応液の温度を降下させてハイブリッドを形成する際に、温度降下に伴う蛍光強度の変動を測定してもよい。 In the above description, the hybrid is heated in the fluorescence intensity measuring step to measure the fluctuation of the fluorescence intensity with the temperature rise, but the fluctuation of the fluorescence intensity at the time of forming the hybrid may be measured. That is, when the temperature of the reaction solution containing the V600 mutation detection probe of the human BRAF of the present disclosure is lowered to form a hybrid, the fluctuation of the fluorescence intensity due to the temperature drop may be measured.

具体例として、単独で蛍光強度を示し、かつハイブリッド形成により蛍光強度を示さない標識化プローブ（例えば、グアニン消光プローブ）を使用した場合、一本鎖増幅核酸と標識化プローブとが解離している状態では蛍光を発するが、温度の降下によりハイブリッドを形成すると、蛍光が減少（又は消光）する。したがって、例えば、反応液の温度を徐々に降下させて、温度降下に伴う蛍光強度の減少を測定することで、ハイブリッドの解離に基づくシグナルの変動を測定することができる。 As a specific example, when a labeled probe (for example, a guanine quenching probe) that exhibits fluorescence intensity alone and does not exhibit fluorescence intensity due to hybrid formation is used, the single-stranded amplified nucleic acid and the labeled probe are dissociated. It emits fluorescence in the state, but when a hybrid is formed by a decrease in temperature, the fluorescence decreases (or quenches). Therefore, for example, by gradually lowering the temperature of the reaction solution and measuring the decrease in fluorescence intensity with the temperature drop, it is possible to measure the fluctuation of the signal based on the dissociation of the hybrid.

次に、このシグナルの変動に基づいて、ハイブリッドのＴｍ値を決定する。 Next, the Tm value of the hybrid is determined based on the fluctuation of this signal.

Ｔｍ値の決定は、例えば、以下のようにして行うことができる。例えば、末端のＣ塩基が標識化された標識化プローブ（グアニン消光プローブ）を使用した場合、得られた蛍光強度の変動から、各温度における単位時間当たりの蛍光強度変化量を算出する。変化量を（−ｄ（蛍光強度増加量）／ｄｔ）とする場合は、例えば、最も低い値を示す温度をＴｍ値として決定することができる。また、変化量を（ｄ（蛍光強度増加量）／ｄｔ）とする場合は、例えば、最も高い値を示す温度をＴｍ値として決定することができる。 The Tm value can be determined, for example, as follows. For example, when a labeled probe (guanine quenching probe) labeled with a C base at the terminal is used, the amount of change in fluorescence intensity per unit time at each temperature is calculated from the obtained variation in fluorescence intensity. When the amount of change is (−d (amount of increase in fluorescence intensity) / dt), for example, the temperature showing the lowest value can be determined as the Tm value. Further, when the amount of change is (d (amount of increase in fluorescence intensity) / dt), for example, the temperature showing the highest value can be determined as the Tm value.

そして、このＴｍ値に基づいて、試料中の一本鎖核酸における、ヒトＢＲＡＦ遺伝子のＶ６００変異の存在を検出する。例えば、ヒトＢＲＡＦのＶ６００変異検出用プローブの、試料中の一本鎖核酸とのハイブリッドにおけるＴｍ値が、対照としての野生型ヒトＢＲＡＦの塩基配列とのハイブリッドにおけるＴｍ値よりも３℃以上、望ましくは５℃以上低ければ、試料中の一本鎖核酸における検出目的配列は、Ｖ６００変異を被っていると判断される。 Then, based on this Tm value, the presence of a V600 mutation of the human BRAF gene in the single-stranded nucleic acid in the sample is detected. For example, the Tm value of the human BRAF V600 mutation detection probe in a hybrid with a single-stranded nucleic acid in a sample is preferably 3 ° C. or higher than the Tm value in a hybrid with a base sequence of wild-type human BRAF as a control. If is lower than 5 ° C., it is determined that the detection target sequence in the single-stranded nucleic acid in the sample has a V600 mutation.

ここで、典型的な実施態様において、本開示のヒトＢＲＡＦのＶ６００変異検出用プローブを用いた場合、数あるヒトＢＲＡＦのＶ６００変異のうち、Ｖ６００Ｅ変異を始め、少なくともＶ６００Ｅ２変異、Ｖ６００Ｋ変異、Ｖ６００Ｒ変異及びＶ６００Ｄ変異においては、野生型ＢＲＡＦと比較して上記したＴｍ値は３℃以上低い。一方、Ｋ６０１Ｅ変異においては、野生型ＢＲＡＦとのＴｍ値の差異は３℃に満たず、ほぼ同一である。よって、本開示のヒトＢＲＡＦのＶ６００変異検出用プローブは、少なくとも上記したＶ６００変異を、野生型はもちろん、Ｋ６０１Ｅ変異からも峻別することが可能となっている。 Here, in a typical embodiment, when the probe for detecting the V600 mutation of the human BRAF of the present disclosure is used, among the many V600 mutations of the human BRAF, the V600E mutation, at least the V600E2 mutation, the V600K mutation, and the V600R mutation are included. And in the V600D mutation, the above-mentioned Tm value is 3 ° C. or more lower than that of the wild type BRAF. On the other hand, in the K601E mutation, the difference in Tm value from the wild-type BRAF is less than 3 ° C., which is almost the same. Therefore, the human BRAF V600 mutation detection probe of the present disclosure can distinguish at least the above-mentioned V600 mutation from not only the wild type but also the K601E mutation.

以下、本開示を実施例により更に具体的に説明するが、本開示はその主旨を越えない限り、以下の実施例に限定されるものではない。なお、特に断りのない限り、「部」は質量基準である。 Hereinafter, the present disclosure will be described in more detail with reference to Examples, but the present disclosure is not limited to the following Examples as long as the gist of the present disclosure is not exceeded. Unless otherwise specified, "parts" are based on mass.

＜プローブの検証＞
［プローブ］
それぞれ配列番号２、４及び５に示す塩基配列を有し、３’末端のシトシンが蛍光色素５−ＴＡＭＲＡで標識されている蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブＰ１、Ｐ３及びＰ４を日鉄住金環境株式会社に製造委託して人工的に合成したものを得た。これらプローブの塩基配列を下記表１に示す。 <Probe verification>
[probe]
Fluorescently labeled oligonucleotide probes P1, P3 and P4, which have the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 2, 4 and 5, respectively and whose cytosine at the 3'end is labeled with the fluorescent dye 5-TAMRA, were supplied to Nippon Steel & Sumitomo Metal Industries, Ltd. The production was outsourced to obtain an artificially synthesized product. The base sequences of these probes are shown in Table 1 below.

ここで、プローブＰ１の塩基配列は、野生型ヒトＢＲＡＦの対応塩基配列に対し、１８０１番目の塩基であるアデニン（Ａ）を、上記表１中にて大文字で示すシトシン（Ｃ）に置換した以外は完全一致である。 Here, the base sequence of the probe P1 is other than that the 1801st base, adenine (A), is replaced with cytosine (C) shown in capital letters in Table 1 above with respect to the corresponding base sequence of wild-type human BRAF. Is an exact match.

また、プローブＰ３の塩基配列は、前記特許文献１に「ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２」（同文献の配列番号２）として開示されている塩基配列（配列番号６）の塩基配列の３’末端を１塩基伸長して得た３’末端のシトシン（Ｃ）を蛍光色素５−ＴＡＭＲＡで標識したものであり、野生型ヒトＢＲＡＦの対応塩基配列と完全一致である。 Further, the base sequence of the probe P3 has 1 at the 3'end of the base sequence of the base sequence (SEQ ID NO: 6) disclosed as "SEQ ID No. 2" (SEQ ID NO: 2 of the same document) in Patent Document 1. The cytosine (C) at the 3'end obtained by base elongation is labeled with the fluorescent dye 5-TAMRA, which is completely identical to the corresponding base sequence of wild-type human BRAF.

さらに、プローブＰ４の塩基配列は、前記特許文献２に「Ｇｅｎｅｒａｌ ｐｒｏｂｅ」（同文献の配列番号３）として開示されている塩基配列（配列番号７）の塩基配列の３’末端を３塩基伸長して得た３’末端のシトシン（Ｃ）を蛍光色素５−ＴＡＭＲＡで標識したものであり、野生型ヒトＢＲＡＦの対応塩基配列と完全一致である。 Further, the base sequence of the probe P4 extends the 3'end of the base sequence of the base sequence (SEQ ID NO: 7) disclosed as "General probe" (SEQ ID NO: 3 of the same document) in Patent Document 2 by 3 bases. The 3'-terminal cytosine (C) obtained above was labeled with the fluorescent dye 5-TAMRA, which is completely identical to the corresponding nucleotide sequence of wild-type human BRAF.

なお、上記表１中の各プローブの塩基配列において大文字で示しているチミン（Ｔ）はＶ６００Ｅ変異において塩基置換を被る１７９９番目の塩基に対応する塩基である。 The thymine (T) shown in capital letters in the base sequence of each probe in Table 1 above is the base corresponding to the 1799th base that undergoes base substitution in the V600E mutation.

以上、上記表１に示すように、上記各プローブは、５’末端のチミン（Ｔ）塩基の数が相違している点、及び、プローブＰ１において１８０１番目の塩基が大文字で示すようにシトシン（Ｃ）で置換されている点を除き、同一の塩基配列を有している。 As described above, as shown in Table 1, the above probes differ in the number of thymine (T) bases at the 5'end, and cytosine (as the 1801st base in probe P1 is shown in capital letters). It has the same base sequence except that it is substituted with C).

［相補鎖］ [Complementary strand]

上記各プローブの相補鎖として、それぞれ配列番号８、９及び１０に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドＣ１、Ｃ２及びＣ３を日鉄住金環境株式会社に製造委託して人工的に合成したものを得た。これら相補鎖の塩基配列を下記表２に示す。 As complementary strands of each of the above probes, oligonucleotides C1, C2 and C3 having the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 8, 9 and 10, respectively, were outsourced to Nippon Steel & Sumitomo Metal Industries, Ltd. to obtain artificially synthesized ones. .. The base sequences of these complementary strands are shown in Table 2 below.

ここで、上記相補鎖Ｃ１、Ｃ２及びＣ３はそれぞれ、野生型ヒトＢＲＡＦ、Ｖ６００Ｅ変異ＢＲＡＦ及びＫ６０１Ｅ変異ＢＲＡＦの各コード領域の１７７４〜１８２３番目の塩基配列に対する相補鎖である。ここで、Ｖ６００Ｅ変異ＢＲＡＦにおいては、１７９９番目の塩基がチミン（Ｔ）からアデニン（Ａ）に置換されているので、これに相補的な上記相補鎖Ｃ２においてはこの置換されたアデニン（Ａ）に対応して上記表２にて大文字で示すチミン（Ｔ）となっている。また、Ｋ６０１Ｅ変異ＢＲＡＦにおいては、１８０１番目の塩基がアデニン（Ａ）からグアニン（Ｇ）に置換されているので、これに相補的な上記相補鎖Ｃ３においてはこの置換されたグアニン（Ｇ）に対応して上記表２にて大文字で示すシトシン（Ｃ）となっている。 Here, the complementary strands C1, C2 and C3 are complementary strands to the base sequences 1774 to 1823 of each coding region of wild-type human BRAF, V600E mutant BRAF and K601E mutant BRAF, respectively. Here, in the V600E mutant BRAF, the base at position 1799 is substituted from thymine (T) to adenine (A), so that the complementary strand C2 complementary to this is replaced with this substituted adenine (A). Correspondingly, it is thymine (T) shown in capital letters in Table 2 above. Further, in the K601E mutant BRAF, the base at position 1801 is substituted from adenine (A) to guanine (G), and thus the complementary strand C3, which is complementary to this, corresponds to this substituted guanine (G). Then, it is cytosine (C) shown in capital in Table 2 above.

そして、下記表３に示す組成で反応液を調製し、下記表４に示す温度条件でＴｍ値の測定を行った。すなわち、反応液を９５℃で１秒間加熱してプローブと相補鎖と一旦乖離させた後、４０℃６０秒間で再びプローブと相補鎖とをハイブリダイズさせ、そして、３秒間に１℃の割合で反応液を７５℃まで加熱し、プローブと相補鎖とを乖離させた。なお、Ｔｍ値の測定は、自動遺伝子解析装置（商品名ｉ−ｄｅｎｓｙ、アークレイ社製）を用いて行った。 Then, a reaction solution was prepared with the composition shown in Table 3 below, and the Tm value was measured under the temperature conditions shown in Table 4 below. That is, the reaction solution is heated at 95 ° C. for 1 second to temporarily dissociate the probe and the complementary strand, then hybridize the probe and the complementary strand again at 40 ° C. for 60 seconds, and then at a rate of 1 ° C. for 3 seconds. The reaction was heated to 75 ° C. to dissociate the probe from the complementary strand. The Tm value was measured using an automatic gene analyzer (trade name i-densy, manufactured by ARKRAY, Inc.).

Ｔｍ値の測定結果を図１、図３及び図５に示す。図１は、プローブＰ１と各相補鎖との間の乖離曲線である。図３は、プローブＰ３と各相補鎖との間の乖離曲線である。図５は、プローブＰ４と各相補鎖との間の乖離曲線である。図１、図３及び図５においてはそれぞれ、プローブと野生型ＢＲＡＦ相補鎖（Ｃ１）との乖離曲線は実線（ＷＴ）で、プローブとＶ６００Ｅ変異ＢＲＡＦ相補鎖（Ｃ２）との乖離曲線は破線（Ｖ６００Ｅ）で、及びプローブとＫ６０１Ｅ変異ＢＲＡＦ相補鎖（Ｃ３）との乖離曲線は一点鎖線（Ｋ６０１Ｅ）にて示している。各乖離曲線のピークは、プローブと相補鎖との乖離が最も多く発生している温度に相当し、この温度がＴｍ値である。 The measurement results of the Tm value are shown in FIGS. 1, 3 and 5. FIG. 1 is a deviation curve between the probe P1 and each complementary strand. FIG. 3 is a deviation curve between the probe P3 and each complementary strand. FIG. 5 is a deviation curve between the probe P4 and each complementary strand. In FIGS. 1, 3 and 5, the deviation curve between the probe and the wild-type BRAF complementary strand (C1) is a solid line (WT), and the deviation curve between the probe and the V600E mutant BRAF complementary strand (C2) is a broken line (C2). In V600E), and the divergence curve between the probe and the K601E mutant BRAF complementary strand (C3) is shown by the alternate long and short dash line (K601E). The peak of each dissociation curve corresponds to the temperature at which the dissociation between the probe and the complementary strand occurs most, and this temperature is the Tm value.

［プローブＰ１］
まず、図１に示すように、プローブＰ１は、野生型ＢＲＡＦ相補鎖（Ｃ１）とのＴｍ値が５９℃、及び、Ｋ６０１Ｅ変異ＢＲＡＦ相補鎖（Ｃ３）とのＴｍ値が５８℃とほぼ同じであった。これに対し、プローブＰ１とＶ６００Ｅ変異ＢＲＡＦ相補鎖（Ｃ２）とのＴｍ値は５３℃であり、Ｃ１及びＣ３とのＴｍ値より５℃以上低い値となっていた。 [Probe P1]
First, as shown in FIG. 1, the probe P1 has a Tm value of 59 ° C. with the wild-type BRAF complementary strand (C1) and a Tm value of 58 ° C. with the K601E mutant BRAF complementary strand (C3). there were. On the other hand, the Tm value of the probe P1 and the V600E mutant BRAF complementary strand (C2) was 53 ° C, which was 5 ° C or more lower than the Tm value of C1 and C3.

ここで、図２は、プローブＰ１と、各相補鎖との間で、相補的な塩基対を対応させて示したものである。本図に示すように、プローブＰ１と相補鎖Ｃ１との間では、Ｐ１において大文字で示すシトシン（Ｃ）の位置で、相補鎖の対応する位置のチミン（Ｔ）とミスマッチが生じている。また、プローブＰ１と相補鎖Ｃ３との間では、同じくＰ１において大文字で示すシトシン（Ｃ）の位置で、Ａ１８０１Ｇ変異に伴う相補的なシトシン（Ｃ）とミスマッチが生じている。これらに対し、プローブＰ１と相補鎖Ｃ２との間では、同じくＰ１において大文字で示すシトシン（Ｃ）の位置に加え、大文字で示すチミン（Ｔ）の位置において、Ｔ１７９９Ａ変異に伴う相補的なチミン（Ｔ）とミスマッチが生じている。 Here, FIG. 2 shows the complementary base pairs corresponding to each other between the probe P1 and each complementary strand. As shown in this figure, a mismatch occurs between the probe P1 and the complementary strand C1 at the position of cytosine (C) indicated by the capital letter in P1 with thymine (T) at the corresponding position of the complementary strand. Further, between the probe P1 and the complementary strand C3, a mismatch with the complementary cytosine (C) associated with the A1801G mutation occurs at the position of cytosine (C) also indicated by the capital letter in P1. On the other hand, between the probe P1 and the complementary strand C2, in addition to the position of cytosine (C) indicated by the capital letter in P1, the position of the thymine (T) indicated by the capital letter is the complementary thymine associated with the T1799A mutation. There is a mismatch with T).

つまり、プローブＰ１と相補鎖Ｃ１との間、及び、プローブＰ１と相補鎖Ｃ３との間ではいずれも１塩基でミスマッチが生じているのに対し、プローブＰ１と相補鎖Ｃ２との間では２塩基でミスマッチが生じている。これに伴い、プローブＰ１と相補鎖Ｃ２との間のＴｍ値が、プローブＰ１と相補鎖Ｃ１との間のＴｍ値及びプローブＰ１と相補鎖Ｃ３との間のＴｍ値より低くなっているものと推察される。 That is, a mismatch occurs at 1 base between the probe P1 and the complementary strand C1 and between the probe P1 and the complementary strand C3, whereas there is a mismatch between the probe P1 and the complementary strand C2 at 2 bases. There is a mismatch in. Along with this, the Tm value between the probe P1 and the complementary strand C2 is lower than the Tm value between the probe P1 and the complementary strand C1 and the Tm value between the probe P1 and the complementary strand C3. Inferred.

以上によって、プローブＰ１は、Ｔｍ値の差異によって、Ｖ６００Ｅ変異を、野生型及びＫ６０１Ｅ変異と峻別することが可能なプローブであることが判明した。 From the above, it was found that the probe P1 is a probe capable of distinguishing the V600E mutation from the wild type and the K601E mutation by the difference in Tm value.

［プローブＰ３］
次に、図３に示すように、プローブＰ３は、野生型ＢＲＡＦ相補鎖（Ｃ１）とのＴｍ値が６５℃であったのに対し、Ｖ６００Ｅ変異ＢＲＡＦ相補鎖（Ｃ２）とのＴｍ値が５９℃、また、Ｋ６０１Ｅ変異ＢＲＡＦ相補鎖（Ｃ３）とのＴｍ値が５８℃と、いずれもＣ１とのＴｍ値より６℃以上低く、Ｃ２とのＴｍ値とＣ３とのＴｍ値とはほぼ同じであった。 [Probe P3]
Next, as shown in FIG. 3, the probe P3 had a Tm value of 65 ° C. with the wild-type BRAF complementary strand (C1), whereas the probe P3 had a Tm value of 59 with the V600E mutant BRAF complementary strand (C2). The Tm value with the K601E mutant BRAF complementary strand (C3) is 58 ° C., which is 6 ° C. or more lower than the Tm value with C1, and the Tm value with C2 and the Tm value with C3 are almost the same. there were.

これは、図４に示すように、プローブＰ３と相補鎖Ｃ１との間ではミスマッチは生じていないのに対し、プローブＰ３と相補鎖Ｃ２との間、及び、プローブＰ３１と相補鎖Ｃ３との間ではいずれも１塩基のミスマッチが生じているためであると推察される。 This is because, as shown in FIG. 4, there is no mismatch between the probe P3 and the complementary strand C1, whereas between the probe P3 and the complementary strand C2 and between the probe P31 and the complementary strand C3. In each case, it is presumed that this is because a mismatch of 1 base has occurred.

以上によってプローブＰ３は、野生型とのＴｍ値の差異は判別できるものの、Ｖ６００Ｅ変異とＫ６０１Ｅ変異との峻別が不可能なプローブであることが判明した。 From the above, it was found that the probe P3 is a probe that cannot be distinguished from the V600E mutation and the K601E mutation, although the difference in Tm value from the wild type can be discriminated.

［プローブＰ４］ [Probe P4]

そして、図５に示すように、プローブＰ４は、野生型ＢＲＡＦ相補鎖（Ｃ１）とのＴｍ値が６６℃であったのに対し、Ｖ６００Ｅ変異ＢＲＡＦ相補鎖（Ｃ２）とのＴｍ値が６０℃、また、Ｋ６０１Ｅ変異ＢＲＡＦ相補鎖（Ｃ３）とのＴｍ値も６０℃と、いずれもＣ１とのＴｍ値より６℃低く、Ｃ２とのＴｍ値とＣ３とのＴｍ値とはほぼ同じであった。 As shown in FIG. 5, the probe P4 had a Tm value of 66 ° C. with the wild-type BRAF complementary strand (C1), whereas the probe P4 had a Tm value of 60 ° C. with the V600E mutant BRAF complementary strand (C2). In addition, the Tm value with the K601E mutant BRAF complementary strand (C3) was also 60 ° C., which was 6 ° C. lower than the Tm value with C1, and the Tm value with C2 and the Tm value with C3 were almost the same. ..

これもまた、図６に示すように、プローブＰ４と相補鎖Ｃ１との間ではミスマッチは生じていないのに対し、プローブＰ４と相補鎖Ｃ２との間、及び、プローブＰ４と相補鎖Ｃ３との間ではいずれも１塩基のミスマッチが生じているためであると推察される。 Again, as shown in FIG. 6, there is no mismatch between the probe P4 and the complementary strand C1, whereas between the probe P4 and the complementary strand C2 and between the probe P4 and the complementary strand C3. It is presumed that this is because there is a mismatch of 1 base between them.

以上によってプローブＰ４も、野生型とのＴｍ値の差異は判別できるものの、Ｖ６００Ｅ変異とＫ６０１Ｅ変異との峻別が不可能なプローブであることが判明した。 From the above, it was found that the probe P4 is also a probe in which it is impossible to distinguish between the V600E mutation and the K601E mutation, although the difference in Tm value from the wild type can be discriminated.

［プローブについて小括］
以上のまとめとして、各プローブと各相補鎖との間のＴｍ値を下記表５に示す。 [Summary of probe]
As a summary of the above, the Tm value between each probe and each complementary strand is shown in Table 5 below.

以上より、プローブＰ３及びプローブＰ４はいずれも、Ｖ６００Ｅ変異をＫ６０１Ｅ変異と区別することが不可能であるが、プローブＰ１は、Ｖ６００Ｅ変異を、野生型のみならずＫ６０１Ｅ変異とも峻別することが可能であることが分かった。このプローブＰ１の塩基配列は、野生型のｃＤＮＡ配列に準拠し、この配列の１８０１番目の塩基に相当するアデニン（Ａ）がシトシン（Ｃ）に置換されている。このシトシン（Ｃ）は、野生型の相補鎖におけるチミン（Ｔ）、Ｖ６００Ｅ変異の相補鎖におけるチミン（Ｔ）、及びＫ６０１Ｅ変異の相補鎖におけるシトシン（Ｃ）のいずれとも相補的でない塩基が選ばれている。この置換は、１８０１番目の塩基において野生型、Ｖ６００Ｅ変異及びＫ６０１Ｅ変異のいずれともミスマッチを起こさせることで、結果としてＡ１８０１Ｇ変異を無効化することに成功している。また、プローブＰ１において１７９９番目の塩基であるチミン（Ｔ）は、野生型の相補鎖及びＫ６０１Ｅ変異の相補鎖におけるアデニン（Ａ）とは相補的であるが、Ｖ６００Ｅ変異の相補鎖のチミン（Ｔ）とは相補的でないため、Ｖ６００Ｅ変異を野生型からもＫ６０１Ｅ変異からも峻別することが可能となっている。 From the above, it is impossible for both the probe P3 and the probe P4 to distinguish the V600E mutation from the K601E mutation, but the probe P1 can distinguish the V600E mutation not only from the wild type but also from the K601E mutation. It turned out that there was. The base sequence of this probe P1 conforms to the wild-type cDNA sequence, and adenine (A) corresponding to the 1801st base of this sequence is replaced with cytosine (C). As this cytosine (C), a base that is not complementary to any of thymine (T) in the wild-type complementary strand, thymine (T) in the complementary strand of the V600E mutation, and cytosine (C) in the complementary strand of the K601E mutation is selected. ing. This substitution has succeeded in nullifying the A1801G mutation by causing a mismatch with any of the wild-type, V600E and K601E mutations at base 1801. In addition, thymine (T), which is the 1799th base in probe P1, is complementary to adenine (A) in the wild-type complementary strand and the complementary strand of the K601E mutation, but thymine (T) in the complementary strand of the V600E mutation. ), So it is possible to distinguish the V600E mutation from both the wild type and the K601E mutation.

＜他のＶ６００変異＞
次に、上記プローブＰ１を用いて、Ｖ６００Ｅ変異以外の他の変異の検出を試みた。 <Other V600 mutations>
Next, using the probe P1, an attempt was made to detect mutations other than the V600E mutation.

［相補鎖］
プローブＰ１の相補鎖として、上記で使用した配列番号８の相補鎖Ｃ１（野生型）及び配列番号９の相補鎖Ｃ１（Ｖ６００Ｅ変異）に加えて、それぞれ配列番号１１〜配列番号１４に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドＣ４〜Ｃ７を日鉄住金環境株式会社に製造委託して人工的に合成したものを得た。これら相補鎖の塩基配列を下記表６に示す。 [Complementary strand]
As the complementary strand of the probe P1, in addition to the complementary strand C1 (wild type) of SEQ ID NO: 8 and the complementary strand C1 (V600E mutation) of SEQ ID NO: 9 used above, the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 11 to 14 respectively. The oligonucleotides C4 to C7 having the above were outsourced to Nittetsu Sumikin Environmental Co., Ltd. to obtain artificially synthesized ones. The base sequences of these complementary strands are shown in Table 6 below.

ここで、上記相補鎖Ｃ１及びＣ２はそれぞれ、前記表２の説明で言及したとおりである。上記相補鎖Ｃ４はＶ６００Ｅ２変異ＢＲＡＦ遺伝子に由来し、この相補鎖においては、ＴＧ１７９９＿１８００ＡＡ変異によって、これに相補的なチミン（Ｔ）２個で上記大文字のように置換されている。上記相補鎖Ｃ５はＶ６００Ｋ変異ＢＲＡＦ遺伝子に由来し、この相補鎖においては、ＧＴ１７９８＿１７９９ＡＡ変異によって、これに相補的なチミン（Ｔ）２個で上記大文字のように置換されている。上記相補鎖Ｃ６はＶ６００Ｒ変異ＢＲＡＦ遺伝子に由来し、この相補鎖においては、ＧＴ１７９８＿１７９９ＡＧ変異によって、これに相補的なチミン（Ｔ）及びシトシン（Ｃ）で上記大文字のように置換されている。上記相補鎖Ｃ７はＶ６００Ｄ変異ＢＲＡＦ遺伝子に由来し、この相補鎖においては、ＴＧ１７９９＿１８００ＡＴ変異によって、これに相補的なチミン（Ｔ）及びアデニン（Ａ）で上記大文字のように置換されている。 Here, the complementary strands C1 and C2 are as described in the description of Table 2 respectively. The complementary strand C4 is derived from the V600E2 mutant BRAF gene, in which the complementary strand is replaced with two complementary thymines (T) by the TG1799_1800AA mutation as shown in the capital letters. The complementary strand C5 is derived from the V600K mutant BRAF gene, in which the complementary strand is replaced with two complementary thymines (T) by the GT1798-1799AA mutation as shown in the capital letters. The complementary strand C6 is derived from the V600R mutant BRAF gene, in which the complementary strand is replaced with thymine (T) and cytosine (C) complementary thereto by the GT1798-1799AG mutation as shown in the capital letters. The complementary strand C7 is derived from the V600D mutant BRAF gene, and the complementary strand is replaced with thymine (T) and adenine (A) complementary thereto by the TG1799_1800AT mutation as shown in the capital letters.

そして、下記表７に示す組成で反応液を調製し、ＰＣＲによって増幅を行いつつ、プローブＰ１を各相補鎖とハイブリダイズさせた。 Then, a reaction solution was prepared with the composition shown in Table 7 below, and the probe P1 was hybridized with each complementary strand while amplifying by PCR.

その後、前記表４に示す温度条件でＴｍ値の測定を行った。すなわち、反応液を９５℃で１秒間加熱してプローブと相補鎖と一旦乖離させた後、４０℃６０秒間で再びプローブと相補鎖とをハイブリダイズさせ、そして、３秒間に１℃の割合で反応液を７５℃まで加熱し、プローブと相補鎖とを乖離させた。なお、Ｔｍ値の測定は、自動遺伝子解析装置（商品名ｉ−ｄｅｎｓｙ、アークレイ社製）を用いて行った。 Then, the Tm value was measured under the temperature conditions shown in Table 4. That is, the reaction solution is heated at 95 ° C. for 1 second to temporarily dissociate the probe and the complementary strand, then hybridize the probe and the complementary strand again at 40 ° C. for 60 seconds, and then at a rate of 1 ° C. for 3 seconds. The reaction was heated to 75 ° C. to dissociate the probe from the complementary strand. The Tm value was measured using an automatic gene analyzer (trade name i-densy, manufactured by ARKRAY, Inc.).

Ｔｍ値の測定結果を図７に示す。図７は、プローブＰ１と各相補鎖との間の乖離曲線である。図７においては、プローブＰ１と野生型ＢＲＡＦ相補鎖（Ｃ１）との乖離曲線は実線（ＷＴ）で、プローブＰ１とＶ６００Ｅ変異ＢＲＡＦ相補鎖（Ｃ２）との乖離曲線は太い破線（Ｖ６００Ｅ）で、プローブＰ１とＶ６００Ｅ２変異ＢＲＡＦ相補鎖（Ｃ４）との乖離曲線は細い破線（Ｖ６００Ｅ２）で、プローブＰ１とＶ６００Ｋ変異ＢＲＡＦ相補鎖（Ｃ５）との乖離曲線は太い一点鎖線（Ｖ６００Ｋ）で、プローブＰ１とＶ６００Ｒ変異ＢＲＡＦ相補鎖（Ｃ６）との乖離曲線は細い一点鎖線（Ｖ６００Ｋ）で、プローブＰ１とＶ６００Ｄ変異ＢＲＡＦ相補鎖（Ｃ７）との乖離曲線は太い点線（Ｖ６００Ｄ）で、及び相補鎖の代わりに蒸留水を用いた陰性対照における曲線は細い点線（ＤＷ）で、それぞれ示している。各乖離曲線のピークは、プローブと相補鎖との乖離が最も多く発生している温度に相当し、この温度がＴｍ値である。プローブＰ１と各相補鎖との間のＴｍ値及び野生型（ＷＴ）とのＴｍ値の差（ΔＴｍ）を下記表８に示す。 The measurement result of the Tm value is shown in FIG. FIG. 7 is a deviation curve between the probe P1 and each complementary strand. In FIG. 7, the deviation curve between the probe P1 and the wild-type BRAF complementary chain (C1) is a solid line (WT), and the deviation curve between the probe P1 and the V600E mutant BRAF complementary chain (C2) is a thick broken line (V600E). The divergence curve between the probe P1 and the V600E2 mutant BRAF complementary chain (C4) is a thin dashed line (V600E2), and the divergence curve between the probe P1 and the V600K mutant BRAF complementary chain (C5) is a thick dashed line (V600K) with the probe P1. The divergence curve with the V600R mutant BRAF complementary chain (C6) is a thin alternate long and short dash line (V600K), and the divergence curve between the probe P1 and the V600D mutant BRAF complementary chain (C7) is a thick dotted line (V600D), and instead of the complementary chain. The curves in the negative control with distilled water are shown by thin dotted lines (DW), respectively. The peak of each dissociation curve corresponds to the temperature at which the dissociation between the probe and the complementary strand occurs most, and this temperature is the Tm value. The difference (ΔTm) between the Tm value between the probe P1 and each complementary strand and the Tm value between the wild type (WT) and the wild type (WT) is shown in Table 8 below.

以上より、Ｖ６００Ｅ変異、Ｖ６００Ｅ２変異、Ｖ６００Ｋ変異、Ｖ６００Ｒ変異及びＶ６００Ｄ変異のいずれも、野生型よりＴｍ値が低かった。そして、Ｖ６００Ｅ２変異、Ｖ６００Ｋ変異、Ｖ６００Ｒ変異及びＶ６００Ｄ変異におけるΔＴｍはＶ６００Ｅ変異より大きかった。以上より、少なくとも上記Ｖ６００変異はプローブＰ１により、野生型及びＫ６０１Ｅ変異から峻別することが可能であることが分かった。 From the above, all of the V600E mutation, V600E2 mutation, V600K mutation, V600R mutation and V600D mutation had lower Tm values than the wild type. The ΔTm in the V600E2 mutation, V600K mutation, V600R mutation and V600D mutation was larger than that in the V600E mutation. From the above, it was found that at least the above V600 mutation can be distinguished from the wild type and the K601E mutation by the probe P1.

＜プローブＰ２＞
前記プローブＰ１の他に、配列番号３に示す塩基配列を有し、３’末端のシトシンが蛍光色素５−ＴＡＭＲＡで標識されている蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブＰ２を日鉄住金環境株式会社に製造委託して人工的に合成したものを得た。このプローブの塩基配列は下記のとおりである。 <Probe P2>
In addition to the probe P1, a fluorescently labeled oligonucleotide probe P2 having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3 and having cytosine at the 3'end labeled with the fluorescent dye 5-TAMRA was outsourced to Nippon Steel & Sumitomo Metal Industries, Ltd. To obtain an artificially synthesized product. The base sequence of this probe is as follows.

Ｐ２：tttggtctagctacagTgTaatc-(TAMRA)（配列番号３） P2: tttggtctagctacagTgTaatc- (TAMRA) (SEQ ID NO: 3)

ここで、プローブＰ２の塩基配列は、野生型ヒトＢＲＡＦの対応塩基配列に対し、１８０１番目の塩基であるアデニン（Ａ）を、上記にて３’末端側で大文字で示すチミン（Ｔ）に置換した以外は完全一致である。この置換されたチミン（Ｔ）は、前記プローブＰ１において対応する位置にあるシトシン（Ｃ）と同様、野生型の相補鎖におけるチミン（Ｔ）、Ｖ６００Ｅ変異の相補鎖におけるチミン（Ｔ）、及びＫ６０１Ｅ変異の相補鎖におけるシトシン（Ｃ）のいずれとも相補的でない塩基としての意義を有する。よって、この置換は、プローブＰ１の場合と同様、１８０１番目の塩基において野生型、Ｖ６００Ｅ変異及びＫ６０１Ｅ変異のいずれともミスマッチを起こさせることで、結果としてＡ１８０１Ｇ変異を無効化しつつ、１７９９番目の塩基であるチミン（Ｔ）が、プローブＰ１と同様に、野生型の相補鎖及びＫ６０１Ｅ変異の相補鎖におけるアデニン（Ａ）とは相補的であるが、Ｖ６００Ｅ変異の相補鎖のチミン（Ｔ）とは相補的でないことで、Ｖ６００Ｅ変異を野生型からもＫ６０１Ｅ変異からも峻別することを可能とすることが強く推認される。 Here, in the base sequence of probe P2, adenine (A), which is the 1801st base, is replaced with thymine (T) indicated by uppercase letters on the 3'end side above with respect to the corresponding base sequence of wild-type human BRAF. Except for the fact that it is an exact match. The substituted thymine (T), like cytosine (C) at the corresponding position in probe P1, is thymine (T) in the wild-type complementary strand, thymine (T) in the complementary strand of the V600E mutation, and K601E. It has significance as a base that is not complementary to any of cytosine (C) in the complementary strand of the mutation. Therefore, as in the case of probe P1, this substitution causes a mismatch with any of the wild-type, V600E mutation, and K601E mutation at the 1801st base, and as a result, invalidates the A1801G mutation and at the 1799th base. A timine (T), like probe P1, is complementary to adenin (A) in the wild-type complementary strand and the complementary strand of the K601E mutation, but complementary to timine (T) in the complementary strand of the V600E mutation. It is strongly inferred that the non-target makes it possible to distinguish the V600E mutation from both the wild type and the K601E mutation.

このことを検証するため、前記した、ソフトウェア「Ｍｅｌｔｃａｌｃ ９９ ｆｒｅｅ」にて、プローブＰ２の塩基配列と、前記表６に示した各Ｖ６００変異の相補鎖Ｃ１、Ｃ２及びＣ４〜Ｃ７の配列、並びに前記表２に示したＫ６０１Ｅ変異の相補鎖Ｃ３とのＴｍ値を計算した。その結果を下記表９に示す。 In order to verify this, in the above-mentioned software "Meltical 99 free", the nucleotide sequence of the probe P2, the sequences of the complementary strands C1, C2 and C4 to C7 of each V600 mutation shown in Table 6 above, and the above-mentioned The Tm value with the complementary strand C3 of the K601E mutation shown in Table 2 was calculated. The results are shown in Table 9 below.

上記表９から、プローブＰ２と各Ｖ６００変異の相補鎖とのＴｍ値は、野生型のＴｍ値よりも６℃以上低くなった。一方、プローブＰ２とＫ６０１Ｅ変異とのＴｍ値は、野生型のＴｍ値よりも１．５℃しか低くなっていなかった。よって、プローブＰ２は、ＢＲＡＦ遺伝子における各Ｖ６００変異を、野生型及びＫ６０１Ｅ変異に対して十分峻別可能であることが強く示唆された。 From Table 9 above, the Tm value of the probe P2 and the complementary strand of each V600 mutation was 6 ° C. or more lower than that of the wild-type Tm value. On the other hand, the Tm value of the probe P2 and the K601E mutation was only 1.5 ° C. lower than that of the wild type Tm value. Therefore, it was strongly suggested that the probe P2 can sufficiently distinguish each V600 mutation in the BRAF gene from the wild type and the K601E mutation.

本発明は、ヒトＢＲＡＦのＶ６００変異検出によって、様々な悪性腫瘍における分子標的薬の適用の可否の判断に利用可能である。 The present invention can be used to determine the applicability of molecular-targeted drugs in various malignant tumors by detecting V600 mutations in human BRAF.

Claims (6)

配列番号１に示す塩基配列において、５’末端から数えて１９番目に位置するアデニンが、シトシンともチミンとも相補的でない塩基に置換されているとともに、３’末端のシトシンが蛍光色素で標識されている蛍光標識オリゴヌクレオチドである、ヒトＢＲＡＦのＶ６００変異検出用プローブ。 In the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1, adenine located at the 19th position counting from the 5'end is replaced with a base that is not complementary to cytosine or thymine, and cytosine at the 3'end is labeled with a fluorescent dye. A probe for detecting V600 mutations in human BRAF, which is a fluorescently labeled oligonucleotide. 配列番号２又は配列番号３に示す塩基配列を有する、請求項１に記載のヒトＢＲＡＦのＶ６００変異検出用プローブ。 The probe for detecting a V600 mutation of human BRAF according to claim 1, which has the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3. 前記蛍光色素が、フルオレセイン、リン光体、ローダミン及びその誘導体、並びにポリメチン色素誘導体からなる群から選択される、請求項１又は２に記載のヒトＢＲＡＦのＶ６００変異検出用プローブ。 The probe for detecting V600 mutations in human BRAF according to claim 1 or 2, wherein the fluorescent dye is selected from the group consisting of fluorescein, phosphorescent bodies, rhodamine and its derivatives, and polymethine dye derivatives. 前記ローダミンの誘導体は、５−カルボキシテトラメチルローダミンである、請求項３に記載のヒトＢＲＡＦのＶ６００変異検出用プローブ。 The probe for detecting V600 mutations in human BRAF according to claim 3, wherein the derivative of rhodamine is 5-carboxytetramethylrhodamine. 請求項１から請求項４までのいずれか１項に記載のヒトＢＲＡＦのＶ６００変異検出用プローブを試料中の一本鎖核酸と接触させて、前記ヒトＢＲＡＦのＶ６００変異検出用プローブと前記一本鎖核酸とのハイブリッドを形成させる工程、
前記ハイブリッドを含む試料溶液の温度を変化させることにより、前記ハイブリッドを解離させ、前記ハイブリッドの解離に基づくシグナルの変動を測定する工程、
前記シグナルの変動に基づいて、前記ハイブリッドのＴｍ値を決定する工程、及び、
前記Ｔｍ値に基づいて、前記試料中の一本鎖核酸における、ヒトＢＲＡＦ遺伝子の変異の存在を検出する工程、
を含む、ヒトＢＲＡＦのＶ６００変異の検出方法。 The human BRAF V600 mutation detection probe according to any one of claims 1 to 4 is brought into contact with the single-stranded nucleic acid in the sample, and the human BRAF V600 mutation detection probe and the single one thereof. The process of forming a hybrid with a chain nucleic acid,
A step of dissociating the hybrid by changing the temperature of a sample solution containing the hybrid and measuring a signal variation based on the dissociation of the hybrid.
The step of determining the Tm value of the hybrid based on the fluctuation of the signal, and
A step of detecting the presence of a mutation in the human BRAF gene in a single-stranded nucleic acid in the sample based on the Tm value.
A method for detecting a V600 mutation in human BRAF, which comprises. 前記試料が、生体から採取した固形組織、血液、喀痰、気管支洗浄液又は胸水である、請求項５に記載のヒトＢＲＡＦのＶ６００変異の検出方法。 The method for detecting a V600 mutation in human BRAF according to claim 5, wherein the sample is solid tissue, blood, sputum, bronchial lavage fluid or pleural effusion collected from a living body.
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