JP2021013373A - 微生物膜透過剤、複合体、これを用いた微生物細胞に化合物を送達する方法、殺菌剤、抗菌剤及びラベル化剤 - Google Patents
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Landscapes
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Abstract
Description
〔式(I)及び式(II)中、nは独立して1〜3の整数であり、アミノ酸残基は(R)体又は(S)体のいずれであってもよい。式(II)中、mは1〜5の整数、R1及びR2はそれぞれ独立に疎水性置換基を表す。式(I)及び式(II)中、*で表される部位は、隣接する部位との結合部位を表す。〕
[2] 第一の膜透過性ペプチドが、(S)−2,5−ジアミノペンタン酸(Orn)、(R)−2,5−ジアミノペンタン酸(Orn)、(S)−2,4−ジアミノブタン酸(Dab)、(R)−2,4−ジアミノブタン酸(Dab)、(S)−2,3−ジアミノプロピオン酸(Dap)及び(R)−2,3−ジアミノプロピオン酸(Dap)からなる群より独立して選択される4〜26個の連続したアミノ酸残基からなる膜透過性ペプチドを含む、[1]に記載の微生物膜透過剤。
[3] 前記第一の膜透過性ペプチドが、少なくとも4個の連続したOrn又はDabを含む、[1]又は[2]に記載の微生物膜透過剤。
[4] 前記第一の膜透過性ペプチドが、5〜26個の連続したOrn又はDabからなるものである、[1]〜[3]のいずれか1つに記載の微生物膜透過剤。
[5] 前記第一の膜透過性ペプチドが、5、6、7、8、9、10、11若しくは12個の連続した(S)−Orn又は5、6、7、8、9、10、11若しくは12個の連続した(S)−Dabからなるものである、[1]〜[4]のいずれか1つに記載の微生物膜透過剤。
[6] 前記第一の膜透過性ペプチドが、6〜26個の連続した同じアミノ酸残基からなるものである、[1]〜[5]のいずれか1つに記載の微生物膜透過剤。
[7] 前記第一の膜透過性ペプチド又は前記第二の膜透過性ペプチドが、前記式(I)のアミノ酸残基に加えて、1若しくは数個のリジン(Lys)残基若しくはアルギニン(Arg)残基を含む、[1]〜[6]のいずれか1つに記載の微生物膜透過剤。
[8] 前記第一の膜透過性ペプチドが、前記4〜26個のそれぞれ独立して選択される式(I)のアミノ酸残基からなるブロックを複数有し、前記複数のブロックの間の少なくとも1カ所に、前記式(I)のアミノ酸残基以外のアミノ酸残基を1個又は2個以上連続して含む、[1]〜[7]のいずれか1つに記載の微生物膜透過剤。
[9] 前記式(I)のアミノ酸残基以外のアミノ酸残基が、置換基として標識分子を有するリジン(Lys)残基、又は、置換基として標識分子を有するアルギニン(Arg)残基を含む、[8]に記載の微生物膜透過剤。
[10] 前記微生物が、真正細菌及び古細菌を含む原核生物、並びに微細藻類、原生生物、菌類及び粘菌を含む真核生物からなる群より選択される少なくとも1種である、[1]〜[9]のいずれか1つに記載の微生物膜透過剤。
[11] 前記微生物が、エンテロバクター科、シネコシスティス属、シュードモナス属、アシネトバクター属又はバチラス属の細菌である、[1]〜[10]のいずれか1つに記載の微生物膜透過剤。
[12] [1]〜[11]のいずれか1つに記載の微生物膜透過剤と化合物とを含む複合体。
[13] 前記化合物が、タンパク質、ペプチド、核酸、ペプチド核酸、無機物、有機金属化合物、有機化合物、高分子、ナノ粒子、ミセル及びリポソームを含む分子集合体、糖並びに標識物質からなる群より選択される少なくとも1種を含む、[12]に記載の複合体。
[14] 前記微生物膜透過剤と化合物とが直接的に又はリンカーを介して連結している、[12]又は[13]に記載の複合体。
[15] 前記リンカーが、1〜10個の連続したアミノ酸残基からなるものである、[14]に記載の複合体。
[16] [1]〜[11]のいずれか1つに記載の微生物膜透過剤と化合物とを含む複合体を微生物細胞と接触させることを含む、微生物細胞に化合物を送達する方法。
[17] 前記化合物が、タンパク質、ペプチド、核酸、ペプチド核酸、無機物、有機金属化合物、有機化合物、高分子、ナノ粒子、糖及び標識物質、並びに、ミセル及びリポソームを含む分子集合体、からなる群より選択される少なくとも1種を含む、[16]に記載の方法。
[18] 前記微生物が、真正細菌及び古細菌を含む原核生物、並びに微細藻類、原生生物、菌類及び粘菌を含む真核生物からなる群より選択される少なくとも1種である、[16]又は[17]に記載の方法。
[19] 前記微生物が、エンテロバクター科、シネコシスティス属、シュードモナス属、アシネトバクター属又はバチラス属の細菌である、[16]〜[18]のいずれか1つに記載の方法。
[20] [1]〜[11]のいずれか1つに記載の微生物膜透過剤を含む、殺菌剤。
[21] [1]〜[11]のいずれか1つに記載の微生物膜透過剤を含む、抗菌剤。
[22] [1]〜[11]のいずれか1つに記載の微生物膜透過剤を含む、ラベル化剤。
本開示において、「Dap」は「Dpr」と表わされることもあり、「Dab」は「Dbu」と表わされることもある。
本開示において、「Dab9-K-FAM」と「(Dab)9K-FAM」は同一の分子である。
本開示において、「Orn9-K-FAM」と「(Orn)9K-FAM」は同一の分子である。
本開示において抗菌剤の概念には、一般的に抗菌剤と呼ばれているものだけでなく、いわゆる制菌剤、静菌剤、防カビ剤等の概念も含まれる。
本開示は、膜透過性ペプチドからなる新規の微生物膜透過剤及びその用途に関する。
本開示の微生物透過剤は、4〜26個のそれぞれ独立して選択される式(I)のアミノ酸残基を連続して含む第一の膜透過性ペプチド、及び、式(II)のアミノ酸残基を含む第二の膜透過性ペプチドの少なくとも一方を含む。
本開示の膜透過性ペプチドは、4〜26個のそれぞれ独立して選択される式(I)のアミノ酸残基を連続して含む第一の膜透過性ペプチド、及び、式(II)のアミノ酸残基を含む第二の膜透過性ペプチドの少なくとも一方である。
第一の膜透過性ペプチドは、4〜26個のそれぞれ独立して選択される式(I)のアミノ酸残基を連続して含む。
式(I)中、nは独立して1〜3の整数であり、アミノ酸残基は(R)体又は(S)体のいずれであってもよい。
式(I)中、*で表される部位は、隣接する部位との結合部位を表す。なお、隣接する部位とは、隣接するアミノ酸残基、末端保護基、N末端の水素原子、C末端のヒドロキシ基、又は、後述するリンカー等の式(I)のアミノ酸残基に隣接する構造を表す。
以下、「4〜26個のそれぞれ独立して選択される式(I)のアミノ酸残基を連続して含む微生物膜透過性ペプチド」を「第一の微生物膜透過性ペプチド」とも称す。
以下、「式(II)のアミノ酸残基を含む膜透過性ペプチド」を「第二の微生物膜透過性ペプチド」とも称す。
例えば、n=2である場合、式(I)のアミノ酸残基は、2,4−ジアミノブタン酸(Dab)の(R)体又は(S)体となる。
例えば、n=3である場合、式(I)のアミノ酸残基は、2,5−ジアミノペンタン酸(Orn)の(R)体又は(S)体となる。
X1−X2−X3−X4−X5−X6−X7−X8−X9−X10−X11−X12−X13−X14−X15−X16−X17−X18−X19−X20−X21−X22−X23−X24−X25−X26(配列番号1)
X1〜X3は、それぞれ独立して、(S)−2,5−ジアミノペンタン酸(Orn)、(R)−2,5−ジアミノペンタン酸(Orn)、(S)−2,4−ジアミノブタン酸(Dab)、(R)−2,4−ジアミノブタン酸(Dab)、(S)−2,3−ジアミノプロピオン酸(Dap)又は(R)−2,3−ジアミノプロピオン酸(Dap)であり、
X4〜X26は、それぞれ独立して、存在しないか、あるいは、(S)−2,5−ジアミノペンタン酸(Orn)、(R)−2,5−ジアミノペンタン酸(Orn)、(S)−2,4−ジアミノブタン酸(Dab)、(R)−2,4−ジアミノブタン酸(Dab)、(S)−2,3−ジアミノプロピオン酸(Dap)又は(R)−2,3−ジアミノプロピオン酸(Dap)である。
5〜26個のそれぞれ独立して選択される式(I)のアミノ酸残基を連続して含むペプチドであることが好ましく、
6〜26個のそれぞれ独立して選択される式(I)のアミノ酸残基を連続して含むペプチドであることがより好ましく、
6〜20個のそれぞれ独立して選択される式(I)のアミノ酸残基を連続して含むペプチドであることがさらに好ましい。
少なくとも4個の連続したOrn、Dab又はDapを含むことが好ましく、
少なくとも4個の連続したOrn又はDabを含むことがより好ましく、
5〜26個の連続したOrn又はDabを含むことがさらに好ましく、
6〜26個の連続したOrn又はDabを含むことが特に好ましい。
5、6、7、8、9、10、11若しくは12個の連続した(S)−Ornからなるもの、
5、6、7、8、9、10、11若しくは12個の連続した(S)−Dabからなるもの、
又は、9個の連続した(S)−Dapからなるものであることが好ましい。
Dab9 :Dab-Dab-Dab-Dab-Dab-Dab-Dab-Dab-Dab(配列番号2)
Orn9 :Orn-Orn-Orn-Orn-Orn-Orn-Orn-Orn-Orn(配列番号3)
Orn6 :Orn-Orn-Orn-Orn-Orn-Orn(配列番号7)
Orn7 :Orn-Orn-Orn-Orn-Orn-Orn-Orn(配列番号8)
Orn8 :Orn-Orn-Orn-Orn-Orn-Orn-Orn-Orn(配列番号9)
Orn10:Orn-Orn-Orn-Orn-Orn-Orn-Orn-Orn-Orn-Orn(配列番号10)
Orn11:Orn-Orn-Orn-Orn-Orn-Orn-Orn-Orn-Orn-Orn-Orn(配列番号11)
Orn12:Orn-Orn-Orn-Orn-Orn-Orn-Orn-Orn-Orn-Orn-Orn-Orn(配列番号12)
Dab4 :Dab-Dab-Dab-Dab(配列番号20)
Dab5 :Dab-Dab-Dab-Dab-Dab(配列番号21)
Dab6 :Dab-Dab-Dab-Dab-Dab-Dab(配列番号13)
Dab7 :Dab-Dab-Dab-Dab-Dab-Dab-Dab(配列番号14)
Dab8 :Dab-Dab-Dab-Dab-Dab-Dab-Dab-Dab(配列番号15)
Dab10:Dab-Dab-Dab-Dab-Dab-Dab-Dab-Dab-Dab-Dab(配列番号16)
Dab11:Dab-Dab-Dab-Dab-Dab-Dab-Dab-Dab-Dab-Dab-Dab(配列番号17)
Dab12:Dab-Dab-Dab-Dab-Dab-Dab-Dab-Dab-Dab-Dab-Dab-Dab(配列番号18)
Dab19:Dab-Dab-Dab-Dab-Dab-Dab-Dab-Dab-Dab-Dab-Dab-Dab-Dab-Dab-Dab-Dab-Dab-Dab-Dab(配列番号25)
Dap9(FAM):Dap-Dap-Dap-Dap-Dap-Dap-Dap-Dap-Dap-K(-FAM)(配列番号22)
Dab4-K(-FAM)-Dab5:Dab-Dab-Dab-Dab-K(-FAM)-Dab-Dab-Dab-Dab-Dab(配列番号23)
第二の膜透過性ペプチドは、式(II)のアミノ酸残基を含む。
式(II)中、nは独立して1〜3の整数であり、アミノ酸残基は(R)体又は(S)体のいずれであってもよい。
式(II)中、mは1〜5の整数、R1及びR2はそれぞれ独立に疎水性置換基を表す。
式(II)中、*で表される部位は、隣接する部位との結合部位を表す。なお、隣接する部位とは、隣接するアミノ酸残基、末端保護基、N末端の水素原子、C末端のヒドロキシ基、又は、後述するリンカー等の式(II)のアミノ酸残基に隣接する構造を表す。
式(II)中、mは1〜5の整数であり、膜透過性をより向上させる観点からは、2〜4の整数であることが好ましく、2〜3の整数であることがより好ましい。
R2で表される疎水性置換基とは、R2が置換する炭素原子の両端に位置するNH及びC=Oを含むアミノ酸残基(NH−C(R2)−C(=O))が、疎水性アミノ酸に由来するアミノ酸残基であることを意味する。
少なくとも1個のOrn、Dab又はDapを含むことが好ましく、
少なくとも2個のOrn又はDabを含むことがより好ましく、
3個のDabを含むことがより好ましい。
(DabFF)3-K-FAM:Dab-F-F-Dab-F-F-Dab-F-F-K(-FAM)(配列番号26)
前記その他のアミノ酸残基を含む場合、前記その他のアミノ酸残基は、特に制限されるものではないが、1〜5個の任意のアミノ酸残基であることが好ましい。
前記その他のアミノ酸残基は、例えば、リジン(Lys)残基又はアルギニン(Arg)残基であることが好ましい。
前記その他のアミノ酸残基の存在位置は、膜透過性ペプチドの末端、複数の式(I)のアミノ酸残基の間、複数の式(II)のアミノ酸残基の間、及び、式(I)のアミノ酸残基と式(II)のアミノ酸残基との間のいずれであってもよい。その他のアミノ酸残基は、置換基として標識分子等を有していてもよい。
細菌(真正細菌)は、細胞膜の外側に外膜を有するか否かで、グラム陰性細菌とグラム陽性細菌とに分類されるが、本開示に係る微生物膜透過剤は、グラム陰性細菌とグラム陽性細菌の両方の細菌に対して適用できる。
別の態様において、本開示は、本開示の微生物膜透過剤と化合物とを含む複合体を提供する。化合物は、微生物の細胞膜を透過させて菌体内に導入する化合物であれば特に制限されるものではない。
菌体内に導入する化合物としては、例えば、タンパク質、ペプチド、核酸、ペプチド核酸、無機物、有機金属化合物、有機化合物、高分子、ナノ粒子、糖及び標識物質、並びに、ミセル及びリポソームの一方を含む分子集合体、からなる群より選択される少なくとも1種を含むことが好ましい。これらの化合物は、当技術分野において公知の方法により調製するか、あるいは市販品として入手することができる。
ペプチドとしては、例えば、抗原、ホルモン、抗菌ペプチド、シグナルペプチド、インヒビターペプチド、グルタチオン等の酸化還元活性ペプチド;オルガネラ標的ペプチド;などが挙げられる。
核酸としては、例えば、DNA、RNA、ハイブリッド核酸、アプタマー等が挙げられる。
ペプチド核酸としては、例えば、ペプチドDNA、ペプチドRNA等が挙げられる。
無機化合物、有機化合物、有機金属化合物及びナノ粒子としては、細胞内に導入可能な公知の化合物が挙げられる。
高分子としては、例えば、ポリエチレングリコール、デンドリマー等が挙げられる。
糖としては、例えば、多糖類、二糖類、単糖類、シクロデキストリン等が挙げられる。
標識物質としては、例えば、5(6)−カルボキシフルオレセイン(FAM)等が挙げられる。
分子集合体としては、ミセル、リポソーム等が挙げられる。なお、本開示において「分子集合体」とは、脂質等の分子が集合した集合体を意味する。
別の態様において、本開示は、本開示の微生物膜透過剤と化合物とを含む複合体を微生物細胞と接触させることを含む、微生物細胞に化合物を送達する方法を提供する。微生物膜透過剤、化合物及び微生物については上述した通りである。
複合体と微生物細胞とを接触させる手段は、特に制限されず、使用する微生物の種類、複合体に含まれる化合物の種類などに応じて、当業者であれば適当な条件で実施することができる。例えば、複合体と微生物細胞とを接触させる手段としては、下記(1)〜(3)等の手法が挙げられる。
(1)微生物細胞を、複合体を添加した培地中で培養する手法。
(2)微生物細胞を、複合体を含む溶液中に添加若しくは浸漬する手法。
(3)微生物細胞上に、複合体を積層させる手法。
別の態様において、本開示は、本開示の微生物膜透過剤を含む殺菌剤を提供する。
本開示の殺菌剤は、本開示の微生物膜透過剤を含む。
本開示の殺菌剤は、微生物膜透過剤と、殺菌作用を有する物質とを含む複合体とすることにより、殺菌対象となる微生物(特に、薬剤耐性を有する微生物)の細胞内に高い効率で前記殺菌作用を有する物質を導入することができる。
別の態様において、本開示は、本開示の微生物膜透過剤を含む抗菌剤を提供する。
本開示の抗菌剤は、本開示の微生物膜透過剤を含む。
本開示の抗菌剤は、微生物膜透過剤と、抗菌作用を有する物質とを含む複合体とすることにより、抗菌対象となる微生物(特に、薬剤耐性を有する微生物)の細胞内に高い効率で前記抗菌作用を有する物質を導入することができる。
別の態様において、本開示は、本開示の微生物膜透過剤を含むラベル化剤を提供する。
本開示のラベル化剤は、本開示の微生物膜透過剤を含む。
本開示のラベル化剤は、微生物膜透過剤と、対象となる微生物における特定部位に対し化学的相互作用し検出が可能な物質(以下、「標識物質」とも称す。)と、を含む複合体であることが好ましい。上記構成とすることにより、対象となる微生物の細胞内に高い効率で侵入し、前記対象となる微生物内における特定部位を発光観察、磁気、光学等により標識化(ラベル化)することができる。
微生物膜透過剤及び標識物質は、共有結合により直接連結されていても、水素結合等の相互作用により連結されていてもよい。標識物質は、例えば、微生物膜透過剤における膜透過性ペプチドの末端と連結するその他のアミノ酸残基(例えば、リジン等)のアミノ基と反応させ、微生物膜透過剤と連結されていてもよい。
本実施例では、複合体として蛍光色素を有するDab9-K-FAM、Orn9-K-FAM、Dab4-K(-FAM)-Dab5及び(DabFF)3-K-FAMを合成した。
固相合成用チューブ(ポリプロピレン製LibraTube本体チューブ5mL、株式会社ハイペップ研究所)中で、Fmoc-NH-SALレジン(渡辺化学株式会社)(64.1mg, 0.025mmol)をN,N’−ジメチルホルムアミド(DMF)(キシダ化学株式会社)中で一晩浸漬し、膨張させた。固相合成用チューブには固相合成用キャップポリプロピレン製LibraTube上部キャップ(株式会社ハイペップ研究所)を使用した。ピペリジン(キシダ化学株式会社)(DMF中20質量%、2mL)を加え、1分間ボルテックスで攪拌し溶媒を除去した。ピペリジン(DMF中20質量%、2mL)を加え、室温で10分間振とうし溶媒を除去した。DMF(2mL)で5回洗浄した。レジンを少量取り出し、TNBS Test Kit(東京化成工業株式会社)を用いてレジンが呈色することを確認した。塩化メチレン(2mL)、DMF(2mL)でそれぞれ3回ずつ洗浄した。HBTU(渡辺化学株式会社)3.05 g、HOBt・H2O(渡辺化学株式会社)1.25 g及びDMF 16mLを予め混合し調製した縮合剤カクテル(175μL)、そしてN,N−ジイソプロピルエチルアミン(DIEA)(ナカライテスク株式会社)とN−メチル−2−ピロリドン(NMP)(キシダ化学株式会社)の混合液(DIEA/NMP=2.75/14.25(v/v),175μL)を、N末端のアミノ酸(0.075mmol)に加えて溶解させ、レジンに添加した。室温で15分間振とうし、溶媒を除去した。DMF(2mL)で5回洗浄した。レジンを少量取り出し、TNBS Test Kitを用いてレジンが呈色しないことを確認した。塩化メチレン(株式会社ゴードー)(2mL)、DMF(2mL)でそれぞれ3回ずつ洗浄した。以降、アミノ酸配列に従って上記の操作を繰り返し、ペプチド鎖を伸長した。伸長操作には、Fmoc-Lys(Dde)-OH(渡辺化学株式会社)、Fmoc-Dab(Boc)-OH(渡辺化学株式会社)、Fmoc-Orn(Boc)-OH(渡辺化学株式会社)、又はFmoc-Phe-OH(渡辺化学株式会社)を使用した。また、攪拌には振とう攪拌専用システムPetiSyzer PSP-5100(株式会社ハイペップ研究所)を使用した。
5(6)−カルボキシフルオレセイン(5−FAM)(Sigma−Aldrich)(28.2mg,0.075mmol)にDMF(2mL)に溶かしたHOBt・H2O(19.1mg,0.125mmol)を加えて溶解させた。そこに、N,N’−ジイソプロピルカルボジイミド(DIC)(富士フイルム和光純薬株式会社)(23.4μL, 0.15mmol)、DIEA(25.8μL,0.15mmol)を加えて、レジンに添加した。室温で遮光し、終夜振とうさせた。溶媒を除去し、DMF(2mL)で5回洗浄した。その後、塩化メチレン(2mL)、DMF(2mL)でそれぞれ3回ずつ洗浄した。ピペリジン(DMF中20質量%,2mL)を加え、室温で10分間振とうし溶媒を除去した。DMF(2mL)、塩化メチレン(2mL)、MeOH(2mL)でそれぞれ5回ずつ洗浄した。デシケーター内で20分間乾燥させた。
デシケーター内で乾燥させたレジンに脱保護カクテル(トリフルオロ酢酸(TFA)(キシダ化学株式会社)600μL、トリイソプロピルシラン(TIS)(東京化成工業株式会社)15.8μL、水15.8μLを予め混合し調製したもの)を加え、室温で30分ごとに軽く振とうし、90分間静置させた。濾液を15mL遠沈管に回収した。合成チューブにTFA(500μL)を加え、濾液を先ほどの遠沈管に回収した。この操作を3回繰り返した。
上述の通り合成したペプチドを、HPLCを用いて精製した。その操作条件は以下の通りである。
[分析HPLC]
カラム:YMC−Triart C18(250×4.6mmφ)
流速:1.0mL/min
測定波長:220nm
溶媒:A:H2O(0.1質量%TFA含有)
B:アセトニトリル(0.1質量%TFA含有)
グラジエント条件:0 min A:B=90:10
20min A:B=40:60
25min A:B=90:10
30min A:B=90:10
[分取HPLC]
カラム:YMC−Actus Triart C18(250×20.0mmφ)
流速:18.9mL/min
測定波長:220 nm
溶媒:A:H2O(0.1質量%TFA含有)
B:アセトニトリル(0.1質量%TFA含有)
グラジエント条件:0min A:B=90:10
20min A:B=40:60
25min A:B=90:10
30min A:B=90:10
本実施例では、実施例1で調製した膜透過性ペプチドを含む複合体の大腸菌への導入について調べた。微生物実験で用いる試薬は特に記述がない限り全て市販の特級品又はそれに準ずるものを使用した。
(1)大腸菌への膜透過性ペプチドの導入
導入には、大腸菌Escherichia coli K-12株(ATCC10798)を使用した。一晩培養した菌体を100μLエッペンに分注し、遠心分離(7,500×g,10min)を行い回収した。次に回収した菌体をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)(Thermo Fisher Scientific社, pH7.4)に懸濁させ、遠心分離(7,500×g,5min)を3回繰り返しPBSで洗浄した。洗浄後に得られた菌体ペレットに対し50μLの2μMのDab9-K-FAM溶液又はOrn9-K-FAM溶液を加え、懸濁させた後、室温(23℃)で1時間インキュベートを行った。インキュベーション後、遠心分離(7,500×g,5min)により菌体を回収し、上記と同様にPBS洗浄を3回繰り返した。最後に得られた菌体ペレットに対し、0.1質量%に希釈したTrypan blue(Sigma-Aldrich社、Trypan Blue solution、0.4質量%)を適量加え、懸濁させた後、解析及び観察を行った。
上記で染色したサンプルを2μL用いて蛍光顕微鏡で観察を行った。蛍光顕微鏡は、OLYMPUS社のBX53正立顕微鏡を使用し、蛍光顕微鏡の光源装置は、OLYMPUS社のU−HGLGPSを使用した。顕微鏡観察で用いた励起/吸収フィルターは、OLYMPUS社の蛍光ミラーユニットで、U−FBW(緑蛍光専用)とU−FGW(赤蛍光専用)の2種類を使用した。画像の撮影は、PC上で行い比較対象となるサンプルの露出時間は揃えて撮影した。
フローサイトメーターの解析とソーティングは、BD社のFACSAriaTMIIを使用した。Dab9-K-FAM又はOrn9-K-FAM及びTrypan Blueで染色した菌体を1000〜2000events/sになるように調整し、BD社の解析ソフトFACSDIVAを用いて解析した。1つのサンプルにおいて解析したサンプル数は30,000events/sに設定した。Dab9-K-FAM又はOrn9-K-FAMの導入が認められた菌体に対してソーティングを行い、LB寒天培地プレートに240菌体(単一細胞)をソートした。ソートした菌体は適切な温度で培養し、形成されたコロニー数で生死割合を算出した。
本実施例では、実施例1と同様に膜透過性ペプチドを含む複合体を調製し、実施例2と同様に大腸菌への導入について調べた。具体的には、膜透過性ペプチドとして、Orn6(配列番号7)、Orn7(配列番号8)、Orn8(配列番号9)、Orn9(配列番号3)、Orn10(配列番号10)、Orn11(配列番号11)及びOrn12(配列番号12)、Dab3(Dab−Dab−Dab)、Dab4(配列番号20)、Dab5(配列番号21)、Dab6(配列番号13)、Dab7(配列番号14)、Dab8(配列番号15)、Dab9(配列番号2)、Dab10(配列番号16)、Dab11(配列番号17)及びDab12(配列番号18)、Dab15(配列番号24)、Dab19(配列番号25)、並びにDap9(配列番号19)をそれぞれ調製した後、リンカーとしてのC末端に連結したリジン側鎖を介して蛍光性FAM基をそれぞれ導入した。これらと同様に、膜透過性ペプチドとして、K(―FAM)―Dab9(配列番号22)及びDab4―K(―FAM)―Dab5(配列番号23)を用いて、大腸菌への導入率を調べた。
Orn6-K-FAM:4.00±0.29%
Orn7-K-FAM:16.90±4.9%
Orn8-K-FAM:97.20±0.73%
Orn9-K-FAM:99.88±0.01%
Orn10-K-FAM:99.93±0.02%
Orn11-K-FAM:99.94±0.01%
Orn12-K-FAM:99.89±0.03%
Dab4-K-FAM:2.55±0.20%
Dab5-K-FAM:53.32±0.06%
Dab6-K-FAM:99.07±0.68%
Dab7-K-FAM:99.94±0.02%
Dab8-K-FAM:99.97±0.01%
Dab9-K-FAM:99.98±0.01%
Dab10-K-FAM:99.97±0.01%
Dab11-K-FAM:99.97±0.01%
Dab12-K-FAM:99.96±0.02%
Dab15-K-FAM:99.97±0.02%
Dab19-K-FAM:58.08±0.47%
K(-FAM)-Dab9:99.99%
Dab4-K(-FAM)-Dab5:99.99%
本実施例では、大腸菌に対する膜透過性ペプチドの毒性について定量評価(蛍光顕微鏡観察)を行った。
本実施例では、大腸菌以外の菌種として、エルシニア・ベルコビエリ(Yersinia bercovieri:グラム陰性)、及びバチルス・メガテリウム(Bacillus megaterium:グラム陽性)への導入について、蛍光顕微鏡観察によって調べた。
本実施例では、蛍光色素FAMと本開示の微生物膜透過剤とを含む複合体(Dab9-K-FAM及びOrn9-K-FAM)、並びに、蛍光色素FAMと公知の微生物膜透過剤とを含む複合体(KFF)3K(配列番号4)、K9(配列番号5)及びR9(配列番号6)を使用した。1、2、5、10、及び20μMの濃度でインキュベートし、各複合体の導入率と細胞毒性について調べた。導入率は、各複合体における蛍光色素FAMに由来する蛍光で評価した。細胞の毒性は、トリパンブルーで染色された菌の蛍光でフローサイトメーターを用いて評価した。結果を図7に示す。
また、図7中、「−D」を付した白抜き記号のグラフに示される通り、全ての複合体は、2%以下の死細胞の割合を示した。このように、蛍光色素FAMと本開示の微生物膜透過剤とを含む複合体(Dab9-K-FAM及びOrn9-K-FAM)は、優れた細胞導入性質をもち、且つ、導入細胞に対する毒性が非常に低いという効果が示されている。
本実施例では、大腸菌以外の菌種として、グラム陰性細菌である、エルシニア・ベルコビエリ(Yersinia bercovieri)、セラチア・グリメシー(Serratia grimesii)、トラブルシエラ・グアメンシス(Trabulsiella guamensis)、エンテロバクター・ホルマエチェイ(Enterobacter hormaechei)、プロテウス・ハウセリ(Proteus hauseri)、アシネトバクター・ラジオレジステンス(Acinetobacter radioresistens)、シュードモナス・フルオレッセンス(Pseudomonas fluorescens)及びシネコシスティス(Synechocystis PCC6803)を用いて、複合体Dab9-K-FAMの導入について、蛍光顕微鏡観察によってそれぞれ調べた。なお、菌種を変更した以外は、実施例2と同様の手順に従って、細菌株に複合体Dab9-K-FAMを導入した。また、実施例2と同様にして、ペプチドを加えていない系(Negative control)、細菌株に(KFF)3K-FAMを導入した系も行った。それぞれの細菌を用いた結果を図8〜図15に示す。
・エルシニア・ベルコビエリ(NBRC105717)
・セラチア・グリメシー(NBRC13537)
・トラブルシエラ・グアメンシス(NBRC103172)
・エンテロバクター・ホルマエチェイ(NBRC105718)
・プロテウス・ハウセリ(NBRC3851)
・アシネトバクター・ラジオレジステンス(NBRC102413)
・シュードモナス・フルオレッセンス(NBRC14160)
・シネコシスティス(Synechocystis PCC6803)
図8〜図15中、Negative controlはペプチドを加えていない系を表し、菌からのバックグラウンド蛍光を見ている。すべて同じ露光時間で観察しているため、蛍光強度の大きさが、蛍光団FAMを有するペプチドの量に対応する。
図8〜図15に示されるように、本開示の微生物膜透過剤を含む複合体は、既知の微生物膜透過剤を含む複合体に比べて又はNegative controlと比べて、グラム陽性及びグラム陰性細菌の菌体内へ、効果的に導入されることがわかった。
本実施例では、複合体Dab4-K(-FAM)-Dab5のグラム陰性細菌である大腸菌への導入について、蛍光顕微鏡観察によってそれぞれ調べた。なお、複合体をDab4-K(-FAM)-Dab5へ変更した以外は、実施例2と同様の手順に従って、細菌株に複合体を導入した。また、実施例2と同様の手順に従って、細菌株にK(-FAM)-Dab9を導入した系も行った。結果を図16に示す。
図16は、菌からのバックグラウンド蛍光を見ており、すべて同じ露光時間で観察しているため、蛍光強度の大きさが、蛍光団FAMを有するペプチドの量に対応する。
図16に示されるように、本開示の微生物膜透過剤を含む複合体(Dab4-K(-FAM)-Dab5及びK(-FAM)-Dab9)は、大腸菌の菌体内へ導入されることがわかった。
本実施例では、グラム陰性細菌である、アシネトバクター・ラジオレジステンス(Acinetobacter radioresistens)、エンテロバクター・ホルマエチェイ(Enterobacter hormaechei)、大腸菌(Escherichia coil)、パントエア・アグロメランス(Pantoea agglomerans)、プロテウス・ハウセリ(Proteus hauseri)、シュードモナス・フルオレッセンス(Pseudomonas fluorescens)、セラチア・グリメシー(Serratia grimesii)及びトラブルシエラ・グアメンシス(Trabulsiella guamensis)それぞれへの導入について、蛍光顕微鏡観察によってそれぞれ調べた。菌種と複合体を変更した以外は、実施例2と同様の手順に従って、細菌株に複合体(DabFF)3K-FAMを導入した。また、実施例2と同様にして、ペプチドを加えていない系(Negative control)、細菌株に(KFF)3K-FAMを導入した系も行った。それぞれの細菌を用いた結果を図18〜図25に示す。
・アシネトバクター・ラジオレジステンス(NBRC102413)
・エンテロバクター・ホルマエチェイ(NBRC105718)
・大腸菌(実施例2と同一種)
・パントエア・アグロメランス(NBRC102470)
・プロテウス・ハウセリ(NBRC3851)
・シュードモナス・フルオレッセンス(NBRC14160)
・セラチア・グリメシー(NBRC13537)
・トラブルシエラ・グアメンシス(NBRC103172)
図18〜図25は、菌からのバックグラウンド蛍光を見ており、すべて同じ露光時間で観察しているため、蛍光強度の大きさが、蛍光団FAMを有するペプチドの量に対応する。
図18〜図25に示されるように、本開示の微生物膜透過剤を含む複合体(DabFF)3K-FAMは、各菌体内へ導入されることがわかった。
本実施例では、蛍光色素FAMと本開示の微生物膜透過剤とを含む複合体((Dab)9K-FAM)を使用した。具体的には、複合体を、細胞と、0μM、2μM及び20μMの濃度で、0時間、1時間及び24時間それぞれインキュベートし、顕微鏡観察により、正常ヒト臍帯静脈内皮細胞に対する微生物膜透過剤を含む複合体の細胞毒性を評価した。結果を図26に示す。
本実施例では、蛍光色素FAMと本開示の微生物膜透過剤とを含む複合体((Orn)9K-FAM)を使用した。具体的には、複合体を、細胞と、0μM、2μM及び20μMの濃度で、0時間、1時間及び24時間それぞれインキュベートし、顕微鏡観察により、正常ヒト臍帯静脈内皮細胞に対する微生物膜透過剤を含む複合体の細胞毒性を評価した。結果を図27に示す。
図27は、正常ヒト臍帯静脈内皮細胞に対する本開示の複合体Orn9-K-FAMの経時的及び濃度依存的な細胞毒性を示す顕微鏡写真を示している。
図26及び図27に示されるように、本開示の微生物膜透過剤を含む複合体は、正常ヒト臍帯静脈内皮細胞に対する細胞毒性が、経時的及び濃度依存的に低く、制限的であることがわかった。
Claims (22)
- 4〜26個のそれぞれ独立して選択される式(I)のアミノ酸残基を連続して含む第一の膜透過性ペプチド、及び、式(II)のアミノ酸残基を含む第二の膜透過性ペプチドの少なくとも一方を含む微生物膜透過剤。
〔式(I)及び式(II)中、nは独立して1〜3の整数であり、アミノ酸残基は(R)体又は(S)体のいずれであってもよい。式(II)中、mは1〜5の整数、R1及びR2はそれぞれ独立に疎水性置換基を表す。式(I)及び式(II)中、*で表される部位は、隣接する部位との結合部位を表す。〕 - 第一の膜透過性ペプチドが、(S)−2,5−ジアミノペンタン酸(Orn)、(R)−2,5−ジアミノペンタン酸(Orn)、(S)−2,4−ジアミノブタン酸(Dab)、(R)−2,4−ジアミノブタン酸(Dab)、(S)−2,3−ジアミノプロピオン酸(Dap)及び(R)−2,3−ジアミノプロピオン酸(Dap)からなる群より独立して選択される4〜26個の連続したアミノ酸残基からなる膜透過性ペプチドを含む、請求項1に記載の微生物膜透過剤。
- 前記第一の膜透過性ペプチドが、少なくとも4個の連続したOrn又はDabを含む、請求項1又は請求項2に記載の微生物膜透過剤。
- 前記第一の膜透過性ペプチドが、5〜26個の連続したOrn又はDabからなるものである、請求項1〜請求項3のいずれか1項に記載の微生物膜透過剤。
- 前記第一の膜透過性ペプチドが、5、6、7、8、9、10、11若しくは12個の連続した(S)−Orn又は5、6、7、8、9、10、11若しくは12個の連続した(S)−Dabからなるものである、請求項1〜請求項4のいずれか1項に記載の微生物膜透過剤。
- 前記第一の膜透過性ペプチドが、6〜26個の連続した同じアミノ酸残基からなるものである、請求項1〜請求項5のいずれか1項に記載の微生物膜透過剤。
- 前記第一の膜透過性ペプチド又は前記第二の膜透過性ペプチドが、前記式(I)のアミノ酸残基に加えて、1若しくは数個のリジン(Lys)残基若しくはアルギニン(Arg)残基を含む、請求項1〜請求項6のいずれか1項に記載の微生物膜透過剤。
- 前記第一の膜透過性ペプチドが、前記4〜26個のそれぞれ独立して選択される式(I)のアミノ酸残基からなるブロックを複数有し、前記複数のブロックの間の少なくとも1カ所に、前記式(I)のアミノ酸残基以外のアミノ酸残基を1個又は2個以上連続して含む、請求項1〜請求項7のいずれか1項に記載の微生物膜透過剤。
- 前記式(I)のアミノ酸残基以外のアミノ酸残基が、置換基として標識分子を有するリジン(Lys)残基、又は、置換基として標識分子を有するアルギニン(Arg)残基を含む、請求項8に記載の微生物膜透過剤。
- 前記微生物が、真正細菌及び古細菌を含む原核生物、並びに微細藻類、原生生物、菌類及び粘菌を含む真核生物からなる群より選択される少なくとも1種である、請求項1〜請求項9のいずれか1項に記載の微生物膜透過剤。
- 前記微生物が、エンテロバクター科、シネコシスティス属、シュードモナス属、アシネトバクター属又はバチラス属の細菌である、請求項1〜請求項10のいずれか1項に記載の微生物膜透過剤。
- 請求項1〜請求項11のいずれか1項に記載の微生物膜透過剤と化合物とを含む複合体。
- 前記化合物が、タンパク質、ペプチド、核酸、ペプチド核酸、無機物、有機金属化合物、有機化合物、高分子、ナノ粒子、ミセル及びリポソームを含む分子集合体、糖並びに標識物質からなる群より選択される少なくとも1種を含む、請求項12に記載の複合体。
- 前記微生物膜透過剤と化合物とが直接的に又はリンカーを介して連結している、請求項12又は請求項13に記載の複合体。
- 前記リンカーが、1〜10個の連続したアミノ酸残基からなるものである、請求項14に記載の複合体。
- 請求項1〜請求項11のいずれか1項に記載の微生物膜透過剤と化合物とを含む複合体を微生物細胞と接触させることを含む、微生物細胞に化合物を送達する方法。
- 前記化合物が、タンパク質、ペプチド、核酸、ペプチド核酸、無機物、有機金属化合物、有機化合物、高分子、ナノ粒子、糖及び標識物質、並びに、ミセル及びリポソームを含む分子集合体、からなる群より選択される少なくとも1種を含む、請求項16に記載の方法。
- 前記微生物が、真正細菌及び古細菌を含む原核生物、並びに微細藻類、原生生物、菌類及び粘菌を含む真核生物からなる群より選択される少なくとも1種である、請求項16又は請求項17に記載の方法。
- 前記微生物が、エンテロバクター科、シネコシスティス属、シュードモナス属、アシネトバクター属又はバチラス属の細菌である、請求項16〜請求項18のいずれか1項に記載の方法。
- 請求項1〜請求項11のいずれか1項に記載の微生物膜透過剤を含む、殺菌剤。
- 請求項1〜請求項11のいずれか1項に記載の微生物膜透過剤を含む、抗菌剤。
- 請求項1〜請求項11のいずれか1項に記載の微生物膜透過剤を含む、ラベル化剤。
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ACS OMEGA, vol. 3, JPN6023026275, 2018, pages 16489 - 16499, ISSN: 0005091720 * |
J. PEPTIDE RES., vol. 56, JPN6023026274, 2000, pages 318 - 325, ISSN: 0005091719 * |
Cited By (2)
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