JP2020536850A - 虚血を処置するための粘稠性組成物 - Google Patents

Abstract

虚血性組織を処置するための医薬組成物であって、血栓溶解薬を含むコア成分とヒアルロナンまたはその誘導体を含むマトリックス成分とを含み、上記マトリックス成分が、１０ｍＰａ・ｓ超の粘度を有する、医薬組成物。【選択図】図１

Description

関連出願に対する相互参照
本出願は、内容が本明細書中参照により組み込まれている、２０１７年９月１日に出願の米国特許仮出願番号第６２／５５３，２６９号に対する優先権を主張する。

虚血では、臓器または組織の血液含有量が低下する。虚血は、全身性の貧血の局所的な顕在化または局所的な血液循環障害の結果であり得る。虚血の種類として、以下が挙げられる：１）圧迫性虚血は、たとえば腫瘍、きつい包帯、および滲出からの動脈性血管への圧力により引き起こされ、これにより、血管の内腔の狭小化または閉塞をもたらし得る。臨床的に、長期間の横臥から形成される痔核または潰瘍は、外側の血管の圧迫による虚血により引き起こされる組織のネクローシスの例であり、筋肉の損傷をもたらす可能性がある。２）動脈の血栓症または塞栓症からの閉塞性虚血は、血管の閉塞をもたらし、これにより、たとえば肢または心臓への血液供給を阻害し得る。３）外側肢の虚血は、腹部の臓器へ大量の血液が急に流れることにより引き起こされ、これにより、他の臓器および組織の虚血をもたらし得る。

下肢の末梢動脈性疾患を有する患者は、大部分が６０歳超であり、この患者のおよそ１／２が糖尿病を有している。現在、虚血性下肢のための血管新生処置が、市場に出回っている。たとえば、ＡｕｔｏｌｏＧｅｌシステムは、患者の自家性高濃度多血小板血漿（ＰＲＰ）を抽出し、創傷治癒を促進する増殖因子およびサイトカインを添加してゼラチン状の物質を形成することにより調製される創傷ドレッシング材である。しかしながら、このような処置は、単に慢性的な損傷を処置するために使用されており、根底にある虚血を処置することができない。血管の閉塞を回復させるためには、バイパス術、血管拡張術、および血管ステントの配置などの他の処置が必要とされている。

虚血性下肢に関する多くの研究によって、血管新生を刺激するためのＶＥＧＦおよびＦＧＦなどの血管新生シグナリングに関連するサイトカインまたは組み換え増殖因子など、血管新生療法が盛んに開発されている。血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）は、発生組織または成年の組織において間葉系細胞の増殖、遊走および分化を刺激することが見いだされており、患者の骨髄由来の内皮由来細胞の放出を促進して血管を増殖させるために使用されている。ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）もまた、血管新生シグナリングに間接的に関連する物質により刺激され、血管新生を刺激し得る。組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔＰＡ）およびＨＵＶＥＣを使用する処置は、骨髄から血管へと遊走する内皮前駆細胞の数を増加させ、血管内皮の活性化（ｒｅｊｕｖｅｎａｔｉｏｎ）を促進して治療効果を達成するために、提供される。

糖尿病により引き起こされる高血糖症の生理的病態は、内皮増殖因子の分泌を低減し、重篤な血管性疾患の場合では、切断をもたらす可能性がある。現在の処置方法の大部分は血管新生因子を含むが、臨床的な使用または医学的有効性において多くの困難に直面している。それにもかかわらず、現在、肢を切断させないために、虚血組織を再生するのに有効な治療は未だ存在していない。よって、大部分の患者に適した虚血組織のための治療用組成物の開発が、解決すべき重要な問題である。

一態様では、本明細書において、虚血性組織を処置するための医薬組成物であって、血栓溶解薬を含むコア成分とヒアルロナンまたはその誘導体を含むマトリックス成分とを含み、上記医薬組成物が１０ｍＰａ・ｓ超の粘度を有する、医薬組成物を記載する。一部の実施形態では、粘度は、１０〜１００００ｍＰａ・ｓである。一部の実施形態では、本医薬組成物は、１ｍｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌのヒアルロナンを含む。

一部の実施形態では、ヒアルロナンは、１００ｋＤａ〜５０００ｋＤａの平均分子量を有する。たとえば、ヒアルロナンは、７００ｋＤａ〜２０００ｋＤａの平均分子量を有し得る。

一部の実施形態では、本医薬組成物の粘度は、７００〜２０００ｋＤａの平均分子量を有する３〜１０ｍｇ／ｍｌのヒアルロナンの粘度の範囲内にある。一部の実施形態では、粘度は、１５６０ｋＤａの平均分子量を有する５ｍｇ／ｍｌのヒアルロナンの粘度と同じである。ヒアルロナンの平均分子量は、７００〜２０００ｋＤａであり得、ヒアルロナンの濃度は、３〜１０ｍｇ／ｍｌであり得る。一部の実施形態では、ヒアルロナンの平均分子量は、１５６０ｋＤａであり、ヒアルロナンの濃度は、５ｍｇ／ｍｌである。

一部の実施形態では、本医薬組成物におけるマトリックス成分はさらに、コラーゲン、細胞外マトリックス因子（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｍａｔｒｉｘ ｆａｃｔｏｒ）、タンパク質、または多糖を含む。

本医薬組成物における血栓溶解薬は、チクロピジン、ワルファリン、組織プラスミノーゲンアクチベーター、エミナーゼ（ｅｍｉｎａｓｅ）、レタバーゼ（ｒｅｔａｖａｓｅ）、ストレプターゼ（ｓｔｒｅｐｔａｓｅ）、組織プラスミノーゲンアクチベーター、テネクテプラーゼ、アボキナーゼ、ｋｉｎｌｙｔｉｃ、ウロキナーゼ、プロウロキナーゼ、アニソイル化された精製ストレプトキナーゼ活性化複合体（ａｎｉｓｏｙｌａｔｅｄ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｓｔｒｅｐｔｏｋｉｎａｓｅ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｃｏｍｐｌｅｘ：ＡＰＳＡＣ）、フィブリン、およびプラスミンからなる群から選択され得る。

一部の実施形態では、本医薬組成物はさらに、血管新生化合物（たとえば血管内皮増殖因子）を含む。

別の態様では、本明細書において、虚血性組織を処置する方法が提供される。本方法は、本明細書中記載の医薬組成物を対象の虚血性組織に直接投与するステップを含み、ただし本医薬組成物は静脈内投与されない。

一部の実施形態では、虚血性組織は、対象の潰瘍であるか、または対象の心臓もしくは肢にある。虚血性組織は、筋肉であり得る。一部の実施形態では、対象は糖尿病を有する。

１つ以上の実施形態の詳細が、添付の図面および以下の説明に記載されている。これら実施形態の他の特性、目的、および利点は、この説明および図面から、ならびに特許請求の範囲から明らかとなるであろう。

図１は、ＶＦＧＦを含む医薬組成物で処置された下肢の虚血を有する糖尿病マウスの外観スコア（ａｐｐｅａｒａｎｃｅ ｓｃｏｒｅ）を示す棒グラフである。 図２は、ＶＦＧＦを含む医薬組成物で処置された下肢の虚血を有する糖尿病マウスの血流を示す棒グラフである。 図３は、チクロピジンを含む医薬組成物で処置された下肢の虚血を有する糖尿病マウスの外観スコアを示す棒グラフである。 図４は、チクロピジンを含む医薬組成物で処置された下肢の虚血を有する糖尿病マウスの血流を示す棒グラフである。 図５は、ワルファリンを含む医薬組成物で処置された下肢の虚血を有する糖尿病マウスの外観スコアを示す棒グラフである。 図６は、ワルファリンを含む医薬組成物で処置された下肢の虚血を有する糖尿病マウスの血流を示す棒グラフである。 図７は、ワルファリンを含む医薬組成物で処置された下肢の虚血を有する糖尿病マウスの血流を示すグラフである。 図８は、ワルファリンを含む医薬組成物で処置された下肢の虚血を有する糖尿病マウスの機能解析を示すグラフのセットである。 図９は、虚血を生じさせた後の異なる時点での、ワルファリンを含む医薬組成物で処置された下肢の虚血を有する糖尿病マウスの外観スコアを示すグラフである。 図１０は、ワルファリンと、異なる分子量のヒアルロナンとを含む医薬組成物で処置された下肢の虚血を有する糖尿病マウスの外観スコアを示すグラフである。 図１１は、ワルファリンと、異なる分子量のヒアルロナンとを含む医薬組成物で処置された下肢の虚血を有する糖尿病マウスの血流を示すグラフである。 図１２は、ワルファリンと、同様の粘度のヒアルロナンとを含む医薬組成物で処置された下肢の虚血を有する糖尿病マウスの外観スコアを示すグラフである。

予想外なことに、特定の粘度を有するヒアルロナンと血栓溶解薬を含む医薬組成物が、虚血性組織の処置に有効であることが発見された。

医薬組成物
よって、本明細書において、虚血性組織を処置するための医薬組成物を記載する。本組成物は、血栓溶解薬を含むコア成分とヒアルロナンまたはその誘導体を含むマトリックス成分とを含む。本医薬組成物は、１０ｍＰａ・ｓ超の粘度を有する。粘度の測定に関して選択されるパラメータ（たとえばスピンドルおよび回転速度）に応じて、本組成物の粘度は、１０〜１００００ｍＰａ・ｓ（たとえば１０〜１００、５０〜１５０、１００〜２００、１５０〜２５０、２５０〜５００、５００〜１０００、１０００〜１５００、１５００〜２０００、２０００〜２５００、２５００〜３０００、３０００〜３５００、３５００〜５０００、５０００〜６０００、６０００〜７０００、７０００〜８０００、８０００〜９０００、または９０００〜１００００）の範囲にあり得る。

本医薬組成物の粘度は、７００〜２０００ｋＤａ（たとえば７００、８００、９００、１０００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、または２０００）の平均分子量を有する３〜１０ｍｇ／ｍｌ（たとえば３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、または１０ｍｇ／ｍｌ）のヒアルロナンの粘度の範囲内にあり得る。以下の表２〜５を参照されたい。一部の実施形態では、本組成物の粘度は、１５６０ｋＤａの平均分子量を有する５ｍｇ／ｍｌのヒアルロナンの粘度と同じである。たとえば、後述のデータは、２０００ｋＤａのヒアルロナン４ｍｇ／ｍｌ、１５６０ｋＤａのヒアルロナン５ｍｇ／ｍｌ、および７００ｋＤａのヒアルロナン６．５ｍｇ／ｍｌは、およそ同じ粘度を有することを示している。

本医薬組成物におけるヒアルロナンの分子量は、４ｋＤａ〜５０００ｋＤａ（たとえば４〜２０、２０〜１００、１００〜５００、５００〜１０００、１０００〜２０００、２０００〜２５００、２５００〜５０００、５、１０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、７５０、１０００、１５００、１８００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、または５０００ｋＤａ）の範囲にあり得る。本医薬組成物におけるヒアルロナンの濃度は、１〜１００ｍｇ／ｍｌ（たとえば１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００ｍｇ／ｍｌ）であり得る。特に、本医薬組成物におけるヒアルロナンの濃度は、７００〜２０００ｋＤａの平均分子量を有するヒアルロナンを使用する場合、３〜１０ｍｇ／ｍｌ（たとえば３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、または１０ｍｇ／ｍｌ）であり得る。当業者は、所望の粘度を有する組成物を獲得するために、適切な分子量および濃度の組み合わせを選択することができる。また当業者は、当該分野で知られている方法および市販の説明書を使用して、組成物の粘度を決定することができる。

用語「ヒアルロナン」は、Ｎ−アセチルグルコサミンおよびＤ−グルクロン酸、およびその誘導体の反復する二糖単位を含む、天然に存在する陰イオン性の非硫酸化グリコサミノグリカンを表す。天然に存在するヒアルロナン（ヒアルロン酸またはヒアルロン酸塩としても知られている）は、従来の方法を介して、その天然の供給源、たとえば連鎖球菌の莢膜、雄鶏の肉冠、軟骨組織、関節の滑液（ｓｙｎｏｖｉａｌ ｊｏｉｎｔｓ ｆｌｕｉｄ）、臍帯、皮膚組織、および眼の硝子体から単離され得る。たとえば、Ｇｕｉｌｌｅｒｍｏ Ｌａｇｏ ｅｔ ａｌ． Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ ６２（４）： ３２１−３２６， ２００５； ａｎｄ Ｉｃｈｉｋａ Ａｍａｇａｉ ｅｔ ａｌ． Ｆｉｓｈｅｒｉｅｓ Ｓｃｉｅｎｃｅ ７５（３）： ８０５−８１０， ２００９を参照されたい。あるいは、これは、市販のベンダー、たとえばＧｅｎｚｙｍｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｌｉｆｅｃｏｒｅ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ， ＬＬＣ、およびＨｙａｌｕｒｏｎ Ｃｏｎｔｒａｃｔ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇから購入され得る。天然に存在するヒアルロナンの誘導体として、限定するものではないが、ヒアルロナンエステル、アジピン酸ジヒドラジドで修飾されたヒアルロナン、ヒアルロナンアミド生成物、架橋したヒアルロン酸、コハク酸またはその重金属塩とヒアルロン酸とのヘミエステル、ヒアルロン酸の部分エステルまたは総エステル（ｔｏｔａｌ ｅｓｔｅｒ）、硫酸化ヒアルロン酸、Ｎ−硫酸化ヒアルロン酸、およびアミドまたはジアミンで修飾されたヒアルロン酸が挙げられる。これらは、その官能基（たとえばカルボン酸基、ヒドロキシル基、還元末端基、Ｎ−アセチル基）のうち１つ以上を化学的に修飾することにより、得ることができる。カルボキシル基は、エステル化またはカルボジイミドおよびビスヒドラジドが介在する反応を介して、修飾され得る。ヒドロキシル基の修飾として、限定するものではないが、硫酸化、エステル化、イソ尿素カップリング、シアノーゲンブロミドの活性化、および過ヨウ素酸塩の酸化が挙げられる。還元末端基は、還元的アミノ化により修飾され得る。これはまた、リン脂質、色素（たとえばフルオロフォアもしくは発色団）、または親和性マトリックスの調製に適切な作用物質に結合し得る。天然に存在するヒアルロナンの誘導体はまた、架橋剤（たとえばビスエポキシド、ジビニルスルホン、ビスカルボジイミド、小分子ホモ二官能性リンカー、ホルムアルデヒド、シクロヘキシルイソアニド、リジンエチルエステル、金属カチオン、ヒドラジド、もしくはそれらの混合物）を使用する架橋により得ることができ、あるいは内部のエステル化、光反応架橋（ｐｈｏｔｏ−ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ）、もしくは表面プラズマ処理（ｓｕｒｆａｃｅ ｐｌａｓｍａ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）を介して得ることができる。ヒアルロナン溶液を作製するために、ヒアルロナンは、リン酸緩衝液（たとえばｐＨ７±１で＜０．０５Ｍ）および／またはＮａＣｌ（たとえば≦０．９％）に溶解され得る。

マトリックス成分は、本組成物の粘度が所望の範囲内にとどまる限り、１つ以上の他のマトリックス分子を含み得る。これらマトリックス分子は、ゼラチン、コラーゲン、ヒアルロナン、フィブロネクチン、エラスチン、テネシン（ｔｅｎａｃｉｎ）、ラミニン、ビトロネクチン、ポリペプチド、ヘパラン硫酸、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸、ケラタン、ケラタン硫酸、デルマタン硫酸、カラゲナン、ヘパリン、キチン、キトサン、アルギン酸塩、アガロース、カンテン、セルロース、メチルセルロース、カルボキシルメチルセルロース、グリコーゲン、およびそれらの誘導体を含み得る。さらに、マトリックス成分は、フィブリン、フィブリノーゲン、トロンビン、ポリグルタミン酸、合成ポリマー（たとえばアクリル酸塩、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、またはポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）、または架橋剤（たとえばゲニピン（ｇｅｎｉｐｉｎ）、グルタルアルデヒド、ホルムアルデヒド、もしくはエポキシド）を含み得る。

血栓溶解薬は、チクロピジン、ワルファリン、組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔ−ＰＡ）、エミナーゼ（ｅｍｉｎａｓｅ）（アニストレプラーゼ）、レタバーゼ（ｒｅｔａｖａｓｅ）（レテプラーゼ）、ストレプターゼ（ｓｔｒｅｐｔａｓｅ）（ストレプトキナーゼ、カビキナーゼ（ｋａｂｉｋｉｎａｓｅ））、ａｃｔｉｖａｓｅ、テネクテプラーゼ（ＴＮＫａｓｅ）、アボキナーゼ、ｋｉｎｌｙｔｉｃ（ロキナーゼ）、ウロキナーゼ、プロウロキナーゼ、アニソイル化されたプラスミノーゲンストレプトキナーゼ活性化複合体（ａｎｉｓｏｙｌａｔｅｄ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ｓｔｒｅｐｔｏｋｉｎａｓｅ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｃｏｍｐｌｅｘ：ＡＰＳＡＣ）、フィブリン、プラスミンであり得る。本医薬組成物は、１つ以上の血栓溶解薬を含み得る。本医薬組成物は、推奨される臨床用量と同様の用量またはそれよりも少ない用量で、血栓溶解薬を含み得る。

本医薬組成物はさらに、血管新生化合物、たとえば血管内皮増殖因子（ＶＦＧＦ）を含み得る。

処置方法
本医薬組成物の有効量が、虚血性処置するために患者に投与され得る。これは、虚血性組織（たとえば筋肉）に直接または当該組織の近くに投与（たとえば注射または塗布）され得る。本組成物は、粘稠度（ｃｏｎｓｉｓｔｅｎｃｙ）においてゼラチン性また粘稠性であり、静脈内投与されない。

本組成物は、適切な処置期間の間、たとえば１〜４週間、１〜１２ケ月、または１〜３年にわたり、必要に応じて、たとえば１日に１〜５回、１週間あたり１〜５回、１ケ月あたり１〜５回、対象に投与され得る。虚血または虚血性損傷が発症した後に可能な限り早く（たとえば０〜４８時間以内または１〜７日以内に）、本組成物が投与されることが好ましい。

投与される本医薬組成物の量は、治療用化合物、たとえば血栓溶解薬の有効量を提供するために十分であるべきである。有効量は、たとえば、血栓溶解薬の効力に応じて、対象の体重１ｇあたり、０．００００１〜１０μｇ（たとえば０．００００１〜０．００１、０．００１〜０．００５、０．００５〜０．０１、０．０５〜０．１、０．１〜０．５、０．５〜１、０．００００１、０．０００１、０．０００５、０．００１、０．００５、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０μｇ）であり得る。

「〜を処置する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」は、ある障害を罹患している対象または当該障害を発症するリスクがある対象に、当該障害、当該障害の症状、当該障害に続発する疾患状態、または当該障害になりやすい傾向を治癒、軽減、緩和、治療（ｒｅｍｅｄｙ）、発症の遅延、予防、または寛解する目的で、医薬組成物を投与することを表す。「有効量」は、処置される対象に医療上望ましい結果をもたらすことができる組成物の量を表す。本処置方法は、単独で、または他の医薬もしくは治療と組み合わせて、行われ得る。処置される対象は、ヒト、または研究動物もしくは家畜動物であり得る。

以下の特定の実施例は、単なる例と解釈すべきであり、いかなる方法であっても本開示の残りを限定するものではない。さらに詳述することなく、当業者が、本明細書中の説明に基づき本開示を最も完全な度合まで利用できると考えられる。本明細書中引用される全ての刊行物は、全体において参照により本明細書に組み込まれている。

実施例１：糖尿病性下肢虚血のマウスモデル
雄性のＣ５７ＢＬ／６マウスを、国立成功大学（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｈｅｎｇ Ｋｕｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ：ＮＣＫＵ）の研究動物センターまたはＢｉｏＬＡＳＣＯ Ｔａｉｗａｎ Ｃｏ．， Ｌｔｄから調達した。これらマウスは、実験を行う前に環境に適応させるため、少なくとも１週間、ＮＣＫＵのバイオテクノロジー研究所の動物施設に収容した。行われた全ての実験は、ＮＣＫＵでＩＡＣＵＣ（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）によりあらかじめ承認されたものであった。

この実験の動物モデルは、下肢虚血のための治療上の処置を試験するために確立されていた。月齢６ケ月以上のマウスを、５０ｍｇ／ｋｇ体重のストレプトゾトシン（ＳＴＺ）溶液で処理して、高齢および治癒が遅い創傷した糖尿病性組織の特徴を呈するように、Ｉ型糖尿病を誘導した。マウスの低血糖値はこの結果を妨げるため、４００ｍｇ／ｄｌ〜５５０ｍｇ／ｄｌの範囲内の血糖値を有するマウスをこの実験に使用し、命に関わる高血糖値を回避するために、微量のインスリンをマウスに使用した。自己再生する血管新生の可能性を回避するために、マウスの下肢の大腿動脈およびその末梢血管を切断した。このモデルは、血管再生の可能性を最小限にされており、試験医薬の血管新生能のより正確な評価を可能にした。

下肢の虚血を誘導するために、剪毛した糖尿病性マウスを、１分当たりにガス１リットル当たり１〜３％のイソフルランを含む人工呼吸ガス（ｖｅｎｔｉｌａｔｉｎｇ ｇａｓ）を伴う麻酔ガスボックスに載置した。マウスが意識を失った後、マウスを、手術台に移動させ、麻酔ガス下で維持した。通気性のあるテープを使用して肢を固定した後、３７℃の加熱パッドを用いてマウスの体温を一定に保った。マウスの下腹部および肢を消毒した後、肢の皮膚を、左足首の小さな開口部から大腿へと切開した。マウスのふくらはぎの筋肉の背側にある２つの外側の血管の両端を縫合糸で結索し、血管を除去して背側の血管の血流を遮断した。次に、腹側の大腿動脈の側枝および主要な血管を遮断した。足首近くの動脈端部およびその周辺の血管を、縫合糸により結索し、大腿動脈および末梢の血流が完全に遮断されることを確保した。

血管を切断した後に、虚血に及ぼす治療効果について試験される医薬組成物を、８つの部位で、組織に直接適用するかまたは腓腹筋に注射し、外科的開口部を縫合した。このマウスに、１ｍｇ／ｋｇ体重のケトロラック鎮痛剤およびリドカイン−ＨＣｌ局所麻酔薬を皮下注射し、また１ｍｌの生理食塩水溶液を投与して、疼痛を緩和させ水分補給を提供した。体力を維持するために、必要な場合はいつでもグルコース溶液を投与した。

外科手術後０、１、２、３、４、５、６、７、１４、２１、および２８日目に、マウスの外観および下肢の血流を、それぞれ、表１に示されるスコアシステムおよびレーザードップラー血流計を使用して評価した。ＲＯＩを、左下肢の血流シグナルの未処置の右下肢の外科手術後の血流シグナルに対する比として計算し、パーセンテージでの比を、手術前に行われた血流シグナルに基づき正規化した。

実施例２：ヒアルロナンの粘度試験
様々な分子量であり異なる濃度のヒアルロナンを含む複数の組成物を生成した。

これら医薬組成物の粘度を、ＤＶ２ＴＲＶ粘度計（Ｂｒｏｏｋｆｉｅｌｄ，ＵＳＡ）をマニュアルに従い使用して試験した。粘度にしたがい、適切なスピンドル（ＣＰＥ４０またはＣＰＥ５２）を選択した。試験前に、この機械を較正し、２５℃、２０ｒｐｍで１分間作動するようにセットした。各サンプル５００μｌを、粘度ピペットでサンプルプレートに移し、作動ボタンを押してサンプルの粘度決定を開始した。平均分子量１，５６０ｋＤａ、７００ｋＤａ、および２，０００ｋＤａを有するヒアルロナンの５ｍｇ／ｍｌでの粘度を決定し、これら結果を表２に示す。平均分子量１，５６０ｋＤａのヒアルロナンの５ｍｇ／ｍｌでの粘度を参照として使用し、平均分子量７００ｋＤａおよび２，０００ｋＤａである、様々な濃度のヒアルロナンの粘度を、表３および４に示すように測定した。次に、参照粘度の値に近い粘度の、平均分子量７００ｋＤａおよび２，０００ｋＤａのヒアルロナンの濃度を計算し、それぞれ６．５ｍｇ／ｍｌおよび４ｍｇ／ｍｌに調節した。

表５に示すように、同じ濃度および分子量の範囲を有するヒアルロナンの粘度は、測定パラメータを変えた際に変化したことが注目に値する。

実施例３：血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）を含む医薬組成物
５ｍｇ／ｍｌ、平均分子量１５６０ｋＤａのヒアルロナンと、ＶＥＧＦとを含む組成物（ＤＩＶ）を、マウスに投与し、その下肢および血流に及ぼす効果を、上記の実施例１に記載のように評価した。外科手術後にこの組成物で処置されなかった糖尿病マウスは、対照として使用した。ＶＥＧＦ医薬は、文献において血管新生作用を有することが記載されている。ヒトにおけるＶＥＧＦの最大有効量および最小有効量を、体重によってマウスの用量に変換した。

外観スコアを図１に示す。１００μｌのＤＩＶの投与は、マウスに３．１２５ｎｇ／ｇ体重のＶＥＧＦを提供した。３．１２５ｎｇ／ｇのＶＥＧＦ（ＤＩＶ２）をマウスへ投与することは、対照のグループと比較して高い外観スコアをもたらした。ＶＥＧＦの用量を０．３ｎｇ／ｇ（ＤＩＶ１）に下げた場合、外観スコアは、対照グループの値より低いことが観察された。ＶＥＧＦの用量を１５ｎｇ／ｇ（ＤＩＶ３）に増やした場合、虚血および下肢の壊疽が悪化したことが観察された。

血流測定の結果を、図２に示す。対照のグループと比較して、３．１２５ｎｇ／ｇのＶＥＧＦのみが、１４日目、および後の外科手術後に血流を有意に増加させた。この結果は、ＶＥＧＦが０．３ｎｇ／ｇ〜１５ｎｇ／ｇの特定の用量でのみ有効であったことを示した。

実施例４：チクロピジンを含む医薬組成物
１０００〜１８００ｋＤａの範囲の分子量を有する５ｍｇ／ｍｌのヒアルロナンと、チクロピジンとを含む組成物（ＤＩＴ）をマウスに投与し、その下肢および血流に及ぼす効果を、上記の実施例１に記載されるように評価した。外科手術後にこの組成物で処置しなかった糖尿病マウスは、対照として使用した。ヒトのチクロピジンの最大有効量および最小有効量を、体重によってマウスの用量に変換した。

手術後の外観スコアを、図３に示す。１００μｌのＤＩＴの投与は、マウスに、０．７μｇ／ｇ体重のチクロピジン（ＤＩＴ２）を提供した。この用量で、２日目から２８日目までの外観スコアは、対照グループのスコアとは有意に異なっていた（Ｐ＜０．０５）。また外観スコアは、０．０７μｇ／ｇのチクロピジン（ＤＩＴ１）を投与する場合でも、対照グループの値と有意に異なっていた。

しかしながら、用量を、７μｇ／ｇ体重（ＤＩＴ３）または１１０μｇ／ｇ体重（ＤＩＴ４）に増加させた場合、外観スコアは、観察期間における対照のグループのスコアと有意に異なるものではなかった。またこれら結果は、チクロピジンが、少ない用量では虚血により引き起こされる壊疽を有効に軽減できるが、この効果は、用量が特定の閾値を下回る場合に低下したことを示すものであった。

血流測定の結果を図４に示す。この結果は、０．０７μｇ／ｇ体重（ＤＩＴ１）および０．７μｇ／ｇ体重（ＤＩＴ２）のチクロピジンで、虚血性下肢での血流シグナルが、外科手術後７日目から対照と比較して有意に増加したことを示した（Ｐ＜０．０５）。しかしながら、これよりも高い用量（ＤＩＴ３およびＤＩＴ４）では、対照と比較して血流に有意差はなかった。

実施例５：ワルファリンを含む医薬組成物
５ｍｇ／ｍｌ、平均分子量１，５６０ｋＤａのヒアルロナンとワルファリンとを含む組成物（ＤＩＷ）をマウスに投与し、その下肢および血流に及ぼす効果を、上記の実施例１に記載されるように評価した。外科手術後にこの組成物で処置しなかった糖尿病マウスは、対照として使用した。ヒトのワルファリンの最大有効量および最小有効量を、体重によってマウスの用量に変換した。

手術後の外観スコアを、図５に示す。１００μｌのＤＩＷの投与は、マウスに７０ｎｇ／ｇ体重のワルファリンを提供した。この用量では（ＤＩＷ２）、２日目から２８日目までの外観スコアは、対照グループのスコアと比較して最も有意に異なっていた（Ｐ＜０．０５）。さらに、この用量を１４０ｎｇ／ｇ体重まで２倍増加させた場合（ＤＩＷ４）、５日目から２８日目までの外観スコアもまた、対照グループのスコアと有意に異なっていた（Ｐ＜０．００１〜０．０５）。他方で、用量を、３倍の２１０ｎｇ／ｇ体重に増加させた場合（ＤＩＷ５）、外観スコアは、対照グループのスコアと有意に異なるものではなかった。これら結果は、ＤＩＷの最適な用量が、虚血性疾患の事例で下肢の外観の完全性を維持し、組織の壊疽を回避した、７０ｎｇ／ｇ体重のワルファリンであることを示唆するものであった。

血流測定の結果を、図６に示す。これら結果は、ワルファリンの用量が７０ｎｇ／ｇ体重（ＤＩＷ２）である場合に、下肢の血流シグナルが、手術後７日目から対照グループのシグナルと有意に異なるものであったことを示した。用量が３５ｎｇ／ｇ（ＤＩＷ１）、１０５ｎｇ／ｇ（ＤＩＷ３）、１４０ｎｇ／ｇ（ＤＩＷ４）、または２１０ｎｇ／ｇ（ＤＩＷ５）である場合、下肢の血流シグナルは、手術後１４日目から、対照グループのシグナルと有意に異なっていた。しかしながら、２１０ｎｇ／ｇのワルファリンでは、外科手術後２８日目で、対照グループと比較して有意差は存在しなかった。

ＤＩＶ（実施例３）、ＤＩＴ（実施例４）、およびＤＩＷで得た結果を比較すると、７０ｎｇ／ｇ体重のワルファリン（ＤＩＷ２）でのＤＩＷ投与が最も有効であると思われた。ＤＩＷ２のグループでは、手術後の観察期間の間、下肢の足指の遠位端のみがわずかに黒ずんだことが観察された。対照的に、対照のグループでは、左下肢は、手術後３日目に黒ずんだ外観を有している。また、一部の組織の脱落が、手術後７日目に観測される場合があり、下肢の壊疽が、手術後１４日目に観察される場合があった。よって、虚血により引きこされる壊疽の外観は、ＤＩＷ２の投与により有意に軽減することができた。

さらに、レーザードップラーにより検出される血流シグナルの分布により、ＤＩＷ２のグループの血流シグナルが、手術後１４日目より後に、徐々に増加したことが示された。逆に、対照グループでは、血流シグナルの増加は観察されなかった。さらに、下肢の壊疽により、レーザードップラー撮像器は、対照グループで下肢の血流を検出することができなかった。これら結果は、下肢の壊疽の外観が、対照グループと比較してＤＩＷ２のグループで有意に軽減したことをさらに示すものであった。

対照グループおよびＤＩＷ２グループにおける手術後の下肢の血流変化のさらなる解析を、オキシメーターを使用して行った。図７に示すように、対照グループおよびＤＩＷ２グループにおける下肢の血流は、手術後すぐに減少し始めた。ＤＩＷ２グループは、手術後７日目に血流を回復し始め、この血流は、観察期間の間、約１００〜２００ＡＵに達した。対照グループは、２８日の観察期間の間血流の回復を全く示さず、実際にはわずかな減少を示した。

実施例６：ワルファリンを含む医薬組成物で処置したマウスの機能の評価
ＤＷＩ２グループおよび対照グループのマウスを、さらに機能について評価した。この評価は、手術後３５日目に行った。

各マウスを、プラットフォームに載置し、その尾を、約５ｃｍの固定した高さで引き、その直立してつかむ姿勢（ｓｔａｎｄｉｎｇ ｇｒｉｐ ｐｏｓｅ）を観察した。直立姿勢において、ＤＩＷ２グループのマウスは、未だ正常なマウスと同様に握ることができなかったことが観察された。しかしながら、ＤＩＷグループの歩長および動揺長（ｓｗａｙ ｌｅｎｇｔｈ）は、対照グループの値と比較して有意に増加し（Ｐ＜０．００１）、正常なマウスの値と同程度であったことが見いだされた。図８（Ａ）および（Ｂ）を参照されたい。これら結果は、ＤＩＷ２グループのマウスの下肢は手術後萎縮し始めるため、これらの歩幅は正常なものに完全に戻ることができないが、それでも対照グループと比較して有意に良好であったことを示した。

さらに、マウスを、ランニングトラックに載置し、マウスの足形によりその足取りを解析した。５ｒｐｍで、ＤＩＷ２グループのマウスおよび正常なマウスは、同様の期間の間落ちることなくトラックに留まることができたが、対照グループのマウスは、それよりも有意に短い期間の後に落下したことが観察された。図８（Ｃ）を参照されたい。回転速度を１０ｒｐｍに上げた場合、ＤＩＷ２のグループのマウスは、正常なマウスよりもかなり早くに落下したが、対照のマウスより有意に長い期間留まったことが観察された。図８（Ｄ）を参照されたい。

実施例７：処置のタイミングの効果
下肢虚血を有する糖尿病マウスを、実施例１に記載のように作製した。このマウスを、ワルファリンと、５ｍｇ／ｍｌ、分子量の範囲が１０００〜１８００ｋＤａのヒアルロナンとを含む組成物で、上記に記載のＤＩＷ２グループのマウスと同様に７０ｎｇ／ｇ体重のワルファリンの用量ではあるが、手術後異なる時点で処置した。図９に示すように、手術後に処置が遅れた場合、下肢の外観スコアは、遅れた長さに応じて減少したことが観察された。にもかかわらず、処置が、手術後４８時間程度遅れて行われた場合であっても、外観スコアは手術後２８日目で未だ約９ポイントであり、足指の壊死のみを伴い肢の一部が残ったことを表した。処置が７２時間遅れた場合、下肢の壊死を回復させることはできなかった。

実施例８：処置の効力に及ぼす異なる分子量のヒアルロナンの効果
本医薬組成物において異なる分子量のヒアルロナンが治療効果に影響を及ぼすかどうかを研究した。

ワルファリンと、異なる平均分子量、すなわち７４ｋＤａ、３５７ｋＤａ、７００ｋＤａ、１５６０ｋＤａ、２０００ｋＤａ、および２５９０ｋＤａであり、５ｍｇ／ｍｌのヒアルロナンとを含む複数の組成物を生成した。これら組成物を、下肢の虚血を有する糖尿病マウスに、７０ｎｇ／ｇ体重のワルファリンの用量で投与し、実施例１に記載のように評価した。

図１０に示すように、平均分子量１，５６０ｋＤａのヒアルロナンを含む組成物が、最良の治療効果を呈した。平均分子量を２，０００ｋＤａに増加させた場合、外観スコアは、対照グループのスコアよりも良好であったが、１，５６０ｋＤａのヒアルロナンよりも低かった。さらに、１，５６０ｋＤａ未満の平均分子量を有するヒアルロナンは、外観スコアを下げる傾向があった。手術後２８日目の３５７ｋＤａおよび７４ｋＤａグループの外観スコアは、対照グループと比較して悪化していた。

図１１に示すように、２，０００ｋＤａおよび１，５６０ｋＤａのグループの血流シグナルは、対照グループと比較して、手術後１４日目より後に、有意に増加した。

実施例９：処置の効力に及ぼす粘度の効果
粘度が本医薬組成物の治療効果に影響するかどうかを調査した。

それぞれ４ｍｇ／ｍｌ、平均２０００ｋＤａのヒアルロナン、５ｍｇ／ｍｌ、平均１５６０ｋＤａのヒアルロナン、または６．５ｍｇ／ｍｌ、平均７００ｋＤａのヒアルロナンを含む組成物を生成した。ヒアルロナンの濃度は、３つ全てが同様の粘度を有するように選択した。上記の表２、３、および４を参照されたい。それぞれを、ワルファリンと混合してゼラチン状組成物を生成した。これら組成物を、下肢の虚血を有する糖尿病マウスに、７０ｎｇ／ｇ体重のワルファリンの用量で投与し、実施例１に記載のように評価した。

図１２に示すように、異なる分子量のヒアルロナンを含む組成物で処置したマウスにおける下肢の外観スコアは、観察期間の間それほど異なるものではなかった。よって、ヒアルロナンの粘度は、分子量よりも重要であると思われた。図１０および１１に示すように、５ｍｇ／ｍｌ、平均１５６０ｋＤａのヒアルロナン、および５ｍｇ／ｍｌ、平均２０００ｋＤａのヒアルロナンは、同じ濃度であるが、分子量がこれらよりも大きいかまたは小さいヒアルロナンよりも有意に有効であったことに留意されたい。これら結果はまた、特定の範囲の粘度が最適であることを示唆している。

他の実施形態
本明細書で開示される全ての特性は、任意の組み合わせで組み合わせることができる。本明細書で開示される各特性は、同じ目的、同等の目的、または同様の目的を供給する別の特性によって置き換えられ得る。よって、特段他が記載されない限り、開示される各特性は、同等または類似の特性の全般的なシリーズの単なる例である。

上記記載から、当業者は、記載される実施形態の本質的な特徴に容易に達することができ、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、様々な利用および条件に適合させるために、これら実施形態の様々な変更および修正を作製することができる。よって、他の実施形態もまた、特許請求の範囲内にある。

Claims (32)

1. 虚血性組織を処置するための医薬組成物であって、
   血栓溶解薬を含むコア成分とヒアルロナンまたはその誘導体を含むマトリックス成分とを含み、前記医薬組成物が１０ｍＰａ・ｓ超の粘度を有する、
   医薬組成物。
2. 前記粘度が、１０〜１００００ｍＰａ・ｓである、請求項１に記載の医薬組成物。
3. 前記ヒアルロナンが、１００ｋＤａ〜５０００ｋＤａの平均分子量を有する、請求項２に記載の医薬組成物。
4. 前記ヒアルロナンが、７００ｋＤａ〜２０００ｋＤａの平均分子量を有する、請求項３に記載の医薬組成物。
5. １ｍｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌの前記ヒアルロナンを含む、請求項３に記載の医薬組成物。
6. 前記粘度が、７００〜２０００ｋＤａの平均分子量を有する３〜１０ｍｇ／ｍｌの前記ヒアルロナンの粘度の範囲内にある、請求項１に記載の医薬組成物。
7. 前記粘度が、１５６０ｋＤａの平均分子量を有する５ｍｇ／ｍｌの前記ヒアルロナンの粘度と同じである、請求項１に記載の医薬組成物。
8. 前記ヒアルロナンの平均分子量が、７００〜２０００ｋＤａであり、前記ヒアルロナンの濃度が、３〜１０ｍｇ／ｍｌである、請求項６に記載の医薬組成物。
9. 前記ヒアルロナンの平均分子量が、１５６０ｋＤａであり、前記ヒアルロナンの濃度が、５ｍｇ／ｍｌである、請求項７に記載の医薬組成物。
10. 前記マトリックス成分がさらに、コラーゲン、細胞外マトリックス因子、タンパク質、または多糖を含む、請求項１に記載の医薬組成物。
11. 前記血栓溶解薬が、チクロピジン、ワルファリン、組織プラスミノーゲンアクチベーター、エミナーゼ（ｅｍｉｎａｓｅ）、レタバーゼ（ｒｅｔａｖａｓｅ）、ストレプターゼ（ｓｔｒｅｐｔａｓｅ）、組織プラスミノーゲンアクチベーター、テネクテプラーゼ、アボキナーゼ、ｋｉｎｌｙｔｉｃ、ウロキナーゼ、プロウロキナーゼ、アニソイル化された精製ストレプトキナーゼ活性化複合体（ａｎｉｓｏｙｌａｔｅｄ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｓｔｒｅｐｔｏｋｉｎａｓｅ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｃｏｍｐｌｅｘ：ＡＰＳＡＣ）、フィブリン、およびプラスミンからなる群から選択される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の医薬組成物。
12. 血管新生化合物をさらに含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の医薬組成物。
13. 前記血管新生化合物が、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）である、請求項１２に記載の医薬組成物。
14. 前記虚血性組織に直接投与されるが、静脈内に投与されない、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
15. 前記虚血性組織が、対象の潰瘍であるか、または対象の心臓もしくは肢にある、請求項１４に記載の医薬組成物。
16. 前記虚血性組織が、筋肉である、請求項１５に記載の医薬組成物。
17. 対象の虚血性組織を処置する方法であって、前記虚血性組織に直接医薬組成物を投与するステップを含み、ただし前記医薬組成物は静脈内投与されず、
    前記医薬組成物が、血栓溶解薬を含むコア成分とヒアルロナンまたはその誘導体を含むマトリックス成分とを含み、前記医薬組成物が１０ｍＰａ・ｓ超の粘度を有する、
    方法。
18. 前記虚血性組織が、対象の潰瘍であるか、または対象の心臓もしくは肢にある、請求項１７に記載の方法。
19. 前記虚血性組織が、筋肉である、請求項１８に記載の方法。
20. 前記対象が、糖尿病を有する、請求項１７に記載の方法。
21. 前記粘度が、１０〜１００００ｍＰａ・ｓである、請求項１７〜２０のいずれか１項に記載の方法。
22. 前記ヒアルロナンが、１００ｋＤａ〜５０００ｋＤａの平均分子量を有する、請求項２１に記載の方法。
23. 前記ヒアルロナンが、７００ｋＤａ〜２０００ｋＤａの平均分子量を有する、請求項２２に記載の方法。
24. 前記医薬組成物が、１ｍｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌの前記ヒアルロナンを含む、請求項２１に記載の方法。
25. 前記粘度が、７００〜２０００ｋＤａの平均分子量を有する３〜１０ｍｇ／ｍｌの前記ヒアルロナンの粘度の範囲内にある、請求項２１に記載の方法。
26. 前記粘度が、１５６０ｋＤａの平均分子量を有する５ｍｇ／ｍｌの前記ヒアルロナンの粘度と同じである、請求項２１に記載の方法。
27. 前記ヒアルロナンの平均分子量が、７００〜２０００ｋＤａであり、前記ヒアルロナンの濃度が、３〜１０ｍｇ／ｍｌである、請求項２５に記載の方法。
28. 前記ヒアルロナンの平均分子量が、１５６０ｋＤａであり、前記ヒアルロナンの濃度が、５ｍｇ／ｍｌである、請求項２６に記載の方法。
29. 前記マトリックス成分がさらに、コラーゲン、細胞外マトリックス因子、タンパク質、または多糖を含む、請求項１７〜２８のいずれか１項に記載の方法。
30. 前記血栓溶解薬が、チクロピジン、ワルファリン、組織プラスミノーゲンアクチベーター、エミナーゼ（ｅｍｉｎａｓｅ）、レタバーゼ（ｒｅｔａｖａｓｅ）、ストレプターゼ（ｓｔｒｅｐｔａｓｅ）、組織プラスミノーゲンアクチベーター、テネクテプラーゼ、アボキナーゼ、ｋｉｎｌｙｔｉｃ、ウロキナーゼ、プロウロキナーゼ、アニソイル化された精製ストレプトキナーゼ活性化複合体（ａｎｉｓｏｙｌａｔｅｄ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｓｔｒｅｐｔｏｋｉｎａｓｅ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｃｏｍｐｌｅｘ：ＡＰＳＡＣ）、フィブリン、およびプラスミンからなる群から選択される、請求項１７〜２８のいずれか１項に記載の方法。
31. 血管新生化合物をさらに含む、請求項１７〜２８のいずれか１項に記載の方法。
32. 前記血管新生化合物が、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）である、請求項３１に記載の方法。

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