JP2020533973A - 改変されたホスホリパーゼドメインを含むアデノ随伴ウイルス(aav) - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、参照によりその内容全体を本明細書に援用する2017年8月31日に提出された米国仮出願第62/553,028号の利益を主張する。
本出願は、EFS−Web経由で電子的に提出した配列表(名称:「4226.006PC01_Sequence_Listing_ST25.txt」;サイズ:100,400バイト;2018年8月22に作成した)を含み、その内容全体を参照により本明細書に援用する。
本開示は、一般的に、改変されたホスホリパーゼドメインを含むウイルスカプシドタンパク質を有するアデノ随伴ウイルス(AAV)、及び昆虫細胞内でのバキュロウイルス発現系を用いたその生成方法に関する。
アデノ随伴ウイルス(AAV)は、ヒト遺伝子治療のための最も有望なウイルスベクターの1つである。AAVは、2つのORFを発現する約4.7kbのssDNAゲノムを含有し、1つのORFは、ウイルスコートタンパク質VP1、VP2及びVP3ならびにアセンブリ関連タンパク質またはアセンブリ活性化タンパク質(AAP)をコードし、第2のORFは4つのウイルスレプリカーゼ成分をコードし;これらのORFは、2つの逆方向末端反復配列(ITR)と隣接する。該ITRは、新生ウイルスカプシドにおけるゲノムの複製及び新たに合成されるゲノムのローディングで非常に重要な役割を果たすウイルスrepタンパク質によって認識される。組換えAAV粒子は、目的の遺伝子(GOI)が2つのITR間でクローン化され、ウイルスのcap及びrepタンパク質がトランスにもたらされるベクターを用いて調製することができる。
本開示は、昆虫細胞内でバキュロウイルス発現系から産生される血清型2以外の血清型からのAAVのエンドソーム脱出能は、ホスホリパーゼドメイン及び隣接領域内の特異的部位でアミノ酸置換を行うことによって、修復または改善できるという発明者らによる予想外の発見に基づいている。詳細には、発明者らは、初めて2種の代表的なAAV血清型、すなわち血清型8及び9のエンドソーム脱出能を、6個までの残基位置でアミノ酸を対応位置のAAV血清型2由来のアミノ酸と置き換えることによって、修復または改善できることを示した。この関連で、本発明者らは、現在まで昆虫細胞内で産生されるAAVの機能性を改善するためにこの戦略が利用されたように、キメラAAVを生成するためにPLAドメイン全体をAAV2のPLAドメインと交換する必要はなく、野生型VP1/PLA配列及びAAV2の野生型VP1/PLA配列、例えば、AAV2/WT VP1を含むモザイクカプシドを発現するAAVを生成する必要もないことを示した。従って、発明者らは、それぞれのAAVの野生型ウイルスカプシドタンパク質内の全ドメイン及び/またはサブユニット配列を置き換えなくても昆虫細胞内で産生される組換え非血清型2AAVのエンドソーム脱出能を修復または改善できる新規手法を提供した。
(i)改変VP1配列が、配列番号15に記載される配列を含む、AAV1由来のウイルスカプシドタンパク質;
(ii)改変VP1配列が、配列番号16に記載される配列を含む、AAV3由来のウイルスカプシドタンパク質;
(iii)改変VP1配列が、配列番号17に記載される配列を含む、AAV4由来のウイルスカプシドタンパク質;
(iv)改変VP1配列が、配列番号18に記載される配列を含む、AAV5由来のウイルスカプシドタンパク質;
(v)改変VP1配列が、配列番号19に記載される配列を含む、AAV6由来のウイルスカプシドタンパク質;
(vi)改変VP1配列が、配列番号20に記載される配列を含む、AAV7由来のウイルスカプシドタンパク質;
(vii)改変VP1配列が、配列番号21に記載される配列を含む、AAV8由来のウイルスカプシドタンパク質;
(viii)改変VP1配列が、配列番号22に記載される配列を含む、AAV9由来のウイルスカプシドタンパク質;
(ix)改変VP1配列が、配列番号23に記載される配列を含む、AAV10由来のウイルスカプシドタンパク質;
(x)改変VP1配列が、配列番号24に記載される配列を含む、AAV11由来のウイルスカプシドタンパク質;
(xi)改変VP1配列が、配列番号25に記載される配列を含む、AAV12由来のウイルスカプシドタンパク質;及び
(xii)改変VP1配列が、配列番号26に記載される配列を含むAAV13由来のウイルスカプシドタンパク質
から成る群より選択される。
本開示は、下記:
(i)本明細書に記載どおりに核酸分子を含む第1のバキュロウイルスベクターであって、核酸分子が、本明細書に記載どおりにAAVウイルスカプシドタンパク質及びRepタンパク質をコードするベクター;及び
(ii)AAV逆方向末端反復(ITR)配列と隣接する目的のタンパク質またはRNAをコードするポリヌクレオチドを含む第2のバキュロウイルスベクター
を含む複数のバキュロウイルスベクターをも提供する。
(i)本明細書に記載どおりに核酸分子を含む第1のバキュロウイルスベクターであって、核酸分子が、本明細書に記載どおりにAAVウイルスカプシドタンパク質をコードするベクター;
(ii)Rep78及びRep68から選択される少なくとも1つの大型AAV複製(Rep)タンパク質ならびにRep52及びRep40から選択される少なくとも1つの小型AAV Repタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含む第2のバキュロウイルスベクター;及び
(iii)AAV逆方向末端反復(ITR)配列と隣接する目的のタンパク質またはRNAをコードするポリヌクレオチドを含む第3のバキュロウイルスベクター
を含む複数のバキュロウイルスベクターをも提供する。
(i)本明細書に記載どおりに昆虫細胞を、培地内で細胞がAAVを産生するのに十分な条件下で培養すること;及び場合により
(ii)培地及び/または細胞からAAVを回収すること
を含む方法をも提供する。
(i)昆虫細胞を、本明細書に記載どおりにAAVウイルスカプシドタンパク質及びRepタンパク質をコードする本明細書に記載の核酸分子を含むゲノムを有する第1のバキュロウイルス;及びAAV逆方向末端反復(ITR)配列、例えばAAV血清型2由来のITR配列と隣接する目的のタンパク質またはRNAをコードするポリヌクレオチドを含むゲノムを有する第2のバキュロウイルスに同時感染させること;
(ii)(i)でバキュロウイルスに感染した昆虫細胞を、培地内で細胞がAAVを産生するのに十分な条件下で培養すること;及び場合により
(iii)培地及び/または細胞からAAVを回収すること
を含む方法をも提供する。
(i)昆虫細胞を、本明細書に記載どおりにAAVウイルスカプシドタンパク質をコードする本明細書に記載の核酸分子を含むゲノムを有する第1のバキュロウイルス;Rep78及びRep68から選択される少なくとも1つの大型AAV複製(Rep)タンパク質ならびにRep52及びRep40から選択される少なくとも1つの小型AAV Repタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含むゲノムを有する第2のバキュロウイルス;及びAAV逆方向末端反復(ITR)配列と隣接する目的のタンパク質またはRNAをコードするポリヌクレオチドを含むゲノムを有する第3のバキュロウイルスに同時感染させること;
(ii)(i)でバキュロウイルスに感染した昆虫細胞を、培地内で細胞がAAVを産生するのに十分な条件下で培養すること;及び場合により
(iii)培地及び/または細胞からAAVを回収すること
を含む方法をも提供する。
(i)改変VP1配列が、配列番号15に記載される配列を含むAAV血清型1;
(ii)改変VP1配列が、配列番号16に記載される配列を含むAAV血清型3;
(iii)改変VP1配列が、配列番号17に記載される配列を含むAAV血清型4;
(iv)改変VP1配列が、配列番号18に記載される配列を含むAAV血清型5;
(v)改変VP1配列が、配列番号19に記載される配列を含むAAV血清型6;
(vi)改変VP1配列が、配列番号20に記載される配列を含むAAV血清型7;
(vii)改変VP1配列が、配列番号21に記載される配列を含むAAV血清型8;
(viii)改変VP1配列が、配列番号22に記載される配列を含むAAV血清型9;
(ix)改変VP1配列が、配列番号23に記載される配列を含むAAV血清型10;
(x)改変VP1配列が、配列番号24に記載される配列を含むAAV血清型11;
(xi)改変VP1配列が、配列番号25に記載される配列を含むAAV血清型12;及び
(xii)改変VP1配列が、配列番号26に記載される配列を含むAAV血清型13
から成る群より選択される。
(i)AAVが血清型1のものであるとき、ウイルスカプシドタンパク質は、配列番号15に記載される配列を含むVP1配列を含む;
(ii)AAVが血清型3のものであるとき、ウイルスカプシドタンパク質は、配列番号16に記載される配列を含むVP1配列を含む;
(iii)AAVが血清型4のものであるとき、ウイルスカプシドタンパク質は、配列番号17に記載される配列を含むVP1配列を含む;
(iv)AAVが血清型5のものであるとき、ウイルスカプシドタンパク質は、配列番号18に記載される配列を含むVP1配列を含む;
(v)AAVが血清型6のものであるとき、ウイルスカプシドタンパク質は、配列番号19に記載される配列を含むVP1配列を含む;
(vi)AAVが血清型7のものであるとき、ウイルスカプシドタンパク質は、配列番号20に記載される配列を含むVP1配列を含む;
(vii)AAVが血清型8のものであるとき、ウイルスカプシドタンパク質は、配列番号21に記載される配列を含むVP1配列を含む;
(viii)AAVが血清型9のものであるとき、ウイルスカプシドタンパク質は、配列番号22に記載される配列を含むVP1配列を含む;
(ix)AAVが血清型10のものであるとき、ウイルスカプシドタンパク質は、配列番号23に記載される配列を含むVP1配列を含む;
(x)AAVが血清型11のものであるとき、ウイルスカプシドタンパク質は、配列番号24に記載される配列を含むVP1配列を含む;
(xi)AAVが血清型12のものであるとき、ウイルスカプシドタンパク質は、配列番号25に記載される配列を含むVP1配列を含む;及び
(xii)AAVが血清型13のものであるとき、ウイルスカプシドタンパク質は、配列番号26に記載される配列を含むVP1配列を含む
ように、対応する野生型配列に対して改変することを含む。
配列番号1:PLA2ドメイン及び隣接配列を含む、AAV血清型の改変コンセンサスVP1部分配列。
通則
本明細書全体を通じて、特に別段の定めをした場合を除き、または文脈上他の意味に解すべき場合を除いて、単一の工程、特徴、組成物、工程の群または特徴もしくは組成物の群への言及は、1つ及び複数の(すなわち1つ以上の)当該工程、特徴、組成物、工程の群または特徴もしくは組成物の群を包含するものと解釈すべきである。
本明細書で使用する場合、用語「アデノ随伴ウイルス」または「AAV」は、短い(約4.7kb)一本鎖DNAゲノムを含有し、それらの複製のためにはアデノウイルス等のヘルパーウイルスの存在に依存するパルボウイルス科内の1群のウイルスに関する。本開示は、AAVに由来するベクター、すなわち遺伝子トランスファービヒクルをも企図する。
本開示は、一般的に、特に改変VP1配列及び関連ホスホリパーゼA2(PLA2)ドメインを含む改変ウイルスカプシドタンパク質を有するAAVに関し、昆虫細胞内で産生されるとき(対応する野生型AAVに比べて)改善または修復された機能性を有する。本開示は、該改変AAVの生成ならびに遺伝子治療の場合のような哺乳動物細胞における外因性核酸の導入及び/または発現のためのベクターとしてのその使用にも関する。
本開示は、昆虫細胞適合ベクター、すなわち、バキュロウイルスベクター内の本開示の核酸分子をも提供する。特に、本開示は、本明細書に記載どおりに改変VP1配列を有するAAVウイルスカプシドタンパク質をコードする核酸分子を含むバキュロウイルスベクターを提供する。
(i)本明細書に記載どおりに改変VP1配列を有するAAVウイルスカプシドタンパク質をコードする核酸分子を含む第1のバキュロウイルスベクター;及び
(ii)AAV逆方向末端反復(ITR)配列と隣接する目的のタンパク質またはRNAをコードするポリヌクレオチドを含む第2のバキュロウイルスベクター
を含む複数のバキュロウイルスベクターをも提供する。
(iii)Rep78及びRep68から選択される少なくとも1つの大型AAV Repタンパク質ならびにRep52及びRep40から選択される少なくとも1つの小型AAV Repタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含む第3のバキュロウイルスベクター
を含む。
本明細書では、本明細書に記載どおりに改変VP1配列を有するAAVウイルスカプシドタンパク質をコードする本開示の核酸分子を含む昆虫細胞をも提供する。
本開示は、改変VP1配列を有するカプシドタンパク質を含むAAVの生成方法であって、本明細書に記載どおりに改変VP1配列をコードする核酸が、昆虫細胞内で発現され、その中でAAVがアセンブルされる、方法をも提供する。一例において、本開示は、昆虫細胞内でのAAVの生成方法であって、下記:
(i)本明細書に記載どおりに昆虫細胞を培地内で細胞がAAVを産生するのに十分な条件下で培養すること;及び場合により
(ii)培地及び/または細胞からAAVを回収すること
を含む方法をも提供する。
(i)昆虫細胞を、本明細書に記載の改変VP1配列を有するAAVウイルスカプシドタンパク質をコードする本開示の核酸分子を含み、かつRep78及びRep68から選択される少なくとも1つの大型AAV複製(Rep)タンパク質ならびにRep52及びRep40から選択される少なくとも1つの小型AAV Repタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含むゲノムを有する第1のバキュロウイルスベクターと、本明細書に記載どおりにAAV逆方向末端反復(ITR)配列と隣接する目的のタンパク質またはRNAをコードするポリヌクレオチドを含むゲノムを有する第2のバキュロウイルスベクターとに同時感染させること;
(ii)(i)でバキュロウイルスベクターに感染した昆虫細胞を、培地内で細胞がAAVを産生するのに十分な条件下で培養すること;及び場合により
(iii)培地及び/または細胞からAAVを回収すること
を含む方法を提供する。
(i)昆虫細胞を、本明細書に記載どおりに改変VP1配列を有するAAVウイルスカプシドタンパク質をコードする本開示の核酸分子を含むゲノムを有する第1のバキュロウイルスベクターと、Rep78及びRep68から選択される少なくとも1つの大型AAV複製(Rep)タンパク質ならびにRep52及びRep40から選択される少なくとも1つの小型AAV Repタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含むゲノムを有する第2のバキュロウイルスベクターと、AAV ITR配列と隣接する目的のタンパク質またはRNAをコードするポリヌクレオチドを含むゲノムを有する第3のバキュロウイルスベクターとに同時感染させること;
(ii)(i)でバキュロウイルスベクターに感染した昆虫細胞を、培地内で細胞がAAVを産生するのに十分な条件下で培養すること;及び場合により
(iii)培地または細胞からAAVを回収すること
を含む方法を提供する。
(i)AAVが血清型1のものであるとき、ウイルスカプシドタンパク質が、配列番号15に記載される配列を含むVP1配列を含む;
(ii)AAVが血清型3のものであるとき、ウイルスカプシドタンパク質が、配列番号16に記載される配列を含むVP1配列を含む;
(iii)AAVが血清型4のものであるとき、ウイルスカプシドタンパク質が、配列番号17に記載される配列を含むVP1配列を含む;
(iv)AAVが血清型5のものであるとき、ウイルスカプシドタンパク質が、配列番号18に記載される配列を含むVP1配列を含む;
(v)AAVが血清型6のものであるとき、ウイルスカプシドタンパク質が、配列番号19に記載される配列を含むVP1配列を含む;
(vi)AAVが血清型7のものであるとき、ウイルスカプシドタンパク質が、配列番号20に記載される配列を含むVP1配列を含む;
(vii)AAVが血清型8のものであるとき、ウイルスカプシドタンパク質が、配列番号21に記載される配列を含むVP1配列を含む;
(viii)AAVが血清型9のものであるとき、ウイルスカプシドタンパク質が、配列番号22に記載される配列を含むVP1配列を含む;
(ix)AAVが血清型10のものであるとき、ウイルスカプシドタンパク質が、配列番号23に記載される配列を含むVP1配列を含む;
(x)AAVが血清型11のものであるとき、ウイルスカプシドタンパク質が、配列番号24に記載される配列を含むVP1配列を含む;
(xi)AAVが血清型12のものであるとき、ウイルスカプシドタンパク質が、配列番号25に記載される配列を含むVP1配列を含む;及び
(xii)AAVが血清型13のものであるとき、ウイルスカプシドタンパク質が、配列番号26に記載される配列を含むVP1配列を含む
ように、対応する野生型配列に対して改変することを含む。
本開示は、改変VP1配列を有するウイルスカプシドタンパク質を含むAAVであって、前記改変VP1配列が、位置1にセリン、位置26にグルタミン酸、位置40にアルギニン、位置43にアスパラギン酸、位置44にセリン及び位置64にリジンを含み、アミノ酸位置は、配列番号1に記載される配列に関して規定され、位置1、26、40、43、44及び64のいずれか1以上のアミノ酸は、対応する野生型配列に対して改変されており、かつ前記いずれか1以上の位置1、26、40、43、44及び64のアミノ酸以外のさらなるアミノ酸は、対応する野生型配列に対して改変されていない、AAVをも提供する。
本開示は、本開示の核酸分子、バキュロウイルスベクター、複数のバキュロウイルスベクター及び/または昆虫細胞をキットの形態でも提供する。キットは、本開示の核酸分子を含む容器を含み得る。一例において、核酸は、バキュロウイルスベクター内に含まれる。一例において、キットは、本開示の核酸分子を含む第1の容器と、AAVを生成するための1種以上のさらなる試薬を含む第2の容器とを含む。一例において、核酸は、バキュロウイルスベクター内に含まれる。一例において、キットは、本開示の複数のバキュロウイルスベクターを含み、それぞれ別々の容器に含まれる。キットは、場合により、例えば、本開示に従うAAVの生成に適した昆虫細胞をさらに含み得る。キットは、本明細書に記載される方法を用いたAAVの生成のために本開示の核酸分子、バキュロウイルスベクター、複数のバキュロウイルスベクター及び/または昆虫細胞を使用するための説明書をさらに含んでもよい。
実施例1−改変AAV VP1配列の設計、生成及び試験
この実施例において、発明者らは、昆虫細胞内での生成時にAAVのホスホリパーゼ活性及びウイルス機能性を修復するため、中に特異的配列改変、すなわち、アミノ酸置換をホスホリパーゼA2(PLA2)ドメイン及び隣接配列に導入したウイルスカプシドタンパク質サブユニット1(VP1)を有するAAVを設計及び調製した。さらに、種々の代表的なAAV血清型についてPLA2ドメイン及び隣接配列を含むVP1部分配列に関して行なった多重配列アラインメントに基づいて、PLA2ドメイン及び隣接配列を含むコンセンサスVP1部分配列を、ホスホリパーゼ活性を修復するように設計した配列改変を含めて調製した。このコンセンサスVP1部分配列は配列番号1に記載されている。
AAV8(配列番号34)及びAAV2(配列番号28)のウイルスカプシドタンパク質1(VP1)タンパク質由来のN末端180アミノ酸、ならびにAAV9(配列番号35)及びAAV2(配列番号26)のVP1タンパク質由来のN末端180アミノ酸についてBLASTpアラインメントツールを用いてペアワイズ配列アラインメントを行なった。これらのアラインメントに基づいて、AAV8及びAAV9由来のPLA2ドメイン及び隣接配列が、AAV2の対応する配列に高度に保存されていることを示した。
AAV2、AAV8及びAAV9の全VP1配列について行なった配列アラインメントン基づいて、AAV血清型1〜13(配列番号15〜26)のPLA2ドメイン及び隣接配列を含むVP1部分配列について多重配列アラインメントを行なった。上記ペアワイズアラインメントから明らかにされた差異に加えて、いくつかのさらなる非同一残基が部分配列内で明らかにされた。しかしながら、これらの差異は保存的差異であると思われたので及び/または残基位置はPLA2ドメインの外部であり、ホスホリパーゼ活性に影響を与える可能性はないと考えられたので、対応するAAV2配列に関する同一性についてこれらの位置を変化させないと決断した。多重配列アラインメントに基づいて、上記アミノ酸置換を有するPLA2ドメイン及び隣接配列を含むコンセンサスVP1部分配列をインシリコで調製した(配列番号1)。
サブユニットVP1、VP2及びVP3を含む改変AAV8カプシドタンパク質ならびにAAV8非構造性タンパク質Rep78及びRep52をコードするバキュロウイルスベクターを調製した(BacAAV8−Rep−VPmod、図1)。
サブユニットVP1、VP2及びVP3ならびにAAV9非構造性タンパク質Rep78、Rep68、Rep52及びRep40を含むAAV9カプシドタンパク質をコードするバキュロウイルスベクターを調製した(BacAAV9−Rep−VPmod、図5)。
AAV2逆方向末端反復配列(ITR)と隣接する目的の遺伝子(GOI)をコードするバキュロウイルスベクターを調製した。簡潔には、一例ではAAV2 ITRと隣接するヒトPABPN1の転写物を標的にする2つのshmiRをコードするDNA構築物を、AAV2−GOI構築物(図8)及びpOET1(Oxford Expression Technologies)をNotIで消化させ、AAV2−GOI構築物をpOET1骨格に連結することによってpOET1バキュロウイルストランスファーベクター(Oxford Expression Technologies)にクローン化して最終クローンを生成した(BacAAV2−GOI、図9)。HBVポリメラーゼ遺伝子転写物の種々の領域を標的にする3つのshmiRをコードするものではあるが、上記と同様に、第2のGOIをも調製した。
Oxford Expression TechnologiesのbaculoCOMPLETEシステムを用いてバキュロウイルスP0ストックを生成した(製造業者の説明書に従って)。簡潔には、トランスフェクションの1時間前に百万個のSf9細胞を6ウェルプレートに播種し、プレートに付着させた。1mlのTC100培地、500ngのBac−AAV2−GOIプラスミド、BacAAV8−Rep−CapPLまたはBacAAV9−Rep−CapPLを500ngのフラッシュBAC DNA及びbaculoFECTINトランスフェクション試薬と混合した(製造業者のプロトコルに従って)。室温での30分のインキュベーション後、播種したSf9細胞にトランスフェクション混合物を加えた。6ウェルプレートを28℃でインキュベートした。トランスフェクション24時間後に、1mlのSf9培地を細胞に添加した。トランスフェクションの5日後に、P0バキュロウイルスストックを含有する培地を収集し、4℃で貯蔵した。このようにしてBacAAV8−Rep-CapPL、BacAAV9−Rep-CapPL及びBac−AAV2−GOIのためのP0バキュロウイルスを生成した。
500ulのP0バキュロウイルスストックを用いて100mlのSf9細胞培養物を2x10e6細胞/mlの濃度で感染させた。バキュロウイルス培養物を140rpmで5日間振盪させながら28℃でインキュベートした。感染5日後、P1を含有する培地を回収して4℃で貯蔵した。
500ulのP1バキュロウイルスストックを用いて100mlのSf9細胞培養物を2x10e6細胞/mlの濃度で感染させた。バキュロウイルス培養物を140rpmで5日間振盪させながら28℃でインキュベートした。感染5日後、P2を含有する培地を回収して4℃で貯蔵した。
バキュロウイルスP2ストックの力価をOxford Expression TechnologiesのbaculoQUANTキットを用いて測定した。製造業者の説明書に従ってバキュロウイルスストックを段階希釈し、提供された溶解バッファーで溶解させた。バキュロウイルスエンベロープ融合タンパク質、gp64のqPCRを利用してDNAを増幅させた。検量線を用いてP2ストックを定量化し、外挿してウイルスのpfu/mlを決定した。
2x10e6細胞/mlの細胞密度の600mlのSf9細胞を、0.1のMOIでBacAAV8−Rep-CapPL及びBacAAV2−GOI(HBVポリメラーゼ遺伝子転写物を標的にする3つのshmiRをコードする)または0.1のMOIでBacAAV9−Rep−CapPL及びBacAAV2−GOI(ヒトPABPN1遺伝子転写物を標的にする2つのshmiRをコードする)に同時感染させた。次に細胞培養物を115rpmで6日間振盪させながら28℃でインキュベートした。
感染6日後に、感染培養物から清澄培地を収集した。0.2ミクロンフィルタリング後に0.1ミクロンフィルタリングを利用してバキュロウイルスをAAVから濾別した。次にバキュロウイルスフリー培地にPEGを添加してAAVを沈殿させた。PEG添加24時間後に培地を2500gで45分間回転させてAAVをペレット化した。上清を捨て、ペレット化ウイルスを溶解バッファーに懸濁させた。イオジキサノール勾配によってAAVの初期精製を行ない、それにより40〜60%のフラクション間の5mlの層が収集された。このウイルス含有層をバッファー交換して残存イオジキサノールを除去し、バッファー交換したウイルスをセシウム勾配上に層化した。次に一晩の遠心分離をセシウム勾配上で行なった。セシウム勾配からAAV含有バンドをシリンジで収集し、バッファー交換して精製AAVウイルスストックから塩化セシウムを除去した。
全てのAAV調製物についての最終AAV力価をqPCRで定量化した。簡潔には、10マイクロリットルの精製AAVウイルスを15分間室温でDNAse処理(DNAseI、増幅グレード、1U/ul、Invitrogen)した。次に65℃での10分間のインキュベーションによりDNAse酵素を失活させた。ウイルスを以下のように希釈した:1:10;1:30;1:100;1:1,000;1:3,000;1:10,000。各希釈物をqPCRで解析して1ml当たりのウイルスゲノムの総数を決定した。
哺乳動物細胞内で調製したAAVの機能性を、上述したように昆虫細胞内で調製したAAVと比較した。哺乳動物及び昆虫細胞内で調製した組換えAAVの生物活性(機能性)を比較するため、種々の力価のウイルスで哺乳動物細胞をインビトロで感染させ、プロセシングされたshmiRの発現をqRT PCRアッセイで定量化した。
Claims (33)
- アデノ随伴ウイルス(AAV)ウイルスカプシドタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、前記ウイルスカプシドタンパク質は、位置1にセリン、位置26にグルタミン酸、位置40にアルギニン、位置43にアスパラギン酸、位置44にセリン及び位置64にリジンを含む改変サブユニット1(VP1)配列を含み、前記アミノ酸位置は、配列番号1に記載される配列に関して規定され、位置1、26、40、43、44及び64のいずれか1以上の前記アミノ酸は、対応する野生型配列に対して改変されており、かつ前記いずれか1以上の位置1、26、40、43、44及び64のアミノ酸以外のさらなるアミノ酸は、前記対応する野生型配列に対して改変されていない、前記核酸分子。
- 前記ウイルスカプシドタンパク質が、下記:
(i)前記改変VP1配列が、配列番号15に記載される配列を含む、AAV1由来のウイルスカプシドタンパク質;
(ii)前記改変VP1配列が、配列番号16に記載される配列を含む、AAV3由来のウイルスカプシドタンパク質;
(iii)前記改変VP1配列が、配列番号17に記載される配列を含む、AAV4由来のウイルスカプシドタンパク質;
(iv)前記改変VP1配列が、配列番号18に記載される配列を含む、AAV5由来のウイルスカプシドタンパク質;
(v)前記改変VP1配列が、配列番号19に記載される配列を含む、AAV6由来のウイルスカプシドタンパク質;
(vi)前記改変VP1配列が、配列番号20に記載される配列を含む、AAV7由来のウイルスカプシドタンパク質;
(vii)前記改変VP1配列が、配列番号21に記載される配列を含む、AAV8由来のウイルスカプシドタンパク質;
(viii)前記改変VP1配列が、配列番号22に記載される配列を含む、AAV9由来のウイルスカプシドタンパク質;
(ix)前記改変VP1配列が、配列番号23に記載される配列を含む、AAV10由来のウイルスカプシドタンパク質;
(x)前記改変VP1配列が、配列番号24に記載される配列を含む、AAV11由来のウイルスカプシドタンパク質;
(xi)前記改変VP1配列が、配列番号25に記載される配列を含む、AAV12由来のウイルスカプシドタンパク質;
(xii)前記改変VP1配列が、配列番号26に記載される配列を含むAAV13由来のウイルスカプシドタンパク質
から成る群より選択される、請求項1に記載の核酸分子。 - 前記ウイルスカプシドタンパク質がAAV8に由来し、前記改変VP1配列が、配列番号21に記載される配列を含む、請求項1または請求項2に記載の核酸分子。
- 前記ウイルスカプシドタンパク質がAAV9に由来し、前記改変VP1配列が、配列番号22に記載される配列を含む、請求項1または請求項2に記載の核酸分子。
- 前記ウイルスカプシドタンパク質が、前記改変VP1と同じAAV血清型由来のサブユニット2(VP2)及びサブユニット3(VP3)配列を含む、請求項1〜4のいずれか1項に記載の核酸分子。
- 前記AAVウイルスカプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列が、昆虫細胞内での発現のためのプロモーターに作動可能に連結されている、請求項1〜5のいずれか1項に記載の核酸分子。
- 昆虫細胞内での発現のための前記プロモーターが、多角体プロモーターまたはp10プロモーターである、請求項6に記載の核酸分子。
- Rep78及びRep68から選択される少なくとも1つの大型AAV複製(Rep)タンパク質ならびにRep52及びRep40から選択される少なくとも1つの小型AAV Repタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含む、請求項1〜7のいずれか1項に記載の核酸分子。
- Rep78及びRep52をコードするポリヌクレオチド配列を含む、請求項8に記載の核酸分子。
- 前記Repタンパク質をコードする前記ポリヌクレオチド配列が、昆虫細胞内での前記Repタンパク質の発現のためのプロモーターに作動可能に連結されている、請求項8または請求項9に記載の核酸分子。
- 昆虫細胞内での発現のための前記プロモーターが、多角体プロモーターまたはp10プロモーターである、請求項10に記載の核酸分子。
- 請求項1〜11のいずれか1項に記載の核酸分子を含むバキュロウイルスベクター。
- 下記:
(i)請求項1〜12のいずれか1項に記載の核酸分子を含む第1のバキュロウイルスベクター;及び
(ii)AAV逆方向末端反復(ITR)配列と隣接する目的のタンパク質またはRNAをコードするポリヌクレオチドを含む第2のバキュロウイルスベクター
を含む複数のバキュロウイルスベクター。 - 下記:
(i)請求項1〜7のいずれか1項に記載の核酸分子を含む第1のバキュロウイルスベクター;
(ii)Rep78及びRep68から選択される少なくとも1つの大型AAV複製(Rep)タンパク質ならびにRep52及びRep40から選択される少なくとも1つの小型AAV Repタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含む第2のバキュロウイルスベクター;及び
(iii)AAV逆方向末端反復(ITR)配列と隣接する目的のタンパク質またはRNAをコードするポリヌクレオチドを含む第3のバキュロウイルスベクター
を含む複数のバキュロウイルスベクター。 - 前記第2のバキュロウイルスベクターが、Rep78及びRep52をコードするポリヌクレオチド配列を含む、請求項14に記載の複数のバキュロウイルスベクター。
- 前記Repタンパク質をコードする前記ポリヌクレオチド配列が、昆虫細胞内での前記Repタンパク質の発現のためのプロモーターに作動可能に連結されている、請求項14または請求項15に記載の複数のバキュロウイルスベクター。
- 請求項1〜11のいずれか1項に記載の核酸を含む昆虫細胞。
- 請求項12に記載のバキュロウイルスベクターまたは請求項13〜16のいずれか1項に記載の複数のバキュロウイルスベクターを含む昆虫細胞。
- 前記AAVウイルスカプシドタンパク質をコードする前記ポリヌクレオチド配列及び前記Repタンパクをコードする前記ポリヌクレオチド配列が、前記昆虫細胞内でエピソームとして複製する組換えバキュロウイルスゲノムから発現される、請求項17または18に記載の昆虫細胞。
- AAV逆方向末端反復(ITR)配列と隣接する目的のタンパク質またはRNAをコードするポリヌクレオチドが、前記昆虫細胞内でエピソームとして複製する組換えバキュロウイルスゲノムから発現される、請求項17〜19のいずれか1項に記載の昆虫細胞。
- 昆虫細胞内でのアデノ随伴ウイルス(AAV)の生成方法であって、下記:
請求項17〜20のいずれか1項に記載の昆虫細胞を、培地内で前記細胞がAAVを産生するのに十分な条件下で培養すること;及び場合により
前記培地及び/または細胞から前記AAVを回収すること
を含む、前記方法。 - 昆虫細胞内でのアデノ随伴ウイルス(AAV)の生成方法であって、下記:
(i)昆虫細胞を、請求項8〜11のいずれか1項に記載の核酸分子を含むゲノムを有する第1のバキュロウイルス;及びAAV逆方向末端反復(ITR)配列と隣接する目的のタンパク質またはRNAをコードするポリヌクレオチドを含むゲノムを有する第2のバキュロウイルスに同時感染させること;
(ii)(i)で前記バキュロウイルに感染した前記昆虫細胞を、培地内で前記細胞がAAVを産生するのに十分な条件下で培養すること;及び場合により
(iii)前記培地及び/または細胞から前記AAVを回収すること
を含む、前記方法。 - 昆虫細胞内でのアデノ随伴ウイルス(AAV)の生成方法であって、下記:
昆虫細胞を、請求項1〜7のいずれか1項に記載の核酸分子を含むゲノムを有する第1のバキュロウイルス;Rep78及びRep68から選択される少なくとも1つの大型AAV複製(Rep)タンパク質ならびにRep52及びRep40から選択される少なくとも1つの小型AAV Repタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含むゲノムを有する第2のバキュロウイルス;及びAAV逆方向末端反復(ITR)配列と隣接する目的のタンパク質またはRNAをコードするポリヌクレオチドを含むゲノムを有する第3のバキュロウイルスに同時感染させること;
(i)で前記バキュロウイルに感染した前記昆虫細胞を、培地内で前記細胞がAAVを産生するのに十分な条件下で培養すること;及び場合により
前記培地及び/または細胞から前記AAVを回収すること
を含む、前記方法。 - 前記AAVを精製することを含む、請求項21〜23のいずれか1項に記載の方法。
- 請求項21〜24のいずれか1項に記載の方法で生成されたアデノ随伴ウイルス(AAV)。
- 位置1にセリン、位置26にグルタミン酸、位置40にアルギニン、位置43にアスパラギン酸、位置44にセリン及び位置64にリジンを含む改変サブユニット1(VP1)配列を含むウイルスカプシドタンパク質を含むアデノ随伴ウイルス(AAV)であって、前記アミノ酸位置は、配列番号1に記載される配列に関して規定され、位置1、26、40、43、44及び64のいずれか1以上の前記アミノ酸は、対応する野生型配列に対して改変されており、かつ前記いずれか1以上の位置1、26、40、43、44及び64のアミノ酸以外のさらなるアミノ酸は、前記対応する野生型配列に対して改変されていない、前記AAV。
- 前記AAVが、下記:
(i)前記改変VP1配列が、配列番号15に記載される配列を含むAAV血清型1;
(ii)前記改変VP1配列が、配列番号16に記載される配列を含むAAV血清型3;
(iii)前記改変VP1配列が、配列番号17に記載される配列を含むAAV血清型4;
(iv)前記改変VP1配列が、配列番号18に記載される配列を含むAAV血清型5;
(v)前記改変VP1配列が、配列番号19に記載される配列を含むAAV血清型6;
(vi)前記改変VP1配列が、配列番号20に記載される配列を含むAAV血清型7;
(vii)前記改変VP1配列が、配列番号21に記載される配列を含むAAV血清型8;
(viii)前記改変VP1配列が、配列番号22に記載される配列を含むAAV血清型9;
(ix)前記改変VP1配列が、配列番号23に記載される配列を含むAAV血清型10;
(x)前記改変VP1配列が、配列番号24に記載される配列を含むAAV血清型11;
(xi)前記改変VP1配列が、配列番号25に記載される配列を含むAAV血清型12;及び
(xii)前記改変VP1配列が、配列番号26に記載される配列を含むAAV血清型13
から成る群より選択される、請求項26に記載のAAV。 - 前記AAVが血清型8のものであり、かつ配列番号21に記載される配列を含む改変VP1を含む、請求項26または請求項27に記載のAAV。
- 前記AAVが血清型9のものであり、かつ配列番号22に記載される配列を含む改変VP1を含む、請求項26または請求項27に記載のAAV。
- 昆虫細胞内で産生される血清型2以外の血清型由来のアデノ随伴ウイルス(AAV)の機能性の改善方法であって、前記AAVのウイルスカプシドタンパク質を、位置1、26、40、43、44及び64のみの1以上のアミノ酸を置換することによって、対応する野生型配列に対して改変することを含み、前記残基位置は、配列番号1に記載される配列に関して決定され、その結果、前記ウイルスカプシドタンパク質は、位置1にセリン、位置26にグルタミン酸、位置40にアルギニン、位置43にアスパラギン酸、位置44にセリン及び位置64にリジンを含み、かつ前記AAVは、改変されなかった、昆虫細胞内で産生される対応する野生型AAVに比べて改善された機能性を有する、前記方法。
- 前記AAVの前記ウイルスカプシドタンパク質を、下記:
(i)前記AAVが血清型1のものであるとき、前記ウイルスカプシドタンパク質は、配列番号15に記載される配列を含むVP1配列を含む;
(ii)前記AAVが血清型3のものであるとき、前記ウイルスカプシドタンパク質は、配列番号16に記載される配列を含むVP1配列を含む;
(iii)前記AAVが血清型4のものであるとき、前記ウイルスカプシドタンパク質は、配列番号17に記載される配列を含むVP1配列を含む;
(iv)前記AAVが血清型5のものであるとき、前記ウイルスカプシドタンパク質は、配列番号18に記載される配列を含むVP1配列を含む;
(v)前記AAVが血清型6のものであるとき、前記ウイルスカプシドタンパク質は、配列番号19に記載される配列を含むVP1配列を含む;
(vi)前記AAVが血清型7のものであるとき、前記ウイルスカプシドタンパク質は、配列番号20に記載される配列を含むVP1配列を含む;
(vii)前記AAVが血清型8のものであるとき、前記ウイルスカプシドタンパク質は、配列番号21に記載される配列を含むVP1配列を含む;
(viii)前記AAVが血清型9のものであるとき、前記ウイルスカプシドタンパク質は、配列番号22に記載される配列を含むVP1配列を含む;
(ix)前記AAVが血清型10のものであるとき、前記ウイルスカプシドタンパク質は、配列番号23に記載される配列を含むVP1配列を含む;
(x)前記AAVが血清型11のものであるとき、前記ウイルスカプシドタンパク質は、配列番号24に記載される配列を含むVP1配列を含む;
(xi)前記AAVが血清型12のものであるとき、前記ウイルスカプシドタンパク質は、配列番号25に記載される配列を含むVP1配列を含む;及び
(xii)前記AAVが血清型13のものであるとき、前記ウイルスカプシドタンパク質は、配列番号26に記載される配列を含むVP1配列を含む
ように、前記対応する野生型配列に対して改変することを含む、請求項30に記載の方法。 - 血清型8のAAVの前記ウイルスカプシドタンパク質を、前記ウイルスカプシドタンパク質が、配列番号21に記載される配列を含むVP1配列を含むように、前記対応する野生型配列に対して改変することを含む、請求項30または31に記載の方法。
- 血清型9のAAVの前記ウイルスカプシドタンパク質を、前記ウイルスカプシドタンパク質が、配列番号22に記載される配列を含むVP1配列を含むように、前記対応する野生型配列に対して改変することを含む、請求項30または31に記載の方法。
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