JP2020531028A - ニューロピリン−１（ｎｒｐ１）のヒト心室前駆細胞を単離するための細胞表面マーカーとしての使用 - Google Patents

Abstract

本発明は、ヒト心筋原性心室前駆細胞（ＨＶＰ）、特に心室筋細胞に優先的に分化する前駆細胞を単離するための細胞表面マーカーとしてＮＲＰ１を提供する。単一細胞配列決定によって同定されたさらなるＨＶＰ細胞表面マーカーも提供される。本発明は、ＮＲＰ１＋心室前駆細胞の分離、およびその大規模増殖（ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）ならびに繁殖（ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ）のインビトロ方法を提供する。単離されたＮＲＰ１＋心室前駆細胞の多数のクローン集団も提供される。ＮＲＰ１＋心室前駆細胞の、心臓修復用の、または心機能を改善するためのインビボでの使用の方法も提供される。ＮＲＰ１＋心室前駆細胞を試験化合物の心臓毒性スクリーニングに使用する方法も提供される。【選択図】図８

Description

関連出願
本出願は、２０１７年８月２３日に出願された米国仮出願第６２／５４９，３４５号の優先日の利益を主張する。この仮出願の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

心不全は、優勢に、心筋梗塞によって引き起こされ、世界中の成人と子供の両方の主要な死因であり、世界中で指数関数的に増加している（Ｂｕｉ，Ａ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｒｄｉｏｌ．８：３０−４１）。この疾患は、主に、心筋傷害中に発生する心室筋の損失によって促進され（Ｌｉｎ，Ｚ．ａｎｄ Ｐｕ，Ｗ．Ｔ．（２０１４）Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．６：２３９ｒｖ１）、再生反応を開始するための成人の心臓のごくわずかな能力によって悪化する（Ｂｅｒｇｍａｎｎ，Ｏ．ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２４：９８−１０２；Ｓｅｎｙｏ，Ｓ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｎａｔｕｒｅ ４９３：４３３−４３６）。心臓移植によって治癒可能であり得るが、ヒト心臓臓器ドナーが非常に入手困難であるために、純粋で成熟し、かつ機能的なヒト心室筋組織の再生可能な供給源に対する満たされていない臨床的なニーズを世界中でもたらしている（Ｓｅｇｅｒｓ，Ｖ．Ｆ．Ｍ．ａｎｄ Ｌｅｅ，Ｒ．Ｊ．（２００８）Ｎａｔｕｒｅ ４５１：９３７−９４２；Ｓｐａｔｅｒ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １４１：４４１８−４４３１）。

ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）は、損傷した、または疾患の心臓における臨床的に可能性のある機能の回復のための、多数の機能的心筋細胞を生成するために可能性を提供している。心機能を改善するために、および／または損傷した心筋を富化しかつ再生させるために、幹細胞の心臓への移植が提案されている（例えば、米国特許公開第２００４０１８００４３号を参照されたい）。成人の幹細胞が、増殖因子タンパク質による治療と組み合わせて投与される併用療法も提案されている（例えば、米国特許公開第２００５０２１４２６０号を参照されたい）。

心臓への細胞移植は、心機能を改善して心臓組織を再生するための有望なアプローチを提供するが、どのような型（複数可）の細胞を移植するべきかの問題が多くの調査の対象であった。心組織の再生で使用するために調査された細胞の型としては、骨髄細胞（例えば、Ｏｒｌｉｃ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｎａｔｕｒｅ ４１０：７０１−７０５；Ｓｔａｍｍ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｌａｎｃｅｔ ３６１：４５−４６；Ｐｅｒｉｎ，Ｅ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １０７：２２９４−２３０２を参照されたい）、成人幹細胞（例えば、Ｊａｃｋｓｏｎ，Ｋ．Ａ．ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０７：１３９５−１４０２を参照されたい）、骨髄由来間葉系幹細胞（例えば、Ｂａｒｂａｓｈ，Ｉ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １０８：８６３；Ｐｅｔｔｉｎｇｅｒ，Ｍ．Ｆ．ａｎｄ Ｍａｒｔｉｎ，Ｂ．Ｊ．（２００３）Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．９５：９−２０を参照されたい）、骨髄間質細胞（Ｂｉｔｔｉｒａ，Ｂ．ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｒｄｉｏｔｈｏｒａｃ．Ｓｕｒｇ．２４：３９３−３９８）、間葉系幹細胞と胎児心筋細胞との組み合わせ（例えば、Ｍｉｎ，Ｊ．Ｙ．ｅｔ ａｌ．（２００２）Ａｎｎ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｓｕｒｇ．７４：１５６８−１５７５を参照されたい）、および骨髄由来単核球と骨髄由来間葉系幹細胞との組み合わせ（例えば、米国特許公開第２００８００３８２２９号を参照されたい）が挙げられる。移植用に心臓幹細胞を生成するためのインビトロでの成体哺乳動物心筋細胞の脱分化も提案されている（例えば、米国特許公開第２０１０００９３０８９号を参照されたい）。

心機能を改善して心臓組織を再生するための細胞移植のアプローチにおける目覚しい進歩は、心臓筋細胞、心臓平滑筋、および心臓内皮細胞を生じさせることができる複能性心臓前駆細胞のファミリーの同定および単離であった（（Ｃａｉ，Ｃ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｄｅｖ．Ｃｅｌｌ．５：８７７−８８９；Ｍｏｒｅｔｔｉ，Ａ．ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｃｅｌｌ １２７：１１５１−１１６５；Ｂｕ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｎａｔｕｒｅ ４６０：１１３−１１７；米国特許公開第２００６０２４６４４６号）。これらの心臓前駆細胞は、ＬＩＭホメオドメイン転写因子Ｉｓｌｅｔ１（Ｉｓｌ１）の発現によって特徴付けられ、したがって、Ｉｓｌ１＋心臓前駆細胞（Ｉｂｉｄ）と称される。対照的に、Ｉｓｌ１は、分化心臓細胞では発現されない。分化においてＩｓｌ１よりも後に生じる、Ｉｓｌ１＋心臓前駆細胞の追加のマーカーが記載されており、Ｎｋｘ２．５およびｆｌｋ１が含まれる（例えば、米国特許公開第２０１００１６６７１４号を参照されたい）。

Ｉｓｌ１＋心臓前駆細胞の複製および分化が、Ｗｎｔ／ベータカテニンシグナル伝達経路によって調節されることが示されている（例えば、Ｑｙａｎｇ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ．１：１６５−１７９；Ｋｗｏｎ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０４：１０８９４−１０８９９を参照されたい）。これは、Ｉｓｌ１＋系統に進入し、Ｗｎｔシグナル伝達の調節を通してＩｓｌ１＋集団を増殖させるために多能性幹細胞を誘導する方法の開発をもたらした（例えば、Ｌｉａｎ，Ｘ．ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０９：Ｅ１８４８−５７；Ｌｉａｎ，Ｘ．ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．８：１６２−１７５；米国特許公開第２０１１００３３４３０号；米国特許公開第２０１３０１８９７８５号を参照されたい）。

ヒト多能性幹細胞はかなり有望であるが、重大な課題は、多様な心臓細胞の単純な分化からインビボでのより大規模で純粋な３Ｄ心室筋組織の形成に移るための能力であって、これは、最終的に、血管新生、細胞外マトリックスの組立ならびにアライメント、および成熟を必要とする。この目標に向かって、心臓細胞の多様な集団（心房、心室、ペースメーカー）が、人工および脱細胞化マトリックスと連結され（Ｍａｓｕｍｏｔｏ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．４：５７１６；Ｏｔｔ，Ｈ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１４：２１３−２２１；Ｓｃｈａａｆ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．（２０１１）ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ６：ｅ２６３９７）、脈管細胞および導管と連結され（Ｔｕｌｌｏｃｈ，Ｎ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．１０９：４７−５９）およびマイクロＲＮＡのカクテルと連結されて（Ｇａｍａ−Ｇａｒｖａｌｈｏ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｃｅｌｌｓ ３：９９６−１０２６）研究されているが、目標には手の届かないままである。
Ｉｓｌ１の心臓前駆細胞のマーカーとしての同定は大幅に進歩したが、Ｉｓｌ１が細胞内タンパク質であるため、これは、大量の生存細胞の単離で使用するために好適なマーカーではない。むしろ、細胞表面マーカー（複数可）がなお必要とされている。さらに、マーカーとしてのＩｓｌ１は、心臓系統内の複数の細胞型に分化し得る集団を同定し、したがって、心臓系統内の特定の細胞型に、特に心室細胞に分化する前駆細胞に偏向している心臓前駆細胞を同定するマーカーに対するさらなるニーズがある。したがって、当該技術分野においては、優勢に、心筋細胞を生じさせ、かつ心筋原性前駆細胞の迅速な単離および大規模増殖を可能にする、心臓前駆細胞の追加のマーカー、特に心臓前駆細胞の細胞表面マーカーに対する大きなニーズがある。さらに、当該技術分野においては、インビボで心室筋細胞に分化し、それにより、心室前駆体または心室筋細胞のインビボでの移植を可能にして心機能を向上させる、心室前駆体を単離するための方法および組成物に対する大きなニーズがある。

Ｂｕｉ，Ａ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｒｄｉｏｌ．８：３０−４１

本発明は、ニューロピリン−１（ＮＲＰ１）の、ヒト心室前駆細胞を単離するための細胞表面マーカーとしての使用を記載する。さらに、表１、５および１０に示されるように、ヒト心室前駆細胞の単離で使用するのに好適な追加の細胞表面マーカーが提供される。これらのヒト心臓前駆細胞は、これらが主として、インビトロおよびインビボでの両方で、心室筋細胞に分化するように、心室系統に偏向している。すなわち、これらの心臓前駆細胞は、これらが心室系統に偏向しており、したがって、ヒト心室前駆（ＨＶＰ）細胞であるように、インビトロでの条件下で培養され得る。さらに、対象の心臓の心室領域に導入されるとき、これらの前駆細胞は、ほぼ例外なく、それらの心室プログラミングに従って機能する、心室筋細胞に分化する。特に、本明細書に提供されるヒト心室前駆細胞は、これらの細胞が、正常なネズミ腎臓または心臓の表面上で、インビボでの純粋な３−Ｄ血管新生された、機能的かつ成熟した心室細胞壁をそれにより構築できる細胞自律経路を利用し、それによって、臓器上臓器のインビボのティッシュエンジニアリングを可能にする。

実施例１４に記載され、表１０に示されるように、分化の異なる段階で心臓前駆体の単一細胞配列決定を使用することにより、ＨＶＰ中で差次的に発現する遺伝子のパネルを同定した。このパネル内には、Ｉｓｌｅｔ１（Ｉｓｌ１）およびＮＲＰ１の両方を発現する５日目の前駆細胞が示された。心室前駆細胞の重要な細胞表面マーカーのこの同定は、細胞の容易かつ迅速な単離を可能にする。さらに、細胞の増殖および心室系統への偏向のための培養条件の決定は、心室前駆細胞のクローン集団の大量培養物の調製を可能にする。これらの細胞は、例えば、対象の損傷した心臓、特に心室領域での損傷における機能を改善するために使用することができる。前駆細胞は、心室細胞にその場で分化するためにインビボで移植することができるか、あるいは、心室筋細胞を含む心筋肉パッチを、後続のインビボでの移植のために、インビボで前駆体から調製することができる。この細胞はまた、例えば、試験化合物の心臓毒性を評価するためにインビトロ毒性スクリーニングアッセイで、ならびに心臓の成熟および分化で使用される関連する経路を同定するための生化学的試験に使用することができる。

したがって、本発明は、ヒト心室前駆細胞を精製された形態で提供する。ヒト心室前駆体は、インビトロおよびインビボで、心室筋細胞に分化することができる。これらの前駆細胞は、インビトロで多数の細胞に増殖することができ、インビボで心臓の心室領域に移植されると、これらは本質的に例外なく心室筋細胞に分化する。なおさらに、これらの細胞は、インビボで異なる部位に移動する能力を有し、インビボで移植されると、細胞は、心室細胞として機能するようにプログラムされたことを行う（単純に収縮する心臓筋細胞とは対照的に）。したがって、心室前駆細胞は、天然の組織にグラフトされ、心室機能を向上させて、脈管構造内で新しい心室組織を呼び寄せる能力を有することができる。

したがって、一態様では、本発明は、ヒト心室前駆細胞を単離するための方法に関し、本方法は、
ヒト心臓前駆細胞を含有する細胞の培養物を、ＮＲＰ１と反応性の１つ以上の薬剤と接触させることと、
ＮＲＰ１反応性陽性細胞を、非反応性細胞から分離して、それにより、ヒト心室前駆細胞を単離することと、を含む。

一実施形態では、ヒト心臓前駆細胞は、ＮＲＰ１と反応性の薬剤と、ＨＶＰマーカー（複数可）に結合する少なくとも１つの第２の薬剤との両方に接触され、それにより、ＮＲＰ１／第２の薬剤反応性陽性細胞を、非反応性細胞から分離する。

好ましくは、ヒト心臓前駆細胞は、Ｉｓｌｅｔ１＋ヒト心臓前駆細胞である。好ましくは、ヒト心臓前駆細胞は、ＪＡＧ１＋、ＦＺＤ４＋、ＬＩＦＲ＋、ＦＧＦＲ３＋および／またはＴＮＦＳＦ９＋である。別の実施形態では、細胞の培養物を、少なくとも１つの第２の薬剤とも接触させ、ＮＲＰ１反応性／第２の薬剤反応性陽性細胞が、非反応性細胞から分離され、それにより、心室前駆細胞を単離する。一実施形態では、少なくとも１つの第２の薬剤は、ＪＡＧ１＋、ＦＺＤ４＋、ＬＩＦＲ＋、ＦＧＦＲ３＋および／またはＴＮＦＳＦ９＋から選択されるマーカーに結合する。細胞の培養物は、ＮＲＰ１と反応性の薬剤と、少なくとも１つの第２の薬剤とに同時に接触させることができる。あるいは、細胞の培養物は、ＮＲＰ１と反応性の薬剤と接触させる前に、少なくとも１つの第２の薬剤と接触させることができる。あるいは、細胞の培養物は、少なくとも１つの第２の薬剤と接触させる前に、ＮＲＰ１と反応性の薬剤と接触させることができる。別の実施形態では、細胞の培養物はまた、ＴＲＡ−１−６０などの多能性幹細胞の少なくとも１つのマーカーの発現の欠如に対して、ネガティブに選択される。別の実施形態では、ヒト心室前駆細胞は、これらが心室マーカーＭＬＣ２ｖを発現するように、さらに培養され分化される。ある特定の実施形態では、ヒト心臓前駆細胞を含有する細胞の出発培養物は、ヒト胚性幹細胞またはヒト誘導多能性細胞に由来する。

別の態様では、本発明は、ヒト心室前駆細胞を単離するための方法に関し、本方法は、
ヒト多能性幹細胞を、心臓前駆細胞を生成する条件下で培養して、培養細胞集団を得ることと、
培養細胞集団を、ＮＲＰ１と反応性の１つ以上の薬剤と接触させることと、
ＮＲＰ１反応性陽性細胞を、非反応性細胞から分離して、それにより、ヒト心室前駆細胞を単離することと、を含む。

別の実施形態では、細胞の培養物を、少なくとも１つの第２の薬剤とも接触させ、ＮＲＰ１反応性／第２の薬剤反応性陽性細胞が、非反応性細胞から分離され、それにより、心室前駆細胞を単離する。一実施形態では、少なくとも１つの第２の薬剤は、ＪＡＧ１＋、ＦＺＤ４＋、ＬＩＦＲ＋、ＦＧＦＲ３＋および／またはＴＮＦＳＦ９＋から選択されるマーカーに結合する。細胞の培養物は、ＮＲＰ１と反応性の薬剤と、少なくとも１つの第２の薬剤とに同時に接触させることができる。あるいは、細胞の培養物は、ＮＲＰ１と反応性の薬剤と接触させる前に、少なくとも１つの第２の薬剤と接触させることができる。あるいは、細胞の培養物は、少なくとも１つの第２の薬剤と接触させる前に、ＮＲＰ１と反応性の薬剤と接触させることができる。別の実施形態では、細胞の培養物はまた、ＴＲＡ−１−６０などの多能性幹細胞の少なくとも１つのマーカーの発現の欠如に対して、ネガティブに選択される。別の実施形態では、ヒト心室前駆細胞は、これらが心室マーカーＭＬＣ２ｖを発現するように、さらに培養され分化される。ある特定の実施形態では、ヒト心臓前駆細胞を含有する細胞の出発培養物は、ヒト胚性幹細胞またはヒト誘導多能性細胞に由来する。

ヒト心室前駆細胞を単離するための方法において、ＮＲＰ１に結合する様々な種類の薬剤を、ＮＲＰ１と反応性の薬剤（複数可）として使用することができる。例えば、一実施形態では、ＮＲＰ１と反応性の薬剤は、モノクローナル抗体などの抗ＮＲＰ１抗体である。別の実施形態では、ＮＲＰ１と反応性の薬剤は、ＮＲＰ１リガンド融合タンパク質などの可溶性ＮＲＰ１リガンドである。例えば、ＮＲＰ１と反応性の薬剤は、ＮＲＰ１リガンドＶＥＧＦ−Ａ、またはＳｅｍａ３Ａ、例えば、可溶性融合タンパク質（例えば、Ｉｇ融合タンパク質）を含むことができる。

ヒト心室前駆細胞を単離するための方法において、様々な種類の分離方法を使用して、ＮＲＰ１反応性陽性細胞を非反応性細胞から分離することができる。例えば、一実施形態では、反応性陽性細胞は、蛍光活性化細胞選別法（ＦＡＣＳ）によって、非反応性細胞から分離される。別の実施形態では、反応性陽性細胞は、磁気活性化細胞選別法（ＭＡＣＳ）によって、非反応性細胞から分離される。

さらに別の態様では、本発明は、ヒト心室前駆細胞のクローン集団を得る方法に関し、本方法は、
単一のＮＲＰ１＋ヒト心室前駆細胞を単離することと、
単一のＮＲＰ１＋ヒト心室前駆細胞を、細胞が少なくとも１×１０^９個の細胞にまで増殖するような条件下で培養し、それにより、ヒト心室前駆細胞のクローン集団を得ることと、を含む。

一実施形態では、単一のＮＲＰ１＋ヒト心室前駆細胞は、初期培養時に、Ｉｓｌｅｔ１陽性、Ｎｋｘ２．５陰性およびｆｌｋ１陰性である。単一のＮＲＰ１＋ヒト心室前駆細胞は、上述されたもの（例えば、ＦＡＣＳまたはＭＡＣＳ）などの方法によって単離することができる。単一のＮＲＰ１＋ヒト心室前駆細胞は、上述されたもの（例えば、抗ＮＲＰ１抗体、リガンド融合タンパク質などの可溶性ＮＲＰ１リガンド）などの、ＮＲＰ１と反応性の試薬（複数可）を使用して単離することができる。さらなる培養および分化時に、ヒト心室前駆細胞のクローン集団は、心室マーカーＭＬＣＶ２を発現することができる。

好ましい実施形態では、単一のＮＲＰ１＋ヒト心室前駆細胞は、細胞を心室分化に偏向するような条件下でインビトロで培養される。例えば、単一のＮＲＰ１＋ヒト心室前駆細胞は、細胞の、ＭＬＣ２ｖ心室マーカーを発現する心室細胞への分化を可能にする、心臓前駆体培養（ＣＰＣ）培地（２０％のＫｎｏｃｋＯｕｔ血清代替物、２．５ｍＭのＧｌｕｔａＭａｘ、および１００μｇ／ｍｌのビタミンＣを補充した８０％アドバンストＤＭＥＭ／Ｆ１２）中で培養することができる。様々な実施形態では、単一のＮＲＰ１＋ヒト心室前駆細胞は、例えば、少なくとも１×１０^９個の細胞、少なくとも２×１０^９個の細胞、少なくとも５×１０^９個の細胞、または少なくとも１０×１０^９個の細胞のクローン集団まで増殖される。

したがって、別の態様では、本発明は、単離されたＮＲＰ１＋ヒト心室前駆細胞のクローン集団に関する。様々な実施形態では、このクローン集団は、例えば、少なくとも１×１０^９個の細胞、少なくとも２×１０^９個の細胞、少なくとも５×１０^９個の細胞、または少なくとも１０×１０^９個の細胞を含む。好ましい実施形態では、このクローン集団は、少なくとも１×１０^９個のＮＲＰ１＋ヒト心室前駆細胞を含む。

さらに別の態様では、本発明は、本明細書に記載のＮＲＰ１＋ヒト心室前駆細胞を使用して、対象の心機能を向上させる方法に関する。例えば、一実施形態では、本発明は、対象の心機能を向上させる方法を提供し、本方法は、少なくとも１×１０^９個の細胞、少なくとも２×１０^９個の細胞、少なくとも５×１０^９個の細胞、または少なくとも１０×１０^９個の細胞のクローン集団などの、クローン集団ＮＲＰ１＋ヒト心室前駆細胞を含む薬学的組成物を投与することを含む。一実施形態では、クローン集団は、対象の心臓に直接投与される。例えば、クローン集団は、対象の心臓の心室領域に直接投与することができる。一実施形態では、対象に投与される薬学的組成物は、心室筋細胞を含む心筋肉パッチなどの三次元マトリックス上に製剤化されたクローン集団を含む。対象は、心機能の向上を必要としている対象であり、例えば、心筋梗塞に罹患した人、または先天性心疾患を有する人である。

さらに別の態様では、本発明は、
ＮＲＰ１＋ヒト心室前駆細胞を非ヒト動物の臓器に移植することと、
ヒト心室組織が生成されるように、前駆細胞をインビボで成長させることと、を含む、ヒト心室組織を生成するための方法に関する。

非ヒト動物は、例えば、免疫不全マウスである。臓器は、例えば、腎臓（例えば、細胞は腎臓被膜下に移植される）、または心臓である。一実施形態では、細胞は、以下の細胞マーカーパターンのうちの１つ、２つ、３つ、４つ、または５つが存在する時点で移植される：（ｉ）心臓中胚葉形成のピーク後、（ｉｉ）Ｉｓｌｅｔ−１発現のピーク時、（ｉｉｉ）ＮＫＸ２．５発現のピーク前、（ｉｖ）下流遺伝子ＭＥＦ−２およびＴＢＸ−１のピーク発現の前、ならびに（ｖ）分化した収縮タンパク質遺伝子の発現前。一実施形態では、細胞は、ヒト心室前駆細胞を生成する条件下でのヒト多能性幹細胞のインビトロ培養の５日目〜７日目（両端の値を含む）に移植される。別の実施形態では、細胞は、ヒト心室前駆細胞を生成する条件下でのヒト多能性幹細胞のインビトロ培養の６日目に移植される。本方法は、非ヒト動物において生成されたヒト心室組織を採取することをさらに含むことができる。

本発明のさらに別の態様では、本明細書に記載のヒト心室前駆細胞は、試験化合物の心臓毒性を評価するために、スクリーニングアッセイで使用することができる。したがって、本発明は、試験化合物の心臓毒性をスクリーニングする方法を提供し、本方法は、
ＮＲＰ１＋心室前駆細胞を提供することと、
この細胞を試験化合物と接触させることと、
この細胞に対する試験化合物の毒性を測定することと、を含み、
この細胞に対する試験化合物の毒性は、試験化合物の心臓毒性を示す。この細胞に対する試験化合物の毒性は、例えば、細胞生存度または細胞の他の生理学的パラメータを評価することによって、測定することができる。

ヒト心室前駆細胞を生成するための培養方法も提供される。例えば、一実施形態では、本発明は、
心臓中胚葉マーカーが生成されるように、ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）を、ＣＨＩＲ９８０１４を含む培地中で培養することと、
ＨＶＰが生成されるように、心臓中胚葉マーカーを発現する細胞を、Ｗｎｔ−Ｃ５９を含む培地中で培養することと、を含む、ヒト心室前駆体（ＨＶＰ）を生成する方法に関する。

本発明の他の特徴および利点は、以下の発明を実施するための形態から明らかになるであろう。

ヒトＩｓｌ１＋心筋原性前駆細胞をヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）から生成するための例示的な培養プロトコルの概略図である。 Ｉｓｌ１、Ｎｋｘ２．５、およびｃＴｎ１の発現を示している、ｈＰＳＣの心分化の間のタンパク質発現のウエスタンブロット分析の結果を示す。ＧＡＰＤＨを、対照として使用した。 分化の６日目での細胞上のＩｓｌ１の発現を示している、心筋原性前駆細胞のフローサイトメトリー分析の結果を示す。 分化の６日目での細胞上のＩｓｌ１およびＪａｇ１の共発現を示している、心筋原性前駆細胞の二重染色フローサイトメトリー分析の結果を示す。 ＦＺＤ４の発現を示している、ｈＰＳＣの心分化の間のタンパク質発現のウエスタンブロット分析の結果を示す。ＧＡＰＤＨを、対照として使用した。 分化の５日目での細胞上のＩｓｌ１およびＦＺＤ４の共発現を示している、心筋原性前駆細胞の二重染色フローサイトメトリー分析の結果を示す。 ヒト心室前駆（ＨＶＰ）細胞の生成、それらの心室筋細胞への最終的な分化、それらの抗体の精製、およびそれらの移植での使用の概略図である。 臓器上臓器ティッシュエンジニアリングのためのＨＰＶの腎被膜への移植（図８Ａ）または心筋内移植（図８Ｂ）の概略図である。 細胞上のＩｓｌ１およびＬＩＦＲの共発現を示している、ヒト心室前駆（ＨＶＰ）細胞の二重染色フローサイトメトリー分析の結果を示す。 未分化の胚性幹（ＥＳ）細胞（図１０Ａ）と比較した、ヒト心室前駆細胞（図１０Ｂ）上でのＬＩＦＲおよびＦＧＦＲ３の発現のフローサイトメトリー分析の結果を示す。 同上。 ０および１とラベルが付けられた分化遺伝子発現に基づく細胞の２つのクラスターを示している、単一細胞配列決定からの５日目細胞のｔＳＮＥプロットである。 単一細胞配列決定からの５日目の細胞上でのＩｓｌ１発現（図１２Ａ）およびＮＲＰ１発現（図１２Ｂ）のｔＳＮＥプロットである。濃い灰色は、高発現を示し、中間の灰色は、低発現を示し、薄い灰色は、発現がないことを示す。 ＮＲＰ１＋およびＩＳＬ１＋細胞が、それらが類似する遺伝子発現プロファイルを有するために、同じクラスター内にあることを示している、単一細胞配列決定からの５日目の細胞のクラスターにおけるＩｓｌ１およびＮＲＰ１の発現レベルのバイオリンプロットである。 Ｈ９幹細胞から生成された６日目のＨＶＰ上のＮＲＰ１（図１４Ａ）、ＴＲＡ−１−６０（図１４Ｂ）、およびＮＲＰ１とＴＲＡ−１−６０との両方（図１４Ｃ）の発現のフローサイトメトリー分析の結果を示す。 Ｈ９幹細胞から生成された６日目のＨＶＰ上のＮＲＰ１（図１５Ａ）、ＩＳＬ１（図１５Ｂ）、およびＮＲＰ１とＩＳＬ１との両方（図１５Ｃ）の発現のフローサイトメトリー分析の結果を示す。

本発明は、ＮＲＰ１が、心室前駆細胞（ＨＶＰ）に対する細胞表面マーカーであるとの発見に基づいて、ヒト心筋原性前駆細胞、特に心室系統に偏向している細胞を単離する方法、ならびにこのような前駆細胞の単離されたクローン集団を提供する。ＨＶＰに対する追加の好適な細胞表面マーカーは、例えば、表１、５、および１０に示されている。これらの心室前駆細胞のインビトロおよびインビボでの使用も提供されている。

ＨＶＰは、ＪＡＧ１、ＦＺＤ４、ＬＩＦＲ、ＦＧＦＲ３および／またはＴＮＦＳＦ９などの細胞表面マーカー、ならびに細胞内マーカーＩｓｌｅｔ１を発現することが以前に示されている（例えば、２０１５年８月２１日出願された米国特許出願第１４／８３２，３２４号、および２０１５年１２月３０日に出願された米国特許出願第１４／９８４，７８３号（これらのそれぞれの内容全体が、参照により本明細書に明示的に組み込まれる）を参照されたい）。さらに、ＨＶＰの様々な陽性および陰性生着マーカーが特定されている（その内容全体が、参照により本明細書に明示的に組み込まれる、２０１７年２月１５日に出願された米国特許出願第１５．４３３，７１３号を参照されたい）。

本発明をより容易に理解するために、特定の用語が最初に定義される。追加の定義は、発明を実施するための形態の全体を通して記載されている。

本明細書で使用される場合、「ニューロピリン−１」、「ＮＲＰ１」という用語は、例えば、Ｓｏｋｅｒ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｃｅｌｌ ９２：７３５−７４５およびＲｏｓｓｉｇｎｏｌ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ７０：２１１−２２２に記載された当該技術分野において既知のタンパク質を指すように互換的に使用される。ＮＲＰ１は、当該技術分野において、ＢＤＣＡ４、ＶＥＧＦ１６５ＲおよびＣＤ３０４とも称される。ＮＲＰ１タンパク質の非限定的な例は、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＰ ００３８６４．４に記載されるアミノ酸配列を有するヒトタンパク質である。

本明細書で使用される場合、「幹細胞」という用語は、広い意味で使用され、従来の幹細胞、前駆細胞、プレ前駆細胞、予備細胞などが含まれる。「幹細胞」または「前駆体」という用語は、本明細書では互換的に使用され、増殖することができ、ひいては分化された、または分化可能な娘細胞を生じさせることができる多数の母細胞を生成することができる能力を有する、より多くの前駆細胞を生じさせることができる未分化細胞を指す。娘細胞は、それ自体が増殖して、その後１つ以上の成熟細胞型に分化する前駆体を生成するように誘導されることができる一方で、親の発生能を有する１つ以上の細胞も保持する。「幹細胞」という用語は、さらに、特定の状況下では、より特殊化または分化した表現型に分化する能力または潜在性を有する細胞、およびある特定の状況下で、実質的に分化することなく増殖するための能力を保持する細胞を指す。一実施形態では、前駆体または幹細胞という用語は、その子孫（ｄｅｓｃｅｎｄａｎｔｓ（ｐｒｏｇｅｎｙ））が、分化によって、例えば、胚細胞および組織の進行性の多様化で発生するように、個々の形質を完全に獲得することによって、多くの場合異なる方向に特化する、一般化された母細胞を指す。細胞分化は、典型的には、多くの細胞***を通して発生する複雑なプロセスである。分化細胞は、それ自体が複能性細胞に由来する複能性細胞などに由来してもよい。これらの複能性細胞のそれぞれは、幹細胞とみなされ得るが、各々が生じさせ得る細胞型の範囲は、かなり異なる場合がある。一部の分化細胞はまた、より大きな発生能の細胞を生じさせる能力を有する。このような能力は、自然なものであってもよく、または様々な因子による処理の際に、人工的に誘導されてもよい。多くの生物学的実例において、幹細胞が、２つ以上の別個の細胞型の子孫を作り出すことができるために、幹細胞は「複能性」でもあるが、「幹細胞性（ｓｔｅｍ−ｎｅｓｓ）」である必要はない。自己複製は、幹細胞定義の他の古典的な部分であり、本文書で使用されるとき、これは必須である。理論上では、自己複製は、２つの主要な機構のいずれかによって発生し得る。幹細胞は、一方の娘細胞が肝細胞状態を保持し、他方の娘細胞がいくつかの別個の他の特異的機能および表現型を発現する状態で、非対称的に***することができる。あるいは、集団中の幹細胞のいくつかは、２つの幹細胞に対称的に***することができるため、集団中の一部の幹細胞を欠けることなく維持するが、集団中の他の細胞は、分化した子孫のみを生じさせる。形式上、幹細胞として開始する細胞は、分化された表現型に向けて進み得るが、次いで幹細胞表現型に「逆転し」、幹細胞表現型を「再発現」することが可能であり、この用語は、しばしば「退行分化」と称される。

「前駆細胞」という用語は、本明細書では、それが分化によって生じさせることができる細胞に対して初期段階にある（例えば、完全に分化した細胞よりも発生経路または進行に沿ってより早い段階にある）細胞を指すように使用される。多くの場合、前駆細胞はまた、顕著な、または非常に高い増殖能を有する。前駆細胞は、発生経路および細胞が発生しかつ分化する環境に応じて、複数の別個の分化細胞型、または単一の分化細胞型を生じせることができる。

本明細書で使用される「多能性」という用語は、異なる条件下で、全ての３つ生殖細胞層（内胚葉、中胚葉、および外胚葉）の細胞型特性に分化するための能力を有する細胞を指す。多能性細胞は、主として、例えば、ヌードマウスおよび奇形腫形成アッセイを使用して、それらの全ての３つの生殖層に分化する能力によって特性化される。多能性についての好ましい試験は、３つの生殖層のそれぞれの細胞へ分化する能力の実証であるが、多能性は、胚性幹（ＥＳ）細胞マーカーの発現によっても証明される。いくつかの実施形態では、多能性細胞は、未分化細胞である。

本明細書で使用される「多能性」または「多能性状態」という用語は、全ての３つの胚性生殖層：内胚葉（消化管組織）、中胚葉（血液、筋肉、および血管を含む）、および外胚葉（皮膚および神経など）に分化する能力を備え、典型的には、長期にわたって、例えば、１年を超えるか、または３０継代を超えてインビトロで***する能力を有する細胞を指す。

「複能性」という用語は、「複能性細胞」と関連して使用される場合、全ての３つの生殖層に由来する細胞のいくつかに分化することができるが、これらの全てには分化することができない細胞を指す。したがって、複能性細胞は、部分的に分化された細胞である。複能性細胞は、当該技術分野において周知であり、複能性細胞の例としては、成体幹細胞、例えば、造血幹細胞、および神経幹細胞などが挙げられる。複能性は、幹細胞が所与の系統において多くの細胞型を形成し得るが、他の系統の細胞は形成し得ないことを意味する。例えば、複能性血液幹細胞は、多くの異なる種類の血球（赤血球、白血球、血小板など）を形成することができるが、ニューロンを形成することはできない。

「胚性幹細胞」または「ＥＳ細胞」または「ＥＳＣ」は、本明細書で互換的に使用され、胚性胚盤胞の内部細胞塊の多能性幹細胞を指す（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，８４３，７８０号、同第６，２００，８０６号を参照されたい）。このような細胞は、体細胞核移植から誘導された胚盤胞の内部細胞塊から同様に得ることができる（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，９４５，５７７号、同第５，９９４，６１９号、同第６，２３５，９７０号を参照されたい）。胚性幹細胞の際立った特性は、胚性幹細胞表現型を画定する。したがって、細胞が他の細胞から区別され得るように、細胞が胚性幹細胞の独自の特性のうちの１つ以上を保有するならば、細胞は胚性幹細胞の表現型を有する。例示的な際立った胚性幹細胞の特性としては、遺伝子発現プロファイル、増殖能力、分化能力、核型、特定の培養条件に対する応答度などが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ＥＳ細胞は、胚を破壊することなく、例えば、ヒト胚を破壊することなく得ることができる。

「成体幹細胞」または「ＡＳＣ」は、胎児組織、幼若組織、および生体組織を含む、非胚性組織に由来する任意の複能性幹細胞を指すように使用される。幹細胞は、血液、骨髄、脳、嗅覚上皮皮膚、膵臓、骨格筋、および心筋肉を含む多種多様な成体組織から単離されている。これらの幹細胞のそれぞれは、遺伝子発現、因子応答度、および培養での形態に基づいて特性化することができる。例示的な成体幹細胞としては、神経幹細胞、神経堤幹細胞、間葉系幹細胞、造血幹細胞、および膵幹細胞が挙げられる。前述の通り、幹細胞は、ほぼ全ての細胞に存在することが判明している。したがって、本発明は、幹細胞集団が、実質上任意の動物組織から単離され得ることを理解する。

「ヒト多能性幹細胞」（ｈＰＳＣと略する）は、本明細書で使用される場合、幹細胞および多能性に関して上述したように、様々な異なる細胞型に分化する能力を有するヒト細胞を指す。ヒト多能性ヒト幹細胞としては、例えば、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）およびＥ細胞株などのヒト胚性幹細胞が挙げられる。

本明細書で使用される「ヒト心臓前駆細胞」という用語は、心臓系統に決定付けされ、かつ全ての３つの心臓系統細胞（心筋細胞、内皮細胞および平滑筋細胞）に分化する能力を有するヒト前駆細胞を指す。ヒト心臓前駆細胞の培養物は、例えば、幹細胞を心臓系統への分化に偏らせる条件下で幹細胞を培養することによって得ることができる。ある特定の実施形態では、ヒト心臓前駆細胞を生成するように培養される幹細胞は、ヒト胚性幹細胞またはヒト誘導多能性細胞である。ある特定の実施形態では、ｃ−ｋｉｔ＋成体前駆細胞は、ヒト心臓前駆細胞の生成において使用するためには、明示的に除外される。

本明細書で使用される「ヒト心筋原性前駆細胞」という用語は、心臓系統に決定付けされ、かつ優勢に心筋肉細胞に分化する（すなわち、前駆細胞に由来する分化細胞の５０％超が、好ましくは前駆細胞に由来する分化細胞の６０％、７０％、８０％、または９０％超が心筋肉細胞である）ヒト前駆細胞を指す。

本明細書で使用される「心室前駆細胞」という用語は、心臓系統に決定付けされ、かつ優勢に心室筋細胞に分化する（すなわち、前駆細胞に由来する分化細胞の５０％超が、好ましくは前駆細胞に由来する分化細胞の６０％、７０％、８０％、または９０％超が心室筋細胞である）前駆細胞を指す。この種の細胞は、本明細書では、ヒト心室前駆細胞、またはＨＶＰ細胞とも称される。

「心筋細胞（ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ）」という用語は、心臓の筋肉細胞（例えば、心筋肉細胞（ｃａｒｄｉａｃ ｍｕｓｃｌｅ ｃｅｌｌ））を指す。心筋細胞は、一般的に、その細胞表面上および／または細胞質内で１つ以上の心臓特異的マーカーを発現するであろう。好適な心筋特異的マーカーとしては、心臓トロポニンＩ、心臓トロポニンーＣ、トポミオシン、カベオリン−３、ＧＡＴＡ−４、ミオシン重鎖、ミオシン軽鎖−２ａ、ミオシン軽鎖−２ｖ、リアノジン受容体、および心房性ナトリウム利尿因子が挙げられるが、これらに限定されない。

別の細胞に由来する細胞に関して使用される「由来する」という用語は、細胞が異なる細胞型である細胞から生じた（例えば、変化した、または産生された）ことを意味する。「由来する」という用語は、前駆細胞から分化した細胞も指す。

本明細書で使用される「Ｉｓｌ１＋心臓前駆細胞」とは、心臓系統に決定付けられ、かつＩｓｌｅｔ１を発現する細胞を指す。

本明細書で使用される「Ｉｓｌ１＋ＮＲＰ１＋心臓前駆細胞」とは、心臓系統に決定付けられ、かつＩｓｌｅｔ１およびＮＲＰ１を発現する細胞を指す。

細胞培養物中または細胞集団中の細胞に関する「実質的に含まない」という用語は、その細胞培養物または細胞集団が含まないとされる特定の細胞型が、その細胞培養物または細胞集団中に存在する細胞の総数の約１０％未満、約９％未満、約８％未満、約７％未満、約６％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、または約１％未満の量で存在することを意味する。

細胞発生という面においては、「分化した」または「分化する」という形容詞Ｉは、相対語である。「分化細胞」は、それが比較されている細胞よりも発生経路を下ってさらに進んだ細胞である。したがって、幹細胞は、系統限定前駆細胞（例えば、中胚葉幹細胞）に分化することができ、今度は経路をさらに下って他の種類の前駆細胞（心筋細胞前駆体）に分化することができ、次いで、ある特定の組織型において特徴的な役割を果たし、さらに増殖するための能力を保持しても、または保持しなくてもよい、最終段階の分化細胞に分化することができる。

本文脈における「分化」という用語は、さらに分化することができない、より特殊化し、終末分化細胞に近づきつつある細胞である細胞に関連することが知られているマーカーを発現する細胞を形成することを意味する。細胞が、あまり傾倒していない細胞から益々特定の細胞種に傾倒している細胞へ進行し、最終的に終末分化細胞へ進行する経路は漸進的分化または漸進的傾倒と呼ばれる。より特殊化しているが（例えば、漸進的分化のある経路に沿って進行し始めたが）、未だ終末分化に至っていない細胞は部分的分化されていると呼ばれる。分化とは、細胞がより特殊化した表現型を呈する、例えば、他の細胞種と別個の１つ以上の特徴または機能を獲得する発生過程である。いくつかの事例では、分化表現型は、ある発生経路の成熟エンドポイントにある細胞の表現型（いわゆる終末分化細胞）を指す。全ての組織ではないが、多くの組織で分化過程は細胞周期からの離脱を伴う。これらの事例では、終末分化細胞はそれらの増殖する能力を失うか、またはその能力を大いに制限する。しかしながら、我々は、本明細書の内容では、「分化」または「分化した」という用語は、細胞の発生の前の時点よりもそれらの運命または機能において特殊化している細胞を指し、終末分化している細胞、および終末分化されていないが、それらの発生の前の時点よりもより特殊化している細胞の両方を含むことに留意する。傾倒していない細胞（例えば、幹細胞）から特定の分化細胞種への傾倒の程度が上昇した細胞への、および最終的に終末分化細胞への細胞の発生は漸進的分化または漸進的傾倒として知られている。前駆細胞に対して「分化した」細胞は、その前駆細胞に対して１つ以上の表現型の違いを有する。表現型の差異としては、形態学的違い、および発現されたマーカーの存在または非存在のみならず、マーカーの量の差異ならびにマーカーのセットの共発現パターンの差異も含まれる遺伝子発現および生物活性における差異が挙げられるが、これらに限定されない。

本明細書で使用される「分化」という用語は、原始的段階からより成熟した（すなわち、より原始的ではない）細胞に向かう細胞の細胞発生を指す。

本明細書で使用される場合、「増殖する」および「増殖」とは、細胞***を用いた集団（成長）中の細胞の数の増加を指す。細胞増殖は、一般的に、成長因子および他の***促進因子を含む環境に応答する複数のシグナル伝達経路の協調的な活性化から生じると理解される。細胞増殖はまた、細胞内または細胞外シグナルの作用からの解放および細胞増殖をブロックするか、またはそれに悪影響を及ぼす機構によって促進され得る。

「複製」または「自己複製」または「増殖」は、本明細書では互換的に使用され、細胞のそれ自体のより多くのコピーを作製する細胞のプロセス（例えば、倍加）を指す。いくつかの実施形態では、細胞は、長期間にわたって、および／または数ヶ月間から数年間にわたって同じ未分化細胞（例えば、前駆細胞型）に***することによって、それら自体を複製することができる。場合によっては、増殖は、単一細胞の２つの娘細胞への繰り返される***による、細胞の増殖（ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）を指す。

本明細書で使用される「系統」という用語は、共通の子孫を有する細胞または共通の発生運命を有する細胞、例えば、心室心筋細胞に発生するような発生運命を有する細胞を指す。

本明細書で使用される「クローン集団」という用語は、単一細胞の外殖に由来する細胞の集団を指す。すなわち、クローン集団中の細胞は、クローン集団に播種するために使用された全て単一細胞の子孫である。

本明細書で使用される「培地」という用語は、細胞の生存生を維持し、かつ増殖を支援する栄養素を含有する、組織もしくは細胞集団を維持するか、または細胞集団を培養するための媒体である。細胞培養培地は、以下の適切な組み合わせのいずれかを含有してもよい：塩（複数可）、緩衝液（複数可）、アミノ酸、グルコースもしくは他の糖類（複数可）、抗生物質、血清もしくは血清代替物、および他の成分（例えば、ペプチド増殖因子など）。通常、特定の細胞型に使用される細胞培養培地は、当業者に既知である。

「表現型」という用語は、実際の遺伝子型とは無関係に、環境条件および因子の特定のセットの下で細胞または生物体を限定する１つまたは多数の総生物学的特性を指す。

本明細書で使用される「マーカー」は、細胞の特性および／または表現型を説明する。マーカーは、目標とする特性を含む細胞の選択のために使用することができる。マーカーは、特定の細胞によって異なるであろう。マーカーは、それが形態的特性であれ、機能的特性であれ、または生化学的（酵素的）特性であれ、細胞型に、または細胞型によって発現される分子に特定な特性である。好ましくは、このようなマーカーはタンパク質であり、より好ましくは、抗体または当該技術分野において利用可能な他の結合分子に対するエピトープを有する。しかしながら、マーカーは、タンパク質（ペプチドおよびポリペプチド）、脂質、多糖類、核酸およびステロイドが挙げられるが、これらに限定されない細胞内に見出される任意の分子からなってもよい。形態的特性または形質の例としては、形状、サイズ、および核・細胞質比が挙げられるが、これらに限定されない。機能的特性または形質の例としては、特定の基質に接着する能力、特定の染料を組み込むか、または排除する能力、特定の条件下で移動する能力、および特定の系統に沿って分化する能力が挙げられるが、これらに限定されない。マーカーは、当業者に利用可能な任意の方法によって検出され得る。

本明細書で使用される「単離された細胞」という用語は、それが元々見出された生物から除去された細胞またはそのような細胞の子孫である。任意に、細胞は、インビトロで、例えば、他の細胞の存在下で培養されていた。任意に、細胞は、その後、第２の生物中に導入されるか、それ（またはその子孫である細胞）が単離された生物体に再導入される。

本明細書で使用される、細胞の単離された集団に関する「単離された集団」という用語は、細胞の混合されたまたは不均一な集団から除去および分離された細胞の集団を指す。いくつかの実施形態では、単離された集団は、細胞がそこから単離されるか、または富化された不均一な集団と比べて実質的に純粋な細胞の集団である。

特定の細胞集団に関して「実質的に純粋な」という用語は、総細胞集団を構成する細胞に関して、少なくとも約７５％、好ましくは、少なくとも約８５％、より好ましくは、少なくとも約９０％、および最も好ましくは、少なくとも約９５％純粋である細胞の集団を指す。

「対象」および「個体」という用語は、本明細書で互換的に使用され、動物、例えば、本明細書に開示される心室前駆細胞が、例えば、いくつかの実施形態では、予防的処置を包含する治療のために移植されるヒトを指し、または本明細書に記載の方法および組成物が提供される疾患モデルを指す。ヒト対象などの特定の動物に特異的である疾患状態の治療については、「対象」という用語は、その特定の動物を指す。「非ヒト動物」および「非ヒト哺乳動物」という用語は、本明細書で互換的に使用され、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ネコ、イヌ、ウシ、ブタ、および非ヒト霊長類などの哺乳動物が含まれる。「対象」という用語はまた、哺乳動物、爬虫類、両生類および魚類が挙げられるが、これらに限定されない任意の脊椎動物を包含する。しかしながら、有利には、対象は、ヒトなどの哺乳動物であるか、または他の哺乳動物、飼いならされた哺乳動物などの他の哺乳動物、例えば、イヌ、ネコ、ウマなど、もしくは生産哺乳動物、例えば、ウシ、ヒツジ、ブタなども、対象という用語に包含される。

本明細書で使用される場合、「レシピエント」という用語は、移植臓器、組織または細胞を受容することになる対象を指す。

本明細書で使用される「三次元マトリックス」または「スキャフォールド」または「マトリックス（複数）」という用語は、広義では、生体適合性マトリックス、スキャフォールドなどを含む組成物を指す。三次元マトリックスは、２５℃で液体、ゲル、半固体、または固体であってもよい。三次元マトリックスは、生分解性であっても、または非生分解性であってもよい。いくつかの実施形態では、三次元マトリックスは、生体適合性、または生体吸収性もしくは生体置換性である。例示的な三次元マトリックスとしては、コラーゲン、フィブリン、キトサンを含むポリマーおよびヒドロゲル、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）、ポリエチレングリコール、化学架橋性または光架橋性デキストランを含むデキストラン、粘膜下組織などの処理された組織マトリックスなどが挙げられる。ある特定の実施形態では、三次元マトリックスは、同種成分、自家成分、または同種成分および自家成分の両方を含む。ある特定の実施形態では、三次元マトリックスは、合成または半合成材料を含む。ある特定の実施形態では、三次元マトリックスは、フィブリン由来スキャフォールドなどのフレームワークまたは支持体を含む。

本明細書で使用される場合、「投与すること」、「導入すること」および「移植すること」という用語は互換的に使用され、本明細書に記載される心筋原性前駆細胞および／または分化した心筋細胞の、所望の部位での少なくとも部分的な局在化をもたらす方法または経路による、対象への配置を指す。細胞は、細胞の少なくとも一部が生き残る、対象の所望の位置への送達をもたらす任意の適切な経路によって投与され得る。対象への投与後の細胞の生存期間は、数時間ほどの短い期間、例えば、２４時間から、数年間ほどの長い期間であり得る。

「統計的に有意な」または「有意に」という用語は統計的な有意性を指し、一般に平均より標準偏差の２倍分（２ＳＤ）下の、またはそれより下のマーカーの濃度を意味する。その用語は、差異が存在するという統計的な証拠を指す。それは、帰無仮説が実際に真であるときに、帰無仮説を拒絶する決定を行う確率として定義される。その決定は、多くの場合、ｐ値を使用してなされる。本明細書で使用される「実質的にまたは「優勢に」という用語は、少なくとも約６０％、または好ましくは、少なくとも約７０％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、または少なくとも約９９％以上、または７０％〜１００％の任意の整数の比率を意味する。

「疾患」または「障害」という用語は、本明細書で互換的に使用され、機能の性能を中断もしくは妨害する、および／または疾患のある人またはその人と接触する人に不快感、機能不全、苦痛、またはさらには死などの症状を引き起こす、身体または臓器の一部の状態の任意の変化を指す。疾患または障害はまた、ジステンパー、病気（ａｉｌｉｎｇ）、病気（ａｉｌｍｅｎｔ）、疾病（ｍａｌａｄｙ）、障害（ｄｉｓｏｒｄｅｒ）、病気（ｓｉｃｋｎｅｓｓ）、病気（ｉｌｌｎｅｓｓ）、病状（ｃｏｍｐｌａｉｎｔ）、不快（ｉｎｄｉｓｐｏｓｉｔｉｏｎ）または疾患（ａｆｆｅｃｔｉｏｎ）にも関連し得る。

本明細書で使用される場合、「心血管系の健康状態、疾患または障害」という語句は、不十分な、望ましくない、または異常な心機能、例えば、虚血性心臓疾患、高血圧性心臓疾患および肺性高血圧性心臓疾患、弁膜症、先天性心臓疾患、および対象、特にヒト対象においてうっ血性心不全を引き起こすあらゆる状態を特徴とする全ての障害を含むことが意図されている。不十分または異常な心機能は、疾患、傷害および／または加齢の結果であり得る。背景として、心筋の傷害に対する応答は、いくつかの細胞は死ぬが、他の細胞は、細胞が未だ死んではいないが、機能不全である休止状態に入る、明確に定義された経路に従う。この後に炎症性細胞の浸潤、瘢痕化の一部としてのコラーゲンの沈着が続き、それらの全てが新しい血管の内殖およびある程度の継続的細胞死と並行して起こる。本明細書で使用される場合、「虚血」という用語は、血液の流入の低下に起因するあらゆる局所組織の虚血を指す。「心筋虚血」という用語は、冠動脈アテローム性硬化症および／または心筋への不十分な酸素供給を原因とする循環障害を指す。例えば、急性心筋梗塞は心筋組織への不可逆性虚血性発作を表す。この発作は、冠循環に閉塞性（例えば、血栓性または塞栓性）事象をもたらし、心筋の代謝要求が心筋組織への酸素の供給を越える環境を作り出す。

本明細書で使用される場合、「治療すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」または「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」という用語は、本明細書で互換的に使用され、心血管の状態、疾患もしくは障害、すなわち、不十分なもしくは望ましくない心機能を特徴とするあらゆる障害の少なくとも１つの有害影響または症状を低減させる、または減少させる、または軽減もしくは停止させることを指す。心臓障害の有害影響または症状は当技術分野において周知であり、これらには、呼吸困難、胸部痛、心悸亢進、めまい、失神、浮腫、チアノーゼ、蒼白、倦怠感および死が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、本明細書で使用される「治療」という用語は、対象の心血管状態の症状の発症を防止するための予防的（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ）処置または防除的（ｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ）処置を指す。

１つ以上の症状または臨床マーカーが、本明細書に定義される通りに減少する場合、治療は一般的に「有効」である。あるいは、疾患の進行が低下または停止している場合、治療は「有効」である。すなわち、「治療」は症状の改善またはその疾患のマーカーの減少だけではなく、治療がない場合に予想される症状の進行または悪化の停止または遅延化も含む。有益な、または望ましい臨床成果には、検出可能であれ、検出不可能であれ、１つ以上の症状（複数可）の軽減、疾患の程度の縮小、疾患の安定化（すなわち、非悪化）状態、疾患進行の遅延または減速、疾患状態の改善または緩和、および（部分的にせよ、全体的にせよ）寛解が含まれるが、これらに限定されない。「治療」は、治療を受けなかった場合に予想される生存期間と比べた生存期間の延長を意味することもできる。治療を必要とする人には、心臓疾患を有すると既に診断されている人、ならびに遺伝的感受性または体重、食事および健康などの他の要因のために心臓状態を発生する可能性がある人が含まれる。いくつかの実施形態では、治療することという用語は、部所的手段および／または予防的処置も包含し、それには疾患または障害の発症を防ぐために本明細書に開示される医薬組成物を投与することが含まれる。

症状の治療的に有意な軽減は、例えば、対照または非治療対象と比べて測定パラメータの少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約１００％、少なくとも約１２５％、少なくとも約１５０％またはそれ以上の軽減である。測定パラメータまたは測定可能パラメータには、疾患の臨床的に検出可能なマーカー、例えば、生物学的マーカーのレベルの上昇または抑制、ならびに疾患または障害の臨床的に許容される規模の症状またはマーカーに関連するパラメータが含まれる。本明細書において開示される組成物および製剤の総１日使用量は、確実な根拠がある医学的判断の範囲内で担当医によって決定されることが理解される。必要とされる正確な量は、治療される疾患の種類などの要因に応じて左右される。

対象における心血管の状態または疾患の治療に関連して、「治療有効量」という用語は、心血管の疾患または障害の発生を防ぐか、または遅らせるために安全かつ十分な量を指す。その量は、そのため、心血管の疾患もしくは障害を治癒することができ、または心血管の疾患もしくは障害の寛解を引き起こすことができ、心血管疾患の進行過程を遅らせることができ、心血管の疾患もしくは障害の症状を遅延化もしくは抑制することができ、心血管の疾患もしくは障害の副次的症状の成立を遅延化もしくは抑制することができ、または心血管疾患もしくは障害の副次的症状の発生を抑制することができる。心血管疾患もしくは障害の治療にとっての有効量は、治療される心血管疾患の種類、その症状の重症度、治療されている対象、その対象の年齢および一般健康状態、投与モードなどによって左右される。したがって、正確な「有効量」を特定することは不可能である。しかしながら、あらゆる所与の事例にとって、適切な「有効量」は、日常の実験法のみを用いて当業者によって決定され得る。治療の効力は当業者によって判断されることができ、例えば、効力は本明細書において考察される通りに心血管の疾患または障害の動物モデルにおいて評価され得る。例えば、急性心筋梗塞または虚血再灌流障害を有するげっ歯類の治療、ならびに本明細書において開示される心血管系の疾患または障害の少なくとも１つの症状の減少、例えば、心臓の駆出率の上昇、心不全の割合の減少、梗塞巣のサイズの減少、合併症（肺浮腫、腎不全、不整脈）の罹患率の減少、運動耐容能または他の生活の質の測定基準の改善、および死亡率の低下をもたらすあらゆる治療または組成物もしくは製剤の投与が有効な治療を表す。その組成物が心血管の疾患または障害の治療のために使用される実施形態では、その組成物の効力は心血管疾患の実験動物モデル、例えば、虚血再灌流障害の動物モデル（Ｈｅａｄｒｉｃｋ Ｊ Ｐ，Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｈｅａｒｔ ｃｉｒｃ Ｐｈｙｓｉｏｌ ２８５；Ｈ１７９７；２００３）、および動物モデルの急性心筋梗塞（Ｙａｎｇ Ｚ，Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｈｅａｒｔ Ｃｉｒｃ．Ｐｈｙｓｉｏｌ ２８２：Ｈ９４９：２００２、Ｇｕｏ Ｙ，Ｊ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｃａｒｄｉｏｌ ３３；８２５−８３０，２００１）を使用して判定され得る。実験動物モデルを使用するとき、治療効力は、心血管系の疾患または障害の症状の低減、例えば、呼吸困難、胸部痛、心悸亢進、めまい、失神、浮腫、チアノーゼ、蒼白、倦怠感および高血圧のうちの１つ以上の症状の低減が治療されていない動物と比べて治療されている動物で早く起こるとき、明らかとなる。「より早く」とは、例えば、腫瘍のサイズの減少が少なくとも５％早く起こるが、好ましくはより早く起こる、例えば、１日早く、２日早く、３日早く、またはそれ以上早く起こることを意味する。

本明細書で使用される場合、「治療すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」という用語は、心血管の疾患または障害の治療に関して使用されるとき、心血管の疾患または障害の症状および／または生化学的マーカーの低減について言及するために使用され、例えば、心血管疾患の少なくとも１つの生化学的マーカーの少なくとも約１０％の低減は有効な治療とみなされ得る。心血管疾患のこのような生化学的マーカーの例には、血液中の、例えば、クレアチンホスフォキナーゼ（ＣＰＫ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）の減少、および／または心血管疾患の症状の減少、および／または心電図（ＥＣＧまたはＥＫＧ）もしくは心エコー図（心臓超音波）、ドップラー超音波画像法および核医学画像法によって測定される、幾人かの当業者によって決定される血流および心機能の改善が含まれる。心血管疾患の症状の少なくとも約１０％の減少も本明細書において開示される方法による有効な治療とみなされ得る。代替例として、心血管疾患の症状の減少、例えば、次の、呼吸困難、胸部痛、心悸亢進、めまい、失神、浮腫、チアノーゼなどのうちの少なくとも１つの少なくとも約１０％の減少、またはそのような系の停止、または心血管疾患の１つのそのような症状のサイズの少なくとも約１０％の減少も本明細書において開示される方法によって有効な治療とみなされ得る。いくつかの実施形態では、治療薬が、単に症状を管理可能な程度にまで軽減するよりも、実際に心血管の疾患または障害を除去することが好ましいが、必須ではない。

本明細書に開示される方法による治療を受け入れることができる対象は、一般的に当該技術分野における当業者に既知である心筋梗塞（一般に心臓発作と呼ばれる）を診断するためのあらゆる方法によって特定されることができ、本明細書に開示される方法を使用する治療を受け入れることができ、このような診断方法としては、例えば、限定されないが、下記が挙げられ、（ｉ）クレアチンホスフォキナーゼ（ＣＰＫ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）および心筋梗塞の間に放出される他の酵素のレベルを検出するための血液検査、（ｉｉ）心臓活動の紙またはコンピュータモニターのどちらかでの図による記録である心電図（ＥＣＧまたはＥＫＧ）。ＥＣＧは、疾患や損傷の検出に有益であり得、（ｉｉｉ）先天性心臓疾患の調査ならびに心臓の壁、弁および血管の機能の異常を含む心臓壁の異常を評価するために使用される心エコー図（心臓超音波）、（ｉｖ）ドップラー超音波画像法は心臓弁を越える血流の測定のために使用することができる。（ｖ）核医学画像法（当技術分野において放射性核種スキャニング法とも呼称される）は生体構造と臓器の機能の画像化を可能とし、冠動脈疾患、心筋梗塞、弁疾患、心臓移植拒絶反応を検出し、バイパス手術の有効性をチェックし、または血管形成術または冠動脈バイパス移植の患者を選択するために使用することができる。

「冠動脈疾患」および「急性冠動脈症候群」という用語は、本明細書において互換的に使用され、心筋梗塞を指す場合、心血管の状態、疾患または障害を指し、不十分な、望ましくない、または異常な心機能を特徴とするあらゆる障害、例えば、虚血性心臓疾患、高血圧性心臓疾患および肺性高血圧性心臓疾患、弁膜症、先天性心臓疾患および対象、特にヒト対象においてうっ血性心不全に至るあらゆる状態を含む。不十分または異常な心機能は、疾患、傷害および／または加齢の結果であり得る。背景として、心筋の傷害に対する応答は、いくつかの細胞は死ぬが、他の細胞は、細胞が未だ死んではいないが、機能不全である休止状態に入る、明確に定義された経路に従う。この後に炎症性細胞の浸潤、瘢痕化の一部としてのコラーゲンの沈着が続き、それらの全てが新しい血管の内殖およびある程度の継続的細胞死と並行して起こる。

本明細書で使用される場合、「虚血」という用語は、血液の流入の低下に起因するあらゆる局所組織の虚血を指す。「心筋虚血」という用語は、冠動脈アテローム性硬化症および／または心筋への不十分な酸素供給を原因とする循環障害を指す。例えば、急性心筋梗塞は心筋組織への不可逆性虚血性発作を表す。この発作は、冠循環に閉塞性（例えば、血栓性または塞栓性）事象をもたらし、心筋の代謝要求が心筋組織への酸素の供給を越える環境を作り出す。

本明細書において互換的に使用される「組成物」または「医薬組成物」という用語は、当技術分野において従来型であり、哺乳類および好ましくはヒトまたはヒト細胞への投与に適切である医薬的に許容される担体などの賦形剤を通常含む組成物または製剤を指す。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、標的の組織または臓器への直接送達、例えば、標的組織への直接注入またはカテーテル注射による直接送達のために特異的に製剤化され得る。他の実施形態では、組成物は、経口経路、眼球非経口経路、静脈内経路、動脈内経路、皮下経路、鼻腔内経路、舌下経路、髄腔内経路、脳室経路などを含むが、これらに限定されない多数の経路のうちの１つ以上を介する投与のために特異的に製剤化され得る。さらに、局所（例えば、口腔粘膜、呼吸器粘膜）投与および／または経口投与のための組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、丸剤、カプセル剤、持続放出性製剤、含嗽剤、または粉剤を形成することができ、当技術分野において既知であるように本明細書に記載される。その組成物は、安定化剤および保存剤を含むこともできる。担体、安定化剤およびアジュバントの例については、フィラデルフィア科学大学（２００５年） Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ ｗｉｔｈ Ｆａｃｔｓ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｓ，２１ｓｔ Ｅｄ．を参照されたい。

本明細書で使用される場合、「投与する」、「導入する」および「移植する」という用語は互換的に使用され、心筋原性前駆細胞を含む薬学的組成物、または本明細書に記載の分化心筋細胞（例えば、心室心筋細胞）の集団を含む組成物の、薬学的組成物の所望の部位または組織位置での少なくとも部分的な局在化をもたらす方法または経路による、対象への配置を指す。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、対象において有効な治療をもたらす、すなわち投与が細胞の少なくとも一部が所望の標的組織または標的細胞位置に位置する、対象の所望の位置または組織への送達をもたらす、任意の適切な経路によって投与され得る。

本明細書で使用される、「非経口投与」および「非経口投与される」という語句は、通常は注射による、経腸および局所投与以外の投与のモードを意味し、これらには、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、脳室内、被膜内、眼窩内、心内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内、脳内脊髄、および胸骨内注射ならびに注入が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書で使用される、「全身投与」、「全身投与する」、「末梢投与」および「末梢投与する」という語句は、心血管幹細胞および／またはそれらの子孫および／または化合物および／または心組織に向けられる以外の他の材料が、動物の系に入り、したがって、代謝または他の類似のプロセスを受けるような、それらの投与、例えば、皮下または静脈内投与を意味する。

「医薬的に許容される」という語句は、過度の毒性、炎症、アレルギー反応、または他の問題もしくは合併症を伴わずに、妥当な利益／リスク比に見合う、人間および動物の組織との接触で使用するのに好適な、健全な医学的判断の範囲内にあるような化合物、材料、組成物、および／または剤形を指す。

本明細書で使用される「医薬的に許容される担体」という語句は、本明細書において使用される場合、ある臓器、または身体の部分から別の臓器または身体の部分への対象作用物質の移送または輸送に関わる医薬的に許容可能な物質、組成物または液体もしくは固体の充填剤、希釈剤、賦形剤、溶媒もしくはカプセル化物質などのベヒクルを意味する。各担体は製剤の他の成分と適合するという意味で「許容される」でなくてはならない。

本明細書で使用される「薬物」または「化合物」または「試験化合物」という用語は、疾患または状態を治療、または予防または制御するために対象に投与される化学物質もしくは生物学的製剤、または化学物質もしくは生物学的製剤の組み合わせを指す。化学物質または生物学的製剤は、必ずしもそうではないが、低分子量化合物であることが好ましいが、より大きい化合物、例えば、限定されないが、タンパク質、オリゴヌクレオチド、リボザイム、ＤＮＡザイム、糖タンパク質、ｓｉＲＮＡ、リポタンパク質、アプタマー、ならびにそれらの修飾および組み合わせを含む、核酸、アミノ酸、または炭水化物からなるオリゴマーであってもよい。

本明細書で使用される「移植」という用語は、新しい細胞（例えば、再プログラムされた細胞）、組織（再プログラムされた細胞から作り出された分化細胞など）、または臓器の宿主（すなわち、移植レシピエントまたは移植対象）への導入を指す。

本明細書で使用される「ＮＲＰ１と反応性の薬剤」という用語は、ＮＲＰ１と結合するか、ないしは別の方法で相互作用する薬剤を指す。好ましくは、薬剤は、それが他の非ＮＲＰ１タンパク質に結合しないか、またはそれと相互作用しないように、ＮＲＰ１と「特異的に」結合するか、ないしは別の方法で相互作用する。

本明細書で使用される「抗体」という用語は、完全長抗体およびあらゆる抗原結合断片（すなわち、抗原結合部分）またはその単鎖を含む。「抗体」とは、１つの好ましい実施形態では、ジスルフィド結合によって相互接続した少なくとも２つの重（Ｈ）鎖と２つの軽（Ｌ）鎖とを含む糖タンパク質、またはその抗原結合部分を指す。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＶ_Ｈと略記される）と重鎖定常領域とから構成される。重鎖定常領域は、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３から構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＶ_Ｌと略記される）と軽鎖定常領域とから構成される。軽鎖定常領域は、１つのドメイン、ＣＬから構成される。本明細書で使用される抗体の「抗原結合部分」（または簡単に「抗体部分」）は、抗原に特異的に結合するための能力を保持する、抗体の１つ以上の断片を指す。

本明細書で使用される「モノクローナル抗体」という用語は、特定のエピトープに対する単一の結合特異性および親和性を示す抗体を指す。

本明細書で使用される「ヒトモノクローナル抗体」という用語は、単一の結合特異性を示し、かつヒト生殖細胞系の免疫グロブリン配列に由来する可変領域および任意の定常領域を有する抗体を指す。

本明細書で使用される「ヒト化モノクローナル抗体」という用語は、単一の結合特異性を示し、かつヒトフレームワークおよび定常領域中にグラフトされた非ヒト抗体（例えば、マウスモノクローナル抗体）からの重鎖ならびに軽鎖ＣＤＲ１、２、および３を有する抗体を指す。

本明細書で使用される「キメラモノクローナル抗体」という用語は、単一の結合特異性を示し、かつ別の種からの定常領域に連結した１つの種からの重鎖ならびに軽鎖可変領域を有する抗体を指す。

本明細書で使用される「融合タンパク質」という用語は、典型的には、２つの異なるタンパク質、またはその部分が、作動可能に一緒に連結している、組換えＤＮＡ技術を使用して作製された複合タンパク質を指す。非限定的な例は、非免疫グロブリンタンパク質が、免疫グロブリンＦｃ領域に作動可能に連結しているＦｃ融合タンパク質である。

本発明の様々な態様は、以下のサブセクションにさらに詳細に記載される。

ヒト心室前駆細胞を単離する方法
一態様では、本発明は、ヒト心室前駆細胞を単離するための方法に関する。実施例に記載されるように、ＮＲＰ１はここでは、ヒト心室前駆細胞の細胞表面マーカーとして特定されているため、このマーカーは前駆細胞の単離を容易にするために使用することができる。ＮＲＰ１の代わりに、表１、５、および１０に示されるマーカーを含む、ヒト心室前駆細胞に対する追加のマーカーが本明細書で提供されている。細胞表面タンパク質であるこれらの表のタンパク質のいずれも、本明細書に記載されるＨＶＰの単離において使用することができる。

したがって、一実施形態では、本発明は、ヒト心室前駆細胞を単離するための方法を提供し、本方法は、
心臓前駆細胞を含有するヒト細胞の培養物を、ＮＲＰ１と反応性の１つ以上の薬剤と接触させることと、
ＮＲＰ１反応性陽性細胞を、非反応性細胞から分離して、それにより、ヒト心室前駆細胞を単離することと、を含む。

あるいは、接触工程の後、本方法は、非反応性細胞からＮＲＰ１反応性陽性細胞を単離し、それによってヒト心室前駆細胞を単離することを含むことができる。

また実施例に記載されるように、Ｉｓｌｅｔ１は、心室前駆細胞によってＮＲＰ１と共発現するマーカーであるため、両方のマーカーはこれらの前駆細胞の単離を容易にするために使用することができる。したがって、上記方法の別の実施形態では、ヒト細胞の培養物を、Ｉｓｌｅｔ１と反応性の薬剤とも接触させ、ＮＲＰ１反応性／Ｉｓｌｅｔ１反応性陽性細胞が、非反応性細胞から分離され、それにより、心室前駆細胞を単離する。代替として、または加えて、ＪＡＧ１、ＦＺＤ４、ＬＩＦＲ、ＦＧＦＲ３、および／またはＴＮＦＳＦ９が挙げられるが、これらに限定されない他のＨＶＰマーカーと反応性の薬剤は、ＨＶＰの単離においてＮＲＰ１と組み合わせて使用することができる。したがって、ヒト細胞の培養物を、ＮＲＰ１と反応性の薬剤（複数可）および／または、ＪＡＧ１、ＦＺＤ４、ＬＩＦＲ、ＦＧＦＲ３、および／またはＴＮＦＳＦ９が挙げられるが、これらに限定されないＨＶＰマーカー（複数可）と反応性の少なくとも１つの第２の薬剤と同時に接触させることができる。一実施形態では、ヒト細胞の培養物は、ＨＶＰマーカー（複数可）と反応性の第２の薬剤（複数可）と接触する前に、ＮＲＰ１と反応性の薬剤と接触される。別の実施形態では、ヒト細胞の培養物は、ＮＲＰ１と反応性の薬剤と接触する前に、ＨＶＰマーカー（複数可）と反応する第２の薬剤（複数可）と接触される。

別の実施形態では、ＨＶＰを単離する方法は、ＴＲＡ−１−６０などのヒト多能性幹細胞の表面上に発現する少なくとも１つのマーカーを陰性選択することをさらに含む。陰性選択（ＮＲＰ１発現に対する陽性選択、および／または他の陽性ＨＶＰマーカーの発現に加えて）の使用は、ＨＶＰ集団の厳密な定義、ならびにバッチ変動および潜在的な奇形腫を引き起こす細胞の排除を確実にする。したがって、一実施形態では、ＴＲＡ−１−６０などのヒト多能性幹細胞の表面上に発現する少なくとも１つのマーカーの発現の欠如（陰性選択）について心臓前駆細胞を選択し、それによって高度に精製されたＨＶＰの集団を単離する。陰性選択のために使用できるヒト多能性幹細胞の表面に発現するマーカーの非限定的な例としては、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１、ＴＲＡ−２−５４、ＳＳＥＡ１、ＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４、ＣＤ９、ＣＤ２４、Ｅ−カドヘリンおよびポドカリキシン、およびそれらの組み合わせが挙げられる。

別の態様では、本発明は、ヒト心室前駆細胞を単離するための方法を提供し、本方法は、
ヒト多能性幹細胞を、心臓前駆細胞を生成する条件下で培養して、細胞の培養物を得ることと、
細胞の培養物を、ＮＲＰ１と反応性の１つ以上の薬剤と接触させることと、
ＮＲＰ１反応性陽性細胞を、非反応性細胞から分離して、それにより、ヒト心室前駆細胞を単離することと、を含む。

あるいは、培養工程および接触工程の後、本方法は、非反応性細胞からＮＲＰ１を単離し、それによってヒト心室前駆細胞を単離することを含むことができる。

代替として、または加えて、ＪＡＧ１、ＦＺＤ４、ＬＩＦＲ、ＦＧＦＲ３、および／またはＴＮＦＳＦ９が挙げられるが、これらに限定されない他のＨＶＰマーカーと反応性の第２薬剤は、ＨＶＰの単離においてＮＲＰ１と組み合わせて使用することができる。したがって、ヒト細胞の培養物を、ＮＲＰ１と反応性の薬剤（複数可）および／または、ＪＡＧ１、ＦＺＤ４、ＬＩＦＲ、ＦＧＦＲ３、および／またはＴＮＦＳＦ９が挙げられるが、これらに限定されないＨＶＰマーカー（複数可）と反応性の少なくとも１つの第２の薬剤と同時に接触させることができる。一実施形態では、ヒト細胞の培養物は、ＨＶＰマーカー（複数可）と反応性の第２の薬剤（複数可）と接触する前に、ＮＲＰ１と反応性の薬剤と接触される。別の実施形態では、ヒト細胞の培養物は、ＮＲＰ１と反応性の薬剤と接触する前に、ＨＶＰマーカー（複数可）と反応する第２の薬剤（複数可）と接触される。

別の実施形態では、ＨＶＰを単離する方法は、ＴＲＡ−１−６０などのヒト多能性幹細胞の表面上に発現する少なくとも１つのマーカーを陰性選択することをさらに含む。陰性選択（ＮＲＰ１発現に対する陽性選択、および／または他の陽性ＨＶＰマーカーの発現に加えて）の使用は、ＨＶＰ集団の厳密な定義、ならびにバッチ変動および潜在的な奇形腫を引き起こす細胞の排除を確実にする。したがって、一実施形態では、ＴＲＡ−１−６０などのヒト多能性幹細胞の表面上で発現する少なくとも１つのマーカーの発現の欠如（陰性選択）について心臓前駆細胞を選択し、それによって高度に精製されたＨＶＰの集団を単離する。陰性選択のために使用できるヒト多能性幹細胞の表面に発現するマーカーの非限定的な例としては、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１、ＴＲＡ−２−５４、ＳＳＥＡ１、ＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４、ＣＤ９、ＣＤ２４、Ｅ−カドヘリンおよびポドカリキシン、およびそれらの組み合わせが挙げられる。

好ましい実施形態では、ＮＲＰ１と反応性の薬剤は、モノクローナル抗体などの抗ＮＲＰ１抗体である。非限定的な例としては、ＮＲＰ１に対する結合特異性を有するネズミ、ウサギ、ヒト、ヒト化またはキメラモノクローナル抗体が挙げられる。抗ＮＲＰ１モノクローナル抗体は、当技術分野において市販されている。さらに、抗ＮＲＰ１抗体は、抗原としてＮＲＰ１を使用して、当技術分野において十分に確立された標準的な技術を使用して調製することができる。

別の実施形態では、ＮＲＰ１と反応性の薬剤は、可溶性ＮＲＰ１リガンドまたは可溶性ＮＲＰ１リガンド融合タンパク質などのＮＲＰ１リガンドである。ＮＲＰ１リガンドの非限定的な例としては、ＶＥＧＦ−ＡおよびＳｅｍａ３Ａが挙げられる。可溶性ＮＲＰ１リガンドは、標準的な組換えＤＮＡ技術を使用して、例えば、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインの欠失によって調製することができる。可溶性リガンドは、標準的な組換えＤＮＡ技術を使用することによっても、可溶性リガンド融合タンパク質に変換することができる。融合パートナーが融合タンパク質の分離を容易にする結合部分を含むことができる、融合タンパク質を調製することができる。

ＮＲＰ１反応性陽性細胞を非反応性細胞から分離するために、当技術分野において既知の様々な異なる細胞分離技術のうちの１つを使用することができる。好ましくは、ＮＲＰ１反応性陽性細胞は、蛍光活性化細胞選別法（ＦＡＣＳ）によって、非反応性細胞から分離される。ＦＡＣＳ技術、およびそれを実施して細胞を分離するための装置は、当技術分野において十分に確立されている。ＦＡＣＳが細胞分離に使用される場合、使用されるＮＲＰ１と反応性の薬剤（複数可）は、蛍光標識された抗ＮＲＰ１モノクローナル抗体であることが好ましい。あるいは、細胞分離は、例えば、磁気活性化細胞選別法（ＭＡＣＳ）によって達成することができる。ＭＡＣＳが細胞分離に使用される場合、使用されるＮＲＰ１と反応性の薬剤は、抗ＮＲＰ１モノクローナル抗体でコーティングされた磁気ナノ粒子であることが好ましい。あるいは、当技術分野において既知の他の単一細胞選別方法を、ＩｓｏＲａｆｔアレイおよびＤＥＰＡｒｒａｙ技術を含むがこれらに限定されない、本発明の心室前駆細胞を単離する方法に適用することができる。

ＮＲＰ１と反応性の薬剤（複数可）との接触、およびＮＲＰ１反応性細胞の分離の前に、ヒト多能性幹細胞を、心臓前駆細胞の生成をもたらす条件下で培養することができる。心臓前駆細胞を生成するための培養条件は、当技術分野において記載されており（例えば、Ｌｉａｎ，Ｘ．ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０９：Ｅ１８４８−１８５７；米国特許公開第２０１３０１８９７８５号を参照されたい）、また、実施例１および図１、ならびに実施例１０で詳細に記載されている。典型的には、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達は、最初にｈＰＳＣ中で活性化され、その後インキュベーション期間が続き、その後Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達の阻害が続く。Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達の活性化は、Ｇｓｋ３阻害剤、好ましくはＣＨＩＲ９８０１４（ＣＡＳＳ５５６８１３−３９−９）とのインキュベーションにより達成される。Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達の阻害は、Ｐｏｒｃｎ阻害剤、好ましくはＷｎｔ−Ｃ５９（ＣＡＳ１２４３２４３−８９−１）とのインキュベーションにより達成される。本発明の方法で使用するために好適なｈＰＳＣとしては、１９−１１−１、１９−９−７または６−９−９細胞などの誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）（Ｙｕ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２４：７９７−８０１）、およびＥＳ０３細胞（ＷｉＣｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）またはＨ９細胞（Ｔｈｏｍｓｏｎ，Ｊ．Ａ．ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：１１４５−１１４７）などのヒト胚性幹細胞株が挙げられる。心筋原性前駆細胞を生成するために好適な培地としては、Ｅ８培地、ｍＴｅＳＲ１培地、およびＲＰＭＩ／Ｂ２７マイナスインスリンが挙げられ、それぞれは、実施例１および／または実施例１０にさらに記載される。

好ましくは、ヒト心筋原性前駆細胞は、心室前駆細胞である。心筋原性前駆細胞を心室系統に偏らせる培養条件が、ここでは決定されている。これらの心室心筋前駆細胞は、ＲＰＭＩ／Ｂ２７培地中で培養することができ、これらは、さらに心室筋細胞に分化することができる。心室前駆細胞を、これらが心室細胞に分化する（例えば、以下に記載されるＭＬＣ２ｖマーカーの発現する）ようにインビトロで培養するための好ましい培地は、心臓前駆細胞培養（ＣＰＣ）培地（２０％のＫｎｏｃｋＯｕｔ血清代替物、２．５ｍＭのＧｌｕｔａＭａｘ、および１００μｇ／ｍｌのビタミンＣを補充したアドバンストＤＭＥＭ／Ｆ１２）である。

分化した心臓細胞の既知のマーカーを使用して、心臓前駆細胞の分化によって生成される細胞の型（複数可）を特定することができる。例えば、心臓トロポニンＩ（ｃＴｎＩ）は、心筋細胞分化のマーカーとして使用することができる。ＣＤ１４４（ＶＥ−カドヘリン）は、内皮細胞のマーカーとして使用することができる。平滑筋アクチン（ＳＭＡ）は、平滑筋細胞のマーカーとして使用することができる。ＭＬＣ２Ｖは、心室筋細胞のマーカーとして使用することができる。未成熟な心室筋細胞と心房筋細胞との両方で発現するＭＬＣ２ａは、これらの細胞型のマーカーとして使用することができる。さらに、心房筋細胞に特異的に発現するサルコリピンは、心房筋細胞のマーカーとして使用することができる。優勢に心室に発現し、心房での発現の程度が低いホスホランバンもまた、マーカーとしても使用することができる。Ｈｅｙ１とも呼ばれ、心房心筋細胞中に発現するヘアリー関連転写因子１（ＨＲＴ１）は、心房心筋細胞のマーカーとして使用することができる。心室心筋細胞に発現するＨＲＴ２（Ｈｅｙ２）は、心室心筋細胞のマーカーとして使用することができる。加えて、ＩＲＸ４は発生における全ての段階中に、心室制限発現パターンを有しており、したがって、心室系統マーカーとして使用することができる。まとめると、心室に発現する遺伝子、したがって、適切な心室マーカーは、ＭＬＣ２ｖ、ＩＲＸ４、ＨＲＴ２であり、一方、心房に発現する遺伝子、したがって適切な心房マーカーは、ＭＬＣ２ａ、ＨＲＴ１、サルコリピン、ＡＮＦ（心房性ナトリウム利尿因子）である。心室分化の好ましいマーカーは、ＭＬＣ２ｖである。

ヒト心室前駆細胞のクローン集団
別の態様では、本発明は、ヒト心室前駆細胞のクローン集団、ならびにこのような前駆体の単離されたクローン集団を得るための方法を提供する。本発明は、十億個以上の細胞のクローン集団を達成できるように、心室前駆細胞の増殖および繁殖を可能にする。ＮＲＰ１＋心室前駆細胞をこのような多数にクローン的に増殖させる能力は、このような使用には十億個以上ほどの細胞が必要であるため、心機能を強化するためのインビトロでのこれらの細胞の成功利用のために必要な機能である。

したがって、別の態様では、本発明は、ヒト心室前駆細胞のクローン集団を得る方法を提供し、本方法は、
単一のＮＲＰ１＋ヒト心室前駆細胞を単離することと、
単一のＮＲＰ１＋ヒト心室前駆細胞を、細胞が少なくとも１×１０^９個の細胞にまで増殖するような条件下で培養し、それにより、ヒト心室前駆細胞のクローン集団を得ることと、を含む。

好ましい実施形態では、単一のＮＲＰ１＋ヒト心室前駆細胞は、初期培養時に、Ｉｓｌｅｔ１陽性、Ｎｋｘ２．５陰性およびｆｌｋ１陰性である。実施例にさらに記載されるように、このような単一細胞は、心筋原性前駆細胞の生成を促進する条件下での培養のおよそ６日目に得ることができる。ヒト心室前駆細胞のクローン集団は、細胞が心室マーカーＭＬＣ２ｖを発現するように、さらに培養および分化され得る。

好ましくは、単一のＮＲＰ１＋ヒト心室前駆細胞は、蛍光活性化細胞選別法により単離される。あるいは、細胞は、ＭＡＣＳによって単離することができるか、または当技術分野において既知の、および／または本明細書に記載される他の細胞選別法により単離することができる。

好ましくは、単一のＮＲＰ１＋ヒト心室前駆細胞は、本明細書で前述した抗ＮＲＰ１抗体またはＮＲＰ１と反応性の他の薬剤などの、１つ以上の、ＮＲＰ１と反応性の薬剤を使用して単離される。

他の実施形態では、ヒト心室前駆細胞のクローン集団はＮＲＰ１＋であり、ＨＶＰの少なくとも１つの第２のマーカー（例えば、Ｉｓｌ１、ＦＺＤ４、ＬＩＦＲ、ＦＧＦＲ３、ＴＮＦＳＦ９）に対して陽性である。このような二重陽性細胞は、ＮＲＰ１と反応性の薬剤および第２のマーカーと反応性の薬剤の両方を使用する前に、本明細書に記載されるように単離され、クローン的に増殖することができる。

好ましい実施形態では、単一のＮＲＰ１＋ヒト心室前駆細胞は、前述されるように、心臓前駆細胞培養（ＣＰＣ）培地で培養される。

好ましい実施形態では、単一のＮＲＰ１＋ヒト心室前駆細胞は、細胞を心室分化に偏らせるような条件下で培養される。好ましい培養条件は、ＣＰＣ培地中での培養を含む。

様々な実施形態では、単一のＮＲＰ１＋ヒト心室前駆細胞は、少なくとも１×１０^９個の細胞、少なくとも２×１０^９個の細胞、少なくとも３×１０^９個の細胞、少なくとも４×１０^９個の細胞、少なくとも５×１０^９個の細胞、少なくとも６×１０^９個の細胞、少なくとも７×１０^９個の細胞、少なくとも８×１０^９個の細胞、少なくとも９×１０^９個の細胞、または少なくとも１０×１０^９個の細胞にまで増殖することができる。

したがって、本発明はまた、少なくとも１×１０^９個のＮＲＰ１＋ヒト心室前駆細胞のクローン集団を提供し、これらは、ヒト心室前駆細胞のクローン集団を得るための本発明の方法によって得ることができるか、または得られる。様々な実施形態では、ＮＲＰ１＋ヒト心室前駆細胞のクローン集団は、少なくとも１×１０^９個の細胞、少なくとも２×１０^９個の細胞、少なくとも３×１０^９個の細胞、少なくとも４×１０^９個の細胞、少なくとも５×１０^９個の細胞、少なくとも６×１０^９個の細胞、少なくとも７×１０^９個の細胞、少なくとも８×１０^９個の細胞、少なくとも９×１０^９個の細胞、または少なくとも１０×１０^９個の細胞を含む。前駆細胞の心室系統へのインビトロでの分化は、心室系統に向かって偏らせるための本明細書に記載される条件下で培養することにより達成することができる。さらに、心室前駆細胞のインビトロでの移植は、インビトロでの心室分化をもたらす。

本発明はまた、心室前駆細胞のクローン集団を含む医薬組成物を提供する。医薬組成物は、典型的には無菌であり、薬剤投与に好適な緩衝液、媒体、賦形剤などを含むことができる。一実施形態では、クローン集団を含む医薬組成物は、三次元（３Ｄ）マトリックス上に製剤化される。３Ｄマトリックス上に製剤化された組成物は、心筋肉修復のためにインビボで移植できる心筋肉細胞パッチの形成に特に好ましい。さらに、組成物は、Ｄｏｍｉａｎ，Ｉ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２６：４２６−４２９に記載されている筋肉薄膜（ＭＴＦ）などの細胞の２次元（２Ｄ）シートに製剤化することができる。このような細胞組織の２Ｄシートもまた、心筋肉修復のためにインビボで移植できる心筋肉細胞パッチの形成に使用することができる。

ヒト心室前駆体（ＨＶＰ）の生成
前述の方法による分離、および任意に前述の方法によるクローン集団の取得の前に、ヒト心室前駆細胞（ＨＶＰ）の非クローン集団は、ＨＶＰを生成するための適切な培養条件下でヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）を培養することによって得ることができる。例示的な培養条件のセット、および好適な開始細胞は、実施例１および実施例１０に詳細に記載されており、本明細書でヒト心室前駆細胞生成（ＨＶＰＧ）プロトコルとしても称される。好適なｈＰＳＣ開始細胞としては、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、およびＥＳ細胞株などのヒト胚性幹細胞が挙げられる。プロトコルについては、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達が、最初にｈＰＳＣ中で活性化され、その後インキュベーション期間が続き、その後Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達の阻害が続く。Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達活性化は、Ｇｓｋ３阻害剤、好ましくは、ＣＨＩＲ９８０１４（例えば、Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍから市販されている、ＣＡＳ５５６８１３−３９−９）とのインキュベーションにより達成される。Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達阻害は、Ｐｏｒｃｎ阻害剤、好ましくは、Ｗｎｔ−Ｃ５９（ＳｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍまたはＴｏｃｒｉｓなどから市販されている、ＣＡＳ１２４３２４３−８９−１）とのインキュベーションにより達成される。Ｇｓｋ３阻害剤は、心臓中胚葉分化を促進するために使用されるが、一方Ｐｏｒｃｎ阻害剤は、中胚葉細胞からの心室前駆細胞の分化を増強させるために使用される。

したがって、別の態様では、本発明は、Ｇｓｋ３阻害剤、好ましくはＣＨＩＲ９８０１４を含む培地でヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）を少なくとも２４時間、より好ましくは２日間または３日間培養し、続いて、ＨＶＰが生成されるように、少なくとも４８時間、Ｐｏｒｃｎ阻害剤、好ましくはＷｎｔ−Ｃ５９（およびＧｓｋ３阻害剤を欠く）を含む培地でｈＰＳＣを培養することを含む、ヒト心室前駆細胞（ＨＶＰ）を生成する方法を提供する。実験は、ＣＨＩＲ−９８０１４で２４時間処理した後、ｈＰＳＣの９９％以上が中胚葉マーカーのＢｒａｃｈｙｕｒｙを発現し、ＣＨＩＲ−９８０１４で処理した３日後、分化した細胞の９５％以上が心臓中胚葉のマーカーのＭｅｓｐ１を発現することを示した。さらに、Ｗｎｔ−Ｃ５９による４８時間の処置は、中胚葉細胞からの心室前駆細胞の分化を増強させた。

したがって、Ｇｓｋ３およびＰｏｒｃｎ阻害剤の使用のタイミングに関して、典型的には、培養０日目に、ｈＰＳＣはＧｓｋ３阻害剤と共に培養され、培養３日目に培地を交換してＧｓｋ３阻害剤を除去し、次いで、細胞はＰｏｒｃｎ阻害剤を含有する培地で培養５日目まで培養される。ＨＶＰの生成は、培養５〜７日目（両端の値を含む）で最適であり、培養６日目でピークに達する。培養条件およびＧｓｋ３およびＰｏｒｃｎ阻害剤の使用のタイミングに関する他の非限定的な例示的な詳細は、実施例１および１０に詳細に記載されている。

インビボのティッシュエンジニアリング
ヒト心室前駆細胞（ＨＶＰ）がヌードマウスの腎被膜下に移植された実施例６および７に記載されるインビボでの移植研究は、腎被膜の表面上の成熟した機能的なヒトの心室筋の大きな壁に自発的に集合するＨＶＰの能力を実証している。血管新生は、ネズミの脈管構造を心室の室筋壁に呼び込むことによってパラクリン経路を介して生じるが、マトリックスは、前駆体自体から細胞自律的経路を介して生成される。ＨＶＰが正常なネズミ心臓に移植された実施例８に記載さるインビボでの心筋内移植研究では、ＨＶＰが心外膜表面に自発的に移動し、そこで拡大増殖し、その後分化して、成熟して心外膜の表面のヒト心室筋の壁になることを実証している。総合すれば、これらの研究は、精製されたＨＶＰを介したインビボでの完全な細胞自律的経路を介してヒトの心室形成が生じ、それによって臓器対臓器のインビボティッシュエンジニアリングにおけるそれらの使用を可能にすることを示している。

ヒトの心室心筋の再生能力は限られており、そのほとんどは１０歳以降に失われる（Ｂｅｒｇｍａｎｎ，Ｏ．ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｃｅｌｌ １６１：１５６６−１５７５）。かくして、心臓損傷中に心筋肉の修復、再生、およびティッシュエンジニアリングのアプローチを生成する新しい戦略は、再生生物学および医学の徹底的な調査の対象となっている（Ｓａｈａｒａ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．（２０１５）ＥＭＢＯＪ．３４：７１０−７３８；Ｓｅｇｅｒｓ，Ｖ．Ｆ．Ｍ．ａｎｄ Ｌｅｅ，Ｒ．Ｔ．（２００８）Ｎａｔｕｒｅ ４５１：９３７−９４２）。任意の固形臓器のティッシュエンジニアリング中に、協調的な血管新生およびマトリックス形成を達成する必要性を考えると、インビボでの無傷の３−Ｄ固形臓器の形成が、最終的に、血管細胞および／または導管、ならびに整列および収縮力の生成を可能にする生体材料および／または脱細胞化されたマトリックスの追加が最終的に必要になると推論された（Ｆｏｒｂｅｓ，Ｓ．Ｊ．ａｎｄ Ｒｏｓｅｎｔｈａｌ，Ｎ．（２０１４）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．２０：８５７−８６９；Ｈａｒｒｉｓｏｎ，Ｒ．Ｈ．ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇ．Ｐａｒｔ Ｂ Ｒｅｖ．２０：１−１６）。機能的な固形臓器の形成を達成するためのこれらの様々な成分を追加する複雑さは、これを臨床診療に還元する試みを混乱させた（Ｗｅｂｂｅｒ，Ｍ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ａｎｎ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．４３：６４１−６５６）。ｈＰＳＣは、今日まで大きな有望さを有しているが、任意の哺乳動物系において、心臓の表面上に、純粋な、血管新生した、完全に機能的な成熟３Ｄヒト心室筋臓器をインビボで構築することは可能ではなかった（Ｖｕｎｊａｋ−Ｎｏｖａｋｏｖｉｃ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．１３：２４５−２６７）。

ヒトＥＳまたはｉＰＳ細胞株のいずれかの再生可能な供給源から数十億の精製ＨＶＰを生成する能力は、進行型心不全の背景における機能的な心室筋の生成のための新しいアプローチを提示する。前駆体は、心筋内注射によって送達され、次いで、心外膜表面に自己遊走し、その場所で、それらは拡大増殖および分化して、前駆体マーカーを喪失する。数週間の過程のうちに、細胞は細胞周期から退出し、Ｔ管の形成、カテコールアミン応答性、自動能の喪失、整列された筋節構造を有する成体桿状コンフォメーション、およびｈＰＳＣ分化した心筋細胞由来の他の心筋肉パッチと同等な力を生む能力を含む、成熟心室心筋のいくつかの独立したマーカーを示す成体桿状細胞を形成するように進行する（Ｔｕｌｌｏｃｈ，Ｎ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．１０９：４７−５９）。この細胞自律的経路のスケーラビリティは、厚さ１．５ｃｍを超える合わせた厚さを有するヒト心室筋の異所性生成を可能にし、ヒト心室自由壁に対応するレベルに近づいている（Ｂａｓａｖａｒａｊａｉａｈ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｂｒ．Ｊ．Ｓｐｏｒｔｓ Ｍｅｄ．４１：７８４−７８８）。

より後期の段階における成体心臓前駆体の大部分の部位、心外膜ニッチに遊走する能力は、ＨＶＰの独自の特色であり、心室形成中の心室の緻密層（ｃｏｍｐａｃｔ ｚｏｎｅ）の拡大増殖の間のこれらの細胞の正常ニッチを模倣する。以前の研究は、急性虚血性損傷の生成および血管透過性の破壊が、損傷した心筋への比較的少数のＥＳ細胞由来心筋細胞のグラフト化の必要条件であり（ｖａｎ Ｌａａｋｅ，Ｌ．Ｗ．ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．１：９−２４；Ｌａｆｌａｍｍｅ，Ｍ．Ａ．ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２５：１０１５−１０２４）が、その場合にも、生存率が低い（＜５％）（Ｌａｆｌａｍｍｅ，Ｍ．Ａ．ａｎｄ Ｍｕｒｒｙ，Ｃ．Ｅ．（２０１１）Ｎａｔｕｒｅ ４７３：３２６−３３５；Ｌａｆｌａｍｍｅ，Ｍ．Ａ．ｅｔ ａｌ．（２００５）Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１６７：６６３−６７１）ことが示されている。急性虚血性傷害がない場合に心筋内ＨＶＰが心外膜表面に広範な心室パッチを形成する能力は、追加の生体材料、細胞、または外因性遺伝子および／またはＲＮＡの転送を必要とすることなく、拡張型心筋症の新しい治療戦略を提供する。

より後期の前駆体は、心背景または非心背景のいずれかにおいて三次元心室組織の形成能力を示さないため、インビボの正常心臓の心外膜表面上に３Ｄ心室筋肉壁を形成する能力は、傾倒した心室系統を生成すること、ならびに心室形成の特定の段階で特定の心室前駆体を精製することの重要性を強調している。

したがって、本発明は、本明細書に記載されるＨＶＰを使用して、ヒト心室組織をインビボで生成するための方法を提供する。一実施形態では、本方法は、ＮＲＰ１＋前駆体を、非ヒト動物の臓器中に移植することと、ヒト心室組織が生成されるように、これらの前駆体をインビボで成長させることと、を含む。好ましくは、非ヒト動物は、ヒト前駆細胞に対する免疫応答を開始できないように、免疫不全である。一実施形態では、非ヒト動物は、マウス、例えば、免疫不全ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪマウス、または免疫不全ＳＣＩＤ−ベージュマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｆｒａｎｃｅから市販されている）である。一実施形態では、この臓器は、腎臓である（例えば、これらの細胞は、腎臓被膜下に移植される）。別の実施形態では、この臓器は心臓である。様々な実施形態では、少なくとも１×１０^６個の細胞、少なくとも２×１０^６個の細胞、少なくとも３×１０^６個の細胞、少なくとも４×１０^６個の細胞、少なくとも５×１０^６個の細胞、少なくとも１×１０^７個の細胞、少なくとも５×１０^７個の細胞、少なくとも１×１０^８個の細胞、少なくとも１×１０^９個の細胞が移植される。

移植のためのＨＶＰを取得するために、ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）は、本明細書に記載される、ＨＶＰの生成をもたらす条件（本明細書でＨＶＰＧプロトコルと呼ばれる）下でインビトロで培養され得る。インビトロ培養後にＨＶＰを移植するタイミングに関して、最適な心室組織生成のために、これらの細胞は、ＨＶＰＧプロトコルの０日目として定義される培養の開始の数日後に決定される、移植の時点においてＨＶＰによって発現される細胞マーカーに基づいて規定され得る段階において移植すべきである。一実施形態では、これらの細胞は、中胚葉マーカーＭＥＳＰ１のピーク発現として規定され得る心中胚葉形成のピーク後に移植される。典型的には、ＭＥＳＰ１発現は、培養の２日目〜４日目（両端の値を含む）であり、３日目にピークに達する。一実施形態では、これらの細胞は、Ｉｓｌｅｔ１発現のピークに対応する時点で移植される。典型的には、Ｉｓｌｅｔ１は、培養の４日目〜８日目（両端の値を含む）に発現され、培養の６日目にピークに達する。一実施形態では、これらの細胞は、ＮＫＸ２．５発現のピーク前に移植される。典型的には、ＮＫＸ２．５発現は、培養の６日目に始まり、培養の１０日目にピークに達し、次いで、その後維持される。一実施形態では、これらの細胞は、下流遺伝子ＭＥＦ−２およびＴＢＸ−１の発現のピーク前に移植される。典型的には、これらの下流遺伝子は、培養の５日目〜１５日目（両端の値を含む）に発現され、培養の８日目にピークに達する。一実施形態では、これらの細胞は、分化した収縮タンパク質遺伝子の発現前に移植される。典型的には、収縮タンパク質遺伝子（ＴＮＮＴ２およびＭＹＨ６を含む）の発現は、培養の１０日目以降に始まる。ある特定の実施形態では、これらの細胞は、上述のマーカーパターンのうちの２、３つまたは４つが存在するときに、移植される。別の実施形態では、これらの細胞は、上述のマーカーパターンのうちの５つ全てが存在するときに、移植される。一実施形態では、これらの細胞は、培養の４日目〜８日目（両端の値を含む）に移植される。より好ましい実施形態では、これらの細胞は、培養の５日目〜７日目（両端の値を含む）に移植される。最も好ましい実施形態では、これらの細胞は、培養の６日目に移植される。

移植された細胞は、所望のサイズ、量または厚さの心室組織の生成を可能にするために、好適な期間にわたって非ヒト動物中で成長させることができる。様々な実施形態では、これらの細胞は、１週間、２週間、１ヶ月間、２ヶ月間、３ヶ月間、４ヶ月間、５ヶ月間または６ヶ月間にわたって成長させることができる。本方法は、細胞の成長および心室組織への分化後に、この非ヒト動物から心室組織を採取することをさらに含み得る。

心機能を増強する方法
本発明の心室前駆細胞は、細胞を心臓中に直接移植することによって心機能を増強するためにインビボで使用され得る。ＮＲＰ１＋前駆体は、３つ全ての型の心系統細胞（心筋細胞、内皮細胞および平滑筋細胞）へと分化する能力を有することが、本明細書で示されている（実施例３を参照されたい）。さらに、心室系統に偏向させる条件下で培養される場合、ＮＲＰ１＋前駆体は、天然の心室環境中にインビボで移植される場合に、優勢に心室の筋肉表現型をとることが本明細書で示されており、このことは、これらの前駆細胞が心室環境を「認識」し、インビボで適切に応答および分化することを実証している。心室環境への損傷は、心疾患および障害において損なわれた心機能の大きな原因であるので、本発明の心室前駆細胞を使用して心室筋細胞を回復させる能力は、当該分野において顕著な進歩を示す。

したがって、別の態様では、本発明は、対象において心機能を増強する方法を提供し、本方法は、本発明のＮＲＰ１＋心室前駆細胞のクローン集団を含む医薬組成物を、対象に投与することを含む。好ましくは、クローン集団は、対象の心臓に直接投与される。より好ましくは、クローン集団は、対象の心臓の心室領域中に直接投与される。一実施形態では、対象に投与される医薬組成物は、三次元マトリックス上に製剤化されたクローン集団を含む。

対象において心機能を増強するための本発明の方法は、心臓への損傷、または低減もしくは損なわれた心機能が関与する、種々の臨床的状況において使用され得る。このような臨床的状況の非限定的な例としては、心筋梗塞に罹患している対象および先天性心臓障害を有する対象が挙げられる。したがって、別の態様では、本発明は、対象において心血管状態、疾患または障害を処置する方法であって、本発明のＮＲＰ１＋心室前駆細胞のクローン集団を含む医薬組成物を、対象に投与する工程を含む、方法を提供する。治療有効量の心室前駆細胞が、心血管状態、疾患または障害の処置のために投与され得る。好ましい心血管状態、疾患または障害の例としては、冠状動脈疾患および急性冠症候群が挙げられる。

インビトロでの心室前駆細胞の使用の方法
本発明の心室前駆細胞は、心成熟化および分化の種々の態様の研究、特に、心成熟化および分化のプロセスに関与する細胞シグナル伝達経路および生物学的メディエータを同定する際に、インビトロで使用され得る。

さらに、本発明のＮＲＰ１＋心室前駆細胞は、心系統に傾倒しており、さらに、心室分化に偏向されているので、これらの前駆細胞は、試験化合物の心毒性を評価するためにも有用である。全ての潜在的な新たな薬物および治療薬が、ヒトでの使用について安全であるとみなされる前に、心細胞に対するそれらの毒性について評価されなければならない。したがって、インビトロ培養系において心毒性を判定する能力は、非常に有利である。したがって、別の態様では、本発明は、試験化合物の心臓毒性をスクリーニングする方法を提供し、本方法は、
ＮＲＰ１＋ヒト心室前駆細胞を提供することと、
この細胞を試験化合物と接触させることと、
この細胞に対する試験化合物の毒性を測定することと、を含み、
この細胞に対する試験化合物の毒性は、試験化合物の心臓毒性を示す。

好ましい実施形態では、ＮＲＰ１＋ヒト心室前駆細胞は、本明細書に記載される方法に従って細胞を単離することによって提供される。特に好ましい実施形態では、これらの細胞は、抗ＮＲＰ１抗体を使用して、心臓前駆細胞を含む細胞培養物からＮＲＰ１＋細胞を分離することによって単離される。好ましくは、これらの細胞は、本明細書に記載されるように、ＦＡＣＳまたはＭＡＣＳを使用して単離される。さらに別の実施形態では、ＮＲＰ１＋ヒト心室前駆細胞は、試験化合物と接触させる前に、ＭＬＣ２ｖ＋心室細胞へとさらに培養および分化される。

細胞に対する試験化合物の毒性は、細胞生存度または他の生理学的機能を判定するための種々の異なる方法のうちの１つ以上によって測定することができる。好ましくは、細胞生存度に対する試験化合物の影響は、標準的な細胞生存度アッセイを使用して測定され、ここで、試験化合物の存在下で低減された細胞生存度は、試験化合物の心毒性を示す。加えて、または代替として、細胞成長を測定することができる。加えて、または代替として、生理学的機能の他の指標、例えば、細胞接着、細胞シグナル伝達、表面マーカー発現、遺伝子発現などを測定することができる。同様に、生理学的機能のこれらの指標のいずれかに対する試験化合物の負の影響は、試験化合物の心毒性を示す。

本発明は、ヒト心室前駆細胞分化を調節する化合物を同定する方法をさらに提供し、本方法は、
ＮＲＰ１＋ヒト心室前駆細胞を提供することと、
細胞を、試験化合物の存在下または非存在下で培養することと、
細胞の分化を、試験化合物の存在下または非存在下で測定することと、
試験化合物の非存在下での分化と比較して、ヒト心室前駆細胞分化を調節する試験化合物を選択し、それにより、ヒト心室前駆細胞分化を調節する化合物を同定することと、を含む。

一実施形態では、この試験化合物は、ヒト心室前駆細胞分化を刺激する。別の実施形態では、この試験化合物は、ヒト心室前駆細胞分化を阻害する。細胞の分化は、例えば、本明細書に記載されるように、培養された細胞上に出現する分化マーカーの発現の経時的な測定によって測定することができる。好ましい実施形態では、ＮＲＰ１＋ヒト心室前駆細胞は、本明細書に記載される方法に従って細胞を単離することによって提供される。特に好ましい実施形態では、これらの細胞は、抗ＮＲＰ１抗体を使用して、心臓前駆細胞を含む細胞培養物からＮＲＰ１＋細胞を分離することによって単離される。好ましくは、これらの細胞は、本明細書に記載されるように、ＦＡＣＳまたはＭＡＣＳを使用して単離される。

本発明は、ヒト心室心筋細胞機能を調節する化合物を同定する方法をさらに提供し、本方法は、
ＮＲＰ１＋ヒト心室前駆細胞を提供することと、
細胞を、ヒト心室心筋細胞を生成する条件下で、試験化合物の存在下または非存在下で培養することと、
ヒト心室心筋細胞の機能を、試験化合物の存在下または非存在下で測定することと、
試験化合物の非存在下での機能と比較して、ヒト心室心筋細胞機能を調節する試験化合物を選択し、それにより、ヒト心室心筋細胞機能を調節する化合物を同定することと、を含む。

一実施形態では、この試験化合物は、ヒト心室心筋細胞機能を刺激する。別の実施形態では、この試験化合物は、ヒト心室心筋細胞機能を阻害する。細胞の機能は、例えば、Ｔ管の形成、成体−桿状心室心筋細胞の獲得、および電気刺激に応答して力を生む能力が含まれるがこれらに限定されない、心室細胞機能の任意の適切な指標の測定によって測定することができる。心室細胞機能のこのような指標を測定するのに好適なアッセイは、当該技術分野において既知である。好ましい実施形態では、ＮＲＰ１＋ヒト心室前駆細胞は、本明細書に記載される方法に従って細胞を単離することによって提供される。特に好ましい実施形態では、これらの細胞は、抗ＮＲＰ１抗体を使用して、心臓前駆細胞を含む細胞培養物からＮＲＰ１＋細胞を分離することによって単離される。好ましくは、これらの細胞は、本明細書に記載されるように、ＦＡＣＳまたはＭＡＣＳを使用して単離される。

ヒト心室前駆細胞を使用したインビボ動物モデル
心疾患のヒトｉＰＳおよびＥＳ細胞ベースのモデルの開発は、心血管薬物の開発および発見における新たな展望を開いている。しかしながら、現在まで、これらの系は、培養細胞系における２Ｄ構造に基づいているという制限を有してきた。加えて、細胞の胎児特性および未熟特性が、成体心臓に対するそれらの有用性および忠実度を制限している。ヒト心疾患、特に心不全は、治療標的として既知の部位である、環境性、ホルモン性および他の重要な臓器、例えば腎臓によって影響される、複雑な多因子性の多臓器疾患である。異所的に、またはインタクトな正常マウス心臓の表面上のいずれかに成熟した機能的なヒト心室臓器を構築する能力は、通常は成熟ヒト心室筋腔に対してアッセイされ得るだけの研究を可能にするための、新たなインビボモデル系、例えば、心室不整脈、収縮力の発生、線維症、および再生のための潜在力を開拓する。したがって、インビトロ組織培養系を離れて、インビボで心不全の背景において直接的にヒト心疾患を研究するための選択肢が、本明細書では明らかに可能である。

したがって、ヒト心室前駆細胞は、例えば、試験化合物の心毒性をインビボで決定するため、またはヒト心組織の分化もしくは機能を調節する化合物をインビボで同定するための、ヒト心組織機能のインビボ判定および化合物のインビボスクリーニングを可能にする動物モデルを創出するためにも使用することができる。したがって、本発明は、本明細書に記載されるＨＶＰを使用してヒト心室組織に対する試験化合物の影響をインビボで試験するための方法を提供する。一実施形態では、本方法は、
ＮＲＰ１＋ヒト心室前駆細胞を非ヒト動物の臓器に移植することと、
ヒト心室組織が生成されるように、前駆体をインビボで成長させることと、
試験化合物を非ヒト動物に投与することと、
非ヒト動物におけるヒト心室組織に対する試験化合物の影響を評価することと、を含む。

別の実施形態では、本方法は、
試験化合物を非ヒト動物に投与することであって、この非ヒト動物が、非ヒト動物の臓器中に移植されたＮＲＰ１＋ヒト心室前駆体を含む、投与することと、
非ヒト動物におけるＮＲＰ１＋ヒト心室前駆体に対する試験化合物の影響を評価することと、を含む。

一実施形態では、試験化合物の心毒性は、例えば、非ヒト動物における、ヒト心室組織またはＮＲＰ１＋ヒト心室前駆体の生存度に対する（試験化合物の非存在下での組織または前駆体の生存度と比較した）試験化合物の影響を測定することによって評価される。細胞生存度は、当該分野において既知の標準的な方法によって判定することができる。

別の実施形態では、試験化合物の心分化を調節するための能力は、例えば、非ヒト動物における、ヒト心室組織またはＮＲＰ１＋前駆体の分化に対する（試験化合物の非存在下での組織または前駆体の分化と比較した）試験化合物の影響を測定することによって評価することができる。細胞の分化は、例えば、細胞上に出現する分化マーカーの発現の経時的な測定によって測定することができる。

別の実施形態では、試験化合物の心機能を調節するための能力は、例えば、非ヒト動物における、ヒト心室組織またはＮＲＰ１＋ヒト前駆体の機能に対する（試験化合物の非存在下での組織または前駆体の機能と比較した）試験化合物の影響を測定することによって評価することができる。組織または前駆体の機能は、例えば、Ｔ管の形成、成体−桿状心室心筋細胞の獲得、および電気刺激に応答して力を生む能力が含まれるがこれらに限定されない、心室細胞機能の任意の適切な指標の測定によって測定することができる。心室細胞機能のこのような指標を測定するのに好適なアッセイは、当該技術分野において既知である。

好ましくは、非ヒト動物は、ヒト前駆細胞に対する免疫応答を開始できないように、免疫不全である。一実施形態では、非ヒト動物は、マウス、例えば、免疫不全ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪマウス、または免疫不全ＳＣＩＤ−ベージュマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｆｒａｎｃｅから市販されている）である。一実施形態では、この臓器は、腎臓である（例えば、これらの細胞は、腎臓被膜下に移植される）。別の実施形態では、この臓器は心臓である。様々な実施形態では、少なくとも１×１０^６個の細胞、少なくとも２×１０^６個の細胞、少なくとも３×１０^６個の細胞、少なくとも４×１０^６個の細胞、少なくとも５×１０^６個の細胞、少なくとも１×１０^７個の細胞、少なくとも５×１０^７個の細胞、少なくとも１×１０^８個の細胞、少なくとも１×１０^９個の細胞が移植される。

動物モデルを創出するために、移植のためのＨＶＰが、ＨＶＰの生成をもたらす条件下でｈＰＳＣをインビトロで培養することによって、上記のように取得することができる。インビトロ培養後にＨＶＰを移植するタイミングに関して、最適な心室組織生成のために、これらの細胞は、ＨＶＰＧプロトコルの０日目として定義される培養の開始の数日後に決定される、移植の時点においてＨＶＰによって発現される細胞マーカーに基づいて規定され得る段階において移植すべきである。一実施形態では、これらの細胞は、中胚葉マーカーＭＥＳＰ１のピーク発現として規定され得る心中胚葉形成のピーク後に移植される。典型的には、ＭＥＳＰ１発現は、培養の２日目〜４日目（両端の値を含む）であり、３日目にピークに達する。一実施形態では、これらの細胞は、Ｉｓｌｅｔ１発現のピークに対応する時点で移植される。典型的には、Ｉｓｌｅｔ１は、培養の４日目〜８日目（両端の値を含む）に発現され、培養の６日目にピークに達する。一実施形態では、これらの細胞は、ＮＫＸ２．５発現のピーク前に移植される。典型的には、ＮＫＸ２．５発現は、培養の６日目に始まり、培養の１０日目にピークに達し、次いで、その後維持される。一実施形態では、これらの細胞は、下流遺伝子ＭＥＦ−２およびＴＢＸ−１の発現のピーク前に移植される。典型的には、これらの下流遺伝子は、培養の５日目〜１５日目（両端の値を含む）に発現され、培養の８日目にピークに達する。一実施形態では、これらの細胞は、分化した収縮タンパク質遺伝子の発現前に移植される。典型的には、収縮タンパク質遺伝子（ＴＮＮＴ２およびＭＹＨ６を含む）の発現は、培養の１０日目以降に始まる。ある特定の実施形態では、これらの細胞は、上述のマーカーパターンのうちの２、３つまたは４つが存在するときに、移植される。別の実施形態では、これらの細胞は、上述のマーカーパターンのうちの５つ全てが存在するときに、移植される。一実施形態では、これらの細胞は、培養の４日目〜８日目（両端の値を含む）に移植される。より好ましい実施形態では、これらの細胞は、培養の５日目〜７日目（両端の値を含む）に移植される。最も好ましい実施形態では、これらの細胞は、培養の６日目に移植される。

移植された細胞は、所望のサイズ、量または厚さの心室組織の生成を可能にするために、試験化合物の投与の前に、適切な期間にわたって非ヒト動物中で成長させることができる。様々な実施形態では、これらの細胞は、１週間、２週間、１ヶ月間、２ヶ月間、３ヶ月間、４ヶ月間、５ヶ月間または６ヶ月間にわたって成長させることができる。

本発明は、さらなる限定として解釈すべきではない以下の実施例によってさらに説明される。図面、ならびに本出願を通じて引用される全ての参考文献、特許および公開された特許出願の内容は、参照によって明示的に本明細書に組み込まれる。

実施例１：ヒト多能性幹細胞におけるＷｎｔシグナル伝達の調節によるヒトＩｓｌ１＋心筋原性前駆細胞の生成
古典的Ｗｎｔシグナル伝達の一時的調節は、多数のｈＰＳＣ株から、高い収量かつ純度で機能的心筋細胞を生成するのに十分であることが示されている（Ｌｉａｎ，Ｘ．ｅｔ ａｌ．（２０１２年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ１０９：Ｅ１８４８−１８５７頁；Ｌｉａｎ，Ｘ．ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．８：１６２−１７５）。このプロトコルについては、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達が、最初にｈＰＳＣ中で活性化され、その後インキュベーション期間が続き、その後Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達の阻害が続く。元々公開されたプロトコルでは、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達の活性化は、Ｇｓｋ３阻害剤ＣＨＩＲ９９０２１（ＧＳＫ−３α、ＩＣ_５０＝１０ｎＭ；ＧＳＫ−３、βＩＣ_５０＝６．７ｎＭ）とのインキュベーションによって達成され、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達の阻害は、Ｐｏｒｃｎ阻害剤ＩＷＰ２（ＩＣ_５０＝２７ｎＭ）とのインキュベーションによって達成されていた。本発明者らは、心分化のためにＧｓｋ３阻害剤およびＷｎｔ産生阻害剤を使用したので、このプロトコルをＧｉＷｉプロトコルと称した。元のプロトコルの効率を改善し、元のプロトコルにおいて使用した小分子の潜在的副作用を低減させるために、より高い阻害効力を有する小分子の別のセットを使用する第２世代プロトコルを開発した。この第２世代ＧｉＷｉプロトコルでは、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達の活性化を、Ｇｓｋ３阻害剤ＣＨＩＲ９８０１４（ＣＡＳ ５５６８１３−３９−９；例えば、Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍから市販されている）（ＧＳＫ−３α、ＩＣ_５０＝０．６５ｎＭ；ＧＳＫ−３、βＩＣ_５０＝０．５８ｎＭ）とのインキュベーションによって達成し、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達の阻害を、Ｐｏｒｃｎ阻害剤Ｗｎｔ−Ｃ５９（ＣＡＳ １２４３２４３−８９−１；例えば、ＳｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍまたはＴｏｃｒｉｓから市販されている）（ＩＣ_５０＝７４ｐＭ）とのインキュベーションによって達成した。Ｇｓｋ３阻害剤ＣＨＩＲ９８０１４を使用して、心中胚葉分化を促進し、Ｐｏｒｃｎ阻害剤Ｗｎｔ−Ｃ５９を使用して、中胚葉細胞からの心室前駆体分化を増強した。

これらの小分子の使用を介した心筋細胞分化のために、ｈＰＳＣを、Ｅ８培地（Ｃｈｅｎ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ，８：４２４−４２９に記載される；ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから市販）またはｍＴｅＳＲ１培地（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから市販）中で、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）コーティングされたプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）上で維持した。好適なｈＰＳＣとしては、１９−１１−１、１９−９−７または６−９−９細胞などの誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）（Ｙｕ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｓｃｉｅｎｃｅ３２４：７９７−８０１）、およびＥＳ０３（ＷｉＣｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）およびはＨ９細胞（Ｔｈｏｍｓｏｎ，Ｊ．Ａ．ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：１１４５−１１４７）などのヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）が挙げられる。

ｍＴｅＳＲ１培地中でＭａｔｒｉｇｅｌコーティングされた表面上で維持したｈＰＳＣを、３７℃で５分間Ａｃｃｕｔａｓｅ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて単一の細胞へと解離させ、次いで、５μＭのＲＯＣＫ阻害剤Ｙ−２７６３２（Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ）を補充したｍＴｅＳＲ１培地中１００，０００〜２００，０００細胞／ｃｍ^２で、Ｍａｔｒｉｇｅｌコーティングされた細胞培養皿上に２４時間播種した（−２日目）。 次いで、細胞を、毎日交換して、ｍＴｅＳＲ１中で培養した。次いで、０日目に、細胞を、ＲＰＭＩ／Ｂ２７−ｉｎｓ（１０ｍｌ Ｂ２７補充物を含みインスリンを含まない５００ｍｌ ＲＰＭＩ）中で、１μＭのＧｓｋ３阻害剤ＣＨＩＲ９８０１４（Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ）で２４時間（０日目〜１日目）処理した。次いで、培地を、３日目に、２μＭのＰｏｒｃｎ阻害剤Ｗｎｔ−Ｃ５９（Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ）を含む対応する培地に交換し、これを次いで、５日目に培地交換の間に除去した。細胞を、７日目から開始してＲＰＭＩ／Ｂ２７（ストック溶液：５００ｍｌ ＲＭＰＩ培地＋１０ｍｌ Ｂ２７補充物）中で維持し、３日毎に培地を交換した。心筋原性前駆細胞を生成するためのこの例示的な培養プロトコルは、図１中に模式的に示される。

フローサイトメトリーおよび免疫染色を実施して、特定の系統マーカーの発現を検査した。ＣＨＩＲ−９８０１４による２４時間の処理後、ｈＰＳＣの９９％超が、中胚葉マーカーブラキュリを発現した。ＣＨＩＲ−９８０１４による処理の３日後、分化した細胞の９５％超が、心中胚葉を示すＭｅｓｐ１を発現した。この培養プロトコルは、ｃＴｎＴフローサイトメトリーおよび電気生理学分析によって決定したように、細胞を心中胚葉系統へと同調的に分化させただけでなく、１４日間の分化後に９０％超の心室筋細胞を再現性よく生成した。

ｈＰＳＣの心分化を経時的にさらに判定するために、ウエスタンブロット分析を、０〜７日目および１１日目に実施して、Ｉｓｌ１およびＮｋｘ２．５（心筋原性前駆体マーカー）およびｃＴｎＩ（心筋細胞マーカー）の発現を検査した。細胞を、Ｈａｌｔ Ｐｒｏｔｅａｓｅ ａｎｄ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｃｏｃｋｔａｉｌ（Ｐｉｅｒｃｅ）の存在下で、Ｍ−ＰＥＲ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｉｅｒｃｅ）中で溶解させた。タンパク質を、変性条件下で１０％のＴｒｉｓ−グリシンＳＤＳ／ＰＡＧＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって分離し、ニトロセルロース膜に移した。ＴＢＳＴ中５％の粉乳でブロッキングした後、膜を、一次抗体と共に４℃で一晩インキュベートした。次いで、この膜を洗浄し、抗マウス／ウサギペルオキシダーゼコンジュゲート化二次抗体と共に室温で１時間インキュベートし、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ化学発光（Ｐｉｅｒｃｅ）によって発色させた。結果を図２に示す。ｈＰＳＣの心分化の間、Ｉｓｌ１発現は、４日目に始まり、６日目にその最大発現まで増加したが、ＮＫｘ２．５は、６日目になってやっと発現され始め、１０日目の後にその最大発現に達した。心筋細胞（ｃＴｎＩ＋細胞）は、分化の１１日目まで誘導されなかった。

加えて、６日目の細胞の免疫染色を、Ｉｓｌ１発現について実施した。細胞を、４％ホルムアルデヒドを用いて室温で１５分間固定し、次いで、ＰＢＳ＋０．４％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００および５％の脱脂粉乳（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）中の一次抗体（抗Ｉｓｌ１）および二次抗体で染色した。核を、ＤＡＰＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と共にＧｏｌｄ Ａｎｔｉ−ｆａｄｅ Ｒｅａｇｅｎｔを用いて染色した。ＱＩｍａｇｉｎｇ（登録商標）Ｒｅｔｉｇａ ４０００Ｒカメラを用いた落射蛍光顕微鏡（Ｌｅｉｃａ ＤＭ ＩＲＢ）を、画像分析に使用した。結果は、かなりの数のＩｓｌ１＋細胞を示した。

Ｉｓｌ１発現についての６日目の細胞のフローサイトメトリー分析もまた実施した。細胞を、Ａｃｃｕｔａｓｅを１０分間用いて単一の細胞へと解離させ、次いで、１％のパラホルムアルデヒドで室温で２０分間固定し、ＰＢＳ、０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００および０．５％のＢＳＡ中の一次抗体および二次抗体で染色した。データを、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｅｒフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で収集し、ＦｌｏＪｏを使用して分析した。図３に示される結果は、この段階において細胞の９５％超がＩｓｌ１を発現したことを示した。

まとめると、この実施例は、６日以内の効率的に数十億のＩｓｌ１＋ヒトＨＰＶの大規模産生を可能にする、ヒト心室前駆体生成のためのプロトコル（ＨＶＰＧプロトコル）を提供する。

実施例２：心臓前駆細胞の細胞表面マーカーとしてのＪａｇｇｅｄ１の同定
心分化プロセスの間に生じる転写変化をゲノム規模レベルでプロファイリングするために、ＲＮＡ配列決定（ＲＮＡ−ｓｅｑ）を、分化後の異なる時点において実施して、心発生転写景観を構築した。本発明者らは、０日目〜７日目の試料、ならびに１９日目および３５日目の試料に対して、ＲＮＡ−ｓｅｑ実験を実施した（１つの時点につき２つの独立した生物学的複製）。２バッチのＲＮＡ−ｓｅｑ（１００ｂｐおよび５０ｂｐのリード長さ）を、ｉｌｌｕｍｉｎｅ Ｈｉｓｅｑ ２０００プラットホームを使用して実施した。合計で、２０の試料を検査した。ＢｏｗｔｉｅおよびＴｏｐｈａｔを使用して、本発明者らのリードを参照ヒトゲノム（ｈｇ１９）へとマッピングし、本発明者らは、ＲＰＫＭ法（リード／転写物１キロベース／１００万リード）を使用して、各遺伝子発現（Ｒｅｆｓｅｑに従う遺伝子のアノテーション）を計算した。心筋細胞へのｈＰＳＣの分化には、５つの主要な細胞型が関与する：多能性幹細胞（０日目）、中胚葉前駆体（１日目〜２日目）、心中胚葉細胞（３日目〜４日目）、心臓原基前駆体（５日目、６日目および７日目）、および心筋細胞（１０日目の後）。

ＨＶＰＧプロトコルを使用したｈＰＳＣからの心分化の分子ｍＲＮＡ分析により、分化の間の多能性マーカーＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧおよびＳＯＸ２の下方調節を伴う、遺伝子発現におけるダイナミックな変化が明らかとなった。原始線条様遺伝子ＴおよびＭＩＸＬ１の誘導が、ＣＨＩＲ−９８０１４添加後の最初の２４時間以内に生じ、その後、２日目および３日目に、心中胚葉マーカーＭＥＳＰ１の上方調節が続いた。心筋マーカーＴＮＮＴ２、ＴＮＮＣ１、ＭＹＬ２、ＭＹＬ７、ＭＹＨ６、ＭＹＨ７およびＩＲＸ４の発現が、分化のより後期の段階（１０日目の後）に検出された。

この分析によって、中胚葉細胞、心臓前駆体および心筋細胞を含む各分化段階において富化された遺伝子が同定された。１日目の分化した細胞と関連する中胚葉細胞は、ブラキュリを発現する。本発明者らは、ＦＺＤ１０、ＣＤ４８、ＣＤ１Ｄ、ＣＤ８Ｂ、ＩＬ１５ＲＡ、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ、ＴＮＦＳＦ１３、ＩＣＯＳＬＧ、ＳＥＭＡ７Ａ、ＳＬＣ３Ａ２、ＳＤＣ１、ＨＬＡ−Ａを含む、中胚葉細胞についての潜在的表面マーカーを同定した。類似の分析によって、本発明者らは、ＣＸＣＲ４、ＡＮＰＥＰ、ＩＴＧＡ５、ＴＮＦＲＳＦ９、ＦＺＤ２、ＣＤ１Ｄ、ＣＤ１７７、ＡＣＶＲＬ１、ＩＣＡＭ１、Ｌ１ＣＡＭ、ＮＧＦＲ、ＡＢＣＧ２、ＦＺＤ７、ＴＮＦＲＳＦ１３Ｃ、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂを含む、心中胚葉ｍｅｓｐ１陽性細胞についての表面マーカーもまた同定した。

ウエスタンブロット分析と一致して、ＩＳＬ１ ｍＲＮＡは、早くも４日目に発現され、そのタンパク質発現がそのピークに達する１日前の５日目にピークに達した。分化の５日目（心臓前駆体段階、５日目にｉｓｌ１ ｍＲＮＡ発現最大、６日目にｉｓｌ１タンパク質発現最大）、５日目の富化された遺伝子を、抗ＣＤ抗体アレイ（３５０の既知のＣＤ抗体のパネル）と比較し、多数の可能性のある細胞表面タンパク質マーカーを同定した。本発明者らは、ＦＺＤ４、ＪＡＧ１、ＰＤＧＦＲＡ、ＬＩＦＲ（ＣＤ１１８）、ＴＮＦＳＦ９、ＦＧＦＲ３を含む、この段階で発現された多くの細胞表面タンパク質を同定した。

細胞表面タンパク質Ｊａｇｇｅｄ１（ＪＡＧ１）およびＦｒｉｚｚｌｅｄ４（ＦＺＤ４）を、さらなる分析のために選択した。Ｊａｇｇｅｄ１発現を、以下ならびに実施例３および４に記載されるようにさらに研究した。Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４発現を、実施例５に記載されるようにさらに研究した。

最初に、Ｉｓｌ１およびＪａｇ１の発現を、二重染色フローサイトメトリー技術を使用してプロファイリングした。フローサイトメトリー分析を、二重染色のために抗Ｉｓｌ１抗体および抗Ｊａｇ１抗体を使用して、本質的に実施例１に記載されるように実施した。結果を図４に示す。Ｊａｇｇｅｄ１発現は、分化の６日目に、Ｉｓｌｅｔ１の発現を追跡することが見出され、Ｉｓｌｅｔ１陽性細胞の全ては、Ｊａｇｇｅｄ１もまた発現し、逆もまた同様であった。これら２つのマーカーの共発現パターンにより、Ｊａｇｇｅｄ１抗体を使用して、９９．８％の純度のＩｓｌｅｔ１＋Ｊａｇｇｅｄ１＋細胞へと、９４．１％のＩｓｌｅｔ１＋細胞の分化した集団を富化した。

Ｉｓｌｅｔ１は、ＨＶＰにおけるＩＳＬ１およびＮＫＸ２．５発現の二重免疫染色を使用して、Ｎｋｘ２．５遺伝子よりも早期の発生遺伝子であることもまた確認された。精製されたＨＶＰは、ＩＳＬ１遺伝子を均一に発現するが、この段階では、これらの細胞のうちのほんのわずかだけが、Ｎｋｘ２．５を発現し始めた。

さらに、抗Ｉｓｌ１および抗Ｊａｇ１の両方による免疫染色を、４週目ヒト胎児心臓組織、新生児心臓組織および８歳心臓組織に対して、本質的に実施例１に記載されるように実施した。これらの結果により、インビボの胎児心臓において、Ｉｓｌｅｔ１陽性細胞の全てがＪａｇｇｅｄ１もまた発現したことが明らかになった。しかしながら、新生児心臓および８歳心臓は、Ｉｓｌｅｔ１またはＪａｇｇｅｄ１も発現しなかった。４週目ヒト胎児心臓の心室において、心筋トロポニンＴ（ｃＴｎＴ）染色により、可視的な筋節構造が明らかになった。加えて、４週目胎児心臓中の心室細胞の５０％超が、Ｉｓｌｅｔ１およびＪａｇｇｅｄ１の両方を発現し、これは、ヒト新生児心臓の心室筋細胞におけるＩｓｌｅｔ１およびＪａｇｇｅｄ１の両方の発現の喪失を伴って、その後の成熟化の間に顕著に減少した。

上記実験は、Ｊａｇｇｅｄ１がＩｓｌｅｔ１陽性心筋原性前駆細胞についての細胞表面マーカーであることを実証している。

実施例３：Ｉｓｌ１＋Ｊａｇ１＋心臓前駆細胞のクローン性分化
Ｉｓｌ１＋Ｊａｇ１＋細胞のクローン性分化潜在力を特性化するために、心筋原性前駆細胞を、実施例１に記載される培養プロトコルによって生成し、１つの単一のＩｓｌ１＋Ｊａｇ１＋細胞を、Ｍａｔｒｉｇｅｌコーティングされた４８ウェルプレートの１つのウェル中に播種した。細胞を、Ｊａｇ１の抗体を用いて精製し、次いで、１つの単一の細胞を、１つのウェル中に播種した。次いで、単一の細胞を、心臓前駆体培養（ＣＰＣ）培地（２．５ｍＭのＧｌｕｔａＭＡＸ、１００μｇ／ｍｌのビタミンＣ、２０％のノックアウト血清代替物を補充したアドバンストＤＭＥＭ／Ｆ１２）中で３週間培養した。

次いで、３週目の分化細胞集団の免疫染色を、３つの抗体：心筋細胞について心筋トロポニンＩ（ｃＴｎ１）、内皮細胞についてＣＤ１４４（ＶＥ−カドヘリン）、および平滑筋細胞について平滑筋アクチン（ＳＭＡ）を用いて実施した。これらの結果は、単一の細胞から培養されたＩｓｌ１＋Ｊａｇ１＋細胞が、ｃＴｎＩ陽性およびＳＭＡ陽性細胞を生じさせたが、ＶＥ−カドヘリン陽性内皮細胞は生じさせなかったことを示しており、このことは、これらの生成されたＩｓｌｅｔ１＋細胞が、内皮系統への限定的な分化潜在力を有する心筋前駆体であることを示している。ヒト誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ １９−９−１１株）からＨＶＰＧプロトコルによって分化された精製されたＩｓｌｅｔ１＋Ｊａｇｇｅｄ１＋細胞もまた、類似のインビトロ分化潜在力を示し、ｃＴｎＩ＋ＳＭＡ＋細胞へと優勢に分化するが、ＶＥ−カドヘリン＋細胞へは分化しない。数週間の過程のうちに、細胞は、心室特異的マーカーＭＬＣ２ｖを発現し、このことは、初期のＩＳＬ１＋サブセットが心室細胞になることが既に決まっていたことを示している。ＨＶＰＧプロトコルを使用して生成されたＩｓｌｅｔ１＋細胞の限定的な脈管分化潜在力に起因して、これらの生成されたＩｓｌｅｔ１＋細胞は、心血管細胞の３つ全ての系統を生じさせ得る、以前に報告されたＫＤＲ＋集団（Ｙａｎｇ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｎａｔｕｒｅ ４５３：５２４−５２８）または複能性ＩＳＬ１＋細胞（Ｂｕ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｎａｔｕｒｅ ４６０：１１３−１１７；Ｍｏｒｅｔｔｉ，Ａ．ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｃｅｌｌ １２７：１１５１−１１６５）とは別個の前駆体集団を示し得る。

これらの結果は、Ｉｓｌ１＋Ｊａｇ１＋心筋原性前駆細胞が、心筋細胞優位で、心系統細胞の３つ全ての型を含む顕著に拡大増殖された細胞集団（１×１０^９細胞以上）へと、単一の細胞からインビトロで首尾よく培養され得ることを実証した。さらに、これらの細胞は、延長された期間にわたって、少なくとも２〜３週間にわたって、さらには数ヶ月間（例えば、６カ月間以上）にわたって、インビトロで培養され得る。心筋原性前駆細胞は、増殖しない心筋細胞へと徐々に分化するので、およそ２〜３週間の培養期間が好ましい。

実施例４：Ｉｓｌ１＋Ｊａｇ１＋心臓前駆細胞のインビボ発生潜在力
ＥＳ０３ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）株（ＷｉＣｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅから取得した）は、心特異的ｃＴｎＴプロモーターによって駆動される緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現する。ＥＳ０３細胞を使用して、実施例１に記載される培養プロトコルを使用して、Ｉｓｌ１＋Ｊａｇ１＋心筋原性前駆細胞を生成した。これらのＩｓｌ１＋Ｊａｇ１＋心筋原性前駆細胞を、重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）ベージュマウスの心臓中に移植して、インビボでのそれらの発生潜在力を立証した。

簡潔に言うと、Ｉｓｌ１＋Ｊａｇ１＋細胞を、開胸手順においてＮＯＤ／ＳＣＩＤ−ガンママウスの左心室壁中に直接注射した（レシピエント１匹当たり１，０００，０００個の細胞）。心臓を、手術の２〜３週間後に採取し、１％のＰＦＡ中で固定し、１０μｍで切片化した（ｎ＝１２）。移植されたマウスの心臓の組織学的分析により、落射蛍光および抗ＧＦＰ抗体による染色によって検出されたＧＦＰ＋ドナー細胞の存在が明らかになり、このことは、Ｉｓｌ１＋Ｊａｇ１＋心筋原性前駆細胞が、インビボで移植された場合に心筋細胞へと分化することが可能であったことを実証している。

Ｉｓｌ１＋Ｊａｇ１＋心筋原性前駆細胞を、同様に移植された正常マウスと比較して、ＳＣＩＤベージュマウス（「傷害されたマウス」）の梗塞した心臓中にも、直接移植した。２週間後に分析した場合、Ｉｓｌ１＋Ｊａｇ１＋心筋原性前駆細胞が移植された傷害されたマウスは、同様に移植した正常マウスよりも大きいグラフトサイズを有し、このことは、Ｉｓｌ１＋Ｊａｇ１＋心筋原性前駆細胞のインビボでの心筋細胞再生能力を実証している。

実施例５：心臓前駆細胞の細胞表面マーカーとしてのＦｒｉｚｚｌｅｄ４の同定
実施例２に記載されるように、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４（ＦＺＤ４）は、ＲＮＡ−ｓｅｑ分析によって心臓前駆細胞において発現することが同定された。したがって、心臓前駆細胞の細胞表面マーカーとしてＦＺＤ４を確認するために、ＦＺＤ４発現を、ウエスタンブロット分析を介して心分化の間に判定した。図５に示される結果は、ＦＺＤ４が、多能性幹細胞および最初の３日間の分化した細胞においては発現されなかったことを実証した。しかしながら、ＦＺＤ４は、４日目に発現され始め、発現の５日目にその発現を最大化する。

単一の細胞のレベルでＦＺＤ４およびＩｓｌ１の共発現パターンを定量化するために、ＦＡＣＳ分析を実施した。図６に示されるように、分化の５日目に、細胞の８３％超が、ｉｓｌ１およびＦＺＤ４の両方を発現し、このことは、ＦＺＤ４が、ＧｉＷｉプロトコルを使用した心臓前駆体分化の間のｉｓｌ１陽性細胞についての細胞表面マーカーであることを実証している。

ＪＡＧ１およびＦＺＤ４の両方がヒト心室前駆細胞上でＩＳＬ１と共に実際に共発現されたことを確認するために、ｈＰＳＣ由来の６日目の分化した細胞の三重免疫蛍光分析を、Ｉｓｌｅｔ１、Ｊａｇｇｅｄ１およびＦｒｉｚｚｌｅｄ４に対する抗体を用いて実施した。この三重染色実験により、Ｉｓｌ１＋細胞がＪａｇｇｅｄ１およびＦｒｉｚｚｌｅｄ４の両方を発現したことが実証された。

実施例６：ヒト心室前駆体（ＨＰＶ）は、インビボで３Ｄ心室心筋臓器を生成する
心室の心筋腔の構築は、ヒト臓器形成の間の最も重要かつ早期の工程のうちの１つであり、遊走、増殖、血管新生、アセンブリおよびマトリックス整列を含む、一連の協調された工程を必要とする。ＨＶＰがインビボで心室形成を駆動する能力を試験するために、本発明者らは、免疫不全マウスの腎臓被膜下に、精製されたＨＶＰまたは未精製のＨＶＰ（９２．０±１．９％ ＩＳＬ１＋）を移植した。移植の２カ月後に、未精製のＨＶＰを移植した動物は、腫瘍を形成し、１００％の腫瘍形成効率（１００％、４／４）を生じたが、精製されたＨＶＰを移植した動物は、いずれの腫瘍も形成しなかった（０％、０／１０）。

精製されたＨＶＰが生着した腎臓を、組織学的分析のためにさらにアッセイした。ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色により、マウス腎臓の表面上に、長さが０．５ｃｍを超え、厚さが１ｍｍ超の、心室特異的マーカーＭＬＣ２ｖを均一に発現した臓器が明らかになった（Ｏ´Ｂｒｉｅｎ，Ｔ．Ｘ．ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５１５７−５１６１）。得られたヒト筋肉臓器は、完全に血管新生し、赤血球が血管中で検出できた。ｃＴｎＴ、ＭＬＣ２ｖおよびＭＬＣ２ａ免疫染色の分析により、移植されたＨＶＰが心筋肉細胞（ｃＴｎＴ＋細胞）へと分化しただけではなく、さらに成熟して、ＭＬＣ２ａ発現について陰性のＭＬＣ２ｖ＋心室筋細胞になることが、さらに明らかになった。得られた心室筋肉臓器は、その血管新生がＨＶＰ由来のパラクリン合図を介して生じたという見解と一致して、ネズミ由来脈管細胞によって完全に血管新生する。

構造化された血管が、ＶＥ−カドヘリンおよび平滑筋アクチン発現に対する抗体の免疫染色分析によって明らかになった。加えて、ラミニンγ−１鎖を標的化するヒト特異的モノクローナルラミニン抗体を使用して、ＨＶＰは、それらの細胞外マトリックスとして、それら自身のヒトラミニンを分泌した（マウス腎臓領域は、ヒトラミニン免疫染色について陰性である）。加えて、本発明者らは、モノクローナルヒトフィブロネクチン抗体を使用して、ヒトフィブロネクチン発現が血管の近傍のエリアに限定されることを見出した。

後期段階の心細胞が心室形成を駆動する能力を判定するために、ＮＫＸ２．５＋細胞（分化後１０日目）を、免疫不全ＮＳＧマウスの腎臓被膜下に移植した。移植の３週間後に、ＮＫＸ２．５＋細胞を移植した動物は、いずれの可視的なヒト筋肉グラフトも形成せず、このことは、ＨＶＰが、Ｉｓｌｅｔ−１発現のピーク後にインビボ心室形成のためのそれらの能力を喪失することを示している。

総合すれば、これらの研究は、ＨＶＰが、それら自身の心ラミニン由来マトリックス、ならびに新生心室臓器への脈管構造を安定化するように機能するフィブロネクチンを、合成および放出できることを示している。

実施例７：ＨＶＰは、細胞自律的経路を介してインビボで、成熟した機能性の心室筋臓器を創出する
ヒト心生物学および疾患の研究のためのｈＰＳＣの有用性についての重要な制限の１つは、成熟度の欠如および胎児アイソフォームの発現の持続である。ＨＶＰ由来の臓器が機能的な成熟した心室筋肉になることができるかどうかを決定するために、長期移植研究を実施し、その後、Ｔ管の形成（Ｂｒｅｔｔｅ，Ｆ．ａｎｄ Ｏｒｃｈａｒｄ，Ｃ．（２００３）Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．９２：１１８２−１１９２頁；Ｍａｒｋｓ，Ａ．Ｒ．（２０１３）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１２３：４６−５２）、操作された心室組織の他の研究と同等な力を生む能力、自動能の喪失、および成体−桿状心室心筋細胞の獲得を含む、成体心室心筋の十分に受容された特色のパネルの詳細な分析を行った。

精製されたＨＶＰの移植の５カ月後に、腫瘍は、本発明者らの動物の全てにおいて形成されなかった。動物を屠殺し、生着した腎臓を、さらなる分析のために取り出した。５カ月目のヒトグラフトは、半径０．４ｃｍ（直径０．８ｃｍ）を有する半球構造であった。５カ月目のヒトグラフトについての体積は、腎臓１つにつきほぼ０．１３ｃｍ^３であり、この体積は、インビボヒト成体心臓と同等の厚さを達成するヒト心室筋肉を生成することの実現可能性を示唆している。桿状成熟ヒト心室筋細胞が、ヒト筋肉臓器において観察された。加えて、本発明者らの成熟ヒト筋肉臓器から採取した筋条片は、電気刺激に応答して力（０．３６±０．０４ｍＮ）を生み出し、β−アドレナリンアゴニストイソプレナリンによる処理後にそれらの力発生を増加させた（０．５１±０．０２ｍＮ、対照と比較してｐ＜０．０５）。総合すれば、これらの研究は、ＨＶＰが、細胞自律的経路を介して、すなわち、他の細胞、遺伝子、マトリックスタンパク質または生体材料の添加なしに、完全に機能的な成熟ヒト心室筋肉臓器をインビボで生成することが可能であることを示している。

実施例８：ＨＶＰは、心外膜ニッチに向かって遊走し、正常マウス心臓の表面上でヒト心室筋肉パッチをインビボで自発的に形成する
心外膜は、緻密層拡大増殖の間に心室腔の成長を駆動し、ならびに心筋傷害後に増殖でき、既知の脈管細胞運命スイッチ、例えばＶＥＧＦに応答して脈管形成を駆動できる成体心外膜前駆体のホームとして機能する、心臓前駆体のための既知のニッチである（Ｇｉｏｒｄａｎｏ，Ｆ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９８：５７８０−５７８５；Ｍａｓｔｅｒｓ，Ｍ．ａｎｄ Ｒｉｌｅｙ，Ｐ．Ｒ．（２０１４）Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．１３：６８３−６９２；Ｚａｎｇｉ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１：８９８−９０７）。ＨＶＰが正常心臓の心外膜表面へと自発的に遊走し得るかどうかを決定するために、精製された緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）標識ＨＶＰを、免疫不全マウスの心臓中に心筋内注射した。移植の１週間後または１カ月後、動物を屠殺し、生着した心臓を組織学のために取り出した。移植の１週間後、ＧＦＰ＋細胞の大部分は、心筋中で保持された。しかしながら、ほぼ全てのＧＦＰ＋細胞が、移植の１ヶ月後に心外膜に遊走した。加えて、ＧＦＰ＋細胞は、移植の１週間後にＩＳＬ１＋かつＫｉ６７＋であった。

Ｉｓｌｅｔ１＋細胞の分化潜在力を追跡するために、ｃＴｎＴプロモーター駆動性の緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）発現性ｈＥＳＣ株（Ｈ９−ｃＴｎＴ−ＧＦＰ）から生成された精製されたＩＳＬ１＋ＪＡＧ１＋細胞を、重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）ベージュマウスの心臓中に移植して、インビボでのそれらの発生潜在力を立証した。ＳＣＩＤベージュマウスの心臓の心室中へ直接のＩｓｌ１＋Ｊａｇ１＋細胞の移植の１カ月後、ヘマトキシリンおよびエオシン染色により、マウス心臓の心外膜中に存在するヒト筋条片グラフトが明らかになった。さらに、免疫組織学的分析により、落射蛍光および抗ＧＦＰ抗体による染色によって検出されるＧＦＰ＋ドナー細胞の存在が明らかになった。より重要なことに、ＭＬＣ２ｖおよびＭＬＣ２ａの抗体を用いて分析した場合、グラフトされたヒト筋条片は、ＭＬＣ２ｖについて陽性（細胞＋の１００％）であり、心房マーカーＭＬＣ２ａについて陰性であり、このことは、移植されたＩＳＬ１＋細胞が、心筋細胞へとさらに分化しただけでなく、心室筋細胞にもなったことを示している。

総合すれば、合わせると、これらの研究は、ＨＶＰが心外膜ニッチへと遊走でき、その場所で増殖し、引き続いて、再び外因性の細胞、遺伝子、マトリックスまたは生体材料の添加なしに、均質な心室筋肉パッチへと分化することを示している。

実施例９：さらなる実験材料および方法
この実施例では、実施例１〜８において使用した実験材料および方法に関するさらなる詳細が提供される。

ｈＰＳＣの維持
ｈＥＳＣ（ＥＳ０３、Ｈ９）およびヒトｉＰＳＣ（１９−９−１１）を、以前に公開された方法（Ｌｉａｎ，Ｘ．ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｎａｔ．Ｐｒｏｃ．８：１６２〜１７５；Ｌｉａｎ，Ｘ．ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ３１：４４７〜４５７）に従って、ｍＴｅＳＲ１培地（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中でＭａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）コーティングしたプレート上で維持した。

ヒト心室前駆体生成（ＨＶＰＧ）プロトコル
ｍＴｅＳＲ１中でＭａｔｒｉｇｅｌコーティングされた表面上で維持したｈＰＳＣを、３７℃で１０分間Ａｃｃｕｔａｓｅを用いて単一の細胞へと解離させ、次いで、５μＭのＲＯＣＫ阻害剤Ｙ−２７６３２を補充したｍＴｅＳＲ１中１００，０００〜２００，０００細胞／ｃｍ^２で、Ｍａｔｒｉｇｅｌコーティングされた細胞培養ディッシュ上に２４時間播種した（−２日目）。−１日目に、細胞をｍＴｅＳＲ１中で培養した。０日目に、細胞を、インスリン非含有Ｂ２７を補充したＲＰＭＩ（ＲＰＭＩ／Ｂ２７−ｉｎｓ）中１μＭのＣＨＩＲ−９８０１４（Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ）で２４時間（０日目〜１日目）処理し、次いで、これを、１日目に培地交換の間に除去した。３日目に、培地の半分を、２μＭのＷｎｔ−Ｃ５９（Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ）を含むＲＰＭＩ／Ｂ２７−ｉｎｓ培地に交換し、次いで、これを、５日目に培地交換の間に除去した。６日目に、細胞を、単一の細胞へと解離させ、抗ＪＡＧ１抗体または抗ＦＺＤ４抗体を用いて精製した。

ＲＮＡ−ｓｅｑライブラリ構築
ＲＮＡを単離し（ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ ｋｉｔ、Ｑｉａｇｅｎ）、定量化し（Ｑｕｂｉｔ ＲＮＡ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、品質制御した（ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ ２１００、Ａｇｉｌｅｎｔ）。各試料由来のＲＮＡ（８００ｎｇ）を、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＴｒｕＳｅｑ ｍＲＮＡ Ｓａｍｐｌｅ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ ｖ２（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）のためのインプットとして使用し、配列決定ライブラリを、製造者のプロトコルに従って創出した。簡潔に言うと、ポリ−Ａ含有ｍＲＮＡ分子を、ポリ−Ｔオリゴが結合した磁性ビーズを使用して精製した。精製後、ｍＲＮＡを断片化し、ランダムプライマーおよび逆転写酵素を使用して第１鎖相補的ＤＮＡへとコピーした。次いで、第２鎖ｃＤＮＡ合成を、ＤＮＡポリメラーゼＩおよびＲＮａｓｅ Ｈを使用して実施した。ｃＤＮＡをアダプターにライゲーションさせ、ＰＣＲで富化して、最終ｃＤＮＡライブラリを創出した。このライブラリをプールし、製造者の指示に従ってＨｉＳｅｑ ２０００（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）機器で配列決定した。

ＲＮＡ−ｓｅｑデータ処理
ＲＮＡ−ｓｅｑのリードをトリミングし、Ｔｏｐｈａｔ ２を使用してｈｇ１９参照にマッピングした。平均して、およそ２，３００万リードが１試料当たり生成され、これらのリードのうち７６％が、独自にマッピングされた。各遺伝子についての発現レベルを、ｐｙｔｈｏｎ ｓｃｒｉｐｔ ｒｐｋｍｆｏｒｇｅｎｅｓを使用して定量化し、ＲｅｆＳｅｑを使用してアノテーションした。少なくとも１０リードを有する少なくとも１つの試料がない遺伝子を、分析から除去した。Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｎａｌｙｓｉｓおよびヒートマップを、それぞれ、ＲおよびＧｅｎｅ−Ｅを使用して構築した。

移植
２００万の精製されたＨＶＰのアリコートを、エッペンドルフチューブ中に収集した。細胞を遠心分離し、上清を廃棄した。細胞の各チューブを、以前に記載されたプロトコル（Ｓｈｕｌｔｚ，Ｌ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７４：６４７７−６４８９）に従って、それぞれ免疫不全マウス、ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪまたはＳＣＩＤ−ベージュ（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｆｒａｎｃｅ）の腎臓被膜下に移植したか、またはそれらの心臓中に心筋内注射した。生着した腎臓または心臓を、組織学的分析および生理学的分析のために、種々の時間間隔で採取した。

フローサイトメトリー
細胞を、Ａｃｃｕｔａｓｅを１０分間用いて単一の細胞へと解離させ、次いで、１％のパラホルムアルデヒドで室温で２０分間固定し、ＰＢＳ＋０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００および０．５％のＢＳＡ中の一次抗体および二次抗体で染色した。データを、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｅｒフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で収集し、ＦｌｏｗＪｏを使用して分析した。

免疫染色
細胞を、４％パラホルムアルデヒドを用いて室温で１５分間固定し、次いで、ＰＢＳ＋０．４％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００および５％の脱脂粉乳（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）中の一次抗体および二次抗体で染色した。核を、ＤＡＰＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と共にＧｏｌｄ Ａｎｔｉ−ｆａｄｅ Ｒｅａｇｅｎｔを用いて染色した。落射蛍光顕微鏡および共焦点顕微鏡（ＺＥＩＳＳ、ＬＳＭ ７００）を、画像分析に使用した。

ウエスタンブロット分析
細胞を、Ｈａｌｔ Ｐｒｏｔｅａｓｅ ａｎｄ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｃｏｃｋｔａｉｌ（Ｐｉｅｒｃｅ）の存在下で、Ｍ−ＰＥＲ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｉｅｒｃｅ）中で溶解させた。タンパク質を、変性条件下で１０％のＴｒｉｓ−グリシンＳＤＳ／ＰＡＧＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって分離し、ニトロセルロース膜に移した。ＴＢＳＴ中５％の粉乳でブロッキングした後、膜を、一次抗体と共に４℃で一晩インキュベートした。次いで、この膜を洗浄し、抗マウス／ウサギペルオキシダーゼコンジュゲート化二次抗体と共に室温で１時間インキュベートし、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ化学発光（Ｐｉｅｒｃｅ）によって発色させた。

電気生理学（パッチクランピング）
拍動する心室筋細胞クラスターを、顕微解剖し、記録前にガラスカバースリップ上に再プレートした。活動電位活性を、１２０ｍＭのＫ Ｄ−グルコネート、２５ｍＭのＫＣｌ、４ｍＭのＭｇＡＴＰ、２ｍＭのＮａＧＴＰ、４ｍＭのＮａ２−ホスホ−クレアチン、１０ｍＭのＥＧＴＡ、１ｍＭのＣａＣｌ２および１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（２５℃でＨＣｌによってｐＨ７．４に調整した）からなる細胞内溶液を満たしたホウケイ酸ガラスピペット（４〜５Ｍオームの抵抗）を使用して判定した。カバースリップディッシュ上に播種した培養した心筋細胞を、１４０ｍＭのＮａＣｌ、５．４ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのグルコース、１．８ｍＭのＣａＣｌ２および１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（２５℃でＮａＯＨによってｐＨ７．４に調整した）を含む細胞外溶液（タイロード溶液）中に浸した。自発的活動電位を、１ｋＨｚでローパスフィルタをかけたＭｕｌｔｉｃｌａｍｐ ７００Ｂ増幅器（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）ソフトウェアを使用して実施したパッチクランプ技術（全細胞、電流固定構成）を使用して３７℃で記録し、デジタル化し、Ｄｉｇｉｄａｔａ １３２２ＡおよびＣｌａｍｐｅｘ ９．６ソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して保存した。

統計
データは、平均±平均値の標準誤差（ＳＥＭ）として示される。統計的有意性を、２つの群間のスチューデントｔ検定（両側）によって決定した。ｐ＜０．０５を統計的に有意とみなした。

実施例１０：ゼノフリー（Ｘｅｎｏ−Ｆｒｅｅ）ヒト心室前駆体分化プロトコル
この実施例では、規定されたゼノフリー培養培地、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ８を利用する、ヒト心室前駆体の分化のための代替的分化プロトコルが提供される。Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ８培地は、ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）の成長および増殖のために開発したものであり、Ｃｈｅｎ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ８：４２４−４２９（この中では「Ｅ８」培地と呼ばれる）中にさらに記載されている。

Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ８培地中でビトロネクチン（またはラミニン５２１）コーティングされた表面上で維持したｈＰＳＣを、３７℃で１０分間Ｖｅｒｓｅｎｅ溶液を用いて単一の細胞へと解離させ、次いで、５μＭのＲＯＣＫ阻害剤Ｙ−２７６３２を補充したＥｓｓｅｎｔｉａｌ ８培地中１００，０００〜２００，０００細胞／ｃｍ^２で、ビトロネクチン（またはラミニン５２１）コーティングされた細胞培養皿上に２４時間播種した（−２日目）。−１日目に、細胞をＥｓｓｅｎｔｉａｌ ８培地中で培養した。０日目に、細胞を、ＲＰＭＩ中０．５μＭのＣＨＩＲ−９８０１４で２４時間（０日目〜１日目）処理し、次いで、これを、１日目に培地交換の間に除去した。３日目に、培地の半分を、０．５μＭのＷｎｔ−Ｃ５９を含むＲＰＭＩ培地に交換し、次いで、これを、５日目に培地交換の間に除去した。６日目に、細胞（ヒト心室前駆体）を、単一の細胞へと解離させ、抗ＪＡＧ１抗体または抗ＦＺＤ４抗体を用いて精製した。あるいは、細胞を、抗ＬＩＦＲまたは抗ＦＧＦＲ３抗体で精製する。

実施例１１：生着可能なヒト心室前駆細胞に対する血管新生マーカー
この実施例では、ヒト心室前駆細胞（ＨＶＰ）に発現する血管新生ファミリーの遺伝子を同定した。ＨＶＰを、実施例１または１０に記載される通りに生成し、ＲＮＡ配列決定（ＲＮＡ−ｓｅｑ）を、実施例１に記載される通りに、分化後の異なる時点で実施した。ＨＶＰ分化の間の遺伝子発現プロファイルのクラスター分析は、段階依存的なシグネチャー遺伝子を同定した。これらの遺伝子を、それらの発現プロファイルの類似性に基づいて、階層的にクラスター化した。最初に、４つの異なるカテゴリーでの発現を示す遺伝子を同定した：（ｉ）細胞表面発現、（ｉｉ）Ｉｓｌｅｔ１との共発現、（ｉｉｉ）分化の５日目での高発現、および（ｉｖ）高いｄ５／ｄ０比。この分析は、ＪＡＧ１、ＦＺＤ４、ＦＧＦＲ３、ＬＩＦＲ（ＣＤ１１８）およびＴＮＦＳＦ９のＨＶＰに対する細胞表面タンパク質を確認した。次に、細胞表面マーカーを同定したＨＶＰの同じ集団から、遺伝子個体発生探索を実施して、このＨＶＰの集団で発現された血管新生ファミリー遺伝子を同定し、それにより、細胞生着に重要な遺伝子を同定する遺伝子フィンガープリントプロファイルを同定した。

統計的に、Ｉｓｌ１発現とのピアソンの相関を使用して、ＨＶＰ中の疎の発現がＩＩｓｌ１発現と最も相関するような血管新生遺伝子を同定した。以下の表１は、０．５０以上のピアソン相関を有する、Ｉｓｌ１発現と相関する血管新生遺伝子を列挙している。

以下の表２は、０．４９〜０．００のピアソン相関を有する、Ｉｓｌ１発現と相関する血管新生遺伝子を列挙している。

その発現がＨＶＰ中のＩｓｌ１発現と負の相関関係にある血管新生遺伝子も同定した。以下の表３は、−０．５０以下のピアソン相関を有する、Ｉｓｌ１発現と負の相関関係にある血管新生遺伝子を列挙している。

以下の表４は、−０．０１〜−０．４９のピアソン相関を有する、Ｉｓｌ１発現と相関する血管新生遺伝子を列挙している。

実施例１２：生着可能なヒト心室前駆細胞に対する細胞外マトリックスマーカー
この実施例では、ヒト心室前駆細胞（ＨＶＰ）に発現する細胞外マトリックスファミリーの遺伝子を同定した。ＨＶＰを、実施例１または１０に記載される通りに生成し、ＲＮＡ配列決定（ＲＮＡ−ｓｅｑ）を、実施例１に記載される通りに、分化後の異なる時点で実施した。ＨＶＰ分化の間の遺伝子発現プロファイルのクラスター分析は、段階依存的なシグネチャー遺伝子を同定した。これらの遺伝子を、それらの発現プロファイルの類似性に基づいて、階層的にクラスター化した。最初に、４つの異なるカテゴリーでの発現を示す遺伝子を同定した：（ｉ）細胞表面発現、（ｉｉ）Ｉｓｌｅｔ１との共発現、（ｉｉｉ）分化の５日目での高発現、および（ｉｖ）高いｄ５／ｄ０比。この分析は、ＪＡＧ１、ＦＺＤ４、ＦＧＦＲ３、ＬＩＦＲ（ＣＤ１１８）およびＴＮＦＳＦ９のＨＶＰに対する細胞表面タンパク質を確認した。次に、細胞表面マーカーを同定したＨＶＰの同じ集団から、遺伝子個体発生探索を実施して、このＨＶＰの集団で発現された細胞外マトリックスファミリー遺伝子を同定し、それにより、細胞生着に重要な遺伝子を同定する遺伝子フィンガープリントプロファイルを同定した。

統計的に、Ｉｓｌ１発現とのピアソンの相関を使用して、ＨＶＰ中の疎の発現がＩｓｌ１発現と最も相関するような細胞外マトリックス遺伝子を同定した。以下の表５は、０．５０以上のピアソン相関を有する、Ｉｓｌ１発現と相関する細胞外マトリックス遺伝子を列挙している。

以下の表６は、０．４９〜０．００のピアソン相関を有する、Ｉｓｌ１発現と相関する細胞外マトリックス遺伝子を列挙している。

その発現がＨＶＰ中のＩｓｌ１発現と負の相関関係にある細胞外マトリックス遺伝子も同定した。以下の表７は、−０．５０以下のピアソン相関を有する、Ｉｓｌ１発現と負の相関関係にある細胞外マトリックス遺伝子を列挙している。

以下の表８は、−０．０１〜−０．４９のピアソン相関を有する、Ｉｓｌ１発現と相関する細胞外マトリックス遺伝子を列挙している。

実施例１３：６日目のＩｓｌｅｔ１陰性細胞についての遺伝子発現プロファイル
この実施例では、６日目のＨＶＰ集団内のＩｓｌｅｔ１陰性細胞について、遺伝子発現プロファイルを決定し、必要なマーカーを発現しない６日目の集団内の細胞のサブ集団をさらに特性化し、生着可能なＨＶＰとみなした。６日目のＨＶＰ集団を、実施例１または１０に記載される通りに生成し、ＲＮＡ配列決定（ＲＮＡ−ｓｅｑ）を、実施例２に記載される通りに、分化後に実施した。Ｉｓｌｅｔ１陰性（Ｉｓｌ１−）である細胞を、それらの遺伝子発現プロファイルに関してさらに分析した。２０００以上の平均ＲＮＡコピー数を有するＩｓｌ１−細胞で圧減された遺伝子を、以下の表９に示している。

したがって、表９に示されたデータは、移植に好適ではなく、したがって、移植および生着のために細胞を選択する場合に選択するべきではない、６日目のＨＶＰ集団内のＩｓｌｅｔ１陰性の生着不能な細胞についての遺伝子発現プロファイルを提供する。

実施例１４：ＨＶＰの単一細胞配列決定
この実施例では、単一細胞配列決定を、分化の４、５、６、８、９または１５日目に実施し、それにより分化の異なる段階において個々の細胞中で発現された遺伝子を同定した。バルク中の細胞集団の配列決定は、その集団内の細胞のサブタイプをマスクすることができる。単一細胞配列決定は、集団内の細胞型を分類するために偏りのないアプローチを提供する。

本明細書で使用される単一細胞配列決定アプローチは、３つの工程：ライブラリ調製、配列決定および分析から構成される。ライブラリ調製については、単一細胞を収集して溶解した。ＲＮＡトランスクリプトームを捕捉し、ＤＮＡに変換し、配列決定用に準備した。細胞の補足されたトランスクリプトームは、「ライブラリ」と呼ばれる。配列決定を、次世代シーケンサーを使用して実施した。分析については、配列を読み取り、遺伝子にマッピングした。これが、核細胞についてのトランスクリプトームワイドな発現プロファイルを作り出した。次いで、発現プロファイルを互いに比較した。類似に細胞を、一緒に「クラスター化」して、細胞型を再現した。

単一細胞愛列決定に使用するための単一細胞を得るために、ＨＶＰ分化を、前に記載されたように行った（実施例１および１０を参照されたい）。４、５、６、８、９および１５日目からの細胞を、トリプシン処理後に収集し、口ピペットで手作業で拾い上げた。毎日、１２８個の細胞を拾い上げた。単一細胞のライブラリ調製を、Ｓｍａｒｔ−ｓｅｑ２プロトコルを使用して以前に記載されたように実施した（Ｐｉｃｅｌｌｉ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ １０：１０９６−１０９８）。単一細胞ライブラリを、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ ２５００配列決定システムで配列決定した。ＢｏｗＴｉｅを使用して、読み取り値をヒトゲノムにマッピングした（Ｌａｎｇｍｅａｄ，Ｂ．ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ．１０（３）：Ｒ２５）．Ｓｅｕｒａｔパッケージを使用して、データ分析を行った（Ｓａｊｉｔａ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３３：４９５−５０２）。

ｔ−ＳＮＥ次元削減を使用して、４、５、６、８、９および１５日目に対するデータを可視化し、４つの主な細胞型：非心臓集団、上皮様集団、心臓前駆体および心筋細胞を観察した。心臓前駆体の発現が変動している遺伝子を、ＳｅｕｒａｔパッケージのＦｉｎｄＭａｒｋｅｒ機能を使用して抽出した。パラメータは、心臓前駆体クラスター内の細胞の少なくとも１０％で発現された心臓前駆体クラスターにおいて発現が変動している遺伝子であった。心臓前駆体クラスターにおいて発現が変動している遺伝子のリストを、以下の表１０に示している。

遺伝子のリストから、ニューロピリン１（ＮＲＰ１）を、ＨＶＰの陽性細胞の選別のための候補として選択した。ＭＡＣＳ選別に適合する抗ＮＲＰ１抗体は市販されている。

５日目に発現されたＲＮＡが、これらの細胞が生着し得る重要なウインドウである６日目に翻訳されるために、５日目のデータセットをさらに検討した。図１１に示した５日目のデータセットのｔＳＮＥプロットは、類似の発現パターンを有する細胞の２つのクラスターが、０および１と任意にラベル付けされたことを明らかにしている。クラスター内の細胞は、類似の遺伝子を発現する。異なるクラスター内の細胞は、異なる遺伝子を発現する。ｔＳＮＥのプロット上の各細胞間の距離は、それらの遺伝子発現プロファイルにおける差異の程度を表している。１とラベルされたクラスターは、高レベルのＩｓｌ１発現を有する。

図１２は、５日目のＩｓｌ１およびＮＲＰ１の発現を示しており、ここでは、濃い灰色は、高発現を示し、中間の灰色は、低発現を示し、薄い灰色は、発現がないことを示している。したがって、図１２は、高レベルのＩｓｌ１発現を有する細胞の多くが、高レベルのＮＲＰ１発現も有することを実証している。

これは、図１３に示したＩｓｌ１およびＮＲＰ１の発現レベルのバイオリンプロットによって確認された。クラスター１内の細胞（図１１に示した）は、高レベルのＩｓｌ１の発現を有する。図１３のバイロンプロットは、Ｉｓｌ１＋細胞およびＮｒｐ１＋細胞が、これらが類似する遺伝子発現プロファイルを有するために、同じクラスター内にあることを実証している。したがって、ＮＲＰ１は、ＨＶＰの陽性選択（例えば、５〜６日目のＩｓｌ１＋ＨＶＰ）のために好適な細胞表面マーカーである。

実施例１５：ＮＲＰ１＋ＨＶＰのさらなる特性化
この実施例では、ヒト胚性幹細胞株でのＮＲＰ１の発現をさらに検討した。Ｈ９幹細胞株（当該技術分野においては、ＷＡ０９としても知られる；Ｔｈｏｍｓｏｎ，Ｊ．Ａ．ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：１１４５−１１４７；ＷｉＣｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）を、これらの実験に使用した。Ｈ９細胞を、心臓分化条件下で培養し（例えば、本明細書で実施例１および１０に記載されるように）、６日目のヒト心室前駆細胞（ＨＶＰ）を生成した。

実験の第１のセットでは、Ｈ９細胞からの６日目のＨＶＰを、抗ＮＲＰ１、抗ＴＲＡ−１−６０、または抗ＮＲＰ１および抗ＴＲＡ−１６０の両方で染色し、続いてフローサイトメトリー分析を行った。これらを結果を、図１４Ａ（ＮＲＰ１＋細胞についての単一染色）、図１４Ｂ（ＴＲＡ−１−６０＋細胞についての単一染色）および図１４Ｃ（ＮＲＰ１＋ＴＲＡ−１−６０＋細胞についての二重染色）に示している。これらの結果は、６日目のＨＶＰの９２％がＮＲＰ１＋であり、６日目のＨＶＰの１７％がＴＲＡ−１−６０＋であると判定した。二重染色分析は、ＮＲＰ１＋集団のうちで、これらの細胞１５．５％がＴＲＡ−１−６０＋であると判定した。

実験の第２のセットでは、Ｈ９細胞からの６日目のＨＶＰを、抗ＮＲＰ１、抗ＩＳＬ１、または抗ＮＲＰ１および抗ＩＳＬ１の両方で染色し、続いてフローサイトメトリー分析を行った。これらを結果を、図１５Ａ（ＮＲＰ１＋細胞についての単一染色）、図１５Ｂ（ＩＳＬ１＋細胞についての単一染色）および図１５Ｃ（ＮＲＰ１＋ＩＳＬ１＋細胞についての二重染色）に示している。これらの結果は、６日目のＨＶＰの７８％がＮＲＰ１＋であり、６日目のＨＶＰの８０％がＩＳＬ１＋であり、６日目のＨＶＰの７３％がＮＲＰ１＋ＩＳＬ１＋であると判定した。

これらの結果は、大多数の６日目のＨＶＰの表面上のＮＲＰ１の発現、ならびにＩＳＬ１とＴＲＡ−１−６０との共発現を確認し、それにより、ＮＲＰ１の陽性選択としての好適性、ＩＳＬ１の陽性共選択マーカーとしての好適性、およびＴＲＡ−１−６０の陰性選択マーカーとしての好適性を確認している。

等価物
当業者は、慣用的実験にすぎないものを使用して、本明細書に記載される発明の具体的実施形態の多くの等価物を認識し、またはそれらを確認することができる。このような等価物は、以下の特許請求の範囲によって包含されることを意図する。

Claims (53)

1. ヒト心室前駆細胞を単離するための方法であって、前記方法が、
   心臓前駆細胞を含有するヒト細胞の培養物を、ニューロピリン−１（ＮＲＰ１）と反応性の１つ以上の薬剤と接触させることと、
   ＮＲＰ１反応性陽性細胞を、非反応性細胞から分離して、それにより、ヒト心室前駆細胞を単離することと、を含む、方法。
2. 前記ヒト細胞の培養物が、ヒト心室前駆細胞と反応性の少なくとも１つの第２の薬剤とさらに接触され、ＮＲＰ１反応性／第２の薬剤反応性陽性細胞が、非反応性細胞から分離され、それにより、ヒト心室前駆細胞を単離する、請求項１に記載の方法。
3. 前記少なくとも１つの第２の薬剤が、ＪＡＧ１、ＦＺＤ４、ＬＩＦＲ、ＦＧＦＲ３および／またはＴＮＦＳＦ９と反応性である、請求項２に記載の方法。
4. 前記ヒト細胞の培養物が、前記少なくとも１つの第２の薬剤と接触する前に、前記ＮＲＰ１と反応性の薬剤と接触される、請求項２に記載の方法。
5. 前記ヒト細胞の培養物が、前記ＮＲＰ１と反応性の薬剤と接触する前に、前記少なくとも１つの第２の薬剤と接触される、請求項２に記載の方法。
6. 前記ヒト細胞の培養物が、前記ＮＲＰ１と反応性の薬剤と、前記少なくとも１つの第２の薬剤とに、同時に接触される、請求項２に記載の方法。
7. 前記ヒト心室前駆細胞を、ヒト多能性幹細胞の表面上に発現する少なくとも１つのマーカーと反応性の１つ以上の薬剤と接触させることと、マーカーに非反応性の陰性細胞を反応性細胞から分離して、それにより、ヒト心室前駆細胞をさらに単離することと、をさらに含む、請求項１に記載の方法。
8. ヒト多能性幹細胞の表面上に発現する前記少なくとも１つのマーカーが、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１、ＴＲＡ−２−５４、ＳＳＥＡ１、ＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４、ＣＤ９、ＣＤ２４、Ｅ−カドヘリン、およびポドカリキシン、ならびにこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項７に記載の方法。
9. ヒト多能性幹細胞の表面上に発現する前記少なくとも１つのマーカーが、ＴＲＡ−１−６０である、請求項７に記載の方法。
10. 前記ＴＲＡ−１−６０と反応性の薬剤が、抗ＴＲＡ−１−６０抗体である、請求項９に記載の方法。
11. 前記ＮＲＰ１と反応性の薬剤が、抗ＮＲＰ１抗体である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
12. 前記ＮＲＰ１と反応性の薬剤が、可溶性ＮＲＰ１リガンド融合タンパク質である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
13. 前記ＮＲＰ１リガンドが、ＶＥＧＦ−ＡまたはＳｅｍａ３Ａである、請求項１２に記載の方法。
14. 前記ＮＲＰ１反応性陽性細胞が、蛍光活性化細胞選別法（ＦＡＣＳ）または磁気活性化細胞選別法（ＭＡＣＳ）によって、前記非反応性細胞から分離される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
15. 前記ヒト心室前駆細胞が、これらがＭＬＣ２ｖ陽性であるように、さらに培養され、かつ分化される、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
16. 心臓前駆細胞を含有する前記ヒト細胞の培養物が、ヒト誘導多能性幹細胞のヒト胚性幹細胞に由来する、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
17. ヒト心室前駆細胞を単離するための方法であって、前記方法が、
    ヒト多能性幹細胞を、心臓前駆細胞を生成する条件下で培養して、細胞の培養物を得ることと、
    前記細胞の培養物を、ニューロピリン−１（ＮＲＰ１）と反応性の１つ以上の薬剤と接触させることと、
    ＮＲＰ１反応性陽性細胞を、非反応性細胞から分離して、それにより、ヒト心室前駆細胞を単離することと、を含む、方法。
18. 前記ヒト細胞の培養物が、ヒト心室前駆細胞と反応性の少なくとも１つの第２の薬剤とさらに接触され、ＮＲＰ１反応性／第２の薬剤反応性陽性細胞が、非反応性細胞から分離され、それにより、ヒト心室前駆細胞を単離する、請求項１７に記載の方法。
19. 前記少なくとも１つの第２の薬剤が、ＪＡＧ１、ＦＺＤ４、ＬＩＦＲ、ＦＧＦＲ３および／またはＴＮＦＳＦ９と反応性である、請求項１８に記載の方法。
20. 前記ヒト細胞の培養物が、前記少なくとも１つの第２の薬剤と接触する前に、前記ＮＲＰ１と反応性の薬剤と接触される、請求項１８に記載の方法。
21. 前記ヒト細胞の培養物が、前記ＮＲＰ１と反応性の薬剤と接触する前に、前記少なくとも１つの第２の薬剤と接触される、請求項１８に記載の方法。
22. 前記ヒト細胞の培養物が、前記ＮＲＰ１と反応性の薬剤と、前記少なくとも１つの第２の薬剤とに、同時に接触される、請求項１８に記載の方法。
23. 前記ヒト心室前駆細胞を、ヒト多能性幹細胞の表面上に発現する少なくとも１つのマーカーと反応性の１つ以上の薬剤と接触させることと、マーカーに非反応性の陰性細胞を反応性細胞から分離して、それにより、ヒト心室前駆細胞をさらに単離することと、をさらに含む、請求項１７に記載の方法。
24. ヒト多能性幹細胞の表面上に発現する前記少なくとも１つのマーカーが、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１、ＴＲＡ−２−５４、ＳＳＥＡ１、ＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４、ＣＤ９、ＣＤ２４、Ｅ−カドヘリン、およびポドカリキシン、ならびにこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項２３に記載の方法。
25. ヒト多能性幹細胞の表面上に発現する前記少なくとも１つのマーカーが、ＴＲＡ−１−６０である、請求項２３に記載の方法。
26. 前記ＴＲＡ−１−６０と反応性の薬剤が、抗ＴＲＡ−１−６０抗体である、請求項２５に記載の方法。
27. 前記ＮＲＰ１と反応性の薬剤が、抗ＮＲＰ１抗体である、請求項１７〜２６のいずれか一項に記載の方法。
28. 前記ＮＲＰ１と反応性の薬剤が、可溶性ＮＲＰ１リガンド融合タンパク質である、請求項１７〜２６のいずれか一項に記載の方法。
29. 前記ＮＲＰ１リガンドが、ＶＥＧＦ−ＡまたはＳｅｍａ３Ａである、請求項２８に記載の方法。
30. 前記ＮＲＰ１反応性陽性細胞が、蛍光活性化細胞選別法（ＦＡＣＳ）または磁気活性化細胞選別法（ＭＡＣＳ）によって、前記非反応性細胞から分離される、請求項１７〜２９のいずれか一項に記載の方法。
31. 前記ヒト心室前駆細胞が、これらがＭＬＣ２ｖ陽性であるように、さらに培養され、かつ分化される、請求項１７〜３０のいずれか一項に記載の方法。
32. 心臓前駆細胞を含有する前記ヒト細胞の培養物が、ヒト誘導多能性幹細胞のヒト胚性幹細胞に由来する、請求項１７〜３１のいずれか一項に記載の方法。
33. ヒト心室前駆細胞のクローン集団を得るための方法であって、前記方法が、
    ヒト心室前駆細胞の培養物をＮＲＰ１と反応性の１つ以上の薬剤と接触させることによって、単一のＮＲＰ１＋ヒト心室前駆細胞を単離することと、
    単一のＮＲＰ１＋ヒト心室前駆細胞が、前記細胞が少なくとも１×１０^９個の細胞にまで拡大増殖するような条件下で培養し、それにより、ヒト心室前駆細胞のクローン集団を得ることと、を含む、方法。
34. 前記単一のＮＲＰ１＋ヒト心室前駆細胞が、初期培養時に、Ｉｓｌｅｔ１陽性、Ｎｋｘ２．５陰性、およびｆｌｋ１陰性である、請求項３３に記載の方法。
35. 前記単一のＮＲＰ１＋ヒト心室前駆細胞が、蛍光活性化細胞選別法または磁気活性化細胞選別法によって単離される、請求項３３に記載の方法。
36. 前記ＮＲＰ１と反応性の薬剤が、抗ＮＲＰ１抗体である、請求項３３に記載の方法。
37. 前記単一のＮＲＰ１＋ヒト心室前駆細胞が、前記細胞を心室分化に偏向させるような条件下で培養される、請求項３３に記載の方法。
38. 前記単一のＮＲＰ１＋ヒト心室前駆細胞が、少なくとも１０×１０^９個の細胞にまで拡大増殖する、請求項３３に記載の方法。
39. 請求項３３に記載の方法によって得られた、少なくとも１×１０^９個のＮＲＰ１＋ヒト心室前駆細胞のクローン集団。
40. 請求項３８に記載の方法によって得られた、少なくとも１０×１０^９個のＮＲＰ１＋ヒト心室前駆細胞のクローン集団。
41. 対象の心機能を向上させる方法であって、前記方法が、請求項３９に記載のクローン集団を含む薬学的組成物を、前記対象に投与することを含む、方法。
42. 前記クローン集団が、前記対象の心臓に直接投与される、請求項４１に記載の方法。
43. 前記対象が、心筋梗塞に罹患している、請求項４１または４２に記載の方法。
44. 前記対象が、先天性心臓障害を有する、請求項４１または４２に記載の方法。
45. 前記クローン集団が、前記対象の心臓の心室領域に直接投与される、請求項４２に記載の方法。
46. 前記薬学的組成物が、二次元または三次元マトリックス上に製剤化された前記クローン集団を含む、請求項４１〜４５のいずれか一項に記載の方法。
47. ヒト心室組織を生成する方法であって、
    ＮＲＰ１＋ヒト心室前駆細胞を非ヒト動物の臓器に移植することと、
    ヒト心室組織が生成されるように、前駆細胞をインビボで増殖させることと、を含む、方法。
48. 前記非ヒト動物が、免疫不全マウスである、請求項４７に記載の方法。
49. 前記臓器が、腎臓または心臓である、請求項４７に記載の方法。
50. 前記細胞が、以下の、（ｉ）心臓中胚葉形成のピーク後、（ｉｉ）Ｉｓｌｅｔ−１発現のピーク時、（ｉｉｉ）ＮＫＸ２．５発現のピーク前、（ｉｖ）下流遺伝子ＭＥＦ−２およびＴＢＸ−１のピーク発現の前、ならびに（ｖ）分化した収縮タンパク質遺伝子の発現前のうちの細胞マーカーパターンのうちの１つ、２つ、３つ、４つ、または５つが存在する時点で移植される、請求項４７に記載の方法。
51. 前記細胞が、ヒト心室前駆細胞を生成する条件下でのヒト多能性幹細胞のインビトロ培養の５日目〜７日目（両端の値を含む）に移植される、請求項４７に記載の方法。
52. 前記細胞が、ヒト心室前駆細胞を生成する条件下でのヒト多能性幹細胞のインビトロ培養の６日目に移植される、請求項５１に記載の方法。
53. 試験化合物の心臓毒性をスクリーニングする方法であって、
    ＮＲＰ１＋ヒト心室前駆細胞を提供することと、
    前記細胞を、前記試験化合物と接触させることと、
    前記細胞に対する前記試験化合物の毒性を測定することと、を含み、
    前記細胞に対する前記試験化合物の毒性が、前記試験化合物の心臓毒性を示す、方法。
    
    

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