JP2020500010A - 分泌性バリアント免疫調節タンパク質および改変細胞療法 - Google Patents

分泌性バリアント免疫調節タンパク質および改変細胞療法 Download PDF

Info

Publication number
JP2020500010A
JP2020500010A JP2019520983A JP2019520983A JP2020500010A JP 2020500010 A JP2020500010 A JP 2020500010A JP 2019520983 A JP2019520983 A JP 2019520983A JP 2019520983 A JP2019520983 A JP 2019520983A JP 2020500010 A JP2020500010 A JP 2020500010A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
modified
affinity
domain
igsf
cell
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2019520983A
Other languages
English (en)
Other versions
JP2020500010A5 (ja
Inventor
ライアン スワンソン
ライアン スワンソン
マイケル コルナッカー
マイケル コルナッカー
Original Assignee
アルパイン イミューン サイエンシズ インコーポレイテッド
アルパイン イミューン サイエンシズ インコーポレイテッド
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by アルパイン イミューン サイエンシズ インコーポレイテッド, アルパイン イミューン サイエンシズ インコーポレイテッド filed Critical アルパイン イミューン サイエンシズ インコーポレイテッド
Publication of JP2020500010A publication Critical patent/JP2020500010A/ja
Publication of JP2020500010A5 publication Critical patent/JP2020500010A5/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70532—B7 molecules, e.g. CD80, CD86
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/177—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/177—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A61K38/1774—Immunoglobulin superfamily (e.g. CD2, CD4, CD8, ICAM molecules, B7 molecules, Fc-receptors, MHC-molecules)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K39/4611—T-cells, e.g. tumor infiltrating lymphocytes [TIL], lymphokine-activated killer cells [LAK] or regulatory T cells [Treg]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/463—Cellular immunotherapy characterised by recombinant expression
    • A61K39/4631—Chimeric Antigen Receptors [CAR]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/463—Cellular immunotherapy characterised by recombinant expression
    • A61K39/4636—Immune checkpoint inhibitors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A61K39/464402—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A61K39/464411—Immunoglobulin superfamily
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A61K39/464402—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A61K39/464411—Immunoglobulin superfamily
    • A61K39/464412—CD19 or B4
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70517—CD8
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70521—CD28, CD152
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70596—Molecules with a "CD"-designation not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • C12N5/0637—Immunosuppressive T lymphocytes, e.g. regulatory T cells or Treg
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0639—Dendritic cells, e.g. Langherhans cells in the epidermis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/03—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a transmembrane segment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/33—Fusion polypeptide fusions for targeting to specific cell types, e.g. tissue specific targeting, targeting of a bacterial subspecies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/36011—Togaviridae
    • C12N2770/36111—Alphavirus, e.g. Sindbis virus, VEE, EEE, WEE, Semliki
    • C12N2770/36141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

免疫調節タンパク質、該免疫調節タンパク質をコードする核酸、該免疫調節タンパク質を発現するように改変された細胞、および該免疫調節タンパク質をコードする核酸を含有する感染性物質が提供される。いくつかの態様において、免疫調節タンパク質は、分泌性である。いくつかの態様において、免疫調節タンパク質は、表面に発現する膜貫通タンパク質である。免疫調節タンパク質、改変細胞、および感染性物質は、様々な免疫学的および腫瘍学的状態に対する治療的有用性を提供する。当該タンパク質を製造および使用するための組成物および方法が提供される。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、2016年10月20日に出願された「Secretable Variant Immunomodulatory Proteins and Engineered Cell Therapy」という表題の米国仮特許出願第62/410,827号、2017年3月22日に出願された「Secretable Variant Immunomodulatory Proteins and Engineered Cell Therapy」という表題の米国仮特許出願第62/475,210号、および2017年7月27日に出願された「Secretable Variant Immunomodulatory Proteins and Engineered Cell Therapy」という表題の米国仮特許出願第62/537,921号の優先権を主張するものであり、それらの各々の内容は、その全体が参照によって組み入れられる。
配列表の参照による組み入れ
本出願は、電子形式の配列表と共に出願される。配列表は、2017年10月19日に作成された761612001440SeqList.TXTという表題の、サイズが3,524,332バイトのファイルとして提供される。電子形式の配列表の情報は、その全体が参照によって組み入れられる。
分野
本開示は、免疫調節タンパク質、そのような免疫調節タンパク質をコードする核酸、免疫調節タンパク質を発現するように改変された細胞、および免疫調節タンパク質をコードする核酸を含有する感染性物質を提供する。いくつかの態様において、免疫調節タンパク質は、分泌性である。いくつかの態様において、免疫調節タンパク質は、表面において発現する膜貫通タンパク質である。免疫調節タンパク質、改変細胞、および感染性物質は、様々な免疫学的状態および腫瘍学的状態に対する治療的有用性を提供する。そのようなタンパク質を製造および使用するための組成物および方法が提供される。
背景
抗原提示細胞(APC)または標的細胞とリンパ球との間でそれらによって形成される免疫学的シナプス(IS)で起こるプロセスに介入することによる免疫応答の調節に関して医学的関心が高まっている。現在のところ、免疫応答を増強または抑制するために使用される生物製剤は、一般に、免疫グロブリン（例えば、抗PD-1 mAb）または可溶性受容体（例えば、Fc-CTLA4）に限定されている。可溶性受容体は、いくつかの場合に、数多くの欠陥を抱えている。可溶性受容体は、タンパク質間相互作用に拮抗するのに有用であるが、そのような相互作用を刺激する能力を欠いていることが多い。抗体は、これに関して制限が少ないと証明されており、アゴニスト抗体とアンタゴニスト抗体の両方の例が当技術分野において公知である。それにもかかわらず、可溶性受容体および抗体は共に、ISにおいて機能するのに不可欠である重要な属性を欠いている。機構的には、IS内の細胞表面タンパク質は、複数のタンパク質標的とそれらが結合する単一タンパク質との間の協調的でしばしば同時の相互作用に関与し得る。ISにおける相互作用は、2つの細胞の接合と密接に関連して起こり、この構造体内の単一タンパク質が、同じ細胞上のタンパク質（シス）および相互作用している細胞上のタンパク質（トランス）の両方と（おそらく同時に）相互作用することができる。ISを調節することができるいくつかの作用物質が知られているが、改善された治療薬が必要とされている。このようなニーズを満たす態様が提供される。
概要
一局面において、野生型IgSFドメイン内に1つまたは複数のアミノ酸置換を含む少なくとも1つの非免疫グロブリン親和性改変免疫グロブリンスーパーファミリー(IgSF)ドメインを含む、免疫調節タンパク質であって、少なくとも1つの親和性改変IgSFドメインが、野生型IgSFドメインの少なくとも1つの細胞表面同族結合パートナーに特異的に結合し；免疫調節タンパク質が膜貫通ドメインを含まず；免疫調節タンパク質が半減期延長部分にコンジュゲートされていない、免疫調節タンパク質が提供される。いくつかの態様において、半減期延長部分は、多量体化ドメインである。いくつかの態様において、半減期延長部分は、Fcドメインである。
いくつかの態様において、免疫調節タンパク質は、シグナルペプチドをさらに含む。いくつかの態様において、シグナルペプチドは、対応する野生型IgSFメンバーに由来するネイティブシグナルペプチドである。いくつかの態様において、シグナルペプチドは、非ネイティブシグナルペプチドである。いくつかの態様において、シグナルペプチドは、免疫グロブリン抗体分子に由来するシグナルペプチド（例えば、IgG-κシグナルペプチド)、IL-2シグナルペプチド、もしくはCD33シグナルペプチド、または公知もしくは記載の他のシグナルペプチドである。例示的なシグナルペプチドは、SEQ ID NO:413〜430のいずれかに示される。
免疫調節タンパク質のいくつかの態様において、少なくとも1つの細胞表面同族結合パートナーは、哺乳動物細胞上に発現する。いくつかの態様において、哺乳動物細胞は、抗原提示細胞(APC)、腫瘍細胞、またはリンパ球である。いくつかの態様において、哺乳動物細胞は、T細胞である。いくつかの態様において、哺乳動物細胞は、マウス、ラット、カニクイザル、またはヒトの細胞である。
免疫調節タンパク質のいくつかの態様において、少なくとも1つの親和性改変IgSFドメインは、野生型IgSFドメインと比較して、少なくとも1つの細胞表面同族結合パートナーに対する向上した結合親和性を有する。
免疫調節タンパク質のいくつかの態様において、少なくとも1つの親和性改変IgSFドメインを含む免疫調節タンパク質の特異的結合は、野生型IgSFドメインと比較して、哺乳動物細胞の免疫学的活性を調節する。いくつかの態様において、少なくとも1つの親和性改変IgSFドメインを含む免疫調節タンパク質の特異的結合は、野生型IgSFドメインと比較して、哺乳動物細胞の免疫学的活性を増強する。いくつかの態様において、免疫調節タンパク質の特異的結合は、野生型IgSFドメインと比較して、哺乳動物細胞の免疫学的活性を低減する。
免疫調節タンパク質のいくつかの態様において、野生型IgSFドメインは、シグナル制御タンパク質(SIRP)ファミリー、骨髄細胞に発現するトリガー受容体様(TREML)ファミリー、がん胎児性抗原関連細胞接着分子(CEACAM)ファミリー、シアル酸結合Ig様レクチン(SIGLEC)ファミリー、ブチロフィリンファミリー、B7ファミリー、CD28ファミリー、Vセットおよび免疫グロブリンドメイン含有(VSIG)ファミリー、Vセット膜貫通ドメイン(VSTM)ファミリー、主要組織適合複合体(MHC)ファミリー、シグナル伝達リンパ球活性化分子(SLAM)ファミリー、白血球免疫グロブリン様受容体(LIR)、ネクチン(Nec)ファミリー、ネクチン様(NECL)ファミリー、ポリオウイルス受容体関連(PVR)ファミリー、天然細胞傷害誘発受容体(NCR)ファミリー、T細胞免疫グロブリンおよびムチン(TIM)ファミリー、ならびにキラー細胞免疫グロブリン様受容体(KIR)ファミリーからなる群より選択されるファミリーのIgSFファミリーメンバーに由来する。いくつかの態様において、野生型IgSFドメインは、CD80、CD86、PD-L1、PD-L2、ICOSリガンド、B7-H3、B7-H4、CD28、CTLA4、PD-1、ICOS、BTLA、CD4、CD8-α、CD8-β、LAG3、TIM-3、CEACAM1、TIGIT、PVR、PVRL2、CD226、CD2、CD160、CD200、CD200R、NKp30、VISTA、VSIG3、およびVSIG8からなる群より選択されるIgSFメンバーに由来する。いくつかの態様において、野生型IgSFドメインは、ヒトIgSFドメインである。いくつかの態様において、少なくとも1つの親和性改変IgSFドメインは、SEQ ID NO:1〜27および408のいずれかに示されるアミノ酸配列に含有される野生型IgSFドメインまたはその特異的結合断片に対して少なくとも90％の配列同一性を有する。いくつかの態様において、免疫調節タンパク質は、SEQ ID NO:28〜54および410のいずれかから選択されるアミノ酸配列またはその特異的結合断片（IgSFドメインを含有する）に対して、少なくとも90％の配列同一性を有する。いくつかの態様において、野生型IgSFドメインは、B7ファミリーのメンバーのものである。いくつかの態様において、野生型IgSFドメインは、CD80、CD86、またはICOSLのドメインである。
免疫調節タンパク質のいくつかの態様において、少なくとも1つの細胞表面同族結合パートナーは、T細胞上に発現する刺激性受容体であり、少なくとも1つの親和性改変IgSFドメインは、該刺激性受容体に対して、該刺激性受容体に対する野生型IgSFドメインの結合親和性と比較して向上した結合親和性を有する。いくつかの態様において、親和性改変IgSFドメインの刺激性受容体への結合（例えば、細胞から分泌されたときの刺激性受容体への結合）は、T細胞の免疫学的活性を増強する。いくつかの態様において、親和性改変IgSFドメインの刺激性受容体への結合（例えば、細胞から分泌されたときの刺激性受容体への結合）は、T細胞の免疫学的活性を低減する。いくつかの態様において、刺激性受容体は、CD28、ICOS、またはCD226である。いくつかの態様において、少なくとも1つの親和性改変IgSFドメインは、ICOSおよびCD28のうちの少なくとも1つに対する向上した結合親和性を有する親和性改変ICOSL IgSFドメインである。いくつかの態様において、少なくとも1つの親和性改変IgSFドメインは親和性改変ICOSL IgSFドメインであり、刺激性受容体はICOSである。いくつかの態様において、少なくとも1つの親和性改変IgSFドメインは親和性改変ICOSL IgSFドメインであり、刺激性受容体はCD28である。いくつかの態様において、少なくとも1つの親和性改変IgSFドメインは親和性改変CD80 IgSFドメインであり、刺激性受容体はCD28である。いくつかの態様において、親和性改変IgSFドメインは、CTLA-4に実質的に特異的に結合しないか、またはCTLA-4に対して、CTLA-4に対する野生型IgSFドメインの結合親和性と比較して低下した結合親和性を示す。
免疫調節タンパク質のいくつかの態様において、少なくとも1つの細胞表面同族結合パートナーは、T細胞上に発現する抑制性受容体であり、少なくとも1つの親和性改変IgSFドメインは、該抑制性受容体に対して、該抑制性受容体に対する野生型IgSFドメインの結合親和性と比較して向上した結合親和性を有する。いくつかの態様において、親和性改変IgSFドメインの抑制性受容体への結合（例えば、細胞から分泌されたときの抑制性受容体への結合）は、T細胞の免疫学的活性を増強する。いくつかの態様において、親和性改変IgSFドメインの抑制性受容体への結合（例えば、細胞から分泌されたときの抑制性受容体への結合）は、T細胞の免疫学的活性を低減する。免疫調節タンパク質のいくつかの態様において、抑制性受容体は、ITIMシグナル伝達ドメインを含む。いくつかの態様において、抑制性受容体は、PD-1、CTLA-4、LAG3、TIGIT、TIM-3、BTLA、VSIG3、またはVSIG8であり、かつ少なくとも1つの親和性改変IgSFドメインはそれぞれ、PD-1、CTLA-4、LAG3、TIGIT、TIM-3、BTLA、VSIG3、またはVSIG8のリガンドの親和性改変IgSFドメインである。いくつかの態様において、抑制性受容体のリガンドは、PD-L1、PD-L2、B7-1、B7-2、MHCクラスII、PVR、CEACAM-1、GAL9、またはVISTAであり、かつ少なくとも1つの親和性改変IgSFドメインはそれぞれ、PD-L1、PD-L2、B7-1、B7-2、MHCクラスII、PVR、CEACAM-1、GAL9、またはVISTAのリガンドの親和性改変IgSFドメインである。いくつかの態様において、抑制性受容体はPD-1であり、少なくとも1つの親和性改変IgSFドメインは、PD-L1の親和性改変IgSFまたはPD-L2の親和性改変IgSFである。いくつかの態様において、抑制性受容体はTIGITであり、少なくとも1つの親和性改変IgSFドメインは、CD112またはCD155の親和性改変IgSFである。
免疫調節タンパク質のいくつかの態様において、少なくとも1つの親和性改変IgSFドメインは、わずか1つの細胞表面同族結合パートナーに特異的に結合する。いくつかの態様において、免疫調節タンパク質は、わずか1つの細胞表面同族結合パートナーに特異的に結合する。
免疫調節タンパク質のいくつかの態様において、少なくとも1つの親和性改変ドメインは、少なくとも2つの細胞表面同族結合パートナーに特異的に結合する。いくつかの態様において、第一の細胞表面同族結合パートナーは、T細胞上に発現する刺激性受容体であり；第二の細胞表面同族結合パートナーは、T細胞上に発現する抑制性受容体の抑制性リガンドである。いくつかの態様において、抑制性リガンドに対する親和性改変ドメインの結合は、抑制性受容体への抑制性リガンドの結合を競合的に阻害する。いくつかの態様において、抑制性受容体は、PD-1、CTLA-4、LAG-3、TIGIT、CD96、CD112R、BTLA、CD160、TIM-3、VSIG3、もしくはVSIG8であるか；または、抑制性受容体のリガンドは、PD-L1、PD-L2、B7-1、B7-2、HVEM、MHCクラスII、PVR、CEACAM-1、GAL9、もしくはVISTAである。いくつかの態様において、親和性改変IgSFドメインは親和性改変CD80ドメインであり、刺激性受容体はCD28である。いくつかの態様において、抑制性リガンドはPD-L1であり、抑制性受容体はPD-1である。いくつかの態様において、親和性改変IgSFドメインは、野生型IgSFドメインと比較して、CTLA-4に対する低下した結合親和性を示す。いくつかの態様において、親和性改変IgSFドメインは、CTLA-4に実質的に特異的に結合しない。
免疫調節タンパク質のいくつかの態様において、親和性改変IgSFドメインは、親和性改変CD155 IgSFドメインまたは親和性改変CD112 IgSFドメインであり、少なくとも1つの細胞表面同族結合パートナーは、CD226、TIGIT、またはCD112Rである。いくつかの態様において、親和性改変IgSFドメインは、CD226に対して、CD226に対する野生型IgSFドメインの結合親和性と比較して低下した結合親和性を示す。いくつかの態様において、親和性改変IgSFドメインは、TIGITまたはCD112Rに対して、TIGITまたはCD112Rに対する野生型IgSFドメインの結合親和性と比較して向上した結合性を保持または示す。
免疫調節タンパク質のいくつかの態様において、少なくとも1つの親和性改変IgSFドメインは、腫瘍特異的抗原である細胞表面同族結合パートナーに特異的に結合する。いくつかの態様において、腫瘍特異的抗原は、B7-H6である。いくつかの態様において、親和性改変IgSFドメインは、親和性改変NKp30 IgSFドメインである。
免疫調節タンパク質のいくつかの態様において、少なくとも1つの親和性改変IgSFドメインは、第一の親和性改変IgSFドメインおよび第二の親和性改変IgSFドメインを含む。いくつかの態様において、第一の親和性改変IgSFドメインと第二の親和性改変IgSFドメインは、異なる。いくつかの態様において、第一の親和性改変IgSFドメインおよび第二の親和性改変IgSFドメインは各々、同じ野生型IgSFドメイン内に1つまたは複数の異なるアミノ酸置換を含む。いくつかの態様において、第一の親和性改変IgSFドメインおよび第二の親和性改変IgSFドメインは各々、異なる野生型IgSFドメイン内に1つまたは複数のアミノ酸置換を含む。
免疫調節タンパク質のいくつかの態様において、野生型IgSFドメインは、抑制性受容体のリガンドであるIgSFメンバーに由来し、該抑制性受容体はITIMシグナル伝達ドメインを含む。いくつかの態様において、抑制性受容体は、PD-1、CTLA-4、LAG3、TIGIT、TIM-3、BTLA、VSIG3、またはVSIG8であり、かつ少なくとも1つの親和性改変IgSFドメインはそれぞれ、PD-1、CTLA-4、LAG3、TIGIT、TIM-3、BTLA、VSIG3、またはVSIG8のリガンドの親和性改変IgSFドメインである。いくつかの態様において、抑制性受容体のリガンドは、PD-L1、PD-L2、B7-1、B7-2、MHCクラスII、PVR、CEACAM-1、GAL9、またはVISTAであり、かつ少なくとも1つの親和性改変IgSFドメインはそれぞれ、PD-L1、PD-L2、B7-1、B7-2、MHCクラスII、PVR、CEACAM-1、GAL9、またはVISTAのリガンドの親和性改変IgSFドメインである。いくつかの態様において、抑制性受容体はPD-1であり、少なくとも1つの親和性改変IgSFドメインは、PD-L1またはPD-L2の親和性改変IgSFである。いくつかの態様において、抑制性受容体はTIGITであり、少なくとも1つの親和性改変IgSFドメインは、CD112またはCD155の親和性改変IgSFである。
免疫調節タンパク質のいくつかの態様において、親和性改変IgSFドメインは、野生型IgSFドメインとアミノ酸置換10個以下異なる。いくつかの態様において、親和性改変IgSFドメインは、野生型IgSFドメインとアミノ酸置換5個以下異なる。
免疫調節タンパク質のいくつかの態様において、1つまたは複数の親和性改変IgSFドメインは、1つまたは複数のアミノ酸置換を含む、親和性改変IgVドメイン、親和性改変IgC1ドメイン、もしくは親和性改変IgC2ドメインである、もしくはそれを含む、またはその特異的結合断片である。
免疫調節タンパク質のいくつかの態様において、免疫調節タンパク質は、1つまたは複数の親和性が改変されていないIgSFドメインをさらに含む。
免疫調節タンパク質のいくつかの態様において、免疫調節タンパク質は、改変細胞から分泌されているかまたは分泌されることができる。いくつかの態様において、改変細胞は、免疫細胞である。いくつかの態様において、改変細胞は、初代細胞である。
別の局面において、免疫調節タンパク質をコードする組換え核酸が提供される。いくつかの態様において、核酸分子は、免疫調節タンパク質の発現を制御するために機能的に連結された少なくとも1つのプロモーターをさらに含む。いくつかの態様において、プロモーターは、構成的活性型プロモーターである。いくつかの態様において、プロモーターは、誘導性プロモーターである。いくつかの態様において、プロモーターは、T細胞活性化シグナル伝達に応答性のエレメントに応答性である。いくつかの態様において、プロモーターは、NFATの結合部位またはNF-κBの結合部位を含む。別の局面において、記載の核酸を含む組換え発現ベクターが提供される。
さらなる局面において、分泌のためのシグナル配列の機能的制御下にある免疫調節タンパク質をコードする核酸を含む組換え発現ベクターであって、免疫調節タンパク質が、野生型IgSFドメイン内に1つまたは複数のアミノ酸置換を含む少なくとも1つの非免疫グロブリン親和性改変免疫グロブリンスーパーファミリー(IgSF)ドメインを含み、少なくとも1つの親和性改変IgSFドメインが、野生型IgSFドメインの少なくとも1つの細胞表面同族結合パートナーに特異的に結合し；コードされる免疫調節タンパク質が、細胞から発現されると分泌される、組換え発現ベクターが提供される。いくつかの態様において、免疫調節タンパク質は、膜貫通ドメインを含まない。いくつかの態様において、免疫調節タンパク質は、半減期延長部分にコンジュゲートされていない。いくつかの態様において、半減期延長部分は、多量体化ドメインである。いくつかの態様において、半減期延長部分は、Fcドメインである。いくつかの態様において、分泌のためのシグナル配列は、分泌シグナルペプチドをコードする。いくつかの態様において、シグナルペプチドは、対応する野生型IgSFメンバーに由来するネイティブシグナルペプチドである。いくつかの態様において、シグナルペプチドは、非ネイティブシグナルペプチドである。いくつかの態様において、シグナルペプチドは、IgG-κシグナルペプチド、IL-2シグナルペプチド、もしくはCD33シグナルペプチドまたは公知かもしくは記載の他のシグナルペプチドである。例示的なシグナルペプチドは、SEQ ID NO:413〜430のいずれかに示される。
発現ベクターのいくつかの態様において、核酸分子は、免疫調節タンパク質の発現を制御するために機能的に連結された少なくとも1つのプロモーターをさらに含む。いくつかの態様において、プロモーターは、構成的活性型プロモーターである。いくつかの態様において、プロモーターは、誘導性プロモーターである。いくつかの態様において、プロモーターは、T細胞活性化シグナル伝達に応答性のエレメントに応答性である。いくつかの態様において、プロモーターは、NFATの結合部位またはNF-κBの結合部位を含む。
発現ベクターのいくつかの態様において、ベクターは、ウイルスベクターである。いくつかの態様において、ウイルスベクターは、レトロウイルスベクターである。いくつかの態様において、ウイルスベクターは、レンチウイルスベクターまたはガンマレトロウイルスベクターである。
発現ベクターのいくつかの態様において、少なくとも1つの親和性改変IgSFドメインは、野生型IgSFドメインと比較して、少なくとも1つの細胞表面同族結合パートナーに対する向上した結合親和性を有する。
発現ベクターのいくつかの態様において、少なくとも1つの細胞表面同族結合パートナーは、哺乳動物細胞上に発現する。いくつかの態様において、哺乳動物細胞は、抗原提示細胞(APC)、腫瘍細胞、またはリンパ球である。いくつかの態様において、哺乳動物細胞は、T細胞である。いくつかの態様において、哺乳動物細胞は、マウス、ラット、カニクイザル、またはヒトの細胞である。
発現ベクターのいくつかの態様において、少なくとも1つの親和性改変IgSFドメインを含む免疫調節タンパク質の特異的結合は、野生型IgSFドメインと比較して、哺乳動物細胞の免疫学的活性を調節する。いくつかの態様において、少なくとも1つの親和性改変IgSFドメインを含む免疫調節タンパク質の特異的結合は、野生型IgSFドメインと比較して、哺乳動物細胞の免疫学的活性を増強する。いくつかの態様において、免疫調節タンパク質の特異的結合は、野生型IgSFドメインと比較して、哺乳動物細胞の免疫学的活性を低減する。
発現ベクターのいくつかの態様において、野生型IgSFドメインは、シグナル制御タンパク質(SIRP)ファミリー、骨髄細胞に発現するトリガー受容体様(TREML)ファミリー、がん胎児性抗原関連細胞接着分子(CEACAM)ファミリー、シアル酸結合Ig様レクチン(SIGLEC)ファミリー、ブチロフィリンファミリー、B7ファミリー、CD28ファミリー、Vセットおよび免疫グロブリンドメイン含有(VSIG)ファミリー、Vセット膜貫通ドメイン(VSTM)ファミリー、主要組織適合複合体(MHC)ファミリー、シグナル伝達リンパ球活性化分子(SLAM)ファミリー、白血球免疫グロブリン様受容体(LIR)、ネクチン(Nec)ファミリー、ネクチン様(NECL)ファミリー、ポリオウイルス受容体関連(PVR)ファミリー、天然細胞傷害誘発受容体(NCR)ファミリー、T細胞免疫グロブリンおよびムチン(TIM)ファミリー、ならびにキラー細胞免疫グロブリン様受容体(KIR)ファミリーからなる群より選択されるファミリーのIgSFファミリーメンバーに由来する。いくつかの態様において、野生型IgSFドメインは、CD80、CD86、PD-L1、PD-L2、ICOSリガンド、B7-H3、B7-H4、CD28、CTLA4、PD-1、ICOS、BTLA、CD4、CD8-α、CD8-β、LAG3、TIM-3、CEACAM1、TIGIT、PVR、PVRL2、CD226、CD2、CD160、CD200、CD200R、NKp30、VISTA、VSIG3、およびVSIG8からなる群より選択されるIgSFメンバーに由来する。いくつかの態様において、野生型IgSFドメインは、ヒトIgSFドメインである。いくつかの態様において、少なくとも1つの親和性改変IgSFドメインは、SEQ ID NO:1〜27および408のいずれかに示されるアミノ酸配列に含有される野生型IgSFドメインまたはその特異的結合断片に対して少なくとも90％の配列同一性を有する。いくつかの態様において、免疫調節タンパク質は、SEQ ID NO:28〜54および410のいずれかから選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも90％の配列同一性を有する。いくつかの態様において、野生型IgSFドメインは、B7ファミリーのメンバーのものである。いくつかの態様において、野生型IgSFドメインは、CD80、CD86、またはICOSLのドメインである。
発現ベクターのいくつかの態様において、少なくとも1つの細胞表面同族結合パートナーは、T細胞上に発現する刺激性受容体であり、少なくとも1つの親和性改変IgSFドメインは、該刺激性受容体に対して、該刺激性受容体に対する野生型IgSFドメインの結合親和性と比較して向上した結合親和性を有する。いくつかの態様において、親和性改変IgSFドメインの刺激性受容体への結合（例えば、発現ベクターを含有する細胞から発現されたときの刺激性受容体への結合）は、T細胞の免疫学的活性を増強する。いくつかの態様において、親和性改変IgSFドメインの刺激性受容体への結合（例えば、発現ベクターを含有する細胞から発現されたときの刺激性受容体への結合）は、T細胞の免疫学的活性を低減する。いくつかの態様において、刺激性受容体は、CD28、ICOS、またはCD226である。いくつかの態様において、少なくとも1つの親和性改変IgSFドメインは、ICOSおよびCD28のうちの少なくとも1つに対する向上した結合親和性を有する親和性改変ICOSL IgSFドメインである。いくつかの態様において、少なくとも1つの親和性改変IgSFドメインは親和性改変ICOSL IgSFドメインであり、刺激性受容体はICOSである。いくつかの態様において、少なくとも1つの親和性改変IgSFドメインは親和性改変ICOSL IgSFドメインであり、刺激性受容体はCD28である。いくつかの態様において、少なくとも1つの親和性改変IgSFドメインは親和性改変CD80 IgSFドメインであり、刺激性受容体はCD28である。いくつかの態様において、親和性改変IgSFドメインは、CTLA-4に実質的に特異的に結合しないか、または、CTLA-4に対して、CTLA-4に対する野生型IgSFドメインの結合親和性と比較して低下した結合親和性を示す。
発現ベクターのいくつかの態様において、少なくとも1つの親和性改変IgSFドメインは、わずか1つの細胞表面同族結合パートナーに特異的に結合する。いくつかの態様において、免疫調節タンパク質は、わずか1つの細胞表面同族結合パートナーに特異的に結合する。
発現ベクターのいくつかの態様において、少なくとも1つの親和性改変ドメインは、少なくとも2つの細胞表面同族結合パートナーに特異的に結合する。いくつかの態様において、第一の細胞表面同族結合パートナーは、T細胞上に発現する刺激性受容体であり；第二の細胞表面同族結合パートナーは、T細胞上に発現する抑制性受容体の抑制性リガンドである。いくつかの態様において、抑制性リガンドに対する親和性改変IgSFドメインの結合は、抑制性受容体への抑制性リガンドの結合を競合的に阻害する。いくつかの態様において、抑制性受容体は、PD-1、CTLA-4、LAG-3、TIGIT、CD96、CD112R、BTLA、CD160、TIM-3、VSIG3、もしくはVSIG8であるか；または、抑制性受容体のリガンドは、PD-L1、PD-L2、B7-1、B7-2、HVEM、MHCクラスII、PVR、CEACAM-1、GAL9、もしくはVISTAである。
発現ベクターのいくつかの態様において、親和性改変IgSFドメインは親和性改変CD80ドメインであり、刺激性受容体はCD28である。いくつかの態様において、親和性改変IgSFドメインは、野生型IgSFドメインと比較して、CTLA-4に対する低下した結合親和性を示す。いくつかの態様において、親和性改変IgSFドメインは、CTLA-4に実質的に特異的に結合しない。いくつかの態様において、抑制性リガンドはPD-L1であり、抑制性受容体はPD-1である。いくつかの態様において、抑制性リガンドはPD-L2であり、抑制性受容体はPD-1である。
発現ベクターのいくつかの態様において、親和性改変IgSFドメインは、親和性改変CD155 IgSFドメインまたは親和性改変CD112 IgSFドメインであり、少なくとも1つの細胞表面同族結合パートナーは、CD226、TIGIT、またはCD112Rである。いくつかの態様において、親和性改変IgSFドメインは、CD226に対して、CD226に対する野生型IgSFドメインの結合親和性と比較して低下した結合親和性を示す。いくつかの態様において、親和性改変IgSFドメインは、TIGIT(IgおよびITIMドメインを有するT細胞免疫受容体)またはCD112Rに対して、TIGITまたはCD112Rに対する野生型IgSFドメインの結合親和性と比較して向上した結合性を保持または示す。
発現ベクターのいくつかの態様において、少なくとも1つの親和性改変IgSFドメインは、腫瘍特異的抗原である細胞表面同族結合パートナーに特異的に結合する。いくつかの態様において、腫瘍特異的抗原は、B7-H6である。いくつかの態様において、親和性改変IgSFドメインは、親和性改変NKp30 IgSFドメインである。
発現ベクターのいくつかの態様において、少なくとも1つの親和性改変IgSFドメインは、第一の親和性改変IgSFドメインおよび第二の親和性改変IgSFドメインを含む。いくつかの態様において、第一の親和性改変IgSFドメインと第二の親和性改変IgSFドメインは異なる。いくつかの態様において、第一の親和性改変IgSFドメインおよび第二の親和性改変IgSFドメインは各々、同じ野生型IgSFドメイン内に1つまたは複数の異なるアミノ酸置換を含む。いくつかの態様において、第一の親和性改変IgSFドメインおよび第二の親和性改変IgSFドメインは各々、異なる野生型IgSFドメイン内に1つまたは複数のアミノ酸置換を含む。
発現ベクターのいくつかの態様において、野生型IgSFドメインは、抑制性受容体のリガンドであるIgSFメンバーに由来し、該抑制性受容体はITIMシグナル伝達ドメインを含む。いくつかの態様において、抑制性受容体は、PD-1、CTLA-4、LAG3、TIGIT、TIM-3、BTLA、VSIG3、またはVSIG8であり、かつ少なくとも1つの親和性改変IgSFドメインはそれぞれ、PD-1、CTLA-4、LAG3、TIGIT、TIM-3、BTLA、VSIG3、またはVSIG8のリガンドの親和性改変IgSFドメインである。いくつかの態様において、抑制性受容体のリガンドは、PD-L1、PD-L2、B7-1、B7-2、MHCクラスII、PVR、CEACAM-1、GAL9、またはVISTAであり、かつ少なくとも1つの親和性改変IgSFドメインはそれぞれ、PD-L1、PD-L2、B7-1、B7-2、MHCクラスII、PVR、CEACAM-1、GAL9、またはVISTAのリガンドの親和性改変IgSFドメインである。いくつかの態様において、抑制性受容体はPD-1であり、少なくとも1つの親和性改変IgSFドメインは、PD-L1またはPD-L2の親和性改変IgSFである。いくつかの態様において、親和性改変IgSFドメインは、野生型IgSFドメインと比較して、トランス表面同族結合パートナーに対する向上した結合親和性を有し、それによって、向上した結合親和性は、抑制性受容体へのトランス表面同族結合パートナーの結合を競合的に阻害する。
発現ベクターのいくつかの態様において、親和性改変IgSFドメインは、野生型IgSFドメインとアミノ酸置換10個以下異なる。いくつかの態様において、親和性改変IgSFドメインは、野生型IgSFドメインとアミノ酸置換5個以下異なる。
発現ベクターのいくつかの態様において、1つまたは複数の親和性改変IgSFドメインは、1つまたは複数のアミノ酸置換を含む、親和性改変IgVドメイン、親和性改変IgC1ドメイン、もしくは親和性改変IgC2ドメインである、もしくはそれを含む、またはその特異的結合断片である。
発現ベクターのいくつかの態様において、免疫調節タンパク質は、1つまたは複数の親和性が改変されていないIgSFドメインをさらに含む。
別の局面において、上記の核酸または上記の発現ベクターのいずれか1つまたは複数を含む改変細胞が提供される。別の局面において、免疫調節タンパク質のいずれか1つまたは複数を含む改変細胞が提供される。別の局面において、免疫調節タンパク質のいずれか1つまたは複数を分泌する改変細胞が提供される。いくつかの態様において、改変細胞は、免疫細胞である。
別の局面において、免疫調節タンパク質をコードする核酸分子を含む改変免疫細胞であって、免疫調節タンパク質が、野生型IgSFドメイン内に1つまたは複数のアミノ酸置換を含む少なくとも1つの非免疫グロブリン親和性改変免疫グロブリンスーパーファミリー(IgSF)ドメインを含み、少なくとも1つの親和性改変IgSFドメインが、野生型IgSFドメインの少なくとも1つの細胞表面同族結合パートナーに特異的に結合し；改変免疫細胞が免疫調節タンパク質を発現および分泌する、改変免疫細胞が提供される。いくつかの態様において、免疫調節タンパク質は、膜貫通ドメインを含まない。いくつかの態様において、免疫調節タンパク質は、半減期延長部分にコンジュゲートされていない。いくつかの態様において、半減期延長部分は、多量体化ドメインである。いくつかの態様において、半減期延長部分は、Fcドメインである。
改変細胞のいくつかの態様において、核酸分子は、免疫調節タンパク質をコードする配列に機能的に連結された、分泌シグナルペプチドをコードする配列を含む。いくつかの態様において、シグナルペプチドは、対応する野生型IgSFメンバーに由来するネイティブシグナルペプチドである。いくつかの態様において、シグナルペプチドは、非ネイティブシグナル配列である。いくつかの態様において、シグナルペプチドは、IgG-κシグナルペプチド、IL-2シグナルペプチド、もしくはCD33シグナルペプチドまたは当技術分野において公知の任意の他のシグナルペプチドである。例示的なシグナルペプチドは、SEQ ID NO:413〜430のいずれかに示される。
改変細胞のいくつかの態様において、核酸分子は、免疫調節タンパク質の発現を制御するために機能的に連結された少なくとも1つのプロモーターをさらに含む。いくつかの態様において、プロモーターは、構成的活性型プロモーターである。いくつかの態様において、プロモーターは、誘導性プロモーターである。いくつかの態様において、プロモーターは、T細胞活性化シグナル伝達に応答性のエレメントに応答性である。いくつかの態様において、プロモーターは、NFATの結合部位またはNF-κBの結合部位を含む。いくつかの態様において、免疫調節タンパク質は、改変細胞を誘導物質と接触させた後またはT細胞活性化シグナル伝達の誘導後に改変細胞によって発現および分泌され、それは、場合により、改変細胞によって発現されるキメラ抗原受容体(CAR)または改変されたT細胞受容体(TCR)への抗原の結合時に誘導される。いくつかの態様において、細胞はリンパ球である。いくつかの態様において、リンパ球は、T細胞、B細胞、またはNK細胞である。いくつかの態様において、細胞はT細胞である。いくつかの態様において、T細胞はCD4+またはCD8+である。いくつかの態様において、細胞は抗原提示細胞である。いくつかの態様において、細胞は、対象から得られた初代細胞である。いくつかの態様において、対象はヒト対象である。
改変細胞のいくつかの態様において、少なくとも1つの親和性改変IgSFドメインは、野生型IgSFドメインと比較して、少なくとも1つの細胞表面同族結合パートナーに対する向上した結合親和性を有する。いくつかの態様において、少なくとも1つの細胞表面同族結合パートナーは、哺乳動物細胞上に発現する。いくつかの態様において、哺乳動物細胞は、抗原提示細胞(APC)、腫瘍細胞、またはリンパ球である。いくつかの態様において、哺乳動物細胞は、T細胞である。いくつかの態様において、哺乳動物細胞は、マウス、ラット、カニクイザル、またはヒトの細胞である。
改変細胞のいくつかの態様において、少なくとも1つの親和性改変IgSFドメインを含む免疫調節タンパク質の特異的結合は、野生型IgSFドメインと比較して、哺乳動物細胞の免疫学的活性を調節する。いくつかの態様において、少なくとも1つの親和性改変IgSFドメインを含む免疫調節タンパク質の特異的結合は、野生型IgSFドメインと比較して、哺乳動物細胞の免疫学的活性を増強する。いくつかの態様において、免疫調節タンパク質の特異的結合は、野生型IgSFドメインと比較して、哺乳動物細胞の免疫学的活性を低減する。
改変細胞のいくつかの態様において、野生型IgSFドメインは、シグナル制御タンパク質(SIRP)ファミリー、骨髄細胞に発現するトリガー受容体様(TREML)ファミリー、がん胎児性抗原関連細胞接着分子(CEACAM)ファミリー、シアル酸結合Ig様レクチン(SIGLEC)ファミリー、ブチロフィリンファミリー、B7ファミリー、CD28ファミリー、Vセットおよび免疫グロブリンドメイン含有(VSIG)ファミリー、Vセット膜貫通ドメイン(VSTM)ファミリー、主要組織適合複合体(MHC)ファミリー、シグナル伝達リンパ球活性化分子(SLAM)ファミリー、白血球免疫グロブリン様受容体(LIR)、ネクチン(Nec)ファミリー、ネクチン様(NECL)ファミリー、ポリオウイルス受容体関連(PVR)ファミリー、天然細胞傷害誘発受容体(NCR)ファミリー、T細胞免疫グロブリンおよびムチン(TIM)ファミリー、ならびにキラー細胞免疫グロブリン様受容体(KIR)ファミリーからなる群より選択されるファミリーのIgSFファミリーメンバーに由来する。いくつかの態様において、野生型IgSFドメインは、CD80、CD86、PD-L1、PD-L2、ICOSリガンド、B7-H3、B7-H4、CD28、CTLA4、PD-1、ICOS、BTLA、CD4、CD8-α、CD8-β、LAG3、TIM-3、CEACAM1、TIGIT、PVR、PVRL2、CD226、CD2、CD160、CD200、CD200R、NKp30、VISTA、VSIG3、およびVSIG8からなる群より選択されるIgSFメンバーに由来する。いくつかの態様において、野生型IgSFドメインは、ヒトIgSFドメインである。いくつかの態様において、少なくとも1つの親和性改変IgSFドメインは、SEQ ID NO:1〜27および408のいずれかに示されるアミノ酸配列に含有される野生型IgSFドメインまたはその特異的結合断片に対して少なくとも90％の配列同一性を有する。いくつかの態様において、免疫調節タンパク質は、SEQ ID NO:28〜54および410のいずれかから選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも90％の配列同一性を有する。
改変細胞のいくつかの態様において、少なくとも1つの細胞表面同族結合パートナーは、T細胞上に発現する刺激性受容体であり、少なくとも1つの親和性改変IgSFドメインは、該刺激性受容体に対して、該刺激性受容体に対する野生型IgSFドメインの結合親和性と比較して向上した結合親和性を有する。いくつかの態様において、親和性改変IgSFドメインの刺激性受容体への結合（例えば、細胞から分泌されたときの刺激性受容体への結合）は、T細胞の免疫学的活性を増強する。いくつかの態様において、親和性改変IgSFドメインの刺激性受容体への結合（例えば、細胞から分泌されたときの刺激性受容体への結合）は、T細胞の免疫学的活性を低減する。いくつかの態様において、刺激性受容体は、CD28、ICOS、またはCD226である。いくつかの態様において、少なくとも1つの親和性改変IgSFドメインは、ICOSおよびCD28のうちの少なくとも1つに対する向上した結合親和性を有する親和性改変ICOSL IgSFドメインである。いくつかの態様において、少なくとも1つの親和性改変IgSFドメインは親和性改変ICOSL IgSFドメインであり、刺激性受容体はICOSである。いくつかの態様において、少なくとも1つの親和性改変IgSFドメインは親和性改変ICOSL IgSFドメインであり、刺激性受容体はCD28である。いくつかの態様において、少なくとも1つの親和性改変IgSFドメインは親和性改変CD80 IgSFドメインであり、刺激性受容体はCD28である。いくつかの態様において、親和性改変IgSFドメインは、CTLA-4に実質的に特異的に結合しないか、または、CTLA-4に対して、CTLA-4に対する野生型IgSFドメインの結合親和性と比較して低下した結合親和性を示す。
改変細胞のいくつかの態様において、少なくとも1つの親和性改変IgSFドメインは、わずか1つの細胞表面同族結合パートナーに特異的に結合する。いくつかの態様において、免疫調節タンパク質は、わずか1つの細胞表面同族結合パートナーに特異的に結合する。
改変細胞のいくつかの態様において、少なくとも1つの親和性改変ドメインは、少なくとも2つの細胞表面同族結合パートナーに特異的に結合する。いくつかの態様において、第一の細胞表面同族結合パートナーは、T細胞上に発現する刺激性受容体であり；第二の細胞表面同族結合パートナーは、T細胞上に発現する抑制性受容体の抑制性リガンドである。いくつかの態様において、抑制性リガンドに対する親和性改変ドメインの結合は、抑制性受容体への抑制性リガンドの結合を競合的に阻害する。いくつかの態様において、抑制性受容体は、PD-1、CTLA-4、LAG-3、TIGIT、CD96、CD112R、BTLA、CD160、TIM-3、VSIG3、もしくはVSIG8であるか；または、抑制性受容体のリガンドは、PD-L1、PD-L2、B7-1、B7-2、HVEM、MHCクラスII、PVR、CEACAM-1、GAL9、もしくはVISTAである。いくつかの態様において、親和性改変IgSFドメインは親和性改変CD80ドメインであり、刺激性受容体はCD28である。いくつかの態様において、抑制性リガンドはPD-L1であり、抑制性受容体はPD-1である。いくつかの態様において、抑制性リガンドはPD-L2であり、抑制性受容体はPD-1である。いくつかの態様において、親和性改変IgSFドメインは、野生型IgSFドメインと比較して、CTLA-4に対する低下した結合親和性を示す。いくつかの態様において、親和性改変IgSFドメインは、CTLA-4に実質的に特異的に結合しない。
改変細胞のいくつかの態様において、親和性改変IgSFドメインは、親和性改変CD155 IgSFドメインまたは親和性改変CD112 IgSFドメインであり、少なくとも1つの細胞表面同族結合パートナーは、CD226、TIGIT、またはCD112Rである。いくつかの態様において、親和性改変IgSFドメインは、CD226に対して、CD226に対する野生型IgSFドメインの結合親和性と比較して低下した結合親和性を示す。いくつかの態様において、親和性改変IgSFドメインは、TIGIT(IgおよびITIMドメインを有するT細胞免疫受容体)またはCD112Rに対して、TIGITまたはCD112Rに対する野生型IgSFドメインの結合親和性と比較して向上した結合性を保持または示す。
改変細胞のいくつかの態様において、少なくとも1つの親和性改変IgSFドメインは、腫瘍特異的抗原である細胞表面同族結合パートナーに特異的に結合する。いくつかの態様において、腫瘍特異的抗原は、B7-H6である。いくつかの態様において、親和性改変IgSFドメインは、親和性改変NKp30 IgSFドメインである。
改変細胞のいくつかの態様において、少なくとも1つの親和性改変IgSFドメインは、第一の親和性改変IgSFドメインおよび第二の親和性改変IgSFドメインを含む。いくつかの態様において、第一の親和性改変IgSFドメインと第二の親和性改変IgSFドメインは異なる。いくつかの態様において、第一の親和性改変IgSFドメインおよび第二の親和性改変IgSFドメインは各々、同じ野生型IgSFドメイン内に1つまたは複数の異なるアミノ酸置換を含む。いくつかの態様において、第一の親和性改変IgSFドメインおよび第二の親和性改変IgSFドメインは各々、異なる野生型IgSFドメイン内に1つまたは複数のアミノ酸置換を含む。
改変細胞のいくつかの態様において、野生型IgSFドメインは、抑制性受容体のリガンドであるIgSFメンバーに由来し、該抑制性受容体はITIMシグナル伝達ドメインを含む。いくつかの態様において、抑制性受容体は、PD-1、CTLA-4、LAG3、TIGIT、TIM-3、BTLA、VSIG3、またはVSIG8であり、かつ少なくとも1つの親和性改変IgSFドメインはそれぞれ、PD-1、CTLA-4、LAG3、TIGIT、TIM-3、BTLA、VSIG3、またはVSIG8のリガンドの親和性改変IgSFドメインである。いくつかの態様において、抑制性受容体のリガンドは、PD-L1、PD-L2、B7-1、B7-2、MHCクラスII、PVR、CEACAM-1、GAL9、またはVISTAであり、かつ少なくとも1つの親和性改変IgSFドメインはそれぞれ、PD-L1、PD-L2、B7-1、B7-2、MHCクラスII、PVR、CEACAM-1、GAL9、またはVISTAのリガンドの親和性改変IgSFドメインである。いくつかの態様において、抑制性受容体はPD-1であり、少なくとも1つの親和性改変IgSFドメインは、PD-L1またはPD-L2の親和性改変IgSFである。いくつかの態様において、抑制性受容体はTIGITであり、親和性改変IgSFドメインは、CD155またはCD112の親和性改変IgSFドメインである。
改変細胞のいくつかの態様において、親和性改変IgSFドメインは、野生型IgSFドメインとアミノ酸置換10個以下異なる。いくつかの態様において、親和性改変IgSFドメインは、野生型IgSFドメインとアミノ酸置換5個以下異なる。
改変細胞のいくつかの態様において、1つまたは複数の親和性改変IgSFドメインは、1つまたは複数のアミノ酸置換を含む、親和性改変IgVドメイン、親和性改変IgC1ドメイン、もしくは親和性改変IgC2ドメインである、もしくはそれを含む、またはその特異的結合断片である。
改変細胞のいくつかの態様において、免疫調節タンパク質は、1つまたは複数の親和性が改変されていないIgSFドメインをさらに含む。
改変細胞のいくつかの態様においては、キメラ抗原受容体(CAR)または改変されたT細胞受容体(TCR)をさらに含む。
別の局面において、上記の改変細胞および薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物が提供される。いくつかの態様において、薬学的組成物は、滅菌状態である。
別の局面において、免疫調節タンパク質を対象に導入する方法であって、提供される改変細胞または改変細胞を含有する薬学的組成物のいずれかを対象に投与することを含む方法が提供される。
別の局面において、対象における免疫応答を調節する方法であって、提供される改変細胞または提供される改変細胞のいずれかを含有する薬学的組成物のいずれかを対象に投与することを含む方法が提供される。いくつかの態様において、免疫応答の調節は、対象における疾患または障害を治療する。いくつかの態様において、免疫応答の調節は、免疫応答の増強である。いくつかの態様において、疾患または障害は、腫瘍である。いくつかの態様において、疾患または障害は、がんである。いくつかの態様において、疾患または障害は、黒色腫、肺がん、膀胱がん、または血液学的悪性腫瘍である。いくつかの態様において、免疫応答の調節は、免疫応答の低減である。いくつかの態様において、疾患または障害は、炎症性の疾患または状態である。いくつかの態様において、疾患または状態は、クローン病、潰瘍性大腸炎、多発性硬化症、喘息、関節リウマチ、または乾癬である。
前記方法のいくつかの態様において、対象はヒトである。いくつかの態様において、細胞は、対象に対して自家である。いくつかの態様において、細胞は、対象に対して同種異系である。いくつかの態様において、改変細胞は、免疫調節タンパク質を発現および分泌する。いくつかの態様において、免疫調節タンパク質は、改変細胞によって構成的に発現される。いくつかの態様において、免疫調節タンパク質は、改変細胞を誘導物質と接触させた後に改変細胞によって発現および分泌される。いくつかの態様において、免疫調節タンパク質は、T細胞活性化シグナル伝達時に改変細胞によって発現および分泌される。いくつかの態様において、改変細胞は、キメラ抗原受容体(CAR)または改変されたT細胞受容体(TCR)を発現し、CARまたはTCRによる抗原の結合時にT細胞活性化シグナル伝達が誘導される。
また、分泌性免疫調節タンパク質または膜貫通型免疫調節タンパク質をコードする核酸分子を含有する記載の通りの感染性物質のいずれかが提供される。
膜貫通型免疫調節タンパク質(TIP)をコードする核酸分子を含有する感染性物質であって、TIPが、野生型IgSFドメイン内に1つまたは複数のアミノ酸置換を含む少なくとも1つの非免疫グロブリン親和性改変免疫グロブリンスーパーファミリー(IgSF)ドメインを含むエクトドメインであって、少なくとも1つの親和性改変IgSFドメインが、野生型IgSFドメインの少なくとも1つの細胞表面同族結合パートナーに特異的に結合する、エクトドメイン；および膜貫通ドメインを含有する、感染性物質が提供される。
いくつかの態様において、少なくとも1つの親和性改変IgSFドメインは、少なくとも1つの細胞表面同族結合パートナーに対して、参照野生型IgSFドメインと比較して向上した結合親和性を有する。
任意のそのような態様のうちのいくつかにおいて、野生型IgSFドメインは、シグナル制御タンパク質(SIRP)ファミリー、骨髄細胞に発現するトリガー受容体様(TREML)ファミリー、がん胎児性抗原関連細胞接着分子(CEACAM)ファミリー、シアル酸結合Ig様レクチン(SIGLEC)ファミリー、ブチロフィリンファミリー、B7ファミリー、CD28ファミリー、Vセットおよび免疫グロブリンドメイン含有(VSIG)ファミリー、Vセット膜貫通ドメイン(VSTM)ファミリー、主要組織適合複合体(MHC)ファミリー、シグナル伝達リンパ球活性化分子(SLAM)ファミリー、白血球免疫グロブリン様受容体(LIR)、ネクチン(Nec)ファミリー、ネクチン様(NECL)ファミリー、ポリオウイルス受容体関連(PVR)ファミリー、天然細胞傷害誘発受容体(NCR)ファミリー、T細胞免疫グロブリンおよびムチン(TIM)ファミリー、またはキラー細胞免疫グロブリン様受容体(KIR)ファミリーから選択されるファミリーのIgSFファミリーメンバーに由来する。いくつかの態様において、野生型IgSFドメインは、CD80、CD86、PD-L1、PD-L2、ICOSリガンド、B7-H3、B7-H4、CD28、CTLA4、PD-1、ICOS、BTLA、CD4、CD8-α、CD8-β、LAG3、TIM-3、CEACAM1、TIGIT、PVR、PVRL2、CD226、CD2、CD160、CD200、CD200R、NKp30、VISTA、VSIG3、およびVSIG8から選択されるIgSFメンバーに由来する。
任意のそのような態様のうちのいくつかにおいて、野生型IgSFドメインは、ヒトIgSFメンバーのものである。いくつかの態様において、膜貫通型免疫調節タンパク質は、SEQ ID NO:381〜407および409のいずれかから選択されるアミノ酸配列またはその隣接部分（親和性改変IgSFドメインおよび膜貫通ドメインを含有する）に対して、少なくとも90％の配列同一性を有する。
いくつかの態様において、膜貫通型免疫調節タンパク質は、細胞内ドメインが野生型IgSFドメインを含む野生型IgSFメンバーに由来する細胞内ドメインではない、キメラ受容体である。いくつかの場合に、細胞内ドメインは、少なくとも1つのITAM(免疫受容体チロシン活性化モチーフ)を含有するシグナル伝達ドメインを含有する。いくつかの状況で、細胞内ドメインは、CD3-ζシグナル伝達ドメインを含有する。いくつかの局面において、細胞内ドメインは、CD28共刺激ドメイン、ICOSシグナル伝達ドメイン、OX40シグナル伝達ドメイン、および41BBシグナル伝達ドメインのうちの少なくとも1つをさらに含有する。
任意のそのような態様のうちのいくつかにおいて、親和性改変IgSFドメインは、野生型IgSFドメインとアミノ酸置換10個以下または5個以下異なる。いくつかの態様において、親和性改変IgSFドメインは、1つまたは複数のアミノ酸置換を含む、親和性改変IgVドメイン、親和性改変IgC1ドメインまたは親和性改変IgC2ドメインであるもしくはそれを含有するか、またはその特異的結合断片である。
任意のそのような態様のうちのいくつかにおいて、膜貫通ドメインは、対応する野生型IgSFメンバーに由来するネイティブ膜貫通ドメインである。いくつかの場合に、膜貫通ドメインは、対応する野生型IgSFメンバーに由来するネイティブ膜貫通ドメインではない。いくつかの例では、膜貫通タンパク質は、CD8に由来する膜貫通タンパク質である。
任意のそのような態様のうちのいくつかにおいて、感染性物質は、細菌またはウイルスである。いくつかの場合に、ウイルスは、腫瘍溶解性ウイルスである。いくつかの局面において、腫瘍溶解性ウイルスは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、単純ヘルペスウイルス、水疱性口腔ウイルス(Vesticular Stomatic virus)、レオウイルス、ニューカッスル病ウイルス、パルボウイルス、麻疹ウイルス、水疱性口内炎ウイルス(vesticular stomatitis virus)(VSV)、コクサッキーウイルス、またはワクシニアウイルスである。いくつかの場合に、ウイルスは、樹状細胞(DC)を特異的に標的化し、かつ/または、樹状細胞指向性である。いくつかの態様において、ウイルスは、改変されたシンドビスウイルスエンベロープ産物で偽型化されたレンチウイルスベクターである。
任意のそのような態様のうちのいくつかにおいて、感染性物質は、標的細胞の死をもたらすかまたは免疫応答を増強もしくは強化することができるさらなる遺伝子産物をコードする核酸分子をさらに含有する。いくつかの場合に、さらなる遺伝子産物は、抗がん剤、抗転移剤、抗血管新生剤、免疫調節分子、免疫チェックポイント阻害剤、抗体、サイトカイン、成長因子、抗原、細胞傷害性遺伝子産物、アポトーシス促進性遺伝子産物、抗アポトーシス性遺伝子産物、細胞マトリックス分解性遺伝子、組織再生のための遺伝子、またはヒト体細胞の多能性へのリプログラミングのための遺伝子から選択される。
未標識の組換えヒトPD-L1-His、ヒトCTLA-4-His、またはヒトPD-L2-Fc融合タンパク質の存在下での、固定化されたCD80バリアントA91G ECD-Fc融合分子へのビオチン化組換えCD28-Fc融合タンパク質(rCD28.Fc)の結合についての競合結合アッセイの結果を示す。 未標識の組換えヒトrCD28.Fc、ヒトCTLA-4.Fc、またはヒトPD-L2.Fcの存在下での、固定化されたCD80バリアントA91G ECD-Fc融合分子へのビオチン化組換えヒトPD-L1-his単量体タンパク質の結合についての競合結合アッセイの結果を示す。 形質導入されたCD19 CAR T細胞の上清中のPD-L2 SIPの検出を示す。 形質導入されたHEK-293細胞の上清中のPD-L2 SIPの検出を示す。 例示的な試験バリアントPD-L2 SIPを形質導入されたT細胞についての増殖試験を示す。 再刺激後5日目にELISAによって測定された場合の、例示的な試験バリアントPD-L2 SIPを形質導入されたT細胞によって放出された上清中のIFN-γのレベルを示す。 標的細胞で刺激後の、CARおよび例示的なバリアントPD-L2 SIPまたは野生型PD-L2 SIPで共形質導入されたT細胞の増殖を示す。 バリアントIgSFドメイン(vIgD)が細胞、例えば第一のT細胞（例えば、CAR T細胞）から分泌される、分泌性免疫調節タンパク質(SIP)を示す。ある例示的な態様において、分泌されたvIgDの同族結合パートナーは、第一の細胞（例えば、T細胞）上および/または第二の細胞（例えば、T細胞；内因性または改変型のいずれか、例えばCAR T細胞）上に発現することができる、活性化受容体である。SIPがその同族結合パートナーと結合すると、活性化受容体を介したシグナル伝達が遮断される。全ての場合に、vIgDは、V-ドメイン(IgV)のみ、V-ドメイン(IgV)およびC-ドメイン(IgC)の組み合わせ（細胞外ドメイン(ECD)全体を含む）、またはIgSFスーパーファミリーメンバーのIgドメインの任意の組み合わせであることができる。 バリアントIgSFドメイン(vIgD)が細胞、例えば第一のT細胞（例えば、CAR T細胞）から分泌される、分泌性免疫調節タンパク質(SIP)を示す。ある例示的な態様において、分泌されたvIgDの同族結合パートナーは、第一の細胞（例えば、CAR T細胞）上および/または第二の細胞（例えば、T細胞；内因性または改変型のいずれか、例えばCAR T細胞）上に発現することができる、抑制性受容体である。SIPがその同族結合パートナーと結合すると、SIPは、抑制性受容体を介する負のシグナル伝達に拮抗するかまたはそれを遮断し、それによって、活性化されたT細胞またはエフェクターT細胞が遮断される。全ての場合に、vIgDは、V-ドメイン(IgV)のみ、V-ドメイン(IgV)およびC-ドメイン(IgC)の組み合わせ（細胞外ドメイン(ECD)全体を含む）、またはIgSFスーパーファミリーメンバーのIgドメインの任意の組み合わせであることができる。 例示的な試験バリアントPD-L1 SIPを形質導入されたT細胞についての増殖試験を示す。 形質導入されたHEK-293細胞の上清中のSIP（バリアントまたは野生型のPD-L1 SIPおよびPD-L2 SIPを含む）の検出についての細胞ベースアッセイの結果を示す。
詳細な説明
本明細書において、細胞において発現されると分泌されることができる分泌性免疫調節タンパク質、それをコードする核酸およびベクター、ならびに、そのような免疫調節タンパク質を発現および分泌するように改変された細胞（例えば免疫細胞）または感染性物質が提供される。免疫調節タンパク質は、野生型IgSFドメイン内に1つまたは複数のアミノ酸置換を含む親和性改変IgSFドメインであって、少なくとも1つの親和性改変IgSFドメインが、野生型IgSFドメインの少なくとも1つの細胞表面同族結合パートナーに特異的に結合する、親和性改変IgSFドメインを含有する。いくつかの態様において、免疫調節タンパク質は、膜貫通ドメインおよび/または半減期延長部分を含まない。
提供される態様の中には、例えば免疫調節タンパク質をコードする発現ベクターを含むように細胞を改変することによって免疫調節タンパク質を発現および分泌するように改変された細胞（例えば、免疫細胞（例えば、T細胞））がある。いくつかの態様において、発現ベクターによってコードされる免疫調節タンパク質は、細胞が免疫調節タンパク質を発現したときに免疫調節タンパク質が改変細胞によって分泌されるように、分泌のためのシグナル配列の機能的制御下にある。いくつかの態様において、免疫調節タンパク質の発現は、プロモーターの機能的制御下にある。プロモーターは、例えば、誘導性プロモーターであることができる。いくつかの態様において、誘導性プロモーターは、T細胞活性化シグナル伝達に応答性のエレメントに応答性である。いくつかの態様において、改変細胞（例えば、T細胞）はまた、抗原結合時にT細胞シグナル伝達を誘導または媒介することができるかまたは誘導または媒介する細胞内シグナル伝達ドメインを含有する抗原受容体、例えばT細胞受容体(TCR)またはキメラ抗原受容体(CAR)を、その表面上に発現するように改変される。いくつかの局面において、細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫受容体チロシン活性化モチーフ(ITAM)を含む。したがって、いくつかの態様において、改変免疫細胞は、免疫細胞の活性化に応答したとき（いくつかの局面において、改変された抗原受容体による抗原の認識に応答したときを含む）のみ、免疫調節タンパク質を発現および分泌する。
また、本明細書において、免疫調節タンパク質を対象に導入する方法であって、改変細胞または感染性物質（または改変細胞もしくは感染性物質を含む薬学的組成物）を対象に投与することを含む方法が提供される。別の局面において、対象における免疫応答を調節する方法であって、改変細胞（または改変細胞もしくは感染性物質を含む薬学的組成物）を対象に投与することを含む方法が提供される。別の局面において、治療を必要とする対象（例えば、がんなどの疾患を有する対象）を治療する方法であって、改変細胞または感染性物質（または改変細胞もしくは感染性物質を含む薬学的組成物）の有効量を対象に投与することを含む方法が提供される。改変細胞は、細胞の集団、例えば細胞培養物または多数の別々に改変された細胞であることができる。
いくつかの態様において、提供される改変細胞が対象に投与され、対象に投与された改変細胞は、誘導シグナル（例えば、免疫細胞活性化または誘導物質の投与）に応答して免疫調節タンパク質を発現および分泌する。いくつかの態様において、改変細胞は、免疫調節タンパク質を構成的に発現および分泌する。いくつかの態様において、改変細胞は、疾患細胞または病変、例えば腫瘍微小環境中に存在する細胞（例えば、腫瘍細胞）に局在化し、これは、いくつかの局面において、改変細胞によって発現される改変された抗原受容体による抗原の認識によって媒介され、それによって、分泌性免疫調節タンパク質を疾患または病変の部位、例えば腫瘍微小環境に標的化する。
いくつかの態様において、免疫調節タンパク質の同族結合パートナーは、1つまたは複数の他の免疫受容体（例えば、リンパ球上の）と会合して抑制シグナルまたは活性化シグナルを誘導する免疫細胞によって発現される、細胞表面タンパク質である。例えば、抗原提示細胞(APC)または標的細胞とリンパ球との間で免疫学的シナプス(IS)を形成する、リンパ球上のある特定の受容体とそれらの細胞表面同族結合パートナーとの相互作用は、免疫系を調節することができる共刺激シグナルまたは抑制シグナルを提供することができる。いくつかの局面において、本明細書において提供される免疫調節タンパク質（改変細胞によって発現および分泌されることができる）は、細胞表面タンパク質リガンドとそれらの受容体との相互作用を変更して、免疫細胞（例えばT細胞）の活性を調節することができる。いくつかの態様において、リガンド（同族結合パートナー）への免疫調節タンパク質の結合は、免疫調節タンパク質が特異的に結合する細胞の免疫学的免疫応答を調節する（例えば、誘導する、増強する、または抑制する）。いくつかの態様において、提供される通りの、例えば改変細胞によって分泌される分泌性免疫調節タンパク質は、その同族結合パートナーを抑制する、例えば阻害するかまたはそれに拮抗する。
いくつかの態様において、正常な生理的条件下では、T細胞媒介性免疫応答は、T細胞受容体（TCR）による抗原認識によって開始され、かつ、共刺激シグナルと抑制シグナル（すなわち、免疫チェックポイントタンパク質）とのバランスによって制御される。免疫系は、自己免疫を抑制する（すなわち、自己寛容）、および、免疫応答の間（例えば、病原体感染に対する攻撃の間）の過度の損傷から組織を保護する、免疫チェックポイントに依拠する。しかしながら、いくつかの場合では、これらの免疫調節タンパク質は、腫瘍を含む疾患および状態において、免疫系を回避するための機序として脱制御されている可能性がある。
したがって、いくつかの局面において、T細胞活性のような免疫細胞活性を変化させる免疫療法は、免疫応答が脱制御されているある種の疾患および状態を治療することができる。ISにおける相互作用を調節しようとする治療アプローチは、複数のIS標的に同時にかつ時系列および空間的方向性に感受性である様式で結合する能力から恩恵を受けるだろう。現行の治療アプローチは、この目標に達していない。野生型受容体およびリガンドが保有する同族結合パートナーに対する親和性は低く、これは、可溶性治療薬としてのそれらの使用を妨げ得る。さらに、可溶性受容体および抗体は、いくつかの局面において、典型的には一度に1つより多くの標的タンパク質に結合し、かつ/またはその標的に（例えば、一度にわずか1つの標的種に）競合的に結合し、それゆえ、複数の標的に同時に結合する能力を欠いている。そして、一方で、二重特異性抗体、および二つの抗原結合領域を含むモダリティは、複数の標的分子に同時に結合することができるが、これらのモダリティに特有の三次元配置は、しばしば、それらの時間的および空間的要件に合致するやり方でこれらがISにおいて起こる重要なプロセスに介入することを妨げる。
必要とされるものは、抗体の特異性および親和性を有するが、加えて、ISにおいて必要とされるサイズ、体積、および空間的方向性の制約を維持する、全く新しいクラスの治療用分子である。さらに、このような治療薬は、それらの標的に非競合的および競合的に結合する能力を有するだろう。それゆえ、これらの特性を備えた分子は、ISにおいて多タンパク質複合体へ一体化する能力において新規機能を有し、かつ、所望の結合配置および結果としてもたらされる生物学的活性を生じさせるだろう。
この目的に向けて、新たに出現した免疫腫瘍学治療法は、腫瘍により誘導されるT細胞寛容を安全に破壊することを必要とする。現在の最先端の免疫治療薬は、T細胞エフェクター機能を制限することが知られているB7/CD28ファミリーの中心的阻害分子である、PD-1またはCTLA4をブロックする。このような単一標的に対するアンタゴニスト抗体は、免疫シナプスチェックポイントシグナル伝達複合体を崩壊させるように機能するが、同時にT細胞を活性化するには不十分である。反対に、二重特異性抗体アプローチは、T細胞を活性化するが、それと同時に、誘導されたシグナルを制御する抑制性リガンドをブロックするには、不十分である。
これらの欠点に取り組むために、免疫細胞の活性を調節することができる免疫療法（例えば、細胞療法）を提供する。いくつかの態様において、免疫細胞シグナル伝達（例えば、T細胞活性化シグナル伝達）を増強することができ、かつ/または抑制性制御をブロックすることができ、場合によってはそれらが同時に行われる、免疫療法が提供される。いくつかの態様において、提供される免疫療法は、T細胞活性化および抑制性リガンドのブロックの両方における二つの役割を有することが知られている、免疫シナプスの免疫グロブリンスーパーファミリー（IgSF）成分に関する。いくつかの局面において、ヒト免疫系リガンドのような免疫系リガンドから改変されたIgSFベースの細胞療法は、それ自体、免疫シナプスの重要な経路に正常に集合するそれらの能力を保持し、かつ、抗体または次世代の二重特異性試薬ができない方法で正常な相互作用および制御機能を維持する可能性がより高い。これは、抗体のその相対的に大きなサイズ、および、これらが免疫シナプスの天然成分ではないという事実に起因する。ヒト免疫系リガンドのこれらの固有の特徴、およびそのようなリガンドの親和性改変バリアントを発現するように改変された細胞は、新たなレベルの免疫療法的有効性および安全性を提供することを約束する。特定の局面において、提供される改変細胞は、親和性が改変された天然の免疫リガンドを使用した分泌可能な免疫調節プラットフォームであって、様々な腫瘍学的および免疫学的適応症の治療における、調整可能な親和性でそれらの同族免疫受容体の1つまたは複数に結合する免疫療法生物製剤を生成するプラットフォームを提供する。
本明細書において言及される全ての刊行物（特許、特許出願、科学論文およびデータベースを含む）は、それぞれ個々の刊行物（特許、特許出願、科学論文およびデータベースを含む）が参照によって組み入れられると具体的にかつ個別に示されたかのように同程度に、参照によってその全体が全ての目的において本明細書に組み入れられる。本明細書に示されている定義が参照によって本明細書に組み入れられる特許、出願、公開出願および他の刊行物に示されている定義に反しているかまたは他に矛盾している場合、本明細書に示されている定義が参照によって本明細書に組み入れられる定義より優先される。
本明細書において使用される項目の見出しは、単に構成を目的としたものであって、記載される主題を限定するものと解釈されるべきではない。
I．定義
別段の定義のない限り、本明細書において使用される全ての専門用語、注記、ならびに他の技術および科学用語または関連用語は、請求される主題が属する技術分野の当業者によって通常理解されているものと同じ意味を有することを意図する。いくつかの場合では、通常理解されている意味を有する用語は、明確化のためおよび／またはすぐに参照できるように本明細書において定義され、そして、本明細書におけるこのような定義の包含は、必ずしも一般に当技術分野において理解されているものと大きな差異をなすと解釈されるべきではない。
本明細書を通して使用される用語は、特定の事例において別段限定されない限り、以下のとおり定義される。別段の定義のない限り、本明細書において使用される全ての技術および科学用語、頭字語、ならびに略称は、本発明が属する技術分野の当業者によって通常理解されているものと同じ意味を有する。別段の指示のない限り、化学名および生化学名の略称および記号は、IUPAC-IUB命名法による。別段の指示のない限り、全ての数値範囲は、その範囲を規定する値だけでなくその間の全ての整数値も含む。
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形の「a」、「an」、および「the」は、その文脈が他のことを明確に示さない限り、複数形の指示対象を含む。
用語「親和性改変」は、免疫グロブリンスーパーファミリードメインの文脈において使用される場合、親の野生型または未改変の（すなわち、親和性が改変されていない）IgSF対照ドメインと比較してその同族結合パートナー（あるいは「カウンター構造体」）のうちの少なくとも1つに対する結合親和性またはアビディティが（対応する野生型の親または未改変IgSFドメインと比べて）向上または低下するように変化したアミノ酸配列を有する哺乳動物免疫グロブリンスーパーファミリー（IgSF）ドメインを意味する。いくつかの態様において、親和性が改変されたIgSFドメインは、野生型または未改変のIgSFドメイン中に1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30またはそれ以上のアミノ酸の差異（例えば、アミノ酸置換）を含有することができる。結合親和性またはアビディティの向上または低下は、フローサイトメトリーなどの周知の結合アッセイを使用して決定することができる。Larsen et al., American Journal of Transplantation, Vol 5: 443-453 (2005)。また、Linsley et al., Immunity, 1: 7930801 (1994) も参照されたい。その同族結合パートナーに対するタンパク質の結合親和性またはアビディティの向上は、野生型IgSFドメイン対照よりも少なくとも10％大きい値、いくつかの態様において、野生型IgSFドメイン対照値よりも少なくとも20％、30％、40％、50％、100％、200％、300％、500％、1000％、5000％、または10000％大きい値になる向上である。その同族結合パートナーのうちの少なくとも1つに対するタンパク質の結合親和性またはアビディティの低下は、対照の90％以下であるが野生型IgSFドメイン対照値の10％以上の値、いくつかの態様において、野生型IgSFドメイン対照値の80％、70％、60％、50％、40％、30％、または20％以下であるが10％以上の値になる低下である。親和性が改変されたタンパク質は、アミノ酸残基の置換、付加、または欠失によって一次アミノ酸配列が変化している。用語「親和性改変IgSFドメイン」は、親和性改変IgSFドメインが作製された任意の特定の出発組成物または方法のあらゆる条件を強要するものと解釈されるべきではない。したがって、本発明の親和性改変IgSFドメインについては、任意の特定の親和性改変プロセスによって野生型IgSFドメインが親和性改変IgSFドメインへと変換されるのに限定されない。親和性改変IgSFドメインポリペプチドは、例えば、野生型哺乳動物IgSFドメイン配列情報から開始して生成され、次いで、その同族結合パートナーに対する結合性についてインシリコでモデル化され、そして、最後に組換えまたは化学合成されて、主題の親和性改変IgSFドメイン組成物を生成することができる。別のほんの一例として、親和性改変IgSFドメインは、野生型IgSFドメインの部位特異的変異誘発によって作製することができる。したがって、親和性改変IgSFドメインは、任意の所与のプロセスによって生産されるが必ずしもその必要はない、生成物を表す。組換え法、化学合成、またはその組み合わせを含む様々な技術を用いてもよい。
用語「同種」は、本明細書において使用される場合、ある生物から取り出され、次いで同じ種の遺伝的に異なる生物に注入または養子移入される、細胞または組織を意味する。
用語「自家」は、本明細書において使用される場合、同じ生物から取り出され、後に前記生物に注入または養子移入される、細胞または組織を意味する。自家の細胞または組織を、例えば、組換えDNA法によって、生物から取り出される天然の細胞または天然の組織とはもはや遺伝的に同一ではないように改変することができる。例えば、天然の自家T細胞を、（改変細胞から分泌され得る）免疫調節タンパク質および／またはキメラ抗原受容体（CAR）を発現する自家の改変細胞となるように組換えDNA技術によって遺伝的に改変することができ、これは、いくつかの場合では、T細胞またはTIL（腫瘍浸潤性リンパ球）を改変することを包含する。次いで、改変細胞を、天然のT細胞が単離された患者へ注入することができる。いくつかの態様において、生物は、ヒトまたはマウスである。
用語「結合親和性」および「結合アビディティ」は、本明細書において使用される場合、特異的結合条件下でのあるタンパク質のその同族結合パートナー（すなわち、そのカウンター構造体）に対する、それぞれ特異的結合親和性および特異的結合アビディティを意味する。生化学速度論では、アビディティは、複数の個々の非共有結合相互作用（例えば、あるIgSFドメインとその同族結合パートナー（すなわち、そのカウンター構造体）との間の非共有結合相互作用）の親和性の強さの総和を指す。このように、アビディティは、単一の相互作用の強さを表す親和性とは異なる。その同族結合パートナーに対する親和性改変IgSFドメインの結合親和性の向上または低下は、未改変のIgSFドメイン（例えば、天然のまたは野生型のIgSFドメイン）の結合親和性と比較して決定される。結合親和性またはアビディティを決定するための方法は、当技術分野で公知である。例えば、Larsen et al., American Journal of Transplantation, Vol 5: 443-453 (2005) を参照されたい。用語「細胞表面カウンター構造体」（あるいは「細胞表面同族結合パートナー」）は、本明細書において使用される場合、哺乳動物細胞上に発現するカウンター構造体（あるいは、同族結合パートナー）である。典型的には、細胞表面同族結合パートナーは膜貫通型タンパク質である。いくつかの態様において、細胞表面同族結合パートナーは受容体である。
用語「キメラ抗原受容体」または「CAR」は、本明細書において使用される場合、少なくともエクトドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内ドメインを含む、哺乳動物細胞上に発現する人工の（すなわち、人造の）膜貫通型タンパク質を指す。場合により、CARタンパク質は、共有結合によりエクトドメインを膜貫通ドメインに連結する「スペーサー」を含む。スペーサーは、多くの場合、ペプチド結合を介してエクトドメインを膜貫通ドメインに連結するポリペプチドである。CARは、典型的には、哺乳動物リンパ球上に発現する。いくつかの態様において、CARは、T細胞または腫瘍浸潤性リンパ球（TIL）のような哺乳動物細胞上に発現する。T細胞上に発現するCARは、本明細書においてCAR T細胞または「CAR-T」と称される。いくつかの態様において、CAR-Tは、ヘルパーT細胞、細胞傷害性T細胞、ナチュラルキラーT細胞、メモリーT細胞、制御性T細胞、またはγδT細胞である。例えば養子細胞移入において臨床的に使用されるとき、患者の腫瘍に対して抗原結合特異性を有するCARは、典型的には、患者から得られる天然リンパ球上に発現するように改変される。CARを発現する改変されたリンパ球は、次いで患者に注入して戻される。したがって、リンパ球は、多くの場合自家T細胞ではあるが、同種のT細胞も本発明の範囲内に含まれる。CARのエクトドメインは、生理的条件下で腫瘍特異的抗原などの抗原と特異的に結合する、抗体またはその抗原結合断片（例えば、scFv）などの抗原結合領域を含む。特異的結合によって、生化学的な一連の事象（すなわち、シグナル伝達）は、CARを発現する細胞の免疫活性の調節をもたらす。したがって、例えば、その抗原へのCAR-Tの抗原結合領域の特異的結合によって、細胞傷害性、増殖またはサイトカイン産生の変化によって反映されるとおり、T細胞活性の免疫活性の変化を導くことができる。CAR活性化によるシグナル伝達は、いくつかの態様において、天然の哺乳動物T細胞におけるシグナル伝達に関与するCD3ζ鎖（「CD3z」）によって達成される。CARは、T細胞の免疫調節応答をさらに調節するための複数のシグナル伝達ドメイン（例えば、CD28、ICOS、41BB、またはOX40）をさらに含んでもよい。CD3zは、T細胞受容体シグナル伝達に関与する免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ITAM）として知られている保存されたモチーフを含む。
IgSFドメインまたは親和性改変IgSFドメインなどのタンパク質に関する用語「同族結合パートナー」または「カウンター構造体」は、言及されるタンパク質が特異的結合条件下で特異的に結合する少なくとも1つの分子（典型的には、天然の哺乳動物タンパク質）を指す。いくつかの局面において、親和性改変IgSFドメインは、対応する天然または野生型のIgSFドメインの同族結合パートナーに特異的に結合するが、親和性は向上または低下している。特異的結合条件下で認識されてその同族受容体に特異的に結合するリガンドの一種は、その受容体のカウンター構造体または同族結合パートナーの一例である。特異的結合条件下で天然リガンドが認識して特異的に結合する受容体は、そのリガンドの同族結合パートナーの一例である。同様に、天然リガンドは、その受容体の同族結合パートナーである。例えば、ICOSLは、CD28およびICOSに特異的に結合し、したがって、これらのタンパク質は、ICOSLの同族結合パートナーである。別の例では、腫瘍特異的抗原およびそれが特異的に結合する親和性改変IgSFドメインは各々、他方の同族結合パートナーである。本発明において、「細胞表面分子種」は、免疫シナプスを形成する哺乳動物細胞などの細胞（例えば、免疫細胞）上にまた該細胞によって発現される免疫シナプス（IS）のリガンドの同族結合パートナーである。
用語「競合的結合」は、本明細書において使用される場合、あるタンパク質が、少なくとも2種の同族結合パートナーに特異的に結合することができるが、1つの同族結合パートナーの特異的結合が第二の同族結合パートナーの同時結合を阻害する（例えば、妨害するまたは妨げる）ことを意味する。したがって、いくつかの場合では、あるタンパク質が2つの同族結合パートナーに同時に結合することはできない。一般に、競合結合剤は、結合のための同じまたは重複した結合部位を含有するが、これは必須要件ではない。いくつかの態様において、競合的結合は、第二の同族結合パートナーの特異的結合に起因して、その同族結合パートナーのうちの1つへのタンパク質の特異的結合の測定可能な（部分的または完全な）阻害を引き起こす。ELISA（酵素結合免疫吸着アッセイ）またはForte-Bio社のOctet実験システムなどの競合的結合を定量する様々な方法が公知である。
用語「保存的アミノ酸置換」は、本明細書において使用される場合、あるアミノ酸残基が類似の化学特性（例えば、電荷または疎水性）を備える側鎖R基を有する別のアミノ酸残基によって置換されている、アミノ酸置換を意味する。類似の化学特性を備える側鎖を有するアミノ酸の群の例は、1）脂肪族側鎖：グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシン；2）脂肪族-ヒドロキシル側鎖：セリンおよびトレオニン；3）アミド含有側鎖：アスパラギンおよびグルタミン；4）芳香族側鎖：フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファン；5）塩基性側鎖：リシン、アルギニン、およびヒスチジン；6）酸性側鎖：アスパラギン酸およびグルタミン酸；ならびに7）硫黄含有側鎖：システインおよびメチオニンを含む。保存的アミノ酸置換の群は、バリン-ロイシン-イソロイシン、フェニルアラニン-チロシン、リシン-アルギニン、アラニン-バリン、グルタマート-アスパルタート、およびアスパラギン-グルタミンである。
タンパク質の位置に関する「に対応する」という用語、例えば、ヌクレオチドまたはアミノ酸の位置が（例えば、配列表に示されている）開示された配列中のヌクレオチドまたはアミノ酸の位置「に対応する」という記述は、構造配列アライメントに基づいてまたは標準的なアライメントアルゴリズム（例えば、GAPアルゴリズム）を使用して、開示された配列とのアライメントによって同定される、ヌクレオチドまたはアミノ酸の位置を指す。配列をアライメントすることによって、当業者は、例えば保存されているアミノ酸残基および同一のアミノ酸残基を規準として使用して、対応する残基を同定することができる。
用語「サイトカイン」は、例えば、インターロイキン、インターフェロン（IFN）、ケモカイン、造血成長因子、腫瘍壊死因子（TNF）、およびトランスフォーミング成長因子を含むが、それらに限定されない。一般に、これらは、免疫系の細胞の成熟、活性化、増殖、および分化を制御する、低分子量タンパク質である。
用語「誘導体」または「誘導体化されている」は、その治療的恩恵を保持または増強させながら、半減期、バイオアベイラビリティ、免疫原性、溶解性、毒性、効力、または有効性などの特性を変化させるための、免疫調節タンパク質を直接または間接的に共有結合させることによる免疫調節タンパク質の修飾を指す。誘導体は、グリコシル化、ペグ化、脂質化、またはFc融合によって製造することができる。いくつかの態様において、免疫調節タンパク質は誘導体化されていない。いくつかの態様において、免疫調節タンパク質は、半減期延長部分（例えばFcドメイン）にコンジュゲートされていない。
本明細書において使用される場合、「ドメイン」（典型的には、3以上、一般に5または7またはそれ以上のアミノ酸、例えば10〜200のアミノ酸残基の配列）は、分子の他の部分と構造的および／または機能的に異なりかつ同定可能な分子（例えば、タンパク質またはコーディング核酸）の一部を指す。例えば、ドメインは、1つまたは複数の構造モチーフで構成されているタンパク質内で独立して折り畳まれた構造を形成することができ、かつ／または結合活性などの機能活性によって認識される、ポリペプチド鎖の一部を含む。タンパク質は、1つまたは複数の別個のドメインを有することができる。例えば、ドメインは、関連ファミリーメンバーに対する一次配列または構造の相同性、例えばモチーフに対する相同性によって、同定、定義、または識別することができる。別の例では、ドメインは、その機能（例えば、同族結合パートナーなどの生体分子と相互作用する能力）によって識別することができる。ドメインが独立してまたは別の分子に融合して、活動（例えば、結合）を遂行することができるように、ドメインは、独立して、生物学的機能または活性を示すことができる。ドメインは、線形のアミノ酸配列または非線形のアミノ酸配列であることができる。多くのポリペプチドは、複数のドメインを含有する。このようなドメインは、公知であり、かつ、当業者が同定することができる。本明細書における例示のため、定義が提供されるが、名称によって特定のドメインを認識することは十分に当技術分野の技能の範囲内であると理解される。必要であれば、ドメインを同定するために適切なソフトウェアを採用することができる。IgSFドメインのドメイン構成を説明するために使用されるSEQ ID NOとして示される特定の配列を含めたアミノ酸についての言及は、説明を目的としており、提供される態様の範囲を限定することを意味していないことが理解される。ポリペプチドおよびそのドメインの説明は、類似の分子との相同性分析およびアライメントに基づいて理論的に導出されることが理解される。したがって、正確な遺伝子座は、変化することができ、必ずしもタンパク質毎に同じとは限らない。よって、特定のIgSFドメイン、例えば特定のIgVドメインまたはIgCドメインは、数個のアミノ酸（1、2、3または4個）長めまたは短めになることができる。
用語「エクトドメイン」、「細胞外ドメイン」、または「ECD」は、本明細書において使用される場合、膜タンパク質（例えば、膜貫通型タンパク質）の、小胞膜の外側（例えば、細胞の外側の空間）にある領域を指す。エクトドメインは、多くの場合、特異的なリガンドまたは特異的な細胞表面受容体と、例えば当該リガンドまたは当該細胞表面受容体に特異的に結合する結合ドメインを介して相互作用する。
用語「有効量」または「治療有効量」は、単独（すなわち、単剤療法として）または追加の治療剤との組み合わせのいずれかでエクスビボ（患者由来の細胞との接触による）またはインビボ（患者への投与による、例えば養子移入による）で投与されたとき、例えば、疾患の症状および／または病因を改善または排除することによって、疾患進行の統計的に有意な阻害をもたらす、本発明の治療用組成物（例えば、改変細胞を含有する組成物）の量および／または濃度を指す。免疫系の疾患または障害を治療するための有効量は、疾患または障害と関連する少なくとも1つの症状または生物学的応答もしくは影響を緩和する、低下させる、または軽減する、疾患または障害の進行を防止する、あるいは患者の身体機能を改善する量であり得る。細胞療法の場合、有効量は、患者に投与される細胞の有効用量または有効数である。いくつかの態様において、患者は、ヒト患者である。
用語「細胞内ドメイン」は、本明細書において使用される場合、いくつかの膜タンパク質（例えば、膜貫通型タンパク質）において見いだされる、細胞表面膜によって画定される内部空間内に延びる領域を指す。哺乳動物細胞では、細胞内ドメインは、膜タンパク質の細胞質領域である。細胞内において、細胞内ドメインは、細胞内構成成分と相互作用し、かつ、シグナル伝達においてある役割を果たすことができ、したがって、いくつかの場合では、細胞内シグナル伝達ドメインであることができる。細胞の膜貫通型タンパク質の細胞内ドメインは、代替的に細胞質ドメインと称され、これは、いくつかの場合では、細胞質シグナル伝達ドメインであることができる。
用語「増強された」または「増加した」は、本明細書において哺乳動物リンパ球の免疫活性の増強の文脈で使用される場合、リンパ球の1つまたは複数の活性の増強を意味する。活性の増強は、細胞生存、細胞増殖、サイトカイン産生、またはT細胞の細胞傷害性のうちのうちの1つまたは複数の（例えば、統計的に有意な量の）増強であり得る。いくつかの態様において、増強された免疫活性への言及は、インターフェロンγ（IFNγ）産生を（例えば、統計的に有意な量だけ）増加させることを意味する。リンパ球の活性を評価する方法は、本明細書に記載のとおりのいずれかのアッセイを含め、当技術分野において公知である。いくつかの態様において、増強は、非ゼロ対照値より少なくとも10％、20％、30％、40％、50％、75％、100％、200％、300％、400％、または500％大きい増強であり得る。
用語「改変細胞」は、本明細書において使用される場合、ヒトによる介入（例えば、組換えDNA法またはウイルス形質導入法）によって遺伝的に改変された哺乳動物細胞を指す。いくつかの態様において、改変細胞は、免疫細胞、例えばリンパ球（例えば、T細胞、B細胞、NK細胞）または抗原提示細胞（例えば、樹状細胞）である。細胞は、患者由来の初代細胞であってもよいし、細胞株であってもよい。いくつかの態様において、改変細胞は、本明細書に記載の免疫調節タンパク質を発現および分泌することができる。いくつかの態様において、改変細胞は、改変されたT細胞受容体(TCR)またはキメラ抗原受容体(CAR)をさらに発現または含有する。
用語「改変されたT細胞」は、本明細書において使用される場合、ヒトによる介入（例えば、組換えDNA法）によって遺伝的に改変されたT細胞（例えば、Tヘルパー細胞、細胞傷害性T細胞(あるいは、細胞傷害性Tリンパ球もしくはCTL)、ナチュラルキラーT細胞、制御性T細胞、メモリーT細胞、またはγδT細胞）を指す。いくつかの態様において、改変されたT細胞は、本明細書に記載の免疫調節タンパク質を発現および分泌することができる。
用語「改変されたT細胞受容体」または「改変されたTCR」は、多くの場合、養子免疫療法に使用される、選択され、クローニングされ、かつ/またはその後T細胞の集団に導入される、主要組織適合複合体(MHC)/ペプチド標的抗原に所望の親和性で特異的に結合するように改変されたT細胞受容体(TCR)を指す。改変されたTCRとは対照的に、CARは、MHC非依存的に標的抗原に結合するように改変されている。
細胞「上に発現する」タンパク質は、本明細書において、細胞によって発現されるタンパク質および少なくとも一部が細胞の表面上に存在するタンパク質に言及するために使用される。細胞上に発現するタンパク質には、膜貫通タンパク質または細胞表面受容体が含まれる。いくつかの態様において、タンパク質は、薬物または検出可能標識などの低分子部分にコンジュゲートされる。
用語「半減期延長部分」は、ポリペプチド融合物または化学的コンジュゲートの一部分であって、そのように該部分にコンジュゲートされていないタンパク質の半減期と比較して哺乳動物血清中に循環するタンパク質の半減期を延長する部分を指す。いくつかの態様において、半減期は、1.2倍、1.5倍、2.0倍、3.0倍、4.0倍、5.0倍、もしくは6.0倍より大きく、または約1.2倍、約1.5倍、約2.0倍、約3.0倍、約4.0倍、約5.0倍、もしくは約6.0倍より大きく延長される。いくつかの態様において、半減期は、半減期延長部分を有さないタンパク質と比較して、インビボ投与後、6時間超、12時間超、24時間超、48時間超、72時間超、96時間超、または1週間超延長される。半減期は、タンパク質がその濃度、量、または活性の半分を喪失するのに要する時間を指す。半減期を、例えば、ELISAアッセイまたは活性アッセイを使用することによって決定することができる。例示的な半減期延長部分には、Fcドメイン、多量体化ドメイン、ポリエチレングリコール(PEG)、ヒドロキシエチルデンプン(HES)、XTEN(伸長された組換えペプチド；WO2013130683を参照のこと)、ヒト血清アルブミン(HSA)、ウシ血清アルブミン(BSA)、脂質(アシル化)、およびポリ-Pro-Ala-Ser(PAS)、およびポリグルタミン酸(グルタミル化)が含まれる。
用語「宿主細胞」は、組換え発現ベクターによってコードされるタンパク質を発現させるために使用することができる任意の細胞を指す。宿主細胞は、原核生物、例えば、大腸菌（E. coli）であることができるか、または、宿主細胞は、真核生物、例えば、単細胞真核生物（例えば、酵母または他の真菌）、植物細胞（例えば、タバコまたはトマト植物細胞）、動物細胞（例えば、ヒト細胞、サル細胞、ハムスター細胞、ラット細胞、マウス細胞、または昆虫細胞）またはハイブリドーマであることができる。宿主細胞の例には、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞またはそれらの誘導体、例えば、無血清培地で成長するVeggie CHOおよび関連細胞株またはDHFR欠損であるCHO系統DX-B11が含まれる。
用語「免疫シナプス」（「IS」と略記される）は、本明細書において使用される場合、MHC（主要組織適合複合体）IまたはMHC IIを発現する哺乳動物細胞（例えば、抗原提示細胞または腫瘍細胞）と、哺乳動物リンパ球（例えば、エフェクターT細胞またはナチュラルキラー（NK）細胞）との間の接触面を意味する。
用語「免疫グロブリン」（「Ig」と略記される）は、本明細書において使用される場合、用語「抗体」（「Ab」と略記される）と同義であり、かつ、5種のヒトクラス：IgA（サブクラスIgA1およびIgA2を含む）、IgD、IgE、IgG（サブクラスIgG1、IgG2、IgG3、およびIgG4を含む）、およびIgMのいずれかを含む哺乳動物免疫グロブリンタンパク質を指す。該用語はまた、完全または部分的合成（例えば、組換えまたは化学合成）であるか天然に産生されるかにかかわらず全長未満である免疫グロブリン、例えば、抗原結合断片（Fab）、VHおよびVLを含有する可変断片（Fv）、1つの鎖中で一緒に連結されたVHおよびVLを含有する単鎖可変断片（scFv）、ならびに他の抗体V領域断片（Fab’、F(ab)2、F(ab’)2、dsFvダイアボディ、Fc、およびFdポリペプチド断片）を含む。ホモ二重特異性およびヘテロ二重特異性の二重特異性抗体は、該用語の範囲内に含まれる。
免疫グロブリン分子のFc（結晶性断片）領域またはドメイン（Fcポリペプチドとも呼ばれる）は、主に免疫グロブリン重鎖の定常領域に対応し、かつ、抗体のエフェクター機能を含む種々の機能に関与している。免疫グロブリンFc融合物（「Fc融合物」）は、免疫グロブリンのFc領域に機能的に連結されている1つまたは複数のポリペプチド（または1つまたは複数の低分子）を含む分子である。Fc融合物は、例えば、抗体のFc領域（いくつかの場合には、エフェクター機能および薬物動態を促進する）および野生型もしくは親和性が改変された免疫グロブリンスーパーファミリードメイン（「IgSF」）のIgSFドメイン、または他のタンパク質もしくはその断片のFc領域を含み得る。いくつかの態様において、Fcは、エフェクター機能を促進する低下した（例えば、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％またはそれ以上低下した）活性を示すバリアントFcである。IgSFドメインは、同族結合パートナーの認識を媒介する（抗原に対する抗体の抗体可変領域の認識に匹敵する）。免疫グロブリンFc領域は、1つまたは複数のポリペプチドまたは低分子（融合パートナー）に間接的または直接的に連結し得る。種々のリンカーは、当技術分野において公知であり、これを使用して、Fcを融合パートナーに連結させてFc融合物を生成することができる。Fc融合タンパク質は、少なくとも1つの親和性改変IgSFドメインに直接または間接的に共有結合された免疫グロブリンFc領域を含むことができる。同一種のFc融合物は、二量体化してFc融合ホモ二量体を形成することができるか、または、非同一種を使用してFc融合ヘテロ二量体形成することができる。いくつかの態様において、免疫調節タンパク質は、Fcドメインまたはその任意の部分にコンジュゲートされていない。
用語「免疫グロブリンスーパーファミリー」または「IgSF」は、本明細書において使用される場合、細胞の、認識、結合、または接着プロセスに関与する、細胞表面タンパク質および可溶性タンパク質の群を意味する。分子は、免疫グロブリン（すなわち、抗体）と共通の構造的特徴に基づいて、このスーパーファミリーのメンバーとして類別され；これらは全て、免疫グロブリンドメインまたはフォールドとして公知のドメインを保有する。IgSFのメンバーは、免疫系の、細胞表面抗原受容体、共受容体および共刺激分子、リンパ球への抗原提示に関与する分子、細胞接着分子、ある種のサイトカイン受容体ならびに細胞内筋タンパク質を含む。これらは、通常、免疫系における役割と関連する。免疫シナプス中のタンパク質は、IgSFのメンバーであることが多い。IgSFはまた、機能のような共通の特性に基づいて「サブファミリー」に分類することができる。このようなサブファミリーは、典型的には、4〜30のIgSFメンバーからなる。
用語「IgSFドメイン」または「免疫グロブリンドメイン」または「Igドメイン」は、本明細書において使用される場合、IgSFタンパク質の構造ドメインを指す。Igドメインは、免疫グロブリン分子に因んで命名されている。これらは、約70〜110アミノ酸を含有し、それらのサイズおよび機能に従って類別される。Igドメインは、逆平行β鎖の2つのシートによって形成されるサンドイッチ様構造を有する、特徴的なIgフォールドを保有する。サンドイッチの内側の疎水性アミノ酸間の相互作用ならびにBおよびF鎖中のシステイン残基間で形成される高度に保存されているジスフィルド結合は、Igフォールドを安定化させる。Igドメインの一端は、抗体のそれらのリガンドに対する特異性に重要な相補性決定領域と呼ばれる部分を有する。Ig様ドメインは、IgV、IgC1、IgC2、またはIgIとして（クラスに）分類することができる。ほとんどのIgドメインは、可変（IgV）ドメインまたは定常（IgC）ドメインのいずれかである。9つのβ鎖を有するIgVドメインは、一般に、7つのβ鎖を有するIgCドメインより長い。IgSFのいくつかのメンバーのIgドメインは、アミノ酸配列中のIgVドメインと似ているが、なおIgCドメインとサイズが類似している。これらは、IgC2ドメインと呼ばれ、一方で、標準的なIgCドメインは、IgC1ドメインと呼ばれる。T細胞受容体（TCR）鎖は、細胞外部分における2つのIgドメイン（1つはN末端におけるIgVドメインおよび1つは細胞膜に隣接するIgC1ドメイン）を含有する。
用語「IgSF種」は、本明細書において使用される場合、同一のまたは実質的に同一の一次アミノ酸配列を有するIgSFメンバータンパク質の集団を意味する。各哺乳動物免疫グロブリンスーパーファミリー（IgSF）メンバーは、そのIgSFメンバーに属する全てのIgSF種にユニークの同一性を規定する。したがって、各IgSFファミリーメンバーは、他のIgSFファミリーメンバーと比べてユニークであり、したがって、特定のIgSFファミリーメンバーの各種は、別のIgSFファミリーメンバー種と比べてユニークである。それにもかかわらず、同じIgSF種の分子間の相違が、グリコシル化、リン酸化、ユビキチン化、ニトロシル化、メチル化、アセチル化、および脂質化などの翻訳後修飾の差異が原因で生じ得る。さらに、遺伝子多型性が原因の単一のIgSF種内の小さな配列差異は、例えばタンパク質分解的切断が原因のIgSF種の野生型短縮形態と同様、単一のIgSF種内の別の形態の相違も成す。「細胞表面IgSF種」は、細胞（一般に哺乳動物細胞）の表面に発現するIgSF種である。
用語「免疫活性」は、本明細書において哺乳動物リンパ球の文脈で使用される場合、細胞生存、細胞増殖、サイトカイン産生（例えば、インターフェロンγ）、またはT細胞の細胞傷害活性の1つまたは複数を指す。免疫調節タンパク質の活性を評価することを含む、改変細胞の免疫活性のアッセイ法は、当技術分野において公知であり、抗原刺激後のT細胞増殖能、再刺激の非存在下でのT細胞増殖持続能、および適切な動物モデルにおける抗がん活性を非限定的に含む。アッセイには細胞傷害性を評価するアッセイも含まれ、それには、標準的な51Cr放出アッセイ（例えば、Milone et al., (2009) Molecular Therapy 17: 1453-1464 を参照のこと）もしくはフローベースの細胞傷害性アッセイ、またはインピーダンスベースの細胞傷害性アッセイ（Peper et al. (2014) Journal of Immunological Methods, 405:192-198）が含まれる。改変細胞の免疫活性を評価するアッセイを、対照の未改変細胞と比較するか、または公知の活性を有する1つまたは複数の他の改変された組換え受容体（例えば、抗原受容体）を含有する細胞と比較することができる。
「免疫調節タンパク質」または「免疫調節ポリペプチド」は、免疫活性を調節するタンパク質である。免疫応答の「調節」とは、免疫活性の増強または抑制のいずれかを意味する。免疫調節タンパク質は、単一のポリペプチド鎖であるか、または（例えば、鎖間ジスフィルド結合によって）互いに共有結合された少なくとも2つのポリペプチド鎖の多量体（二量体またはより高次の多量体）であることができる。したがって、単量体、二量体、およびより高次の多量体タンパク質は、その定義された用語の範囲内である。多量体タンパク質は、（同一のポリペプチド鎖の）ホモ多量体または（異なるポリペプチド鎖の）ヘテロ多量体であることができる。分泌可能な免疫調節タンパク質は、免疫調節タンパク質の一種である。
用語「向上させる」は、本明細書において使用される場合、統計的に有意な量だけ向上させることを意味する。向上は、非ゼロ対照値より少なくとも5％、10％、20％、30％、40％、50％、75％、100％、またはより大きい向上であり得る。
用語「リンパ球」は、本明細書において使用される場合、哺乳動物免疫系の白血球の3つのサブタイプのいずれかを意味する。これらは、ナチュラルキラー細胞（NK細胞）（細胞媒介性の細胞傷害性自然免疫において機能する）、T細胞（細胞媒介性の細胞傷害性獲得免疫に関する）、およびB細胞（体液性の抗体による獲得免疫に関する）を含む。T細胞は、ヘルパーT細胞、細胞傷害性T細胞、ナチュラルキラーT細胞、メモリーT細胞、制御性T細胞、またはγδT細胞を含む。また、自然リンパ球（ILC）もリンパ球の定義の範囲内に含まれる。
「抑制性カウンター構造体」または「抑制性同族結合パートナー」は、別個の活性化受容体の近くで近接して結合したとき、活性化受容体によって媒介される活性化シグナル伝達カスケードおよび表現型の頻度、期間、大きさ、または強度の減弱を導く、細胞膜タンパク質、多くの場合受容体である。抑制性受容体の例には、PD-1、CTLA-4、LAG-3、TIGIT、CD96、CD112R、BTLA、CD160、TIM-3、およびVSIG8が含まれる。用語「刺激性カウンター構造体」または「刺激性同族結合パートナー」は、活性化されたときおよびシグナル伝達がそれによって誘導されたとき、その受容体によって媒介される表現型の頻度、期間、または強度の増加を導く、細胞膜タンパク質、多くの場合、受容体である。刺激性受容体の例には、CD28、ICOS、およびCD226が含まれる。
用語「リンパ球」は、本明細書において使用される場合、哺乳動物免疫系の白血球の3つのサブタイプのいずれかを意味する。これらは、ナチュラルキラー細胞（NK細胞）（細胞媒介性の細胞傷害性自然免疫において機能する）、T細胞（細胞媒介性の細胞傷害性獲得免疫に関する）、およびB細胞（体液性の抗体による獲得免疫に関する）を含む。T細胞は、ヘルパーT細胞、細胞傷害性T細胞、ナチュラルキラーT細胞、メモリーT細胞、制御性T細胞、またはγδT細胞を含む。また、自然リンパ球（ILC）もリンパ球の定義の範囲内に含まれる。
用語「哺乳動物」、「対象」、または「患者」は、具体的には、ヒト、チンパンジー、アカゲザル、カニクイザル、イヌ、ネコ、マウス、またはラットのうちの少なくとも1つへの言及を含む。
用語「膜タンパク質」は、本明細書において使用される場合、生理的条件下で脂質二重層に直接または間接的に付着するタンパク質を意味する。膜を形成する脂質二重層は、生体膜、例えば真核生物（例えば、哺乳動物）の細胞膜または人工の（すなわち、人造の）膜、例えばリポソーム上に見いだされる膜であることができる。脂質二重層への膜タンパク質の付着は、共有結合による付着であるか、または非共有相互作用、例えば疎水性相互作用もしくは静電相互作用による付着であることができる。膜タンパク質は、内在性膜タンパク質または表在性膜タンパク質であることができる。表在性膜タンパク質である膜タンパク質は、脂質二重層に非共有相互作用により付着されるか、または内在性膜タンパク質に非共有相互作用により付着される。表在性膜タンパク質は、哺乳動物において生理的な範囲の条件下で表在性膜タンパク質が脂質二重層と相互作用するおよび／または脂質二重層から解離することができるように、脂質二重層への一時的な付着を形成する。表在性膜タンパク質とは対照的に、内在性膜タンパク質は、哺乳動物において生理的な範囲の条件下で内在性膜タンパク質が脂質二重層への付着から解離しないように、膜の脂質二重層への実質的に恒久的な付着を形成する。膜タンパク質は、脂質二重層の一層による膜への付着を形成することができる（モノトピック型）か、または膜の両方の層によって付着することができる（ポリトピック型）。1つの脂質二重層とだけ相互作用する内在性膜タンパク質は、「内在性モノトピック型タンパク質」である。脂質二重層の両方と相互作用する内在性膜タンパク質は、「内在性ポリトピック型タンパク質」である。あるいは、本明細書において「膜貫通型タンパク質」と称される。
用語「調節」または「調節する」は、本明細書において免疫応答（例えば哺乳動物の免疫応答）の文脈で使用される場合、本発明の免疫調節タンパク質の投与の結果として、または本発明の免疫調節タンパク質（例えば分泌可能な免疫調節タンパク質）を発現する改変細胞の投与の結果として起こる、既存のまたは潜在的な免疫応答の任意の変化、例えば増強または低下を指す。このような調節は、免疫細胞の免疫活性の任意の誘導、または度合いもしくは程度の変化、または抑制を含む。免疫細胞には、B細胞、T細胞、NK（ナチュラルキラー）細胞、NK T細胞、プロフェッショナル抗原提示細胞（APC）、および非プロフェッショナル抗原提示細胞、ならびに炎症細胞（好中球、マクロファージ、単球、好酸球、および好塩基球）が含まれる。調節は、既存の免疫応答；発生段階にある免疫応答；潜在的な免疫応答；または免疫応答を誘導する、制御する、それに影響を及ぼす、もしくは応答する能力；に与えられる任意の変化を含む。調節は、免疫応答の一部としての、免疫細胞における遺伝子、タンパク質および／または他の分子の発現および／または機能の任意の変化を含む。免疫応答の調節または免疫活性の調節は、例えば、以下を含む：免疫細胞の排除、欠失、または隔離；自己反応性リンパ球、抗原提示細胞、または炎症細胞のような他の細胞の機能的能力を調節することができる免疫細胞の増殖、誘導、生存または生成；免疫細胞における無応答状態の誘導（すなわち、アネルギー）；免疫細胞の活性または機能の増強または抑制（これらの細胞が発現するタンパク質のパターンを変化させることを非限定に含む）。例には、サイトカイン、ケモカイン、パーフォリン、グランザイム、成長因子、転写因子、キナーゼ、共刺激分子、もしくは他の細胞表面受容体のようなある分子クラスの産生および/もしくは分泌の変化、またはこれらの調節事象の任意の組み合わせが含まれる。調節は、例えば、野生型IgSFタンパク質で改変された細胞と比較して、改変細胞の免疫活性の変化、例えば改変細胞の細胞傷害活性の変化、または改変細胞のサイトカイン分泌の変化によって評価することができる。
用語「分子種」は、本明細書において使用される場合、同一のまたは実質的に同一の一次アミノ酸配列を備えたタンパク質の集団を意味する。各哺乳動物免疫グロブリンスーパーファミリー（IgSF）メンバーは、同一のまたは実質的に同一の分子種の集合体を規定する。したがって、例えば、ヒトCD80はIgSFメンバーであり、各ヒトCD80分子はCD80の一種である。同じ分子種の分子間の相違が、グリコシル化、リン酸化、ユビキチン化、ニトロシル化、メチル化、アセチル化、および脂質化のような翻訳後修飾の差異が原因で起こり得る。さらに、遺伝子多型性が原因の単一の分子種内の小さな配列差異は、例えばタンパク質分解的切断が原因の単一の分子種の野生型短縮形態と同様、単一の分子種内の別の形態の相違も成す。「細胞表面分子種」は、哺乳動物細胞の表面に発現する分子種である。各々がISを形成する2つの哺乳動物細胞のうちの一方のみ又はもう一方のみに存在する（しかし両方ではない）、2つ以上の異なるタンパク質種は、互いに「シス」または「シス配置」にあると言われる。第一のものがISを形成する2つの哺乳動物細胞のうちの第一の細胞のみに存在し、第二のものがISを形成する2つの哺乳動物細胞のうちの第二の細胞のみに存在する、2つの異なるタンパク質種は、「トランス」または「トランス配置」にあると言われる。各々がISを形成する2つの哺乳動物細胞の両方に存在する、2つの異なるタンパク質種は、これらの細胞上でシス型およびトランス型の両配置にある。
用語「非競合的結合」は、本明細書において使用される場合、少なくとも2つの同族結合パートナーに同時に特異的に結合するタンパク質の能力を意味する。いくつかの態様において、結合は、特異的結合条件下で起こる。したがって、タンパク質は、少なくとも2つの異なる同族結合パートナーに同時に結合することができるが、結合相互作用は、同じ期間である必要はないので、いくつかの場合では、タンパク質は、同族結合パートナーの1つにのみ特異的に結合される。いくつかの態様において、同時結合は、1つの同族結合パートナーの結合が第二の同族結合パートナーへの同時結合を実質的に阻害しないようなものである。いくつかの態様において、非競合的結合は、タンパク質上のその結合部位への第二の同族結合パートナーの結合が、タンパク質上のその結合部位への第一の同族結合パートナーの結合に置き換わらないことを意味する。非競合的結合を評価する方法は、Perez de La Lastra et al.， Immunology， 1999 Apr: 96(4): 663-670 に記載されている方法など、当技術分野において周知である。いくつかの場合では、非競合的相互作用において、第一の同族結合パートナーは、第二の同族結合パートナーの相互作用部位と重複しない相互作用部位で、第二の同族結合パートナーの結合が第一の同族結合パートナーの結合と直接干渉しないように、特異的に結合する。したがって、第二の同族結合パートナーの結合による同族結合パートナーの結合へのあらゆる影響は、第一の同族結合パートナーの結合との直接的な干渉以外の機序を介するものである。例えば、酵素-基質相互作用の状況では、非競合的阻害剤は、酵素の活性部位以外の部位に結合する。非競合的結合は、第二の同族結合パートナーが、第一の同族結合パートナーの結合と重複しない相互作用部位で特異的に結合するが、第一の相互作用部位が第一の同族結合パートナーに占有されているときだけ第二の相互作用部位に結合する、非競合的な結合相互作用を包含する。
用語「核酸」および「ポリヌクレオチド」は、互換的に使用され、一本鎖または二本鎖のいずれかの形態の核酸残基（例えば、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド）のポリマーを指す。別段の限定されない限り、該用語は、公知の天然ヌクレオチドの類似体を含有する核酸、およびそれと類似の結合特性を有する核酸、および天然に存在するヌクレオチドと同様な様式で代謝される核酸を包含する。他に指定のない限り、特定の核酸配列はまた、明示的に示されている配列だけでなく、保存的に改変されたそのバリアント（例えば、縮重コドン置換）および相補的ヌクレオチド配列も暗黙のうちに包含する。具体的には、縮重コドン置換は、1つまたは複数の選択された（または全ての）コドンの第三の位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換されている配列を生成することによって達成してもよい。核酸またはポリヌクレオチドという用語は、遺伝子によってコードされるcDNAまたはmRNAを包含する。
用語「薬学的組成物」は、哺乳動物対象、しばしばヒトにおける、薬学的用途に好適な組成物を指す。薬学的組成物は、典型的には、有効量の活性剤（例えば、本発明の免疫調節タンパク質または免疫調節タンパク質を発現および/または分泌する改変細胞）と担体、賦形剤、または希釈剤とを含む。担体、賦形剤、または希釈剤は、それぞれ、典型的には、薬学的に許容し得る担体、賦形剤または希釈剤である。
用語「ポリペプチド」および「タンパク質」は、本明細書において互換的に使用され、かつ、ペプチド結合を介して連結されている2つ以上のアミノ酸の分子鎖を指す。該用語は、その産物の特定の長さを指すわけではない。したがって、「ペプチド」および「オリゴペプチド」は、ポリペプチドの定義の範囲内に含まれる。該用語は、ポリペプチドの翻訳後修飾、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化などを含む。該用語はまた、合成するかまたは公知のタンパク質改変技術を使用して組換え発現することができるような、1つまたは複数のアミノ酸類似体または非標準なもしくは非天然アミノ酸が含まれる分子も含む。加えて、タンパク質は、周知の有機化学技術によって本明細書に記載されるとおり誘導体化することができる。
用語「初代T細胞アッセイ」は、本明細書において使用される場合、インターフェロン-γ（「IFN-γ」）発現を測定するためのインビトロアッセイを指す。実施例6に記載されるアッセイのような様々なこのような初代T細胞アッセイが当技術分野において公知である。好ましい態様において、使用されるアッセイは、抗CD3同時固定アッセイである。このアッセイでは、初代T細胞が、追加の組換えタンパク質と共にまたはそれなしで固定された抗CD3によって刺激される。ある時点（通常24〜72時間）で培養上清を収集する。別の態様において、使用されるアッセイは、混合リンパ球反応（MLR）である。このアッセイでは、初代T細胞が、同種異系APCで刺激される。ある時点（通常24〜72時間）で培養上清を収集する。標準的なELISA技術によって培養上清中のヒトIFN-γレベルを測定する。市販のキットが供給業者から入手可能であり、製造業者の推奨に従ってアッセイを実施する。
用語「精製されている」は、核酸（例えば、分泌可能な免疫調節タンパク質をコードする核酸）またはタンパク質（例えば、免疫調節タンパク質）に適用される場合、一般に、当技術分野において周知の分析技術によって決定したときに他の成分を実質的に含まない核酸またはポリペプチドを表す（例えば、精製されたポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、電気泳動ゲル、クロマトグラフ溶出液、および／または密度勾配遠心分離に供された媒体中で、離散バンドを形成する）。例えば、電気泳動ゲル中で基本的に1つのバンドを生じる核酸またはポリペプチドは、「精製されている」。精製された核酸またはタンパク質は、少なくとも約50％純粋、通常、少なくとも約75％、80％、85％、90％、95％、96％、99％またはそれ以上純粋（例えば、重量パーセントまたはモルベース）である。
用語「組換え」は、物質（例えば、核酸またはポリペプチド）がヒトの介入によって人工的に（すなわち、非天然に）変化していることを示す。該変化は、その天然の環境もしくは状態内のまたはそこから取り出された物質に対して実施することができる。例えば、「組換え核酸」は、例えば、クローニング、親和性改変、DNAシャッフリングまたは他の周知の分子生物学的手順の間に、核酸を組換えることによって製造されるものである。「組換えDNA分子」は、このような分子生物学的技術によって一緒に接合されたDNAのセグメントから構成される。用語「組換えタンパク質」または「組換えポリペプチド」は、本明細書において使用される場合、組換えDNA分子を使用して発現されるタンパク質分子（例えば、免疫調節タンパク質）を指す。「組換え宿主細胞」は、組換え核酸を含有するおよび／もしくは発現する細胞であるか、またはそうではなく（例えば、組換えタンパク質（例えば、本明細書において提供される免疫調節タンパク質）をコードする核酸分子を細胞に導入することによって）遺伝子工学により改変された細胞である。真核生物における転写制御シグナルは、「プロモーター」および「エンハンサー」エレメントを含む。プロモーターおよびエンハンサーは、転写に関与する細胞タンパク質と特異的に相互作用する短いDNA配列アレイからなる。プロモーターおよびエンハンサーエレメントは、酵母、昆虫および哺乳動物細胞ならびにウイルス中の遺伝子を含め様々な真核生物源から単離されている（類似した制御エレメント、すなわち、プロモーターはまた原核生物中にも見いだされる）。特定のプロモーターおよびエンハンサーの選択は、関心対象のタンパク質を発現させるためにどんな細胞タイプが使用されるべきであるかに依存する。用語「機能的な組み合わせにある」、「機能的な順序にある」および「機能的に連結されている」は、本明細書において使用される場合、所与の遺伝子の転写および／または所望のタンパク質分子の合成を指令することが可能な核酸分子が産生される様式または配向での核酸配列の連結を指す。該用語はまた、機能的タンパク質が産生および／または輸送される様式でのアミノ酸配列の連結も指す。
用語「組換え発現ベクター」は、本明細書において使用される場合、所望のコード配列（例えば、免疫調節タンパク質をコードするもの）とその機能的に連結されているコード配列の特定の細胞における発現に必要な適切な核酸配列とを含有するDNA分子を指す。原核生物における発現に必要な核酸配列は、プロモーター、場合によりオペレーター配列、リボソーム結合部位およびおそらく他の配列を含む。真核細胞は、プロモーター、エンハンサー、ならびに終止およびポリアデニル化シグナルを利用することが知られている。所望により、細胞からの融合タンパク質のより簡易な単離のため、発現されたタンパク質が組換え宿主細胞によって分泌されることができるように、分泌シグナルペプチド配列がまた、場合により、コード配列に機能的に連結されている組換え発現ベクターによってコードされることができる。この用語は、自己複製する核酸構造としてのベクター、ならびにそれが導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれたベクターを含む。このようなベクターには、ウイルスベクター、例えばレンチウイルスベクターがある。
用語「選択性」は、1つの基質（例えば1つの同族結合パートナー）に対する対象タンパク質またはポリペプチドの特異的結合の、別の基質（例えば異なる同族結合パートナー）に対する当該対象タンパク質の特異的結合と比較しての優先度を指す。選択性は、対象タンパク質と第一の基質（例えば第一の同族結合パートナー）との結合活性（例えば、結合親和性）（例えば、Kd1）と、同じ対象タンパク質と第二の同族結合パートナーとの結合活性（例えば結合親和性）（例えばKd2）との比率として示すことができる。
用語「配列同一性」は、本明細書において使用される場合、遺伝子またはタンパク質間の、それぞれヌクレオチドまたはアミノ酸レベルでの配列同一性を指す。「配列同一性」は、タンパク質間のアミノ酸レベルでの同一性の尺度および核酸間のヌクレオチドレベルでの同一性の尺度である。タンパク質配列同一性は、配列をアライメントしたときの各配列中の所与の位置におけるアミノ酸配列を比較することによって決定され得る。同様に、核酸配列同一性は、配列をアライメントしたときの各配列中の所与の位置におけるヌクレオチド配列を比較することによって決定され得る。比較のための配列のアライメントのための方法は、当技術分野において周知であり、このような方法は、GAP、BESTFIT、BLAST、FASTAおよびTFASTAを含む。BLASTアルゴリズムは、配列同一性（％）を計算し、かつ、2つの配列間の類似性の統計分析を実施する。BLAST分析を実施するためのソフトウェアは、National Center for Biotechnology Information（NCBI）ウェブサイトを通して公表されている。
用語「可溶性」は、タンパク質に関して本明細書において使用される場合、タンパク質が膜タンパク質ではないことを意味する。一般に、可溶性タンパク質は、1つまたは複数のIgSFドメインまたはその特異的結合断片を含有するIgSFファミリーメンバー受容体の細胞外ドメイン、またはその一部のみを含有する。
用語「種」は、核酸配列またはポリペプチド配列の文脈において本明細書で使用される場合、このような配列の同一の集合体を指す。全長種とアミノ末端またはカルボキシ末端がわずか1、2、または3アミノ酸残基だけ異なる（または差異をコードする）わずかに短縮された配列は、単一種の配列であると見なされる。このような微不均一性は、製造されたタンパク質の共通の特徴である。
用語「特異的に結合する」は、本明細書において使用される場合、その親和性またはアビディティが、十分な統計的サイズのランダムペプチドまたはポリペプチドの集合体に対する同じタンパク質の平均親和性またはアビディティの少なくとも10倍大きく、しかし場合により50、100、250または500倍大きく、またはさらに少なくとも1000倍大きくなるように、特異的結合条件下で、標的タンパク質に結合するタンパク質の能力を意味する。特異的に結合するタンパク質は、単一の標的分子（例えば、その同族結合パートナー）のみに結合する必要はないが、標的と非標的（例えば、パラログまたはオーソログ）との間の立体配置の類似性に起因して非標的分子に特異的に結合し得る。当業者は、異なる動物種における同じ機能を有する分子（すなわち、オーソログ）への特異的結合または標的分子と実質的に類似のエピトープを有する非標的分子（例えば、パラログ）への特異的結合が、可能であり、かつ、固有の非標的（例えば、ランダムポリペプチド）の統計的に有効な集合体に対して決定される結合の特異性を損なわないことを認識するだろう。したがって、本発明の親和性改変ポリペプチドは、交差反応性に起因して、複数の別個の標的分子種に特異的に結合し得る。一般に、このようなオフ標的特異的結合は、望ましくない標的に対する親和性またはアビディティを低減することによって緩和される。固相ELISAイムノアッセイまたはビアコア（Biacore）測定を使用して、2つのタンパク質間の特異的結合を決定することができる。一般に、2つの結合タンパク質間の相互作用は、約1×10-5 M未満、しばしば約1×10-12 Mまでの低さの解離定数（Kd）を有する。本開示のある種の局面において、2つの結合タンパク質間の相互作用は、約1×10-6 M、約1×10-7 M、約1×10-8 M、約1×10-9 M、約1×10-10 M、または約1×10-11 M未満の解離定数を有する。
用語「特異的結合断片」または「断片」は、成熟（すなわち、シグナルペプチドを欠いている）野生型IgSFドメインに関して本明細書において使用される場合、全長成熟IgSFドメインより短く、かつ、インビトロおよび／またはインビボで野生型IgSFドメインの天然同族結合パートナーに特異的に結合するポリペプチドを意味する。いくつかの態様において、特異的結合断片は、全長成熟野生型配列の配列長の少なくとも20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、または99％である。特異的結合断片は、本発明の親和性改変IgSFドメインを形成するために配列を変化させることができる。いくつかの態様において、特異的結合断片は、リンパ球の免疫活性を調節する。用語「抑制する」または「減弱させる」または「低下（減少）させる」は、本明細書において使用される場合、統計的に有意な量の低下（減少）を意味する。いくつかの態様において、抑制は、少なくとも10％、最大で20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、または90％の低下（減少）であることができる。
本明細書において使用される場合、「合成」は、例えば、合成核酸分子または合成遺伝子または合成ペプチドに関して、組換え法および／または化学合成法によって生産される核酸分子またはポリペプチド分子を指す。
本明細書において使用される場合、用語「膜貫通型タンパク質」は脂質二重層を実質的にまたは完全に貫通する膜タンパク質を意味し、脂質二重層は、例えば、哺乳動物細胞などの生体膜中に、またはリポソームなどの人工構築物中に見いだされる。膜貫通型タンパク質は、脂質二重層に統合されかつその統合が生理的条件下で熱力学的に安定である、膜貫通ドメイン（「膜貫通ドメイン」）を含む。膜貫通ドメインは一般に、膜貫通ドメインの疎水性が、タンパク質における水性環境（例えば、細胞質ゾル、細胞外流体）と相互作用する領域と比較して高いことに基づいて、幾つもの市販の生命情報科学ソフトウェアアプリケーションを介して、膜貫通ドメインのアミノ酸配列から予測可能である。膜貫通ドメインは多くの場合、膜を貫通する疎水性αヘリックスである。膜貫通型タンパク質は、脂質二重層の両層を1回または複数回貫通していてもよい。
疾患または障害の「治療」または「治療法」という用語は、本明細書において使用される場合、本発明の免疫調節タンパク質または膜貫通型免疫調節タンパク質を発現する改変細胞を、単独、または本明細書に記載されるとおりの別の化合物との組み合わせのいずれかで投与することによる臨床または診断症状のいずれかの低減、停止、または排除によって証明される、疾患または障害の進行を遅延、中断、または反転させることを意味する。「治療する」または「治療」は、急性もしくは慢性疾患もしくは障害における症状の重症度の低下、または再発率の低下（例えば、自己免疫疾患経過を再発するまたは寛解する場合のような）、または自己免疫疾患の炎症的側面の場合の炎症の低減も意味する。がんの文脈において本明細書で使用される場合、がんの「治療」またはがんを「阻害する」またはがんの「阻害」という用語は、限定されないが、Response Evaluation Criteria for Solid Tumors（RECIST）のような標準的な基準によって測定した場合の、腫瘍成長率の統計的に有意な低下、腫瘍成長の停止、または腫瘍の、サイズ、質量、代謝活性もしくは体積の低下、または無増悪生存率（PFS）もしくは全生存率（OS）の統計的に有意な向上のうちの少なくとも1つを指す。疾患もしくは障害を「予防する」または疾患もしくは障害の「予防」は、本発明の文脈において使用される場合、疾患もしくは障害の出現もしくは発症または疾患もしくは障害の症状の一部もしくは全てを予防するか、または疾患もしくは障害の発症の可能性を低下させるための、本発明の免疫調節タンパク質または免疫調節タンパク質を発現する改変細胞を単独または別の化合物との組み合わせのいずれかで投与することを指す。
用語「腫瘍特異的抗原」または「TSA」は、本明細書において使用される場合、哺乳動物対象の腫瘍細胞上に主に存在するが一般に哺乳動物対象の正常細胞上には見いだされない抗原を指す。いくつかの場合においては、腫瘍特異的抗原は、IgSFメンバーのカウンター構造体または同族結合パートナーである。腫瘍特異的抗原は、腫瘍細胞のみに存在する必要はないが、抗腫瘍治療薬で標的化できかつ腫瘍の影響から哺乳動物を予防または治療することを提供できるように、腫瘍特異的抗原を有する特定の哺乳動物の細胞の割合が十分に高いかまたは腫瘍の表面の腫瘍特異的抗原のレベルが十分に高い。いくつかの態様において、腫瘍を有する哺乳動物由来の細胞のランダム統計試料では、TSAを提示する細胞の少なくとも50％ががん性である。他の態様において、TSAを提示する細胞の少なくとも60％、70％、80％、85％、90％、95％、または99％ががん性である。
用語「野生型」または「天然」または「親」は、本明細書において使用される場合、核酸分子、タンパク質、IgSFメンバー、宿主細胞などの生物学的材料と併用され、天然に見いだされかつヒトの介入によって改変されていないものを指す。
II. 親和性改変ドメインを含有する膜貫通型免疫調節タンパク質
いくつかの態様において、分泌可能な免疫調節タンパク質（SIP）または膜貫通型免疫調節タンパク質（TIP）を含む免疫調節タンパク質は、野生型哺乳動物IgSFメンバーのIgSFドメインと比較して親和性が改変されたIgSFドメインを少なくとも1つ含む。抗体（すなわち、免疫グロブリン）、例えば、哺乳動物の抗体または哺乳動物起源の抗体は、野生型哺乳動物IgSFメンバーに含まれない。したがって、本発明は、非免疫グロブリン（すなわち、非抗体）IgSFドメインであるIgSFドメインに関する。免疫グロブリン（すなわち、抗体）ではない野生型哺乳動物IgSFファミリーメンバーは、それらの核酸配列およびアミノ酸配列と同様に、当技術分野において公知である。全ての非免疫グロブリン哺乳動物IgSFファミリーメンバーの野生型IgSFドメインの親和性が改変されたIgSFドメインが、本発明の範囲内に含まれる。
いくつかの態様において、提供される免疫調節タンパク質は、それらの種々の態様において、少なくとも1つの親和性が改変された哺乳動物IgSFドメイン、例えば少なくとも1つの親和性が改変された非免疫グロブリン哺乳動物IgSFドメインを含む。いくつかの態様において、非免疫グロブリンIgSFファミリーメンバー、およびその中に存在する対応するIgSFドメインは、マウス、ラット、カニクイザル、またはヒト起源である。いくつかの態様において、IgSFファミリーメンバーは、少なくともまたは厳密に1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、またはより多くのIgSFサブファミリーに由来するメンバーであり、例えばシグナル制御タンパク質（SIRP）ファミリー、骨髄細胞に発現するトリガー受容体様（TREML）ファミリー、がん胎児性抗原関連細胞接着分子（CEACAM）ファミリー、シアル酸結合Ig様レクチン（SIGLEC）ファミリー、ブチロフィリンファミリー、B7ファミリー、CD28ファミリー、Vセットおよび免疫グロブリンドメイン含有（VSIG）ファミリー、Vセット膜貫通ドメイン（VSTM）ファミリー、主要組織適合複合体（MHC）ファミリー、シグナル伝達リンパ球活性化分子（SLAM）ファミリー、白血球免疫グロブリン様受容体（LIR）、ネクチン（Nec）ファミリー、ネクチン様（NECL）ファミリー、ポリオウイルス受容体関連（PVR）ファミリー、天然細胞傷害誘発受容体（NCR）ファミリー、またはキラー細胞免疫グロブリン様受容体（KIR）ファミリーに由来するメンバーである。いくつかの態様において、少なくとも1つのIgSFドメインは、CD80（B7-1）、CD86（B7-2）、CD274（PD-L1、B7-H1）、PDCD1LG2（PD-L2、CD273）、ICOSLG（B7RP1、CD275、ICOSL、B7-H2）、CD276（B7-H3）、VTCN1（B7-H4）、CD28、CTLA4、PDCD1（PD-1）、ICOS、BTLA（CD272）、CD4、CD8A（CD8α）、CD8B（CD8β）、LAG3、HAVCR2（TIM-3）、CEACAM1、TIGIT、PVR（CD155）、PVRL2（CD112）、CD226、CD2、CD160、CD200、CD200R1（CD200R）、NC R3（NKp30）、VISTA、VSIG3、およびVSIG8のうちのいずれかであるIgSFタンパク質に由来する。
いくつかの態様において、免疫調節タンパク質は、少なくとも1つの親和性改変IgSFドメインを含有する。いくつかの態様において、少なくとも1つの親和性改変IgSFドメインは、哺乳動物IgSFメンバーである非免疫グロブリンIgSFファミリーメンバーの対応するIgSFドメインと比較して親和性が改変されている。いくつかの態様において、哺乳動物IgSFメンバーは、表1に示されているIgSFメンバー（およびそれらの任意の哺乳動物オーソログ）のうちの1つであるか、または当該IgSFメンバーのうちの1つに由来するIgSFドメインを含む。オーソログは、種分岐によって共通の祖先遺伝子から進化した異なる種の遺伝子である。通常、オーソログは、進化の過程で同じ機能を保持している。いくつかの態様において、親和性改変IgSFドメインは、親和性改変IgVまたはIgCドメイン（IgC1またはIgC2ドメインを含む）である。
いくつかの態様において、本発明の免疫調節タンパク質は、野生型哺乳動物非免疫グロブリン（すなわち、非抗体)IgSFファミリーメンバーの細胞外ドメインの配列を含むが、その中の少なくとも1つのIgSFドメインの親和性が改変されている。単なる例として、いくつかの態様において、野生型哺乳動物非免疫グロブリンIgSFファミリーメンバーは、第一のIgSFドメインおよび第二のIgSFドメインを含み、免疫調節タンパク質は、野生型IgSFファミリーメンバーの第一のIgSFドメインおよび第二のIgSFドメインを含むが、ただし少なくとも第一のIgSFドメインまたは第二のIgSFドメインの親和性が改変されている。野生型哺乳動物免疫グロブリン（すなわち、非抗体)IgSFファミリーメンバーの細胞外ドメインの配列を含むが少なくとも1つのIgSFドメインの親和性が改変されている免疫調節タンパク質を、「I型」免疫調節タンパク質と呼ぶことができる。IgSFファミリー内に存在するさらなるドメイン（例えば少なくとも2、3、4、または5つのIgSFドメイン、いくつかの態様においては正確に2、3、4、または5つのIgSFドメイン）の親和性が改変されていてもよい。本発明の免疫調節タンパク質のいくつかの態様において、哺乳動物IgSFメンバーは、表1に示されているIgSFメンバーのうちの1つ（その任意の哺乳動物オーソログを含む）である。
表1の第一の列は、その特定のIgSFメンバーについての名称および場合によりいくつかの可能な別名を提供する。第二の列は、uniprot.orgでインターネットを介してアクセス可能な公表されているデータベースである、UniProtKBデータベースのタンパク質識別子を提供する。Universal Protein Resource（UniProt）は、タンパク質配列および注釈データ用の包括的リソースである。UniProtデータベースは、UniProt Knowledgebase（UniProtKB）を含む。UniProtは、欧州バイオインフォマティクス研究所（European Bioinformatics Institute）（EMBL-EBI）、SIBスイスバイオインフォマティクス研究所（SIB Swiss Institute of Bioinformatics）とタンパク質情報リソース（Protein Information Resource）（PIR）の間の共同組織であり、米国国立保健研究所（U.S. National Institutes of Health（NIH））の助成金によって主に支援されている。第三の列は、表示のIgSFドメインが位置している領域を提供する。該領域は、ドメインが範囲を規定している残基を包含する範囲として特定される。列3はまた、特定されたIgSF領域のIgSFドメインクラスを示す。列4は、表示の追加のドメインが位置している領域を提供する（シグナルペプチド、S；細胞外ドメイン、E；膜貫通ドメイン、T；細胞質ドメイン、C）。列5は、列挙されたIgSFメンバーのいくつか、すなわちその細胞表面同族結合パートナーのいくつかを示す。
典型的には、提供される態様の免疫調節タンパク質の親和性改変IgSFドメインは、ヒトまたはマウスの親和性改変IgSFドメインである。
（表１）本開示のIgSFメンバー
Figure 2020500010
Figure 2020500010
Figure 2020500010
Figure 2020500010
いくつかの態様において、免疫調節タンパク質は、少なくとも1つの親和性改変ドメイン、および少なくとも1つの親和性が改変されていないIgSFドメイン（例えば、未改変のまたは野生型のIgSFドメイン）を含有する。いくつかの態様において、免疫調節タンパク質は、親和性改変ドメインを少なくとも2つ含有する。いくつかの態様において、免疫調節タンパク質は、複数の親和性が改変されていないIgSFドメインおよび／または親和性が改変されたIgSFドメイン、例えば1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、もしくは6つの親和性が改変されていないIgSFおよび／または親和性が改変されたIgSFドメインを含有する。
いくつかの態様において、免疫調節タンパク質は、野生型IgSFファミリーメンバーには見られない、親和性が改変されたIgSFドメイン配列および／または親和性が改変されていないIgSFドメイン配列の組み合わせ（「非野生型組み合わせ」）および／または配置（「非野生型配置」もしくは「非野生型配列」）を含む（「II型」免疫調節タンパク質）。親和性が改変されていない（例えば、野生型）IgSFドメインまたは親和性が改変されているIgSFドメインの配列は、哺乳動物（例えば、マウス、ラット、カニクイザル、もしくはヒト）起源であってもよいし、それらの組み合わせであってもよい。いくつかの態様において、親和性が改変されていないドメインの配列は、表1に示されている任意のIgSFドメインである。II型免疫調節タンパク質（非野生型組み合わせまたは非野生型配置にかかわらず）のこれらの態様に存在するこのような親和性が改変されていないまたは親和性が改変されたIgSFドメインの数は、少なくとも2つ、3つ、4つ、または5つ、いくつかの態様においては厳密に2つ、3つ、4つ、または5つのIgSFドメインである。
いくつかの態様において、親和性改変IgSFドメインのうちの少なくとも2つは、同一の親和性改変IgSFドメインである。いくつかの態様において、親和性改変IgSFドメインは、同一ではない（すなわち、異なる）IgSFドメインである。同一ではない親和性改変IgSFドメインは、特異的結合条件下で異なる同族結合パートナーに特異的に結合し、かつ、これらが設計された野生型IgSFドメインが同じあったか否かに関係なく「同一ではない」。したがって、例えば、本発明の免疫調節タンパク質における少なくとも2つの同一ではないIgSFドメインの組み合わせは、起源が1つのIgSFファミリーメンバーに由来しかつユニークである少なくとも1つのIgSFドメイン配列と、起源が別のIgSFファミリーメンバーに由来しかつユニークである第二のIgSFドメイン配列の少なくとも1つとを含むことができ、ここで、免疫調節タンパク質のIgSFドメインは、親和性が改変された形態である。しかしながら、別の態様において、2つの同一ではないIgSFドメインは、同じIgSFドメイン配列が起源であるが、これらが異なる同族結合パートナーに特異的に結合するように異なって親和性が改変されている。いくつかの態様において、本発明の免疫調節タンパク質に存在する同一ではない親和性改変IgSFドメインの数は、少なくとも2つ、3つ、4つ、または5つ、いくつかの態様においては厳密に2つ、3つ、4つ、または5つの同一ではない親和性改変IgSFドメインである。いくつかの態様において、同一ではないIgSFドメインは、表1に示されている少なくとも2種のIgSFメンバーに由来する組み合わせであり、いくつかの態様においては、表1の少なくとも3または4つのIgSFメンバーに由来する組み合わせである。
他の態様において、本明細書において提供される免疫調節タンパク質は、単一のIgSFメンバーに由来するが非野生型配置の少なくとも2つのIgSFドメインを含む。非野生型配置または並べ換えの1つの例証となる例は、IgSFドメイン配列が親和性改変IgSFドメインの供給源の役割を果たす野生型哺乳動物IgSFファミリーメンバーにおいて見いだされるものと比べて、野生型とは異なる順序で親和性改変IgSFドメイン配列を含む、本発明の免疫調節タンパク質である。前述の態様における哺乳動物野生型IgSFメンバーには、具体的には、表1に列挙されているものが含まれる。したがって、一例では、野生型ファミリーメンバーが、タンパク質のN末端の近位にあるIgC1ドメインおよびN末端の遠位にあるIgVドメインを含む場合、本明細書において提供される免疫調節タンパク質は、親和性改変形態ではあるが、N末端の近位にあるIgVおよびN末端の遠位にあるIgC1を含むことができる。親和性改変IgSFドメインの非野生型組み合わせと非野生型配置の両方が免疫調節タンパク質内に存在することも本発明の範囲内である。免疫調節タンパク質のポリペプチド鎖内の多数の親和性改変IgSFドメインは、互いに直接共有連結される必要はない。いくつかの態様において、1つまたは複数のアミノ酸残基のある介在範囲が、親和性改変IgSFドメインを互いに間接的に共有結合する。そのような「ペプチドリンカー」は、単一アミノ酸残基であっても、より長いものであってもよい。
いくつかの態様において、親和性改変IgSFドメインを、哺乳動物細胞上に発現する単一（例えば、1つ）または複数（例えば、2つ、3つ、4つ、もしくはそれ以上）のカウンター構造体（「同族結合パートナー」とも呼ばれる）に特異的に結合するように親和性を改変することができる。典型的には、同族結合パートナーは、親和性が改変されている野生型IgSFドメインのネイティブ同族結合パートナーである。いくつかの態様において、同族結合パートナーは、IgSFメンバーである。いくつかの態様において、同族結合パートナーは、非IgSFファミリーメンバーである。例えば、いくつかの態様において、BTLA(B-およびT-リンパ球減弱)などの親和性改変IgSFドメインの同族結合パートナーは、非IgSFメンバー同族結合パートナーHVEM(ヘルペスウイルス侵入メディエーター)である。BTLA-HVEM複合体は、T細胞免疫応答を負に調節する。免疫調節タンパク質内に存在する各IgSFドメインを、それが結合する単一または複数の同族結合パートナーの各々に対する特異的結合親和性またはアビディティを独立して向上または低下させるように親和性を改変することができる。この方法によって、複数の同族結合パートナーの各々への特異的結合は、独立して、特定の親和性またはアビディティに合わせられる。
いくつかの態様において、IgSFドメインの同族結合パートナーは、表1に列挙されているものなどの、野生型IgSFドメインのカウンター構造体（同族結合パートナー）のうちの少なくとも1つ（場合によっては少なくとも2つまたは3つ）である。
IgSFドメイン（例えば哺乳動物IgSFドメイン）の配列は、その配列を少なくとも1つの置換、付加、または欠失で変更することによって親和性が改変される。配列は、同族結合パートナーの結合部位またはアロステリック部位で変更されることができる。いくつかの態様において、IgSFドメイン（例えば哺乳動物IgSFドメイン）をコードする核酸は、特異的かつ所定のヌクレオチド部位の置換、付加、欠失、またはそれらの組み合わせによって親和性が改変され、本発明の免疫調節タンパク質をコードする核酸が生成される。いくつかの対照的な態様において、IgSFドメイン（例えば哺乳動物IgSFドメイン）をコードする核酸は、核酸内のランダムな部位における置換、付加、欠失、またはそれらの組み合わせによって、親和性が改変される。いくつかの態様において、2つのアプローチ（所定およびランダム）の組み合わせが利用される。いくつかの態様において、親和性改変IgSFドメインの設計は、インシリコで実施される。
いくつかの態様において、免疫調節タンパク質の親和性改変IgSFドメインは、免疫グロブリンスーパーファミリー(IgSF)ドメインを含有する野生型もしくは未改変ポリペプチドまたはその一部と比べて、1つまたは複数のアミノ酸置換（あるいは、「変異」または「交換」）を含有する。いくつかの態様において、IgSFドメインは、IgVドメインもしくはIgCドメインまたはIgVドメインもしくはIgCドメインの特異的結合断片である。いくつかの態様において、免疫調節タンパク質は、IgVドメインもしくはIgCドメインまたはその特異的結合断片を含有する親和性改変IgSFドメインを含み、その中で、アミノ酸置換の少なくとも1つがIgVドメインもしくはIgCドメインまたはその特異的結合断片内にある。いくつかの態様において、IgVドメインまたはIgCドメインは、結合活性または親和性が変化していることが理由で、親和性改変IgSFドメインである。
いくつかの態様において、IgSFドメイン（例えば哺乳動物IgSFドメイン）は親和性が改変されており、その配列が合計1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10個以下のアミノ酸置換、付加、欠失、またはそれらの組み合わせを有する。いくつかの態様において、IgSFドメイン（例えば哺乳動物IgSFドメイン）は親和性が改変されており、その配列が少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10個のアミノ酸置換、付加、欠失、またはそれらの組み合わせを有する。いくつかの態様において、IgSFドメイン（例えば哺乳動物IgSFドメイン）は親和性が改変されており、その配列が1（または2、3、4、5、6、7、8、もしくは9）個と10（または9、8、7、6、5、4、3、もしくは2）個の間のアミノ酸置換、付加、欠失、またはそれらの組み合わせを有する。いくつかの態様において、IgSFドメイン（例えば哺乳動物IgSFドメイン）は親和性が改変されており、その配列が合計1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10個以下のアミノ酸置換を有する。いくつかの態様において、IgSFドメイン（例えば哺乳動物IgSFドメイン）は親和性が改変されており、その配列が少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10個のアミノ酸置換を有する。いくつかの態様において、IgSFドメイン（例えば哺乳動物IgSFドメイン）は親和性改変されており、その配列が1（または2、3、4、5、6、7、8、もしくは9）個と10（または9、8、7、6、5、4、3、もしくは2）個の間のアミノ酸置換を有する。いくつかの態様において、置換は保存的置換である。いくつかの態様において、置換は非保存的置換である。いくつかの態様において、置換は、保存的置換と非保存的置換の組み合わせである。いくつかの態様において、配列は、その同族結合パートナーに対するIgSFドメインの結合部位で改変されている。
いくつかの態様において、野生型または未改変のIgSFドメインは、哺乳動物のIgSFドメインである。いくつかの態様において、野生型または未改変のIgSFドメインは、ヒト、マウス、カニクイザル、またはラットのものを含むがそれらに限定されないIgSFドメインであることができる。いくつかの態様において、野生型または未改変のIgSFドメインは、ヒトのIgSFドメインである。
いくつかの態様において、野生型または未改変のIgSFドメインは、IgSFドメイン（例えば、IgVドメインまたはIgCドメイン）を含有するIgSFファミリーメンバーの細胞外ドメインまたはその一部であるか、あるいはそれらを含む。いくつかの場合において、未改変または野生型のIgSFドメインの細胞外ドメインは、複数のIgSFドメイン（例えば、IgVドメインおよびIgCドメイン）を含むことができる。しかしながら、親和性改変IgSFドメインは、IgVドメインおよびIgCドメインの両方を含む必要はない。いくつかの態様において、親和性改変IgSFドメインは、IgVドメインまたはその特異的結合断片を含むかまたは本質的にそれからなる。いくつかの態様において、親和性改変IgSFドメインは、IgCドメインまたはその特異的結合断片を含むかまたは本質的にそれからなる。いくつかの態様において、親和性改変IgSFドメインは、IgVドメインまたはその特異的結合断片、およびIgCドメインまたはその特異的結合断片を含む。
いくつかの態様において、親和性改変IgSFドメインの1つまたは複数のアミノ酸置換は、IgSFポリペプチドドメインの任意の1つまたは複数の中に位置することができる。例えば、いくつかの態様において、1つまたは複数のアミノ酸置換は、IgSFポリペプチドの細胞外ドメイン中に位置する。いくつかの態様において、1つまたは複数のアミノ酸置換は、IgVドメインまたはIgVドメインの特異的結合断片中に位置する。いくつかの態様において、1つまたは複数のアミノ酸置換は、IgCドメインまたはIgCドメインの特異的結合断片中に位置する。
いくつかの態様において、野生型または未改変のIgSFドメインは、SEQ ID NO：1〜27および408のいずれかに示されるアミノ酸配列内に含有されるかまたはSEQ ID NO：1〜27および408のいずれかに対して少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％もしくはより高い配列同一性を示すアミノ酸配列内に含有されるIgSFドメインであるか、あるいはその特異的結合断片である。いくつかの態様において、IgSFドメインは、その中に含有されるIgVドメインもしくはIgCドメインまたはそれらの特異的結合断片である。表1は、SEQ ID NO：1〜27および408の各々に含有されるIgSFドメインを特定する。
いくつかの態様において、未改変のまたは野生型のIgSFドメインは、IgSFメンバー、例えば哺乳動物IgSFメンバーのIgSFドメイン（例えば、IgVドメインまたはIgCドメイン）を含む、細胞外ドメイン（ECD）または一部を含む。いくつかの態様において、未改変のまたは野生型のIgSFドメインは、（i）SEQ ID NO：28〜54および410のいずれかに示されるアミノ酸配列、(ii）SEQ ID NO：28〜54および410のいずれかに対して少なくとも約85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、または（iii）IgVドメインもしくはIgCドメインを含む（i）もしくは（ii）の特異的結合断片である。
いくつかの態様において、少なくとも1つのIgSFドメイン、例えば本発明の免疫調節タンパク質の少なくとも1つの哺乳動物IgSFドメインは、独立して、限定されないがSEQ ID NO:1〜27および408として表1に開示されるもののような、野生型または未改変IgSFタンパク質中に含有される対応する野生型IgSFドメインまたはその特異的結合断片に対して少なくとも99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、89％、88％、87％、86％、85％、または80％の配列同一性を有するように配列の親和性が改変される。
いくつかの態様において、本明細書において提供される免疫調節タンパク質の親和性改変IgSFドメインは、限定されないがSEQ ID NO:1〜27および408で表1に開示されるもののような、野生型または未改変IgSFタンパク質中に含有される野生型または未改変のIgSFドメインの特異的結合断片である。いくつかの態様において、特異的結合断片は、少なくとも50アミノ酸、例えば少なくとも60、70、80、90、100、または110アミノ酸のアミノ酸長を有することができる。いくつかの態様において、IgVドメインの特異的結合断片は、野生型または未改変IgVドメインの長さの少なくとも約85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％であるアミノ酸配列を含有する。いくつかの態様において、IgCドメインの特異的結合断片は、野生型または未改変IgCドメインの長さの少なくとも約85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％であるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、特異的結合断片は、免疫活性を調節する。より具体的な態様において、IgSFドメインの特異的結合断片は、免疫活性を増強させる。別の態様において、特異的結合断片は、免疫活性を低下させる。
いくつかの態様において、2つの核酸配列または2つのアミノ酸の同一性（％）を決定するために、配列を最適な比較のためアライメントさせる（例えば、第二のアミノ酸または核酸配列との最適なアライメントのために第一のアミノ酸または核酸配列の配列中にギャップが導入され得る）。次いで、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置におけるアミノ酸残基またはヌクレオチドが比較される。第一の配列中の位置が第二の配列中の対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドによって占有されるとき、分子はその位置で同一である。2つの配列間の同一性（％）は、その配列によって共有される同一位置の数の関数である（すなわち、同一性％=同一位置の数（#）／位置（例えば、重複位置）の総数（#）×100）。一態様において、2つの配列は、同じ長さである。配列を手動でアライメントさせて、同一の核酸またはアミノ酸の数を計数してもよい。あるいは、同一性（％）の決定のための2つの配列のアライメントを、数学的アルゴリズムを使用して達成してもよい。このようなアルゴリズムは、NBLASTおよびXBLASTプログラムに組み入れられている。本発明の核酸分子と相同なヌクレオチド配列を得るために、NBLASTプログラム、スコア=100、ワード長=12でBLASTヌクレオチド検索を実施してもよい。本発明のタンパク質分子と相同なアミノ酸配列を得るために、XBLASTプログラム、スコア=50、ワード長=3でBLASTタンパク質検索を実施してもよい。比較目的のためにギャップのあるアライメントを得るために、Gapped BLASTを利用してもよい。あるいは、PSI-Blastを使用して、分子間の距離関係を検出する繰り返し検索を実施してもよい。NBLAST、XBLAST、およびGapped BLASTプログラムを利用するとき、それぞれのプログラムのデフォルトパラメーター、例えばNCBIウェブサイトで入手可能なものを使用してもよい。あるいは、NCBIデータベースにおいて、例えばBLASTプログラムによって配列をアライメントさせた後に、配列同一性を計算してもよい。一般に、例えば「スコア行列」および「ギャップペナルティ」に関するデフォルト設定をアライメントに使用してもよい。本発明の文脈において、BLASTNおよびPSI BLAST NCBIのデフォルト設定を採用してもよい。
本発明の免疫調節タンパク質の親和性改変IgSFドメインが設計または作製される手段は、任意の特定の方法に限定されない。しかしながら、いくつかの態様において、野生型IgSFドメインが野生型IgSF遺伝物質から変異誘発され（部位特異的、ランダム、またはその組み合わせ）、実施例に開示される方法に従って結合性の変化についてスクリーニングされる。核酸を変異誘発するための方法は、当業者に公知である。いくつかの態様において、親和性改変IgSFドメインは、多数の公表されているデータベースで入手可能なタンパク質または核酸配列を利用してデノボ合成され、その後スクリーニングされる。National Center for Biotechnology Informationは、このような情報を提供し、そして、そのウェブサイトは、先に考察したとおりのUniProtKBデータベースと同様にインターネットを介して公的にアクセス可能である。
いくつかの態様において、本明細書において提供される免疫調節タンパク質中に存在する少なくとも1つの親和性が改変されていないIgSFドメインおよび／または1つの親和性が改変されたIgSFドメインは、免疫シナプス（IS）を形成する哺乳動物細胞の表面に発現する少なくとも1つの細胞表面分子種に特異的に結合する。いくつかの態様において、本明細書において提供される免疫調節タンパク質は、複数の親和性が改変されていないIgSFドメインおよび／または親和性が改変されたIgSFドメイン、例えば1、2、3、4、5、もしくは6つの親和性が改変されていないIgSFおよび／または親和性が改変されたIgSFドメインを含み得る。これらの親和性が改変されていないIgSFドメインおよび／または親和性が改変されたIgSFドメインの1つまたは複数は、独立して、ISを形成する哺乳動物細胞の一方または両方のいずれかに特異的に結合することができる。
しばしば、免疫調節タンパク質の親和性改変IgSFドメインが特異的に結合する細胞表面分子種は、親和性が改変されている、野生型IgSFファミリーメンバーまたは野生型IgSFドメインの同族結合パートナーであろう。いくつかの態様において、細胞表面分子種は、哺乳動物IgSFメンバーである。いくつかの態様において、細胞表面分子種は、ヒトIgSFメンバーである。いくつかの態様において、細胞表面分子種は、表1に示されている細胞表面同族結合パートナーであろう。いくつかの態様において、細胞表面分子種は、ヒト細胞のような哺乳動物細胞の細胞表面のウイルスタンパク質、例えばポリオウイルスタンパク質であろう。
いくつかの態様において、本明細書において提供される免疫調節タンパク質の少なくとも1つの親和性が改変されていないおよび／または親和性が改変されたIgSFドメインは、ISを形成する哺乳動物細胞上に存在する少なくとも2つまたは3つの細胞表面分子種に結合する。免疫調節タンパク質の親和性が改変されていないIgSFドメインおよび／または親和性が改変されたIgSFドメインが特異的に結合する細胞表面分子種は、ISを形成する2つの哺乳動物細胞のうちの一方もしくは他方の表面のみにある（すなわち、シス配置にある）ことができるか、または、代替的に、細胞表面分子種は、両方上に存在することができる。
いくつかの態様において、親和性改変IgSFドメインは、少なくとも2種の細胞表面分子種に特異的に結合し、ここで、分子種の一方は、ISを形成する2つの哺乳動物細胞のうちの一方の細胞に存在し、そして、他方の分子種は、ISを形成する2つの哺乳動物細胞のうちの第二の細胞上に存在する。このような態様において、細胞表面分子種は、ISを形成する2つの哺乳動物細胞のうちの一方または他方の細胞上に単独で存在する（すなわち、トランス配置にある）必要は必ずしもないが、いくつかの態様において、存在する。したがって、本明細書において提供される態様は、各細胞表面分子種が、ISを形成する哺乳動物細胞のうちの一方または他方のみの表面に存在するもの（シス配置）、ならびに、親和性改変各IgSFが結合する細胞表面分子種がISを形成する哺乳動物細胞の両方の表面に存在するもの（すなわち、シスおよびトランス配置）を含む。
当業者は、抗原提示細胞（APC）および腫瘍細胞がリンパ球と共に免疫シナプスを形成することを認識するだろう。したがって、いくつかの態様において、免疫調節タンパク質の少なくとも1つの親和性が改変されていないIgSFドメインおよび／または少なくとも1つの親和性が改変されたIgSFドメインは、がん細胞上に存在する細胞表面分子種にのみ特異的に結合し、ここで、がん細胞は、リンパ球と連動してISを形成する。他の態様において、免疫調節タンパク質の少なくとも1つの親和性が改変されていないIgSFドメインおよび／または少なくとも1つの親和性が改変されたIgSFドメインは、リンパ球上に存在する細胞表面分子種にのみ特異的に結合し、ここで、リンパ球は、APCまたは腫瘍細胞と連動してISを形成する。いくつかの態様において、親和性が改変されていないIgSFドメインおよび／または親和性が改変されたIgSFドメインは、ISを形成する標的細胞（またはAPC）およびリンパ球の両方上に存在する細胞表面分子種に結合する。
本発明の態様は、特異的結合条件下における、本明細書において提供される免疫調節タンパク質の、その同族結合パートナーのうちの少なくとも1つに対する、親和性改変IgSFドメインの結合親和性（または多量体もしくは他の関連構造にある場合はアビディティ）が、変化していない野生型または未改変のIgSFドメイン対照と比べて向上するかまたは低下するかのいずれかであるように、本明細書において提供される免疫調節タンパク質が、野生型または未改変のIgSFドメイン（例えば、哺乳動物IgSFドメイン）と異なるアミノ酸配列を有する少なくとも1つの親和性改変IgSFドメインを含む態様を含む。いくつかの態様において、親和性改変IgSFドメインは、例えば、固相ELISAイムノアッセイ、フローサイトメトリーまたはビアコアアッセイによって決定したところ、野生型または未改変IgSF対照配列のものと異なる、同族結合パートナーに対する結合親和性を有する。いくつかの態様において、親和性改変IgSFドメインは、1つまたは複数の同族結合パートナーに対する結合親和性が、野生型または未改変のIgSFドメインと比べて向上している。いくつかの態様において、親和性改変IgSFドメインは、野生型または未改変のIgSFドメインと比べて、1つまたは複数の同族結合パートナーに対する結合親和性が低下している。いくつかの態様において、同族結合パートナーは、ヒトタンパク質またはマウスタンパク質のような哺乳動物タンパク質であることができる。
各同族結合パートナーに対する結合親和性は、独立している；すなわち、いくつかの態様において、親和性改変IgSFドメインは、野生型または未改変ポリペプチドと比べて、1つ、2つまたは3つの異なる同族結合パートナーに対する結合親和性が向上しており、かつ、異なる同族結合パートナーのうちの1つ、2つまたは3つに対する結合親和性が低下している。
いくつかの態様において、本明細書において提供される免疫調節タンパク質は、親和性改変IgSFドメインの結合親和性またはアビディティが、野生型または未改変の対照IgSFドメインと比較して、少なくとも10％、20％、30％、40％、50％、100％、200％、300％、400％、500％、1000％、5000％、または10,000％向上している、少なくとも1つの親和性改変ドメインを含む。いくつかの態様において、野生型または未改変のIgSFドメインと比較しての結合親和性の向上は、1.2倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、または50倍より大きい向上である。
いくつかの態様において、本明細書において提供される免疫調節タンパク質は、親和性改変IgSFドメインの結合親和性またはアビディティが、野生型または未改変の対照IgSFドメインと比較して、少なくとも10％、最大で20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％または最大で90％低下している、少なくとも1つの親和性改変ドメインを含む。いくつかの態様において、結合親和性の低下は、野生型または未改変のIgSFドメインと比較して、1.2倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、または50倍より大きい低下である。
いくつかの態様において、本明細書において提供される免疫調節タンパク質は、特定の同族結合パートナーに対する親和性改変IgSFドメインの選択性が野生型または未改変対照IgSFドメインと比較して向上している、少なくとも1つの親和性改変ドメインを含む。いくつかの態様において、選択性は、特定の同族結合パートナーに対する結合性の、1つまたは複数の他の同族結合パートナーに対する結合性と比較しての比として表される。いくつかの態様において、特定の同族結合パートナーに対する結合の選択性の比率は、1.2倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、もしくは50倍より大きいか、または約1.2倍、約1.5倍、約2倍、約3倍、約4倍、約5倍、約6倍、約7倍、約8倍、約9倍、約10倍、約20倍、約30倍、約40倍、もしくは約50倍より大きい。いくつかの態様において、親和性改変IgSFドメインの選択性は、野生型または未改変対照IgSFドメインと比べて、少なくとも10％、20％、30％、40％、50％、100％、200％、300％、400％、500％、1000％、5000％、または10,000％向上している。
いくつかの態様において、本明細書において提供される免疫調節タンパク質は、同族結合パートナーに対するその特異的結合親和性が、1×10-5 M、1×10-6 M、1×10-7 M、1×10 8 M、1×10-9 M、1×10-10 M、1×10-11 M、もしくは1×10-12 Mより小さい値であるか、または概ねそれらの値よりも小さい値であることができる、少なくとも1つの親和性改変ドメインを含む。
いくつかの態様において、提供される免疫調節タンパク質はIgSFドメインを少なくとも2つ含み、該IgSFドメインのうちの少なくとも1つ（いくつかの態様においては両方）の親和性が改変されており、親和性が改変されたIgSFドメインのうちの少なくとも1つが、その同族結合パートナーに対する向上した親和性（またはアビディティ）を有し、かつ、少なくとも1つの親和性が改変されたIgSFドメインがその同族結合パートナーに対する低下した親和性（またはアビディティ）を有する。1つまたは複数の親和性改変IgSFドメインを含む免疫調節タンパク質は、機能的に、その同族結合パートナーへの特異的結合が向上するか低下するかに関係なく、適切なアッセイ制御下で、改変免疫細胞（例えば、リンパ球または抗原提示細胞）の免疫活性を、野生型の親分子を発現する改変免疫細胞と比較して増強または抑制するように作用する。いくつかの態様において、親和性改変IgSFドメインを少なくとも2つ含む免疫調節タンパク質は、親和性改変IgSFドメインのうちの少なくとも1つが活性化受容体を刺激しかつ親和性改変IgSFドメインのうちの少なくとも1つが抑制性受容体と拮抗するように作用するものである。いくつかの態様において、免疫活性の増強は、例えば細胞傷害活性アッセイ、細胞サイトカインを評価するためのアッセイ、または細胞増殖アッセイにおいて、非ゼロ対照値より少なくとも10％、20％、30％、40％、50％、75％、100％、200％、300％、400％、または500％大きい増強であり得る。いくつかの態様において、免疫活性の抑制は、少なくとも10％、最大で20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、または90％の抑制であり得る。
本発明の免疫調節タンパク質の親和性改変IgSFドメインは、いくつかの態様において、その同族結合パートナーに競合的に特異的に結合することができる。他の態様において、本発明の親和性改変IgSFドメインは、その同族結合パートナーに非競合的に特異的に結合する。
いくつかの態様において、本明細書において提供される免疫調節タンパク質は、別様に複数の細胞表面分子種に結合するがその細胞表面同族分子種の1つにもはや実質的に特異的に結合しないように親和性が改変されている、IgSFドメインを含有する。したがって、これらの態様において、その細胞表面同族分子種の1つへの特異的結合は、野生型レベルの90％以下、例えば、80％以下、70％以下、60％以下、50％以下、40％以下、30％以下、20％以下、またはより低い特異的結合まで低減されている。いくつかの態様において、その細胞表面同族分子種の1つへの特異的結合は、野生型レベルの10％以下、多くの場合、7％以下、5％以下、3％以下、1％以下、または検出不可もしくは統計的に有意でない特異的結合まで低減されている。
いくつかの態様において、哺乳動物IgSFドメイン上の特異的結合部位は、細胞表面分子種の少なくとも1つに関して不活性化されているか、または実質的に不活性化されている。したがって、例えば、野生型IgSFドメインが厳密に2つの細胞表面分子種に特異的に結合する場合、いくつかの態様において、該ドメインは厳密に1つの細胞表面分子種に特異的に結合するように親和性が改変される。また、野生型IgSFドメインが厳密に3つの細胞表面分子種に特異的に結合する場合、いくつかの態様において、該ドメインは厳密に2つの細胞表面分子種に特異的に結合するように親和性が改変される。その細胞表面同族分子種のうちの1つにもはや実質的に特異的に結合しないように親和性が改変されているIgSFドメインは、別様にその細胞表面分子種に競合的にまたは非競合的に特異的に結合する、IgSFドメインであることができる。一実例は、同族結合パートナー：CD28、PD-L1、およびCTLA4に特異的に結合する天然CD80（B7-1）に関係する。いくつかの態様において、CD80を、CD28および／またはPD-L1へのその特異的結合を増加または減弱させるようにするが、しかしCTLA4にはいかなる生理学的に顕著な程度にも特異的に結合しないように、IgSFの親和性を改変することができる。その細胞表面同族結合パートナーのうちの1つにもはや実質的に特異的に結合しないように親和性が改変されているIgSFドメインは、別様にその同族結合パートナーに競合的にまたは非競合的に特異的に結合するIgSFドメインであることができる。当業者は、2種の同族結合パートナーに競合的に結合する野生型IgSFドメインがそれでもなおそれらのうちの厳密に一方に関して不活性化されることができることを認識するだろう（例えば、それらの結合部位が厳密に同一範囲にないが、一方の特異的結合が他方の同族結合パートナーの結合を阻害し、かつなお両方の競合的結合部位が別個であるように単に重複している場合）。
本明細書において提供される免疫調節タンパク質の親和性が改変されていないIgSFドメインおよび／または親和性が改変されたIgSFドメインは、いくつかの態様において、その細胞表面同族分子種に競合的に特異的に結合することができる。他の態様において、本明細書において提供される免疫調節タンパク質の親和性が改変されていないIgSFドメインおよび／または親和性が改変されたIgSFドメインは、その細胞表面同族分子種に非競合的に特異的に結合する。本明細書において提供される免疫調節タンパク質中に存在する任意の数の親和性が改変されていないIgSFドメインおよび／または親和性が改変されたIgSFドメインは、競合的にまたは非競合的に特異的に結合することができる。
いくつかの態様において、本明細書において提供される免疫調節タンパク質は、少なくとも2つの親和性が改変されていないIgSFドメイン、または少なくとも1つの親和性が改変されていないIgSFドメインおよび少なくとも1つの親和性が改変されたIgSFドメイン、または少なくとも2つの親和性が改変されたIgSFドメインを含み、ここで、1つのIgSFドメインは、その細胞表面同族分子種に、競合的に特異的に結合し、第二のIgSFドメインは、非競合的に結合する。より一般に、本明細書において提供される免疫調節タンパク質は、1、2、3、4、5、もしくは6つの競合的または1、2、3、4、5、もしくは6つの非競合的に結合している親和性が改変されていないIgSFおよび／または親和性が改変されたIgSFドメイン、またはその任意の組み合わせを含むことができる。したがって、本明細書において提供される免疫調節タンパク質は、それぞれ：0および1、0 および2、0および3、0および4、1および0、1および1、1および2、1および3、2および0、2および1、2および2、2および3、3および0、3および1、3および2、3および3、4および0、4および1、ならびに、4および2の非競合的および競合的に結合しているIgSFドメインの数を有することができる。
免疫調節タンパク質が複数のIgSFドメインを含有するいくつかの態様において、本明細書において提供される免疫調節タンパク質の複数の親和性が改変されていないおよび／または親和性が改変されたIgSFドメインは、互いに直接共有結合している必要はない。いくつかの態様において、1つまたは複数のアミノ酸残基の介在範囲は、親和性が改変されていないおよび／または親和性が改変されたIgSFドメインを互いに間接的に共有結合させる。その連結は、N末端からC末端の残基を介することができる。
いくつかの態様において、連結は、親和性が改変されていないまたは親和性が改変されたIgSFドメインのN末端またはC末端に位置していないアミノ酸残基の側鎖を介して行うことができる。したがって、連結は、末端もしくは内部アミノ酸残基またはその組み合わせを介して行うことができる。
親和性が改変されていないIgSFドメインおよび/または親和性改変IgSFドメインを連結する「ペプチドリンカー」は、単一アミノ酸残基であっても、より長いものであってもよい。いくつかの態様において、ペプチドリンカーは、少なくとも1つのアミノ酸残基を有するが、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、または1以下のアミノ酸残基長である。いくつかの態様において、リンカーは、3つのアラニン(AAA)である。いくつかの態様において、リンカーは（一文字アミノ酸コードで）GGGGS（「4GS」；SEQ ID NO:1870）または4GSリンカーの多量体、例えば、SEQ ID NO:229（2×GGGGS）またはSEQ ID NO:228（3×GGGGS）に示されるものなどの2、3、4、または5つの4GSリンカーの反復である。いくつかの態様において、リンカーは（一文字アミノ酸コードで）GSGGGGS（SEQ ID NO:1869）である。
III. 例示的な親和性改変ドメインおよび免疫調節タンパク質
いくつかの態様において、免疫調節タンパク質は、上記の表1に示されているものなどの、野生型または未改変IgSFタンパク質のIgSFドメイン内に1つまたは複数のアミノ酸置換を有する親和性改変IgSFドメインを含有する。いくつかの態様において、1つまたは複数のアミノ酸置換は、IgVドメインまたはその特異的結合断片内にある。いくつかの態様において、1つまたは複数のアミノ酸置換は、IgCドメインまたはその特異的結合断片内にある。いくつかの態様において、1つまたは複数のアミノ酸置換は、IgVドメインまたはその特異的結合断片内にあり、1つまたは複数のアミノ酸置換のいくつかは、IgCドメインまたはその特異的結合断片内にある。
野生型または未改変IgSFドメイン配列は、必ずしも、本明細書に記載のバリアントIgSFドメインポリペプチドを作製するための出発組成物として使用される必要はない。それ故、用語「改変」（例えば「置換」）の使用は、本態様がバリアントIgSFタンパク質の特定の製造法に限定されることを暗示するものではない。バリアントIgSFポリペプチドは、例えば、デノボペプチド合成によって製造することができ、したがって、改変（例えば置換）をコードするようコドンを変更するという意味で、必ずしも改変（例えば「置換」）を必要とするわけではない。この原則はまた、アミノ酸残基の「付加」および「欠失」という用語まで拡張され、これも同じく特定の製造法を暗示するものではない。バリアントIgSFポリペプチドが設計または作製される手段は、任意の特定の方法に限定されない。いくつかの態様において、しかしながら、野生型または未改変IgSFポリペプチドをコードする核酸は、野生型または未改変遺伝物質から変異し、所望の特異的結合親和性および/もしくはIFN-γ発現の誘導または他の機能的活性についてスクリーニングされる。いくつかの態様において、バリアントIgSFポリペプチドは、いくつもの公的に利用可能なデータベースで利用可能なタンパク質または核酸配列を利用してデノボ合成され、次いで、その後スクリーニングされる。国立生物工学情報センターは、そのような情報を提供し、そのウェブサイトは、先に考察したUniProtKBデータベースと同じくインターネットを介して公的にアクセス可能である。
他に規定のない限り、本開示を通して示す通り、アミノ酸置換は、表1に示されている未改変ECD配列の位置のナンバリングに対応するアミノ酸位置番号によって指定される。
親和性改変IgSFドメイン（そのIgSFドメイン（例えば、IgV)を含有するその部分を含む）における改変（例えば、アミノ酸置換）の対応する位置を（例えば参照配列のアライメントによって）同定することは当業者のレベルの範囲内である。本開示全体にわたる改変の一覧において、アミノ酸位置が中央に表示され、対応する未改変（例えば、野生型）アミノ酸が番号の前に記載され、同定されたバリアントアミノ酸置換が番号の後に記載される。改変が当該位置の欠失である場合、「del」が表示され、改変が当該位置における挿入である場合、「ins」が表示される。いくつかの場合に、挿入が記載されるとき、アミノ酸位置が中央に表示され、対応する未改変（例えば、野生型）アミノ酸が番号の前や後に記載され、同定されたバリアントアミノ酸挿入は、未改変（例えば、野生型）アミノ酸の後に記載される。
いくつかの態様において、親和性改変IgSFドメインは、最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20個のアミノ酸置換を有する。置換は、IgVドメインまたはIgCドメイン内であることができる。いくつかの態様において、親和性改変IgSFドメインは、IgVドメインまたはその特異的結合断片内に、最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20個のアミノ酸置換を有する。いくつかの態様において、親和性改変IgSFドメインは、IgCドメインまたはその特異的結合断片内に、最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20個のアミノ酸置換を有する。いくつかの態様において、親和性改変IgSFドメインは、野生型もしくは未改変IgSFドメインまたはその特異的結合断片、例えばSEQ ID NO:1〜27および408のうちのいずれかに示されるIgSFタンパク質に含有されるIgSFドメインと少なくとも約85％、86％、86％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％の配列同一性を有する。
いくつかの態様において、免疫調節タンパク質は、B7 IgSFファミリーメンバーの野生型または未改変IgSFドメイン内に1つまたは複数のアミノ酸置換を含有する少なくとも1つの親和性改変IgSFドメインを含有する。いくつかの態様において、B7 IgSFファミリーメンバーは、CD80、CD86、またはICOSリガンド(ICOSL)である。いくつかの態様において、免疫調節タンパク質の親和性改変IgSFドメインは、CD80、CD86、またはICOSリガンド(ICOSL)の野生型もしくは未改変IgSFドメインまたはその特異的結合断片、例えばSEQ ID NO:1、2または5のいずれかに示されるIgSFタンパク質に含有されるIgSFドメイン（例えば、IgVまたはIgC)と少なくとも約85％、86％、86％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％の配列同一性を有する。CD80の例示的な親和性改変IgSFドメインは、表2および表3に示されている。いくつかの態様において、CD80の親和性改変IgSFドメインは、CD28に対する向上した結合親和性または向上した結合選択性を示す。いくつかの態様において、CD80の親和性改変IgSFドメインは、CTLA-4に対する向上した結合親和性または向上した結合選択性を示す。ICOSLの例示的な親和性改変IgSFドメインは、表4に示されている。いくつかの態様において、ICOSLの親和性改変IgSFドメインは、CD28またはICOSに対する向上した結合親和性または向上した結合選択性を示す。CD86の例示的な親和性改変IgSFドメインは、表5に示されている。
（表２）例示的なバリアントCD80ポリペプチド
Figure 2020500010
Figure 2020500010
（表３）例示的なバリアントCD80ポリペプチド
Figure 2020500010
Figure 2020500010
Figure 2020500010
（表４）例示的なバリアントICOSLポリペプチド
Figure 2020500010
Figure 2020500010
（表５）例示的なバリアントCD86ポリペプチド
Figure 2020500010
いくつかの態様において、親和性改変IgSFドメインは、場合によってはより高い結合親和性または選択性で、抑制性受容体に結合する。いくつかの態様において、親和性改変IgSFドメインは、抑制性受容体に結合するIgSFファミリーメンバーの野生型または未改変IgSFドメイン（例えば、IgV）内に、1つまたは複数のアミノ酸改変（例えば、置換、欠失、または付加)を含有する。例示的なそのような抑制性受容体は、PD-1、CTLA-4、LAG3、TIGIT、TIM-3、またはBTLAである。
いくつかの態様において、免疫調節タンパク質は、ポリオウイルス受容体IgSFファミリーメンバーの野生型または未改変IgSFドメイン内に1つまたは複数のアミノ酸置換を含有する少なくとも1つの親和性改変IgSFドメインを含有する。いくつかの態様において、ポリオウイルスIgSFファミリーメンバーは、CD155(PVR)またはCD122(PRR-2)である。いくつかの態様において、免疫調節タンパク質の親和性改変IgSFドメインは、CD155またはCD112の野生型もしくは未改変IgSFドメインまたはその特異的結合断片、例えばSEQ ID NO:20または21のいずれかに示されるIgSFタンパク質に含有されるIgSFドメイン（例えば、IgVまたはIgC)と少なくとも約85％、86％、86％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％の配列同一性を有する。CD155の例示的な親和性改変IgSFドメインは、表6に示されている。CD112の例示的な親和性改変IgSFドメインは、表7に示されている。いくつかの態様において、CD155またはCD122の親和性改変IgSFドメインは、TIGITに対する向上した結合親和性または向上した結合選択性を示す。
（表６）例示的なバリアントCD155ポリペプチド
Figure 2020500010
Figure 2020500010
Figure 2020500010
Figure 2020500010
Figure 2020500010
（表７）例示的なバリアントCD112ポリペプチド
Figure 2020500010
Figure 2020500010
Figure 2020500010
Figure 2020500010
いくつかの態様において、免疫調節タンパク質は、PD-L1またはPD-L2の野生型または未改変IgSFドメイン内に1つまたは複数のアミノ酸置換を含有する少なくとも1つの親和性改変IgSFドメインを含有する。いくつかの態様において、免疫調節タンパク質の親和性改変IgSFドメインは、PD-L1またはPD-L2の野生型もしくは未改変IgSFドメインまたはその特異的結合断片、例えばSEQ ID NO:3または4に示されるIgSFタンパク質に含有されるIgSFドメイン（例えば、IgVまたはIgC)と少なくとも約85％、86％、86％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％の配列同一性を有する。PD-L1の例示的な親和性改変IgSFドメインは、表8に示されている。PD-L2の例示的な親和性改変IgSFドメインは、表9に示されている。いくつかの態様において、PD-L1またはPD-L2の親和性改変IgSFドメインは、PD-1に対する向上した結合親和性または向上した結合選択性を示す。
（表８）例示的なバリアントPD-L1ポリペプチド
Figure 2020500010
Figure 2020500010
Figure 2020500010
Figure 2020500010
Figure 2020500010
（表９）例示的なバリアントPD-L2ポリペプチド
Figure 2020500010
Figure 2020500010
Figure 2020500010
いくつかの態様において、免疫調節タンパク質は、NKp30ファミリーメンバーの野生型または未改変IgSFドメイン内に1つまたは複数のアミノ酸置換を含有する親和性改変IgSFドメインを含有する。いくつかの態様において、親和性改変IgSFドメインは、NKp30ファミリーメンバーの野生型もしくは未改変IgSFドメインまたはその特異的結合断片、例えばSEQ ID NO:27に示されるIgSFタンパク質に含有されるIgSFドメイン（例えば、IgC)と少なくとも約85％、86％、86％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％の配列同一性を有する。表10は、例示的な親和性改変NKp30 IgSFドメインを提供する。
（表１０）例示的なバリアントNKp30ポリペプチド
Figure 2020500010
IV. 分泌性免疫調節タンパク質および改変細胞
本明細書において、改変細胞によって発現および分泌されることができる、免疫調節タンパク質、例えば上記のいずれかが提供される。分泌性免疫調節タンパク質(SIP)、ならびにそのような分泌性免疫調節タンパク質を発現および分泌する改変細胞は、免疫系応答の調節が有益である疾患または障害を有する哺乳動物において免疫学的活性を調節することによって治療的有用性を有することができる。
いくつかの態様において、免疫調節タンパク質は、野生型IgSFドメイン内に1つまたは複数のアミノ酸置換を含む少なくとも1つの非免疫グロブリン親和性改変免疫グロブリンスーパーファミリー(IgSF)ドメインを含み、ここで、少なくとも1つの親和性改変IgSFドメインは、野生型IgSFドメインの少なくとも1つの細胞表面同族結合パートナーに特異的に結合する。いくつかの態様において、親和性改変IgSFドメインは、Igスーパーファミリーメンバーの親和性改変IgSFドメイン、例えば本明細書に記載のいずれかを含むことができる。いくつかの態様において、親和性改変IgSFドメインは、B7ファミリーのタンパク質のIgSFファミリーメンバー内にある。いくつかの態様において、親和性改変IgSFドメインは、抑制性受容体に結合するIgSFファミリーメンバー内にある。いくつかの態様において、親和性改変IgSFドメインは、IgSFドメイン内に任意の1つまたは複数のアミノ酸置換、例えば表2〜10のいずれかに示されている任意の1つまたは複数のアミノ酸置換を含む。
いくつかの態様において、免疫調節タンパク質は、膜貫通ドメインを含まない。いくつかの態様において、免疫調節タンパク質は、半減期延長部分（例えば、Fcドメインまたは多量体化ドメイン)にコンジュゲートされていない。いくつかの態様において、免疫調節タンパク質は、ドメインを細胞の外に出すためのシグナルペプチド、例えば抗体シグナルペプチドまたは他の効率的なシグナル配列を含む。免疫調節タンパク質がシグナルペプチドを含み、シグナルペプチドは、免疫調節タンパク質が改変細胞によって発現されると免疫調節タンパク質が改変細胞によって分泌されるようにする。一般に、シグナルペプチド、またはシグナルペプチドの一部は、分泌と共に免疫調節タンパク質から切断される。免疫調節タンパク質は、核酸（発現ベクターの一部であることができる）によってコードされることができる。いくつかの態様において、免疫調節タンパク質は、細胞（例えば免疫細胞、例えば初代免疫細胞）によって発現および分泌される。
A. シグナルペプチド
いくつかの態様において、本明細書において提供される免疫調節タンパク質は、シグナルペプチドをさらに含む。いくつかの態様において、シグナルペプチドをコードする分泌配列に機能的に接続された、免疫調節タンパク質をコードする核酸分子が、本明細書において提供される。
シグナルペプチドは、細胞からの免疫調節タンパク質の分泌を伝える免疫調節タンパク質のN末端上の配列である。いくつかの態様において、シグナルペプチドは、約5〜約40アミノ酸長（例えば、約5〜約7、約7〜約10、約10〜約15、約15〜約20、約20〜約25、または約25〜約30、約30〜約35、または約35〜約40アミノ酸長)である。
いくつかの態様において、シグナルペプチドは、対応する野生型IgSFファミリーメンバーに由来するネイティブシグナルペプチドである。例えば、いくつかの態様において、免疫調節タンパク質は、野生型IgSFファミリーメンバーに由来する野生型IgSFドメイン内に1つまたは複数のアミノ酸置換を含む少なくとも1つの非免疫グロブリン親和性改変免疫グロブリンスーパーファミリー(IgSF)ドメイン、および野生型IgSFファミリーメンバーに由来するシグナルペプチドを含む。IgSFファミリーメンバーに由来する例示的なシグナルペプチドは、表1において特定される。
いくつかの態様において、シグナルペプチドは、非ネイティブシグナルペプチドである。例えば、いくつかの態様において、非ネイティブシグナルペプチドは、対応する野生型IgSFファミリーメンバーに由来する変異ネイティブシグナルペプチドであって、1つまたは複数（例えば、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、9つ、または10以上）の置換、挿入、または欠失を含むことができる。いくつかの態様において、非ネイティブシグナルペプチドは、野生型IgSFファミリーメンバーと同じIgSFファミリーのファミリーメンバーのシグナルペプチドまたはその変異体である。いくつかの態様において、非ネイティブシグナルペプチドは、野生型IgSFファミリーメンバーとは異なるIgSFファミリーのIgSFファミリーメンバーに由来するシグナルペプチドまたはその変異体である。いくつかの態様において、シグナルペプチドは、非IgSFタンパク質ファミリーに由来するシグナルペプチドまたはその変異体、例えば、免疫グロブリン（例えば、IgG重鎖またはIgG-κ軽鎖）、サイトカイン（例えば、インターロイキン-2(IL-2)、またはCD33）、血清アルブミンタンパク質（例えば、HSAまたはアルブミン）、ヒトアズロシジンプレタンパク質シグナル配列、ルシフェラーゼ、トリプシノーゲン（例えば、キモトリプシノーゲンまたはトリプシノーゲン）に由来するシグナルペプチド、または細胞からタンパク質を効率的に分泌することができる他のシグナルペプチドである。例示的なシグナルペプチドには、表11に記載のいずれかが含まれる。
(表１１)例示的なシグナルペプチド
Figure 2020500010
いくつかの態様において、免疫調節タンパク質は、発現時にシグナルペプチドを含み、分泌時に当該シグナルペプチド（またはその一部）が当該免疫調節タンパク質から切断される。
B. 核酸分子および発現ベクター
本明細書において、本発明の免疫調節ポリペプチドの種々の提供される態様のいずれかをコードする、「核酸」と総称される単離されたまたは組換え核酸が提供される。一局面において、野生型IgSFドメイン内に1つまたは複数のアミノ酸置換を含む少なくとも1つの非免疫グロブリン親和性改変免疫グロブリンスーパーファミリー(IgSF)ドメインを含む免疫調節タンパク質をコードする核酸であって、少なくとも1つの親和性改変IgSFドメインが、野生型IgSFドメインの少なくとも1つの細胞表面同族結合パートナーに特異的に結合する、核酸が提供される。いくつかの態様において、核酸分子によってコードされる免疫調節タンパク質は、膜貫通ドメインを含まない。いくつかの態様において、核酸分子によってコードされる免疫調節タンパク質は、半減期延長部分（例えば、Fcドメインまたは多量体化ドメイン)を含まない。いくつかの態様において、核酸分子によってコードされる免疫調節タンパク質は、シグナルペプチドを含む。いくつかの態様において、核酸分子は、免疫調節タンパク質の発現を制御するために機能的に連結された少なくとも1つのプロモーターをさらに含む。
下記の全てを含む本明細書において提供される核酸は、細胞を改変するためのものを含め、免疫調節タンパク質の組換え発現において有用である。本明細書において提供される核酸は、RNAの形態であってもDNAの形態であってもよく、mRNA、cRNA、組換えまたは合成のRNAおよびDNA、ならびにcDNAを含むことができる。本発明の核酸は、典型的には、DNA分子、通常二本鎖のDNA分子である。しかしながら、本発明のヌクレオチド配列のいずれかを含む、一本鎖DNA、一本鎖RNA、二本鎖RNA、およびハイブリッドDNA/RNA核酸またはそれらの組み合わせも提供される。
また、本明細書において、本発明の免疫調節タンパク質を発現するように細胞を改変する際に有用な発現ベクターが提供される。一局面において、分泌のためのシグナル配列の機能的制御下にある免疫調節タンパク質をコードする核酸を含む組換え発現ベクターであって、免疫調節タンパク質が、野生型IgSFドメイン内に1つまたは複数のアミノ酸置換を含む少なくとも1つの非免疫グロブリン親和性改変免疫グロブリンスーパーファミリー(IgSF)ドメインを含み、少なくとも1つの親和性改変IgSFドメインが、野生型IgSFドメインの少なくとも1つの細胞表面同族結合パートナーに特異的に結合する、組換え発現ベクターが提供される。いくつかの態様において、細胞から発現されると、コードされる免疫調節タンパク質が分泌される。いくつかの態様において、核酸分子によってコードされる免疫調節タンパク質は、膜貫通ドメインを含まない。いくつかの態様において、核酸分子によってコードされる免疫調節タンパク質は、半減期延長部分（例えば、Fcドメインまたは多量体化ドメイン)を含まない。いくつかの態様において、核酸分子によってコードされる免疫調節タンパク質は、シグナルペプチドを含む。
本明細書において提供される免疫調節ポリペプチドをコードする核酸を、組換えDNAおよびクローニング技術を使用して細胞に導入することができる。そのために、免疫調節ポリペプチドをコードする組換えDNA分子が調製される。そのようなDNA分子を調製する方法は、当技術分野において周知である。例えば、ペプチドをコードする配列を、好適な制限酵素を使用してDNAから切り取ることもできる。代替的に、ホスホロアミダイト法などの化学合成技術を使用してDNA分子を合成することもできる。また、これらの技術の組み合わせを使用することもできる。いくつかの状況で、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を通じて組換えまたは合成核酸を作製してよい。
いくつかの態様において、1つまたは複数の親和性改変IgSFドメインおよびいくつかの態様においてシグナルペプチドをコードする、DNAインサートを作製することができる。このDNAインサートを、当業者に公知の通り、適切な形質導入/トランスフェクションベクターにクローニングすることができる。また、核酸分子を含有する発現ベクターも提供される。
いくつかの態様において、発現ベクターは、免疫調節タンパク質を適切な細胞においてタンパク質の発現に適した条件下で発現させることができる。いくつかの局面において、核酸分子または発現ベクターは、適切な発現制御配列に機能的に連結された免疫調節タンパク質をコードするDNA分子を含む。DNA分子がベクターに挿入される前か後かのいずれかにこの機能的連結を達成する方法は周知である。発現制御配列は、プロモーター、アクチベーター、エンハンサー、オペレーター、リボソーム結合部位、開始シグナル、停止シグナル、キャップシグナル、ポリアデニル化シグナル、および転写または翻訳の制御に関与する他のシグナルを含む。いくつかの態様において、本発明の核酸は、免疫調節タンパク質をコードする核酸に機能的に連結された分泌またはシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列をさらに含み、それによって免疫調節タンパク質の分泌が可能となる。
いくつかの態様において、免疫調節タンパク質の発現は、発現を制御または調節するプロモーターまたはエンハンサーによって制御される。プロモーターは、免疫調節タンパク質をコードする核酸分子の部分に機能的に連結される。いくつかの態様において、プロモーターは、構成的活性型プロモーター（例えば、組織特異的な構成的活性型プロモーターまたは他の構成的プロモーター)である。いくつかの態様において、プロモーターは、誘導物質（例えば、T細胞活性化シグナル)に応答性であり得る誘導性プロモーターである。
いくつかの態様において、構成的プロモーターは、免疫調節タンパク質をコードする核酸分子に機能的に連結される。例示的な構成的プロモーターは、サル空胞ウイルス40(SV40)プロモーター、サイトメガロウイルス(CMV)プロモーター、ユビキチンC(UbC)プロモーター、およびEF-1α(EF1a)プロモーターを含む。いくつかの態様において、構成的プロモーターは、組織特異的である。例えば、いくつかの態様において、プロモーターは、免疫調節タンパク質の特定の組織、例えば免疫細胞、リンパ球、またはT細胞における構成的発現を可能にする。例示的な組織特異的プロモーターは、例えば、フェトタンパク質、DF3、チロシナーゼ、CEA、界面活性タンパク質、およびErbB2プロモーターを含め、米国特許第5,998,205号に記載されている。
いくつかの態様において、誘導性プロモーターは、転写の適切な誘導因子の存在または非存在を制御することによって核酸の発現が制御可能であるように、免疫調節タンパク質をコードする核酸分子に機能的に連結される。例えば、プロモーターは、コードされるポリペプチドの調節された発現を可能にする、調節されたプロモーターおよび転写因子発現系、例えば公開されているテトラサイクリンで調節された系または他の調節可能な系（例えば、公開されている国際PCT出願第WO 01/30843号を参照のこと)であることができる。例示的な調節可能なプロモーター系は、例えばClontech(Palo Alto, CA)から入手可能なTet-On(およびTet-Off)系である。このプロモーター系は、テトラサイクリンまたはテトラサイクリン誘導体、例えばドキシサイクリンによって制御される、導入遺伝子の調節された発現を可能にする。他の調節可能なプロモーター系は、公知である（例えば、リガンド結合ドメインおよび転写調節ドメイン、例えばホルモン受容体由来のものを含有する遺伝子スイッチを説明している「Regulation of Gene Expression Using Single-Chain, Monomeric, Ligand Dependent Polypeptide Switches」という表題の公開されている米国出願第2002-0168714号を参照のこと)。
いくつかの態様において、プロモーターは、T細胞活性化シグナル伝達に応答性のエレメントに応答性である。単なる例として、いくつかの態様において、改変されたT細胞は、免疫調節タンパク質および免疫調節タンパク質の発現を制御するために機能的に連結されたプロモーターをコードする発現ベクターを含む。改変されたT細胞を、例えば、改変されたT細胞受容体(TCR)またはキメラ抗原受容体(CAR)を通じたシグナル伝達によって活性化することができ、それによって、応答性プロモーターを通じた免疫調節タンパク質の発現および分泌を引き起こすことができる。
いくつかの態様において、誘導性プロモーターは、活性化されたT細胞の核因子(NFAT)または活性化されたB細胞の核因子κ軽鎖エンハンサー(NF-κB)に応答して免疫調節タンパク質が発現されるように、免疫調節タンパク質をコードする核酸分子に機能的に連結される。例えば、いくつかの態様において、誘導性プロモーターは、NFATまたはNF-κBの結合部位を含む。例えば、いくつかの態様において、プロモーターは、NFATもしくはNF-κBプロモーターまたはその機能的バリアントである。したがって、いくつかの態様において、核酸は、免疫調節タンパク質の毒性を低減または排除しながらも、免疫調節タンパク質の発現を制御することを可能にする。特に、本発明の核酸を含む改変免疫細胞は、細胞（例えば、細胞によって発現されるT細胞受容体(TCR)またはキメラ抗原受容体(CAR))が抗原によって特異的に刺激されたとき、および/または、細胞（例えば、細胞のカルシウムシグナル伝達経路)が、例えばホルボールミリスタートアセタート(PMA)/イオノマイシンによって非特異的に刺激されたときにだけ、免疫調節タンパク質を発現および分泌する。したがって、免疫調節タンパク質の発現および分泌を、それが必要なときと場合に（例えば、感染症を引き起こす物質、がんの存在下、または腫瘍部位で)だけ起こるように制御することができ、それで望ましくない免疫調節タンパク質相互作用を減少または回避することができる。
いくつかの態様において、本明細書に記載の免疫調節タンパク質をコードする核酸は、NFATプロモーター、NF-κBプロモーター、またはその機能的バリアントをコードする好適なヌクレオチド配列を含む。「NFATプロモーター」は、本明細書において使用される場合、最小プロモーターに連結された1つまたは複数のNFAT応答性エレメントを意味する。「NF-κBプロモーター」は、最小プロモーターに連結された1つまたは複数のNF-κB応答性エレメントを指す。いくつかの態様において、遺伝子の最小プロモーターは、最小ヒトIL-2プロモーターまたはCMVプロモーターである。NFAT応答性エレメントは、例えば、NFAT1、NFAT2、NFAT3、および/またはNFAT4応答性エレメントを含んでよい。NFATプロモーター、NF-κBプロモーター、またはその機能的バリアントは、いくつもの結合モチーフ、例えば、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、または少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、または最大で12個の結合モチーフを含んでよい。
いくつかの態様において、DNA分子をその上に有する得られた発現ベクターが、適切な細胞を形質転換、例えば形質導入するために使用される。当技術分野において周知の方法を使用して導入を実施することができる。例示的な方法は、ウイルス、例えばレトロウイルスまたはレンチウイルス、形質導入、トランスポゾン、およびエレクトロポレーションを介したものを含む、受容体をコードする核酸の移入のための方法を含む。いくつかの態様において、発現ベクターは、ウイルスベクターである。いくつかの態様において、核酸は、レンチウイルスまたはレトロウイルス形質導入法によって細胞に移入される。
C. 例示的な免疫調節タンパク質およびコード核酸分子
SEQ ID NO:28〜54および410のいずれかまたはその特異的結合断片（IgSFドメイン（例えば、IgVドメインまたはIgCドメイン)を含有する）に対して少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％の配列同一性を示し、かつ、IgSFドメイン内に1つまたは複数のアミノ酸改変（例えば、アミノ酸置換）を含有する記載の通りの少なくとも1つの親和性改変IgSFドメインを含有するアミノ酸配列を含む、上記の説明に従う免疫調節タンパク質、例えば分泌性免疫調節タンパク質が本明細書において提供される。いくつかの態様において、免疫調節タンパク質、例えば分泌性免疫調節タンパク質は、IgVドメインが、SEQ ID NO:28〜54および410のいずれかに含有される対応するIgVドメインに対して少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％の配列同一性を示すように、SEQ ID NO:28〜54および410（例えば、表1を参照のこと)のいずれかに示されるアミノ酸配列内に含有されるIgVドメインまたはその特異的断片を含むがその中に1つまたは複数のアミノ酸改変（例えば、アミノ酸置換）を含有するアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、免疫調節タンパク質は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個、またはそれ以上のアミノ酸改変（例えば、アミノ酸置換）を含有する。いくつかの態様において、免疫調節タンパク質は、記載の通りのシグナルペプチドをさらに含む。いくつかの態様において、シグナルペプチドは、対応する野生型IgSFメンバーのネイティブシグナルペプチドである（例えば、表1を参照のこと)。いくつかの態様において、シグナルペプチドは、例えば表11に記載されているもののうちのいずれかのような非ネイティブシグナルペプチドである。
また、SEQ ID NO:28〜54および410のいずれかまたはその特異的結合断片（IgSFドメイン（例えば、IgVドメインまたはIgCドメイン)を含有する）に対して少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％の配列同一性を示し、かつ、1つまたは複数のアミノ酸改変（例えば、アミノ酸置換）を含有する記載の通りの少なくとも1つの親和性改変IgSFドメインを含有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む免疫調節タンパク質をコードする核酸分子が本明細書において提供される。いくつかの態様において、免疫調節タンパク質、例えば分泌性免疫調節タンパク質は、IgVドメインが、SEQ ID NO:28〜54および410のいずれかに含有される対応するIgVドメインに対して少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％の配列同一性を示すように、SEQ ID NO:28〜54および410（例えば、表1を参照のこと)のいずれかに示されるアミノ酸配列内に含有されるIgVドメインまたはその特異的断片を含むがその中に1つまたは複数のアミノ酸改変（例えば、アミノ酸置換）を含有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様において、核酸分子は、シグナルペプチドをコードするヌクレオチドの配列をさらに含む。いくつかの態様において、シグナルペプチドは、対応する野生型IgSFメンバーのネイティブシグナルペプチドである（例えば、表1を参照のこと)。いくつかの態様において、シグナルペプチドは、例えば表11に記載されているもののうちのいずれかのような非ネイティブシグナルペプチドである。
いくつかの態様において、免疫調節タンパク質は、表2〜10のいずれかに示されるECDもしくはIgVのSEQ ID NOのいずれかに示されるアミノ酸配列を有するか、または、表2〜10のいずれかに示されているECDもしくはIgVのSEQ ID NOのいずれかに対して少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、もしくは99％を示しかつ記載されたアミノ酸改変（例えば、アミノ酸置換)を含有するアミノ酸配列を有する。いくつかの態様において、免疫調節タンパク質は、記載の通りのシグナルペプチドをさらに含む。いくつかの態様において、シグナルペプチドは、対応する野生型IgSFメンバーのネイティブシグナルペプチドである（例えば、表1を参照のこと)。いくつかの態様において、シグナルペプチドは、例えば表11に記載されているもののうちのいずれかのような非ネイティブシグナルペプチドである。
いくつかの態様において、核酸分子は、表2〜10のいずれかに示されているECDもしくはIgVのSEQ ID NOのうちのいずれかに示されるアミノ酸配列を有するか、または、表2〜10のいずれかに示されているECDもしくはIgVのSEQ ID NOのうちのいずれかに対して少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、もしくは99％を示しかつ記載されたアミノ酸改変（例えば、アミノ酸置換)を含有するアミノ酸配列を有する免疫調節タンパク質をコードする。いくつかの態様において、核酸分子は、シグナルペプチドをコードするヌクレオチドの配列をさらに含む。いくつかの態様において、シグナルペプチドは、対応する野生型IgSFメンバーのネイティブシグナルペプチドである（例えば、表1を参照のこと)。いくつかの態様において、シグナルペプチドは、例えば表11に記載されているもののうちのいずれかのような非ネイティブシグナルペプチドである。
V. 膜貫通型免疫調節タンパク質
本明細書において、膜貫通タンパク質である免疫調節タンパク質(「膜貫通型免疫調節タンパク質」)が提供される。膜貫通型免疫調節タンパク質、およびそのような膜貫通型免疫調節タンパク質を発現する改変細胞は、概して、免疫系応答の調節が有益である疾患または障害を有する哺乳動物において免疫学的活性を調節することによって治療的有用性を有する。本発明の膜貫通型免疫調節タンパク質は、エクトドメイン、膜貫通、およびいくつかの態様においては細胞内ドメイン（例えば細胞質シグナル伝達ドメイン）を含む。
A. エクトドメイン
いくつかの態様において、提供される膜貫通型免疫調節タンパク質は、野生型哺乳動物IgSFメンバーのIgSFドメインと比較して少なくとも1つの親和性改変IgSFドメインを含むエクトドメインを含む。いくつかの態様において、免疫調節タンパク質は、野生型IgSFドメイン内に1つまたは複数のアミノ酸置換を含む少なくとも1つの非免疫グロブリン親和性改変免疫グロブリンスーパーファミリー(IgSF)ドメインを含み、ここで、少なくとも1つの親和性改変IgSFドメインは、野生型IgSFドメインの少なくとも1つの細胞表面同族結合パートナーに特異的に結合する。いくつかの態様において、親和性改変IgSFドメインは、Igスーパーファミリーメンバーの親和性改変IgSFドメイン、例えば本明細書に記載のいずれかを含むことができる。いくつかの態様において、親和性改変IgSFドメインは、B7ファミリーのタンパク質のIgSFファミリーメンバー内にある。いくつかの態様において、親和性改変IgSFドメインは、抑制性受容体に結合するIgSFファミリーメンバー内にある。いくつかの態様において、親和性改変IgSFドメインは、本明細書に記載のIgSFドメイン内に任意の1つまたは複数のアミノ酸置換、例えば表2〜10のいずれかに示されている任意の1つまたは複数のアミノ酸置換を含む。
B. 膜貫通ドメイン
本明細書において提供される膜貫通型免疫調節タンパク質は、エクトドメインに連結された膜貫通ドメインをさらに含有する。いくつかの態様において、膜貫通ドメインは、細胞上での細胞表面発現のためのコードされたタンパク質をもたらす。いくつかの態様において、膜貫通ドメインは、エクトドメインに直接連結されている。いくつかの態様において、膜貫通ドメインは、1つまたは複数のリンカーまたはスペーサーを介して間接的にエクトドメインに連結されている。いくつかの態様において、膜貫通ドメインは、主として疎水性アミノ酸残基、例えばロイシンおよびバリンを含有する。
いくつかの態様において、完全長膜貫通アンカードメインを使用して、TIPが確実に改変細胞（例えば、改変されたT細胞）の表面に発現するようにすることができる。好都合には、これは、親和性が改変されている特定の天然タンパク質（例えば、CD80もしくはICOSLまたは他の天然IgSFタンパク質）に由来することもでき、かつ、天然IgSFタンパク質（例えば、CD80またはICOSL）と同様にして第一の膜近位ドメインの配列に簡単に融合されることもできる。いくつかの態様において、膜貫通型免疫調節タンパク質は、対応する野生型または未改変のIgSFメンバーの膜貫通ドメイン、例えばSEQ ID NO：1〜27および408（表1を参照のこと）のいずれかに示されるアミノ酸配列内に含有される膜貫通ドメインを含む。
いくつかの態様において、膜貫通ドメインは、野生型IgSFメンバーの膜貫通ドメインではない非天然膜貫通ドメインである。いくつかの態様において、膜貫通ドメインは、膜結合型タンパク質であるかまたは膜貫通型タンパク質である別の非IgSFファミリーメンバーポリペプチドに由来する膜貫通ドメインに由来する。いくつかの態様において、T細胞上の別のタンパク質に由来する膜貫通アンカードメインを使用することができる。いくつかの態様において、膜貫通ドメインは、CD8に由来する。いくつかの態様において、膜貫通ドメインは、スペーサードメインとして役立つCD8の細胞外部分をさらに含有することができる。例示的なCD8由来膜貫通ドメインは、SEQ ID NO：1574に示されるか、またはCD8膜貫通ドメインを含有するその一部である。いくつかの態様において、膜貫通ドメインは、合成膜貫通ドメインである。
C. 細胞内ドメイン
いくつかの態様において、膜貫通型免疫調節タンパク質は、膜貫通ドメインに連結された細胞内ドメイン、例えば細胞質シグナル伝達ドメインをさらに含有する。いくつかの態様において、細胞質シグナル伝達ドメインは、細胞シグナル伝達を誘導する。いくつかの態様において、膜貫通型免疫調節タンパク質の細胞内ドメインは、対応する野生型または未改変のポリペプチドの細胞質ドメイン、例えばSEQ ID NO：1〜27および408（表1を参照のこと）のいずれかに示されるアミノ酸配列内に含有される細胞質ドメインを含む。
いくつかの態様において、膜貫通型免疫調節タンパク質の細胞内ドメインが少なくとも1つのITAM（免疫受容体チロシン活性化モチーフ）含有シグナル伝達ドメインを含む細胞質シグナル伝達ドメインを含む、CAR関連膜貫通型免疫調節タンパク質が提供される。ITAMは、T細胞受容体シグナル伝達に関与するCD3ζ鎖（「CD3z」）を含む、免疫細胞のシグナル伝達に関与する数多くのタンパク質のシグナル伝達ドメインに見いだされる、保存されたモチーフである。いくつかの態様において、細胞内ドメインは、CD3ζシグナル伝達ドメインを含む。いくつかの態様において、CD3ζシグナル伝達ドメインは、SEQ ID NO：1575に示されるアミノ酸配列、またはSEQ ID NO：1575に少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、もしくは99％を示しかつT細胞シグナル伝達活性を保持するアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、CAR関連膜貫通型免疫調節タンパク質の細胞内ドメインは、T細胞の免疫調節応答をさらに調節する共刺激シグナル伝達ドメインをさらに含むことができる。いくつかの態様において、共刺激シグナル伝達ドメインは、CD28、ICOS、41BBまたはOX40である。いくつかの態様において、提供されるCAR関連膜貫通型免疫調節タンパク質は、同族結合パートナーまたはカウンター構造体に対する親和性改変IgSFドメインの結合によってT細胞シグナル伝達を刺激するCARの特徴を有する。いくつかの態様において、そのカウンター構造体に対する親和性改変IgSFドメインによる特異的結合によって、細胞傷害性、増殖またはサイトカイン産生の変化によって反映されるとおり、T細胞活性の免疫活性の変化を導くことができる。
いくつかの態様において、CAR関連膜貫通型免疫調節タンパク質は、所望のカウンター構造体に特異的に結合するように改変されている抗原結合領域を含む。いくつかの態様において、親和性改変IgSFドメインは、その天然カウンター構造体に特異的に結合する。いくつかの態様において、カウンター構造体は、IgSFファミリーメンバーである。いくつかの態様において、腫瘍特異的IgSFカウンター構造体に特異的に結合するCAR関連膜貫通型免疫調節タンパク質が提供される。いくつかの態様において、抗原結合領域（エクトドメイン）は、親和性改変IgSFドメインNKp30である。いくつかの態様において、親和性改変IgSFドメインは、腫瘍特異的抗原NKp30リガンドB7-H6（Levin et al., The Journal of Immunology, 2009, 182, 134.20 を参照のこと）に特異的に結合する。このような態様の例では、細胞内ドメインは、少なくとも1つのITAM（免疫受容体チロシン活性化モチーフ）含有シグナル伝達ドメイン、例えばCD3ζシグナル伝達ドメインを含む。いくつかの態様において、細胞内ドメインは、CD28共刺激ドメイン、OX40シグナル伝達ドメイン、および41BBシグナル伝達ドメインのうちの少なくとも1つをさらに含むことができる。
いくつかの態様において、膜貫通型免疫調節タンパク質は、細胞質シグナル伝達を媒介することが可能な細胞内ドメインを含有しない。いくつかの態様において、膜貫通型免疫調節タンパク質は、野生型または未改変のポリペプチドのシグナル伝達機序を欠いており、それゆえ、それ自体は細胞シグナル伝達を誘導しない。いくつかの態様において、膜貫通型免疫調節タンパク質は、対応する野生型または未改変のポリペプチドの細胞内（細胞質）ドメインまたは細胞内ドメインの一部、例えばSEQ ID NO：1〜27および408（表1を参照のこと）のいずれかに示されるアミノ酸配列内に含有される細胞質シグナル伝達ドメインを欠いている。いくつかの態様において、膜貫通型免疫調節タンパク質は、例えばIgSFファミリーの抑制性受容体（例えば、PD-1またはTIGIT）を含むある種の抑制性受容体に含有されるITIM（免疫受容体チロシン抑制性モチーフ）を含有していない。したがって、いくつかの態様において、膜貫通型免疫調節タンパク質は、エクトドメインおよび膜貫通ドメイン（例えば、記載のとおりのいずれか）のみを含有する。
D. 核酸分子およびベクター
本発明の膜貫通型免疫調節ポリペプチドの種々の提供される態様のいずれかをコードする、「核酸」とまとめて称される単離された核酸または組換え核酸が本明細書において提供される。本明細書において提供される核酸（下記の全てを含む）は、細胞を改変するためということを含め、膜貫通型免疫調節タンパク質の組換え発現において有用である。本明細書において提供される核酸は、RNAの形態またはDNAの形態であることができ、かつ、mRNA、cRNA、組換えもしくは合成RNAおよびDNA、ならびにcDNAを含むことができる。本発明の核酸は、典型的にはDNA分子であり、通常は二本鎖DNA分子である。しかしながら、本発明のヌクレオチド配列のいずれかを含む一本鎖DNA、一本鎖RNA、二本鎖RNA、およびハイブリッドDNA/RNA核酸、またはそれらの組み合わせも提供される。
いくつかの態様において、膜貫通型免疫調節タンパク質の発現は、別の分泌性免疫調節タンパク質について本明細書に記載のような、発現を制御または調節するプロモーターまたはエンハンサーによって制御される。プロモーターは、免疫調節タンパク質をコードする核酸分子の部分に機能的に連結される。いくつかの態様において、プロモーターは、構成的活性型プロモーター（例えば、組織特異的な構成的活性型プロモーターまたは他の構成的プロモーター)である。いくつかの態様において、プロモーターは、誘導物質（例えば、T細胞活性化シグナル)に応答性であり得る誘導性プロモーターである。構成的または誘導性のいずれかで発現を増強、制御、または調節するための任意のプロモーターまたはエレメントを用いることができ、本明細書に記載のいずれかを含む。特定の局面において、プロモーターは、例えば改変されたT細胞受容体(TCR)またはキメラ抗原受容体(CAR)を通じたシグナル伝達によって、T細胞活性化シグナル伝達に応答性のエレメントに応答性である、プロモーターである。例示的なそのようなプロモーターは、記載の通りのNFATまたはNF-κBの結合部位を含有するプロモーターである。例えば、いくつかの態様において、プロモーターは、NFATもしくはNF-κBプロモーターまたはその機能的バリアントである。
また、本発明の膜貫通型免疫調節タンパク質を発現するように細胞を改変する際に有用である発現ベクターが本明細書において提供される。本明細書において提供される免疫調節ポリペプチドを、組換えDNA技術を使用して細胞内に導入することができる。そのために、膜貫通型免疫調節ポリペプチドをコードする組換えDNA分子が調製される。このようなDNA分子を調製する方法は、当技術分野において周知である。例として、該ペプチドをコードする配列を、好適な制限酵素を使用してDNAから切除することもできる。あるいは、ホスホロアミダイト法のような化学合成技術を使用してDNA分子を合成することもできる。また、これらの技術の組み合わせを使用することもできる。いくつかの例では、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を通して組換えまたは合成核酸を生成してもよい。
いくつかの態様において、任意の細胞内ドメイン（すなわち、細胞質ドメイン）、膜貫通アンカードメイン、任意のスペーサードメイン、任意のエピトープタグ、および最後に1つまたは複数の細胞外親和性改変IgSFドメインを含む、完全長DNAインサートを生成することができる。このDNAインサートを、当業者に公知であるとおり、適切なT細胞形質導入/トランスフェクションベクター内にクローニングすることができる。また、該核酸分子を含有するベクターが提供される。
いくつかの態様において、発現ベクターは、タンパク質の発現に適する条件下にて、適切な細胞内で膜貫通型免疫調節タンパク質を発現させることができる。いくつかの局面において、発現ベクターは、適切な発現制御配列に機能的に連結されている膜貫通型免疫調節タンパク質をコードするDNA分子を含む。DNA分子がベクターに挿入される前後のいずれかにこの機能的連結を行う方法が周知である。発現制御配列には、プロモーター、アクチベーター、エンハンサー、オペレーター、リボソーム結合部位、開始シグナル、停止シグナル、キャップシグナル、ポリアデニル化シグナル、および転写または翻訳の制御に関与する他のシグナルが含まれる。いくつかの態様において、本発明の核酸は、膜貫通型免疫調節タンパク質をコードする核酸に機能的に連結されている分泌またはシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列をさらに含む。
いくつかの態様において、DNA分子を有する得られた発現ベクターを使用して、適切な細胞を形質転換、例えば形質導入する。当技術分野において周知の方法を使用して導入を実施することができる。例示的な方法は、ウイルス、例えば、レトロウイルスまたはレンチウイルス、形質導入、トランスポゾン、および電気穿孔法を介することを含む、受容体をコードする核酸の移送のための方法を含む。いくつかの態様において、発現ベクターは、ウイルスベクターである。いくつかの態様において、核酸は、レンチウイルスまたはレトロウイルス形質導入法によって細胞に移送される。
E. 例示的な膜貫通型免疫調節タンパク質およびそれらをコードする核酸分子
記載の通りの少なくとも1つの親和性改変IgSFドメインを含むエクトドメインおよび膜貫通ドメインを含有する、SEQ ID NO:381〜407および409のいずれかまたはその一部に対して、少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％の配列同一性を示すアミノ酸配列を含む、上記の説明に従う膜貫通型免疫調節タンパク質が、本明細書において提供される。いくつかの態様において、膜貫通型免疫調節タンパク質は、表2〜10のいずれかに示されているECDもしくはIgVのSEQ ID NOのいずれかに示されるアミノ酸配列を含有するか、または、表2〜10のいずれかに示されているECDもしくはIgVのSEQ ID NOのいずれかに対して少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％を示しかつ記載されたアミノ酸改変（例えば、アミノ酸置換)を含有するアミノ酸配列を含有するエクトドメインを有する。いくつかの態様において、コードされる免疫調節タンパク質は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個、またはそれ以上のアミノ酸改変（例えば、アミノ酸置換）を含有する。いくつかの態様において、膜貫通型免疫調節タンパク質は、記載の通りの細胞質ドメイン、例えば表1に示されている通りのSEQ ID NO:381〜407および409のいずれかの細胞質ドメインをさらに含むことができる。いくつかの態様において、膜貫通型免疫調節タンパク質は、シグナルペプチドをさらに含有することができる。いくつかの態様において、シグナルペプチドは、対応する野生型IgSFメンバーのネイティブシグナルペプチドである（例えば、表1を参照のこと)。いくつかの態様において、シグナルペプチドは、例えば表11に記載されているもののうちのいずれかのような非ネイティブシグナルペプチドである。
また、記載の通りの少なくとも1つの親和性改変IgSFドメインを含むエクトドメイン、膜貫通ドメイン、および場合により細胞質ドメインを含有する、SEQ ID NO:381〜407および409のいずれかまたはその一部に対して少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％の配列同一性を示すアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む膜貫通型免疫調節タンパク質をコードする核酸分子が本明細書において提供される。いくつかの態様において、核酸は、表2〜10のいずれかに示されているECDもしくはIgVのSEQ ID NOのいずれかに示されるアミノ酸配列を有するか、または、表2〜10のいずれかに示されているECDもしくはIgVのSEQ ID NOのいずれかに対して少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％を示しかつ記載されたアミノ酸改変（例えば、アミノ酸置換)を含有するアミノ酸配列を有する免疫調節タンパク質をコードする。いくつかの態様において、コードされる免疫調節タンパク質は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個、またはそれ以上のアミノ酸改変（例えば、アミノ酸置換）を含有する。いくつかの態様において、核酸分子は、シグナルペプチドをコードするヌクレオチドの配列をさらに含むことができる。いくつかの態様において、シグナルペプチドは、対応する野生型IgSFメンバーのネイティブシグナルペプチドである（例えば、表1を参照のこと)。いくつかの態様において、シグナルペプチドは、例えば表11に記載されているもののうちのいずれかのような非ネイティブシグナルペプチドである。
VI. 改変細胞
本明細書において、本明細書に記載の通りの免疫調節タンパク質または免疫調節タンパク質をコードする核酸（例えば、発現ベクター)を含む改変細胞が提供される。
いくつかの態様において、改変細胞は、分泌性免疫調節タンパク質または分泌性免疫調節タンパク質をコードする核酸分子、例えば記載の通りのいずれかを含有する。いくつかの態様において、改変細胞は、免疫調節タンパク質を発現および分泌する。いくつかの態様において、改変細胞は、免疫調節タンパク質を発現し、かつ、タンパク質の分泌に適した条件下で細胞からそれを分泌することができる。
一局面において、免疫調節タンパク質をコードする核酸分子を含む改変免疫細胞であって、免疫調節タンパク質が、野生型IgSFドメイン内に1つまたは複数のアミノ酸改変（例えば、置換)を含む少なくとも1つの非免疫グロブリン親和性改変免疫グロブリンスーパーファミリー(IgSF)ドメインを含み、少なくとも1つの親和性改変IgSFドメインが、野生型IgSFドメインの少なくとも1つの細胞表面同族結合パートナーに特異的に結合し；改変免疫細胞が免疫調節タンパク質を発現および分泌するように構成される、改変免疫細胞が提供される。いくつかの態様において、免疫調節タンパク質は、膜貫通ドメインを含まない。いくつかの態様において、免疫調節タンパク質は、半減期延長部分（例えば、多量体化ドメインまたはFcドメイン)にコンジュゲートされていない。いくつかの態様において、核酸分子は、免疫調節タンパク質をコードする配列に機能的に連結された、分泌シグナルペプチドをコードする配列を含む。
いくつかの態様において、改変細胞は、膜貫通型免疫調節タンパク質または膜貫通型免疫調節タンパク質をコードする核酸分子、例えば記載の通りのいずれかを含有する。いくつかの態様において、改変細胞は、免疫調節タンパク質をその表面に発現する。
いくつかの態様において、改変細胞は、免疫細胞、例えばリンパ球（例えば、腫瘍浸潤性リンパ球(TIL)、T細胞またはNK細胞）または骨髄系細胞である。いくつかの態様において、改変細胞は、抗原提示細胞(APC)である。いくつかの態様において、改変細胞は、改変された哺乳動物T細胞または改変された哺乳動物抗原提示細胞(APC)である。いくつかの態様において、改変免疫細胞またはAPCは、ヒトまたはネズミの細胞である。
いくつかの態様において、改変されたT細胞は、Tヘルパー細胞、細胞傷害性T細胞（代替的に、細胞傷害性Tリンパ球またはCTL)、ナチュラルキラーT細胞、制御性T細胞、メモリーT細胞、またはγδT細胞を含むが、これらに限定されない。いくつかの態様において、改変されたT細胞は、CD4+またはCD8+である。MHCのシグナルに加えて、改変されたT細胞はまた、いくつかの態様において本明細書に考察した通りの免疫調節タンパク質によって提供される共刺激シグナルを必要とする。
いくつかの態様において、改変されたAPCには、例えば、MHC IIを発現するAPC、例えばマクロファージ、B細胞、および樹状細胞、ならびに、人工APC(aAPC)が含まれ、これらは細胞性aAPCと無細胞性aAPC（例えば、生分解性高分子微粒子）の両方を含む。人工APC(aAPC)は、これらが抗原をT細胞に提示しかつそれらを活性化するという点でAPCと類似の様式で作用することができる、APCの合成バージョンである。抗原提示は、MHC（クラスIまたはクラスII）によって実施される。いくつかの局面において、改変されたAPC（例えばaAPC）では、MHC上に負荷される抗原は、いくつかの態様において、腫瘍特異的抗原または腫瘍関連抗原である。MHC上に負荷される抗原は、T細胞のT細胞受容体(TCR)によって、いくつかの場合に本明細書において提供される免疫調節タンパク質の親和性改変IgSFドメインによって認識される1つまたは複数の同族結合パートナーまたは他の分子を発現することができるT細胞のT細胞受容体(TCR)によって、認識される。
いくつかの態様において、細胞性aAPCを、養子細胞療法において使用されるSIPまたはTIPおよびTCRアゴニストを含有するように改変することができる。いくつかの態様において、細胞性aAPCを、例えば患者への再導入のために、例えば投与の前に、ヒトT細胞のエクスビボ拡大において使用されるSIPまたはTIPおよびTCRアゴニストを含有するように改変することができる。いくつかの局面において、aAPCは、少なくとも1つの抗CD3抗体クローン、例えば、OKT3および/またはUCHT1などの発現を含み得る。いくつかの局面において、aAPCは、不活化されてよい（例えば、照射されてよい)。一部の態様において、SIPまたはTIPは、T細胞上の同族結合パートナーに対して結合親和性を示す、任意のバリアントまたは親和性改変IgSFドメインを含むことができる。
いくつかの態様において、本明細書において提供される免疫調節タンパク質、例えば膜貫通型免疫調節タンパク質または分泌性免疫調節タンパク質は、抗原結合受容体、例えば組換え受容体、例えばキメラ抗原受容体(CAR)またはT細胞受容体(TCR)を発現する細胞で共発現または改変される。いくつかの態様において、改変細胞、例えば改変されたT細胞は、がん、炎症性および自己免疫性障害、またはウイルス感染に関連する所望の抗原を認識する。具体的な態様において、抗原結合受容体は、腫瘍特異的抗原または腫瘍関連抗原に特異的に結合する抗原結合部分を含有する。いくつかの態様において、改変されたT細胞は、抗原、例えば腫瘍特異的抗原または腫瘍関連抗原に特異的に結合する抗原結合ドメイン（例えば、scFv)を含有するCAR(キメラ抗原受容体)T細胞である。別の態様において、改変されたT細胞は、組換えまたは改変されたTCRを含めたTCRを保有する。いくつかの態様において、TCRは、ネイティブTCRであることができる。当業者は、一般に、ネイティブ哺乳動物T細胞受容体が、抗原特異的認識および結合に関与するαおよびβ鎖(またはγおよびδ鎖)を含むことを認識するだろう。いくつかの態様において、TCRは、改変されている改変されたTCRである。いくつかの態様において、改変されたT細胞のTCRは、APCによって提示される腫瘍関連または腫瘍特異的抗原に特異的に結合する。したがって、いくつかの態様において、免疫調節タンパク質は、改変されたT細胞受容体細胞または/および改変されたキメラ抗原受容体細胞において発現および分泌される。そのような態様において、改変細胞は、免疫調節タンパク質およびCARまたはTCRを共発現する。いくつかの態様において、SIPタンパク質は、改変されたT細胞受容体細胞または改変されたキメラ抗原受容体細胞において発現される。そのような態様において、改変細胞は、SIPおよびCARまたはTCRを共発現する。
キメラ抗原受容体(CAR)は、抗原結合ドメイン(エクトドメイン)と、膜貫通ドメインと、抗原が結合した後にT細胞へ活性化シグナルを誘導または媒介することができる細胞内シグナル伝達領域(細胞内ドメイン)とを含む組換え受容体である。いくつかの例では、CAR発現細胞は、活性化ドメインおよびいくつかの場合に共刺激ドメインを含む細胞内シグナル伝達部に連結された特定の腫瘍抗原に対する特異性を有する細胞外単鎖可変断片(scFv)を発現するように改変される。共刺激ドメインは、例えば、CD28、OX-40、4-1BB/CD137、誘導性T細胞共刺激因子(ICOS)に由来することができる。活性化ドメインは、例えば、CD3、例えばCD3ζ、ε、δ、γなどに由来することができる。ある特定の態様において、CARは、2、3、4個、またはそれ以上の共刺激ドメインを有するように設計される。全ての正常B細胞およびB細胞悪性腫瘍(NHL、CLL、および非T細胞ALLを非限定的に含む)を含めたB細胞系列の細胞によって発現される膜貫通タンパク質である、疾患または状態に関連する細胞上に発現する抗原、例えば腫瘍抗原、例えばCD19などを標的化するように、CAR scFvを設計することができる。例となるCAR+T細胞療法および構築物は、米国特許公報第2013/0287748号、第2014/0227237号、第2014/0099309号、および第2014/0050708号に記載されており、これらの参考文献は、参照によってその全体が組み入れられる。
いくつかの局面において、抗原結合ドメインは、抗体またはその抗原結合断片、例えば単鎖断片(scFv)である。いくつかの態様において、抗原は、腫瘍またはがん細胞上に発現する。例示的な抗原は、CD19である。例示的なCARは、抗CD19 CAR、例えば、SEQ ID NO:1576またはSEQ ID NO:1577に示される抗CD19 scFvを含有するCARである。
いくつかの態様において、CARは、スペーサー、膜貫通ドメイン、および、ITAMシグナル伝達ドメイン、例えばCD3ζシグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインまたは領域をさらに含有する。
いくつかの態様において、CARは、共刺激シグナル伝達ドメインをさらに含む。いくつかの態様において、スペーサーおよび膜貫通ドメインは、CD8に由来するヒンジおよび膜貫通ドメイン、例えば、SEQ ID NO:1574、1578、2158に示される例示的な配列またはSEQ ID NO:1574、1578、2158に対して少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、またはそれ以上の配列同一性を示すアミノ酸配列を有するものである。いくつかの態様において、細胞内ドメインは、CD3-ζシグナル伝達ドメインを含む。いくつかの態様において、CD3-ζシグナル伝達ドメインは、SEQ ID NO:1575に示されるアミノ酸配列またはSEQ ID NO:1575に対して少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、もしくは99％、またはそれ以上の配列同一性を示すアミノ酸配列を含み、T細胞シグナル伝達の活性を保持する。いくつかの態様において、CARの細胞内ドメインは、T細胞の免疫調節応答をさらに調節するための共刺激シグナル伝達ドメインまたは領域をさらに含むことができる。いくつかの態様において、共刺激シグナル伝達ドメインは、CD28、ICOSL、41BB、またはOX40である。いくつかの態様において、共刺激シグナル伝達ドメインは、CD28または4-1BBに由来し、SEQ ID NO:1579〜1582のいずれかに示されるアミノ酸配列またはSEQ ID NO:1579〜1582に対して少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、もしくは99％、またはそれ以上の配列同一性を示すアミノ酸配列を含み、T細胞共刺激シグナル伝達の活性を保持する。
いくつかの態様において、CARをコードする構築物は、自己切断ペプチド配列によってCARから分離された第二のタンパク質（例えばマーカー、例えば検出可能タンパク質）をさらにコードする。いくつかの態様において、自己切断ペプチド配列は、F2A、T2A、E2A、またはP2A自己切断ペプチドである。T2A自己切断ペプチドの例示的な配列は、SEQ ID NO:2165、2169、2177のいずれか1つまたはSEQ ID NO:2165、2169、2177のいずれかに対して少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、もしくは99％、またはそれ以上の配列同一性を示すアミノ酸配列で示される。いくつかの態様において、T2Aは、SEQ ID NO:2176に示されるヌクレオチドの配列またはSEQ ID NO:2176のいずれかに対して少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、もしくは99％、またはそれ以上の配列同一性を示す配列によってコードされる。P2A自己切断ペプチドの例示的な配列は、SEQ ID NO:2178またはSEQ ID NO:2178に対して少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、もしくは99％、またはそれ以上の配列同一性を示すアミノ酸配列で示される。
いくつかの態様において、マーカーは、検出可能タンパク質、例えば蛍光タンパク質、例えば緑色蛍光タンパク質(GFP)または青色蛍光タンパク質(BFP)である。蛍光タンパク質マーカーの例示的な配列は、SEQ ID NO:2164、2170、2179、2180、または、SEQ ID NO:2164もしくは2170に対して少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、もしくは99％、またはそれ以上の配列同一性を示すアミノ酸配列で示される。
いくつかの態様において、CARは、SEQ ID NO:2166、2171、2172、2173、2159、2160、2162、もしくは2163のいずれかに示されるアミノ酸配列またはSEQ ID NO:2166、2171、2172、2173、2159、2160、2162もしくは2163のいずれか1つに対して少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、もしくは99％、またはそれ以上の配列同一性を示すアミノ酸配列を有する。いくつかの態様において、CARは、SEQ ID NO:2175もしくは2161に示されるヌクレオチドの配列またはSEQ ID NO:2175もしくは2161のいずれか1つに対して少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、もしくは99％、またはそれ以上の配列同一性を示すアミノ酸配列によってコードされる。
別の態様において、改変されたT細胞は、組換えまたは改変されたTCRを含めたTCRを保有する。いくつかの態様において、TCRは、ネイティブTCRであることができる。当業者は、一般に、ネイティブ哺乳動物T細胞受容体が、抗原特異的認識および結合に関与するαおよびβ鎖(またはγおよびδ鎖)を含むことを認識するだろう。いくつかの態様において、TCRは、改変されている改変されたTCRである。いくつかの態様において、改変されたT細胞のTCRは、APCによって提示される腫瘍関連または腫瘍特異的抗原に特異的に結合する。
いくつかの態様において、免疫調節タンパク質、例えば膜貫通免疫調節ポリペプチドまたは分泌性免疫調節ポリペプチドをコードする核酸が、改変細胞、例えば改変されたT細胞または改変されたAPCに、組換え宿主細胞に用いられるような様々な戦略によって組み込まれる。DNA構築物を初代T細胞に導入するための様々な方法が当技術分野において公知である。いくつかの態様において、ウイルス形質導入またはプラスミドエレクトロポレーションが用いられる。典型的な態様において、免疫調節タンパク質をコードする核酸分子、または発現ベクターは、発現された免疫調節タンパク質が細胞から分泌されるようにするシグナルペプチドを含む。いくつかの態様において、本発明の免疫調節タンパク質をコードする核酸は、宿主哺乳動物細胞における発現を可能にするウイルスベクター、例えばレトロウイルスベクターにサブクローニングされる。発現ベクターを哺乳動物宿主細胞に導入することができ、宿主細胞培養条件下、免疫調節タンパク質が発現および分泌される。
ある例示的な例では、初代T細胞を、エクスビボ精製して(CD4細胞またはCD8細胞または両方)、種々のTCR/CD28アゴニスト、例えば抗CD3/抗CD28コートビーズからなる活性化プロトコルで刺激することができる。活性化プロセスの2または3日後、本発明の免疫調節タンパク質をコードするDNAベクターを、当技術分野において標準のレンチウイルスもしくはレトロウイルス形質導入プロトコルまたはプラスミドエレクトロポレーション戦略を通じて、初代T細胞に安定的に導入することができる。免疫調節タンパク質の発現および分泌について、例えば、ネイティブ親分子および親和性改変バリアントと交差反応する抗エピトープタグまたは抗体を使用することによって、細胞をモニタリングすることができる。
免疫調節タンパク質の発現および分泌時に、改変されたT細胞を、様々な手段によって改善された機能についてアッセイすることができる。改変されたT細胞のこの部分が免疫調節構築物の発現および分泌によってあまり影響されなかったことを示すために、改変されたCARまたはTCR共発現を検証することができる。検証されたら、標準的なインビトロ細胞傷害性、増殖、またはサイトカインアッセイを使用して、改変細胞の機能を評価することができる。例示的な標準的なエンドポイントは、腫瘍株の溶解、改変されたT細胞の増殖、または培養上清中のIFN-γタンパク質発現のパーセントである。対照構築物に対して統計的に有意な腫瘍株の溶解の増加、改変されたT細胞の増殖の増加、またはIFN-γ発現の増加をもたらす改変された構築物を選択することができる。追加的に、改変されていない細胞、例えばネイティブ初代または内因性T細胞をまた同じインビトロアッセイに組み込んで、改変細胞、例えば改変されたT細胞によって発現および分泌される免疫調節タンパク質構築物の、バイスタンダーネイティブT細胞の活性を調節する（いくつかの場合に、エフェクター機能を活性化および生成することを含む)能力を測定することもできる。活性化マーカー、例えばCD69、CD44、またはCD62Lの増加された発現を内因性T細胞上でモニタリングすることもでき、増加された増殖および/またはサイトカイン産生は、改変されたT細胞によって発現および分泌される免疫調節タンパク質の所望の活性を示すこともできる。
いくつかの態様において、類似のアッセイを使用して、CARまたはTCR単独を含有する改変されたT細胞の機能を、CARまたはTCRを含有し免疫調節タンパク質を発現および分泌するものと比較することができる。典型的には、これらのインビトロアッセイは、種々の比率の改変されたT細胞と同族CARまたはTCR抗原を含有する「腫瘍」細胞株とを一緒に培養下でプレーティングすることによって実施される。標準エンドポイントは、腫瘍株の溶解、改変されたT細胞の増殖、または培養上清中のIFN-γ産生のパーセントである。同じTCRまたはCAR構築物単独に対して統計的に有意な腫瘍株の溶解の増加、改変されたT細胞の増殖の増加、またはIFN-γ産生の増加をもたらした改変細胞を選択することができる。改変されたヒトT細胞を、マウスのT、NKおよびB細胞を欠いているNSG系統のような免疫不全マウスで分析することができる。CARまたはTCRが異種移植片上の標的同族結合パートナーに結合しかつ親和性改変IgSFドメインを含有する免疫調節タンパク質と共発現される(また分泌される）改変されたヒトT細胞を、異種移植片と比較して異なる細胞数および比率にてインビボで養子移入することができる。例えば、ルシフェラーゼ/GFPベクターを含有するCD19+白血病腫瘍株の生着を、生物発光を通じてまたはエクスビボでフローサイトメトリーによってモニタリングすることができる。ある共通の態様において、異種移植片がネズミモデルに導入され、数日後に改変されたT細胞が導入される。免疫調節タンパク質を発現および分泌する改変されたT細胞を、CARまたはTCR単独を含有する改変されたT細胞と比べて増加された生存、腫瘍クリアランス、または改変されたT細胞数の拡大についてアッセイすることができる。インビトロアッセイと同様に、内因性のネイティブ（すなわち、改変されていない)ヒトT細胞を共養子移入して、その集団において、より良好な生存または腫瘍クリアランスをもたらすエピトープ拡散の成功を予測することもできる。
A. 例示的な機能的活性および特徴
いくつかの局面において、改変細胞、例えば改変されたリンパ球（例えば、腫瘍浸潤性リンパ球、T細胞またはNK細胞）または骨髄系細胞（例えば、抗原提示細胞）は、1つまたは複数の望ましい特徴または活性を示す。
いくつかの態様において、免疫調節タンパク質の親和性改変IgSFドメインは、細胞上にまたは細胞から発現されると、哺乳動物細胞上に発現する少なくとも1つの同族結合パートナーに特異的に結合する。いくつかの態様において、哺乳動物細胞は、自家または同種異系のマウス、ラット、カニクイザル、またはヒトの細胞である。いくつかの局面において、哺乳動物細胞は、抗原提示細胞(APC)、腫瘍細胞、またはT細胞のような態様を含むことができる。いくつかの態様において、腫瘍細胞は、マウス、ラット、カニクイザル、またはヒトの腫瘍細胞である。
免疫調節タンパク質は、1つまたは複数（例えば、2、3、もしくは4個）の親和性改変IgSFドメインを含むことができる。したがって、いくつかの態様において、免疫調節タンパク質は、哺乳動物細胞上のわずか1つの同族結合パートナーに結合する。いくつかの態様において、免疫調節タンパク質の親和性改変IgSFドメインは、哺乳動物細胞上のわずか1つの同族結合パートナーに特異的に結合する。あるいは、いくつかの態様において、免疫調節タンパク質は、哺乳動物細胞上に発現する少なくとも2、3、もしくは4個、または正確に2、3、もしくは4個の同族結合パートナーに特異的に結合する。いくつかの態様において、免疫調節タンパク質は、わずか1つの細胞表面同族結合パートナーに特異的に結合する。哺乳動物細胞上の同族結合パートナーへの、1つまたは複数の親和性改変IgSFドメインを含有する免疫調節タンパク質の特異的結合は、哺乳動物細胞の免疫学的活性を調節する。親和性改変IgSFドメインと哺乳動物細胞同族結合パートナーとの間のそれらによる特異的結合は、シス配置の特異的結合（すなわち、同じ細胞上での特異的結合）またはトランス配置の特異的結合（すなわち、異なる細胞上での特異的結合）であることも、シスおよびトランスの両配置の特異的結合であることもできる。例えば、細胞生存、細胞増殖、サイトカイン産生、またはT細胞の細胞傷害性の増強によって証明されたときに、細胞の免疫学的活性は増強されているということができる。別の態様において、細胞生存、細胞増殖、サイトカイン産生、またはT細胞の細胞傷害性の低減によって証明されたときに、細胞の免疫学的活性は低減されている。
いくつかの態様において、免疫調節タンパク質内に存在する少なくとも1つの親和性改変IgSFドメインは、免疫学的活性の調節が望まれる哺乳動物細胞上に発現する少なくとも1つの細胞表面同族結合パートナーに特異的に結合する。いくつかの態様において、親和性改変IgSFドメインが特異的に結合する同族結合パートナーは、親和性が改変されている野生型IgSFファミリーメンバーまたは野生型IgSFドメインのネイティブ同族結合パートナーである。いくつかの態様において、特異的結合は、親和性改変IgSFドメインが改善された結合を示す同族結合パートナーを発現する哺乳動物細胞の活性を増強および/または低減する。したがって、特異的な結合親和性を向上させることによって、提供される免疫調節タンパク質は、哺乳動物細胞の免疫学的活性を増強または低減することができる。いくつかの態様において、特異的結合は、免疫調節タンパク質と共に改変細胞の免疫学的活性を調節（例えば増強）する。
いくつかの態様において、哺乳動物細胞上に発現する同族結合パートナーは、哺乳動物IgSFメンバーである。哺乳動物細胞は、いくつかの態様において、抗原提示細胞(APC)、リンパ球、または腫瘍細胞である。いくつかの態様において、リンパ球は、腫瘍浸潤性リンパ球(TIL)、改変されたもしくはネイティブT細胞、または改変されたもしくはネイティブNK細胞である。いくつかの態様において、親和性改変IgSFドメインの同族結合パートナーは、ネイティブヒトIgSFメンバーである。いくつかの態様において、同族結合パートナーは、表1に示されている「細胞表面同族結合パートナー」である。
いくつかの態様において、親和性改変IgSFを含む免疫調節タンパク質は、免疫細胞（例えば、T細胞などのリンパ球)によって発現および分泌されると、第二の免疫細胞（例えば、T細胞などのリンパ球）上に発現する少なくとも1つの同族結合パートナーに特異的に結合することができる。第二の免疫細胞（例えば、第二のT細胞）上の同族結合パートナーは、抑制性同族結合パートナーまたは刺激性同族結合パートナーであることができる。例示的な同族結合パートナーには、細胞表面受容体またはリガンドが含まれる。抑制性受容体/リガンドの例には、PD-1/PD-L1、PD-L2、CTLA-4/B7-1/B7-2、BTLA/HVEM、LAG3/MHCクラスII、TIGIT/PVR、TIM-3/CEACAM-1/GAL9、およびVSIG8/VISTAが含まれる。刺激性受容体/リガンドの例には、CD28/B7-1/B7-2、ICOS/ICOSL、およびCD226/PVRが含まれる。
特定の態様において、免疫調節タンパク質は、T細胞によって発現および分泌され、T細胞上に発現する同族結合パートナーに特異的に結合する、親和性改変IgSFドメインを含む。いくつかの態様において、第一および第二のT細胞は別個のT細胞であり、この態様において、免疫調節タンパク質および同族結合パートナーは、互いにトランスである。いくつかの態様において、免疫調節タンパク質および同族結合パートナーは、同じT細胞上に発現し（ここで、免疫調節タンパク質が分泌される）、互いにシスである。いくつかの態様において、T細胞のうちの少なくとも1つは、ネイティブT細胞または改変されたT細胞である。いくつかの態様において、改変されたT細胞は、キメラ抗原受容体(CAR)T細胞またはT細胞受容体(TCR)改変T細胞である。
いくつかの態様において、免疫調節タンパク質は、受容体シグナル伝達の増強を刺激するために、細胞表面受容体に対する親和性が向上した親和性改変IgSFドメインを含む。受容体シグナル伝達の増強を刺激することは、いくつかの態様において、例えば、受容体がそのような効果を媒介するように働く刺激性受容体である場合、その細胞の免疫学的活性を増強することができる。いくつかの場合に、受容体シグナル伝達が刺激された細胞の炎症活性は増強される。いくつかの態様において、免疫調節タンパク質は、刺激性受容体の活性を増強する。そのような例では、免疫調節タンパク質のIgSFドメインを、哺乳動物細胞上のネイティブ同族結合パートナー（いくつかの場合に、刺激性受容体である)に対する特異的結合親和性を向上させるように親和性を改変することができる。いくつかの態様において、刺激性受容体は、T細胞上に発現する。ある特定の態様において、免疫調節タンパク質の親和性改変IgSFドメイン、例えば改変細胞（例えば、第一のT細胞）によって発現および分泌されるものは、T細胞（例えば、第二のT細胞）上に発現する刺激性同族結合パートナーに、（対照としての親和性が改変されていないIgSFドメインと比較して）向上した親和性で特異的に結合する。ある特定の態様において、免疫調節タンパク質の親和性改変IgSFドメインは、T細胞（例えば、第二のT細胞）上に発現する刺激性同族結合パートナーに特異的に結合し、T細胞の免疫調節活性を増強する。いくつかの態様において、免疫調節タンパク質の親和性改変IgSFドメインは、向上した親和性でT細胞（例えば、第二のT細胞）上の刺激性同族結合パートナーに結合し、T細胞の免疫調節活性を増強する。
いくつかの態様において、刺激性受容体は、CD28、ICOS、またはCD226であり、免疫調節タンパク質は、野生型IgSFドメインを含有するタンパク質と比較して、CD28、ICOS、またはCD226のうちの1つに対する向上した結合親和性を示す親和性改変IgSFドメインを含有する。いくつかの態様において、親和性改変IgSFドメインは、CD80(B7-1)の親和性改変ドメインである。いくつかの態様において、本発明の免疫調節タンパク質の親和性改変CD80(B7-1)IgSFドメインは、第一のT細胞上に発現し、第二のT細胞上の刺激性同族結合パートナーCD28に向上した親和性で結合するように親和性が改変されている。いくつかの態様において、親和性改変IgSFドメインは、ICOSLの親和性改変ドメインである。具体的な態様において、親和性改変IgSFドメインは、親和性改変ICOSL(誘導性共刺激因子リガンド）ドメインであり、刺激性同族結合パートナーは、ICOS(誘導性共刺激因子)またはCD28のうちの少なくとも1つである。いくつかの態様において、ICOSLドメインは、ICOSとCD28の両方に特異的に結合するように親和性が改変されている。いくつかの態様において、ICOSLは、ICOSとCD28の両方ではなくいずれかに特異的に結合するように親和性が改変されている。いくつかの態様において、ICOSまたはCD28のうちの一方に対する結合親和性は向上しているが、他方に対する結合親和性は低下している。いくつかの態様において、親和性改変IgSFドメインは親和性改変CD155であり、活性化同族リガンドはCD226である。一部の態様において、親和性改変IgSFドメインは親和性改変CD112であり、活性化同族リガンドはCD226である。
本発明のいくつかの方法において、免疫調節タンパク質は、抑制性受容体の活性を低減する。いくつかの場合に、同族細胞表面分子に対する免疫調節タンパク質の向上した結合親和性は、哺乳動物細胞上のネイティブ同族結合パートナー間の特異的結合の阻害をもたらす。そのネイティブ同族結合パートナーに対するより大きな親和性(ネイティブIgSFメンバーの競合する親和性と比べて)は、その同族結合パートナーに対するネイティブ分子の特異的結合親和性を低下させる。当業者は、抑制性受容体シグナル伝達に拮抗することは、いくつかの態様において、例えば、受容体がそのような細胞の効果を引き起こす役割を果たす抑制性受容体である場合、その細胞の免疫学的活性を低減することができることを認識するだろう。いくつかの態様において、CD155/TIGIT、CD112/TIGIT、CD80/CTLA-4、ICOSL/CTLA-4、PD-L1/PD-1またはPD-:2/PD-1の中からの抑制性受容体とそのリガンドとの間の1つまたは複数の活性が免疫調節タンパク質によって遮断される。
したがって、いくつかの態様において、免疫調節タンパク質を使用して、免疫調節タンパク質が発現および分泌される細胞(シス細胞）の阻害を低減しながら、免疫調節タンパク質が発現も分泌もされない細胞（すなわち、トランス細胞）を刺激することができる。例えば、いくつかの態様において、免疫調節タンパク質は、少なくとも2つの細胞表面同族結合パートナーに対する向上した結合親和性をもたらす、少なくとも1つの親和性改変IgSFドメインおよびいくつかの場合に少なくとも2つの親和性改変ドメインを含む。いくつかの態様において、第一の同族結合パートナーは、刺激性受容体であり、第二の細胞表面同族結合パートナーは、抑制性受容体の抑制性リガンドである。いくつかの態様において、抑制性リガンドに対する親和性改変ドメインの結合は、抑制性受容体への抑制性リガンドの結合を競合的に阻害する。いくつかの態様において、刺激性受容体および抑制性受容体は、独立して、免疫細胞、例えばT細胞または抗原提示細胞上に発現することができる。いくつかの態様において、刺激性受容体は、リンパ球上、例えばT細胞上に発現する。いくつかの態様において、刺激性受容体は、CD28、ICOS、もしくはCD226であり、かつ/または、刺激性受容体のリガンドは、ICOSLである。いくつかの態様において、抑制性受容体は、改変細胞上、例えば改変T細胞上に発現する。いくつかの態様において、抑制性受容体は、PD-1、CTLA-4、LAG-3、TIGIT、CD96、CD112R、BTLA、CD160、TIM-3、VSIG3、もしくはVSIG8であり、かつ/または、抑制性受容体のリガンドは、PD-L1、PD-L2、B7-1、B7-2、CD112、CD155、HVEM、MHCクラスII、PVR、CEACAM-1、GAL9、またはVISTAである（例えば、表1を参照のこと)。いくつかの態様において、抑制性同族結合パートナーは、PD-L1またはPD-L2である。
いくつかの態様において、免疫調節タンパク質を使用して、免疫調節タンパク質を発現および分泌する細胞、例えば免疫調節タンパク質を発現および分泌するT細胞の阻害を低減することができる。例えば、T細胞（例えば、第一のT細胞）によって発現および分泌される免疫調節タンパク質は、第二のT細胞上の同族結合パートナー間の特異的結合を阻害する親和性改変IgSFドメインを含むことができる。いくつかの態様において、抑制性受容体のリガンドは、親和性改変され、改変細胞から分泌されたときに、その抑制性受容体に拮抗するかまたはそれを阻害する。いくつかの態様において、抑制性受容体の親和性改変リガンドは、PD-L1、PD-L2、B7-1、B7-2、HVEM、MHCクラスII、PVR（例えば、CD112またはCD155)、CEACAM-1、GAL9、またはVISTAである（例えば、表1を参照のこと)。いくつかの態様において、抑制性受容体のリガンドである親和性改変ドメインは、別の受容体（例えば刺激性受容体）に対する向上した結合性を保持または示す。例えば、親和性改変ドメインは、CD226に対する低下した結合性を示すように親和性が改変されているが、TIGITおよびいくつかの場合にCD112Rに対する向上した結合性を保持または示す、CD155またはCD112であることができる。そのような態様において、親和性改変CD155またはCD112は、細胞から発現および分泌されたとき、TIGITに拮抗することができる。
いくつかの場合に、この態様を、独立に使用しても、本発明の親和性改変IgSFドメインが、第一のT細胞によって発現および分泌され、第二のT細胞上に発現する少なくとも1つの刺激性同族結合パートナーに特異的に結合しかつ第二のT細胞における免疫学的活性を増強する態様と併せて使用することもできる。この機序によって、第二の細胞上の刺激性同族結合パートナーへの第一のT細胞上に発現する免疫調節タンパク質の特異的結合によって、増強された免疫調節応答が第二のT細胞において生成され；第二のT細胞が、第二のT細胞上の同族結合パートナーと、第一のT細胞上に発現する抑制性同族結合パートナーとの間のそれらによる特異的結合を阻害する第一のT細胞上に発現する親和性改変IgSFドメインの特異的結合によって、第一のT細胞の免疫調節活性を低減させないようにする。本態様および前述の態様において使用されるT細胞は、一般に、ネズミまたはヒトT細胞であるが、他の哺乳動物のT細胞を用いることができる。しばしば、細胞傷害性T細胞(CTL)が使用される。
先に述べた通り、いくつかの態様において、本発明の免疫調節タンパク質は、第一のT細胞上に発現し、第二のT細胞上のネイティブ同族結合パートナー（例えば、抑制性リガンド）と第一のT細胞上のその抑制性ネイティブ同族結合パートナー（例えば、抑制性受容体)との間の特異的結合を阻害しながらも、第二のT細胞上の刺激性同族結合パートナー（例えば、刺激性受容体）に特異的に結合する、親和性改変IgSFドメインを含む。第二のT細胞上の同族結合パートナーと第一のT細胞上の同族結合パートナーとの間の特異的結合の阻害は、親和性改変IgSFドメインと2つのネイティブ同族結合パートナーのうちの少なくとも1つとの、それらの相互の結合が妨害されるような競合結合によって、達成することができる。典型的には、IgSFドメインは、その同族結合パートナーに対して、ネイティブ同族結合パートナー同士が有するよりも高い結合親和性を有するように、親和性が改変される。この設計のいくつかの態様において、免疫調節タンパク質は、抑制性同族結合パートナーと刺激性同族結合パートナーの両方に結合する親和性改変IgSFドメインを含むことができる。したがって、この態様において、親和性改変IgSFは、二重結合能を有する。いくつかの態様において、免疫調節タンパク質は、第一のT細胞上の同族結合パートナーに結合する第一の親和性改変IgSFドメインと、第一および第二のT細胞上の同族結合パートナー間のそれらによる特異的結合を阻害する第二の親和性改変IgSFドメインとを含む。
なお別の態様において、第一のT細胞上の刺激性同族結合パートナーに結合する親和性改変IgSFドメインは、第一の免疫調節タンパク質上にあり、第一および第二のT細胞上の同族結合パートナー間のそれらによる特異的結合を阻害する親和性改変IgSFドメインは、第二の免疫調節タンパク質上にある。この態様において、第一および第二の免疫調節タンパク質は、異なるポリペプチド鎖である。いくつかの態様において、第一の親和性改変IgSFドメインおよび第二の親和性改変IgSFドメインは、同一の親和性改変IgSFドメインである。例えば、具体的な態様において、ICOSL(誘導性共刺激因子リガンド）IgSFドメイン（例えば、親和性改変IgVドメイン)は、向上した親和性でICOSとCD28の両方に特異的に結合するように親和性が改変されている。いくつかの態様において、親和性改変IgSFドメインは、ICOSとCD28の両方に対する親和性が向上した、またはICOSおよびCD28の一方もしくは両方に対する親和性が低下した、親和性改変ICOSL IgSFドメイン（例えば、親和性改変IgVドメイン)である。
いくつかの態様において、免疫調節タンパク質は、ネイティブ同族結合パートナー間のそれらによる特異的結合の阻害をもたらす。いくつかの態様において、当該阻害は、ネイティブ同族結合パートナーの一方または両方に対する親和性がより大きな親和性改変IgSFドメインによって達成され、それによって、これらの同族結合パートナー間のそれらによる特異的結合を競合的に阻害することができる。
いくつかの態様において、免疫調節タンパク質は、CD226に対する親和性が向上しかつTIGIT(IgおよびITIMドメインを有するT細胞免疫受容体）に対する親和性が低下した親和性改変CD155 IgSFドメインである親和性改変IgSFドメインを含む。
いくつかの態様において、（例えば、第一のT細胞上に発現する）免疫調節タンパク質は、向上した親和性で（例えば、第二のT細胞上の）刺激性同族結合パートナーCD28に結合するように親和性が改変されている親和性改変CD80(B7-1)IgSFドメインを含む。追加的に、この態様において、親和性改変CD80(B7-1)IgSFドメインは、向上した親和性で（例えば、第二のT細胞上に発現する）PD-L1に結合することができ、（例えば、第一のT細胞上に発現する）その同族結合パートナーPD-1への特異的結合を阻害することができる。前述の態様のいずれかのなおさらなる追加において、親和性改変CD80(B7-1)IgSFドメインを、それがCTLA-4に実質的に特異的に結合しないかまたは低下した親和性で結合することで刺激性同族結合パートナーCD28へのその特異的結合がCTLA-4によってそれほど阻害されることがないように、親和性改変することができる。
いくつかの態様において、免疫調節タンパク質は、ネイティブ同族結合パートナー間のそれらによる特異的結合を阻害するデコイ同族結合パートナーとして使用され、そのうちの少なくとも1つは、IgSFファミリーメンバーを含む。いくつかの場合に、ネイティブ同族結合パートナーの1つとの親和性改変IgSFドメインを含む免疫調節タンパク質の特異的結合は、ネイティブ同族結合パートナー（例えば、ネイティブ受容体およびリガンド対）間のそれらによる相互の特異的結合を阻害する。したがって、いくつかの態様において、免疫調節タンパク質は、競合的または非競合的な結合によって特異的結合を減弱させることができる。いくつかの態様において、ネイティブ同族結合パートナーは、刺激性受容体または抑制性受容体であることができる細胞表面受容体である。同族結合パートナーの親和性改変IgSFドメインの特異的結合がT細胞の免疫学的活性を増強または低減する態様は、本発明の範囲内に含まれる。
いくつかの態様において、ネイティブ同族結合パートナーは、そのネイティブ同族結合パートナーが特異的に結合したときに免疫学的活性を低減するように作用する、抑制性同族結合パートナーである。例えば、抗原提示細胞(APC)または哺乳動物腫瘍細胞上に発現するネイティブ細胞表面同族結合パートナーは、NK細胞またはリンパ球、例えばT細胞上のネイティブ抑制性同族結合パートナーに特異的に結合することができる。抑制性同族結合パートナーへの特異的結合は、抑制性同族結合パートナーが発現されるNK細胞またはリンパ球の免疫調節活性を低減するように作用する。
いくつかの態様において、抑制性同族結合パートナーは、抑制性受容体である。いくつかの態様において、抑制性同族結合パートナーは、抑制性同族結合パートナーを含有するITIM(免疫受容体チロシン抑制モチーフ)である。ITIMモチーフは、免疫系の多くの抑制性受容体の細胞内ドメインに見いだされる(Cell Signal, 16 (4): 435-456, 2004)。いくつかの態様において、親和性改変IgSFドメインは、免疫調節タンパク質の親和性改変IgSFドメインのそのネイティブ同族結合パートナーに対する親和性が野生型抑制性受容体のネイティブ同族結合パートナーに対する親和性よりも大きい、野生型抑制性受容体IgSFドメインの親和性改変形態である。したがって、これらの態様において、免疫調節タンパク質は、そのネイティブIgSFドメイン同族結合パートナーへの免疫調節タンパク質の親和性改変IgSFドメインの特異的結合、例えばITIMを含有する抑制性受容体への免疫調節タンパク質の親和性改変IgSFドメインの特異的結合によって、ITIMモチーフ受容体の抑制性応答を減弱させることができる。一例として、ITIMを含有する同族結合パートナーは、PD-1である。典型的には、PD-1は、抑制性リガンドPD-1に特異的に結合する抑制性受容体である。PD-L1のPD-1への特異的結合時に、PD-1は、ITIMドメインからのシグナル伝達を介してT細胞活性化を抑制するのに関与する。
いくつかの態様において、抑制性受容体同族結合パートナーは、PD-1、CTLA-4、LAG3、TIGIT、TIM-3、BTLA、VSIG3、またはVSIG8である。いくつかの態様において、免疫調節タンパク質は、抑制性受容体のネイティブ抑制性リガンドに野生型抑制性受容体よりも大きな親和性で結合するPD-1、CTLA-4、LAG3、TIGIT、TIM-3、またはBTLAの親和性改変IgSFドメインである親和性改変IgSFドメインを含有する（例示的な抑制性受容体のリガンド結合パートナーについて表1を参照のこと)。いくつかの態様において、免疫調節タンパク質は、PD-L1に野生型PD-1よりも大きな親和性で結合する親和性改変PD-1 IgSFドメインを含むことができる。特異的結合を、競合的または非競合的な結合によって達成することができ、これは本発明の具体的な態様である。親和性改変IgSFドメインと同族結合パートナー（すなわち、抑制性受容体、例えばPD-1)との間のそれらによる競合的な結合は、そのネイティブリガンド同族結合パートナー（例えば、PD-L1)へのその結合を阻害する。いくつかの態様において、この態様の免疫調節タンパク質は、野生型抑制性受容体のシグナル伝達機序を実質的に欠いており、それ故、それ自体が抑制性応答を誘導することはない。
VII. 感染性物質
また、本明細書に記載の分泌性または膜貫通型免疫調節タンパク質を含めた親和性改変IgSFドメインを含有する免疫調節タンパク質のいずれかをコードする核酸を含有する感染性物質が提供される。いくつかの態様において、そのような感染性物質は、本明細書に記載の免疫調節ポリペプチドをコードする核酸を、対象の標的細胞、例えば、対象における免疫細胞および/または抗原提示細胞(APC)または腫瘍細胞に送達することができる。また、そのような感染性物質に含有される核酸、および/または、そのような感染性物質の生成もしくは改変のための核酸、例えばベクターおよび/またはプラスミド、ならびにそのような感染性物質を含有する組成物が提供される。
いくつかの態様において、感染性物質は、微生物または病原菌である。いくつかの態様において、感染性物質は、ウイルスまたは細菌である。いくつかの態様において、感染性物質は、ウイルスである。いくつかの態様において、感染性物質は、細菌である。いくつかの態様において、そのような感染性物質は、本明細書に記載の分泌性または膜貫通型免疫調節タンパク質を含めた免疫調節タンパク質のいずれかをコードする核酸配列を送達することができる。したがって、いくつかの態様において、感染性物質に感染されたまたは接触された対象の細胞は、免疫調節ポリペプチドを細胞表面上に発現するかまたは分泌するようになることができる。いくつかの態様において、感染性物質は、1つまたは複数の他の治療薬または他の治療薬をコードする核酸を対象内の細胞および/または環境に送達することもできる。いくつかの態様において、感染性物質によって送達されることができる他の治療薬は、サイトカインまたは他の免疫調節分子を含む。
いくつかの態様において、感染性物質、例えばウイルスまたは細菌は、本明細書に記載の分泌性または膜貫通型免疫調節タンパク質を含めた免疫調節タンパク質のいずれかをコードする核酸配列を含有し、対象の細胞の接触および/または感染によって、細胞は、感染性物質に含有される核酸配列によってコードされる分泌性または膜貫通型免疫調節タンパク質を含めた免疫調節タンパク質を発現する。いくつかの態様において、感染性物質を対象に投与することができる。いくつかの態様において、感染性物質を対象由来の細胞とエクスビボで接触させることができる。
いくつかの態様において、免疫調節タンパク質は、感染性物質に感染した細胞によって発現されて、その表面に発現する、膜貫通型免疫調節タンパク質である。いくつかの態様において、免疫調節タンパク質は、感染性物質に感染した細胞によって発現されて当該細胞から発現および分泌される、分泌性免疫調節タンパク質である。膜貫通型免疫調節タンパク質または分泌性免疫調節タンパク質は、本明細書に記載のいずれかであることができる。
いくつかの態様において、感染性物質によって標的化される対象の細胞には、腫瘍細胞、免疫細胞、および/または抗原提示細胞(APC)が含まれる。いくつかの態様において、感染性物質は、腫瘍微小環境(TME)にある細胞を標的とする。いくつかの態様において、感染性物質は、免疫調節タンパク質（分泌性または膜貫通型免疫調節タンパク質を含む）をコードする核酸を適切な細胞（例えば、APC、例えばペプチド/MHC複合体をその細胞表面上に表示する細胞、例えば樹状細胞）または組織（例えば、リンパ系組織）に送達し、それにより、所望の効果（例えば、免疫調節および/または特異的な細胞媒介性免疫応答、例えばCD4および/またはCD8 T細胞応答）が誘導および/または増強され、CD8 T細胞応答には、細胞傷害性T細胞(CTL)応答が含まれ得る。いくつかの態様において、感染性物質は、APC、例えば樹状細胞(DC)を標的とする。いくつかの態様において、本明細書に記載の感染性物質によって送達される核酸分子は、バリアント免疫調節ポリペプチドをコードする機能的に連結されたコード配列の特定の標的細胞における発現に必要な適切な核酸配列（例えば、調節エレメント、例えばプロモーター）を含む。
いくつかの態様において、免疫調節ポリペプチドをコードする核酸配列を含有する感染性物質はまた、1つまたは複数の追加の遺伝子産物、例えば、サイトカイン、プロドラッグ変換酵素、細胞毒素、および/または検出可能な遺伝子産物をコードする核酸配列を含有することもできる。例えば、いくつかの態様において、感染性物質は、腫瘍溶解性ウイルスであり、ウイルスは、追加の治療用遺伝子産物をコードする核酸配列を含むことができる（例えば, Kirn et al., (2009) Nat Rev Cancer 9:64-71；Garcia-Aragoncillo et al., (2010) Curr Opin Mol Ther 12:403-411を参照のこと；米国特許第7,588,767号、第7,588,771号、第7,662,398号および第7,754,221号ならびに米国特許公報第2007/0202572号、第2007/0212727号、第2010/0062016号、第2009/0098529号、第2009/0053244号、第2009/0155287号、第2009/0117034号、第2010/0233078号、第2009/0162288号、第2010/0196325号、第2009/0136917号および第2011/0064650号を参照のこと）。いくつかの態様において、追加の遺伝子産物は、標的細胞（例えば、腫瘍細胞）の死をもたらすことができる治療用遺伝子産物であることも、免疫応答を増強または強化または調節することができる遺伝子産物（例えば、サイトカイン)であることもできる。また、例示的な遺伝子産物の中には、抗がん剤、抗転移剤、抗血管新生剤、免疫調節分子、免疫チェックポイント阻害剤、抗体、サイトカイン、成長因子、抗原、細胞傷害性遺伝子産物、アポトーシス促進性遺伝子産物、抗アポトーシス性遺伝子産物、細胞マトリックス分解性遺伝子、組織再生のための遺伝子およびヒト体細胞の多能性へのリプログラミングのための遺伝子、ならびに本明細書に記載のまたは当業者に公知の他の遺伝子が含まれる。いくつかの態様において、追加の遺伝子産物は、顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)である。
A. ウイルス
いくつかの態様において、感染性物質は、ウイルスである。いくつかの態様において、感染性物質は、腫瘍溶解性ウイルス、または、特定の細胞、例えば免疫細胞を標的とするウイルスである。いくつかの態様において、感染性物質は、対象における腫瘍細胞および/またはがん細胞を標的とする。いくつかの態様において、感染性物質は、免疫細胞または抗原提示細胞(APC)を標的とする。
いくつかの態様において、感染性物質は、腫瘍溶解性ウイルスである。腫瘍溶解性ウイルスは、腫瘍細胞に蓄積しかつ腫瘍細胞において複製するウイルスである。本明細書に記載の免疫調節ポリペプチドをコードする核酸の細胞における複製、および任意の送達によって、腫瘍細胞は溶解され、腫瘍は縮小し、排除されることができる。腫瘍溶解性ウイルスはまた、広範な宿主および細胞タイプを有することができる。例えば、腫瘍溶解性ウイルスは、腫瘍および/または転移を含めまた創傷組織および細胞も含め、免疫特権を有する細胞または免疫特権を有する組織に蓄積することができ、したがって、本明細書に記載の免疫調節ポリペプチドをコードする核酸の広範な細胞タイプにおける送達および発現が可能となる。腫瘍溶解性ウイルスはまた、腫瘍細胞特異的に複製し、その結果、腫瘍細胞溶解および効率的な腫瘍退縮をもたらすことができる。
例示的な腫瘍溶解性ウイルスには、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、単純ヘルペスウイルス、水疱性口腔ウイルス、レオウイルス、ニューカッスル病ウイルス、パルボウイルス、麻疹ウイルス、水疱性口内炎ウイルス(VSV)、コクサッキーウイルス、およびワクシニアウイルスが含まれる。いくつかの態様において、腫瘍溶解性ウイルスは、他の器官に感染することなく固形腫瘍に特異的に定着することができ、これを感染性物質として使用して、本明細書に記載の免疫調節ポリペプチドをコードする核酸をそのような固形腫瘍に送達することができる。
本明細書に記載のバリアントICOSLポリペプチドまたは免疫調節ポリペプチドをコードする核酸を送達するのに使用するための腫瘍溶解性ウイルスは、当業者に公知のもののいずれかであることができ、例えば、水疱性口内炎ウイルス(vesicular stomatitis virus)（例えば、米国特許第7,731,974号、第7,153,510号、第6,653,103号および米国特許公報第2010/0178684号、第2010/0172877号、第2010/0113567号、第2007/0098743号、第20050260601号、第20050220818号ならびに欧州特許第1385466号、第1606411号および第1520175号を参照のこと)；単純ヘルペスウイルス（例えば、米国特許第7,897,146号、第7,731,952号、第7,550,296号、第7,537,924号、第6,723,316号、第6,428,968号および米国特許公報第2014/0154216号、第2011/0177032号、第2011/0158948号、第2010/0092515号、第2009/0274728号、第2009/0285860号、第2009/0215147号、第2009/0010889号、第2007/0110720号、第2006/0039894号、第2004/0009604号、第2004/0063094号、国際特許公報第WO 2007/052029号、第WO 1999/038955号を参照のこと)；レトロウイルス（例えば、米国特許第6,689,871号、第6,635,472号、第5,851,529号、第5,716,826号、第5,716,613号および米国特許公報第20110212530号を参照のこと)；ワクシニアウイルス（例えば、2016/0339066を参照のこと)、およびアデノ随伴ウイルス（例えば、米国特許第8,007,780号、第7,968,340号、第7,943,374号、第7,906,111号、第7,927,585号、第7,811,814号、第7,662,627号、第7,241,447号、第7,238,526号、第7,172,893号、第7,033,826号、第7,001,765号、第6,897,045号、および第6,632,670号を参照のこと)を含む。
腫瘍溶解性ウイルスはまた、それらの病原性を減弱され、それらの安全性プロファイルを改善し、それらの腫瘍特異性を増強するよう遺伝子変更されているウイルスを含み、これらはまた、ウイルスの有効性全体を改善する追加の遺伝子、例えば細胞毒素、サイトカイン、プロドラッグ変換酵素を備えている（例えば、Kirn et al., (2009) Nat Rev Cancer 9:64-71；Garcia-Aragoncillo et al., (2010) Curr Opin Mol Ther 12:403-411を参照のこと；米国特許第7,588,767号、第7,588,771号、第7,662,398号および第7,754,221号ならびに米国特許公報第2007/0202572号、第2007/0212727号、第2010/0062016号、第2009/0098529号、第2009/0053244号、第2009/0155287号、第2009/0117034号、第2010/0233078号、第2009/0162288号、第2010/0196325号、第2009/0136917号および第2011/0064650号を参照のこと)。いくつかの態様において、腫瘍溶解性ウイルスは、これらががん性細胞において選択的に複製し、したがって腫瘍溶解性であるように、改変されているものであることができる。例えば、腫瘍溶解性ウイルスは、腫瘍治療のためのまた遺伝子治療ベクターとしての改変された指向性を有するように改変されているアデノウイルスである。その例示は、ONYX-015、H101およびAd5ΔCR(Hallden and Portella (2012) Expert Opin Ther Targets, 16:945-58)ならびにTNFerade(McLoughlin et al. (2005) Ann. Surg. Oncol., 12:825-30)、または制限増殖型アデノウイルスOncorine(登録商標)である。
いくつかの態様において、感染性物質は、改変された単純ヘルペスウイルスである。いくつかの態様において、感染性物質は、本明細書に記載の免疫調節ポリペプチドのいずれかをコードする核酸を含有するように改変された、タリモジーン・ラハーパレプベック(Talimogene laherparepvec)(T-Vec、ImlygicまたはOncoVex GM-CSFとしても公知）の改変されたバージョンである。いくつかの態様において、感染性物質は、例えば、WO 2007/052029、WO 1999/038955、US 2004/0063094、US 2014/0154216に記載されている改変された単純ヘルペスウイルス、またはそのバリアントである。
いくつかの態様において、感染性物質は、ウイルスが投与される対象の特定の細胞タイプを標的とするウイルス、例えば、免疫細胞または抗原提示細胞(APC)を標的とするウイルスである。樹状細胞(DC)は、免疫応答の開始および制御に必須のAPCである。DCは、抗原を捕捉およびプロセシングし、末梢からリンパ系器官へ移動し、抗原を静止T細胞に主要組織適合性複合体(MHC)拘束様式で提示することができる。いくつかの態様において、感染性物質は、DCを特異的に標的化してDCにおける発現のために免疫調節ポリペプチドをコードする核酸を送達できる、ウイルスである。いくつかの態様において、ウイルスは、レンチウイルスまたはそのバリアントもしくは誘導体、例えば組み込み欠損型レンチウイルスベクターである。いくつかの態様において、ウイルスは、細胞表面マーカーである樹状細胞特異的細胞間接着分子-3-結合ノンインテグリン(DC-SIGN)を発現する細胞、例えばDCに効率的に結合して、生産的に感染するよう偽型化された、レンチウイルスである。いくつかの態様において、ウイルスは、シンドビスウイルスE2糖タンパク質またはその改変された形態で偽型化されたレンチウイルス、例えばWO 2013/149167に記載されているものである。いくつかの態様において、ウイルスは、関心対象の配列（例えば、本明細書に記載の免疫調節ポリペプチドのいずれかをコードする核酸)のDCへの送達および発現を可能にする。いくつかの態様において、ウイルスは、WO 2008/011636、US 2011/0064763、Tareen et al. (2014) Mol. Ther., 22:575-587に記載されているもの、またはそのバリアントを含む。例示的な樹状細胞指向性ベクタープラットフォームは、ZVex(商標)である。
B. 細菌
いくつかの態様において、感染性物質は、細菌である。例えば、いくつかの態様において、細菌は、本明細書に記載の免疫調節ポリペプチドのいずれかをコードする核酸を、対象の標的細胞、例えば腫瘍細胞、免疫細胞、抗原提示細胞および/または食細胞に送達することができる。いくつかの態様において、細菌は、免疫調節ポリペプチドの発現および/もしくは分泌のため、ならびに/または、バリアント免疫調節ポリペプチドの発現のために該環境の特異的細胞を標的化するため、対象内の特定の環境、例えば腫瘍微小環境(TME)に優先的に標的化されることができる。
いくつかの態様において、細菌は、プラスミドDNAの哺乳動物細胞への細菌媒介性移入(「バクトフェクション」とも称される）を介して核酸を細胞に送達する。例えば、いくつかの態様において、遺伝物質の送達は、細菌全体の標的細胞への侵入を通じて達成される。いくつかの態様において、自発的なまたは誘導された溶菌は、その後の真核細胞発現のためのプラスミドの放出を導くことができる。いくつかの態様において、細菌は、核酸を、哺乳動物非食細胞（例えば、腫瘍細胞）および/または食細胞、例えば、ある特定の免疫細胞および/またはAPCに送達することができる。いくつかの態様において、細菌によって送達される核酸を、発現のために対象の細胞の核に移入することができる。いくつかの態様において、核酸はまた、バリアント免疫調節ポリペプチドをコードする機能的に連結された配列の特定の宿主細胞における発現に必要な適切な核酸配列、例えば、調節エレメント、例えばプロモーターまたはエンハンサーを含む。いくつかの態様において、細菌である感染性物質は、標的細胞の機序による翻訳のために標的細胞の細胞質に送達される予め製造された翻訳能力のあるRNAのようなRNAの形態で、免疫調節タンパク質をコードする核酸を送達することができる。
いくつかの態様において、細菌は、標的細胞、例えば腫瘍細胞において複製し、該細胞を溶解することができる。いくつかの態様において、細菌は、標的細胞の細胞質で核酸配列および/または遺伝子産物を含有しかつ/または放出し、それによって、標的細胞、例えば腫瘍細胞を殺傷することができる。いくつかの態様において、感染性物質は、対象の特定の環境、例えば腫瘍微小環境(TME)で特異的に複製することができる細菌である。例えば、いくつかの態様において、細菌は、嫌気または低酸素微小環境で特異的に複製することができる。いくつかの態様において、特定の環境に存在する条件または因子、例えば、TMEで細胞によって産生されるアスパラギン酸、セリン、クエン酸、リボースまたはガラクトースは、細菌を環境に誘引する化学誘引物質として作用することができる。いくつかの態様において、細菌は、本明細書に記載の免疫調節タンパク質を、環境、例えばTMEにおいて、発現および/または分泌することができる。
いくつかの態様において、感染性物質は、リステリア属(Listeria sp.)、ビフィドバクテリウム属(Bifidobacterium sp.)、エシェリキア属(Escherichia sp.)、クロストリジウム属(Clostridium sp.)、サルモネラ属(Salmonella sp.)、シゲラ属(Shigella sp.)、ビブリオ属(Vibrio sp.)またはエルシニア属(Yersinia sp)である細菌である。いくつかの態様において、細菌は、リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)、サルモネラ・ティフィムリウム(Salmonella typhimurium)、サルモネラ・コレラエスイス(Salmonella choleraesuis)、エシェリキア・コリ(Escherichia coli)、ビブリオ・コレラ(Vibrio cholera)、クロストリジウム・パーフリンジェンス(Clostridium perfringens)、クロストリジウム・ブチリカム(Clostridium butyricum)、クロストリジウム・ノビイ(Clostridium novyi)、クロストリジウム・アセトブチリクム(Clostridium acetobutylicum)、ビフィドバクテリウム・インファンティス(Bifidobacterium infantis)、ビフィドバクテリウム・ロングム(Bifidobacterium longum)およびビフィドバクテリウム・アドレセンティス(Bifidobacterium adolescentis)の1つまたは複数の中から選択される。いくつかの態様において、細菌は、改変された細菌である。いくつかの態様において、細菌は、改変された細菌、例えば、Seow and Wood (2009) Molecular Therapy 17(5):767-777；Baban et al. (2010) Bioengineered Bugs 1:6, 385-394；Patyar et al. (2010) J Biomed Sci 17:21；Tangney et al. (2010) Bioengineered Bugs 1:4, 284-287；van Pijkeren et al. (2010) Hum Gene Ther. 21(4):405-416；WO 2012/149364；WO 2014/198002；US 9103831；US 9453227；US 2014/0186401；US 2004/0146488；US 2011/0293705；US 2015/0359909およびEP 3020816に記載されているものなどである。本明細書において提供される免疫調節ポリペプチド、コンジュゲートおよび/または融合体のいずれかをコードする核酸配列を送達しかつ/またはそのような免疫調節ポリペプチドを対象において発現するように、細菌を改変することができる。
VIII. 組成物、方法、および治療用途
本明細書において、哺乳動物細胞の免疫学的活性を調節する際に使用するための本明細書に記載の提供される免疫調節タンパク質、改変細胞および感染性物質に関する組成物および方法が提供される。組成物を、関連する方法、例えば、免疫療法アプローチ（例えば、哺乳動物のがんの治療、または他の態様において、自己免疫性障害の治療のための）における免疫学的活性を調節するための関連する方法において使用することができる。いくつかの態様において、該方法は、本発明の免疫調節タンパク質(改変細胞によって分泌され得る)と哺乳動物細胞とを、親和性改変IgSFドメインの特異的結合および哺乳動物細胞の免疫学的活性の調節を許容する条件下で接触させることを含む。当該方法を、エクスビボまたはインビボで用いることができる。
いくつかの態様において、免疫学的活性を調節する方法は、免疫調節タンパク質を発現および分泌するように改変または感染させた免疫細胞、例えばリンパ球（例えば、T細胞またはTIL)またはNK細胞による、本発明の免疫調節タンパク質の発現および分泌によって達成される。いくつかの態様において、免疫学的活性を調節する方法は、表面上に膜貫通型免疫調節タンパク質を発現するように改変または感染させた免疫細胞、例えばリンパ球（例えば、T細胞またはTIL)またはNK細胞による、本発明の免疫調節タンパク質の発現および表面発現によって達成される。いくつかの態様において、腫瘍細胞に、例えば腫瘍溶解性ウイルスを感染させて、分泌性免疫調節タンパク質または膜貫通型免疫調節タンパク質を発現させて、腫瘍環境において免疫細胞を調節することができる。いくつかの態様において、免疫調節タンパク質を発現および分泌する細胞を、哺乳動物細胞、例えばAPC、第二のリンパ球または腫瘍細胞と、免疫学的活性を哺乳動物細胞において調節できるような哺乳動物細胞上の同族結合パートナーに対する親和性改変IgSFドメインの特異的結合を許容する条件下で接触させる。
いくつかの態様において、該方法は、免疫調節タンパク質を発現および分泌する改変細胞（例えば、T細胞）が患者に注入して戻される養子細胞移入によって実行される。いくつかの態様において、該方法は、表面上に膜貫通型免疫調節タンパク質を発現する改変細胞（例えば、T細胞）の養子細胞移入によって実行される。
本明細書において、免疫調節タンパク質を発現および分泌または表面発現するように構成された改変細胞の有効量を必要とする対象（例えば、疾患または障害を有する対象)に投与する方法が提供される。本明細書に記載の薬学的組成物を、様々な治療用途、例えば疾患の治療において使用することができる。例えば、いくつかの態様において、薬学的組成物は、哺乳動物における炎症性もしくは自己免疫性障害、がん、臓器移植、ウイルス感染、および/または細菌感染を治療するために使用される。薬学的組成物は、免疫応答を調節して疾患を治療することができる。例えば、いくつかの態様において、薬学的組成物は、免疫応答を刺激し、これは、例えば、がん、ウイルス感染、または細菌感染の治療において有用であることができる。いくつかの態様において、薬学的組成物は、免疫応答を抑制し、これは、炎症性もしくは自己免疫性障害、または臓器移植の治療において有用であることができる。
提供される方法は、例えば、免疫系および免疫系の応答の調節または制御が有益である哺乳動物における様々な免疫系の疾患または状態を治療するための予防的または治療的方法を非限定的に含む、様々な用途に有用性を有すると考えられる。例えば、免疫応答を抑制することは、ドナー由来の組織、細胞、または臓器移植のレシピエントによる拒絶反応を阻害するための予防的および/または治療的方法において有益であることができる。治療的状況においては、哺乳動物対象は、典型的には、免疫系の疾患または状態を有するものであり、投与は、疾患または状態のさらなる進行を防止するために実行される。
本発明の免疫調節タンパク質を発現および分泌するように改変された細胞組成物ならびに関連する方法を、免疫療法用途において使用することができる。いくつかの態様において、哺乳動物、例えばマウスまたはヒトから単離された細胞を、免疫調節タンパク質を発現および分泌または表面発現するように改変することができる。いくつかの態様において、免疫調節タンパク質の発現および分泌または表面発現のための宿主細胞として役立つ哺乳動物細胞は、リンパ球、例えば腫瘍浸潤性リンパ球(TIL)、ナチュラルキラー(NK)細胞、または、T細胞、例えばCD8+細胞傷害性Tリンパ球またはCD4+ヘルパーTリンパ球である。いくつかの態様において、細胞は、自家細胞である。提供される方法の局面において、改変細胞は、一般に生理学的条件下で、免疫学的活性の調節が望まれる哺乳動物細胞と接触させられる。例えば、哺乳動物細胞は、ネズミまたはヒトの細胞、例えば抗原提示細胞または腫瘍細胞であることができる。いくつかの態様において、改変細胞は、自家細胞である。他の態様において、細胞は、同種異系である。細胞をインビボまたはエクスビボで接触させることができる。いくつかの態様において、改変細胞は、例えば注入によって、対象に投与される。したがって、組成物および方法を、養子細胞移入免疫療法において使用することができる。
いくつかの態様において、前記方法は、分泌性免疫調節タンパク質または膜貫通型免疫調節タンパク質のいずれかの免疫調節タンパク質をコードする核酸分子を含有する感染性物質を含有する薬学的組成物の投与によって実行される。いくつかの態様において、薬学的組成物は、治療に好適な用量の、対象への投与に好適な感染性物質を含有する。いくつかの態様において、薬学的組成物は、1×105プラーク形成単位(pfu)と1×1012pfuとの間もしくは概ねそれらの値の間、1×106pfuと1×1010pfuとの間もしくは概ねそれらの値の間、または1×107pfuと1×1010pfuとの間もしくは概ねそれらの値の間（それぞれ両端の値を含む）、例えば、少なくとも1×106、1×107、1×108、1×109、2×109、3×109、4×109、5×109pfu、または少なくとも概ねそれらの値、または概ねそれらの値、あるいは約1×1010pfuの単一または複数の投与量のウイルスである感染性物質を含有する。いくつかの態様において、薬学的組成物は、105または約105〜約1010pfu/mL、例えば、5×106〜5×109pfu/mLまたは1×107〜1×109pfu/mL、例えば、少なくとも106pfu/mL、107pfu/mL、108pfu/mL、もしくは109pfu/mL、または少なくとも概ねそれらの値、または概ねそれらの値のウイルス濃度を含有することができる。いくつかの態様において、薬学的組成物は、1×103コロニー形成単位(cfu)と1×109cfuとの間もしくは概ねそれらの値の間、1×104cfuと1×109cfuとの間もしくは概ねそれらの値の間、または1×105cfuと1×107cfuとの間もしくは概ねそれらの値の間（それぞれ両端の値を含む）、例えば、少なくとも1×104、1×105、1×106、1×107、1×108、もしくは1×109cfu、または少なくとも概ねそれらの値、または概ねそれらの値の単一または複数の投与量の細菌である感染性物質を含有する。いくつかの態様において、薬学的組成物は、103または約103〜約108cfu/mL、例えば、5×105〜5×107cfu/mLまたは1×106〜1×107cfu/mL、例えば、少なくとも105cfu/mL、106cfu/mL、107cfu/mL、もしくは108cfu/mL、または少なくとも概ねそれらの値、または概ねそれらの値の細菌濃度を含有することができる。
いくつかの態様において、本発明の免疫調節タンパク質による免疫活性の調節に感受性であるがんの進行を阻害、停止、または反転させるために、有効量の薬学的組成物が投与される。いくつかの態様において、本発明の方法は、リンパ腫、リンパ性白血病、骨髄性白血病、子宮頚がん、神経芽細胞腫、または多発性骨髄腫などのがんの哺乳動物患者の治療において使用される。本発明の方法によって治療できる他のがんには、黒色腫、膀胱がん、血液悪性腫瘍（白血病、リンパ腫、骨髄腫）、肝臓がん、脳腫瘍、腎臓がん、乳がん、膵臓がん（腺がん）、大腸がん、肺がん（小細胞肺がんおよび非小細胞肺がん）、脾臓がん、胸腺のがんもしくは血液細胞のがん（すなわち、白血病）、前立腺がん、精巣がん、卵巣がん、子宮がん、胃がん、またはユーイング肉腫が非限定的に含まれる。
ヒトがん細胞を、インビボ、またはエクスビボで処置することができる。ヒト患者のエクスビボ処置では、がん細胞を含有する組織または流体を体外で処置し、次いで、その組織または流体を患者に再導入して戻す。いくつかの態様において、がんは、治療用組成物の患者への投与によって、ヒト患者においてインビボ処置される。したがって、本発明は、腫瘍の進行を阻害、停止もしくは反転させる、またはそうでなければ、対照での処置と比較して、無増悪生存期間（すなわち、がんが悪化せずに患者が生存している処置中および処置後の時間の長さ）、または全生存期間（「生存率」とも呼ばれる；すなわち、試験群または処置群における、がんと診断された後またはがんを処置された後に一定期間生存している人の割合）の統計的に有意な増加をもたらす、エクスビボおよびインビボ法を提供する。
いくつかの態様において、本発明の薬学的組成物をまた、単剤療法として（すなわち、単一の薬剤として）、少なくとも1つの化学療法剤との組み合わせ（すなわち、組み合わせ療法）で、がんワクチンとの組み合わせで、免疫チェックポイント阻害剤との組み合わせで、および／または放射線療法との組み合わせで使用して、哺乳動物（特にヒト）のがん細胞の成長を阻害することもできる。本開示のいくつかの局面において、免疫チェックポイント阻害剤は、ニボルマブ、トレメリムマブ、ペンブロリズマブ、イピリムマブなどである。
いくつかの態様において、提供される組成物は、例えば、抑制性リガンドの親和性改変IgSFドメインを免疫調節タンパク質が含む場合、免疫応答を減弱させることができる。いくつかの態様において、組成物を使用して、自己免疫性疾患を治療することができる。いくつかの態様において、免疫系疾患（例えば、自己免疫性疾患）を患っている対象に本発明の治療用組成物を投与することにより、当該免疫系の攻撃またはそれと関連する生物学的応答の抑制または阻害をもたらすことができる。健康な体組織に対するこの免疫系の攻撃を抑制することによって、健康な体組織に対するこのような攻撃に起因するかまたはそれに伴う結果として生じる身体的症状（例えば、疼痛、関節の炎症、関節の腫脹または圧痛）を減少させるまたは軽減することができ、免疫系の攻撃から生じるかまたはそれと関連する生物学的および身体的損傷を減少、遅延、または停止させることができる。予防に係る文脈においては、対象は、免疫系の疾患、障害、または状態を有するもの、それに罹り易いもの、またはそれを呈すると考えられるものであり得、投与は、典型的には、疾患、障害、もしくは状態の進行を防止する、それと関連する症状、徴候、もしくは生物学的応答を阻害もしくは軽減する、そこから潜在的に生じる肉体的損傷を防止する、および／または対象の身体機能を維持もしくは改善するために実行される。
いくつかの態様において、炎症性または自己免疫性障害は、抗好中球細胞質抗体(ANCA)関連血管炎、血管炎、自己免疫性皮膚疾患、移植、リウマチ性疾患、炎症性胃腸疾患、炎症性眼疾患、炎症性神経疾患、炎症性肺疾患、炎症性内分泌疾患、または自己免疫性血液疾患である。
いくつかの態様において、免疫調節タンパク質を発現し分泌するように改変された細胞を含む薬学的組成物を使用して、対象における1つまたは複数の他の免疫疾患または障害を治療することができる。患者の免疫系の疾患または障害は、例えば、限定されるものではないが、アジソン病、アレルギー、円形脱毛症、アルツハイマー病、抗好中球細胞質抗体（ANCA）-関連血管炎、強直性脊椎炎、抗リン脂質症候群（ヒューズ症候群）、関節炎、喘息、アテローム性動脈硬化、アテローム斑、自己免疫性疾患（例えば、ループス、RA、MS、グレーブス病など）、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫性内耳疾患、自己免疫性リンパ増殖症候群、自己免疫性心筋炎、自己免疫性卵巣炎、自己免疫性精巣炎、無***症、ベーチェット病、ベルガー病、水疱性類天疱瘡、心筋症、心血管疾患、セリアック病/シリアック病、慢性疲労免疫機能不全症候群（CFIDS）、慢性特発性多発神経炎、慢性炎症性脱髄性多発神経根障害（Chronic Inflammatory Demyelinating, Polyradicalneuropathy）（CIPD）、慢性再発性多発ニューロパチー（ギラン・バレー症候群）、チャーグ・ストラウス症候群（CSS）、瘢痕性類天疱瘡、寒冷凝集素症（CAD）、COPD、CREST症候群、クローン病、疱疹状皮膚炎（Dermatitis, Herpetiformus）、皮膚筋炎、糖尿病、円板状ループス、湿疹、後天性表皮水疱症、本態性混合型クリオグロブリン血症、エバンス症候群、眼球突出（Exopthalmos）、線維筋痛、グッドパスチャー症候群、移植関連疾患または障害、グレーブス病、GVHD、橋本甲状腺炎、特発性肺線維症、特発性血小板減少性紫斑病（Idiopathic Thrombocytopenia Purpura）（ITP）、IgA腎症、免疫増殖性疾患または障害（例えば、乾癬）、炎症性腸疾患（IBD）、インスリン依存性糖尿病（IDDM）、間質性肺疾患、若年性糖尿病、若年性関節炎、若年性特発性関節炎（JIA）、川崎病、ランバート・イートン筋無力症候群、扁平苔癬、ループス、ループス腎炎、リンパ球性下垂体炎（Lymphoscytic Lypophisitis）、メニエール病、ミラーフィッシャー症候群（Miller Fish Syndrome）/急性散在性脳脊髄神経根障害（acute disseminated encephalomyeloradiculopathy）、混合性結合組織病、多発性硬化症（MS）、筋肉リウマチ、筋痛性脳脊髄炎（ME）、重症筋無力症、眼炎症、落葉性天疱瘡、尋常性天疱瘡、悪性貧血、結節性多発動脈炎、多発性軟骨炎、多腺性症候群（ウィテカー症候群）、リウマチ性多発筋痛症、多発性筋炎、原発性無γグロブリン血症、原発性胆汁性肝硬変/自己免疫性胆管症、乾癬、乾癬性関節炎、レイノー現象、ライター症候群/反応性関節炎、再狭窄、リウマチ熱、リウマチ性疾患、関節リウマチ、サルコイドーシス、シュミット症候群、強皮症、シェーグレン症候群、固形臓器移植拒絶反応（腎臓、心臓、肝臓、肺など）、スティッフマン症候群、全身性エリテマトーデス（SLE）、全身性強皮症、高安動脈炎、側頭動脈炎/巨細胞動脈炎、甲状腺炎、1型糖尿病、2型糖尿病、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、血管炎、白斑、ウェゲナー肉芽腫症であっても、それらを含んでもよい。ドナー組織、細胞、移植片、もしくは臓器移植のレシピエント対象による拒絶反応と関連する免疫応答の防止または抑制も挙げられる。移植片関連疾患または障害には、移植片対宿主病（GVDH）（例えば、骨髄移植と関連する）、および、例えば、皮膚、筋肉、神経細胞、膵島、臓器の移植片、肝臓の実質細胞などを含む、臓器、組織、もしくは細胞移植片移植（例えば、組織または細胞の同種移植片または異種移植片）の拒絶反応に起因するかまたはそれに伴う結果として生じる免疫障害が含まれる。レシピエント対象におけるドナー組織、細胞、移植片または固形臓器移植に関して、本明細書に開示される本発明の治療用組成物は、レシピエントにおけるこのような移植の急性拒絶反応を防止する際におよび／またはレシピエントにおけるこのような移植の拒絶反応を防止するための長期維持療法に効果的であり得ると考えられる（例えば、糖尿病を患っている対象レシピエントにおけるドナーからのインスリン産生膵島細胞移植の拒絶反応の阻害）。
いくつかの態様において、治療量の薬学的組成物が投与される。典型的には、投与されるべき本発明の組成物の正確な量は、患者（対象）の年齢、体重、腫瘍サイズ、感染または転移の範囲、および状態の個々の違いを考慮して医師が決定することができる。概して、本明細書に記載の改変細胞（例えばT細胞）を含む薬学的組成物を、104〜109個の細胞/kg（体重）、例えば105〜106個の細胞/kg（体重）の投与量（これらの範囲内の全ての整数値を含む）で投与可能と規定することができる。また、改変細胞組成物（例えばT細胞組成物）をこれらの投与量で複数回投与してもよい。該細胞を、免疫療法において通常知られている注入技術を使用することによって投与することができる（例えば、Rosenberg et al, New Eng. J. of Med. 319: 1676, 1988 を参照のこと）。特定の患者に対する最適な投与量および治療レジメンは、医学分野の当業者が、患者の疾患の兆候をモニタリングし、それに応じて治療を調整することによって、容易に決定することができる。
対象の組成物の投与を、エアロゾル吸入、注射、摂取、輸血、インプランテーションまたは移植によることを含む任意の簡便な手法で行ってもよい。本明細書に記載される組成物を、皮下、皮内、腫瘍内、結節内（intranodally）、骨髄内、筋肉内、静脈内（i.v.）注射によって、または腹腔内で患者に投与してもよい。一態様において、治療用組成物は、皮内または皮下注射によって患者に投与される。別の態様において、治療用組成物は、i.v.注射によって投与される。いくつかの場合では、該細胞組成物を、腫瘍、リンパ節、または感染部位に直接注射してもよい。
A. 薬学的組成物
免疫調節タンパク質、このような免疫調節タンパク質を発現して分泌するかまたは表面に発現するように構成された改変細胞、または感染性因子を含む薬学的組成物が提供される。いくつかの態様において、薬学的組成物および製剤は、1つまたは複数の任意の薬学的に許容し得る担体または賦形剤を含む。
このような組成物は、緩衝液、例えば中性の緩衝食塩水、リン酸緩衝食塩水など；糖質、例えばグルコース、マンノース、スクロースまたはデキストラン、マンニトール；タンパク質；ポリペプチドまたはアミノ酸、例えばグリシン；酸化防止剤；キレート剤、例えばEDTAまたはグルタチオン；補助剤（例えば、水酸化アルミニウム）；および保存料を含んでもよい。本発明の組成物は、好ましくは、静脈内投与用に製剤化される。
本発明の薬学的組成物は、治療（または予防）される疾患に適した手法で投与され得る。投与の量および頻度は、患者の状態、ならびに患者の疾患の種類および重症度のような要因によって決定されるが、適切な投与量を臨床試験によって決定してもよい。
このような製剤は、例えば、静脈内注入に好適な形態であってもよい。薬学的に許容し得る担体は、1つの組織、臓器、または身体の一部から、別の組織、臓器、または身体の一部への関心対象の細胞の運搬または輸送に関与する薬学的に許容し得る材料、組成物、またはビヒクルであってもよい。例えば、担体は、液体または固体の充填剤、希釈剤、賦形剤、溶媒、もしくは封入材料、またはそれらのいくつかの組み合わせであってもよい。担体の各成分は、製剤のその他の有効成分と適合可能でなければならないという点で「薬学的に許容し得る」でなければならない。それはまた、その治療的恩恵を過度に上回る毒性、刺激、アレルギー応答、免疫原性、または任意の他の合併症のリスクを有するべきではないという意味で、直面し得る任意の組織、臓器、または身体の一部との接触に好適でなければならない。
いくつかの態様において、薬学的組成物は、滅菌状態である。いくつかの態様において、薬学的組成物は、細菌またはウイルスを含有しないかまたは実質的に含有しない。いくつかの態様において、薬学的組成物は、本明細書に記載の改変細胞以外の細胞を含有しないかまたは実質的に含有しない。
治療的に採用されるべき薬学的組成物の有効量は、例えば、治療背景および目的に依存するだろう。したがって、当業者は、治療のための適切な投与量レベルが送達される分子、結合剤分子が使用されている適応症、投与経路、ならびに患者のサイズ（体重、体表または臓器サイズ）および状態（年齢および総体的な健康）に部分的に依存するだろうことを認識するだろう。したがって、臨床医は、最適な治療効果を得るために、投与量を設定し、かつ、投与経路を変更してもよい。本発明の薬学的組成物は、非経口、皮下、もしくは静脈内に、または本明細書の他の箇所に記載のとおり投与することができる。本発明の薬学的組成物は、治療有効量で、1ヶ月に1、2、3もしくは4回、1週間に2回、隔週（2週間毎）、または隔月（2ヶ月毎）投与してもよい。投与は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、または12ヶ月またはそれ以上の期間（例えば、1、2、3、4年またはそれ以上、対象の一生にわたる期間を含む）にわたり続けてもよい。
任意の組成物について、最初に、細胞培養アッセイ、またはマウス、ラット、ウサギ、イヌ、ブタ、もしくはサルのような動物モデルのいずれかで治療有効用量を推定することができる。また、適切な濃度範囲および投与経路を決定するために動物モデルを使用してもよい。次いで、このような情報を使用して、ヒトにおける有用な用量および投与経路を決定することができる。正確な投与量は、治療を必要とする対象に関連する要因に照らして決定されるだろう。投与量および投与は、細胞組成物の十分なレベルを提供するようにまたは所望の効果を維持するように調整される。考慮され得る要因は、疾患状態の重症度、対象の総体的な健康、対象の年齢、体重、および性別、投与の時間および頻度、薬物併用、反応感度、ならびに治療への応答を含む。適切な用量-応答データの使用によって適切な投与量を突き止めてもよい。T細胞活性化もしくは増殖、サイトカイン合成もしくは産生（例えば、TNF-α、IFN-γ、IL-2の産生）、種々の活性化マーカー（例えば、CD25、IL-2受容体）の誘導、炎症、関節の腫脹もしくは圧痛、C-反応性タンパク質の血清中レベル、抗コラーゲン抗体産生、および／またはT細胞依存性抗体応答を含む、治療効果についての多数のバイオマーカーまたは生理学的マーカーをモニタリングすることができる。
望ましくない免疫応答を媒介するもしくは媒介することが可能な免疫細胞を排除、隔離、もしくは不活性化すること；防御免疫応答を媒介するもしくは媒介することが可能な免疫細胞を誘導、生成、もしくは刺激すること；免疫細胞の物理的もしくは機能的特性を変化させること；またはこれらの効果の組み合わせによって、本発明の治療用組成物の投与が免疫活性を十分に調節するかどうかを決定するための様々な手段が公知である。免疫活性の調節の測定例は、免疫細胞集団の有無の検査（フローサイトメトリー、免疫組織化学、組織学、電子顕微鏡法、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を使用する）；シグナルに応答して増殖もしくは***する能力または増殖もしくは***への抵抗性を含む、免疫細胞の機能的能力の測定（例えば、T細胞増殖アッセイ、および抗CD3抗体、抗T細胞受容体抗体、抗CD28抗体、カルシウムイオノフォア、PMA、ペプチドまたはタンパク質抗原を負荷した抗原提示細胞で刺激した後の3H-チミジン取込に基づいたpepscan分析；B細胞増殖アッセイを使用する）；他の細胞を殺傷または溶解する能力の測定（例えば、細胞傷害性T細胞アッセイ）；サイトカイン、ケモカイン、細胞表面分子、抗体および細胞の他の産物の測定（例えば、フローサイトメトリー、酵素結合免疫吸着アッセイ、ウェスタンブロット分析、タンパク質マイクロアレイ分析、免疫沈降分析による）；免疫細胞または免疫細胞内のシグナル伝達経路の活性化の生化学マーカーの測定（例えば、チロシン、セリンまたはトレオニンリン酸化、ポリペプチド切断、およびタンパク質複合体の形成または解離の、ウェスタンブロットおよび免疫沈降分析；タンパク質アレイ分析；DNAアレイまたはサブトラクティブハイブリダイザーションを使用するDNA転写プロファイリング）；アポトーシス、壊死または他の機序による細胞死の測定（例えば、アネキシンV染色、TUNELアッセイ、DNAラダリングを測定するゲル電気泳動、組織学；蛍光発生カスパーゼアッセイ、カスパーゼ基質のウェスタンブロット分析）；免疫細胞によって産生される遺伝子、タンパク質、および他の分子の測定（例えば、ノーザンブロット分析、ポリメラーゼ連鎖反応、DNAマイクロアレイ、タンパク質マイクロアレイ、2次元ゲル電気泳動、ウェスタンブロット分析、酵素結合免疫吸着アッセイ、フローサイトメトリー）；ならびに自己タンパク質または自己ポリペプチドが関与する自己免疫疾患、神経変性性疾患、および他の疾患の臨床症状または改善のような臨床転帰の、例えば、多発性硬化症の場合には再発率または疾患重症度を測定することによる（当業者に公知の臨床スコアを使用する）、I型糖尿病の場合には血糖を、または関節リウマチの場合には関節の炎症を測定することよる、測定（臨床スコア、追加の治療法を使用する必要性、機能的状態、画像試験）を含むが、それらに限定されない。
IX. 例示的な態様
例として、提供される態様の中に以下の態様がある。
1. 野生型IgSFドメイン内に1つまたは複数のアミノ酸置換を含む少なくとも1つの非免疫グロブリン親和性改変免疫グロブリンスーパーファミリー(IgSF)ドメインを含む、免疫調節タンパク質であって、
少なくとも1つの親和性改変IgSFドメインが、野生型IgSFドメインの少なくとも1つの細胞表面同族結合パートナーに特異的に結合し；
免疫調節タンパク質が膜貫通ドメインを含まず；かつ
免疫調節タンパク質が半減期延長部分にコンジュゲートされていない、
免疫調節タンパク質。
2. 半減期延長部分が、多量体化ドメインである、態様1に記載の免疫調節タンパク質。
3. 半減期延長部分が、Fcドメインである、態様1または2に記載の免疫調節タンパク質。
4. シグナルペプチドをさらに含む、態様1〜3のいずれか1つに記載の免疫調節タンパク質。
5. シグナルペプチドが、対応する野生型IgSFメンバーに由来するネイティブシグナルペプチドである、態様4に記載の免疫調節タンパク質。
6. シグナルペプチドが、非ネイティブシグナルペプチドである、態様4に記載の免疫調節タンパク質。
7. シグナルペプチドが、IgG-κシグナルペプチド、IL-2シグナルペプチド、またはCD33シグナルペプチドである、態様4または6に記載の免疫調節タンパク質。
8. 少なくとも1つの細胞表面同族結合パートナーが、哺乳動物細胞上に発現する、態様1〜7のいずれか1つに記載の免疫調節タンパク質。
9. 哺乳動物細胞が、抗原提示細胞(APC)、腫瘍細胞、またはリンパ球である、態様8に記載の免疫調節タンパク質。
10. 哺乳動物細胞がT細胞である、態様8または9に記載の免疫調節タンパク質。
11. 哺乳動物細胞が、マウス、ラット、カニクイザル、またはヒトの細胞である、態様8〜10のいずれかに記載の免疫調節タンパク質。
12. 少なくとも1つの親和性改変IgSFドメインが、少なくとも1つの細胞表面同族結合パートナーに対して、野生型IgSFドメインと比較して向上した結合親和性を有する、態様1〜11のいずれかに記載の免疫調節タンパク質。
13. 少なくとも1つの親和性改変IgSFドメインを含む免疫調節タンパク質の特異的結合が、野生型IgSFドメインと比較して、哺乳動物細胞の免疫学的活性を調節する、態様8〜12のいずれかに記載の免疫調節タンパク質。
14. 少なくとも1つの親和性改変IgSFドメインを含む免疫調節タンパク質の特異的結合が、野生型IgSFドメインと比較して、哺乳動物細胞の免疫学的活性を増強する、態様8〜13のいずれかに記載の免疫調節タンパク質。
15. 免疫調節タンパク質の特異的結合が、野生型IgSFドメインと比較して、哺乳動物細胞の免疫学的活性を低減する、態様8〜13のいずれかに記載の免疫調節タンパク質。
16. 野生型IgSFドメインが、シグナル制御タンパク質(SIRP)ファミリー、骨髄細胞に発現するトリガー受容体様(TREML)ファミリー、がん胎児性抗原関連細胞接着分子(CEACAM)ファミリー、シアル酸結合Ig様レクチン(SIGLEC)ファミリー、ブチロフィリンファミリー、B7ファミリー、CD28ファミリー、Vセットおよび免疫グロブリンドメイン含有(VSIG)ファミリー、Vセット膜貫通ドメイン(VSTM)ファミリー、主要組織適合複合体(MHC)ファミリー、シグナル伝達リンパ球活性化分子(SLAM)ファミリー、白血球免疫グロブリン様受容体(LIR)、ネクチン(Nec)ファミリー、ネクチン様(NECL)ファミリー、ポリオウイルス受容体関連(PVR)ファミリー、天然細胞傷害誘発受容体(NCR)ファミリー、T細胞免疫グロブリンおよびムチン(TIM)ファミリー、ならびにキラー細胞免疫グロブリン様受容体(KIR)ファミリーからなる群より選択されるファミリーのIgSFファミリーメンバーに由来する、態様1〜15のいずれかに記載の免疫調節タンパク質。
17. 野生型IgSFドメインが、CD80、CD86、PD-L1、PD-L2、ICOSリガンド、B7-H3、B7-H4、CD28、CTLA4、PD-1、ICOS、BTLA、CD4、CD8-α、CD8-β、LAG3、TIM-3、CEACAM1、TIGIT、PVR、PVRL2、CD226、CD2、CD160、CD200、CD200R、NKp30、VISTA、VSIG3、およびVSIG8からなる群より選択されるIgSFメンバーに由来する、態様1〜16のいずれかに記載の免疫調節タンパク質。
18. 野生型IgSFドメインが、ヒトIgSFドメインである、態様1〜17のいずれかに記載の免疫調節タンパク質。
19. 少なくとも1つの親和性改変IgSFドメインが、SEQ ID NO:1〜27および408のいずれかに示されるアミノ酸配列に含有される野生型IgSFドメインまたはその特異的結合断片に対して少なくとも90％の配列同一性を有する、態様1〜18のいずれかに記載の免疫調節タンパク質。
20. 免疫調節タンパク質が、IgSFドメインを含有する、SEQ ID NO:28〜54および410のいずれかから選択されるアミノ酸配列またはその特異的結合断片に対して少なくとも90％の配列同一性を有する、態様1〜19のいずれかに記載の免疫調節タンパク質。
21. 野生型IgSFドメインが、B7ファミリーのメンバーのものである、態様1〜20のいずれかに記載の免疫調節タンパク質。
22. 野生型IgSFドメインが、CD80、CD86、またはICOSLのドメインである、態様1〜21のいずれかに記載の免疫調節タンパク質。
23. 少なくとも1つの細胞表面同族結合パートナーが、T細胞上に発現する刺激性受容体であり、少なくとも1つの親和性改変IgSFドメインが、該刺激性受容体に対して、該刺激性受容体に対する野生型IgSFドメインの結合親和性と比較して向上した結合親和性を有する、態様1〜22のいずれかに記載の免疫調節タンパク質。
24. 刺激性受容体に対する親和性改変IgSFドメインの結合が、T細胞の免疫学的活性を増強する、態様23に記載の免疫調節タンパク質。
25. 刺激性受容体が、CD28、ICOS、またはCD226である、態様23または24に記載の免疫調節タンパク質。
26. 少なくとも1つの親和性改変IgSFドメインが、ICOSおよびCD28のうちの少なくとも1つに対する向上した結合親和性を有する親和性改変ICOSL IgSFドメインである、態様23〜25のいずれか1つに記載の免疫調節タンパク質。
27. 少なくとも1つの親和性改変IgSFドメインが親和性改変ICOSL IgSFドメインであり、刺激性受容体がICOSである、態様23〜26のいずれか1つに記載の免疫調節タンパク質。
28. 少なくとも1つの親和性改変IgSFドメインが親和性改変ICOSL IgSFドメインであり、刺激性受容体がCD28である、態様23〜26のいずれか1つに記載の免疫調節タンパク質。
29. 少なくとも1つの親和性改変IgSFドメインが親和性改変CD80 IgSFドメインであり、刺激性受容体がCD28である、態様23〜25のいずれか1つに記載の免疫調節タンパク質。
30. 親和性改変IgSFドメインが、CTLA-4に実質的に特異的に結合しないか、または、CTLA-4に対して、CTLA-4に対する野生型IgSFドメインの結合親和性と比較して低下した結合親和性を示す、態様23〜29のいずれか1つに記載の免疫調節タンパク質。
31. 少なくとも1つの親和性改変IgSFドメインが、わずか1つの細胞表面同族結合パートナーに特異的に結合する、態様1〜30のいずれかに記載の免疫調節タンパク質。
32. わずか1つの細胞表面同族結合パートナーに特異的に結合する、態様1〜31のいずれかに記載の免疫調節タンパク質。
33. 少なくとも1つの親和性改変ドメインが、少なくとも2つの細胞表面同族結合パートナーに特異的に結合する、態様1〜30のいずれかに記載の免疫調節タンパク質。
34. 第一の細胞表面同族結合パートナーが、T細胞上に発現する刺激性受容体であり；かつ
第二の細胞表面同族結合パートナーが、抑制性受容体の抑制性リガンドであり、該抑制性受容体がT細胞上に発現する、
態様33に記載の免疫調節タンパク質。
35. 抑制性リガンドに対する親和性改変ドメインの結合が、抑制性受容体への抑制性リガンドの結合を競合的に阻害する、態様34に記載の免疫調節タンパク質。
36. 抑制性受容体が、PD-1、CTLA-4、LAG-3、TIGIT、CD96、CD112R、BTLA、CD160、TIM-3、VSIG3、もしくはVSIG8であるか；または
抑制性受容体のリガンドが、PD-L1、PD-L2、B7-1、B7-2、HVEM、MHCクラスII、PVR、CEACAM-1、GAL9、もしくはVISTAである、態様34または態様35に記載の免疫調節タンパク質。
37. 親和性改変IgSFドメインが親和性改変CD80ドメインであり、刺激性受容体がCD28である、態様34〜36のいずれか1つに記載の免疫調節タンパク質。
38. 抑制性リガンドがPD-L1であり、抑制性受容体がPD-1である、態様37に記載の免疫調節タンパク質。
39. 親和性改変IgSFドメインが、野生型IgSFドメインと比較して、CTLA-4に対する低下した結合親和性を示す、態様37または態様38に記載の免疫調節タンパク質。
40. 親和性改変IgSFドメインが、CTLA-4に実質的に特異的に結合しない、態様37〜39のいずれか1つに記載の免疫調節タンパク質。
41. 親和性改変IgSFドメインが、親和性改変CD155 IgSFドメインまたは親和性改変CD112 IgSFドメインであり、少なくとも1つの細胞表面同族結合パートナーが、CD226、TIGIT、またはCD112Rである、態様1〜20のいずれかに記載の免疫調節タンパク質。
42. 親和性改変IgSFドメインが、CD226に対して、CD226に対する野生型IgSFドメインの結合親和性と比較して低下した結合親和性を示し、場合により、TIGIT(IgおよびITIMドメインを有するT細胞免疫受容体）またはCD112Rに対して、野生型IgSFドメインの結合親和性と比較して向上した結合性を保持または示す、態様41に記載の免疫調節タンパク質。
43. 少なくとも1つの親和性改変IgSFドメインが、腫瘍特異的抗原である細胞表面同族結合パートナーに特異的に結合する、態様1〜20のいずれかに記載の免疫調節タンパク質。
44. 腫瘍特異的抗原が、B7-H6である、態様43に記載の免疫調節タンパク質。
45. 親和性改変IgSFドメインが、親和性改変NKp30 IgSFドメインである、態様43または44に記載の免疫調節タンパク質。
46. 少なくとも1つの親和性改変IgSFドメインが、第一の親和性改変IgSFドメインおよび第二の親和性改変IgSFドメインを含む、態様1〜45のいずれか1つに記載の免疫調節タンパク質。
47. 第一の親和性改変IgSFドメインと第二の親和性改変IgSFドメインが異なる、態様46に記載の免疫調節タンパク質。
48. 第一の親和性改変IgSFドメインおよび第二の親和性改変IgSFドメインが各々、同じ野生型IgSFドメイン内に1つまたは複数の異なるアミノ酸置換を含む、態様46または47に記載の免疫調節タンパク質。
49. 第一の親和性改変IgSFドメインおよび第二の親和性改変IgSFドメインが各々、異なる野生型IgSFドメイン内に1つまたは複数のアミノ酸置換を含む、態様46または47に記載の免疫調節タンパク質。
50. 野生型IgSFドメインが、抑制性受容体のリガンドであるIgSFメンバーに由来し、該抑制性受容体がITIMシグナル伝達ドメインを含む、態様1〜20のいずれかに記載の免疫調節タンパク質。
51. 抑制性受容体が、PD-1、CTLA-4、LAG3、TIGIT、TIM-3、もしくはBTLAであり、かつ少なくとも1つの親和性改変IgSFドメインがそれぞれ、PD-1、CTLA-4、LAG3、TIGIT、TIM-3、BTLA、VSIG3、もしくはVSIG8のリガンドの親和性改変IgSFドメインであるか；
または
抑制性受容体のリガンドが、PD-L1、PD-L2、B7-1、B7-2、MHCクラスII、PVR、CEACAM-1、GAL9、もしくはVISTAであり、かつ少なくとも1つの親和性改変IgSFドメインがそれぞれ、PD-L1、PD-L2、B7-1、B7-2、MHCクラスII、PVR、CEACAM-1、GAL9、もしくはVISTAのリガンドの親和性改変IgSFドメインである、態様50に記載の免疫調節タンパク質。
52. 抑制性受容体がPD-1であり、少なくとも1つの親和性改変IgSFドメインがPD-1の親和性改変IgSFである、態様50または51に記載の免疫調節タンパク質。
53. 親和性改変IgSFドメインが、野生型IgSFドメインと比較して、トランス表面同族結合パートナーに対する向上した結合親和性を有し、それによって、向上した結合親和性が、抑制性受容体へのトランス表面同族結合パートナーの結合を競合的に阻害する、態様50〜52のいずれかに記載の免疫調節タンパク質。
54. 親和性改変IgSFドメインが、野生型IgSFドメインとアミノ酸置換10個以下異なる、態様1〜53のいずれかに記載の免疫調節タンパク質。
55. 親和性改変IgSFドメインが、野生型IgSFドメインとアミノ酸置換5個以下異なる、態様1〜54のいずれかに記載の免疫調節タンパク質。
56. 1つまたは複数の親和性改変IgSFドメインが、1つまたは複数のアミノ酸置換を含む、親和性改変IgVドメイン、親和性改変IgC1ドメイン、もしくは親和性改変IgC2ドメインである、もしくはそれを含む、またはその特異的結合断片である、態様1〜55のいずれかに記載の免疫調節タンパク質。
57. 1つまたは複数の親和性が改変されていないIgSFドメインをさらに含む、態様1〜56のいずれかに記載の免疫調節タンパク質。
58. 改変細胞から分泌される、態様1〜56のいずれか1つに記載の免疫調節タンパク質。
59. 改変細胞が免疫細胞である、態様58に記載の免疫調節タンパク質。
60. 改変細胞が初代細胞である、態様58または59に記載の免疫調節タンパク質。
61. 態様1〜60のいずれかに記載の免疫調節タンパク質をコードする、組換え核酸。
62. 核酸分子が、免疫調節タンパク質の発現を制御するために機能的に連結された少なくとも1つのプロモーターをさらに含む、態様61記載の組換え核酸。
63. プロモーターが、構成的活性型プロモーターである、態様62記載の組換え核酸。
64. プロモーターが、誘導性プロモーターである、態様62記載の組換え核酸。
65. プロモーターが、T細胞活性化シグナル伝達に応答性のエレメントに応答性である、態様64記載の組換え核酸。
66. プロモーターが、NFATの結合部位またはNF-κBの結合部位を含む、態様64、または65記載の組換え核酸。
67. 態様61〜66のいずれかに記載の核酸を含む、組換え発現ベクター。
68. 分泌のためのシグナル配列の機能的制御下にある免疫調節タンパク質をコードする核酸を含む組換え発現ベクターであって、
免疫調節タンパク質が、野生型IgSFドメイン内に1つまたは複数のアミノ酸置換を含む少なくとも1つの非免疫グロブリン親和性改変免疫グロブリンスーパーファミリー(IgSF)ドメインを含み、少なくとも1つの親和性改変IgSFドメインが、野生型IgSFドメインの少なくとも1つの細胞表面同族結合パートナーに特異的に結合し；かつ
コードされる免疫調節タンパク質が、細胞から発現されると分泌される、
前記組換え発現ベクター。
69. 免疫調節タンパク質が、膜貫通ドメインを含まない、態様68に記載の発現ベクター。
70. 免疫調節タンパク質が、半減期延長部分にコンジュゲートされていない、態様68または69に記載の発現ベクター。
71. 半減期延長部分が、多量体化ドメインである、態様68〜70のいずれか1つに記載の発現ベクター。
72. 半減期延長部分が、Fcドメインである、態様68〜71のいずれか1つに記載の発現ベクター。
73. 分泌のためのシグナル配列が、分泌シグナルペプチドをコードする、態様68〜72のいずれか1つに記載の発現ベクター。
74. シグナルペプチドが、対応する野生型IgSFメンバーに由来するネイティブシグナルペプチドである、態様73に記載の発現ベクター。
75. シグナルペプチドが、非ネイティブシグナルペプチドである、態様73に記載の発現ベクター。
76. シグナルペプチドが、IgG-κシグナルペプチド、IL-2シグナルペプチド、またはCD33シグナルペプチドである、態様73または75に記載の発現ベクター。
77. 核酸分子が、免疫調節タンパク質の発現を制御するために機能的に連結された少なくとも1つのプロモーターをさらに含む、態様68〜76のいずれかに記載の発現ベクター。
78. プロモーターが、構成的活性型プロモーターである、態様77に記載の発現ベクター。
79. プロモーターが、誘導性プロモーターである、態様77に記載の発現ベクター。
80. プロモーターが、T細胞活性化シグナル伝達に応答性のエレメントに応答性である、態様79に記載の発現ベクター。
81. プロモーターが、NFATの結合部位またはNF-κBの結合部位を含む、態様79または80に記載の発現ベクター。
82.ウイルスベクターである、態様68〜81のいずれかに記載の発現ベクター。
83. ウイルスベクターが、レトロウイルスベクターである、態様82に記載の発現ベクター。
84. ウイルスベクターが、レンチウイルスベクターまたはガンマレトロウイルスベクターである、態様82または83の発現ベクター。
85. 少なくとも1つの親和性改変IgSFドメインが、野生型IgSFドメインと比較して、少なくとも1つの細胞表面同族結合パートナーに対する向上した結合親和性を有する、態様68〜84のいずれか1つに記載の発現ベクター。
86. 少なくとも1つの細胞表面同族結合パートナーが、哺乳動物細胞上に発現する、態様68〜85のいずれか1つに記載の発現ベクター。
87. 哺乳動物細胞が、抗原提示細胞(APC)、腫瘍細胞、またはリンパ球である、態様86に記載の発現ベクター。
88. 哺乳動物細胞が、T細胞である、態様86または87に記載の発現ベクター。
89. 哺乳動物細胞が、マウス、ラット、カニクイザル、またはヒトの細胞である、態様86〜88のいずれか1つに記載の発現ベクター。
90. 少なくとも1つの親和性改変IgSFドメインを含む免疫調節タンパク質の特異的結合が、野生型IgSFドメインと比較して、哺乳動物細胞の免疫学的活性を調節する、態様86〜89のいずれか1つに記載の発現ベクター。
91. 少なくとも1つの親和性改変IgSFドメインを含む免疫調節タンパク質の特異的結合が、野生型IgSFドメインと比較して、哺乳動物細胞の免疫学的活性を増強する、態様86〜90のいずれか1つに記載の発現ベクター。
92. 免疫調節タンパク質の特異的結合が、野生型IgSFドメインと比較して、哺乳動物細胞の免疫学的活性を低減する、態様86〜910のいずれか1つに記載の発現ベクター。
93. 野生型IgSFドメインが、シグナル制御タンパク質(SIRP)ファミリー、骨髄細胞に発現するトリガー受容体様(TREML)ファミリー、がん胎児性抗原関連細胞接着分子(CEACAM)ファミリー、シアル酸結合Ig様レクチン(SIGLEC)ファミリー、ブチロフィリンファミリー、B7ファミリー、CD28ファミリー、Vセットおよび免疫グロブリンドメイン含有(VSIG)ファミリー、Vセット膜貫通ドメイン(VSTM)ファミリー、主要組織適合複合体(MHC)ファミリー、シグナル伝達リンパ球活性化分子(SLAM)ファミリー、白血球免疫グロブリン様受容体(LIR)、ネクチン(Nec)ファミリー、ネクチン様(NECL)ファミリー、ポリオウイルス受容体関連(PVR)ファミリー、天然細胞傷害誘発受容体(NCR)ファミリー、T細胞免疫グロブリンおよびムチン(TIM)ファミリー、ならびにキラー細胞免疫グロブリン様受容体(KIR)ファミリーからなる群より選択されるファミリーのIgSFファミリーメンバーに由来する、態様68〜92のいずれか1つに記載の発現ベクター。
94. 野生型IgSFドメインが、CD80、CD86、PD-L1、PD-L2、ICOSリガンド、B7-H3、B7-H4、CD28、CTLA4、PD-1、ICOS、BTLA、CD4、CD8-α、CD8-β、LAG3、TIM-3、CEACAM1、TIGIT、PVR、PVRL2、CD226、CD2、CD160、CD200、CD200R、NKp30、VISTA、VSIG3、およびVSIG8からなる群より選択されるIgSFメンバーに由来する、態様68〜93のいずれか1つに記載の発現ベクター。
95. 野生型IgSFドメインが、ヒトIgSFドメインである、態様68〜94のいずれか1つに記載の発現ベクター。
96. 少なくとも1つの親和性改変IgSFドメインが、SEQ ID NO:1〜27および408のいずれかに示されるアミノ酸配列に含有される野生型IgSFドメインまたはその特異的結合断片に対して少なくとも90％の配列同一性を有する、態様68〜95のいずれか1つに記載の発現ベクター。
97. 免疫調節タンパク質が、SEQ ID NO:28〜54および410のいずれかから選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも90％の配列同一性を有する、態様68〜96のいずれか1つに記載の発現ベクター。
98. 野生型IgSFドメインが、B7ファミリーのメンバーのものである、態様68〜97のいずれかに記載の発現ベクター。
99. 野生型IgSFドメインが、CD80、CD86、またはICOSLのドメインである、態様68〜98のいずれかに記載の発現ベクター。
100. 少なくとも1つの細胞表面同族結合パートナーが、T細胞上に発現する刺激性受容体であり、少なくとも1つの親和性改変IgSFドメインが、該刺激性受容体に対して、該刺激性受容体に対する野生型IgSFドメインの結合親和性と比較して向上した結合親和性を有する、態様68〜99のいずれか1つに記載の発現ベクター。
101. 刺激性受容体に対する親和性改変IgSFドメインの結合が、T細胞の免疫学的活性を増強する、態様100に記載の発現ベクター。
102. 刺激性受容体が、CD28、ICOS、またはCD226である、態様100または101に記載の発現ベクター。
103. 少なくとも1つの親和性改変IgSFドメインが、ICOSおよびCD28のうちの少なくとも1つに対する向上した結合親和性を有する親和性改変ICOSL IgSFドメインである、態様100〜102のいずれか1つに記載の発現ベクター。
104. 少なくとも1つの親和性改変IgSFドメインが親和性改変ICOSL IgSFドメインであり、刺激性受容体がICOSである、態様100〜103のいずれか1つに記載の発現ベクター。
105. 少なくとも1つの親和性改変IgSFドメインが親和性改変ICOSL IgSFドメインであり、刺激性受容体がCD28である、態様100〜103のいずれか1つに記載の発現ベクター。
106. 少なくとも1つの親和性改変IgSFドメインが親和性改変CD80 IgSFドメインであり、刺激性受容体がCD28である、態様100〜102のいずれか1つに記載の発現ベクター。
107. 親和性改変IgSFドメインが、CTLA-4に実質的に特異的に結合しないか、または、CTLA-4に対して、CTLA-4に対する野生型IgSFドメインの結合親和性と比較して低下した結合親和性を示す、態様100〜106のいずれか1つに記載の発現ベクター。
108. 少なくとも1つの親和性改変IgSFドメインが、わずか1つの細胞表面同族結合パートナーに特異的に結合する、態様68〜107のいずれか1つに記載の発現ベクター。
109. 免疫調節タンパク質が、わずか1つの細胞表面同族結合パートナーに特異的に結合する、態様68〜108のいずれか1つに記載の発現ベクター。
110. 少なくとも1つの親和性改変ドメインが、少なくとも2つの細胞表面同族結合パートナーに特異的に結合する、態様68〜107のいずれか1つに記載の発現ベクター。
111. 第一の細胞表面同族結合パートナーが、T細胞上に発現する刺激性受容体であり；かつ
第二の細胞表面同族結合パートナーが、抑制性受容体の抑制性リガンドであり、該抑制性受容体がT細胞上に発現する、
態様110に記載の発現ベクター。
112. 抑制性リガンドに対する親和性改変IgSFドメインの結合が、抑制性受容体への抑制性リガンドの結合を競合的に阻害する、態様111に記載の発現ベクター。
113. 抑制性受容体が、PD-1、CTLA-4、LAG-3、TIGIT、CD96、CD112R、BTLA、CD160、TIM-3、VSIG3、もしくはVSIG8であるか；または
抑制性受容体のリガンドが、PD-L1、PD-L2、B7-1、B7-2、HVEM、MHCクラスII、PVR、CEACAM-1、GAL9、もしくはVISTAである、態様111または112に記載の発現ベクター。
114. 親和性改変IgSFドメインが親和性改変CD80ドメインであり、刺激性受容体がCD28である、態様111〜113のいずれか1つに記載の発現ベクター。
115. 抑制性リガンドがPD-L1であり、抑制性受容体がPD-1である、態様114に記載の発現ベクター。
116. 親和性改変IgSFドメインが、野生型IgSFドメインと比較して、CTLA-4に対する低下した結合親和性を示す、態様114または115に記載の発現ベクター。
117. 親和性改変IgSFドメインが、CTLA-4に実質的に特異的に結合しない、態様114〜116のいずれか1つに記載の発現ベクター。
118. 親和性改変IgSFドメインが、親和性改変CD155 IgSFドメインまたは親和性改変CD112 IgSFドメインであり、少なくとも1つの細胞表面同族結合パートナーが、CD226、TIGIT、またはCD112Rである、態様68〜97のいずれかに記載の発現ベクター。
119. 親和性改変IgSFドメインが、CD226に対して、CD226に対する野生型IgSFドメインの結合親和性と比較して低下した結合親和性を示し、場合により、TIGIT(IgおよびITIMドメインを有するT細胞免疫受容体）またはCD112Rに対して、野生型IgSFドメインの結合親和性と比較して向上した結合性を保持または示す、態様118に記載の発現ベクター。
120. 少なくとも1つの親和性改変IgSFドメインが、腫瘍特異的抗原である細胞表面同族結合パートナーに特異的に結合する、態様68〜97のいずれかに記載の発現ベクター。
121. 腫瘍特異的抗原が、B7-H6である、態様120に記載の発現ベクター。
122. 親和性改変IgSFドメインが、親和性改変NKp30 IgSFドメインである、態様120または121に記載の発現ベクター。
123. 少なくとも1つの親和性改変IgSFドメインが、第一の親和性改変IgSFドメインおよび第二の親和性改変IgSFドメインを含む、態様68〜122のいずれか1つに記載の発現ベクター。
124. 第一の親和性改変IgSFドメインと第二の親和性改変IgSFドメインが異なる、態様123に記載の発現ベクター。
125. 第一の親和性改変IgSFドメインおよび第二の親和性改変IgSFドメインが各々、同じ野生型IgSFドメイン内に1つまたは複数の異なるアミノ酸置換を含む、態様123または124に記載の発現ベクター。
126. 第一の親和性改変IgSFドメインおよび第二の親和性改変IgSFドメインが各々、異なる野生型IgSFドメイン内に1つまたは複数のアミノ酸置換を含む、態様123または124に記載の発現ベクター。
127. 野生型IgSFドメインが、抑制性受容体のリガンドであるIgSFメンバーに由来し、該抑制性受容体がITIMシグナル伝達ドメインを含む、態様68〜97のいずれかに記載の発現ベクター。
128. 抑制性受容体が、PD-1、CTLA-4、LAG3、TIGIT、TIM-3、もしくはBTLAであり、かつ少なくとも1つの親和性改変IgSFドメインがそれぞれ、PD-1、CTLA-4、LAG3、TIGIT、TIM-3、BTLA、VSIG3、もしくはVSIG8の親和性改変IgSFドメインであるか；または
抑制性受容体のリガンドが、PD-L1、PD-L2、B7-1、B7-2、MHCクラスII、PVR、CEACAM-1、GAL9、もしくはVISTAであり、かつ少なくとも1つの親和性改変IgSFドメインがそれぞれ、PD-L1、PD-L2、B7-1、B7-2、MHCクラスII、PVR、CEACAM-1、GAL9、もしくはVISTAのリガンドの親和性改変IgSFドメインである、態様127に記載の発現ベクター。
129. 抑制性受容体がPD-1であり、少なくとも1つの親和性改変IgSFドメインが、PD-1の親和性改変IgSFである、態様127または128に記載の発現ベクター。
130. 親和性改変IgSFドメインが、野生型IgSFドメインと比較して、トランス表面同族結合パートナーに対する向上した結合親和性を有し、それによって、向上した結合親和性が、抑制性受容体へのトランス表面同族結合パートナーの結合を競合的に阻害する、態様127〜129のいずれかに記載の発現ベクター。
131. 親和性改変IgSFドメインが、野生型IgSFドメインとアミノ酸置換10個以下異なる、態様68〜130のいずれかに記載の発現ベクター。
132. 親和性改変IgSFドメインが、野生型IgSFドメインとアミノ酸置換5個以下異なる、態様68〜131のいずれかに記載の発現ベクター。
133. 1つまたは複数の親和性改変IgSFドメインが、1つまたは複数のアミノ酸置換を含む、親和性改変IgVドメイン、親和性改変IgC1ドメイン、もしくは親和性改変IgC2ドメインである、もしくはそれを含む、またはその特異的結合断片である、態様68〜132のいずれかに記載の発現ベクター。
134. 免疫調節タンパク質が、1つまたは複数の親和性が改変されていないIgSFドメインをさらに含む、態様68〜133のいずれかに記載の発現ベクター。
135. 態様61〜66のいずれか1つに記載の核酸または態様67〜134のいずれか1つに記載の発現ベクターを含む、改変細胞。
136. 態様1〜60のいずれか1つに記載の免疫調節タンパク質を含む、改変細胞。
137. 態様1〜60のいずれか1つに記載の免疫調節タンパク質を分泌する、改変細胞。
138. 免疫細胞である、態様135〜137のいずれかに記載の改変細胞。
139. 免疫調節タンパク質をコードする核酸分子を含む改変免疫細胞であって、
免疫調節タンパク質が、野生型IgSFドメイン内に1つまたは複数のアミノ酸置換を含む少なくとも1つの非免疫グロブリン親和性改変免疫グロブリンスーパーファミリー(IgSF)ドメインを含み、少なくとも1つの親和性改変IgSFドメインが、野生型IgSFドメインの少なくとも1つの細胞表面同族結合パートナーに特異的に結合し；
改変免疫細胞が免疫調節タンパク質を発現および分泌する、
前記改変免疫細胞。
140. 免疫調節タンパク質が、膜貫通ドメインを含まない、態様139に記載の改変免疫細胞。
141. 免疫調節タンパク質が、半減期延長部分にコンジュゲートされていない、態様139または140に記載の改変免疫細胞。
142. 半減期延長部分が、多量体化ドメインである、態様141に記載の改変免疫細胞。
143. 半減期延長部分が、Fcドメインである、態様141または142に記載の改変免疫細胞。
144. 核酸分子が、免疫調節タンパク質をコードする配列に機能的に連結された、分泌シグナルペプチドをコードする配列を含む、態様139〜143のいずれか1つに記載の改変免疫細胞。
145. シグナルペプチドが、対応する野生型IgSFメンバーに由来するネイティブシグナルペプチドである、態様144に記載の改変免疫細胞。
146. シグナルペプチドが、非ネイティブシグナル配列である、態様144に記載の改変免疫細胞。
147. シグナルペプチドが、IgG-κシグナルペプチド、IL-2シグナルペプチド、またはCD33シグナルペプチドである、態様144または146に記載の改変免疫細胞。
148. 核酸分子が、免疫調節タンパク質の発現を制御するために機能的に連結された少なくとも1つのプロモーターをさらに含む、態様139〜148のいずれか1つに記載の改変免疫細胞。
149. プロモーターが、構成的活性型プロモーターである、態様148に記載の改変免疫細胞。
150. プロモーターが、誘導性プロモーターである、態様148に記載の改変免疫細胞。
151. プロモーターが、T細胞活性化シグナル伝達に応答性のエレメントに応答性である、態様148または150に記載の改変免疫細胞。
152. プロモーターが、NFATの結合部位またはNF-κBの結合部位を含む、態様148、150、および151のいずれか1つに記載の改変免疫細胞。
153. 免疫調節タンパク質が、改変細胞を誘導物質と接触させた後またはT細胞活性化シグナル伝達の誘導後に改変細胞によって発現および分泌され、それが、場合により、改変細胞によって発現されるキメラ抗原受容体(CAR)または改変されたT細胞受容体(TCR)への抗原の結合時に誘導される、態様135〜152記載の改変細胞。
154. リンパ球である、態様135〜153のいずれか1つに記載の改変細胞。
155. リンパ球が、T細胞、B細胞、またはNK細胞である、態様154記載の改変細胞。
156. T細胞である、態様135〜155のいずれか1つに記載の改変細胞。
157. T細胞が、CD4+またはCD8+である、態様156記載の改変細胞。
158. 抗原提示細胞である、態様135〜154のいずれか1つに記載の改変細胞。
159. 対象から得られた初代細胞である、態様135〜158のいずれか1つに記載の改変細胞。
160. 対象が、ヒト対象である、態様159記載の改変細胞。
161. 少なくとも1つの親和性改変IgSFドメインが、野生型IgSFドメインと比較して、少なくとも1つの細胞表面同族結合パートナーに対する向上した結合親和性を有する、態様135〜160のいずれか1つに記載の改変細胞。
162. 少なくとも1つの細胞表面同族結合パートナーが、哺乳動物細胞上に発現する、態様135〜161のいずれか1つに記載の改変細胞。
163. 哺乳動物細胞が、抗原提示細胞(APC)、腫瘍細胞、またはリンパ球である、態様162記載の改変細胞。
164. 哺乳動物細胞が、T細胞である、態様162または163記載の改変細胞。
165. 哺乳動物細胞が、マウス、ラット、カニクイザル、またはヒトの細胞である、態様162〜164のいずれか1つに記載の改変細胞。
166. 少なくとも1つの親和性改変IgSFドメインを含む免疫調節タンパク質の特異的結合が、野生型IgSFドメインと比較して、哺乳動物細胞の免疫学的活性を調節する、態様162〜165のいずれか1つに記載の改変細胞。
167. 少なくとも1つの親和性改変IgSFドメインを含む免疫調節タンパク質の特異的結合が、野生型IgSFドメインと比較して、哺乳動物細胞の免疫学的活性を増強する、態様162〜166のいずれか1つに記載の改変細胞。
168. 免疫調節タンパク質の特異的結合が、野生型IgSFドメインと比較して、哺乳動物細胞の免疫学的活性を低減する、態様162〜166のいずれか1つに記載の改変細胞。
169. 野生型IgSFドメインが、シグナル制御タンパク質(SIRP)ファミリー、骨髄細胞に発現するトリガー受容体様(TREML)ファミリー、がん胎児性抗原関連細胞接着分子(CEACAM)ファミリー、シアル酸結合Ig様レクチン(SIGLEC)ファミリー、ブチロフィリンファミリー、B7ファミリー、CD28ファミリー、Vセットおよび免疫グロブリンドメイン含有(VSIG)ファミリー、Vセット膜貫通ドメイン(VSTM)ファミリー、主要組織適合複合体(MHC)ファミリー、シグナル伝達リンパ球活性化分子(SLAM)ファミリー、白血球免疫グロブリン様受容体(LIR)、ネクチン(Nec)ファミリー、ネクチン様(NECL)ファミリー、ポリオウイルス受容体関連(PVR)ファミリー、天然細胞傷害誘発受容体(NCR)ファミリー、T細胞免疫グロブリンおよびムチン(TIM)ファミリー、ならびにキラー細胞免疫グロブリン様受容体(KIR)ファミリーからなる群より選択されるファミリーのIgSFファミリーメンバーに由来する、態様135〜168のいずれか1つに記載の改変細胞。
170. 野生型IgSFドメインが、CD80、CD86、PD-L1、PD-L2、ICOSリガンド、B7-H3、B7-H4、CD28、CTLA4、PD-1、ICOS、BTLA、CD4、CD8-α、CD8-β、LAG3、TIM-3、CEACAM1、TIGIT、PVR、PVRL2、CD226、CD2、CD160、CD200、CD200R、NKp30、VISTA、VSIG3、およびVSIG8からなる群より選択されるIgSFメンバーに由来する、態様135〜169のいずれか1つに記載の改変細胞。
171. 野生型IgSFドメインが、ヒトIgSFドメインである、態様135〜170のいずれか1つに記載の改変細胞。
172. 少なくとも1つの親和性改変IgSFドメインが、SEQ ID NO:1〜27および408のいずれかに示されるアミノ酸配列に含有される野生型IgSFドメインまたはその特異的結合断片に対して少なくとも90％の配列同一性を有する、態様135〜171のいずれか1つに記載の改変細胞。
173. 免疫調節タンパク質が、SEQ ID NO:28〜54および410のいずれかから選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも90％の配列同一性を有する、態様135〜172のいずれか1つに記載の改変細胞。
174. 少なくとも1つの細胞表面同族結合パートナーが、T細胞上に発現する刺激性受容体であり、少なくとも1つの親和性改変IgSFドメインが、該刺激性受容体に対して、該刺激性受容体に対する野生型IgSFドメインの結合親和性と比較して向上した結合親和性を有する、態様135〜173のいずれか1つに記載の改変細胞。
175. 刺激性受容体に対する親和性改変IgSFドメインの結合が、T細胞の免疫学的活性を増強する、態様174記載の改変細胞。
176. 刺激性受容体が、CD28、ICOS、またはCD226である、態様174または175記載の改変細胞。
177. 少なくとも1つの親和性改変IgSFドメインが、ICOSおよびCD28のうちの少なくとも1つに対する向上した結合親和性を有する親和性改変ICOSL IgSFドメインである、態様174〜176のいずれか1つに記載の改変細胞。
178. 少なくとも1つの親和性改変IgSFドメインが親和性改変ICOSL IgSFドメインであり、刺激性受容体がICOSである、態様174〜177のいずれか1つに記載の改変細胞。
179. 少なくとも1つの親和性改変IgSFドメインが親和性改変ICOSL IgSFドメインであり、刺激性受容体がCD28である、態様174〜177のいずれか1つに記載の改変細胞。
180. 少なくとも1つの親和性改変IgSFドメインが親和性改変CD80 IgSFドメインであり、刺激性受容体がCD28である、態様174〜176のいずれか1つに記載の改変細胞。
181. 親和性改変IgSFドメインが、CTLA-4に実質的に特異的に結合しないか、または、CTLA-4に対して、CTLA-4に対する野生型IgSFドメインの結合親和性と比較して低下した結合親和性を示す、態様174〜180のいずれか1つに記載の改変細胞。
182. 少なくとも1つの親和性改変IgSFドメインが、わずか1つの細胞表面同族結合パートナーに特異的に結合する、態様135〜181のいずれか1つに記載の改変細胞。
183. 免疫調節タンパク質が、わずか1つの細胞表面同族結合パートナーに特異的に結合する、態様135〜182のいずれか1つに記載の改変細胞。
184. 少なくとも1つの親和性改変ドメインが、少なくとも2つの細胞表面同族結合パートナーに特異的に結合する、態様135〜181のいずれか1つに記載の改変細胞。
185. 第一の細胞表面同族結合パートナーが、T細胞上に発現する刺激性受容体であり；かつ
第二の細胞表面同族結合パートナーが、抑制性受容体の抑制性リガンドであり、該抑制性受容体がT細胞上に発現する、
態様184記載の改変細胞。
186. 抑制性リガンドに対する親和性改変ドメインの結合が、抑制性受容体への抑制性リガンドの結合を競合的に阻害する、態様185記載の改変細胞。
187. 抑制性受容体が、PD-1、CTLA-4、LAG-3、TIGIT、CD96、CD112R、BTLA、CD160,TIM-3、VSIG3、もしくはVSIG8であるか；または
抑制性受容体のリガンドが、PD-L1、PD-L2、B7-1、B7-2、HVEM、MHCクラスII、PVR、CEACAM-1、GAL9、もしくはVISTAである、態様185または186記載の改変細胞。
188. 親和性改変IgSFドメインが親和性改変CD80ドメインであり、刺激性受容体がCD28である、態様185〜187のいずれか1つに記載の改変細胞。
189. 抑制性リガンドがPD-L1であり、抑制性受容体がPD-1である、態様188記載の改変細胞。
190. 親和性改変IgSFドメインが、野生型IgSFドメインと比較して、CTLA-4に対する低下した結合親和性を示す、態様188または189記載の改変細胞。
191. 親和性改変IgSFドメインが、CTLA-4に実質的に特異的に結合しない、態様188〜190のいずれか1つに記載の改変細胞。
192. 親和性改変IgSFドメインが、親和性改変CD155 IgSFドメインまたは親和性改変CD112 IgSFドメインであり、少なくとも1つの細胞表面同族結合パートナーが、CD226、TIGIT、またはCD112Rである、態様135〜173のいずれかに記載の改変細胞。
193. 親和性改変IgSFドメインが、CD226に対して、CD226に対する野生型IgSFドメインの結合親和性と比較して低下した結合親和性を示し、場合により、TIGIT(IgおよびITIMドメインを有するT細胞免疫受容体）またはCD112Rに対して、野生型IgSFドメインの結合親和性と比較して向上した結合性を保持または示す、態様192記載の改変細胞。
194. 少なくとも1つの親和性改変IgSFドメインが、腫瘍特異的抗原である細胞表面同族結合パートナーに特異的に結合する、態様135〜173のいずれかに記載の改変細胞。
195. 腫瘍特異的抗原が、B7-H6である、態様194記載の改変細胞。
196. 親和性改変IgSFドメインが、親和性改変NKp30 IgSFドメインである、態様194または195記載の改変細胞。
197. 少なくとも1つの親和性改変IgSFドメインが、第一の親和性改変IgSFドメインおよび第二の親和性改変IgSFドメインを含む、態様135〜173のいずれか1つに記載の改変細胞。
198. 第一の親和性改変IgSFドメインと第二の親和性改変IgSFドメインが異なる、態様197記載の改変細胞。
199. 第一の親和性改変IgSFドメインおよび第二の親和性改変IgSFドメインが各々、同じ野生型IgSFドメイン内に1つまたは複数の異なるアミノ酸置換を含む、態様197または198記載の改変細胞。
200. 第一の親和性改変IgSFドメインおよび第二の親和性改変IgSFドメインが各々、異なる野生型IgSFドメイン内に1つまたは複数のアミノ酸置換を含む、態様197または198記載の改変細胞。
201. 野生型IgSFドメインが、抑制性受容体のリガンドであるIgSFメンバーに由来し、該抑制性受容体がITIMシグナル伝達ドメインを含む、態様135〜173のいずれかに記載の改変細胞。
202. 抑制性受容体が、PD-1、CTLA-4、LAG3、TIGIT、TIM-3、もしくはBTLAであり、かつ少なくとも1つの親和性改変IgSFドメインがそれぞれ、PD-1、CTLA-4、LAG3、TIGIT、TIM-3、BTLA、VSIG3、もしくはVSIG8のリガンドの親和性改変IgSFドメインであるか；または
抑制性受容体のリガンドが、PD-L1、PD-L2、B7-1、B7-2、MHCクラスII、PVR、CEACAM-1、GAL9、もしくはVISTAであり、かつ少なくとも1つの親和性改変IgSFドメインがそれぞれ、PD-L1、PD-L2、B7-1、B7-2、MHCクラスII、PVR、CEACAM-1、GAL9、もしくはVISTAのリガンドの親和性改変IgSFドメインである、態様201記載の改変細胞。
203. 抑制性受容体がPD-1であり、少なくとも1つの親和性改変IgSFドメインが、PD-1の親和性改変IgSFである、態様201または202記載の改変細胞。
204. 親和性改変IgSFドメインが、野生型IgSFドメインと比較して、トランス表面同族結合パートナーに対する向上した結合親和性を有し、それによって、向上した結合親和性は、抑制性受容体へのトランス表面同族結合パートナーの結合を競合的に阻害する、態様201〜203のいずれかに記載の改変細胞。
205. 親和性改変IgSFドメインが、野生型IgSFドメインとアミノ酸置換10個以下異なる、態様135〜204のいずれかに記載の改変細胞。
206. 親和性改変IgSFドメインが、野生型IgSFドメインとアミノ酸置換5個以下異なる、態様135〜205のいずれかに記載の改変細胞。
207. 1つまたは複数の親和性改変IgSFドメインが、1つまたは複数のアミノ酸置換を含む、親和性改変IgVドメイン、親和性改変IgC1ドメイン、もしくは親和性改変IgC2ドメインである、もしくはそれを含む、またはその特異的結合断片である、態様135〜206のいずれかに記載の改変細胞。
208. 免疫調節タンパク質が、1つまたは複数の親和性が改変されていないIgSFドメインをさらに含む、態様135〜207のいずれかに記載の改変細胞。
209. キメラ抗原受容体(CAR)または改変されたT細胞受容体(TCR)をさらに含む、態様135〜208のいずれかに記載の改変細胞。
210. 態様135〜209のいずれかに記載の細胞または態様230〜252のいずれかに記載の感染性物質および薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物。
211. 滅菌状態である、態様210に記載の薬学的組成物。
212. 免疫調節タンパク質を対象に導入する方法であって、態様135〜209のいずれか1つに記載の改変細胞、態様230〜252のいずれかに記載の感染性物質、または態様210もしくは211に記載の薬学的組成物を対象に投与することを含む、前記方法。
213. 対象における免疫応答を調節する方法であって、態様135〜209のいずれか1つに記載の細胞、態様230〜252のいずれかに記載の感染性物質、または態様210もしくは211に記載の薬学的組成物を対象に投与することを含む、前記方法。
214. 免疫応答の調節が、対象における疾患または障害を治療する、態様213に記載の方法。
215. 免疫応答の調節が、免疫応答の増強である、態様213または214に記載の方法。
216. 疾患または障害が、腫瘍である、態様214または215に記載の方法。
217. 疾患または障害が、がんである、態様214〜216のいずれか1つに記載の方法。
218. 疾患または障害が、黒色腫、肺がん、膀胱がん、または血液学的悪性腫瘍である、態様214〜217のいずれか1つに記載の方法。
219. 免疫応答の調節が、免疫応答の低減である、態様213または214に記載の方法。
220. 疾患または障害が、炎症性の疾患または状態である、態様214または219に記載の方法。
221. 疾患または状態が、クローン病、潰瘍性大腸炎、多発性硬化症、喘息、関節リウマチ、または乾癬である、態様214、219、および220のいずれか1つに記載の方法。
222. 対象が、ヒトである、態様212〜221のいずれか1つに記載の方法。
223. 細胞が、対象に対して自家である、態様212〜222のいずれかに記載の方法。
224. 細胞が、対象に対して同種異系である、態様212〜222のいずれかに記載の方法。
225. 改変細胞が、免疫調節タンパク質を発現および分泌する、態様212〜224のいずれか1つに記載の方法。
226. 免疫調節タンパク質が、改変細胞によって構成的に発現される、態様212〜225のいずれか1つに記載の方法。
227. 免疫調節タンパク質が、改変細胞を誘導物質と接触させた後に改変細胞によって発現および分泌される、態様212〜225のいずれか1つに記載の方法。
228. 免疫調節タンパク質が、T細胞活性化シグナル伝達時に改変細胞によって発現および分泌される、態様212〜227のいずれか1つに記載の方法。
229. 改変細胞が、キメラ抗原受容体(CAR)または改変されたT細胞受容体(TCR)を発現し、CARまたはTCRによる抗原の結合時にT細胞活性化シグナル伝達が誘導される、態様228に記載の方法。
230. 態様1〜60のいずれか1つに記載の免疫調節タンパク質をコードする核酸分子、態様61〜66のいずれかに記載の核酸分子、または態様67〜134のいずれか1つに記載の発現ベクターを含む、感染性物質。
231. 膜貫通型免疫調節タンパク質(TIP)をコードする核酸分子を含む感染性物質であって、TIPが、
(i)野生型IgSFドメイン内に1つまたは複数のアミノ酸置換を含む少なくとも1つの非免疫グロブリン親和性改変免疫グロブリンスーパーファミリー(IgSF)ドメインを含むエクトドメインであって、少なくとも1つの親和性改変IgSFドメインが、野生型IgSFドメインの少なくとも1つの細胞表面同族結合パートナーに特異的に結合する、エクトドメイン；および
(ii)膜貫通ドメイン
を含む、感染性物質。
232. 少なくとも1つの親和性改変IgSFドメインが、参照野生型IgSFドメインと比較して、少なくとも1つの細胞表面同族結合パートナーに対する向上した結合親和性を有する、態様231に記載の感染性物質。
233. 野生型IgSFドメインが、シグナル制御タンパク質(SIRP)ファミリー、骨髄細胞に発現するトリガー受容体様(TREML)ファミリー、がん胎児性抗原関連細胞接着分子(CEACAM)ファミリー、シアル酸結合Ig様レクチン(SIGLEC)ファミリー、ブチロフィリンファミリー、B7ファミリー、CD28ファミリー、Vセットおよび免疫グロブリンドメイン含有(VSIG)ファミリー、Vセット膜貫通ドメイン(VSTM)ファミリー、主要組織適合複合体(MHC)ファミリー、シグナル伝達リンパ球活性化分子(SLAM)ファミリー、白血球免疫グロブリン様受容体(LIR)、ネクチン(Nec)ファミリー、ネクチン様(NECL)ファミリー、ポリオウイルス受容体関連(PVR)ファミリー、天然細胞傷害誘発受容体(NCR)ファミリー、T細胞免疫グロブリンおよびムチン(TIM)ファミリー、またはキラー細胞免疫グロブリン様受容体(KIR)ファミリーから選択されるファミリーのIgSFファミリーメンバーに由来する、態様231または態様232に記載の感染性物質。
234. 野生型IgSFドメインが、CD80、CD86、PD-L1、PD-L2、ICOSリガンド、B7-H3、B7-H4、CD28、CTLA4、PD-1、ICOS、BTLA、CD4、CD8-α、CD8-β、LAG3、TIM-3、CEACAM1、TIGIT、PVR、PVRL2、CD226、CD2、CD160、CD200、CD200R、またはNKp30から選択されるIgSFメンバーに由来する、態様231〜233のいずれかに記載の感染性物質。
235. 野生型IgSFドメインが、ヒトIgSFメンバーのものである、態様231〜234のいずれかに記載の感染性物質。
236. 膜貫通型免疫調節タンパク質が、親和性改変IgSFドメインおよび膜貫通ドメインを含有する、SEQ ID NO:381〜407および409のいずれかから選択されるアミノ酸配列またはその隣接部分に対して少なくとも90％の配列同一性を有する、態様231〜235のいずれかに記載の感染性物質。
237. 膜貫通型免疫調節タンパク質がキメラ受容体であり、細胞内ドメインが、野生型IgSFドメインを含む野生型IgSFメンバーに由来する細胞内ドメインではない、態様231〜236のいずれかに記載の感染性物質。
238. 細胞内ドメインが、少なくとも1つのITAM(免疫受容体チロシン活性化モチーフ)を含有するシグナル伝達ドメインを含む、態様237に記載の感染性物質。
239. 細胞内ドメインが、CD3-ζシグナル伝達ドメインを含む、態様238に記載の感染性物質。
240. 細胞内ドメインが、CD28共刺激ドメイン、ICOSシグナル伝達ドメイン、OX40シグナル伝達ドメイン、および41BBシグナル伝達ドメインのうちの少なくとも1つをさらに含む、態様238または態様239に記載の感染性物質。
241. 親和性改変IgSFドメインが、野生型IgSFドメインとアミノ酸置換10個以下または5個以下異なる、態様231〜240のいずれかに記載の感染性物質。
242. 親和性改変IgSFドメインが、1つまたは複数のアミノ酸置換を含む、親和性改変IgVドメイン、親和性改変IgC1ドメイン、もしくは親和性改変IgC2ドメインである、もしくはそれを含む、またはその特異的結合断片である、態様231〜241のいずれかに記載の感染性物質。
243. 膜貫通ドメインが、対応する野生型IgSFメンバーに由来するネイティブ膜貫通ドメインである、態様231〜242のいずれかに記載の感染性物質。
244. 膜貫通ドメインが、対応する野生型IgSFメンバーに由来するネイティブ膜貫通ドメインではない、態様231〜243のいずれかに記載の感染性物質。
245. 膜貫通タンパク質が、CD8に由来する膜貫通タンパク質である、態様244に記載の感染性物質。
246. 細菌またはウイルスである、態様230〜245のいずれかに記載の感染性物質。
247. ウイルスが、腫瘍溶解性ウイルスである、態様246に記載の感染性物質。
248. 腫瘍溶解性ウイルスが、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、単純ヘルペスウイルス、水疱性口腔ウイルス、レオウイルス、ニューカッスル病ウイルス、パルボウイルス、麻疹ウイルス、水疱性口内炎ウイルス(VSV)、コクサッキーウイルス、またはワクシニアウイルスである、態様247に記載の感染性物質。
249. ウイルスが、樹状細胞(DC)を特異的に標的化し、かつ/または、樹状細胞指向性である、態様246に記載の感染性物質。
250. ウイルスが、改変されたシンドビスウイルスエンベロープ産物で偽型化されたレンチウイルスベクターである、態様249に記載の感染性物質。
251. 標的細胞の死をもたらすかまたは免疫応答を増強もしくは強化することができるさらなる遺伝子産物をコードする核酸分子をさらに含む、態様230〜250のいずれかに記載の感染性物質。
252. さらなる遺伝子産物が、抗がん剤、抗転移剤、抗血管新生剤、免疫調節分子、免疫チェックポイント阻害剤、抗体、サイトカイン、成長因子、抗原、細胞傷害性遺伝子産物、アポトーシス促進性遺伝子産物、抗アポトーシス性遺伝子産物、細胞マトリックス分解性遺伝子、組織再生のための遺伝子、またはヒト体細胞の多能性へのリプログラミングのための遺伝子から選択される、態様251に記載の感染性物質。
X. 実施例
以下の実施例は、単に例証のために含まれるものであり、本発明の範囲を限定することを意図したものではない。
実施例1〜12は、免疫活性化および抑制の両方において実証された二重の役割を有する免疫シナプス(IS)の成分である、例示的な親和性改変CD80(B7-1)、CD86(B7-2)、ICOSL、およびNKp30免疫調節タンパク質の設計、作製、およびスクリーニングを記載する。これらの実施例は、IgSFドメインの親和性改変が、免疫学的活性を増強および低減するように作用できるタンパク質を生成することを実証している。この研究はまた、免疫調節活性を達成するためのII型免疫調節タンパク質を形成するように対で融合された（すなわち、スタックされた）これらのドメインの種々の組み合わせも記載する。実施例はまた、そのような親和性改変免疫調節タンパク質を含有する例示的な分泌性免疫調節タンパク質の作製も記載する。
実施例1
IgSFドメインの変異DNA構築物の作製
実施例1は、酵母ディスプレイライブラリーとしての酵母の表面での翻訳および発現のための、ヒトCD80、CD86、ICOSL、およびNKp30 IgSFドメインの変異DNA構築物の作製を記載する。以下の実施例は、Fc融合フォーマットの例示的なIgSFタンパク質の親和性改変ドメインの結合および活性を例示する；そのような親和性改変ドメインは、記載の通りの分泌性免疫調節タンパク質または膜貫通型免疫調節タンパク質と関連付けられることが企図される。
A．縮重ライブラリー
縮重コドン（例えば、様々なアミノ酸置換をコードするための特定の混合塩基セット）での完全または部分的ランダム化のための標的タンパク質の特異的残基を標的化するライブラリーについて、ヒトCD80（SEQ ID NO:28）、ICOSL（SEQ ID NO:32）、およびNKp30（SEQ ID NO:54）の細胞外ドメイン（ECD）のコーディングDNAを、Integrated DNA Technologies（Coralville, IA）から、最大80塩基対（bp）長の一連の重複オリゴヌクレオチドとして注文した。各ECDの多様なバリアントのライブラリーを生成するために、オリゴヌクレオチドは、所望のアミノ酸位置に所望の縮重コドンを含有した。URL: rosettadesign.med.unc.edu/SwiftLib/におけるアルゴリズムを使用して、縮重コドンを生成した。
概して、変異させる位置および縮重コドンを以下から選択した：関心対象の標的-リガンド対の結晶構造（CD80、NKp30）または相同性モデル（ICOSL）を使用して、リガンド接触残基ならびにタンパク質相互作用界面にある残基を同定した。この分析を、URL:spdbv.vital-it.ch）で利用可能な構造ビューア（structure viewer）を使用して実施した。例えば、CTLA4に結合しているCD80についての結晶構造は、URL:www.rcsb.org/pdb/explore/explore.do?structureId=1I8L）に公表されており、そして、CTLA4への改善された結合剤の選択のためにCD80::CTLA4界面に基づいて標的化ライブラリーを設計した。しかしながら、リガンドCD28およびPD-L1との入手可能なCD80構造体はなく、そのためまた同じライブラリーを使用して、CD28（CD80上のCTLA4と同じ領域に結合する）およびPD-L1（PD-L1がCTLA4と同じ部位に結合するか公知ではない）の結合剤について選択した。ライブラリー設計における次の工程は、保存されている残基を同定するためのヒト、マウス、ラットおよびサルCD80、ICOSL、またはNKp30配列のアライメントであった。この分析に基づいて、保存されている標的残基を縮重コドンで変異させたところ、保存的アミノ酸変化＋野生型残基を特定しただけであった。保存されていない残基を、より積極的に変異させたが、これも野生型残基を含んでいた。野生型残基をまたコードする縮重コドンを配置して、標的タンパク質の過度の変異誘発を回避した。同じ理由で、変異誘発のため最大20の位置までしか一度に標的化できなかった。これらの残基は、接触残基と非接触界面残基との組み合わせであった。
オリゴヌクレオチドを滅菌水に溶解させ、等モル比で混合し、95℃に5分間加熱し、そして、アニーリングのためゆっくり室温まで冷ました。次いで、ECDの開始点および終点にアニーリングするECD特異的オリゴヌクレオチドプライマーをそれぞれ使用して、PCR産物を生成した。次いで、改変バージョンのpBYDS03クローニングベクター（Life Technologies USA）とBamHIおよびKpnIクローニング部位以外および以内で40〜50bpだけ重複するECD特異的オリゴヌクレオチドを使用して、前工程からのPCR産物100ngを増幅させ、エレクトロポレーション毎に合計少なくとも12μgのDNAを生成した。両方のPCRは、OneTaq 2×PCR master mix（New England Biolabs, USA）を使用したポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によるものであった。PCR精製キット（Qiagen, Germany）を使用して第二のPCR産物を精製し、滅菌脱イオン水に再懸濁した。ライブラリー挿入を準備するために、改変された酵母ディスプレイバージョンのベクターpBYDS03をBamHIおよびKpnI制限酵素（New England Biolabs, USA）で消化し、そして、大きなベクター断片をゲル精製して、滅菌脱イオン水に溶解させた。エレクトロポレーション毎にライブラリーDNA 12μgと線状ベクター4μgを総容量50μlの脱イオンおよび滅菌水中で混合することによって、次の工程のためのエレクトロポレーション可能なDNAを生成した。標的化ライブラリーを生成するための別の方法は、縮重コドンを含有するオリゴヌクレオチドを用いて標的ECDの部位特異的変異誘発（Multisite kit, Agilent, USA）を行うことであった。このアプローチを使用して、変異誘発のためのDNAの特異的なストレッチのみを標的化するサブライブラリーを生成した。これらの場合、選択工程に進む前にサブライブラリーを混合した。一般に、ライブラリーサイズは、10×107〜10×108個のクローンの範囲であったが、ただし、サブライブラリーは、10×104〜10×105個の範囲でしかなかった。大きなライブラリーおよびサブライブラリーをCD80、ICOSL、CD86およびNKp30について生成した。サブライブラリーをCD80、ICOSLおよびNKp30について生成した。
B．ランダムライブラリー
また、ランダムライブラリーを構築して、CD80（SEQ ID NO:28）、CD86（SEQ ID NO: 29）、ICOSL（SEQ ID NO:32）およびNKp30（SEQ ID NO:54）のECDのバリアントを同定した。野生型ECDをコードするDNAを、改変された酵母ディスプレイベクターpBYDS03のBamHI制限部位とKpnI制限部位との間にクローニングし、いくつかの場合には、同じ制限酵素を使用してDNAを切り離した。次いで、ライブラリーバリアント当たり平均3〜5つのアミノ酸変化を生成するために、切り離したDNAまたは未消化のプラスミドをGenemorph II kit（Agilent, USA）で変異誘発させた。次いで、変異誘発させたDNAを2工程PCRによって増幅させ、標的化ライブラリーについて上記のとおりさらに処理した。
実施例2
酵母へのDNAライブラリーの導入
実施例2は、酵母へのCD80、CD86、ICOSL、およびNKp30 DNAライブラリーの導入を記載する。
縮重およびランダムライブラリーDNAを酵母に導入するために、酵母BJ5464系統（ATCC.org；ATCC number 208288）のエレクトロポレーションコンピテントセルを調製し、そして、上の工程からのエレクトロポレーション可能なDNAを用いてGene Pulser II（Biorad, USA）で基本的には記載のとおりエレクトロポレーションした（Colby, D.W. et al. 2004 Methods Enzymology 388, 348-358）。唯一の例外は、改変プラスミドpBYDS03によって担持されるLEU2選択マーカーに対応するために形質転換細胞を非誘導最小選択SCD-Leu培地中で成長させたことであった。
ライブラリーサイズは、新たに回収した細胞の段階希釈物をSCD-Leu寒天プレート上にプレーティングし、次いで、1プレート当たり少なくとも50個のコロニーを生成したプレーティング由来の単一コロニーの数からライブラリーサイズを推定することによって決定した。エレクトロポレーションした培養物の残りを飽和まで成長させ、そして、この培養物に由来する細胞を同じ培地中でもう一度継代培養して、非形質転換細胞の画分を最小限に抑えた。ライブラリーの多様性を維持するために、計算したライブラリーサイズよりも少なくとも10×以上の細胞を含有した接種源を使用してこの継代培養工程を行った。第二の飽和培養物に由来する細胞を、滅菌25％（重量/体積）グリセロールを含有する新鮮培地に10×1010個/mlの密度に再懸濁して、-80℃で凍結および貯蔵した（凍結ライブラリーストック）。
SCD-Leu培地1リットルは、クエン酸ナトリウム二水和物14.7グラム、クエン酸一水和物4.29グラム、デキストロース20グラム、Difcoブランドの酵母用ニトロゲンベース6.7グラム、およびロイシン不含の酵母用合成ドロップアウト培地サプリメント1.6グラムからなる。0.2μMの真空濾過装置を使用して、使用前に培地を滅菌濾過した。
ライブラリーサイズは、新たに回収した細胞の希釈物をSCD-Leu寒天プレート上にプレーティングし、次いで、1プレート当たり少なくとも50個のコロニーを生成したプレーティング由来の単一コロニーの数からライブラリーサイズを推定することによって決定した。
2つ以上の異なるライブラリークローンを含有する細胞からプラスミドを分離するために、ライブラリーサイズの10倍に相当する数の細胞をSCD-Leu一晩培養物から採取し、新鮮SCD-Leu培地中に1/100に継代培養し、そして、一晩成長させた。この一晩培養物に由来する細胞を、滅菌25％（重量／体積）グリセロールに1010個/mlの密度に再懸濁して、-80℃で凍結および貯蔵した（凍結ライブラリーストック）。
実施例3
酵母の選択
実施例3は、CD80、CD86、ICOSL、およびNKp30の親和性が改変されたバリアントを発現する酵母の選択を記載する。
ライブラリーサイズの少なくとも10倍に等しい数の細胞を、個々のライブラリーストックから解凍し、非誘導SCD-Leu培地中0.1×106個の細胞/mlに懸濁し、そして、一晩成長させた。翌日、ライブラリーサイズの10倍に等しい数の細胞を2000 RPMで2分間遠心分離し、誘導SCDG-Leu培地中0.5×106個の細胞/mlに再懸濁した。SCDG-Leu誘導培地1リットルは、水に溶解させて0.22μmの膜濾過装置に通して滅菌した、Na2HPO4 5.4グラム、NaH2PO4*H20 8.56グラム、ガラクトース20グラム、デキストロース2.0グラム、Difco酵母用ニトロゲンベース6.7グラム、およびロイシン不含の酵母用合成ドロップアウト培地サプリメント1.6グラムからなる。培養物を20℃で2日間成長させて、酵母細胞表面でライブラリータンパク質の発現を誘導した。
細胞を磁気ビーズで処理して、非結合剤を還元し、外因性組換えカウンター構造体タンパク質（同族結合パートナー）に結合する能力を有する全てのCD80、CD86、ICOSL、またはNKp30バリアントを富化させた。例えば、酵母にディスプレイされた標的化またはランダムCD80ライブラリーをCD28、CTLA-4、PD-L1に対して選択した。ICOSLライブラリーをICOSに対して選択し、CD28およびNKp30ライブラリーをB7-H6に対して選択した。これに続いて、外因性同族結合パートナータンパク質染色を使用した2〜3ラウンドの蛍光活性化細胞選別（FACS）を行って、改善された結合剤をディスプレイする酵母細胞の画分を富化させた。磁気ビーズ富化およびフローサイトメトリーによる選択は、基本的には、Keith D. Miller,1 Noah B. Pefaur,2 and Cheryl L. Baird1 Current Protocols in Cytometry 4.7.1-4.7.30, July 2008 に記載のとおりである。
CD80、CD86、ICOSL、およびNKp30ライブラリーと共に、標的リガンドタンパク質は、以下のとおりR&D Systems（USA）から供給された：ヒトrCD28.Fc（すなわち、組換えCD28-Fc融合タンパク質）、rPDL1.Fc、rCTLA4.Fc、rICOS.Fc、およびrB7H6.Fc。磁気ストレプトアビジンビーズをNew England Biolabs, USAから得た。同族結合パートナータンパク質のビオチン化のために、ビオチン化キット（cat# 21955, Life Technologies, USA）を使用した。2色フローサイトメトリーソーティングのために、Becton Dickinson FACS Aria II sorterを使用した。CD80、CD86、ICOSL、またはNKp30ディスプレイレベルを、Alexafluor 488（Life Technologies, USA）で標識した抗ヘマグルチニンタグ抗体でモニタリングした。リガンド結合Fc融合タンパク質rCD28.Fc、rCTLA4.Fc、rPDL1.Fc、rICOS.Fc、またはrB7-H6.Fcを、PEコンジュゲートヒトIg特異的ヤギFab（Jackson ImmunoResearch, USA）で検出した。二重酵母を前方散乱（FSC）／側方散乱（SSC）パラメーターを使用してゲーティングし、そして、ソートゲートは、FL2で検出されたより高いリガンド結合に基づいており、FL1でより限定されたHAタグ発現結合を保有した。
フローサイトメトリーソートからの酵母アウトプットを、より高い特異的結合親和性についてアッセイした。ソートアウトプット酵母を増殖および再誘導して、これらがコードする特定のIgSF親和性改変ドメインバリアントを発現させた。次いで、この集団を、フローサイトメトリーによって、親の野生型酵母系統、またはビーズアウトプット酵母集団のような任意の他の選択されたアウトプットと比較することができる。
ICOSLについて、各集団を、抗HA（ヘマグルチニン）タグ発現および抗ヒトFc二次で二重染色してリガンド結合を検出することによって、各rICOS.Fc、rCD28.Fc、およびrCTLA4.Fcの結合について第二のソートアウトプット（F2）を親ICOSL酵母と比較した。
ICOSに対する結合性について選択されたICOSL酵母バリアントの場合、F2ソートアウトプットは、5.6nM rICOS.Fcで染色したとき平均蛍光強度（MFI）値997を与えたが、一方で、親ICOSL系統のMFIは、同じ濃度のrICOS.Fcで染色したとき397と測定された。これは、このF2で選択されたクローンのプールでおおまかに3倍の平均結合の改善を表し、そして、個別に試験したときに、そのプールからの個々のクローンがはるかに良好な改善されたMFI/親和性を有すると予測される。
CD28に対する結合性について選択されたICOSL酵母バリアントの場合、F2ソートアウトプットは、100nM rCD28.Fcで染色したときMFI値640を与えたが、一方で、親ICOSL系統のMFIは、同じ濃度のrCD28.Fcで染色したとき29と測定された（22倍改善）。CTLA4に対する結合性について選択されたICOSL酵母バリアントの場合、F2ソートアウトプットは、100nM rCTLA4.Fcで染色したときMFI値949を与えたが、一方で、親ICOSL系統のMFIは、同じ濃度のrCTLA4.Fcで染色したとき29と測定された（32倍改善）。
B7-H6に対する結合性について選択されたNKp30酵母バリアントの場合、F2ソートアウトプットは、16.6nM rB7H6.Fcで染色したときMFI値533を与えたが、一方で、親NKp30系統のMFIは、同じ濃度のrB7H6.Fcで染色したとき90と測定された（6倍改善）。
同定されたNKp30バリアントの中には、SEQ ID NO:54に示される位置に対応するNKp30 細胞外ドメイン内の位置を参照して変異L30V/A60V/S64P/S86Gを含有したバリアントがあった。同定されたCD86バリアントの中には、SEQ ID NO:29に示される位置に対応するCD86細胞外ドメイン内の位置を参照して変異Q35H/H90L/Q102Hを含有したバリアントがあった。
重要なことに、上記の全てのF2アウトプットのMFIは、FL1にて抗HAタグ抗体を用いて測定したとき、野生型系統と比較して増加することなく、時に低下した場合もあったが、このことは、向上した結合性が選択されたバリアントの酵母の表面での増加した発現の関数ではなかったことを示しており、そして、高いリガンド結合を有する中から低エクスプレッサーのみを選択するゲーティング戦略を検証した。
実施例4
Fc融合物としてのおよび種々の免疫調節タンパク質タイプにおける選択アウトプットの再編成
実施例4は、Fc分子に融合されたCD80またはICOSLの親和性が改変された（バリアント）細胞外ドメイン（ECD）（バリアントECD-Fc融合分子）を含有する免疫調節タンパク質としての選択アウトプットの再編成を記載する。
最終フローサイトメトリーCD80およびICOSLソートからのアウトプット細胞をSCD-Leu培地中末端密度まで成長させた。各アウトプットからのプラスミドDNAを、酵母プラスミドDNA単離キット（Zymo Research, USA）を使用して単離した。Fc融合物について、選択したFc融合ベクターへのクローニングに好適な制限部位を付加したPCRプライマーを使用して、プラスミドDNAプレップから変異標的ECDのコーディングDNAをバッチ増幅させた。制限消化後、PCR産物を、適切なFc融合ベクターにライゲーションし、続いて、XL1 Blue系統大腸菌（Agilent, USA）またはNEB5α（New England Biolabs, USA）に供給者の指示どおり化学形質転換した。例示的なFc融合ベクターは、pFUSE-hIgG1-Fc2（Invivogen, USA）である。
形質転換反応の希釈物を、100μg/mlカルベニシリン（Teknova, USA）を含有するLB-寒天上にプレーティングして、単一コロニーを生成した。次いで、各形質転換からの最大96個のコロニーを、96ウェルプレート内、LB-ブロス（Teknova cat # L8112）中37℃で一晩飽和まで成長させ、そして、全てのクローン中の変異を同定するために各ウェルからの小アリコートをECDインサートのDNAシークエンシングに送った。サービス提供会社（Genewiz；South Plainfield, NJ）によって提供されるプロトコールを使用して、DNAシークエンシング用の試料調製を行った。DNAシークエンシング用の試料を取り出した後、次いで残りの培養物にグリセロールを最終グリセロール含量25％まで加え、そして、後で使用するためプレートをマスタープレート（以下参照）として-20℃で貯蔵した。あるいは、DNAシークエンシング用の試料を、成長させた液体培養物から固体寒天プレートへのディスポーザブル96ウェルレプリケーター（VWR, USA）を使用したレプリカプレーティングによって生成した。これらのプレートを一晩インキュベートして成長パッチを生成し、そして、プレートをGenewizに規定されているとおりGenewizに送った。
Genewizで生成されたDNAシークエンシングデータの分析からの関心対象のクローンの同定後、関心対象のクローンをマスタープレートから回収し、100μg/mlカルベニシリン（Teknova, USA）を含有する液体LB-ブロス5ml中で密度まで個々に成長させ、次いで、各培養物2mlを、Pureyield kit（Promega）のような標準キットを使用する各クローンの約10μgのミニプレッププラスミドDNAの調製に使用した。関心対象のクローンの同定は、一般に、以下の工程を包含した。最初に、DNA配列データファイルをGenewizウェブサイトからダウンロードした。次いで、ECDコード領域の開始点で始まるように全ての配列を手動で処理した。次いで、URL:www.ebi.ac.uk/Tools/st/emboss_transeq/.で利用可能な好適なプログラムを使用して、処理した配列をバッチ翻訳した。次いで、翻訳した配列を、URL:multalin.toulouse.inra.fr/multalin/multalin.htmlで利用可能な好適なプログラムを使用してアライメントさせた。あるいは、Genewizで決定された配列を加工して、Ugeneのソフトウェア（http://ugene.net）を用いてアライメントを生成した。
次いで、関心対象のクローンを以下の基準を使用して同定した：1.）同一のクローンがアライメント中に少なくとも2回生じる、および2.）変異がアライメント中に少なくとも2回、好ましくは別個のクローンで生じる。これらの基準のうちの少なくとも1つを満たしたクローンは、おそらく改善された結合に起因して本発明者らのソーティングプロセスによって富化されたクローンであった。
方法は、以下のとおり設計されたタンパク質をコードするコーディングDNAを生成し、少なくとも1つの親和性改変ドメインを有するCD80またはICOSLのECDを含有する免疫調節タンパク質を生成した：シグナルペプチド、続いてバリアント（変異）ECD、続いて3つのアラニン（AAA）のリンカー、続いて変異N297G（SEQ ID NO:226に示される野生型ヒトIgG1 Fcに関してはN82G）を含有するヒトIgG1 Fc（SEQ ID NO:2084に示される）。当該ヒトIgG1 Fcは、変異R292CおよびV302C（SEQ ID NO:226に示される野生型ヒトIgG1 Fcに関してはR77CおよびV87Cに対応する）も含有した。その構築物は、システインと共有結合を形成することができる抗体軽鎖を含まないので、ヒトIgG1 Fcはまた、EUナンバリングによる220位におけるシステイン残基のセリン残基への置換（C220S）（SEQ ID NO:226に示される野生型または未改変のFcに関する5位におけるシステイン残基のセリン残基への置換（C5S）に対応する）を含有した。
加えて、以下の実施例8は、一緒に連結されFcに縮合された同定バリアントCD80、CD86、ICOSL、およびNKp30分子に由来する少なくとも2つの異なる親和性改変ドメインを含有するスタック構築物として生成されたさらなる免疫調節タンパク質を記載する。
実施例5
Fc融合物の発現および精製
実施例5は、上記の実施例で記載したとおりのバリアントECD CD80、CD86、ICOSL、およびNKp30を含有するFc融合タンパク質のハイスループット発現および精製を記載する。
組換えバリアントFc融合タンパク質を、Expi293発現系（Invitrogen, USA）を用いて浮遊培養に適応したヒト胚性腎細胞（HEK）293から生産した。先の工程からの各プラスミドDNA 4μgをOpti-MEM（Invitrogen, USA）200μlに加え、同時に、ExpiFectamine 10.8μlを別のOpti-MEM 200μlに別々に加えた。5分後、プラスミドDNA 200μlをExpiFectamine 200μlと混合し、この混合物を細胞に加える前に追加で20分間さらにインキュベートした。1000万個のExpi293細胞を、10mlの滅菌円錐底ディープ24ウェル成長プレート（Thomson Instrument Company, USA）の別々のウェルのExpi293培地（Invitrogen, USA）容量3.4ml中に分注した。プレートを、湿度95％および8％CO2に設定された哺乳動物細胞培養インキュベーター内、120RPMで5日間振盪した。5日間のインキュベーション後、細胞をペレット化し、培養上清を保管した。
ハイスループット96ウェルタンパク質A精製キット（Catalog number 45202, Life Technologies, USA）を使用し製造業者のプロトコールを使用して、上清からタンパク質を精製した。得られた溶出分画を、Zeba 96 well spin desalting plate（Catalog number 89807, Life Technologies, USA）を使用し製造業者のプロトコールを使用して、PBSに緩衝液交換した。Nanodrop instrument（Thermo Fisher Scientific, USA）によって測定した280nmの吸光度を使用して、精製したタンパク質を定量し、そして、タンパク質5μgを変性および還元条件下のNUPAGEプレキャストポリアクリルアミドゲル（Life Technologies, USA）上にロードし、その後ゲル電気泳動することによってタンパク質純度を評価した。標準的なクマシー染色を使用してゲル中でタンパク質を可視化した。
実施例6
親和性成熟されたIgSFドメイン含有分子の結合および活性の評価
A．細胞表面に発現している同族結合パートナーに対する結合性
この実施例は、同族結合パートナーに対するCD80およびICOSLドメインバリアント免疫調節タンパク質の特異性および親和性を評価するための、上記実施例からの精製されたタンパク質のFc融合物結合試験を記載する。
同族結合パートナーを発現する細胞を生産するため、ヒトCD28、CTLA4、PD-L1、ICOS、およびB7-H6の各々についての全長哺乳動物表面発現構築物は、pcDNA3.1発現ベクター（Life Technologies）中で設計されており、これはGenscript, USAから供給された。上記のExpi293F一過性トランスフェクション系（Life Technologies, USA）を使用して結合試験を行った。実験に必要な細胞数を決定し、そして、製造業者の推奨プロトコールを使用して、適切な30mlスケールのトランスフェクションを実施した。CD28、CTLA-4、PD-L1、ICOS、B7-H6またはモックの30mlトランスフェクション毎に、7500万個のExpi293F細胞を発現構築物DNA 30μgおよび希釈したExpiFectamine 293試薬1.5mlと48時間インキュベートし、その時点で染色用に細胞を収集した。
フローサイトメトリーによる染色のために、適切な一過性トランスフェクションまたは陰性対照の200,000個の細胞を96ウェル丸底プレート中にプレーティングした。細胞をスピンダウンし、染色緩衝液（PBS（リン酸緩衝食塩水）、1％BSA（ウシ血清アルブミン）、および0.1％アジ化ナトリウム）中に20分間再懸濁して、非特異的結合をブロッキングした。その後、細胞を再度遠心分離し、これを、50μlの各候補CD80バリアントFc、ICOSLバリアントFc、またはスタックされたIgSFバリアントFc融合タンパク質の実験に応じて、100nM〜1nMのバリアント免疫調節タンパク質を含有する染色緩衝液に再懸濁した。一次染色を氷上で45分間実施した後、染色緩衝液中で細胞を2回洗浄した。PEコンジュゲート抗ヒトFc（Jackson ImmunoResearch, USA）を染色緩衝液50μl中1:150に希釈し、細胞に加えて氷上でさらに30分間インキュベートした。二次抗体を2回洗い流し、細胞を4％ホルムアルデヒド／PBS中で固定し、そして、FACScan flow cytometer（Becton Dickinson, USA）で試料を分析した。
トランスフェクタントおよび陰性親系統毎に、Cell Quest Pro software（Becton Dickinson, USA）で平均蛍光強度（MFI）を計算した。
B．生物活性の特性決定
この実施例は、ヒト初代T細胞インビトロアッセイにおけるFc融合バリアントタンパク質の生物活性の特性決定をさらに記載する。
1．混合リンパ球反応（MLR）
可溶性rICOSL.FcまたはrCD80.Fcの生物活性をヒト混合リンパ球反応（MLR）で試験した。PBMC（BenTech Bio, USA）から単離された単球をEx-Vivo 15培地（Lonza, Switzerland）中500U/ml rIL-4（R&D Systems, USA）および250U/ml rGM-CSF（R&D Systems, USA）とインビトロで7日間培養することによって、ヒト初代樹状細胞（DC）を生成した。10,000個の成熟DCおよび100,000個の精製同種CD4+T細胞（BenTech Bio, USA）を、96ウェル丸底プレート内、最終容量200μlのEx-Vivo 15培地中でICOSLバリアント融合タンパク質、CD80バリアントFc融合タンパク質、または対照と共培養した。5日目に、Human IFN-gamma Duoset ELISA kit（R&D Systems, USA）を使用して培養上清中のIFN-γ分泌を分析した。VMax ELISA Microplate Reader（Molecular Devices, USA）によって光学密度を測定し、IFN-gamma Duo-set kit（R&D Systems, USA）に含まれる用量設定したrIFN-γ標準に対して定量した。
2．抗CD3同時固定アッセイ
ICOSL融合タンパク質およびCD80 Fc融合バリアントの共刺激生物活性を抗CD3同時固定アッセイで決定した。1nMまたは4nMのマウス抗ヒトCD3（OKT3, Biolegends, USA）を、PBS中1nM〜80nM rICOSL.FcまたはrCD80.Fcバリアントタンパク質で希釈した。この混合物を、組織培養処理平底96ウェルプレート（Corning, USA）に一晩加え、プレートのウェルへの刺激タンパク質の結合を促進した。翌日、未結合のタンパク質をプレートから洗い出し、100,000個の精製ヒトpan T細胞（BenTech Bio, US）またはヒトT細胞クローンBC3（Astarte Biologics, USA）を、各ウェル内、最終容量200μlのEx-Vivo 15培地（Lonza, Switzerland）に加えた。細胞を3日間培養した後、培養上清を収集し、上に述べたとおりDuoset ELISA kit（R&D Systems, USA）でヒトIFN-γレベルを測定した。
C．結果
例示的な試験バリアントについての結合および活性試験の結果を表12〜15に示す。特に、表12は、それぞれの同族構造体CD28に対する親和性成熟のスクリーニングにおいて選択されたCD80のECDにおける例示的なIgSFドメインアミノ酸置換（交換）を示す。表13は、それぞれの同族構造体PD-L1に対する親和性成熟のスクリーニングにおいて選択されたCD80のECDにおける例示的なIgSFドメインアミノ酸置換（交換）を示す。表14は、それぞれの同族構造体ICOSおよびCD28に対する親和性成熟のスクリーニングにおいて選択されたICOSLのECDにおける例示的なIgSFドメインアミノ酸置換（交換）を示す。表毎に、例示的なアミノ酸置換は、以下のとおり、それぞれの参照未改変ECD配列に対応するアミノ酸位置番号によって示される。例えば、表12および13中の参照未改変ECD配列は、SEQ ID NO:28に示される未改変のCD80 ECD配列であり、そして、表14中の参照未改変ECD配列は、未改変ICOSL ECD配列（SEQ ID NO:32）である。アミノ酸位置が中央に示され、当該番号の前に、対応する未改変（例えば、野生型）アミノ酸が記載され、当該番号の後に、同定されたバリアントアミノ酸置換が記載される。列2は、バリアントECD-Fc融合分子毎のバリアントECDのSEQ ID NO識別子を示す。
また、同族結合パートナーリガンドを発現するように改変された細胞への各バリアントFc融合分子の結合についての平均蛍光強度（MFI）値と、同じ細胞が発現する同族結合パートナーリガンドへのアミノ酸置換を含有しない対応する未改変のECD-Fc融合分子の結合と比較したMFIの比とによって測定された場合の、結合活性が示される。また、i）抗CD3と同時固定された表示のバリアントECD-Fc融合分子またはii）MLRアッセイ中の表示のバリアントECD-Fc融合分子のいずれかで生成された、培養上清中のIFN-γの計算値（pg/ml）に基づく、T細胞の活性を調節するバリアントFc融合分子の機能活性も示される。また、表は、両方の機能性アッセイにおいて対応する未改変のECD-Fcと比較した、各バリアントECD-Fcによって生産されたIFN-γの比も示す。
示されるとおり、選択は、少なくとも1つ、いくつかの場合では複数の同族結合パートナーリガンドに対する向上した結合性を示すように親和性が改変された多数のCD80またはICOSL IgSFドメインバリアントの同定をもたらした。加えて、その結果は、バリアント分子の親和性改変がまた、当該分子のフォーマットに応じて免疫活性を増強および低下させる改善された活性を示したことを示した。例えば、リガンドの同時固定は、おそらく、アミノ酸交換を含有しない未改変（例えば、野生型）のECD-Fc分子と比較して、細胞との多価相互作用を提供してクラスター化するか、またはアゴニスト活性を有利にするアビディティを向上させて、T細胞活性化を向上させる。しかしながら、分子が溶液で二価Fc分子として提供されるとき、同じIgSFドメインバリアントは、アミノ酸交換を含有しない未改変（例えば、野生型）のECD-Fv分子と比較して、T細胞活性化を低下させるアンタゴニスト活性を示した。
（表１２）CD28に対して選択されたCD80バリアント。分子配列、結合データ、および共刺激生物活性データ。
Figure 2020500010
Figure 2020500010
（表１３）PD-L1に対して選択されたCD80バリアント。分子配列、結合データ、および共刺激生物活性データ。
Figure 2020500010
Figure 2020500010
（表１４）CD28またはICOSに対して選択されたICOSLバリアント。分子配列、結合データ、および共刺激生物活性データ。
Figure 2020500010
Figure 2020500010
*:親に対する比率は、WT ICOSLについての346pg/ml IFN-γを使用して計算された
実施例7
リガンド結合競合アッセイ
実施例6に示されるとおり、いくつかのCD80バリアント分子は、CD28およびPD-L1の一方または両方に対する改善された結合性を示した。リガンドCD28およびPD-L1へのCD80の結合活性をさらに評価するため、この実施例は、CD28およびPD-L1の両方に結合する例示的なCD80バリアントの非競合性を評価するリガンド競合アッセイを記載する。
CD28およびPD-L1に同時に結合するCD80の能力を評価するために、プレートに結合したCD80バリアントA91G ECD-Fcを組み込んだELISAベースの結合アッセイを設定した。PBS中の100nMヒト組換えCD80バリアントA91G ECD-Fc融合タンパク質でMaxisorp 96ウェルELISAプレート（Nunc, USA）を一晩コートした。翌日、未結合タンパク質を洗い流し、そして、1％ウシ血清アルブミン（Millipore, USA）/PBSを用いて室温で1時間プレートをブロッキングした。このブロッキング試薬をPBS/0.05％Tweenで3回洗い流した。洗浄毎にプラットフォーム振盪器上での2分間のインキュベーションを含めた。
競合アッセイの一方のアームでは、CD80をCD28とインキュベートした後、次いで、他の公知のCD80同族結合パートナーPD-L1もしくはCTLA-4または陰性対照リガンドPD-L2のいずれかの存在下でCD28結合CD80を競合的結合について評価した。具体的には、ビオチン化組換えヒトCD28 Fc融合タンパク質（rCD28.Fc；R&D Systems）を、ウェル内、25μl容量中10nMで開始して、1:2希釈で8点希釈することで用量漸増した。ビオチン化rCD28.Fcを加えた直後に、未標識競合結合剤の組換えヒトPD-L1単量体hisタグ化タンパク質、組換えヒトCTLA-4単量体hisタグ化タンパク質、または陰性対照ヒト組換えPD-L2 Fc融合タンパク質（R&D Systems）を、それぞれ25μl容量中2000/1000/500nMで、最終容量50μlでウェルに加えた。これらのタンパク質を一緒に1時間インキュベートした後、上記のとおりの3回の洗浄工程を繰り返した。
洗浄後、1ウェル当たり2.5ngのHRPコンジュゲートストレプトアビジン（Jackson Immunoresearch, USA）を1％BSA/PBS中で希釈してウェルに加え、結合したビオチン化rCD28.Fcを検出した。1時間のインキュベーション後、ウェルを再度上記のとおり3回洗浄した。シグナルを検出するために、洗浄に続いてTMB基質（Pierce, USA）50μlをウェルに加え、7分間インキュベートした後に2M硫酸停止溶液50ulを加えた。光学密度をEmax Plus microplate reader（Molecular Devices, USA）で決定した。光学密度値をPrism（Graphpad, USA）でグラフ化した。
結果を図1Aに示す。結果は、rCD28.Fcの用量漸増に伴うCD80バリアントA91G ECD-Fc融合タンパク質へのビオチン化rCD28.Fcの低下した結合性を示した。rCD28.Fc結合が非競合対照タンパク質rPDL2の存在下で起こったとき、CD80に対するCD28結合の減少はなかった（黒三角）。対照的に、競合対照タンパク質rCTLA-4は、CD28.Fcとインキュベートしたとき、予想のとおりCD80に対して減少したCD28結合をもたらした（x線）。組換えPD-L1をCD28.Fcとインキュベートしたとき、CD80へのCD28結合の減少は観察されず、このことは、CD80に対するCD28およびPD-L1のエピトープが非競合的であることを実証した。CD80へのCD28競合アッセイにおいて使用された組換えPD-L1タンパク質の結合は、ビオチン化PD-L1を非ビオチン化rCD28.Fcの存在下でインキュベートすることによって確認された（四角）。
また、CD80をPD-L1とインキュベートした逆競合を設定した後、次いで、PD-L1結合CD80を、他の公知のCD80同族結合パートナーCD28もしくはCTLA-4または陰性対照リガンドPD-L2のいずれかの存在下での競合的結合について評価した。具体的には、ビオチン化組換えヒトPD-L1-his単量体タンパク質を組換えCD80バリアントを含有するウェルに用量漸増することによってアッセイを実施した。このリガンドとは結合が弱いので、用量漸増を、25μL中5000nMで開始して同様の8点の1:2希釈を行った。結合を検出するためにrPD-L1-hisを使用したとき、競合リガンドヒトrCD28.Fc、ヒトrCTLA-4.Fc、またはヒトrPD-L2.Fc対照を、総容量50μlで25μl中2.5nMの最終濃度で加えた。その後の洗浄、検出、およびOD測定は、上記と同じであった。
結果を図1Bに示す。用量漸増したPD-L1-his結合単独は、プレート上に固定されたCD80バリアントA91G ECD-Fc融合分子にPD-L1が結合したことを確認した（四角）。PD-L1-his結合が非競合対照タンパク質rPDL2の存在下で起こったとき、CD80に対するPD-L1結合の減少はなかった（三角）。CD28競合対照タンパク質rCTLA-4は、PD-L1-hisとインキュベートしたとき、CTLA-4はCD28に対して競合的であるにもかかわらず、CD80に対して減少したPD-L1結合をもたらさなかった（x線）。この結果は、CD80結合に対してのCD28とPD-L1との間の競合の欠如をさらに実証した。最後に、PD-L1-hisをCD28.Fcとインキュベートしたとき、CD80へのPD-L1結合の減少が観察されず、このことは、CD80に対するCD28およびPD-L1のエピトープが非競合的であることを実証した。
したがって、結果は、CTLA-4はCD80へのCD28の結合に対して競合したが、PD-L1または陰性対照PD-L2は競合しなかったこと（図1A）、およびCD28、CTLA-4、およびPD-L2は、CD80へのPD-L1の結合に対して競合しなかったこと（図1B）を示した。したがって、これらの結果は、CD28およびPD-L1がCD80の非競合結合剤であること、および、リガンドがELISAで検出されるかに関係なくこの非競合的結合を実証できることを実証した。
実施例8
異なる親和性改変ドメインを含有するスタックされた分子の作製および評価
1つまたは複数の同族結合パートナーに対する親和性が改変された上記の選択されたバリアント分子を使用して、2つ以上の親和性改変IgSFドメインを含有する「スタック」分子（すなわち、II型免疫調節タンパク質）を作製した。ギブソンアセンブリキット(New England Biolabs)を使用した標準的なギブソンアセンブリによるFcへのその融合を可能にするフォーマットのスタックをコードする遺伝子ブロック(Integrated DNA Technologies, Coralville, IA)としてスタック構築物を得た。上記の通り、この実施例は、Fc融合フォーマットの親和性改変ドメインを含有する分子の結合および活性を例示する；2つ以上の親和性改変ドメインを含有するそのようなスタック分子は、記載の通りの分泌性免疫調節タンパク質または膜貫通型免疫調節タンパク質と関連付けられることが企図される。
以下のとおり設計されたタンパク質をコードする全てのスタックのコーディング核酸分子を生成した：シグナルペプチド、続いて関心対象の第一のバリアントIgV、続いて3つのGGGGS（G4S）モチーフから構成される15アミノ酸リンカー（SEQ ID NO:228）、続いて関心対象の第二のIgV、続いて2つのGGGGSリンカー（SEQ ID NO: 229）、続いて3つのアラニン（AAA）、続いて上記のとおりのヒトIgG1 Fc。各スタックにおけるIgVドメインの正確なホールディングの可能性を最大限にするため、第一のIgVの前に、通常野生型タンパク質で生じる全ての残基をこのIgVとシグナルペプチド（リーディング配列）との間に置く。同様に、第一のIgVの後に、通常該IgVを野生型タンパク質中で次のIgドメイン（典型的には、IgCドメイン）またはこのような第二のIgVドメインが存在しない場合は該IgVを膜貫通ドメイン（トレーリング配列）に接続する残基のいずれかに接続する全ての残基が続く。両方のIgVドメインが同じ親タンパク質由来であった（例えば、別のCD80 IgVでスタックされたCD80 IgV）場合は両方の間のリンカーが繰り返し存在しなかったこと以外は、同じ設計原理を第二のIgVドメインに適用した。
表15は、例示的なスタックされた構築物の設計を示す。表15に示される例示的なスタック分子は、表示のとおりのIgVドメインおよびさらに上記のとおりのリーディングまたはトレーリング配列を含有する。表には、以下の成分が次の順序で存在する：シグナルペプチド（SP; SEQ ID NO:225）、IgVドメイン1（IgV1）、トレーリング配列1（TS1）、リンカー1（LR1; SEQ ID NO:228）、IgVドメイン2（IgV2）、トレーリング配列2（TS2）、リンカー2（LR2; SEQ ID NO:230）およびFcドメイン（C5S/N82Gアミノ酸置換を含有するSEQ ID NO:226）。いくつかの場合では、リーディング配列1（LS1）は、シグナルペプチドとIgV1の間に存在し、いくつかの場合では、リーディング配列2（LS2）は、リンカーとIgV2の間に存在する。
（表１５）例示的なスタックされた構築物の成分のアミノ酸配列（SEQ ID NO）
Figure 2020500010
Figure 2020500010
Figure 2020500010
Figure 2020500010
Figure 2020500010
Figure 2020500010
Figure 2020500010
Figure 2020500010
Figure 2020500010
Figure 2020500010
少なくとも1つの親和性改変IgVドメインを含有するCD80、CD86、ICOSLまたはNkp30に由来するバリアントIgVドメインの種々の組み合わせを含有するバリアントのIgVがスタックされたFc融合分子のハイスループット発現および精製を、実施例5に記載のとおり行った。また、バリアントのIgVがスタックされたFc融合分子のそれぞれの同族結合パートナーに対する結合性および抗CD3同時固定アッセイによる機能活性を実施例6に記載されるとおり評価した。例えば、スタックされたIgSF Fc融合タンパク質の共刺激生物活性を上記と同様の固定化抗CD3アッセイで決定した。この場合、4nMの抗CD3（OKT3, Biolegend, USA）を、組織培養処理96ウェルプレート（Corning, USA）上で4nM〜120nMのヒトrB7-H6.Fc（R&D Systems, USA）またはヒトrPD-L1.Fc（R&D Systems, USA）と一晩同時固定した。翌日、未結合タンパク質をPBSで洗い出し、そして、100,000個の精製したpan T細胞を各ウェルのEx-Vivo 15培地（Lonza, Switzerland）100ulに加えた。その後、スタックされたIgSFドメインを100ulの容量中8nM〜40nMの濃度で合計200ulの容量で加えた。細胞を3日間培養した後、培養上清を収集し、上に述べたとおりDuoset ELISA kit（R&D Systems, USA）でヒトIFN-γレベルを測定した。
結果を表16〜20に示す。具体的には、表16は、NKp30 IgVドメインおよびICOSL IgVドメインを含有するバリアントのIgVがスタックされたFc融合分子についての結合および機能活性結果を示す。表17は、NKp30 IgVドメインおよびCD80またはCD86 IgVドメインを含有するバリアントのIgVがスタックされたFv融合分子についての結合および機能活性結果を示す。表18は、バリアントCD80 IgVドメインおよびCD80、CD86、またはICOSL IgVドメインを含有するバリアントのIgVがスタックされたFc融合分子についての結合および機能活性結果を示す。表19は、2つのバリアントCD80 IgVドメインを含有するバリアントのIgVがスタックされたFc融合分子についての結合および機能活性結果を示す。表20は、バリアントCD80またはCD86 IgVドメインおよびバリアントICOSL IgVドメインを含有するバリアントのIgVがスタックされたFc融合分子についての結果を示す。
表16〜20の各々について、列1は、アミノ末端（N末端）ドメインから始まり、続いてC末端ヒトIgG1 Fcドメインの前に中央のWTまたは親和性が改変されたドメインが位置する、スタックされた、親和性が改変されたまたは野生型（WT）ドメインの構造的構成および配向を示す。列2は、それぞれの「スタック」分子中に含有される各IgVドメインの配列についてのSEQ ID NO識別子を示す。列3は結合パートナーを示しており、当該結合パートナーに対して、列1に表示されている親和性が改変されたスタックされたドメインが選択された。
また、種々の同族結合パートナーを発現するように改変された細胞への各スタック分子の結合についての平均蛍光強度（MFI）値と、同じ細胞が発現する同族結合パートナーへのアミノ酸置換を含有しない未改変IgVドメインを含有する対応するスタック分子の結合と比較したMFIの比とによって測定された場合の、結合活性が示される。また、溶液の表示のバリアントスタック分子および実施例6に記載されるとおりの抗CD3と同時固定された適切なリガンドで生成された培養上清中のIFN-γの計算レベル（pg/ml）に基づく、T細胞の活性を調節するバリアントスタック分子の機能活性も示される。また、表は、同時固定アッセイにおいて対応する未改変のスタック分子と比較した、各バリアントスタック分子によって生産されたIFN-γの比も示す。
示されるとおり、結果は、それぞれの未改変（例えば、野生型）のIgVドメインを含有する対応するスタック分子と比較して、少なくとも1つの同族結合パートナーに対して親和性が改変された向上した結合活性を示した少なくとも1つのバリアントIgSFドメインを含有するスタック分子を生成することが可能であったことを示した。いくつかの場合では、分子中の両方のバリアントIgSFドメインの一方または組み合わせのいずれかに由来するスタック分子は、複数の同族結合パートナーに対する向上した結合性を示した。結果はまた、スタックされた分子中のIgVドメインの順序が、いくつかの場合では、改善された結合活性の程度も変化させうることを示した。いくつかの場合では、標的化同時固定アッセイで評価したときに機能的T細胞活性もまた変化した。
（表１６）NKp30 IgVドメインおよびICOSL IgVドメインを含有するスタックされたバリアントIgV Fc融合タンパク質
Figure 2020500010
（表１７）NKp30 IgVドメインおよびCD80またはCD86 IgVドメインを含有するスタックされたバリアントIgV Fc融合タンパク質
Figure 2020500010
（表１８）CD80 IgVドメインおよびCD80、CD86、またはICOSL IgVドメインを含有するスタックされたバリアントIgV Fc融合タンパク質
Figure 2020500010
Figure 2020500010
Figure 2020500010
Figure 2020500010
（表１９）2つのCD80 IgVドメインを含有するスタックされたバリアントIgV Fc融合タンパク質
Figure 2020500010
Figure 2020500010
（表２０）CD80またはCD86 IgVドメインおよびICOSL IgVドメインを含有するスタックされたバリアントIgV Fc融合タンパク質
Figure 2020500010
Figure 2020500010
Figure 2020500010
実施例9
CD155の親和性改変IgSFドメインバリアントの生成、選択およびスクリーニング
CD155の親和性改変IgSFドメインバリアントを、上記実施例1〜6に実質的に記載のとおり、幾らかのわずかな修正を加えて生成した。例えば、CD155バリアントの生成について、ECDのその他の2つのドメインではなくIgVドメインのみを生成されたタンパク質中に含めた。本実施例は、Fc融合フォーマットの例示的親和性改変ドメイン（当該親和性改変ドメインは、記載されているとおりの分泌可能な免疫調節タンパク質または膜貫通型免疫調節タンパク質と関連するものを企図している）の結合および活性を例示する。
縮重コドンでの完全または部分的ランダム化によってCD155の特異的残基を標的化するライブラリーを生成するために、ヒトCD155の免疫グロブリン様V型（IgV）ドメイン（SEQ ID NO：241）についてのコーディングDNAを、Integrated DNA Technologies（Coralville, IA）から、最大80塩基対（bp）長の一連の重複オリゴヌクレオチドとして注文した。一般に、IgVドメインの多様なバリアントのライブラリーを生成するために、オリゴヌクレオチドは、所望のアミノ酸位置に所望の縮重コドンを含有した。縮重コドンを、URL：rosettadesign.med.unc.edu/SwiftLib/でのアルゴリズムを使用して生成した。一般に、変異させる位置および縮重コドンを、関心対象の標的-リガンド対を含有するこの構造から作られた結晶構造情報（PDB：3UDW）または相同性モデルから選択して、リガンド接触残基ならびにタンパク質相互作用界面にある残基を同定した。例えば、TIGITに結合したCD155の結晶構造は、タンパク質データベースコード3UDWについてURL：www.rcsb.org/pdb/explore/explore.do?structureId=3UDWで公的に利用可能である。この分析を、URL: spdbv.vital-it.ch）で利用可能な構造ビューア（structure viewer）を使用して実施した。
実施例1に記載のとおり、オリゴヌクレオチドをPCR増幅に使用して、改変された酵母提示バージョンのベクターpBYDS03への挿入のためのライブラリーDNAインサートを実質的に生成した。あるいは、最大200bp長のUltramer（Integrated DNA Technologies）をメガプライマーPCR（URL: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC146891/pdf/253371.pdf）と共に使用して、複数の小さい重複プライマーを使用して容易に組み込むことのできないより大きなストレッチの縮重コドンを生成した。メガプライマーPCRを使用した完全長産物の生成に続いて、変異IgVドメインライブラリーを、酵母への相同組換えのための改変されたpBYDS03クローニングバリアントと40bpの重複領域を含有するDNAプライマーを使用して再度PCR増幅した。DNAインサートのライブラリーを、実施例1に実質的に記載のとおりライブラリー挿入用に調製し、電気穿孔法に使用できるDNAを調製した。
別のアプローチとして、CD155のIgVドメインの特異的残基を標的とする部位特異的変異誘発によって生成されるサブライブラリーまたはCD155のIgVドメインのランダムライブラリーのいずれかを生成して、実施例1に実質的に記載のとおりCD155のIgVドメインのバリアントをさらに同定した。
縮重またはランダムライブラリーDNAを、実施例2に記載のとおり実質的に酵母に挿入した。CD155の親和性改変バリアントを発現する酵母を、実施例3に記載される方法を使用して実質的に選択した。選択のために、以下の標的リガンドタンパク質を採用した：ヒトrTIGIT.Fc（すなわち、組換えTIGIT-Fc融合タンパク質）およびrCD226.Fc。磁気プロテインAビーズをNew England Biolabs（USA）から得た。2色フローサイトメトリーソーティングのために、Bio-Rad S3eソーターを使用した。CD155提示レベルを、Alexafluor 488で標識された抗ヘマグルチニン抗体（Life Technologies, USA）でモニタリングした。Fc融合タンパク質rTIGIT.FcまたはrCD226.Fcのリガンド結合を、PEコンジュゲートヒトIg特異的ヤギFab（Jackson ImmunoResearch, USA）で検出した。二重酵母を前方散乱（FSC）/側方散乱（SSC）パラメーターを使用してゲートアウトし、ソートゲートは、FL2で検出されたより高いリガンド結合（これは、FL1でより限定されたタグ発現結合を有した）に基づいた。
第二のソートアウトプット（F2）を、実施例3に記載のとおり、より高い特異的結合親和性についてアッセイされたソートアウトプットを拡大してその発現を再誘導することによって実質的に得て、これを使用して、親の野生型酵母系統と比較した結合を評価した。CD155について、各集団を抗HA（ヘマグルチニン）タグ発現および抗ヒトFc二次で二重染色してリガンド結合を検出することによって、第二のFACSアウトプット（F2）を親CD155酵母とrTIGIT.FcまたはrCD226.Fcの結合について比較した。
選択されたアウトプットを、完全ECDドメインではなくIgVドメインのみを含むこと以外は実施例4に記載のとおり、Fc分子に融合されたCD155の親和性改変（バリアント）免疫グロブリン様V型（IgV）ドメイン（バリアントIgVドメイン-Fc融合分子）を含有する免疫調節タンパク質として実質的に再編成した。CD155アウトプットについてのいくつかの別の方法では、そのアウトプット由来のDNAを、Fc融合ベクターといずれかの端部上に40bpの重複領域を含有するプライマーでPCR増幅し、Gibson Assembly Mastermix（New England Biolabs）を使用したインビトロ組換えを行って、これをその後、大腸菌（E. Coli）系統NEB5αへの熱ショック形質転換に使用した。例示的なFc融合ベクターは、pFUSE-hIgG1-Fc2（Invivogen, USA）である。
形質転換後、実施例4に実質的に記載のとおり試料をDNAシーケンス用に調製した。次いで、IgVコード領域の最初で開始するように配列を手動でキュレートした以外は実施例4に記載のとおり、配列を手動でキュレートした。キュレートされた配列を、実施例4に記載のとおりバッチ翻訳および整列させた。関心対象のクローンを、実施例4に記載のとおりの基準を使用して同定した。表21は、同定されたバリアントCD155親和性改変分子（各バリアントに含有されるアミノ酸置換を含む）を示す。
当該方法は、以下のとおりのタンパク質をコードするコーディングDNAが生成された、CD155の親和性改変IgVドメインを含有する免疫調節タンパク質を生成した：シグナルペプチド、続く、バリアント（変異）IgVドメイン、続く、3つのアラニン（AAA）のリンカー、続く、変異N297Gを含有するヒトIgG1 Fc（SEQ ID NO：226に示される野生型ヒトIgG1 Fcに関してはN82G）。ヒトIgG1 Fcはまた、EUナンバリングによる変異R292CおよびV302Cを含有した（SEQ ID NO：226に示される野生型ヒトIgG1 Fcに関してはR77CおよびV87Cに対応する）。構築物は、システインと共有結合を形成できる任意の抗体軽鎖も含まないので、ヒトIgG1 Fcはまた、EUナンバリングによる220位におけるシステイン残基のセリン残基への置き換え（C220S）（SEQ ID NO：226に示される野生型または未改変のFcに関する5位におけるシステイン残基のセリン残基への置き換え（C5S）に対応する）を含有した。
組換えバリアントCD155 Fc融合タンパク質を、実施例5に記載のとおり実質的に発現および精製した。親和性改変バリアントCD155 Fc融合タンパク質の結合および活性を、完全長ヒトCD226およびTIGIT同族結合パートナーを発現する細胞を生成した以外は実施例6に記載のとおり実質的に評価した。細胞をフローサイトメトリーによってCD155 Fcバリアントで染色し、平均蛍光強度（MFI）を実施例5に記載のとおり決定した。生物活性の特徴付けのために、組換えCD155 Fcバリアントを、実施例5に記載のとおり抗CD3同時固定化アッセイで実質的に評価した。
結合および活性の試験についての結果は、表21に示される。表は、それぞれの同族構造TIGITおよびCD226に対する親和性成熟についてのスクリーニングにおいて選択されたCD155のIgVドメイン内の例示的なIgSFドメインアミノ酸置換（置き換え）を示す。例示的なアミノ酸置換は、SEQ ID NO：241に示される未改変の配列（IgV）の位置に対応するアミノ酸位置番号によって指定される。アミノ酸位置は中央に示され、対応する未改変の（例えば、野生型）アミノ酸は番号の前に記載され、同定されたバリアントアミノ酸置換は番号の後に記載される。カラム2は、バリアントECD-Fc融合分子毎のバリアントについてのSEQ ID NO識別子を示す。
また、同族結合パートナーを発現するよう改変された細胞への各バリアントFc融合分子の結合についての平均蛍光強度（MFI）値によって測定された場合の結合活性が、同じ細胞が発現している同族結合パートナーへのアミノ酸置換（1つまたは複数）を含有しない対応する未改変のECD-Fc融合分子の結合と比較したMFIの比として示される。また、T細胞の活性を調節するためのバリアントFc融合分子の機能活性も、抗CD3と同時固定された表示のバリアントFc融合分子で生成された培養上清中のIFNγの算出されたレベル（pg/ml）に基づいて、両方の機能的アッセイにおいて対応する未改変のCD155 IgV-Fcと比較した各バリアントCD155 IgV-Fcによって産生されたIFNγの比として示される。
（表２１）同族結合パートナーに対して選択されたCD155バリアント。分子配列、結合データ、および共刺激生物活性データ。
Figure 2020500010
実施例10
CD112の親和性改変IgSFドメインバリアントの生成、選択およびスクリーニング
CD112の親和性改変IgSFドメインバリアントを、上記実施例1〜6に記載のとおり、いくらかのわずかな修正を加えて実質的に生成した。例えば、CD112バリアントの生成について、ECDのその他の2つのドメインではなくIgVドメインのみを生成されたタンパク質中に含めた。本実施例は、Fc融合フォーマットの例示的親和性改変ドメイン（当該親和性改変ドメインは、記載されているとおりの分泌可能な免疫調節タンパク質または膜貫通型免疫調節タンパク質と関連するものを企図している）の結合および活性を例示する。
縮重コドンでの完全または部分的ランダム化によってCD155の特異的残基を標的化するライブラリーを生成するために、ヒトCD112の免疫グロブリン様V型（IgV）ドメイン（SEQ ID NO：286）についてのコーディングDNAを、Integrated DNA Technologies（Coralville, IA）から、最大80塩基対（bp）長の一連の重複オリゴヌクレオチドとして注文した。一般に、IgVドメインの多様なバリアントのライブラリーを生成するために、オリゴヌクレオチドは、所望のアミノ酸位置に所望の縮重コドンを含有した。縮重コドンを、URL：rosettadesign.med.unc.edu/SwiftLib/でのアルゴリズムを使用して生成した。一般に、変異させる位置および縮重コドンを、関心対象の標的-リガンド対を含有するこの構造から作られた結晶構造情報（PDB：3UDW）または相同性モデルから選択して、リガンド接触残基ならびにタンパク質相互作用界面にある残基を同定した。
実施例1に記載のとおり、オリゴヌクレオチドをPCR増幅に使用して、改変された酵母提示バージョンのベクターpBYDS03への挿入のためのライブラリーDNAインサートを実質的に生成した。あるいは、最大200bp長のUltramer（Integrated DNA Technologies）をメガプライマーPCR（URL: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC146891/pdf/253371.pdf）と共に使用して、複数の小さい重複プライマーを使用して容易に組み込むことのできないより大きなストレッチの縮重コドンを生成した。メガプライマーPCRを使用した完全長産物の生成に続いて、変異IgVドメインライブラリーを、酵母への相同組換えのための改変されたpBYDS03クローニングバリアントと40bpの重複領域を含有するDNAプライマーを使用して再度PCR増幅した。DNAインサートのライブラリーを、実施例1に記載のとおりライブラリー挿入用に実質的に調製し、電気穿孔法に使用できるDNAを調製した。
別のアプローチとして、CD112のIgVドメインの特異的残基を標的とする部位特異的変異誘発によって生成されるサブライブラリーまたはCD112のIgVドメインのランダムライブラリーのいずれかを生成して、実施例1に記載のとおりCD112のIgVドメインのバリアントをさらに実質的に同定した。
縮重またはランダムライブラリーDNAを、実施例2に記載のとおり酵母に実質的に挿入した。CD112の親和性改変バリアントを発現する酵母を、実施例3に記載される方法を使用して実質的に選択した。選択のために、以下の標的リガンドタンパク質を採用した：ヒトrTIGIT.Fc（すなわち、組換えTIGIT-Fc融合タンパク質）、rCD226.FcおよびrCD112R.Fc。磁気プロテインAビーズをNew England Biolabs（USA）から得た。2色フローサイトメトリーソーティングのために、Bio-Rad S3eソーターを使用した。CD112提示レベルを、Alexafluor 488で標識された抗ヘマグルチニン抗体（Life Technologies, USA）でモニタリングした。Fc融合タンパク質rTIGIT.Fc、rCD226.Fc、またはrCD112R.Fcのリガンド結合を、PEコンジュゲートヒトIg特異的ヤギFab（Jackson ImmunoResearch, USA）で検出した。二重酵母を前方散乱（FSC）/側方散乱（SSC）パラメーターを使用してゲートアウトし、ソートゲートは、FL2で検出されたより高いリガンド結合（これは、FL1でより限定されたタグ発現結合を有した）に基づいた。
第二のソートアウトプット（F2）を、実施例3に記載のとおり、より高い特異的結合親和性についてアッセイされたソートアウトプットを拡大してその発現を再誘導することによって実質的に得て、これを使用して、親の野生型酵母系統と比較した結合を評価した。CD112について、各集団を抗HA（ヘマグルチニン）タグ発現および抗ヒトFc二次で二重染色してリガンド結合を検出することによって、第二のFACSアウトプット（F2）を親CD112酵母と各rTIGIT.Fc、rCD226.Fc、およびrCD112Rの結合について比較した。
選択されたアウトプットを、完全ECDドメインではなくIgVドメインのみを含むこと以外は実施例4に記載のとおり、Fc分子に融合されたCD112の親和性改変（バリアント）免疫グロブリン様V型（IgV）ドメイン（バリアントIgVドメイン-Fc融合分子）を含有する免疫調節タンパク質として実質的に再編成した。CD112アウトプットについてのいくつかの別の方法では、そのアウトプット由来のDNAを、Fc融合ベクターといずれかの端部上に40bpの重複領域を含有するプライマーでPCR増幅し、Gibson Assembly Mastermix（New England Biolabs）を使用したインビトロ組換えを行って、これをその後、大腸菌系統NEB5αへの熱ショック形質転換に使用した。例示的なFc融合ベクターは、pFUSE-hIgG1-Fc2（Invivogen, USA）である。
形質転換後、実施例4に記載のとおり試料をDNAシーケンス用に実質的に調製した。次いで、IgVコード領域の最初で開始するように配列を手動でキュレートした以外は実施例4に記載のとおり、配列を手動でキュレートした。キュレートされた配列を、実施例4に記載のとおりバッチ翻訳および整列させた。関心対象のクローンを、実施例4に記載のとおりの基準を使用して同定した。表22は、同定されたバリアントCD112親和性改変分子（各バリアントに含有されるアミノ酸置換を含む）を示す。
当該方法は、以下のとおりのタンパク質をコードするコーディングDNAが生成された、CD112の親和性改変IgVドメインを含有する免疫調節タンパク質を生成した：シグナルペプチド、続く、バリアント（変異）IgVドメイン、続く、3つのアラニン（AAA）のリンカー、続く、変異N297Gを含有するヒトIgG1 Fc（SEQ ID NO：226に示される野生型ヒトIgG1 Fcに関してはN82G）。ヒトIgG1 Fcはまた、変異R292CおよびV302Cを含有した（SEQ ID NO：226に示される野生型ヒトIgG1 Fcに関してはR77CおよびV87Cに対応する）。構築物は、システインと共有結合を形成できる任意の抗体軽鎖も含まないので、ヒトIgG1 Fcはまた、SEQ ID NO：226に示される野生型または未改変のFcと比較して、5位におけるシステイン残基のセリン残基への置き換え（C5S）を含有した。
組換えバリアントCD112 Fc融合タンパク質を、実施例5に記載のとおり実質的に発現および精製した。親和性改変バリアントCD112 Fc融合タンパク質の結合および活性を、完全長ヒトCD226、TIGITおよびCD112R同族結合パートナーを発現する細胞を生成した以外は実施例6に記載のとおり実質的に評価した。細胞をフローサイトメトリーによってCD112 Fcバリアントで染色し、平均蛍光強度（MFI）を実施例5に記載のとおり決定した。生物活性の特徴付けのために、組換えCD112 Fcバリアントを、実施例5に記載のとおり抗CD3同時固定化アッセイで実質的に評価した。
結合および活性の試験についての結果は、表22に示される。表は、それぞれの同族構造TIGIT、CD226およびCD112Rに対する親和性成熟についてのスクリーニングにおいて選択されたCD112のIgVドメイン内の例示的なIgSFドメインアミノ酸置換（置き換え）を示す。例示的なアミノ酸置換は、SEQ ID NO：286に示される未改変の配列の位置に対応するアミノ酸位置番号によって指定される。アミノ酸位置は中央に示され、対応する未改変の（例えば、野生型）アミノ酸は番号の前に記載され、同定されたバリアントアミノ酸置換は番号の後に記載される。カラム2は、バリアントIgV-Fc融合分子毎のバリアントECDについてのSEQ ID NO識別子を示す。
また、同族結合パートナーを発現するよう改変された細胞への各バリアントFc融合分子の結合についての平均蛍光強度（MFI）値によって測定された場合の結合活性が、同じ細胞が発現している同族結合パートナーへのアミノ酸置換（1つまたは複数）を含有しない対応する未改変のIgV-Fc融合分子の結合と比較したMFIの比として示される。また、T細胞の活性を調節するバリアントFc融合分子の機能活性も、抗CD3と同時固定された表示のバリアントFc融合分子で生成された培養上清中のIFNγの算出されたレベル（pg/ml）に基づいて、両方の機能的アッセイにおいて対応する未改変のCD112 IgV-Fcと比較した各バリアントCD112 IgV-Fcによって産生されたIFNγの比として示される。
（表２２）同族結合パートナーに対して選択されたCD112バリアント。分子配列、結合データ、および共刺激生物活性データ。
Figure 2020500010
Figure 2020500010
Figure 2020500010
実施例11
追加の親和性改変IgSFドメイン
この実施例は、免疫活性化および抑制の両方において実証された二重の役割を有する免疫シナプス(IS)の他の成分である、追加の親和性改変CD80、CD155、CD112、PD-L1、PD-L2、CD86(B7-2)免疫調節タンパク質の設計、作製、およびスクリーニングを記載する。また、Nkp30バリアントの作製およびスクリーニングも記載する。これらの実施例は、IgSFドメインの親和性改変が、免疫学的活性を増強および低減するように作用できるタンパク質を生成することを実証している。免疫調節活性を達成するためのII型免疫調節タンパク質を形成するようにバリアント親和性改変CD80と対で融合された（すなわち、スタックされた）これらのドメインの種々の組み合わせ。実施例は、Fc融合フォーマットの例示的な親和性改変ドメインの結合および活性を例示する；そのような親和性改変ドメインは、記載の通りの分泌性免疫調節タンパク質または膜貫通型免疫調節タンパク質と関連付けられることが企図される。
酵母ディスプレイライブラリーとしての翻訳および発現のためのヒトCD80、CD155、CD112、PD-L1、PD-L2、CD86(B7-2)、およびNKp30のIgVドメインの変異体をコードする突然バリアントDNA構築物を、実質的に実施例1に記載の通り作製した。縮重コドンでの完全または部分的ランダム化のための特異的残基を標的とする標的ライブラリーおよび/またはランダムライブラリーを構築して、CD80（SEQ ID NO:578)、CD112（SEQ ID NO:965)、CD155（SEQ ID NO:652)、PD-L1（SEQ ID NO:1332)のIgVのバリアント、およびPD-L2（SEQ ID NO:1393)のIgVのバリアントを実質的に実施例1に記載の通り同定した。また、類似の方法を使用して、NKp30（SEQ ID NO:1566)のIgC様ドメインのライブラリーも作製した。
縮重またはランダムライブラリーDNAを実質的に実施例2記載の通り酵母に導入して、酵母ライブラリーを作製した。ライブラリーを使用して、CD80、CD155、CD112、PD-L1、PD-L2、CD86 (B7-2)、およびNKp30の親和性改変バリアントを発現する酵母を実質的に実施例3に記載の通り選択した。実質的に実施例3に記載の通り、細胞を処理して、非結合因子を還元し、外因性組換えカウンター構造タンパク質に結合する能力を有するCD80、CD155、CD112、PD-L1またはPD-L2バリアントについて濃縮した。
CD80、CD86およびNKp30ライブラリーと共に、標的リガンドタンパク質は、以下の通りR&D Systems(USA)から供給された:ヒトrCD28.Fc（すなわち、組換えCD28-Fc融合タンパク質)、rPDL1.Fc、rCTLA4.Fc、およびrB7H6.Fc。2色フローサイトメトリーを実質的に実施例3に記載の通り実施した。フローサイトメトリー選別からの酵母アウトプットを、より高い特異的結合親和性について評価した。選別アウトプット酵母を拡大および再誘導して、これらがコードする特定のIgSF親和性改変ドメインバリアントを発現させた。次いで、この集団を、親、野生型酵母系統、または任意の他の選択されたアウトプット、例えばビーズアウトプット酵母集団とフローサイトメトリーによって比較することができる。
B7-H6への結合について選択されたNKp30酵母バリアントの場合、F2選別アウトプットは、16.6nMのrB7H6.Fcで染色したときMFI値533を与えたが、一方で、親NKp30系統のMFIは、同じ濃度のrB7H6.Fcで染色したとき90と測定された(6倍改善)。
同定されたNKp30バリアントの中には、SEQ ID NO:54に示される位置に対応するNKp30細胞外ドメイン内の位置を参照して変異L30V/A60V/S64P/S86Gを含有したバリアントがあった。
表23A〜Eに提供されるCD155バリアントについて、CD226を避けて選択し、バリアントCD155の結合特異性を改善するために、選択は、所望のカウンター構造TIGITおよびCD96を用いた2回の陽性選択とそれに続くカウンター構造CD226を用いた1回の陰性選択を含んだ。リード化合物同定(lead identification)を最適化するためにカウンター構造(TIGIT/CD96)の濃度および陽性選別の選択ストリンジェンシーを変更した以外は基本的に上記の実施例3に記載の通り選択を実施した。陰性選択についてのCD226の濃度を100nMに維持した。
表24A〜Bに提供される追加のCD112バリアントについて、CD226を避けて選択し、バリアントCD112の結合特異性を改善するために、選択は、所望のカウンター構造TIGITおよびCD112Rを用いた2回の陽性選択とそれに続くカウンター構造CD226を用いた1回の陰性選択を含んだ。リード化合物同定を最適化するためにカウンター構造(TIGIT/CD112R)の濃度および陽性選別の選択ストリンジェンシーを変更した以外は基本的に上記の実施例3に記載の通り選択を実施した。陰性選択についてのCD226の濃度を100nMに維持した。
表25および26A〜Bに提供されるPD-L1およびPD-L2バリアントについて、酵母ディスプレイ標的化またはランダムPD-L1またはPD-L2ライブラリーをPD-1に対して選択した。これに続いて、外因性カウンター構造タンパク質染色を使用した2〜3ラウンドのフローサイトメトリー選別を行って、改善された結合因子を表示する酵母細胞の画分を濃縮した。代替的に、PD-L1について、ヒトrCD80.Fc（すなわち、R&D Systems, USAからのヒト組換えCD80 Fc融合タンパク質)を用いて選択を実施した。選択を主に上記のPD-1について記載した通り行った。フローサイトメトリーによる磁性ビーズ濃縮および選択は、基本的に、Miller K. D. et al., Current Protocols in Cytometry 4.7.1-4.7.30, July 2008に記載の通りである。
表27A〜Bに提供されるCD80バリアントについて、CD80ライブラリーは、所望のカウンター構造CTLA4を用いた陽性選択およびカウンター構造CD28を用いた陰性選択から構成された。
例示的な選択アウトプットを、実質的に実施例4に記載の通り、各々Fc分子に融合された(バリアントIgV-Fc融合分子)、CD80の親和性改変(バリアント)IgV、CD155のバリアントIgV、CD112のバリアントIgV、PD-L1のバリアントIgV、PD-L2のバリアントIgVを含有する免疫調節タンパク質として再フォーマットし、Fc融合タンパク質を実質的に実施例5に記載の通り発現および精製した。いくつかの場合に、親和性改変IgSFドメインと続くGSGGGGSリンカーと続くEUナンバリングによる変異L234A、L235E、G237A、E356D、およびM358Lを含有するヒトIgG1 Fc（SEQ ID NO:2153)を含有する、Fc融合タンパク質を作製した。
次いで、細胞が発現したカウンター構造(同族結合パートナー)への例示的なIgSFドメインバリアントの結合を実質的に実施例6に記載の通り評価した。同族結合パートナーを発現する細胞を生産し、結合試験およびフローサイトメトリーを実質的に実施例6に記載の通り行った。加えて、Fc融合バリアントタンパク質の生物活性を、実質的に実施例6に記載の通り混合リンパ球反応(MLR)または抗CD3同時固定アッセイのいずれかによって特徴付けた。
上記の通り、表毎に、例示的なアミノ酸置換は、それぞれの参照未改変ECDに対応するアミノ酸位置番号によって指定される(表1を参照のこと)。アミノ酸位置は、中央に表示され、対応する未改変（例えば、野生型）アミノ酸は、番号の前に記載され、同定されたバリアントアミノ酸置換は、番号の後に記載される(または、aによって指定されて挿入される）。
また、同族カウンター構造リガンドを発現するように改変された細胞への各バリアントFc融合分子の結合についての平均蛍光強度(MFI)値によって測定された場合の結合活性、および同じ細胞が発現するカウンター構造リガンドへのアミノ酸置換を含有しない対応する未改変Fc融合分子の結合と比較したMFIの比も示す。また、MLRアッセイにおいて表示のバリアントFc融合分子を用いて生成された培養上清中のIFN-γの計算レベル(pg/mL)に基づき、T細胞の活性を調節するPD-L2バリアントFc融合分子の機能活性を示す。表26Bはまた、MLRアッセイにおいて対応する未改変IgV-Fcと比較した、各バリアントIgV-Fcによって産生されたIFN-γの比も示す。
示す通り、選択は、少なくとも1つ、いくつかの場合に2つ以上の同族カウンター構造リガンドに対する向上した結合性を示すように親和性が改変された多数のCD80、CD155、CD112、PD-L1、およびPD-L2 IgSFドメインバリアントの同定をもたらした。加えて、結果は、バリアント分子の親和性改変がまた、免疫学的活性を増強する改善された活性と低減する改善された活性との両方を示したことも示した。
（表２３Ａ）追加のCD155バリアントおよび結合データ
Figure 2020500010
Figure 2020500010
Figure 2020500010
（表２３Ｂ）追加のCD155バリアントおよび結合データ
Figure 2020500010
Figure 2020500010
Figure 2020500010
（表２３Ｃ）追加のCD155バリアントおよび結合データ
Figure 2020500010
（表２３Ｄ）追加のCD155バリアントおよび結合データ
Figure 2020500010
Figure 2020500010
（表２３Ｅ）追加のCD155バリアントおよび結合データ
Figure 2020500010
Figure 2020500010
Figure 2020500010
Figure 2020500010
（表２４Ａ）追加のCD112バリアントおよび結合データ
Figure 2020500010
Figure 2020500010
Figure 2020500010
Figure 2020500010
（表２４Ｂ）追加のCD112バリアントおよび結合データ
Figure 2020500010
Figure 2020500010
Figure 2020500010
（表２５Ａ）選択されたPD-L1バリアントおよび結合データ
Figure 2020500010
Figure 2020500010
Figure 2020500010
（表２５Ｂ）PD-1またはCD80を発現する細胞へのフロー結合
Figure 2020500010
Figure 2020500010
（表２５Ｃ）追加の親和性成熟されたIgSFドメインを含有する分子
Figure 2020500010
（表２６Ａ）PD-1に対して選択されたバリアントPD-L2．分子配列および結合データ
Figure 2020500010
Figure 2020500010
Figure 2020500010
（表２６Ｂ）MLRにおけるPD-1に対して選択されたPD-L2バリアントの生物活性データ
Figure 2020500010
Figure 2020500010
Figure 2020500010
（表２７Ａ）CTLA4、CD28またはPD-L1をトランスフェクトしたHEK293細胞へのバリアントCD80結合
Figure 2020500010
Figure 2020500010
*表示位置の終止コドン
（表２７Ｂ）CTLA4、CD28、またはPD-L1をトランスフェクトしたHEK293細胞へのバリアントCD80の結合
Figure 2020500010
Figure 2020500010
実施例12
分泌性免疫調節タンパク質の作製
PD-L2分泌性免疫調節タンパク質(SIP)を作製するために、例示的なSIPをコードするDNAを、Integrated DNA Technologies(Coralville, USA)から遺伝子ブロックとして得て、次いで、ギブソンアセンブリ(New England Biolabs Gibson assembly kit)によって、改変型のpRRLベクター(Dull et al., (1998) J Virol, 72(11): 8463-8471)にMNDプロモーターの下流の制限部位間にクローニングしてGFPを除去した。シグナルペプチドを含めたSEQ ID NO:1571〜1573に示されるタンパク質をコードする例示的なSIP構築物を作製した。この例示的な実施例では、タグ部分を追加で含む構築物を作製した。遺伝子ブロックは、以下の構造を順に有していた：第一の制限部位の前にpRRLとの39塩基対重複-第一の制限部位-GCCGCCACC(Kozak)；SEQ ID NO:1393に示されるPD-L2 IgV野生型アミノ酸配列またはSEQ ID NO:1535に示されるバリアントPD-L2 IgV(H15Q,V31M,S67L,Q82R,V89D)、SEQ ID NO:1547に示されるバリアントPD-L2 IgV(H15Q,T47A,K65R,S67L,Q82R,V89D)もしくはSEQ ID NO:1561に示されるバリアントPD-L2 IgV(H15Q,T47A,S67L,R76G,Q82R,V89D)をコードする完全ORF（全ての場合に、SEQ ID NO:1567に示されるPD-L2シグナルペプチド
Figure 2020500010
も含む)；SEQ ID NO:1568に示されるAvitag
Figure 2020500010
をコードするDNA；SEQ ID NO:1569に示されるHisタグ（HHHHHH）をコードするDNA；TAA終止コドン；第二の制限部位-第二の制限部位を越えてpRRLとの41塩基対重複。
レンチウイルスベクターを調製するために、100mmディッシュ当たり3×106のHEK293細胞をプレーティングした。翌日、P-Mix(PAX2 3μgおよびpMD2G 1.5μg)4.5μgを、5mLポリプロピレンチューブ中のSIP構築物をコードするDNA 6μgに加えた。希釈緩衝液(10mM HEPES/150mM NaCl pH7.05/1L TC grade H20)をチューブに加えて、総容量を500μLにした。希釈DNA(PEI:合計DNA 4:1)にPEI(1μg/μL)42μLを加え、ボルテックスすることによって混合した。混合物を室温で10分間インキュベートし、付着細胞をかき乱すことなく穏やかにディッシュから培地を吸引することによって細胞を調製し、次いで、Opti-MEM(1×)6mLに交換した。次いで、DNA/PEI混合物をディッシュに加え、37℃で24時間インキュベートした。24時間後、ディッシュから培地を吸引し、新鮮DMEM培地10mLに交換し、次いで37℃でインキュベートした。48時間後に、培養物から細胞および残屑を除去するために0.45μmフィルターPES付属シリンジ(Thermo Scientific Nalgene Syringe Filter)を使用してウイルス上清を収集した。また、実質的に記載の通り抗CD19 CAR(抗CD19 scFv、CD8に由来するヒンジおよび膜貫通ドメイン、ならびにCD3ζシグナル伝達ドメインを含有する）をコードする別個のレンチウイルスベクターストックも調製した。使用される例示的な抗CD19 CARは、SEQ ID NO:1576に示されるscFv、SEQ ID NO:1574に示されるCD8由来ヒンジおよび膜貫通ドメイン、ならびにSEQ ID NO:1575に示されるCD3ζを含有して、SEQ ID NO:2160に示される（SEQ ID NO:2161に示される配列によってコードされる）。
PD-L2 SIPをコードするウイルスベクターでPan T細胞を形質導入した。T細胞を融解し、1:1比の抗CD3/抗CD28ビーズ(Dynal)で活性化した。T細胞(1×106の細胞）を、表示のPD-L2 SIPをコードするレンチウイルスベクター上清および抗CD19 CARをコードするレンチウイルスベクター上清を等容量(各0.5mL)含有する合計1mLのレンチウイルスベクター上清と混合した。対照として、細胞を、抗CD19 CARをコードするレンチウイルスベクターでのみ形質導入するかまたはモックベクター対照で形質導入した。形質導入を、10μg/mLのポリブレンおよび50IU/mLのIL-2の存在下で実施した。細胞を30℃にて2500rpmで60分間スピンダウンした。24時間後、Xvivo15+培地およびIL2 3mLを各ウェルに加えた。2日毎に細胞に新鮮培地およびサイトカインを供給した。
また、表示のPD-L2 SIPをコードするレンチウイルス上清1mLと共に2×105の細胞で再懸濁したHEK-293細胞でも形質導入を行った。細胞に、DMEM培地3mLを加え、2日毎に細胞に新鮮培地を供給した。
分泌されたSIPの量を評価するために、細胞ベースアッセイを実施して、PD-1への分泌性バリアントPD-L2の結合を評価した。1ウェル当たりおよそ100,000のPD-1+Jurkat細胞を、上記の形質導入細胞から得られたPD-L2 SIPを含有する培養上清50μLの存在下でプレーティングし、4℃で30分間インキュベートした。標準曲線を作成するために、それぞれのバリアントPD-L2タンパク質50μLをPD-1+Jurkat細胞に10μg/mL、3μg/mL、1μg/mL、0.3μg/mL、0.1μg/mL、および0μg/mLで加え、同じく4℃で30分間インキュベートした。細胞を洗浄し、抗his-APC 50μLを加え(1:50)、これを4℃で30分間インキュベートした。表面に結合したPD-L2タンパク質をフローサイトメトリーによって検出し、標準曲線との比較によって上清試料中のSIPの濃度を決定した。図2Aおよび2Bに示す通り、SIPタンパク質は、形質導入されたT細胞および形質導入されたHEK293細胞の上清中で検出されたが、モックが形質導入されたまたはSIPなしで形質導入された細胞からの上清試料からは検出されなかった。
実施例13
PD-L2 SIPを形質導入されたPan T細胞の増殖および生物活性の評価
基本的に実施例12に記載の通りPD-L2 SIPをコードするウイルスベクターでPan T細胞を形質導入した。T細胞を融解し、1:1比の抗CD3/抗CD28ビーズ(Dynal)で活性化した。T細胞(1×106の細胞）を、表示のPD-L2 SIPをコードするレンチウイルスベクター上清および抗CD19 CARをコードするレンチウイルスベクター上清を等容量(各0.5mL)含有する合計1mLのレンチウイルスベクター上清と混合した。対照として、細胞を、抗CD19 CARをコードするレンチウイルスベクターでのみ形質導入するかまたはモックベクター対照で形質導入した。形質導入を、10μg/mLのポリブレンおよび50IU/mLのIL-2の存在下で実施した。細胞を30℃にて2500rpmで60分間スピンダウンした。24時間後、Xvivo15+培地およびIL2 3mLを各ウェルに加えた。2日毎に細胞に新鮮培地およびサイトカインを供給した。
活性化の14日後に、PD-L1の発現を提供するレンチウイルスベクターで形質導入されたNalm6細胞(Nalm6 PDL1+)で細胞を再刺激した。形質導入されたT細胞をCell Trace Far Redで標識し、5日目に色素の希薄を示した細胞の画分を決定することによって増殖を測定した。例示的な試験バリアントPD-L2 SIPを形質導入されたT細胞についての増殖試験の結果を図3Aに示す。
再刺激後5日目に上清中に放出されたIFN-γのレベルをELISAによって測定した。例示的な試験バリアントPD-L2 SIPを形質導入されたT細胞についての生物活性試験の結果を図3Bに示す。PD-L2バリアントSIPを形質導入されたT細胞は、SEQ ID NO:31に示される未改変(野生型）PD-L2 ECD配列の位置に対応する位置を参照したPD-L2のIgV内のアミノ酸置換を参照して同定される。図3Aおよび3Bに示す通り、増殖および免疫学的活性を増強する改善された活性が観察された。
抗CD19 CARとバリアントPD-L2 IgVまたは野生型(WT)PD-L2 IgVのいずれかのSIPをコードするレンチウイルスベクターとでT細胞を共形質導入した以外は同様の試験を行った。形質導入されたT細胞を上記の通りのNalm6 PDL1+細胞で刺激した後、3日目に色素の希薄を示した細胞の画分を決定することによってT細胞の増殖を測定した。図3Cに示す通り、バリアントPD-L2 SIPで改変された細胞は、CARのみを発現するT細胞の増殖と比較して増殖を改善し、改善された増殖はまた、野生型PD-L2 SIPを発現するT細胞の増殖よりも大きかった。
実施例14
分泌性免疫調節タンパク質の作製およびPD-L1 SIPを形質導入されたPan T細胞の増殖の評価
PD-L1分泌性免疫調節タンパク質(SIP)を作製するために、例示的なSIPをコードするDNAを、Integrated DNA Technologies(Coralville, USA)から遺伝子ブロックとして得て、次いで、ギブソンアセンブリ(New England Biolabs Gibson assembly kit)によって改変型のpRRLベクター(Dull et al., (1998) J Virol、72(11): 8463-8471)にMNDプロモーターの下流の制限部位間にクローニングしてGFPを除去した。シグナルペプチドを含めたSEQ ID NO:2155〜2156に示されるタンパク質をコードする例示的なPD-L1 SIP構築物を作製した。この例示的な実施例では、タグ部分を追加で含む構築物を作製した。遺伝子ブロックは、以下の構造を順に有していた：第一の制限部位の前にpRRLとの39塩基対重複-第一の制限部位-GCCGCCACC(Kozak)；SEQ ID NO:1332に示されるPD-L1 IgV野生型アミノ酸配列またはSEQ ID NO:1326に示されるバリアントPD-L1 IgV(D43G/N45D/L56Q/V58A/G101G-ins (G101GG)をコードする完全ORF（全ての場合に、SEQ ID NO:2157に示されるシグナルペプチド
Figure 2020500010
も含む)；SEQ ID NO:2154に示されるFlagタグ（DYKDDDDK）をコードするDNA；SEQ ID NO:1569に示されるHisタグ（HHHHHH）をコードするDNA；TAA終止コドン；第二の制限部位-第二の制限部位を越えてpRRLとの41塩基対重複。比較のために、野生型PD-L1をコードするSIPも評価した。
レンチウイルスベクターを調製するために、100mmディッシュ当たり3×106のHEK293細胞をプレーティングした。翌日、P-Mix(PAX2 3μgおよびpMD2G 1.5μg)4.5μgを、5mLポリプロピレンチューブ中のSIP構築物をコードするDNA 6μgに加えた。希釈緩衝液(10mM HEPES/150mM NaCl pH7.05/1L TC grade H20)をチューブに加えて、総容量を500μLにした。希釈DNA(PEI:合計DNA 4:1)にPEI(1μg/μL)42μLを加え、ボルテックスすることによって混合した。混合物を室温で10分間インキュベートし、付着細胞をかき乱すことなく穏やかにディッシュから培地を吸引することによって細胞を調製し、次いで、Opti-MEM(1×)6mLに交換した。次いで、DNA/PEI混合物をディッシュに加え、37℃で24時間インキュベートした。24時間後、ディッシュから培地を吸引し、新鮮DMEM培地10mLに交換し、次いで37℃でインキュベートした。48時間後に、培養物から細胞および残屑を除去するために0.45μmフィルターPES付属シリンジ(Thermo Scientific Nalgene Syringe Filter)を使用してウイルス上清を収集した。また、実質的に記載の通り抗CD19 CAR(抗CD19 scFv、CD8に由来するヒンジおよび膜貫通ドメイン、ならびにCD3ζシグナル伝達ドメインを含有する）をコードする別個のレンチウイルスベクターストックも調製した。使用される例示的な抗CD19 CARは、SEQ ID NO:1576に示されるscFv、SEQ ID NO:1574に示されるCD8由来ヒンジおよび膜貫通ドメイン、ならびにSEQ ID NO:1575に示されるCD3ζを含有して、SEQ ID NO:2160に示される（SEQ ID NO:2161に示される配列によってコードされる）。
T細胞を融解し、1:1比の抗CD3/抗CD28ビーズ(Dynal)で活性化した。T細胞(1×106の細胞）を、表示のPD-L1 SIP(D43G/N45D/L56Q/V58A/G101GGまたは野生型）をコードするレンチウイルスベクター上清および抗CD19 CARをコードするレンチウイルスベクター上清を等容量(各0.5mL)含有する合計1mLのレンチウイルスベクター上清と混合した。対照として、細胞を、抗CD19 CARをコードするレンチウイルスベクターでのみ形質導入するかまたはモックベクター対照で形質導入した。形質導入を、10μg/mLのポリブレンおよび50IU/mLのIL-2の存在下で実施した。細胞を30℃にて2500rpmで60分間スピンダウンした。24時間後、Xvivo15+培地およびIL2 3mLを各ウェルに加えた。2日毎に細胞に新鮮培地およびサイトカインを供給した。
活性化の14日後に、PD-L1の発現を提供するレンチウイルスベクターで形質導入されたNalm6細胞(Nalm6 PDL1+)で細胞を再刺激した。形質導入されたT細胞をCell Trace Far Redで標識し、3日目に色素の希薄を示した細胞の画分を決定することによって増殖を測定した。例示的な試験バリアントPD-L1 SIPを形質導入されたT細胞についての増殖試験の結果を図5に示す。
実施例15
形質導入された細胞の上清中の分泌性免疫調節タンパク質の検出
細胞ベースアッセイを用いて、培養上清中のSIPの存在を検出した。HEK-293細胞を、実施例12および14に記載の通り、例示的なSIPのバリアントPD-L1 IgV（SEQ ID NO:1326に示されるD43G/N45D/L56Q/V58A/G101G-ins(G101GG))、野生型PD-L1 IgV（SEQ ID NO:1332に示される）、バリアントPD-L2 IgV（SEQ ID NO:1547に示されるH15Q/T47A/K65R/S67L/Q82R/V89D)または野生型PD-L2 IgV（SEQ ID NO:1393に示される）をコードするレンチウイルスベクターで形質導入した。形質導入の4日後に上清を収集した。1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64、1:128希釈、または無希釈の上清およそ50μLを、96ウェル丸底プレート中、PD-1を発現するように形質導入された1×105個の9K562細胞(K562 PD-1+)に加え、4℃で30分間インキュベートした。標準曲線を作成するために、10,000pg/mL、1,000pg/mL、100pg/mL、10pg/mL、1pg/mL、および0.1pg/mLに希釈したPD-L2 hisタグタンパク質もK562 PD-1+細胞と4℃で30分間インキュベートした。細胞を洗浄し、抗his-APC 50μLを加え(1:50)、これを4℃で30分間インキュベートした。表面に結合したPD-L2タンパク質をフローサイトメトリーによって検出し、標準曲線との比較によって上清試料中のSIPの濃度を決定した。図6に示す通り、バリアントPD-L1およびバリアントPD-L2 SIPは、細胞の上清中に検出されたが、野生型タンパク質は検出されなかった。
上記の細胞ベースアッセイを使用して、抗原発現標的細胞と培養した後のT細胞の上清中のPD-L2 SIPの存在を評価した。実施例9に記載の通り、T細胞を活性化し、抗CD19 CARをコードするレンチウイルスベクターおよびバリアントPD-L2 H15Q/T47A/K65R/S67L/Q82R/V89D（SEQ ID NO:1547に示される）または野生型PD-L2 IgV（SEQ ID NO:1393に示される）のいずれかをコードするレンチウイルスベクターで形質導入した。活性化の14日後、形質導入されたT細胞を、CD19を発現するNalm6 PD-L1+細胞またはRaji細胞と培養した。T細胞の培養開始後の3、6、9、および12日目に、上清を収集し、上記の通りPD-L2の存在を検出した。バリアントPD-L2 SIPは、このアッセイを使用して標的抗原発現細胞で刺激後の上清中に観察されたが、野生型PD-L2 SIPは観察されなかった。この結果は、K562/PD-1+細胞に結合するのに十分に高い親和性を有していない野生型PD-L2 SIPに起因し得る。バリアントPD-L2 SIPは、Raji細胞で刺激されたT細胞の上清中でNalm6 PD-L1細胞と比較してかなり高いレベルで検出され、Raji細胞で刺激後の上清中のバリアントPD-L2 SIPのレベルは、この試験過程を通して継続した。
本発明の好ましい態様を本明細書に示しかつ説明してきたが、当業者には、そのような態様が単に例として提供されているにすぎないことが明らかであろう。本発明から逸脱することなしに多数の変更、変化、および置換がここで当業者に想定されよう。本明細書に記載の発明の態様の種々の代替物を、発明の実施に用いてよいことが理解されるべきである。以下の特許請求の範囲が本発明の範囲を規定すること、ならびに、これらの特許請求の範囲内の方法および構造とそれらの等価物がこれによって網羅されることが意図される。

Claims (72)

  1. 免疫調節タンパク質をコードする核酸分子を含む改変免疫細胞であって、
    該免疫調節タンパク質が、免疫グロブリンスーパーファミリー(IgSF)ファミリーメンバーの野生型IgSFドメイン内に1つまたは複数のアミノ酸置換を含む少なくとも1つの非免疫グロブリン親和性改変IgSFドメインを含み、該少なくとも1つの親和性改変IgSFドメインが、該野生型IgSFドメインの少なくとも1つの細胞表面同族結合パートナーに特異的に結合し；かつ
    該改変免疫細胞が該免疫調節タンパク質を発現および分泌する、
    前記改変免疫細胞。
  2. 前記免疫調節タンパク質が、膜貫通ドメインを含まない、請求項1に記載の改変免疫細胞。
  3. 前記核酸分子が、前記免疫調節タンパク質をコードする配列に機能的に連結された、分泌シグナルペプチドをコードする配列を含む、請求項1または請求項2に記載の改変免疫細胞。
  4. 前記シグナルペプチドが、対応する野生型IgSFメンバーに由来するネイティブシグナルペプチドである、請求項3に記載の改変免疫細胞。
  5. 前記シグナルペプチドが、非ネイティブシグナル配列である、請求項3に記載の改変免疫細胞。
  6. 前記シグナルペプチドが、IgG-κシグナルペプチド、IL-2シグナルペプチド、またはCD33シグナルペプチドである、請求項3または請求項5に記載の改変免疫細胞。
  7. 前記核酸分子が、前記免疫調節タンパク質の発現を制御するために機能的に連結された少なくとも1つのプロモーターをさらに含む、請求項1〜6のいずれか一項に記載の改変免疫細胞。
  8. 前記プロモーターが、構成的活性型プロモーターである、請求項7に記載の改変免疫細胞。
  9. 前記プロモーターが、誘導性プロモーターである、請求項7に記載の改変免疫細胞。
  10. 前記プロモーターが、T細胞活性化シグナル伝達に応答性のエレメントに応答性である、請求項7または請求項9に記載の改変免疫細胞。
  11. 前記プロモーターが、NFATの結合部位またはNF-κBの結合部位を含む、請求項7、9、および10のいずれか一項に記載の改変免疫細胞。
  12. リンパ球である、請求項1〜11のいずれか一項に記載の改変免疫細胞。
  13. 前記リンパ球が、T細胞、B細胞、またはNK細胞である、請求項12に記載の改変免疫細胞。
  14. T細胞である、請求項1〜13のいずれか一項に記載の改変免疫細胞。
  15. 前記T細胞が、CD4+またはCD8+である、請求項14に記載の改変免疫細胞。
  16. 抗原提示細胞である、請求項1〜15のいずれか一項に記載の改変免疫細胞。
  17. 対象から得られた初代細胞である、請求項1〜16のいずれか一項に記載の改変免疫細胞。
  18. 前記対象が、ヒト対象である、請求項17に記載の改変免疫細胞。
  19. 前記少なくとも1つの親和性改変IgSFドメインが、前記少なくとも1つの細胞表面同族結合パートナーに対して、該少なくとも1つの細胞表面同族結合パートナーに対する前記野生型IgSFドメインの結合親和性と比較して向上した結合親和性を有する、請求項1〜18のいずれか一項に記載の改変免疫細胞。
  20. 前記野生型IgSFドメインが、B7ファミリー、シグナル制御タンパク質(SIRP)ファミリー、骨髄細胞に発現するトリガー受容体様(TREML)ファミリー、がん胎児性抗原関連細胞接着分子(CEACAM)ファミリー、シアル酸結合Ig様レクチン(SIGLEC)ファミリー、ブチロフィリンファミリー、CD28ファミリー、Vセットおよび免疫グロブリンドメイン含有(VSIG)ファミリー、Vセット膜貫通ドメイン(VSTM)ファミリー、主要組織適合複合体(MHC)ファミリー、シグナル伝達リンパ球活性化分子(SLAM)ファミリー、白血球免疫グロブリン様受容体(LIR)、ネクチン(Nec)ファミリー、ネクチン様(NECL)ファミリー、ポリオウイルス受容体関連(PVR)ファミリー、天然細胞傷害誘発受容体(NCR)ファミリー、T細胞免疫グロブリンおよびムチン(TIM)ファミリー、またはキラー細胞免疫グロブリン様受容体(KIR)ファミリーから選択されるファミリーのIgSFファミリーメンバーに由来する、請求項1〜19のいずれか一項に記載の改変免疫細胞。
  21. 前記野生型IgSFドメインが、PD-L1、PD-L2、CD80、CD86、ICOSリガンド、B7-H3、B7-H4、CD28、CTLA4、PD-1、ICOS、BTLA、CD4、CD8-α、CD8-β、LAG3、TIM-3、CEACAM1、TIGIT、PVR、PVRL2、CD226、CD2、CD160、CD200、CD200R、NKp30、VISTA、VSIG3、およびVSIG8からなる群より選択されるIgSFメンバーに由来する、請求項1〜20のいずれか一項に記載の改変免疫細胞。
  22. 前記野生型IgSFドメインが、ヒトIgSFドメインである、請求項1〜21のいずれか一項に記載の改変免疫細胞。
  23. 前記野生型IgSFドメインが、刺激性受容体のリガンドであるIgSFメンバーに由来し、該刺激性受容体が共刺激シグナル伝達ドメインを含む、請求項1〜22のいずれか一項に記載の改変免疫細胞。
  24. 前記少なくとも1つの細胞表面同族結合パートナーが、T細胞上に発現する刺激性受容体であり、前記少なくとも1つの親和性改変IgSFドメインが、該刺激性受容体に対して、該刺激性受容体に対する前記野生型IgSFドメインの結合親和性と比較して向上した結合親和性を有する、請求項1〜23のいずれか一項に記載の改変免疫細胞。
  25. 前記刺激性受容体が、CD28、ICOS、またはCD226である、請求項23または請求項24に記載の改変免疫細胞。
  26. 前記野生型IgSFドメインが、抑制性受容体のリガンドであるIgSFメンバーに由来し、該抑制性受容体がITIMシグナル伝達ドメインを含む、請求項1〜22のいずれか一項に記載の改変免疫細胞。
  27. 前記少なくとも1つの細胞表面同族結合パートナーが、T細胞上に発現する抑制性受容体であり、前記少なくとも1つの親和性改変IgSFドメインが、該抑制性受容体に対して、該抑制性受容体に対する前記野生型IgSFドメインの結合親和性と比較して向上した結合親和性を有する、請求項1〜22および26のいずれか一項に記載の改変免疫細胞。
  28. 前記抑制性受容体が、PD-1、CTLA-4、LAG3、TIGIT、TIM-3、BTLA、VSIG3、もしくはVSIG8であり、かつ前記少なくとも1つの親和性改変IgSFドメインがそれぞれ、PD-1、CTLA-4、LAG3、TIGIT、TIM-3、BTLA、VSIG3、もしくはVSIG8のリガンドの親和性改変IgSFドメインであるか；または
    前記抑制性受容体のリガンドが、PD-L1、PD-L2、B7-1、B7-2、MHCクラスII、CD155、CD112、CEACAM-1、GAL9、もしくはVISTAであり、かつ前記少なくとも1つの親和性改変IgSFドメインがそれぞれ、PD-L1、PD-L2、B7-1、B7-2、MHCクラスII、CD155、CD112、CEACAM-1、GAL9、もしくはVISTAの親和性改変IgSFドメインである、
    請求項25または請求項26に記載の改変免疫細胞。
  29. 前記抑制性受容体がPD-1であり、かつ前記少なくとも1つの親和性改変IgSFドメインが、PD-L1の親和性改変IgSFであるかまたはPD-L2の親和性改変IgSFである、請求項26〜28のいずれか一項に記載の改変免疫細胞。
  30. 前記親和性改変IgSFドメインが、親和性改変CD155 IgSFドメインまたは親和性改変CD112 IgSFドメインであり、かつ前記少なくとも1つの細胞表面同族結合パートナーが、CD226、TIGIT、またはCD112Rである、請求項1〜28のいずれか一項に記載の改変免疫細胞。
  31. 前記親和性改変IgSFドメインが、前記野生型IgSFドメインとアミノ酸置換10個以下異なる、請求項1〜30のいずれか一項に記載の改変免疫細胞。
  32. 前記親和性改変IgSFドメインが、前記野生型IgSFドメインとアミノ酸置換5個以下異なる、請求項1〜30のいずれか一項に記載の改変免疫細胞。
  33. 前記1つまたは複数の親和性改変IgSFドメインが、前記1つまたは複数のアミノ酸置換を含む、親和性改変IgVドメイン、親和性改変IgC1ドメイン、もしくは親和性改変IgC2ドメインである、もしくはそれを含む、またはその特異的結合断片である、請求項1〜32のいずれか一項に記載の改変免疫細胞。
  34. 前記免疫調節タンパク質が、1つまたは複数の親和性が改変されていないIgSFドメインをさらに含む、請求項1〜33のいずれか一項に記載の改変免疫細胞。
  35. キメラ抗原受容体(CAR)または改変されたT細胞受容体(TCR)をさらに含む、請求書1〜34のいずれか一項記載の改変細胞。
  36. 免疫調節タンパク質をコードする核酸分子を含む感染性物質であって、
    該免疫調節タンパク質が、免疫グロブリンスーパーファミリー(IgSF)ファミリーメンバーの野生型IgSFドメイン内に1つまたは複数のアミノ酸置換を含む少なくとも1つの非免疫グロブリン親和性改変IgSFドメインを含み、該少なくとも1つの親和性改変IgSFドメインが、該野生型IgSFドメインの少なくとも1つの細胞表面同族結合パートナーに特異的に結合し；かつ
    該感染性物質が該免疫調節タンパク質を発現および分泌する、
    前記感染性物質。
  37. 前記免疫調節タンパク質が、膜貫通ドメインを含まない、請求項36に記載の感染性物質。
  38. 膜貫通型免疫調節タンパク質(TIP)をコードする核酸分子を含む感染性物質であって、該TIPが、
    (i)免疫グロブリンスーパーファミリー(IgSF)ファミリーメンバーの野生型IgSFドメイン内に1つまたは複数のアミノ酸置換を含む少なくとも1つの非免疫グロブリン親和性改変IgSFドメインを含むエクトドメインであって、該少なくとも1つの親和性改変IgSFドメインが、野生型IgSFドメインの少なくとも1つの細胞表面同族結合パートナーに特異的に結合する、エクトドメイン；および
    (ii)膜貫通ドメイン
    を含む、前記感染性物質。
  39. 前記膜貫通ドメインが、対応する野生型IgSFメンバーに由来するネイティブ膜貫通ドメインである、請求項38に記載の感染性物質。
  40. 前記膜貫通ドメインが、対応する野生型IgSFメンバーに由来するネイティブ膜貫通ドメインではない、請求項38または請求項39に記載の感染性物質。
  41. 前記膜貫通ドメインが、CD8に由来する膜貫通ドメインである、請求項40に記載の感染性物質。
  42. 前記少なくとも1つの親和性改変IgSFドメインが、前記少なくとも1つの細胞表面同族結合パートナーに対して、該少なくとも1つの細胞表面同族結合パートナーに対する前記野生型IgSFドメインの結合親和性と比較して向上した結合親和性を有する、請求項36〜41のいずれか一項に記載の感染性物質。
  43. 前記野生型IgSFドメインが、B7ファミリー、シグナル制御タンパク質(SIRP)ファミリー、骨髄細胞に発現するトリガー受容体様(TREML)ファミリー、がん胎児性抗原関連細胞接着分子(CEACAM)ファミリー、シアル酸結合Ig様レクチン(SIGLEC)ファミリー、ブチロフィリンファミリー、CD28ファミリー、Vセットおよび免疫グロブリンドメイン含有(VSIG)ファミリー、Vセット膜貫通ドメイン(VSTM)ファミリー、主要組織適合複合体(MHC)ファミリー、シグナル伝達リンパ球活性化分子(SLAM)ファミリー、白血球免疫グロブリン様受容体(LIR)、ネクチン(Nec)ファミリー、ネクチン様(NECL)ファミリー、ポリオウイルス受容体関連(PVR)ファミリー、天然細胞傷害誘発受容体(NCR)ファミリー、T細胞免疫グロブリンおよびムチン(TIM)ファミリー、またはキラー細胞免疫グロブリン様受容体(KIR)ファミリーから選択されるファミリーのIgSFファミリーメンバーに由来する、請求項36〜42のいずれか一項に記載の感染性物質。
  44. 前記野生型IgSFドメインが、PD-L1、PD-L2、CD80、CD86、ICOSリガンド、B7-H3、B7-H4、CD28、CTLA4、PD-1、ICOS、BTLA、CD4、CD8-α、CD8-β、LAG3、TIM-3、CEACAM1、TIGIT、PVR、PVRL2、CD226、CD2、CD160、CD200、CD200R、またはNKp30から選択されるIgSFメンバーに由来する、請求項36〜43のいずれか一項に記載の感染性物質。
  45. 前記野生型IgSFドメインが、ヒトIgSFメンバーのものである、請求項36〜44のいずれか一項に記載の感染性物質。
  46. 前記親和性改変IgSFドメインが、前記野生型IgSFドメインとアミノ酸置換10個以下または5個以下異なる、請求項36〜45のいずれか一項に記載の感染性物質。
  47. 前記親和性改変IgSFドメインが、前記1つまたは複数のアミノ酸置換を含む、親和性改変IgVドメイン、親和性改変IgC1ドメイン、もしくは親和性改変IgC2ドメインである、もしくはそれを含む、またはその特異的結合断片である、請求項36〜46のいずれか一項に記載の感染性物質。
  48. 細菌またはウイルスである、請求項36〜47のいずれか一項に記載の感染性物質。
  49. 前記感染性物質がウイルスであり、該ウイルスが腫瘍溶解性ウイルスである、請求項48に記載の感染性物質。
  50. 前記腫瘍溶解性ウイルスが、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、単純ヘルペスウイルス、水疱性口腔ウイルス(Vesticular Stomatic virus)、レオウイルス、ニューカッスル病ウイルス、パルボウイルス、麻疹ウイルス、水疱性口内炎ウイルス(vesticular stomatitis virus)(VSV)、コクサッキーウイルス、またはワクシニアウイルスである、請求項49に記載の感染性物質。
  51. 前記感染性物質がウイルスであり、該ウイルスが、樹状細胞(DC)を特異的に標的化し、かつ/または、樹状細胞指向性である、請求項48に記載の感染性物質。
  52. 前記ウイルスが、改変されたシンドビスウイルスエンベロープ産物で偽型化されたレンチウイルスベクターである、請求項48または請求項51に記載の感染性物質。
  53. 標的細胞の死をもたらすかまたは免疫応答を増強もしくは強化するさらなる遺伝子産物をコードする核酸分子をさらに含む、請求項36〜52のいずれか一項に記載の感染性物質。
  54. 前記さらなる遺伝子産物が、抗がん剤、抗転移剤、抗血管新生剤、免疫調節分子、免疫チェックポイント阻害剤、抗体、サイトカイン、成長因子、抗原、細胞傷害性遺伝子産物、アポトーシス促進性遺伝子産物、抗アポトーシス性遺伝子産物、細胞マトリックス分解性遺伝子、組織再生のための遺伝子、またはヒト体細胞の多能性へのリプログラミングのための遺伝子から選択される、請求項53に記載の感染性物質。
  55. 請求項1〜35のいずれか一項に記載の改変免疫細胞または請求項36〜54のいずれか一項に記載の感染性物質および薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物。
  56. 滅菌状態である、請求項55に記載の薬学的組成物。
  57. 免疫調節タンパク質を対象に導入する方法であって、請求書1〜35のいずれか一項記載の改変細胞、請求項36〜54のいずれか一項に記載の感染性物質、および請求項55または請求項56に記載の薬学的組成物を該対象に投与することを含む、前記方法。
  58. 対象における免疫応答を調節する方法であって、請求項1〜35のいずれか一項に記載の改変免疫細胞、請求項36〜54のいずれか一項に記載の感染性物質、または請求項55もしくは請求項56に記載の薬学的組成物を該対象に投与することを含む、前記方法。
  59. 前記免疫応答の調節が、前記対象における疾患または障害を治療する、請求項58に記載の方法。
  60. 前記免疫応答の調節が、免疫応答の増強を含む、請求項58または請求項59に記載の方法。
  61. 前記疾患または障害が、がんである、請求項59または請求項60のいずれか一項に記載の方法。
  62. 前記免疫応答の調節が、免疫応答の低減を含む、請求項58または請求項59に記載の方法。
  63. 前記疾患または障害が、炎症性の疾患または状態である、請求項59または請求項62に記載の方法。
  64. 前記対象がヒトである、請求項58〜63のいずれか一項に記載の方法。
  65. 疾患または障害の治療における使用のための組成物であって、請求項1〜35のいずれか一項に記載の改変免疫細胞または請求項36〜54のいずれか一項に記載の感染性物質および薬学的に許容される担体を含む、前記組成物。
  66. 疾患または障害の治療のための医薬の製造のための組成物の使用であって、該組成物が、請求項1〜35のいずれか一項に記載の改変免疫細胞または請求項36〜54のいずれか一項に記載の感染性物質および薬学的に許容される担体を含む、前記使用。
  67. 前記組成物が免疫応答を調節する、請求項65記載の組成物または請求項66記載の使用。
  68. 前記免疫応答の調節が、免疫応答の増強を含む、請求項67記載の組成物または使用。
  69. 前記疾患または障害が、がんである、請求項65〜68のいずれか一項記載の組成物または使用。
  70. 前記免疫応答の調節が、免疫応答の低減を含む、請求項67記載の組成物または使用。
  71. 前記疾患または障害が、炎症性の疾患または状態である、請求項65〜68および70のいずれか一項記載の組成物または使用。
  72. 前記対象がヒトである、請求項65〜71のいずれか一項記載の組成物または使用。
JP2019520983A 2016-10-20 2017-10-20 分泌性バリアント免疫調節タンパク質および改変細胞療法 Pending JP2020500010A (ja)

Applications Claiming Priority (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201662410827P 2016-10-20 2016-10-20
US62/410,827 2016-10-20
US201762475210P 2017-03-22 2017-03-22
US62/475,210 2017-03-22
US201762537921P 2017-07-27 2017-07-27
US62/537,921 2017-07-27
PCT/US2017/057743 WO2018075978A1 (en) 2016-10-20 2017-10-20 Secretable variant immunomodulatory proteins and engineered cell therapy

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2020500010A true JP2020500010A (ja) 2020-01-09
JP2020500010A5 JP2020500010A5 (ja) 2020-11-26

Family

ID=60480369

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2019520983A Pending JP2020500010A (ja) 2016-10-20 2017-10-20 分泌性バリアント免疫調節タンパク質および改変細胞療法

Country Status (10)

Country Link
US (1) US20200040059A1 (ja)
EP (2) EP3529361B1 (ja)
JP (1) JP2020500010A (ja)
KR (1) KR20190099194A (ja)
CN (1) CN110352245A (ja)
AU (1) AU2017345764A1 (ja)
CA (1) CA3040296A1 (ja)
IL (1) IL266045A (ja)
SG (1) SG11201903407XA (ja)
WO (1) WO2018075978A1 (ja)

Families Citing this family (30)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SG11201602887QA (en) 2013-10-25 2016-05-30 Psioxus Therapeutics Ltd Oncolytic adenoviruses armed with heterologous genes
GB201414021D0 (en) 2014-08-07 2014-09-24 Nascient Ltd Biological materials and uses thereof
WO2016168771A2 (en) 2015-04-17 2016-10-20 Alpine Immune Sciences, Inc. Immunomodulatory proteins with tunable affinities
CN108396015B (zh) 2015-04-30 2022-02-18 皮斯奥克斯治疗公司 编码b7蛋白质的溶瘤腺病毒
US10273281B2 (en) 2015-11-02 2019-04-30 Five Prime Therapeutics, Inc. CD80 extracellular domain polypeptides and their use in cancer treatment
KR20180107105A (ko) 2015-12-17 2018-10-01 싸이오서스 테라퓨틱스 엘티디. 항-tcr-복합체 항체 또는 단편을 암호화하는 군 b 아데노바이러스
US11325948B2 (en) 2016-03-19 2022-05-10 Exuma Biotech Corp. Methods and compositions for genetically modifying lymphocytes to express polypeptides comprising the intracellular domain of MPL
MA43552A (fr) 2016-04-15 2018-11-07 Alpine Immune Sciences Inc Protéines immunomodulatrices à variants de cd80 et leurs utilisations
EP3442999A2 (en) 2016-04-15 2019-02-20 Alpine Immune Sciences, Inc. Icos ligand variant immunomodulatory proteins and uses thereof
US11471488B2 (en) 2016-07-28 2022-10-18 Alpine Immune Sciences, Inc. CD155 variant immunomodulatory proteins and uses thereof
US11834490B2 (en) 2016-07-28 2023-12-05 Alpine Immune Sciences, Inc. CD112 variant immunomodulatory proteins and uses thereof
GB201713765D0 (en) 2017-08-28 2017-10-11 Psioxus Therapeutics Ltd Modified adenovirus
BR112019018747A2 (pt) 2017-03-16 2020-05-05 Alpine Immune Sciences Inc proteínas imunomoduladoras variantes de cd80 e usos das mesmas
EP3596115A1 (en) 2017-03-16 2020-01-22 Alpine Immune Sciences, Inc. Pd-l2 variant immunomodulatory proteins and uses thereof
KR20190139216A (ko) 2017-04-28 2019-12-17 파이브 프라임 테라퓨틱스, 인크. Cd80 세포외 도메인 폴리펩티드를 이용한 치료 방법
US11142580B2 (en) 2017-06-01 2021-10-12 Psioxus Therapeutics Limited Oncolytic virus and method
SG11202000387YA (en) 2017-08-25 2020-03-30 Five Prime Therapeutics Inc B7-h4 antibodies and methods of use thereof
KR20230020022A (ko) 2017-10-10 2023-02-09 알파인 이뮨 사이언시즈, 인코포레이티드 Ctla-4 변이체 면역조절 단백질 및 이의 용도
AU2018351000B2 (en) 2017-10-18 2023-11-30 Alpine Immune Sciences, Inc. Variant ICOS Ligand immunomodulatory proteins and related compositions and methods
EA202091810A1 (ru) 2018-03-02 2021-01-29 Файв Прайм Терапьютикс, Инк. Антитела к b7-h4 и способы их применения
CN112543642A (zh) * 2018-08-29 2021-03-23 戊瑞治疗有限公司 CD80胞外结构域Fc融合蛋白给药方案
WO2020052645A1 (zh) * 2018-09-14 2020-03-19 上海原能细胞医学技术有限公司 表面包含免疫调节剂的细胞及其用途
US20220177587A1 (en) * 2018-09-19 2022-06-09 Alpine Immune Sciences, Inc. Methods and uses of variant cd80 fusion proteins and related constructs
US20220144913A1 (en) * 2019-02-27 2022-05-12 The General Hospital Corporation Personalized and timed release of biomolecules
JP2022546101A (ja) * 2019-09-01 2022-11-02 エクスマ バイオテック コーポレイション リンパ球の改変および送達のための方法および組成物
CN113087806B (zh) * 2019-12-31 2022-09-06 华东师范大学 靶向多种肿瘤的新型car-t细胞及其制备和方法
CN115335087A (zh) * 2020-04-01 2022-11-11 南京传奇生物科技有限公司 用于减少同种异体细胞疗法中的移植物排斥的组合物和方法
MX2022013998A (es) 2020-05-08 2023-02-16 Alpine Immune Sciences Inc Proteinas inmunomoduladoras inhibidoras de april y baff con y sin una proteina inhibidora de celulas t y metodos de uso de las mismas.
WO2022036495A1 (en) * 2020-08-17 2022-02-24 Utc Therapeutics Inc. Lymphocytes-antigen presenting cells co-stimulators and uses thereof
CN113308491B (zh) * 2021-05-25 2022-03-22 北京鼎成肽源生物技术有限公司 一种共表达nfat和人dnam-1蛋白的重组质粒、重组细胞及其构建方法和应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2010533649A (ja) * 2007-07-13 2010-10-28 ザ ジョンズ ホプキンス ユニバーシティー Ｂ７−ｄｃ改変体
JP2015512263A (ja) * 2012-03-30 2015-04-27 イミューン デザイン コーポレイション Ｄｃ−ｓｉｇｎを発現する細胞に対して改善された形質導入の有効性を有するレンチウイルスベクター粒子
JP2016502554A (ja) * 2012-12-04 2016-01-28 オンコメッド ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド 結合物質を用いた免疫療法

Family Cites Families (78)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5716826A (en) 1988-03-21 1998-02-10 Chiron Viagene, Inc. Recombinant retroviruses
US20020159979A1 (en) 1994-06-06 2002-10-31 Children's Hospital, Inc. Adeno-associated virus materials and methods
US5998205A (en) 1994-11-28 1999-12-07 Genetic Therapy, Inc. Vectors for tissue-specific replication
US7153510B1 (en) 1995-05-04 2006-12-26 Yale University Recombinant vesiculoviruses and their uses
FR2735789B1 (fr) 1995-06-23 1997-07-25 Centre Nat Rech Scient Adenovirus recombinants, leur utilisation pour preparer des aav, lignee cellulaire complementaire et compositions pharmaceutiques les contenant
EP0850313B8 (en) 1995-09-08 2009-07-29 Genzyme Corporation Improved aav vectors for gene therapy
US7001765B2 (en) 1996-03-06 2006-02-21 Medigene Ag Adeno-associated virus vector for boosting immunogenicity of cells
WO1999009139A1 (en) 1997-08-15 1999-02-25 Rubicon Laboratory, Inc. Retrovirus and viral vectors
AU9397098A (en) 1997-09-19 1999-04-12 Trustees Of The University Of Pennsylvania, The Methods and cell line useful for production of recombinant adeno-associated viruses
GB9801930D0 (en) 1998-01-29 1998-03-25 Univ London Mutant herpes simplex viruses and uses thereof
US6436392B1 (en) 1998-05-20 2002-08-20 University Of Iowa Research Foundation Adeno-associated virus vectors
US20040063094A1 (en) 1998-05-20 2004-04-01 Biovex Limited Mutant herpes simplex viruses and uses thereof
US6491907B1 (en) 1998-11-10 2002-12-10 The University Of North Carolina At Chapel Hill Recombinant parvovirus vectors and method of making
GB9904582D0 (en) 1999-02-26 1999-04-21 Nycomed Imaging As Process
US6428968B1 (en) 1999-03-15 2002-08-06 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Combined therapy with a chemotherapeutic agent and an oncolytic virus for killing tumor cells in a subject
DE19933288A1 (de) 1999-07-15 2001-01-18 Medigene Ag Strukturprotein von Adeno-assoziiertem Virus mit veränderter Antigenität, seine Herstellung und Verwendung
US7241447B1 (en) 1999-10-07 2007-07-10 University Of Iowa Research Foundation Adeno-associated virus vectors and uses thereof
US7329728B1 (en) 1999-10-25 2008-02-12 The Scripps Research Institute Ligand activated transcriptional regulator proteins
WO2001045737A2 (en) 1999-12-22 2001-06-28 Onyx Pharmaceuticals, Inc. Herpes simplex virus-1 glycoprotein c mutants for treating unwanted hyperproliferative cell growth
WO2001053505A2 (en) 2000-01-21 2001-07-26 Biovex Limited Herpes virus strains for gene therapy
US7306902B2 (en) 2002-06-28 2007-12-11 Oncolyties Biotech Inc. Oncolytic viruses as phenotyping agents for neoplasms
US7011972B2 (en) 2000-07-18 2006-03-14 The Scripps Research Institute Fusion polypeptide comprising two ligand binding domains
US6653103B2 (en) 2001-03-30 2003-11-25 Wisconsin Alumni Research Foundation Inhibition of nucleocytoplasmic transport by vesicular stomatitis virus M protein-like polypeptides
CA2442648C (en) 2001-05-11 2012-10-16 Pro-Virus, Inc. Oncolytic virus therapy
US20030044386A1 (en) 2001-07-11 2003-03-06 Barber Glen N. Recombinant VSV for the treatment of tumor cells
CN1304559C (zh) 2001-10-09 2007-03-14 杭州康科生物技术有限公司 表达热休克蛋白的溶瘤微生物及其应用
AU2003258060B2 (en) 2002-03-27 2007-07-12 Baylor College Of Medicine Potent oncolytic herpes simplex virus for cancer therapy
US20030225260A1 (en) 2002-04-30 2003-12-04 Snyder Richard O. Production of recombinant AAV virions
US20050220818A1 (en) 2002-06-21 2005-10-06 Wellstat Biologics Corporation Administration of therapeutic viruses
CA2498297A1 (en) 2002-09-09 2004-03-18 University Of Tennessee Research Foundation Recombinatant mutants of rhabdovirus and methods of use thereof
MXPA05010260A (es) 2003-03-27 2006-03-17 Ottawa Health Research Inst Virus de estomatitis vesicular mutantes y usos de los mismos.
US7731974B2 (en) 2003-03-27 2010-06-08 Ottawa Hospital Research Institute Mutant vesicular stomatitis viruses and uses thereof
CN100562570C (zh) 2003-06-18 2009-11-25 吉恩勒克斯公司 修饰的重组痘苗病毒及其它微生物,及其应用
AU2004278684B2 (en) 2003-09-30 2011-05-12 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Adeno-associated virus (AAV) clades, sequences, vectors containing same, and uses therefor
GB0326798D0 (en) 2003-11-17 2003-12-24 Crusade Lab Ltd Methods for generating mutant virus
JP2007511216A (ja) 2003-11-17 2007-05-10 クルセイド ラボラトリーズ リミテッド 変異ウイルス
US7897146B2 (en) 2003-11-17 2011-03-01 Crusade Laboratories Limited Treatment using herpes simplex virus
WO2005116224A2 (en) 2004-05-18 2005-12-08 Children's Memorial Hospital Tetracycline-regulated adeno-associated viral (aav) vectors for gene delivery to the nervous system
US7427396B2 (en) 2004-06-03 2008-09-23 Genzyme Corporation AAV vectors for gene delivery to the lung
WO2006002394A2 (en) 2004-06-24 2006-01-05 New York University Avirulent oncolytic herpes simplex virus strains engineered to counter the innate host response
EP1819823A2 (en) 2004-12-01 2007-08-22 Bayer Schering Pharma Aktiengesellschaft Generation of replication competent viruses for therapeutic use
EP2963118B1 (en) 2005-06-01 2017-08-09 California Institute of Technology Method of targeted gene delivery using viral vectors
CN105483093A (zh) 2005-06-23 2016-04-13 休斯顿大学 Ⅱ型单纯疱疹病毒突变体在治疗癌症中的用途
US7943374B2 (en) 2005-08-21 2011-05-17 Markus Hildinger Super-size adeno-associated viral vector harboring a recombinant genome larger than 5.7 kb
GB0522476D0 (en) 2005-11-03 2005-12-14 Biovex Ltd Oncolytic herpes virus vectors
EP2526774A3 (en) 2006-07-21 2013-03-06 California Institute of Technology Targeted gene delivery for dendritic cell vaccination
US20090098529A1 (en) 2006-10-16 2009-04-16 Nanhai Chen Methods for attenuating virus strains for diagnostic and therapeutic uses
US20100178684A1 (en) 2006-12-21 2010-07-15 Woo Savio L C Transgenic oncolytic viruses and uses thereof
EP2114420B1 (en) 2007-02-16 2016-01-27 Virttu Biologics Limited Herpes simplex viruses and methods of viral replication
US20090117034A1 (en) 2007-06-15 2009-05-07 Nanhai Chen Microorganisms for imaging and/or treatment of tumors
US20090162288A1 (en) 2007-07-18 2009-06-25 Nanhai Chen Use of modified vaccinia virus strains in combination with a chemotherapeutic agent for use in therapeutic methods
US20090136917A1 (en) 2007-10-25 2009-05-28 Szalay Aladar A Systems and methods for viral therapy
US8313896B2 (en) 2008-04-04 2012-11-20 The General Hospital Corporation Oncolytic herpes simplex virus immunotherapy in the treatment of brain cancer
EP2300023A2 (en) 2008-05-16 2011-03-30 Genelux Corporation Microorganisms for preventing and treating neoplasms accompanying cellular therapy
EP2307033A4 (en) 2008-05-29 2012-06-13 Gen Hospital Corp USE OF ONCOLYTIC HERPESVIRUS FOR THE KILLING OF CANCER STEM CELLS
EP3936122A1 (en) 2008-11-24 2022-01-12 Massachusetts Institute Of Technology Methods and compositions for localized agent delivery
US8481297B2 (en) 2009-01-08 2013-07-09 Yale University Compositions and methods of use of an oncolytic vesicular stomatitis virus
US20150359909A1 (en) 2009-07-16 2015-12-17 University College Cork-National University Of Ireland, Cork Orally administered bacteria as vehicles for systemic delivery of agents
EP2283810A1 (en) 2009-07-16 2011-02-16 University College Cork-National University of Ireland, Cork Orally administered bacteria as vehicles for systemic delivery of agents
SI2770061T1 (sl) 2009-07-24 2019-02-28 Immune Design Corp. Neintegrirani lentiviralni vektorji
EP3305798A1 (en) 2010-12-09 2018-04-11 The Trustees of The University of Pennsylvania Use of chimeric antigen receptor-modified t cells to treat cancer
CA2824997C (en) 2011-01-18 2023-01-17 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods for treating cancer
JP2014517685A (ja) * 2011-04-15 2014-07-24 コンピュゲン エルティーディー． 免疫関連疾患およびがんの治療のためのポリペプチドおよびポリヌクレオチドならびにそれらの使用
WO2012149364A1 (en) 2011-04-28 2012-11-01 Diamond Don J Tumor associated vaccines and compositions for disrupting tumor-derived immunosuppression for use in combination cancer immunotherapy
KR20140060541A (ko) 2011-09-16 2014-05-20 더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실바니아 암을 치료하기 위한 rna 조작된 t 세포
KR102057356B1 (ko) 2012-02-27 2019-12-18 아뮤닉스 파마슈티컬스, 인크. Ｘｔｅｎ 콘주게이트 조성물 및 그의 제조 방법
WO2014055657A1 (en) 2012-10-05 2014-04-10 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Use of a trans-signaling approach in chimeric antigen receptors
WO2014198002A1 (en) 2013-06-14 2014-12-18 Ottawa Hospital Research Institute A bacterium producing an interferon binding protein and uses thereof
WO2015103438A2 (en) 2014-01-02 2015-07-09 Genelux Corporation Oncolytic virus adjunct therapy with agents that increase virus infectivity
EP3105333B1 (en) * 2014-02-10 2020-04-08 Emory University Expression of chimeric polypeptide with variable lymphocyte receptors on immune cells and uses for treating cancer
KR20170048396A (ko) * 2014-09-03 2017-05-08 버베리안 노딕 에이/에스 재조합 변형된 백시니아 바이러스 앙카라 (mva) 필로바이러스 백신
EP3020816A1 (en) 2014-11-11 2016-05-18 University College Cork Bacterial mediated gene therapy
CA2980622A1 (en) * 2015-04-02 2016-10-06 Cancure Limited Agents and compositions for eliciting an immune response
WO2016168771A2 (en) * 2015-04-17 2016-10-20 Alpine Immune Sciences, Inc. Immunomodulatory proteins with tunable affinities
AU2016323069A1 (en) * 2015-09-14 2018-04-12 Alpine Immune Sciences, Inc. Tunable variant immunoglobulin superfamily domains and engineered cell therapy
EP3442999A2 (en) * 2016-04-15 2019-02-20 Alpine Immune Sciences, Inc. Icos ligand variant immunomodulatory proteins and uses thereof
MA43552A (fr) * 2016-04-15 2018-11-07 Alpine Immune Sciences Inc Protéines immunomodulatrices à variants de cd80 et leurs utilisations
AU2017266905B2 (en) * 2016-05-18 2022-12-15 Albert Einstein College Of Medicine, Inc. Variant PD-L1 polypeptides, T-cell modulatory multimeric polypeptides, and methods of use thereof

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2010533649A (ja) * 2007-07-13 2010-10-28 ザ ジョンズ ホプキンス ユニバーシティー Ｂ７−ｄｃ改変体
JP2015512263A (ja) * 2012-03-30 2015-04-27 イミューン デザイン コーポレイション Ｄｃ−ｓｉｇｎを発現する細胞に対して改善された形質導入の有効性を有するレンチウイルスベクター粒子
JP2016502554A (ja) * 2012-12-04 2016-01-28 オンコメッド ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド 結合物質を用いた免疫療法

Also Published As

Publication number Publication date
CA3040296A1 (en) 2018-04-26
KR20190099194A (ko) 2019-08-26
CN110352245A (zh) 2019-10-18
EP3529361A1 (en) 2019-08-28
US20200040059A1 (en) 2020-02-06
EP3529361B1 (en) 2021-03-24
EP3872180A1 (en) 2021-09-01
AU2017345764A1 (en) 2019-05-02
WO2018075978A1 (en) 2018-04-26
IL266045A (en) 2019-06-30
SG11201903407XA (en) 2019-05-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP3529361B1 (en) Secretable variant immunomodulatory proteins and engineered cell therapy
US20220242930A1 (en) Immunomodulatory proteins with tunable affinities
US20180256644A1 (en) Tunable variant immunoglobulin superfamily domains and engineered cell therapy
JP7108551B2 (ja) リンパ球に形質導入を行うための方法及び組成物、並びにその制御された増加
JP7280827B2 (ja) Ａｘｌまたはｒｏｒ２に対するキメラ抗原受容体およびその使用方法
AU2019205273B2 (en) Multi-domain immunomodulatory proteins and methods of use thereof
CN108884164A (zh) 用于免疫疗法的经修饰细胞
JP2017519494A (ja) Ｏｘ４０ｌ融合タンパク質およびその使用
JP2020509776A (ja) Ｐｄ−ｌ１バリアント免疫調節タンパク質及びその使用
JP2022501361A (ja) バリアントｃｄ８０融合タンパク質および関連構築物の方法および使用
JP2023138962A (ja) Ｃｔｌａ－４変異型免疫調節タンパク質およびそれらの使用
CN112261950A (zh) 用于治疗cd30+肿瘤的car-cd30 t细胞
JP2020536552A5 (ja)
Levin et al. Novel immunomodulatory proteins generated via directed evolution of variant IgSF domains
EP4146233A2 (en) Compositions and methods for tcr reprogramming using cd70 specific fusion proteins
JP2022547416A (ja) Ｂ細胞標的化並列ＣＡＲ（ｐＣＡＲ）治療的薬剤
KR102663253B1 (ko) 고형암을 위한 키메라 항원 수용체 및 키메라 항원 수용체가 발현된 t세포

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20190726

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20201016

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20201016

RD04 Notification of resignation of power of attorney

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7424

Effective date: 20210204

A977 Report on retrieval

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007

Effective date: 20210823

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20210906

A02 Decision of refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02

Effective date: 20220331