JP2020191802A - 微生物、油分分解剤、及び油分分解方法 - Google Patents
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Abstract
Description
油脂、鉱物油等の油分を含有する廃水の処理のためには、従来から加圧浮上分離法が一般的に使用されている。この方法では、廃水を加圧装置に入れて十分に加圧した後、常圧のタンクに移すことにより、もともと比重の異なる油分と水分とが2層分離してくるので、油分を分離除去することができる。加圧浮上分離法の運転管理は比較的容易であるが、処理水の油分を十分に低位に保持することが困難である場合が多い。さらに、それを実施するためには、比較的大きな装置と、多量の水を加圧するための多量のエネルギーが必要となる。また、この方法では、分離された油分を産業廃棄物として処分する必要がある。
本発明者らは、鋭意検討の結果、油分分解能力の高い微生物を用いて、さらにこの目的に好適な油分分解方法を採用することが重要であるとの結論に達し、上記の目的に合致した微生物を求めて、多様な土壌および水域の微生物を収集し、長期間の探索の末、油分含有物質に含まれる油分を積極的に資化し、分解しうる微生物を得、得られた微生物を用いて、油分含有物質に含まれる油分を分解することができることを見出し、本発明を完成した。
[1] キャンディダ(Candida)属に属し、26S rDNAの塩基配列が、配列番号1で示される塩基配列、又は配列番号1で示される塩基配列と90%以上の相同性を有する塩基配列であり、下記の菌学的性質を示し、塩分0〜5%(W/V)を含む環境下で油分分解活性を有することを特徴とする微生物。
(1)コロニー形態(YM寒天培地、27℃、1週間培養)
色調:白色〜クリーム色
形:円形
***状態:周辺部は扁平で、中央部はクッション形
周縁:全縁
表面の形状:平滑
光沢及び性状:鈍光性、湿性
(2)生育温度:12〜37℃
(3)生育塩濃度:0〜5%(W/V)
(4)細胞形態観察
栄養細胞は楕円形〜卵形
増殖は出芽による
培養4週間で有性生殖器官の形成なし
[2] 生理・生化学的性状試験において、下記の生理・生化学的性質を示す、[1]に記載の微生物。
(1)糖類発酵性試験
グルコース +
ガラクトース −
マルトース −
スクロース +
トレハロース −
ラフィノース +
(2)炭素源資化性試験
グルコース +
ガラクトース −
L−ソルボース −
D−グルコサミン −
D−リボース −
D−キシロース +
L−アラビノース −
D−アラビノース −
L−ラムノース −
スクロース +
マルトース +
トレハロース +
α−メチル−D−グルコシド +
セロビオース +
サリシン L
アルブチン D
メリビオース −
ラフィノース +
メレチトース +
イヌリン +
可溶性デンプン −
グリセロール +
エリスリトール −
リビトール(アドニトール) −
キシリトール −
D−グルシトール(ソルビトール) L
D−マンニトール D
ガラクチトール(ダルシトール) −
イノシトール −
スクシネート −
シトレート D
エタノール +
(3)窒素源資化性
硝酸塩 +
亜硝酸塩 +
L−リジン +
(4)耐性試験
25℃での生育 +
35℃での生育 +
45℃での生育 −
0.01%シクロヘキシミド −
50%(W/V)D−グルコース −
10%塩化ナトリウム/5%グルコース −
(5)ビタミン要求性試験
ビタミン非含有培地 +
(上記において、「+」は陽性、「−」は陰性、「L(latent)」は試験開始2週間以降に急速に陽性反応が認められたこと、「D(delay)」は試験開始後1週間以上の時間をかけて徐々に陽性反応が認められたこと、をそれぞれ示す)
[3] キャンディダ・メンギュニエ(Candida mengyuniae)に属する、[1]又は[2]に記載の微生物。
[4] キャンディダ・メンギュニエ(Candida mengyuniae)MC7株(NITE P−02894)。
[5] [1]〜[4]のいずれか一項に記載の微生物を含有する油分分解剤。
[6] [5]に記載の油分分解剤と油分含有物質とを接触させ、前記油分含有物質中の油分を分解することを特徴とする油分分解方法。
[7] 前記油分含有物質が、油分含有廃水である[6]に記載の油分分解方法。
前記油脂とは、グリセリンと、1〜3個の脂肪酸とがエステル結合したグリセリドを含む物質を意味し、油脂の主要成分であるトリグリセリド(トリアシルグリセロール)のほか、ジグリセリド(ジアシルグリセロール)及びモノグリセリド(モノアシルグリセロール)を含んでいてもよい。また、前記油脂には、動植物性の油脂(動物油、植物油、魚油)のほか、動植物油由来のグリセリド以外の成分(例えば、植物ステロール、レシチン、抗酸化成分、色素成分等)が含まれてもよい。
ガソリンは、芳香族炭化水素類を多く含んでおり、灯油、軽油及び重油は、脂肪族炭化水素類を多く含んでいる。本発明の微生物は、特に、炭素数が22〜36の脂肪族炭化水素類が多く含まれている鉱物油を効率よく分解することができる。
本発明の微生物は、キャンディダ(Candida)属に属し、26S rDNAの塩基配列が、配列番号1で示される塩基配列、又は配列番号1で示される塩基配列と90%以上、好ましくは95%以上、より好ましくは98%以上、さらに好ましくは99%以上の相同性を有する塩基配列であり、下記の菌学的性質を示し、塩分0〜5%(W/V)を含む環境下で油分分解活性を有することを特徴とする。
(1)コロニー形態(YM寒天培地、27℃、1週間培養)
色調:白色〜クリーム色
形:円形
***状態:周辺部は扁平で、中央部はクッション形
周縁:全縁
表面の形状:平滑
光沢及び性状:鈍光性、湿性
(2)生育温度:12〜37℃
(3)生育pH:4.0〜9.0
(4)生育塩濃度:0〜5%(W/V)
(5)細胞形態観察
栄養細胞は楕円形〜卵形
増殖は出芽による
培養4週間で有性生殖器官の形成なし
尚、本発明において、生理・生化学的性状試験は、Kurtzman C. P., Fell J. W., Boekhout T. & Robert V. (2011). Methods for isolation, phenotypic characterization and maintenance of yeasts. In: Kurtzman C. P., Fell J. W. & Boekhout T. (eds.) The Yeasts, a taxonomic study, 5th edition. pp. 87-110, Elsevier, Amsterdam.に記載の方法を用いた。
<生理・生化学的性状試験結果>
(1)糖類発酵性試験
グルコース +
ガラクトース −
マルトース −
スクロース +
トレハロース −
ラフィノース +
(2)炭素源資化性試験
グルコース +
ガラクトース −
L−ソルボース −
D−グルコサミン −
D−リボース −
D−キシロース +
L−アラビノース −
D−アラビノース −
L−ラムノース −
スクロース +
マルトース +
トレハロース +
α−メチル−D−グルコシド +
セロビオース +
サリシン L
アルブチン D
メリビオース −
ラフィノース +
メレチトース +
イヌリン +
可溶性デンプン −
グリセロール +
エリスリトール −
リビトール(アドニトール) −
キシリトール −
D−グルシトール(ソルビトール) L
D−マンニトール D
ガラクチトール(ダルシトール) −
イノシトール −
スクシネート −
シトレート D
エタノール +
(3)窒素源資化性
硝酸塩 +
亜硝酸塩 +
L−リジン +
(4)耐性試験
25℃での生育 +
35℃での生育 +
45℃での生育 −
0.01%シクロヘキシミド −
50%(W/V)D−グルコース −
10%塩化ナトリウム/5%グルコース −
(5)ビタミン要求性試験
ビタミン非含有培地 +
(上記において、「+」は陽性、「−」は陰性、「L(latent)」は試験開始2週間以降に急速に陽性反応が認められたこと、「D(delay)」は試験開始後1週間以上の時間をかけて徐々に陽性反応が認められたこと、をそれぞれ示す)
ここで、「油分分解活性を有する」とは、下記手順で測定した油分分解率が5%以上であることを言う。
手順1:SCD培地(15g/Lカゼインペプトン、5g/L大豆ペプトン、5g/L塩化ナトリウム)50mLに、寒天プレート上の菌株を1白金耳またはグリセロールストック菌株を100μL加え、30℃で一晩、振とうし、前培養を行う。
手順2:塩分0%(W/V)の分解試験用培地(10g/L 鉱物油または油脂、1g/Lコーンスティープリカー、0.5g/L尿素)150mLに、前培養液を100μL加え、pH7、30℃で24時間振とうし、油分分解反応を行う。
手順3:ノルマルヘキサン抽出物質−重量法(JIS K102)により、反応前後のノルマルヘキサン抽出物質濃度を測定し、反応前のノルマルヘキサン抽出物質濃度から、反応後のノルマルヘキサン抽出物質濃度を差し引き、反応前のノルマルヘキサン抽出物質濃度で除することにより、油分分解率を求める。
また、本発明の微生物の油分分解率は、最大の油分分解率を示す温度条件下で、油脂に対する分解率として20%以上が好ましく、30%以上がより好ましく、40%以上がさらに好ましい。
本発明の油分分解剤は、本発明の微生物、又は本発明の微生物の処理物を含む。前記微生物の処理物としては、本発明の微生物の培養液を遠心分離等により集菌したものを、生理食塩水、培地等の媒体に懸濁し、凍結乾燥したもの等が例示される。
本発明の油分分解剤は、液体の形状でも固体の形状でもよい。液体形状のものとしては、微生物の培養液そのもの、微生物を遠心分離等により集菌したものを生理食塩水や培地等の媒体に再度分散させたもの等が例示される。固体形状のものは、例えば微生物の培養菌体を凍結乾燥したもの等が例示される。固形形状のものは、例えば、「産業用酵素、上島孝之著、丸善、1995年」等に記載の方法により、微生物を顆粒状にしたものであってもよい。また、微生物を各種担体に固定化したものであってもよい。
本発明の油分分解方法は、本発明の油分分解剤と前記油分含有物質とを接触させ、前記油分含有物質中の油分を分解する方法である。前記油分含有物質に、本発明の油分分解剤を接触させる方法としては、本発明の油分分解剤と前記油分含有物質とを直接接触させる方法、本発明の油分分解剤を、前記油分含有物質に添加して、前記油分分解剤中の微生物を培養する方法、本発明の油分分解剤中の微生物を前培養し、得られた培養液を、前記油分含有物質に添加する方法、本発明の油分分解剤中の微生物を前培養し、得られた培養液を、前記油分含有物質に添加して、前記微生物を培養する方法等が挙げられる。
本発明の油分分解剤と前記油分含有物質との接触は、好気的条件下で行うことが好ましい。
本発明の油分分解剤と油分分解物質とを接触させる際の温度は、特に制限はないが、12〜37℃が好ましく、15〜35℃がより好ましく、25〜35℃がさらに好ましく、30℃が特に好ましい。
本発明の油分分解剤と油分含有物質とを接触させる際の、油分分解剤の量は、特に制限はないが、例えば、微生物の生菌数として、107〜109個/mL程度となる量である。
本発明の油分分解剤と油分含有物質とを接触させる時間は、特に制限はないが、1時間〜168時間が好ましく、24時間〜96時間がより好ましく、48時間〜72時間がさらに好ましい。
<MC7株の分離>
L字型試験管に無機培地[(NH4)2SO4、NaNO3、及びK2HPO4を任意の割合で混合後、10μmのフィルターで沈殿物を濾過したもの]10mL、油脂として菜種油10μL、及び汚泥1gを加え、懸濁するまで30℃で斜方振とう培養した。得られた懸濁液を100μL分取して、同様に無機培地10mLと、菜種油10μLとを加えたL字試験管に添加し、無機培地が懸濁するまで振とう培養した。この操作を6回繰り返した後、寒天平板培地へ段階的に希釈した懸濁液100μLを滴下し、コンラージ棒で塗沫して30℃で24時間培養した。なお、寒天培地は菜種油を塗布した無機寒天培地を用い、これらの培地上にコロニーが適度に形成された培養シャーレを選び、形状の整ったコロニーを新たなLB寒天培地に取り分けて菌体を分離した。このような方法を用いて油脂分解活性を有する菌株を50株取得した。
上記で得られたMC7株について、26S rDNAの塩基配列解析を行った。なお、PCR増幅はITS5及びNL4プライマーを用いてターゲット領域のDNAを増幅した後、シークエンスはNL1、NL4プライマーを用いて増幅し、塩基配列を決定した。決定されたMC7株の26S rDNAは、配列番号1で示される塩基配列からなることが確認された。
得られた塩基配列を、国際塩基配列データベース(DDBJ/EMBL/GenBank)に対するBLAST相同検索を行った結果、MC7株の26S rDNAの塩基配列は、子嚢菌系酵母の一種であるCandida mengyuniae CBS 10845Tに対し、相同率100%の相同性を示した。相同性検索で得られた塩基配列を基に解析した分子系統樹を図1に示す。この分子系統樹において、MC7株は、Candida属及びCyberlndnera属で構成される系統群に含まれ、キャンディダ・メンギュニエ(Candida mengyuniae) CBS 10845T(アクセッション番号EU043158)と同一の分子系統学的位置を示した。以上のことから、MC7株は、キャンディダ・メンギュニエ(Candida mengyuniae)に帰属すると推定された。
(1)コロニー形態(YM寒天培地、27℃、1週間培養)
色調:白色〜クリーム色
形:円形
***状態:周辺部は扁平で、中央部はクッション形
周縁:全縁
表面の形状:平滑
光沢及び性状:鈍光性、湿性
(2)生育温度:12〜37℃(至適温度:30℃)
(3)生育pH:4.0〜9.0(至適pH:5.0)
(4)生育塩濃度:0〜5%(W/V)
(5)細胞形態観察
栄養細胞は楕円形〜卵形
増殖は出芽による
培養4週間で有性生殖器官の形成なし
<生理・生化学的性状試験結果>
(1)糖類発酵性試験
グルコース +
ガラクトース −
マルトース −
スクロース +
トレハロース −
ラフィノース +
(2)炭素源資化性試験
グルコース +
ガラクトース −
L−ソルボース −
D−グルコサミン −
D−リボース −
D−キシロース +
L−アラビノース −
D−アラビノース −
L−ラムノース −
スクロース +
マルトース +
トレハロース +
α−メチル−D−グルコシド +
セロビオース +
サリシン L
アルブチン D
メリビオース −
ラフィノース +
メレチトース +
イヌリン +
可溶性デンプン −
グリセロール +
エリスリトール −
リビトール(アドニトール) −
キシリトール −
D−グルシトール(ソルビトール) L
D−マンニトール D
ガラクチトール(ダルシトール) −
イノシトール −
スクシネート −
シトレート D
エタノール +
(3)窒素源資化性
硝酸塩 +
亜硝酸塩 +
L−リジン +
(4)耐性試験
25℃での生育 +
35℃での生育 +
45℃での生育 −
0.01%シクロヘキシミド −
50%(W/V)D−グルコース −
10%塩化ナトリウム/5%グルコース −
(5)ビタミン要求性試験
ビタミン非含有培地 +
(上記において、「+」は陽性、「−」は陰性、「L(latent)」は試験開始2週間以降に急速に陽性反応が認められたこと、「D(delay)」は試験開始後1週間以上の時間をかけて徐々に陽性反応が認められたこと、をそれぞれ示す)
<MC7株を用いた鉱物油の分解>
300mL三角フラスコにSCD培地(15g/Lカゼインペプトン、5g/L大豆ペプトン、5g/L塩化ナトリウム)50mLと寒天プレート上のMC7株を1白金耳加え、30℃で一晩、振とうし、前培養を行った。油分分解試験は、500mL三角フラスコに分解試験用培地(10g/L シェルテラスオイルC、1g/L コーンスティープリカー、0.5g/L 尿素)150mL、及び前培養液100μL加え、所定のpH、温度で振とうした。pH7にて15℃〜35℃で24時間分解を行った結果を図2に示す。MC7株は、30℃にて最大の分解率23%を示した。また、30℃にてpH4〜8で24時間分解を行った結果を図3に示す。MC7株は、pH5において最大の分解率29%を示した。
<MC7株を用いた油脂の分解>
300mL三角フラスコにSCD培地(15g/Lカゼインペプトン、5g/L大豆ペプトン、5g/L塩化ナトリウム)50mLと寒天プレート上のMC7株を1白金耳加え、30℃で一晩、振とうし、前培養を行った。油分分解試験は、500mL三角フラスコに分解試験用培地(10g/L 菜種油、1g/Lコーンスティープリカー、0.5g/L尿素)150mL、及び前培養液100μL加え、所定のpH、温度で振とうした。pH7にて15℃〜35℃で24時間分解を行った結果を図4に示す。MC7株は、30℃にて最大の分解率54%を示した。また、30℃にてpH4〜8で24時間分解を行った結果を図5に示す。MC7株は、pH5において最大の分解率67%を示した。
300mL三角フラスコにSCD培地(15g/Lカゼインペプトン、5g/L大豆ペプトン、5g/L塩化ナトリウム)50mLと寒天プレート上のキャンディダ・アルビカンス(Candida albicans)ATCC90029株を1白金耳加え、30℃で一晩、振とうし、前培養を行った。鉱物油分解試験は実施例2と同様の方法により行い、油脂分解試験は、実施例3と同様の方法により行った。油脂に対してpH7にて15℃〜35℃で24時間分解を行った結果を図6に示す。また、鉱物油に対して、30℃にてpH4〜8で24時間分解を行った結果を図7に示す。いずれの油分に対しても、キャンディダ・アルビカンス(Candida albicans)ATCC90029株の分解率は、MC7株の分解率よりも劣っていた。
Claims (7)
- キャンディダ(Candida)属に属し、26S rDNAの塩基配列が、配列番号1で示される塩基配列、又は配列番号1で示される塩基配列と90%以上の相同性を有する塩基配列であり、下記の菌学的性質を示し、塩分0〜5%(W/V)を含む環境下で油分分解活性を有することを特徴とする微生物。
(1)コロニー形態(YM寒天培地、27℃、1週間培養)
色調:白色〜クリーム色
形:円形
***状態:周辺部は扁平で、中央部はクッション形
周縁:全縁
表面の形状:平滑
光沢及び性状:鈍光性、湿性
(2)生育温度:12〜37℃
(3)生育pH:4.0〜9.0
(4)生育塩濃度:0〜5%(W/V)
(5)細胞形態観察
栄養細胞は楕円形〜卵形
増殖は出芽による
培養4週間で有性生殖器官の形成なし - 生理・生化学的性状試験において、下記の生理・生化学的性質を示す、請求項1に記載の微生物。
(1)糖類発酵性試験
グルコース +
ガラクトース −
マルトース −
スクロース +
トレハロース −
ラフィノース +
(2)炭素源資化性試験
グルコース +
ガラクトース −
L−ソルボース −
D−グルコサミン −
D−リボース −
D−キシロース +
L−アラビノース −
D−アラビノース −
L−ラムノース −
スクロース +
マルトース +
トレハロース +
α−メチル−D−グルコシド +
セロビオース +
サリシン L
アルブチン D
メリビオース −
ラフィノース +
メレチトース +
イヌリン +
可溶性デンプン −
グリセロール +
エリスリトール −
リビトール(アドニトール) −
キシリトール −
D−グルシトール(ソルビトール) L
D−マンニトール D
ガラクチトール(ダルシトール) −
イノシトール −
スクシネート −
シトレート D
エタノール +
(3)窒素源資化性
硝酸塩 +
亜硝酸塩 +
L−リジン +
(4)耐性試験
25℃での生育 +
35℃での生育 +
45℃での生育 −
0.01%シクロヘキシミド −
50%(W/V)D−グルコース −
10%塩化ナトリウム/5%グルコース −
(5)ビタミン要求性試験
ビタミン非含有培地 +
(上記において、「+」は陽性、「−」は陰性、「L」は試験開始2週間以降に急速に陽性反応が認められたこと、「D」は試験開始後1週間以上の時間をかけて徐々に陽性反応が認められたこと、をそれぞれ示す) - キャンディダ・メンギュニエ(Candida mengyuniae)に属する、請求項1又は2に記載の微生物。
- キャンディダ・メンギュニエ(Candida mengyuniae)MC7株(NITE P−02894)。
- 請求項1〜4のいずれか一項に記載の微生物を含有する油分分解剤。
- 請求項5に記載の油分分解剤と油分含有物質とを接触させ、前記油分含有物質中の油分を分解することを特徴とする油分分解方法。
- 前記油分含有物質が、油分含有廃水である請求項6に記載の油分分解方法。
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