JP2020186953A - 質量分析用標識組成物、代謝物の定量分析法、及び代謝物の動態解析法 - Google Patents
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Abstract
Description
2H、13C、18O等の安定同位体で標識したリン酸化合物を用い、31P−NMR等で反応機構等を解析する方法も知られている(例えば、非特許文献1、2)。標識に安定同位体を用いれば、放射線によって分析対象物が損傷を受けることを防止できる。
[1]2種以上の標識化合物を含む質量分析用標識組成物であって、
前記の2種以上の標識化合物は、生体内の代謝変換の一連の経路の中の2種以上のリン酸化合物が、18Oを含む1種以上の安定同位体により標識された2種以上の標識化合物であり、
前記の2種以上の標識化合物は、前記の2種以上の標識化合物と、前記の2種以上の標識化合物の代謝変換によって生じる標識化合物とが、多重反応モニタリングのトランジションで互いに区別できるように標識されている、質量分析用標識組成物。
[2]前記安定同位体が、18Oと、2H、13C、15N及び17Oからなる群から選ばれる1種以上との組み合わせである、[1]に記載の質量分析用標識組成物。
[3]前記の2種以上の標識化合物が、ヌクレオシド、ヌクレオシド一リン酸、ヌクレオシド二リン酸、及びヌクレオシド三リン酸からなる群から選ばれる2種以上が標識された標識化合物である、[1]又は[2]に記載の質量分析用標識組成物。
[4]前記の2種以上の標識化合物が、ヌクレオシド二リン酸が標識された標識化合物と、ヌクレオシド三リン酸が標識された標識化合物とを含む、[1]又は[2]に記載の質量分析用標識組成物。
[5][1]〜[4]のいずれかに記載の質量分析用標識組成物を用い、前記の2種以上の標識化合物を内部標準物質として対象の代謝物を絶対定量する、代謝物の定量分析法。
[6][1]〜[4]のいずれかに記載の質量分析用標識組成物を用いて対象の代謝物の動態を解析する、代謝物の動態解析法。
本発明の質量分析用標識組成物(以下、「本標識組成物」とも記す。)は、2種以上の標識化合物を含む。
本標識組成物中の2種以上の標識化合物は、生体内の代謝変換の一連の経路の中の2種以上のリン酸化合物が、18Oを含む1種以上の安定同位体によって標識されたものである。また、本標識組成物中の2種以上の標識化合物は、それら2種以上の標識化合物と、それら2種以上の標識化合物の代謝変換によって生じる標識化合物とが、多重反応モニタリング(MRM:Multiple Reaction Monitoring)のトランジションで互いに区別できるように標識されている。すなわち、2種以上の標識化合物は、それら2種以上の標識化合物と、それら2種以上の標識化合物から一連の代謝の分解及び再合成によって生じる標識化合物とがMRMトランジションで互いに区別できるように標識されている。
ATP、ADP、AMP及びアデノシンの組み合わせは、代謝変換の一連の経路の中のリン酸化合物である。同様に、GTP、GDP、GMP及びグアノシンの組み合わせ、UTP、UDP、UMP及びウリジンの組み合わせ、m5UTP、m5UDP、m5UMP及び5−メチルウリジンの組み合わせ、CTP、CDP、CMP及びシチジンの組み合わせ、dATP、dADP、dAMP及びデオキシアデノシンの組み合わせ、dGTP、dGDP、dGMP及びデオキシグアノシンの組み合わせ、dUTP、dUDP、dUMP及びデオキシウリジンの組み合わせ、dTTP、dTDP、dTMP及びデオキシチミジンの組み合わせ、dCTP、dCDP、dCMP及びデオキシシチジンの組み合わせは、代謝変換の一連の経路の中のリン酸化合物である。
18O以外の安定同位体を用いる場合、生体化合物中における存在確率が多い点から、リン酸化合物を標識する安定同位体は、18Oと、2H、13C、15N及び17Oからなる群から選ばれる1種以上との組み合わせが好ましく、18Oと、13C及び15Nのいずれか一方又は両方との組み合わせがより好ましい。
また、一般に、生体中に含まれるリン酸化合物の炭素骨格部分は、複雑な糖や脂質等の化学合成法では合成が困難なものが多い。そのため、より安価かつ簡便に得られる点では、本標識組成物における標識化合物は、リン酸化合物の炭素骨格部分を非標識体とし、リン酸部分を18Oで標識した標識化合物が好ましい。
標識化合物の合成方法は、特に限定されず、公知の方法を採用できる。
本発明の代謝物の定量分析法は、本標識組成物を用い、2種以上の標識化合物を内部標準物質として、対象の代謝物を絶対定量する方法である。具体的には、本標識組成物中の2種以上の標識化合物を内部標準物質とし、GC−MS/MS、LC−MS/MS等でMRM測定を行い、対象の代謝物を絶対定量する。
本標識組成物中の2種以上の標識化合物を内部標準物質として用いる以外のMRM測定の測定条件は、適宜設定できる。
本発明の代謝物の動態解析法は、本標識組成物を用いて対象の代謝物の動態を解析する方法である。具体的には、本標識組成物中の2種以上の標識化合物を分析試料に添加し、所定の条件で保持した後に、GC−MS/MS、LC−MS/MS等でMRM測定を行い、対象の代謝物の動態を解析する。
本標識組成物中の2種以上の標識化合物を用いる以外のMRM測定の測定条件は、適宜設定できる。
[例1]細胞抽出液中のATPの酸化分解状況の評価実験
10cmディッシュで培養したHeLa細胞を、リン酸緩衝食塩水(PBS)で3回洗浄し、冷メタノール(1mL)で代謝をクエンチした後に、スクレーピング処理により細胞縣濁抽出液を回収した。前記細胞抽出液に、内部標準物質として標識化合物(C−1)10nmolを添加し、さらに、クロロホルム及び水を添加することで2相分画を行った。親水性代謝物画分として上相の水メタノール抽出液を回収し、分析試料を得た。前記分析試料中の標識化合物(C−1)について、LC−MS/MSとしてNexera UHPLC−LCMS−8060(株式会社津製作所)によるMRM測定を行った。
標識化合物(C−1)のMRMトランジションは、m/z=526→422、136である。標識化合物(C−1)の分解物である標識化合物(C−11)のMRMトランジションは、m/z=440→136、119である。標識化合物(C−11)の分解物である標識化合物(C−12)のMRMトランジションは、m/z=354→69、136である。
標識化合物(C−1)を添加した分析試料のMRM測定は2回(n=2)行った。また、細胞抽出液に含まれている、18Oで標識されていないATP(非標識ATP)についてもMRM測定を行った。結果を図1に示す。
水、及び、濃度0.1質量%、1質量%、5質量%のギ酸水溶液のそれぞれに、標識化合物(D−1)を200質量ppmとなるように添加し、4℃、室温(25℃)、及び40℃で保存した。調製直後、5日後、及び20日後の各溶液について、LC−MS/MSとしてACQUITY H class(waters製)及びXEVO−G2XSQTOF(waters製)を用いて以下の条件で質量分析を行い、18O濃縮度を算出した。結果を図2に示す。
(質量分析条件)
移動相A:5mM酢酸アンモニウム水溶液、
移動相B:5mM酢酸アンモニウム/アセトニトリル、
分離カラム:CAPCELLPAK ADME 2μm 2.1×100mm、
イオン化モード:ネガティブ、
キャピラリー電圧:2.0kV、
コーン電圧:40V、
ソース温度:150℃、
脱溶媒ガス温度:350℃、
脱溶媒ガス流量:800L/h、
コーンガス流量50L/h。
標識化合物(D−1)の代わりに標識化合物(D−2)を用いた場合についても、同様にして18O濃縮度を算出した。結果を図3に示す。
また、図3に示すように、標識化合物(D−2)においても、溶液中で18Oの16Oとの交換は観察されず、18O濃縮度はほとんど低下しなかった。
Claims (6)
- 2種以上の標識化合物を含む質量分析用標識組成物であって、
前記の2種以上の標識化合物は、生体内の代謝変換の一連の経路の中の2種以上のリン酸化合物が、18Oを含む1種以上の安定同位体により標識された2種以上の標識化合物であり、
前記の2種以上の標識化合物は、前記の2種以上の標識化合物と、前記の2種以上の標識化合物の代謝変換によって生じる標識化合物とが、多重反応モニタリングのトランジションで互いに区別できるように標識されている、質量分析用標識組成物。 - 前記安定同位体が、18Oと、2H、13C、15N及び17Oからなる群から選ばれる1種以上との組み合わせである、請求項1に記載の質量分析用標識組成物。
- 前記の2種以上の標識化合物が、ヌクレオシド、ヌクレオシド一リン酸、ヌクレオシド二リン酸、及びヌクレオシド三リン酸からなる群から選ばれる2種以上が標識された標識化合物である、請求項1又は2に記載の質量分析用標識組成物。
- 前記の2種以上の標識化合物が、ヌクレオシド二リン酸が標識された標識化合物と、ヌクレオシド三リン酸が標識された標識化合物とを含む、請求項1又は2に記載の質量分析用標識組成物。
- 請求項1〜4のいずれか一項に記載の質量分析用標識組成物を用い、前記の2種以上の標識化合物を内部標準物質として対象の代謝物を絶対定量する、代謝物の定量分析法。
- 請求項1〜4のいずれか一項に記載の質量分析用標識組成物を用いて対象の代謝物の動態を解析する、代謝物の動態解析法。
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