JP2020172505A

JP2020172505A - ヒト補体ｃ５に結合する安定なポリペプチド

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Publication number: JP2020172505A
Application number: JP2020113725A
Authority: JP
Inventors: ヨアキム・ニルソン; Nilsson Joakim; エーリク・ノルドリング; Nordling Erik; パトリク・ストレームベルイ; Stroemberg Patrik
Original assignee: Swedish Orphan Biovitrum AB
Current assignee: Swedish Orphan Biovitrum AB
Priority date: 2013-08-28
Filing date: 2020-07-01
Publication date: 2020-10-22
Also published as: MX2016002397A; EP3811961A1; CA2926976A1; EP3038633B1; KR20160048121A; JP6767865B2; SI3038633T1; CA2926976C; CN105658228B; EP3038633A1; IL244218A; RU2016111115A3; PH12016500371A1; RU2020128977A; DK3038633T3; RS61347B1; WO2015028558A1; AU2014314222B2; BR112016003142A2; HK1225656A1

Abstract

【課題】ヒト補体成分５（Ｃ５）に結合することが可能なポリペプチドを提供する。【解決手段】アミノ酸配列［ＢＭ］−［Ｌ２］−ＱＳＸ４２Ｘ４３ＬＬＸ４６ＥＡＫＫＬＸ５２Ｘ５３Ｘ５４Ｑを含み、式中、［ＢＭ］は、Ｃ５結合モチーフであり；［Ｌ２］は、相互接続ループであり；Ｘ４２は、ＡおよびＳから選択され；Ｘ４３は、ＮおよびＥから選択され；Ｘ４６は、Ａ、ＳおよびＣから選択され；Ｘ５２は、Ｅ、ＮおよびＳから選択され；Ｘ５３は、Ｄ、ＥおよびＳから選択され、但し、Ｘ５２がＮである場合にはＸ５３はＤではなく；Ｘ５４は、ＡおよびＳから選択される、前記ポリペプチド。【選択図】なし

Description

本発明は、ヒト補体成分５（Ｃ５）に結合するポリペプチド、および治療におけるかかるポリペプチドの使用に関する。

補体タンパク質Ｃ５は、自然免疫系の重要な一部である補体系の、中心的成分である。補体系は、厳しく制御された多様なプロセスにおいて多数の役割を有する複雑な免疫監視系である。これは、他の生物による感染に対する第一線の宿主防御系として機能し、また、細胞細片ならびにアポトーシス細胞および壊死細胞から健康な宿主組織を識別する際にも機能する。さらに、これは、免疫複合体のクリアランス、適応免疫応答の調節、組織再生の促進、血管新生、幹細胞の動員および中枢神経系の発生に関与する（非特許文献１；非特許文献２）。補体の活性化および調節の微妙なバランスを乱す任意の引き金、例えば、誤ったもしくは無制限の活性化または不十分な調節は、広範な組織損傷をもたらす宿主の細胞の自己攻撃を含む、病原的な状態をもたらす。

補体系は、約３０種のタンパク質からなる。補体を開始させるための３つの経路が存在する；細胞の表面上の免疫複合体を認識するためにＣ１ｑを使用する古典経路；マンノース結合レクチン（ＭＢＬ）が特定の糖を認識する場合に開始されるレクチン経路；および補体因子３（Ｃ３）の加水分解によって自発的に開始される代替経路（ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅｐａｔｈｗａｙ）。この代替経路は、侵入する病原体上には存在しない特定の哺乳動物細胞表面分子によって抑制されるプロセスである。代替経路は、補体系のための増幅ループとしても作用する。３つの経路は全て、Ｃ３の段階において収束する。Ｃ３ａおよびＣ３ｂへのＣ３の切断は、コンバターゼの形成をもたらし、これが次に、補体因子５（Ｃ５）をＣ５ａおよびＣ５ｂへと切断する。Ｃ５ａは、種々の免疫細胞の非常に強力な誘引因子であるが、Ｃ５ｂは、Ｃ６〜９とオリゴマー化して、膜侵襲複合体（ｍｅｍｂｒａｎｅａｔｔａｃｋｃｏｍｐｌｅｘ）（ＭＡＣ）または時折、終末補体複合体（ＴＣＣ）として公知のポアを形成する。補体系の活性化は、病原体を中和することを目的としたいくつかの機構につながる；侵入する細菌などの細胞の表面上でのＭＡＣの形成は、溶解をもたらし、Ｃ３およびＣ４の切断産物Ｃ３ｂおよびＣ４ｂの沈着は、マクロファージによる病原体の食作用をもたらすオプソニン化を助け、Ｃ３ａおよびＣ５ａなどのアナフィラトキシンは、活性化部位へと単球および好中球を誘引し、増加した免疫学的感受性およびサイトカインの放出をもたらす表面マーカーを上方調節する。

Ｃ５は、それぞれ１１５ｋＤａおよび７５ｋＤａの分子量を有するジスルフィド連結された２つのポリペプチド鎖、アルファおよびベータから構成される、１９０ｋＤａの糖タンパク質である（非特許文献３）。非特許文献４は、１８アミノ酸のリーダーペプチドと、ベータ鎖とアルファ鎖とを隔てる４アミノ酸のリンカーを含む１，６７６アミノ酸のプロ分子とをコードすると予測されるヒト補体プロ−Ｃ５の完全ｃＤＮＡ配列を構築した（配列番号２５１）。Ｃ５は、補体活性化の全ての経路に共通しているので、Ｃ５を遮断することは、刺激と無関係にカスケードの進行を停止させ、それによって、近位補体カスケードの免疫保護機能および免疫調節機能をインタクトなままにしつつ、終末補体活性化の有害な特性を防止する。

病原体に対する防御における補体系の重要な役割の故に、一般に、補体系は、医薬介入のための興味深い標的である。これは、補体の多くの変異または損なわれた調節が、種々の疾患および状態に関与するという事実によって強調される。これらには、免疫複合体の沈着が古典経路を誘発する全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）などの自己免疫疾患に対す
る増加した感受性が含まれる（非特許文献５）。さらに、補体タンパク質Ｃ１〜Ｃ５の変異は、ＳＬＥまたはＳＬＥ様症状を生じる場合が多い。補体系の強い関与を伴う他の自己免疫疾患は、免疫複合体がＲＡ関節において補体を活性化する関節リウマチ（ＲＡ）、シェーグレン症候群、皮膚筋炎および他の自己抗体駆動性疾患、例えば、ギラン・バレー症候群（ＧＢＳ）、フィッシャー症候群（非特許文献６）、異なる型の血管炎、全身性強皮症、抗糸球体基底膜（抗ＧＢＭ）および抗リン脂質症候群（ＡＰＳ）（非特許文献７）である。さらに、補体の阻害は、歯周炎（非特許文献８）、創傷治癒（非特許文献９、オンライン公開）、腫瘍増殖（非特許文献１０）ならびに眼の疾患、例えば、ぶどう膜炎および加齢黄斑変性（ＡＭＤ）（非特許文献１１）などの種々の状態の動物モデルにおいて有効であることが証明されている。

ヒト補体Ｃ５に対して標的化された抗体は、例えば、特許文献１；特許文献２；および特許文献３から公知である。エクリズマブ（Ｓｏｌｉｒｉｓ（商標））は、タンパク質Ｃ５に対して指向されたヒト化モノクローナル抗体であり、Ｃ５ａおよびＣ５ｂへのＣ５の切断を防止する。エクリズマブは、血管内溶血性貧血、血栓形成傾向および骨髄不全を特徴とする、稀でありかつ時折生命を危うくする血液の疾患、発作性夜間ヘモグロビン尿症（ＰＮＨ）を処置する際に有効であることが示されており、この適応症について承認されている。エクリズマブは、非典型溶血性***症候群（ａＨＵＳ）の処置のためにも、ＦＤＡによって最近承認された。この症候群は、過剰活性化をもたらす副補体経路の制御の喪失によって引き起こされる、稀であるが生命を危うくする疾患であり、この過剰活性化は、腎臓、心臓および脳などの重要な臓器への損傷の一定のリスクをもたらす血栓性微小血管症（ＴＭＡ）として顕在化する。ａＨＵＳでは、肝臓が制御性タンパク質（最も頻繁には補体因子Ｈまたは代替経路の他のタンパク質）の変異形態を産生し続けるので、損傷した臓器の移植は、患者を一時的に助けるに過ぎない。一過性の急性病態生理を有する関連疾患は、志賀毒素陽性大腸菌（ＳＴＥＣ−ＨＵＳ）の感染によって引き起こされるＨＵＳであり、この状態についても、効能を示唆する有望な臨床データが存在する（非特許文献１２）。最後に、Ｃ５遮断抗体エクリズマブは、高度に不適合の腎臓のレシピエントにおいて抗体媒介性拒絶反応（ＡＭＲ）を予防する際（非特許文献１３）、ならびに視神経脊髄炎および重症筋無力症などの自己免疫性神経障害を処置する際に（非特許文献１４；非特許文献１５）、効果的であることが証明されている。

全長抗体とは別に、Ｃ５を標的化する単鎖可変断片（ｓｃＦＶ）、ミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）およびアプタマーが、文献中に記載されている。これらのＣ５インヒビターは、Ｃ５分子上の異なる部位（エピトープ）に結合することがあり、また異なる作用様式を有することもある。例えば、エクリズマブは、コンバターゼ切断部位から少し離れたところでＣ５と相互作用するが、ミニボディＭｕｂｏｄｉｎａ（登録商標）は、Ｃ５の切断部位と相互作用する。ヒメダニのオルニトドロス・モウバタ（Ｏｒｎｉｔｈｏｄｏｒｏｓ
ｍｏｕｂａｔａ）由来のＣ５阻害タンパク質オルニトドロス・モウバタ補体インヒビター（ＯｍＣＩ、非特許文献１６）は、コンバターゼ切断部位に近い、ＣＵＢ−Ｃ５ｄ−ＭＧ８スーパードメインの遠位端に結合すると仮説が立てられている（非特許文献１７）。Ｃ５の切断を阻害する、上で言及した３種のタンパク質とは対照的に、モノクローナル抗体ＴＮＸ−５５８は、Ｃ５の切断を阻害することなく、インタクトなＣ５および放出されたＣ５ａの両方に存在するＣ５ａエピトープに結合する（非特許文献１８）。

Ｃ５結合モチーフを含むＣ５結合ポリペプチドは、特許文献４として公開された特許文献５に開示されている。特に、特許文献４は、アミノ酸配列
ＥＸ_２Ｘ_３Ｘ_４ＡＸ_６Ｘ_７ＥＩＤＸ_１１ＬＰＮＬＸ_１６Ｘ_１７Ｘ_１８ＱＷＸ_２１ＡＦＩＸ_２５Ｘ_２６ＬＸ_２８Ｄ
からなるＣ５結合モチーフＢＭを開示しており、
式中、互いに独立に、
Ｘ_２は、Ｈ、Ｑ、Ｓ、ＴおよびＶから選択され；
Ｘ_３は、Ｉ、Ｌ、ＭおよびＶから選択され；
Ｘ_４は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、ＴおよびＹから選択され；
Ｘ_６は、ＮおよびＷから選択され；
Ｘ_７は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、ＳおよびＴから選択され；
Ｘ_１１は、Ａ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、ＴおよびＹから選択され；
Ｘ_１６は、ＮおよびＴから選択され；
Ｘ_１７は、Ｉ、ＬおよびＶから選択され；
Ｘ_１８は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、ＳおよびＴから選択され；
Ｘ_２１は、Ｉ、ＬおよびＶから選択され；
Ｘ_２５は、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｎ、ＳおよびＴから選択され；
Ｘ_２６は、ＫおよびＳから選択され；
Ｘ_２８は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、ＴおよびＹから選択される。

特許文献４で以前に開示された特異的Ｃ５結合モチーフの例は、本特許出願において、配列番号１〜２４８として示される。

さらなるペプチドまたはポリペプチドが、Ｃ５結合ポリペプチドの安定化を改善できることが、特許文献４から公知である。かかるポリペプチドの一例は、本明細書において配列番号２５０として示されるアルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）である。適切なアルブミン結合ドメインの他の例は、特許文献６および特許文献７に開示されている。ＡＢＤ伸長ポリペプチドは、ｉｎｖｉｖｏで血清アルブミンに結合し、血清アルブミンの半減期がより長いことによる恩恵を受け、ポリペプチド自体の正味の半減期が増加する（例えば、特許文献８を参照のこと）。

ＷＯ９５／２９６９７ＷＯ０２／３０９８５ＷＯ２００４／００７５５３ＷＯ２０１３／１２６００６国際特許出願番号ＰＣＴ／ＳＥ２０１３／０５０１３９ＷＯ２００９／０１６０４３ＷＯ２０１２／００４３８４ＷＯ９１／０１７４３

ＷｏｏｄｒｕｆｆらＭｏｌＩｍｍｕｎｏｌ２０１１、４８（１４）：１６３１〜１６４２頁ＲｉｃｋｌｉｎらＮａｔＩｍｍｕｎｏｌ２０１０、１１（９）：７８５〜７９５頁ＴａｃｋらＢｉｏｃｈｅｍ１９７９、１８：１４９０〜１４９７頁Ｈａｖｉｌａｎｄら（ＪＩｍｍｕｎ１９９１、１４６：３６２〜３６８頁）ＭａｎｄｅｒｓｏｎらＡｎｎｕＲｅｖＩｍｍｕｎｏｌ２００４、２２：４３１〜４５６頁ＫａｉｄａらＪ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎ２０１０、２２３：５〜１２頁ＣｈｅｎらＪＡｕｔｏｉｍｍｕｎ２０１０、３４：Ｊ２７６〜Ｊ２８６頁ＡｂｅらＪＩｍｍｕｎｏｌ２０１２、１８９：５４４２〜５４４８頁ＣａｚｅｎｄｅｒらＣｌｉｎＤｅｖＩｍｍｕｎｏｌ２０１２頁ＭａｒｋｉｅｗｓｋｉらＮａｔＩｍｍｕｎｏｌ２００８、９：１２２５〜１２３５頁ＣｏｐｌａｎｄらＣｌｉｎＥｘｐＩｍｍｕｎｏｌ２００９、１５９：３０３〜３１４頁Ｌａｐｅｙｒａｑｕｅら、ＮＥｎｇｌＪＭｅｄ２０１１、３６４：２５６１〜２５６３頁Ｓｔｅｇａｌｌ，Ｍ．Ｄ．らＡｍＪＴｒａｎｓｐｌａｎｔ２０１１、１１：２４０５〜２４１３頁ＰｉｔｔｏｃｋらＬａｎｃｅｔＮｅｕｒｏｌ２０１３、１２：５５４〜５６２頁ＨｏｗａｒｄらＭｕｓｃｌｅＮｅｒｖｅ２０１３、４８：７６〜８４頁Ｎｕｎｎ，Ｍ．Ａ．らＪＩｍｍｕｎｏｌ２００５、１７４：２０８４〜２０９１頁ＦｒｅｄｓｌｕｎｄらＮａｔＩｍｍｕｎｏｌ２００８、９（７）：７５３〜７６０頁ＦｕｎｇらＣｌｉｎＥｘｐＩｍｍｕｎｏｌ２００３、１３３（２）：１６０〜１６９頁

同等のＣ５遮断活性を有する薬剤の継続的な提供は、依然として当分野での大きな関心事である。特に、終末補体カスケード、ならびに炎症促進性分子Ｃ５ａの形成を防止する分子が、継続して必要とされている。疾患の処置におけるかかる分子の使用の提供もまた、大いに関心が持たれる。

アミノ酸配列が特定の位置において改変されているＣ５結合ポリペプチドおよび化合物が、以前に公知のＣ５結合ポリペプチドおよび化合物と比較した場合に、改善された安定性を有することが、驚くべきことに見出された。

結果的に、本発明は、ヒト補体成分５（Ｃ５）に結合することが可能なポリペプチドであって：
（ａ）アミノ酸配列
［ＢＭ］−［Ｌ２］−ＱＳＸ_４２Ｘ_４３ＬＬＸ_４６ＥＡＫＫＬＸ_５２Ｘ_５３Ｘ_５４Ｑ
を含むポリペプチドであって、
式中、互いに独立に、
［ＢＭ］は、Ｃ５結合モチーフであり；
［Ｌ２］は、ＤＤＰＳおよびＲＱＰＥから選択され；
Ｘ_４２は、ＡおよびＳから選択され；
Ｘ_４３は、ＮおよびＥから選択され；
Ｘ_４６は、Ａ、ＳおよびＣから選択され；
Ｘ_５２は、Ｅ、ＮおよびＳから選択され；
Ｘ_５３は、Ｄ、ＥおよびＳから選択され、但し、Ｘ_５２がＮである場合にはＸ_５３はＤではなく；
Ｘ_５４は、ＡおよびＳから選択される、
該ポリペプチド；ならびに
（ｂ）（ａ）のポリペプチドと少なくとも８９％のアミノ酸配列同一性を有し、但し、Ｘ_５２がＮである場合にはＸ_５３はＤではない、ポリペプチド
から選択される、前記ポリペプチドを提供する。

バンドが、安定性試験の前（０）；および２週間の安定性試験後（２週間）の、Ｃ５結合化合物ＰＳＩ０２４２（配列番号２４９）を示す、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す図である。安定性試験の前（実線）および２週間の安定性試験後（点線）の、ＰＳＩ０２４２（配列番号２４９）の逆相ＨＰＬＣからのクロマトグラムを示す図である。第１のレーンが、ＳｅｅＢｌｕｅ２Ｐサイズマーカーを含み、バンドが、初期サンプル（０）；および２週間の安定性試験後のサンプル（２週間）を示す、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す図である。図３Ａ：配列番号２４９；図３Ｂ：配列番号２６１；図３Ｃ：配列番号２６２；図３Ｄ：配列番号２６４。安定性試験の前（実線）および２週間の安定性試験後（点線）の、Ｃ５結合化合物（配列番号２５３）の逆相ＨＰＬＣからのクロマトグラムを示す図である。安定性試験の前（実線）および２週間の安定性試験後（点線）の、Ｃ５結合化合物（配列番号２６４）の逆相ＨＰＬＣからのクロマトグラムを示す図である。２週間の安定性試験の前（０）および後（２週間）の、元のおよび改変されたポリペプチドバリアントを比較するＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの画像を示す図である。分子サイズマーカー（Ｍｗ）は、Ｎｏｖｅｘ（登録商標）ＳｈａｒｐＰｒｅ−ｓｔａｉｎｅｄＰｒｏｔｅｉｎＳｔａｎｄａｒｄ（２１６、１６０、１１０、８０、６０、５０、４０、３０、２０、１５、１０、３．５ｋＤａ）であった。図６Ａは、ＨＥＲ２結合ポリペプチドのゲルを示し、ゲル中、レーンは、レーン１：Ｍｗ、レーン２：（０）Ｚ０２８９１（配列番号２７２）、レーン３：（２週間）Ｚ０２８９１（配列番号２７２）、レーン４：Ｍｗ、レーン５：（０）Ｚ１７３４１（配列番号２７３）、レーン６：（２週間）Ｚ１７３４１（配列番号２７３）、レーン７：（０）Ｚ１７３４２（配列番号２７４）、レーン８：（２週間）Ｚ１７３４２（配列番号２７４）を示す。図６Ｂは、ＰＤＧＦ−Ｒβ結合ポリペプチドのゲルであり、ゲル中、レーンは以下を示す：レーン１：Ｍｗ、レーン２：（０）Ｚ１５８０５（配列番号２７５）、レーン３：（２週間）Ｚ１５８０５（配列番号２７５）、レーン４：Ｍｗ、レーン５：（０）Ｚ１７３４３（配列番号２７６）、レーン６：（２週間）Ｚ１７３４３（配列番号２７６）、レーン７：（０）Ｚ１７３４４（配列番号２７７）、レーン８：（２週間）Ｚ１７３４４（配列番号２７７）。図６Ｃは、ＦｃＲｎ結合ポリペプチドのゲルを示し、ゲル中、レーンは以下を示す：レーン１：（０）Ｚ１０１０３（配列番号２７８）、レーン２：（２週間）Ｚ１０１０３（配列番号２７８）、レーン３：Ｍｗ、レーン４：（０）Ｚ１７３４７（配列番号２７９）、レーン５：（２週間）Ｚ１７３４７（配列番号２７９）、レーン６：（０）Ｚ１７３４８（配列番号２８０）、レーン７：（２週間）Ｚ１７３４８（配列番号２８０）。図６Ｃ中で見られる斜めのバンドは、同じ容器中の染色された第２のゲルからのインプリントから生じたアーチファクトである。図６Ｄは、ＣＡＩＸ結合ポリペプチドのゲルであり、ゲル中、レーンは、レーン１：Ｍｗ、レーン２：（０）Ｚ０９７８２（配列番号２８１）、レーン３：（２週間）Ｚ０９７８２（配列番号２８１）、レーン４：Ｍｗ、レーン５：（０）Ｚ１７３５１（配列番号２８２）、レーン６：（２週間）Ｚ１７３５１（配列番号２８２）、レーン７：（０）Ｚ１７３５２（配列番号２８３）、レーン８：（２週間）Ｚ１７３５２（配列番号２８３）；レーン９：（０）Ｚ１７３５５（配列番号２８４）、レーン１０：（２週間）Ｚ１７３５５（配列番号２８４）、レーン１１：（０）Ｚ１７３５７（配列番号２８５）、レーン１２：（２週間）Ｚ１７３５７（配列番号２８５）、レーン１３：（０）Ｚ１７３５９（配列番号２８６）、レーン１４：（２週間）Ｚ１７３５９（配列番号２８６）、レーン１５：（０）Ｚ１７３６０（配列番号２８７）、レーン１６：（２週間）Ｚ１７３６０（配列番号２８７）を示す。図６−１の続き。図６−２の続き。以下のアミノ酸配列を示す表である： −Ｃ５結合モチーフの例（配列番号１〜２４８）； −ＰＳＩ０２４２と称されるＣ５結合化合物（配列番号２４９）； −アルブミン結合ドメイン（配列番号２５０）； −ヒトＣ５のＳｗｉｓｓ−ＰｒｏｔエントリーＰ０１０３１（配列番号２５１）、配列中、α鎖は、アミノ酸残基６７８〜１６７６に対応し、β鎖は、アミノ酸残基１９〜６７３に対応する； −改変されたＣ５結合ポリペプチドの例（配列番号２６０、２６５〜２６７）。 −改変されたＣ５結合化合物の例（配列番号２５２〜２５９、２６１〜２６４、２６８〜２７０）。 −他の標的分子に対する結合親和性を有するポリペプチドバリアントの例（配列番号２７２、２７５、２７８、２８１） −他の標的に対する結合親和性を有する、安定性が改善されたポリペプチドバリアントの例（配列番号２７３〜２７４、２７６〜２７７、２７９〜２８０、２８２〜２８７）。図７−１の続き。図７−２の続き。図７−３の続き。図７−４の続き。図７−５の続き。図７−６の続き。図７−７の続き。図７−８の続き。図７−９の続き。図７−１０の続き。図７−１１の続き。図７−１２の続き。

本発明者らは、驚くべきことに、ＷＯ２０１３／１２６００６に記載されるＣ５結合ポリペプチドのアミノ酸配列の特定の位置におけるアミノ酸残基の改変または置換が、Ｃ５結合ポリペプチドの安定性を改善するが、ヒト補体成分５（Ｃ５）に対する結合親和性および補体経路機能の阻害などの生物学的活性が実質的に保持されることを見出した。従って、改変されたＣ５結合ポリペプチドの生物学的活性は、公知のＣ５結合ポリペプチドの生物学的活性と同等である。本発明のＣ５結合ポリペプチドの安定性試験は、Ｘ_５２におけるＮからＥもしくはＳへの、またはＸ_５３におけるＤからＥもしくはＳへの置換が、安定性を改善することを実証している。さらに、［Ｌ２］中の特定のアミノ酸置換が安定性を独立して促進できることが見出されている。

用語「Ｃ５結合」および「Ｃ５に対する結合親和性」とは、本明細書で使用する場合、Ｂｉａｃｏｒｅ機器（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）などにおいて、例えば、表面プラズモン共鳴技術の使用によって試験されるポリペプチドの特性を指す。Ｃ５結合親和性は、例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ機器のセンサチップ上にＣ５が固定化され、試験されるポリペプチドを含むサンプルが、チップ上を通過させられる実験において試験される。あるいは、試験されるポリペプチドが、機器のセンサチップ上に固定化され、Ｃ５またはその断片を含むサンプルが、チップ上を通過させられる。次いで、当業者は、Ｃ５へのポリペプチドの結合の少なくとも定性的な測定を行うために、かかる実験によって得られた結果を解釈できる。例えば、相互作用についての見かけの平衡解離定数Ｋ_Ｄを決定するために定量的測定が望まれる場合、表面プラズモン共鳴法を使用することもできる。結合値は、例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ２０００機器（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）中で確定される。Ｃ５
は、測定センサチップ上に固定化され、その親和性が決定されるポリペプチドのサンプルが、連続希釈によって調製され、チップ上に注入される。次いで、Ｋ_Ｄ値が、例えば、機器の製造業者によって提供されるＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアの１：１Ｌａｎｇｍｕｉｒ結合モデルを使用して、これらの結果から計算される。Ｋ_Ｄ決定において使用されるＣ５またはその断片は、例えば、配列番号２５１によって示されるアミノ酸配列を含む。Ｃ５結合親和性が如何に試験されるかの例は、本明細書に提供される、実施例３および５を参照のこと。

本発明の好ましい一形態では、このポリペプチドは：
（ａ）アミノ酸配列
ＡＥＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−［Ｌ２］−ＱＳＸ_４２Ｘ_４３ＬＬＸ_４６ＥＡＫＫＬＸ_５２Ｘ_５３Ｘ_５４ＱＡＰ
を含むポリペプチドであって、
式中、互いに独立に、
［ＢＭ］、［Ｌ２］、Ｘ_４２、Ｘ_４３、Ｘ_４６、Ｘ_５２、Ｘ_５３およびＸ_５４は、上に規定した通りである、該ポリペプチド；ならびに
（ｂ）（ａ）のポリペプチドと少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有し、但し、Ｘ_５２がＮである場合にはＸ_５３はＤではない、ポリペプチド
から選択される。

ＷＯ２０１３／１２６００６に以前に開示されたように、本発明に従うＣ５結合ポリペプチドは、３ヘリックスバンドルタンパク質ドメインの一部を形成する。上記Ｃ５結合モチーフ［ＢＭ］は、実質的に、この３ヘリックスバンドル内で、相互接続ループと共に、２つのアルファヘリックスの一部を形成する。本明細書で［Ｌ２］と呼ばれる第２の相互接続ループは、「骨格」と呼ばれる第３のアルファヘリックスにこのＣ５結合モチーフを接続する。

一実施形態では、このＣ５結合モチーフ［ＢＭ］は、実質的にＷＯ２０１３／１２６００６に開示されている。しかし、本発明によれば、このＣ５結合モチーフは、好ましくは、２９アミノ酸ではなく２８アミノ酸からなり、さらなるアミノ酸置換をさらに保有することができる。

従って、一実施形態では、この［ＢＭ］は、ＷＯ２０１３／１２６００６に開示された［ＢＭ］と比較した場合、例えば１７位において、少なくとも１つのさらなるアミノ酸置換を保有する。従って、この［ＢＭ］は：
（ａ）アミノ酸配列
ＥＸ_９Ｘ_１０Ｘ_１１ＡＸ_１３Ｘ_１４ＥＩＤＸ_１７Ｘ_１８ＬＰＮＬＸ_２３Ｘ_２４Ｘ_２５ＱＷＸ_２８ＡＦＩＸ_３２Ｘ_３３ＬＸ_３５
を含むポリペプチドであって、
式中、互いに独立に、
Ｘ_９は、Ｈ、Ｑ、Ｓ、ＴおよびＶから選択され；
Ｘ_１０は、Ｉ、Ｌ、ＭおよびＶから選択され；
Ｘ_１１は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、ＴおよびＹから選択され；
Ｘ_１３は、ＮおよびＷから選択され；
Ｘ_１４は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、ＳおよびＴから選択され；
Ｘ_１７は、ＤおよびＥから選択され；
Ｘ_１８は、Ａ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、ＴおよびＹから選択され；
Ｘ_２３は、ＮおよびＴから選択され；
Ｘ_２４は、Ｉ、ＬおよびＶから選択され；
Ｘ_２５は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、ＳおよびＴから選択され；
Ｘ_２８は、Ｉ、ＬおよびＶから選択され；
Ｘ_３２は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｎ、ＳおよびＴから選択され；
Ｘ_３３は、ＫおよびＳから選択され；
Ｘ_３５は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、ＴおよびＹから選択される、
該ポリペプチド；ならびに
（ｂ）（ａ）のポリペプチドと少なくとも８５％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチド
から選択されるポリペプチドである。

好ましい一実施形態では、このＣ５結合モチーフ［ＢＭ］は、実質的にＷＯ２０１３／１２６００６に開示される通りである。従って、この［ＢＭ］は：
（ａ）アミノ酸配列
ＥＸ_９Ｘ_１０Ｘ_１１ＡＸ_１３Ｘ_１４ＥＩＤＸ_１８ＬＰＮＬＸ_２３Ｘ_２４Ｘ_２５ＱＷＸ_２８ＡＦＩＸ_３２Ｘ_３３ＬＸ_３５
を含むポリペプチドであって、
式中、互いに独立に、
Ｘ_９は、Ｈ、Ｑ、Ｓ、ＴおよびＶから選択され；
Ｘ_１０は、Ｉ、Ｌ、ＭおよびＶから選択され；
Ｘ_１１は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、ＴおよびＹから選択され；
Ｘ_１３は、ＮおよびＷから選択され；
Ｘ_１４は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、ＳおよびＴから選択され；
Ｘ_１８は、Ａ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、ＴおよびＹから選択され；
Ｘ_２３は、ＮおよびＴから選択され；
Ｘ_２４は、Ｉ、ＬおよびＶから選択され；
Ｘ_２５は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、ＳおよびＴから選択され；
Ｘ_２８は、Ｉ、ＬおよびＶから選択され；
Ｘ_３２は、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｎ、ＳおよびＴから選択され；
Ｘ_３３は、ＫおよびＳから選択され；
Ｘ_３５は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、ＴおよびＹから選択される、
該ポリペプチド；ならびに
（ｂ）（ａ）のポリペプチドと少なくとも８５％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチド
から選択されるポリペプチドである。

さらなる好ましい態様では、［ＢＭ］は、配列番号１〜２４８中の１〜２８位からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むまたはかかるアミノ酸配列からなる。より好ましくは、［ＢＭ］は、配列番号１中の１〜２８位として示されるアミノ酸配列を含むまたはかかるアミノ酸配列からなる。

さらなる一態様では、本発明に従うＣ５結合ポリペプチドは：
（ａ）アミノ酸配列
ＡＥＡＫＹＡＫＥＸ_９Ｘ_１０Ｘ_１１ＡＸ_１３Ｘ_１４ＥＩＸ_１７Ｘ_１８ＬＰＮＬＸ_２３Ｘ_２４Ｘ_２５ＱＷＸ_２８ＡＦＩＸ_３２Ｘ_３３ＬＸ_３５−［Ｌ２］−ＱＳＸ_４２Ｘ_４３ＬＬＸ_４６ＥＡＫＫＬＸ_５２Ｘ_５３Ｘ_５４ＱＡＰ
を含むポリペプチドであって、
式中、互いに独立に、
Ｘ_９は、Ｈ、Ｑ、Ｓ、ＴおよびＶから選択され；
Ｘ_１０は、Ｉ、Ｌ、ＭおよびＶから選択され；
Ｘ_１１は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、ＴおよびＹから選択され；
Ｘ_１３は、ＮおよびＷから選択され；
Ｘ_１４は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、ＳおよびＴから選択され；
Ｘ_１７は、ＤおよびＥから選択され；
Ｘ_１８は、Ａ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、ＴおよびＹから選択され；
Ｘ_２３は、ＮおよびＴから選択され；
Ｘ_２４は、Ｉ、ＬおよびＶから選択され；
Ｘ_２５は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、ＳおよびＴから選択され；
Ｘ_２８は、Ｉ、ＬおよびＶから選択され；
Ｘ_３２は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｎ、ＳおよびＴから選択され；
Ｘ_３３は、ＫおよびＳから選択され；
Ｘ_３５は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、ＴおよびＹから選択され；
［Ｌ２］は、ＤＤＰＳおよびＲＱＰＥから選択され；
Ｘ_４２は、ＡおよびＳから選択され；
Ｘ_４３は、ＮおよびＥから選択され；
Ｘ_４６は、Ａ、ＳおよびＣから選択され；
Ｘ_５２は、Ｅ、ＮおよびＳから選択され；
Ｘ_５３は、Ｄ、ＥおよびＳから選択され、但し、Ｘ_５２がＮである場合にはＸ_５３はＤではなく；
Ｘ_５４は、ＡおよびＳから選択される、
該ポリペプチド；ならびに
（ｂ）（ａ）のポリペプチドと少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有し、但し、Ｘ_５２がＮである場合にはＸ_５３はＤではない、ポリペプチド
から選択される。

好ましい一実施形態では、本発明に従うＣ５結合ポリペプチドは：
（ａ）アミノ酸配列
ＡＥＡＫＹＡＫＥＸ_９Ｘ_１０Ｘ_１１ＡＸ_１３Ｘ_１４ＥＩＤＸ_１８ＬＰＮＬＸ_２３Ｘ_２４Ｘ_２５ＱＷＸ_２８ＡＦＩＸ_３２Ｘ_３３ＬＸ_３５−［Ｌ２］−ＱＳＸ_４２Ｘ_４３ＬＬＸ_４６ＥＡＫＫＬＸ_５２Ｘ_５３Ｘ_５４ＱＡＰ
を含むポリペプチドであって、
式中、互いに独立に、
Ｘ_９は、Ｈ、Ｑ、Ｓ、ＴおよびＶから選択され；
Ｘ_１０は、Ｉ、Ｌ、ＭおよびＶから選択され；
Ｘ_１１は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、ＴおよびＹから選択され；
Ｘ_１３は、ＮおよびＷから選択され；
Ｘ_１４は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、ＳおよびＴから選択され；
Ｘ_１８は、Ａ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、ＴおよびＹから選択され；
Ｘ_２３は、ＮおよびＴから選択され；
Ｘ_２４は、Ｉ、ＬおよびＶから選択され；
Ｘ_２５は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、ＳおよびＴから選択され；
Ｘ_２８は、Ｉ、ＬおよびＶから選択され；
Ｘ_３２は、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｎ、ＳおよびＴから選択され；
Ｘ_３３は、ＫおよびＳから選択され；
Ｘ_３５は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、ＴおよびＹから選択され；
［Ｌ２］は、ＤＤＰＳおよびＲＱＰＥから選択され；
Ｘ_４２は、ＡおよびＳから選択され；
Ｘ_４３は、ＮおよびＥから選択され；
Ｘ_４６は、Ａ、ＳおよびＣから選択され；
Ｘ_５２は、Ｅ、ＮおよびＳから選択され；
Ｘ_５３は、Ｄ、ＥおよびＳから選択され、但し、Ｘ_５２がＮである場合にはＸ_５３はＤではなく；
Ｘ_５４は、ＡおよびＳから選択される、
該ポリペプチド；ならびに
（ｂ）（ａ）のポリペプチドと少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有し、但し、Ｘ_５２がＮである場合にはＸ_５３はＤではない、ポリペプチド
から選択される。

本発明の好ましい形態では、以下の１８の条件、場合により１９の条件：
Ｘ_９はＶである、
Ｘ_１０はＬである、
Ｘ_１１はＥである、
Ｘ_１３はＷである、
Ｘ_１４はＤである、
場合によりＸ_１７はＤである、
Ｘ_１８はＲである、
Ｘ_２３はＴである、
Ｘ_２４はＩである、
Ｘ_２５はＥである、
Ｘ_２８はＬである、
Ｘ_３２はＮである、
Ｘ_３３はＫである、
Ｘ_３５はＤである、
［Ｌ２］はＤＤＰＳである、
Ｘ_４２はＳである、
Ｘ_４３はＥである、
Ｘ_４６はＳである、
Ｘ_５４はＳである、
のうち少なくとも１つが満たされる。

より好ましくは、上の条件のうち少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８または１９個の条件が満たされる。

一実施形態では、Ｘ_５２およびＸ_５３は、ＥおよびＳから独立して選択される。好ましくは、（ａ）Ｘ_５２はＳでありＸ_５３はＥである、または（ｂ）Ｘ_５２はＥでありＸ_５３はＳである。

一実施形態では、Ｘ_５２はＳでありＸ_５３はＤである。

別の一実施形態では、Ｘ_５２はＮでありＸ_５３はＥである。

さらなる一態様では、本発明に従うポリペプチドは、配列番号２６０、配列番号２６５、配列番号２６６または配列番号２６７として示されるアミノ酸配列を含む。

さらなる一態様では、Ｃ５に結合することが可能な化合物であって：
ａ．上に規定した通りの少なくとも１つのＣ５結合ポリペプチド；
ｂ．連鎖球菌プロテインＧの少なくとも１つのアルブミン結合ドメイン、またはその誘導体；および
ｃ．場合により、該少なくとも１つのＣ５結合ポリペプチドのＣ末端またはＮ末端に、少なくとも該１つのアルブミン結合ドメインまたはその誘導体を連結させるための、少なくとも１つの連結部分、
を含む前記化合物を提供する。

好ましくは、このアルブミン結合ドメインは、配列番号２５０として示されるアミノ酸配列を含む。

好ましくは、この連結部分は、アミノ酸配列ＫＶＸ_６０ＧＳを含むペプチドであり、式中、Ｘ_６０は、Ｄ、ＥおよびＡから選択される。Ｘ_６０がＤである場合、好ましい化合物は、配列番号２５３として示されるアミノ酸配列を含むまたはかかるアミノ酸配列からなる。Ｘ_６０がＥである場合、好ましい化合物は、配列番号２６１、配列番号２６３、配列番号２６４、配列番号２６９もしくは配列番号２７０として示されるアミノ酸配列を含むまたはかかるアミノ酸配列からなる。Ｘ_６０がＡである場合、好ましい化合物は、配列番号２６２として示されるアミノ酸配列を含むまたはかかるアミノ酸配列からなる。上に列挙したＣ５結合化合物のアミノ酸配列において、アミノ酸残基１〜５７は、Ｃ５結合ポリペプチドのアミノ酸配列を示し、残基５８〜６２は、リンカーのアミノ酸配列を示し、残基６３〜１０８は、アルブミン結合ドメインのアミノ酸配列を示す。

一実施形態では、この連結部分は存在しない。

上で議論したように、本発明に従う好ましいＣ５結合ポリペプチドには、Ｘ_５２およびＸ_５３がＥおよびＳから独立して選択されるＣ５結合ポリペプチドが含まれる。具体的には、本発明に従う化合物は、ＰＳＩ０２４２（配列番号２４９）から誘導されるが、５２位、５３位および６０位のうち少なくとも１つにおいて改変を有する。例えば、図７および配列表に示されるように、ＰＳＩ０３７８と称される好ましい化合物（配列番号２６１）は、アミノ酸置換Ｎ５２Ｓ、Ｄ５３ＥおよびＤ６０Ｅを保有する；ＰＳＩ０３７９と称される好ましい化合物（配列番号２６２）は、アミノ酸置換Ｎ５２Ｓ、Ｄ５３ＥおよびＤ６０Ａを保有する；ＰＳＩ０３８１と称される好ましい化合物（配列番号２６３）は、アミノ酸置換Ｎ５２Ｅ、Ｄ５３ＳおよびＤ６０Ｅを保有する；ＰＳＩ０３８３と称される好ましい化合物（配列番号２６４）は、アミノ酸置換Ｎ５２Ｓ、Ｄ５３ＥおよびＤ６０Ｅを保有する。さらに、配列番号２６４は、ループ［Ｌ２］中に置換、即ち、Ｄ３６Ｒ、Ｄ３７ＱおよびＳ３９Ｅもまた保有する。さらに、ＰＳＩ０４０３と称される好ましい化合物（配列番号２６９）は、アミノ酸置換Ｄ５３ＥおよびＤ６０Ｅを保有し、ＰＳＩ０４０４と称される好ましい化合物（配列番号２７０）は、アミノ酸置換Ｎ５２ＳおよびＤ６０Ｅを保有する。

上で説明するように、本発明者らは、ＷＯ２０１３／１２６００６に記載されるＣ５結合ポリペプチドのアミノ酸配列の特定の位置におけるアミノ酸置換が安定性を改善することを、驚くべきことに見出した。かかる置換は、Ｃ５結合化合物の安定性を改善するが、Ｃ５結合能力およびｉｎｖｉｔｒｏでの溶血の阻害などの生物学的活性は保持される。本発明のＣ５結合化合物の安定性試験は、例えば、Ｎ５２Ｓ（Ｘ_５２）およびＤ５３Ｅ（Ｘ_５３）（配列番号２５３）の各々が個々に、ならびにＤ６０の除去（Ｘ_６０）（連結部分を欠く配列番号２５９）が、安定性を改善することを実証している。置換Ｎ５２Ｓ、Ｄ５３Ｅ、およびＤ６０ＥまたはＤ６０Ａの組み合わせは、安定性をさらに改善する（配列番号２６１および配列番号２６２）。Ｎ５２ＳおよびＤ６０Ｅ（配列番号２７０）の組み合わされた置換ならびにＤ５３ＥおよびＤ６０Ｅ（配列番号２６９）の組み合わされた置換の各々も、同様に安定性を改善することが見出された。これは、列挙したアミノ酸置換の各々が、ポリペプチドの安定性を改善することに関与すること、従って、これらの置換の各々が、以前に公知のＣ５結合ポリペプチドおよび化合物と比較して、さらに安定化されたＣ５結合ポリペプチドおよび化合物を提供することを示している。

しかし、当業者は、５２位、５３位および６０位のうち少なくとも１つにおいて、ならびに／またはループ［Ｌ２］において改変を有するが、置換、小さい欠失、挿入または逆
位などのさらなる改変もまた保有し、それにもかかわらず開示された生物学的活性および改善された安定性を実質的に有する、ポリペプチドならびに／または化合物を同定することが可能である。さらに、本発明に従うＣ５結合ポリペプチドおよび／または化合物は、産生、精製、ｉｎｖｉｖｏもしくはｉｎｖｉｔｒｏでの安定化、カップリング、またはポリペプチドの検出を改善するさらなるＣ末端アミノ酸および／またはＮ末端アミノ酸を含むことができる。

本発明のさらなる一態様では、Ｃ５に結合することが可能な化合物であって：
ａ．少なくとも１つのＣ５結合ポリペプチドであって：
ａ−１．アミノ酸配列
［ＢＭ］−［Ｌ２］−ＱＳＸ_４２Ｘ_４３ＬＬＸ_４６ＥＡＫＫＬＸ_５２Ｘ_５３Ｘ_５４Ｑ
を含むポリペプチドであって、
式中、互いに独立に、
［ＢＭ］は、Ｃ５結合モチーフであり；
［Ｌ２］は、ＤＤＰＳおよびＲＱＰＥから選択され；
Ｘ_４２は、ＡおよびＳから選択され；
Ｘ_４３は、ＮおよびＥから選択され；
Ｘ_４６は、Ａ、ＳおよびＣから選択され；
Ｘ_５２は、Ｅ、ＮおよびＳから選択され；
Ｘ_５３は、Ｄ、ＥおよびＳから選択され；
Ｘ_５４は、ＡおよびＳから選択される、
該ポリペプチド；ならびに
ａ−２．ａ−１のポリペプチドと少なくとも８９％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチド
から選択される、該少なくとも１つのＣ５結合ポリペプチド；
ｂ．連鎖球菌プロテインＧの少なくとも１つのアルブミン結合ドメイン、またはその誘導体；ならびに
ｃ．少なくとも１つのＣ５結合ポリペプチドのＣ末端またはＮ末端に、少なくとも１つのアルブミン結合ドメインまたはその誘導体を連結させるための、少なくとも１つの連結部分であって；該連結部分は、ＫＶＥＧＳもしくはＫＶＡＧＳを含みもしくはこれらからなり；または該連結部分は存在しない、該少なくとも１つの連結部分
を含む前記化合物を提供する。

配列番号２４９のＤ６０の除去または６０位におけるアミノ酸置換単独は、以前に公知のＣ５結合化合物と比較して、本発明のＣ５結合化合物の安定性を改善することが見出されている。好ましくは、この連結部分はＫＶＥＧＳ（Ｘ_６０＝Ｅ）であり、Ｘ_５２Ｘ_５３はＮＤであり、かかる連結部分を保有する好ましい化合物の一例は、ＰＳＩ０４１０（配列番号２６８）である。別の好ましい一実施形態では、Ｄ６０および連結部分全体は存在せず、かかる化合物の一例は、ＰＳＩ０３６９と称される好ましい化合物（配列番号２５９）である。

上記態様の実施形態では、［ＢＭ］およびアルブミン結合ドメインは、関連する態様において上に規定した通りである。好ましくは、［Ｌ２］はＤＤＰＳである。

さらなる一態様では、Ｃ５に結合することが可能な化合物であって：
ａ．少なくとも１つのＣ５結合ポリペプチドであって：
ａ−１．アミノ酸配列
［ＢＭ］−［Ｌ２］−ＱＳＸ_４２Ｘ_４３ＬＬＸ_４６ＥＡＫＫＬＸ_５２Ｘ_５３Ｘ_５４Ｑ
を含むポリペプチドであって、
式中、互いに独立に、
［ＢＭ］は、Ｃ５結合モチーフであり；
［Ｌ２］は、ＲＱＰＥであり；
Ｘ_４２は、ＡおよびＳから選択され；
Ｘ_４３は、ＮおよびＥから選択され；
Ｘ_４６は、Ａ、ＳおよびＣから選択され；
Ｘ_５２は、Ｅ、ＮおよびＳから選択され；
Ｘ_５３は、Ｄ、ＥおよびＳから選択され；
Ｘ_５４は、ＡおよびＳから選択される、
該ポリペプチド；ならびに
ａ−２．ａ−１のポリペプチドと少なくとも８９％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチド
から選択される、該少なくとも１つのＣ５結合ポリペプチド；
ｂ．連鎖球菌プロテインＧの少なくとも１つのアルブミン結合ドメイン、またはその誘導体；ならびに
ｃ．場合により、該少なくとも１つのＣ５結合ポリペプチドのＣ末端またはＮ末端に、該少なくとも１つのアルブミン結合ドメインまたはその誘導体を連結させるための、少なくとも１つの連結部分
を含む前記化合物を提供する。

ループ［Ｌ２］中の特定のアミノ酸置換は、以前に公知のＣ５結合化合物と比較して、本発明のＣ５結合化合物（例えば、配列番号２５２）の安定性を改善することが見出されている。上記態様の実施形態では、上記［ＢＭ］およびアルブミン結合ドメインは、個々に、関連する態様において上に規定した通りである。好ましくは、上記連結部分は、アミノ酸配列ＫＶＸ_６０ＧＳを含むペプチドであり、式中、Ｘ_６０は、Ｄ、ＥおよびＡから選択される。

本発明は、本発明に従うポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。本発明には、本発明に従うポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、発現ベクターなどのベクターがさらに含まれる。かかるベクターを含む宿主細胞もまた含まれる。

本発明には、治療における使用のための、上記Ｃ５結合ポリペプチドおよび化合物が含まれる。特に、本発明に従うＣ５結合ポリペプチドおよび化合物は、炎症性疾患；自己免疫疾患；感染性疾患；心血管疾患；神経変性障害；移植傷害（ｇｒａｆｔｉｎｊｕｒｙ）；眼疾患；腎臓疾患；肺疾患；発作性夜間ヘモグロビン尿症（ＰＮＨ）のような血液学的疾患；アレルギー疾患および皮膚科学的疾患などのＣ５関連状態の処置および／または予防のための方法において有用である。

処置および／または予防のための方法において、このＣ５結合ポリペプチドまたは化合物は、好ましくは、静脈内に、皮下に、吸入により、経鼻的に、経口で、硝子体内にまたは局所的に（ｔｏｐｉｃａｌｌｙ）投与される。

公知のＣ５インヒビターの安定性試験
ＰＳＩ０２４２と称されるＣ５結合化合物（配列番号２４９）を、２５ｍＭＮａＰ／１２５ｍＭＮａＣｌｐＨ７．０中に調合し、３７℃で２週間の加速安定性研究に供した。安定性を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび逆相ＨＰＬＣ（ＲＰＣ）による、安定性試験後の新たなバリアントの出現によって測定した。両方の分析において、初期サンプルおよび安定性研究に供したサンプルを、並行して実行した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥでは、７．５μｇタンパク質を、各ウェルにロードした。ＲＰＣは、水中０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）からなる移動相Ａを使用し、０．１％ＴＦＡ／４５％ＭｅＯＨ／４５％イソプロピルア
ミン（ＩＰＡ）／１０％水からなる移動相Ｂを使用して、Ａｇｉｌｅｎｔ１１００ＨＰＬＣで実行した。

これらの結果は、新たな形態のタンパク質が、インキュベーションの間に形成されたことを示し、これらの新たな形態を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいてバンドとして可視化し（図１）、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰＣ）クロマトグラムにおいて新たなピークとして可視化した（図２）。図２において、２週間のインキュベーション後のメインピークは、元のタンパク質サンプルの５７％に対応する。

配列番号２４９中の１〜６０位は、配列番号７５３としてＷＯ２０１３／１２６００６において以前に開示されたポリペプチドＺ０６１７５ａに対応する。ＰＳＩ０２４２（配列番号２４９）は、実質的にＷＯ２０１３／１２６００６に開示されたように産生させた。

改変されたＣ５結合ポリペプチドおよび化合物の安定性
改変されたＣ５結合ポリペプチドおよび化合物を、実質的にＷＯ２０１３／１２６００６に開示されたように合成および精製した。

簡潔に述べると、Ｃ５結合ＺバリアントをコードするＤＮＡを、大腸菌コドン最適化し、ＧｅｎｅＡｒｔ，ＧｍｂＨによって合成した。Ｃ５結合性Ｚバリアントを示す合成遺伝子を、サブクローニングし、大腸菌で発現させた。

細胞内で発現させたＺバリアントを、従来のクロマトグラフィー方法を使用して精製した。ホモジナイズおよび清澄化を、超音波処理と、その後の遠心分離および濾過とによって実施した。アニオン交換クロマトグラフィーを、捕捉工程として使用した。さらなる精製を、疎水性相互作用クロマトグラフィーによって得た。精製は、酸性条件（ｐＨ５．５）において実行した。研磨および緩衝液交換を、サイズ排除クロマトグラフィーによって実施した。

精製したタンパク質を、２５ｍＭＮａＰ／１２５ｍＭＮａＣｌｐＨ７．０中に調合し、３７℃で２週間の加速安定性研究に供した。安定性を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび逆相ＨＰＬＣ（ＲＰＣ）による、安定性試験後の新たなバリアントの出現によって測定した。両方の分析において、初期サンプルおよび安定性研究に供したサンプルを、並行して実行した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥでは、７．５μｇタンパク質を、各ウェルにロードした。得られたゲルの一例を図３に示す。

ＲＰＣは、水中０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）からなる移動相Ａ、および０．１％ＴＦＡ／４５％ＭｅＯＨ／４５％イソプロピルアミン（ＩＰＡ）／１０％水からなる移動相Ｂを使用して、Ａｇｉｌｅｎｔ１１００ＨＰＬＣで実行した。得られたクロマトグラムの一例を、配列番号２５３について図４に示す。

安定性試験の結果を、以下の表Ｉにまとめる。

表Ｉから、特定の改変されたＣ５結合ポリペプチドまたは化合物が、ＰＳＩ０２４２と比較した場合に、増加した安定性などの改善された特性を有すると結論付けることができる。かかる改善されたＣ５結合ポリペプチドまたは化合物には、ＰＳＩ０３３４（配列番号２５３）、ＰＳＩ０３４０（配列番号２５８）、ＰＳＩ０３６９（配列番号２５９）、ＰＳＩ０３７７（配列番号２６０）、ＰＳＩ０３７８（配列番号２６１）、ＰＳＩ０３７９（配列番号２６２）、ＰＳＩ０３８１（配列番号２６３）、ＰＳＩ０３８３（配列番号２６４）、ＰＳＩ０４００（配列番号２６７）、ＰＳＩ０４１０（配列番号２６８）、ＰＳＩ０４０３（配列番号２６９）およびＰＳＩ０４０４（配列番号２７０）が含まれる。言及されたバリアントのうち６つ（配列番号２５３、２６０、２６１、２６２、２６４および２６７）において、５２〜５３位におけるアミノ酸残基は、ＮＤ（ＰＳＩ０２４２と比較）からＳＥへと置換されている。配列番号２６３では、対応する置換は、ＮＤからＥＳである。配列番号２６９では、５３位におけるアミノ酸残基のみがＤからＥに置換されているが、配列番号２７０では、５２位におけるアミノ酸残基が、ＮからＳに置換されている。

さらに、ＰＳＩ０３７８（配列番号２６１）、ＰＳＩ０３８１（配列番号２６３）、ＰＳＩ０３８３（配列番号２６４）、ＰＳＩ０４１０（配列番号２６８）、ＰＳＩ０４０３（配列番号２６９）およびＰＳＩ０４０４（配列番号２７０）は、６０位におけるＤからＥへのアミノ酸残基置換を、共通して有する。

５２位または５３位、および６０位における安定性増強性の置換の組み合わされた利点は、ＰＳＩ０３８３（配列番号２６４）のクロマトグラムを示す図５において見ることができる。ＰＳＩ０３７９（配列番号２６２）では、６０位における置換は、ＤからＡであ
る。

ＰＳＩ０３６９（配列番号２５９）では、リンカー部分（Ｄ６０を含む）が完全に除去されて、より安定なＣ５結合化合物を生じ、Ｃ５結合化合物の安定性に対する６０位の影響を示す。

改変された化合物のヒトＣ５への結合
ヒト血清アルブミンを、アミンカップリングによって、ＡｍｉｎｅＲｅａｃｔｉｖｅ
２^ｎｄｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ（ＡＲ２Ｇ）ＤｉｐおよびＲｅａｄＢｉｏｓｅｎｓｏｒｓ（ＰａｌｌＬｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）カタログ番号１８−５０９２）に固定化した。ｒｅａｄ緩衝液（使用準備済みＨＢＳ−ＥＰ緩衝液２００ｍｌ、ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ＃ＢＲ１００１８８）中のＰＳＩ０２４２（配列番号２４９；１μＭ）およびＣ５結合化合物（１μＭ）をそれぞれ、ＨＳＡを有する別個のセンサ上に１２０秒間ロードし、その後、ｒｅａｄ緩衝液中で６０秒間ベースライン記録し、その後、再生サイクルの下、各濃度間でのベースライン記録を取りつつ、ｒｅａｄ緩衝液中の０．７９ｎＭから２５ｎＭまでの範囲の濃度のヒトＣ５（Ｑｕｉｄｅｌカタログ番号４０３）を加えた。センサのための再生条件は、１０ｍＭグリシン、ｐＨ２（３０秒間の３回のパルスおよび６０秒間のランニング緩衝液）であった。各スペクトログラムは、アルブミン結合ドメイン（配列番号２５０）を含むがＣ５結合能がない類似の構築物で参照差引きを行った（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓｕｂｔｒａｃｔｅｄ）。データを、ＦｏｒｔｅＢｉｏＡｎａｌｙｓｉｓ７．１（ＰａｌｌＬｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）速度論ソフトウェア）を使用して、Ｌａｎｇｍｕｉｒ１：１モデルに従って分析した。

ＰＳＩ０２４２（配列番号２４９）と比較した、Ｃ５との相互作用のＫ_Ｄを、表ＩＩに示す。ＰＳＩ０２４２のＫ_Ｄは、異なる実験において１〜３ｎＭで変動した。

表ＩＩ中の結果は、本発明に従うＣ５結合化合物が、ＷＯ２０１３／１２６００６に開示されたポリペプチドＰＳＩ０２４２（配列番号２４９）の結合能と類似の、ヒトＣ５への結合能を有することを示している。

化学的に合成されたＣ５結合ポリペプチドの安定性
化学的に合成されたＰＳＩ０４００（配列番号２６７）は、ＢＡＣＨＥＭＡＧに発注した。このポリペプチドの安定性を、実施例２と同じ方法に従って試験した。安定性試験の結果を、表ＩＩＩに示す。

ＰＳＩ０４００の安定性は、実施例２において大腸菌で産生させたポリペプチドと同等だった。

ＰＳＩ０４００（配列番号２６７）の折り畳みの完全性を、遠ＵＶ円二色性（ＣＤ）スペクトルを使用して、実施例２の方法に従って産生させた組換えＣ５結合ポリペプチド（ＰＳＩ０２５７、配列番号２７１）と比較した。

ＣＤスペクトルを、Ｊ−７２０ＣＤ分光偏光計（Ｊａｓｃｏ、Ｊａｐａｎ）によって記録した。サンプルを、Ｐｉ緩衝液（５ｍＭＮａ−Ｋ−ＰＯ_４、ｐＨ７．０）を使用して、０．１７ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度に希釈した。Ｐｉ緩衝液のＣＤスペクトルを最初に記録し、次いで、スペクトルを、サンプルの各々について、および最後にＰｉ緩衝液について再度、記録した。２つの緩衝液スペクトルが一致した場合、最初に記録したスペクトルを緩衝液スペクトルとして使用した。この緩衝液スペクトルを、２５の畳み込み幅（ｃｏｎｖｏｌｕｔｉｏｎｗｉｄｔｈ）でＳａｖｉｔｚｋｙ−Ｇｏｌａｙ手順を使用してスムージングした。他のスペクトルを、１５の畳み込み幅で同じ手順に従ってスムージングした。次いで、スムージングした緩衝液スペクトルを、他のスムージングしたスペクトルの各々から差し引いた。ＣＤＮＮプログラムを使用して、タンパク質の二次構造含量を推定し、得られた推定を表ＩＶに示した。結果は、５２位および５３位における２つのアミノ酸置換も、化学的合成によるポリペプチド産生も、化学的に合成されたポリペプチドの二次構造含量に影響を与えないことを示した。二次構造含量の完全性を、組換え産生させたＰＳＩ０２５７（配列番号２７１）と比較した。

ヒトＣ５への改変された化合物およびポリペプチドの結合
Ｃ５結合化合物ＰＳＩ０２４２（配列番号２４９）、ＰＳＩ０３４０（配列番号２５８）、ＰＳＩ０３７８（配列番号２６１）およびＰＳＩ０４１０（配列番号２６８）ならびにＣ５結合ポリペプチドＰＳＩ０４００（配列番号２６７）の、ヒトＣ５に対する結合親和性を、ＢｉａｃｏｒｅＴ２００機器（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して分析した。ヒトＣ５（Ａ４０３、ＱｕｉｄｅｌＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を、製造業者のプ
ロトコールに従って、アミンカップリング化学反応を使用して、ＣＭ５センサチップ（９００ＲＵ）にカップリングした。このカップリングを、１０ｍＭ酢酸Ｎａ緩衝液ｐＨ＝５（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）中で７．５μｇ／ｍＬの濃度でｈＣ５を注入することによって実施した。参照セルを、ヒトＣ５を注入することなしに、同じ試薬で処理した。固定化したｈＣ５へのＣ５結合因子の結合を、単一サイクルの速度論的方法を用いて研究し、このとき、５つの濃度のサンプル、典型的には、ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液（１０ｍＭＨＥＰＥＳｐＨ７．４、１５０ｍＭＮａＣｌ、３ｍＭＥＤＴＡ、０．００５％ＳｕｒｆａｃｔａｎｔＰ２０、ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）中２５、１２．５、６．２５、３．１２および１．５６ｎＭを、注入間での再生なしに、同じサイクルで２５℃で３０μＬ／分の流速で順々に注入した。参照セルからのデータを差し引いて、バルク屈折率変化を補償した。ほとんどの場合、ＨＢＳ−ＥＰの注入もまた、センサグラムが二重ブランクになるように、コントロールとして含めた。表面を、ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液中で再生した。反応速度定数を、ＢｉａｃｏｒｅＴ２００ＥｖａｌｕａｔｉｏｎＳｏｆｔｗａｒｅバージョン１．０のＬａｎｇｍｕｉｒ１：１分析物モデルを使用して、センサグラムから計算した。相互作用について得られたＫ_Ｄ値を、表Ｖに一覧にする。

安定性増強性のアミノ酸置換は、これらの分子がＣ５に結合する能力にとって有害ではなく、従って、それらの生物学的活性には影響しない。

溶血の阻害
古典補体経路の機能、ならびにＣ５結合化合物ＰＳＩ０３７８（配列番号２６１）およびＰＳＩ０４１０（配列番号２６８）ならびにＣ５結合ポリペプチドＰＳＩ０４００（配列番号２６７）によるそれらの阻害の研究のために、ヒツジ赤血球を、Ａｌｓｅｖｅｒ溶液（ＳｗｅｄｉｓｈＮａｔｉｏｎａｌＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＩｎｓｔｉｔｕｔｅ）中で新鮮なヒツジ全血から調製し、その後、ウサギ抗ヒツジ赤血球抗血清（Ｓｉｇｍａ）で処理して、抗体感作ヒツジ赤血球（ＥＡ）にした。このプロセス全体を、無菌条件下で実施した。他の全ての試薬は、市販の供給源から得た。

ｉｎｖｉｔｒｏアッセイを、９６ウェルのＵ型マイクロタイタープレート中で、試験タンパク質、補体血清およびＥＡ懸濁物の連続的な添加によって実行した。ｐＨ７．３〜７．４における１ウェル当たり５０μＬの総反応体積中の全ての試薬の最終濃度は、以下であった：０．１５ｍＭＣａＣｌ_２；０．５ｍＭＭｇＣｌ_２；３ｍＭＮａＮ_３；１３８ｍＭＮａＣｌ；０．１％ゼラチン；１．８ｍＭバルビタールナトリウム；３．１ｍＭバルビツール酸；５百万のＥＡ；適切な希釈での補体タンパク質Ｃ５血清、および所望の濃度でのＣ５結合化合物またはポリペプチド。

これらのＣ５結合化合物およびポリペプチドを、上記補体血清と共に氷上で２０分間プ
レインキュベートし、その後、ＥＡ懸濁物の添加によって反応を開始させた。溶血反応を、４５分間の撹拌の間３７℃で進行させ、次いで、場合により、０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０を含む１００μＬ氷冷生理食塩水の添加によって終結させた。細胞を、底に遠心分離し、１００μＬ上清に対応する上部部分を、反面積（ｈａｌｆ−ａｒｅａ）かつ平底のウェルを有する透明マイクロプレートに移した。反応結果を、４１５ｎｍの波長でマイクロタイタープレートリーダーを使用して、光学密度として分析した。

全ての試験の際に、コントロールサンプル（ＰＳＩ０２４２、配列番号２４９）およびビヒクルを各プレート中に含めて、それぞれ、阻害されていない反応および完全に阻害された反応についての値を確定した。これらの値を使用して、任意の所与のサンプル濃度における補体溶血の％阻害を計算した。試験したＣ５結合化合物およびポリペプチドの阻害能（ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙｐｏｔｅｎｃｙ）（ＩＣ５０値）を、Ｃ５を除去した血清に添加した制御された濃度のヒトＣ５の存在下で同じアッセイを適用することによって確定した。非常に強力なインヒビター（低いナノモル濃度〜ナノモル濃度未満）については、反応混合物の最終Ｃ５濃度を０．１ｎＭに制御し、この濃度は、場合により、Ｃ５を除去したまたは欠乏させた血清を使用することによって達成した。結果を、以下の表ＶＩ中に示す。

溶血アッセイからの結果は、改善されたＣ５結合化合物配列番号２６１および２６８が、参照化合物と同等であることを示している。Ｃ５結合ポリペプチド配列番号２６７は、このアッセイにおいて機能的であったが、これは、アルブミン結合ドメインを含まないので、これらの結果は、参照化合物と直接的に比較することはできない。

ヒトアルブミンへの結合
アルブミンに対するＣ５結合化合物の結合親和性の評価のために、それぞれＮｏｖｏｚｙｍｅｓ、ＡｆｆｉｂｏｄｙＡＢおよびＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎから購入した組換えヒトアルブミン（被覆）および市販の抗体（一次および検出）を利用するヒトアルブミンＥＬＩＳＡを使用した。Ｃ５結合ポリペプチドと連鎖球菌プロテインＧのアルブミン結合ドメインとを含むＰＳＩ０２４２（配列番号２４９）から調製した方法標準（ｍｅｔｈｏｄｓｔａｎｄａｒｄ）を、サンプルの定量化のために使用した。９６ウェルマイクロプレートを、組換えヒトアルブミンで被覆した。次いで、このプレートを、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳＴ）で洗浄し、ＰＢＳ中１％のカゼインで１〜２時間ブロッキングした。１回のプレート洗浄後、標準、方法コントロール、コントロールサンプルおよび試験サンプルを、このプレートに添加した。２時間のインキュベーション後、未結合の物質を、１回の洗浄によって除去した。ヤギＡｎｔｉ−Ａｆｆｉｂｏｄｙ（登録商標）ＩｇＧ（ＡｆｆｉｂｏｄｙＡＢ、カタログ番号２０．１０００．０１．０００５）をウェルに添加し、このプレートを１．５時間インキュベートして、結合したＣ５結合化合物に結合させた。１回の洗浄後、ウサギ抗ヤギＩｇＧＨＲＰを
、ヤギ抗体に１時間結合させた。最後の１回の洗浄の後、結合したＨＲＰの量を、酵素によって青色産物に変換されるＴＭＢ基質の添加によって検出した。３０分後の１Ｍ塩酸の添加によって反応を停止させたところ、ウェル内容物の色は青色から黄色に変化した。参照波長として６５０ｎｍにおける吸光度を使用し、４５０ｎｍにおける吸光度を測光法で測定した。色の強度は、ＰＳＩ０２４２（配列番号２４９）の量と比例しており、サンプル濃度を検量線から決定した。

連鎖球菌プロテインＧのアルブミン結合ドメインを含むＣ５結合化合物は、ヒトアルブミンに結合することが可能であることが証明され、データを以下の表ＶＩＩに示した。

このアッセイからの結果は、調べた、安定性が改善されたＣ５結合化合物は両方とも、ヒトアルブミンに結合する能力を維持していることを示した。

Ｃ５結合ポリペプチド／化合物の３ヶ月間の安定性試験
３７℃での２週間の安定性試験（実施例２）において、ＰＳＩ０２４２と比較して改善された安定性を示したＣ５結合ポリペプチド／化合物を、３７℃でのより長い３ヶ月間の安定性試験に供した。安定性試験の設定は、実施例２に記載した通りとし、安定性の評価を、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰＣ）による総タンパク質含量のクロマトグラム百分率のメインピークを測定することによって行い、このＲＰＣ方法を、実施例２に記載したように実施した。実施例２からの２週間のデータを、解釈をより容易にするために、以下の表ＶＩＩＩに含めた。

ＰＳＩ０２４２と比較して、５２位、５３位におけるＮＤからＳＥへのアミノ酸置換および６０位におけるＤからＥまたはＡへの置き換えを有するＣ５結合化合物（配列番号２６１、２６４および２６２）は、３７℃で３ヶ月間後において元の形態にあるタンパク質の割合が、同じ条件で２週間後におけるＰＳＩ０２４２（配列番号２４９）での割合よりも高い。他の化合物もまた、増加した安定性を示した。

同様に改変されたポリペプチドの安定性
Ｃ５よりも他の標的分子に対する結合親和性を有するプロテインＺ（ＧｒｏｅｎｗａｌｌらＪＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ２００７、１２８：１６２〜１８３頁）由来の以前に公知のポリペプチドバリアントを、安定性を改善するために、アミノ酸配列の特定の位置において同様に改変した。ヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）、血小板由来増殖因子受容体ベータ（ＰＤＧＦ−Ｒβ）、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）および炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）に対する結合親和性を有する元のポリペプチドバリアントの選択および産生は、例えば、ＷＯ２００９／０８０８１０、ＷＯ２００９／０７７１７５、ＰＣＴ／ＥＰ２０１４／０５５２９９およびＷＯ２０１４／０９６１６３に開示されている。安定性が改善されたポリペプチドバリアントを、アミノ酸配列の選択された位置における部位特異的変異誘発によって作製した。ＨＥＲ２を標的化するポリペプチドバリアントＺ０２８９１（配列番号２７２）；ＰＤＧＦ−Ｒβを標的化するＺ１５８０５（配列番号２７５）；ＦｃＲｎを標的化するＺ１０１０３（配列番号２７８）；およびＣＡＩＸを標的化するＺ０９７８２（配列番号２８１）中の、安定性改善性のアミノ酸置換を、以下の表ＩＸ中で特定する。これらの安定性が改善されたポリペプチドバリアントは、例えば、ＨＥＲ２、ＰＤＧＦ−Ｒβ、ＦｃＲｎおよびＣＡＩＸに対する結合親和性を有する結合モチーフ［ＢＭ］を有するという点で、本発明のＣ５結合ポリペプチドとは異なる。

全てのバリアントを、Ｎ末端６×ヒスチジンタグ（Ｈｉｓ６）と共にクローニングし、得られた構築物は、形式ＭＧＳＳＨＨＨＨＨＨＬＱ−［Ｚ＃＃＃＃＃］のポリペプチドをコードした。変異を、所望のアミノ酸置換をコードする重複するオリゴヌクレオチドプライマー対を使用し、確立された分子生物学の技術を適用することによって、ポリペプチドバリアントのプラスミド中に導入した。正確なプラスミド配列を、ＤＮＡ配列決定によって検証した。

大腸菌（株Ｔ７Ｅ２）細胞（ＧｅｎｅＢｒｉｄｇｅ）を、元のおよび改変されたポリペプチドをコードする遺伝子断片を含むプラスミドで形質転換した。これらの細胞を、５０μｇ／ｍｌカナマイシンを補充したＴＳＢ−ＹＥ培地中で３７℃で培養し、引き続いて、タンパク質発現を、ＩＰＴＧの添加によって誘導した。ペレット化した細胞を、ＦａｓｔＰｒｅｐ（登録商標）−２４ホモジナイザー（ＮｏｒｄｉｃＢｉｏｌａｂｓ）を使用して破壊し、細胞細片を、遠心分離によって除去した。Ｈｉｓ６タグ化タンパク質としてポリペプチドバリアントを含む各上清を、製造業者の指示に従ってＨｉｓＧｒａｖｉＴｒａｐ（商標）カラム（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用し、固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）によって精製した。精製したポリペプチドバリアントを、ＰＤ−１０脱塩カラム（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；１．４７ｍＭＫＨ_２ＰＯ_４、８．１ｍＭＮａ_２ＨＰＯ_４、１３７ｍＭＮａＣｌ、２．６８ｍＭＫＣｌ、ｐＨ７．４）に緩衝液交換した。各ポリペプチドは、正しいものが得られたかをＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＨＰＬＣ−ＭＳによって検証した。

Ｎ５２およびＤ５３のうちの一方（配列番号２８４〜２８７）または両方（配列番号２７３〜２７４、２７６〜２７７、２７９〜２８０、２８２〜２８３）の置換とは別に、置換を、ループ［Ｌ２］に対応する位置においても実施した。従って、配列番号２７４、２７７、２８０、２８３、２８５および２８７のポリペプチドバリアント中では、［Ｌ２］はＲＱＰＥである。

安定性試験を実施するために、ＰＢＳｐＨ７．４中に調合したポリペプチドバリアントを、１ｍｇ／ｍｌに希釈し、２００μｌずつ分取して３７℃で２週間インキュベートした。安定性試験の前および後に収集したサンプルを、１０％Ｂｉｓ−ＴｒｉｓＮｕＰＡＧＥゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用し、各ウェル中に５μｇタンパク質をロードして、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。得られたクマシーブルー染色されたゲルを、図６に示す。安定性を、昇温におけるインキュベーション後の新たなバリアントの出現によって評価し、変異したバリアントを、それぞれの元のポリペプチドと比較した。

表ＩＸに概略した改変を有する全てのポリペプチドバリアントは、元のポリペプチドのサンプルについて観察されたメインバンドのすぐ上の第２のバンドが、置換Ｄ５３Ｅおよび／またはＮ５２Ｓを有する改変されたポリペプチドのサンプルにおいては見られなかったという意味において、それぞれの元のポリペプチドと比較して改善された安定性を示した、図６を参照のこと。置換Ｄ３６Ｒ、Ｄ３７ＱおよびＳ３９Ｅと組み合わされた置換Ｄ５３Ｅおよび／またはＮ５２Ｓを有するポリペプチドは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で類似のプロフィールを示した。単独の置換Ｄ５３Ｅ、または置換Ｄ３６Ｒ、Ｄ３７ＱおよびＳ３９Ｅと組み合わされた置換Ｄ５３Ｅは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で第２のバンドとして観察された代替的なコンフォメーションを有する分子種の量を低減させるように見えたが、この分子種の形成を完全に防止するわけではなかった。

さらに、改変されたポリペプチドバリアントの結合能力を試験した。全てのポリペプチドバリアントが、改変された後に、それらの標的に対するそれらの結合親和性を保持していた（結果示さず）。

Ｃ５以外の標的分子に対する結合親和性を有するポリペプチドバリアントについて上で示した結果は、本発明のＣ５結合ポリペプチドおよび化合物について示された結果と十分に一致する（例えば、実施例２および４を参照のこと）。従って、本明細書に記載される特定のアミノ酸改変は、［ＢＭ］のアミノ酸配列と無関係に安定化効果を有するようである。従って、本明細書に記載されるアミノ酸の改変または置換は、本明細書およびＷＯ２０１３／１２６００６中に記載された全てのＣ５結合ポリペプチドおよび化合物の安定性を改善すると考えられる。

Claims

ヒト補体成分５（Ｃ５）に結合することが可能なポリペプチドであって：
（ａ）アミノ酸配列
［ＢＭ］−［Ｌ２］−ＱＳＸ_４２Ｘ_４３ＬＬＸ_４６ＥＡＫＫＬＸ_５２Ｘ_５３Ｘ_５４Ｑ
を含むポリペプチドであって、
式中、互いに独立に、
［ＢＭ］は、Ｃ５結合モチーフであり；
［Ｌ２］は、ＤＤＰＳおよびＲＱＰＥから選択され；
Ｘ_４２は、ＡおよびＳから選択され；
Ｘ_４３は、ＮおよびＥから選択され；
Ｘ_４６は、Ａ、ＳおよびＣから選択され；
Ｘ_５２は、Ｅ、ＮおよびＳから選択され；
Ｘ_５３は、Ｄ、ＥおよびＳから選択され、但し、Ｘ_５２がＮである場合にはＸ_５３はＤではなく；
Ｘ_５４は、ＡおよびＳから選択される、
該ポリペプチド；ならびに
（ｂ）（ａ）のポリペプチドと少なくとも８９％のアミノ酸配列同一性を有し、但し、Ｘ_５２がＮである場合にはＸ_５３はＤではない、ポリペプチド
から選択される、前記ポリペプチド。
（ａ）アミノ酸配列
ＡＥＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−［Ｌ２］−ＱＳＸ_４２Ｘ_４３ＬＬＸ_４６ＥＡＫＫＬＸ_５２Ｘ_５３Ｘ_５４ＱＡＰ
を含むポリペプチドであって、
式中、互いに独立に、
［ＢＭ］、［Ｌ２］、Ｘ_４２、Ｘ_４３、Ｘ_４６、Ｘ_５２、Ｘ_５３およびＸ_５４は、請求項１に記載した通りである、該ポリペプチド；ならびに
（ｂ）（ａ）のポリペプチドと少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有し、但し、Ｘ_５２がＮである場合にはＸ_５３はＤではない、ポリペプチド
から選択される、請求項１に記載のポリペプチド。
Ｘ_５２およびＸ_５３は、ＥおよびＳから独立して選択される、請求項１または２に記載のポリペプチド。
（ａ）Ｘ_５２はＳでありＸ_５３はＥである、または（ｂ）Ｘ_５２はＥでありＸ_５３はＳである、請求項３に記載のポリペプチド。
Ｘ_５２はＳでありＸ_５３はＤである、請求項１または２に記載のポリペプチド。
Ｘ_５２はＮでありＸ_５３はＥである、請求項１または２に記載のポリペプチド。
［ＢＭ］は：
（ａ）アミノ酸配列
ＥＸ_９Ｘ_１０Ｘ_１１ＡＸ_１３Ｘ_１４ＥＩＤＸ_１８ＬＰＮＬＸ_２３Ｘ_２４Ｘ_２５ＱＷＸ_２８ＡＦＩＸ_３２Ｘ_３３ＬＸ_３５
を含むポリペプチドであって、
式中、互いに独立に、
Ｘ_９は、Ｈ、Ｑ、Ｓ、ＴおよびＶから選択され；
Ｘ_１０は、Ｉ、Ｌ、ＭおよびＶから選択され；
Ｘ_１１は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、ＴおよびＹから選択され；
Ｘ_１３は、ＮおよびＷから選択され；
Ｘ_１４は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、ＳおよびＴから選択され；
Ｘ_１８は、Ａ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、ＴおよびＹから選択され；
Ｘ_２３は、ＮおよびＴから選択され；
Ｘ_２４は、Ｉ、ＬおよびＶから選択され；
Ｘ_２５は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、ＳおよびＴから選択され；
Ｘ_２８は、Ｉ、ＬおよびＶから選択され；
Ｘ_３２は、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｎ、ＳおよびＴから選択され；
Ｘ_３３は、ＫおよびＳから選択され；
Ｘ_３５は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、ＴおよびＹから選択される、
該ポリペプチド；ならびに
（ｂ）（ａ）のポリペプチドと少なくとも８５％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチド
から選択されるポリペプチドである、請求項１〜６のいずれか１項に記載のポリペプチド。
（ａ）アミノ酸配列
ＡＥＡＫＹＡＫＥＸ_９Ｘ_１０Ｘ_１１ＡＸ_１３Ｘ_１４ＥＩＤＸ_１８ＬＰＮＬＸ_２３Ｘ_２４Ｘ_２５ＱＷＸ_２８ＡＦＩＸ_３２Ｘ_３３ＬＸ_３５−［Ｌ２］−ＱＳＸ_４２Ｘ_４３ＬＬＸ_４６ＥＡＫＫＬＸ_５２Ｘ_５３Ｘ_５４ＱＡＰ
を含むポリペプチドであって、
式中、互いに独立に、
Ｘ_９は、Ｈ、Ｑ、Ｓ、ＴおよびＶから選択され；
Ｘ_１０は、Ｉ、Ｌ、ＭおよびＶから選択され；
Ｘ_１１は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、ＴおよびＹから選択され；
Ｘ_１３は、ＮおよびＷから選択され；
Ｘ_１４は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、ＳおよびＴから選択され；
Ｘ_１８は、Ａ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、ＴおよびＹから選択され；
Ｘ_２３は、ＮおよびＴから選択され；
Ｘ_２４は、Ｉ、ＬおよびＶから選択され；
Ｘ_２５は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、ＳおよびＴから選択され；
Ｘ_２８は、Ｉ、ＬおよびＶから選択され；
Ｘ_３２は、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｎ、ＳおよびＴから選択され；
Ｘ_３３は、ＫおよびＳから選択され；
Ｘ_３５は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、ＴおよびＹから選択され；
［Ｌ２］は、ＤＤＰＳおよびＲＱＰＥから選択され；
Ｘ_４２は、ＡおよびＳから選択され；
Ｘ_４３は、ＮおよびＥから選択され；
Ｘ_４６は、Ａ、ＳおよびＣから選択され；
Ｘ_５２は、Ｅ、ＮおよびＳから選択され；
Ｘ_５３は、Ｄ、ＥおよびＳから選択され、但し、Ｘ_５２がＮである場合にはＸ_５３はＤではなく；
Ｘ_５４は、ＡおよびＳから選択される、
該ポリペプチド；ならびに
（ｂ）（ａ）のポリペプチドと少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有し、但し、Ｘ_５２がＮである場合にはＸ_５３はＤではない、ポリペプチド
から選択される、請求項１〜７のいずれか１項に記載のポリペプチド。
以下の条件：
Ｘ_９はＶである、
Ｘ_１０はＬである、
Ｘ_１１はＥである、
Ｘ_１３はＷである、
Ｘ_１４はＤである、
Ｘ_１８はＲである、
Ｘ_２３はＴである、
Ｘ_２４はＩである、
Ｘ_２５はＥである、
Ｘ_２８はＬである、
Ｘ_３２はＮである、
Ｘ_３３はＫである、
Ｘ_３５はＤである、
［Ｌ２］はＤＤＰＳである、
Ｘ_４２はＳである、
Ｘ_４３はＥである、
Ｘ_４６はＳである、
Ｘ_５４はＳである、
のうち少なくとも１つが満たされる、請求項７または８に記載のポリペプチド。
［ＢＭ］は、配列番号１〜２４８中の１〜２８位からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載のポリペプチド。
［ＢＭ］は、配列番号１中の１〜２８位として示されるアミノ酸配列を含む、請求項１０に記載のポリペプチド。
配列番号２６０、配列番号２６５、配列番号２６６または配列番号２６７として示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドから選択される、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のポリペプチド。
Ｃ５に結合することが可能な化合物であって：
ａ．請求項１〜１２のいずれか１項に記載の少なくとも１つのＣ５結合ポリペプチド；
ｂ．連鎖球菌プロテインＧの少なくとも１つのアルブミン結合ドメイン、またはその誘導体；および
ｃ．場合により、該少なくとも１つのＣ５結合ポリペプチドのＣ末端またはＮ末端に、該少なくとも１つのアルブミン結合ドメインまたはその誘導体を連結させるための、少なくとも１つの連結部分
を含む前記化合物。
アルブミン結合ドメインは、配列番号２５０として示されるアミノ酸配列を含む、請求項１３に記載の化合物。
連結部分は、アミノ酸配列ＫＶＸ_６０ＧＳを含むペプチドであり、式中、Ｘ_６０は、Ｄ、ＥおよびＡから選択される、請求項１３または１４に記載の化合物。
Ｘ_６０はＤである、請求項１５に記載の化合物。
配列番号２５３として示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドである、請求項１６に記載の化合物。
Ｘ_６０はＥである、請求項１５に記載の化合物。
配列番号２６１、配列番号２６３、配列番号２６４、配列番号２６９または配列番号２７０として示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドである、請求項１８に記載の化合物。
Ｘ_６０はＡである、請求項１５に記載の化合物。
配列番号２６２として示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドである、請求項２０に記載の化合物。
連結部分は存在しない、請求項１５に記載の化合物。
Ｃ５に結合することが可能な化合物であって：
ａ．少なくとも１つのＣ５結合ポリペプチドであって：
ａ−１．アミノ酸配列
［ＢＭ］−［Ｌ２］−ＱＳＸ_４２Ｘ_４３ＬＬＸ_４６ＥＡＫＫＬＸ_５２Ｘ_５３Ｘ_５４Ｑ
を含むポリペプチドであって、
式中、互いに独立に、
［ＢＭ］は、Ｃ５結合モチーフであり；
［Ｌ２］は、ＤＤＰＳおよびＲＱＰＥから選択され；
Ｘ_４２は、ＡおよびＳから選択され；
Ｘ_４３は、ＮおよびＥから選択され；
Ｘ_４６は、Ａ、ＳおよびＣから選択され；
Ｘ_５２は、Ｅ、ＮおよびＳから選択され；
Ｘ_５３は、Ｄ、ＥおよびＳから選択され；
Ｘ_５４は、ＡおよびＳから選択される、
該ポリペプチド；ならびに
ａ−２．ａ−１のポリペプチドと少なくとも８９％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチド
から選択される、該少なくとも１つのＣ５結合ポリペプチド；
ｂ．連鎖球菌プロテインＧの少なくとも１つのアルブミン結合ドメイン、またはその誘導体；ならびに
ｃ．該少なくとも１つのＣ５結合ポリペプチドのＣ末端またはＮ末端に、該少なくとも１つのアルブミン結合ドメインまたはその誘導体を連結させるための、少なくとも１つの連結部分であって；該連結部分は、ＫＶＥＧＳもしくはＫＶＡＧＳを含み；または該連結部分は存在しない、該少なくとも１つの連結部分
を含む前記化合物。
Ｃ５に結合することが可能な化合物であって：
ａ．少なくとも１つのＣ５結合ポリペプチドであって：
ａ−１．アミノ酸配列
［ＢＭ］−［Ｌ２］−ＱＳＸ_４２Ｘ_４３ＬＬＸ_４６ＥＡＫＫＬＸ_５２Ｘ_５３Ｘ_５４Ｑ
を含むポリペプチドであって、
式中、互いに独立に、
［ＢＭ］は、Ｃ５結合モチーフであり；
［Ｌ２］は、ＲＱＰＥであり；
Ｘ_４２は、ＡおよびＳから選択され；
Ｘ_４３は、ＮおよびＥから選択され；
Ｘ_４６は、Ａ、ＳおよびＣから選択され；
Ｘ_５２は、Ｅ、ＮおよびＳから選択され；
Ｘ_５３は、Ｄ、ＥおよびＳから選択され；
Ｘ_５４は、ＡおよびＳから選択される、
該ポリペプチド；ならびに
ａ−２．ａ−１のポリペプチドと少なくとも８９％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチド
から選択される、該少なくとも１つのＣ５結合ポリペプチド；
ｂ．連鎖球菌プロテインＧの少なくとも１つのアルブミン結合ドメイン、またはその誘導体；ならびに
ｃ．場合により、該少なくとも１つのＣ５結合ポリペプチドのＣ末端またはＮ末端に、該少なくとも１つのアルブミン結合ドメインまたはその誘導体を連結させるための、少なくとも１つの連結部分
を含む前記化合物。
治療における使用のための、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のＣ５結合ポリペプチド、または請求項１３〜２４のいずれか１項に記載のＣ５結合化合物。
Ｃ５関連状態の処置および／または予防のための方法における使用のための、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のＣ５結合ポリペプチド、または請求項１３〜２４のいずれか１項に記載のＣ５結合化合物。
Ｃ５関連状態は、炎症性疾患；自己免疫疾患；感染性疾患；心血管疾患；神経変性障害；移植傷害；眼疾患；腎臓疾患；肺疾患；発作性夜間ヘモグロビン尿症（ＰＮＨ）のような血液学的疾患；アレルギー疾患および皮膚科学的疾患から選択される状態である、請求項２６に記載の、使用のためのＣ５結合ポリペプチドまたは使用のためのＣ５結合化合物。
静脈内に、皮下に、吸入により、経鼻的に、経口で、硝子体内にまたは局所的に投与される、請求項２５〜２７のいずれか１項に記載の使用のためのＣ５結合ポリペプチドまたは使用のためのＣ５結合化合物。