BR122023020080A2 - Ligação de polipeptídeos estáveis ao c5 do complemento humano - Google Patents
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Abstract
ligação de polipeptídeos estáveis ao c5 do complemento humano. a invenção diz respeito a um polipeptídeo capaz de se ligar ao componente 5 (c5) do complemento humano, o dito polipeptídeo compreendendo as sequências de aminoácidos [bm]-[l2]-qsx42x43llx46eakklx52x53x54q em que [bm] é um motivo de ligação de c5; [l2] é um laço de interligação; x42 é selecionado de a e s; x43 é selecionado de n e e; x46 é selecionado de a, s e c; x52 é selecionado de e, n e s; x53 é selecionado de d, e e s, desde que x53 não seja d quando x52 for n; e x54 é selecionado de a e s.
Description
[0001] A presente invenção diz respeito a polipeptídeos que se ligam ao componente 5 (C5) do complemento humano e ao uso de tais polipeptídeos em terapia.
[0002] A proteína C5 do complemento é um componente central do sistema complemento; uma parte chave do sistema imune inato. O sistema complemento é um sistema de vigilância imune complicado com inúmeras tarefas em diversos processos rigorosamente controlados. Ele funciona como um sistema de defesa do hospedeiro de primeira linha contra infecção por outros organismos, e também na discriminação dos tecidos do hospedeiro saudáveis dos resíduos celulares e células apoptóticas e necróticas. Além disso, ele está envolvido na depuração de complexos imunes, regulação da resposta imune adaptativa, promoção de regeneração do tecido, angiogênese, mobilização das células tronco e desenvolvimento do sistema nervoso central (Woodruff et al. Mol Immunol 2011, 48 (14):1631-1642); Ricklin et al. Nat Immunol 2010, 11(9):785-795). Qualquer desencadeamento, por exemplo, ativação errônea ou irrestrita, ou regulação insuficiente, que perturba o equilíbrio fino de ativação e regulação do complemento pode levar a condições patológicas incluindo autoataque das células do hospedeiro, levando a dano do tecido extensivo.
[0003] O sistema complemento consiste em cerca de 30 proteínas. Existem três caminhos para iniciar o complemento: o caminho clássico, que emprega C1q para reconhecer complexos imunes na superfície das células; o caminho de lectina, que é iniciado quando lectina de ligação de manose (MBL) reconhece certos açúcares; e o caminho alternativo, que é iniciado espontaneamente por hidrólise do fator 3 do complemento (C3), um processo suprimido por certas moléculas da superfície celular de mamífero não presentes em patógenos invasores. O caminho alternativo também age como um laço de amplificação para o sistema complemento. Todos os três caminhos convergem para o nível de C3. Clivagem de C3 em C3a e C3b leva à formação de uma convertase que, por sua vez, cliva o fator do complemento 5 (C5) em C5a e C5b. C5a é um atraente muito potente de várias células imunes, enquanto C5b oligomeriza com C6-9 para formar um poro conhecido como o complexo de ataque da membrana (MAC) ou, algumas vezes, o complexo terminal do complemento (TCC). Ativação do sistema complemento leva a inúmeros mecanismos com o propósito de neutralizar o patógeno; formação de MAC na superfície de uma célula tal como uma bactéria invasora leva a lise, deposição de produtos de clivagem de C3 e C4, C3b e C4b, ajuda na opsonização, levando a fagocitose do patógeno por macrófagos, e anafilatoxinas tais como C3a, e C5a, atrai monócitos e neutrófilos para o sítio de ativação, supra-regula marcadores de superfície, levando a maior susceptibilidade imunológica e à liberação das citocinas. C5 é uma glicoproteína de 190-kDa compreendida de 2 cadeias de polipeptídeo ligadas por dissulfeto, alfa e beta, com uma massa molecular de 115 e 75 kDa, respectivamente (Tack et al. Biochem 1979, 18:1490-1497). Haviland et al. (J Immun 1991, 146: 362-368) construíram a sequência de DNAc completa de pro-C5 do complemento humano, que presumivelmente codifica uma pró-molécula de 1.676 aminoácidos que contém um peptídeo líder de 18 aminoácidos e um adaptador de 4 aminoácidos separando as cadeias beta e alfa (SEQ ID NO: 251). Uma vez que C5 é comum a todos os caminhos de ativação do complemento, bloqueio de C5 interromperá a progressão da cascata indiferentemente dos estímulos e por meio disso impedirá as propriedades deletérias de ativação do complemento terminal, deixando ao mesmo tempo as funções imunoprotetoras e imuno-reguladoras da cascata de complemento proximal intactas.
[0004] O papel chave do sistema complemento na defesa contra patógenos em geral faz dele um alvo interessante para intervenção farmacêutica. Isto é enfatizado pelo fato de que muitas mutações ou regulação prejudicada do complemento estão envolvidas em várias doenças e condições. Essas incluem maior susceptibilidade a doenças autoimunes tal como lúpus eritematoso sistêmico (SLE) onde deposição de complexos imunes desencadeia o caminho clássico (Manderson et al. Annu Rev Immunol 2004, 22:431-456). Além do mais, mutações das proteínas do complemento C1-C5 frequentemente resultam em sintomas tipo SLE ou SLE. Outras doenças autoimune com um forte envolvimento do sistema complemento são artrite reumatóide (RA) onde complexos imunes podem ativar complemento na junta de RA, síndrome de Sjogren, dermatomiosite e outras doenças acionadas por autoanticorpo tais como síndrome de Guillain-Barré (GBS), síndrome de Fisher (Kaida et al. J. Neuroimmun 2010, 223:5-12), diferentes tipos de vasculite, esclerose sistêmica, membrana antiglomerular com embasamento (anti-GBM) e síndrome antifosfolipídio (APS) (Chen et al. J Autoimmun 2010, 34:J276-J286). Além disso, inibição do complemento tem se demonstrado efetiva em modelos animais de diferentes condições tais como periodontite (Abe et al. J Immunol 2012, 189:54425448), cicatrização de ferida (Cazender et al. Clin Dev Immunol 2012, on-line publication), crescimento tumoral (Markiewski et al. Nat Immunol 2008, 9:1225-1235) e doenças do olho tais como uveite e degeneração macular relacionada a idade (AMD) (Copland et al. Clin Exp Immunol 2009, 159:303-314).
[0005] Anticorpos alvejados no complemento C5 de humano são conhecidos, por exemplo, pela WO 95/29697, WO 02/30985 e WO 2004/007553. Eculizumab (SolirisÔ) é um anticorpo monoclonal humanizado direcionado contra proteína C5 e impede clivagem de C5 em C5a e C5b. Eculizumab mostrou ser efetivo no tratamento de hemoglobinúria paroxística noturna (PNH), uma doença do sangue rara e algumas vezes com risco de vida caracterizada por anemia hemolítica intravascular, trombofilia e deficiência da medula óssea, e é aprovado para esta indicação. Eculizumab foi também recentemente aprovado pela FDA para tratamento de síndrome hemolítica atípica (aHUS), uma doença rara, mas com risco de vida causada por perda de controle do caminho do complemento alternativo, levando a superativação manifestada como microangiopatia trombótica (TMA), levando ao risco constante de dano a órgãos vitais tais como rim, coração e o cérebro. Em aHUS, transplante do órgão danificado somente temporariamente ajuda o paciente, já que o fígado continua a produzir a forma mutada da proteína de controle (mais frequentemente fator H do complemento ou outras proteínas do caminho alternativo). Uma doença relacionada com uma patofisiologia aguda transiente é HUS causada por infecção de E. coli positivo de toxina Shiga (STEC-HUS) e existem dados clínicos promissores sugerindo eficácia também para esta condição (Lapeyraque et al, N Engl J Med 2011, 364:2561-2563). Finalmente, o anticorpo de bloqueio de C5 Eculizumab se mostrou eficaz na prevenção de rejeição mediada por anticorpo (AMR) em recipientes de rins com pareamento altamente imperfeito (Stegall, M. D. et al. Am J Transplant 2011, 11:2405-2413), e no tratamento de neuropatias autoimunes tais como neuromielite optica e miastenia grave (Pittock et al. Lancet Neurol 2013, 12:554-562; Howard et al. Muscle Nerve 2013, 48:76-84).
[0006] À parte dos anticorpos de comprimento total, fragmentos variáveis de cadeia única (scFV), minicorpos e aptâmeros que alvejam C5 são descritos na literatura. Esses inibidores de C5 podem ligar em diferentes sítios (epítopos) na molécula de C5 e podem ter diferentes modos de ação. Por exemplo, enquanto Eculizumab interage com C5 a uma certa distância do sítio de clivagem de convertase, o minicorpo Mubodina® interage com o sítio de clivagem de C5. Conjeturou-se que a proteína inibitória de C5 Ornithodoros moubata Complement Inhibitor (OmCI, Nunn, M. A. et al. J Immunol 2005, 174:2084-2091) do carrapato mole Ornithodoros moubata se liga na extremidade distal do superdomínio CUB- C5d-MG8, que é próximo ao sítio de clivagem de convertase (Fredslund et al. Nat Immunol 2008, 9 (7):753-760). Ao contrário das três proteínas mencionadas anteriormente que inibem clivagem de C5, o anticorpo monoclonal TNX-558 liga em um epítopo de C5a presente tanto em C5 intacto quanto C5a liberado sem inibir a clivagem de C5. (Fung et al. Clin Exp Immunol 2003, 133 (2):160-169).
[0007] Polipeptídeos de ligação de C5, compreendendo um motivo de ligação de C5, são revelados no Pedido de Patente Internacional No. PCT/SE2013/050139, publicado como WO 2013/126006. Em particular, WO 2013/126006 revela um motivo de ligação de C5, BM, consistindo na sequência de aminoácidos
[0008] EX2X3X4A X6X7EID X11LPNL X16X17X18QW X21AFIX25 X26LX28D,
[0009] em que, independentemente um do outro,
[0010] X2 é selecionado de H, Q, S, T e V;
[0011] X3 é selecionado de I, L, M e V;
[0012] X4 é selecionado de A, D, E, H, K, L, N, Q, R, S, T e Y;
[0013] X6 é selecionado de N e W;
[0014] X7 é selecionado de A, D, E, H, N, Q, R, S e T;
[0015] X11 é selecionado de A, E, G, H, K, L, Q, R, S, T e Y;
[0016] X16 é selecionado de N e T;
[0017] X17 é selecionado de I, L e V;
[0018] X18 é selecionado de A, D, E, H, K, N, Q, R, S e T;
[0019] X21 é selecionado de I, L e V;
[0020] X25 é selecionado de D, E, G, H, N, S e T;
[0021] X26 é selecionado de K e S; e
[0022] X28 é selecionado de A, D, E, H, N, Q, S, T e Y.
[0023] Exemplos de motivos de ligação de C5 específicos, previamente revelados em WO 2013/126006, são mostrados como SEQ ID NO: 1-248 no presente pedido de patente.
[0024] Sabe-se pela WO 2013/126006 que peptídeos ou polipeptídeos adicionais podem melhorar a estabilização de polipeptídeos de ligação de C5. Um exemplo de um polipeptídeo como esse é o domínio de ligação de albumina (ABD) mostrado como SEQ ID NO: 250 na presente descrição. Outros exemplos de domínios de ligação de albumina adequados são revelados em WO 2009/016043 e WO 2012/004384. Um polipeptídeo ABD estendido se liga em albumina de soro in vivo, e se beneficia de sua meia vida mais longa, que aumenta a meia vida líquida do próprio polipeptídeo (vide, por exemplo, WO 91/01743).
[0025] A provisão contínua de agentes com atividade de bloqueio de C5 equiparável continua uma matéria de interesse substancial no campo. Em particular, existe uma necessidade contínua de moléculas que impedem a cascata de complemento terminal, bem como a formação da molécula C5a proinflamatória. De grande interesse é também uma provisão de usos de tais moléculas no tratamento de doença.
[0026] Figura 1 ilustra um gel SDS-PAGE em que as bandas representam o composto de ligação de C5 PSI0242 (SEQ ID NO: 249) (0) antes do teste de estabilidade; e (w) depois de teste de estabilidade de 2 semanas.
[0027] Figura 2 é um cromatograma de HPLC de fase reversa de PSI0242 (SEQ ID NO: 249) antes do teste de estabilidade (linha cheia) e depois do teste de estabilidade de 2 semanas (linha pontilhada).
[0028] Figura 3 ilustra um gel SDS-PAGE em que a primeira pista contém marcador de tamanho SeeBlue 2P e as bandas representam (0) as amostras iniciais; e (w) as amostras depois do teste de estabilidade de 2 semanas. Fig. 3A: SEQ ID NO: 249; Fig. 3B: SEQ ID NO: 261; Fig. 3C: SEQ ID NO: 262; Fig. 3D: SEQ ID NO: 264.
[0029] Figura 4 é um cromatograma de HPLC de fase reversa de um composto de ligação de C5 (SEQ ID NO: 253) antes do teste de estabilidade (linha cheia) e depois do teste de estabilidade de 2 semanas (linha pontilhada).
[0030] Figura 5 é um cromatograma de HPLC de fase reversa de um composto de ligação de C5 (SEQ ID NO: 264) antes do teste de estabilidade (linha cheia) e depois do teste de estabilidade de 2 semanas (linha pontilhada).
[0031] Figura 6A-D mostra imagens de gel SDS-PAGEs comparando variantes de polipeptídeo original e modificado (0) antes e (w) depois do teste de estabilidade de 2 semanas. O marcador de tamanho molecular (Mw) foi Novex® Sharp Prestained Protein Standard (216, 160, 110, 80, 60, 50, 40, 30, 20, 15, 10, 3,5 kDa). Fig. 6A mostra um gel de polipeptídeos de ligação de HER2 em que as pistas mostram pista 1: Mw, pista 2: (0) Z02891 (SEQ ID NO: 272) , pista 3: (w) Z02891 (SEQ ID NO: 272), pista 4: Mw, pista 5: (0) Z17341 (SEQ ID NO: 273), pista 6: (w) Z17341 (SEQ ID NO: 273), pista 7: (0) Z17342 (SEQ ID NO: 274), pista 8: (w) Z17342 (SEQ ID NO: 274). Fig. 6B é um gel de polipeptídeos de ligação de PDGF-Rb em que as pistas mostram: pista 1: Mw, pista 2: (0) Z15805 (SEQ ID NO: 275), pista 3: (w) Z15805 (SEQ ID NO: 275), pista 4: Mw, pista 5: (0) Z17343 (SEQ ID NO: 276), pista 6: (w) Z17343 (SEQ ID NO: 276), pista 7: (0) Z17344 (SEQ ID NO: 277), pista 8: (w) Z17344 (SEQ ID NO: 277). Fig. 6C mostra um gel de polipeptídeos de ligação de FcRn em que as pistas mostram: pista 1: (0) Z10103 (SEQ ID NO: 278), pista 2: (w) Z10103 (SEQ ID NO: 278), pista 3: Mw, pista 4: (0) Z17347 (SEQ ID NO: 279), pista 5: (w) Z17347 (SEQ ID NO: 279), pista 6: (0) Z17348 (SEQ ID NO: 280), pista 7: (w) Z17348 (SEQ ID NO: 280). As bandas diagonais observadas na figura 6C é um artefato resultante de uma impressão de um segundo gel manchado no mesmo recipiente. Fig. 6D é um gel de polipeptídeos de ligação de CAIX em que as pistas mostram pista 1:Mw, pista 2: (0) Z09782 (SEQ ID NO: 281), pista 3: (w) Z09782 (SEQ ID NO: 281), pista 4: Mw, pista 5: (0) Z17351 (SEQ ID NO: 282), pista 6: (w) Z17351 (SEQ ID NO: 282), pista 7: (0) Z17352 (SEQ ID NO: 283), pista 8: (w) Z17352 (SEQ ID NO: 283); pista 9: (0) Z17355 (SEQ ID NO: 284), pista 10: (w) Z17355 (SEQ ID NO: 284), pista 11: (0) Z17357 (SEQ ID NO: 285), pista 12: (w) Z17357 (SEQ ID NO: 285), pista 13: (0) Z17359 (SEQ ID NO: 286), pista 14: (w) Z17359 (SEQ ID NO: 286), pista 15: (0) Z17360 (SEQ ID NO: 287), pista 16: (w) Z17360 (SEQ ID NO: 287).
[0032] Figura 7 é uma tabela mostrando a sequência de aminoácidos de:
[0033] exemplos de motivos de ligação de C5 (SEQ ID NO: 1-248);
[0034] o composto de ligação de C5 designado PSI0242 (SEQ NO: 249);
[0035] um domínio de ligação de albumina (SEQ ID NO: 250);
[0036] a entrada Swiss-Prot P01031 de C5 de humano (SEQ ID NO:251) em que a cadeia α corresponde a resíduos de aminoácido 678-1676 e a cadeia β corresponde a resíduos de aminoácido 19-673;
[0037] exemplos de polipeptídeos de ligação de C5 modificados (SEQ ID NO: 260, 265-267).
[0038] exemplos de compostos de ligação de C5 modificados (SEQ ID NO: 252259, 261-264, 268-270).
[0039] exemplos de variantes de polipeptídeo com afinidade de ligação com outras moléculas alvos (SEQ ID NO: 272, 275, 278, 281)
[0040] exemplos de variantes de polipeptídeo de estabilidade melhorada com afinidade de ligação com outros alvos com (SEQ ID NO: 273-274, 276-277, 279-280, 282-287).
[0041] Observou-se surpreendentemente que polipeptídeos e compostos de ligação de C5, em que a sequência de aminoácidos foi modificada nas posições específicas, têm estabilidade melhorada, quando comparados com polipeptídeos e compostos de ligação de C5 previamente conhecidos.
[0042] Consequentemente, esta invenção fornece um polipeptídeo capaz de ligar componente 5 (C5) do complemento humano, o dito polipeptídeo sendo selecionado de:
[0043] um polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos
[0044] [BM]-[L2]-QSX42X43LLX46EAKKLX52X53X54Q
[0045] em que, independentemente um do outro,
[0046] [BM] é um motivo de ligação de C5;
[0047] [L2] é selecionado de DDPS e RQPE;
[0048] X42 é selecionado de A e S;
[0049] X43 é selecionado de N e E;
[0050] X46 é selecionado de A, S e C;
[0051] X52 é selecionado de E, N e S;
[0052] X53 é selecionado de D, E e S, desde que X53 não seja D quando X52 for N; e
[0053] X54 é selecionado de A e S; e
[0054] (b) um polipeptídeo que tem pelo menos 89 % de identidade de sequência de aminoácidos com o polipeptídeo de (a), desde que X53 não seja D quando X52 for N.
[0055] Os inventores observaram surpreendentemente que modificação ou substituição de resíduo(s) de aminoácido em certa(s) posição(s) da sequência de aminoácidos dos polipeptídeos de ligação de C5 conforme descrito em WO 2013/126006 melhora a estabilidade dos polipeptídeos de ligação de C5, enquanto a atividade biológica, tais como afinidade de ligação com o componente 5 (C5) do complemento humano e inibição da função do caminho do complemento, é essencialmente retida. Assim, a atividade biológica dos polipeptídeos de ligação de C5 modificados é comparável com a atividade biológica dos polipeptídeos de ligação de C5 conhecidos. Teste de estabilidade dos polipeptídeos de ligação de C5 da presente invenção demonstra que substituição tanto em X52, de N a E ou S, quanto X53, de D a E ou S, melhora a estabilidade. Além disso, observou-se que substituição de aminoácido específico em [L2] independentemente pode promover estabilidade.
[0056] As expressões “ligação de C5” e ”afinidade de ligação com C5” da maneira usada nesta especificação se refere a uma propriedade de um polipeptídeo que pode ser testado, por exemplo, pelo uso de tecnologia de ressonância de plasmon de superfície, tal como em um instrumento Biacore (GE Healthcare). Afinidade de ligação de C5 pode, por exemplo, ser testada em um experimento no qual C5 é imobilizado em um chipe de sensor de um instrumento Biacore, e a amostra contendo o polipeptídeo a ser testado é passado sobre o chipe. Alternativamente, o polipeptídeo a ser testado é imobilizado em um chipe de sensor do instrumento, e uma amostra contendo C5, ou fragmento do mesmo, é passada sobre o chipe. Versados na técnica podem então interpretar os resultados obtidos por tais experimentos para estabelecer pelo menos uma medida qualitativa da ligação do polipeptídeo em C5. Se uma medida quantitativa for desejada, por exemplo, para determinar a constante de dissociação KD de equilíbrio aparente para a interação, métodos de ressonância de plasmon de superfície podem também ser usados. Valores de ligação podem, por exemplo, ser definidos em um instrumento Biacore 2000 (GE Healthcare). C5 é imobilizado em um chipe de sensor da medição, e amostras do polipeptídeo cuja afinidade deve ser determinada são preparadas por diluição serial e injetadas sobre o chipe. Valores KD podem então ser calculados a partir dos resultados usando, por exemplo, o modelo de ligação Langmuir 1:1 do software BIAevaluation fornecido pelo fabricante do instrumento. O C5 ou fragmento do mesmo usado na determinação de KD pode, por exemplo, compreender a sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 251. Exemplos de como a afinidade de ligação de C5 pode ser testada são dados aqui, vide Exemplo 3 e 5.
[0057] Em uma forma preferida da invenção, o dito polipeptídeo é selecionado de:
[0058] um polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos
[0059] AEAKYAK-[BM]-[L2]-QSX42X43LLX46EAKKLX52X53X54QAP
[0060] em que, independentemente um do outro,
[0061] [BM], [L2], X42, X43, X46, X52, X53 e X54 são da maneira definida anteriormente; e
[0062] (b) um polipeptídeo que tem pelo menos 90 % de identidade de sequência de aminoácidos com o polipeptídeo de (a), desde que X53 não seja D quando X52 for N.
[0063] Conforme previamente revelado em WO 2013/126006, o polipeptídeo de ligação de C5 de acordo com a invenção pode formar parte de um domínio de proteína de feixe de três hélices. O dito motivo de ligação de C5 [BM] essencialmente pode formar parte de duas hélices alfa, com um laço de interligação, no dito feixe de três hélices. Um segundo laço de interligação, referido aqui como [L2], conecta o motivo de ligação de C5 na terceira hélice alfa, referido como a “Espinha dorsal”.
[0064] Em uma modalidade, o motivo de ligação de C5 [BM] é essencialmente conforme revelados em WO 2013/126006. Entretanto, de acordo com a presente invenção o motivo de ligação de C5 preferivelmente consiste em 28, em vez de 29 aminoácidos, e pode além disso carregar substituições de aminoácidos adicionais.
[0065] Assim, em uma modalidade, o dito [BM] carrega pelo menos uma substituição de aminoácido adicional, por exemplo, na posição 17, quando comparado com o [BM] revelado em WO 2013/126006. Assim, o dito [BM] é um polipeptídeo selecionado de:
[0066] um polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos
[0067] EX9X10X11A X13X14EIDX17X18LPNLX23X24X25QWX28AFIX32X33LX35;
[0068] em que, independentemente um do outro,
[0069] X9 é selecionado de H, Q, S, T e V;
[0070] X10 é selecionado de I, L, M e V;
[0071] X11 é selecionado de A, D, E, H, K, L, N, Q, R, S, T e Y;
[0072] X13 é selecionado de N e W;
[0073] X14 é selecionado de A, D, E, H, N, Q, R, S e T;
[0074] X17 é selecionado de D e E;
[0075] X18 é selecionado de A, E, G, H, K, L, Q, R, S, T e Y;
[0076] X23 é selecionado de N e T;
[0077] X24 é selecionado de I, L e V;
[0078] X25 é selecionado de A, D, E, H, K, N, Q, R, S e T;
[0079] X28 é selecionado de I, L e V;
[0080] X32 é selecionado de A, D, E, G, H, N, S e T;
[0081] X33 é selecionado de K e S;
[0082] X35 é selecionado de A, D, E, H, N, Q, S, T e Y; e
[0083] (b) um polipeptídeo que tem pelo menos 85% de identidade de sequência de aminoácidos com o polipeptídeo de (a).
[0084] Em uma modalidade preferida, o motivo de ligação de C5 [BM] é essencialmente como revelado em WO 2013/126006. O dito [BM] é dessa maneira um polipeptídeo selecionado de:
[0085] um polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos
[0086] EX9X10X11A X13X14EIDX18LPNLX23X24X25QWX28AFIX32X33LX35;
[0087] em que, independentemente um do outro,
[0088] X9 é selecionado de H, Q, S, T e V;
[0089] X10 é selecionado de I, L, M e V;
[0090] X11 é selecionado de A, D, E, H, K, L, N, Q, R, S, T e Y;
[0091] X13 é selecionado de N e W;
[0092] X14 é selecionado de A, D, E, H, N, Q, R, S e T;
[0093] X18 é selecionado de A, E, G, H, K, L, Q, R, S, T e Y;
[0094] X23 é selecionado de N e T;
[0095] X24 é selecionado de I, L e V;
[0096] X25 é selecionado de A, D, E, H, K, N, Q, R, S e T;
[0097] X28 é selecionado de I, L e V;
[0098] X32 é selecionado de D, E, G, H, N, S e T;
[0099] X33 é selecionado de K e S;
[00100] X35 é selecionado de A, D, E, H, N, Q, S, T e Y; e
[00101] (b) um polipeptídeo que tem pelo menos 85 % de identidade de sequência de aminoácidos com o polipeptídeo de (a).
[00102] Em um aspecto preferido adicional, [BM] compreende ou consiste em uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas posições 1-28 na SEQ ID NOS: 1-248. Mais preferivelmente, [BM] compreende ou consiste na sequência de aminoácidos mostrada como posições 1-28 na SEQ ID NO: 1.
[00103] Em um aspecto adicional, o polipeptídeo de ligação de C5 de acordo com a invenção é selecionado de:
[00104] um polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos
[00105] AEAKYAKEX9X10X11AX13X14EIX17X18LPNLX23X24X25QWX28AFIX32
[00106] X33LX35-[L2]-QSX42X43LLX46EAKKLX52X53X54QAP;
[00107] em que, independentemente um do outro,
[00108] X9 é selecionado de H, Q, S, T e V;
[00109] X10 é selecionado de I, L, M e V;
[00110] X11 é selecionado de A, D, E, H, K, L, N, Q, R, S, T e Y;
[00111] X13 é selecionado de N e W;
[00112] X14 é selecionado de A, D, E, H, N, Q, R, S e T;
[00113] X17 é selecionado de D e E;
[00114] X18 é selecionado de A, E, G, H, K, L, Q, R, S, T e Y;
[00115] X23 é selecionado de N e T;
[00116] X24 é selecionado de I, L e V;
[00117] X25 é selecionado de A, D, E, H, K, N, Q, R, S e T;
[00118] X28 é selecionado de I, L e V;
[00119] X32 é selecionado de A, D, E, G, H, N, S e T;
[00120] X33 é selecionado de K e S;
[00121] X35 é selecionado de A, D, E, H, N, Q, S, T e Y;
[00122] [L2] é selecionado de DDPS e RQPE;
[00123] X42 é selecionado de A e S;
[00124] X43 é selecionado de N e E;
[00125] X46 é selecionado de A, S e C;
[00126] X52 é selecionado de E, N e S;
[00127] X53 é selecionado de D, E e S, desde que X53 não seja D quando X52 for N;
[00128] e
[00129] X54 é selecionado de A e S; e
[00130] um polipeptídeo que tem pelo menos 90 % de identidade de sequência de aminoácidos com o polipeptídeo de (a), desde que X53 não seja D quando X52 for N.
[00131] Em uma modalidade preferida, o polipeptídeo de ligação de C5 de acordo com a invenção é selecionado de:
[00132] um polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos
[00133] AEAKYAKEX9X10X11AX13X14EIDX18LPNLX23X24X25QWX28AFIX32X33LX35- [L2]-QSX42X43LLX46EAKKLX52X53X54QAP;
[00134] em que, independentemente um do outro,
[00135] X9 é selecionado de H, Q, S, T e V;
[00136] X10 é selecionado de I, L, M e V;
[00137] X11 é selecionado de A, D, E, H, K, L, N, Q, R, S, T e Y;
[00138] X13 é selecionado de N e W;
[00139] X14 é selecionado de A, D, E, H, N, Q, R, S e T;
[00140] X18 é selecionado de A, E, G, H, K, L, Q, R, S, T e Y;
[00141] X23 é selecionado de N e T;
[00142] X24 é selecionado de I, L e V;
[00143] X25 é selecionado de A, D, E, H, K, N, Q, R, S e T;
[00144] X28 é selecionado de I, L e V;
[00145] X32 é selecionado de D, E, G, H, N, S e T;
[00146] X33 é selecionado de K e S;
[00147] X35 é selecionado de A, D, E, H, N, Q, S, T e Y;
[00148] [L2] é selecionado de DDPS e RQPE;
[00149] X42 é selecionado de A e S;
[00150] X43 é selecionado de N e E;
[00151] X46 é selecionado de A, S e C;
[00152] X52 é selecionado de E, N e S;
[00153] X53 é selecionado de D, E e S, desde que X53 não seja D quando X52 for N;
[00154] e
[00155] X54 é selecionado de A e S; e
[00156] um polipeptídeo que tem pelo menos 90 % de identidade de sequência de aminoácidos com o polipeptídeo de (a), desde que X53 não seja D quando X52 for N.
[00157] Em formas preferidas da invenção, pelo menos uma das seguintes dezoito, opcionalmente dezenove, condições é satisfeita:
[00158] X9 é V,
[00159] X10 é L,
[00160] X11 é E,
[00161] X13 é W,
[00162] X14 é D,
[00163] opcionalmente X17 é D,
[00164] X18 é R,
[00165] X23 é T,
[00166] X24 é I,
[00167] X25 é E,
[00168] X28 é L,
[00169] X32é N,
[00170] X33 é K,
[00171] X35 é D,
[00172] [L2] é DDPS,
[00173] X42 é S,
[00174] X43 é E,
[00175] X46 é S,
[00176] X54 é S.
[00177] Mais preferivelmente, pelo menos duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez, onze, doze, treze, quatorze, quinze, dezesseis, dezessete, dezoito ou dezenove das condições anteriores são satisfeitas.
[00178] Em uma modalidade, X52 e X53 são independentemente selecionados de E e S. Preferivelmente, (a) X52 é S e X53 é E, ou (b) X52 é E e X53 é S.
[00179] Em uma modalidade, X52 é S e X53 é D.
[00180] Em uma outra modalidade, X52 é N e X53 é E.
[00181] Em um aspecto adicional, o polipeptídeo de acordo com a invenção compreende a sequência de amino mostrada como SEQ ID NO: 260, SEQ ID NO: 265, SEQ ID NO: 266, ou SEQ ID NO: 267.
[00182] Em um aspecto adicional, é fornecido um composto capaz de ligar C5, o dito composto compreendendo:
[00183] pelo menos um polipeptídeo de ligação de C5 da maneira definida anteriormente;
[00184] pelo menos um domínio de ligação de albumina de proteína G estreptocócica, ou um derivado da mesma; e
[00185] opcionalmente, pelo menos uma fração de ligação para ligar o dito pelo menos um domínio de ligação de albumina ou derivado do mesmo no terminal C ou N do dito pelo menos um polipeptídeo de ligação de C5.
[00186] Preferivelmente, o dito domínio de ligação de albumina compreende a sequência de aminoácidos mostrada como SEQ ID NO: 250.
[00187] Preferivelmente, a dita fração de ligação é um peptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos KVX60GS, em que X60 é selecionado de D, E e A. Quando X60 é D, um composto preferido compreende ou consiste na sequência de amino mostrada como SEQ ID NO: 253. Quando X60 é E, compostos preferidos compreendem ou consistem na sequência de amino mostrada como SEQ ID NO: 261, SEQ ID NO: 263, SEQ ID NO: 264, SEQ ID NO: 269 ou SEQ ID NO: 270. Quando X60 é A, um composto preferido compreende ou consiste na sequência de aminoácidos mostrada como SEQ ID NO: 262. Nas sequências de aminoácidos listadas anteriormente dos compostos de ligação de C5, resíduos de aminoácido 157 representam as sequências de aminoácidos de um polipeptídeo de ligação de C5, resíduos 58-62 representam as sequências de aminoácidos de um adaptador, e resíduos 63-108 representam as sequências de aminoácidos de um domínio de ligação de albumina.
[00188] Em uma modalidade, a fração de ligação está ausente.
[00189] Conforme discutido anteriormente, polipeptídeos de ligação de C5 preferidos de acordo com a invenção incluem aqueles em que X52 e X53 são independentemente selecionados de E e S. Especificamente, compostos de acordo com a invenção podem ser derivados de PSI0242 (SEQ ID NO: 249), mas têm modificações em pelo menos uma das posições 52, 53 e 60. Por exemplo, como mostrado na Fig. 7 e na listagem de sequência, o composto preferido designado PSI0378 (SEQ ID NO: 261) carrega as substituições de aminoácido N52S, D53E e D60E; o composto preferido designado PSI0379 (SEQ ID NO: 262) carrega as substituições de aminoácido N52S, D53E e D60A; o composto preferido designado PSI0381 (SEQ ID NO: 263) carrega as substituições de aminoácido N52E, D53S e D60E; e o composto preferido designado PSI0383 (SEQ ID NO: 264) carrega as substituições de aminoácido N52S, D53E e D60E. Adicionalmente, SEQ ID NO: 264 também carrega substituições no laço [L2], a saber, D36R, D37Q e S39E. Além disso, o composto preferido designado PSI0403 (SEQ ID NO: 269) carrega as substituições de aminoácido D53E e D60E, e o composto preferido designado PSI0404 (SEQ ID NO: 270) carrega as substituições de aminoácido N52S e D60E.
[00190] Conforme esclarecido, os inventores observaram surpreendentemente que substituições de aminoácido em certas posições da sequências de aminoácidos dos polipeptídeos de ligação de C5 conforme descrito em WO 2013/126006 podem melhorar a estabilidade. Tais substituições melhoram a estabilidade dos compostos de ligação de C5, enquanto atividade biológica, tais como capacidade de ligação de C5 e inibição de hemólise in vitro, é retida. Teste de estabilidade dos compostos de ligação de C5 da presente invenção demonstram, por exemplo, que cada qual de N52S (X52) e D53E (X53) (SEQ ID NO: 253) individualmente, bem como remoção de D60 (X60) (SEQ ID NO: 259 que não tem fração de ligação) melhora a estabilidade. A combinação das substituições N52S, D53E e D60E ou D60A adicionalmente melhora a estabilidade (SEQ ID NO: 261 e SEQ ID NO: 262). Observou-se que cada qual das substituições combinadas de N52S e D60E (SEQ ID NO: 270) e D53E e D60E (SEQ ID NO: 269) similarmente melhora a estabilidade. Isto indica que cada qual das substituições de aminoácido listadas é envolvida na melhoria da estabilidade do polipeptídeo, e assim que cada qual dessas substituições fornecerá polipeptídeos de ligação de C5 adicionalmente estabilizados e compostos comparados com polipeptídeos e compostos de ligação de C5 previamente conhecidos.
[00191] Entretanto, versados na técnica poderão identificar polipeptídeos e/ou compostos que têm modificações em pelo menos uma das posições 52, 53 e 60, e/ou no laço [L2], mas que também carregam modificações adicionais como substituições, pequenas deleções, inserções ou inversões e, no entanto, têm substancialmente as atividades biológicas reveladas e estabilidade melhorada. Adicionalmente, um polipeptídeo e/ou composto de ligação de C5 de acordo com a invenção pode compreender adicionalmente aminoácidos do terminal C e/ou terminal N que melhoram produção, purificação, estabilização in vivo ou in vitro, acoplamento, ou detecção do polipeptídeo.
[00192] Em um aspecto adicional da invenção, é fornecido um composto capaz de ligar C5, o dito composto compreendendo:
[00193] pelo menos um polipeptídeo de ligação de C5, o dito polipeptídeo sendo selecionado de:
[00194] a-1. um polipeptídeo compreendendo as sequências de aminoácidos
[00195] [BM]-[L2]-QSX42X43LLX46EAKKLX52X53X54Q
[00196] em que, independentemente um do outro,
[00197] [BM] é um motivo de ligação de C5;
[00198] [L2] é selecionado de DDPS e RQPE;
[00199] X42 é selecionado de A e S;
[00200] X43 é selecionado de N e E;
[00201] X46 é selecionado de A, S e C;
[00202] X52 é selecionado de E, N e S;
[00203] X53 é selecionado de D, E e S;
[00204] X54 é selecionado de A e S; e
[00205] a-2. um polipeptídeo que tem pelo menos 89 % de identidade de sequências de aminoácidos com o polipeptídeo de a-1.;
[00206] b. pelo menos um domínio de ligação de albumina de proteína G estreptocócica, ou um derivado da mesma; e
[00207] c. pelo menos uma fração de ligação para ligar o dito pelo menos um domínio de ligação de albumina ou derivado do mesmo no terminal C ou N do dito pelo menos um polipeptídeo de ligação de C5; em que a fração de ligação compreende ou consiste em KVEGS ou KVAGS; ou em que a dita fração de ligação está ausente.
[00208] Observou-se que remoção de D60 ou uma substituição de aminoácido na posição 60 de SEQ ID NO: 249 sozinha melhora a estabilidade dos compostos de ligação de C5 da invenção comparados com compostos de ligação de C5 previamente conhecidos. Preferivelmente, a fração de ligação é KVEGS (X60=E) enquanto X52X53 pode ser ND, e um exemplo de um composto preferido que carrega uma fração de ligação como essa é PSI0410 (SEQ ID NO: 268). Em uma outra modalidade preferida, D60 e toda a fração de ligação estão ausentes e um exemplo de um composto como esse é o composto preferido designado PSI0369 (SEQ ID NO: 259).
[00209] Em modalidades do aspecto anterior, [BM] e o domínio de ligação de albumina são da maneira definida anteriormente em aspectos relacionados. Preferivelmente, [L2] é DDPS.
[00210] Em um aspecto adicional, é fornecido um composto capaz de ligar C5, o dito composto compreendendo:
[00211] pelo menos um polipeptídeo de ligação de C5, o dito polipeptídeo sendo selecionado de:
[00212] a-1. um polipeptídeo compreendendo as sequências de aminoácidos
[00213] [BM]-[L2]-QSX42X43LLX46EAKKLX52X53X54Q
[00214] em que, independentemente um do outro,
[00215] [BM] é um motivo de ligação de C5;
[00216] [L2] é RQPE;
[00217] X42 é selecionado de A e S;
[00218] X43 é selecionado de N e E;
[00219] X46 é selecionado de A, S e C;
[00220] X52 é selecionado de E, N e S;
[00221] X53 é selecionado de D, E e S;
[00222] X54 é selecionado de A e S; e
[00223] a-2. um polipeptídeo que tem pelo menos 89 % de identidade de sequências de aminoácidos com o polipeptídeo de a-1.;
[00224] b. pelo menos um domínio de ligação de albumina de proteína G estreptocócica, ou um derivado da mesma; e
[00225] c. opcionalmente, pelo menos uma fração de ligação para ligar o dito pelo menos um domínio de ligação de albumina ou derivado do mesmo no terminal C ou N do dito pelo menos um polipeptídeo de ligação de C5.
[00226] Observou-se que substituições de aminoácido específicas no laço [L2] melhoram a estabilidade dos compostos de ligação de C5 (por exemplo, SEQ ID NO: 252) da invenção, comparados com compostos de ligação de C5 previamente conhecidos. Em modalidades do aspecto anterior, o dito [BM] e domínio de ligação de albumina são individualmente da maneira definida anteriormente em aspectos relacionados. Preferivelmente, a dita fração de ligação é um peptídeo compreendendo as sequências de aminoácidos KVX60GS, em que X60 é selecionado de D, E e A.
[00227] A invenção inclui polinucleotídeos que codificam polipeptídeos de acordo com a invenção. Adicionalmente incluídos na invenção estão vetores, tais como vetores de expressão, compreendendo polinucleotídeos que codificam polipeptídeos de acordo com a invenção. Estão também incluídas células hospedeiras que compreendem tais vetores.
[00228] Estão incluídos na invenção polipeptídeos e compostos de ligação de C5 conforme descrito anteriormente, para uso em terapia. Em particular, os polipeptídeos e compostos de ligação de C5 de acordo com a invenção são úteis em métodos para o tratamento e/ou profilaxia de condições relacionadas a C5, tais como doenças inflamatórias; doenças autoimunes; doenças infecciosas; doenças cardiovasculares; distúrbios neurodegenerativos; lesão do enxerto; doenças do olho; doenças renais; doenças pulmonares; doenças hematológicas tal como hemoglobinúria paroxística noturna (PNH); doenças alérgicas e doenças dermatológicas.
[00229] Em métodos para tratamento e/ou profilaxia, o dito polipeptídeo ou composto de ligação de C5 pode preferivelmente ser administrado intravenosamente, subcutaneamente, por inalação, nasalmente, oralmente, intravitrealmente, ou topicamente.
[00230] EXEMPLOS
[00231] EXEMPLO 1: Teste de estabilidade de inibidor de C5 conhecido
[00232] O composto de ligação de C5 designado PSI0242 (SEQ ID NO: 249) foi formulado em NaP 25 mM/NaCl 125 mM pH 7,0 e submetido a um estudo de estabilidade acelerada por 2 semanas a 37 °C. A estabilidade foi medida pelo aparecimento de novas variantes depois do teste de estabilidade por SDS-PAGE e HPLC de Fase Reversa (RPC). Em ambas as análises a amostra inicial e aquela submetida ao estudo de estabilidade foram corridas em paralelo. Para o SDS-PAGE, 7,5 μg de proteína foram carregados em cada poço. O RPC foi corrido em um HPLC Agilent 1100 usando uma Fase A Móvel consistindo em 0,1 % de ácido trifluoracético (TFA) em água, e usando uma Fase B Móvel consistindo em 0,1 % de TFA/45 % de MeOH/45 % de isopropilamina (IPA)/10 % de água.
[00233] Os resultados mostram que novas formas da proteína são formadas durante incubação, essas novas formas visualizadas como bandas em SDS-PAGE (Fig.1) e como novos picos em cromatogramas de HPLC de Fase Reversa (RPC) (Fig. 2). Na Fig. 2, o pico principal depois de 2 semanas de incubação corresponde a 57 % da amostra da proteína original.
[00234] Posições 1-60 na SEQ ID NO: 249 correspondem ao polipeptídeo Z06175a, previamente revelado em WO 2013/126006 como SEQ ID NO: 753. PSI0242 (SEQ ID NO: 249) foi produzido essencialmente como revelado em WO 2013/126006.
[00235] EXEMPLO 2: Estabilidade de polipeptídeos de ligação de C5 modificados e compostos
[00236] Polipeptídeos de ligação de C5 modificados e compostos foram sintetizados e purificados essencialmente conforme descrito em WO 2013/126006.
[00237] Resumidamente, DNA que codifica variantes da ligação de C5 Z foi E. coli códon otimizado e sintetizado por GeneArt, GmbH. Os genes sintéticos representando as variantes da ligação de C5 Z foram subclonados e expressos em E. coli.
[00238] Variantes Z intracelularmente expressos foram purificados usando métodos de cromatografia convencional. Homogeneização e clarificação foram realizadas por sonicação seguido por centrifugação e filtração. Cromatografia de troca iônica foi usada como etapa de captura. Purificação adicional foi obtida por cromatografia de interação hidrofóbica. As purificações foram executadas em condições ácidas (pH 5,5). Polimento e troca de tampão foram realizados por cromatografia de exclusão de tamanho.
[00239] As proteínas purificadas foram formuladas em NaP 25 mM /NaCl 125 mM pH 7,0 e submetidas a um estudo de estabilidade acelerada por 2 semanas a 37 °C. A estabilidade foi medida pelo aparecimento de novas variantes depois do teste de estabilidade por SDS-PAGE e HPLC de Fase Reversa (RPC). Em ambas as análises as amostra iniciais e as submetidas ao estudo de estabilidade foram corridas em paralelo. Para o SDS-PAGE, 7,5 μg de proteína foram carregados em cada poço. Um exemplo de um gel resultante é mostrado na Fig. 3.
[00240] O RPC foi corrido em um HPLC 1100 Agilent usando uma Fase A Móvel consistindo em 0,1 % de ácido trifluoracético (TFA) em água, e uma Fase B Móvel consistindo em 0,1 % de TFA/45 % de MeOH/45 % de isopropilamina (IPA)/10 % de água. Um exemplo de um cromatograma resultante é mostrado na Fig. 4 para SEQ ID NO: 253.
[00241] Os resultados do teste de estabilidade estão sumarizados na Tabela I, a seguir. TABELA I
[00242] Pode-se concluir a partir da Tabela I que certos polipeptídeos de ligação de C5 modificados ou compostos têm propriedades melhoradas, tal como maior estabilidade, quando comparados com PSI0242. Tais polipeptídeos ou compostos de ligação de C5 melhorados incluem PSI0334 (SEQ ID NO: 253), PSI0340 (SEQ ID NO: 258), PSI0369 (SEQ ID NO: 259), PSI0377 (SEQ ID NO: 260), PSI0378 (SEQ ID NO: 261), PSI0379 (SEQ ID NO: 262), PSI0381 (SEQ ID NO: 263), PSI0383 (SEQ ID NO: 264), PSI0400 (SEQ ID NO: 267), PSI0410 (SEQ ID NO: 268), PSI0403 (SEQ ID NO: 269) e PSI0404 (SEQ ID NO: 270). Em seis das variantes mencionadas (SEQ ID NO: 253, 260, 261, 262, 264 e 267), os resíduos de aminoácido nas posições 52-53 foram substituídos de ND (cf PSI0242) a SE. Na SEQ ID NO: 263, a substituição correspondente é de ND a ES. Na SEQ ID NO: 269 somente o resíduo de aminoácido na posição 53 foi substituídos de D a E, enquanto na SEQ ID NO: 270 o resíduo de aminoácido na posição 52 foi substituído de N a S.
[00243] Adicionalmente, PSI0378 (SEQ ID NO: 261), PSI0381 (SEQ ID NO: 263), PSI0383 (SEQ ID NO: 264), PSI0410 (SEQ ID NO: 268), PSI0403 (SEQ ID NO: 269) e PSI0404 (SEQ ID NO: 270) têm em comum um substituição do resíduo de aminoácido de D a E na posição 60.
[00244] O benefício combinado de substituições que aumentam a estabilidade na posição 52 ou 53 e posição 60 pode ser observado na Fig. 5, que mostra o cromatograma de PSI0383 (SEQ ID NO: 264). Em PSI0379 (SEQ ID NO: 262) a substituição na posição 60 é de D por A.
[00245] Em PSI0369 (SEQ ID NO: 259) fração do adaptador (incluindo D60) é completamente removida, produzindo um composto de ligação de C5 mais estável e indicando a influência de posição 60 mediante estabilidade dos compostos de ligação de C5.
[00246] EXEMPLO 3: Ligação de compostos modificados em C5 de humano
[00247] Albumina de soro humana foi imobilizada em Dip e Read Biosensors de segunda geração de Amina Reativa (AR2G) (Pall Life sciences (ForteBio) Cat # 185092) por acoplamento de amina. PSI0242 (SEQ ID NO: 249; 1 μM) e compostos de ligação de C5 (1 μM) em tampão de leitura (Tampão HBS-EP pronto para uso 200 mL, GE Healthcare #BR100188) foram carregados, cada qual em um sensor separado com HSA, por 120 segundos seguido por um registro de linha de base por 60 segundos em tampão de leitura antes de ser submetidos a C5 de humano (Quidel Cat # 403) em concentrações variando de 0,79 nM a 25 nM em tampão de leitura com um ciclo de regeneração e um registro de linha de base entre cada concentração. Condições de regeneração para o sensores foram Glicina 10 mM, pH 2 (três pulsos com 30 segundos e correndo o tampão por 60 segundos). Cada espectrograma foi referência subtraída contra um construto análogo contendo um domínio de ligação de albumina (SEQ ID NO: 250), mas sem a capacidade de ligação de C5. Os dados foram analisados de acordo com modelo Langmuir 1:1 usando software de cinética ForteBio Analysis 7.1 (Pall Life sciences (ForteBio)).
[00248] O KD de interação com C5 relativo a PSI0242 (SEQ ID NO: 249) é mostrado na Tabela II. O KD de PSI0242 variou de 1-3 nM em corridas diferentes.
[00249] Os resultados na Tabela II indicam que compostos de ligação de C5 de acordo com a invenção têm uma capacidade de ligação em C5 de humano que é similar àquela do polipeptídeo PSI0242 (SEQ ID NO: 249) revelado em WO 2013/126006. TABELA II
[00250] EXEMPLO 4: Estabilidade de polipeptídeo de ligação de C5 quimicamente sintetizado
[00251] Um PSI0400 quimicamente sintetizado (SEQ ID NO: 267) foi encomendado da BACHEM AG. A estabilidade do polipeptídeo foi testada de acordo com a mesma metodologia do Exemplo 2. Os resultados do teste de estabilidade são mostrados na Tabela III. TABELA III
[00252] A estabilidade do PSI0400 foi comparável aos polipeptídeos que foram produzidos em E.coli no Exemplo 2.
[00253] A integridade da dobra de PSI0400 (SEQ ID NO: 267) foi comparada com um polipeptídeo de ligação de C5 recombinante (PSI0257, SEQ ID NO: 271), produzido de acordo com os métodos do Exemplo 2, usando espectros de dicroísmo circular (CD) de UV distante.
[00254] Os espectros CD foram registrados por um espectropolarímetro J-720 CD (Jasco, Japão). As amostras foram diluídas em concentração de proteína de 0,17 mg/mL usando tampão Pi (Na-K-PO4 5 mM, pH 7,0). Um tampão Pi do espectro CD de foi primeiramente registrado, então espectros foram registrados para cada qual das amostras e finalmente para o tampão Pi novamente. Como os dois espectros de tampão coincidem, o espectro primeiramente registrado foi usado como os espectros de tampão. O espectro de tampão foi suavizado usando o procedimento Savitzky- Golay com largura de convolução de 25. Os outros espectros foram suavizados de acordo com o mesmo procedimento com uma largura de convolução de 15. O espectro de tampão suavizado foi então subtraído de cada qual dos outros espectros suavizados. O programa CDNN foi usado para estimar o teor secundário das proteínas e as estimativas resultantes estão apresentadas na Tabela IV. Os resultados mostraram que nem as duas substituições de aminoácido na posição 52 e 53 nem a produção de polipeptídeo por síntese química influencia o conteúdo da estrutura secundária do polipeptídeo quimicamente sintetizado. A integridade do teor da estrutura secundária foi comparada com o PSI0257 recombinantemente produzido (SEQ ID NO: 271). TABELA IV
[00255] EXEMPLO 5: Ligação de compostos e polipeptídeos modificados em C5 de humano
[00256] A afinidade de ligação dos compostos de ligação de C5 PSI0242 (SEQ ID NO: 249), PSI0340 (SEQ ID NO: 258), PSI0378 (SEQ ID NO: 261), e PSI0410 (SEQ ID NO: 268) e o polipeptídeo de ligação de C5 PSI0400 (SEQ ID NO: 267) para C5 de humano foi analisada usando um instrumento Biacore T200 (GE Healthcare). C5 de humano (A403, Quidel Corporation) foi acoplado em um chipe de sensor CM5 (900 RU) usando química de acoplamento de amina de acordo com o protocolo do fabricante. O acoplamento foi realizado injetando hC5 a uma concentração de 7,5 μg/mL em tampão de acetato de Na 10 mM pH=5 (GE Healthcare). A célula de referência foi tratada com os mesmos reagentes, mas sem injetar C5 de humano. Ligação dos ligantes de C5 em hC5 imobilizado foi estudado com o método de cinética de único ciclo, no qual cinco concentrações de amostra, tipicamente 25, 12,5, 6,25, 3,12 e 1,56 nM em tampão HBS-EP (HEPES 10 mM pH 7,4, NaCl 150 mM, EDTA 3 mM, 0,005% de Agente tensoativo P20, GE Healthcare) foram injetadas um depois do outro a uma vazão de 30 μL/minutos a 25°C no mesmo ciclo sem regeneração entre injeções. Dados das células de referência foram subtraídos para compensar mudanças no índice refrativo aparente. Na maioria dos casos, uma injeção de HBS-EP foi também incluída como controle de forma que os sensorgramas foram esvaziados em dobro. As superfícies foram regeneradas em tampão HBS-EP. Constantes da cinética foram calculadas a partir dos sensorgramas usando o modelo analito Langmuir 1:1 da Biacore T200 Evaluation Software versão 1.0. Os valores KD resultante das interações são tabulados na Tabela V.
[00257] As substituições que aumentam a estabilidade de aminoácido não são detrimentais para a capacidade das moléculas de ligar em C5 e assim não influenciam suas atividades biológicas.
[00258] EXEMPLO 6: Inibição de hemólise
[00259] Para estudos da função e inibição do caminho do complemento clássico dos mesmos pelos compostos de ligação de C5 PSI0378 (SEQ ID NO: 261) e PSI0410 (SEQ ID NO: 268) e polipeptídeo de ligação de C5 PSI0400 (SEQ ID NO: 267), eritrócitos de ovelha foram preparados do sangue total fresco de ovelha em solução de Alsever (Swedish National Veterinary Institute) e em seguida tratados com anti-soro de eritrócito coelho anti-ovelha (Sigma) para tornar o eritrócito de ovelha sensibilizado a anticorpo (EA). O processo total foi conduzido em condições assépticas. Todos os outros reagentes foram de fontes comerciais.
[00260] O ensaio in vitro foi corrido em placa microtituladora em forma de U de 96 poços por adições consecutivas de uma proteína de teste, um soro do complemento e suspensão de EA. As concentrações finais de todos os reagentes, em um volume de reação total de 50 μL por poço e a pH 7,3-7,4, foram: CaCl20,15 mM; MgCl2 0.5 mM; NaN33 mM; NaCl 138 mM; 0,1 % de gelatina; barbital de sódio1,8 mM; ácido barbitúrico 3,1 mM; EA 5 milhões; soro da proteína C5 do complemento em diluição adequada, e composto ou polipeptídeo de ligação de C5 a concentrações desejadas.
[00261] Os compostos e polipeptídeo de ligação de C5 foram pré-incubados com o soro do complemento descrito anteriormente por 20 minutos no gelo antes de iniciar a reação pela adição de suspensão de EA. A reação hemolítica se deu naturalmente a 37 °C durante agitação por 45 minutos e foi então opcionalmente finalizada por adição de 100 μL de salina gelada contendo 0,02 % de Tween 20. As células foram centrifugadas na base e a porção superior, correspondendo a 100 μL de sobrenadante, foi transferida para uma microplaca transparente com meia área e poços de base plana. Os resultados da reação foram analisados como densidade optica usando uma leitora de placa microtituladora a um comprimento de onda de 415 nm.
[00262] Em todas as ocasiões de teste, uma amostra de controle e veículo (PSI0242, SEQ ID NO: 249) foram incluídos em cada placa para definir valores para reações não inibidas e totalmente inibidas, respectivamente. Esses valores foram usados para calcular o % de inibição de hemólise do complemento em qualquer dada concentração da amostra. As potências inibitórias (valores IC 50) dos compostos e polipeptídeo de ligação de C5 testadas foram definidas aplicando o mesmo ensaio na presença de uma concentração controlada de C5 de humano adicionada em soros esgotados de C5. Para inibidores altamente potentes (baixo nanomolar a subnanomolar), uma concentração de C5 final da mistura da reação foi controlada a 0,1 nM, que foi opcionalmente estabelecida usando soros esgotados de C5 ou deficientes. Os resultados estão apresentados a seguir na Tabela VI. TABELA VI
[00263] Os resultados do ensaio de hemólise mostram que os compostos de ligação de C5 melhorados SEQ ID NO: 261 e 268 são comparáveis ao composto de referência. O polipeptídeo de ligação de C5 SEQ ID NO: 267 foi funcional no ensaio, mas, uma vez que ele não contém um domínio de ligação de albumina, os resultados não podem ser diretamente comparados com o composto de referência.
[00264] EXEMPLO 7: Ligação em albumina humana
[00265] Para avaliação de compostos de afinidade de ligação de C5 de ligação com albumina, um ELISA de albumina humana utilizando albumina humana recombinante (revestimento) e anticorpos comercialmente disponíveis (primário e de detecção) adquiridos da Novozymes, Afficorpo AB e DakoCytomation, respectivamente, foi usado. Um padrão de método preparado a partir de PSI0242 (SEQ ID NO:249), compreendendo um polipeptídeo de ligação de C5 e um domínio de ligação de albumina de proteína G estreptocócica, foi usado para quantificação das amostras. Uma microplaca de 96 poços foi revestida com albumina humana recombinante. A placa foi então lavada com salina tamponada com fosfato contendo 0,05 % de Tween 20 (PBST) e bloqueada por 1-2 horas com 1 % de caseína em PBS. Depois de uma lavagem na placa, o padrão, controles de método, amostra de controle e amostras de teste são adicionados na placa. Depois de incubação por 2 horas, material não ligado foi removido por uma lavagem. Um IgG de cabra Anti- Afficorpo® (Afficorpo AB, cat no. 20.1000.01,0005) foi adicionado nos poços e a placa foi incubada por 1,5 hora para permitir ligação nos compostos de ligação de C5 ligados. Depois de uma lavagem, HRP de IgG de coelho anti-cabra foi deixado ligar nos anticorpos de cabra por 1 hora. Depois de uma lavagem final, a quantidade de HRP ligado foi detectada por adição de substrato de TMB, que foi convertido em um azul produto pela enzima. Adição de ácido depois clorídrico 1 M 30 minutos interrompeu a reação e a cor dos conteúdos do poço mudou de azul para amarelo. A absorbância a 450 nm foi medida fotometricamente, usando a absorbância a 650 nm como um comprimento de onda de referência. A intensidade da cor foi proporcional à quantidade de PSI0242 (SEQ ID NO:249) e as concentrações da amostra foram determinadas pela curva padrão.
[00266] Os compostos de ligação de C5 compreendendo um domínio de ligação de albumina de proteína G estreptocócica provou ser capaz de ligar em albumina humana e os dados são apresentados na Tabela VII a seguir. TABELA VII
[00267] Os resultados do ensaio mostraram que ambos os compostos de ligação de C5 com estabilidade melhorada investigados mantêm sua capacidade de ligar albumina humana.
[00268] EXEMPLO 8: teste de estabilidade de 3 meses de polipeptídeos/compostos de ligação de C5
[00269] Os polipeptídeos/compostos de ligação de C5 que mostraram uma estabilidade melhorada comparada a PSI0242 no teste de estabilidade de 2 semanas a 37 °C (Exemplo 2) foram submetidos a um teste de estabilidade de 3 meses a mais a 37 °C. A configuração do teste de estabilidade foi conforme descrito no Exemplo 2 e a avaliação da estabilidade foi feita medindo o pico principal da porcentagem do cromatograma do teor de proteína total por HPLC de Fase Reversa (RPC), o método RPC foi realizado conforme descrito no exemplo 2. Os dados de 2 semanas do exemplo 2 estão incluídos na Tabela VIII a seguir para tornar a interpretação mais fácil. TABELA VIII
[00270] Compostos de ligação de C5 com substituições de aminoácido na posição 52, 53 de ND a SE e uma substituição na posição 60 de D a E ou A (SEQ ID NO: 261, 264, e 262) comparados a PSI0242 têm uma maior proporção de proteína na forma original depois de 3 meses a 37 °C do que PSI0242 (SEQ ID NO: 249) tem depois de 2 semanas nas mesmas condições. Os outros compostos também exibiram uma maior estabilidade.
[00271] EXEMPLO 9: Estabilidade de polipeptídeos similarmente modificados
[00272] Variantes de polipeptídeo previamente conhecidas derivadas de proteína Z (Gronwall et al. J Biotechnol 2007, 128:162-183) com afinidade de ligação com outras moléculas alvos além de C5 foram similarmente modificadas nas posições específicas da sequências de aminoácidos a fim de melhorar a estabilidade. Seleção e produção das variantes de polipeptídeo originais com afinidade de ligação com o receptor 2 do fator de crescimento epidérmico humano (HER2), o receptor beta de fator de crescimento derivado de plaqueta (PDGF-Rb), o receptor Fc neonatal (FcRn), e a anidrase carbônica IX (CAIX) são revelados, por exemplo, em WO 2009/080810, WO 2009/077175, PCT/EP2014/055299, e WO 2014/096163. As variantes de polipeptídeo de estabilidade melhorada foram produzidas por mutagênese direcionada ao sítio nas posições selecionadas das sequências de aminoácidos. As substituições de aminoácido que melhoram a estabilidade nas variantes de polipeptídeo Z02891 (SEQ ID NO: 272), que alvejam HER2; Z15805 (SEQ ID NO: 275), que alvejam PDGF-Rb; Z10103 (SEQ ID NO: 278), que alvejam FcRn; e Z09782 (SEQ ID NO: 281), que alvejam CAIX, são especificadas a seguir na Tabela IX. Essas variantes de polipeptídeo de estabilidade melhorada diferem dos polipeptídeos de ligação de C5 da presente invenção, por exemplo, em que elas têm um motivo de ligação [BM] com afinidade de ligação com HER2, PDGF-Rb, FcRn, e CAIX.
[00273] Todas as variantes foram clonadas com um N-terminal 6 x marcado com Histidina (His6) e os construtos obtidos codificaram polipeptídeos no formato MGSSHHHHHHLQ-[Z#####]. Mutações foram introduzidas nos plasmídeos das variantes de polipeptídeo usando pares de oligonucleotídeos iniciadores de sobreposição que codificam as substituições de aminoácido desejadas e aplicando técnicas de biologia molecular estabelecidas. As sequências de plasmídeo corretas foram verificadas por sequenciamento de DNA.
[00274] Células E coli (cepa T7E2) (GeneBridge) foram transformadas com plasmídeos contendo os fragmentos do gene que codifica os polipeptídeos originais e os modificados. As células foram cultivadas a 37 °C em meio TSB-YE suplementado com 50 μg/mL de canamicina e expressão de proteína foi subsequentemente induzida por adição de IPTG. Células precipitadas foram rompidas usando um homogeneizador FastPrep®-24 (Nordic Biolabs) e resíduos da célula foram removidos por centrifugação. Cada sobrenadante contendo a variante de polipeptídeo como uma proteína His6-marcada foi purificado por cromatografia de afinidade de íon metálico imobilizado (IMAC) usando colunas His GraviTrapTM (GE Healthcare) de acordo com as instruções dos fabricantes. Variantes de polipeptídeo purificadas tiveram o tampão trocado para salina tamponada com fosfato (PBS; 1,47 mM KH2PO4, 8,1 mM Na2HPO4, NaCl 137 mM, KCl 2,68 mM, pH 7,4) usando colunas dessalinizantes PD-10 (GE Healthcare). A identidade correta de cada polipeptídeo foi verificada por SDS-PAGE e HPLC-MS. TABELA IX.
[00275] À parte das substituições de um de (SEQ ID NO: 284-287) ou ambos de (SEQ ID NO: 273-274, 276-277, 279-280, 282-283) N52 e D53, substituições foram também realizadas nas posições correspondentes ao laço [L2]. Assim, nas variantes de polipeptídeo de SEQ ID NO: 274, 277, 280, 283, 285 e 287, [L2] é RQPE.
[00276] Para realizar o teste de estabilidade, as variantes de polipeptídeo, formuladas em PBS pH 7,4, foram diluídas em 1 mg/mL e alíquotas de 200 μL foram incubados a 37 °C por 2 semanas. Amostras coletadas antes e depois do teste de estabilidade foram analisadas por SDS-PAGE usando 10% de géis Bis-Tris NuPAGE (Invitrogen) e carregando 5 μg de proteína em cada poço. Géis manchados com azul de Coomassie resultantes são mostrados na Fig. 6. A estabilidade foi avaliada pelo aparecimento de novas variantes depois de incubação à temperatura elevada, e variantes mutadas foram comparadas com o respectivo polipeptídeo original.
[00277] Todas as variantes de polipeptídeo com as modificações esboçadas na Tabela IX mostraram estabilidade melhorada comparado com o respectivo polipeptídeo original no sentido de que uma segunda banda imediatamente acima da banda principal observada para amostras do polipeptídeo original não foi visível nas amostras dos polipeptídeos modificados com a substituição D53E e/ou N52S, vide Fig. 6. Polipeptídeos com as substituições D53E e/ou N52S combinadas com as substituições D36R, D37Q e S39E mostraram perfis similares no gel SDS-PAGE. A substituição D53E sozinha ou em combinação com as substituições D36R, D37Q e S39E parece reduzir a quantidade da espécie com uma confirmação alternativa observada como uma segunda banda no gel SDS-PAGE, mas não pôde prevenir completamente a formação desta espécie.
[00278] Além do mais, a capacidade de ligação das variantes de polipeptídeo modificado foi testada. Todas as variantes de polipeptídeo retiveram sua afinidade de ligação com seu alvo depois de ser modificadas (resultados não mostrados).
[00279] Os resultados apresentados anteriormente para as variantes de polipeptídeo com afinidade de ligação com outras moléculas alvos além de C5 correspondem bem aos resultados apresentados para os polipeptídeos e compostos de ligação de C5 da presente invenção (vide, por exemplo, Exemplo 2 e 4). Assim, as modificações de aminoácido específicas conforme descrito aqui parece ter um efeito estabilizante independentemente das sequências de aminoácidos do [BM]. Considera-se assim que as modificações ou substituições de aminoácido conforme descrito aqui melhoraram a estabilidade de todos os polipeptídeos e compostos de ligação de C5 conforme descrito aqui e em WO 2013/126006.
Claims (14)
1. Polipeptídeo capaz de se ligar ao componente 5 (C5) do complemento humano, caracterizadopelo fato de que o dito polipeptídeo compreende a sequência de aminoácidos [BM]-[L2]-QSX42X43LLX46EAKKLX52X53X54Q em que, independentemente um do outro, [BM] é um motivo de ligação de C5 compreendendo a sequência de aminoácido EX9X10X11A X13X14EIDX18LPNLX23X24X25QWX28AFIX32X33LX35; em que, independentemente um do outro, X9 é selecionado de H, Q, S, T e V; X10 é selecionado de I, L, M e V; X11 é selecionado de A, D, E, H, K, L, N, Q, R, S, T e Y; X13 é selecionado de N e W; X14 é selecionado de A, D, E, H, N, Q, R, S e T; X18 é selecionado de A, E, G, H, K, L, Q, R, S, T e Y; X23 é selecionado de N e T; X24 é selecionado de I, L e V; X25 é selecionado de A, D, E, H, K, N, Q, R, S e T; X28 é selecionado de I, L e V; X32 é selecionado de D, E, G, H, N, S e T; X33 é selecionado de K e S; e X35 é selecionado de A, D, E, H, N, Q, S, T e Y; e [L2] é selecionado de DDPS e RQPE; X42 é selecionado de A e S; X43 é selecionado de N e E; X46 é selecionado de A, S e C; X52 é selecionado de E, N e S; X53 é selecionado de D, E e S, desde que X53 não seja D quando X52 for N; e X54 é selecionado de A e S.
2. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o dito polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácido AEAKYAK-[BM]-[L2]-QSX42X43LLX46EAKKLX52X53X54QAP em que, independentemente um do outro, [BM], [L2], X42, X43, X46, X52, X53 e X54 são conforme definidos na reivindicação 1.
3. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que X52 e X53 são independentemente selecionados dentre E e S; X52 é S e X53 é E; X52 é E e X53 é S; X52 é S e X53 é D, ou X52 é N e X53 é E.
4. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que compreende a sequência de aminoácido: AEAKYAKEX9X10X11AX13X14EIDX18LPNLX23X24X25QWX28AFIX32X33LX35- [L2]-QSX42X43LLX46EAKKLX52X53X54QAP; em que, independentemente um do outro, X9 é selecionado de H, Q, S, T e V; X10 é selecionado de I, L, M e V; X11 é selecionado de A, D, E, H, K, L, N, Q, R, S, T e Y; X13 é selecionado de N e W; X14 é selecionado de A, D, E, H, N, Q, R, S e T; X18 é selecionado de A, E, G, H, K, L, Q, R, S, T e Y; X23 é selecionado de N e T; X24 é selecionado de I, L e V; X25 é selecionado de A, D, E, H, K, N, Q, R, S e T; X28 é selecionado de I, L e V; X32 é selecionado de D, E, G, H, N, S e T; X33 é selecionado de K e S; X35 é selecionado de A, D, E, H, N, Q, S, T e Y; [L2] é selecionado de DDPS e RQPE; X42 é selecionado de A e S; X43 é selecionado de N e E; X46 é selecionado de A, S e C; X52 é selecionado de E, N e S; X53 é selecionado de D, E e S, desde que X53 não seja D quando X52 for N; e X54 é selecionado de A e S.
5. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma das seguintes condições é satisfeita: X9 é V, X10 é L, X11 é E, X13 é W, X14 é D, X18 é R, X23 é T, X24 é I, X25 é E, X28 é L, X32 é N, X33 é K, X35 é D, [L2] é DDPS, X42 é S, X43 é E, X46 é S, X54 é S.
6. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que [BM] compreende uma sequência de aminoácido selecionada do grupo que consiste nas posições 1-28 nas SEQ ID NOS: 1-248, preferivelmente em que [BM] compreende a sequência de aminoácido mostrada como posições 1-28 na SEQ ID NO: 1.
7. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que é selecionado de um polipeptídeo compreendendo a sequência de amino mostrada como SEQ ID NO: 260, SEQ ID NO: 265, SEQ ID NO: 266, ou SEQ ID NO: 267.
8. Composto capaz de se ligar a C5, caracterizado pelo fato de que o dito composto compreende: a. pelo menos um polipeptídeo de ligação de C5 como definido em qualquer uma das reivindicações anteriores; b. pelo menos um domínio de ligação de albumina de proteína G estreptocócica; e c. opcionalmente, pelo menos uma fração de ligação para ligar o dito pelo menos um domínio de ligação de albumina no terminal C ou N do dito pelo menos um polipeptídeo de ligação de C5, a dita fração de ligação sendo um peptídeo compreendendo as sequências de aminoácidos KVX60GS, em que X60 é selecionado de D, E e A.
9. Composto, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que X60 é e e o dito composto é um polipeptídeo compreendendo a sequência de amino mostrada como SEQ ID NO: 261, SEQ ID NO: 263, SEQ ID NO: 264, SEQ ID NO: 269 ou SEQ ID NO: 270.
10. Composto, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que X60 é A e o dito composto é um polipeptídeo compreendendo a sequência de amino mostrada como SEQ ID NO: 262.
11. Polipeptídeo de ligação de C5 de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-7 ou o composto de ligação de C5 de acordo com qualquer uma das reivindicações 8-10, caracterizado pelo fato de que é para uso em terapia.
12. Polipeptídeo de ligação de C5 de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-7 ou o composto de ligação de C5 de acordo com qualquer uma das reivindicações 8-10, caracterizado pelo fato de que é para uso em um método para tratamento e/ou profilaxia de uma condição relacionada a C5.
13. Polipeptídeo de ligação de C5 para uso de acordo com a reivindicação 12 ou o composto de ligação de C5 para uso de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que a dita condição relacionada a C5 é uma condição selecionada de doenças inflamatórias, doenças autoimunes, doenças infecciosas, doenças cardiovasculares, distúrbios neurodegenerativos, lesão do enxerto; doenças do olho, doenças renais, doenças pulmonares, doenças hematológicas tal como hemoglobinúria paroxística noturna (PNH), doenças alérgicas e doenças dermatológicas.
14. Polipeptídeo de ligação de C5 para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 13 ou composto de ligação de C5 para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 11-13, caracterizado pelo fato de que o dito polipeptídeo ou composto de ligação de C5 é administrado intravenosamente, subcutaneamente, por inalação, nasalmente, oralmente, intravitrealmente, ou topicamente.
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