JP2020158437A - Composition for increasing aim of free form in blood - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、血中フリー体ＡＩＭ増加用組成物に関する。 The present invention relates to a composition for increasing blood-free AIM.
ＡＩＭ（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ；ＣＤ５Ｌ、ａｐｉ６、Ｓｐαとも称する）は、組織マクロファージが特異的に産生する分子量約５０ｋＤａの分泌型タンパク質である（非特許文献１）。ＡＩＭは、システイン残基を多く含む特異的な配列であるｓｃａｖｅｎｇｅｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｃｙｓｔｅｉｎｅ−ｒｉｃｈ（ＳＲＣＲ）ドメインをタンデムに３つつなげた構造をしており、それぞれのシステイン残基は各ドメイン内で互いにジスルフィド結合することで、コンパクトな球状の立体構造をしていると考えられている。 AIM (apoptosis inhibitor of macrophage; also referred to as CD5L, api6, Spα) is a secretory protein having a molecular weight of about 50 kDa specifically produced by tissue macrophages (Non-Patent Document 1). AIM has a structure in which three scavenger receptor cysteine-rich (SRCR) domains, which are specific sequences containing many cysteine residues, are connected in tandem, and each cysteine residue is disulfide-bonded to each other in each domain. By doing so, it is considered to have a compact spherical three-dimensional structure.
ＡＩＭは、尿中へ排出されず、血液中で安定的に存在する。このために、ＩｇＭとの結合が深く関与していること、またほとんどすべてのＡＩＭは血液中ではＩｇＭと複合体を形成し、非結合体で存在することがほとんどないことが報告されている（非特許文献２）。
そしてＡＩＭとＩｇＭの結合様式は、ＩｇＭ五量体のギャップの中にＡＩＭが嵌まり込むような形で結合し、ＡＩＭが持つ、システインを多く含む３つのドメインのうち、２番目のドメインに存在するフリーのシステイン残基が、ＩｇＭ五量体にあるギャップの片側に存在するフリーのシステインとジスルフィド結合により結合していること、ＡＩＭのＣ末端側の３番目のドメイン内に存在する正に荷電したアミノ酸のクラスターが、ギャップのもう片側に存在する負に荷電したアミノ酸クラスターと電荷による結合をしており、ＡＩＭにより、ギャップの両側のＩｇＭがクロスブリッジされていることが明らかになっている（非特許文献３）。
AIM is not excreted in urine and is stably present in blood. For this reason, it has been reported that binding to IgM is deeply involved, and that almost all AIMs form a complex with IgM in blood and rarely exist as an unbound form ( Non-Patent Document 2).
The binding mode between AIM and IgM is such that the AIM fits into the gap of the IgM pentamer and is present in the second domain among the three cysteine-rich domains of the AIM. The free cysteine residue that forms is bound by a disulfide bond to the free cysteine present on one side of the gap in the IgM pentamer, and is positively charged in the third domain on the C-terminal side of the AIM. Amino acid clusters are charged with negatively charged amino acid clusters on the other side of the gap, and AIM reveals that IgMs on both sides of the gap are cross-bridged (AIM). Non-Patent Document 3).
ヒトにおけるＡＩＭの作用効果の全貌は、未だ不明な点が多いが、その作用効果の一部が明らかになるにつれて、新たな医薬用途の発明がなされている。
特許文献１には、ＡＩＭを含有してなる、肝疾患の予防・治療剤の発明が記載されている。
The whole picture of the action and effect of AIM in humans is still unclear, but as some of the action and effect are clarified, inventions for new pharmaceutical uses have been made.
Patent Document 1 describes an invention of a prophylactic / therapeutic agent for liver disease, which comprises AIM.
特許文献２には、ＡＩＭもしくはその部分ペプチドを含有してなる、腎疾患の予防・治療剤の発明が記載されている。
特許文献１および２には、いずれもＡＩＭタンパク質又はペプチド断片を有効成分とする疾患治療剤や、その遺伝子を利用した新たな治療剤やＡＩＭ遺伝子の利用が開示されている。
また特許文献３は、ＡＩＭの作用を抑止する医薬発明が記載されている。すなわちＡＩＭと結合性を有し、ＡＩＭ作用を抑制する抗体やＡＩＭ遺伝子に対するアンチセンス核酸や、ＲＮＡｉ効果を有する二本鎖核酸を投与することで、ＡＩＭの作用を抑制し、メタボリックシンドロームを治療するための医薬発明が記載されている。
Patent Document 2 describes an invention of a preventive / therapeutic agent for renal diseases, which comprises AIM or a partial peptide thereof.
Patent Documents 1 and 2 both disclose a disease therapeutic agent containing an AIM protein or peptide fragment as an active ingredient, a new therapeutic agent using the gene, and the use of an AIM gene.
Further, Patent Document 3 describes a pharmaceutical invention that suppresses the action of AIM. That is, by administering an antibody that binds to AIM and suppresses the action of AIM, an antisense nucleic acid against the AIM gene, or a double-stranded nucleic acid having an RNAi effect, the action of AIM is suppressed and metabolic syndrome is treated. Pharmaceutical inventions for this purpose are described.
ＡＩＭは、生体中ではマクロファージによって産生されるが、血液中では、上記の通り、ＩｇＭと複合体を形成しており、不活性化されている。そして、腎疾患や肝臓疾患の進行に伴って、フリー体のＡＩＭが出現し、疾患の改善にプラスに作用する。
例えば、急性腎障害、脂肪肝、肝細胞癌、肥満、真菌性腹膜炎、多発性硬化症などさまざまな疾患症状に対し抑制的な効果を示すことが確認されている。特にネコに腎不全が多発するのは、ネコのＡＩＭが、ＡＩＭ−ＩｇＭ五量体（複合体）から解離しないためであることが明らかになっている（非特許文献４）。
また、このような疾患の指標として、血中のＡＩＭ濃度を測定する技術が、特許文献４、５、６に開示されている。
しかし、これまで血中に存在するＩｇＭの五量体とＡＩＭの複合体からＡＩＭをフリー体として生成させる手段や薬剤は提供されていない。
AIM is produced by macrophages in the living body, but in blood, as described above, it forms a complex with IgM and is inactivated. Then, with the progress of renal disease and liver disease, free AIM appears, which has a positive effect on the improvement of the disease.
For example, it has been confirmed that it has a suppressive effect on various disease symptoms such as acute kidney injury, fatty liver, hepatocellular carcinoma, obesity, fungal peritonitis, and multiple sclerosis. In particular, it has been clarified that the frequent occurrence of renal failure in cats is due to the fact that AIM in cats does not dissociate from the AIM-IgM pentamer (complex) (Non-Patent Document 4).
Further, as an index of such a disease, techniques for measuring the AIM concentration in blood are disclosed in Patent Documents 4, 5 and 6.
However, until now, no means or drug for producing AIM as a free form from a complex of IgM pentamer and AIM present in blood has been provided.
本発明者らは、多数の天然物や化合物のＡＩＭに対する作用を研究する過程で、多数の天然物や抽出物のスクリーニングを行い、ドリアン果実抽出物及び香辛料に利用されるアサフェティダ抽出物が、血中のＡＩＭとＩｇＭの複合体からＡＩＭを生成させることを見出し、本発明をなした。
すなわち、本発明は、血中のＡＩＭとＩｇＭの複合体からＡＩＭを生成させ、血中のフリー体のＡＩＭ濃度を上昇させる作用を有する組成物を提供することを課題とする。
In the process of studying the effects of many natural products and compounds on AIM, the present inventors screened many natural products and extracts, and the asafetida extract used for Dorian fruit extract and spices was used. We have found that AIM is produced from a complex of AIM and IgM in blood, and made the present invention.
That is, it is an object of the present invention to provide a composition having an action of generating AIM from a complex of AIM and IgM in blood and increasing the AIM concentration of a free form in blood.
本発明は、以下の構成からなる。
（１）ドリアン及び／又はアサフェティダの搾汁物、乾燥物または抽出物を有効成分として含有する血中のフリー体ＡＩＭ増加用の組成物。
（２）ドリアン果実抽出物がγ−グルタミルシステインを含有する（１）に記載の組成物。
（３）ドリアン及び／又はアサフェティダの搾汁物、乾燥物または抽出物が、血中のＡＩＭとＩｇＭ複合体からフリー体ＡＩＭを生成させる作用を有する（１）または（２）に記載の組成物。
The present invention has the following configuration.
(1) A composition for increasing free AIM in blood containing a squeezed product, dried product or extract of dorian and / or asafetida as an active ingredient.
(2) The composition according to (1), wherein the durian fruit extract contains γ-glutamylcysteine.
(3) The composition according to (1) or (2), wherein the juice, dried product or extract of dorian and / or asafetida has an action of producing a free AIM from the AIM and IgM complex in blood. ..
本発明により、ドリアン及び／又はアサフェティダの搾汁物、乾燥物または抽出物を有効成分として含有する血中のフリー体ＡＩＭ増加用の組成物が提供される。
本発明の組成物は、血中のフリー体ＡＩＭを増加させ、急性腎障害、脂肪肝、肝細胞癌、肥満、真菌性腹膜炎、多発性硬化症等のフリー体ＡＩＭが関与する疾患の予防改善剤として利用可能である。
INDUSTRIAL APPLICABILITY The present invention provides a composition for increasing free AIM in blood containing a squeezed product, dried product or extract of dorian and / or asafetida as an active ingredient.
The composition of the present invention increases free AIM in blood and prevents and improves diseases associated with free AIM such as acute kidney injury, fatty liver, hepatocellular carcinoma, obesity, fungal peritonitis, and multiple sclerosis. It can be used as an agent.
本発明について具体的に説明する。
本発明でいう「フリー体ＡＩＭ」とは、ＡＩＭがＩｇＭの五量体から生成して、単独で血中に存在している状態をいう。当該フリー体ＡＩＭは、ＩｇＭをはじめとする血中のタンパク質や糖蛋白質と非結合の状態である。
ドリアン及び／又はアサフェティダの搾汁物、乾燥物または抽出物とは、ドリアン果実或いはアギを搾汁した搾汁液、乾燥させた乾燥物、あるいはドリアン果実又はアサフェティダの溶媒抽出物あるいは水蒸気蒸留物をいう。
本発明でいう「組成物」とは、ドリアン及び／又はアサフェティダの搾汁物、乾燥物または抽出物を含有し、血中フリー体増加効果を発揮するものをいう。「組成物」には食品、医薬品、健康食品、動物用飼料を包含する。
本発明においては、ＩｇＭ等と結合した状態のＡＩＭを「複合体ＡＩＭ」という。また複合体ＡＩＭとフリー体ＡＩＭの両方を合わせたＡＩＭ量を「全ＡＩＭ量」という。
なお、ＡＩＭの検出、定量は、特許文献４〜６に開示された抗ＡＩＭモノクローナル抗体を用いるイムノアッセイ法で測定することができる。
The present invention will be specifically described.
The "free AIM" as used in the present invention refers to a state in which AIM is produced from an IgM pentamer and is present alone in blood. The free AIM is in a state of being unbound with proteins and glycoproteins in blood such as IgM.
The squeezed, dried or extract of durian and / or asafetida is a squeezed juice of durian fruit or agi, dried dried product, or a solvent extract or steam distilled product of durian fruit or asafetida. Say.
The "composition" as used in the present invention refers to a composition containing a squeezed product, dried product or extract of dorian and / or asafetida and exerting a blood-free body increasing effect. The "composition" includes foods, pharmaceuticals, health foods and animal feeds.
In the present invention, AIM in a state of being bound to IgM or the like is referred to as "complex AIM". Further, the total AIM amount of both the complex AIM and the free AIM is referred to as "total AIM amount".
The detection and quantification of AIM can be measured by an immunoassay method using an anti-AIM monoclonal antibody disclosed in Patent Documents 4 to 6.
＜ドリアン果実抽出物＞
以下ドリアン果実抽出物について説明する。
本発明に用いるドリアン（Ｄｕｒｉｏ ｚｉｂｅｔｈｉｎｕｓ Ｍｕｒｒ．、Ｄｕｒｉｏ ｏｘｌｅｙａｎｕｓ、Ｄｕｒｉｏ ｇｒａｖｅｏｌｅｎｓを含むＤｕｒｉｏ ｓｐｐ．）は、ボルネオ島から西マレーシアを原産地とし、東南アジアに広く分布するパンヤ科の植物である。
本発明の有効成分であるドリアン果実抽出物は、ドリアンの果実の可食部から水性の溶媒によって抽出した物又は非水溶性の有機溶媒で抽出したもの、或いは水蒸気蒸留によって抽出したものをいう。
<Durian fruit extract>
The durian fruit extract will be described below.
Durian (Durio spp. Including Durio zibethinus Murr., Durio oxleyans, Durio graveolens) used in the present invention is a plant of the Panya family that originates in West Malaysia from Borneo and is widely distributed in Southeast Asia.
The durian fruit extract, which is the active ingredient of the present invention, refers to a product extracted from the edible portion of durian fruit with an aqueous solvent, a product extracted with a water-insoluble organic solvent, or a product extracted by steam distillation.
本発明において、溶媒抽出に用いられる抽出溶媒は、植物材料からの溶媒抽出に用いられる公知の抽出溶媒であればいずれも使用可能である。抽出溶媒としては、親水性の高い溶媒を用いると、本願発明の目的に合致した、効果の高い抽出物が得られるため、好ましく用いられる。このような溶媒として、本発明では、水、水溶性有機溶剤又はこれらの混合溶媒から選ばれる溶媒が特に好ましく用いられる。前記水溶性有機溶媒とは、水と相溶性を有する溶媒を指し、具体的には、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、等の低級アルコール、ブチレングリコール、プロピレングリコール等の多価アルコール類、その他アセトン等の極性の高い有機溶剤が挙げられる。また非水溶性の有機溶媒としては、ブタノール、酢酸メチル、酢酸エチル等の脂肪族カルボン酸エステル類が例示できる。 In the present invention, the extraction solvent used for solvent extraction can be any known extraction solvent used for solvent extraction from plant materials. When a highly hydrophilic solvent is used as the extraction solvent, a highly effective extract that meets the object of the present invention can be obtained, and is therefore preferably used. As such a solvent, in the present invention, a solvent selected from water, a water-soluble organic solvent, or a mixed solvent thereof is particularly preferably used. The water-soluble organic solvent refers to a solvent compatible with water, and specifically, lower alcohols such as methanol, ethanol, propanol and isopropanol, polyhydric alcohols such as butylene glycol and propylene glycol, and other acetone. Examples thereof include highly polar organic solvents such as. Examples of the water-insoluble organic solvent include aliphatic carboxylic acid esters such as butanol, methyl acetate, and ethyl acetate.
抽出に当たっては、ドリアン果肉、又はドリアン果肉乾燥物を、公知の適当な手段で果肉試料を細断、破砕する。溶媒による抽出は公知の方法に従って行えばよい。例えば、水、水溶性有機溶媒又はこれらの混合溶媒を抽出溶媒として用いた場合、抽出原料に対して質量比で１〜５０倍、好ましくは３〜１０倍の抽出溶媒量で、０℃〜１００℃の範囲で、かつ抽出溶媒の沸点より低い温度条件下で、０．１〜５０時間、好ましくは０．５〜２４時間抽出すればよい。抽出は静置状態でも良いが、より効率的に抽出を行うには、適度に攪拌しながら抽出を行うのが望ましい。 In the extraction, the dorian pulp or the dried dorian pulp is shredded and crushed by a known appropriate means. Extraction with a solvent may be carried out according to a known method. For example, when water, a water-soluble organic solvent, or a mixed solvent thereof is used as the extraction solvent, the amount of the extraction solvent is 1 to 50 times, preferably 3 to 10 times, the mass ratio of the extraction raw material, and is 0 ° C. to 100. Extraction may be carried out in the range of ° C. and under temperature conditions lower than the boiling point of the extraction solvent for 0.1 to 50 hours, preferably 0.5 to 24 hours. The extraction may be in a stationary state, but in order to perform the extraction more efficiently, it is desirable to perform the extraction with moderate stirring.
こうして得られるドリアン果実抽出物は、このまま食品に配合して良いし、濃縮や乾固させたものを錠剤などの形態に加工しても良い。さらに、抽出物を公知の順相カラムクロマトグラフィーや逆相カラムクロマトグラフィーや、分取用液体クロマトグラフィーなどの精製手段により分画、精製することにより得られる画分を用いても良い。 The durian fruit extract thus obtained may be blended into food as it is, or concentrated or dried and processed into a tablet or the like. Further, a fraction obtained by fractionating and purifying the extract by a known purification means such as normal phase column chromatography, reverse phase column chromatography, or liquid chromatography for preparative use may be used.
ドリアン果実抽出物には、分析により、次の化学式１で表されるγ−グルタミルシステインを含有していることを確認できる。 It can be confirmed by analysis that the durian fruit extract contains γ-glutamylcysteine represented by the following chemical formula 1.
本発明のドリアン果実抽出物を配合した組成物は、フリー体のＡＩＭ増加の目的で各種医薬品、食品、健康食品、動物飼料等とすることが可能である。剤形としては特に制限されず、種々の形態とすることができ、具体的には、錠剤、カプセル剤、顆粒剤等経口投与のための形態とすることができる。 The composition containing the durian fruit extract of the present invention can be used as various pharmaceuticals, foods, health foods, animal feeds, etc. for the purpose of increasing the AIM of the free form. The dosage form is not particularly limited and may be in various forms. Specifically, it may be in a form for oral administration such as tablets, capsules and granules.
本発明に係るドリアン果実抽出物の、フリー体ＡＩＭ増加用組成物への配合量は、特に制限されず、また、目的、対象とする疾病により異なるので、一概に規定できるものではないが、一般的には乾固物換算で０．００００１〜９９質量％、好ましくは０．００１〜９９質量％で用いることで、血中のフリー体のＡＩＭ濃度を増加させることができる。 The amount of the durian fruit extract according to the present invention to be added to the composition for increasing free AIM is not particularly limited and varies depending on the purpose and the target disease, and thus cannot be unconditionally defined, but is generally used. The AIM concentration of the free form in blood can be increased by using 0.00001 to 99% by mass, preferably 0.001 to 99% by mass in terms of dry matter.
＜アサフェティダ抽出物＞
本発明で用いるアサフェティダは、和名をアギと呼ぶオオウイキョウ属アギ（ａｓｓａｆｏｅｔｉｄａ、学名：Ｆｅｒｕｌａ ａｓｓａ−ｆｏｅｔｉｄａ）の植物又は、この植物から得られる樹脂状の香料をいう。樹脂状の香料のアサフェティダは、複数の揮発性硫黄化合物を含みニンニクやドリアンに似た強烈な臭いがある。アサフェティダは、別名をヒングとも呼ばれている。樹脂又はアギ全草から水蒸気蒸留して得られる蒸留物や、水又はアルコール抽出物であるアギエキスを抽出原料として使用することができる。
<Asafetida extract>
The asafetida used in the present invention refers to a plant of the genus Ferula (scientific name: Ferrula assa-foetida) whose Japanese name is Agi, or a resinous fragrance obtained from this plant. The resinous fragrance Asafetida contains multiple volatile sulfur compounds and has a strong odor similar to garlic and dorian. Asafetida is also known as Hing. Distillate obtained by steam distillation from resin or whole Agi, or Agi extract, which is a water or alcohol extract, can be used as an extraction raw material.
水蒸気蒸留によって本発明の組成物を得るには、樹脂状のアサフェティダ香料又は植物アギ、あるいはオオウイキョウ属の植物を乾燥させ又は生のままで使用することができる。水蒸気蒸留に先立ち、植物又は樹脂の裁断物を蒸留水に浸漬する。浸漬は、一般的に植物体１ｋｇに対して蒸留水を１〜１０Ｌの割合で使用するのが好ましい。浸漬温度は、特に限定されず、常温で行うのが好ましい。浸漬時間は、１〜２４時間程度である。あるいは、アサフェティダ根塊から得られる樹脂状の塊を同様に処理してもよい。
水蒸気蒸留は、公知の方法で実施すればよい。水蒸気蒸留水又は精油画分を回収し、これを本発明の組成物として用いる。
To obtain the composition of the present invention by steam distillation, a resinous asafetida fragrance or plant agi, or a plant of the genus Ferula can be used dried or raw. Prior to steam distillation, the cut plant or resin is immersed in distilled water. For immersion, it is generally preferable to use 1 to 10 L of distilled water with respect to 1 kg of the plant. The immersion temperature is not particularly limited, and it is preferably performed at room temperature. The immersion time is about 1 to 24 hours. Alternatively, the resinous mass obtained from the asafetida root mass may be treated in the same manner.
Steam distillation may be carried out by a known method. The steam distilled water or the essential oil fraction is recovered and used as the composition of the present invention.
なお、植物アギ、あるいはオオウイキョウ属の植物から本発明の組成物を得るには植物体は、必要に応じて水洗浄した後、裁断し水切りしたものを用いる。原料のアギやオオウイキョウ属の植物は、搾汁または抽出の効率を高めるため、搾汁または抽出の前に、原料を細断（約１〜２０ｍｍ）し、またはミキサーなどで破砕する。 In order to obtain the composition of the present invention from a plant Agi or a plant of the genus Ferula, the plant body is used after being washed with water as necessary, then cut and drained. In order to increase the efficiency of squeezing or extraction, raw materials such as Agi and Ferula communis are shredded (about 1 to 20 mm) or crushed with a mixer or the like before squeezing or extraction.
搾汁の調製は、濾布や、各種のフィルター、メッシュ金網などを用いて通常の方法で行うことができる。この場合、加圧して作業効率を高めてもよい。別法として、遠心分離（１０００〜２００００ｒｐｍ）により搾汁を得ることもできる。 The squeezed juice can be prepared by a usual method using a filter cloth, various filters, a mesh wire mesh, or the like. In this case, pressurization may be applied to improve work efficiency. Alternatively, the juice can be obtained by centrifugation (1000-20000 rpm).
抽出液の調製は、溶媒として、水のほか、各種の有機溶媒およびそれらの混合物を用い、公知の抽出方法で行う。抽出操作を行う前に、原料をそのまま、または粗く細断したものを、疎水性もしくは親水性溶媒単独または混合有機溶媒で洗浄し、色素等の不要物を除去してもよい。疎水性溶媒としては、クロロホルム、エーテル、ヘキサン、シクロヘキサン、トルエン、ジクロロメタン、石油エーテルおよびベンゼンなどが挙げられ、親水性溶媒としては低級アルコール（例、メチル、エチル、ｎ−プロピル）、酢酸エチル、アセトンおよびアセトニトリルなどが挙げられる。所望により原料に水を適宜加え、原料を湿潤させてもよい。 The extract is prepared by a known extraction method using water, various organic solvents and a mixture thereof as a solvent. Before performing the extraction operation, the raw material may be washed as it is or a coarsely shredded material with a hydrophobic or hydrophilic solvent alone or with a mixed organic solvent to remove unnecessary substances such as dyes. Examples of the hydrophobic solvent include chloroform, ether, hexane, cyclohexane, toluene, dichloromethane, petroleum ether and benzene, and examples of the hydrophilic solvent include lower alcohol (eg, methyl, ethyl, n-propyl), ethyl acetate and acetone. And acetonitrile and the like. If desired, water may be appropriately added to the raw material to moisten the raw material.
水で抽出を行うには、例えば、原料１質量部に対し、水０．５〜１０質量部を加え、４０〜１２０℃で、５分〜２時間、好ましくは１０〜６０分間、さらに好ましくは１０〜２０分間抽出を行うことができる。このとき、撹拌により抽出効率を高めることもできる。また、抽出は、加熱還流により行うこともできる。抽出後、濾布、フィルターまたはメッシュ金網などを用いて濾過または圧搾を行う。この場合、加圧して作業効率を高めてもよい。また、別法として、遠心分離（１０００〜２００００ｒｐｍ）により抽出液を得ることもできる。回収率を高めるために、この抽出・濾過工程を１〜５回繰り返すことができる。 For extraction with water, for example, 0.5 to 10 parts by mass of water is added to 1 part by mass of the raw material, and the temperature is 40 to 120 ° C. for 5 minutes to 2 hours, preferably 10 to 60 minutes, more preferably. Extraction can be performed for 10 to 20 minutes. At this time, the extraction efficiency can be improved by stirring. The extraction can also be carried out by heating and refluxing. After extraction, filtration or squeezing is performed using a filter cloth, a filter or a mesh wire mesh. In this case, pressurization may be applied to improve work efficiency. Alternatively, the extract can be obtained by centrifugation (1000 to 20000 rpm). This extraction / filtration step can be repeated 1 to 5 times in order to increase the recovery rate.
有機溶媒で抽出を行うには、例えば、原料１質量部に対し、溶媒０．５〜１０質量部を加え、水での抽出と同様にして抽出物を得ることができる。用いる溶媒としては上記した疎水性、親水性溶媒を単独で、または２種以上を組み合わせて使用することができ、含水溶媒も使用できる。特に、上記のように抽出前に原料を疎水性溶媒で洗浄して色素等の不要物を除去する場合および下記のように抽出後の粗抽出物を疎水性溶媒で洗浄する場合において、抽出に用いる溶媒としては、水、低級アルコール、５０〜８０％（ｖ／ｖ）含水低級アルコールが好ましい。これらの低級アルコールとしては上記と同様のものを例示できる。溶媒の除去は、濾過、遠心分離、蒸留などの常法に従って行うことができる。 To perform extraction with an organic solvent, for example, 0.5 to 10 parts by mass of a solvent can be added to 1 part by mass of a raw material to obtain an extract in the same manner as extraction with water. As the solvent to be used, the above-mentioned hydrophobic and hydrophilic solvents can be used alone or in combination of two or more, and a water-containing solvent can also be used. In particular, when the raw material is washed with a hydrophobic solvent before extraction to remove unnecessary substances such as dyes as described above, and when the crude extract after extraction is washed with a hydrophobic solvent as described below, it is suitable for extraction. As the solvent used, water, a lower alcohol, and a 50 to 80% (v / v) hydrous lower alcohol are preferable. Examples of these lower alcohols include those similar to the above. Removal of the solvent can be performed according to a conventional method such as filtration, centrifugation, or distillation.
本発明においては、得られた抽出物（抽出液を含む）は、そのまま本発明のフリー体ＡＩＭ増加用の組成物として使用することができる。また、精製、濃縮、乾燥などの処理を行ってもよい。 In the present invention, the obtained extract (including the extract) can be used as it is as the composition for increasing the free AIM of the present invention. In addition, treatments such as purification, concentration, and drying may be performed.
精製・濃縮は、上記抽出物を、親水性溶媒または含水溶媒に分散または溶解させ、濃縮して析出物を取得することを繰り返すことによって行うことができる。
或いは、公知の分離・精製に用いるクロマトグラフィー装置に高濃度に濃縮した画分を得ることもできる。これらの精製操作は繰り返して行うことができる。
Purification / concentration can be carried out by repeating the process of dispersing or dissolving the above extract in a hydrophilic solvent or a water-containing solvent and concentrating to obtain a precipitate.
Alternatively, a fraction concentrated to a high concentration can be obtained in a known chromatography device used for separation / purification. These purification operations can be repeated.
本発明に使用可能なアサフェティダ抽出物は、市販されている抽出物であっても使用可能である。 The assafetida extract that can be used in the present invention can be a commercially available extract.
本発明のアサフェティダ抽出物を配合した組成物は、フリー体のＡＩＭ増加の目的で各種医薬品、食品、健康食品、動物飼料等とすることが可能である。剤形としては特に制限されず、種々の形態とすることができ、具体的には、錠剤、カプセル剤、顆粒剤等経口投与のための形態とすることができる。 The composition containing the asafetida extract of the present invention can be used as various pharmaceuticals, foods, health foods, animal feeds, etc. for the purpose of increasing the AIM of the free form. The dosage form is not particularly limited and may be in various forms. Specifically, it may be in a form for oral administration such as tablets, capsules and granules.
本発明に係るアサフェティダ抽出物の、フリー体ＡＩＭ増加用組成物への配合量は、特に制限されず、また、目的、対象とする疾病により異なるので、一概に規定できるものではないが、一般的には乾固物換算で０．００００１〜９９質量％、好ましくは０．００１〜９９質量％で用いることで、血中のフリー体のＡＩＭ濃度を増加させることができる。 The amount of the asafetida extract according to the present invention to be added to the composition for increasing free AIM is not particularly limited and varies depending on the purpose and the target disease, and thus cannot be unconditionally defined, but is generally used. The AIM concentration of the free form in the blood can be increased by using 0.00001 to 99% by mass, preferably 0.001 to 99% by mass in terms of dry matter.
実施例、試験例を示し、本発明についてさらに説明する。
＜実施例１．ドリアン果実抽出物＞
１．抽出物の調製
ドリアン果実を凍結乾燥させ、ミルサーにて粉末状にした。粉末状にしたドリアン果実（６．００ｇ）を高速溶媒抽出ＡＳＥ２００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、１００℃ １０００ｐｓｉの条件で抽出を行い、熱水抽出物（１．０９ｇ）を得た。
Examples and test examples will be shown, and the present invention will be further described.
<Example 1. Durian Fruit Extract>
1. 1. Extract Preparation Durian fruit was lyophilized and powdered with a miller. The powdered durian fruit (6.00 g) was extracted using high-speed solvent extraction ASE200 (Thermo Scientific) at 100 ° C. and 1000 psi to obtain a hot water extract (1.09 g).
２．フリー体ＡＩＭ増加効果確認試験
（１）試験試料
熱水抽出物（熱水抽出エキス）、ドリアン果実から搾汁した果汁（ドリアン果汁）、ドリアン果実凍結乾燥粉末を試験試料とした。
2. 2. Free AIM increase effect confirmation test (1) Test sample Hot water extract (hot water extract), fruit juice squeezed from durian fruit (durian juice), and durian fruit lyophilized powder were used as test samples.
（２）試験方法
ヒト血清とＰＢＳ（−）とを２：３の比率で混合し、血清希釈液を調製した。
熱水抽出物及びドリアン果実凍結乾燥粉末は、２０ｍｇ／ｍＬの濃度になるように、ＰＢＳに分散又は溶解させた。ドリアン果汁は、そのまま試験に用いた。
果実の凍結乾燥粉末および熱水抽出物のＰＢＳ溶液（２０ｍｇ／ｍＬ）あるいはドリアン果汁と血清希釈液を等容量で混合し、３７℃１時間インキュベートした。インキュベートしたものをフリー体ＡＩＭの増加を確認するウエスタンブロッティング用の試料とした。
(2) Test method Human serum and PBS (-) were mixed at a ratio of 2: 3 to prepare a serum diluent.
The hot water extract and lyophilized durian fruit powder were dispersed or dissolved in PBS to a concentration of 20 mg / mL. Dorian juice was used as it was in the test.
The lyophilized powder of the fruit and the PBS solution of hot water extract (20 mg / mL) or Dorian juice and serum diluent were mixed in equal volumes and incubated at 37 ° C. for 1 hour. The incubated sample was used as a sample for Western blotting to confirm the increase in free AIM.
（３）ウエスタンブロッティング
ウエスタンブロッティング用試料に４×ＬＤＳ試料用緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を加え混合し、１ウェルあたり血清が１μＬ含まれるようＸＶ ＰＡＮＴＥＲＡ ＭＰ Ｇｅｌ（ゲル濃度：５〜２０％、ディー・アール・シー）にロードし、２００Ｖの定電圧でＳＤＳ−ＰＡＧＥ法により試料中のタンパク質を分離した。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、タンパク質をＰＶＤＦ膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｈｙｂｏｎｄ Ｐ ＰＶＤＦ ０．４５、ＧＥヘルスケア）に転写した。
転写後のＰＶＤＦ膜をＴｒｉｓ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ ｗｉｔｈ Ｔｗｅｅｎ（ＴＢＳＴ ０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で洗浄し、続いてブロッキング溶液（５％スキムミルク／ＴＢＳＴ）に浸した後、室温で１時間振盪し、ブロッキング処理を行った。
ブロッキング処理を行ったＰＶＤＦ膜は抗体希釈用緩衝液で希釈した抗体と４℃、１６〜１８時間反応させた。反応後、ＰＶＤＦ膜を３回ＴＢＳＴで洗浄し、ブロッキング溶液で二次抗体を希釈して室温、１時間の条件で二次抗体反応を行った。なお、使用した抗体の希釈条件は以下の通りである。一次抗体：抗ヒト／マウスＡＩＭ抗体 ｒａｂ１(宮崎研究室で生産・非特許文献２等で使用)（１：３０００）、二次抗体：抗ウサギ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体ＨＲＰ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（１：５０００）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）。
反応終了後、再度３回、ＴＢＳＴで洗浄し、ＥＣＬ Ｐｒｉｍｅ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔｓ（ＧＥヘルスケア）を基質として用い、ＣｈｅｍｉＤｏｃ Ｔｏｕｃｈ（ＢｉｏＲａｄ）にてシグナルの検出・撮影を行った。
同様の操作を血清のみの試料（ＰＢＳ添加）についても行った。
(3) Western blotting Add 4 × LDS sample buffer (Thermo Scientific) to the Western blotting sample and mix, and XV PANTERA MP Gel (gel concentration: 5 to 20%, D. Gel) so that 1 μL of serum is contained per well. It was loaded on RC), and the protein in the sample was separated by the SDS-PAGE method at a constant voltage of 200 V.
After SDS-PAGE, the protein was transcribed on a PVDF membrane (Amersham Hybrid P PVDF 0.45, GE Healthcare).
The PVDF membrane after transfer is washed with Tris buffered saline with Tween (TBST 0.05% Tween 20), then immersed in a blocking solution (5% skim milk / TBST), and then shaken at room temperature for 1 hour for blocking treatment. It was.
The blocking-treated PVDF membrane was reacted with the antibody diluted with the antibody dilution buffer at 4 ° C. for 16 to 18 hours. After the reaction, the PVDF membrane was washed 3 times with TBST, the secondary antibody was diluted with a blocking solution, and the secondary antibody reaction was carried out under the conditions of room temperature and 1 hour. The dilution conditions for the antibody used are as follows. Primary antibody: Anti-human / mouse AIM antibody rab1 (produced in Miyazaki laboratory, used in non-patent documents 2 etc.) (1: 3000), Secondary antibody: Anti-rabbit IgG (H + L) antibody HRP conjugate (1: 5000) ( Thermo Scientific).
After completion of the reaction, the cells were washed with TBST three times again, and signals were detected and photographed by ChemiDoc Touch (BioRad) using ECL Prime Western Blotting Detection Reagents (GE Healthcare) as a substrate.
The same operation was performed on the serum-only sample (with PBS added).
（４）結果
ウエスタンブロッティングの撮影画像を図１、画像より読み取ったフリー体ＡＩＭ量を図２に示す。
図１、図２に示すとおり、本来は血清には殆ど検出されないフリー体のＡＩＭに相当するバンドがドリアン果汁、ドリアン果実の凍結乾燥粉末及びドリアンの熱水抽出物（熱水抽出エキス）が出現した。なお図１には比較対照として、ヒト血清とＰＢＳの混合物に試料に相当する容量のＰＢＳを添加したものをＰＢＳと略記して表示した。このバンドがフリー体のＡＩＭであることは非特許文献２等で使用している組み換えＡＩＭを電気泳動の対照とすることで確認できた。
以上の試験結果から、ドリアンの果実には、通常血中に存在しないフリー体のＡＩＭを増加させる作用があることがわかった。
ドリアン抽出物による血中のフリー体ＡＩＭの増加により、急性腎障害、脂肪肝、肝細胞癌、肥満、真菌性腹膜炎、多発性硬化症等のフリー体ＡＩＭが関与する疾患の予防改善剤として期待される。
(4) Results Fig. 1 shows the photographed image of Western blotting, and Fig. 2 shows the amount of free AIM read from the image.
As shown in FIGS. 1 and 2, durian juice, lyophilized powder of durian fruit, and hot water extract of durian (hot water extract) appear as bands corresponding to free AIM, which are rarely detected in serum. did. In FIG. 1, as a comparative control, a mixture of human serum and PBS to which a volume of PBS corresponding to the sample was added is abbreviated as PBS. It was confirmed that this band was a free AIM by using the recombinant AIM used in Non-Patent Document 2 and the like as a control for electrophoresis.
From the above test results, it was found that durian fruits have an action of increasing free AIM which is not normally present in blood.
Due to the increase in free AIM in blood by Dorian extract, it is expected to be a preventive and ameliorating agent for diseases associated with free AIM such as acute renal injury, fatty liver, hepatocellular carcinoma, obesity, fungal peritonitis, and multiple sclerosis. Will be done.
＜実施例２．ドリアン果実中のフリー体ＡＩＭ増加活性の分画＞
１．分画操作
ドリアン果汁２５ｍＬに対して、同量のブタノール（以下ＢｕＯＨ）２５ｍＬを加えて液々分配し、さらにその水層を再度ＢｕＯＨ ２５ｍＬで繰り返し抽出した。
水層およびＢｕＯＨ層をそれぞれ乾固し、水層画分２．７ｇとＢｕＯＨ層画分１８０ｍｇを得た。
得られた水層画分２．７ｇをＸＧ−Ｃ３０Ｍ−５ １０×２５０ｍｍ ５μｍカラム、移動相２％アセトニトリル（０．１％ギ酸水溶液）、流速５ｍＬ／分、検出ＵＶ２１０ｎｍの条件による高速液体クロマトグラフィーを用いてさらに分画を行った。
画分は、実施例１と同様にウエスタンブロッティングによって、フリー体ＡＩＭの増加効果を確認しながら行った。図３にブタノール抽出物のウエスタンブロット撮影画像、図４に画像より読み取ったフリー体ＡＩＭの量を示す。
得られた活性画分を乾固し、Ａｍｉｄｅ−８０ ７．８×３００ｍｍ １０μｍカラム、移動相８０％アセトニトリル水溶液、流速２．８ｍＬ／分、検出ＵＶ２１０ｎｍの条件による高速液体クロマトグラフィーで再分画し、２ｍｇの最終活性画分を得た。
得られた最終活性画分は、ＴｏＦＭＳにて分子量及び組成式を得た。この最終画分は、分子量ｍ／ｚ２５１．０６９６（Ｍ＋Ｈ）、組成式Ｃ８Ｈ１４Ｎ２Ｏ５Ｓであった。この結果から活性物質の１つは、γ−グルタミルシステインと推定し、標品試薬としてγ−グルタミルシステイン(ＳＩＧＭＡ)を入手し、ＨＰＬＣで保持時間の一致、ＴｏＦＭＳにて分子量組成式及びフラグメンテーションの一致を確認した。
γ−グルタミルシステインは、次の化学式１で表すことができる。
<Example 2. Fraction of free AIM increasing activity in durian fruit>
1. 1. Fractionation operation To 25 mL of Dorian juice, 25 mL of butanol (hereinafter referred to as BuOH) was added in the same amount to dispense the liquid, and the aqueous layer was repeatedly extracted with 25 mL of BuOH.
The aqueous layer and the BuOH layer were dried to dryness, respectively, to obtain 2.7 g of the aqueous layer fraction and 180 mg of the BuOH layer fraction.
2.7 g of the obtained aqueous layer fraction was subjected to high performance liquid chromatography under the conditions of XG-C30M-5 10 × 250 mm 5 μm column, mobile phase 2% acetonitrile (0.1% formic acid aqueous solution), flow rate 5 mL / min, and detection UV 210 nm. Further fractionation was performed using.
The fraction was subjected to Western blotting as in Example 1 while confirming the effect of increasing the free AIM. FIG. 3 shows a Western blot image of the butanol extract, and FIG. 4 shows the amount of free AIM read from the image.
The obtained active fraction was dried and refractionated by high performance liquid chromatography under the conditions of Amide-80 7.8 × 300 mm 10 μm column, mobile phase 80% acetonitrile aqueous solution, flow rate 2.8 mL / min, and detection UV 210 nm. A final active fraction of 2 mg was obtained.
The obtained final active fraction was subjected to ToFMS to obtain a molecular weight and composition formula. This final fraction had a molecular weight of m / z 251.0696 (M + H) and a composition formula C 8 H 14 N 2 O 5 S. From this result, one of the active substances was presumed to be γ-glutamylcysteine, γ-glutamylcysteine (SIGMA) was obtained as a standard reagent, the retention time was matched by HPLC, and the molecular weight composition formula and fragmentation were matched by ToFMS. It was confirmed.
Gamma-glutamylcysteine can be represented by the following chemical formula 1.
＜実施例３．グルタミルシステインのフリー体ＡＩＭ増加効果確認試験＞
実施例１と同様に、グルタミルシステインのフリー体ＡＩＭ増加効果を確認した。
図５に高純度γ−グルタミルシステインのヒト血清中のＡＩＭ増加効果を確認したウエスタンブロット画像、図６にこの画像から読み取ったフリー体ＡＩＭ量のグラフを示す。（なお図５、図６には比較対照として、ヒト血清とＰＢＳの混合物に試料に相当する容量のＰＢＳを添加したものをＰＢＳと略記して表示した。）
γ−グルタミルシステインは強いフリー体ＡＩＭ増加作用を有することが確認された。
<Example 3. Glutamil cysteine free AIM increase effect confirmation test>
Similar to Example 1, the free AIM increasing effect of glutamil cysteine was confirmed.
FIG. 5 shows a Western blot image confirming the AIM increasing effect of high-purity γ-glutamylcysteine in human serum, and FIG. 6 shows a graph of the amount of free AIM read from this image. (In addition, in FIGS. 5 and 6, as a comparative control, a mixture of human serum and PBS supplemented with a volume of PBS corresponding to the sample is abbreviated as PBS.)
It was confirmed that γ-glutamylcysteine has a strong free AIM increasing action.
＜実施例４．アサフェティダ抽出物によるフリー体ＡＩＭ増加効果確認試験＞
市販されている水蒸気蒸留法で抽出されたアサフェティダ抽出物を用いて血中フリー体ＡＩＭの増加作用について試験を行った。
（１）試験試料
アサフェティダオイル(バイオアクティブズジャパン株式会社)を試験試料とした。
アサフェティダオイルは、最終の濃度が１％（Ｖ／Ｖ）になるようジメチルスルフォオキシド（ＤＭＳＯ）に溶解させた。
<Example 4. Free AIM increase effect confirmation test by Asafetida extract>
A safetida extract extracted by a commercially available steam distillation method was used to test the increasing action of blood-free AIM.
(1) Test sample Asafetida oil (Bioactives Japan Co., Ltd.) was used as a test sample.
Asafetida oil was dissolved in dimethyl sulfoxide (DMSO) to a final concentration of 1% (V / V).
（２）試験方法
ヒト血清とＰＢＳ（−）とを２：３の比率で混合し、血清希釈液を調製した。
ＤＭＳＯに溶解したアサフェティダオイルをＰＢＳ（−）容量の１／５量を添加して調製した溶液と血清希釈液を等量で混合し、３７℃１時間インキュベートした。果実の凍結乾燥粉末および熱水抽出物のＰＢＳ溶液（２０ｍｇ／ｍＬ）あるいはドリアン果汁と血清希釈液を等容量で混合し、３７℃１時間インキュベートした。これをウエスタンブロッティング用の試料とした。
(2) Test method Human serum and PBS (-) were mixed at a ratio of 2: 3 to prepare a serum diluent.
A solution prepared by adding 1/5 of the volume of PBS (−) of asafetida oil dissolved in DMSO and a serum diluent were mixed in equal amounts and incubated at 37 ° C. for 1 hour. The lyophilized powder of the fruit and the PBS solution of hot water extract (20 mg / mL) or Dorian juice and serum diluent were mixed in equal volumes and incubated at 37 ° C. for 1 hour. This was used as a sample for Western blotting.
（３）ウエスタンブロッティング
ウエスタンブロッティング用試料に４×ＬＤＳ試料用緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を加え混合し、１ウェルあたり血清が１μＬ含まれるようＸＶ ＰＡＮＴＥＲＡ ＭＰ Ｇｅｌ（ゲル濃度：５〜２０％、ディー・アール・シー）にロードし、２００Ｖの定電圧でＳＤＳ−ＰＡＧＥ法により試料中のタンパク質を分離した。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、タンパク質をＰＶＤＦ膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｈｙｂｏｎｄ Ｐ ＰＶＤＦ ０．４５、ＧＥヘルスケア）に転写した。
転写後のＰＶＤＦ膜をＴｒｉｓ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ ｗｉｔｈ Ｔｗｅｅｎ（ＴＢＳＴ ０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で洗浄し、続いてブロッキング溶液（５％スキムミルク／ＴＢＳＴ）に浸した後、室温で１時間振盪し、ブロッキング処理を行った。
ブロッキング処理を行ったＰＶＤＦ膜は抗体希釈用緩衝液で希釈した抗体と４℃、１６〜１８時間反応させた。反応後、ＰＶＤＦ膜を３回ＴＢＳＴで洗浄し、ブロッキング溶液で二次抗体を希釈して室温、１時間の条件で二次抗体反応を行った。なお、使用した抗体の希釈条件は以下の通りである。一次抗体：抗ヒト／マウスＡＩＭ抗体 ｒａｂ１（１：３０００）、二次抗体：抗ウサギ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体ＨＲＰ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（１：５０００）。
反応終了後、再度３回、ＴＢＳＴで洗浄し、ＥＣＬ Ｐｒｉｍｅ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔｓ（ＧＥヘルスケア）を基質として用い、ＣｈｅｍｉＤｏｃ Ｔｏｕｃｈ（ＢｉｏＲａｄ）にてシグナルの検出・撮影を行った。
同様の操作を血清のみの試料についても行った。
(3) Western blotting Add 4 × LDS sample buffer (Thermo Scientific) to the Western blotting sample and mix, and XV PANTERA MP Gel (gel concentration: 5 to 20%, D. Gel) so that 1 μL of serum is contained per well. It was loaded on RC), and the protein in the sample was separated by the SDS-PAGE method at a constant voltage of 200 V.
After SDS-PAGE, the protein was transcribed on a PVDF membrane (Amersham Hybrid P PVDF 0.45, GE Healthcare).
The PVDF membrane after transfer is washed with Tris buffered saline with Tween (TBST 0.05% Tween 20), then immersed in a blocking solution (5% skim milk / TBST), and then shaken at room temperature for 1 hour for blocking treatment. It was.
The blocking-treated PVDF membrane was reacted with the antibody diluted with the antibody dilution buffer at 4 ° C. for 16 to 18 hours. After the reaction, the PVDF membrane was washed 3 times with TBST, the secondary antibody was diluted with a blocking solution, and the secondary antibody reaction was carried out under the conditions of room temperature and 1 hour. The dilution conditions for the antibody used are as follows. Primary antibody: anti-human / mouse AIM antibody rab1 (1: 3000), secondary antibody: anti-rabbit IgG (H + L) antibody HRP conjugate (1: 5000).
After completion of the reaction, the cells were washed with TBST three times again, and signals were detected and photographed by ChemiDoc Touch (BioRad) using ECL Prime Western Blotting Detection Reagents (GE Healthcare) as a substrate.
The same operation was performed on serum-only samples.
（４）結果
ウエスタンブロッティングの撮影画像を図７に示す。
図７に示すとおり、アサフェティダ抽出物には、通常血中に存在しないフリー体のＡＩＭを増加させる作用があることがわかった。アサフェティダ抽出物による血中のフリー体ＡＩＭの増加により、急性腎障害、脂肪肝、肝細胞癌、肥満、真菌性腹膜炎、多発性硬化症等のフリー体ＡＩＭが関与する疾患の予防改善剤として期待される。
(4) Results The photographed image of Western blotting is shown in FIG.
As shown in FIG. 7, it was found that the asafetida extract has an action of increasing the free AIM which is not normally present in blood. As a preventive and ameliorating agent for diseases associated with free AIM such as acute kidney injury, fatty liver, hepatocellular carcinoma, obesity, fungal peritonitis, and multiple sclerosis due to an increase in free AIM in blood due to Asafetida extract. Be expected.
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