JP2020118636A - System and method for evaluating water permeability of lipid double membrane, and method for screening drug for controlling water permeability of lipid double membrane - Google Patents

System and method for evaluating water permeability of lipid double membrane, and method for screening drug for controlling water permeability of lipid double membrane Download PDF

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Abstract

To provide a system and a method for easily and accurately evaluating water permeability of a lipid double membrane and water permeability of a water channel embedded in the lipid double membrane, and clarifying the drug action on a control mechanism of the water channel and the water channel.SOLUTION: A system for evaluating water permeability of a lipid double membrane of the present invention includes: a pipe (5) inside which a first aqueous solution, a lipid double membrane, and a second aqueous solution having the higher osmotic concentration than the first aqueous solution are arranged in this order and which includes an opening/closing part (15); a moving distance measuring meter (50) for measuring a moving distance of the lipid double membrane; and electrode pairs (40, 41) for metering/controlling and/or measuring the potential difference and electric current through the lipid double membrane.SELECTED DRAWING: Figure 1

Description

本発明は、脂質二重膜の水透過性の評価システム、脂質二重膜の水透過性の評価方法、および、脂質二重膜の水透過性を制御する薬剤のスクリーニング方法に関する。 TECHNICAL FIELD The present invention relates to an evaluation system for water permeability of a lipid bilayer membrane, a method for evaluating water permeability of a lipid bilayer membrane, and a screening method for a drug that controls the water permeability of a lipid bilayer membrane.

細胞は、一般的に、脂質二重膜にて形成されている細胞膜によって覆われており、当該細胞膜によって、細胞と外界との境界が形成されている。 A cell is generally covered with a cell membrane formed of a lipid bilayer membrane, and the cell membrane forms a boundary between the cell and the outside world.

細胞膜は、外界から細胞内へ物質が自由拡散することを防ぐ機能を有しているのみならず、外界から細胞内へ物質を選択的に取り込む機能も有している。このような細胞膜の機能は、細胞膜を形成している脂質や、細胞膜中に埋め込まれている様々な膜タンパク質などによって発現している。 The cell membrane has not only the function of preventing free diffusion of a substance from the outside world into the cell, but also the function of selectively taking in the substance from the outside world into the cell. Such functions of the cell membrane are expressed by lipids forming the cell membrane, various membrane proteins embedded in the cell membrane, and the like.

近年、細胞膜が有している様々な機能に注目が集まっており、当該機能を解析しようとする試みがなされている。 In recent years, attention has been focused on various functions possessed by cell membranes, and attempts have been made to analyze the functions.

例えば、細胞膜は外界から細胞内へ物質が自由拡散することを防ぐ機能を有しているため、体内における薬剤の拡散に影響を及ぼし得る。それ故に、薬剤の開発にあたっては、薬剤の細胞膜の透過性を解析しようとする試みがなされている。 For example, the cell membrane has a function of preventing free diffusion of a substance from the outside to the inside of the cell, and thus may affect the diffusion of the drug in the body. Therefore, in developing a drug, attempts have been made to analyze the permeability of the drug to the cell membrane.

例えば、細胞膜は外界から細胞内へ物質が自由拡散することを防ぐ機能を有しているものの、有毒な化合物の中には、細胞膜を貫通して拡散し得るものがある。それ故に、有毒な化合物の毒性評価にあたって、当該化合物の細胞膜の透過性を解析しようとする試みがなされている。 For example, although the cell membrane has a function of preventing free diffusion of a substance from the outside into the cell, some toxic compounds can diffuse through the cell membrane. Therefore, in evaluating the toxicity of a toxic compound, attempts have been made to analyze the permeability of the compound to the cell membrane.

例えば、膜タンパク質は細胞膜から分離すると変性する場合がある。それ故に、膜タンパク質の機能を解析するために、膜タンパク質を人工的に細胞膜に埋め込もうとする試みがなされている。 For example, membrane proteins may denature upon separation from the cell membrane. Therefore, attempts have been made to artificially embed the membrane protein in the cell membrane in order to analyze the function of the membrane protein.

例えば、細胞膜は水を透過させる機能を有しており、脂質二重膜の脂質組成によって細胞膜の水透過性が異なるだけでなく、脂質二重膜に埋め込まれた膜蛋白質である水チャネル（アクアポリン）によって細胞膜の水透過性が調節されている。細胞および組織の細胞膜の局所にアクアポリンが分布することによって、細胞内外および組織内に、組織化された水の流れ（水流ネットワーク）が生み出される。そして、当該水流ネットワークが、細胞の移動等の様々な生命現象に深く関与していることが明らかになりつつある（非特許文献１）。 For example, the cell membrane has a function of allowing water to permeate, and not only the water permeability of the cell membrane varies depending on the lipid composition of the lipid bilayer membrane, but also the water channel (aquaporin) which is a membrane protein embedded in the lipid bilayer membrane. ) Regulates the water permeability of the cell membrane. The local distribution of aquaporins in the cell membranes of cells and tissues creates an organized flow of water (water flow network) inside and outside the cells and within the tissues. Then, it is becoming clear that the water flow network is deeply involved in various life phenomena such as cell migration (Non-Patent Document 1).

細胞膜が有している水流形成機能を解析するためには、脂質二重膜を人工的に作製し、脂質二重膜それ自体の水透過性と、脂質二重膜に埋め込まれた水チャネルの水透過性と、を測定する技術が必要であって、このような技術の開発が進められてきた。 In order to analyze the water flow formation function of the cell membrane, we artificially created the lipid bilayer membrane and calculated the water permeability of the lipid bilayer membrane itself and the water channels embedded in the lipid bilayer membrane. There is a need for a technique for measuring water permeability and such a technique has been developed.

脂質二重膜を人工的に作製する技術としては、例えば、脂質一重膜によって覆われた液滴と、脂質一重膜によって覆われた他の液滴とを、機械的な外力によって接触させる方法が挙げられる（特許文献１）。また、脂質二重膜を人工的に作製する技術としては、油の中で予め脂質一重膜によって覆われた液滴を形成させ、その液滴をマニピュレータなどで操作することによって、脂質二重膜を作製する方法も挙げられる（非特許文献２）。 As a technique for artificially producing a lipid bilayer, for example, a method in which a droplet covered with a lipid monolayer and another droplet covered with a lipid monolayer are brought into contact with each other by a mechanical external force is used. (Patent Document 1). Further, as a technique for artificially producing a lipid bilayer membrane, a lipid bilayer membrane is formed by forming droplets previously covered with a lipid monolayer in oil and operating the droplets with a manipulator or the like. There is also a method of manufacturing (Non-Patent Document 2).

一方、水透過性の測定方法は、限られており、リポソームの体積変化を光散乱に基づいて観察する技術が挙げられる（非特許文献３）。非特許文献４に記載の技術は、イオン電極を用いて、膜近傍のイオン濃度分布から水流束を測定する技術である。 On the other hand, the method for measuring the water permeability is limited, and a technique for observing the volume change of liposomes based on light scattering can be mentioned (Non-Patent Document 3). The technique described in Non-Patent Document 4 is a technique of measuring a water flux from an ion concentration distribution near the membrane using an ion electrode.

特開２０１４−１００６７２号公報JP, 2014-100672, A

Stroka KM, Jiang H, Chen SH, Tong Z, Wirtz D, Sun SX, Konstantopoulos K. Cell. Vol. 157, April 2014, Issue 3, 611-623.Stroka KM, Jiang H, Chen SH, Tong Z, Wirtz D, Sun SX, Konstantopoulos K. Cell. Vol. 157, April 2014, Issue 3, 611-623. Masayuki Iwamoto & Shigetoshi Oiki, Sci. Rep., 5, 9110, 2015.Masayuki Iwamoto & Shigetoshi Oiki, Sci. Rep., 5, 9110, 2015. Tadaatsu Kometani & Michiki Kasai, The Journal of Membrane Biology, Vol.41, December 1978, Issue 4, 295-308.Tadaatsu Kometani & Michiki Kasai, The Journal of Membrane Biology, Vol.41, December 1978, Issue 4, 295-308. Peter Pohl et al, Biophysical Journal, Vol.72, April 1997, 1711-1718.Peter Pohl et al, Biophysical Journal, Vol.72, April 1997, 1711-1718.

しかしながら、上述のような従来技術は、脂質二重膜の水透過性の評価、および、脂質二重膜に埋め込まれた水チャネルの水透過性の評価を容易に、かつ、正確に行うことができないという課題を有している。 However, the conventional techniques as described above can easily and accurately evaluate the water permeability of the lipid bilayer membrane and the water permeability of the water channel embedded in the lipid bilayer membrane. It has a problem that it cannot do it.

例えば、非特許文献３に記載の技術では、水体積流に伴う非撹拌水層の影響を正確に評価することができなかった。一方、引用文献４に記載の技術では、直接水の流れを測定していないので、水透過性を正確に評価できなかった。 For example, with the technique described in Non-Patent Document 3, it was not possible to accurately evaluate the influence of the non-stirred water layer associated with the water volume flow. On the other hand, in the technique described in the cited document 4, since the flow of water is not directly measured, the water permeability cannot be accurately evaluated.

このため生体で極めて重要視されている水チャネルの分子特性が十分に明らかになっていない。 For this reason, the molecular characteristics of water channels, which are extremely important in living organisms, have not been fully clarified.

本発明は、上記問題点に鑑みなされたものであって、その目的は、簡便かつ正確に、脂質二重膜の水透過性、および、脂質二重膜に埋め込まれた水チャネルの水透過性を評価し、水チャネルの制御機構や水チャネルに対する薬物作用を明らかにするための、システムおよび方法を実現することを目的とする。 The present invention has been made in view of the above problems, and an object thereof is simply and accurately, water permeability of a lipid bilayer membrane, and water permeability of a water channel embedded in the lipid bilayer membrane. The present invention aims to realize a system and method for evaluating the control mechanism of water channels and clarifying drug action on water channels.

上記の課題を解決するために、本発明の一態様に係る脂質二重膜の水透過性の評価システムは、内部に、所定の浸透圧濃度である第１の水溶液、脂質二重膜、および、上記第１の水溶液よりも高い浸透圧濃度である第２の水溶液をこの順番にて配置するための管であって、当該管を開閉する開閉部を備えている管と、上記脂質二重膜の移動距離を計測するための移動距離計測計と、上記脂質二重膜を介した電位差と電流とを制御および計測（または、制御および／または計測）するための電極対と、を備えていることを特徴とする。 In order to solve the above-mentioned problems, an evaluation system of water permeability of a lipid bilayer membrane according to one aspect of the present invention has a first aqueous solution having a predetermined osmotic concentration, a lipid bilayer membrane, and A tube for arranging in this order a second aqueous solution having a higher osmotic pressure concentration than the first aqueous solution, the tube having an opening/closing part for opening and closing the tube; A moving distance meter for measuring the moving distance of the membrane, and an electrode pair for controlling and measuring (or controlling and/or measuring) the potential difference and the current through the lipid bilayer membrane. It is characterized by being

上記構成によれば、移動距離計測計の測定結果と、電極対の測定結果とを用いて、水透過性に関するパラメータのうち、例えば、水流束と脂質二重膜の面積とを評価することができる。評価の原理については、後述する〔１−１．本発明の原理〕の欄にて説明する。 According to the above configuration, using the measurement result of the distance meter and the measurement result of the electrode pair, of the parameters related to water permeability, for example, it is possible to evaluate the water flux and the area of the lipid bilayer membrane. it can. The principle of evaluation will be described later [1-1. Principle of the present invention].

本発明の一態様に係る脂質二重膜の水透過性の評価システムでは、上記脂質二重膜は、イオノフォア、または、ポリペプチド（例えば、イオンチャネルタンパク質）を含有するものであり得る。 In the evaluation system for water permeability of a lipid bilayer membrane according to one aspect of the present invention, the lipid bilayer membrane may contain an ionophore or a polypeptide (for example, an ion channel protein).

脂質二重膜が、イオノフォア、または、ポリペプチド（例えば、イオンチャネルタンパク質）を含有すると、これらによって、脂質二重膜を介したイオンの移動が可能になる。上記構成によれば、移動距離計測計の測定結果と、電極対の測定結果とを用いて、水透過性に関するパラメータのうち、例えば、非撹拌水層、および、流動電位を評価することができる。評価の原理については、後述する〔１−１．本発明の原理〕の欄にて説明する。 When the lipid bilayer contains ionophores or polypeptides (eg, ion channel proteins), these allow the transfer of ions across the lipid bilayer. According to the above configuration, by using the measurement result of the moving distance meter and the measurement result of the electrode pair, of the parameters relating to water permeability, for example, the non-stirred water layer, and the streaming potential can be evaluated. .. The principle of evaluation will be described later [1-1. Principle of the present invention].

本発明の一態様に係る脂質二重膜の水透過性の評価システムは、水流束の評価システム、非撹拌水層の評価システム、または、流動電位の評価システムであり得る。 The water permeability evaluation system for a lipid bilayer membrane according to an aspect of the present invention may be a water flux evaluation system, a non-stirred water layer evaluation system, or a streaming potential evaluation system.

本発明の一態様に係る脂質二重膜の水透過性の評価システムは、水流束、非撹拌水層、および、流動電位などを評価することができる。 The evaluation system for water permeability of a lipid bilayer membrane according to one aspect of the present invention can evaluate water flux, non-stirred water layer, streaming potential, and the like.

本発明の一態様に係る脂質二重膜の水透過性の評価システムでは、上記管は、上記管内に上記第１の水溶液を導入するための第１の開口と、上記管内に上記第２の水溶液を導入するための第２の開口と、上記第１の開口と上記第２の開口との間にて上記管に設けられている第３の開口であって、上記第３の開口から上記管内に配置されている、上記脂質二重膜を形成するための油を吸引するための第３の開口と、を備え得る。 In the evaluation system for water permeability of a lipid bilayer membrane according to an aspect of the present invention, the tube has a first opening for introducing the first aqueous solution into the tube and the second opening in the tube. A second opening for introducing an aqueous solution, and a third opening provided in the pipe between the first opening and the second opening, the third opening opening A third opening disposed in the tube for aspirating oil to form the lipid bilayer membrane.

脂質二重膜を形成するための油、第１の水溶液、および、第２の水溶液からなる群から選択される少なくとも１つには、脂質一重膜を形成するための脂質が含まれている。上記油が充填されている管内に第１の水溶液および第２の水溶液を導入すると、当該第１の水溶液および第２の水溶液を覆うように、脂質一重膜が形成される。このとき、管内には上記油が充填されているので、脂質一重膜を形成する脂質は、自身の疎水性領域を上記油の側に配置し、自身の親水性領域を第１の水溶液または第２の水溶液の側に配置することになる。第３の開口は、第１の開口と第２の開口との間に設けられているので、当該第３の開口から管内の上記油を吸引すると、管内に上記油の流れが生じ、当該流れによって、脂質一重膜によって覆われた第１の水溶液と、脂質一重膜によって覆われた第２の水溶液とが接触することになる。上述したように、脂質一重膜を形成する脂質は、自身の疎水性領域を上記油の側に配置し、自身の親水性領域を第１の水溶液または第２の水溶液の側に配置しているので、脂質一重膜同士が接触して形成されている脂質二重膜では、内側にて疎水性領域同士が向かい合うように配置され、外側に親水性領域が配置されることになる。つまり、当該脂質二重膜は細胞膜と同じ構造を有しており、上記構成によれば、簡便に、細胞膜のモデルを容易に作製できるとともに、脂質二重膜についての評価を容易に行うことができる。 At least one selected from the group consisting of an oil for forming a lipid bilayer, a first aqueous solution, and a second aqueous solution contains a lipid for forming a lipid monolayer. When the first aqueous solution and the second aqueous solution are introduced into the tube filled with the oil, a lipid monolayer is formed so as to cover the first aqueous solution and the second aqueous solution. At this time, since the oil is filled in the tube, the lipid forming the lipid monolayer has its hydrophobic region located on the oil side and its hydrophilic region in the first aqueous solution or the first aqueous solution. 2 will be placed on the side of the aqueous solution. Since the third opening is provided between the first opening and the second opening, when the oil in the pipe is sucked from the third opening, a flow of the oil occurs in the pipe and the flow Thus, the first aqueous solution covered with the lipid monolayer and the second aqueous solution covered with the lipid monolayer come into contact with each other. As described above, the lipid forming the lipid monolayer has its hydrophobic region arranged on the side of the oil and its hydrophilic region arranged on the side of the first aqueous solution or the second aqueous solution. Therefore, in the lipid bilayer formed by contacting the lipid monolayers, the hydrophobic regions are arranged so as to face each other on the inner side, and the hydrophilic regions are arranged on the outer side. That is, the lipid bilayer membrane has the same structure as the cell membrane, and according to the above configuration, a model of the cell membrane can be easily produced easily and the lipid bilayer membrane can be easily evaluated. it can.

本発明の一態様に係る脂質二重膜の水透過性の評価システムは、上記管を複数備え得る。 The evaluation system for water permeability of a lipid bilayer membrane according to an aspect of the present invention may include a plurality of the above tubes.

上記構成によれば、複数の管の各々の中で同時に脂質二重膜を作製することができ、その結果、短時間にて複数の脂質二重膜について評価を行うことができる。 According to the above configuration, a lipid bilayer membrane can be produced simultaneously in each of a plurality of tubes, and as a result, a plurality of lipid bilayer membranes can be evaluated in a short time.

本発明の一態様に係る脂質二重膜の水透過性の評価システムは、複数の上記第１の開口のうちの少なくとも２つと接続されている第１の副管と、複数の上記第２の開口のうちの少なくとも２つと接続されている第２の副管と、を備え得る。 A lipid bilayer membrane water permeability evaluation system according to one aspect of the present invention includes a first sub-tube connected to at least two of the plurality of first openings, and a plurality of the second sub-tubes. A second sub-tube connected to at least two of the openings.

上記構成によれば、第１の副管を用いて、複数の第１の開口に対して第１の水溶液を供給することができ、第２の副管を用いて、複数の第２の開口に対して第２の水溶液を供給することができる。それ故に、上記構成によれば、複数の管の各々の中で同時に脂質二重膜を作製することができ、その結果、短時間にて複数の脂質二重膜について評価を行うことができる。 According to the above configuration, the first aqueous solution can be supplied to the plurality of first openings by using the first sub-tube, and the second aqueous solution can be supplied by using the second sub-tube. To the second aqueous solution. Therefore, according to the above-mentioned composition, a lipid bilayer membrane can be produced simultaneously in each of a plurality of pipes, and as a result, a plurality of lipid bilayer membranes can be evaluated in a short time.

上記の課題を解決するために、本発明の一態様に係る脂質二重膜の水透過性の評価方法は、本発明の一態様に係る脂質二重膜の水透過性の評価システムを用いる脂質二重膜の水透過性の評価方法であって、上記管内に配置されている脂質二重膜の移動距離の計測、および、上記管内に配置されている脂質二重膜を介した電位差と電流との制御および／または計測、を行う計測工程を有することを特徴とする。 In order to solve the above problems, a method for evaluating water permeability of a lipid bilayer membrane according to one aspect of the present invention is a lipid using the evaluation system for water permeability of a lipid bilayer membrane according to one aspect of the present invention. A method for evaluating the water permeability of a bilayer membrane, which comprises measuring the distance traveled by a lipid bilayer membrane arranged in the tube, and the potential difference and current through the lipid bilayer membrane arranged in the tube. It is characterized by having a measurement step of controlling and/or measuring with.

上記構成によれば、移動距離計測計の測定結果と、電極対の測定結果とを用いて、水透過性に関するパラメータのうち、例えば、水流束と脂質２重膜の面積とを評価することができる。また、脂質二重膜がイオノフォア、または、ポリペプチド（例えば、イオンチャネルタンパク質）を含有する場合には、移動距離計測計の測定結果と、電極対の測定結果とを用いて、水透過性に関するパラメータのうち、例えば、非撹拌水層、および、流動電位を評価することができる。評価の原理については、後述する〔１−１．本発明の原理〕の欄にて説明する。 According to the above configuration, it is possible to evaluate, for example, the water flux and the area of the lipid bilayer among the parameters related to water permeability, using the measurement result of the distance meter and the measurement result of the electrode pair. it can. When the lipid bilayer membrane contains an ionophore or a polypeptide (for example, an ion channel protein), the measurement results of the distance meter and the measurement results of the electrode pair are used to determine the water permeability. Among the parameters, for example, the non-stirred water layer and the streaming potential can be evaluated. The principle of evaluation will be described later [1-1. Principle of the present invention].

本発明の一態様に係る脂質二重膜の水透過性の評価方法は、水流束の評価方法、非撹拌水層の評価方法、または、流動電位の評価方法であり得る。 The method for evaluating the water permeability of the lipid bilayer membrane according to one aspect of the present invention may be a method for evaluating a water flux, a method for evaluating a non-stirred water layer, or a method for evaluating a streaming potential.

本発明の一態様に係る脂質二重膜の水透過性の評価方法は、水流束、非撹拌水層、および、流動電位などを評価することができる。 The method for evaluating water permeability of a lipid bilayer membrane according to one aspect of the present invention can evaluate water flux, unstirred water layer, streaming potential, and the like.

上記の課題を解決するために、本発明の一態様に係る脂質二重膜の水透過性を制御する薬剤のスクリーニング方法は、本発明の一態様に係る脂質二重膜の水透過性の評価システムを用いる、脂質二重膜の水透過性を制御する薬剤のスクリーニング方法であって、上記管内に配置されている第１の水溶液、脂質二重膜、および、第２の水溶液からなる群から選択される少なくとも１つに薬剤の候補物質を加える添加工程と、上記管内に配置されている脂質二重膜の移動距離の計測、および、上記管内に配置されている脂質二重膜を介した電位差と電流との制御および／または計測を行う、計測工程と、上記計測工程によって得られた計測値と、参照値とを比較する比較工程と、を有することを特徴とする。 In order to solve the above problems, a method for screening a drug for controlling the water permeability of a lipid bilayer membrane according to one aspect of the present invention is an evaluation of the water permeability of a lipid bilayer membrane according to one aspect of the present invention. A method for screening a drug for controlling the water permeability of a lipid bilayer membrane using a system, which comprises a first aqueous solution, a lipid bilayer membrane, and a second aqueous solution placed in the tube. The addition step of adding a drug candidate substance to at least one selected, the measurement of the migration distance of the lipid bilayer membrane arranged in the tube, and the addition through the lipid bilayer membrane arranged in the tube It is characterized by comprising a measuring step of controlling and/or measuring the potential difference and the current, and a comparing step of comparing the measured value obtained by the measuring step with a reference value.

添加工程では、管内に配置されている第１の水溶液、脂質二重膜、および、第２の水溶液からなる群から選択される少なくとも１つに薬剤の候補物質を加える。薬剤の候補物質は、脂質二重膜自体、または、脂質二重膜に埋め込まれている物質（例えば、イオノフォア、または、ポリペプチド（例えば、イオンチャネルタンパク質））の近傍に存在するので、薬剤の候補物質は、脂質二重膜自体、または、脂質二重膜に埋め込まれている物質に作用（例えば、脂質二重膜に埋め込まれている物質の活性を、上昇または低下）し得る。 In the adding step, the drug candidate substance is added to at least one selected from the group consisting of the first aqueous solution, the lipid bilayer membrane, and the second aqueous solution arranged in the tube. Since the drug candidate substance is present in the vicinity of the lipid bilayer membrane itself or a substance (eg, ionophore or polypeptide (eg, ion channel protein)) embedded in the lipid bilayer membrane, The candidate substance may act on the lipid bilayer membrane itself or a substance embedded in the lipid bilayer membrane (for example, increase or decrease the activity of the substance embedded in the lipid bilayer membrane).

計測工程では、管内に配置されている脂質二重膜の移動距離の計測、および、上記管内に配置されている脂質二重膜を介した電位差と電流との制御および／または計測を行う。その結果、当該計測工程では、計測値（例えば、脂質二重膜の移動距離、脂質二重膜の移動速度、水流束、非撹拌水層、および、流動電位など）が得られる。 In the measuring step, the moving distance of the lipid bilayer membrane arranged in the tube is measured, and the potential difference and the current through the lipid bilayer membrane arranged in the tube are controlled and/or measured. As a result, in the measurement step, measured values (for example, the moving distance of the lipid bilayer membrane, the moving speed of the lipid bilayer membrane, the water flux, the unstirred water layer, and the streaming potential) are obtained.

薬剤の候補物質が脂質二重膜自体、または、脂質二重膜に埋め込まれている物質に作用する場合の計測値は、薬剤の候補物質が脂質二重膜自体、または、脂質二重膜に埋め込まれている物質に作用しない場合の計測値（換言すれば、参照値）と異なる。それ故に、比較工程にて計測値と参照値とを比較することによって、脂質二重膜（例えば、脂質二重膜に埋め込まれている物質）の水透過性を制御する薬剤をスクリーニングすることができる。 When the drug candidate substance acts on the lipid bilayer membrane itself or the substance embedded in the lipid bilayer membrane, the measured value is the drug candidate substance on the lipid bilayer membrane itself or on the lipid bilayer membrane. It differs from the measured value (in other words, reference value) when it does not act on the embedded substance. Therefore, by comparing the measured value and the reference value in the comparison step, it is possible to screen for a drug that controls the water permeability of the lipid bilayer membrane (for example, the substance embedded in the lipid bilayer membrane). it can.

本発明の一態様によれば、脂質二重膜の水透過性（例えば、水流束、非撹拌水層および流動電位など）、および、脂質二重膜に埋め込まれた水チャネルの水透過性（例えば、水流束、非撹拌水層および流動電位など）を簡便かつ正確に評価することができる。 According to one aspect of the present invention, the water permeability of lipid bilayer membranes (eg, water flux, unstirred water layer and streaming potential, etc.) and water permeability of water channels embedded in lipid bilayer membranes ( For example, water flux, non-stirred water layer, streaming potential, etc.) can be evaluated simply and accurately.

（ａ）〜（ｄ）は、本発明の原理を説明する図である。(A)-(d) is a figure explaining the principle of this invention. 本発明の原理を説明する図である。It is a figure explaining the principle of this invention. （ａ）〜（ｃ）は、本発明の実施例における試験結果を示す図である。(A)-(c) is a figure which shows the test result in the Example of this invention. 本発明の実施例における試験結果を示す図である。It is a figure which shows the test result in the Example of this invention. 本発明の実施例における試験結果を示す図である。It is a figure which shows the test result in the Example of this invention. （ａ）〜（ｃ）は、本発明の一態様に係る脂質二重膜の水透過性の評価システムの構成の一例を示す図である。(A)-(c) is a figure which shows an example of a structure of the evaluation system of the water permeability of the lipid bilayer membrane which concerns on 1 aspect of this invention. 本発明の一態様に係る脂質二重膜の水透過性の評価システムの構成の一例を示す図である。It is a figure showing an example of composition of an evaluation system of water permeability of a lipid bilayer membrane concerning one mode of the present invention. （ａ）は、本発明の一態様に係る脂質二重膜の水透過性の評価システムの構成の一例を示す図であり、（ｂ）および（ｃ）は、本発明の一態様に係る脂質二重膜の水透過性の評価方法の構成の一例を示す図である。(A) is a figure which shows an example of a structure of the water permeability evaluation system of the lipid bilayer membrane which concerns on 1 aspect of this invention, (b) and (c) are lipids which concern on 1 aspect of this invention. It is a figure which shows an example of a structure of the water permeability evaluation method of a bilayer membrane.

本発明の一実施形態について説明すると以下の通りであるが、本発明はこれに限定されない。本発明は、以下に説明する各構成に限定されるものではなく、特許請求の範囲に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態及び実施例にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態及び実施例についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された文献の全てが、本明細書中において参考文献として援用される。本明細書中、数値範囲に関して「Ａ〜Ｂ」と記載した場合、当該記載は「Ａ以上Ｂ以下」を意図する。 One embodiment of the present invention will be described below, but the present invention is not limited thereto. The present invention is not limited to each configuration described below, and various modifications can be made within the scope shown in the claims, and the technical means disclosed in different embodiments and examples can be applied. Embodiments and examples obtained by appropriately combining them are also included in the technical scope of the present invention. Moreover, all the documents described in this specification are used as a reference in this specification. In the present specification, when “A to B” is described for the numerical range, the description means “A or more and B or less”.

〔１．脂質二重膜の水透過性の評価システム〕
〔１−１．本発明の原理〕
図１および図２を参照しながら、本発明の原理を説明する。 [1. Evaluation system for water permeability of lipid bilayer membranes]
[1-1. Principle of the present invention]
The principle of the present invention will be described with reference to FIGS. 1 and 2.

＜Ａ．水透過性の評価＞
本明細書にて水透過性の評価とは、水流束の発生の有無の評価、または、水流束の大きさ（例えば、水の透過係数）の評価、を意図する。 <A. Evaluation of water permeability>
In the present specification, the evaluation of water permeability is intended to evaluate whether or not a water flux is generated, or to evaluate the magnitude of the water flux (for example, water permeability coefficient).

図１（ａ）に示すように、まず、所定の浸透圧濃度である第１の水溶液（低浸透圧電解質溶液）、脂質二重膜を形成するためのリン脂質を溶解した油、および、上記第１の水溶液よりも高い浸透圧濃度である第２の水溶液（高浸透圧電解質溶液）を、この順番にて管の中に配置する。リン脂質を、両水溶液か油にあらかじめ加えてあるので、水溶液と油との界面（油―水界面）にリン脂質の単分子層が形成される。なお、当該管には、図１（ａ）および（ｂ）に示されている第２の水溶液よりも右側に、図６（ｃ）に示すような開閉部が設けられている。 As shown in FIG. 1A, first, a first aqueous solution (low osmotic pressure electrolyte solution) having a predetermined osmotic pressure concentration, an oil in which a phospholipid for forming a lipid bilayer is dissolved, and the above A second aqueous solution (high osmotic electrolyte solution) having a higher osmotic pressure concentration than the first aqueous solution is placed in the tube in this order. Since the phospholipid has been added to both aqueous solutions or oil in advance, a monolayer of phospholipid is formed at the interface between the aqueous solution and the oil (oil-water interface). The tube is provided with an opening/closing part as shown in FIG. 6(c) on the right side of the second aqueous solution shown in FIGS. 1(a) and 1(b).

次いで、図１（ａ）に示すように、管の開口から油の中へ細管を挿入し、当該細管を用いて、余分な油を除去する。余分な油を除去すると、図１（ｂ）に示すように、第１の水溶液と第２の水溶液とが、接近し、２枚の単分子層が互いに接触する。そして、第１の水溶液と第２の水溶液とが接触した箇所に、脂質二重膜が形成される。 Next, as shown in FIG. 1(a), a thin tube is inserted into the oil through the opening of the tube, and excess oil is removed using the thin tube. When the excess oil is removed, the first aqueous solution and the second aqueous solution come close to each other and the two monolayers contact each other, as shown in FIG. 1(b). Then, a lipid bilayer membrane is formed at the location where the first aqueous solution and the second aqueous solution are in contact with each other.

図１（ｂ）に示すように、第１の水溶液（低浸透圧電解質溶液）、脂質二重膜、および、第２の水溶液（高浸透圧電解質溶液）が、この順番にて管の中に配置されると、脂質二重膜を介して、第１の水溶液から第２の水溶液に向かって水流束が生じる。当該水流束は、第２の水溶液の体積を増加させる。 As shown in FIG. 1(b), the first aqueous solution (low osmotic pressure electrolyte solution), the lipid bilayer membrane, and the second aqueous solution (high osmotic pressure electrolyte solution) were placed in this order in the tube. When placed, a water flux is created from the first aqueous solution to the second aqueous solution through the lipid bilayer membrane. The water flux increases the volume of the second aqueous solution.

このとき、開閉部（例えば、脂質二重膜と開閉部とによって第２の水溶液を挟むように設けられている、開閉部）を閉じて第２の水溶液が脂質二重膜とは反対の側に移動することを妨げれば、体積が増加した第２の水溶液は、脂質二重膜に対して、第１の水溶液に向かう力を加える。これによって、脂質二重膜は、第１の水溶液に向かって移動する。 At this time, the opening/closing part (for example, the opening/closing part provided so that the second aqueous solution is sandwiched between the lipid bilayer membrane and the opening/closing part) is closed so that the second aqueous solution is on the side opposite to the lipid bilayer membrane. The second aqueous solution having the increased volume exerts a force on the lipid bilayer membrane toward the first aqueous solution if it is prevented from moving to the first aqueous solution. As a result, the lipid bilayer moves toward the first aqueous solution.

脂質二重膜の移動速度を、移動距離計測計によって測定する。管の断面積と、脂質二重膜の移動距離とから、水の移動体積を算出することができる。 The moving speed of the lipid bilayer membrane is measured by a moving distance meter. The moving volume of water can be calculated from the cross-sectional area of the tube and the moving distance of the lipid bilayer membrane.

電極対を用いれば、脂質二重膜の静電膜容量（μＦ）を測定することができ、当該静電膜容量から、脂質二重膜の面積を算出することができる。具体的には、測定された静電膜容量を、脂質二重膜を形成する脂質の特性膜容量（μＦ／ｃｍ２；ヘキサデカンが油相の場合、０．７μＦ／ｃｍ２）にて除することにより、脂質二重膜の面積を算出することができる。あるいは、画像から脂質二重膜の面積を算出することもできる。 By using the electrode pair, the electrostatic membrane capacity (μF) of the lipid bilayer membrane can be measured, and the area of the lipid bilayer membrane can be calculated from the electrostatic membrane capacity. Specifically, the measured electrostatic membrane capacity is divided by the characteristic membrane capacity of the lipid that forms the lipid bilayer (μF/cm 2 ; when hexadecane is the oil phase, 0.7 μF/cm 2 ). Thus, the area of the lipid bilayer membrane can be calculated. Alternatively, the area of the lipid bilayer membrane can be calculated from the image.

水透過性は、水の移動体積を、脂質二重膜の面積にて除することにより、算出することができる。水透過性を浸透圧差濃度差で除したものが、水透過係数である。 Water permeability can be calculated by dividing the moving volume of water by the area of the lipid bilayer membrane. The water permeability is obtained by dividing the water permeability by the osmotic pressure difference and the concentration difference.

＜Ｂ．非撹拌水層の評価＞
本明細書において、非撹拌水層の評価とは、非撹拌水層の発生の有無の評価、または、非撹拌水層の影響を考慮した浸透圧差の評価、を意図する。より具体的に、本明細書において、非撹拌水層の評価とは、例えば、非撹拌水層を考慮した上での、水透過性の評価を意図する。 <B. Evaluation of unstirred water layer>
In the present specification, the evaluation of the non-stirred water layer means the evaluation of the presence or absence of the non-stirred water layer or the evaluation of the osmotic pressure difference in consideration of the influence of the non-stirred water layer. More specifically, in the present specification, the evaluation of the non-stirred water layer means, for example, the evaluation of the water permeability in consideration of the non-stirred water layer.

図２に示すように、所定の浸透圧濃度である第１の水溶液（低浸透圧電解質溶液）、脂質二重膜、および、上記第１の水溶液よりも高い浸透圧濃度である第２の水溶液（高浸透圧電解質溶液）を、この順番にて管の中に配置すると、脂質二重膜を介して、第１の水溶液から第２の水溶液に向かって水流束が生じる。この結果、脂質二重膜の近傍で溶質濃度が変化する。水流束の上流側の膜近傍では溶質濃度が増大し、下流では減少する。これが非攪拌層である。非攪拌層により水の駆動力は減弱し、水流束も減少する。当該水の駆動力の減弱を考慮しない場合には、脂質二重膜の水の透過性を過小に評価してしまうという問題が生じる。それ故に、脂質二重膜の水の透過性を正確に評価するためには、脂質二重膜の近傍におけるイオン濃度の変化を評価する必要がある。 As shown in FIG. 2, a first aqueous solution (low osmotic electrolyte solution) having a predetermined osmotic pressure concentration, a lipid bilayer membrane, and a second aqueous solution having an osmotic pressure concentration higher than that of the first aqueous solution. When the (hyperosmotic electrolyte solution) is placed in the tube in this order, a water flux is generated from the first aqueous solution to the second aqueous solution through the lipid bilayer membrane. As a result, the solute concentration changes near the lipid bilayer membrane. The solute concentration increases near the membrane on the upstream side of the water flux and decreases on the downstream side. This is the non-stirred layer. The non-stirred layer reduces the driving force of water and also reduces the water flux. If the reduction of the driving force of the water is not taken into consideration, there arises a problem that the water permeability of the lipid bilayer membrane is underestimated. Therefore, in order to accurately evaluate the water permeability of the lipid bilayer membrane, it is necessary to evaluate the change in ion concentration in the vicinity of the lipid bilayer membrane.

このとき、脂質二重膜が、イオノフォア、ポリペプチド（例えば、イオンチャネルタンパク質）などを含有すると、これらによって、脂質二重膜を介したイオンの移動が可能になる。 At this time, if the lipid bilayer membrane contains an ionophore, a polypeptide (for example, an ion channel protein), etc., these allow the transfer of ions through the lipid bilayer membrane.

脂質二重膜に所定のランプ波（例えば、Ａ［ｍＶ］〜−Ａ［ｍＶ］）を印加した状態にて、電流および電圧を測定して電流−電圧曲線を描き、各膜電位（例えば、＋１００ ｍＶと−１００ ｍＶと）でのコンダクタンス比を求める。脂質二重膜内に形成される対称構造を有するチャネルでは、両水溶液のイオン組成が同じであれば電流−電圧曲線は、理論上は対称になる。ところが非攪拌水層の発生に伴って、脂質二重膜近傍のイオン組成が非対称となり電流−電圧曲線が非対称になり、当該非対称性から、非攪拌水層内のイオン濃度を推定することができる。 With a predetermined ramp wave (for example, A [mV] to −A [mV]) applied to the lipid bilayer, current and voltage are measured to draw a current-voltage curve, and each membrane potential (for example, The conductance ratio at +100 mV and −100 mV) is obtained. In a channel having a symmetrical structure formed in a lipid bilayer membrane, if the ionic composition of both aqueous solutions is the same, the current-voltage curve is theoretically symmetrical. However, with the generation of the non-stirred water layer, the ionic composition near the lipid bilayer becomes asymmetric and the current-voltage curve becomes asymmetric, and the ion concentration in the non-stirred water layer can be estimated from the asymmetry. ..

コンダクタンス比は、非撹拌水層の形成に伴うイオン（例えば、ナトリウムイオン）濃度の比であると考えられる。当該コンダクタンス比に基づいて、非撹拌水層の影響を加味した、脂質二重膜の近傍での浸透圧調節物質（例えば、尿素）の真の濃度、換言すれば、非撹拌水層の影響を考慮した真の浸透圧差を推定できる。 The conductance ratio is considered to be the ratio of the concentration of ions (for example, sodium ions) accompanying the formation of the non-stirred water layer. Based on the conductance ratio, the true concentration of the osmotic pressure adjusting substance (for example, urea) in the vicinity of the lipid bilayer including the effect of the non-stirred water layer, in other words, the effect of the non-stirred water layer The true osmotic pressure difference can be estimated.

なお、電位Ａ［ｍＶ］時の非撹拌水層のコンダクタンスの絶対値をＧ（＋）とし、電位−Ａ［ｍＶ］時の非撹拌水層のコンダクタンスの絶対値をＧ（−）とすれば、電位Ａ［ｍＶ］時における脂質二重膜の真のコンダクタンスＧｍは、「Ｇｍ＝（Ｇ（＋）＋Ｇ（−））／２」にて算出することができる。また、浸透圧調節物質（例えば、尿素）を含有する水溶液の側の非撹拌水層のコンダクタンスの絶対値Ｇ（−）と、脂質二重膜のコンダクタンスＧｍとの誤差Ｇ’は、「Ｇ’＝[（Ｇｍ−Ｇ（−））／Ｇｍ]×１００」にて算出することができる。 If the absolute value of the conductance of the non-stirred water layer at the potential A [mV] is G(+) and the absolute value of the conductance of the non-stirred water layer at the potential −A [mV] is G(−). The true conductance Gm of the lipid bilayer membrane at the potential A [mV] can be calculated by “Gm=(G(+)+G(−))/2”. Further, the error G′ between the absolute value G(−) of the conductance of the non-stirred water layer on the side of the aqueous solution containing the osmotic pressure adjusting substance (for example, urea) and the conductance Gm of the lipid bilayer is “G′”. =[(Gm−G(−))/Gm]×100”.

コンダクタンス比から、非撹拌水層の影響を考慮した真の浸透圧差を求めることができる。例えば、計算式、「真の浸透圧差＝見かけの浸透圧差×１００−Ｇ’（％）／１００」に基づいて、非撹拌水層の影響を考慮した真の浸透圧差を求めることができる。 From the conductance ratio, it is possible to obtain the true osmotic pressure difference considering the effect of the non-stirred water layer. For example, the true osmotic pressure difference in consideration of the influence of the non-stirred water layer can be obtained based on the calculation formula, “true osmotic pressure difference=apparent osmotic pressure difference×100−G′(%)/100”.

＜Ｃ．流動電位の評価＞
非攪拌層の評価のために、脂質二重膜にグラミシジンなどのイオンチャネルを組み込み、チャネル電流の非対称性から非攪拌層を評価するが、その際、イオンチャネルの存在によって流動電位が発生する。ここで発生する流動電位の値は１ｍＶ以下であるが、これを補正してチャネル電流の非対称性を正確に評価することが目的である。
本明細書において、流動電位の評価とは、流動電位の発生の有無の評価、または、流動電位の大きさ（例えば、水／イオン流束比）の評価、を意図する。より具体的に、本明細書において、流動電位の評価とは、例えば、流動電位を考慮した上での、水流束の評価を意図する。 <C. Evaluation of streaming potential>
In order to evaluate the non-stirred layer, an ion channel such as gramicidin is incorporated into the lipid bilayer membrane, and the non-stirred layer is evaluated based on the asymmetry of the channel current. At that time, a streaming potential is generated due to the presence of the ion channel. The value of the streaming potential generated here is 1 mV or less, and the purpose is to correct this and accurately evaluate the asymmetry of the channel current.
In the present specification, the evaluation of the streaming potential is intended to evaluate whether or not the streaming potential is generated, or to evaluate the magnitude of the streaming potential (for example, water/ion flux ratio). More specifically, in the present specification, the evaluation of the streaming potential means the evaluation of the water flux in consideration of the streaming potential, for example.

図２に示すように、所定の浸透圧濃度である第１の水溶液（低浸透圧電解質溶液）、脂質二重膜、および、上記第１の水溶液よりも高い浸透圧濃度である第２の水溶液（高浸透圧電解質溶液）を、この順番にて管の中に配置する。第１の水溶液および第２の水溶液中に電極を設置する。このとき、脂質二重膜が、イオノフォア、ポリペプチド（例えば、膜タンパク質）、などを含有すると、浸透圧濃度差によって、脂質二重膜に組み込まれたイオンチャネル内を、水の流れに押し流されてイオンが移動する。このイオン流によって流動電位が発生する。この時パッチクランプアンプのモードをcurrent clamp modeとして電流をゼロに設定することによって、流動電位を観察することができる。流動電位からチャネルを流れる水−イオン流束比（Ｊｗ／Ｊｉ）を求めることができる。 As shown in FIG. 2, a first aqueous solution (low osmotic electrolyte solution) having a predetermined osmotic pressure concentration, a lipid bilayer membrane, and a second aqueous solution having an osmotic pressure concentration higher than that of the first aqueous solution. The (high osmotic electrolyte solution) is placed in the tube in this order. The electrodes are placed in the first aqueous solution and the second aqueous solution. At this time, if the lipid bilayer membrane contains ionophores, polypeptides (eg, membrane proteins), etc., the osmotic pressure difference causes the ion channels incorporated in the lipid bilayer membrane to be swept by the water flow. Ions move. A streaming potential is generated by this ion flow. At this time, by setting the current clamp mode to the current clamp mode of the patch clamp amplifier, the streaming potential can be observed. The water-ion flux ratio (Jw/Ji) flowing through the channel can be obtained from the streaming potential.

脂質二重膜に電圧を印加すると、実際には、流動電位の分の誤差が加わった電圧が脂質二重膜に印加される。流動電位の分の誤差を予め考慮した電圧を脂質二重膜に印加すれば、脂質二重膜に所定の電圧を正確に印加することができる。 When a voltage is applied to the lipid bilayer membrane, a voltage to which an error corresponding to the streaming potential is added is actually applied to the lipid bilayer membrane. By applying a voltage to the lipid bilayer membrane in which an error corresponding to the streaming potential is taken into consideration, a predetermined voltage can be accurately applied to the lipid bilayer membrane.

〔１−２．評価システムの構成〕
本実施の形態の脂質二重膜の水透過性の評価システムは、内部に、所定の浸透圧濃度である第１の水溶液、脂質二重膜、および、上記第１の水溶液よりも高い浸透圧濃度である第２の水溶液をこの順番にて配置するための管であって、当該管を開閉する開閉部を備えている管と、上記脂質二重膜の移動距離を計測するための移動距離計測計と、上記脂質二重膜を介した電位差と電流とを制御および計測（または、制御および／または計測）するための電極対と、を備えている。 [1-2. Evaluation system configuration]
The water permeability evaluation system for lipid bilayer membranes of the present embodiment has a first aqueous solution having a predetermined osmotic pressure concentration, a lipid bilayer membrane, and an osmotic pressure higher than that of the first aqueous solution. A tube for arranging the second aqueous solution having a concentration in this order, the tube having an opening/closing section for opening and closing the tube, and a moving distance for measuring the moving distance of the lipid bilayer membrane. A measuring instrument and an electrode pair for controlling and measuring (or controlling and/or measuring) the potential difference and the electric current through the lipid bilayer membrane are provided.

管の中に第１の水溶液、脂質二重膜、および、第２の水溶液を配置する方法は、特に限定されず、細管を用いて配置してもよいし、後述する〔１−３．評価システムの構成の一例〕に記載の構成を用いて配置してもよい。 The method for arranging the first aqueous solution, the lipid bilayer membrane, and the second aqueous solution in the tube is not particularly limited, and the tube may be arranged by using a thin tube, which will be described later [1-3. An example of the configuration of the evaluation system] may be used.

上記第１の水溶液は、第２の水溶液よりも浸透圧濃度が低い溶液であればよく、具体的な組成は、特に限定されない。一方、第２の水溶液は、第１の水溶液よりも浸透圧濃度が高い溶液であればよく、具体的な組成は、特に限定されない。第１の水溶液の浸透圧濃度の値、および、第２の水溶液の浸透圧濃度の値は、所望の値に設定され得、その値は限定されない。 The first aqueous solution may be a solution having an osmotic pressure concentration lower than that of the second aqueous solution, and the specific composition is not particularly limited. On the other hand, the second aqueous solution may be a solution having an osmotic pressure concentration higher than that of the first aqueous solution, and the specific composition is not particularly limited. The value of the osmotic pressure concentration of the first aqueous solution and the value of the osmotic pressure concentration of the second aqueous solution can be set to desired values, and the values are not limited.

第１の水溶液および第２の水溶液の溶媒としては、水が用いられ得る。 Water may be used as a solvent for the first aqueous solution and the second aqueous solution.

第１の水溶液、および、第２の水溶液は、所望の浸透圧濃度を実現するために、様々な溶質成分（例えば、塩、塩基、浸透圧調節物質）を、所望の濃度にて含み得る。上記塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、リン酸、および、アミノ酸塩を挙げることができる。上記塩基としては、例えば、グアニン、アデニン、チミン、および、シトシンを挙げることができる。上記浸透圧調節物質としては、例えば、尿素、スクロース、ソルビトール、ポリエチレングリコールを挙げることができる。 The first aqueous solution and the second aqueous solution may include various solute components (eg, salts, bases, osmolytes) at desired concentrations to achieve the desired osmolarity. Examples of the salt include sodium salt, potassium salt, magnesium salt, calcium salt, phosphoric acid, and amino acid salt. Examples of the base include guanine, adenine, thymine, and cytosine. Examples of the osmotic pressure adjusting substance include urea, sucrose, sorbitol, and polyethylene glycol.

上記脂質二重膜は、例えば、脂質単分子層同士を接触させることによって形成され得る。脂質二重膜の内側では、構成成分である脂質の疎水性領域同士が向かい合うように配置され、脂質二重膜の外側に、構成成分である脂質の親水性領域が配置され得る。つまり、当該脂質二重膜は細胞膜と同じ構造を有し得る。 The lipid bilayer membrane can be formed, for example, by bringing lipid monolayers into contact with each other. Inside the lipid bilayer membrane, the hydrophobic regions of the constituent lipid can be arranged so as to face each other, and outside the lipid bilayer membrane, the hydrophilic region of the component lipid can be arranged. That is, the lipid bilayer membrane can have the same structure as the cell membrane.

脂質二重膜を構成する脂質は、特に限定されない。当該脂質としては、例えば、リン脂質、および、コレステロールを挙げることができる。リン脂質としては、例えば、ホスホコリン、ホスファチジルコリン、ジフィタノイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、スフィンゴミエリン、および、ホスファチジルグリセロール等が挙げられる。 The lipid that constitutes the lipid bilayer membrane is not particularly limited. Examples of the lipid include phospholipid and cholesterol. Examples of the phospholipid include phosphocholine, phosphatidylcholine, diphytanoylphosphatidylcholine, dipalmitoylphosphatidylcholine, palmitoyloleoylphosphatidylcholine, dioleoylphosphatidylcholine, phosphatidylethanolamine, phosphatidylserine, sphingomyelin, and phosphatidylglycerol.

脂質二重膜は、ポリペプチド、チャネルを含有するものであり得る。上記構成であれば、様々な機能（例えば、イオン透過機能）を有する脂質二重膜を再現することができる。上記ペプチドとしては、例えば、グラミシジンを挙げることができる。上記ポリペプチドとしては、例えば、膜貫通タンパク質、トランスポータ、および、膜貫通型の輸送タンパク質を挙げることができる。 The lipid bilayer membrane may contain a polypeptide and a channel. With the above configuration, a lipid bilayer membrane having various functions (for example, an ion permeation function) can be reproduced. Examples of the peptide include gramicidin. Examples of the above-mentioned polypeptide include a transmembrane protein, a transporter, and a transmembrane transport protein.

上記管は、その内部に、脂質二重膜を挟むように、第１の水溶液および第２の水溶液を配置し得るものであればよく、その構成は限定されない。 The tube is not particularly limited as long as the first aqueous solution and the second aqueous solution can be placed inside the tube so as to sandwich the lipid bilayer membrane.

管の材質は、特に限定されないが、油によって変形および腐食しない材質が好ましい。例えば、管の材質としては、ガラス、プラスチック、アクリル、および、テフロン（登録商標）等があげられる。耐薬品性に優れると共に、管の内部に配置されている脂質二重膜の光学観察を容易に行うことができるという観点から、管の材質は、ガラスが好ましい。 The material of the tube is not particularly limited, but a material that is not deformed or corroded by oil is preferable. For example, examples of the material of the tube include glass, plastic, acrylic, Teflon (registered trademark), and the like. The tube is preferably made of glass from the viewpoints of excellent chemical resistance and facilitating optical observation of the lipid bilayer membrane disposed inside the tube.

管の長さは、特に限定されず、所望の長さに設定することができる。管の長さは、例えば、５ｍｍ〜１０００ｍｍ、１０ｍｍ〜５００ｍｍ、１０ｍｍ〜１００ｍｍ、１０ｍｍ〜５０ｍｍ、または、１０ｍｍ〜３０ｍｍであってもよい。管の長さを短く設定できるので、本実施の形態の評価システムを小さく構成することができる。 The length of the tube is not particularly limited and can be set to a desired length. The length of the tube may be, for example, 5 mm to 1000 mm, 10 mm to 500 mm, 10 mm to 100 mm, 10 mm to 50 mm, or 10 mm to 30 mm. Since the length of the pipe can be set short, the evaluation system of the present embodiment can be made small.

管の断面の形状は、特に限定されないが、円形であることが好ましい。当該円の直径は、特に限定されず、例えば、０．１ｍｍ〜１００ｍｍ、１ｍｍ〜１０ｍｍ、または、１ｍｍ〜５ｍｍであってもよい。 The shape of the cross section of the tube is not particularly limited, but it is preferably circular. The diameter of the circle is not particularly limited and may be, for example, 0.1 mm to 100 mm, 1 mm to 10 mm, or 1 mm to 5 mm.

上記管は、当該管を開閉する開閉部を備え得る。当該構成によれば、管を閉鎖した状態にて、脂質二重膜の水透過性をより正確に評価することができる（例えば、後述する実施例におけるＣｌｏｓｅｄ法を参照）。また、当該構成によれば、管の内部に第１の水溶液、および／または、第２の水溶液を導入するタイミングを制御することができる。 The pipe may include an opening/closing unit that opens/closes the pipe. With this configuration, the water permeability of the lipid bilayer membrane can be evaluated more accurately with the tube closed (see, for example, the Closed method in Examples described later). Moreover, according to the said structure, the timing which introduce|transduces a 1st aqueous solution and/or a 2nd aqueous solution into a pipe can be controlled.

開閉部は、（ｉ）管を閉じる動作、および、管を開ける動作を、繰り返し行うものであってもよいし、（ｉｉ）開いている管を閉じる動作を行った後、管を閉じた状態に維持するものであってもよいし、（ｉｉｉ）閉じている管を開く動作を行った後、管を開いた状態に維持するものであってもよい。上記（ｉｉ）の構成であれば、脂質二重膜の水透過性をより正確に評価することができる（例えば、後述する実施例におけるＣｌｏｓｅｄ法を参照）。上記（ｉｉｉ）の構成であれば、脂質二重膜の水透過性を評価した後、管の内部に存在する不要な物質を容易に除去することができる。上記（ｉ）の構成であれば、上記（ｉｉ）の構成にて行い得る事項、および、上記（ｉｉｉ）の構成にて行い得る事項の両方を行うことができる。 The opening/closing unit may repeat (i) the operation of closing the pipe and the operation of opening the pipe, or (ii) the state of closing the pipe after performing the operation of closing the open pipe. May be maintained, or (iii) the operation of opening the closed tube may be performed and then the tube may be maintained in the open state. With the above configuration (ii), the water permeability of the lipid bilayer membrane can be evaluated more accurately (see, for example, the Closed method in Examples described later). With the above configuration (iii), after evaluating the water permeability of the lipid bilayer membrane, unnecessary substances existing inside the tube can be easily removed. With the configuration of (i) above, both the items that can be performed in the configuration of (ii) and the items that can be performed in the configuration of (iii) can be performed.

開閉部は、様々な様式にて構成され得、例えば、開閉可能なバルブ、または、管を遮断可能な板などによって構成され得る。 The opening/closing part can be configured in various ways, for example, by a valve that can be opened and closed, or a plate that can shut off a tube.

管に設けられる開閉部の数は、特に限定されず、１つ以上であってもよいし、２つ以上であってもよいし、３つ以上であってもよい。 The number of opening/closing sections provided in the pipe is not particularly limited, and may be one or more, two or more, or three or more.

開閉部が設けられる位置は、特に限定されないが、例えば、後述する第１の開口と同じ位置に設けられてもよく、第１の開口の近傍に設けられてもよく、後述する第２の開口と同じ位置に設けられてもよく、第２の開口の近傍に設けられてもよい。 The position at which the opening/closing portion is provided is not particularly limited, but for example, it may be provided at the same position as the first opening described later, may be provided in the vicinity of the first opening, or the second opening described later. It may be provided at the same position as, or may be provided in the vicinity of the second opening.

開閉部は、当該開閉部と脂質二重膜とによって第２の水溶液を挟むことが可能な位置に、設けられてもよい。上記構成であれば、第２の水溶液が脂質二重膜とは反対の側に移動することを妨げることができるので、脂質二重膜の水透過性をより正確に評価することができる（例えば、後述する実施例におけるＣｌｏｓｅｄ法を参照）。 The opening/closing part may be provided at a position where the second aqueous solution can be sandwiched between the opening/closing part and the lipid bilayer membrane. With the above configuration, it is possible to prevent the second aqueous solution from moving to the side opposite to the lipid bilayer membrane, so that the water permeability of the lipid bilayer membrane can be evaluated more accurately (for example, , See the Closed method in Examples described later).

本実施の形態の脂質二重膜の水透過性の評価システムは、脂質二重膜の移動距離を計測するための移動距離計測計を備え得る。 The evaluation system for water permeability of the lipid bilayer membrane of the present embodiment may include a moving distance meter for measuring the moving distance of the lipid bilayer membrane.

移動距離計測計としては、脂質二重膜の移動距離を計測できるものであればよく、その構成は、特に限定されない。移動距離計測計は、例えば、脂質二重膜の像（脂質二重膜の移動距離の算出に使用される像）を撮影する撮影部（例えば、カメラ）と、時間の経過（例えば、脂質二重膜の移動に要した時間）を計測する時間計測部（例えば、タイマー）とを備え得る。移動距離計測計は、撮影部によって得られた複数の像と、時間計測部によって計測された時間とから、脂質二重膜の移動速度を算出する算出部を備えていてもよい。 The moving distance measuring device is not particularly limited as long as it can measure the moving distance of the lipid bilayer membrane. The moving distance measuring device includes, for example, an imaging unit (for example, a camera) that takes an image of the lipid bilayer membrane (an image used for calculating the moving distance of the lipid bilayer membrane) and a passage of time (for example, the lipid bilayer). A time measuring unit (for example, a timer) that measures the time required for the movement of the bilayer membrane can be provided. The moving distance meter may include a calculating unit that calculates the moving speed of the lipid bilayer membrane from the plurality of images obtained by the photographing unit and the time measured by the time measuring unit.

当該算出部は、脂質二重膜の移動速度を算出のみならず、（１）水の移動体積の算出、（２）脂質二重膜の面積の算出、（３）水流束の算出、（４）電流−電圧曲線の作成、（５）各膜電位におけるコンダクタンス比の算出、（６）コンダクタンスＧｍの算出、（７）誤差Ｇ’の算出、および、（８）非撹拌水層の影響を考慮した真の浸透圧差の算出、からなる群から選択される少なくとも１つ（好ましくは全て）を行い得る。上記構成であれば、簡単な構成の評価システムを用いて、水流束の評価、非撹拌水層の評価、または、流動電位の評価を行うことができる。 The calculation unit not only calculates the moving speed of the lipid bilayer membrane, but also calculates (1) the moving volume of water, (2) the area of the lipid bilayer membrane, (3) the water flux, and (4) ) Creation of current-voltage curve, (5) Calculation of conductance ratio at each membrane potential, (6) Calculation of conductance Gm, (7) Calculation of error G′, and (8) Considering influence of non-stirred water layer At least one (preferably all) selected from the group consisting of: With the above configuration, the evaluation of the water flux, the evaluation of the non-stirred water layer, or the evaluation of the streaming potential can be performed using the evaluation system having a simple structure.

当該算出部は、移動距離計測計の計測結果、および、後述する電極対の測定結果に基づいて、後述する〔４．本発明の別の態様〕の欄に記載の「上記脂質二重膜の移動速度として浸透圧濃度差に従った水流束を測定すると同時に、電気生理学的に静電容量として膜面積を測定し、上記水流束および上記膜面積に基づいて、単位膜面積当たりの水流束を求める工程」または「上記脂質二重膜の移動速度として浸透圧濃度差に従った水流束を測定すると同時に、電気生理学的にグラミシジンチャネルの電流−電圧曲線を測定し、電流−電圧曲線の非対称性から非撹拌水層の局所濃度を推定し、当該局所濃度によって上記水流束を補正する工程」を行ってもよい。 The calculation unit will be described later on the basis of the measurement result of the moving distance meter and the measurement result of the electrode pair described later [4. Another aspect of the present invention] described in the section "at the same time as measuring the water flux according to the osmotic concentration difference as the migration rate of the lipid bilayer membrane, electrophysiologically measure the membrane area as capacitance, "A step of determining a water flux per unit membrane area based on the water flux and the membrane area" or "measuring the water flux according to the osmotic concentration difference as the moving speed of the lipid bilayer membrane, and at the same time, electrophysiologically The step of measuring the current-voltage curve of the gramicidin channel, estimating the local concentration of the unstirred water layer from the asymmetry of the current-voltage curve, and correcting the water flux by the local concentration may be performed.

上述した算出部は、移動距離計測計の一部分として構成され得るが、移動距離計測計とは別に構成されてもよい。例えば、移動距離計測計および／または電極対と接続された、移動距離計測計および電極対とは別のものとして、構成されてもよい。 The above-described calculation unit may be configured as a part of the travel distance meter, but may be configured separately from the travel distance meter. For example, it may be configured as a separate device from the distance measuring device and the electrode pair, which is connected to the distance measuring device and/or the electrode pair.

上記算出部の構成は、特に限定されず、集積回路（ＩＣチップ）等に形成された論理回路（ハードウェア）によって実現されてもよいし、ソフトウェアによって実現されてもよい。後者の場合、算出部は、各機能を実現するソフトウェアであるプログラムの命令を実行するコンピュータを備え得る。このコンピュータは、例えば少なくとも１つのプロセッサ（制御装置）を備えていると共に、上記プログラムを記憶したコンピュータ読み取り可能な少なくとも１つの記録媒体を備えている。そして、上記コンピュータにおいて、上記プロセッサが上記プログラムを上記記録媒体から読み取って実行することにより、本発明の目的が達成される。上記プロセッサとしては、例えばＣＰＵ（Central Processing Unit）を用いることができる。上記記録媒体としては、「一時的でない有形の媒体」、例えば、ＲＯＭ（Read Only Memory）等の他、テープ、ディスク、カード、半導体メモリ、プログラマブルな論理回路などを用いることができる。また、上記プログラムを展開するＲＡＭ（Random Access Memory）などをさらに備えていてもよい。また、上記プログラムは、該プログラムを伝送可能な任意の伝送媒体（通信ネットワークや放送波等）を介して上記コンピュータに供給されてもよい。なお、本発明の一態様は、上記プログラムが電子的な伝送によって具現化された、搬送波に埋め込まれたデータ信号の形態でも実現され得る。 The configuration of the calculation unit is not particularly limited, and may be realized by a logic circuit (hardware) formed in an integrated circuit (IC chip) or the like, or may be realized by software. In the latter case, the calculation unit may include a computer that executes the instructions of a program that is software that realizes each function. The computer includes, for example, at least one processor (control device) and at least one computer-readable recording medium that stores the program. Then, in the computer, the processor reads the program from the recording medium and executes the program to achieve the object of the present invention. As the processor, for example, a CPU (Central Processing Unit) can be used. As the recording medium, a "non-transitory tangible medium" such as a ROM (Read Only Memory), a tape, a disk, a card, a semiconductor memory, a programmable logic circuit, or the like can be used. Further, a RAM (Random Access Memory) for expanding the program may be further provided. The program may be supplied to the computer via any transmission medium (communication network, broadcast wave, etc.) capable of transmitting the program. Note that one aspect of the present invention can also be realized in the form of a data signal embedded in a carrier wave, in which the program is embodied by electronic transmission.

本実施の形態の脂質二重膜の水透過性の評価システムは、脂質二重膜を介した電位差と電流とを制御および計測（または、制御および／または計測）するための電極対を備え得る。当該電極対は、脂質二重膜の膜容量も計測し得る。当該電極対は、水透過性の評価に必要な、あらゆる電気的情報を取得するために用いられ得る。電極対としては、市販の電極対（例えば、塩化銀電極）を用いることができる。 The lipid bilayer membrane water permeability evaluation system of the present embodiment may include an electrode pair for controlling and measuring (or controlling and/or measuring) a potential difference and a current through the lipid bilayer membrane. .. The electrode pair can also measure the membrane capacity of the lipid bilayer. The electrode pair can be used to obtain all the electrical information needed to assess water permeability. A commercially available electrode pair (for example, a silver chloride electrode) can be used as the electrode pair.

本実施の形態の脂質二重膜の水透過性の評価システムは、水流束の評価システム、非撹拌水層の評価システム、または、流動電位の評価システムとして使用することができる。 The water permeability evaluation system of the lipid bilayer membrane of the present embodiment can be used as a water flux evaluation system, a non-stirred water layer evaluation system, or a streaming potential evaluation system.

〔１−３．評価システムの構成の一例〕
本実施の形態の脂質二重膜の水透過性の評価システムは、脂質二重膜を形成することが可能な管、または、当該管を有する脂質二重膜形成装置を備えていてもよい。以下では、図６および図７を参照しながら、当該管、および、当該脂質二重膜形成装置について説明する。 [1-3. Example of configuration of evaluation system]
The lipid bilayer membrane water permeability evaluation system of the present embodiment may include a tube capable of forming a lipid bilayer membrane, or a lipid bilayer membrane forming apparatus having the tube. Hereinafter, the tube and the lipid bilayer forming apparatus will be described with reference to FIGS. 6 and 7.

６（ａ）および図６（ｂ）に示すように、管５は、管５内に第１の水溶液１を導入するための第１の開口６と、管５内に第２の水溶液２を導入するための第２の開口７と、第１の開口６と第２の開口７との間にて管５に設けられている第３の開口８であって、第３の開口から管５内に配置されている、脂質二重膜を形成するための油を吸引するための第３の開口８と、を備えている。 As shown in FIG. 6( a) and FIG. 6( b ), the pipe 5 has a first opening 6 for introducing the first aqueous solution 1 into the pipe 5 and a second aqueous solution 2 in the pipe 5. A second opening 7 for introducing, and a third opening 8 provided in the pipe 5 between the first opening 6 and the second opening 7, the third opening 8 extending from the third opening to the pipe 5 A third opening 8 disposed therein for suctioning oil to form a lipid bilayer.

管５内に充填される油、第１の水溶液１、および、第２の水溶液２からなる群から選択される少なくとも１つには、脂質一重膜を形成するための脂質が含まれ得る。図６（ａ）の矢印にて示すように管５内に第１の水溶液１および第２の水溶液２が導入された後、第１の水溶液１および第２の水溶液２が管５内を移動しているとき、および／または、第１の水溶液１と第２の水溶液２とが管５内で接触したときに、第１の水溶液１および第２の水溶液２の各々を覆うように、脂質一重膜が形成される。このとき、管５には油が充填されているので、脂質一重膜を形成する脂質は、自身の疎水性領域を油の側に配置し、自身の親水性領域を第１の水溶液１または第２の水溶液２の側に配置することになる。第３の開口８は、第１の開口６と第２の開口７との間に設けられているので、図６（ａ）および図６（ｂ）の矢印にて示すように第３の開口８から管５内の油を管５の外へ向かって吸引すると、管５内に油の流れが生じ、当該流れによって、脂質一重膜によって覆われた第１の水溶液１と、脂質一重膜によって覆われた第２の水溶液２とが接近し（例えば、互いに向かって移動し）、脂質二重膜形成領域１０にて接触し、その結果、脂質二重膜が形成されることになる。上述したように、脂質一重膜を形成する脂質は、自身の疎水性領域を油の側に配置し、自身の親水性領域を第１の水溶液１または第２の水溶液２の側に配置しているので、脂質一重膜同士が接触して形成されている脂質二重膜では、内側にて疎水性領域同士が向かい合うように配置され、外側に親水性領域が配置されることになる。つまり、当該脂質二重膜は細胞膜と同じ構造を有している。 At least one selected from the group consisting of the oil filled in the tube 5, the first aqueous solution 1, and the second aqueous solution 2 may include a lipid for forming a lipid monolayer. After the first aqueous solution 1 and the second aqueous solution 2 are introduced into the tube 5 as shown by the arrow in FIG. 6A, the first aqueous solution 1 and the second aqueous solution 2 move in the tube 5. And/or when the first aqueous solution 1 and the second aqueous solution 2 come into contact with each other in the tube 5, the lipid is so coated as to cover each of the first aqueous solution 1 and the second aqueous solution 2. A single film is formed. At this time, since the tube 5 is filled with oil, the lipid forming the lipid monolayer has its own hydrophobic region arranged on the oil side and its own hydrophilic region in the first aqueous solution 1 or 2 will be placed on the side of the aqueous solution 2. Since the third opening 8 is provided between the first opening 6 and the second opening 7, as shown by the arrows in FIGS. 6A and 6B, the third opening 8 is formed. When the oil in the tube 5 is sucked from the tube 8 toward the outside of the tube 5, a flow of the oil is generated in the tube 5, and the flow causes the first aqueous solution 1 covered with the lipid monolayer and the lipid monolayer to flow. The covered second aqueous solution 2 approaches (for example, moves toward each other) and comes into contact with the lipid bilayer formation region 10, and as a result, a lipid bilayer is formed. As described above, the lipid forming the lipid monolayer has its hydrophobic region arranged on the oil side and its hydrophilic region arranged on the first aqueous solution 1 or second aqueous solution 2 side. Therefore, in the lipid bilayer membrane in which the lipid monolayers are formed in contact with each other, the hydrophobic regions are arranged so as to face each other inside, and the hydrophilic regions are arranged outside. That is, the lipid bilayer membrane has the same structure as the cell membrane.

第１の開口６、第２の開口７、および、第３の開口８の形状は、特に限定されないが、管５の断面の形状と同じであることが好ましい。第１の開口６、第２の開口７、および、第３の開口８の形状は、例えば、直径が０．１ｍｍ〜１００ｍｍ、１ｍｍ〜１０ｍｍ、または、１ｍｍ〜５ｍｍである円であり得る。 The shapes of the first opening 6, the second opening 7, and the third opening 8 are not particularly limited, but are preferably the same as the cross-sectional shape of the tube 5. The shape of the first opening 6, the second opening 7, and the third opening 8 can be, for example, a circle having a diameter of 0.1 mm to 100 mm, 1 mm to 10 mm, or 1 mm to 5 mm.

第３の開口８には、第３の開口８から管５の外へ向かって吸引された油を導くための管（図示せず）が接続されていてもよい。当該管は、例えば、管５に接続された注射器であってもよい。当該構成によれば、第３の開口８から管５の外へ向かって、所望の速度にて油を吸引することができる。その結果、より効率よく、脂質二重膜を形成することができる。 A pipe (not shown) for guiding the oil sucked from the third opening 8 to the outside of the pipe 5 may be connected to the third opening 8. The tube may be, for example, a syringe connected to the tube 5. According to this configuration, oil can be sucked from the third opening 8 to the outside of the pipe 5 at a desired speed. As a result, the lipid bilayer membrane can be formed more efficiently.

管５内における、第１の開口６および第２の開口７の位置は、特に限定されない。例えば、（ｉ）管５の端部の各々に第１の開口６および第２の開口７の各々を設けてもよいし、（ｉｉ）管５の端部よりも内側に第１の開口６および第２の開口７の各々を設けてもよいし、（ｉｉｉ）管５の端部に第１の開口６または第２の開口７の一方を設け、かつ、管５の端部よりも内側に第１の開口６または第２の開口７の他方を設けてもよい。管５内における油の流れをスムーズにするという観点からは、上記（ｉ）の位置が好ましい。 The positions of the first opening 6 and the second opening 7 in the tube 5 are not particularly limited. For example, (i) each of the ends of the pipe 5 may be provided with each of the first opening 6 and the second opening 7, or (ii) the first opening 6 may be provided inside the end of the pipe 5. And each of the second openings 7 may be provided, or (iii) one of the first opening 6 and the second opening 7 may be provided at the end of the tube 5 and the inside of the end of the tube 5 may be provided. Alternatively, the other of the first opening 6 and the second opening 7 may be provided. From the viewpoint of smoothing the oil flow in the pipe 5, the position (i) is preferable.

管５内における第３の開口８の位置は、特に限定されない。例えば、管５の端部と管５の反対側の端部とを結ぶ線の中央、または、中央の近傍に、第３の開口８が設けられてもよい。当該構成であれば、第１の水溶液１と第２の水溶液２とを効率よく接触させることによって、脂質二重膜を効率よく形成することができる。 The position of the third opening 8 in the tube 5 is not particularly limited. For example, the third opening 8 may be provided at the center of the line connecting the end of the pipe 5 and the end on the opposite side of the pipe 5, or in the vicinity of the center. With this structure, the lipid bilayer membrane can be efficiently formed by efficiently contacting the first aqueous solution 1 and the second aqueous solution 2.

管５内に充填される油は、特に限定されず、脂質一重膜および脂質二重膜を形成する脂質の種類等に応じて、適宜、選択することができる。管５内に充填される油としては、リン脂質、ヘキサデカン、デカン、スクアレン、シリコンオイル、および、ミネラルオイル等があげられる。これらの中でも、形成された脂質一重膜および脂質二重膜の中に入り込み難く、形成された脂質二重膜が細胞膜により近い膜構造になるという観点、および、揮発性が低く、取り扱いが容易であるという観点から、上記油としては、ヘキサデカンが好ましい。 The oil filled in the tube 5 is not particularly limited, and can be appropriately selected depending on the type of lipid forming the lipid monolayer and the lipid bilayer. Examples of the oil filled in the tube 5 include phospholipid, hexadecane, decane, squalene, silicone oil, and mineral oil. Among them, it is difficult to enter into the formed lipid monolayer and lipid bilayer, and the formed lipid bilayer has a membrane structure closer to that of the cell membrane, and the low volatility makes it easy to handle. From the standpoint of the presence, hexadecane is preferable as the oil.

上記油、第１の水溶液１、および、第２の水溶液２からなる群から選択される少なくとも１つは、例えば、イオノフォア、ポリペプチド、チャネル、疎水性化合物、または、疎水性イオンを含んでいてもよい。上記構成であれば、これらの物質を含有する脂質二重膜を形成することができる。上記イオノフォアとしては、例えば、グラミシジンを挙げることができる。上記ポリペプチドとしては、例えば、膜貫通タンパク質、トランスポータ、および、膜貫通型の輸送タンパク質を挙げることができる。 At least one selected from the group consisting of the oil, the first aqueous solution 1, and the second aqueous solution 2 contains, for example, an ionophore, a polypeptide, a channel, a hydrophobic compound, or a hydrophobic ion. Good. With the above structure, a lipid bilayer membrane containing these substances can be formed. Examples of the ionophore include gramicidin. Examples of the above-mentioned polypeptide include a transmembrane protein, a transporter, and a transmembrane transport protein.

上記油、第１の水溶液１、および、第２の水溶液２からなる群から選択される少なくとも１つは、脂質一重膜を形成するための脂質を含んでいてもよい。より具体的に、（ｉ）管５内に充填される油、（ｉｉ）第１の水溶液１および第２の水溶液２の両方、または、（ｉｉｉ）管５内に充填される油、第１の水溶液１および第２の水溶液２の全てに、脂質一重膜を形成するための脂質が含まれていてもよい。 At least one selected from the group consisting of the oil, the first aqueous solution 1, and the second aqueous solution 2 may contain a lipid for forming a lipid monolayer. More specifically, (i) oil filled in the pipe 5, (ii) both the first aqueous solution 1 and the second aqueous solution 2, or (iii) oil filled in the pipe 5, the first The aqueous solution 1 and the second aqueous solution 2 may each contain a lipid for forming a lipid monolayer.

図６（ｃ）に示すように、管５は、管５を開閉する開閉部１５を備えていてもよい。 As shown in FIG. 6C, the pipe 5 may include an opening/closing unit 15 that opens/closes the pipe 5.

図７に示すように、本実施の形態の脂質二重膜の水透過性の評価システムは、管５（例えば、管５、第１の開口６、第２の開口７、および、第３の開口８からなるユニット）を複数備えていてもよい。更に、図７に示すように、本実施の形態の脂質二重膜の水透過性の評価システムは、複数のユニットに含まれている複数の第１の開口６のうちの少なくとも２つと接続されている第１の副管２０と、複数のユニットに含まれている複数の第２の開口７のうちの少なくとも２つと接続されている第２の副管３０と、を備えていてもよい。また、本実施の形態の脂質二重膜の水透過性の評価システムは、複数のユニットに含まれている複数の第１の開口６の全てと接続されている第１の副管２０と、複数のユニットに含まれている複数の第２の開口７の全てと接続されている第２の副管３０と、を備えていてもよい。 As shown in FIG. 7, the water permeability evaluation system for lipid bilayer membranes according to the present embodiment includes a tube 5 (for example, the tube 5, the first opening 6, the second opening 7, and the third opening 5). A plurality of units each including the opening 8) may be provided. Furthermore, as shown in FIG. 7, the evaluation system for water permeability of a lipid bilayer membrane of the present embodiment is connected to at least two of the plurality of first openings 6 included in the plurality of units. The first auxiliary pipe 20 and the second auxiliary pipe 30 connected to at least two of the plurality of second openings 7 included in the plurality of units may be provided. The evaluation system for water permeability of a lipid bilayer membrane of the present embodiment includes a first sub-tube 20 connected to all of the plurality of first openings 6 included in the plurality of units, The second auxiliary pipe 30 connected to all of the plurality of second openings 7 included in the plurality of units may be provided.

より具体的に、図７に示す脂質二重膜の水透過性の評価システムは、管５、第１の開口６、第２の開口７、および、第３の開口８からなるユニットを３つ備えている。なお、本実施の形態の脂質二重膜の水透過性の評価システムが備え得るユニットの数は、特に限定されず、例えば、２〜１０ユニット、２〜５０ユニット、または、２〜１００ユニットであってもよい。勿論、本実施の形態の脂質二重膜の水透過性の評価システムが備え得るユニットの数は、１００ユニット以上を備えていてもよい。 More specifically, the evaluation system for water permeability of a lipid bilayer membrane shown in FIG. 7 has three units each including a tube 5, a first opening 6, a second opening 7, and a third opening 8. I have it. The number of units that can be included in the water permeability evaluation system for lipid bilayer membranes of the present embodiment is not particularly limited, and is, for example, 2 to 10 units, 2 to 50 units, or 2 to 100 units. It may be. As a matter of course, the evaluation system for water permeability of the lipid bilayer membrane of the present embodiment may include 100 units or more.

図７に示すように、本実施の形態の脂質二重膜の水透過性の評価システムでは、第１の投入口２１から第１の副管２０内へ第１の水溶液１が導入されて、当該第１の副管２０内を第１の水溶液１が移動する。各管５では、第３の開口８から管５内の油が管５の外へ向かって吸引される。このとき、各管５では、第１の開口６から第３の開口８に向かって油の流れが生じる。当該油の流れによって、第１の副管２０内を移動している第１の水溶液１が、第１の開口６の各々を経て、管５の各々の中へ導入される。管５の各々の中へ導入された第１の水溶液１は、第３の開口８に向かって移動する。 As shown in FIG. 7, in the water permeability evaluation system for lipid bilayer membranes of the present embodiment, the first aqueous solution 1 is introduced into the first sub-tube 20 from the first inlet 21, The first aqueous solution 1 moves in the first auxiliary pipe 20. In each pipe 5, the oil in the pipe 5 is sucked toward the outside of the pipe 5 from the third opening 8. At this time, in each pipe 5, a flow of oil is generated from the first opening 6 toward the third opening 8. Due to the flow of the oil, the first aqueous solution 1 moving in the first auxiliary pipe 20 is introduced into each of the pipes 5 through each of the first openings 6. The first aqueous solution 1 introduced into each of the tubes 5 moves towards the third opening 8.

また、本実施の形態の脂質二重膜の水透過性の評価システムでは、第２の投入口３１から第２の副管３０内へ第２の水溶液２が導入されて、当該第２の副管３０内を第２の水溶液２が移動する。各管５では、第３の開口８から管５内の油が管５の外へ向かって吸引される。このとき、各管５では、第２の開口７から第３の開口８に向かって油の流れが生じる。当該油の流れによって、第２の副管３０内を移動している第２の水溶液２が、第２の開口７の各々を経て、管５の各々の中へ導入される。管５の各々の中へ導入された第２の水溶液２は、第３の開口８に向かって移動する。 In addition, in the evaluation system for water permeability of a lipid bilayer membrane of the present embodiment, the second aqueous solution 2 is introduced from the second inlet 31 into the second auxiliary pipe 30, and the second auxiliary The second aqueous solution 2 moves in the tube 30. In each pipe 5, the oil in the pipe 5 is sucked toward the outside of the pipe 5 from the third opening 8. At this time, in each pipe 5, a flow of oil occurs from the second opening 7 toward the third opening 8. Due to the flow of the oil, the second aqueous solution 2 moving in the second auxiliary pipe 30 is introduced into each of the pipes 5 through each of the second openings 7. The second aqueous solution 2 introduced into each of the tubes 5 moves towards the third opening 8.

第３の開口８へ向かって移動する第１の水溶液１と第２の水溶液２とは、第３の開口８の近傍にて接触し、その結果、脂質二重膜が形成される。上記構成によれば、短時間にて複数の脂質二重膜を作製することができ、その結果、複数の脂質二重膜の水透過性を短時間にて評価することができる。例えば、上記構成によれば、後述する脂質二重膜の水透過性を制御する薬剤のスクリーニング方法を、効率良く実施することができる。 The first aqueous solution 1 and the second aqueous solution 2 moving toward the third opening 8 come into contact with each other in the vicinity of the third opening 8, and as a result, a lipid bilayer membrane is formed. According to the above configuration, a plurality of lipid bilayer membranes can be produced in a short time, and as a result, the water permeability of the plurality of lipid bilayer membranes can be evaluated in a short time. For example, according to the above-mentioned composition, the screening method of the medicine which controls the water permeability of a lipid bilayer membrane mentioned below can be implemented efficiently.

第１の副管２０には、第１の投入口２１の反対側に第１の排出口２２が設けられ得、第２の副管３０には、第２の投入口３１の反対側に第２の排出口３２が設けられ得る。第１の排出口２２からは、第１の副管２０内に充填される油、および／または、管５内に導入されなかった第１の水溶液１を排出することができる。一方、第２の排出口３２からは、第２の副管３０内に充填される油、および／または、管５内に導入されなかった第２の水溶液２を排出することができる。 The first auxiliary pipe 20 may be provided with a first outlet 22 opposite to the first inlet 21, and the second auxiliary pipe 30 may be provided with a first outlet 22 opposite to the second inlet 31. Two outlets 32 may be provided. From the first discharge port 22, the oil filled in the first auxiliary pipe 20 and/or the first aqueous solution 1 not introduced into the pipe 5 can be discharged. On the other hand, from the second discharge port 32, the oil filled in the second auxiliary pipe 30 and/or the second aqueous solution 2 not introduced into the pipe 5 can be discharged.

第１の副管２０、および、第２の副管３０の長さ等は、管５の数などに応じて、適宜設定することができる。また、第１の副管２０、および、第２の副管３０は、管５と同じ材料によって形成されてもよいし、管５と異なる材料によって形成されてもよい。また、第１の副管２０、および、第２の副管３０の断面の形状は、管５の断面の形状と同じ形状であってもよいし、管５の断面の形状と異なる形状であってもよい。 The length and the like of the first sub-tube 20 and the second sub-tube 30 can be appropriately set according to the number of the tubes 5 and the like. Further, the first sub-tube 20 and the second sub-tube 30 may be made of the same material as the tube 5, or may be made of a material different from that of the tube 5. The cross-sectional shapes of the first sub-tube 20 and the second sub-tube 30 may be the same as the cross-section of the tube 5, or may be different from the cross-section of the tube 5. May be.

本実施の形態の脂質二重膜の水透過性の評価システムの別の態様は、図８（ａ）に示すように、内部に、所定の浸透圧濃度である第１の水溶液、脂質二重膜、および、第１の水溶液よりも高い浸透圧濃度である第２の水溶液をこの順番にて配置するための管５であって、管５を開閉する開閉部（図６（ｃ）を参照）を備えている管５と、脂質二重膜６０の移動距離を計測するための移動距離計測計５０と、脂質二重膜６０を介した電位差と電流とを制御および計測（または、制御および／または計測）するための電極対４０・４１と、を備えていてもよい。管５は、その端部に、第１の開口６と第２の開口７とを備え得る。管５は、第３の開口を備えていてもよいし、備えていなくてもよい。 Another aspect of the water permeability evaluation system for lipid bilayer membranes of the present embodiment is as shown in FIG. 8(a), in which a first aqueous solution having a predetermined osmotic concentration and a lipid bilayer are used. A tube 5 for arranging a membrane and a second aqueous solution having an osmotic pressure concentration higher than that of the first aqueous solution in this order, and an opening/closing part for opening and closing the tube 5 (see FIG. 6(c)). ), a travel distance meter 50 for measuring the travel distance of the lipid bilayer membrane 60, and a potential difference and a current through the lipid bilayer membrane 60 are controlled and measured (or control and And/or electrode pairs 40 and 41 for measuring) may be provided. The tube 5 may be provided at its end with a first opening 6 and a second opening 7. The tube 5 may or may not include the third opening.

〔２．脂質二重膜の水透過性の評価方法〕
図８を参照しながら、本実施の形態の脂質二重膜の水透過性の評価方法について説明する。 [2. Method for evaluating water permeability of lipid bilayer membrane]
A method for evaluating water permeability of the lipid bilayer membrane of the present embodiment will be described with reference to FIG.

図８（ｂ）に示すように、本実施の形態の脂質二重膜の水透過性の評価方法は、上述した脂質二重膜の水透過性の評価システムを用いる脂質二重膜の水透過性の評価方法であって、上記管内に配置されている脂質二重膜の移動距離の計測、および、上記管内に配置されている脂質二重膜を介した電位差と電流との制御および／または計測、を行う計測工程Ｓ１を有する。 As shown in FIG. 8( b ), the method for evaluating the water permeability of a lipid bilayer membrane according to the present embodiment is the same as the water permeability of a lipid bilayer membrane using the above-described system for evaluating water permeability of a lipid bilayer membrane. A method for evaluating sex, which comprises measuring a migration distance of a lipid bilayer membrane arranged in the tube, and controlling a potential difference and a current through the lipid bilayer membrane arranged in the tube, and/or It has a measurement step S1 for performing measurement.

計測工程Ｓ１では、管内に配置されている脂質二重膜の移動距離の計測、および、管内に配置されている脂質二重膜を介した電位差と電流との制御および／または計測、が行われる。なお、管内に配置されている脂質二重膜の移動距離の計測は、上述した移動距離計測計を用いて行われ得る。一方、管内に配置されている脂質二重膜を介した電位差と電流との制御および／または計測は、上述した電極対を用いて行われ得る。 In the measurement step S1, measurement of the movement distance of the lipid bilayer membrane arranged in the tube and control and/or measurement of the potential difference and the current through the lipid bilayer membrane arranged in the tube are performed. .. The movement distance of the lipid bilayer membrane arranged in the tube can be measured by using the above-mentioned movement distance meter. On the other hand, the control and/or measurement of the electric potential difference and the electric current through the lipid bilayer membrane arranged in the tube can be performed using the electrode pair described above.

計測工程Ｓ１は、例えば、脂質二重膜の像（脂質二重膜の移動距離の算出に使用される像）を撮影する撮影工程と、時間の経過（例えば、脂質二重膜の移動に要した時間）を計測する時間計測工程とを包含してもよい。計測工程Ｓ１は、撮影工程によって得られた複数の像と、時間計測工程によって得られた時間とから、脂質二重膜の移動速度を算出する移動速度算出工程を包含してもよい。 The measurement step S1 includes, for example, a photographing step of photographing an image of a lipid bilayer membrane (an image used for calculating the movement distance of the lipid bilayer membrane) and a lapse of time (for example, necessary for moving the lipid bilayer membrane). And a time measuring step of measuring the time). The measuring step S1 may include a moving speed calculating step of calculating the moving speed of the lipid bilayer membrane from the plurality of images obtained by the photographing step and the time obtained by the time measuring step.

計測工程Ｓ１は、上述した工程の他に、（１）水の移動体積を算出する工程、（２）脂質二重膜の面積を算出する工程、（３）水流束を算出する工程、（４）電流−電圧曲線を作成する工程、（５）膜電位とコンダクタンス比とを算出する工程、（６）コンダクタンスＧｍを算出する工程、（７）誤差Ｇ’を算出する工程、および、（８）非撹拌水層の影響を考慮した真の浸透圧差を算出する工程、からなる群から選択される少なくとも１つ（好ましくは全て）を包含してもよい。上記構成であれば、簡単に、水流束の評価、非撹拌水層の評価、または、流動電位の評価を行うことができる。 In addition to the steps described above, the measurement step S1 includes (1) a step of calculating a moving volume of water, (2) a step of calculating the area of the lipid bilayer membrane, (3) a step of calculating a water flux, and (4) ) A step of creating a current-voltage curve, (5) a step of calculating a membrane potential and a conductance ratio, (6) a step of calculating a conductance Gm, (7) a step of calculating an error G′, and (8) At least one (preferably all) selected from the group consisting of the step of calculating the true osmotic pressure difference in consideration of the influence of the non-stirred water layer may be included. With the above configuration, it is possible to easily evaluate the water flux, the non-stirred water layer, or the streaming potential.

図８（ｃ）に示すように、本実施の形態の脂質二重膜の水透過性の評価方法は、計測工程Ｓ１よりも前に、脂質二重膜形成工程Ｓ０を包含してもよい。 As shown in FIG. 8C, the method for evaluating water permeability of a lipid bilayer membrane of the present embodiment may include a lipid bilayer membrane formation step S0 before the measurement step S1.

脂質二重膜形成工程Ｓ０は、例えば、管内に充填されている油を第３の開口から吸引することによって、脂質一重膜によって覆われた第１の水溶液と脂質一重膜によって覆われた第２の水溶液とを互いに接触させて脂質二重膜を形成させる工程であってもよい。 In the lipid bilayer formation step S0, for example, by sucking the oil filled in the tube through the third opening, the first aqueous solution covered with the lipid monolayer and the second aqueous solution covered with the lipid monolayer. It may be a step of forming a lipid bilayer by contacting each of them with the aqueous solution.

本実施の形態の脂質二重膜の水透過性の評価方法は、脂質二重膜形成工程Ｓ０の後（例えば、脂質二重膜形成工程Ｓ０の後であって、かつ、計測工程Ｓ１の前）に、（ｉ）第１の水溶液と第２の水溶液とが接触している界面を観察する界面観察工程、および／または、脂質二重膜の静電容量を測定する静電容量測定工程を有していてもよい。当該構成によれば、脂質二重膜が形成されているか否かを判定することができる。なお、界面観察工程は、第１の水溶液と第２の水溶液とが接触している界面を、顕微鏡（例えば、倒立顕微鏡）によって観察し、界面の状態が変化することを確認することによって行うことができる。一方、静電容量測定工程は、電極対などを用いて脂質二重膜の静電容量を測定し、静電容量の値が変化することを確認することによって行うことができる。 The method for evaluating the water permeability of the lipid bilayer membrane of the present embodiment is performed after the lipid bilayer membrane formation step S0 (for example, after the lipid bilayer membrane formation step S0 and before the measurement step S1. ), (i) an interface observing step of observing an interface where the first aqueous solution and the second aqueous solution are in contact with each other, and/or a capacitance measuring step of measuring a capacitance of the lipid bilayer membrane. You may have. According to the said structure, it can be judged whether the lipid bilayer membrane is formed. Note that the interface observation step is performed by observing the interface where the first aqueous solution and the second aqueous solution are in contact with each other with a microscope (for example, an inverted microscope) and confirming that the state of the interface changes. You can On the other hand, the capacitance measurement step can be performed by measuring the capacitance of the lipid bilayer membrane using an electrode pair or the like and confirming that the capacitance value changes.

本実施の形態の脂質二重膜の水透過性の評価方法は、水流束の評価方法、非撹拌水層の評価方法、または、流動電位の評価方法として使用することができる。 The water permeability evaluation method of the lipid bilayer membrane of the present embodiment can be used as a water flux evaluation method, a non-stirred water layer evaluation method, or a streaming potential evaluation method.

〔３．脂質二重膜の水透過性を制御する薬剤のスクリーニング方法〕
本実施の形態の脂質二重膜の水透過性を制御する薬剤のスクリーニング方法は、上述した脂質二重膜の水透過性の評価システムを用いる、脂質二重膜の水透過性を制御する薬剤のスクリーニング方法であって、上記管内に配置されている第１の水溶液、脂質二重膜、および、第２の水溶液からなる群から選択される少なくとも１つに薬剤の候補物質を加える添加工程と、上記管内に配置されている脂質二重膜の移動距離の計測、および、上記管内に配置されている脂質二重膜を介した電位差と電流との制御および／または計測を行う、計測工程と、上記計測工程によって得られた計測値と、参照値とを比較する比較工程と、を有する。 [3. Method for screening drug controlling water permeability of lipid bilayer membrane]
The method for screening a drug for controlling the water permeability of a lipid bilayer membrane of the present embodiment is a drug for controlling the water permeability of a lipid bilayer membrane, which uses the above-described evaluation system for water permeability of a lipid bilayer membrane. And a step of adding a drug candidate substance to at least one selected from the group consisting of a first aqueous solution, a lipid bilayer membrane, and a second aqueous solution arranged in the tube. A measurement step of measuring a migration distance of the lipid bilayer membrane arranged in the tube, and controlling and/or measuring a potential difference and an electric current through the lipid bilayer membrane arranged in the tube; , And a comparison step of comparing the measurement value obtained by the measurement step with a reference value.

添加工程では、管内に配置されている第１の水溶液、脂質二重膜、および、第２の水溶液からなる群から選択される少なくとも１つに薬剤の候補物質を加える。薬剤の候補物質は、脂質二重膜自体、または、脂質二重膜に埋め込まれている物質（例えば、イオノフォア、ポリペプチド（例えば、膜タンパク質）、疎水性化合物、または、疎水性イオン）の近傍に存在するので、薬剤の候補物質は、脂質二重膜自体、または、脂質二重膜に埋め込まれている物質に作用（例えば、脂質二重膜に埋め込まれている物質の活性を、上昇または低下）し得る。 In the adding step, the drug candidate substance is added to at least one selected from the group consisting of the first aqueous solution, the lipid bilayer membrane, and the second aqueous solution arranged in the tube. The drug candidate substance is in the vicinity of the lipid bilayer membrane itself or a substance embedded in the lipid bilayer membrane (eg, ionophore, polypeptide (eg, membrane protein), hydrophobic compound, or hydrophobic ion). As a result, the drug candidate substance acts on the lipid bilayer membrane itself or the substance embedded in the lipid bilayer membrane (for example, the activity of the substance embedded in the lipid bilayer membrane is increased or Can decrease).

添加工程を実施する方法は、特に限定されず、例えば、（ｉ）管内に既に配置されている第１の水溶液、脂質二重膜、および、第２の水溶液からなる群から選択される少なくとも１つに、細管などを用いて、直接、薬剤の候補物質を加える方法、または、（ｉｉ）管内に脂質二重膜を形成する際に、脂質二重膜を形成するための油、第１の水溶液、および、第２の水溶液からなる群から選択される少なくとも１つに、予め薬剤の候補物質を加える方法、を用いることができる。 The method of carrying out the addition step is not particularly limited, and for example, at least one selected from the group consisting of (i) a first aqueous solution, a lipid bilayer membrane, and a second aqueous solution that are already placed in the tube. First, a method of directly adding a drug candidate substance using a thin tube, or (ii) an oil for forming a lipid bilayer when forming the lipid bilayer in the tube, A method of previously adding a drug candidate substance to at least one selected from the group consisting of an aqueous solution and a second aqueous solution can be used.

計測工程では、管内に配置されている脂質二重膜の移動距離の計測、および、上記管内に配置されている脂質二重膜を介した電位差と電流との制御および／または計測を行う。その結果、当該計測工程では、水透過性に関する計測値（例えば、脂質二重膜の移動距離、脂質二重膜の移動速度、水流束、非撹拌水層、および、流動電位など）が得られる。 In the measuring step, the moving distance of the lipid bilayer membrane arranged in the tube is measured, and the potential difference and the current through the lipid bilayer membrane arranged in the tube are controlled and/or measured. As a result, in the measurement step, measurement values relating to water permeability (for example, movement distance of lipid bilayer membrane, movement speed of lipid bilayer membrane, water flux, unstirred water layer, and streaming potential) are obtained. ..

薬剤の候補物質が脂質二重膜自体、または、脂質二重膜に埋め込まれている物質に作用する場合の計測値は、薬剤の候補物質が脂質二重膜自体、または、脂質二重膜に埋め込まれている物質に作用しない場合の計測値（換言すれば、参照値）と異なる。それ故に、比較工程にて計測値と参照値とを比較することによって、脂質二重膜（例えば、脂質二重膜に埋め込まれている物質）の水透過性を制御する薬剤をスクリーニングすることができる。なお、上記参照値は、管内に配置されている第１の水溶液、脂質二重膜、および、第２の水溶液の何れにも薬剤の候補物質を加えない場合の計測値であってもよい。 When the drug candidate substance acts on the lipid bilayer membrane itself or the substance embedded in the lipid bilayer membrane, the measured value is the drug candidate substance on the lipid bilayer membrane itself or on the lipid bilayer membrane. It differs from the measured value (in other words, reference value) when it does not act on the embedded substance. Therefore, by comparing the measured value and the reference value in the comparison step, it is possible to screen for a drug that controls the water permeability of the lipid bilayer membrane (for example, the substance embedded in the lipid bilayer membrane). it can. The reference value may be a measured value when a drug candidate substance is not added to any of the first aqueous solution, the lipid bilayer membrane, and the second aqueous solution arranged in the tube.

計測値と参照値との差が大きいほど、当該候補物質を、脂質二重膜の水透過性をより強く制御する薬剤とみなすことができる。 The larger the difference between the measured value and the reference value, the more the candidate substance can be regarded as a drug that more strongly controls the water permeability of the lipid bilayer membrane.

〔４．本発明の別の態様〕
本発明は、以下のように構成することも可能である。 [4. Another aspect of the present invention]
The present invention can also be configured as follows.

本発明の一実施形態は、管（例えば、ガラス管）を使った移動接触膜法であって、
上記管の内壁を疎水性物質にて表面処理した後、当該管の内壁を更にリン脂質（例えば、ヘキサン溶液）にて表面処理する工程と、
上記管内に、浸透圧濃度の低い第一の水溶液、上記リン脂質を分散した油、および、浸透圧濃度の高い第二の水溶液を、この順番にて充填する工程と、
上記管の一端に電極Ａ（例えば、ＡｇＣｌ電極）を設置した後、当該管の一端を閉じる（たとえば、熱可塑性チューブを用いて閉じる）工程と、
上記閉じられた一端とは反対側の開放端から、上記リン脂質を分散した油を吸引して（例えば、注射器を用いて吸引）、２つの単分子層を接着させて脂質二重膜を形成する工程と、
上記開放端に電極Ｂ（例えば、ＡｇＣｌ電極）を設置する工程と、
上記脂質二重膜の移動速度として浸透圧濃度差に従った水流束を測定すると同時に、電気生理学的に静電容量として膜面積を測定し、上記水流束および上記膜面積に基づいて、単位膜面積当たりの水流束を求める工程と、を有する、移動接触膜法（または、水流束の評価方法）。 One embodiment of the present invention is a moving contact membrane method using a tube (eg, glass tube),
A step of surface-treating the inner wall of the tube with a hydrophobic substance, and then further surface-treating the inner wall of the tube with a phospholipid (for example, a hexane solution);
In the tube, a first aqueous solution having a low osmotic concentration, an oil in which the phospholipid is dispersed, and a second aqueous solution having a high osmotic concentration are filled in this order,
Placing an electrode A (eg, AgCl electrode) on one end of the tube and then closing one end of the tube (eg, closing with a thermoplastic tube);
The phospholipid-dispersed oil is sucked from the open end opposite to the closed end (for example, by using a syringe) to adhere the two monolayers to form a lipid bilayer membrane. The process of
Installing electrode B (eg, AgCl electrode) at the open end,
At the same time as measuring the water flux according to the difference in osmotic concentration as the moving speed of the lipid bilayer membrane, the membrane area was measured electrophysiologically as a capacitance, and based on the water flux and the membrane area, the unit membrane was measured. A moving contact membrane method (or a water flux evaluation method), which comprises a step of determining a water flux per area.

本発明の一実施形態は、管（例えば、ガラス管）を使った非撹拌水層評価法であって、
上記管の内壁を疎水性物質にて表面処理した後、当該管の内壁を更にリン脂質（例えば、ヘキサン溶液）にて表面処理する工程と、
上記管内に、少量のグラミシジンを含む浸透圧濃度の低い第一の水溶液（例えば、電解質溶液）、上記リン脂質を分散した油、および、少量のグラミシジンを含む浸透圧濃度の高い第二の水溶液（例えば、電解質溶液）を、この順番にて充填する工程と、
上記管の一端に電極Ａ（例えば、ＡｇＣｌ電極）を設置した後、当該管の一端を閉じる（たとえば、熱可塑性チューブを用いて閉じる）工程と、
上記閉じられた一端とは反対側の開放端から、上記リン脂質を分散した油を吸引して（例えば、注射器を用いて吸引）、２つの単分子層を接着させて脂質二重膜を形成する工程と、
上記開放端に電極Ｂ（例えば、ＡｇＣｌ電極）を設置する工程と、
上記脂質二重膜の移動速度として浸透圧濃度差に従った水流束を測定すると同時に、電気生理学的にグラミシジンチャネルの電流−電圧曲線を測定し、電流−電圧曲線の非対称性から非撹拌水層の局所濃度を推定し、当該局所濃度によって上記水流束を補正する工程と、を有する、非撹拌水層評価法（または、水流束の評価方法）。 One embodiment of the present invention is a non-stirred water layer evaluation method using a tube (for example, a glass tube),
A step of surface-treating the inner wall of the tube with a hydrophobic substance, and then further surface-treating the inner wall of the tube with a phospholipid (for example, a hexane solution);
In the tube, a first aqueous solution having a low osmotic concentration containing a small amount of gramicidin (for example, an electrolyte solution), an oil in which the phospholipid is dispersed, and a second aqueous solution having a high osmotic concentration containing a small amount of gramicidin ( For example, a step of filling the electrolyte solution) in this order,
Placing an electrode A (eg, AgCl electrode) on one end of the tube and then closing one end of the tube (eg, closing with a thermoplastic tube);
The phospholipid-dispersed oil is sucked from the open end opposite to the closed end (for example, by using a syringe) to adhere two monolayers to form a lipid bilayer membrane. The process of
Installing electrode B (eg, AgCl electrode) at the open end,
At the same time as measuring the water flux according to the difference in osmotic concentration as the migration rate of the lipid bilayer, the current-voltage curve of the gramicidin channel was measured electrophysiologically, and the non-stirred water layer was obtained from the asymmetry of the current-voltage curve. Of the non-stirring water layer (or the method of evaluating the water flux), the method comprising:

＜１．試験の準備＞
Ａ．試験に用いた器具
顕微鏡としては、倒立顕微鏡（具体的には、Ｏｌｙｍｐｕｓ ＩＸ７０）を使用した。パッチクランプアンプとしては、ＡｘｏＰａｔｃｈ ２００Ｂ（Axon Instrumental）を用いた。電位記録は、Ｃｌａｍｐｅｘ １０．７（Intermedical）を用いて行った。データの解析は、Ｃｌａｍｐｆｉｔ １０．７（Intermedical）を用いて行った。顕微鏡の画像記録は、ＷＲＡＹＣＡＭ ＮＦ１０００（WRAYMER）を用いて行った。記録した画像の解析は、Ｉｍａｇｅ Ｊを用いて行った。データ解析は、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ ２０１３を用いて行った。 <1. Preparation for exam>
A. Instrument used for the test As the microscope, an inverted microscope (specifically, Olympus IX70) was used. As the patch clamp amplifier, AxoPatch 200B (Axon Instrumental) was used. The electrogram was recorded using Clampex 10.7 (Intermedical). Data analysis was performed using Clampfit 10.7 (Intermedical). Image recording with a microscope was performed using a WRAYCAM NF1000 (WRAYMER). Analysis of the recorded images was performed using Image J. Data analysis was performed using Microsoft Excel 2013.

Ｂ．脂質の準備
脂質一重膜および脂質二重膜を形成するための脂質としては、diphytanoylphosphocholine（ＤｐｈＰＣ ５０ｍｇ／ｍＬ：avanti polar lipid）を用いた。 B. Preparation of lipid As a lipid for forming a lipid monolayer and a lipid bilayer, diphytanoylphosphocholine (DphPC 50 mg/mL: avanti polar lipid) was used.

ＤｐｈＰＣが溶解したクロロホルム溶液１５０μＬをロータリーエバポレーターにかけて溶媒の除去を行い、得られた固形物を、デシケーター内にて、１７ｈＰａの低圧環境下にて６時間以上保管した。 150 μL of a chloroform solution in which DphPC was dissolved was removed by a rotary evaporator to remove the solvent, and the obtained solid was stored in a desiccator under a low pressure environment of 17 hPa for 6 hours or more.

保管後の固形物を、２５０μＬのヘキサンに溶解し、３０ｍｇ／ｍＬにてＤｐｈＰＣを含有するヘキサン溶液を得た。以後の試験では、当該ヘキサン溶液を用いて、キャピラリーの内部をプレコーティングした。 The solid matter after storage was dissolved in 250 μL of hexane to obtain a hexane solution containing DphPC at 30 mg/mL. In the subsequent tests, the inside of the capillary was pre-coated with the hexane solution.

また、保管後の固形物を、２５０μＬのヘキサデカンに溶解し、３０ｍｇ／ｍＬにてＤｐｈＰＣを含有するヘキサデカン溶液を得た。以後の試験では、当該ヘキサデカン溶液（脂質二重膜作製用ＤｐｈＰＣとも呼ぶ）を、プレコーティングされたキャピラリーに充填することによって、水溶液を覆う脂質一重膜を形成した。 Further, the solid matter after storage was dissolved in 250 μL of hexadecane to obtain a hexadecane solution containing DphPC at 30 mg/mL. In the subsequent tests, the hexadecane solution (also referred to as DphPC for lipid bilayer formation) was filled in a pre-coated capillary to form a lipid monolayer covering the aqueous solution.

Ｃ．水溶液の準備
溶媒としては水を用い、溶質としてはＮａＣｌおよび尿素を用いた。まずＮａＣｌを１００ｍＭの濃度にて含有する水溶液を作製し、これを基本の水溶液とした。基本の水溶液に尿素を加えることによって、ＮａＣｌを１００ｍＭの濃度にて含有し、かつ、尿素を２００ｍＭ、４００ｍＭ、６００ｍＭ、８００ｍＭ、または、１０００ｍＭの濃度にて含有する水溶液を作製した。 C. Preparation of aqueous solution Water was used as a solvent, and NaCl and urea were used as solutes. First, an aqueous solution containing NaCl at a concentration of 100 mM was prepared, and this was used as a basic aqueous solution. An aqueous solution containing NaCl at a concentration of 100 mM and urea at a concentration of 200 mM, 400 mM, 600 mM, 800 mM or 1000 mM was prepared by adding urea to the basic aqueous solution.

非撹拌水層の測定を行う場合には、ＮａＣｌおよび尿素を含有する水溶液に対して、更にグラミシジン（Gramicidin） Ａ（SANTA CRUZ）を溶解した水溶液を用いた。具体的に、Ｄｉｍｅｔｈｙｌ ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ（ＤＭＳＯ）にグラミシジン Ａの粉末を溶解し、グラミシジン Ａを１ｍｍｏｌ／Ｌの濃度にて含有するＤＭＳＯ溶液を作製した。当該ＤＭＳＯ溶液をさらにＤＭＳＯを用いて希釈し、グラミシジン Ａを１００ｎｍｏｌ／Ｌの濃度にて含有するＤＭＳＯ溶液を作製した。 When the measurement of the non-stirred water layer was performed, an aqueous solution in which Gramicidin A (SANTA CRUZ) was further dissolved in an aqueous solution containing NaCl and urea was used. Specifically, a powder of gramicidin A was dissolved in dimethyl sulfoxide (DMSO) to prepare a DMSO solution containing gramicidin A at a concentration of 1 mmol/L. The DMSO solution was further diluted with DMSO to prepare a DMSO solution containing gramicidin A at a concentration of 100 nmol/L.

当該ＤＭＳＯ溶液を、ＮａＣｌを含有する水溶液、または、ＮａＣｌと尿素とを含有する水溶液を用いて５０倍に希釈した。グラミシジン Ａを２ｎｍｏｌ／Ｌの濃度にて含有するＤＭＳＯ溶液を試験に用いた。なお、ＮａＣｌおよび尿素を用いた理由は、ＮａＣｌの拡散係数と、尿素の拡散係数とが、略同じであるからである。 The DMSO solution was diluted 50 times with an aqueous solution containing NaCl or an aqueous solution containing NaCl and urea. A DMSO solution containing gramicidin A at a concentration of 2 nmol/L was used for the test. The reason for using NaCl and urea is that the diffusion coefficient of NaCl and the diffusion coefficient of urea are substantially the same.

Ｄ．キャピラリーの準備
内径１．１ｍｍ、長さ５０ｍｍのガラス製のキャピラリーを用いた。まず、キャピラリーの内腔にＳＩＧＭＡＣＯＴＥ（SIGMA-ALDRICH）を通し、内腔を疎水化した後、当該キャピラリーを、６時間以上デシケーター内で１７ｈＰａにて保管した。 D. Preparation of Capillary A glass capillary having an inner diameter of 1.1 mm and a length of 50 mm was used. First, SIGMACOTE (SIGMA-ALDRICH) was passed through the lumen of the capillary to make the lumen hydrophobic, and the capillary was stored at 17 hPa in a desiccator for 6 hours or more.

その後、あらかじめ上記方法にて準備しておいたＤｐｈＰＣが溶解したヘキサン溶解を、キャピラリーの内腔に通した。当該キャピラリーを、３時間以上デシケーター内で１７ｈＰａにて保管した。以上の操作によって、キャピラリーの内腔のコーティングを行った。 Then, a hexane solution prepared by dissolving the DphPC prepared in the above method was passed through the lumen of the capillary. The capillary was stored at 17 hPa in a desiccator for 3 hours or more. By the above operation, the lumen of the capillary was coated.

＜２．水流束の測定試験＞
水の体積移動に伴う脂質二重膜の平行移動を正確に観察するために、コーティングされたキャピラリーの片側の端部を閉塞させた（Ｃｌｏｓｅｄ法）。 <2. Water flux measurement test>
In order to accurately observe the parallel movement of the lipid bilayer membrane accompanied by the volumetric movement of water, one end of the coated capillary was closed (Closed method).

具体的には、コーティングされたキャピラリーの片側の端部に、長さが７〜８ｍｍ程度のheat shrink tubeをとりつけた。ＡｇＣｌインクが塗布されているキャピラリーの部分に、２〜３ｍｍ程度の長さのheat shrink tubeを被せ、当該heat shrink tubeに熱風をふきつけることによって、キャピラリーにheat shrink tubeを装着させた。 Specifically, a heat shrink tube having a length of about 7 to 8 mm was attached to one end of the coated capillary. The capillary part coated with the AgCl ink was covered with a heat shrink tube having a length of about 2 to 3 mm, and the heat shrink tube was wiped with hot air to attach the heat shrink tube to the capillary.

次いで、当該キャピラリー内に、（ｉ）ＮａＣｌを１００ｍＭの濃度にて含有する水溶液（２５μＬ）、（ｉｉ）脂質二重膜作製用ＤｐｈＰＣ（３μＬ）、（ｉｉｉ）ＮａＣｌを１００ｍＭの濃度にて含有し、かつ、尿素を所望の濃度にて含有する水溶液（２５μＬ）を、当該順番にて充填した。 Then, the capillary contains (i) an aqueous solution (25 μL) containing NaCl at a concentration of 100 mM, (ii) DphPC for lipid bilayer preparation (3 μL), and (iii) NaCl at a concentration of 100 mM. Further, an aqueous solution (25 μL) containing urea at a desired concentration was filled in the order.

上記（ｉ）〜（ｉｉｉ）の溶液を充填したキャピラリーを倒立顕微鏡にセットした。塩化銀電極をキャピラリー内に挿入した後、加熱されたピンセットの先端にて、heat shrink tubeをつまむことによって、キャピラリーの片側の端部を閉塞させた。 The capillaries filled with the solutions (i) to (iii) were set on an inverted microscope. After inserting the silver chloride electrode into the capillary, one end of the capillary was closed by pinching the heat shrink tube at the tip of the heated tweezers.

倒立顕微鏡の拡大率を４０倍〜１００倍として、キャピラリーの内部を観察しながら、キャピラリー内の脂質二重膜作製用ＤｐｈＰＣを、キャピラリーの開放端から挿入した吸引用キャピラリーを用いて吸引および除去し、当該脂質二重膜作製用ＤｐｈＰＣの両側に存在する（ｉ）の溶液のコンパートメントと、（ｉｉｉ）の溶液のコンパートメントとを接触させた（図１（ａ）および図１（ｂ）参照）。なお、吸引用キャピラリーとしては、２７Ｇ注射針（テルモ製）に対して、７０ｍｍ程度の長さに切った内径５０μｍのキャピラリー（フナコシ製）を接着したものを、１ｍｍシリンジ（テルモ）に接続したものを用いた。 While observing the inside of the capillary with a magnification of the inverted microscope of 40 to 100 times, the lipid bilayer membrane-producing DphPC in the capillary was sucked and removed using the suction capillary inserted from the open end of the capillary. The compartment of the solution (i) and the compartment of the solution (iii) present on both sides of the lipid bilayer membrane-producing DphPC were brought into contact with each other (see FIGS. 1(a) and 1(b)). As the suction capillary, a 27G injection needle (made by Terumo), to which a capillary (made by Funakoshi) having an inner diameter of 50 μm cut to a length of about 70 mm is bonded, is connected to a 1 mm syringe (Terumo). Was used.

溶液のコンパートメント同士を接触させた後、塩化銀電極を開放端からキャピラリー内に差し込んだ。その後、倒立顕微鏡の拡大率を４００倍として、溶液のコンパートメント同士の境界面を観察した。はじめは境界面に厚みが存在するが、しばらくすると境界面が突然薄くなり、溶液のコンパートメント同士がより強く接触する。この時に、溶液のコンパートメント同士の間に、大きな脂質二重膜が形成される（図１（ｃ）および図１（ｄ）参照）。なお、脂質二重膜の厚さは、略４ｎｍである。脂質二重膜の厚さが略４ｎｍになっているか否かは、顕微鏡観察のみならず、静電容量から判断することができる。 After contacting the solution compartments, a silver chloride electrode was inserted into the capillary from the open end. Then, the magnification of the inverted microscope was set to 400 times, and the boundary surface between the solution compartments was observed. Initially there is thickness at the interface, but after a while the interface suddenly becomes thinner and the solution compartments are in stronger contact with each other. At this time, a large lipid bilayer membrane is formed between the solution compartments (see FIG. 1(c) and FIG. 1(d)). The thickness of the lipid bilayer is approximately 4 nm. Whether or not the thickness of the lipid bilayer is about 4 nm can be determined not only by microscopic observation but also by capacitance.

溶液のコンパートメントの間の浸透圧の差に従って、脂質二重膜を通って水が移動すると、脂質二重膜が、水の体積変化に応じて、キャピラリー内を平行移動する。この動きをタイムラプスにて、５秒間隔で合計４５秒間、１０枚の写真を撮影した。 As the water moves through the lipid bilayer according to the difference in osmotic pressure between the compartments of the solution, the lipid bilayer moves in parallel in the capillary in response to the volume change of the water. This movement was time-lapsed, and 10 photographs were taken at 5-second intervals for a total of 45 seconds.

同時に、Voltage Clamp modeにて脂質二重膜に対して１０ｍＶ〜−１０ｍＶのランプ波をかけ、膜容量の測定を行った。ＤｐｈＰＣの特性膜容量は、６．５２×１０−３ｐＦ／μｍ２（Graham et al. Direct in situ measurement of specific capacitance, monolayer tension, and bilayer tension in a droplet interface bilayer : Soft Matter, 2015, 11, 7592-7605）であり、当該データから、脂質二重膜の面積を算出した脂質二重膜の面積（μｍ２）は、測定した膜容量（ｐＦ）を前述のＤｐｈＰＣの特性膜容量で除して算出した。 At the same time, a ramp wave of 10 mV to −10 mV was applied to the lipid bilayer membrane in the Voltage Clamp mode to measure the membrane capacity. The characteristic membrane capacity of DphPC is 6.52×10 −3 pF/μm 2 (Graham et al. Direct in situ measurement of specific capacitance, monolayer tension, and bilayer tension in a droplet interface bilayer: Soft Matter, 2015, 11, 7592-7605), and the area of the lipid bilayer membrane (μm 2 ) for which the area of the lipid bilayer membrane was calculated from the data was obtained by dividing the measured membrane capacity (pF) by the characteristic membrane capacity of DphPC described above. Calculated by

撮影したデータを、ｉｍａｇｅ ＪのＭａｎｕａｌ ｔｒａｃｋｉｎｇ ｍｏｄｅを用いて解析し、４５秒間で脂質二重膜が移動した距離を測定した。本試験では内径１．１ｍｍのキャピラリーを用いていることから、キャピラリーの断面積と脂質二重膜の移動距離との積として、水の移動体積が得られる。脂質二重膜の面積も得られているので、これらのデータからＤｐｈＰＣに対する水の透過係数を得ることができる。なお、具体的な水の透過係数（μｍ／ｓｅｃ）は、単位時間当たりの水の移動体積すなわち水の移動速度（μｍ３／ｓｅｃ）を膜面積（μｍ２）で除して算出した。 The photographed data was analyzed using the Manual tracking mode of image J, and the distance traveled by the lipid bilayer membrane was measured in 45 seconds. Since a capillary having an inner diameter of 1.1 mm is used in this test, the moving volume of water can be obtained as the product of the cross-sectional area of the capillary and the moving distance of the lipid bilayer membrane. Since the area of the lipid bilayer is also obtained, the permeability coefficient of water to DphPC can be obtained from these data. The specific water permeability coefficient (μm/sec) was calculated by dividing the moving volume of water per unit time, that is, the moving speed of water (μm 3 /sec) by the membrane area (μm 2 ).

この試験を、浸透圧差２００ｍＭ、４００ｍＭ、６００ｍＭ、８００ｍＭ、１０００ｍＭと変えながら試験を行い、水の透過係数を算出した。浸透圧差２００ｍＭ、４００ｍＭ、６００ｍＭ、８００ｍＭ、１０００ｍＭの場合、水の透過係数は、各々、０．９０１、１．８１４、２．６１９、３．２３３、および、４．０７６であった。 This test was conducted while changing the osmotic pressure difference to 200 mM, 400 mM, 600 mM, 800 mM, 1000 mM, and the water permeability coefficient was calculated. When the osmotic pressure differences were 200 mM, 400 mM, 600 mM, 800 mM, and 1000 mM, the water permeability coefficients were 0.901, 1.814, 2.619, 3.233, and 4.076, respectively.

＜３．非撹拌水層の測定試験＞
高浸透圧の水溶液と低浸透圧の水溶液との間に脂質二重膜を配置すると、低浸透圧の水溶液から高浸透圧の水溶液に向かって、水が流れ込む。このとき、低浸透圧の水溶液の側の脂質二重膜の近傍ではイオン（例えば、ナトリウムイオン）の濃度が上昇し、高浸透圧の水溶液の側の脂質二重膜の近傍ではイオン（例えば、ナトリウムイオン）の濃度が低下する。そして、脂質二重膜の近傍におけるイオン濃度の変化は、水の駆動力を減弱させる。当該水の駆動力の減弱を考慮しない場合には、脂質二重膜の水の透過性を過大に評価してしまうという問題が生じる。それ故に、脂質二重膜の水の透過性を正確に評価するためには、脂質二重膜の近傍におけるイオン濃度の変化（換言すれば、脂質二重膜の近傍における浸透圧濃度の変化）を評価する必要がある（図２参照）。 <3. Measurement test of non-stirred water layer>
When a lipid bilayer membrane is placed between a high osmotic pressure aqueous solution and a low osmotic pressure aqueous solution, water flows from the low osmotic pressure aqueous solution toward the high osmotic pressure aqueous solution. At this time, the concentration of ions (for example, sodium ions) increases near the lipid bilayer membrane on the low osmotic pressure aqueous solution side, and the concentration of ions (for example, sodium ion) increases near the lipid bilayer membrane on the high osmotic pressure aqueous solution side. Sodium ion) concentration decreases. Then, the change in the ion concentration in the vicinity of the lipid bilayer reduces the driving force of water. If the reduction of the driving force of the water is not taken into consideration, there is a problem that the water permeability of the lipid bilayer membrane is overestimated. Therefore, in order to accurately evaluate the water permeability of the lipid bilayer membrane, the change of the ion concentration in the vicinity of the lipid bilayer membrane (in other words, the change of the osmotic pressure concentration in the vicinity of the lipid bilayer membrane) Should be evaluated (see FIG. 2).

本試験では、脂質二重膜の近傍に形成される非撹拌水層の測定を行った。なお、本試験では、グラミシジンを２ｎｍｏｌ／Ｌにて含有する水溶液を用いた。なお、当該グラミシジンとしては、SANTA CRUZ社製のものを用いた。 In this test, the non-stirred water layer formed near the lipid bilayer was measured. In this test, an aqueous solution containing gramicidin at 2 nmol/L was used. As the gramicidin, one manufactured by SANTA CRUZ was used.

グラミシジンを含有する水溶液を用いること以外は、上記＜２．水流束の測定試験＞に記載の方法と同じ方法にしたがって、キャピラリー内に脂質二重膜を形成した。 <2. above except that an aqueous solution containing gramicidin is used. Water Flux Measurement Test> A lipid bilayer membrane was formed in the capillary according to the same method as described in “1.

グラミシジンを含有する水溶液を用いることによって、脂質二重膜を介した水の移動のみならず、イオンの移動も可能になる。脂質二重膜を介してイオンが移動すると、流動電位が発生する。パッチクランプアンプのモードをcurrent clamp modeに設定することによって、流動電位を観察することができる。 By using an aqueous solution containing gramicidin, not only the movement of water through the lipid bilayer membrane but also the movement of ions becomes possible. A streaming potential is generated when the ions move through the lipid bilayer. The streaming potential can be observed by setting the mode of the patch clamp amplifier to the current clamp mode.

本試験では、後に、脂質二重膜の両側から１００ｍＶずつの電圧をかけることになるが、流動電位を放置しておくと、脂質二重膜に印加される電圧に、流動電位の分の誤差が発生する。そこで、本試験では、最初にアンプに対して流動電位の分の補正を行うことによって、脂質二重膜に印加される電圧に流動電位の分の誤差が発生することを防いだ。アンプに補正を施した後、脂質二重膜に対して１００ｍＶ〜−１００ｍＶのランプ波をかけ、データを記録した。 In this test, a voltage of 100 mV is applied from both sides of the lipid bilayer membrane later, but if the streaming potential is left undisturbed, the error applied to the lipid bilayer membrane will be equal to the error of the streaming potential. Occurs. Therefore, in this test, by first correcting the streaming potential for the amplifier, the error applied to the lipid bilayer membrane due to the streaming potential was prevented. After correcting the amplifier, a ramp wave of 100 mV to -100 mV was applied to the lipid bilayer membrane, and the data was recorded.

記録したデータに基づいてＥｘｃｅｌを用いて電流−電圧曲線を描き、その１００ｍＶ〜−１００ｍＶのランプ波をかけた時の、膜電位とコンダクタンス比とを求めた。なお、グラミシジンによって脂質二重膜内に形成されるチャネルは対称構造を持つので、電流−電圧曲線は、理論上は対称になる。ところが非攪拌水層の発生に伴って、電流−電圧曲線が非対称になり、当該非対称性から、非攪拌水層内のイオン濃度を推定することができる。当該コンダクタンス比は、ＵＷＬ（Unstirred Water Layer）の形成に伴うＮａイオン濃度の比であると考えられる。当該コンダクタンス比に基づいて、ＵＷＬの影響を加味した、脂質二重膜の近傍での尿素の真の濃度を推定できると考えられる。浸透圧ごとのコンダクタンス比をグラフにまとめた（図３（ａ）参照）。 A current-voltage curve was drawn using Excel based on the recorded data, and the membrane potential and conductance ratio when the ramp wave of 100 mV to -100 mV was applied were obtained. Since the channel formed in the lipid bilayer membrane by gramicidin has a symmetrical structure, the current-voltage curve is theoretically symmetrical. However, with the generation of the non-stirred water layer, the current-voltage curve becomes asymmetric, and the ion concentration in the non-stirred water layer can be estimated from the asymmetry. It is considered that the conductance ratio is the ratio of Na ion concentration associated with the formation of UWL (Unstirred Water Layer). Based on the conductance ratio, it is considered possible to estimate the true concentration of urea in the vicinity of the lipid bilayer membrane, taking into consideration the influence of UWL. The conductance ratio for each osmotic pressure is summarized in a graph (see FIG. 3(a)).

（ｉ）ＮａＣｌを１００ｍＭの濃度にて含有する水溶液と、（ｉｉｉ）ＮａＣｌを１００ｍＭの濃度にて含有し、かつ、尿素を所望の濃度にて含有する水溶液との間の浸透圧差が１０００ｍＭの時には、脂質二重膜から十分に離れた水溶液と、脂質二重膜の近傍の水溶液との間の浸透圧には、１０％程度の誤差が認められた。 When the osmotic pressure difference between (i) an aqueous solution containing NaCl at a concentration of 100 mM and (iii) an aqueous solution containing NaCl at a concentration of 100 mM and urea at a desired concentration is 1000 mM An error of about 10% was observed in the osmotic pressure between the aqueous solution sufficiently separated from the lipid bilayer membrane and the aqueous solution in the vicinity of the lipid bilayer membrane.

つまり、（ｉ）ＮａＣｌを１００ｍＭの濃度にて含有する水溶液と、（ｉｉｉ）ＮａＣｌを１００ｍＭの濃度にて含有し、かつ、尿素を所望の濃度にて含有する水溶液との間の浸透圧差が１０００ｍＭの時の、ＵＷＬの影響が考慮されていないＰｆ（Osmotic Water Permeability Coefficient）の値は、実際のＰｆよりも、１０％程度過小評価されていると考えられる。 That is, the osmotic pressure difference between the aqueous solution containing (i) NaCl at a concentration of 100 mM and the aqueous solution containing (iii) NaCl at a concentration of 100 mM and urea at a desired concentration is 1000 mM. At this time, the value of Pf (Osmotic Water Permeability Coefficient) in which the influence of UWL is not considered is considered to be underestimated by about 10% from the actual Pf.

コンダクタンス比から、ＵＷＬの影響を考慮した真の浸透圧差（水透過性）を求めることができる。グラミシジンを含有する水溶液と従来から使用されているＤｐｈＰＣとによって形成された脂質二重膜の水のＰｆの値は、ＵＷＬの影響を考慮して算出すると、約４．５５μｍ／ｓ（浸透圧差１０００ｍＭ)であった（図３（ｂ）および図３（ｃ）参照）。 From the conductance ratio, the true osmotic pressure difference (water permeability) in consideration of the influence of UWL can be obtained. The value of Pf of water in the lipid bilayer formed by the aqueous solution containing gramicidin and the conventionally used DphPC was calculated to be about 4.55 μm/s (osmotic pressure difference of 1000 mM when calculated taking into account the influence of UWL. ) (See FIG. 3(b) and FIG. 3(c)).

本実施例において、１００ｍＶ時のＵＷＬのコンダクタンスの絶対値をＧ（＋）とし、−１００ｍＶ時のＵＷＬのコンダクタンスの絶対値をＧ（−）とすれば、１００ｍＶ時における脂質二重膜の真のコンダクタンスＧｍは、「Ｇｍ＝（Ｇ（＋）＋Ｇ（−））／２」にて算出することができる。また、本実施例において、尿素を含有する水溶液の側のＵＷＬのコンダクタンスの絶対値Ｇ（−）と、脂質二重膜のコンダクタンスＧｍとの誤差Ｇ’は、「Ｇ’＝[（Ｇｍ−Ｇ（−））／Ｇｍ]×１００」にて算出することができる。 In this example, if the absolute value of the UWL conductance at 100 mV is G(+) and the absolute value of the UWL conductance at −100 mV is G(−), the true value of the lipid bilayer membrane at 100 mV is shown. The conductance Gm can be calculated by “Gm=(G(+)+G(−))/2”. Further, in the present example, the error G′ between the absolute value G(−) of the UWL conductance on the side of the aqueous solution containing urea and the conductance Gm of the lipid bilayer is “G′=[(Gm−G (−))/Gm]×100”.

＜４．流動電位の測定試験＞
上記＜３．非撹拌水層の測定試験＞に記載の方法と同じ方法にしたがって、キャピラリー内に脂質二重膜を形成した。但し、本試験では、キャピラリーの両端部は、閉塞させることなく、開放した（Ｏｐｅｎ法）。また、本試験では、ＮａＣｌの代わりに２００ｍＭの濃度のＫＣｌを用い、かつ、尿素の各々の代わりに、２００ｍＭ、４００ｍＭ、６００ｍＭ、８００ｍＭ、または、１００ｍＭのスクロースを用いた。また、本試験では、グラミシジンを２ｎｍｏｌ／Ｌにて含有する水溶液を用いた。 <4. Streaming potential measurement test>
Above <3. A lipid bilayer membrane was formed in the capillary according to the same method as described in "Measurement test of non-stirred water layer". However, in this test, both ends of the capillary were opened without being closed (Open method). In this test, KCl at a concentration of 200 mM was used instead of NaCl, and 200 mM, 400 mM, 600 mM, 800 mM, or 100 mM sucrose was used instead of each of urea. In this test, an aqueous solution containing gramicidin at 2 nmol/L was used.

浸透圧差によって、脂質二重膜内に形成されたチャネルを介して水が移動すると、当該水と共にイオンも移動する。そして、当該イオンの移動によって、流動電位が発生する。そこで、当該流動電位を、current clamp（Ｉ＝０）の条件下にて、塩化銀電極を用いて測定した。その結果を、図４に示す。図４より、水／イオン流束比の値は、１１．２であった。 When water moves through the channel formed in the lipid bilayer due to the osmotic pressure difference, ions move with the water. Then, due to the movement of the ions, a streaming potential is generated. Therefore, the streaming potential was measured using a silver chloride electrode under the condition of current clamp (I=0). The result is shown in FIG. From FIG. 4, the value of the water/ion flux ratio was 11.2.

＜５．グラミシジンチャネルの機能解析＞
グラミシジンおよび尿素を含有する水溶液（液１）、脂質二重膜作製用ＤｐｈＰＣ、および、純水（液２）を用いて、脂質二重膜を形成した（Ｃｌｏｓｅｄ法）。このとき、浸透圧の低い液２側から液１側へ水が移動し、膜の移動が起こった（図５参照）。グラミシジンは液１のみにしか入っていないため、脂質二重膜内にチャネルは形成されない。それ故に、このときの水の移動は、脂質二重膜を介してのみ起こっている。 <5. Functional analysis of gramicidin channel>
A lipid bilayer membrane was formed using the aqueous solution containing gramicidin and urea (Liquid 1), DphPC for lipid bilayer membrane formation, and pure water (Liquid 2) (Closed method). At this time, water moved from the liquid 2 side having a low osmotic pressure to the liquid 1 side, and movement of the membrane occurred (see FIG. 5). Since gramicidin is contained only in the liquid 1, no channel is formed in the lipid bilayer membrane. Therefore, the movement of water at this time occurs only through the lipid bilayer membrane.

次いで、液２にグラミシジンを少量投与した。当該投与によって、脂質二重膜内にグラミシジンチャネルが形成され、脂質二重膜以外に、グラミシジンを介しても水の移動が起こる。その結果、脂質二重膜の移動速度は増加した（図５参照）。 Then, a small amount of gramicidin was administered to the liquid 2. By the administration, a gramicidin channel is formed in the lipid bilayer membrane, and migration of water occurs not only through the lipid bilayer membrane but also through gramicidin. As a result, the migration rate of the lipid bilayer membrane was increased (see FIG. 5).

次いで、液２に、グラミシジンチャネルのブロッカーとして機能する塩化ナトリウム溶液を投与した。グラミシジンチャネルの水透過性は、ナトリウムイオン存在時の方が、ナトリウムイオン非存在時よりも低下し、その結果、脂質二重膜の移動速度は減少した（図５参照）。 Liquid 2 was then administered a sodium chloride solution that functions as a blocker for the gramicidin channel. The water permeability of the gramicidin channel was lower in the presence of sodium ion than in the absence of sodium ion, and as a result, the migration rate of lipid bilayer membrane was decreased (see FIG. 5).

なお、グラミシジンチャネルが存在しない脂質二重膜の水透過性よりも、塩化ナトリウムが存在する条件下にて測定された、グラミシジンチャネルが存在する脂質二重膜の水透過性の方が、大きかった。 The water permeability of the lipid bilayer membrane in the presence of gramicidin channel was higher than that of the lipid bilayer membrane in the absence of gramicidin channel, as measured under the condition of sodium chloride. ..

本発明は、脂質二重膜の水流束の評価システム、脂質二重膜の非撹拌水層の評価システム、または、脂質二重膜の流動電位の評価システムなどに用いることができる。 INDUSTRIAL APPLICATION This invention can be used for the evaluation system of the water flux of a lipid bilayer membrane, the evaluation system of the unstirred water layer of a lipid bilayer membrane, the evaluation system of the streaming potential of a lipid bilayer membrane, etc.

１ 第１の水溶液
２ 第２の水溶液
５ 管
６ 第１の開口
７ 第２の開口
８ 第３の開口
１０ 脂質二重膜形成領域
１５ 開閉部
２０ 第１の副管
２１ 第１の投入口
２２ 第１の排出口
３０ 第２の副管
３１ 第２の投入口
３２ 第２の排出口
４０・４１ 電極
５０ 移動距離計測計
６０ 脂質二重膜
Ｓ０ 脂質二重膜形成工程
Ｓ１ 計測工程 1 1st aqueous solution 2 2nd aqueous solution 5 pipe 6 1st opening 7 2nd opening 8 3rd opening 10 Lipid bilayer formation area 15 Opening/closing part 20 1st auxiliary pipe 21 1st input port 22 First discharge port 30 Second auxiliary pipe 31 Second input port 32 Second discharge port 40/41 Electrode 50 Moving distance meter 60 Lipid bilayer membrane S0 Lipid bilayer formation step S1 Measurement step

Claims (9)

内部に、所定の浸透圧濃度である第１の水溶液、脂質二重膜、および、上記第１の水溶液よりも高い浸透圧濃度である第２の水溶液をこの順番にて配置するための管であって、当該管を開閉する開閉部を備えている管と、
上記脂質二重膜の移動距離を計測するための移動距離計測計と、
上記脂質二重膜を介した電位差と電流とを制御および計測するための電極対と、
を備えていることを特徴とする、脂質二重膜の水透過性の評価システム。 A pipe for arranging a first aqueous solution having a predetermined osmotic concentration, a lipid bilayer membrane, and a second aqueous solution having a higher osmotic concentration than the first aqueous solution in this order inside. There is a pipe that has an opening and closing unit that opens and closes the pipe,
A travel distance meter for measuring the travel distance of the lipid bilayer membrane,
An electrode pair for controlling and measuring the electric potential difference and the electric current through the lipid bilayer membrane,
An evaluation system for water permeability of a lipid bilayer membrane, comprising: 上記脂質二重膜は、イオノフォア、または、ポリペプチドを含有するものであることを特徴とする、請求項１に記載の脂質二重膜の水透過性の評価システム。 The lipid bilayer membrane water permeability evaluation system according to claim 1, wherein the lipid bilayer membrane contains an ionophore or a polypeptide. 上記脂質二重膜の水透過性の評価システムは、水流束の評価システム、非撹拌水層の評価システム、または、流動電位の評価システムであることを特徴とする、請求項１または２に記載の脂質二重膜の水透過性の評価システム。 The water permeation evaluation system of the lipid bilayer membrane is a water flux evaluation system, a non-stirred water layer evaluation system, or a streaming potential evaluation system, wherein the evaluation system is characterized. System for evaluating water permeability of lipid bilayer membranes in Japan. 上記管は、
上記管内に上記第１の水溶液を導入するための第１の開口と、
上記管内に上記第２の水溶液を導入するための第２の開口と、
上記第１の開口と上記第２の開口との間にて上記管に設けられている第３の開口であって、上記第３の開口から上記管内に配置されている、上記脂質二重膜を形成するための油を吸引するための第３の開口と、を備えていることを特徴とする、請求項１〜３の何れか１項に記載の脂質二重膜の水透過性の評価システム。 The tube is
A first opening for introducing the first aqueous solution into the tube;
A second opening for introducing the second aqueous solution into the tube;
The lipid bilayer membrane, which is a third opening provided in the tube between the first opening and the second opening and which is arranged in the tube from the third opening. And a third opening for sucking oil for forming the oil. 4. Evaluation of water permeability of the lipid bilayer membrane according to any one of claims 1 to 3, system. 上記脂質二重膜の水透過性の評価システムは、上記管を複数備えていることを特徴とする、請求項１〜４の何れか１項に記載の脂質二重膜の水透過性の評価システム。 The water permeability evaluation system for a lipid bilayer membrane comprises a plurality of the tubes, wherein the water permeability evaluation for a lipid bilayer membrane according to any one of claims 1 to 4, characterized in that system. 上記水透過性の評価システムは、複数の上記第１の開口のうちの少なくとも２つと接続されている第１の副管と、複数の上記第２の開口のうちの少なくとも２つと接続されている第２の副管と、を備えていることを特徴とする、請求項５に記載の脂質二重膜の水透過性の評価システム。 The water permeability evaluation system is connected to a first sub-tube connected to at least two of the plurality of first openings and at least two of the plurality of second openings. The water-permeability evaluation system of the lipid bilayer membrane according to claim 5, further comprising a second sub-tube. 請求項１〜６の何れか１項に記載の脂質二重膜の水透過性の評価システムを用いる脂質二重膜の水透過性の評価方法であって、
上記管内に配置されている脂質二重膜の移動距離の計測、および、上記管内に配置されている脂質二重膜を介した電位差と電流との制御および／または計測、を行う計測工程を有することを特徴とする、脂質二重膜の水透過性の評価方法。 A method for evaluating water permeability of a lipid bilayer membrane using the evaluation system for water permeability of a lipid bilayer membrane according to claim 1.
It has a measuring step of measuring the migration distance of the lipid bilayer membrane arranged in the tube, and controlling and/or measuring the electric potential difference and the current through the lipid bilayer membrane arranged in the tube. A method for evaluating water permeability of a lipid bilayer membrane, comprising: 上記脂質二重膜の水透過性の評価方法は、水流束の評価方法、非撹拌水層の評価方法、または、流動電位の評価方法である請求項７に記載の脂質二重膜の水透過性の評価方法。 The water permeation of the lipid bilayer membrane according to claim 7, wherein the water permeation evaluation method of the lipid bilayer membrane is a water flux evaluation method, an unstirred water layer evaluation method, or a streaming potential evaluation method. Sex evaluation method. 請求項１〜６の何れか１項に記載の脂質二重膜の水透過性の評価システムを用いる、脂質二重膜の水透過性を制御する薬剤のスクリーニング方法であって、
上記管内に配置されている第１の水溶液、脂質二重膜、および、第２の水溶液からなる群から選択される少なくとも１つに薬剤の候補物質を加える添加工程と、
上記管内に配置されている脂質二重膜の移動距離の計測、および、上記管内に配置されている脂質二重膜を介した電位差と電流との制御および／または計測を行う、計測工程と、
上記計測工程によって得られた計測値と、参照値とを比較する比較工程と、を有することを特徴とする、スクリーニング方法。 A method for screening a drug for controlling the water permeability of a lipid bilayer membrane, which uses the evaluation system for water permeability of a lipid bilayer membrane according to claim 1.
An addition step of adding a drug candidate substance to at least one selected from the group consisting of a first aqueous solution, a lipid bilayer membrane, and a second aqueous solution arranged in the tube,
A measurement step of measuring the migration distance of the lipid bilayer membrane arranged in the tube, and controlling and/or measuring the potential difference and the current through the lipid bilayer membrane arranged in the tube, and a measuring step,
A screening method comprising a comparison step of comparing the measurement value obtained by the measurement step with a reference value.
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