JP2010081838A - Microfluidic chip and cell counter - Google Patents

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To detect a reaction in a measurement object such as cell contents or a specific cell organelle, etc., and to continuously and efficiently perform analyses and measurements. <P>SOLUTION: The cell counter includes a microfluidic chip in which a phospholipid molecule-containing organic phase flows in a flow channel, an introduction mechanism for alternately introducing water phases containing a measurement object to the flow channel of the microfluidic chip so as to form a phospholipid membrane of unimolecular structure constituted of at least a phospholipid molecule between the water phases and the organic phase and alternately forming immiscible two-phase liquid drops in a state in which water phases are wrapped in the phospholipid membrane and a detection mechanism for detecting a reaction of a measurement object in the flow channel. In the flow channel of the microfluidic chip, phospholipid membranes formed on the surfaces of the two-phase liquid drops are contacted and a lipid bimolecular membrane is formed in parallel in the flow channel and a reaction of a measurement object between the lipid bimolecular membrane in the flow channel is detected by a detection mechanism. <P>COPYRIGHT: (C)2010,JPO&INPIT

Description

本発明は、マイクロ流体チップおよび細胞計測装置に関する。   The present invention relates to a microfluidic chip and a cell measurement device.

従来から、マイクロ流体チップ内などで連続的に計測対象の細胞や試薬等との反応などを計測する技術として、以下の技術が報告されている。   Conventionally, the following techniques have been reported as techniques for continuously measuring reactions with cells or reagents to be measured in a microfluidic chip or the like.

例えば、特許文献１は、細胞を整列させて流すフローセルと、このフローセル内を流れる細胞にレーザ光を照射する光照射手段と、前記光照射手段から直接光の通過を阻止するビームストッパと、細胞によって散乱された２種類の散乱光をそれぞれ検知し得る少なくとも２個に分画された受光センサー部を有する単一の受光手段とを備えた細胞分析装置を開示している。   For example, Patent Document 1 discloses a flow cell that allows cells to flow in an aligned manner, a light irradiation unit that irradiates a laser beam to cells flowing in the flow cell, a beam stopper that blocks direct passage of light from the light irradiation unit, and a cell. And a single light-receiving means having at least two light-receiving sensor sections that can respectively detect two types of scattered light scattered by the cell.

また、特許文献２は、計測対象となる細胞などの試料を含む液体を保持する試料保持機構と、試料保持機構の計測領域に対して互いに異なる３つの計測方法に沿って計測光源から計測光を照射し、計測方向のそれぞれについて試料を通過した光を撮像装置で測定してその位相差像を取得する位相差像取得装置とを設けた試料計測装置および計測方法を開示している。   Patent Document 2 discloses a sample holding mechanism for holding a liquid containing a sample such as a cell to be measured, and measurement light from a measurement light source along three different measurement methods with respect to the measurement region of the sample holding mechanism. There is disclosed a sample measuring apparatus and a measuring method provided with a phase difference image acquiring apparatus that irradiates and measures the light passing through the sample in each measurement direction with an imaging device and acquires the phase difference image thereof.

また、特許文献３は、基板に形成された細胞を搬送する流路を備え、該流路の上流端に細胞を注入する手段と、前記流路内の細胞を画像信号として検出する第１の細胞識別領域と、該第１の細胞識別領域の下流に形成された時間調整器と、該時間調整器の下流に形成された前記流路内の細胞を画像信号として検出する第２の細胞識別領域と、該第２の細胞識別領域の下流に形成された前記流路内の細胞を２つの流路に選択的に排出流路と、からなるセルソーターチップおよびセルソータを開示している。   Further, Patent Document 3 includes a flow path for transporting cells formed on a substrate, first means for injecting cells into the upstream end of the flow path, and first cells for detecting cells in the flow path as image signals. A cell identification area; a time adjuster formed downstream of the first cell identification area; and a second cell identification for detecting a cell in the channel formed downstream of the time adjuster as an image signal There is disclosed a cell sorter chip and a cell sorter comprising a region, and a cell in the channel formed downstream of the second cell identification region, and a discharge channel selectively into two channels.

また、特許文献４は、第１のパラメータが細胞に光を照射して得られる細胞の錯乱光ないし蛍光情報によるものであり、第２のパラメータが細胞の画像によるものであるゲル電極付きセルソーターチップを開示している。   Patent Document 4 discloses a cell sorter chip with a gel electrode, in which the first parameter is based on the scattered light or fluorescence information obtained by irradiating the cell with light, and the second parameter is based on the cell image. Is disclosed.

また、特許文献５は、流体サンプルを少なくとも２種類の色素および少なくとも一種細胞表面マーカーと混合させる段階からなり、上記色素はそれぞれ別々にサンプル内の細胞の異なった特徴を評価し、かつ上記マーカーは異なる系統の細胞に別様に発現する抗原を認識し、標識した溶液を形成する流体内細胞成分の分析法を開示している。また、特許文献５の流体内細胞成分の分析法において、それぞれの色素および標識は蛍光を発し、かつ互いに識別可能な放出スペクトルのピークを持つことや、さらに標識した溶液は検出器を通過させ、その中で溶液中の各細胞は一度に実質上１個ずつ試験され、蛍光強度および散乱光の測定が試験しようとするそれぞれに細胞について行われていることが開示されている。   Patent Document 5 includes a step of mixing a fluid sample with at least two kinds of dyes and at least one kind of cell surface marker, wherein each of the dyes separately evaluates different characteristics of cells in the sample, and the marker is Disclosed are methods for analyzing cellular components in fluids that recognize antigens that are differentially expressed in cells of different lineages and form labeled solutions. In addition, in the method for analyzing cellular components in a fluid of Patent Document 5, each dye and label fluoresce and have emission spectrum peaks that are distinguishable from each other, and the labeled solution is passed through a detector. It is disclosed that each cell in solution is tested substantially one at a time, and that fluorescence intensity and scattered light measurements are performed on each cell to be tested.

また、特許文献６は、単一もしくは複数の核関連タンパク質をコードする遺伝子と蛍光タンパク質をコードする遺伝子とを融合し培養細胞に導入して細胞内に発現させた母細胞を生成し、被検物質の毒性もしくは突然変異性試験のための処理を施し、小核領域が限定的に蛍光を発するような限定的励起を行い、核関連タンパク成分に応じた蛍光量を定量的に測定することにより、計測対象の細胞の固定を行うことなく生細胞中における検出を可能とする細胞内小核の検出方法を開示している。   Further, Patent Document 6 generates a mother cell that is expressed in a cell by fusing a gene encoding a single or a plurality of nuclear-related proteins and a gene encoding a fluorescent protein into a cultured cell. By subjecting the substance to toxicity or mutation testing, performing limited excitation such that the micronuclear region emits fluorescence in a limited manner, and quantitatively measuring the amount of fluorescence according to the nuclear-related protein component Discloses a method for detecting intracellular micronuclei that enables detection in living cells without fixing cells to be measured.

さらに、細胞機能の計測項目の１つである膜タンパク質の評価技術として、例えば、特許文献７の電気生理学的測定システムにおいて、イオン・チャネルを持つ脂質膜組織内のイオン・チャネルの電気生理学的な特性を測定および／または観察するための基板が報告されている。   Furthermore, as an evaluation technique of membrane protein which is one of the measurement items of cell function, for example, in the electrophysiological measurement system of Patent Document 7, the electrophysiological of the ion channel in the lipid membrane tissue having the ion channel is described. Substrates for measuring and / or observing properties have been reported.

また、流路内の微小セグメントに細胞などのサンプルを封入して輸送する技術として、以下の技術が報告されている。   Moreover, the following techniques have been reported as a technique for enclosing and transporting a sample such as a cell in a minute segment in a flow path.

例えば、特許文献８は、マイクロドロップにカプセル化した細胞から分泌されるタンパク質を解析する解析法を開示している。また、特許文献８の方法は、細胞集団を解析し、細胞集団をマイクロドロップにカプセル化する工程、固相支持体に吸着した細胞カプセル化マイクロドロップのアレイを作製し、走査型蛍光、比色、化学発光検出器等を用いて検出する工程、および、細胞カプセル化マイクロドロップを薬剤と接触させ、薬剤が分泌タンパク質のレベルに影響を及ぼすか否かが検出によって示される工程などを更に含むことを開示している。   For example, Patent Document 8 discloses an analysis method for analyzing a protein secreted from a cell encapsulated in a microdrop. Further, the method of Patent Document 8 analyzes a cell population, encapsulates the cell population in microdrops, creates an array of cell-encapsulated microdrops adsorbed on a solid support, and scans fluorescence and colorimetry. , Further including a step of detecting using a chemiluminescence detector or the like, and a step of contacting the cell-encapsulated microdrop with the drug and indicating whether or not the drug affects the level of secreted protein by detection. Is disclosed.

また、特許文献９は、マイクロチャネル内で、材料の一連の微小容積体セグメントを形成しかつ輸送する方法であって、（ａ）輸送流体源に接続されたインレット・エンドと、流体リザーバに接続されたアウトレット・エンドとを有する第１チャンネルを設けるステップと、（ｂ）セグメント化流体源に接続されたインレット・エンドと、前記第１チャンネルに相互接続されたアウトレット・エンドとを有する第２チャンネルを設けるステップと、（ｃ）セグメント化流体の容積を第１チャンネルに引き込むステップと、および、（ｄ）前記第１チャンネル内のセグメント化流体の容積を、前記流体リザーバ方向に輸送するステップと、（ｅ）ステップ（ｃ）と（ｄ）とを繰り返して、セグメント化流体の一連の分離した容積を形成するステップとを含む小容量体を制御操作する方法および微小流体デバイスを開示している。   Patent document 9 is a method for forming and transporting a series of microvolume segments of material within a microchannel, (a) an inlet end connected to a transport fluid source and a fluid reservoir Providing a first channel having a configured outlet end; and (b) a second channel having an inlet end connected to a segmented fluid source and an outlet end interconnected to the first channel. (C) drawing the volume of segmented fluid into the first channel; and (d) transporting the volume of segmented fluid in the first channel toward the fluid reservoir; (E) Repeat steps (c) and (d) to form a series of separate volumes of segmented fluid. It discloses a method and microfluidic devices for controlling the operation of small-capacity body and a flop.

特許第３３７５２０３号公報Japanese Patent No. 3375203 特開２００６−８４２３３号公報JP 2006-84233 A 特開２００７−１０４９２９号公報JP 2007-104929 A 特許第４０４７３３６号公報Japanese Patent No. 4047336 特公平０７−２６９５４号公報Japanese Patent Publication No. 07-26954 特開２００６−１０１７０５号公報JP 2006-101705 A 特許第４０３３７６８号公報Japanese Patent No. 4033768 特表２００４−５２８５７４号公報Special table 2004-528574 gazette 特表２００３−５０７１６２号公報Special table 2003-507162

しかしながら、従来のマイクロ流体チップ内などで連続的に計測対象の細胞や試薬等との反応などを計測する技術（特許文献１〜特許文献６等）によれば、細胞を整列させて流すフローセルとこのフローセル内を流れる細胞にレーザ光などを照射する光照射手段とを有し、蛍光発光技術を用いて細胞の特性を計測する一般的な方法を実施するものであるものの、これらの従来技術（特許文献１〜特許文献６等）においては、その構造上、細胞を表面から観察する手法に過ぎず、細胞の内容物の厳密な測定には不向きであるという問題点を有していた。また、その細胞内容物は、細胞自身の細胞膜により作動溶液と分離されているため、外的手段等により細胞を破砕した場合は、細胞の内容物が瞬時に作動溶液内に拡散し、消失してしまうという問題点を有していた。   However, according to a technique (Patent Document 1 to Patent Document 6 and the like) that continuously measures a reaction with cells or reagents to be measured in a conventional microfluidic chip or the like, Although it has a light irradiation means for irradiating the cells flowing in the flow cell with laser light and the like, and implements a general method for measuring cell characteristics using a fluorescence emission technology, these conventional techniques ( In Patent Documents 1 to 6, etc., there is a problem that, due to its structure, it is only a method for observing cells from the surface, and is not suitable for strict measurement of cell contents. In addition, since the cell contents are separated from the working solution by the cell membrane of the cell itself, when the cells are disrupted by external means, the cell contents are instantly diffused into the working solution and disappear. It had the problem that it ended up.

また、従来の細胞機能の計測項目の１つである膜タンパク質の評価技術（特許文献７等）においては、個別の細胞を測定部位に拘束する必要があるため、高速で連続的な測定ができないという問題点を有していた。   In addition, in the conventional membrane protein evaluation technique (Patent Document 7, etc.) which is one of the measurement items of cell function, it is necessary to constrain individual cells to the measurement site, and thus high-speed and continuous measurement cannot be performed. It had the problem that.

また、従来の流路内の微小セグメントに細胞などのサンプルを封入して輸送する技術（特許文献８および９等）においては、計測対象の環境に大きな影響を与えることなく細胞の計測が可能となるものの、隣接する微小領域間で細胞およびその内容物等に含まれる分子の脂質膜等を介した移動を考慮しておらず、隣接する微小領域による影響により生じる細胞およびその内容物内における反応を検出することができないという問題点を有していた。   In addition, in the conventional technology (Patent Documents 8 and 9, etc.) in which a sample such as a cell is enclosed and transported in a minute segment in a flow channel, the cell can be measured without greatly affecting the environment of the measurement target. However, it does not take into account the movement of molecules contained in cells and their contents between adjacent microregions through lipid membranes, etc., and the reaction in the cells and their contents caused by the influence of adjacent microregions Has a problem that it cannot be detected.

本発明は、上記に鑑みてなされたもので、細胞やその内容物もしくは特定の細胞小器官等の計測対象を２相液滴（リン脂質膜カプセル）内に収容でき、隣接する２相液滴による影響にて生じる計測対象における反応を検出でき、これらを連続的に効率よく分析・計測することができるマイクロ流体チップおよび細胞計測装置を提供することを目的とする。   The present invention has been made in view of the above, and can measure a measurement target such as a cell, its contents, or a specific organelle in a two-phase droplet (phospholipid membrane capsule), and adjacent two-phase droplets. It is an object of the present invention to provide a microfluidic chip and a cell measuring apparatus that can detect a reaction in a measurement target caused by the influence of, and can analyze and measure these continuously and efficiently.

上述した課題を解決して、本発明の目的を達成するために、本発明に係るマイクロ流体チップは、非混合性の２相液滴を流路内に交互に生成し、当該２相液滴の表面に生成されたリン脂質膜を前記流路内で接触させて脂質二分子膜を前記流路内に並列生成するマイクロ流体チップであって、前記脂質二分子膜間に計測対象が導入されることを特徴とする。   In order to solve the above-described problems and achieve the object of the present invention, a microfluidic chip according to the present invention alternately generates non-mixable two-phase droplets in a flow path, and the two-phase droplets. A microfluidic chip in which a phospholipid membrane formed on the surface of the membrane is brought into contact in the flow path to generate a lipid bilayer in parallel in the flow path, and a measurement target is introduced between the lipid bilayers. It is characterized by that.

また、本発明の望ましい態様としては、前記脂質二分子膜間に前記計測対象である細胞を少なくとも１つ含むことが好ましい。   Moreover, as a desirable aspect of the present invention, it is preferable that at least one cell to be measured is included between the lipid bilayer membranes.

また、本発明の望ましい態様としては、前記流路上に配置された破砕機構により前記計測対象の少なくとも膜構造を破砕することが好ましい。   Moreover, as a desirable aspect of the present invention, it is preferable that at least the membrane structure of the measurement target is crushed by a crushing mechanism disposed on the flow path.

また、本発明の望ましい態様としては、前記破砕機構は、前記流路上に配置された電極から印加された電圧により、前記計測対象の少なくとも前記膜構造を破砕する電気的破砕機構であることが好ましい。   Moreover, as a desirable aspect of the present invention, the crushing mechanism is preferably an electric crushing mechanism that crushes at least the membrane structure of the measurement target by a voltage applied from an electrode disposed on the flow path. .

また、本発明の望ましい態様としては、前記破砕機構は、前記２相液滴を前記接触させる前に配置されていることが好ましい。   Moreover, as a desirable aspect of the present invention, it is preferable that the crushing mechanism is disposed before the two-phase droplets are brought into contact with each other.

また、本発明の望ましい態様としては、前記リン脂質膜および前記脂質二分子膜を構成するリン脂質分子は、機能性分子を含むことが好ましい。   As a desirable mode of the present invention, it is preferable that the phospholipid molecules constituting the phospholipid membrane and the lipid bilayer membrane include a functional molecule.

上述した課題を解決して、本発明の目的を達成するために、本発明に係る細胞計測装置は、リン脂質分子を含む有機相が流路内を流れるマイクロ流体チップと、前記マイクロ流体チップの前記流路内へ、計測対象を含む水相を交互に導入することにより、前記水相と前記有機相との間に、少なくとも前記リン脂質分子から構成される単分子構造のリン脂質膜を生成し、当該リン脂質膜内に前記水相を包んだ状態の非混合性の２相液滴を交互に生成する導入機構と、前記流路内における前記計測対象の反応を検出する検出機構と、を備え、前記マイクロ流体チップの前記流路において、当該２相液滴の表面に生成された前記リン脂質膜を前記流路内で接触させて脂質二分子膜を前記流路内に並列生成し、前記検出機構により、前記流路内の前記脂質二分子膜間の前記計測対象の反応を検出する、ことを特徴とする。   In order to solve the above-described problems and achieve the object of the present invention, a cell measurement device according to the present invention includes a microfluidic chip in which an organic phase containing phospholipid molecules flows in a flow path, and the microfluidic chip. A phospholipid membrane having a monomolecular structure composed of at least the phospholipid molecule is generated between the aqueous phase and the organic phase by alternately introducing an aqueous phase including a measurement target into the flow path. An introduction mechanism that alternately generates non-mixable two-phase droplets in a state where the aqueous phase is wrapped in the phospholipid membrane, a detection mechanism that detects a reaction of the measurement target in the flow path, And in the flow path of the microfluidic chip, the phospholipid membrane formed on the surface of the two-phase droplet is brought into contact in the flow path to form a lipid bilayer in parallel in the flow path. , By the detection mechanism, Detecting the reaction of the measurement object between quality bilayer, characterized in that.

また、本発明の望ましい態様としては、前記有機相を前記マイクロ流体チップの前記流路内から除去する有機相除去機構、を更に備え、前記２相液滴の周辺の前記有機相を当該有機相除去機構により前記流路内から除去することにより、近接する前記２相液滴の前記単分子構造の前記リン脂質膜同士を接触させて前記脂質二分子膜を生成し、生成された当該脂質二分子膜で前記２相液滴を並列化することが好ましい。   In addition, as a desirable aspect of the present invention, an organic phase removal mechanism that removes the organic phase from the flow path of the microfluidic chip is further provided, and the organic phase around the two-phase droplet is the organic phase. By removing the phospholipid membrane of the monomolecular structure of the adjacent two-phase droplets by contacting with each other by removing from the flow path by a removal mechanism, the lipid bilayer membrane is generated, and the generated lipid bilayer membrane is formed. It is preferable to parallelize the two-phase droplets with a molecular film.

また、本発明の望ましい態様としては、前記脂質二分子膜間に前記計測対象である細胞を少なくとも１つ含むことが好ましい。   Moreover, as a desirable aspect of the present invention, it is preferable that at least one cell to be measured is included between the lipid bilayer membranes.

また、本発明の望ましい態様としては、前記細胞計測装置は、前記計測対象の少なくとも膜構造を破砕する破砕機構、を更に備えることが好ましい。   Moreover, as a desirable aspect of the present invention, it is preferable that the cell measuring device further includes a crushing mechanism that crushes at least the membrane structure of the measurement target.

また、本発明の望ましい態様としては、前記破砕機構は、前記流路上に配置された電極から印加された電圧により、前記計測対象の少なくとも前記膜構造を破砕する電気的破砕機構であることが好ましい。   Moreover, as a desirable aspect of the present invention, the crushing mechanism is preferably an electric crushing mechanism that crushes at least the membrane structure of the measurement target by a voltage applied from an electrode disposed on the flow path. .

また、本発明の望ましい態様としては、前記破砕機構は、前記２相液滴を前記接触させる前に配置されていることが好ましい。   Moreover, as a desirable aspect of the present invention, it is preferable that the crushing mechanism is disposed before the two-phase droplets are brought into contact with each other.

また、本発明の望ましい態様としては、前記リン脂質分子は、機能性分子を含むことが好ましい。   As a desirable mode of the present invention, it is preferred that the phospholipid molecule contains a functional molecule.

このように、本発明は、細胞および細胞内容物を効率よく連続的に計測・分析するため、細胞および細胞内容物等の計測対象をリン脂質膜で区切られた微小空間（２相液滴内）に導入し、導入することにより生成された２相液滴（細胞カプセル）を、計測・分析用の反応容器として利用することを特徴とする。   Thus, in the present invention, in order to efficiently and continuously measure and analyze cells and cell contents, the measurement object such as cells and cell contents is separated into a minute space (in a two-phase droplet) separated by a phospholipid membrane. ), And the two-phase droplet (cell capsule) generated by the introduction is used as a reaction vessel for measurement and analysis.

本発明に係るマイクロ流体チップおよび細胞計測装置は、細胞やその内容物もしくは特定の細胞小器官等の計測対象を２相液滴（リン脂質膜カプセル）内に収容でき、隣接する２相液滴による影響にて生じる計測対象における反応を検出でき、これらを連続的に効率よく分析・計測できる。   The microfluidic chip and the cell measurement device according to the present invention can accommodate a measurement target such as a cell, its contents, or a specific organelle in a two-phase droplet (phospholipid membrane capsule), and adjacent two-phase droplets It is possible to detect the reaction in the measurement target that occurs due to the influence of, and analyze and measure these continuously and efficiently.

以下、本発明につき図面を参照しつつ詳細に説明する。なお、以下に説明する発明を実施するための最良の形態（以下、実施形態という）により本発明が限定されるものではない。   Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to the drawings. It should be noted that the present invention is not limited to the best mode for carrying out the invention described below (hereinafter referred to as an embodiment).

本実施形態は、マイクロ流体チップにおいて、非混合性の２相液滴（例えば、エマルション滴）を流路内に交互に生成し、当該２相液滴の表面に生成されたリン脂質膜を流路内で接触させて脂質二分子膜を流路内に並列生成し、脂質二分子膜間に計測対象が導入される点に特徴がある。また、本実施形態は、細胞計測装置において、リン脂質分子を含む有機相が流路内を流れるマイクロ流体チップと、マイクロ流体チップの流路内へ、計測対象を含む水相を交互に導入することにより、水相と有機相との間に、少なくともリン脂質分子から構成される単分子構造のリン脂質膜を生成し、当該リン脂質膜内に水相を包んだ状態の非混合性の２相液滴を交互に生成する導入機構と、流路内における計測対象の反応を検出する検出機構と、を備え、マイクロ流体チップの流路において、当該２相液滴の表面に生成されたリン脂質膜を流路内で接触させて脂質二分子膜を流路内に並列生成し、検出機構により、流路内の脂質二分子膜間の計測対象の反応を検出する点に特徴がある。   In this embodiment, in a microfluidic chip, non-mixable two-phase droplets (for example, emulsion droplets) are alternately generated in the flow path, and the phospholipid membrane generated on the surface of the two-phase droplets is allowed to flow. It is characterized in that lipid bilayer membranes are produced in parallel in the channel by contacting in the channel, and the measurement target is introduced between the lipid bilayer membranes. Further, in the present embodiment, in the cell measurement device, a microfluidic chip in which an organic phase containing phospholipid molecules flows in the flow path and a water phase containing a measurement target are alternately introduced into the flow path of the microfluidic chip. Thus, a phospholipid membrane having a monomolecular structure composed of at least phospholipid molecules is generated between the aqueous phase and the organic phase, and the immiscible 2 in a state where the aqueous phase is enclosed in the phospholipid membrane. An introduction mechanism that alternately generates phase droplets and a detection mechanism that detects a reaction to be measured in the flow channel, and the phosphor formed on the surface of the two-phase droplet in the flow channel of the microfluidic chip. The lipid membrane is brought into contact in the flow channel to form a lipid bilayer in parallel in the flow channel, and the detection mechanism detects the reaction to be measured between the lipid bilayers in the flow channel.

ここで、本実施形態において「計測対象」とは、マイクロ流体チップ内で検出機構により反応等が計測される対象物であり、例えば、細胞、細胞内容物、情報伝達物質、酵素化合物、抗体、蛍光試料、および、試薬等のうち少なくとも１つを含む。   Here, in this embodiment, the “measurement object” is an object whose reaction is measured by a detection mechanism in the microfluidic chip, for example, a cell, a cell content, an information transmission substance, an enzyme compound, an antibody, At least one of a fluorescent sample and a reagent is included.

具体的には、計測対象の細胞内容物の一例としては、細胞核、ミトコンドリアなどの細胞内小器官の他、ＤＮＡ、ＲＮＡなどの核酸類やそれらによってコードされたアミノ酸、ペプチド、タンパク質、その他脂肪粒やグリコーゲン粒などそれ自体に活性を持たない物質を含んでもよく、または、細胞膜内に存在する各種受容体や、細胞膜表面を修飾する糖鎖類を含んでもよい。   Specifically, examples of cell contents to be measured include intracellular organelles such as cell nuclei and mitochondria, nucleic acids such as DNA and RNA, and amino acids, peptides, proteins, and other fat particles encoded by them. Or a substance having no activity per se, such as glycogen granules, or various receptors present in the cell membrane and sugar chains that modify the cell membrane surface.

また、計測対象の情報伝達物質の一例としては、シグナル伝達、細胞活性に寄与するカルシウムイオンなどの電解質や各種ホルモンなどの情報伝達物質を含んでもよい。   In addition, as an example of the information transmission substance to be measured, an information transmission substance such as an electrolyte such as calcium ions and various hormones that contribute to signal transmission and cell activity may be included.

また、計測対象の酵素化合物の一例としては、プロテインキナーゼなどの酵素化合物を含んでもよい。   Moreover, as an example of the enzyme compound to be measured, an enzyme compound such as protein kinase may be included.

また、計測対象の蛍光試料の一例としては、蛍光抗体観察において一般的に用いられるフルオレシンやローダミン、蛍光標識として多用されている蛍光タンパク質グループ（例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ））などの他、核酸染色プローブとして用いられる、ＥｔＢｒ（エチジウムブロマイド）やＳＹＢＲ（登録商標）シリーズ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ 社等）など、細胞・酵素活性測定のためのプローブとして用いられるルシフェリン化合物などを含んでもよい。また、特願２００４−２３７９５１や、特願２００４−１６５０８４に開示されているような、微量核酸（主としてｍＲＮＡ）を検出するための蛍光プローブを含んでもよい。   Examples of fluorescent samples to be measured include fluorescein and rhodamine that are commonly used in fluorescent antibody observation, fluorescent protein groups (eg, green fluorescent protein (GFP)) that are frequently used as fluorescent labels, and nucleic acids. A luciferin compound used as a probe for cell / enzyme activity measurement, such as EtBr (ethidium bromide) and SYBR (registered trademark) series (Molecular Probes, etc.) used as a staining probe may also be included. Further, a fluorescent probe for detecting a small amount of nucleic acid (mainly mRNA) as disclosed in Japanese Patent Application Nos. 2004-237951 and 2004-165084 may be included.

ここで、脂質二分子膜間に計測対象である細胞（単一細胞）を少なくとも１つ含んでもよい。なお、本実施形態において、脂質二分子膜間（細胞カプセル）に細胞を１つのみ含むことが望ましい（ただし、空のカプセルがあってもよい）。すなわち、脂質二分子膜間に細胞を一つ以下となるように配置して計測することが望ましい。   Here, at least one cell (single cell) to be measured may be included between the lipid bilayer membranes. In the present embodiment, it is desirable to include only one cell between the lipid bilayer membranes (cell capsule) (however, there may be an empty capsule). That is, it is desirable to place and measure one cell or less between lipid bilayer membranes.

これにより、例えば、従来実施されてきた細胞集団を対象とする計測では、個別細胞の変異を検出できず、集団的な平均値のなかに微小変化が埋もれてしまう可能性があったが、本発明に係るマイクロ流体チップおよび細胞計測装置では、個別細胞の変化を知った上で集団平均的な議論をすることができ、細胞集団の変化をより正確に計測することが可能となる。   As a result, for example, in the conventional measurement for cell populations, mutations of individual cells could not be detected, and there was a possibility that minute changes were buried in the collective average value. In the microfluidic chip and the cell measurement device according to the invention, it is possible to discuss the group average after knowing the change of the individual cells, and it is possible to measure the change of the cell population more accurately.

［細胞計測装置１００］
図１は、本実施形態のマイクロ流体チップ２００を含む細胞計測装置１００の一例を示す説明図である。 [Cell measuring device 100]
FIG. 1 is an explanatory view showing an example of a cell measuring apparatus 100 including a microfluidic chip 200 of the present embodiment.

図１に示すように、細胞計測装置１００は、リン脂質分子を含む有機相（例えば、デカン＋フォスファチジルコリンなど）が流路内を流れ、測定部（測定容器）となるマイクロ流体チップ２００と、マイクロ流体チップ２００に計測対象（例えば、細胞、細胞内容物、情報伝達物質、酵素化合物、抗体、蛍光試料、および、試薬等）の水相を交互に導入し、水相と有機相の間にリン脂質分子から構成される単分子構造のリン脂質膜を生成し、このリン脂質膜内に導入した水相を包んだ状態の非混合性の２相液滴を交互に生成するポンプ機能をする導入機構３００−１〜２と、計測対象の少なくとも膜構造を破砕する破砕機構４００と、マイクロ流体チップ２００の流路内を流れる２相液滴の周辺の有機相を除去することにより、近接する２相液滴の単分子構造のリン脂質膜同士を接触させて脂質二分子膜を生成し、生成された脂質二分子膜で２相液滴を生成化する機能を有する有機相除去機構５００と、マイクロ流体チップ２００の流路内における計測対象の反応をモニターして検出する検出機構６００と、を備えて構成されている。ここで、また、細胞計測装置１００において、脂質二分子膜間に１つの計測対象の細胞を含んでもよい。また、細胞計測装置１００において、リン脂質膜および脂質二分子膜を構成するリン脂質分子は、機能性分子を含んでもよい。   As shown in FIG. 1, a cell measuring device 100 includes a microfluidic chip 200 in which an organic phase containing phospholipid molecules (for example, decane + phosphatidylcholine and the like) flows in a flow path and serves as a measurement unit (measurement container). And an aqueous phase of a measurement target (for example, a cell, a cell content, an information transmission substance, an enzyme compound, an antibody, a fluorescent sample, and a reagent) are alternately introduced into the microfluidic chip 200, and the aqueous phase and the organic phase are A pump function that alternately generates non-mixed two-phase droplets that enclose a water phase introduced into the phospholipid membrane by generating a phospholipid membrane composed of phospholipid molecules between them. Removing the organic phase around the two-phase droplets flowing in the flow path of the microfluidic chip 200, the introduction mechanism 300-1 to 300-2, the crushing mechanism 400 that crushes at least the membrane structure to be measured, Two adjacent phases An organic phase removal mechanism 500 having a function of generating a lipid bimolecular film by bringing phospholipid films having a single molecular structure of droplets into contact with each other, and generating a two-phase liquid droplet with the generated lipid bimolecular film; And a detection mechanism 600 that monitors and detects a reaction to be measured in the flow path of the chip 200. Here, in the cell measurement device 100, one cell to be measured may be included between the lipid bilayer membranes. Moreover, in the cell measuring apparatus 100, the phospholipid molecules constituting the phospholipid membrane and the lipid bilayer membrane may include a functional molecule.

ここで、マイクロ流体チップ２００は、例えば、温度を維持する温度調節機能を更に備えてもよい。この場合、マイクロ流体チップ２００は、反応温度による影響を回避できる他、抗体反応などを促進することも可能となる。また、温度調整機構には、例えば、抵抗加熱を利用した微細電極ヒータや、ペルチェ素子などを利用してもよい。更に、空／水冷却機構を備えてもよく、これにより、より的確な温度制御を実施することができる。なお、マイクロ流体チップ２００の詳細（構造、材質、脂質膜生成方法等）については、後述する。   Here, the microfluidic chip 200 may further include, for example, a temperature adjustment function for maintaining the temperature. In this case, the microfluidic chip 200 can avoid the influence of the reaction temperature, and can promote the antibody reaction and the like. Further, for example, a fine electrode heater using resistance heating or a Peltier element may be used for the temperature adjustment mechanism. Further, an air / water cooling mechanism may be provided, and thereby more accurate temperature control can be performed. Details (structure, material, lipid membrane generation method, etc.) of the microfluidic chip 200 will be described later.

また、導入機構３００−１〜２は、適切な流量を確保し、かつ脈動（流速の周期的な変化）を抑制するため、例えば、シリンジポンプを用いてもよく、また、例えば、ギヤポンプやダイアフラム型ポンプ、浸透流ポンプ等を用いてもよい。   The introduction mechanisms 300-1 and 300-2 may use, for example, a syringe pump in order to ensure an appropriate flow rate and suppress pulsation (periodic change in flow velocity), and for example, a gear pump or a diaphragm. A mold pump, an osmotic flow pump, or the like may be used.

また、破砕機構４００は、流路上に配置された電極から印加された電圧により、計測対象の少なくとも膜構造を破砕する電気的破砕機構４５０であってもよい。また、破砕機構４００は、２相液滴を接触させる前に配置されてもよい。なお、破砕機構４００の詳細については、後述する。   Further, the crushing mechanism 400 may be an electric crushing mechanism 450 that crushes at least a membrane structure to be measured by a voltage applied from an electrode arranged on the flow path. Moreover, the crushing mechanism 400 may be disposed before the two-phase droplets are brought into contact with each other. Details of the crushing mechanism 400 will be described later.

また、有機相除去機構５００は、マイクロ流体チップ２００の壁面に設けられた分岐微小流路として構成してもよく、この分岐微小流路の毛管作用により有機相を除去してもよく、また、この分岐微小流路に吸引ポンプ等を更に備えることにより有機相を吸引して除去してもよい。   The organic phase removal mechanism 500 may be configured as a branched microchannel provided on the wall surface of the microfluidic chip 200, and may remove the organic phase by the capillary action of the branched microchannel. The organic phase may be sucked and removed by further providing a suction pump or the like in this branched microchannel.

また、検出機構６００は、計測対象によって適宜選択できるが、例えば、イオンの移動など微小な電気生理現象を検出するための微小電極を用いてもよい。この場合、従来用いられている光学的な検出手段に比べて装置を小型化できるという利点がある。また、検出機構６００として、光学的な検出手段を用いてよい。この光学的な検出手段の一例としては、市販の生物顕微鏡や、フローサイトメータなどに利用される一般的な蛍光光学系の分析装置による蛍光観察の他、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）や全反射顕微鏡（ＴＩＲＦ）などの微量分析装置などを用いてもよい。   In addition, the detection mechanism 600 can be appropriately selected depending on the measurement target. For example, a microelectrode for detecting a microelectrophysiological phenomenon such as ion movement may be used. In this case, there is an advantage that the apparatus can be miniaturized as compared with the optical detection means conventionally used. Further, as the detection mechanism 600, an optical detection unit may be used. As an example of this optical detection means, in addition to fluorescence observation by a commercially available biological microscope, a general fluorescence optical system analyzer used for a flow cytometer, etc., surface plasmon resonance (SPR) or total reflection microscope A microanalyzer such as (TIRF) may be used.

以下、本実施形態におけるマイクロ流体チップ２００を含む細胞計測装置１００の細胞計測の一例について、再度図１を参照して説明する。   Hereinafter, an example of cell measurement of the cell measurement device 100 including the microfluidic chip 200 in the present embodiment will be described with reference to FIG. 1 again.

図１に示すように、マイクロ流体チップ２００を含む細胞計測装置１００における細胞計測は、一例として、（１）セル生成、（２）細胞破砕（細胞膜溶解）、（３）有機相除去、（４）検出、の順に実行される。   As shown in FIG. 1, cell measurement in the cell measurement device 100 including the microfluidic chip 200 includes, for example, (1) cell generation, (2) cell disruption (cell membrane lysis), (3) organic phase removal, (4 ) Detection is executed in this order.

（１）セル生成
まず、導入機構３００−１〜２は、脂質膜となるリン脂質を混入した有機溶液相内に計測対象の水相１、水相２を交互に導入する。このとき、導入機構３００−１〜２は、例えば、計測対象に一例として水相１には細胞と抗体Ａ、水相２には細胞と抗体Ｂを導入しておく。また、このとき、マイクロ流体チップ２００の流路内では、水相と有機相は互いに溶け合わないのでそれぞれ水相１と水相２が有機容器相内で液滴となって交互に配列した状態となり、有機相内に混入していた両親媒性分子（親水基と疎水基を両極にもつ分子）であるリン脂質は、親水基の部分を水相側に、疎水基の部分を有機相側にして、水相の液滴の周辺に脂質膜（単分子構造のリン脂質膜）を形成するため、計測対象を含む２相液滴（細胞カプセル）ができる。 (1) Cell generation First, the introduction mechanisms 300-1 and 300-2 alternately introduce the water phase 1 and the water phase 2 to be measured into the organic solution phase mixed with the phospholipid that is a lipid film. At this time, for example, the introduction mechanisms 300-1 and 300-2 introduce cells and antibodies A into the aqueous phase 1 and cells and antibodies B into the aqueous phase 2, for example, as measurement targets. At this time, since the water phase and the organic phase do not melt together in the flow path of the microfluidic chip 200, the water phase 1 and the water phase 2 are alternately arranged as droplets in the organic container phase, respectively. Phospholipids, which are amphipathic molecules (molecules having both hydrophilic and hydrophobic groups) mixed in the organic phase, have hydrophilic groups on the water phase side and hydrophobic groups on the organic phase side. Thus, since a lipid film (single molecular structure phospholipid film) is formed around the aqueous phase droplet, a two-phase droplet (cell capsule) including a measurement target can be formed.

また、このとき、各２相液滴（細胞カプセル）に１つの細胞が導入されるよう、導入機構３００−１〜２の水相の流入条件および細胞を導入する溶液の濃度を調整してもよい。これにより、細胞個別の反応を観察することができるようになり、個々の細胞の特性を同時に計測することが可能となる。   Further, at this time, even if the inflow conditions of the aqueous phase of the introduction mechanisms 300-1 and 300-2 and the concentration of the solution for introducing the cells are adjusted so that one cell is introduced into each two-phase droplet (cell capsule). Good. Thereby, it becomes possible to observe the reaction of each individual cell, and the characteristics of each individual cell can be measured simultaneously.

（２）細胞破砕（細胞膜溶解）
次に、マイクロ流体チップ２００の流路内に設けた破砕機構４００（主に、電気的破砕機構４５０）は、計測対象の細胞の細胞膜の溶解（内容物の抽出）を行う。この細胞膜溶解は、化学反応を利用する手法や、物理的な衝撃（超音波など）を利用する手法などを用いることもできるが、電気的な手法を用いてもよく、この場合、化学物質によるコンタミネーションの影響がなく測定精度が向上する他、装置の小型化が可能となる。 (2) Cell disruption (cell membrane lysis)
Next, the crushing mechanism 400 (mainly the electric crushing mechanism 450) provided in the flow path of the microfluidic chip 200 performs lysis (extraction of contents) of the cell to be measured. For this cell membrane lysis, a method using a chemical reaction or a method using a physical impact (such as ultrasonic waves) can be used, but an electric method may be used. In addition to being free from the influence of contamination, the measurement accuracy is improved and the apparatus can be miniaturized.

破砕機構４００の一例としては、具体的には、マイクロ流体チップ２００の流路内を流れる計測対象の細胞等を電極で挟むことにより、高周波の電界を印加し、細胞の脂質膜の自己溶解を促してもよい（Ｔ．Ｙ．Ｔｓｏｎｇ：Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．６０（１９９１）２９７）。また、破砕機構４００の別の一例としては、マイクロ流体チップ２００の流路内を流れる計測対象の細胞等を電極で挟むことにより、高周波の電界を印加すると同時に、物理的な拘束を利用し、電気的に細胞膜を破砕（内容物抽出）してもよい（Ｎ．Ｉｋｅｄａ ｅｔ ａｌ．：Ｊｐｎ．Ｊ．ａｐｐｌ．ｐｈｙｓ．４６（２００７）６４１０）。また、この破砕機構４００を利用して、マイクロ流体チップ２００の流路内を流れる計測対象の細胞を拘束する突起部を設けることにより、電気的な細胞溶解を援助してもよい。ここで、この破砕機構４００による細胞破砕を、２相液滴を接触させて２分子膜を構築する前に実施してもよい。これは、リン脂質膜が単分子膜の状態であれば、細胞破砕のための外部エネルギーの印加によって損傷してもすぐに再構成できるためである。これらの詳細については、後述する。   As an example of the crushing mechanism 400, specifically, a cell to be measured flowing in the flow path of the microfluidic chip 200 is sandwiched between electrodes, thereby applying a high-frequency electric field and self-dissolving the lipid membrane of the cell. (T. Y. Tsong: Biophys. J. 60 (1991) 297). Further, as another example of the crushing mechanism 400, a cell to be measured flowing in the flow path of the microfluidic chip 200 is sandwiched between electrodes, thereby applying a high-frequency electric field and simultaneously using physical constraints, The cell membrane may be electrically disrupted (content extraction) (N. Ikeda et al .: Jpn. J. appl. Phys. 46 (2007) 6410). In addition, by using this crushing mechanism 400, electric cell lysis may be assisted by providing a protrusion that restrains a measurement target cell flowing in the flow path of the microfluidic chip 200. Here, the cell disruption by the disruption mechanism 400 may be performed before the bilayer droplet is brought into contact with the bilayer film. This is because if the phospholipid membrane is in a monomolecular state, it can be immediately reconstructed even if damaged by application of external energy for cell disruption. Details of these will be described later.

（３）有機相除去
そして、有機相除去機構５００は、破砕機構４００により計測対象の細胞の細胞膜が破砕（溶解）され、その細胞の内容物が展開された２相液滴と、試薬の入った２相液滴を接触させて並列化した脂質２分子膜を形成する。この有機相除去機構５００により、単分子構造のリン脂質膜を２分子膜とすることで脂質膜が安定化し、それぞれの２相液滴が細胞内容物と各抗体との反応容器となるという利点がある。また、このとき、有機相または水相に予めイオノフォアなどの機能性分子を混合しておくことにより、脂質２分子膜を高機能化することも可能となる。これらの詳細については後述する。 (3) Organic Phase Removal The organic phase removal mechanism 500 includes a two-phase droplet in which the cell membrane of a measurement target cell is crushed (dissolved) by the crushing mechanism 400 and the contents of the cell are developed, and a reagent is contained. The two-phase droplets are brought into contact with each other to form a lipid bilayer membrane paralleled. By this organic phase removal mechanism 500, the phospholipid membrane having a monomolecular structure is made into a bimolecular membrane, so that the lipid membrane is stabilized, and each two-phase droplet becomes a reaction container for the cell contents and each antibody. There is. At this time, it is also possible to enhance the function of the lipid bimolecular membrane by previously mixing a functional molecule such as an ionophore into the organic phase or the aqueous phase. Details of these will be described later.

（４）検出
最後に、検出機構６００は、導入機構３００−１〜２、破砕機構４００、および、有機相除去機構５００等により生成した脂質膜アレイを、例えば、光学的な検出手段（一例として、蛍光標識試薬による蛍光観察の他、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）や全反射顕微鏡（ＴＩＲＦ）などを用いた微量分析手法など）や、電気的な検出手段（一例として、微小電極を用いてイオンの移動など微小な電気生理現象を検出する手段など）を用いて検出する。このとき、検出機構６００は、水相１と水相２での検出値の差異から、対象細胞の内容物と抗体Ａ、抗体Ｂとの反応を知ることができ、細胞内のタンパク発現量などを測定することができる。 (4) Detection Finally, the detection mechanism 600 uses a lipid membrane array generated by the introduction mechanism 300-1 to 2, the crushing mechanism 400, the organic phase removal mechanism 500, or the like, for example, as an optical detection means (as an example). In addition to fluorescence observation with fluorescent labeling reagents, microanalysis techniques using surface plasmon resonance (SPR), total reflection microscope (TIRF), etc., and electrical detection means (for example, using microelectrodes to measure ions This is detected using a means for detecting a minute electrophysiological phenomenon such as movement). At this time, the detection mechanism 600 can know the reaction between the contents of the target cell and the antibodies A and B from the difference in the detected values in the aqueous phase 1 and the aqueous phase 2, and the amount of protein expression in the cells, etc. Can be measured.

このように、本実施形態におけるマイクロ流体チップ２００を含む細胞計測装置１００によれば、導入機構３００−１〜２、破砕機構４００、および、有機相除去機構５００にり、細胞膜を模擬した脂質膜によって細胞の内容物等を含む微小領域を仕切ることにより、細胞内の状態を維持しながら細胞およびその内容物を保持することができる。また、本実施形態におけるマイクロ流体チップ２００を含む細胞計測装置１００は、脂質膜を連続的に生成する構成となっているため、流路内に設けた検出機構６００により連続的に計測が可能である。   Thus, according to the cell measuring apparatus 100 including the microfluidic chip 200 in the present embodiment, the lipid membrane simulating the cell membrane by the introduction mechanism 300-1-2, the crushing mechanism 400, and the organic phase removal mechanism 500. By partitioning the micro area containing the contents of the cell by the above, it is possible to hold the cell and its contents while maintaining the intracellular state. In addition, since the cell measuring device 100 including the microfluidic chip 200 in the present embodiment is configured to continuously generate a lipid membrane, it can be continuously measured by the detection mechanism 600 provided in the flow path. is there.

以上で、細胞計測装置１００の概要の説明を終える。   Above, description of the outline | summary of the cell measuring device 100 is finished.

［マイクロ流体チップ２００］
続いて、本細胞計測装置１００の主要部分であるマイクロ流体チップ２００の詳細について、図２〜図４を参照して以下に説明する。 [Microfluidic chip 200]
Next, details of the microfluidic chip 200 that is a main part of the cell measuring apparatus 100 will be described below with reference to FIGS.

本実施形態の細胞計測装置１００における二分子膜の製造方法においては、両親媒性分子を含有する、２つの液相または液相と気相が、微細流路内部に交互に並んだ状態を作製し、該微細流路の壁面の片側あるいは両側に設けた有機相除去機構５００（分岐微小流路）により２つの液相のうち一方、または液相と気相より気相、を導出して隣り合う残った液相同士を接触させ、その接触により両親媒性分子からなる二分子膜の並列構造を形成させる。   In the method for producing a bilayer membrane in the cell measuring apparatus 100 of the present embodiment, a state in which two liquid phases containing an amphipathic molecule or a liquid phase and a gas phase are alternately arranged in a fine channel is prepared. Then, the organic phase removal mechanism 500 (branch microchannel) provided on one side or both sides of the wall surface of the microchannel leads out one of the two liquid phases, or the gas phase from the liquid phase and the gas phase, and is adjacent thereto. The remaining liquid phases are brought into contact with each other, and a parallel structure of bimolecular films made of amphiphilic molecules is formed by the contact.

２つの液相としては有機相および水相、または極性の異なる２種の有機相（例えば、極性の大きい水性溶媒と極性の小さい油性溶媒）が挙げられるが、有機相および水相が最も一般的である。有機相としては、各種の有機化合物から選ばれるが、好適にはデカン、オクタン等のアルカン類、クロロホルム等のハロゲン化炭化水素類、トルエン等の芳香族炭化水素類、オレイン酸等の脂肪酸類等が挙げられる。液相と気相を用いる場合、液相としては有機相もしくは水相、一方、気相としては空気、窒素、アルゴン、ヘリウム等であってもよい。   The two liquid phases include an organic phase and an aqueous phase, or two organic phases with different polarities (for example, a highly polar aqueous solvent and a less polar oily solvent), with the organic and aqueous phases being the most common It is. The organic phase is selected from various organic compounds, but preferably alkanes such as decane and octane, halogenated hydrocarbons such as chloroform, aromatic hydrocarbons such as toluene, fatty acids such as oleic acid, etc. Is mentioned. When using a liquid phase and a gas phase, the liquid phase may be an organic phase or an aqueous phase, while the gas phase may be air, nitrogen, argon, helium, or the like.

両親媒性分子としては、通常、リン脂質、糖脂質、中性脂質等の脂質；パルミチン酸、ステアリン酸、等の両親媒性界面活性剤；もしくはその構造中に疎水部と親水部を有するブロックコポリマー等のポリマーから選ばれる。このようなブロックコポリマーとしては、ポリエチレンオキシド−ポリエチルエチレン、ポリエチレンオキシド−ポリブタジエン、ポリスチレン−ポリアクリル酸、ポリエチレンオキシド−ポリカプロラクタム、ポリブチルアクリレート−ポリアクリル酸等が挙げられる。   As amphiphilic molecules, lipids such as phospholipids, glycolipids and neutral lipids; amphiphilic surfactants such as palmitic acid and stearic acid; or a block having a hydrophobic part and a hydrophilic part in its structure Selected from polymers such as copolymers. Examples of such block copolymers include polyethylene oxide-polyethylethylene, polyethylene oxide-polybutadiene, polystyrene-polyacrylic acid, polyethylene oxide-polycaprolactam, polybutyl acrylate-polyacrylic acid, and the like.

両親媒性分子を含有する２つの液相または液相と気相を微細流路の導入機構３００−１〜２（分岐構造）を用いて、交互に導入することにより、両親媒性分子を含有する２つの液相または液相と気相が交互に並んだ状態を作製してもよい。このような微細流路の導入機構３００−１〜２（分岐構造）としては、特に制限されないが、好適には十字路、Ｔ字路もしくはＹ字路から選ばれる。微細流路の大きさは、目的に応じて決定してもよいが、通常０．１〜１０００μｍ程度、好ましくは１０〜５００μｍ程度から選ばれる。微細流路を形成する材料の材質は、例えば、プラスチック、セラミック、金属等のいずれでもよく、例えば、微細流路の壁面を疎水性とする場合にはアクリル樹脂、シリコーン樹脂等が好適であり、一方、親水性にする場合には石英ガラス、シリコン、ホウケイ酸ガラス（例えば、「パイレックス（登録商標）」（商標））等が好適である。微細流路を形成する材料の形状、大きさは目的とする用途等により適宜選定し得、例えば、加工した流路を有する板状体（例えば、数センチ角）が挙げられる。   Amphiphilic molecules are contained by alternately introducing two liquid phases containing an amphiphilic molecule or a liquid phase and a gas phase using the introduction mechanism 300-1 to 2 (branch structure) of the fine channel. Two liquid phases or a state in which a liquid phase and a gas phase are alternately arranged may be produced. The introduction mechanism 300-1 to 2 (branch structure) of such a fine channel is not particularly limited, but is preferably selected from a cross road, a T-junction or a Y-junction. The size of the fine channel may be determined according to the purpose, but is usually about 0.1 to 1000 μm, preferably about 10 to 500 μm. The material of the material forming the fine flow path may be any of plastic, ceramic, metal, etc., for example, when the wall surface of the fine flow path is hydrophobic, acrylic resin, silicone resin, etc. are suitable, On the other hand, quartz glass, silicon, borosilicate glass (for example, “Pyrex (registered trademark)” (trademark)) and the like are suitable for making hydrophilic. The shape and size of the material forming the fine flow path can be appropriately selected depending on the intended use and the like, and examples thereof include a plate-like body (for example, several centimeters square) having a processed flow path.

両親媒性分子は有機相に配合して導入してもよい。両親媒性分子は２つの液相（例えば、有機相および水相）、または液相と気相、の界面に吸着し単分子膜を形成する。後述する図４に示すように、有機相を２分して異なる両親媒性分子を導入することにより、非対称二分子膜を形成してもよい。   Amphiphilic molecules may be introduced in the organic phase. Amphiphilic molecules adsorb to two liquid phases (for example, an organic phase and an aqueous phase) or an interface between a liquid phase and a gas phase to form a monomolecular film. As shown in FIG. 4 described later, an asymmetric bimolecular film may be formed by dividing the organic phase into two and introducing different amphiphilic molecules.

両親媒性分子を含有する２つの液相または液相と気相が交互に並んだ状態を制御するためには、上記の微細流路の導入機構３００−１〜２（分岐構造）を用いて、例えば、供給する２つの液相の粘度、表面張力、密度、液性（極性）等にもよるが、２つの液相の吐出速度（吐出量）を適宜調整する。この場合、特開２００４−１２４０２号公報、特開２００４−６７９５３号公報、特開２００４−５９８０２号公報、特開２００５−２５５９８７号公報および特開２００５−２７０８９４号公報に記載される方法に準じて連続相と分散相（液滞）の形成を行うこともできる。   In order to control two liquid phases containing an amphiphilic molecule or a state in which a liquid phase and a gas phase are alternately arranged, the introduction mechanism 300-1 to 2 (branch structure) of the above-described microchannel is used. For example, although depending on the viscosity, surface tension, density, liquidity (polarity), and the like of the two liquid phases to be supplied, the discharge speed (discharge amount) of the two liquid phases is appropriately adjusted. In this case, in accordance with the methods described in JP-A-2004-12402, JP-A-2004-67953, JP-A-2004-59802, JP-A-2005-255987, and JP-A-2005-270894. Formation of a continuous phase and a dispersed phase (stagnation) can also be performed.

２つの液相が有機相および水相である場合、好ましくは疎水性の微細流路の壁面の片側あるいは両側に設けた有機相除去機構５００（分岐微小流路）により有機相を導出して、隣り合う水相同士を接触させて、単分子膜を結合させることにより二分子膜を形成してもよい。   When the two liquid phases are an organic phase and an aqueous phase, the organic phase is preferably derived by the organic phase removal mechanism 500 (branch microchannel) provided on one side or both sides of the wall surface of the hydrophobic microchannel, A bimolecular film may be formed by bringing adjacent aqueous phases into contact with each other and bonding the monomolecular film.

一方、好ましくは親水性の微細流路の壁面の片側あるいは両側に設けた有機相除去機構５００（分岐微小流路）により水相を導出して、隣り合う有機相同土を接触させて、単分子膜を結合させることにより二分子膜を形成してもよい。   On the other hand, the aqueous phase is preferably derived by the organic phase removal mechanism 500 (branch microchannel) provided on one side or both sides of the wall surface of the hydrophilic microchannel, and the adjacent organic homologous soil is brought into contact with each other. A bimolecular film may be formed by bonding the films.

本実施形態における二分子漠は、互いに異なる成分の液相、例えば、水相と有機相、または互いに異なる成分を含有する水相同士もしくは有機相同士で挟まれてもよい。この場合、例えば、細胞の内部と外部を模した実験系を構築してもよい。   The bimolecular vagueness in the present embodiment may be sandwiched between liquid phases having different components, for example, an aqueous phase and an organic phase, or aqueous phases or organic phases containing different components. In this case, for example, an experimental system simulating the inside and outside of the cell may be constructed.

有機相除去機構５００（分岐微小流路）は、微細流路の壁面の片側あるいは両側に設けられ、毛管作用（自発的な浸透）および／または吸引（ポンプやバルブを用いる）により、上記のように液相のひとつを導出させる。有機相除去機構５００（分岐微小流路）の大きさは、毛管作用および／または吸引に適した範囲から適宜選定され得るが、通常０．１〜２００μｍ程度等から選ばれる。   The organic phase removal mechanism 500 (branch microchannel) is provided on one side or both sides of the wall surface of the microchannel, and is as described above by capillary action (spontaneous penetration) and / or suction (using a pump or a valve). To derive one of the liquid phases. The size of the organic phase removal mechanism 500 (branch microchannel) can be appropriately selected from a range suitable for capillary action and / or suction, but is usually selected from about 0.1 to 200 μm or the like.

本実施形態のマイクロ流体チップ２００によれば、微細流路内（もしくは微細流路であった空間内）に二分子膜が配置された構造を有し、両親媒性分子からなる二分子膜が得られる。通常２個以上の二分子膜が間隔をおいて並列に配置される。上記間隔は目的に応じて決定され得、有機相もしくは水相を介して形成され、有機相もしくは水相の間に両親媒性分子からなる二分子膜が配置されている。二分子膜は異なる成分の液相で挟まれてもよい。しかしながら、これらの有機相もしくは水相を除去してその間隔を零（すなわち多層膜）とすることができるし、二分子膜と多層膜の混合型としてもよい。さらに、微細流路内（もしくは微細流路であった空間内）に、有機相もしくは水相の間に１個のみの二分子膜が配置されてもよい。   According to the microfluidic chip 200 of the present embodiment, a bilayer membrane having a structure in which a bilayer membrane is arranged in a microchannel (or in a space that was a microchannel), and the bilayer membrane composed of amphiphilic molecules is provided. can get. Usually, two or more bilayers are arranged in parallel at intervals. The interval can be determined according to the purpose, and is formed through an organic phase or an aqueous phase, and a bimolecular film composed of amphiphilic molecules is disposed between the organic phase or the aqueous phase. The bilayer membrane may be sandwiched between liquid phases of different components. However, these organic phases or aqueous phases can be removed to make the interval zero (that is, a multilayer film), or a mixed type of a bimolecular film and a multilayer film may be used. Furthermore, only one bimolecular film may be disposed between the organic phase or the aqueous phase in the fine channel (or in the space that was the fine channel).

二分子膜は平面、球面のいずれであってもよく、閉じた球体形であってもよいが、通常は二分子平面膜が選ばれる。   The bimolecular film may be either a flat surface or a spherical surface, and may be a closed sphere, but usually a bimolecular planar film is selected.

両親媒性分子が例えば、リン脂質である場合、有機相もしくは水相に膜タンパク質等の生体分子を配合しておくことにより、膜タンパク質等の生体分子が固定された二分子膜を得ることができる。膜タンパク質としては、イオンチャンネルタンパク質、トランスポーター、イオンポンプタンパク質およびレセプター（受容体）等の一種以上が挙げられる。また、これらの機能性生体分子としては、例えば、生物由来（天然のイオノフォア分子など）であってもよく、人工的に合成されたものでもあってもよい。   When the amphiphilic molecule is, for example, a phospholipid, it is possible to obtain a bilayer membrane in which a biomolecule such as a membrane protein is fixed by blending a biomolecule such as a membrane protein in the organic phase or the aqueous phase. it can. Examples of the membrane protein include one or more of ion channel protein, transporter, ion pump protein, and receptor (receptor). In addition, these functional biomolecules may be derived from living organisms (natural ionophore molecules, etc.) or may be artificially synthesized.

例えば、イオンチャンネルタンパク質はイオンを電気化学的ポテンシャルの勾配にしたがって透過させる働きを持つ。イオンチャンネルタンパク質を取り込んだ二分子平面膜において、イオンの流れを電気生理的に計測してもよい。トランスポーターは糖質やアミノ酸等の有機物質を輸送する担体であり、例えば、ＡＴＰ結合部位（ＡＢＣ）を持ち、ＡＢＣ加水分解活性を有するＡＢＣトランスポーターが挙げられ、１放射性標識した糖やアミノ酸等の有機物質が輸送される現象を測定してもよい。イオンポンプタンパク質はナトリウムイオン、カリウムイオン、水素イオン、カルシウムイオン等を輸送する輸送担体であり、イオンの濃度勾配（電気化学ポテンシャル差）に抗して輸送する。イオンを輸送するためには例えば、ＡＴＰ分解により得られる化学エネルギー、もしくは光エネルギー等の供給が必要である。   For example, ion channel proteins have the function of permeating ions according to the gradient of the electrochemical potential. An ion flow may be measured electrophysiologically in a bimolecular planar membrane incorporating an ion channel protein. Transporters are carriers that transport organic substances such as carbohydrates and amino acids, and include, for example, ABC transporters that have an ATP binding site (ABC) and have ABC hydrolysis activity. The phenomenon in which the organic substance is transported may be measured. An ion pump protein is a transport carrier that transports sodium ions, potassium ions, hydrogen ions, calcium ions, and the like, and transports them against an ion concentration gradient (electrochemical potential difference). In order to transport ions, for example, it is necessary to supply chemical energy obtained by ATP decomposition, light energy, or the like.

さらに、レセプターは、例えば、神経伝達物質のような特異的な物質（リガンド）と結合し、細胞の反応を開始させ、細胞外のシグナルを細胞内のシグナルに変換してもよい。   Further, the receptor may bind to a specific substance (ligand) such as a neurotransmitter, initiate a cell reaction, and convert an extracellular signal into an intracellular signal.

ここで、検出機構６００による検出の一例として、上述のような生体分子が固定された二分子膜に常法により微小電極等を設け、生体分子の電気応答性を測定することにより創薬スクリーニング、細胞機能解明等を目的とした生体膜タンパク質機能解析装置として細胞計測装置１００を作製してもよい。電極構造としては特に制限されないが、微細流路内を流動もしくは停止している複数の脂質二分子膜に対して、平行に配置された多数の電極を用いて並列的に信号を検出する方式（多数の電極を用いて並列的に検出）、または微細流路内を流動している複数の脂質二分子膜を次々に電極部を通過させ、１つずつ連続的に信号を検出する方式（一対の電極を用いてシーケンシャルに検出）が通常である。   Here, as an example of detection by the detection mechanism 600, a drug discovery screening is performed by providing a microelectrode or the like on a bilayer membrane on which a biomolecule as described above is fixed by a conventional method, and measuring the electrical responsiveness of the biomolecule, The cell measurement device 100 may be manufactured as a biological membrane protein function analysis device for the purpose of elucidating cell functions. The electrode structure is not particularly limited, but a method for detecting signals in parallel using a plurality of electrodes arranged in parallel for a plurality of lipid bilayers flowing or stopped in a fine channel ( (Detected in parallel using a large number of electrodes), or a method of detecting signals continuously one by one by passing a plurality of lipid bilayer membranes flowing in a microchannel one after another through the electrode part (Sequential detection using the electrode).

さらに、脂質二分子膜への固定は上記の膜タンパク質に限定されるものではなく、目的に応じ種々の物質を取り込むことができる。例えば、免疫グロブリン等の抗体を蛍光標識し、抗原を吸着させて生じる蛍光強度変化から抗原を検出してもよい。また、微生物が産生するペプチド抗生物質であるグラミシジン等のイオノフォアを取り込み、親水性イオンを二分子膜の疎水性相に入り易くして、透過させるようにすることができる。例えば、グラミシジンＡは膜にチャンネル（イオン透過路）を形成して、水素イオン、リチウムイオン、ナトリウムイオン、カリウムイオンを透過させる。   Furthermore, the fixation to the lipid bilayer membrane is not limited to the above membrane protein, and various substances can be incorporated depending on the purpose. For example, the antigen may be detected from a fluorescence intensity change caused by fluorescently labeling an antibody such as an immunoglobulin and adsorbing the antigen. In addition, ionophores such as gramicidin, which is a peptide antibiotic produced by microorganisms, can be incorporated to facilitate entry of hydrophilic ions into the hydrophobic phase of the bilayer membrane. For example, gramicidin A forms a channel (ion passage) in the membrane and allows hydrogen ions, lithium ions, sodium ions, and potassium ions to pass therethrough.

検出機構６００により検出する際、例えば、放射性標識、蛍光標識等の常法を用いることができ、電気、光、熱等を利用した測定系とすることもでき、創薬スクリーニング、バイオセンサー、抗原抗体反応分析等に有効に利用してもよい。   When detecting by the detection mechanism 600, for example, a conventional method such as a radioactive label or a fluorescent label can be used, and a measurement system using electricity, light, heat, or the like can be used. You may use effectively for an antibody reaction analysis etc.

以下に、本実施形態における検出機構６００による検出の一例として、脂質二分子膜を備えてなるデバイスについて、さらに詳細に説明する。   Hereinafter, as an example of detection by the detection mechanism 600 in the present embodiment, a device including a lipid bilayer will be described in more detail.

１．膜タンパク質の機能解析デバイス
（Ａ）単一の膜タンパク質の機能解析を目的としたもの、ならびに（Ｂ）多数の膜タンパク質を脂質二分子平面膜に配置し、巨視的な挙動の解析を目的としたもの、が挙げられる。 1. Device for functional analysis of membrane proteins (A) For the purpose of functional analysis of a single membrane protein, and (B) For the purpose of analyzing macroscopic behavior by arranging a large number of membrane proteins in a lipid bilayer planar membrane The thing which was done.

本実施形態のマイクロ流体チップ２００内で作製した脂質二分子平面膜に、機能を調べたい膜タンパク質（イオンチャンネル、トランスポーター、レセプター等）を配置する。各種の物理的または化学的な刺激を与え、膜タンパク質の応答を測定する。   Membrane proteins (ion channels, transporters, receptors, etc.) whose functions are to be investigated are arranged on the lipid bimolecular planar membrane produced in the microfluidic chip 200 of this embodiment. Apply various physical or chemical stimuli and measure membrane protein response.

解析する機能としては、チャンネル形成膜タンパク質の場合には、単一チャンネルのコンダクタンス、チャンネル開閉時間、開閉状態確率等が挙げられる。刺激の種類としては、例えば、電位作動性の膜タンパク質の場合には電気刺激を刺激として用い、リガンド作動性の膜タンパク質の場合にはリガンドを刺激として用い、機械刺激作動性の膜タンパク質の場合には機械刺激を刺激として用いられる。また、測定手段としては、電気的測定の場合には、測定対象として膜電位、膜電流、単一チャンネル電流、ゲート電流（電位作動性イオンチャンネル）が挙げられる。   In the case of a channel-forming membrane protein, functions to be analyzed include single channel conductance, channel open / close time, open / close state probability, and the like. For example, in the case of a voltage-gated membrane protein, electrical stimulation is used as a stimulus, in the case of a ligand-gated membrane protein, a ligand is used as a stimulus, and in the case of a mechanical-stimulated membrane protein. In this case, mechanical stimulation is used as stimulation. In the case of electrical measurement, the measuring means includes membrane potential, membrane current, single channel current, and gate current (potential-operated ion channel) as measurement targets.

２．脂質二分子平面膜を用いたセンサーデバイス
（Ａ）二分子平面膜をセンサーとして利用する場合
作製した脂質二分子平面膜に、水相中の物質が吸着した際に生じる電気応答（脂質膜の膜電位、膜電流、膜容量等）の変化を測定し、（ａ）脂質二分子平面膜への物質の取り込みの確認、（ｂ）水相中に含まれる物質の検知、濃度測定等を行う。水相中の物質としては、各種タンパク質、水溶性環境汚染物質等が挙げられる。 2. Sensor device using a lipid bilayer planar membrane (A) When using a bimolecular planar membrane as a sensor Electric response (lipid membrane membrane) generated when a substance in an aqueous phase is adsorbed on the prepared lipid bilayer planar membrane Changes in potential, membrane current, membrane capacity, etc.) are measured, (a) confirmation of the incorporation of the substance into the lipid bilayer planar membrane, (b) detection of substance contained in the aqueous phase, concentration measurement, etc. are performed. Examples of substances in the aqueous phase include various proteins and water-soluble environmental pollutants.

（Ｂ）脂質二分子平面膜に埋め込んだ膜タンパク質をセンサーとして利用する場合
（１）リガンド作動性イオンチャンネルの利用
作製した脂質二分子平面膜に、レセプター（受容体）膜タンパク質を配し、水相にそのレセプターに対応するリガンド（例えば、神経終末から放出される神経伝達物質、分泌細胞から放出される生理活性物質）、またはリガンドを生成し得るもの（例えば、神経細胞、分泌細胞）を導入しておき、リガンドの結合によるレセプターの応答を検出することで、リガンドの放出、存在を検出する。例えば、ニコチン性アセチルコリンレセプターは、イオンチャンネル型のレセプター（リガンド作動性イオンチャンネル）で、リガンドであるアセチルコリンが結合することによりチャンネルが開口する。したがって、このチャンネル開口に伴う電流測定により、リガンド放出をリアルタイムに検知できる。このレセプターを脂質平面膜に配置し、水溶液中にアセチルコリン生成源である細胞を導入しておくことで、アセチルコリンの放出をリアルタイムでセンシングすることができる。 (B) When a membrane protein embedded in a lipid bilayer planar membrane is used as a sensor (1) Utilization of a ligand-gated ion channel A receptor (receptor) membrane protein is placed on a prepared lipid bilayer planar membrane, and water is added. Introduced into the phase a ligand corresponding to the receptor (for example, a neurotransmitter released from a nerve terminal, a physiologically active substance released from a secretory cell), or a substance capable of generating a ligand (for example, a neuron or secretory cell) The release and presence of the ligand are detected by detecting the response of the receptor due to the binding of the ligand. For example, the nicotinic acetylcholine receptor is an ion channel type receptor (ligand-operated ion channel), and the channel is opened by binding of acetylcholine as a ligand. Therefore, ligand release can be detected in real time by measuring the current associated with the channel opening. By disposing this receptor on a lipid planar membrane and introducing cells that are acetylcholine production sources into an aqueous solution, the release of acetylcholine can be sensed in real time.

同様に、グルタミン酸レセプターをセンサーとしてグルタミン酸の放出を検出することができる。   Similarly, the release of glutamate can be detected using the glutamate receptor as a sensor.

（２）その他のイオンチャンネルの利用
Ｃａ２＋活性化Ｋ＋チャンネルは細胞内側のカルシウム濃度に依存した活性を示すので、このイオンチャンネルを二分子平面膜に配することにより、カルシウムセンサーとして利用できる。 (2) Use of other ion channels Since the Ca2 + activated K + channel shows activity depending on the calcium concentration inside the cell, it can be used as a calcium sensor by arranging this ion channel on a bimolecular planar membrane.

以下、図面を用いてさらに本発明のマイクロ流体チップ２００について詳細に説明する。   Hereinafter, the microfluidic chip 200 of the present invention will be described in detail with reference to the drawings.

図２において、（ａ）は二相プラグ流形成の概念図、（ｂ）および（ｃ）は微細流路の両側面に設けた有機相除去機構５００（分岐微小流路）を利用した有機相の抽出および膜形成の模式図、（ｃ）および（ｄ）は微細流路の片方の側面に設けた有機相除去機構５００（分岐微小流路）を利用した有機相の抽出および膜形成の模式図を示す。   2, (a) is a conceptual diagram of two-phase plug flow formation, and (b) and (c) are organic phases using organic phase removal mechanisms 500 (branch microchannels) provided on both sides of the microchannel. (C) and (d) are schematic diagrams of organic phase extraction and film formation using an organic phase removal mechanism 500 (branch microchannel) provided on one side surface of the microchannel. The figure is shown.

微細流路（３）内部に，両親媒性分子を含有する有機相（２）、および水相（１）が規則的に交互に並んだ状態を作製する（ａ）。次に、側面に設けた有機相除去機構５００（分岐微小流路）（４）に有機相（２）を導出させ、隣接する水相（１）同士を接触させる。これにより、両親媒性分子で構成される脂質二分子平面膜の並列構造を形成する（（ｂ）〜（ｅ））。   An organic phase (2) containing an amphiphilic molecule and an aqueous phase (1) are regularly and alternately arranged in the microchannel (3) (a). Next, the organic phase (2) is led out to the organic phase removal mechanism 500 (branch microchannel) (4) provided on the side surface, and the adjacent aqueous phases (1) are brought into contact with each other. Thereby, a parallel structure of a lipid bimolecular planar membrane composed of amphiphilic molecules is formed ((b) to (e)).

（ａ）にＴ字路を用いた例を示す。本発明においては、規則正しい時間周期でサイズの揃った液滴を生成することができ、且つ流れの制御により、液滴のサイズおよび生成周期を精密に制御することが可能である。両親媒性分子は有機相−水相の界面に吸着し、単分子膜を形成する。   (A) shows an example using a T-junction. In the present invention, it is possible to generate droplets having a uniform size in a regular time period, and it is possible to precisely control the droplet size and generation period by controlling the flow. The amphiphilic molecules are adsorbed at the interface between the organic phase and the aqueous phase to form a monomolecular film.

次に、疎水性の微細流路（３）の側面（片側または両側）に設けられたより有機相除去機構５００（分岐微小流路）（４）から有機相（２）を抽出する。隣り合う水相（１）同士を接触させ、両親媒性分子で構成される薄膜の形成を促す（（ｂ）および（ｃ））。   Next, the organic phase (2) is extracted from the organic phase removal mechanism 500 (branch microchannel) (4) provided on the side surface (one side or both sides) of the hydrophobic microchannel (3). Adjacent aqueous phases (1) are brought into contact with each other to promote the formation of a thin film composed of amphiphilic molecules ((b) and (c)).

あらかじめ、有機相（２）あるいは水相（１）に脂質膜に埋め込むための生体分子（例：膜タンパク質）を混ぜておくことで、それら生体分子を脂質膜に固定化することができる。   By previously mixing biomolecules (eg, membrane proteins) for embedding in the lipid membrane into the organic phase (2) or the aqueous phase (1), these biomolecules can be immobilized on the lipid membrane.

図３は、検出機構６００の一例としての微小電極（５）と徴細流路（３）の組み合わせの例を示し、微小電極（５）と微細流路（３）を組み合わせることにより、膜厚の検証や生体分子の電気応答性を測定することができる。   FIG. 3 shows an example of a combination of the microelectrode (5) and the fine flow path (3) as an example of the detection mechanism 600. By combining the microelectrode (5) and the fine flow path (3), the film thickness can be reduced. Verification and electrical response of biomolecules can be measured.

図４は非対称二分子膜の生成法の一例を示す。（ａ）は二相プラグ流形成の概念図、（ｂ）および（ｃ）は微細流路の両側面に設けた有機相除去機構５００（分岐微小流路）を利用した有機相の抽出および膜形成の模式図、（ｃ）および（ｄ）は微細流路の片方の側面に設けた有機相除去機構５００（分岐微小流路）を利用した有機相の抽出および膜形成の模式図を示す。この態様によれば、異なる種類の両親媒性分子からなる非対称な二分子膜を形成することも可能である。   FIG. 4 shows an example of a method for producing an asymmetric bilayer. (A) is a conceptual diagram of two-phase plug flow formation, (b) and (c) are organic phase extraction and membranes using an organic phase removal mechanism 500 (branch microchannel) provided on both sides of the microchannel. Schematic diagrams of formation, (c) and (d) show schematic diagrams of organic phase extraction and film formation using an organic phase removal mechanism 500 (branch microchannel) provided on one side of the microchannel. According to this aspect, it is also possible to form an asymmetric bilayer film composed of different types of amphiphilic molecules.

続いて、本実施形態のマイクロ流体チップ２００の流路に設置された破砕機構４００の詳細について、図５〜図１２を参照して以下に説明する。具体的には、本実施形態における破砕機構４００（主に、電気的破砕機構４５０）を用いて計測対象である細胞の膜構造を破砕（部分的に孔を開けることを含む）する方法の一例について説明する。なお、本細胞計測装置１００において用いられる破砕機構４００は、本実施形態における破砕機構４００に限定されるものではなく、例えば、一般の細胞膜上に微小孔を開け遺伝子導入などを実施するエレクトロポレーション技術を応用して、所定の直流電圧パルスを細胞に付加してもよい。ここで、図５は、破砕機構４００で用いた電界形成用電極５２による破砕構造を示す図である。また、図６は、図５に示した電極構造の別の形態の一例を示す図である。   Next, details of the crushing mechanism 400 installed in the flow path of the microfluidic chip 200 of the present embodiment will be described below with reference to FIGS. Specifically, an example of a method for crushing (including partially opening a hole) the cell membrane structure to be measured using the crushing mechanism 400 (mainly the electric crushing mechanism 450) in the present embodiment. Will be described. The crushing mechanism 400 used in the cell measuring apparatus 100 is not limited to the crushing mechanism 400 in the present embodiment. For example, electroporation that performs gene introduction by opening a micropore on a general cell membrane. A predetermined DC voltage pulse may be applied to the cell by applying the technology. Here, FIG. 5 is a diagram showing a crushing structure by the electric field forming electrode 52 used in the crushing mechanism 400. Moreover, FIG. 6 is a figure which shows an example of another form of the electrode structure shown in FIG.

本実施形態において、破砕機構４００（細胞破砕機構）は、図５に示すように、マイクロ流体チップ２００の流路２３内に外部電源（後述する電界印加装置５３）に接続可能な電極構造（電界形成用電極５２）を有し、その電極間に細胞が通過することによって細胞膜を破砕する構成となっている。また、特に破砕効率を向上させるため、後述する図６の例では、流路幅の一部を狭くした部分で電極平面を覆い、非対称的な形状となって露出した電界形成用電極５２による破砕構造や、電極自体を非対称とした破砕構造を用いてもよい。   In this embodiment, as shown in FIG. 5, the crushing mechanism 400 (cell crushing mechanism) has an electrode structure (electric field) that can be connected to an external power source (electric field applying device 53 described later) in the flow path 23 of the microfluidic chip 200. It has an electrode for forming 52), and the cell membrane is crushed when cells pass between the electrodes. In order to improve the crushing efficiency in particular, in the example of FIG. 6 to be described later, the electrode plane is covered with a portion in which a part of the channel width is narrowed, and crushing is performed by the electric field forming electrode 52 exposed in an asymmetric shape. You may use the structure and the crushing structure which made the electrode itself asymmetrical.

また、本実施形態において、破砕機構４００は、図６に示すように、１対の電界形成用電極５２，５２が、膜状電極で構成され、流路２３の側壁から突出形成される１対の構造体５５，５５の近傍に形成されてもよい。なお、図６中では、分かり易くするために、電界形成用電極５２，５２を流路２３の近傍部分のみ示しているが、実際はマイクロ流体チップ２００の端部まで流路２３が延び、電界形成用電極５２，５２は、非対称的な形状で、例えば、図６（ｂ）〜（ｄ）に示すものがあり、この電界形成用電極５２，５２間のギャップは、細胞の径以下となっている。   In the present embodiment, as shown in FIG. 6, the crushing mechanism 400 includes a pair of electric field forming electrodes 52, 52 configured as film electrodes and protruding from the side wall of the flow path 23. It may be formed in the vicinity of the structures 55, 55. In FIG. 6, for the sake of clarity, the electric field forming electrodes 52, 52 are shown only in the vicinity of the flow path 23, but actually, the flow path 23 extends to the end of the microfluidic chip 200, thereby forming the electric field. The electrodes 52 and 52 have asymmetric shapes, for example, as shown in FIGS. 6B to 6D. The gap between the electric field forming electrodes 52 and 52 is less than the cell diameter. Yes.

図６において、電界印加装置５３は、電界形成用電極５２，５２に交流電圧を供給する。交流電圧が供給されると、上記のように電界形成用電極５２，５２が非対称的な形状であるため、当該電界形成用電極５２，５２間に各領域で強度が不均一な電界が形成される。そして、この不均一電界が形成された領域では、流路２３中の物質が誘電泳動力を受ける。本実施形態では、比較的に高周波の交流電圧（例えば、１ＭＨｚ）を印加するので、不均一電界が形成された領域で、細胞Ｃが負の誘電泳動力を受け、電界強度の小さい弱電界側の電極（下流側に配置された方の電界形成用電極５２）に向かって移動する。さらに、本実施形態においては、この交流電圧は、絶縁性の細胞膜に間欠的に電界を集中させ、細胞膜構造の可逆又は不可逆破壊を引き起こす。なお、どのような交流電界を印加するかは、細胞の大きさや種類等に応じて決定する。このとき、電界をかけることによる細胞の及ぼす影響を低減させることを考慮して設定することが好ましい。また、できるだけ高周波数で小振幅の電界を用いると、流路２３内での気泡の発生を抑制することも可能となる。なお、上記電界印加装置５３及び電界形成用電極５２，５２が、電界形成手段に相当する。   In FIG. 6, the electric field applying device 53 supplies an AC voltage to the electric field forming electrodes 52 and 52. When an AC voltage is supplied, the electric field forming electrodes 52 and 52 have an asymmetric shape as described above, so that an electric field with non-uniform strength is formed in each region between the electric field forming electrodes 52 and 52. The In the region where the non-uniform electric field is formed, the substance in the flow path 23 receives a dielectrophoretic force. In the present embodiment, since a relatively high frequency alternating voltage (for example, 1 MHz) is applied, the cell C receives a negative dielectrophoretic force in a region where the non-uniform electric field is formed, and the weak electric field side where the electric field strength is small. Move toward the electrode (the electric field forming electrode 52 disposed on the downstream side). Furthermore, in this embodiment, this alternating voltage intermittently concentrates the electric field on the insulating cell membrane, causing reversible or irreversible destruction of the cell membrane structure. Note that what AC electric field is applied is determined according to the size and type of cells. At this time, it is preferable to set in consideration of reducing the influence exerted by the cell by applying an electric field. In addition, when an electric field having a small amplitude is used at a frequency as high as possible, the generation of bubbles in the flow path 23 can be suppressed. The electric field applying device 53 and the electric field forming electrodes 52 and 52 correspond to electric field forming means.

また、本実施形態において、破砕機構４００は、図９〜図１２に示すように、破砕補助機構（構造体５５および尖部５５ａを含む）を有してもよい。また、例えば、図７に示すように、流路２３の一部を細胞の直径よりも小さく絞り、細胞の通過を困難にすることで、細胞内圧を発生させて破砕しやすくしてもよい。なお、図７では、破砕補助機構を分かり易くするために電界形成用電極５２，５２の図示を省略しているが、本来は、図６に示すように、電極構造を組み合わせて電気破砕的効果を援助する形で用いる。ここで、図８は、破砕補助機構の一例を示しており、また、図９〜図１２は、破砕補助機構の別の形態の一例を示す図である。これらを電極と組合せることで、より低い電界で（測定対象物への電気的な影響を最小限にして）細胞を破砕することが可能となる。   Moreover, in this embodiment, the crushing mechanism 400 may have a crushing auxiliary mechanism (including the structural body 55 and the pointed portion 55a) as shown in FIGS. Further, for example, as shown in FIG. 7, a part of the flow path 23 may be narrowed to be smaller than the cell diameter to make it difficult for the cells to pass therethrough, thereby generating an intracellular pressure and making it easy to crush. In FIG. 7, the electric field forming electrodes 52 and 52 are not shown for easy understanding of the crushing assisting mechanism, but originally, as shown in FIG. It is used in a form that assists. Here, FIG. 8 shows an example of the crushing auxiliary mechanism, and FIGS. 9 to 12 are views showing examples of another form of the crushing auxiliary mechanism. By combining these with an electrode, it becomes possible to disrupt cells with a lower electric field (minimizing the electrical influence on the measurement object).

本実施形態における破砕機構４００（主に、電気的破砕機構４５０）を用いて計測対象である細胞の膜構造の破砕する際には、試料分子として細胞Ｃを含む試料溶液を、導入機構３００−１〜２によりマイクロ流体チップ２００の流路２３内に投入する。そして、この状態で、マイクロ流体チップ２００の流路２３に設置された１対の電極に電圧を印加し
、細胞膜を破砕または孔を開けて細胞の内容物と外部溶液（例えば、抗体や試薬など）とを反応させる。 When crushing the membrane structure of a cell to be measured using the crushing mechanism 400 (mainly the electric crushing mechanism 450) in the present embodiment, a sample solution containing cells C as sample molecules is introduced into the introduction mechanism 300-. The microfluidic chip 200 is charged into the flow path 23 by 1-2. In this state, a voltage is applied to a pair of electrodes installed in the flow path 23 of the microfluidic chip 200, and the cell membrane is crushed or perforated so that the contents of the cell and an external solution (for example, an antibody or a reagent) ).

また、本実施形態において、破砕機構４００は、破砕補助機構を備えた電極構造として、図７および図８に示す破砕機構４００を用いてもよい。ここで、図７は、本実施形態における破砕機構４００の一例の効果を説明するための図である。また、図８は、本実施形態における構造体の一例を示す図である。   Moreover, in this embodiment, the crushing mechanism 400 may use the crushing mechanism 400 shown in FIG. 7 and FIG. 8 as an electrode structure provided with the crushing auxiliary mechanism. Here, FIG. 7 is a figure for demonstrating the effect of an example of the crushing mechanism 400 in this embodiment. FIG. 8 is a diagram illustrating an example of a structure in the present embodiment.

そして、細胞Ｃが移動し始めた後、電界形成電極５２，５２に高周波電圧を印加し、不均一電界を形成する。図７において、マイクロ流体チップ２００の流路２３内の流体の流れと共に、当該流路２３内で細胞Ｃが当該不均一電界の形成領域に差し掛かると、上記のように流路２３内で上流側から下流側に向かう負の誘電泳動力を受けて、構造体５５，５５に押し付けられる（同図（ｂ））。これにより、細胞Ｃの内圧が高まると共に、交流電圧の電気的な破砕作用も加わって、細胞が破砕する（同図（ｃ））。なお、細胞Ｃが構造体に衝突時のみでなく、衝突後にも、細胞Ｃの構造体５５，５５に接していない部分が誘電泳動力を受けて下流側に引っ張られることで、構造体５５，５５に挟みこまれた上流側部分の内圧が高められ、細胞の破砕が促進される。   Then, after the cell C starts to move, a high frequency voltage is applied to the electric field forming electrodes 52 and 52 to form a non-uniform electric field. In FIG. 7, together with the flow of the fluid in the flow path 23 of the microfluidic chip 200, when the cell C reaches the formation region of the non-uniform electric field in the flow path 23, the upstream in the flow path 23 as described above. Upon receiving a negative dielectrophoretic force from the side toward the downstream side, the structure is pressed against the structures 55 (55). As a result, the internal pressure of the cell C is increased, and an electric crushing action of the alternating voltage is also applied, so that the cell is crushed ((c) in the figure). In addition, not only when the cell C collides with the structure but also after the collision, the portion of the cell C that is not in contact with the structure 55, 55 receives the dielectrophoretic force and is pulled to the downstream side. The internal pressure of the upstream portion sandwiched between 55 is increased, and cell disruption is promoted.

また、破砕補助機構は、図８に示すように、本実施形態の破砕機構４００は、流路２３の底面から延びる構造体５５に限らず、流路２３の側壁から突出して、流路幅を狭くする構造体５５であってもよい。図８には、そのような構造体５５を１対、流路２３の対向する１対の側壁に夫々設けた場合を示す。図８（ａ）では、構造体５５が流路２３の側壁から流路幅方向に平面斜で略三角状に突出形成されており、１対が流路２３を挟んで対称的に形成されている。そして、その１対の構造体５５，５５が最も突出した部分で、破砕対象の細胞の径よりも流路幅が狭くなっている。このため、細胞Ｃが流体により運ばれてくると、流路幅が細胞Ｃの径よりも狭くなった部分で１対の構造体５５，５５に挟み込まれる。そして、誘電泳動力や流体駆動力によって構造体５５，５５に押し込まれ、細胞Ｃの内圧が高まることで、細胞膜が破れて細胞Ｃが破砕する。   As shown in FIG. 8, the crushing mechanism 400 of the present embodiment is not limited to the structure 55 extending from the bottom surface of the flow path 23, but protrudes from the side wall of the flow path 23 to increase the flow path width. The structure 55 may be narrowed. FIG. 8 shows a case where a pair of such structures 55 are provided on a pair of opposing side walls of the flow path 23. In FIG. 8A, the structural body 55 is formed so as to project from the side wall of the flow path 23 in a substantially diagonal shape in the plane width direction in the flow path width direction, and one pair is formed symmetrically across the flow path 23. Yes. And the flow path width is narrower than the diameter of the cell to be crushed at the portion where the pair of structures 55, 55 protrudes most. For this reason, when the cell C is carried by the fluid, it is sandwiched between the pair of structures 55 and 55 at a portion where the channel width is narrower than the diameter of the cell C. And it is pushed into the structures 55 and 55 by the dielectrophoretic force or the fluid driving force, and the internal pressure of the cell C increases, so that the cell membrane is broken and the cell C is crushed.

図８（ｂ）及び（ｃ）も同様の作用によって細胞を破砕するものであり、同図（ｂ）の構造体５５，５５は平面視円弧状に突出している。また、図８（ｃ）の構造体５５，５５は、流路幅を狭くするように突出すると共に、上流側に向かって尖った尖部５５ａを有する。このため、細胞Ｃが構造体５５，５５に衝突した際に内圧を増加させるのみでなく、細胞膜に尖部５５ａが食い込み、細胞膜を壊す作用も果たすので、細胞Ｃがより確実に破砕できる。   FIGS. 8B and 8C also crush cells by the same action, and the structures 55 and 55 in FIG. 8B protrude in an arc shape in plan view. Further, the structures 55 and 55 in FIG. 8C project so as to narrow the flow path width, and have a pointed portion 55a sharpened toward the upstream side. For this reason, not only does the internal pressure increase when the cell C collides with the structures 55, 55, but also the tip 55a bites into the cell membrane and breaks the cell membrane, so that the cell C can be more reliably crushed.

なお、このような構造体５５は、上記のものに限られず、例えば、図１０の（ａ）や（ｂ）に示すように三角柱状のものを流路幅方向に２つ以上並べたり、図１０の（ｃ）や（ｄ）に示すように三角柱状以外の形状をしてもよい。また、上流側に向かって尖った尖部５５ａを有するものに限られず、図１１に示すような円柱状の構造体５５としてもよい。尖部５５ａを設けた場合、衝突した部分の細胞膜が壊れたり、衝突に伴って細胞の形状が大きく変化することで内圧の一部で極大化したりするので、細胞が破砕しやすくなる。   Such a structure 55 is not limited to the above structure, and for example, as shown in FIGS. 10A and 10B, two or more triangular prisms may be arranged in the flow path width direction. As shown in 10 (c) and (d), shapes other than the triangular prism shape may be used. Moreover, it is not restricted to what has the pointed part 55a pointed toward the upstream, It is good also as a column-shaped structure 55 as shown in FIG. When the cusp 55a is provided, the cell membrane at the colliding part is broken, or the shape of the cell is greatly changed in accordance with the collision, so that it is maximized by a part of the internal pressure.

また、流路２３の側壁から突出し、流路幅を挟める形式の構造体５５，５５に限られず、図１２に示すように、流路２３の底面から延びる形式の構造体５５を用いてもよい。   Further, the structure 55 is not limited to the structure 55 or 55 that protrudes from the side wall of the flow path 23 and sandwiches the width of the flow path, but may be a structure 55 that extends from the bottom surface of the flow path 23 as shown in FIG. .

なお、本実施形態における破砕機構４００の適用は上記実施形態に限定されない。例えば、電界形成用電極５２，５２は、図６（ａ）に示すような配置及び形状に限定されず、図６の（ｂ）〜（ｄ）に示すようなものであってもよい。例えば、正の誘電泳動力が生じるような周波数の低い電圧を印加する場合には、大きい方の電界形成用電極５２を上流側に形成し（同図（ｃ））、誘電泳動力が上流側から下流側に向くようにしてもよい。また、誘電泳動力を上流側から下流側に向ける場合に限られず、例えば、１対の電界形成用電極５２，５２を流路２３の幅方向に並べて配置し（同図（ｂ）及び（ｄ））、幅方向に並んだ構造体５５，５５の一方に向かって細胞Ｃを押し込むように誘電泳動力が作用するようにしてもよい。このほか、３つ以上の電極を設けて、交流電圧を印加した場合にも、不均一電界を形成できる。   In addition, application of the crushing mechanism 400 in this embodiment is not limited to the said embodiment. For example, the electric field forming electrodes 52 and 52 are not limited to the arrangement and shape as shown in FIG. 6A, and may be as shown in FIGS. 6B to 6D. For example, when applying a voltage having a low frequency so as to generate a positive dielectrophoretic force, the larger electric field forming electrode 52 is formed on the upstream side ((c) in the figure), and the dielectrophoretic force is on the upstream side. You may make it face to the downstream side. Further, the present invention is not limited to the case where the dielectrophoretic force is directed from the upstream side to the downstream side. For example, a pair of electric field forming electrodes 52 and 52 are arranged side by side in the width direction of the flow path 23 (see FIGS. )), The dielectrophoretic force may act so as to push the cell C toward one of the structures 55, 55 arranged in the width direction. In addition, a non-uniform electric field can be formed even when three or more electrodes are provided and an AC voltage is applied.

また、上記実施形態では、一定の交流電圧を所定時間連続して印加するが、これに限らず、一定時間おきに高周波電圧を所定時間印加する方式（バースト波形）を繰り返してもよい。また、交流電界の印加期間、振幅、周波数を時間の経過と共に、増減させてもよい。   In the above embodiment, a constant AC voltage is continuously applied for a predetermined time. However, the present invention is not limited to this, and a method (burst waveform) in which a high-frequency voltage is applied for a predetermined time every predetermined time may be repeated. Moreover, you may increase / decrease the application period, amplitude, and frequency of an alternating electric field with progress of time.

また、上記実施形態では、細胞の通過に合わせ交流電界を印加してもよく、また、常時交流電界を印加してもよい。また、一例として、細胞の破砕を確認するため、破砕機構４００にて細胞の状態を顕微鏡等により常時観察し、画像処理技術等を用いて細胞が破砕したか否かを判別してもよい。   Moreover, in the said embodiment, an alternating electric field may be applied according to passage of a cell, and an alternating electric field may be applied constantly. Further, as an example, in order to confirm cell disruption, the state of the cell may be constantly observed with a microscope or the like by the disruption mechanism 400, and it may be determined whether or not the cell has been disrupted using an image processing technique or the like.

また、破砕機構４００の設置箇所は、１箇所に限定されず、マイクロ流体チップ２００の流路２３上の複数箇所に設置してもよい。特に、高速で流体を流す場合には、破砕機構４００を複数個、流路２３上に連続的に設置してもよい。また、同様に、破砕機構４００の破砕用の電極（電界形成用電極５２を含む）は、１対に限定されず、マイクロ流体チップ２００の流路２３内に複数対設けてもよい。   Moreover, the installation location of the crushing mechanism 400 is not limited to one location, and may be installed at a plurality of locations on the flow path 23 of the microfluidic chip 200. In particular, when flowing fluid at high speed, a plurality of crushing mechanisms 400 may be continuously installed on the flow path 23. Similarly, the crushing electrodes (including the electric field forming electrode 52) of the crushing mechanism 400 are not limited to one pair, and a plurality of pairs may be provided in the flow path 23 of the microfluidic chip 200.

また、流路２３の一部に誘電泳動力を作用させる場合に限られず、例えば、流路２３に設置された電極に交流電圧を印加して、流路２３の全長に対して誘電泳動力を作用させるものであってもよい。   In addition, the present invention is not limited to the case where the dielectrophoretic force is applied to a part of the flow path 23. For example, an alternating voltage is applied to the electrode installed in the flow path 23 so that the dielectrophoretic force is applied to the entire length of the flow path 23. You may make it act.

さらに、細胞破砕のための駆動方法は、上述の実施形態のように、誘電泳動力による場合に限定されず、例えば、電気浸透流やポンプを用いるなど圧力流で駆動する方式であってもよく、マイクロポンプ等を用いることもできる。また、電界形成用電極５２，５２等の電極は、膜状電極としてマイクロ流体チップ２００の流路２３に一体形成する場合に限らず、例えば、ワイヤ状の電極として構成し、流路２３に挿入して電圧を印加するようにしてもよい。   Furthermore, the driving method for cell disruption is not limited to the case of using dielectrophoretic force as in the above-described embodiment, and may be a system driven by pressure flow such as using an electroosmotic flow or a pump. A micropump or the like can also be used. In addition, the electrodes such as the electric field forming electrodes 52 and 52 are not limited to being integrally formed in the flow path 23 of the microfluidic chip 200 as film-like electrodes. Then, a voltage may be applied.

また、流路２３の配置は、例えば、流路２３が複数併設されるものや、他の機能部（例えば、破砕後の内包物Ｃ１を分離する分離部）が設けられるものであってもよい。   In addition, the arrangement of the flow path 23 may be, for example, a structure in which a plurality of flow paths 23 are provided or another function part (for example, a separation part that separates the inclusion C1 after crushing). .

このように、本実施形態における細胞計測装置１００では、上述の破砕機構４００（細胞破砕機構）を、マイクロ流体チップ２００中に組み込むことにより、２相液滴（脂質膜カプセル）内での細胞破砕（内容物抽出）を可能とする。特に、電気的破砕機構４５０により、マイクロ流体チップ２００の流路上に配置された電極から印加された電圧によって細胞膜を電気的に破砕することにより、細胞膜を非接触で破砕することが可能となる。これにより、２相液滴（脂質膜カプセル）を構成している脂質膜への影響を少なくできる。また、この際、上述の破砕機構４００（細胞破砕機構）のいずれかを利用できるが、本実施形態において、マイクロ流体チップ２００の流路内を流れる流体（２相液滴や有機相を含む）の駆動は、マイクロ流体チップ２００全体の流体駆動力（例えば、シリンジポンプなどの外部動力）によって行われるため、上述の電気浸透流を発生させなくてもよい。   As described above, in the cell measurement device 100 according to the present embodiment, the above-described crushing mechanism 400 (cell crushing mechanism) is incorporated into the microfluidic chip 200 to thereby crush the cells in the two-phase droplet (lipid membrane capsule). (Content extraction) is enabled. In particular, the cell membrane can be crushed in a non-contact manner by electrically crushing the cell membrane by the voltage applied from the electrode arranged on the flow path of the microfluidic chip 200 by the electric crushing mechanism 450. Thereby, the influence on the lipid membrane constituting the two-phase droplet (lipid membrane capsule) can be reduced. At this time, any of the above-described crushing mechanisms 400 (cell crushing mechanisms) can be used. In this embodiment, the fluid (including two-phase droplets and organic phases) flowing in the flow path of the microfluidic chip 200 is used. Is driven by the fluid driving force of the entire microfluidic chip 200 (for example, external power such as a syringe pump), the above-described electroosmotic flow need not be generated.

また、本実施形態において、上述のように、電界形成用電極５２を利用して細胞の破砕を容易化する場合には、マイクロ流体チップ２００の流路の断面積を突起形状等に変形して一時的に縮小することにより、電界の集中や細胞の捕獲を行ってもよいが、２相液滴（脂質膜カプセル）内で細胞膜の破砕を行う場合には、脂質膜への影響を極小化するため、可能な限りマイクロ流体チップ２００の流路内の空間を均一に構成する（細胞捕獲のための突起部を設けない）必要があるため、突起部を設けずに電極のみによる細胞膜の破砕を行ってもよい。また、この際、細胞が電極上を通過する時間をマイクロ流体チップ２００全体の流速を制御し、的確に細胞膜を破砕するよう調整してもよい。   In the present embodiment, as described above, when the electric field forming electrode 52 is used to facilitate cell disruption, the cross-sectional area of the flow path of the microfluidic chip 200 is changed to a protrusion shape or the like. It may be possible to concentrate the electric field or capture the cells by temporarily reducing the size, but when disrupting the cell membrane in a two-phase droplet (lipid membrane capsule), the effect on the lipid membrane is minimized. Therefore, it is necessary to make the space in the flow path of the microfluidic chip 200 as uniform as possible (without providing a projection for capturing cells), so that the cell membrane is crushed only by the electrode without providing the projection. May be performed. At this time, the time required for the cells to pass over the electrodes may be adjusted by controlling the flow rate of the entire microfluidic chip 200 so as to crush the cell membrane accurately.

以上で、マイクロ流体チップ２００の詳細の説明を終える。   This is the end of the detailed description of the microfluidic chip 200.

続いて、本実施形態における細胞計測装置１００の実施例により更に具体的に説明する。なお、本実施形態における細胞計測装置１００は本実施例に限定されるものではない。ここで、図１３は、本実施例における細胞計測装置１００の装置全体の一例を示す図である。   Then, it demonstrates still more concretely by the Example of the cell measuring device 100 in this embodiment. In addition, the cell measuring device 100 in this embodiment is not limited to a present Example. Here, FIG. 13 is a diagram illustrating an example of the entire apparatus of the cell measuring apparatus 100 in the present embodiment.

図１３に示すように、本実施例における細胞計測装置１００は、基本構成として、核となるマイクロ流体チップ２００（上記図１に示すような流路パターンが実装されており、有機相除去機構５００が流路上に構成される）と、そのマイクロ流体チップ２００の周辺機器（例えば、流体駆動用のポンプユニット（導入機構３００に対応）、細胞破砕装置（破砕機構４００に対応）、および、検出装置（検出機構６００に対応））とを備えて構成される。ここで、マイクロ流体チップ２００は、例えば、ソケット式コネクターにより外部の周辺機器と接続されていてもよく、ディスポーザブルに着脱自在であってもよい。   As shown in FIG. 13, the cell measuring apparatus 100 in the present embodiment has a microfluidic chip 200 as a basic structure (on which a flow path pattern as shown in FIG. 1 is mounted, and an organic phase removing mechanism 500). And a peripheral device of the microfluidic chip 200 (for example, a fluid-driven pump unit (corresponding to the introduction mechanism 300), a cell disrupting device (corresponding to the disrupting mechanism 400), and a detection device) (Corresponding to the detection mechanism 600)). Here, the microfluidic chip 200 may be connected to an external peripheral device by, for example, a socket type connector, or may be detachably attachable.

図１３において、細胞破砕装置（破砕機構４００）は、一例として、１対の電極（電界形成用電極５２を含む）と、ファンクションジェネレータ（例えば、Ａｇｉｌｅｎｔ（会社名）の３３１２０Ａ（型番）等）と、高周波アンプ（例えば、ＮＦ（会社名）のＨＳＡ４０１１（型番）等）とを備えて構成されている。また、検出装置（検出機構６００）は、一例として、電気検出の場合、１対の電極と、微小電流計（例えば、Ｋｅｉｔｈｌｅｙ（会社名）の６４８７（型番）等）やパッチ／ホールセルクランプ用増幅器（例えば、日本光電（会社名）のＣＥＺ−２４００（型番）等）と、データ収集パソコンとを備えて構成されている。また、図１３の検出装置（検出機構６００）は、電気検出の場合の一例であるが、その他に、光学検出の場合に用いる、顕微鏡やその他のイメージングデバイス等の検出機器などを用いてもよい。また、ポンプユニットは、マイクロ流体チップ２００の流路内へ導入される各溶液の流入条件（例えば、流量や圧力等）を最適化して、２相液滴を安定生成する機能を有する。また、同時に、ポンプユニットは、有機相除去機構５００により除去された有機相を吸引し再度流路内に導入することも可能であり、マイクロ流体チップ２００全体の流体駆動力を発生させる機能を有する。また、廃液ポンプユニットは、検出装置により検出された計測対象の２相液滴を廃液として回収する機能を有する。   In FIG. 13, as an example, the cell crushing device (crushing mechanism 400) includes a pair of electrodes (including the electric field forming electrode 52), a function generator (for example, 33120A (model name) of Agilent (company name)), and the like. And a high frequency amplifier (for example, HSA4011 (model number) of NF (company name)). For example, in the case of electrical detection, the detection device (detection mechanism 600) includes a pair of electrodes, a microammeter (for example, Keithley (company name) 6487 (model number), etc.), and a patch / hole cell clamp. An amplifier (for example, CEZ-2400 (model number) of Nihon Kohden (company name)) and a data collection personal computer are provided. In addition, the detection apparatus (detection mechanism 600) in FIG. 13 is an example in the case of electrical detection, but other detection devices such as a microscope and other imaging devices that are used in the case of optical detection may also be used. . The pump unit has a function of optimizing the inflow conditions (for example, flow rate and pressure) of each solution introduced into the flow path of the microfluidic chip 200 to stably generate two-phase droplets. At the same time, the pump unit can suck the organic phase removed by the organic phase removal mechanism 500 and introduce it again into the flow path, and has a function of generating the fluid driving force of the entire microfluidic chip 200. . In addition, the waste liquid pump unit has a function of collecting the measurement target two-phase droplets detected by the detection device as waste liquid.

以下、本実施例における細胞計測装置１００の細胞計測の一例について、図１４〜図１９を参照して説明する。ここで、図１４は、導入機構３００によるセル生成（液滴生成）の一例を示す写真である。また、図１５は、破砕機構４００による細胞破砕の一例を示す写真である。また、図１６は、有機相除去機構５００による有機相除去の一例を示す写真である。また、図１７および図１８は、検出機構６００による検出（光学検出）の一例を示す写真である。また、図１９は、検出機構６００による検出（脂質膜の電気応答の検出）の一例を示すグラフである。   Hereinafter, an example of the cell measurement of the cell measurement device 100 according to the present embodiment will be described with reference to FIGS. Here, FIG. 14 is a photograph showing an example of cell generation (droplet generation) by the introduction mechanism 300. FIG. 15 is a photograph showing an example of cell disruption by the disruption mechanism 400. FIG. 16 is a photograph showing an example of organic phase removal by the organic phase removal mechanism 500. 17 and 18 are photographs showing an example of detection (optical detection) by the detection mechanism 600. FIG. FIG. 19 is a graph showing an example of detection by the detection mechanism 600 (detection of the electrical response of the lipid membrane).

まず、細胞計測装置１００の導入機構３００は、上記図１の（１）「セル生成」として、図１４（ａ）に示すように、計測対象を含む水相を、リン脂質分子が含まれる有機相が流れるマイクロ流体チップ２００の流路内に導入することにより、図１４（ｂ）に示すように、２相液滴を生成する。なお、図１４（ａ）および（ｂ）中では、分かり易くするために導入機構３００の片側部分のみ示しているが、実際は、導入機構３００−１〜２は、マイクロ流体チップ２００の流路内へ計測対象を含む水相を交互に導入している。このように、導入機構３００により、図１４（ｃ）に示すように、有機相が流れるマイクロ流体チップ２００の流路内に２相液滴の水相１および水相２が導入される。   First, the introduction mechanism 300 of the cell measurement device 100 is configured as (1) “cell generation” in FIG. 1, as shown in FIG. By introducing it into the flow path of the microfluidic chip 200 through which the phase flows, two-phase droplets are generated as shown in FIG. 14 (a) and 14 (b), only one side portion of the introduction mechanism 300 is shown for the sake of clarity, but in reality, the introduction mechanisms 300-1 and 2 are located in the flow path of the microfluidic chip 200. The water phase including the measurement target is introduced alternately. In this manner, as shown in FIG. 14C, the introduction mechanism 300 introduces the aqueous phase 1 and the aqueous phase 2 as two-phase droplets into the flow path of the microfluidic chip 200 through which the organic phase flows.

次に、細胞計測装置１００の破砕機構４００は、上記図１の（２）「細胞破砕」として、図１５（ａ）〜（ｅ）の順に示すように、図１５の紙面左側（上流）から右側（下流）へ流路内を流れる２相液滴に含まれる細胞の細胞膜を、流路幅が狭くなった部分にて細胞の内圧を高めると共に、交流電圧の電気的な破砕作用も加えることにより、破砕する。なお、図１５に示す破砕機構４００は、一例として、上記図５に示す破砕機構４００を用いているが、上述の他の破砕機構４００を用いてもよい。   Next, the crushing mechanism 400 of the cell measuring apparatus 100 is shown as (2) “cell crushing” in FIG. 1 from the left side (upstream) in FIG. 15, as shown in the order of FIGS. 15 (a) to 15 (e). The cell membrane of the cells contained in the two-phase droplets that flow in the flow path to the right (downstream) increases the internal pressure of the cells at the portion where the flow path width becomes narrow, and also adds an electrical crushing action of alternating voltage Crush. Note that the crushing mechanism 400 shown in FIG. 15 uses the crushing mechanism 400 shown in FIG. 5 as an example, but other crushing mechanisms 400 described above may be used.

そして、細胞計測装置１００の有機相除去機構５００は、上記図１の（３）「有機相除去」として、図１６（ａ）〜（ｄ）の順に示すように、図１６の紙面右側（上流）から左側（下流）へ流路内を流れる、細胞膜が破砕された細胞内容物を含む隣り合う２相液滴同士を、その２相液滴周辺の有機相を除去することにより接触させて脂質二分子膜（脂質平面膜）を流路内に並列生成する。   Then, the organic phase removal mechanism 500 of the cell measuring apparatus 100 performs the right side (upstream) of FIG. 16 as (3) “organic phase removal” in FIG. 1, as shown in the order of FIGS. ) From the left side (downstream) to the left side (downstream), and the adjacent two-phase droplets containing the cell contents whose cell membranes are crushed are brought into contact with each other by removing the organic phase around the two-phase droplets. Bimolecular membranes (lipid planar membranes) are generated in parallel in the flow path.

そして、細胞計測装置１００の検出機構６００は、上記図１の（４）「検出」として光学検出する場合、図１７および図１８に示すように、隣り合う２相液滴間の計測対象の反応を検出する。一例として、蛍光試料を用いてＣａとの反応を蛍光観察により検出してもよい。具体的には、図１７において、図１７の紙面左側の２相液滴内にはＣａ２＋検出滴、右側の２相液滴内にはＣａ２＋含有滴が含まれており、左側の２相液滴が蛍光を発している（蛍光試料がＣａと反応している）ため、脂質平面膜にイオノフォアが存在し、カルシウムイオンが透過したことが検出される。また、図１８においては、図１７と同様に紙面左側の２相液滴内にはＣａ２＋検出滴、右側の２相液滴内にはＣａ２＋含有滴が含まれており、左側の２相液滴が蛍光を発していない（蛍光試料がＣａと反応していない）ため、脂質平面膜にイオノフォアが存在せず、カルシウムイオンが透過していないことが検出される。   When the detection mechanism 600 of the cell measuring apparatus 100 performs optical detection as (4) “detection” in FIG. 1 as described above, as shown in FIGS. 17 and 18, the measurement target reaction between adjacent two-phase droplets is detected. Is detected. As an example, a reaction with Ca may be detected by fluorescence observation using a fluorescent sample. Specifically, in FIG. 17, the two-phase droplets on the left side of FIG. 17 contain Ca2 + detection droplets, and the two-phase droplets on the right side contain Ca2 + -containing droplets. Is emitting fluorescence (the fluorescent sample is reacting with Ca), it is detected that ionophores exist in the lipid planar membrane and calcium ions are transmitted. In FIG. 18, similarly to FIG. 17, the Ca2 + detection droplets are contained in the two-phase droplets on the left side of the paper, and the Ca2 + -containing droplets are contained in the two-phase droplets on the right side. Does not emit fluorescence (the fluorescent sample does not react with Ca), it is detected that no ionophore is present in the lipid planar membrane and calcium ions are not permeated.

また、細胞計測装置１００の検出機構６００は、上記図１の（４）「検出」として脂質膜の電気応答を検出する場合、図１９に示すように、電気的な検出手段（一例として、微小電極を用いてイオンの移動などにより生じる微小な電位差（膜電位）を検出する手段など）を用いて、隣り合う２相液滴間の計測対象の反応を検出してもよい。   Further, when the detection mechanism 600 of the cell measuring apparatus 100 detects the electrical response of the lipid membrane as (4) “detection” in FIG. 1, as shown in FIG. 19, as shown in FIG. A measurement target reaction between two adjacent two-phase droplets may be detected using a minute potential difference (membrane potential) generated by ion movement using an electrode.

以上のように、本発明を実施するための最良に形態および実施例について説明したが、本発明はこれらに限定されるものではなく、本発明の技術的思想の範囲内で各種の変形が可能であり、かかる変形例も本発明の範囲内である。   As described above, the best modes and examples for carrying out the present invention have been described. However, the present invention is not limited to these, and various modifications are possible within the scope of the technical idea of the present invention. Such modifications are also within the scope of the present invention.

以上詳述に説明したように、本発明に係るマイクロ流体チップおよび細胞計測装置は、細胞やその内容物もしくは特定の細胞小器官等の計測対象を２相液滴（リン脂質膜カプセル）内に収容し、隣接する２相液滴による影響にて生じる計測対象における反応を検出することに有用であり、これらを連続的に効率よく分析・計測することに適している。   As described above in detail, the microfluidic chip and the cell measuring device according to the present invention place a measurement target such as a cell, its contents, or a specific organelle in a two-phase droplet (phospholipid membrane capsule). It is useful for detecting reactions in a measurement target that are contained and influenced by the influence of adjacent two-phase droplets, and is suitable for analyzing and measuring these continuously and efficiently.

本実施形態のマイクロ流体チップ２００を含む細胞計測装置１００の一例を示す説明図である。It is explanatory drawing which shows an example of the cell measuring device 100 containing the microfluidic chip | tip 200 of this embodiment. 本発明における脂質二分子平面膜の製造の模式図である。It is a schematic diagram of manufacture of the lipid bimolecular planar membrane in the present invention. 微小電極と微細流路の組み合わせの例を示す図である。It is a figure which shows the example of the combination of a microelectrode and a microchannel. 非対称二分子膜の生成法の一例を示す図である。It is a figure which shows an example of the production | generation method of an asymmetrical bilayer membrane. 破砕機構４００で用いた電界形成用電極５２による破砕構造を示す図である。It is a figure which shows the crushing structure by the electric field formation electrode 52 used with the crushing mechanism 400. FIG. 図５に示した電極構造の別の形態の一例を示す図である。It is a figure which shows an example of another form of the electrode structure shown in FIG. 本実施形態における破砕機構４００の一例の効果を説明するための図である。It is a figure for demonstrating the effect of an example of the crushing mechanism 400 in this embodiment. 本実施形態における構造体の一例を示す図である。It is a figure which shows an example of the structure in this embodiment. 破砕補助機構の別の形態の一例を示す図である。It is a figure which shows an example of another form of the crushing assistance mechanism. 破砕補助機構の別の形態の一例を示す図である。It is a figure which shows an example of another form of the crushing assistance mechanism. 破砕補助機構の別の形態の一例を示す図である。It is a figure which shows an example of another form of the crushing assistance mechanism. 破砕補助機構の別の形態の一例を示す図である。It is a figure which shows an example of another form of the crushing assistance mechanism. 本実施例における細胞計測装置１００の装置全体の一例を示す図である。It is a figure which shows an example of the whole apparatus of the cell measuring device 100 in a present Example. 導入機構３００によるセル生成（液滴生成）の一例を示す写真である。6 is a photograph showing an example of cell generation (droplet generation) by the introduction mechanism 300. 破砕機構４００による細胞破砕の一例を示す写真である。5 is a photograph showing an example of cell disruption by the disruption mechanism 400. 有機相除去機構５００による有機相除去の一例を示す写真である。5 is a photograph showing an example of organic phase removal by an organic phase removal mechanism 500. 検出機構６００による検出（光学検出）の一例を示す写真である。5 is a photograph showing an example of detection (optical detection) by a detection mechanism 600. 検出機構６００による検出（光学検出）の一例を示す写真である。5 is a photograph showing an example of detection (optical detection) by a detection mechanism 600. 検出機構６００による検出（脂質膜の電気応答の検出）の一例を示すグラフである。It is a graph which shows an example of detection by detection mechanism 600 (detection of an electrical response of a lipid membrane).

符号の説明Explanation of symbols

１００ 細胞計測装置
２００ マイクロ流体チップ
３００−１〜２ 導入機構
４００ 破砕機構
４５０ 電気的破砕機構
２３ 流路
５２ 電界形成用電極
５３ 電界印加装置
５５ 構造体
５５ａ 尖部
Ｃ 細胞
Ｃ１ 内包物
５００ 有機相除去機構
６００ 検出機構 DESCRIPTION OF SYMBOLS 100 Cell measuring device 200 Microfluidic chip 300-1-2 Introduction mechanism 400 Crushing mechanism
450 Electrical crushing mechanism
23 Channel
52 Electrode for forming electric field
53 Electric field application device
55 Structure
55a Apex
C cells
C1 inclusion 500 organic phase removal mechanism 600 detection mechanism

Claims (13)

非混合性の２相液滴を流路内に交互に生成し、当該２相液滴の表面に生成されたリン脂質膜を前記流路内で接触させて脂質二分子膜を前記流路内に並列生成するマイクロ流体チップであって、
前記脂質二分子膜間に計測対象が導入されることを特徴とする、マイクロ流体チップ。 Non-mixable two-phase droplets are alternately generated in the flow channel, and the phospholipid membrane generated on the surface of the two-phase droplets is contacted in the flow channel to form a lipid bilayer membrane in the flow channel. A microfluidic chip that generates in parallel,
A microfluidic chip, wherein a measurement target is introduced between the lipid bilayer membranes. 請求項１に記載のマイクロ流体チップにおいて、
前記脂質二分子膜間に前記計測対象である細胞を少なくとも１つ含むことを特徴とする、マイクロ流体チップ。 The microfluidic chip according to claim 1, wherein
A microfluidic chip comprising at least one cell to be measured between the lipid bilayer membranes. 請求項１または２に記載のマイクロ流体チップにおいて、
前記流路上に配置された破砕機構により前記計測対象の少なくとも膜構造を破砕することを特徴とする、マイクロ流体チップ。 The microfluidic chip according to claim 1 or 2,
A microfluidic chip characterized in that at least the membrane structure of the measurement object is crushed by a crushing mechanism disposed on the flow path. 請求項３に記載のマイクロ流体チップにおいて、
前記破砕機構は、
前記流路上に配置された電極から印加された電圧により、前記計測対象の少なくとも前記膜構造を破砕する電気的破砕機構であることを特徴とする、マイクロ流体チップ。 The microfluidic chip according to claim 3,
The crushing mechanism is
A microfluidic chip, wherein the microfluidic chip is an electrical crushing mechanism that crushes at least the membrane structure to be measured by a voltage applied from an electrode arranged on the flow path. 請求項３または４に記載のマイクロ流体チップにおいて、
前記破砕機構は、
前記２相液滴を前記接触させる前に配置されていることを特徴とする、マイクロ流体チップ。 The microfluidic chip according to claim 3 or 4,
The crushing mechanism is
A microfluidic chip, wherein the two-phase liquid droplet is disposed before the contact. 請求項１〜５のうちいずれか１つに記載のマイクロ流体チップにおいて、
前記リン脂質膜および前記脂質二分子膜を構成するリン脂質分子は、機能性分子を含むことを特徴とする、マイクロ流体チップ。 In the microfluidic chip according to any one of claims 1 to 5,
The microfluidic chip, wherein the phospholipid molecules constituting the phospholipid membrane and the lipid bilayer include functional molecules. リン脂質分子を含む有機相が流路内を流れるマイクロ流体チップと、
前記マイクロ流体チップの前記流路内へ、計測対象を含む水相を交互に導入することにより、前記水相と前記有機相との間に、少なくとも前記リン脂質分子から構成される単分子構造のリン脂質膜を生成し、当該リン脂質膜内に前記水相を包んだ状態の非混合性の２相液滴を交互に生成する導入機構と、
前記流路内における前記計測対象の反応を検出する検出機構と、
を備え、
前記マイクロ流体チップの前記流路において、当該２相液滴の表面に生成された前記リン脂質膜を前記流路内で接触させて脂質二分子膜を前記流路内に並列生成し、前記検出機構により、前記流路内の前記脂質二分子膜間の前記計測対象の反応を検出する、
ことを特徴とする、細胞計測装置。 A microfluidic chip in which an organic phase containing phospholipid molecules flows in the flow path;
By alternately introducing an aqueous phase containing a measurement target into the flow path of the microfluidic chip, a monomolecular structure composed of at least the phospholipid molecule is provided between the aqueous phase and the organic phase. An introduction mechanism for generating a phospholipid membrane and alternately generating non-mixable two-phase droplets in a state where the aqueous phase is wrapped in the phospholipid membrane;
A detection mechanism for detecting a reaction of the measurement target in the flow path;
With
In the flow path of the microfluidic chip, the phospholipid membrane formed on the surface of the two-phase droplet is brought into contact with the flow path to form a lipid bilayer in parallel in the flow path, and the detection Detecting a reaction of the measurement object between the lipid bilayer membranes in the flow path by a mechanism;
A cell measuring apparatus characterized by the above. 請求項７に記載の細胞計測装置において、
前記有機相を前記マイクロ流体チップの前記流路内から除去する有機相除去機構、
を更に備え、
前記２相液滴の周辺の前記有機相を当該有機相除去機構により前記流路内から除去することにより、近接する前記２相液滴の前記単分子構造の前記リン脂質膜同士を接触させて前記脂質二分子膜を生成し、生成された当該脂質二分子膜で前記２相液滴を並列化することを特徴とする、細胞計測装置。 In the cell measuring device according to claim 7,
An organic phase removal mechanism for removing the organic phase from the flow path of the microfluidic chip;
Further comprising
By removing the organic phase around the two-phase droplet from the flow path by the organic phase removal mechanism, the phospholipid membranes of the monomolecular structure of the adjacent two-phase droplets are brought into contact with each other. A cell measuring apparatus, wherein the lipid bilayer membrane is generated, and the two-phase droplets are juxtaposed with the generated lipid bilayer membrane. 請求項７または８に記載の細胞計測装置において、
前記脂質二分子膜間に前記計測対象である細胞を少なくとも１つ含むことを特徴とする、細胞計測装置。 In the cell measuring device according to claim 7 or 8,
A cell measuring apparatus comprising at least one cell to be measured between the lipid bilayer membranes. 請求項７〜９のうちいずれか１つに記載の細胞計測装置において、
前記細胞計測装置は、
前記計測対象の少なくとも膜構造を破砕する破砕機構、
を更に備えたことを特徴とする、細胞計測装置。 In the cell measuring device according to any one of claims 7 to 9,
The cell measuring device comprises:
A crushing mechanism for crushing at least the membrane structure of the measurement object,
A cell measuring apparatus further comprising: 請求項１０に記載の細胞計測装置において、
前記破砕機構は、
前記流路上に配置された電極から印加された電圧により、前記計測対象の少なくとも前記膜構造を破砕する電気的破砕機構であることを特徴とする、細胞計測装置。 In the cell measuring device according to claim 10,
The crushing mechanism is
A cell measuring device, which is an electric crushing mechanism that crushes at least the membrane structure to be measured by a voltage applied from an electrode arranged on the flow path. 請求項１０または１１に記載の細胞計測装置おいて、
前記破砕機構は、
前記２相液滴を前記接触させる前に配置されていることを特徴とする、細胞計測装置。 In the cell measuring device according to claim 10 or 11,
The crushing mechanism is
A cell measuring device, wherein the two-phase droplet is disposed before the contact. 請求項７〜１２のうちいずれか１つに記載の細胞計測装置において、
前記リン脂質分子は、機能性分子を含むことを特徴とする、細胞計測装置。 In the cell measuring device according to any one of claims 7 to 12,
The cell measurement device, wherein the phospholipid molecule contains a functional molecule.