JP2020096627A - 組織因子経路インヒビター抗体およびその使用 - Google Patents

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Abstract

【課題】出血性障害の処置および凝血時間の短縮に有用な、組織因子経路インヒビター（ＴＦＰＩ）を特異的に結合させその活性を阻害する抗体およびその抗原結合断片の提供。【解決手段】特定のアミノ酸配列を有するＴＦＰＩのＫｕｎｉｔｚドメイン２中のエピトープに、特異的に結合する単離抗体またはその抗原結合断片。【選択図】図４

Description

本発明は、組織因子経路インヒビター（ＴＦＰＩ）に結合する抗体に関する。
血友病ＡおよびＢは、それぞれ血漿タンパク質第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）または第ＩＸ因子（ＦＩＸ）の機能的欠損から生じるＸ連鎖遺伝障害である。血友病の臨床的重症度は、凝血因子活性の残留レベルに関係付けられる。１％未満の因子活性は、重度の表現型に関連し、中等度の血友病は、２％〜５％の因子活性に関連し、軽度の血友病は、５％〜４０％の因子活性に関連する。
これらの障害のスタンダードオブケアは、静脈内輸注による不足している凝固因子の補充である。補充因子は一般に、Ｘｙｎｔｈａ（第ＶＩＩＩ因子）またはＢｅｎｅＦＩＸ（ＦＩＸ）などの組換えタンパク質であるが、様々な純度の血漿由来産物が依然として使用されている。補充因子を用いた処置は、出血を、それが起こった際にオンデマンドで処置する一時的なもの、または保護範囲内で因子レベルを維持することによって出血を防止する予防的なものであり得る。予防的処置が、出血、および血友病患者における主要な病的状態である関連した関節損傷を防止するという重要な証拠が存在する。有効な予防的処置は、毎週３〜４回の因子の静脈注射を必要とし、それは、コンプライアンスの困難および生活の質の低減をもたらす。処置のコストも、凝固因子の製造の複雑性に起因して高価である。さらに、重度血友病Ａの患者の最大で３２％というかなりの数の患者が、自分の遺伝子中に突然変異を有する患者によって異種タンパク質と見られる投与された因子に対して中和抗体を発生させる。これらの患者は、バイパス因子、第ＶＩＩａ因子（ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ）などの処置の代替手段を必要とする。
療法の代替手法は、インタクトな外因経路を強化することにより、補充因子の必要性を迂回することである。血友病の患者は、自身のインタクトな外因経路を通じて出血を停止する何らかの能力を有するが、これは、大量出血を遮断し、または自発性出血を防止するのに十分ではない。外因経路は、組織因子経路インヒビター（ＴＦＰＩ）により急速に遮断されるので、保護をもたらすのに不十分である。
ＷＯ２０１０／０１７１９６（Ｂａｙｅｒ）、ＷＯ２０１１／１０９４５２（Ｂａｙｅｒ）、ＷＯ２０１４／１４４５７７（Ｂａｙｅｒ）、ＷＯ２０１０／０７２６８７（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ）、ＷＯ２０１２／００１０８７（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ）、ＷＯ２０１４／１４０２４０（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ）、およびＷＯ２０１５／００７８８０（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ）には、ヒトＴＦＰＩに結合する抗体が開示されているが、これらは、これらを血友病の新規潜在的治療剤にする特性を有する本発明の抗体をもたらさない。
凝固因子を投薬する頻度を低減し、因子を使用する量を低減し、送達の代替経路（例えば、皮下）を可能にし、かつ中和抗体を産生するより低いリスクを有しながら予防的保護をもたらす生成物は、血友病の患者に対する重要な未充足ニーズを満たす。
組織因子経路インヒビター（ＴＦＰＩ）に結合する抗体（およびこれらの抗原結合断片）が本明細書に開示および例示されている。
当業者は、慣例的な実験を使用するだけで、本明細書に記載の本発明の具体的な実施形態の多くの均等物を認識したり、または確認可能になったりすると予想される。このような均等物は、以下の実施形態（Ｅ）によって包含されるように意図されている。
Ｅ１． 組織因子経路インヒビター（ＴＦＰＩ）のＫｕｎｉｔｚドメイン２（Ｋ２）中のエピトープに特異的に結合する単離抗体またはその抗原結合断片であって、エピトープは、配列番号２の番号付けによる残基Ｉｌｅ１０５、Ａｒｇ１０７、およびＬｅｕ１３１を含む、単離抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ２． ＴＦＰＩのＫｕｎｉｔｚドメイン１（Ｋ１）に結合しない、実施形態１に記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ３． エピトープが、配列番号２の番号付けによるＣｙｓ１０６、Ｇｌｙ１０８、Ｃｙｓ１３０、Ｌｅｕ１３１、およびＧｌｙ１３２からなる群から選択される１個または複数の残基をさらに含む、実施形態１または２に記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ４． エピトープが、配列番号２の番号付けによる残基Ｃｙｓ１０６、Ｇｌｙ１０８、Ｃｙｓ１３０、Ｌｅｕ１３１、およびＧｌｙ１３２をさらに含む、実施形態１から３のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ５． エピトープが、配列番号２の番号付けによるＡｓｐ１０２、Ａｒｇ１１２、Ｔｙｒ１２７、Ｇｌｙ１２９、Ｍｅｔ１３４、およびＧｌｕ１３８からなる群から選択される１個または複数の残基をさらに含む、実施形態１から４のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ６． エピトープが、配列番号２の番号付けによるＡｓｐ１０２、Ａｒｇ１１２、Ｔｙｒ１２７、Ｇｌｙ１２９、Ｍｅｔ１３４、およびＧｌｕ１３８をさらに含む、実施形態１から５のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ７． エピトープが、配列番号２の番号付けによるＥ１００、Ｅ１０１、Ｐ１０３、Ｙ１０９、Ｔ１１１、Ｙ１１３、Ｆ１１４、Ｎ１１６、Ｑ１１８、Ｑ１２１、Ｃ１２２、Ｅ１２３、Ｒ１２４、Ｆ１２５、Ｋ１２６、およびＬ１４０からなる群から選択される１個または複数の残基を含まない、実施形態１から６のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ８． エピトープが、配列番号２の番号付けによるＥ１００、Ｅ１０１、Ｐ１０３、Ｙ１０９、Ｔ１１１、Ｙ１１３、Ｆ１１４、Ｎ１１６、Ｑ１１８、Ｑ１２１、Ｃ１２２、Ｅ１２３、Ｒ１２４、Ｆ１２５、Ｋ１２６、およびＬ１４０を含まない、実施形態１から７のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ９． エピトープが、配列番号２の番号付けによるＤ３１、Ｄ３２、Ｐ３４、Ｃ３５、Ｋ３６、Ｅ１００、Ｅ１０１、Ｐ１０３、Ｙ１０９、Ｋ１２６、およびＧ１２８からなる群から選択される１個または複数の残基を含まない、実施形態１から６のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ１０． エピトープが、配列番号２の番号付けによるＤ３１、Ｄ３２、Ｐ３４、Ｃ３５、Ｋ３６、Ｅ１００、Ｅ１０１、Ｐ１０３、Ｙ１０９、Ｋ１２６、およびＧ１２８を含まない、実施形態１から６および９のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ１１． エピトープが、Ａｓｐ１０２、Ｇｌｙ１０４、Ｉｌｅ１０５、Ｃｙｓ１０６、Ａｒｇ１０７、Ｇｌｙ１０８、Ａｒｇ１１２、Ｔｙｒ１２７、Ｇｌｙ１２９、Ｃｙｓ１３０、Ｌｅｕ１３１、Ｇｌｙ１３２、Ａｓｎ１３３、Ｍｅｔ１３４、およびＧｌｕ１３８（配列番号２の番号付けによる）からなる群から選択される１個または複数の残基を含み、エピトープ残基が、抗体またはその抗原結合断片との相互作用に起因する埋没表面積（ＢＳＡ）の非ゼロ変化を有する、実施形態１から１０のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ１２． エピトープが、Ａｓｐ１０２、Ｇｌｙ１０４、Ｉｌｅ１０５、Ｃｙｓ１０６、Ａｒｇ１０７、Ｇｌｙ１０８、Ａｒｇ１１２、Ｔｙｒ１２７、Ｇｌｙ１２９、Ｃｙｓ１３０、Ｌｅｕ１３１、Ｇｌｙ１３２、Ａｓｎ１３３、Ｍｅｔ１３４、およびＧｌｕ１３８（配列番号２の番号付けによる）を含む、実施形態１１に記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ１３． エピトープが、Ａｓｐ１０２、Ａｒｇ１０７、Ａｒｇ１１２、Ｔｙｒ１２７、およびＬｅｕ１３１（配列番号２の番号付けによる）からなる群から選択される１個または複数の残基を含み、エピトープ残基が、抗体またはその抗原結合断片由来の残基との水素結合に関与する、実施形態１から１２のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ１４． エピトープが、Ａｓｐ１０２、Ａｒｇ１０７、Ａｒｇ１１２、Ｔｙｒ１２７、およびＬｅｕ１３１（配列番号２の番号付けによる）を含む、実施形態１３に記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ１５． エピトープが、Ａｓｐ１０２、Ｇｌｙ１０４、Ｉｌｅ１０５、Ｃｙｓ１０６、Ａｒｇ１０７、Ｇｌｙ１０８、Ａｒｇ１１２、Ｔｙｒ１２７、Ｇｌｙ１２９、Ｃｙｓ１３０、Ｌｅｕ１３１、Ｇｌｙ１３２、Ｍｅｔ１３４、およびＧｌｕ１３８（配列番号２の番号付けによる）からなる群から選択される１個または複数の接触残基を含む、実施形態１から１４のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ１６． エピトープが、Ａｓｐ１０２、Ｇｌｙ１０４、Ｉｌｅ１０５、Ｃｙｓ１０６、Ａｒｇ１０７、Ｇｌｙ１０８、Ａｒｇ１１２、Ｔｙｒ１２７、Ｇｌｙ１２９、Ｃｙｓ１３０、Ｌｅｕ１３１、Ｇｌｙ１３２、Ｍｅｔ１３４、およびＧｌｕ１３８（配列番号２の番号付けによる）を含む、実施形態１５に記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ１７． ＴＦＰＩとの相互作用に起因するＢＳＡの非ゼロ変化を有する、以下の重（Ｈ）鎖および軽（Ｌ）鎖パラトープ残基（Ｋａｂａｔによる番号付け）：Ｈ３３ Ａｌａ、Ｈ５８ Ｔｙｒ、Ｈ９５ Ｌｅｕ、Ｈ９６ Ｇｌｙ、Ｈ９７ Ａｌａ、Ｈ９８ Ｔｈｒ、Ｈ９９ Ｓｅｒ、Ｈ１００ Ｌｅｕ、Ｈ１００Ａ Ｓｅｒ、Ｌ２９ Ａｌａ、Ｌ３１ Ｔｙｒ、Ｌ９１ Ｔｙｒ、Ｌ９５Ａ Ｓｅｒ、およびＬ９５Ｂ Ｇｌｙを含む、実施形態１から１６のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ１８． （ａ）Ｈ４７はＴｒｐまたはＴｙｒであり、（ｂ）Ｈ５８はＴｙｒであり、（ｃ）Ｌ９１はＴｙｒまたはＡｒｇである、接触残基（Ｋａｂａｔによる番号付け）を含み、（ｄ）Ｌ９６はＧｌｙまたはＡｓｎであるものを含んでもよい、実施形態１から１７のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ１９． （ａ）Ｈ３３は、Ａｌａ、Ａｓｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、またはＶａｌであり、（ｂ）Ｈ４７は、ＴｒｐまたはＴｙｒであり、（ｃ）Ｈ５０は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ｇｌｙ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、またはＶａｌであり、（ｄ）Ｈ５１は、Ｉｌｅ、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、またはＶａｌであり、（ｅ）Ｈ５２は、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、またはＶａｌであり、（ｆ）Ｈ５６は、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、またはＶａｌであり、（ｇ）Ｈ５８は、Ｔｙｒであり、（ｈ）Ｈ９５は、Ｌｅｕ、Ｇｌｎ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、またはＴｙｒであり、（ｉ）Ｈ９６は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、またはＶａｌであり、（ｊ）Ｈ９７は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、またはＶａｌであり、（ｋ）Ｈ９８は、Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、またはＶａｌであり、（ｌ）Ｈ９９は、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｐｈｅ、またはＰｒｏであり、（ｍ）Ｈ１００は、Ｌｅｕ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、またはＶａｌであり、（ｎ）Ｈ１００Ａは、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、またはＴｒｐであり、（ｏ）Ｌ２９は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、またはＶａｌであり、（ｐ）Ｌ３１は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、またはＶａｌであり、（ｑ）Ｌ９１は、ＴｙｒまたはＡｒｇであり、（ｒ）Ｌ９５Ａは、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、またはＶａｌであり、（ｓ）Ｌ９５Ｂは、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、またはＶａｌであり、（ｔ）Ｌ９５Ｃは、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、またはＶａｌである接触残基（Ｋａｂａｔによる番号付け）を含み、（ｕ）Ｌ９３は、Ｔｙｒ、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、またはＶａｌであり、（ｖ）Ｌ９６は、ＧｌｙまたはＡｓｎである残基を含んでもよい、実施形態１から１８のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ２０． （ａ）Ｈ３３は、ＡｌａまたはＶａｌであり、（ｂ）Ｈ４７は、Ｔｒｐであり、（ｃ）Ｈ５０は、Ａｌａであり、（ｄ）Ｈ５１は、Ｉｌｅであり、（ｅ）Ｈ５２は、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、またはＴｙｒであり、（ｆ）Ｈ５６は、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、またはＬｙｓであり、（ｇ）Ｈ５８は、Ｔｙｒであり、（ｈ）Ｈ９５は、Ｌｅｕであり、（ｉ）Ｈ９６は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、またはＶａｌであり、（ｊ）Ｈ９７は、Ａｌａであり、（ｋ）Ｈ９８は、Ｔｈｒ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、またはＴｙｒであり、（ｌ）Ｈ９９は、Ｓｅｒであり、（ｍ）Ｈ１００は、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、またはＴｙｒであり、（ｎ）Ｈ１００Ａは、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、またはＴｒｐであり、（ｏ）Ｌ２９は、Ａｌａであり、（ｐ）Ｌ３１は、Ｔｙｒであり、（ｑ）Ｌ９１は、Ｔｙｒであり、（ｒ）Ｌ９５Ａは、Ｓｅｒ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、またはＴｙｒであり、（ｓ）Ｌ９５Ｂは、Ｇｌｙであり、（ｔ）Ｌ９５Ｃは、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、またはＶａｌである残基（Ｋａｂａｔによる番号付け）を含み、（ｕ）Ｌ９３はＳｅｒであり、（ｖ）Ｌ９６は、Ｇｌｙである残基を含んでもよい、実施形態１から１８のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ２１． （ａ）Ｈ３３は、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｈｉｓ、またはＰｈｅであり、（ｂ）Ｈ４７は、ＴｒｐまたはＴｙｒであり、（ｃ）Ｈ５０は、Ａｌａ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、またはＰｈｅであり、（ｄ）Ｈ５１は、Ｉｌｅ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、またはＰｒｏであり、（ｅ）Ｈ５２は、Ｓｅｒ、Ｐｈｅ、Ａｒｇ、またはＴｙｒであり、（ｆ）Ｈ５６は、Ｓｅｒ、Ｌｙｓ、Ｔｙｒ、またはＰｈｅであり、（ｇ）Ｈ５８は、Ｔｙｒであり、（ｈ）Ｈ９５は、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｇｌｎ、またはＰｈｅであり、（ｉ）Ｈ９６は、Ｇｌｙ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、またはＬｙｓであり、（ｊ）Ｈ９７は、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｔｙｒ、またはＩｌｅであり、（ｋ）Ｈ９８は、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、またはＨｉｓであり、（ｌ）Ｈ９９は、Ｓｅｒ、Ｐｒｏ、Ａｌａ、またはＰｈｅであり、（ｍ）Ｈ１００は、Ｌｅｕ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、またはＰｈｅであり、（ｎ）Ｈ１００Ａは、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、Ｌｅｕ、またはＴｒｐであり、（ｏ）Ｌ２９は、Ａｌａ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、またはＧｌｎであり、（ｐ）Ｌ３１は、Ｔｙｒ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、またはＴｒｐであり、（ｑ）Ｌ９１は、ＴｙｒまたはＡｒｇであり、（ｒ）Ｌ９５Ａは、Ｓｅｒ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、またはＨｉｓであり、（ｓ）Ｌ９５Ｂは、Ｇｌｙ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、またはＰｒｏであり、（ｔ）Ｌ９５Ｃは、Ｓｅｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、またはＰｈｅである接触残基（Ｋａｂａｔによる番号付け）を含み、（ｕ）Ｌ９３は、Ｓｅｒ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、またはＨｉｓであり、（ｖ）Ｌ９６は、ＧｌｙまたはＡｓｎである残基を含んでもよい、実施形態１から１８のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ２２． 以下の接触残基（Ｋａｂａｔによる番号付け）：Ｈ３３ Ａｌａ、Ｈ４７ Ｔｒｐ、Ｈ５０ Ａｌａ、Ｈ５１ Ｉｌｅ、Ｈ５２ Ｓｅｒ、Ｈ５６ Ｓｅｒ、Ｈ５８ Ｔｙｒ、Ｈ９５ Ｌｅｕ、Ｈ９６ Ｇｌｙ、Ｈ９７ Ａｌａ、Ｈ９８ Ｔｈｒ、Ｈ９９ Ｓｅｒ、Ｈ１００ Ｌｅｕ、Ｈ１００Ａ Ｓｅｒ、Ｌ２９ Ａｌａ、Ｌ３１ Ｔｙｒ、Ｌ９１ Ｔｙｒ、Ｌ９５Ａ Ｓｅｒ、Ｌ９５Ｂ Ｇｌｙ、およびＬ９５Ｃ Ｓｅｒを含み、以下の残基：Ｌ９３ ＳｅｒおよびＬ９６ Ｇｌｙを含んでもよい、実施形態１から１８のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ２３．
（ａ）配列番号３８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）相補性決定領域１（ＣＤＲ−Ｈ１）、
（ｂ）配列番号３９のアミノ酸配列を含むＶＨ相補性決定領域２（ＣＤＲ−Ｈ２）、および
（ｃ）配列番号４０のアミノ酸配列を含むＶＨ相補性決定領域３（ＣＤＲ−Ｈ３）
を含むＶＨを含む、実施形態１から２２のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ２４． 配列番号４１のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３配列を含む、実施形態１から２２のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ２５． ヒトＶＨ３フレームワーク配列を含む、実施形態１から２４のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ２６． ヒトＶＨ１フレームワーク配列を含む、実施形態１から２４のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ２７． ヒトＶＨ５フレームワーク配列を含む、実施形態１から２４のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ２８． ヒト生殖系列ＩＧＨＶ３−２３またはＩＧＨＶ１−６９のＶＨフレームワーク配列を含む、実施形態１から２４のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ２９． ヒト生殖系列ＩＧＨＶ３−７のＶＨフレームワーク配列を含む、実施形態１から２４のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ３０． ヒトＶＨ生殖系列コンセンサスフレームワーク配列を含む、実施形態１から２４のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ３１． 配列番号４１、６３、および６５からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含むＶＨを含む、実施形態１から３０のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ３２． 配列番号４１、６３、および６５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＶＨを含む、実施形態１から３１のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ３３． 配列番号４１のアミノ酸配列を含むＶＨを含む、実施形態１から３２のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ３４． 配列番号６３のアミノ酸配列を含むＶＨを含む、実施形態１から３２のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ３５． 配列番号６５のアミノ酸配列を含むＶＨを含む、実施形態１から３２のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ３６．
（ａ）配列番号３３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）相補性決定領域１（ＣＤＲ−Ｌ１）、
（ｂ）配列番号３４のアミノ酸配列を含むＶＬ相補性決定領域２（ＣＤＲ−Ｌ２）、および
（ｃ）配列番号３５のアミノ酸配列を含むＶＬ相補性決定領域３（ＣＤＲ−Ｌ３）
を含むＶＬを含む、実施形態１から３５のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ３７． 配列番号３６のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３配列を含む、実施形態１から３５のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ３８． ヒトＶκフレームワーク配列を含む、実施形態１から３７のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ３９． ヒトＶλフレームワーク配列を含む、実施形態１から３７のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ４０． ヒト生殖系列ＩＧＫＶ３−２０のＶＬフレームワーク配列を含む、実施形態１から３７のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ４１． ヒト生殖系列ＩＧＫＶ１−３９のＶＬフレームワーク配列を含む、実施形態１から３７のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ４２． ヒトＶＬ生殖系列コンセンサスフレームワーク配列を含む、実施形態１から３７のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ４３． 配列番号３６と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含むＶＬを含む、実施形態１から４２のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ４４． 配列番号３６のアミノ酸配列を含むＶＬを含む、実施形態１から４３のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ４５． 配列番号２０と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む重鎖定常領域（ＣＨ）を含む、実施形態１から４４のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ４６． 配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＨを含む、実施形態１から４５のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ４７． 配列番号２６と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域（ＣＬ）を含む、実施形態１から４６のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ４８． 配列番号２６のアミノ酸配列を含むＣＬを含む、実施形態１から４７のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ４９． Ｆｃドメインを含む、実施形態１から４８のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ５０． Ｆｃドメインが、ＩｇＡのＦｃドメインである、実施形態４９に記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ５１． ＩｇＡが、ＩｇＡ１またはＩｇＡ２である、実施形態５０に記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ５２． Ｆｃドメインが、ＩｇＤのＦｃドメインである、実施形態４９に記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ５３． Ｆｃドメインが、ＩｇＥのＦｃドメインである、実施形態４９に記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ５４． Ｆｃドメインが、ＩｇＭのＦｃドメインである、実施形態４９に記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ５５． Ｆｃドメインが、ＩｇＧのＦｃドメインである、実施形態４９に記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ５６． ＩｇＧが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４である、実施形態５５に記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ５７． 配列番号４２のアミノ酸配列を含む重鎖を含む、実施形態１から５６のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ５８． 配列番号６４のアミノ酸配列を含む重鎖を含む、実施形態１から５６のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ５９． 配列番号６６のアミノ酸配列を含む重鎖を含む、実施形態１から５６のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ６０． 配列番号３７のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、実施形態１から５９のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ６１． ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１２２３２９で寄託されたプラスミド中に存在するインサートによってコードされるＶＨ配列を含む、実施形態１から６０のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ６２． ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１２２３２８で寄託されたプラスミド中に存在するインサートによってコードされるＶＬ配列を含む、実施形態１から６１のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ６３． エピトープが、配列番号２の番号付けによるＧｌｕ１００、Ｇｌｕ１０１、Ａｓｐ１０２、Ｇｌｙ１０４、およびＴｙｒ１０９からなる群から選択される１個または複数の残基をさらに含む、実施形態１から４のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ６４． エピトープが、配列番号２の番号付けによるＧｌｕ１００、Ｇｌｕ１０１、Ａｓｐ１０２、Ｇｌｙ１０４、およびＴｙｒ１０９をさらに含む、実施形態１から４および６３のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ６５． エピトープが、Ｐ１０３、Ｔ１１１、Ｙ１１３、Ｆ１１４、Ｎ１１６、Ｑ１１８、Ｑ１２１、Ｃ１２２、Ｅ１２３、Ｒ１２４、Ｆ１２５、Ｋ１２６、およびＬ１４０（配列番号２による番号付け）からなる群から選択される１個または複数の残基を含まない、実施形態１から４および６３から６４のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ６６． エピトープが、Ｐ１０３、Ｔ１１１、Ｙ１１３、Ｆ１１４、Ｎ１１６、Ｑ１１８、Ｑ１２１、Ｃ１２２、Ｅ１２３、Ｒ１２４、Ｆ１２５、Ｋ１２６、およびＬ１４０（配列番号２による番号付け）を含まない、実施形態１から４および６３から６５のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ６７． エピトープが、Ｄ３１、Ｄ３２、Ｐ３４、Ｃ３５、Ｋ３６、Ｐ１０３、Ｋ１２６、Ｙ１２７、Ｇ１２８（配列番号２による番号付け）からなる群から選択される１個または複数の残基を含まない、実施形態１から４および６３から６４のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ６８． エピトープが、Ｄ３１、Ｄ３２、Ｐ３４、Ｃ３５、Ｋ３６、Ｐ１０３、Ｋ１２６、Ｙ１２７、Ｇ１２８（配列番号２による番号付け）を含まない、実施形態１から４、６３から６４、および６７のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ６９． 以下の残基（Ｋａｂａｔによる番号付け）：Ｈ３３ Ａｌａ、Ｈ３５ Ｇｌｎ、Ｈ５２ Ｓｅｒ、Ｈ５３ Ａｓｎ、Ｈ５５ Ａｒｇ、Ｈ５６ Ｓｅｒ、Ｈ９５ Ｐｈｅ、Ｈ９６ Ｌｅｕ、Ｈ９７ Ｈｉｓ、Ｈ９９ Ｓｅｒ、Ｈ１０１ Ａｓｐ、Ｌ３１ Ｍｅｔ、Ｌ３２ Ｔｙｒ、Ｌ３４ Ｈｉｓ、Ｌ３６ Ｔｙｒ、Ｌ５０ Ａｒｇ、Ｌ９１ Ｔｒｐ、およびＬ９６ Ｔｙｒを含む、実施形態１から４および６３から６８のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ７０．
（ａ）配列番号４８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、
（ｂ）配列番号４９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、および
（ｃ）配列番号５０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３
を含むＶＨを含む、実施形態１から４および６３から６９のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ７１． 配列番号５１のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３配列を含む、実施形態１から４および６３から６９のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ７２． ヒトＶＨ３、ＶＨ１、またはＶＨ５フレームワーク配列を含む、実施形態１から４および６３から７１のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ７３． ヒト生殖系列ＩＧＨＶ３−２３またはＩＧＨＶ１−６９のＶＨフレームワーク配列を含む、実施形態１から４および６３から７２のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ７４． ヒト生殖系列ＩＧＨＶ３−７のＶＨフレームワーク配列を含む、実施形態１から４および６３から７２のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ７５． ヒトＶＨ生殖系列コンセンサスフレームワーク配列を含む、実施形態１から４および６３から７１のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ７６． 配列番号６７、６９、５１、および７９からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含むＶＨを含む、実施形態１から４および６３から７５のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ７７． 配列番号６７、６９、５１、および７９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＶＨを含む、実施形態１から４および６３から７６のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ７８． 配列番号６７のアミノ酸配列を含むＶＨを含む、実施形態１から４および６３から７７のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ７９． 配列番号６９のアミノ酸配列を含むＶＨを含む、実施形態１から４および６３から７７のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ８０． 配列番号５１のアミノ酸配列を含むＶＨを含む、実施形態１から４および６３から７７のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ８１． 配列番号７９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）を含む、実施形態１から４および６３から７７のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ８２．
（ａ）配列番号４３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、
（ｂ）配列番号４４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、および
（ｃ）配列番号４５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３
を含むＶＬを含む、実施形態１から４および６３から８１のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ８３． 配列番号４６のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３配列を含む、実施形態１から４および６３から８１のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ８４． ヒトＶκまたはＶλフレームワーク配列を含む、実施形態１から４および６３から８３のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ８５． ヒト生殖系列ＩＧＫＶ３−２０またはＩＧＫＶ１−３９のＶＬフレームワーク配列を含む、実施形態１から４および６３から８４のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ８６． ヒトＶＬ生殖系列コンセンサスフレームワーク配列を含む、実施形態１から４および６３から８３のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ８７． 配列番号４６、７１、７３、７５、および７７からなる群から選択される配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含むＶＬを含む、実施形態１から４および６３から８６のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ８８． 配列番号４６、７１、７３、７５、および７７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む、実施形態１から４および６３から８７のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ８９． 配列番号４６のアミノ酸配列を含むＶＬを含む、実施形態１から４および６３から８８のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ９０． 配列番号７１のアミノ酸配列を含むＶＬを含む、実施形態１から４および６３から８８のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ９１． 配列番号７３のアミノ酸配列を含むＶＬを含む、実施形態１から４および６３から８８のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ９２． 配列番号７５のアミノ酸配列を含むＶＬを含む、実施形態１から４および６３から８８のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ９３． 配列番号７７のアミノ酸配列を含むＶＬを含む、実施形態１から４および６３から８８のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ９４． 配列番号２０と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含むＣＨを含む、実施形態１から４および６３から９３のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ９５． 配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＨを含む、実施形態１から４および６３から９４のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ９６． 配列番号２６と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含むＣＬを含む、実施形態１から４および６３から９５のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ９７． 配列番号２６のアミノ酸配列を含むＣＬを含む、実施形態１から４および６３から９６のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ９８． Ｆｃドメインを含む、実施形態１から４および６３から９７のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ９９． Ｆｃドメインが、ＩｇＡのＦｃドメインである、実施形態９８に記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ１００． ＩｇＡが、ＩｇＡ１またはＩｇＡ２である、実施形態９９に記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ１０１． Ｆｃドメインが、ＩｇＤ、ＩｇＥ、またはＩｇＭのＦｃドメインである、実施形態９８に記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ１０２． Ｆｃドメインが、ＩｇＧのＦｃドメインである、実施形態９８に記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ１０３． ＩｇＧが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４である、実施形態１０２に記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ１０４． 配列番号５２のアミノ酸配列を含む重鎖を含む、実施形態１から４および６３から１０３のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ１０５． 配列番号６８のアミノ酸配列を含む重鎖を含む、実施形態１から４および６３から１０３のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ１０６． 配列番号７０のアミノ酸配列を含む重鎖を含む、実施形態１から４および６３から１０３のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ１０７． 配列番号８０のアミノ酸配列を含む重鎖を含む、実施形態１から４および６３から１０３のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ１０８． 配列番号４７のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、実施形態１から４および６３から１０７のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ１０９． 配列番号７２のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、実施形態１から４および６３から１０７のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ１１０． 配列番号７４のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、実施形態１から４および６３から１０７のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ１１１． 配列番号７６のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、実施形態１から４および６３から１０７のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ１１２． 配列番号７８のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、実施形態１から４および６３から１０７のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ１１３． 組織因子経路インヒビター（ＴＦＰＩ）のＫｕｎｉｔｚドメイン２（Ｋ２）中のエピトープに特異的に結合する単離抗体またはその抗原結合断片であって、エピトープが、配列番号２の番号付けによる残基Ｇｌｕ１０１、Ｐｒｏ１０３、Ｔｙｒ１０９、Ｔｈｒ１１１、Ｓｅｒ１１９、Ｇｌｎ１２１、Ｇｌｕ１２３、Ａｒｇ１２４、Ｌｙｓ１２６、およびＬｅｕ１４０を含む、単離抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ１１４． ＴＦＰＩのＫｕｎｉｔｚドメイン１（Ｋ１）に結合しない、実施形態１１３に記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ１１５． エピトープが、Ｅ１００、Ｄ１０２、Ｒ１０７、Ｙ１１３、Ｆ１１４、Ｎ１１６、Ｑ１１８、およびＣ１２２（配列番号２による番号付け）からなる群から選択される１個または複数の残基を含まない、実施形態１１３または１１４に記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ１１６． エピトープが、Ｅ１００、Ｄ１０２、Ｒ１０７、Ｙ１１３、Ｆ１１４、Ｎ１１６、Ｑ１１８、およびＣ１２２（配列番号２による番号付け）を含まない、実施形態１１３から１１５のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ１１７． エピトープが、Ｄ３１、Ｄ３２、Ｐ３４、Ｃ３５、Ｋ３６、Ｅ１００、Ｉ１０５、Ｒ１０７、Ｇ１０８、Ｙ１２７、およびＧ１２８（配列番号２による番号付け）からなる群から選択される１個または複数の残基を含まない、実施形態１１３または１１４に記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ１１８． エピトープが、Ｄ３１、Ｄ３２、Ｐ３４、Ｃ３５、Ｋ３６、Ｅ１００、Ｉ１０５、Ｒ１０７、Ｇ１０８、Ｙ１２７、およびＧ１２８（配列番号２による番号付け）を含まない、実施形態１１３から１１４、および１１７のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ１１９． 以下の残基（Ｋａｂａｔ番号付けによる）：Ｈ５０ Ａｓｐ、Ｈ５７ Ｔｈｒ、Ｈ５８ Ｌｅｕ、Ｈ５９ Ｔｙｒ、Ｈ６１ Ｇｌｎ、Ｈ９８ Ａｓｐ、Ｈ９９ Ｔｙｒ、Ｈ１００ Ａｓｐ、Ｌ３０ Ｈｉｓ、Ｌ５０ Ｔｒｐ、Ｌ９２ Ｔｙｒ、Ｌ９３ Ｔｈｒ、Ｌ９４ Ｔｈｒ、およびＬ９６ Ｔｙｒを含む、実施形態１１３から１１８に記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ１２０．
（ａ）配列番号８７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、
（ｂ）配列番号８８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、および
（ｃ）配列番号８９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３
を含むＶＨを含む、実施形態１１３から１１９のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ１２１． 配列番号９０のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３配列を含む、実施形態１１３から１１９のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ１２２． ヒトＶＨ３、ＶＨ１、またはＶＨ５フレームワーク配列を含む、実施形態１１３から１２１のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ１２３． ヒト生殖系列ＩＧＨＶ３−２３、ＩＧＨＶ１−６９、またはＩＧＨＶ３−７のＶＨフレームワーク配列を含む、実施形態１１３から１２２のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ１２４． ヒトＶＨ生殖系列コンセンサスフレームワーク配列を含む、実施形態１１３から１２１のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ１２５． 配列番号９０、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、および１０７からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含むＶＨを含む、実施形態１１３から１２４のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ１２６． 配列番号９０、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、および１０７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＶＨを含む、実施形態１１３から１２５のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ１２７． 配列番号９０のアミノ酸配列を含むＶＨを含む、実施形態１１３から１２６のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ１２８． 配列番号９５のアミノ酸配列を含むＶＨを含む、実施形態１１３から１２６のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ１２９． 配列番号９７のアミノ酸配列を含むＶＨを含む、実施形態１１３から１２６のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ１３０． 配列番号９９のアミノ酸配列を含むＶＨを含む、実施形態１１３から１２６のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ１３１． 配列番号１０１のアミノ酸配列を含むＶＨを含む、実施形態１１３から１２６のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ１３２． 配列番号１０３のアミノ酸配列を含むＶＨを含む、実施形態１１３から１２６のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ１３３． 配列番号１０５のアミノ酸配列を含むＶＨを含む、実施形態１１３から１２６のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ１３４． 配列番号１０７のアミノ酸配列を含むＶＨを含む、実施形態１１３から１２６のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ１３５．
（ａ）配列番号８１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、
（ｂ）配列番号８２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、および
（ｃ）配列番号８３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３
を含むＶＬを含む、実施形態１１３から１３４のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ１３６． 配列番号８４のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３配列を含む、実施形態１１３から１３４のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ１３７． ヒトＶκまたはＶλフレームワーク配列を含む、実施形態１１３から１３６のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ１３８． ヒト生殖系列ＩＧＫＶ３−２０またはＩＧＫＶ１−３９のＶＬフレームワーク配列を含む、実施形態１１３から１３７のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ１３９． ヒトＶＬ生殖系列コンセンサスフレームワーク配列を含む、実施形態１１３から１３６のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ１４０． 配列番号８４、１０９、および１１１からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含むＶＬを含む、実施形態１１３から１３９のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ１４１． 配列番号８４、１０９、および１１１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む、実施形態１１３から１４０のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ１４２． 配列番号８４のアミノ酸配列を含むＶＬを含む、実施形態１１３から１４１のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ１４３． 配列番号１０９のアミノ酸配列を含むＶＬを含む、実施形態１１３から１４１のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ１４４． 配列番号１１１のアミノ酸配列を含むＶＬを含む、実施形態１１３から１４１のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ１４５． 配列番号２０と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含むＣＨを含む、実施形態１１３から１４４のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ１４６． 配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＨを含む、実施形態１１３から１４５のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ１４７． 配列番号９１と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含むＣＨを含む、実施形態１１３から１４４のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ１４８． 配列番号９１のアミノ酸配列を含むＣＨを含む、実施形態１１３から１４４および１４７のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ１４９． 配列番号１４と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含むＣＬを含む、実施形態１１３から１４８のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ１５０． 配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＬを含む、実施形態１１３から１４９のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ１５１． 配列番号８５と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含むＣＬを含む、実施形態１１３から１４８のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ１５２． 配列番号８５のアミノ酸配列を含むＣＬを含む、実施形態１１３から１４８および１５１のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ１５３． Ｆｃドメインを含む、実施形態１１３から１５２のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ１５４． Ｆｃドメインが、ＩｇＡ（例えば、ＩｇＡ１またはＩｇＡ２）のＦｃドメインである、実施形態１５３に記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ１５５． Ｆｃドメインが、ＩｇＤ、ＩｇＥ、またはＩｇＭのＦｃドメインである、実施形態１５３に記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ１５６． Ｆｃドメインが、ＩｇＧのＦｃドメインである、実施形態１５３に記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ１５７． ＩｇＧが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４である、実施形態１５６に記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ１５８． 配列番号９２のアミノ酸配列を含む重鎖を含む、実施形態１１３から１５７のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ１５９． 配列番号９４のアミノ酸配列を含む重鎖を含む、実施形態１１３から１５７のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ１６０． 配列番号９６のアミノ酸配列を含む重鎖を含む、実施形態１１３から１５７のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ１６１． 配列番号９８のアミノ酸配列を含む重鎖を含む、実施形態１１３から１５７のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ１６２． 配列番号１００のアミノ酸配列を含む重鎖を含む、実施形態１１３から１５７のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ１６３． 配列番号１０２のアミノ酸配列を含む重鎖を含む、実施形態１１３から１５７のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ１６４． 配列番号１０４のアミノ酸配列を含む重鎖を含む、実施形態１１３から１５７のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ１６５． 配列番号１０６のアミノ酸配列を含む重鎖を含む、実施形態１１３から１５７のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ１６６． 配列番号１０８のアミノ酸配列を含む重鎖を含む、実施形態１１３から１５７のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ１６７． 配列番号８６のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、実施形態１１３から１６６のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ１６８． 配列番号９３のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、実施形態１１３から１６６のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ１６９． 配列番号１１０のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、実施形態１１３から１６６のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ１７０． 配列番号１１２のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、実施形態１１３から１６６のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ１７１．
（ａ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、
（ｂ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、および
（ｃ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３
を含むＶＨを含む、ＴＦＰＩのＫｕｎｉｔｚドメイン２（Ｋ２）に特異的に結合する単離抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ１７２． 配列番号１９のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３配列を含む、ＴＦＰＩのＫ２ドメインに特異的に結合する単離抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ１７３．
（ａ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、
（ｂ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、および
（ｃ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３
を含むＶＬを含む、ＴＦＰＩのＫ２ドメインに特異的に結合する単離抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ１７４． 配列番号１３のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３配列を含む、ＴＦＰＩのＫ２ドメインに特異的に結合する単離抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ１７５．
（ｉ）
（ａ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、
（ｂ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、および
（ｃ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３
を含むＶＨ、ならびに
（ｉｉ）
（ａ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、
（ｂ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、および
（ｃ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３
を含むＶＬ
を含む、ＴＦＰＩのＫ２ドメインに特異的に結合する単離抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ１７６． 配列番号１９のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３配列、ならびに配列番号１３のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３配列を含む、ＴＦＰＩのＫ２ドメインに特異的に結合する単離抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ１７７． ヒトＶＨ３、ＶＨ１、またはＶＨ５フレームワーク配列を含む、実施形態１７１から１７６のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ１７８． ヒト生殖系列ＩＧＨＶ３−２３、ＩＧＨＶ１−６９、またはＩＧＨＶ３−７のＶＨフレームワーク配列を含む、実施形態１７１から１７７のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ１７９． ヒトＶＨ生殖系列コンセンサスフレームワーク配列を含む、実施形態１７１から１７６のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ１８０．配列番号１９と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含むＶＨを含む、実施形態１７１から１７９のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ１８１． 配列番号１９のアミノ酸配列を含むＶＨを含む、実施形態１７１から１８０のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ１８２． ヒトＶκまたはＶλフレームワーク配列を含む、実施形態１７１から１８１のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ１８３． ヒト生殖系列ＩＧＫＶ３−２０またはＩＧＫＶ１−３９のＶＬフレームワーク配列を含む、実施形態１７１から１８２のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ１８４． ヒトＶＬ生殖系列コンセンサスフレームワーク配列を含む、実施形態１７１から１８１のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ１８５． 配列番号１３と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含むＶＬを含む、実施形態１７１から１８４のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ１８６． 配列番号１３のアミノ酸配列を含むＶＬを含む、実施形態１７１から１８５のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ１８７． 配列番号２０と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含むＣＨを含む、実施形態１７１から１８６のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ１８８． 配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＨを含む、実施形態１７１から１８７のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ１８９． 配列番号１４と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含むＣＬを含む、実施形態１７１から１８８のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ１９０． 配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＬを含む、実施形態１７１から１８９のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ１９１． Ｆｃドメインを含む、実施形態１７１から１９０のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ１９２． Ｆｃドメインが、ＩｇＡ（例えば、ＩｇＡ１もしくはＩｇＡ２）、ＩｇＤ、ＩｇＥ、またはＩｇＭのＦｃドメインである、実施形態１９１に記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ１９３． Ｆｃドメインが、ＩｇＧのＦｃドメインである、実施形態１９１に記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ１９４． ＩｇＧが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４である、実施形態１９３に記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ１９５． 配列番号２１のアミノ酸配列を含む重鎖を含む、実施形態１７１から１９４のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ１９６． 配列番号１５のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、実施形態１７１から１９５のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ１９７．
（ａ）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、
（ｂ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、および
（ｃ）配列番号３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３
を含むＶＨを含む、ＴＦＰＩのＫ２ドメインに特異的に結合する単離抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ１９８． 配列番号３１のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３配列を含む、ＴＦＰＩのＫ２ドメインに特異的に結合する単離抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ１９９．
（ａ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、
（ｂ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、および
（ｃ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３
を含むＶＬを含む、ＴＦＰＩのＫ２ドメインに特異的に結合する単離抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ２００． 配列番号２５のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３配列を含む、ＴＦＰＩのＫ２ドメインに特異的に結合する単離抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ２０１．
（ｉ）
（ａ）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、
（ｂ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、および
（ｃ）配列番号３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３
を含むＶＨ、ならびに
（ｉｉ）
（ａ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、
（ｂ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、および
（ｃ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３
を含むＶＬ
を含む、ＴＦＰＩのＫ２ドメインに特異的に結合する単離抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ２０２． 配列番号３１のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３配列、ならびに配列番号２５のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３配列を含む、ＴＦＰＩのＫ２ドメインに特異的に結合する単離抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ２０３． ヒトＶＨ３、ＶＨ１、またはＶＨ５フレームワーク配列を含む、実施形態１９７から２０２のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ２０４． ヒト生殖系列ＩＧＨＶ３−２３、ＩＧＨＶ１−６９、またはＩＧＨＶ３−７のＶＨフレームワーク配列を含む、実施形態１９７から２０３のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ２０５． ヒトＶＨ生殖系列コンセンサスフレームワーク配列を含む、実施形態１９７から２０２のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ２０６． 配列番号３１と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含むＶＨを含む、実施形態１９７から２０５のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ２０７． 配列番号３１のアミノ酸配列を含むＶＨを含む、実施形態１９７から２０６のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ２０８． ヒトＶκまたはＶλフレームワーク配列を含む、実施形態１９７から２０７のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ２０９． ヒト生殖系列ＩＧＫＶ３−２０またはＩＧＫＶ１−３９のＶＬフレームワーク配列を含む、実施形態１９７から２０８のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ２１０． ヒトＶＬ生殖系列コンセンサスフレームワーク配列を含む、実施形態１９７から２０７のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ２１１． 配列番号２５と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含むＶＬを含む、実施形態１９７から２１０のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ２１２． 配列番号２５のアミノ酸配列を含むＶＬを含む、実施形態１９７から２１１のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ２１３． 配列番号２０と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含むＣＨを含む、実施形態１９７から２１２のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ２１４． 配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＨを含む、実施形態１９７から２１３のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ２１５． 配列番号２６と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含むＣＬを含む、実施形態１９７から２１４のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ２１６． 配列番号２６のアミノ酸配列を含むＣＬを含む、実施形態１９７から２１５のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ２１７． Ｆｃドメインを含む、実施形態１９７から２１６のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ２１８． Ｆｃドメインが、ＩｇＡ（例えば、ＩｇＡ１もしくはＩｇＡ２）、ＩｇＤ、ＩｇＥ、またはＩｇＭのＦｃドメインである、実施形態２１７に記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ２１９． Ｆｃドメインが、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４）のＦｃドメインである、実施形態２１７に記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ２２０． 配列番号３２のアミノ酸配列を含む重鎖を含む、実施形態１９７から２１９のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ２２１． 配列番号２７のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、実施形態１９７から２２０のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ２２２．
（ａ）配列番号５８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、
（ｂ）配列番号５９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、および
（ｃ）配列番号６０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３
を含む重鎖可変領域（ＶＨ）を含む、ＴＦＰＩのＫ２ドメインに特異的に結合する単離抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ２２３． 配列番号６１のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３配列を含む、ＴＦＰＩのＫ２ドメインに特異的に結合する単離抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ２２４．
（ａ）配列番号５３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、
（ｂ）配列番号５４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、および
（ｃ）配列番号５５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３
を含むＶＬを含む、ＴＦＰＩのＫ２ドメインに特異的に結合する単離抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ２２５． 配列番号５６のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３配列を含む、ＴＦＰＩのＫ２ドメインに特異的に結合する単離抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ２２６．
（ｉ）
（ａ）配列番号５８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、
（ｂ）配列番号５９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、および
（ｃ）配列番号６０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３
を含むＶＨ、ならびに
（ｉｉ）
（ａ）配列番号５３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、
（ｂ）配列番号５４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、および
（ｃ）配列番号５５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３
を含むＶＬ
を含む、ＴＦＰＩのＫ２ドメインに特異的に結合する単離抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ２２７． 配列番号６１のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３配列、ならびに配列番号５６のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３配列を含む、ＴＦＰＩのＫ２ドメインに特異的に結合する単離抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ２２８． ヒトＶＨ３、ＶＨ１、またはＶＨ５フレームワーク配列を含む、実施形態２２２から２２７のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ２２９． ヒト生殖系列ＩＧＨＶ３−２３、ＩＧＨＶ１−６９、またはＩＧＨＶ３−７のＶＨフレームワーク配列を含む、実施形態２２２から２２８のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ２３０． ヒトＶＨ生殖系列コンセンサスフレームワーク配列を含む、実施形態２２２から２２７のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ２３１． 配列番号６１と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含むＶＨを含む、実施形態２２２から２３０のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ２３２． 配列番号６１のアミノ酸配列を含むＶＨを含む、実施形態２２２から２３１のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ２３３． ヒトＶκまたはＶλフレームワーク配列を含む、実施形態２２２から２３２のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ２３４． ヒト生殖系列ＩＧＫＶ３−２０またはＩＧＫＶ１−３９のＶＬフレームワーク配列を含む、実施形態２２２から２３３のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ２３５． ヒトＶＬ生殖系列コンセンサスフレームワーク配列を含む、実施形態２２２から２３２のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ２３６． 配列番号５６と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含むＶＬを含む、実施形態２２２から２３５のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ２３７． 配列番号５６のアミノ酸配列を含むＶＬを含む、実施形態２２２から２３６のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ２３８． 配列番号２０と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含むＣＨを含む、実施形態２２２から２３７のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ２３９． 配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＨを含む、実施形態２２２から２３８のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ２４０． 配列番号２６と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含むＣＬを含む、実施形態２２２から２３９のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ２４１． 配列番号２６のアミノ酸配列を含むＣＬを含む、実施形態２２２から２４０のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ２４２． Ｆｃドメインを含む、実施形態２２２から２４１のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ２４３． Ｆｃドメインが、ＩｇＡ（例えば、ＩｇＡ１もしくはＩｇＡ２）、ＩｇＤ、ＩｇＥ、またはＩｇＭのＦｃドメインである、実施形態２４２に記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ２４４． Ｆｃドメインが、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４）のＦｃドメインである、実施形態２４２に記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ２４５． 配列番号６２のアミノ酸配列を含む重鎖を含む、実施形態２２２から２４４のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ２４６． 配列番号５７のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、実施形態２２２から２４５のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ２４７．
（ａ）配列番号１１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、
（ｂ）配列番号１１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、および
（ｃ）配列番号１２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３
を含むＶＨを含む、ＴＦＰＩのＫ２ドメインに特異的に結合する単離抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ２４８． 配列番号１２１のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３配列を含む、ＴＦＰＩのＫ２ドメインに特異的に結合する単離抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ２４９．
（ａ）配列番号１１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、
（ｂ）配列番号１１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、および
（ｃ）配列番号１１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３
を含むＶＬを含む、ＴＦＰＩのＫ２ドメインに特異的に結合する単離抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ２５０． 配列番号１１６のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３配列を含む、ＴＦＰＩのＫ２ドメインに特異的に結合する単離抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ２５１．
（ｉ）
（ａ）配列番号１１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、
（ｂ）配列番号１１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、および
（ｃ）配列番号１２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３
を含むＶＨ、ならびに
（ｉｉ）
（ａ）配列番号１１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、
（ｂ）配列番号１１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、および
（ｃ）配列番号１１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３
を含むＶＬを含む、ＴＦＰＩのＫ２ドメインに特異的に結合する単離抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ２５２． 配列番号１２１のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３配列、ならびに配列番号１１６のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３配列を含む、ＴＦＰＩのＫ２ドメインに特異的に結合する単離抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ２５３． ヒトＶＨ３、ＶＨ１、またはＶＨ５フレームワーク配列を含む、実施形態２４７から２５２のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ２５４． ヒト生殖系列ＩＧＨＶ３−２３、ＩＧＨＶ１−６９、またはＩＧＨＶ３−７のＶＨフレームワーク配列を含む、実施形態２４７から２５３のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ２５５． ヒトＶＨ生殖系列コンセンサスフレームワーク配列を含む、実施形態２４７から２５２のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ２５６． 配列番号１２１と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含むＶＨを含む、実施形態２４７から２５５のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ２５７． 配列番号１２１のアミノ酸配列を含むＶＨを含む、実施形態２４７から２５６のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ２５８． ヒトＶκまたはＶλフレームワーク配列を含む、実施形態２４７から２５７のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ２５９． ヒト生殖系列ＩＧＫＶ３−２０またはＩＧＫＶ１−３９のＶＬフレームワーク配列を含む、実施形態２４７から２５８のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ２６０． ヒトＶＬ生殖系列コンセンサスフレームワーク配列を含む、実施形態２４７から２５７のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ２６１． 配列番号１１６と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含むＶＬを含む、実施形態２４７から２６０のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ２６２． 配列番号１１６のアミノ酸配列を含むＶＬを含む、実施形態２４７から２６１のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ２６３． 配列番号９１と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含むＣＨを含む、実施形態２４７から２６２のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ２６４． 配列番号９１のアミノ酸配列を含むＣＨを含む、実施形態２４７から２６３のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ２６５． 配列番号８５と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含むＣＬを含む、実施形態２４７から２６４のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ２６６． 配列番号８５のアミノ酸配列を含むＣＬを含む、実施形態２４７から２６５のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ２６７． Ｆｃドメインを含む、実施形態２４７から２６６のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ２６８． Ｆｃドメインが、ＩｇＡ（例えば、ＩｇＡ１もしくはＩｇＡ２）、ＩｇＤ、ＩｇＥ、またはＩｇＭのＦｃドメインである、実施形態２６７に記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ２６９． Ｆｃドメインが、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４）のＦｃドメインである、実施形態２６７に記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ２７０． 配列番号１２２のアミノ酸配列を含む重鎖を含む、実施形態２４７から２６９のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ２７１． 配列番号１１７のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、実施形態２４７から２７０のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ２７２．
（ａ）配列番号１２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、
（ｂ）配列番号１２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、および
（ｃ）配列番号１３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３
を含むＶＨを含む、ＴＦＰＩのＫ２ドメインに特異的に結合する単離抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ２７３． 配列番号１３１のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３配列を含む、ＴＦＰＩのＫ２ドメインに特異的に結合する単離抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ２７４．
（ａ）配列番号１２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、
（ｂ）配列番号１２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、および
（ｃ）配列番号１２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３
を含むＶＬを含む、ＴＦＰＩのＫ２ドメインに特異的に結合する単離抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ２７５． 配列番号１２６のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３配列を含む、ＴＦＰＩのＫ２ドメインに特異的に結合する単離抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ２７６．
（ｉ）
（ａ）配列番号１２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、
（ｂ）配列番号１２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、および
（ｃ）配列番号１３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３
を含むＶＨ、ならびに
（ｉｉ）
（ａ）配列番号１２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、
（ｂ）配列番号１２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、および
（ｃ）配列番号１２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３
を含むＶＬ
を含む、ＴＦＰＩのＫ２ドメインに特異的に結合する単離抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ２７７． 配列番号１３１のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３配列、ならびに配列番号１２６のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３配列を含む、ＴＦＰＩのＫ２ドメインに特異的に結合する単離抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ２７８． ヒトＶＨ３、ＶＨ１、またはＶＨ５フレームワーク配列を含む、実施形態２７２から２７７のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ２７９． ヒト生殖系列ＩＧＨＶ３−２３、ＩＧＨＶ１−６９、またはＩＧＨＶ３−７のＶＨフレームワーク配列を含む、実施形態２７２から２７８のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ２８０． ヒトＶＨ生殖系列コンセンサスフレームワーク配列を含む、実施形態２７２から２７７のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ２８１． 配列番号１３１と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含むＶＨを含む、実施形態２７２から２８０のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ２８２． 配列番号１３１のアミノ酸配列を含むＶＨを含む、実施形態２７２から２８１のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ２８３． ヒトＶκまたはＶλフレームワーク配列を含む、実施形態２７２から２８２のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ２８４． ヒト生殖系列ＩＧＫＶ３−２０またはＩＧＫＶ１−３９のＶＬフレームワーク配列を含む、実施形態２７２から２８３のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ２８５． ヒトＶＬ生殖系列コンセンサスフレームワーク配列を含む、実施形態２７２から２８２のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ２８６． 配列番号１２６と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含むＶＬを含む、実施形態２７２から２８５のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ２８７． 配列番号１２６のアミノ酸配列を含むＶＬを含む、実施形態２７２から２８６のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ２８８． 配列番号９１と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含むＣＨを含む、実施形態２７２から２８７のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ２８９． 配列番号９１のアミノ酸配列を含むＣＨを含む、実施形態２７２から２８８のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ２９０． 配列番号８５と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含むＣＬを含む、実施形態２７２から２８９のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ２９１． 配列番号８５のアミノ酸配列を含むＣＬを含む、実施形態２７２から２９０のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ２９２． Ｆｃドメインを含む、実施形態２７２から２９１のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ２９３． Ｆｃドメインが、ＩｇＡ（例えば、ＩｇＡ１もしくはＩｇＡ２）、ＩｇＤ、ＩｇＥ、またはＩｇＭのＦｃドメインである、実施形態２９２に記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ２９４． Ｆｃドメインが、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４）のＦｃドメインである、実施形態２９２に記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ２９５． 配列番号１３２のアミノ酸配列を含む重鎖を含む、実施形態２７２から２９４のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ２９６． 配列番号１２７のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、実施形態２７２から２９５のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ２９７． 実施形態１から２９６のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片とＴＦＰＩへの結合を競合する、ＴＦＰＩのＫ２ドメインに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ２９８． ＴＦＰＩ−３、ＴＦＰＩ−２１、ＴＦＰＩ−２３、ＴＦＰＩ−２４、ＴＦＰＩ−２６、ＴＦＰＩ−１０６、ＴＦＰＩ−１０７、ＴＦＰＩ−１０８、ＴＦＰＩ−１０９、ＴＦＰＩ−１１０、ＴＦＰＩ−１１１、ＴＦＰＩ−１１２、ＴＦＰＩ−１１３、ＴＦＰＩ−１１４、ＴＦＰＩ−１１５、ＴＦＰＩ−１１８、ＴＦＰＩ−１１９、ＴＦＰＩ−１２２、ＴＦＰＩ−１２３、ＴＦＰＩ−１２６、４Ｄ８．ｂ１、ｍｕ−ｈｕ ４Ｄ８キメラ、４Ｄ８−Ｖｋ１．０ｘＶＨ１．０、４Ｄ８−Ｖｋ１．０ｘＶＨ１．１、４Ｄ８−Ｖｋ１．０ｘＶＨ１．２、４Ｄ８−Ｖｋ１．０ｘＶＨ１．３、４Ｄ８−Ｖｋ１．０ｘＶＨ１．４、４Ｄ８−Ｖｋ１．０ｘＶＨ１．５、４Ｄ８−Ｖｋ１．０ｘＶＨ１．６、４Ｄ８−Ｖｋ１．１ｘＶＨ１．０、４Ｄ８−Ｖｋ１．１ｘＶＨ１．１、４Ｄ８−Ｖｋ１．１ｘＶＨ１．２、４Ｄ８−Ｖｋ１．１ｘＶＨ１．３、４Ｄ８−Ｖｋ１．１ｘＶＨ１．４、４Ｄ８−Ｖｋ１．１ｘＶＨ１．５、４Ｄ８−Ｖｋ１．１ｘＶＨ１．６、ｈｚ４Ｄ８、６Ｂ７．ｃ５、および７Ａ４．Ｄ９からなる群から選択される抗体とＴＦＰＩへの結合を競合する、ＴＦＰＩのＫ２ドメインに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ２９９． ＴＦＰＩ−２３、ＴＦＰＩ−２４、ＴＦＰＩ−１０６、およびＴＦＰＩ−１１８からなる群から選択される抗体とＴＦＰＩへの結合を競合する、ＴＦＰＩのＫ２ドメインに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ３００． ＴＦＰＩ−２３またはＴＦＰＩ−１０６とＴＦＰＩへの結合を競合する、実施形態２９９に記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ３０１． ＴＦＰＩ−２４またはＴＦＰＩ−１１８とＴＦＰＩへの結合を競合する、実施形態２９９に記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ３０２． 抗体４Ｄ８とＴＦＰＩへの結合を競合する、ＴＦＰＩのＫ２ドメインに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ３０３． 実施形態１から２９６のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片と同じＴＦＰＩエピトープに結合する、ＴＦＰＩのＫ２ドメインに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ３０４． ＴＦＰＩ−３、ＴＦＰＩ−２１、ＴＦＰＩ−２３、ＴＦＰＩ−２４、ＴＦＰＩ−２６、ＴＦＰＩ−１０６、ＴＦＰＩ−１０７、ＴＦＰＩ−１０８、ＴＦＰＩ−１０９、ＴＦＰＩ−１１０、ＴＦＰＩ−１１１、ＴＦＰＩ−１１２、ＴＦＰＩ−１１３、ＴＦＰＩ−１１４、ＴＦＰＩ−１１５、ＴＦＰＩ−１１８、ＴＦＰＩ−１１９、ＴＦＰＩ−１２２、ＴＦＰＩ−１２３、ＴＦＰＩ−１２６、４Ｄ８．ｂ１、ｍｕ−ｈｕ ４Ｄ８キメラ、４Ｄ８−Ｖｋ１．０ｘＶＨ１．０、４Ｄ８−Ｖｋ１．０ｘＶＨ１．１、４Ｄ８−Ｖｋ１．０ｘＶＨ１．２、４Ｄ８−Ｖｋ１．０ｘＶＨ１．３、４Ｄ８−Ｖｋ１．０ｘＶＨ１．４、４Ｄ８−Ｖｋ１．０ｘＶＨ１．５、４Ｄ８−Ｖｋ１．０ｘＶＨ１．６、４Ｄ８−Ｖｋ１．１ｘＶＨ１．０、４Ｄ８−Ｖｋ１．１ｘＶＨ１．１、４Ｄ８−Ｖｋ１．１ｘＶＨ１．２、４Ｄ８−Ｖｋ１．１ｘＶＨ１．３、４Ｄ８−Ｖｋ１．１ｘＶＨ１．４、４Ｄ８−Ｖｋ１．１ｘＶＨ１．５、４Ｄ８−Ｖｋ１．１ｘＶＨ１．６、ｈｚ４Ｄ８、６Ｂ７．ｃ５、および７Ａ４．Ｄ９からなる群から選択される抗体と同じＴＦＰＩエピトープに結合する、ＴＦＰＩのＫ２ドメインに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ３０５． ＴＦＰＩ−２３、ＴＦＰＩ−２４、ＴＦＰＩ−１０６、およびＴＦＰＩ−１１８からなる群から選択される抗体と同じＴＦＰＩエピトープに結合する、ＴＦＰＩのＫ２ドメインに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ３０６． ＴＦＰＩ−２３またはＴＦＰＩ−１０６と同じＴＦＰＩエピトープに結合する、実施形態３０５に記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ３０７． ＴＦＰＩ−２４またはＴＦＰＩ−１１８と同じＴＦＰＩエピトープに結合する、実施形態３０５に記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ３０８． 抗体４Ｄ８と同じＴＦＰＩエピトープに結合する、ＴＦＰＩのＫ２ドメインに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ３０９． ＴＦＰＩのＫ１ドメインに結合しない、実施形態２９７から３０８のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ３１０． Ｆｃ融合タンパク質、モノボディ、マキシボディ、二機能性抗体、ｓｃＦａｂ、ｓｃＦｖ、ペプチボディ、または上記のいずれかの抗原結合断片である、実施形態１から３０９のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ３１１． 約１×１０−７Ｍ〜約１×１０−１２Ｍの結合親和性（Ｋｄ）値でＴＦＰＩに結合する、実施形態１から３１０のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ３１２． 約５×１０−７Ｍ〜約５×１０−１１Ｍの結合親和性（Ｋｄ）値でＴＦＰＩに結合する、実施形態１から３１１のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ３１３． 約１×１０−８Ｍ〜約１×１０−１０Ｍの結合親和性（Ｋｄ）値でＴＦＰＩに結合する、実施形態１から３１２のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ３１４． 血漿ベースの希釈プロトロンビン時間（ｄＰＴ）アッセイで測定した場合に凝血時間を低下させ、（ｉｉ）トロンボエラストグラフィまたは回転トロンボエラストメトリによって測定した場合に全血中の凝血時間を低減し、（ｉｉｉ）トロンビン産生を増大させ、（ｉｖ）ＴＦＰＩの存在下でＦＸａ活性を増大させ、または（ｖ）これらの任意の組合せをする、実施形態１から３１３のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ３１５． 血漿ベースの希釈プロトロンビン時間アッセイで測定した場合に凝血時間を低下させる、実施形態３１４に記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ３１６． 血漿ベースの希釈プロトロンビン時間アッセイで測定した場合の凝血時間の低下が用量依存的である、実施形態３１５に記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ３１７． トロンボエラストグラフィまたは回転トロンボエラストメトリで測定した場合に全血中の凝血時間を低減する、実施形態３１４に記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ３１８． トロンボエラストグラフィまたは回転トロンボエラストメトリによって測定した場合の凝血時間の低減が用量依存的である、実施形態３１７に記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ３１９． トロンビン産生を増大させる、実施形態３１４に記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ３２０． トロンビン産生の増大が用量依存的である、実施形態３１９に記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ３２１． ＴＦＰＩの存在下でＦＸａ活性を増大させる、実施形態３１４に記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ３２２． ＴＦＰＩの存在下でのＦＸａ活性の増大が用量依存的である、実施形態３２１に記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ３２３． ＴＦＰＩの存在下で血小板蓄積を増強する、実施形態３２２に記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ３２４． ＴＦＰＩの存在下での血小板蓄積の増強が用量依存的である、実施形態３２３に記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ３２５． ＴＦＰＩの存在下でフィブリン産生を増大させる、実施形態３２４に記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ３２６． ＴＦＰＩの存在下でのフィブリン産生の増大が用量依存的である、実施形態３２５に記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ３２７． 全血中の凝血時間の低減が、重度血友病Ａを有するヒト患者から得られる全血を使用して判定される、実施形態３１４に記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ３２８． 全血中の凝血時間の低減が、重度血友病Ａおよびヒト第ＶＩＩＩ因子に対する阻害抗体を有するヒト患者から得られる全血を使用して判定される、実施形態３１４に記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ３２９． 全血中の凝血時間の低減が、中等度血友病Ａを有するヒト患者から得られる全血を使用して判定される、実施形態３１４に記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ３３０． 全血中の凝血時間の低減が、重度血友病Ｂを有するヒト患者から得られる全血を使用して判定される、実施形態３１４に記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ３３１． 全血中の凝血時間の低減が、重度血友病Ｂおよびヒト第ＩＸ因子に対する阻害抗体を有するヒト患者から得られる全血を使用して判定される、実施形態３１４に記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ３３２． 全血中の凝血時間の低減が、中等度血友病Ｂを有するヒト患者から得られる全血を使用して判定される、実施形態３１４に記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ３３３． ｄＰＴアッセイで測定した場合の凝血時間の低減が、重度血友病Ａを有するヒト患者から得られる血漿を使用して判定される、実施形態３１４に記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ３３４． ｄＰＴアッセイで測定した場合の凝血時間の低減が、重度血友病Ａおよびヒト第ＶＩＩＩ因子に対する阻害抗体を有するヒト患者から得られる血漿を使用して判定される、実施形態３１４に記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ３３５． ｄＰＴアッセイで測定した場合の凝血時間の低減が、中等度血友病Ａを有するヒト患者から得られる血漿を使用して判定される、実施形態３１４に記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ３３６． ｄＰＴアッセイで測定した場合の凝血時間の低減が、重度血友病Ｂを有するヒト患者から得られる血漿を使用して判定される、実施形態３１４に記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ３３７． ｄＰＴアッセイで測定した場合の凝血時間の低減が、重度血友病Ｂおよびヒト第ＩＸ因子に対する阻害抗体を有するヒト患者から得られる血漿を使用して判定される、実施形態３１４に記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ３３８． ｄＰＴアッセイで測定した場合の凝血時間の低減が、中等度血友病Ｂを有するヒト患者から得られる血漿を使用して判定される、実施形態３１４に記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ３３９． トロンビン産生の増大が、重度血友病Ａを有するヒト患者から得られる血漿を使用して判定される、実施形態３１４に記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ３４０． トロンビン産生の増大が、重度血友病Ａおよびヒト第ＶＩＩＩ因子に対する阻害抗体を有するヒト患者から得られる血漿を使用して判定される、実施形態３１４に記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ３４１． トロンビン産生の増大が、中等度血友病Ａを有するヒト患者から得られる血漿を使用して判定される、実施形態３１４に記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ３４２． トロンビン産生の増大が、重度血友病Ｂを有するヒト患者から得られる血漿を使用して判定される、実施形態３１４に記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ３４３． トロンビン産生の増大が、重度血友病Ｂおよびヒト第ＩＸ因子に対する阻害抗体を有するヒト患者から得られる血漿を使用して判定される、実施形態３１４に記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ３４４． トロンビン産生の増大が、中等度血友病Ｂを有するヒト患者から得られる血漿を使用して判定される、実施形態３１４に記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ３４５． １００ｎＭの抗体またはその抗原結合断片が、正常な凝血活性の５％を実現するのに十分である量の組換えヒト第ＶＩＩＩ因子と、重度血友病Ａを有するヒト患者から得られる全血の凝血時間を低減することにおいて少なくとも同様に有効である、実施形態３１４に記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ３４６． １００ｎＭの抗体またはその抗原結合断片が、正常な凝血活性の５％を実現するのに十分である量の組換えヒト第ＶＩＩＩ因子と、重度血友病Ａを有するヒト患者から得られる多血小板血漿のピークトロンビン産生を増大させることにおいて少なくとも同様に有効である、実施形態３１４に記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ３４７． ＴＦＰＩがヒトＴＦＰＩである、実施形態１から３４６のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ３４８． ＴＦＰＩが、配列番号２の残基９１〜１４７を含む、実施形態１から３４７のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ３４９． 実施形態１から３４８のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片をコードする１つまたは複数のヌクレオチド配列を含む、単離核酸分子または核酸分子。
Ｅ３５０． 核酸が、配列番号１７５の核酸配列、配列番号１７６の核酸配列、配列番号１７７の核酸配列、配列番号１７８の核酸配列、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１２２３２８下でｍＡｂ−ＴＦＰＩ−１０６ＶＬとして寄託されたベクターのインサートの核酸配列、およびＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１２２３２９下でｍＡｂ−ＴＦＰＩ−１０６ＶＨとして寄託されたベクターのインサートの核酸配列からなる群から選択される核酸配列を含む、ＴＦＰＩに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片をコードする単離核酸分子。
Ｅ３５１． 実施形態３４９および３５０に記載の核酸分子を含むベクター。
Ｅ３５２． 実施形態３４９もしくは３５０に記載の核酸分子または実施形態３５１に記載のベクターを含む宿主細胞。
Ｅ３５３． 哺乳動物細胞である、実施形態３５２に記載の宿主細胞。
Ｅ３５４． ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ−２９３細胞、またはＳｐ２．０細胞である、実施形態３５３に記載の宿主細胞。
Ｅ３５５． 抗体またはその抗原結合断片を作製する方法であって、抗体または抗原結合断片が宿主細胞によって発現される条件下で実施形態３５２から３５４のいずれか一つに記載の宿主細胞を培養することを含む、方法。
Ｅ３５６． 抗体またはその抗原結合断片を単離することをさらに含む、実施形態３５５に記載の方法。
Ｅ３５７． 実施形態３５５または３５６に記載の方法によって得られる、抗体またはその抗原結合断片。
Ｅ３５８． 実施形態１から３４７および３５７のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合断片、ならびに薬学的に許容できる担体または賦形剤を含む医薬組成物。
Ｅ３５９． 組織因子経路インヒビター（ＴＦＰＩ）の活性を低減する方法であって、それを必要とする対象に治療有効量の実施形態１から３４７および３５７のいずれか一つに記載の抗体もしくはその抗原結合断片または実施形態３５８に記載の医薬組成物を投与することを含む、方法。
Ｅ３６０． 出血時間を短縮する方法であって、それを必要とする対象に治療有効量の実施形態１から３４７および３５７のいずれか一つに記載の抗体もしくはその抗原結合断片または実施形態３５８に記載の医薬組成物を投与することを含む、方法。
Ｅ３６１． 対象がヒトである、実施形態３５８または３６０に記載の方法。
Ｅ３６２． 対象が、血液凝固の不全に罹患しているかまたは罹患しやすい、実施形態３５９から３６１のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ３６３． 対象が、血小板障害に罹患しているかまたは罹患しやすい、実施形態３５９から３６１のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ３６４． 対象が、血友病Ａ、Ｂ、またはＣに罹患しているかまたは罹患しやすい、実施形態３５９から３６１のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ３６５． 対象が、血友病ＡまたはＢに罹患しているかまたは罹患しやすい、実施形態３５９から３６１のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ３６６． 対象が、フォンウィルブランド病（ｖＷＤ）に罹患しているかまたは罹患しやすい、実施形態３５９から３６１のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ３６７． 治療有効量のＦＶＩＩを投与することをさらに含む、実施形態３６０に記載の方法。
Ｅ３６８． ＴＦＰＩの存在下でトロンビンの産生を増大させる、実施形態３６７に記載の方法。
Ｅ３６９． 抗体もしくはその抗原結合断片または医薬組成物を静脈内投与することを含む、実施形態３５９から３６８のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ３７０． 抗体もしくはその抗原結合断片または医薬組成物を皮下投与することを含む、実施形態３５９から３６８のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ３７１．抗体もしくはその抗原結合断片または医薬組成物が、３日に１回、４日に１回、５日に１回、６日に１回、１週間に１回、または１週間に２回投与される、実施形態３５９から３６８のいずれか一つに記載の方法。
Ｅ３７２． 医薬としての使用のための実施形態１から３４７および３５７のいずれか一つに記載の抗体もしくはその抗原結合断片または実施形態３５８に記載の医薬組成物。
Ｅ３７３． 対象におけるＴＦＰＩの活性の低減における使用のための実施形態１から３４７および３５７のいずれか一つに記載の抗体もしくはその抗原結合断片または実施形態３５８に記載の医薬組成物。
Ｅ３７４．対象において出血時間の短縮における使用のための実施形態１から３４７および３５７のいずれか一つに記載の抗体もしくはその抗原結合断片または実施形態３５８に記載の医薬組成物。
Ｅ３７５． 対象がヒトである、実施形態３７２から３７４のいずれか一つに記載の抗体もしくは抗原結合断片または医薬組成物。
Ｅ３７６． 対象が、血液凝固の不全に罹患しているかまたは罹患しやすい、実施形態３７２から３７５のいずれか一つに記載の抗体もしくは抗原結合断片または医薬組成物。
Ｅ３７７． 対象が、血友病Ａ、Ｂ、またはＣに罹患しているかまたは罹患しやすい、実施形態３７２から３７５のいずれか一つに記載の抗体もしくは抗原結合断片または医薬組成物。
Ｅ３７８． 対象が、血友病ＡまたはＢに罹患しているかまたは罹患しやすい、実施形態３７２から３７５のいずれか一つに記載の抗体もしくは抗原結合断片または医薬組成物。
Ｅ３７９． 対象が、フォンウィルブランド病（ｖＷＤ）に罹患しているかまたは罹患しやすい、実施形態３７２から３７５のいずれか一つに記載の抗体もしくは抗原結合断片または医薬組成物。
Ｅ３８０． 対象が、血小板障害に罹患しているかまたは罹患しやすい、実施形態３７２から３７５のいずれか一つに記載の抗体もしくは抗原結合断片または医薬組成物。
Ｅ３８１． 対象におけるＴＦＰＩの活性を低減するための、実施形態１から３４８および３５７のいずれか一つに記載の抗体もしくはその抗原結合断片または実施形態３５８に記載の医薬組成物の使用。
Ｅ３８２． 対象におけるＴＦＰＩの活性を低減するための医薬の製造における、実施形態１から３４８および３５７のいずれか一つに記載の抗体もしくはその抗原結合断片または実施形態３５８に記載の医薬組成物の使用。
Ｅ３８３． 対象において出血時間を短縮するための、実施形態１から３４８および３５７のいずれか一つに記載の抗体もしくはその抗原結合断片または実施形態３５８に記載の医薬組成物の使用。
Ｅ３８４． 対象において出血時間を短縮するための医薬の製造における、実施形態１から３４８および３５７のいずれか一つに記載の抗体もしくはその抗原結合断片または実施形態３５８に記載の医薬組成物の使用。
Ｅ３８５． 対象がヒトである、実施形態３８１から３８４のいずれか一つに記載の使用。
Ｅ３８６． 対象が、血液凝固の不全に罹患しているかまたは罹患しやすい、実施形態３８１から３８４のいずれか一つに記載の使用。
Ｅ３８７． 対象が、血友病Ａ、Ｂ、またはＣに罹患しているかまたは罹患しやすい、実施形態３８１から３８４のいずれか一つに記載の使用。
Ｅ３８８． 対象が、血友病ＡまたはＢに罹患しているかまたは罹患しやすい、実施形態３８１から３８４のいずれか一つに記載の使用。
Ｅ３８９． 対象が、フォンウィルブランド病（ｖＷＤ）に罹患しているかまたは罹患しやすい、実施形態３８１から３８４のいずれか一つに記載の使用。
Ｅ３９０． 対象が、血小板障害に罹患しているかまたは罹患しやすい、実施形態３８１から３８４のいずれか一つに記載の使用。
様々な抗ＴＦＰＩ抗体およびＴＦＰＩのＫ２ドメインの共結晶構造を示す図面である。「Ｒ＆Ｄ」または「Ｒ＆Ｄ Ｆａｂ」は、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ製抗体Ｍａｂ２９７４を指す。Ｎｏｖｏ２０２１抗体は、「ｈｚ４Ｆ３６」とも呼ばれる。「クローン２３」は、ＴＦＰＩ−２３を指し、「クローン２４」は、ＴＦＰＩ−２４を指す。 様々な抗ＴＦＰＩ抗体およびＴＦＰＩのＫ２ドメインの共結晶構造を示す図面である。「Ｒ＆Ｄ」または「Ｒ＆Ｄ Ｆａｂ」は、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ製抗体Ｍａｂ２９７４を指す。Ｎｏｖｏ２０２１抗体は、「ｈｚ４Ｆ３６」とも呼ばれる。「クローン２３」は、ＴＦＰＩ−２３を指し、「クローン２４」は、ＴＦＰＩ−２４を指す。 様々な抗ＴＦＰＩ抗体およびＴＦＰＩのＫ２ドメインの共結晶構造を示す図面である。「Ｒ＆Ｄ」または「Ｒ＆Ｄ Ｆａｂ」は、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ製抗体Ｍａｂ２９７４を指す。Ｎｏｖｏ２０２１抗体は、「ｈｚ４Ｆ３６」とも呼ばれる。「クローン２３」は、ＴＦＰＩ−２３を指し、「クローン２４」は、ＴＦＰＩ−２４を指す。 様々な抗ＴＦＰＩ抗体およびＴＦＰＩのＫ２ドメインの共結晶構造を示す図面である。「Ｒ＆Ｄ」または「Ｒ＆Ｄ Ｆａｂ」は、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ製抗体Ｍａｂ２９７４を指す。Ｎｏｖｏ２０２１抗体は、「ｈｚ４Ｆ３６」とも呼ばれる。「クローン２３」は、ＴＦＰＩ−２３を指し、「クローン２４」は、ＴＦＰＩ−２４を指す。 様々な抗ＴＦＰＩ抗体およびＴＦＰＩのＫ２ドメインの共結晶構造を示す図面である。「Ｒ＆Ｄ」または「Ｒ＆Ｄ Ｆａｂ」は、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ製抗体Ｍａｂ２９７４を指す。Ｎｏｖｏ２０２１抗体は、「ｈｚ４Ｆ３６」とも呼ばれる。「クローン２３」は、ＴＦＰＩ−２３を指し、「クローン２４」は、ＴＦＰＩ−２４を指す。 様々な抗ＴＦＰＩ抗体およびＴＦＰＩのＫ２ドメインの共結晶構造を示す図面である。特に、図１Ｆに示したように、本明細書に開示の例示的な抗体、ＴＦＰＩ−２３、ＴＦＰＩ−２４、および４Ｄ８はすべて、他の参照抗体と比較してＫ２ドメインの非重複エピトープに結合する。ＴＦＰＩ−１０６は、ＴＦＰＩ−２３と同じ部位に結合し、ＴＦＰＩ−１１８は、ＴＦＰＩ−２４と同じ部位に結合する。「Ｒ＆Ｄ」または「Ｒ＆Ｄ Ｆａｂ」は、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ製抗体Ｍａｂ２９７４を指す。Ｎｏｖｏ２０２１抗体は、「ｈｚ４Ｆ３６」とも呼ばれる。「クローン２３」は、ＴＦＰＩ−２３を指し、「クローン２４」は、ＴＦＰＩ−２４を指す。 ＴＦＰＩのＫ２ドメイン内のエピトープ残基と様々な抗ＴＦＰＩ抗体由来のパラトープ残基との相互作用を示す略図である。「Ｒ＆Ｄ」または「Ｒ＆Ｄ Ｆａｂ」は、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ製Ｍａｂ２９７４を指す。「クローン２３」は、ＴＦＰＩ−２３を指し、「クローン２４」は、ＴＦＰＩ−２４を指す。 ＴＦＰＩのＫ２ドメイン内のエピトープ残基と様々な抗ＴＦＰＩ抗体由来のパラトープ残基との相互作用を示す略図である。「Ｒ＆Ｄ」または「Ｒ＆Ｄ Ｆａｂ」は、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ製Ｍａｂ２９７４を指す。「クローン２３」は、ＴＦＰＩ−２３を指し、「クローン２４」は、ＴＦＰＩ−２４を指す。 ＴＦＰＩのＫ２ドメイン内のエピトープ残基と様々な抗ＴＦＰＩ抗体由来のパラトープ残基との相互作用を示す略図である。「Ｒ＆Ｄ」または「Ｒ＆Ｄ Ｆａｂ」は、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ製Ｍａｂ２９７４を指す。「クローン２３」は、ＴＦＰＩ−２３を指し、「クローン２４」は、ＴＦＰＩ−２４を指す。 ＴＦＰＩのＫ２ドメイン内のエピトープ残基と様々な抗ＴＦＰＩ抗体由来のパラトープ残基との相互作用を示す略図である。「Ｒ＆Ｄ」または「Ｒ＆Ｄ Ｆａｂ」は、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ製Ｍａｂ２９７４を指す。「クローン２３」は、ＴＦＰＩ−２３を指し、「クローン２４」は、ＴＦＰＩ−２４を指す。 ＴＦＰＩのＫ２ドメイン内のエピトープ残基と様々な抗ＴＦＰＩ抗体由来のパラトープ残基との相互作用を示す略図である。「Ｒ＆Ｄ」または「Ｒ＆Ｄ Ｆａｂ」は、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ製Ｍａｂ２９７４を指す。「クローン２３」は、ＴＦＰＩ−２３を指し、「クローン２４」は、ＴＦＰＩ−２４を指す。 マウス傷害モデルにおける様々な抗ＴＦＰＩ抗体のｉｎ ｖｉｖｏ効力を示す図である。図３Ａは、２Ａ８−２００（本研究において参照抗体として使用した）を投与したときの血友病Ａ第ＶＩＩＩ因子欠損（ＦＶＩＩＩ−／−）マウスにおける出血低下の継続時間を示す。抗体を、傷害前の示された時点（時間（ｈ））に６ｍｇ／ｋｇで静脈注射により血友病Ａマウス（ＦＶＩＩＩ−／−）に投与した。次いで失血の全体積（μＬ）を尾切断後に測定した。媒体（生理食塩水）処置血友病Ａマウスは、対照として機能を果たした。すべての測定は、平均±ＳＥＭとして提示されている。＊＝Ｐ＜０．０５。ＦＶＩＩＩ＋／＋（野生型）マウスは、生理食塩水を受けた。ｎ＝５／群。 マウス傷害モデルにおける様々な抗ＴＦＰＩ抗体のｉｎ ｖｉｖｏ効力を示す図である。図３Ｂは、２Ａ８抗体（本研究において参照抗体として使用した）を投与したときの血友病Ａ第ＶＩＩＩ因子欠損（ＦＶＩＩＩ−／−）マウスにおける出血低下の継続時間を示す。抗体を、傷害前の示された時点（時間（ｈ））に６ｍｇ／ｋｇで静脈注射により血友病Ａマウス（ＦＶＩＩＩ−／−）に投与した。次いで失血の全体積（μＬ）を尾切断後に測定した。媒体（生理食塩水）処置血友病Ａマウスは、対照として機能を果たした。すべての測定は、平均±ＳＥＭとして提示されている。＊＝Ｐ＜０．０５。ＦＶＩＩＩ＋／＋（野生型）マウスは、生理食塩水を受けた。ｎ＝５／群。 マウス傷害モデルにおける様々な抗ＴＦＰＩ抗体のｉｎ ｖｉｖｏ効力を示す図である。図３Ｃは、ＴＦＰＩ ４Ｄ８（対照）、ＴＦＰＩ−２１、ＴＦＰＩ−２３、およびＴＦＰＩ−２４抗体を投与したときの血友病Ａマウスにおける効果の継続時間を示す。抗体を、傷害前の示された時点（時間（ｈ））に６ｍｇ／ｋｇで静脈注射により血友病Ａマウス（ＦＶＩＩＩ−／−）に投与した。次いで失血の全体積（μＬ）を尾切断後に測定した。媒体（生理食塩水）処置血友病Ａマウスは、対照として機能を果たした。すべての測定は、平均±ＳＥＭとして提示されている。＊＝Ｐ＜０．０５。ＦＶＩＩＩ＋／＋（野生型）マウスは、生理食塩水を受けた。ｎ＝５／群。 マウス傷害モデルにおける様々な抗ＴＦＰＩ抗体のｉｎ ｖｉｖｏ効力を示す図である。図３Ｄは、ＴＦＰＩ−１０６抗体を投与したときの血友病Ａマウスにおける継続時間を示す。抗体を、傷害前の示された時点（時間（ｈ））に６ｍｇ／ｋｇで静脈注射により血友病Ａマウス（ＦＶＩＩＩ−／−）に投与した。次いで失血の全体積（μＬ）を尾切断後に測定した。媒体（生理食塩水）処置血友病Ａマウスは、対照として機能を果たした。すべての測定は、平均±ＳＥＭとして提示されている。＊＝Ｐ＜０．０５。ＦＶＩＩＩ＋／＋（野生型）マウスは、生理食塩水を受けた。ｎ＝５／群。 マウス傷害モデルにおける様々な抗ＴＦＰＩ抗体のｉｎ ｖｉｖｏ効力を示す図である。図３Ｅは、ＴＦＰＩ−１１８抗体を投与したときの血友病Ａマウスにおける継続時間を示す。抗体を、傷害前の示された時点（時間（ｈ））に６ｍｇ／ｋｇで静脈注射により血友病Ａマウス（ＦＶＩＩＩ−／−）に投与した。次いで失血の全体積（μＬ）を尾切断後に測定した。媒体（生理食塩水）処置血友病Ａマウスは、対照として機能を果たした。すべての測定は、平均±ＳＥＭとして提示されている。＊＝Ｐ＜０．０５。ＦＶＩＩＩ＋／＋（野生型）マウスは、生理食塩水を受けた。ｎ＝５／群。 ＴＦＰＩ−１０６抗体を投与したときの尾切断後の血友病Ｂマウスにおける出血の継続時間を示す図である。抗体を、傷害前の示された時点（時間（ｈ））に６ｍｇ／ｋｇで静脈注射により血友病Ｂマウスに投与した。次いで失血の全体積（μＬ）を尾切断後に測定した。媒体（生理食塩水）処置血友病Ａマウスは、対照として機能を果たした。すべての測定は、平均±ＳＥＭとして提示されている。＊＝Ｐ＜０．０５。ｎ＝４〜５／群。 図５は、それぞれが６つのパネル（図５Ａ、１〜６および図５Ｂ、１〜６）を含むパネルＡおよびＢを含み、ＴＦＰＩが野生型マウスにおける血管傷害部位においてｉｎ ｖｉｖｏにて血小板血栓内で、かつ内皮に沿って検出されることを示す生体内顕微鏡観察（ＩＶＭ）のマイクロ写真を示す図である。図５Ａは、血小板上のＧＰ１ｂβと結合するＤｙｌｉｇｈｔ６４９−標識ＣＤ４２ｃを使用して検出した場合の傷害部位における血小板血栓の増大を示す。血小板の存在または非存在は、パネル１（０秒）、パネル２（１５秒）、パネル３（３０秒）、パネル４（６０秒）、パネル５（９０秒）、およびパネル６（１２０秒）において検出された蛍光信号により実証される。Ａｌｅｘａ４８８−標識陰性対照ＩｇＧも投与したが、蛍光は検出されなかった。 図５は、それぞれが６つのパネル（図５Ａ、１〜６および図５Ｂ、１〜６）を含むパネルＡおよびＢを含み、ＴＦＰＩが野生型マウスにおける血管傷害部位においてｉｎ ｖｉｖｏにて血小板血栓内で、かつ内皮に沿って検出されることを示す生体内顕微鏡観察（ＩＶＭ）のマイクロ写真を示す図である。図５Ｂは、パネル１〜６を含み、ＴＦＰＩが、野生型マウスにおけるレーザー誘導血管傷害後に血小板血栓内に、かつ内皮に沿って存在することを実証するＩＶＭのマイクロ写真を示す。Ａｌｅｘａ４８８標識ＴＦＰＩ（灰色で示した緑色信号）は、０秒において検出されず（図５Ｂ、パネル１）、かすかな信号を１５秒において見ることができる（図５Ｂ、パネル２）。３０秒（図５Ｂ、パネル３）において、緑色蛍光信号は、増大し、かすかな赤色信号（Ｄｙｌｉｇｈｔ６４９−標識ＣＤ４２ｃ）を見ることができ、ＴＦＰＩが検出されるほぼ同じ部位における血小板蓄積の検出を示す。図５Ｂ、パネル４（６０秒）は、強い緑色および赤色蛍光信号を示す（ともに薄灰色であり、そこで赤色蛍光は、血管傷害部位の左に見ることができ、緑色信号は、傷害部位の右側に向かって主に検出される）、血小板蓄積およびＴＦＰＩがともに傷害部位で検出されることを実証する。図５Ｂ、パネル５は、６０秒までの傷害部位における赤色（血小板）および緑色（ＴＦＰＩ）蛍光信号の両方を示し、両信号は、３０秒より大きい。図５Ｂ、パネル６は、赤色信号（血小板）の低下および緑色信号（ＴＦＰＩ）の低下を示し、ともに１２０秒において傷害部位で依然として検出可能である。 ＩＶＭを使用して査定したレーザー誘導血管傷害後の血友病ＡマウスにおけるＴＦＰＩ−１０６の止血効果を示すグラフであり、血小板血栓の量は、曲線下面積（ＡＵＣ）として表現されている（＊＝Ｐ＜０．００５が示される）。図６Ａは、生理食塩水を投与した場合の０．５時間における血友病Ａマウスにおける血小板蓄積の欠如と比較した、マウスが生理食塩水対照のみを受けた場合の傷害後０．５時間における野生型マウス（ＷＴ）における傷害部位での血小板の蓄積を示す。血小板蓄積は、組換え第ＶＩＩＩ因子（ｒＦＶＩＩＩ）またはＴＦＰＩ−１０６を投与した場合に０．５時間にて血友病Ａマウスにおいて検出された。血栓蓄積効果は、ＴＦＰＩ−１０６を投与された血友病Ａマウスにおいて１６８時間で依然として検出された。 ＩＶＭを使用して査定したレーザー誘導血管傷害後の血友病ＡマウスにおけるＴＦＰＩ−１０６の止血効果を示すグラフであり、フィブリン産生量は、曲線下面積（ＡＵＣ）として表現されている（＊＝Ｐ＜０．００５が示される）。図６Ｂは、生理食塩水を投与した場合の０．５時間における血友病Ａマウスにおける検出可能なフィブリン産生の欠如と比較した、マウスが生理食塩水対照のみを受けた場合の傷害後０．５時間における野生型マウス（ＷＴ）における傷害部位でのフィブリン産生を示す。フィブリン産生は、組換え第ＶＩＩＩ因子（ｒＦＶＩＩＩ）またはＴＦＰＩ−１０６を投与した場合に０．５時間にて血友病Ａマウスにおいて検出された。フィブリン産生効果は、ＴＦＰＩ−１０６を投与された血友病Ａマウスにおいて１６時間で依然として検出された。 １ｐｍ組織因子および４μＭリン脂質の存在下で重度血友病Ａ血漿におけるＴＦＰＩ−１０６および組換え第ＶＩＩａ因子（ｒＦＶＩＩａ）の投与のトロンビン産生アッセイ（ＴＧＡ）に対する効果を示すグラフを表す図である。グラフは、単独で（１６μｇ／ｍｌ）、およびｒＦＶＩＩａ（２０μｇ／ｍｌ、２μｇ／ｍｌ、または０．２μｇ／ｍｌ）と組み合わせたＴＦＰＩ−１０６を含む血友病Ａ血漿のトロンボグラムを示す。ＴＦＰＩ−１０６もｒＦＶＩＩａも含まない血友病Ａ血漿および非血友病血漿のトロンボグラムも示されている。 ｒＦＶＩＩａを伴った、もしくは伴わないＴＦＰＩ−１０６の存在下、またはｒＦＶＩＩａのみの存在下の血友病Ａ血漿における１ｐＭ組織因子および４μＭリン脂質の存在下でのトロンビン産生に対する効果を示すトロンボグラムを表す図である。非血友病血漿が対照として含められている。 ｒＦＶＩＩａを伴った、もしくは伴わないＴＦＰＩ−１０６の存在下、またはｒＦＶＩＩａのみの存在下のクエン酸乏血小板血友病Ａ血漿における３ベセスダ単位（３ＢＵ）のインヒビターの存在下でのトロンビン産生に対する効果を示すトロンボグラムを表す図である。非血友病血漿が対象として含められている。ＴＦＰＩ−１０６（１６μｇ／ｍｌ）が添加された対照非血友病血漿も含められている。 ｒＦＶＩＩａを伴った、もしくは伴わないＴＦＰＩ−１０６の存在下、またはｒＦＶＩＩａのみの存在下のクエン酸乏血小板血友病Ｂ血漿における３ベセスダ単位（３ＢＵ）のインヒビターの存在下でのトロンビン産生に対する効果を示すトロンボグラムを表す。非血友病血漿が対象として含められている。ＴＦＰＩ−１０６（１６μｇ／ｍｌ）が添加された対照非血友病血漿も含められている。 尾切断直後に血友病Ａマウスに抗体ＴＦＰＩ−１０６（６ｍｇ／ｋｇ）を投与し、組換え第ＶＩＩＩ因子（２００ユニット／ｋｇ）を別個に投与することの対照と比較した失血に対する効果を示す図である。 尾切断の２分後に血友病Ａマウスに３つの異なる用量の抗体ＴＦＰＩ−１０６（１、３および６ｍｇ／ｋｇ）を投与し、組換え第ＶＩＩＩ因子（２００ユニット／ｋｇ）を別個に投与することの対照と比較した失血に対する効果を示す図である。 重度血友病Ａのヒト患者由来の全血の凝血時間に対する組換え第ＶＩＩＩ因子と比較した異なる濃度のＴＦＰＩ１０６の効果を示す図である。 重度血友病Ａのヒト患者由来の多血小板血漿中のピークトロンビン産生に対する組換え第ＶＩＩＩ因子と比較した異なる濃度のＴＦＰＩ１０６の効果を示す図である。 重度血友病ＡおよびＦＶＩＩＩのインヒビターを有するヒト患者由来の全血の凝血時間に対する異なる濃度のＴＦＰＩ１０６の効果を示す図である。 重度血友病ＡおよびＦＶＩＩＩのインヒビターを有するヒト患者由来の多血小板血漿におけるピークトロンビン産生に対する異なる濃度のＴＦＰＩ１０６の効果を示す図である。 重度血友病ＡおよびＦＶＩＩＩのインヒビターを有するヒト患者由来の乏血小板血漿の凝血時間に対する異なる濃度のＴＦＰＩ１０６の効果を示す図である。 中等度血友病Ａのヒト患者由来の全血の凝血時間に対する組換え第ＶＩＩＩ因子と比較した異なる濃度のＴＦＰＩ１０６の効果を示す図である。 中等度血友病Ａのヒト患者由来の多血小板血漿中のピークトロンビン産生に対する組換え第ＶＩＩＩ因子と比較した異なる濃度のＴＦＰＩ１０６の効果を示す図である。 中等度血友病Ａのヒト患者由来の乏血小板血漿の凝血時間に対する異なる濃度のＴＦＰＩ１０６の効果を示す図である。 中等度血友病Ｂのヒト患者由来の全血の凝血時間に対する組換え第ＩＸ因子と比較した異なる濃度のＴＦＰＩ１０６の効果を示す図である。 中等度血友病Ｂのヒト患者由来の多血小板血漿中のピークトロンビン産生に対する組換え第ＩＸ因子と比較した異なる濃度のＴＦＰＩ１０６の効果を示す図である。 中等度血友病Ｂのヒト患者由来の乏血小板血漿の凝血時間に対する異なる濃度のＴＦＰＩ１０６の効果を示す図である。 血友病Ａの複数のヒト患者由来の全血の凝血時間に対する組換え第ＶＩＩＩ因子と比較した異なる濃度のＴＦＰＩ１０６の効果を示す図である。 血友病Ａの複数のヒト患者由来の多血小板血漿中のピークトロンビン産生に対する組換え第ＶＩＩＩ因子と比較した異なる濃度のＴＦＰＩ１０６の効果を示す図である。 血友病Ｂの複数のヒト患者由来の乏血小板血漿の凝血時間に対する異なる濃度のＴＦＰＩ１０６の効果を示す図である。
１．概要
上述したように、血友病の患者は、自身のインタクトな外因経路を通じて出血を停止させる何らかの能力を有するが、外因経路は、組織因子経路インヒビター（ＴＦＰＩ）により急速に遮断されるので保護をもたらすのに十分でない。これらの患者におけるＴＦＰＩ阻害をブロック／中和すると、不十分なＦＸａ産生を補償し、出血素因を正常化することができる。したがって、ＴＦＰＩに特異的に結合し、その活性を阻害する抗体およびその抗原結合断片が本明細書に開示および例示されている。
２．定義
「ＴＦＰＩの活性を低減すること」とは、抗体またはその抗原結合断片が、（ｉ）例えば、血漿ベースの希釈プロトロンビン時間アッセイによって測定した場合に抗体の非存在下での凝血時間と比較したとき凝血時間を低下させ、（ｉｉ）例えば、トロンボエラストグラフィもしくは回転トロンボエラストメトリによって測定した場合に抗体の非存在下での凝血時間と比較して全血中の凝血時間を低減し、（ｉｉｉ）トロンビン産生を増大させ、（ｉｖ）ＴＦＰＩの存在下でＦＸａを増大させ、（ｖ）ＴＦＰＩの存在下で血小板蓄積を増強し、（ｖｉ）ＴＦＰＩの存在下でフィブリン産生を増大させ、または（ｖｉｉ）これらの任意の組合せをすることができることを意味する。抗体または抗原結合断片の阻害活性は、用量依存的（例えば、血漿ベースの希釈プロトロンビン時間アッセイで測定した場合に凝血時間の用量依存的低下を引き起こす）であり得るが、そうである必要はない。
さらに、本明細書に開示および例示されている通り、抗ＴＦＰＩ抗体およびＴＦＰＩのＫｕｎｉｔｚドメイン２（Ｋ２ドメイン）の共結晶構造が得られた。構造解析は、本発明の例示的な抗体が他の公的に開示されたＴＦＰＩ抗体（これらは、実施例において参照抗体として使用した）と比較してＴＦＰＩのユニークエピトープを認識することを示す。例えば、図１Ａ〜１Ｆおよび図２Ａ〜２Ｅに示した通り、いくつかの参照ＴＦＰＩ抗体（Ｒ＆Ｄ（Ｍａｂ２４７９）Ｆａｂ、Ｎｏｖｏ２０２１（ｈｚ４Ｆ３６とも呼ばれる）Ｆａｂ、２Ａ８ Ｆａｂ）と比較して、ＴＦＰＩ−２３、ＴＦＰＩ−２４、および４Ｄ８抗体は、ＴＦＰＩのＫ２ドメイン中の非重複部位に結合する。
したがって、ある特定の実施形態では、本明細書に開示の抗体（および抗原結合断片）は、ＴＦＰＩのＫ２ドメインに位置したＴＦＰＩのユニークエピトープを認識する。共結晶構造および計算アラニンスキャンに基づくと、このエピトープは、抗体−抗原相互作用に重要な３つの残基：Ｉｌｅ１０５、Ａｒｇ１０７、およびＬｅｕ１３１（配列番号２に示したヒトＴＦＰＩの番号付けによる）を含む。これらの３つの残基をアラニンに突然変異させると、抗体結合が喪失する。例えば、抗体ＴＦＰＩ−２３ならびにその変異体（例えば、ＴＦＰＩ−１０６およびＴＦＰＩ−１０７）はすべて、このエピトープを認識する。
ある特定の実施形態では、本明細書に開示の重要なエピトープ残基の認識により、抗体（およびそれらの抗原結合断片）がＴＦＰＩの活性を低減することが可能になる。特に、結晶構造は、ＴＦＰＩのＫ２ドメインがコーン型構造を採用し、コーンの先端部（特にＡｒｇ１０７）がＦＸａに結合していることを示す。ＴＦＰＩ−２３およびＴＦＰＩ−２４はともに、このコーン型領域の先端部を認識し、ＴＦＰＩがＦＸａに結合するのをブロックする。抗体４Ｄ８は、Ｋ２ドメイン中の異なるエピトープを認識する。コーンの先端部の残基と直接的に相互作用しないが、４Ｄ８は、それにもかかわらず、ＴＦＰＩがＦＸａに結合するのをブロックする。表１５は、他の公然知られたＴＦＰＩ抗体と比較して、本明細書に開示の例示的な抗体が認識する非重複エピトープ残基を要約するものである。
さらに、ある特定の実施形態では、本明細書に開示の抗体およびそれらの抗原結合断片は、凝固因子欠乏症（血友病など）の処置のため、および出血時間を低減するための望ましい薬理活性および薬物動態学的性質を実証した。
エピトープに「優先的に結合する」または「特異的に結合する」（本明細書で互換的に使用される）抗体は、当技術分野でよく理解されている用語であり、このような特異的または優先的結合を判定する方法も当技術分野で周知である。分子は、それが、特定の細胞または物質と、それが代替の細胞または物質とするより、頻繁に、急速に、長い継続時間および／または大きい親和性で反応または会合する場合、「特異的結合」または「優先的結合」を呈すると言われる。抗体は、標的に、それが他の物質に結合するより、大きい親和性、結合活性で、容易に、かつ／または長い継続時間で結合する場合、「特異的に結合する」または「優先的に結合する」。また、抗体は、試料中のその標的に、それが試料中に存在する他の物質に結合するより、大きい親和性、結合活性で、容易に、かつ／または長い継続時間で結合する場合、「特異的に結合する」または「優先的に結合する」。例えば、ＴＦＰＩエピトープに特異的または優先的に結合する抗体は、それが他のＴＦＰＩエピトープまたは非ＴＦＰＩエピトープに結合するより、大きい親和性、結合活性で、容易に、かつ／または長い継続時間でこのエピトープに結合する抗体である。例えば、第１の標的に特異的または優先的に結合する抗体（または部分もしくはエピトープ）は、第２の標的に特異的または優先的に結合してもよく、結合しなくてもよいことも、本定義を読むことにより理解される。したがって、「特異的結合」または「優先的結合」は、排他的結合を必ずしも要求しない（しかし、それは排他的結合を含み得る）。一般に、しかし必ずしもではなく、結合への言及は、優先的結合を意味する。「特異的結合」または「優先的結合」は、試料中の特異的な分子を認識し、それに結合するが、他の分子を実質的に認識せず、それに実質的に結合しない化合物、例えば、タンパク質、核酸、抗体などを含む。例えば、試料中の同族リガンドまたは結合パートナーを認識し、それに結合する（例えば、ＴＦＰＩと結合する抗ＴＦＰＩ抗体）が、試料中の他の分子を実質的に認識せず、それに実質的に結合させない抗体またはペプチド受容体は、その同族リガンドまたは結合パートナーに特異的に結合する。よって、明示されたアッセイ条件下で、指定された結合部分（例えば、抗体もしくはその抗原結合部分または受容体もしくはそのリガンド結合部分）は、特定の標的分子に優先的に結合し、試験試料中に存在する他の成分に有意な量で結合しない。
様々なアッセイ形式を使用して、目的の分子を特異的に結合させる抗体またはペプチドを選択することができる。例えば、固相ＥＬＩＳＡイムノアッセイ、免疫沈降、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）、ＫｉｎＥｘＡ、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）、Ｏｃｔｅｔ（商標）（ＦｏｒｔｅＢｉｏ，Ｉｎｃ．、Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ、ＣＡ）、およびウエスタンブロット分析は、抗原もしくは受容体と特異的に反応する抗体、または同族リガンドもしくは結合パートナーに特異的に結合するそのリガンド結合部分を同定するのに使用され得る多くのアッセイの中にある。典型的には、特異的または選択的な反応は、バックグラウンド信号またはノイズの少なくとも２倍、より典型的には、バックグラウンドの１０倍超、さらにより典型的には、バックグラウンドの５０倍超、より典型的には、バックグラウンドの１００倍超、なおより典型的には、バックグラウンドの５００倍超、さらにより典型的には、バックグラウンドの１０００倍超、さらにより典型的には、バックグラウンドの１０，０００倍超となる。また、平衡解離定数（ＫＤ）が７ｎＭ以下であるとき、抗体は、抗原を「特異的に結合させる」と言われる。
用語「結合親和性」は、２つの分子、例えば、抗体またはその断片と抗原との間の非共有結合性相互作用の強度の尺度として本明細書で使用される。用語「結合親和性」は、一価相互作用（内活性）を記述するのに使用される。
一価相互作用による２つの分子、例えば、抗体またはその断片と抗原との間の結合親和性は、解離定数（ＫＤ）を判定することにより定量化することができる。次に、ＫＤは、例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法（Ｂｉａｃｏｒｅ）を使用して複合体形成および解離の動態を測定することにより判定することができる。一価複合体の会合および解離に対応する速度定数は、それぞれ、会合速度定数ｋａ（またはｋｏｎ）および解離速度定数ｋｄ（またはｋｏｆｆ）と呼ばれる。ＫＤは、式ＫＤ＝ｋｄ／ｋａによりｋａおよびｋｄと関係付けられる。解離定数の値は、周知の方法により直接判定することができ、例えば、Ｃａｃｅｃｉら（１９８４、Ｂｙｔｅ、９：３４０〜３６２）に示されたものなどの方法により複合混合物についてさえ算出することができる。例えば、ＫＤは、Ｗｏｎｇ＆Ｌｏｈｍａｎ（１９９３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、ＵＳＡ、９０：５４２８〜５４３２）により開示されているものなどの二重フィルターニトロセルロースフィルター結合アッセイを使用して確立することができる。例えば、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット、ＲＩＡ、およびフローサイトメトリー分析、ならびに本明細書の他の場所で例示される他のアッセイを含めて、標的抗原に対する抗体などのリガンドの結合能力を評価する他の標準アッセイは、当技術分野で公知である。抗体の結合動態および結合親和性も、当技術分野で公知の標準アッセイ、例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）システムを使用することによる表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、またはＫｉｎＥｘＡなどで査定することができる。
競合的結合アッセイを行うことができ、このアッセイでは、抗体の抗原への結合が、その標的の別のリガンド、例えば、標的を別段に結合させる別の抗体または可溶性受容体などによる標的の結合と比較される。５０％阻害が起こる濃度は、Ｋｉとして公知である。理想的条件下で、Ｋｉは、ＫＤと等価である。Ｋｉ値は、決してＫＤ未満にならず、したがってＫｉの測定は、好都合なことには、ＫＤの上限を提供するのに代用され得る。
上記定義に従って、異なる分子間相互作用と関連した結合親和性、例えば、所与の抗原に対する異なる抗体の結合親和性の比較は、個々の抗体／抗原複合体のＫＤ値の比較により比較され得る。抗体または他の結合パートナーのＫＤ値は、当技術分野で十分確立された方法を使用して判定することができる。ＫＤを判定する一方法は、表面プラズモン共鳴を使用する、典型的にはＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）システムなどのバイオセンサーシステムを使用することによるものである。
同様に、相互作用の特異性は、目的の相互作用、例えば、抗体と抗原との特異的相互作用のＫＤ値を、目的でない、例えば、ＴＦＰＩと結合しないことが分かっている対照抗体の相互作用のＫＤ値を用いて判定および比較することにより査定され得る。
自己の標的を特異的に結合させる抗体は、高親和性でその標的と結合することができ、すなわち、上記に論じた低いＫＤを呈し、より低い親和性で他の非標的分子に結合し得る。例えば、抗体は、１×１０−６Ｍ以上、より好ましくは１×１０−５Ｍ以上、より好ましくは１×１０−４Ｍ以上、より好ましくは１×１０−３Ｍ以上、さらにより好ましくは１×１０−２Ｍ以上のＫＤで非標的分子に結合し得る。本発明の抗体は、好ましくは、別の非ＴＦＰＩ分子への結合に対するその親和性より少なくとも２倍、１０倍、５０倍、１００倍、２００倍、５００倍、１，０００倍、もしくは１０，０００倍、またはそれ以上である親和性でその標的に結合することができる。
一般に、ＴＦＰＩ抗体は、ＴＦＰＩの活性を有効に低減するために、高親和性でＴＦＰＩに結合する必要がある。しかし、抗体の結合親和性が高すぎると、抗体は、宿主細胞によって急速に内部移行および分解され得る。これは、短い半減期および注射の繰り返しを潜在的にもたらし得る。例えば、抗体ＴＦＰＩ−２３は、ＴＦＰＩ−２４と比較してより低い結合親和性（Ｋｄ）を示し、ある特定の環境下では、臨床用途にとってより望ましいと思われ、その理由は、それがより低い内部移行率およびより長い半減期を有するためである。したがって、５×１０−７Ｍ〜約５×１０−１１Ｍ、特に、約１×１０−８Ｍ〜約１×１０−１０Ｍの結合親和性（Ｋｄ）が一般に、特に、注射の繰り返しを必要とする慢性状態（例えば、血友病）を処置するのに望ましい。いずれの特定の理論にも束縛されるのを望むことなく、この親和性範囲は、（ｉ）ＴＦＰＩの活性を有効に阻害するのに必要とされる結合親和性と（ｉｉ）より長い半減期および抗体内部移行の低減との折り合いをつけると考えられる。
ＴＦＰＩ中の特定のアミノ酸残基位置は、配列番号２（ヒトＴＦＰＩα Ｋ１Ｋ２Ｋ３）に従って番号付けられる。しかし、本発明は、配列番号２に限定されない。他のＴＦＰＩ相同体、アイソフォーム、バリアント、または断片由来の対応する残基は、当技術分野で公知の配列アライメントまたは構造的アライメントに従って同定することができる。例えば、アライメントは、手動で、またはデフォルトパラメータを用いてＣｌｕｓｔａｌＷ２もしくは「ＢＬＡＳＴ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」などの周知の配列アライメントプログラムを使用して行うことができる。例えば、配列番号２のＡｒｇ１０７は、マウスＴＦＰＩ Ｋ１Ｋ２（配列番号４）のＡｒｇ１０４に対応する。
抗体の「抗原結合断片」は、抗原に特異的に結合する能力を保持する（好ましくは実質的に同じ結合親和性で）全長抗体の断片を指す。抗原結合断片の例としては、（ｉ）Ｆａｂ断片、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、およびＣＨ１ドメインからなる一価断片、（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片、ヒンジ領域でジスルフィド架橋により連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片、（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片、（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片、（ｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片（Ｗａｒｄら、（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ、３４１：５４４〜５４６）、ならびに（ｖｉ）単離相補性決定領域（ＣＤＲ）、ジスルフィド連結Ｆｖ（ｄｓＦｖ）、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体、およびイントラボディがある。さらに、Ｆｖ断片の２つのドメイン、ＶＬおよびＶＨは、別々の遺伝子によってコードされるが、これらは、組換え法を使用して、合成リンカーによって接合することができ、合成リンカーは、これらをＶＬおよびＶＨ領域が対をなして一価分子を形成する単一タンパク質鎖（単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として公知）として作製されるようにする；例えば、Ｂｉｒｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４２：４２３〜４２６（１９８８）およびＨｕｓｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８５：５８７９〜５８８３（１９８８）を参照。ダイアボディなどの単鎖抗体の他の形態も包含されている。ダイアボディは、ＶＨおよびＶＬドメインが単一ポリペプチド鎖上であるが、リンカーであって、短すぎて同じ鎖上の２つのドメインの間で対合を可能にすることができず、それによってドメインを別の鎖の相補的ドメインと強制的に対合させ、２つの抗原結合部位を創製する、リンカーを使用して発現される二価二重特異性抗体である（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０：６４４４〜６４４８（１９９３）；Ｐｏｌｊａｋら、１９９４、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、２：１１２１〜１１２３を参照）。
抗体「可変ドメイン」は、単独または組合せで、抗体軽鎖（ＶＬ）の可変領域または抗体重鎖（ＶＨ）の可変領域を指す。当技術分野で公知であるように、重鎖および軽鎖の可変領域はそれぞれ、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）によって接続された４つのフレームワーク領域（ＦＲ）からなり、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する。
可変ドメイン中の残基は、Ｋａｂａｔに従って番号付けられ、Ｋａｂａｔは、抗体の編集物の重鎖可変ドメインまたは軽鎖可変ドメインに使用されている番号方式である。Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、５版、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ．（１９９１）を参照。この番号方式を使用すると、実際の線状アミノ酸配列は、可変ドメインのＦＲまたはＣＤＲの短縮またはこれらへの挿入に対応するより少ないまたは追加のアミノ酸を含有し得る。例えば、重鎖可変ドメインは、Ｈ２の残基５２の後に単一アミノ酸インサート（Ｋａｂａｔによる残基５２ａ）および重鎖ＦＲ残基８２の後に挿入残基（例えば、Ｋａｂａｔによる残基８２ａ、８２ｂ、および８２ｃ）を含み得る。残基のＫａｂａｔ番号付けは、「標準的な」Ｋａｂａｔ番号付け配列と抗体の配列の相同性の領域でのアライメントにより所与の抗体について判定することができる。Ｋａｂａｔ番号付けを割り当てる様々なアルゴリズムが入手可能である。Ａｂｙｓｉｓ（ｗｗｗ．ａｂｙｓｉｓ．ｏｒｇ）の２０１２年リリースにおいて実装されているアルゴリズムが、別段の注記のない限り、可変領域にＫａｂａｔ番号付けを割り当てるのに本明細書で使用される。
抗体中の特定のアミノ酸残基位置（本明細書に開示のパラトープ残基など）も、Ｋａｂａｔにより番号付けられる。
「相補性決定領域」（ＣＤＲ）は、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＫａｂａｔとＣｈｏｔｈｉａの両方の蓄積、ＡｂＭ、接触、および／もしくはコンフォメーション定義の定義、または当技術分野で周知のＣＤＲ判定の任意の方法によって同定することができる。例えば、Ｋａｂａｔら、１９９１、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、５版（超可変領域）；Ｃｈｏｔｈｉａら、１９８９、Ｎａｔｕｒｅ、３４２：８７７〜８８３（構造的ループ構造）を参照。ＣＤＲのＡｂＭ定義は、ＫａｂａｔとＣｈｏｔｈｉａとの間の妥協案であり、Ｏｘｆｏｒｄ ＭｏｌｅｃｕｌａｒのＡｂＭ抗体モデル化ソフトウェア（Ａｃｃｅｌｒｙｓ（登録商標））を使用する。ＣＤＲの「接触」定義は、ＭａｃＣａｌｌｕｍら、１９９６、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２６２：７３２〜７４５に示された観察される抗原接触に基づく。ＣＤＲの「コンフォメーション」定義は、抗原結合にエンタルピー寄与をする残基に基づく（例えば、Ｍａｋａｂｅら、２００８、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２８３：１１５６〜１１６６を参照）。さらに他のＣＤＲ境界定義は、上記手法の１つに厳密には従わない場合があるが、それにもかかわらず、これらは、特定の残基もしくは残基の群、またはさらにはＣＤＲ全体が抗原結合に著しくインパクトを与えないという予測または実験的所見を踏まえると短くまたは長くすることができるとはいえ、Ｋａｂａｔ ＣＤＲの少なくとも一部と重なることになる。本明細書で使用する場合、ＣＤＲは、手法の組合せを含めて当技術分野で公知の任意の手法により定義されるＣＤＲを指すことができる。
実施例（表３および４を参照）では、ＣＤＲは、以下の通り定義される（Ｋａｂａｔによる番号付け、Ｈ：重鎖、Ｌ：軽鎖）：
ＣＤＲ−Ｈ１：Ｈ２６−Ｈ３５Ｂ、ＣＤＲ−Ｈ２：Ｈ５０−Ｈ６５、ＣＤＲ−Ｈ３：Ｈ９５−Ｈ１０２
ＣＤＲ−Ｌ１：Ｌ２４−Ｌ３４、ＣＤＲ−Ｌ２：Ｌ５０−Ｌ５６、ＣＤＲ−Ｌ３：Ｌ８９−Ｌ９７
「フレームワーク」（ＦＲ）残基は、ＣＤＲ残基以外の抗体可変ドメイン残基である。ＶＨまたはＶＬドメインフレームワークは、以下の構造：ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４中にＣＤＲとともに点在した４つのフレームワークサブ領域、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４を含む。実施例（表３および４を参照）では、ＦＲ残基は、以下（Ｋａｂａｔによる番号付け、Ｈ：重鎖、Ｌ：軽鎖）：
Figure 2020096627
 を含む。
「エピトープ」は、抗体が特異的に結合する抗原（Ａｇ）のエリアまたは領域、例えば、抗体（Ａｂ）と相互作用する残基を含むエリアまたは領域を指す。エピトープは、線状または立体構造的であり得る。線状エピトープでは、タンパク質と相互作用分子（抗体など）との相互作用点のすべては、タンパク質の一次アミノ酸配列に沿って直線的に存在する。「非線状エピトープ」または「立体構造エピトープ」は、エピトープに特異的な抗体が結合する抗原タンパク質内に非連続的なポリペプチド（またはアミノ酸）を含む。用語「エピトープ」は、本明細書で使用する場合、当技術分野で周知の任意の方法、例えば、従来のイムノアッセイで判定した場合に抗体が特異的に結合することができる抗原の部分として定義される。代替として、発見プロセス中に、抗体を生成し、特徴付けると、望ましいエピトープについての情報を解明することができる。この情報から、次いで、同じエピトープへの結合について抗体を競合的にスクリーニングすることが可能である。これを実現する手法は、競合および交差競合研究を行って、ＴＦＰＩへの結合を互いに競合または交差競合する抗体を見出すことである。すなわち、抗体が本開示の抗ＴＦＰＩ抗体の抗原結合部位への結合を競合するように、抗体は抗原への結合を競合する。
用語「パラトープ」は、視点を逆転することにより「エピトープ」の上記定義から派生し、抗原の結合に関与する抗体分子のエリアまたは領域、例えば、抗原と相互作用する残基を含むエリアまたは領域を指す。パラトープは、線状または立体構造的（ＣＤＲ中の不連続残基など）であり得る。
所与の抗体／抗原結合対のエピトープ／パラトープは、様々な実験的および計算的エピトープマッピング法を使用して異なる詳細のレベルで定義し、特徴付けることができる。実験的方法としては、突然変異誘発、Ｘ線結晶構造解析法、核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光法、水素／重水素交換質量分析法（ＨＸ−ＭＳ）、および様々な競合結合法がある。各方法はユニークな原理を利用するので、エピトープの説明は、それが判定された方法に密接に関連付けられる。よって、所与の抗体／抗原対のエピトープ／パラトープは、使用されるマッピング方法に応じて異なって定義されることになる。
その最も詳細なレベルにおいて、ＡｇとＡｂとの相互作用のエピトープ／パラトープは、Ａｇ−Ａｂ相互作用内に存在する原子接触を画定する空間的座標、および結合熱力学へのこれらの相対的寄与についての情報により定義することができる。一レベルにおいて、エピトープ／パラトープ残基は、ＡｇとＡｂとの間の原子接触を画定する空間的座標により特徴付けることができる。一態様では、エピトープ／パラトープ残基は、具体的な判断基準、例えば、ＡｂおよびＡｇ中の原子間距離（例えば、同族抗体の重原子および抗原の重原子から４Åに等しいまたはそれ未満の距離（「接触」残基））により定義することができる。別の態様では、エピトープ／パラトープ残基は、同族抗体／抗原との、または同族抗体／抗原にやはり水素結合されている水分子（水媒介水素結合）との水素結合相互作用に関与していると特徴付けることができる。別の態様では、エピトープ／パラトープ残基は、同族抗体／抗原の残基と塩橋を形成していると特徴付けることができる。さらに別の態様では、エピトープ／パラトープ残基は、同族抗体／抗原との相互作用に起因する埋没表面積（ＢＳＡ）の非ゼロ変化を有する残基と特徴付けることができる。さらにより詳細でないレベルにおいて、エピトープ／パラトープは、例えば、他のＡｂとの競合結合による機能を通じて特徴付けることができる。エピトープ／パラトープは、別のアミノ酸による置換がＡｂとＡｇとの相互作用の特性を変更することになるアミノ酸残基を含むことにより一般的に定義することもできる（例えば、アラニンスキャニング）。
抗体、例えば、１つのＦａｂ断片もしくは２つのＦａｂ断片とその抗原との間の複合体の空間座標により定義される、Ｘ線で導出される結晶構造という観点から、別段の指定のない限り、エピトープ残基は、（ｉ）同族抗体の重原子から４Åの距離内である重原子（すなわち、非水素原子）を有し（「接触」残基とも呼ばれる）、（ｉｉ）同族抗体の残基との、もしくは同族抗体にやはり水素結合されている水分子（水媒介水素結合）との水素結合に関与し、（ｉｉｉ）同族抗体の残基への塩橋に関与し、かつ／または（ｉｖ）同族抗体との相互作用に起因する埋没表面積（ＢＳＡ）の非ゼロ変化を有するＴＦＰＩ残基を指す。一般に、最小限の相互作用を有する残基が含まれるのを回避するために、カットオフがＢＳＡに課される。したがって、別段の指定のない限り、カテゴリー（ｉｖ）下のエピトープ残基は、それが、２０Å２以上のＢＳＡを有し、または抗体がＴＦＰＩに結合するとき静電相互作用に関与する場合、選択される。同様に、Ｘ線で導出される結晶構造という観点から、別段の指定のない限りまたは脈絡により矛盾しない限り、パラトープ残基は、（ｉ）ＴＦＰＩの重原子から４Åの距離内である重原子（すなわち、非水素原子）を有し（「接触」残基とも呼ばれる）、（ｉｉ）ＴＦＰＩ残基との、もしくはやはりＴＦＰＩに水素結合されている水分子（水媒介水素結合）との水素結合に関与し、（ｉｉｉ）ＴＦＰＩの残基への塩橋に関与し、かつ／または（ｉｖ）ＴＦＰＩとの相互作用に起因する埋没表面積（ＢＳＡ）の非ゼロ変化を有する抗体残基を指す。やはり、別段の指定のない限り、カテゴリー（ｉｖ）下のパラトープ残基は、それが、２０Å２以上のＢＳＡを有し、または抗体がＴＦＰＩに結合するとき静電相互作用に関与する場合、選択される。
エピトープの説明および定義が、使用されるエピトープマッピング法に依存し、異なる詳細のレベルで得られるという事実から、同じＡｇ上の異なるＡｂについてのエピトープの比較は、同様に、異なる詳細度で行われ得るということになる。例えば、アミノ酸レベルで記述される、例えば、Ｘ線構造から判定されるエピトープは、これらが同じセットのアミノ酸残基を含有する場合、同一であると言われる。エピトープに共有されるアミノ酸残基が無い場合、エピトープは、別個（ユニーク）であると言われる。競合結合により特徴付けられるエピトープは、対応する抗体の結合が相互に排他的である、すなわち、１つの抗体の結合が他の抗体の同時のまたは連続した結合を排除する場合、重複していると言われ、抗原が両方の対応する抗体の結合に同時に適応することができる場合、エピトープは、別個（ユニーク）であると言われる。
所与の抗体／抗原対のエピトープおよびパラトープは、常法により同定することができる。例えば、エピトープの一般的な場所は、本明細書の他の場所で以前により完全に記載した通り、異なる断片またはバリアントＴＦＰＩポリペプチドに結合する抗体の能力を査定することにより判定され得る。抗体内の特異的残基と接触するＴＦＰＩ内の特異的残基も、実施例に記載されるものなどの常法を使用して判定することができる。例えば、抗体／抗原複合体を結晶化することができる。結晶構造を判定および使用して、抗体と抗原との相互作用の特異的部位を同定することができる。
用語「競合する」は、抗体に関して本明細書で使用する場合、第１の抗体またはその抗原結合部分が抗原に結合することにより、第２の抗体またはその抗原結合部分による同じ抗原の後続の結合が低減されることを意味する。一般に、第１の抗体の結合は、立体障害、コンフォメーション変化、または共通エピトープ（もしくはその部分）への結合をもたらし、その結果、第２の抗体の同じ抗原への結合が低減される。標準的な競合アッセイを使用して、２つの抗体が互いに競合するか否かを判定することができる。抗体競合の１つの適切なアッセイでは、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術を使用して、典型的にはバイオセンサーシステム（ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）システムなど）を使用して相互作用の程度を測定することができるＢｉａｃｏｒｅ技術の使用を伴う。例えば、ＳＰＲをｉｎ ｖｉｔｒｏ競合的結合阻害アッセイにおいて使用して、１つの抗体の第２の抗体の結合を阻害する能力を判定することができる。抗体競合を測定する別のアッセイは、ＥＬＩＳＡに基づく手法を使用する。さらに、その競合に基づいて抗体を「ビニングする」ためのハイスループットプロセスが国際特許出願第ＷＯ２００３／４８７３１号に記載されている。１つの抗体（または断片）が別の抗体（または断片）のＴＦＰＩへの結合を低減する場合、競合が存在する。例えば、連続した結合競合アッセイを、異なる抗体を順次添加して使用することができる。第１の抗体は、飽和に近い結合に到達させるように添加される場合がある。次いで、第２の抗体が添加される。第２の抗体のＴＦＰＩへの結合が検出されない、または第１の抗体の非存在下における並列のアッセイ（その値を１００％と設定することができる）と比較して有意に低減されている（例えば、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、もしくは少なくとも約９０％の低減）場合、２つの抗体は、互いに競合していると見なされる。ＳＰＲによる例示的な抗体競合アッセイ（および重複エピトープ分析）が実施例６に提供されている。
本開示の抗ＴＦＰＩ抗体は、本明細書に記載のＴＰＦＩへの結合について本開示の別の抗体と競合または交差競合する能力を有し得る。例えば、本開示の抗体は、本明細書に開示の抗体が結合しているＴＦＰＩまたはＴＦＰＩの適切な断片もしくはバリアントへの結合を本明細書に記載の抗体と競合または交差競合し得る。
すなわち、第１の抗ＴＦＰＩ抗体がＴＦＰＩへの結合を第２の抗体と競合するが、第２の抗体がＴＦＰＩに最初に結合している場合に競合しない場合、それは第２の抗体と「競合する」と見なされる（単方向競合とも呼ばれる）。抗体が、どの抗体がＴＦＰＩに最初に結合しているかにかかわらず別の抗体と競合する場合、その抗体は他の抗体とＴＦＰＩへの結合を「交差競合する」。このような競合または交差競合抗体は、標準的な結合アッセイにおいて本開示の公知の抗体と競合／交差競合するこれらの能力に基づいて同定することができる。例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）システムを使用することによるＳＰＲ、ＥＬＩＳＡアッセイ、またはフローサイトメトリーを使用して競合／交差競合を実証することができる。このような競合／交差競合は、２つの抗体が同一の、重複する、または同様のエピトープに結合することを示唆し得る。
したがって、本開示の抗ＴＦＰＩ抗体は、試験抗体が本開示の参照抗体（例えば、ＴＦＰＩ−３、ＴＦＰＩ−２１、ＴＦＰＩ−２３、ＴＦＰＩ−２４、ＴＦＰＩ−２６、ＴＦＰＩ−１０６、ＴＦＰＩ−１０７、ＴＦＰＩ−１０８、ＴＦＰＩ−１０９、ＴＦＰＩ−１１０、ＴＦＰＩ−１１１、ＴＦＰＩ−１１２、ＴＦＰＩ−１１３、ＴＦＰＩ−１１４、４Ｄ８、６Ｂ７．ｃ５、７Ａ４．Ｄ９）と標的分子の結合部位を競合／交差競合することができるか否かを査定する結合アッセイを含む方法により同定することができる。
「Ｆｃ融合」タンパク質は、１個または複数のポリペプチドがＦｃポリペプチドに作動可能に連結したタンパク質である。Ｆｃ融合は、免疫グロブリンのＦｃ領域を融合パートナーと組み合わせる。
抗体の結合親和性は、Ｋｄ値として表現することができ、これは特定抗原−抗体相互作用の解離速度を指す。Ｋｄは、「オフレート（ｋｏｆｆ）」とも呼ばれる解離の速度と会合速度または「オンレート（ｋｏｎ）」との比である。よって、Ｋｄは、ｋｏｆｆ／ｋｏｎに等しく、モル濃度（Ｍ）として表現され、Ｋｄが小さいほど結合の親和性が強い。抗体のＫｄ値は、当技術分野で十分確立された方法を使用して判定することができる。Ｋｄを測定するための一例示的方法は、典型的にはＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）システムなどのバイオセンサーシステムを使用する表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）である。ＢＩＡｃｏｒｅ動態分析は、表面に分子（例えば、エピトープ結合ドメインを含む分子）が固定化されたチップからの抗原の結合および解離を分析することを含む。抗体のＫｄを判定するための別の方法は、典型的にはＯＣＴＥＴ（登録商標）技術（Ｏｃｔｅｔ ＱＫｅ ｓｙｓｔｅｍ、ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を使用してバイオレイヤー干渉法を使用することによるものである。代替としてまたは追加的に、Ｓａｐｉｄｙｎｅ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（Ｂｏｉｓｅ、Ｉｄ．）から入手可能なＫｉｎＥｘＡ（登録商標）（速度論的排除アッセイ）アッセイも使用され得る。
用語「治療有効量」は、意図された目的、例えば、凝固の増大、もしくは血友病の場合において、凝血時間の低下などを実現するのに、または必要のある対象にｉｎ ｖｉｖｏで測定可能な利益を別段にもたらす十分な量のものである抗ＴＦＰＩ抗体もしくはその断片、またはこのような抗体もしくはその断片を含む組合せの量を意味する。正確な量は、それだけに限らないが、治療用組成物の成分および物理的測定、意図された患者集団、個々の患者の考慮事項などを含めた多数の要因に依存することになり、当業者が判定することができる。
用語「相乗的治療有効量」とは、第２の治療剤、例えば、第ＶＩＩａ因子（ＦＶＩＩａ）とともに提供されるとき、単独で投与される各治療剤または抗体の相加的な測定可能な効果より大きい、測定可能な利益（例えば、凝血時間の低下、出血時間の低下、フィブリン産生の増大、血小板蓄積の増強など）をもたらす抗ＴＦＰＩ抗体またはその抗原結合断片の量を意味する。
用語「処置」は、予防的および／または治療的処置を含む。処置が状態の臨床的顕在化の前に投与される場合、その処置は予防的と見なされる。治療的処置は、例えば、疾患の重症度の寛解もしくは低減、または疾患の長さの短縮を含む。
用語「約」は、ここで使用する場合、値の＋／−１０％を指す。
３． 抗ＴＦＰＩ抗体
組織因子経路インヒビター（ＴＦＰＩ）に結合する抗体（およびこれらの抗原結合断片）が本明細書に開示および例示されている。抗体および抗体断片は、ＴＦＰＩのユニークエピトープに結合する。ある特定の実施形態では、ＴＦＰＩ中のある特定のエピトープ残基の認識により、抗体（およびそれらの抗原結合断片）がＴＦＰＩの活性を低減することが可能になる。さらに、ある特定の実施形態では、本明細書に開示の抗体（およびそれらの抗原結合断片）は、凝固因子欠乏症の処置のため、および出血時間を低減するための望ましい薬理活性および薬物動態学的性質を実証した。
Ａ．組織因子経路インヒビター（ＴＦＰＩ）
ＴＦＰＩは、プロテアーゼインヒビターを含有する多価Ｋｕｎｉｔｚドメインである。ヒト、マウス、カニクイザル、ウサギ、およびラットＴＦＰＩの例示的な配列が表２に提供されている。
ヒトＴＦＰＩは、２つの支配的な形態、ＴＦＰＩ−アルファおよびＴＦＰＩ−ベータを有する細胞外糖タンパク質である。ＴＦＰＩアルファは、２７６アミノ酸糖化タンパク質（ＭＷ ４３ｋＤ）であり、ＴＦＰＩの最大形態であり、３つのＫｕｎｉｔｚ様ドメインおよび塩基性カルボキシ末端領域からなる。代替スプライシングによりＴＦＰＩ−ベータが産生され、これは、Ｋｕｎｉｔｚドメイン１（Ｋ１）およびＫｕｎｉｔｚドメイン２（Ｋ２）を含有するが、Ｋｕｎｉｔｚドメイン３（Ｋ３）および塩基性領域を欠く代替のＣ末端部分を含有する。ＴＦＰＩベータは、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカーでの翻訳後修飾により細胞膜に係留されている。
ＴＦＰＩの主な標的は、プロテアーゼ第Ｘａ因子（ＦＸａ）および第ＶＩＩａ因子（ＦＶＩＩａ）であり、これらは、凝固カスケードの開始段階における重要因子である。生化学分析により、Ｋ２はＦＸａのインヒビターであり、一方、Ｋ１はＦＶＩＩａ−組織因子複合体を阻害することが明らかになった。Ｋ３の役割は、これが直接的なプロテアーゼ阻害活性を有するように思われないために不明確であるが、コファクタープロテインＳの認識部位として機能を果たし得る。ＴＦＰＩ−アルファにユニークなＣ末端ドメインは、血小板表面上のプロトロンビナーゼの認識に関与し得る。
Ｋｕｎｉｔｚドメイン１（Ｋ１）は、配列番号２のアミノ酸残基２６〜７６に対応し、Ｋｕｎｉｔｚドメイン２（Ｋ２）は、配列番号２の残基９１〜１４７に対応する。他のＴＦＰＩ相同体、アイソフォーム、バリアント、または断片由来のＫ１およびＫ２ドメインは、配列番号２に対する配列アライメントまたは構造的アライメントによって同定することができる。
本開示のＴＦＰＩには、任意の適切な生物体に由来し得るＴＦＰＩの任意の天然に存在する形態が含まれる。例えば、ＴＦＰＩは、哺乳動物ＴＦＰＩ、例えば、ヒト、マウス、ラット、非ヒト霊長類、ウシ、ヒツジ、イヌ、ネコ、またはブタＴＦＰＩなどであり得る。ある特定の実施形態では、ＴＦＰＩは、ヒトＴＦＰＩである。ＴＦＰＩは、ＴＦＰＩの成熟形態（すなわち、適切な細胞内で翻訳後プロセシングを受けたタンパク質）であり得る。このような成熟したＴＦＰＩタンパク質は、例えば、グリコシル化されている場合がある。
本開示のＴＦＰＩには、天然に存在するＴＦＰＩに由来する任意の機能性断片またはバリアントが含まれる。ＴＦＰＩの機能性断片は、ＴＦＰＩの活性、例えば、第Ｘａ因子（ＦＸａ）を阻害し、ＦＶＩＩａ−組織因子複合体の活性を阻害し、かつ／または凝固もしくは止血の負の調節因子として機能する能力などを保持するＴＦＰＩの任意の部位または部分であり得る。例えば、機能性断片は、ＴＦＰＩのＫｕｎｉｔｚドメイン、例えば、Ｋ１ドメイン、Ｋ２ドメイン、またはＫ１およびＫ２ドメインの両方などを含むことができる。
機能性バリアントは、天然に存在するＴＦＰＩと比較して１個または複数の突然変異を含み、天然に存在するＴＦＰＩの活性、例えば、第Ｘａ因子（ＦＸａ）を阻害する能力、またはＦＶＩＩａ−組織因子複合体の活性を阻害する能力などを依然として保持することができる。例えば、バリアントは、配列番号１、２、３、４、５、６、または７と様々な程度の配列同一性を有し得る、例えば、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、または配列番号７に列挙された配列と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一などであり得る。
本発明のＴＰＦＩ断片、バリアント、アイソフォーム、および相同体は、本明細書に記載の重要なエピトープ残基（ＴＦＰＩ−２３およびＴＦＰＩ−２４抗体が使用される場合、Ｉｌｅ１０５、Ａｒｇ１０７、およびＬｅｕ１３など）を維持するべきである。さらに、ＴＦＰＩは、５以上、８以上、１０以上、１２以上、または１５以上のＴＦＰＩのＫ２ドメインの表面接近可能残基を含み得る。表面接近可能残基は、４０％超の相対接近性を有する残基である。
例えば、ＴＦＰＩのＫ２ドメインについて（例えば、配列番号２を参照）、以下のアミノ酸残基が４０％超の相対接近性を有する：９４〜９５、９８、１００〜１１０、１１８〜１２１、１２３〜１２４、１３１、１３４、１３８〜１４２、および１４４〜１４５。ＴＦＰＩは、５以上、８以上、１０以上、１２以上、または１５以上のこれらの残基、例えば、５以上、８以上、１０以上、１２以上、または１５以上のこれらの残基を含むＴＦＰＩの断片などを含み得る。
Ｂ．抗ＴＦＰＩ抗体
本発明の抗体またはその抗原結合断片は、ＴＦＰＩのＫ２ドメインを特異的に結合させ、ＦＸａとのその相互作用を阻害し、かつ／またはＴＦＰＩの活性を低減することができる。
ＴＦＰＩ−２３およびバリアント
一態様では、本発明は、抗体ＴＦＰＩ−２３、およびヒトフレームワーク生殖系列残基の含有量を増大させるように作製された（「生殖系列化（ｇｅｒｍｌｉｎｉｎｇ）」）ＴＦＰＩ−２３のバリアントを含む。例えば、ＴＦＰＩ−１０６は、Ｈ１ＱからＥおよびＨ５ＶからＬへの突然変異（Ｋａｂａｔ番号付け）を含み、ＴＦＰＩ−１０７は、Ｈ１ＱからＥ、Ｈ５ＶからＬ、およびＨ９４ＩからＫへの突然変異（Ｋａｂａｔ番号付け）を含む。本発明の目的に関して、ＴＦＰＩ−２３親抗体およびＴＦＰＩ−１０６生殖系列バリアントは、これらのエピトープ残基およびパラトープ残基相互作用において互換性である。
一態様では、本発明は、組織因子経路インヒビター（ＴＦＰＩ）のＫｕｎｉｔｚドメイン２（Ｋ２）中のエピトープに特異的に結合する単離抗体またはその抗原結合断片であって、エピトープは、配列番号２の番号付けによる残基Ｉｌｅ１０５、Ａｒｇ１０７、およびＬｅｕ１３１を含む、単離抗体またはその抗原結合断片を提供する。ある特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、ＴＦＰＩのＫｕｎｉｔｚドメイン１（Ｋ１）に結合しない。
本明細書に開示および例示されているように、共結晶構造および計算アラニンスキャンに基づいて、ＴＦＰＩのＫ２ドメイン中のユニークエピトープが発見された。特に、結晶構造は、ＴＦＰＩのＫ２ドメインがコーン型構造を採用し、コーンの先端部（特にＡｒｇ１０７）はＦＸａに結合していることを示す。ＴＦＰＩ−２３、ＴＦＰＩ−２４、およびこれらのバリアントはすべて、このコーン型領域の先端部付近の残基を認識し、ＴＦＰＩのＦＸａへの結合をブロックする。したがって、コーンの先端部付近に位置したエピトープ残基を認識する抗体は、ＴＦＰＩ活性の阻害に特に有用である。
ある特定の実施形態では、本発明は、抗体−抗原相互作用に重要である３つの残基：Ｉｌｅ１０５、Ａｒｇ１０７、およびＬｅｕ１３１（配列番号２に示したヒトＴＦＰＩの番号付けによる）を含むＴＦＰＩエピトープを開示する。これらの３つの残基をアラニンに突然変異させると、ＴＦＰＩ−２３、ＴＦＰＩ−２４、およびこれらのバリアントによる結合が喪失される。アラニンスキャン結果を要約している表２８を参照。
追加のＴＰＦＩ残基も抗体結合に関与すると同定されているが、これらの残基は、著しい不安定効果を伴うことなくアラニンに突然変異され得る。表２８を参照。したがって、ある特定の実施形態では、ＴＦＰＩエピトープは、Ｃｙｓ１０６、Ｇｌｙ１０８、Ｃｙｓ１３０、Ｇｌｙ１３２（配列番号２の番号付けによる）、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される１個または複数の残基をさらに含む。これらのエピトープ残基は、ＴＦＰＩ−２３、ＴＦＰＩ−２４、およびこれらのバリアントによって認識される。ＴＦＰＩ−２３およびＴＦＰＩ−２４によって共有される共通エピトープ残基を示す表２７を参照。
ある特定の実施形態では、エピトープは、Ａｓｐ１０２、Ａｒｇ１１２、Ｔｙｒ１２７、Ｇｌｙ１２９、Ｍｅｔ１３４、Ｇｌｕ１３８（配列番号２の番号付けによる）、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される１個または複数の残基をさらに含む。これらのエピトープ残基は、ＴＦＰＩ−２３およびそのバリアント（例えば、ＴＦＰＩ−１０６、ＴＦＰＩ−１０７）によって認識されるが、ＴＦＰＩ−２４（およびそのバリアント）によって認識されない。表２７を参照。
ある特定の実施形態では、エピトープは、Ｅ１００、Ｅ１０１、Ｐ１０３、Ｙ１０９、Ｔ１１１、Ｙ１１３、Ｆ１１４、Ｎ１１６、Ｑ１１８、Ｑ１２１、Ｃ１２２、Ｅ１２３、Ｒ１２４、Ｆ１２５、Ｋ１２６、Ｌ１４０（配列番号２による番号付け）、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される１個または複数の残基を含まない。表２７を参照。ＷＯ２０１００７２６９（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ）によれば、参照抗体４Ｆ３６は、Ｅ１００、Ｅ１０１、Ｐ１０３、Ｙ１０９、Ｔ１１１、Ｙ１１３、Ｆ１１４、Ｎ１１６、Ｑ１１８、Ｑ１２１、Ｃ１２２、Ｅ１２３、Ｒ１２４、Ｆ１２５、Ｋ１２６、およびＬ１４０を含むエピトープを認識する。
ある特定の実施形態では、エピトープは、Ｄ３１、Ｄ３２、Ｐ３４、Ｃ３５、Ｋ３６、Ｅ１００、Ｅ１０１、Ｐ１０３、Ｙ１０９、Ｋ１２６、Ｇ１２８（配列番号２による番号付け）、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される１個または複数の残基を含まない。表２７を参照。表２７によれば、参照抗体２Ａ８および２Ａ８−２００は、Ｄ３１、Ｄ３２、Ｐ３４、Ｃ３５、Ｋ３６、Ｅ１００、Ｅ１０１、Ｐ１０３、Ｙ１０９、Ｋ１２６、およびＧ１２８を含むエピトープを認識する。
ある特定の実施形態では、エピトープは、１個または複数のＴＦＰＩ「接触」残基（同族抗体の重原子から４Åの距離以内にある重原子（すなわち、非水素原子）を有する）を指す場合があり、Ａｓｐ１０２、Ｇｌｙ１０４、Ｉｌｅ１０５、Ｃｙｓ１０６、Ａｒｇ１０７、Ｇｌｙ１０８、Ａｒｇ１１２、Ｔｙｒ１２７、Ｇｌｙ１２９、Ｃｙｓ１３０、Ｌｅｕ１３１、Ｇｌｙ１３２、Ｍｅｔ１３４、Ｇｌｕ１３８（配列番号２の番号付けによる）、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される１個または複数の残基を含む。表２９Ｂを参照。
ある特定の実施形態では、エピトープは、抗体の残基との、または同族抗体（水媒介水素結合）にやはり水素結合されている水分子との水素結合に関与している１個または複数のＴＦＰＩ残基を指す場合があり、Ａｓｐ１０２、Ａｒｇ１０７、Ａｒｇ１１２、Ｔｙｒ１２７、およびＬｅｕ１３１（配列番号２の番号付けによる）、ならびにこれらの任意の組合せからなる群から選択される１個または複数の残基を含む。これらのエピトープ残基は、同族抗体との水素結合に関与する。表２９Ｂを参照。
ある特定の実施形態では、エピトープは、同族抗体との相互作用に起因する埋没表面積（ＢＳＡ）の非ゼロ変化を有する残基を指す場合があり、Ａｓｐ１０２、Ｇｌｙ１０４、Ｉｌｅ１０５、Ｃｙｓ１０６、Ａｒｇ１０７、Ｇｌｙ１０８、Ａｒｇ１１２、Ｔｙｒ１２７、Ｇｌｙ１２９、Ｃｙｓ１３０、Ｌｅｕ１３１、Ｇｌｙ１３２、Ａｓｎ１３３、Ｍｅｔ１３４、Ｇｌｕ１３８（配列番号２の番号付けによる）、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される１個または複数の残基を含む。これらについて、表２９Ｂを参照。
エピトープ残基のこれらの異なるカテゴリーの任意の組合せも、本発明によって包含されている。
ある特定の実施形態では、エピトープは、上述したエピトープ残基の少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、もしくはすべて、または上述したエピトープ残基の様々なカテゴリーの任意の組合せを含む。
ＴＦＰＩ−２３（およびバリアント）のパラトープ残基は、以下の接触残基（ＴＦＰＩエピトープ残基の４Å以内）：Ｈ３３ Ａｌａ、Ｈ４７ Ｔｒｐ、Ｈ５０ Ａｌａ、Ｈ５１ Ｉｌｅ、Ｈ５２ Ｓｅｒ、Ｈ５６ Ｓｅｒ、Ｈ５８ Ｔｙｒ、Ｈ９５ Ｌｅｕ、Ｈ９６ Ｇｌｙ、Ｈ９７ Ａｌａ、Ｈ９８ Ｔｈｒ、Ｈ９９ Ｓｅｒ、Ｈ１００ Ｌｅｕ、Ｈ１００Ａ Ｓｅｒ、Ｌ２９ Ａｌａ、Ｌ３１ Ｔｙｒ、Ｌ９１ Ｔｙｒ、Ｌ９５Ａ Ｓｅｒ、Ｌ９５Ｂ Ｇｌｙ、およびＬ９５Ｃ Ｓｅｒを指す場合があり、Ｌ９３ ＳｅｒおよびＬ９６ Ｇｌｙを指してもよい（Ｋａｂａｔによる番号付け）。Ｌ９３ Ｓｅｒ（４．０７Å）およびＬ９６ Ｇｌｙ（４．０３Å）は、任意選択であり、その理由は、距離が４Åをわずかに超えるが、４Åに四捨五入されるほど近いためである。
上記接触残基は、ＴＦＰＩ−２３抗体由来の元の残基であることに留意されたい。しかし、構造解析およびアラニンスキャニングに基づくと、ＴＦＰＩ−２３中のいくつかの接触残基は、抗原結合に著しく影響することなく別の残基と置換することができると考えられる。例えば、表２９Ａは、ＴＦＰＩ−２３中のいくつかの接触残基は、他の残基と置換することができ、結合または安定性に対して０．５ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満の効果をもたらすだけである（「０．５ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満」は、結合に対して中立の効果を有することを意味する）ことを示す。特に、表２９Ａ、列４に示した通り、３つのＣＤＲ位置ならびに１つのフレームワーク位置：Ｈ４７、Ｈ５８、Ｌ９１、およびＬ９６（Ｋａｂａｔによる番号付け）は、１つまたは２つの残基を許容するだけである：（ａ）Ｈ４７は、ＴｒｐまたはＴｙｒであり、（ｂ）Ｈ５８は、Ｔｙｒであり、（ｃ）Ｌ９１は、ＴｙｒまたはＡｒｇであり、（ｄ）Ｌ９６は、ＧｌｙまたはＡｓｎである。他のＣＤＲ位置は、表２９Ａ、列４に要約されている通り、より多くの置換に適応することができる。
したがって、ある特定の実施形態では、本明細書に記載の抗体またはその抗原結合断片は、
（ａ）Ｈ３３は、Ａｌａ、Ａｓｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、またはＶａｌであり、
（ｂ）Ｈ４７は、ＴｒｐまたはＴｙｒであり、
（ｃ）Ｈ５０は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ｇｌｙ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、またはＶａｌであり、
（ｄ）Ｈ５１は、Ｉｌｅ、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、またはＶａｌであり、
（ｅ）Ｈ５２は、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、またはＶａｌであり、
（ｆ）Ｈ５６は、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、またはＶａｌであり、
（ｇ）Ｈ５８は、Ｔｙｒであり、
（ｈ）Ｈ９５は、Ｌｅｕ、Ｇｌｎ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、またはＴｙｒであり、
（ｉ）Ｈ９６は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、またはＶａｌであり、
（ｊ）Ｈ９７は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、またはＶａｌであり、
（ｋ）Ｈ９８は、Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、またはＶａｌであり、
（ｌ）Ｈ９９は、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｐｈｅ、またはＰｒｏであり、
（ｍ）Ｈ１００は、Ｌｅｕ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、またはＶａｌであり、
（ｎ）Ｈ１００Ａは、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、またはＴｒｐであり、
（ｏ）Ｌ２９は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、またはＶａｌであり、
（ｐ）Ｌ３１は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、またはＶａｌであり、
（ｑ）Ｌ９１は、ＴｙｒまたはＡｒｇであり、
（ｒ）Ｌ９５Ａは、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、またはＶａｌであり、
（ｓ）Ｌ９５Ｂは、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、またはＶａｌであり、
（ｔ）Ｌ９５Ｃは、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、またはＶａｌである
残基（Ｋａｂａｔによる番号付け）を含み、
（ｕ）Ｌ９３は、Ｔｙｒ、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、またはＶａｌであり、
（ｖ）Ｌ９６は、ＧｌｙまたはＡｓｎ
であるものを含んでもよい。
これらの残基の中で、Ｈ４７はフレームワーク残基であり、すべての他の残基はＣＤＲ残基である。
より厳格な置換判断基準が課される（置換が、−０．５ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満の親和性をもたらさなければならない、つまり置換が、正の（中立的／安定化）効果を有さなければならない）場合、接触残基は、以下の通りである（Ｋａｂａｔによる番号付け）（表２９Ａ、列５）：
（ａ）Ｈ３３は、ＡｌａまたはＶａｌであり、
（ｂ）Ｈ４７は、Ｔｒｐであり、
（ｃ）Ｈ５０は、Ａｌａであり、
（ｄ）Ｈ５１は、Ｉｌｅであり、
（ｅ）Ｈ５２は、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、またはＴｙｒであり、
（ｆ）Ｈ５６は、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、またはＬｙｓであり、
（ｇ）Ｈ５８は、Ｔｙｒであり、
（ｈ）Ｈ９５は、Ｌｅｕであり、
（ｉ）Ｈ９６は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、またはＶａｌであり、
（ｊ）Ｈ９７は、Ａｌａであり、
（ｋ）Ｈ９８は、Ｔｈｒ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、またはＴｙｒであり、
（ｌ）Ｈ９９は、Ｓｅｒであり、
（ｍ）Ｈ１００は、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、またはＴｙｒであり、
（ｎ）Ｈ１００Ａは、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、またはＴｒｐであり、
（ｏ）Ｌ２９は、Ａｌａであり、
（ｐ）Ｌ３１は、Ｔｙｒであり、
（ｑ）Ｌ９１は、Ｔｙｒであり、
（ｒ）Ｌ９５Ａは、Ｓｅｒ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、またはＴｙｒであり、
（ｓ）Ｌ９５Ｂは、Ｇｌｙであり、
（ｔ）Ｌ９５Ｃは、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、またはＶａｌであり、
（ｕ）Ｌ９３は、Ｓｅｒであってもよく、
（ｖ）Ｌ９６は、Ｇｌｙであってもよい。
代替としてまたは追加的に、許容できる置換の選択は、表２９Ａの列６に基づくことができ、この場合、上位３つの残基が親和性に対するこれらのインパクト（すなわち、親和性に対して最大の安定化効果を有する上位３つの予測された位置）に基づいて選択される。この判定基準の下で、接触残基は、以下の通りである（Ｋａｂａｔによる番号付け）：
（ａ）Ｈ３３は、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｈｉｓ、またはＰｈｅであり、
（ｂ）Ｈ４７は、ＴｒｐまたはＴｙｒであり、
（ｃ）Ｈ５０は、Ａｌａ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、またはＰｈｅであり、
（ｄ）Ｈ５１は、Ｉｌｅ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、またはＰｒｏであり、
（ｅ）Ｈ５２は、Ｓｅｒ、Ｐｈｅ、Ａｒｇ、またはＴｙｒであり、
（ｆ）Ｈ５６は、Ｓｅｒ、Ｌｙｓ、Ｔｙｒ、またはＰｈｅであり、
（ｇ）Ｈ５８は、Ｔｙｒであり、
（ｈ）Ｈ９５は、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｇｌｎ、またはＰｈｅであり、
（ｉ）Ｈ９６は、Ｇｌｙ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、またはＬｙｓであり、
（ｊ）Ｈ９７は、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｔｙｒ、またはＩｌｅであり、
（ｋ）Ｈ９８は、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、またはＨｉｓであり、
（ｌ）Ｈ９９は、Ｓｅｒ、Ｐｒｏ、Ａｌａ、またはＰｈｅであり、
（ｍ）Ｈ１００は、Ｌｅｕ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、またはＰｈｅであり、
（ｎ）Ｈ１００Ａは、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、Ｌｅｕ、またはＴｒｐであり、
（ｏ）Ｌ２９は、Ａｌａ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、またはＧｌｎであり、
（ｐ）Ｌ３１は、Ｔｙｒ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、またはＴｒｐであり、
（ｑ）Ｌ９１は、ＴｙｒまたはＡｒｇであり、
（ｒ）Ｌ９５Ａは、Ｓｅｒ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、またはＨｉｓであり、
（ｓ）Ｌ９５Ｂは、Ｇｌｙ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、またはＰｒｏであり、
（ｔ）Ｌ９５Ｃは、Ｓｅｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、またはＰｈｅであり、
（ｕ）Ｌ９３は、Ｓｅｒ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、またはＨｉｓであってもよく、
（ｖ）Ｌ９６は、ＧｌｙまたはＡｓｎであってもよい。
ＴＦＰＩ−２３（およびバリアント）のパラトープ残基は、ＴＦＰＩの残基との、またはＴＦＰＩにやはり水素結合されている水分子との水素結合に関与している残基も指す場合があり、以下：Ｈ５８ Ｔｙｒ、Ｈ９６ Ｇｌｙ、Ｈ９７ Ａｌａ、Ｈ９８ Ｔｈｒ、Ｈ９９ Ｓｅｒ、Ｈ１００ Ｌｅｕ、Ｌ２９ Ａｌａ、Ｌ３１ Ｔｙｒ、およびＬ９５Ｂ Ｇｌ（Ｋａｂａｔによる番号付け）を含む。表２９Ｂを参照。
ＴＦＰＩ−２３（およびバリアント）のパラトープ残基は、ＴＦＰＩとの相互作用に起因するＢＳＡの非ゼロ変化を有する残基を指す場合もあり、以下（Ｋａｂａｔによる番号付け）：Ｈ３３ Ａｌａ、Ｈ５８ Ｔｙｒ、Ｈ９５ Ｌｅｕ、Ｈ９６ Ｇｌｙ、Ｈ９７ Ａｌａ、Ｈ９８ Ｔｈｒ、Ｈ９９ Ｓｅｒ、Ｈ１００ Ｌｅｕ、Ｈ１００Ａ Ｓｅｒ、Ｌ２９ Ａｌａ、Ｌ３１ Ｔｙｒ、Ｌ９１ Ｔｙｒ、Ｌ９３ Ｓｅｒ、Ｌ９５Ａ Ｓｅｒ、およびＬ９５Ｂ Ｇｌｙを含む。最小限の相互作用を有する残基が含まれるのを回避するために、カットオフ（２０Å２以上の、または静電相互作用に関与するＢＳＡ）が適用される。表２９Ｂを参照。
ＢＳＡのカットオフが適用されない場合、パラトープ残基は、以下：Ｈ３３ Ａｌａ、Ｈ３４ Ｍｅｔ、Ｈ４７ Ｔｒｐ、Ｈ５０ Ａｌａ、Ｈ５１ Ｉｌｅ、Ｈ５２ Ｓｅｒ、Ｈ５６ Ｓｅｒ、Ｈ５８ Ｔｙｒ、Ｈ９５ Ｌｅｕ、Ｈ９６ Ｇｌｙ、Ｈ９７ Ａｌａ、Ｈ９８ Ｔｈｒ、Ｈ９９ Ｓｅｒ、Ｈ１００ Ｌｅｕ、Ｈ１００Ａ Ｓｅｒ、Ｌ２８ Ｇｌｙ、Ｌ２９ Ａｌａ、Ｌ３１ Ｔｙｒ、Ｌ９１ Ｔｙｒ、Ｌ９３ Ｓｅｒ、Ｌ９４ Ｓｅｒ、Ｌ９５Ａ Ｓｅｒ、Ｌ９５Ｂ Ｇｌｙ、Ｌ９５Ｃ Ｓｅｒ、およびＬ９６ Ｇｌｙを含む。表２９Ｃを参照。
本発明の抗体またはその抗原結合断片は、本明細書に具体的に例示されている抗体とＴＦＰＩの同じエピトープまたはドメインに結合し得る。例えば、抗体またはその抗原結合断片は、ＴＦＰＩへのこれらの結合をＴＦＰＩ−２３もしくは生殖系列バリアント（例えば、ＴＦＰＩ−１０６およびＴＦＰＩ−１０７）のものと比較することによって、またはこれらの抗体の機能をＴＦＰＩ−２３およびそのバリアントと比較することによって、同定することができる。このような同定の目的に使用され得る分析およびアッセイとしては、ＴＦＰＩの結合についての競合を査定するアッセイがあり、実施例に例示されている。
一実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合断片は、本明細書に記載の抗体、例えば、ＴＦＰＩ−２３およびそのバリアントなどと同じエピトープまたは領域に結合することができる。これは、上述した特定のＴＦＰＩ残基と接触しているものを含み得る。例えば、本発明の抗体または抗原結合断片は、それがＡｓｐ１０２、Ｇｌｙ１０４、Ｉｌｅ１０５、Ｃｙｓ１０６、Ａｒｇ１０７、Ｇｌｙ１０８、Ａｒｇ１１２、Ｔｙｒ１２７、Ｇｌｙ１２９、Ｃｙｓ１３０、Ｌｅｕ１３１、Ｇｌｙ１３２、Ｍｅｔ１３４、Ｇｌｕ１３８（配列番号２の番号付けによる）、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される残基と接触している（４Å以内）やり方でＴＦＰＩに結合し得る。本発明の抗体または抗原結合断片は、Ａｓｐ１０２、Ｇｌｙ１０４、Ｉｌｅ１０５、Ｃｙｓ１０６、Ａｒｇ１０７、Ｇｌｙ１０８、Ａｒｇ１１２、Ｔｙｒ１２７、Ｇｌｙ１２９、Ｃｙｓ１３０、Ｌｅｕ１３１、Ｇｌｙ１３２、Ｍｅｔ１３４、Ｇｌｕ１３８（配列番号２の番号付けによる）、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される１個または複数の残基を含むエピトープと結合することができる場合がある。
抗体またはその抗原結合断片は、ＴＦＰＩ上の少なくとも１個のエピトープ残基（配列番号２による番号付け）から４．０Å以内である少なくとも１個のパラトープ残基（Ｋａｂａｔによる番号付け）を含むことができ、例えば：エピトープ残基１０２ Ａｓｐがパラトープ残基Ｈ５８ Ｔｙｒの４．０Å以内であり；エピトープ残基１０４ Ｇｌｙがパラトープ残基Ｈ５８ Ｔｙｒの４．０Å以内であり；エピトープ残基１０５ Ｉｌｅがパラトープ残基Ｈ３３ Ａｌａ、Ｈ５０ Ａｌａ、Ｈ５１ Ｉｌｅ、Ｈ５２ Ｓｅｒ、Ｈ５６ Ｓｅｒ、Ｈ５８ Ｔｙｒ、Ｈ９５ Ｌｅｕの４．０Å以内であり；エピトープ残基１０６ Ｃｙｓがパラトープ残基Ｈ１００ Ｌｅｕ、Ｈ１００Ａ Ｓｅｒの４．０Å以内であり；エピトープ残基１０７ Ａｒｇがパラトープ残基Ｈ９６ Ｇｌｙ、Ｈ９７ Ａｌａ、Ｈ９８ Ｔｈｒ、Ｈ９９ Ｓｅｒ、Ｈ１００ Ｌｅｕの４．０Å以内であり；エピトープ残基１０８ Ｇｌｙがパラトープ残基Ｈ１００ Ｌｅｕの４．０Å以内であり；エピトープ残基１１２ Ａｒｇがパラトープ残基Ｌ２９ Ａｌａ、Ｌ３１ Ｔｙｒの４．０Å以内であり；エピトープ残基１２７ Ｔｙｒがパラトープ残基Ｌ３１ Ｔｙｒの４．０Å以内であり；エピトープ残基１２９ Ｇｌｙがパラトープ残基Ｌ３１ Ｔｙｒの４．０Å以内であり；エピトープ残基１３０ Ｃｙｓがパラトープ残基Ｌ９１ Ｔｙｒ、Ｌ９５Ｂ Ｇｌｙの４．０Å以内であり；エピトープ残基１３１ Ｌｅｕがパラトープ残基Ｈ４７ Ｔｒｐ、Ｈ５０ Ａｌａ、Ｈ５８ Ｔｙｒ、Ｌ９５Ａ Ｓｅｒ、Ｌ９５Ｂ Ｇｌｙ、Ｌ９５Ｃ Ｓｅｒの４．０Å以内であり；エピトープ残基１３２ Ｇｌｙがパラトープ残基Ｈ５８ Ｔｙｒ、Ｌ９５Ａ Ｓｅｒの４．０Å以内であり；エピトープ残基１３４ Ｍｅｔがパラトープ残基Ｌ９５Ａ Ｓｅｒの４．０Å以内であり；エピトープ残基１３８ Ｇｌｕがパラトープ残基Ｌ２９ Ａｌａの４．０Å以内である。表２９Ａおよび２９Ｂを参照。
抗体またはその抗原結合断片は、ＴＦＰＩのエピトープ残基（配列番号２による番号付け）と水素結合を形成することができる少なくとも１個のパラトープ残基（Ｋａｂａｔによる番号付け）を含むことができ、例えば：エピトープ残基１０２ Ａｓｐがパラトープ残基Ｈ５８ Ｔｙｒと水素結合を形成することができ；エピトープ残基１０７ ＡｒｇがＨ９６ Ｇｌｙ、Ｈ９７ Ａｌａ、Ｈ９８ Ｔｈｒ、Ｈ９９ Ｓｅｒ、およびＨ１００ Ｌｅｕからなる群から選択される少なくとも１個のパラトープ残基と水素結合を形成することができ；エピトープ残基１１２ Ａｒｇがパラトープ残基Ｌ２９ Ａｌａと水素結合を形成することができ；エピトープ残基１２７ Ｔｙｒがパラトープ残基Ｌ３１ Ｔｙｒと水素結合を形成することができ；エピトープ残基１３１ Ｌｅｕがパラトープ残基Ｌ９５Ｂ Ｇｌｙと水素結合を形成することができる。表２９Ｂを参照。
抗体またはその抗原結合断片は、エピトープ残基（配列番号２による番号付け）との相互作用に起因するＢＳＡの非ゼロ変化を有する少なくとも１個のパラトープ残基（Ｋａｂａｔによる番号付け）を含むこともでき、例えば：エピトープ残基１０２ Ａｓｐがパラトープ残基Ｈ５８ Ｔｙｒと相互作用し；エピトープ残基１０４ Ｇｌｙがパラトープ残基Ｈ５８ Ｔｙｒと相互作用し；エピトープ残基１０５ ＩｌｅがＨ３３ Ａｌａ、Ｈ３４ Ｍｅｔ、Ｈ５０ Ａｌａ、Ｈ５１ Ｉｌｅ、Ｈ５２ Ｓｅｒ、Ｈ５６ Ｓｅｒ、Ｈ５８ Ｔｙｒ、およびＨ９５ Ｌｅｕからなる群から選択される少なくとも１個のパラトープ残基と相互作用し；エピトープ残基１０６ ＣｙｓがＨ９５ Ｌｅｕ、Ｈ１００ Ｌｅｕ、Ｈ１００Ａ Ｓｅｒ、およびＬ９１ Ｔｙｒからなる群から選択される少なくとも１個のパラトープ残基と相互作用し；エピトープ残基１０７ ＡｒｇがＨ９６ Ｇｌｙ、Ｈ９７ Ａｌａ、Ｈ９８ Ｔｈｒ、Ｈ９９ Ｓｅｒ、およびＨ１００ Ｌｅｕからなる群から選択される少なくとも１個のパラトープ残基と相互作用し；エピトープ残基１０８ Ｇｌｙがパラトープ残基Ｈ１００ Ｌｅｕと相互作用し；エピトープ残基１１２ ＡｒｇがＬ２９ Ａｌａ、Ｌ３１ Ｔｙｒ、およびＬ９３ Ｓｅｒからなる群から選択される少なくとも１個のパラトープ残基と相互作用し；エピトープ残基１２７ ＴｙｒがＬ３１ ＴｙｒおよびＬ９５Ｂ Ｇｌｙからなる群から選択される少なくとも１個のパラトープ残基と相互作用し；エピトープ残基１２９ ＧｌｙがＨ１００Ａ Ｓｅｒ、Ｌ３１ Ｔｙｒ、およびＬ９１ Ｔｙｒからなる群から選択される少なくとも１個のパラトープ残基と相互作用し；エピトープ残基１３０ ＣｙｓがＨ９５ Ｌｅｕ、Ｈ１００Ａ Ｓｅｒ、Ｌ３１ Ｔｙｒ、Ｌ９１ Ｔｙｒ、およびＬ９５Ｂ Ｇｌｙからなる群から選択される少なくとも１個のパラトープ残基と相互作用し；エピトープ残基１３１ ＬｅｕがＨ４７ Ｔｒｐ、Ｈ５０ Ａｌａ、Ｈ５８ Ｔｙｒ、Ｈ９５ Ｌｅｕ、Ｌ３１ Ｔｙｒ、Ｌ９１ Ｔｙｒ、Ｌ９５Ａ Ｓｅｒ、Ｌ９５Ｂ Ｇｌｙ、Ｌ９５Ｃ Ｓｅｒ、およびＬ９６ Ｇｌｙからなる群から選択される少なくとも１個のパラトープ残基と相互作用し；エピトープ残基１３２ ＧｌｙがＨ５８ ＴｙｒおよびＬ９５Ａ Ｓｅｒからなる群から選択される少なくとも１個のパラトープ残基と相互作用し；エピトープ残基１３３ Ａｓｎがパラトープ残基Ｌ９５Ａ Ｓｅｒと相互作用し；エピトープ残基１３４ ＭｅｔがＬ９３ Ｓｅｒ、Ｌ９４ Ｓｅｒ、およびＬ９５Ａ Ｓｅｒからなる群から選択される少なくとも１個のパラトープ残基と相互作用し；エピトープ残基１３８ ＧｌｕがＬ２８ Ｇｌｙ、Ｌ２９ Ａｌａ、およびＬ９３ Ｓｅｒからなる群から選択される少なくとも１個のパラトープ残基と相互作用する。
本発明の抗体またはその抗原結合断片は、上記に列挙した少なくとも１個のエピトープ残基と相互作用する上記のパラトープ残基のいずれかを含む任意の抗体または抗原結合断片であり得る。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の抗体またはその抗原結合断片は、上述したパラトープ残基の少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、もしくはすべて、または上述したパラトープ残基の様々なカテゴリーの任意の組合せを含む。さらに、保存的置換がこれらのパラトープ残基に導入されてもよい。例えば、抗体またはその抗原結合性断片は、表３４による１、２、３、４、５、６、７、または８個の保存的置換を含み得る。
Figure 2020096627
本発明の抗体は、別の抗体と本明細書に記載のＴＦＰＩへの結合を競合する能力を有し得る。例えば、本発明の抗体は、本明細書に記載のＴＦＰＩ−２３およびそのバリアントと、ＴＦＰＩへの、またはＴＦＰＩ−２３抗体によって結合されているＴＦＰＩの適切な断片もしくはバリアントへの結合を交差競合し得る。このような交差競合抗体は、標準的な結合アッセイにおいて例示された本発明の抗体と交差競合するこれらの能力に基づいて同定することができる。例えば、ＳＰＲ（例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）システムを使用することによる）、ＥＬＩＳＡアッセイ、またはフローサイトメトリーを使用して交差競合を実証することができる。このような交差競合は、２つの抗体が同一の、重複する、または同様のエピトープに結合することを示唆し得る。
したがって、本発明の抗体は、試験抗体が例示された本発明の抗体（本明細書に記載のＴＦＰＩ−２３、またはその任意のバリアントもしくは断片など）と標的分子の結合部位を競合することができるか否かを査定する結合アッセイを含む方法により同定することができる。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の抗体またはその抗原結合断片は、以下の重鎖ＣＤＲ配列：（ｉ）配列番号３８を含むＣＤＲ−Ｈ１、配列番号３９を含むＣＤＲ−Ｈ２、配列番号４０を含むＣＤＲ−Ｈ３、ならびに／または（ｉｉ）以下の軽鎖ＣＤＲ配列：配列番号３３を含むＣＤＲ−Ｌ１、配列番号３４を含むＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号３５を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む。ある特定の実施形態では、本明細書に記載の抗体またはその抗原結合断片は、以下の重鎖ＣＤＲ配列：（ｉ）配列番号３８と少なくとも８５％、少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％同一のＣＤＲ−Ｈ１、配列番号３９と少なくとも８５％、少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％同一のＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号４０と少なくとも８５％、少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％同一のＣＤＲ−Ｈ３、ならびに／または（ｉｉ）以下の軽鎖ＣＤＲ配列：配列番号３３と少なくとも８５％、少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％同一のＣＤＲ−Ｌ１、配列番号３４と少なくとも８５％、少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％同一のＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号３５と少なくとも８５％、少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％同一のＣＤＲ−Ｌ３を含む。ある特定の実施形態では、それぞれ配列番号３８、３９、４０、３３、３４、および３５と比べて１０個以下、９個以下、８個以下、７個以下、６個以下、５個以下、４個以下、３個以下、２個以下、または１個以下の置換が各ＣＤＲ中に行われる。ある特定の実施形態では、置換は、表３４による保存的置換である。ある特定の実施形態では、置換は、表２９Ａ、列４、列５、または列６によるものである。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の抗体またはその抗原結合断片は、ヒトフレームワーク配列を含む。例えば、重鎖フレームワーク配列は、ヒトＶＨ３生殖系列、ＶＨ１生殖系列、ＶＨ５生殖系列、またはＶＨ４生殖系列由来であり得る。好適なヒト生殖系列重鎖フレームワークは、ＶＨ１、ＶＨ３、またはＶＨ５生殖系列に由来するフレームワークである。例えば、以下の生殖系列由来のＶＨフレームワークを使用することができる：ＩＧＨＶ３−２３、ＩＧＨＶ３−７、またはＩＧＨＶ１−６９（生殖系列の名称は、ＩＭＧＴ生殖系列定義に基づく）。好適なヒト生殖系列軽鎖フレームワークは、ＶΚまたはＶλ生殖系列に由来するフレームワークである。例えば、以下の生殖系列由来のＶＬフレームワークを使用することができる：ＩＧＫＶ１−３９またはＩＧＫＶ３−２０（生殖系列の名称は、ＩＭＧＴ生殖系列定義に基づく）。代替としてまたは追加的に、フレームワーク配列は、ヒト生殖系列コンセンサスフレームワーク配列、例えば、ヒトＶλ１コンセンサス配列、ＶΚ１コンセンサス配列、ＶΚ２コンセンサス配列、ＶΚ３コンセンサス配列、ＶＨ３生殖系列コンセンサス配列、ＶＨ１生殖系列コンセンサス配列、ＶＨ５生殖系列コンセンサス配列、またはＶＨ４生殖系列コンセンサス配列のフレームワークなどであり得る。
ヒト生殖系列フレームワークの配列は、様々な公共データベース、例えば、Ｖ−ｂａｓｅ、ＩＭＧＴ、ＮＣＢＩ、またはＡｂｙｓｉｓなどから入手可能である。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の抗体またはその抗原結合断片は、（ｉ）配列番号４１、６３、および６５からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一のアミノ酸配列を含むＶＨ、および／または（ｉｉ）配列番号３６と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。これらのＶＬおよびＶＨ配列の任意の組合せも、本発明によって包含されている。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の抗体またはその抗原結合断片は、（ｉ）配列番号２０と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一のアミノ酸配列を含むＣＨ、および／または（ｉｉ）配列番号２６と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一のアミノ酸配列を含むＣＬを含む。これらのＣＨおよびＣＬ配列の任意の組合せも、本発明によって包含されている。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の抗体またはその抗原結合断片は、Ｆｃドメインを含む。Ｆｃドメインは、ＩｇＡ（例えば、ＩｇＡ１もしくはＩｇＡ２）、ＩｇＧ、ＩｇＥ、またはＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、もしくはＩｇＧ４）に由来し得る。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の抗体またはその抗原結合断片は、（ｉ）配列番号４２、配列番号６４、もしくは配列番号６６と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一のアミノ酸配列を含む重鎖、および／または（ｉｉ）配列番号３７と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。これらの重鎖および軽鎖配列の任意の組合せも、本発明によって包含されている。
ＴＦＰＩ−２４およびバリアント
共結晶構造は、ＴＦＰＩ−２４（およびそのバリアント）がＴＦＰＩ−２３といくつかのエピトープ残基を共有することを示す。これらの中で、Ｉｌｅ１０５、Ａｒｇ１０７、およびＬｅｕ１３１（配列番号２に示したヒトＴＦＰＩの番号付けによる）が抗体−抗原相互作用に重要であると考えられている。他の共有されるエピトープ残基としては、Ｃｙｓ１０６、Ｇｌｙ１０８、Ｃ１３０、Ｌ１３１、およびＧ１３２（配列番号２の番号付けによる）がある。
ＴＦＰＩ−２４（およびそのバリアント）に特異的であるエピトープ残基としては、Ｇｌｕ１００、Ｇｌｕ１０１、Ａｓｐ１０２、Ｇｌｙ１０４、およびＴｙｒ１０９がある。ＴＦＰＩ−２３およびそのバリアントは、これらの残基に結合しない。表２７を参照。したがって、本発明は、ＴＦＰＩのＫ２中のエピトープに特異的に結合する単離抗体またはその抗原結合断片であって、エピトープは、（ｉ）残基Ｉｌｅ１０５、Ａｒｇ１０７、およびＬｅｕ１３１を含み、（ｉｉ）Ｃｙｓ１０６、Ｇｌｙ１０８、Ｃｙｓ１３０、Ｌｅｕ１３１、およびＧｌｙ１３２からなる群から選択される１個または複数の残基を含んでもよく、（ｉｉｉ）Ｇｌｕ１００、Ｇｌｕ１０１、Ａｓｐ１０２、Ｇｌｙ１０４、およびＴｙｒ１０９（配列番号２の番号付けによる）からなる群から選択される１個または複数の残基をさらに含んでもよい、単離抗体またはその抗原結合断片を提供する。
ある特定の実施形態では、エピトープは、Ｐ１０３、Ｔ１１１、Ｙ１１３、Ｆ１１４、Ｎ１１６、Ｑ１１８、Ｑ１２１、Ｃ１２２、Ｅ１２３、Ｒ１２４、Ｆ１２５、Ｋ１２６、Ｌ１４０（配列番号２による番号付け）、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される１個または複数の残基を含まない。表２７を参照。ＷＯ２０１００７２６９（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ）によれば、参照抗体４Ｆ３６は、Ｐ１０３、Ｔ１１１、Ｙ１１３、Ｆ１１４、Ｎ１１６、Ｑ１１８、Ｑ１２１、Ｃ１２２、Ｅ１２３、Ｒ１２４、Ｆ１２５、Ｋ１２６、およびＬ１４０を含むエピトープを認識する。
ある特定の実施形態では、エピトープは、Ｄ３１、Ｄ３２、Ｐ３４、Ｃ３５、Ｋ３６、Ｐ１０３、Ｋ１２６、Ｙ１２７、Ｇ１２８（配列番号２による番号付け）、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される１個または複数の残基を含まない。表２７を参照。表２７によれば、参照抗体２Ａ８および２Ａ８−２００は、Ｄ３１、Ｄ３２、Ｐ３４、Ｃ３５、Ｋ３６、Ｐ１０３、Ｋ１２６、Ｙ１２７、およびＧ１２８を含むエピトープを認識する。
ＴＦＰＩ−２４由来のパラトープ残基（ＢＳＡに基づく）も特徴付けられており（表２４を参照）、以下：Ｈ３３ Ａｌａ、Ｈ３５ Ｇｌｎ、Ｈ５２ Ｓｅｒ、Ｈ５３ Ａｓｎ、Ｈ５５ Ａｒｇ、Ｈ５６ Ｓｅｒ、Ｈ９５ Ｐｈｅ、Ｈ９６ Ｌｅｕ、Ｈ９７ Ｈｉｓ、Ｈ９９ Ｓｅｒ、Ｈ１０１ Ａｓｐ、Ｌ３１ Ｍｅｔ、Ｌ３２ Ｔｙｒ、Ｌ３４ Ｈｉｓ、Ｌ３６ Ｔｙｒ、Ｌ５０ Ａｒｇ、Ｌ９１ Ｔｒｐ、およびＬ９６ Ｔｙｒを含む。ある特定の実施形態では、本明細書に記載の抗体またはその抗原結合断片は、これらのパラトープ残基の少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、またはすべてを含む。さらに、保存的置換がこれらのパラトープ残基に導入されてもよい。例えば、抗体またはその抗原結合性断片は、１、２、３、４、５、６、７、または８個の表３４による保存的置換を含み得る。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の抗体またはその抗原結合断片は、以下の重鎖ＣＤＲ配列（ｉ）配列番号４８を含むＣＤＲ−Ｈ１、配列番号４９を含むＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号５０を含むＣＤＲ−Ｈ３、ならびに／または（ｉｉ）以下の軽鎖ＣＤＲ配列：配列番号４３を含むＣＤＲ−Ｌ１、配列番号４４を含むＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号４５を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む。ある特定の実施形態では、本明細書に記載の抗体またはその抗原結合断片は、以下の重鎖ＣＤＲ配列：（ｉ）配列番号４８と少なくとも８５％、少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％同一のＣＤＲ−Ｈ１、配列番号４９と少なくとも８５％、少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％同一のＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号５０と少なくとも８５％、少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％同一のＣＤＲ−Ｈ３、ならびに／または（ｉｉ）以下の軽鎖ＣＤＲ配列：配列番号４３と少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％同一のＣＤＲ−Ｌ１、配列番号４４と少なくとも８５％、少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％同一のＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号４５と少なくとも８５％、少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％同一のＣＤＲ−Ｌ３を含む。ある特定の実施形態では、それぞれ配列番号４８、４９、５０、４３、４４、および４５と比べて１０個以下、９個以下、８個以下、７個以下、６個以下、５個以下、４個以下、３個以下、２個以下、または１個以下の置換が各ＣＤＲ中に行われる。ある特定の実施形態では、置換は、表３４による保存的置換である。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の抗体またはその抗原結合断片は、ヒトフレームワーク配列を含む。例えば、重鎖フレームワーク配列は、上述したヒトＶＨ３生殖系列、ＶＨ１生殖系列、ＶＨ５生殖系列、またはＶＨ４生殖系列由来であり得る。好適なヒト生殖系列軽鎖フレームワークは、上述したＶΚまたはＶλ生殖系列に由来するフレームワークである。コンセンサスヒト生殖系列フレームワーク配列も上述した通り使用することができる。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の抗体またはその抗原結合断片は、（ｉ）配列番号６７、６９、５１、および７９からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一のアミノ酸配列を含むＶＨ、および／または（ｉｉ）配列番号４６、７１、７３、７５、および７７からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。これらのＶＬおよびＶＨ配列の任意の組合せも、本発明によって包含されている。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の抗体またはその抗原結合断片は、（ｉ）配列番号２０と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一のアミノ酸配列を含むＣＨ、および／または（ｉｉ）配列番号２６と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一のアミノ酸配列を含むＣＬを含む。これらのＣＨおよびＣＬ配列の任意の組合せも、本発明によって包含されている。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の抗体またはその抗原結合断片は、Ｆｃドメインを含む。Ｆｃドメインは、ＩｇＡ（例えば、ＩｇＡ１もしくはＩｇＡ２）、ＩｇＧ、ＩｇＥ、またはＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、もしくはＩｇＧ４）に由来し得る。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の抗体またはその抗原結合断片は、（ｉ）配列番号５２、配列番号６８、配列番号７０、もしくは配列番号８０と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一のアミノ酸配列を含む重鎖、および／または（ｉｉ）配列番号４７、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、もしくは配列番号７８と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。これらの重鎖および軽鎖配列の任意の組合せも、本発明によって包含されている。
４Ｄ８およびバリアント
共結晶構造は、抗体４Ｄ８およびバリアントについてのエピトープおよびパラトープ情報も明らかにする。４Ｄ８およびそのバリアントのエピトープ残基としては、配列番号２の番号付けによるＧｌｕ１０１、Ｐｒｏ１０３、Ｔｙｒ１０９、Ｔｈｒ１１１、Ｓｅｒ１１９、Ｇｌｎ１２１、Ｇｌｕ１２３、Ａｒｇ１２４、Ｌｙｓ１２６、およびＬｅｕ１４０がある。
ある特定の実施形態では、エピトープは、Ｅ１００、Ｄ１０２、Ｒ１０７、Ｙ１１３、Ｆ１１４、Ｎ１１６、Ｑ１１８、Ｃ１２２（配列番号２による番号付け）、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される１個または複数の残基を含まない。表２７を参照。ＷＯ２０１００７２６９（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ）によれば、参照抗体４Ｆ３６は、Ｅ１００、Ｄ１０２、Ｒ１０７、Ｙ１１３、Ｆ１１４、Ｎ１１６、Ｑ１１８、およびＣ１２２を含むエピトープを認識する。
ある特定の実施形態では、エピトープは、Ｄ３１、Ｄ３２、Ｐ３４、Ｃ３５、Ｋ３６、Ｅ１００、Ｉ１０５、Ｒ１０７、Ｇ１０８、Ｙ１２７、Ｇ１２８（配列番号２による番号付け）、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される１個または複数の残基を含まない。表２７を参照。表２７によれば、参照抗体２Ａ８および２Ａ８−２００は、Ｄ３１、Ｄ３２、Ｐ３４、Ｃ３５、Ｋ３６、Ｅ１００、Ｉ１０５、Ｒ１０７、Ｇ１０８、Ｙ１２７、およびＧ１２８を含むエピトープを認識する。
４Ｄ８由来のパラトープ残基（ＢＳＡに基づく）も特徴付けられており（表２０を参照）、以下：Ｈ５０ Ａｓｐ、Ｈ５７ Ｔｈｒ、Ｈ５８ Ｌｅｕ、Ｈ５９ Ｔｙｒ、Ｈ６１ Ｇｌｎ、Ｈ９８ Ａｓｐ、Ｈ９９ Ｔｙｒ、Ｈ１００ Ａｓｐ、Ｌ３０ Ｈｉｓ、Ｌ５０ Ｔｒｐ、Ｌ９２ Ｔｙｒ、Ｌ９３ Ｔｈｒ、Ｌ９４ Ｔｈｒ、およびＬ９６ Ｔｙｒを含む。ある特定の実施形態では、本明細書に記載の抗体またはその抗原結合断片は、これらのパラトープ残基の少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、またはすべてを含む。さらに、保存的置換がこれらのパラトープ残基を導入されてもよい。例えば、抗体またはその抗原結合性断片は、表３４による１、２、３、４、５、６、７、または８個の保存的置換を含み得る。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の抗体またはその抗原結合断片は、以下の重鎖ＣＤＲ配列：（ｉ）配列番号８７を含むＣＤＲ−Ｈ１、配列番号８８を含むＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号８９を含むＣＤＲ−Ｈ３、ならびに／または（ｉｉ）以下の軽鎖ＣＤＲ配列：配列番号８１を含むＣＤＲ−Ｌ１、配列番号８２を含むＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号８３を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む。ある特定の実施形態では、本明細書に記載の抗体またはその抗原結合断片は、以下の重鎖ＣＤＲ配列：（ｉ）配列番号８７と少なくとも８５％、少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％同一のＣＤＲ−Ｈ１、配列番号８８と少なくとも８５％、少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％同一のＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号８９と少なくとも８５％、少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％同一のＣＤＲ−Ｈ３、ならびに／または（ｉｉ）以下の軽鎖ＣＤＲ配列：配列番号８１と少なくとも８５％、少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％同一のＣＤＲ−Ｌ１、配列番号８２と少なくとも８５％、少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％同一のＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号８３と少なくとも８５％、少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％同一のＣＤＲ−Ｌ３を含む。ある特定の実施形態では、それぞれ配列番号８７、８８、８９、８１、８２、および８３と比べて１０個以下、９個以下、８個以下、７個以下、６個以下、５個以下、４個以下、３個以下、２個以下、または１個以下の置換が各ＣＤＲ中に行われる。ある特定の実施形態では、置換は、表３４による保存的置換である。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の抗体またはその抗原結合断片は、ヒトフレームワーク配列を含む。例えば、重鎖フレームワーク配列は、上述したヒトＶＨ３生殖系列、ＶＨ１生殖系列、ＶＨ５生殖系列、またはＶＨ４生殖系列由来であり得る。好適なヒト生殖系列軽鎖フレームワークは、上述したＶΚまたはＶλ生殖系列に由来するフレームワークである。コンセンサスヒト生殖系列フレームワーク配列も上述した通り使用することができる。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の抗体またはその抗原結合断片は、（ｉ）配列番号９０、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、および１０７からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一のアミノ酸配列を含むＶＨ、および／または（ｉｉ）配列番号８４、１０９、および１１１からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。これらのＶＬおよびＶＨ配列の任意の組合せも、本発明によって包含されている。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の抗体またはその抗原結合断片は、（ｉ）配列番号２０と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一のアミノ酸配列を含むＣＨ、および／または（ｉｉ）配列番号９１もしくは配列番号８５と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一のアミノ酸配列を含むＣＬを含む。これらのＣＨおよびＣＬ配列の任意の組合せも、本発明によって包含されている。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の抗体またはその抗原結合断片は、Ｆｃドメインを含む。Ｆｃドメインは、ＩｇＡ（例えば、ＩｇＡ１もしくはＩｇＡ２）、ＩｇＧ、ＩｇＥ、またはＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、もしくはＩｇＧ４）に由来し得る。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の抗体またはその抗原結合断片は、（ｉ）配列番号９２、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０８と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一のアミノ酸配列を含む重鎖、および／または（ｉｉ）配列番号８６、配列番号９３、配列番号１１０、もしくは配列番号１１２と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。これらの重鎖および軽鎖配列の任意の組合せも、本発明によって包含されている。
ＴＦＰＩ−３およびバリアント
ＴＦＰＩ−３およびそのバリアントも本明細書に提供されている。したがって、ＴＦＰＩ−３に基づく抗体またはその抗原結合断片は、以下の重鎖ＣＤＲ配列：（ｉ）配列番号１６を含むＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１７を含むＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号１８を含むＣＤＲ−Ｈ３、ならびに／または（ｉｉ）以下の軽鎖ＣＤＲ配列：配列番号１０を含むＣＤＲ−Ｌ１、配列番号１１を含むＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号１２を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む。ある特定の実施形態では、本明細書に記載の抗体またはその抗原結合断片は、以下の重鎖ＣＤＲ配列：（ｉ）配列番号１６と少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％同一のＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１７と少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％同一のＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号１８と少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％同一のＣＤＲ−Ｈ３、ならびに／または（ｉｉ）以下の軽鎖ＣＤＲ配列：配列番号１０と少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％同一のＣＤＲ−Ｌ１、配列番号１１と少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％同一のＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号１２と少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％同一のＣＤＲ−Ｌ３を含む。ある特定の実施形態では、それぞれ配列番号１６、１７、１８、１０、１１、および１２と比べて１０個以下、９個以下、８個以下、７個以下、６個以下、５個以下、４個以下、３個以下、２個以下、または１個以下の置換が各ＣＤＲ中に行われる。ある特定の実施形態では、置換は、表３４による保存的置換である。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の抗体またはその抗原結合断片は、ヒトフレームワーク配列を含む。例えば、重鎖フレームワーク配列は、上述したヒトＶＨ３生殖系列、ＶＨ１生殖系列、ＶＨ５生殖系列、またはＶＨ４生殖系列由来であり得る。好適なヒト生殖系列軽鎖フレームワークは、上述したＶΚまたはＶλ生殖系列に由来するフレームワークである。コンセンサスヒト生殖系列フレームワーク配列も上述した通り使用することができる。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の抗体またはその抗原結合断片は、（ｉ）配列番号１９と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一のアミノ酸配列を含むＶＨ、および／または（ｉｉ）配列番号１３と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。これらのＶＬおよびＶＨ配列の任意の組合せも、本発明によって包含されている。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の抗体またはその抗原結合断片は、（ｉ）配列番号２０と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一のアミノ酸配列を含むＣＨ、および／または（ｉｉ）配列番号９１もしくは配列番号１４と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一のアミノ酸配列を含むＣＬを含む。これらのＣＨおよびＣＬ配列の任意の組合せも、本発明によって包含されている。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の抗体またはその抗原結合断片は、Ｆｃドメインを含む。Ｆｃドメインは、ＩｇＡ（例えば、ＩｇＡ１もしくはＩｇＡ２）、ＩｇＧ、ＩｇＥ、またはＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、もしくはＩｇＧ４）に由来し得る。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の抗体またはその抗原結合断片は、（ｉ）配列番号２１と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一のアミノ酸配列を含む重鎖、および／または（ｉｉ）配列番号１５と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。これらの重鎖および軽鎖配列の任意の組合せも、本発明によって包含されている。
ＴＦＰＩ−２１およびバリアント
ＴＦＰＩ−２１およびそのバリアントも本明細書に提供されている。したがって、ＴＦＰＩ−２１に基づく抗体またはその抗原結合断片は、以下の重鎖ＣＤＲ配列：（ｉ）配列番号２８を含むＣＤＲ−Ｈ１、配列番号２９を含むＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号３０を含むＣＤＲ−Ｈ３、ならびに／または（ｉｉ）以下の軽鎖ＣＤＲ配列：配列番号２２を含むＣＤＲ−Ｌ１、配列番号２３を含むＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号２４を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む。ある特定の実施形態では、本明細書に記載の抗体またはその抗原結合断片は、以下の重鎖ＣＤＲ配列：（ｉ）配列番号２８と少なくとも８５％、少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％同一のＣＤＲ−Ｈ１、配列番号２９と少なくとも８５％、少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％同一のＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号３０と少なくとも８５％、少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％同一のＣＤＲ−Ｈ３、ならびに／または（ｉｉ）以下の軽鎖ＣＤＲ配列：配列番号２２と少なくとも８５％、少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％同一のＣＤＲ−Ｌ１、配列番号２３と少なくとも８５％、少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％同一のＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号２４と少なくとも８５％、少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％同一のＣＤＲ−Ｌ３を含む。ある特定の実施形態では、それぞれ配列番号２８、２９、３０、２２、２３、および２４と比べて１０個以下、９個以下、８個以下、７個以下、６個以下、５個以下、４個以下、３個以下、２個以下、または１個以下の置換が各ＣＤＲ中に行われる。ある特定の実施形態では、置換は、表３４による保存的置換である。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の抗体またはその抗原結合断片は、ヒトフレームワーク配列を含む。例えば、重鎖フレームワーク配列は、上述したヒトＶＨ３生殖系列、ＶＨ１生殖系列、ＶＨ５生殖系列、またはＶＨ４生殖系列由来であり得る。好適なヒト生殖系列軽鎖フレームワークは、上述したＶΚまたはＶλ生殖系列に由来するフレームワークである。コンセンサスヒト生殖系列フレームワーク配列も上述した通り使用することができる。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の抗体またはその抗原結合断片は、（ｉ）配列番号３１と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一のアミノ酸配列を含むＶＨ、および／または（ｉｉ）配列番号２５と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。これらのＶＬおよびＶＨ配列の任意の組合せも、本発明によって包含されている。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の抗体またはその抗原結合断片は、（ｉ）配列番号２０と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一のアミノ酸配列を含むＣＨ、および／または（ｉｉ）配列番号９１もしくは配列番号２６と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一のアミノ酸配列を含むＣＬを含む。これらのＣＨおよびＣＬ配列の任意の組合せも、本発明によって包含されている。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の抗体またはその抗原結合断片は、Ｆｃドメインを含む。Ｆｃドメインは、ＩｇＡ（例えば、ＩｇＡ１もしくはＩｇＡ２）、ＩｇＧ、ＩｇＥ、またはＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、もしくはＩｇＧ４）に由来し得る。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の抗体またはその抗原結合断片は、（ｉ）配列番号３２と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一のアミノ酸配列を含む重鎖、および／または（ｉｉ）配列番号２７と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。これらの重鎖および軽鎖配列の任意の組合せも、本発明によって包含されている。
ＴＦＰＩ−２６およびバリアント
ＴＦＰＩ−２６およびそのバリアントも本明細書に提供されている。したがって、ＴＦＰＩ−２６に基づく抗体またはその抗原結合断片は、以下の重鎖ＣＤＲ配列：（ｉ）配列番号５８を含むＣＤＲ−Ｈ１、配列番号５９を含むＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号６０を含むＣＤＲ−Ｈ３、ならびに／または（ｉｉ）以下の軽鎖ＣＤＲ配列：配列番号５３を含むＣＤＲ−Ｌ１、配列番号５４を含むＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号５５を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む。ある特定の実施形態では、本明細書に記載の抗体またはその抗原結合断片は、以下の重鎖ＣＤＲ配列：（ｉ）配列番号５８と少なくとも８５％、少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％同一のＣＤＲ−Ｈ１、配列番号５９と少なくとも８５％、少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％同一のＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号６０と少なくとも８５％、少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％同一のＣＤＲ−Ｈ３、ならびに／または（ｉｉ）以下の軽鎖ＣＤＲ配列：配列番号５３と少なくとも８５％、少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％同一のＣＤＲ−Ｌ１、配列番号５４と少なくとも８５％、少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％同一のＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号５５と少なくとも８５％、少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％同一のＣＤＲ−Ｌ３を含む。ある特定の実施形態では、それぞれ配列番号５８、５９、６０、５３、５４、および５５と比べて１０個以下、９個以下、８個以下、７個以下、６個以下、５個以下、４個以下、３個以下、２個以下、または１個以下の置換が各ＣＤＲ中に行われる。ある特定の実施形態では、置換は、表３４による保存的置換である。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の抗体またはその抗原結合断片は、ヒトフレームワーク配列を含む。例えば、重鎖フレームワーク配列は、上述したヒトＶＨ３生殖系列、ＶＨ１生殖系列、ＶＨ５生殖系列、またはＶＨ４生殖系列由来であり得る。好適なヒト生殖系列軽鎖フレームワークは、上述したＶΚまたはＶλ生殖系列に由来するフレームワークである。コンセンサスヒト生殖系列フレームワーク配列も上述した通り使用することができる。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の抗体またはその抗原結合断片は、（ｉ）配列番号６１と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一のアミノ酸配列を含むＶＨ、および／または（ｉｉ）配列番号５６と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。これらのＶＬおよびＶＨ配列の任意の組合せも、本発明によって包含されている。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の抗体またはその抗原結合断片は、（ｉ）配列番号２０と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一のアミノ酸配列を含むＣＨ、および／または（ｉｉ）配列番号２６と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一のアミノ酸配列を含むＣＬを含む。これらのＣＨおよびＣＬ配列の任意の組合せも、本発明によって包含されている。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の抗体またはその抗原結合断片は、Ｆｃドメインを含む。Ｆｃドメインは、ＩｇＡ（例えば、ＩｇＡ１もしくはＩｇＡ２）、ＩｇＧ、ＩｇＥ、またはＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、もしくはＩｇＧ４）に由来し得る。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の抗体またはその抗原結合断片は、（ｉ）配列番号６２と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一のアミノ酸配列を含む重鎖、および／または（ｉｉ）配列番号５７と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。これらの重鎖および軽鎖配列の任意の組合せも、本発明によって包含されている。
６Ｂ７．ｃ５およびバリアント
６Ｂ７．ｃ５およびそのバリアントも本明細書に提供されている。したがって、６Ｂ７．ｃ５に基づく抗体またはその抗原結合断片は、以下の重鎖ＣＤＲ配列：（ｉ）配列番号１１８を含むＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１１９を含むＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号１２０を含むＣＤＲ−Ｈ３、ならびに／または（ｉｉ）以下の軽鎖ＣＤＲ配列：配列番号１１３を含むＣＤＲ−Ｌ１、配列番号１１４を含むＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号１１５を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む。ある特定の実施形態では、本明細書に記載の抗体またはその抗原結合断片は、以下の重鎖ＣＤＲ配列：（ｉ）配列番号１１８と少なくとも８５％、少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％同一のＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１１９と少なくとも８５％、少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％同一のＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号１２０と少なくとも８５％、少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％同一のＣＤＲ−Ｈ３、ならびに／または（ｉｉ）以下の軽鎖ＣＤＲ配列：配列番号１１３と少なくとも８５％、少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％同一のＣＤＲ−Ｌ１、配列番号１１４と少なくとも８５％、少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％同一のＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号１１５と少なくとも８５％、少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％同一のＣＤＲ−Ｌ３を含む。ある特定の実施形態では、それぞれ配列番号１１８、１１９、１２０、１１３、１１４、および１１５と比べて１０個以下、９個以下、８個以下、７個以下、６個以下、５個以下、４個以下、３個以下、２個以下、または１個以下の置換が各ＣＤＲ中に行われる。ある特定の実施形態では、置換は、表３４による保存的置換である。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の抗体またはその抗原結合断片は、ヒトフレームワーク配列を含む。例えば、重鎖フレームワーク配列は、上述したヒトＶＨ３生殖系列、ＶＨ１生殖系列、ＶＨ５生殖系列、またはＶＨ４生殖系列由来であり得る。好適なヒト生殖系列軽鎖フレームワークは、上述したＶΚまたはＶλ生殖系列に由来するフレームワークである。コンセンサスヒト生殖系列フレームワーク配列も上述した通り使用することができる。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の抗体またはその抗原結合断片は、（ｉ）配列番号１２１と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一のアミノ酸配列を含むＶＨ、および／または（ｉｉ）配列番号１１６と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。これらのＶＬおよびＶＨ配列の任意の組合せも、本発明によって包含されている。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の抗体またはその抗原結合断片は、（ｉ）配列番号９１と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一のアミノ酸配列を含むＣＨ、および／または（ｉｉ）配列番号９１もしくは配列番号８５と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一のアミノ酸配列を含むＣＬを含む。これらのＣＨおよびＣＬ配列の任意の組合せも、本発明によって包含されている。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の抗体またはその抗原結合断片は、Ｆｃドメインを含む。Ｆｃドメインは、ＩｇＡ（例えば、ＩｇＡ１もしくはＩｇＡ２）、ＩｇＧ、ＩｇＥ、またはＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、もしくはＩｇＧ４）に由来し得る。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の抗体またはその抗原結合断片は、（ｉ）配列番号１２２と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一のアミノ酸配列を含む重鎖、および／または（ｉｉ）配列番号１１７と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。これらの重鎖および軽鎖配列の任意の組合せも、本発明によって包含されている。
７Ａ４．Ｄ９およびバリアント
７Ａ４．Ｄ９およびそのバリアントも本明細書に提供されている。したがって、７Ａ４．Ｄ９に基づく抗体またはその抗原結合断片は、以下の重鎖ＣＤＲ配列：（ｉ）配列番号１２８を含むＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１２９を含むＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号１３０を含むＣＤＲ−Ｈ３、ならびに／または（ｉｉ）以下の軽鎖ＣＤＲ配列：配列番号１２３を含むＣＤＲ−Ｌ１、配列番号１２４を含むＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号１２５を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む。ある特定の実施形態では、本明細書に記載の抗体またはその抗原結合断片は、以下の重鎖ＣＤＲ配列：（ｉ）配列番号１２８と少なくとも８５％、少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％同一のＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１２９と少なくとも８５％、少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％同一のＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号１３０と少なくとも８５％、少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％同一のＣＤＲ−Ｈ３、ならびに／または（ｉｉ）以下の軽鎖ＣＤＲ配列：配列番号１２３と少なくとも８５％、少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％同一のＣＤＲ−Ｌ１、配列番号１２４と少なくとも８５％、少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％同一のＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号１２５と少なくとも８５％、少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％同一のＣＤＲ−Ｌ３を含む。ある特定の実施形態では、それぞれ配列番号１２８、１２９、１３０、１２３、１２４、および１２５と比べて１０個以下、９個以下、８個以下、７個以下、６個以下、５個以下、４個以下、３個以下、２個以下、または１個以下の置換が各ＣＤＲ中に行われる。ある特定の実施形態では、置換は、表３４による保存的置換である。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の抗体またはその抗原結合断片は、ヒトフレームワーク配列を含む。例えば、重鎖フレームワーク配列は、上述したヒトＶＨ３生殖系列、ＶＨ１生殖系列、ＶＨ５生殖系列、またはＶＨ４生殖系列由来であり得る。好適なヒト生殖系列軽鎖フレームワークは、上述したＶΚまたはＶλ生殖系列に由来するフレームワークである。コンセンサスヒト生殖系列フレームワーク配列も上述した通り使用することができる。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の抗体またはその抗原結合断片は、（ｉ）配列番号１３１と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一のアミノ酸配列を含むＶＨ、および／または（ｉｉ）配列番号１２６と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。これらのＶＬおよびＶＨ配列の任意の組合せも、本発明によって包含されている。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の抗体またはその抗原結合断片は、（ｉ）配列番号９１と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一のアミノ酸配列を含むＣＨ、および／または（ｉｉ）配列番号９１もしくは配列番号８５と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一のアミノ酸配列を含むＣＬを含む。これらのＣＨおよびＣＬ配列の任意の組合せも、本発明によって包含されている。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の抗体またはその抗原結合断片は、Ｆｃドメインを含む。Ｆｃドメインは、ＩｇＡ（例えば、ＩｇＡ１もしくはＩｇＡ２）、ＩｇＧ、ＩｇＥ、またはＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、もしくはＩｇＧ４）に由来し得る。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の抗体またはその抗原結合断片は、（ｉ）配列番号１３２と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一のアミノ酸配列を含む重鎖、および／または（ｉｉ）配列番号１２７と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。これらの重鎖および軽鎖配列の任意の組合せも、本発明によって包含されている。
ＴＦＰＩのＫ２ドメインに特異的に結合し、本明細書に記載の抗体またはその抗原結合断片のいずれか、例えば、表３に列挙された抗体（またはその抗原結合性断片）のいずれか１つなどとＴＦＰＩへの結合を競合する抗体またはその抗原結合断片も、本明細書に開示されている。例えば、抗体またはその抗原結合部分のＴＦＰＩへの結合がＴＦＰＩ−２３またはＴＦＰＩ−１０６によるＴＦＰＩへの後続の結合を邪魔する場合、この抗体またはその抗原結合部分は、ＴＦＰＩ−２３またはＴＦＰＩ−１０６とＴＦＰＩ結合を競合する。
ＴＦＰＩのＫ２ドメインに特異的に結合し、本明細書に記載の抗体またはその抗原結合断片のいずれか、例えば、表３に列挙された抗体またはその抗原結合性断片のいずれか１つなどと同じＴＦＰＩエピトープに結合する抗体またはその抗原結合断片も、本明細書に開示されている。
ＳＰＲによる例示的な抗体競合アッセイ（および重複エピトープ分析）が実施例６に提供されている。
本明細書に開示の抗体および抗原結合断片としては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗体断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、Ｆｃなど）、キメラ抗体、二重特異性抗体、ヘテロコンジュゲート抗体、単鎖（ＳｃＦｖ）、これらの突然変異体、抗体部分を含む融合タンパク質、ドメイン抗体（ｄＡｂ）、ヒト化抗体、ならびに抗体のグリコシル化バリアント、抗体のアミノ酸配列バリアント、および共有結合修飾抗体を含めた要求される特異性の抗原認識部位を含む免疫グロブリン分子の任意の他の修飾された構成がある。抗体および抗原結合断片は、マウス、ラット、ヒト、または任意の他の起源（キメラもしくはヒト化抗体を含む）のものであり得る。一部の実施形態では、抗体は、モノクローナル抗体である。一部の実施形態では、抗体は、キメラ、ヒト化、またはヒト抗体である。ある特定の実施形態では、抗体は、ヒト抗体である。ある特定の実施形態では、抗体は、ヒト化抗体である。
ある特定の実施形態では、本明細書に開示の抗体またはその抗原結合断片は、約１×１０−３Ｍ以下、例えば、約５×１０−４Ｍ以下、約４×１０−４Ｍ以下、約３×１０−４Ｍ以下、約２×１０−４Ｍ以下、約１×１０−４Ｍ以下、約９×１０−５Ｍ以下、約８×１０−５Ｍ以下、約７×１０−５Ｍ以下、約６×１０−５Ｍ以下、約５×１０−５Ｍ以下、約４×１０−５Ｍ以下、約３×１０−５Ｍ以下、約２×１０−５Ｍ以下、約１×１０−５Ｍ以下、約９×１０−６Ｍ以下、約８×１０−６Ｍ以下、約７×１０−６Ｍ以下、約６×１０−６Ｍ以下、約５×１０−６Ｍ以下、約４×１０−６Ｍ以下、約３×１０−６Ｍ以下、約２×１０−６Ｍ以下、約１×１０−６Ｍ以下、約９×１０−７Ｍ以下、約８×１０−７Ｍ以下、約７×１０−７Ｍ以下、約６×１０−７Ｍ以下、約５×１０−７Ｍ以下、約４×１０−７Ｍ以下、約３×１０−７Ｍ以下、約２×１０−７Ｍ以下、約１×１０−７Ｍ以下、約９×１０−８Ｍ以下、約８×１０−８Ｍ以下、約７×１０−８Ｍ以下、約６×１０−８Ｍ以下、約５×１０−８Ｍ以下、約４×１０−８Ｍ以下、約３×１０−８Ｍ以下、約２×１０−８Ｍ以下、約１×１０−８Ｍ以下、約９×１０−９Ｍ以下、約８×１０−９Ｍ以下、約７×１０−９Ｍ以下、約６×１０−９Ｍ以下、約５×１０−９Ｍ以下、約４×１０−９Ｍ以下、約３×１０−９Ｍ以下、約２×１０−９Ｍ以下、約１×１０−９Ｍ以下、約１×１０−３Ｍ〜約１×１０−１３Ｍ、１×１０−４Ｍ〜約１×１０−１３Ｍ、１×１０−５Ｍ〜約１×１０−１３Ｍ、約１×１０−６Ｍ〜約１×１０−１３Ｍ、約１×１０−７Ｍ〜約１×１０−１３Ｍ、約１×１０−８Ｍ〜約１×１０−１３Ｍ、約１×１０−９Ｍ〜約１×１０−１３Ｍ、１×１０−３Ｍ〜約１×１０−１２Ｍ、１×１０−４Ｍ〜約１×１０−１２Ｍ、約１×１０−５Ｍ〜約１×１０−１２Ｍ、約１×１０−６Ｍ〜約１×１０−１２Ｍ、約１×１０−７Ｍ〜約１×１０−１２Ｍ、約１×１０−８Ｍ〜約１×１０−１２Ｍ、約１×１０−９Ｍ〜約１×１０−１２Ｍ、１×１０−３Ｍ〜約１×１０−１１Ｍ、１×１０−４Ｍ〜約１×１０−１１Ｍ、約１×１０−５Ｍ〜約１×１０−１１Ｍ、約１×１０−６Ｍ〜約１×１０−１１Ｍ、約１×１０−７Ｍ〜約１×１０−１１Ｍ、約１×１０−８Ｍ〜約１×１０−１１Ｍ、約１×１０−９Ｍ〜約１×１０−１１Ｍ、１×１０−３Ｍ〜約１×１０−１０Ｍ、１×１０−４Ｍ〜約１×１０−１０Ｍ、約１×１０−５Ｍ〜約１×１０−１０Ｍ、約１×１０−６Ｍ〜約１×１０−１０Ｍ、約１×１０−７Ｍ〜約１×１０−１０Ｍ、約１×１０−８Ｍ〜約１×１０−１０ＭＭ、または約１×１０−９Ｍ〜約１×１０−１０Ｍなどの親和性（Ｋｄ）値を有する。
ある特定の実施形態では、解離定数は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法（Ｂｉａｃｏｒｅ）を使用して測定される。表面プラズモン共鳴は、例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）システムを使用して、バイオセンサーマトリックス内のタンパク質濃度の変化を検出することによりリアルタイム生体特異的相互作用の分析を可能にする光学現象を指す。ある特定の実施形態では、ＳＰＲ測定は、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ１００またはＴ２００計測器を使用して行われる。
例えば、表面プラズモン共鳴の標準アッセイ条件は、ＳＰＲチップ上へのおよそ１００応答単位（ＲＵ）のＩｇＧのリガンド固定化に基づき得る。精製標的タンパク質は、緩衝液中に希釈されて一連の最終濃度にされ、要求される流量（例えば、１０〜１００μｌ／分）で注入されてＫａの算出を可能にする。解離が進行させられてオフレート（Ｋｄ）が確立され、その後、チップ表面を再生するために３Ｍ ＭｇＣｌ２（または２０ｍＭ ＮａＯＨ）の５秒パルスが続く。次いでセンサーグラムが、動態評価ソフトウェアパッケージを使用して分析される。
例示的な実施形態では、ＳＰＲアッセイは、副題「表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）」の下で実施例１に示した条件によるものである。
ある特定の実施形態では、解離定数は、溶液に基づく動的排除アッセイ（ＫｉｎＥｘＡ（商標））を使用して測定される。特定の実施形態では、ＫｉｎＥｘＡ測定は、ＫｉｎＥｘＡ（商標）３２００計測器（Ｓａｐｉｄｙｎｅ）を使用して行われる。動的排除アッセイ（ＫｉｎＥｘＡ（商標））は、抗原／抗体相互作用の平衡解離定数ならびに会合および解離速度定数を測定することができる汎用イムノアッセイプラットフォーム（基本的にはフロー蛍光分光計）である。ＫｉｎＥｘＡ（商標）は、平衡状態が得られた後に実施されるので、これは、相互作用のオフレートが非常に遅い場合がある高親和性相互作用のＫｄの測定に使用するのに有利な技法である。ＫｉｎＥｘＡ（商標）方法は一般に、Ｄｒａｋｅら（２００４）、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３２８、３５〜４３に記載されている通りに行うことができる。
一般に、ＴＦＰＩ抗体は、ＴＦＰＩの活性を有効にブロックするために、高親和性でＴＦＰＩに結合する必要がある。しかし、ＴＦＰＩは、細胞表面上でも発現されるので、抗体の結合親和性が高すぎると、抗体は、宿主細胞によって急速に内部移行および分解され得る。これは、短い半減期および注射の繰り返しを潜在的にもたらし得る。例えば、抗体ＴＦＰＩ−２３は、ＴＦＰＩ−２４と比較してより低い結合親和性（Ｋｄ）を示し、ある特定の環境下では、より望ましく、その理由は、それがより低い内部移行率およびより長い半減期を有するためである。したがって、より長い半減期が望まれる場合、５×１０−７Ｍ〜約５×１０−１１Ｍ、特に、約１×１０−８Ｍ〜約１×１０−１０Ｍ（０．１ｎＭ〜１０ｎＭ）の結合親和性（Ｋｄ）が一般に望ましい。この範囲は、（ｉ）ＴＦＰＩの活性を有効に阻害するのに必要とされる結合親和性と（ｉｉ）より長い半減期および抗体内部移行の低減との折り合いをつけると考えられる。
特に、３ｍｇ／ｋｇでの毎週の皮下投薬を維持するのに、約１×１０−８Ｍ〜約１×１０−１０Ｍ（０．１ｎＭ〜１０ｎＭ）のＫｄ値が望ましいと考えられる。
抗体またはその抗原結合断片が、ＴＦＰＩの活性を低減し、またはＴＦＰＩの生理的基質（例えば、ＦＸａ）への結合を低減するか否かは、ＴＦＰＩの生理的基質への結合親和性の低下を測定することによって、例えば、（ｉ）抗ＴＦＰＩ抗体（またはその抗原結合性断片）の存在下でのＴＦＰＩのその基質への結合親和性を、（ｉｉ）抗ＴＦＰＩ抗体の非存在下でのＴＦＰＩの同じ基質への結合親和性と比較することによって判定することができる。ＴＦＰＩの生理的基質（例えば、ＦＸａ）への結合の低減は、抗ＴＦＰＩ抗体（またはその抗原結合性断片）の存在下で、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％であり得る。抗体（または断片）の非存在下でのＴＦＰＩのその生理的基質への予期される結合は、１００％と設定することができる。
抗ＴＦＰＩ抗体またはその抗原結合性断片のＴＦＰＩ阻害活性は、「ＴＦＰＩの活性を低減すること」とも本明細書で呼ばれ、例えば、血漿系を使用してｉｎ ｖｉｖｏモデルおよび／またはｉｎ ｖｉｔｒｏで査定することもできる。例えば、抗体の阻害活性（またはＴＦＰＩの活性を低減するレベル）は、（ｉ）血漿ベースの希釈プロトロンビン時間アッセイによって測定した場合の凝血時間の低下、（ｉｉ）トロンボエラストグラフィによって測定した場合の全血中の凝血時間の低減、（ｉｉｉ）トロンビン産生の増大、（ｉｖ）ＴＦＰＩの存在下でのＦＸａの増大、（ｖ）ＴＦＰＩの存在下での血小板蓄積の増強、（ｖｉ）ＴＦＰＩの存在下でのフィブリン産生の増大、または（ｖｉｉ）これらの任意の組合せによって査定することができる。抗体または抗原結合断片の阻害活性は、用量依存的であり得る（例えば、血漿ベースの希釈プロトロンビン時間アッセイで測定した場合に凝血時間の用量依存的低下を引き起こす）。
抗体のＴＦＰＩ阻害活性を査定するためのいくつかの例示的なアッセイは、実施例で詳細に記載されている。例えば、血漿希釈プロトロンビン時間（ＰＴ）アッセイは、アッセイの凝血時間およびダイナミックレンジを延ばすために希釈されたトロンボプラスチンまたは組織因子を使用する改変されたＰＴアッセイである。阻害／中和抗ＴＦＰＩ抗体は、希釈プロトロンビン時間を低下させるはずである。
ＴＦＰＩ阻害活性を判定するための別の例示的モデル系は、外因性テナーゼアッセイであり、これは、抗体またはその抗原結合断片の、ＴＦＰＩの存在下での外因性複合体媒介ＦＸ活性化を回復させる能力を試験する。ＴＦＰＩ阻害活性を特徴付けるための別のモデル系は、ＦＸａ活性がＴＦＰＩの存在下で測定される、ＦＸａ阻害アッセイである（Ｓｐｒｅｃｈｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９１：３３５３〜３３５７（１９９４）を参照）。
抗体またはその抗原結合断片の阻害活性は、血漿に基づくアッセイにおいても査定することができる。トロンビン形成は、抗ＴＦＰＩ抗体またはその抗原結合性断片の存在下でＦＶＩＩＩまたはＦＩＸ活性を実質的に欠く（例えば、残留凝固因子活性が１％未満である）血漿中で誘発され得る。トロンビン形成は、蛍光発生または発色基質を使用して検出することができる。プロトロンビン変換は、例えば、Ｔｈｒｏｍｂｏｇｒａｐｈ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、Ｍａｓｓ．）を使用して測定することができ、結果として生じるデータを、Ｔｈｒｏｍｂｉｎｏｓｃｏｐｅ ＢＶから入手可能なＴｈｒｏｍｂｉｎｏｓｃｏｐｅ（商標）ソフトウェアによって生成される較正済み自動トロンボグラムにコンパイルすることができる。
例えば、抗体または抗原結合断片は、ＦＶＩＩＩの非存在下（例えば、ＦＶＩＩＩ枯渇血漿中）でのＴＦＰＩ調節トロンビン産生を正常血漿中のＴＦＰＩ依存性トロンビン産生のレベルの少なくとも１％に改善し得る。一般に、正常（未発症）血漿は、約０．５Ｕ／ｍＬ〜約２Ｕ／ｍＬの第ＶＩＩＩ因子を含有する。したがって、一部の事例では、本発明の抗体または抗原結合断片は、ＦＶＩＩＩの非存在下でのトロンビン形成を０．５Ｕ／ｍＬ〜２Ｕ／ｍＬのＦＶＩＩＩの存在下で観察されるものの少なくとも１％に増強することになる。さらなる実施形態では、抗体（またはその抗原結合性断片）は、第ＶＩＩＩ因子の非存在下でのトロンビン形成を正常血漿中での、すなわち、生理的レベルの第ＶＩＩＩ因子の存在下でのトロンビン形成のレベルの少なくとも約２％、少なくとも約３％、少なくとも約５％、少なくとも約７％、または少なくとも約１０％に増強する。
抗体または抗原結合断片は、トロンビン欠乏症または血友病の動物モデルに投与してｉｎ ｖｉｖｏでＴＦＰＩ阻害活性を特徴付けることもできる。このようなｉｎ ｖｉｖｏモデルは、当技術分野で公知であり、これらとしては、例えば、抗ＦＶＩＩＩ抗体を投与されて血友病Ａを誘導されたマウス（Ｔｒａｎｈｏｌｍら、Ｂｌｏｏｄ、１０２、３６１５〜３６２０（２００３））；凝固因子ノックアウトモデル、例えば、それだけに限らないが、ＦＶＩＩＩノックアウトマウス（Ｂｉら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．、１０（１）、１１９〜１２１（１９９５））およびＦＩＸノックアウトマウス（Ｗａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９４（２１）：１１５６３〜１１５６６（１９９７））など；ウサギにおける誘導された血友病Ａ（Ｓｈｅｎら、Ｂｌｏｏｄ、４２（４）：５０９〜５２１（１９７３））；ならびにＣｈａｐｅｌ Ｈｉｌｌ ＨＡイヌ（Ｌｏｚｉｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９９：１２９９１〜１２９９６（２００２））がある。
ある特定の実施形態では、本明細書に開示の抗体（または抗原結合断片）は、ＴＦＰＩの存在下でＦＸａ活性を増強し、半最大有効濃度（ＥＣ５０）は、１×１０−４Ｍ以下、１×１０−５Ｍ以下、１×１０−６Ｍ以下、１×１０−７Ｍ以下、１×１０−８Ｍ以下、１×１０−９Ｍ以下、１×１０−１０Ｍ以下、１×１０−１１Ｍ以下、または１×１０−１２Ｍ以下である。好ましくは、ＥＣ５０は、約５×１０−７Ｍ〜１×１０−１１Ｍ、例えば、約１×１０−７Ｍ〜５×１０−１０Ｍ、約１×１０−７Ｍ〜１×１０−１０Ｍ、１×１０−７Ｍ〜５×１０−９Ｍ、５×１０−７Ｍ〜５×１０−１０Ｍ、約５×１０−７Ｍ〜１×１０−１０Ｍ、または約５×１０−７Ｍ〜５×１０−９Ｍなどである。
ある特定の実施形態では、本明細書に開示の抗体（または抗原結合断片）は、ＦＶＩＩａ／ＴＦ媒介ＦＸ活性化のＴＦＰＩ阻害を中和し、半最大有効濃度（ＥＣ５０）は、１×１０−４Ｍ以下、１×１０−５Ｍ以下、１×１０−６Ｍ以下、１×１０−７Ｍ以下、１×１０−８Ｍ以下、１×１０−９Ｍ以下、１×１０−１０Ｍ以下、１×１０−１１Ｍ以下、または１×１０−１２Ｍ以下である。好ましくは、ＥＣ５０は、約５×１０−７Ｍ〜１×１０−１１Ｍ、例えば、約１×１０−７Ｍ〜５×１０−１０Ｍ、約１×１０−７Ｍ〜１×１０−１０Ｍ、１×１０−７Ｍ〜５×１０−９Ｍ、５×１０−７Ｍ〜５×１０−１０Ｍ、約５×１０−７Ｍ〜１×１０−１０Ｍ、または約５×１０−７Ｍ〜５×１０−９Ｍなどである。
ある特定の実施形態では、本明細書に開示の抗体（または抗原結合断片）は、血漿ベースの希釈プロトロンビン時間アッセイで測定した場合に凝血時間を低下させ、半最大有効濃度（ＥＣ５０）は、１×１０−４Ｍ以下、１×１０−５Ｍ以下、１×１０−６Ｍ以下、１×１０−７Ｍ以下、１×１０−８Ｍ以下、１×１０−９Ｍ以下、１×１０−１０Ｍ以下、１×１０−１１Ｍ以下、または１×１０−１２Ｍ以下である。好ましくは、ＥＣ５０は、約５×１０−７Ｍ〜１×１０−１１Ｍ、例えば、約１×１０−７Ｍ〜５×１０−１０Ｍ、約１×１０−７Ｍ〜１×１０−１０Ｍ、１×１０−７Ｍ〜５×１０−９Ｍ、５×１０−７Ｍ〜５×１０−１０Ｍ、約５×１０−７Ｍ〜１×１０−１０Ｍ、または約５×１０−７Ｍ〜５×１０−９Ｍなどである。
ある特定の実施形態では、本明細書に開示の抗体（または抗原結合断片）は、トロンビン産生速度指数を増大させ、半最大有効濃度（ＥＣ５０）は、１×１０−４Ｍ以下、１×１０−５Ｍ以下、１×１０−６Ｍ以下、１×１０−７Ｍ以下、１×１０−８Ｍ以下、１×１０−９Ｍ以下、１×１０−１０Ｍ以下、１×１０−１１Ｍ以下、または１×１０−１２Ｍ以下である。好ましくは、ＥＣ５０は、約５×１０−７Ｍ〜１×１０−１１Ｍ、例えば、約１×１０−７Ｍ〜５×１０−１０Ｍ、約１×１０−７Ｍ〜１×１０−１０Ｍ、１×１０−７Ｍ〜５×１０−９Ｍ、５×１０−７Ｍ〜５×１０−１０Ｍ、約５×１０−７Ｍ〜１×１０−１０Ｍ、または約５×１０−７Ｍ〜５×１０−９Ｍなどである。
ある特定の実施形態では、本明細書に開示の抗体および抗体断片は、例えば、治療剤としてのその効能、薬理活性、および潜在的効力を評価するために、他の生物活性アッセイでさらに査定されてもよい。このようなアッセイは、当技術分野で公知であり、抗体の標的抗原および使用目的に依存する。例としては、例えば、腫瘍細胞増殖阻害アッセイ、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）および補完媒介細胞傷害性（ＣＤＣ）アッセイ、アゴニスト活性またはアンタゴニスト活性アッセイがある。
Ｃ．ポリヌクレオチド、ベクター、および宿主細胞
本発明は、本明細書に記載の抗体断片および修飾抗体を含めた本開示のＴＦＰＩ結合抗体のいずれか、例えば、Ｆｃエフェクター機能が損なわれた抗体などをコードするポリヌクレオチドも提供する。別の態様では、本発明は、本明細書に記載のポリヌクレオチドのいずれかを作製する方法を提供する。ポリヌクレオチドは、当技術分野で公知の手順によって作製し、発現させることができる。したがって、本発明は、本発明のＴＦＰＩ抗体およびそれらの抗原結合断片のいずれかをコードするポリヌクレオチド、またはポリヌクレオチドを含む医薬組成物を含む組成物を提供する。
一実施形態では、ＶＨおよびＶＬドメイン、もしくはその抗原結合性断片、または全長ＨＣもしくはＬＣは、別々のポリヌクレオチドによってコードされる。代替として、ＶＨおよびＶＬの両方、もしくはその抗原結合性断片、またはＨＣおよびＬＣは、単一ポリヌクレオチドによってコードされる。
本発明は、それだけに限らないが、ＴＦＰＩ−２３、ＴＦＰＩ−２４、ＴＦＰＩ−１０６、ＴＦＰＩ−１０７、および４Ｄ８を含めた本発明のＴＦＰＩ抗体およびそれらの抗原結合断片のいずれかをコードするポリヌクレオチド、またはポリヌクレオチドを含む組成物であって、ポリヌクレオチドの配列は、配列番号１７５（ＴＦＰＩ−１０６ ＶＨ領域をコードする）、配列番号１７６（ＴＦＰＩ−１０６ ＶＬ領域をコードする）、配列番号１７７（ＴＦＰＩ−１０６重鎖をコードする）、および配列番号１７８（ＴＦＰＩ−１０６軽鎖をコードする）の配列を包含する、ポリヌクレオチド、またはポリヌクレオチドを含む組成物を提供する。
別の態様では、本発明は、ＴＦＰＩを特異的に結合させ、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１２２３２９として寄託されたプラスミド中に存在するインサートの核酸配列を含む、抗体またはその抗原結合部分のＶＨ領域をコードする単離核酸を提供する。
別の態様では、本発明は、ＴＦＰＩを特異的に結合させ、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１２２３２８として寄託されたプラスミド中に存在するインサートの核酸配列を含む、抗体またはその抗原結合部分のＶＬ領域をコードする単離核酸を提供する。
別の態様では、本発明は、ＴＦＰＩ抗体またはその部分をコードするポリヌクレオチドおよびこれらのバリアントであって、このようなバリアントポリヌクレオチドは、本明細書に開示の特異的核酸配列のいずれかと少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８７％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を共有する核酸配列を含む、ポリヌクレオチドおよびこれらのバリアントを提供する。ヌクレオチド配列の任意の長さにわたる配列同一性の程度は、当業者によく知られている方法を使用して算出することができる。限定されない一実施形態では、２つ以上の関連するヌクレオチド配列間のパーセント配列同一性は、国立医学図書館から入手可能なヌクレオチドＢＬＡＳＴサーバー（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を使用して判定することができる。このソフトウェアは、当業者が使用して長さ、複雑性、および他の要因などの要因に応じて配列比較を最適化することができる異なる設定を提供する。
本発明は、表３３に提供した抗体またはその抗原結合断片のアミノ酸配列（例えば、配列番号２１〜１７４のアミノ酸配列）を含めた本発明の任意のＴＦＰＩ抗体およびその抗原結合断片のアミノ酸配列ならびに本発明の抗体と同じエピトープと結合し、かつ／またはＴＦＰＩの結合を競合する任意の抗体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を提供する。
別の態様では、本発明は、ＴＦＰＩ抗体をコードするポリヌクレオチドおよびこれらのバリアントであって、このようなバリアントポリヌクレオチドは、本明細書に開示の任意のＴＦＰＩ抗体アミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８７％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を共有するアミノ酸配列をコードする、ポリヌクレオチドおよびこれらのバリアントを提供する。
他の実施形態では、ＴＦＰＩ抗体またはその部分をコードするバリアントポリヌクレオチド配列を含む核酸と、本明細書に開示の特異的ヌクレオチド配列のいずれかとの関連性の程度は、バリアント配列（またはその相補体）が、ノーザンブロットまたはサザンブロットアッセイ形式における中等度または高度にストリンジェントな条件下で特異的ヌクレオチド配列（またはその相補体）とハイブリダイズすることができるか否かを試験することによって判定することができる。例示的なかつ限定されない「中程度にストリンジェントな条件」は、５×ＳＳＣ、０．５％ ＳＤＳ、１．０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の溶液中での予洗；５０℃〜６５℃、５×ＳＳＣで一晩のハイブリダイジング；その後の、０．１％ ＳＤＳを含有する２×、０．５×、および０．２×ＳＳＣのそれぞれを用いた６５℃で２０分間の２回の洗浄を含む。
例示的なかつ限定されない、「高度にストリンジェントな条件」または「高ストリンジェンシー条件」は、（１）洗浄のために低イオン強度および高温、例えば、５０℃で０．０１５Ｍ塩化ナトリウム／０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム／０．１％ドデシル硫酸ナトリウムを使用し、（２）ハイブリダイゼーション中に変性剤、例えば、ホルムアミド、例えば、４２℃の、０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％フィコール／０．１％ポリビニルピロリドン／７５０ｍＭ塩化ナトリウム、７５ｍＭクエン酸ナトリウムを含むｐＨ６．５の５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液を含む５０％ホルムアミドなどを使用し、または（３）０．２×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）中で４２℃での洗浄、５５℃にて５０％ホルムアミド中での洗浄、その後の５５℃でＥＤＴＡを含有する０．１×ＳＳＣからなる高ストリンジェンシー洗浄を伴った、４２℃で５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．７５Ｍ ＮａＣｌ、０．０７５Ｍクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％ピロリン酸ナトリウム、５×デンハルト溶液、超音波処理したサケ***ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％ ＳＤＳ、および１０％デキストラン硫酸を使用するものである。当業者は、プローブ長などの要因に適応する必要に応じて温度、イオン強度などをどのように調整するかを認識すると予想される。当業者は、ノーザンブロットまたはサザンブロットアッセイを行って、バリアントヌクレオチド配列と本開示の特異的ヌクレオチド配列との関連性の程度を検出するための標準技法もよく知っていると予想される。
任意のこのような配列に相補的なポリヌクレオチドも本発明によって包含されている。ポリヌクレオチドは、一本鎖（コードまたはアンチセンス）であっても二本鎖であってもよく、ＤＮＡ（ゲノム、ｃＤＮＡ、または合成）分子であってもＲＮＡ分子であってもよい。ＲＮＡ分子としては、イントロンを含有し、１対１様式でＤＮＡ分子に対応するｈｎＲＮＡ分子、およびイントロンを含有しないｍＲＮＡ分子がある。追加のコードまたは非コード配列が本発明のポリヌクレオチド内に存在してもよいが、その必要はない。
バリアントは、天然遺伝子またはその部分もしくは相補体に、やはり、または代わりに実質的に相同であり得る。このようなポリヌクレオチドバリアントは、中程度にストリンジェントな条件下で、天然抗体（または相補配列）をコードする天然に存在するＤＮＡ配列にハイブリダイズすることができる。
遺伝コードの縮重の結果として、本明細書に開示のＴＦＰＩ抗体のいずれかまたはその部分をコードすることができる多くのヌクレオチド配列が存在することを、当業者は認識していると予想される。これらのポリヌクレオチドの一部は、本明細書に提供されるＴＦＰＩ抗体の特異的ヌクレオチド配列のいずれかと相対的に低い程度の配列同一性を有するが、同じアミノ酸配列をコードする場合がある。それにもかかわらず、コドン使用の差異に起因して変動するポリヌクレオチドも本発明によって具体的に予期される。
本発明のポリヌクレオチドは、化学合成、組換え法、またはＰＣＲを使用して得ることができる。化学的ポリヌクレオチド合成の方法は、当技術分野で周知であり、本明細書で詳細に記載される必要はない。当業者は、本明細書に提供される配列および市販のＤＮＡシンセサイザーを使用して所望のＤＮＡ配列を生成することができる。
組換え法を使用してポリヌクレオチドを調製するために、本明細書にさらに論じられるように、所望の配列を含むポリヌクレオチドを適切なベクター中に挿入することができ、次にベクターを、複製および増幅のために適切な宿主細胞内に導入することができる。ポリヌクレオチドは、当技術分野で公知の任意の手段によって宿主細胞内に挿入され得る。細胞は、直接取込み、エンドサイトーシス、トランスフェクション、Ｆ接合、または電気穿孔により外因性ポリヌクレオチドを導入することによって形質転換することができる。導入した後、外因性ポリヌクレオチドを非組込みベクター（プラスミドなど）として細胞内に維持し、または宿主細胞ゲノムに組み込むことができる。このように増幅されたポリヌクレオチドは、当技術分野で周知の方法によって宿主細胞から単離することができる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９を参照。
代替として、ＰＣＲがＤＮＡ配列の複製を可能にする。ＰＣＲ技術は、当技術分野で周知であり、米国特許第４，６８３，１９５号、同第４，８００，１５９号、同第４，７５４，０６５号、および同第４，６８３，２０２号、ならびにＰＣＲ：Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ、Ｍｕｌｌｉｓら編、Ｂｉｒｋａｕｓｗｅｒ Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｓｔｏｎ、１９９４に記載されている。
ＲＮＡは、適切なベクター中の単離ＤＮＡを使用し、それを適切な宿主細胞内に挿入することによって得ることができる。細胞が複製し、ＤＮＡがＲＮＡに転写されたとき、ＲＮＡは、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、上記に示されているように、当業者に周知の方法を使用して単離することができる。
適切なクローニングベクターは、標準技法によって構築されてもよく、または当技術分野で入手可能な多数のクローニングベクターから選択されてもよい。選択されるクローニングベクターは、使用されるように意図された宿主細胞によって変動し得るが、有用なクローニングベクターは、自己複製する能力を一般に有することになり、特定の制限エンドヌクレアーゼの単一標的を有し得、かつ／またはベクターを含有するクローンの選択に使用することができるマーカーの遺伝子を担持し得る。適切な例としては、プラスミドならびに細菌ウイルス、例えば、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（例えば、ｐＢＳ ＳＫ＋）およびその誘導体、ｍｐ１８、ｍｐ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９、ＣｏｌＥ１、ｐＣＲ１、ＲＰ４、ファージＤＮＡ、ならびにシャトルベクター、例えば、ｐＳＡ３およびｐＡＴ２８などがある。これらおよび多くの他のクローニングベクターは、市販供給業者、例えば、ＢｉｏＲａｄ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、およびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手可能である。
発現ベクターがさらに提供されている。発現ベクターは一般に、本発明によるポリヌクレオチドを含有する複製可能なポリヌクレオチドコンストラクトである。発現ベクターは、エピソームとして、または染色体ＤＮＡの不可欠な部分として宿主細胞内で複製可能でなければならないことが暗示されている。適切な発現ベクターとしては、それだけに限らないが、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、コスミド、およびＰＣＴ公開第ＷＯ８７／０４４６２号に開示された発現ベクターを含めたプラスミド、ウイルスベクターがある。ベクター成分は一般に、それだけに限らないが、以下：シグナル配列、複製起点、１つまたは複数のマーカー遺伝子、適切な転写制御エレメント（プロモーター、エンハンサー、およびターミネーターなど）の１つまたは複数を含む。発現（すなわち、翻訳）のために、１つまたは複数の翻訳制御エレメント、例えば、リボソーム結合部位、翻訳開始部位、および停止コドンなども通常要求される。
目的のポリヌクレオチドを含有するベクターおよび／またはポリヌクレオチド自体を、電気穿孔、塩化カルシウム、塩化ルビジウム、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ−デキストラン、または他の物質を使用するトランスフェクション；微粒子銃；リポフェクション；および感染（例えば、ベクターがワクシニアウイルスなどの感染エージェントである場合）を含めたいくつかの適切な手段のいずれかによって宿主細胞内に導入することができる。ベクターまたはポリヌクレオチドを導入する選択は、多くの場合宿主細胞の特徴に依存することになる。
本発明は、本明細書に記載のポリヌクレオチドのいずれかを含む宿主細胞も提供する。異種ＤＮＡを過剰発現することができる任意の宿主細胞を、目的の抗体、ポリペプチド、またはタンパク質をコードする遺伝子を単離する目的に使用することができる。哺乳動物宿主細胞の非限定的な例としては、それだけに限らないが、サルＣＯＳ、ヒトＨｅＬａ、ヒト胚腎臓（ＨＥＫ）２９３、Ｓｐ２．０、およびチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞がある。ＰＣＴ公開第ＷＯ８７／０４４６２号も参照。適切な非哺乳動物宿主細胞としては、原核生物（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）またはＢ．スブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｌｉｓ）など）および酵母（Ｓ．セレビジエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓａｅ）、Ｓ．ポンべ（Ｓ．ｐｏｍｂｅ）、またはＫ．ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）など）がある。ＴＦＰＩ抗体またはその抗原結合部分を発現する細胞のスクリーニングは、免疫結合アッセイ、例えば、ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳ、または当業者によく知られている他のアッセイを使用して検出することができる。
よって、本発明の抗体（またはその抗原結合性断片）は、適切な宿主細胞を使用して組換え産生され得る。抗体またはその抗原結合断片をコードする核酸を、発現ベクター中にクローン化することができ、次いでこれを、免疫グロブリンタンパク質を別段に産生しない宿主細胞、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞、酵母細胞、昆虫細胞、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、または骨髄腫細胞など内に導入して、組換え宿主細胞内でのモノクローナル抗体の合成物を得ることができる。例示的な宿主細胞としては、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３、およびＳｐ２．０細胞がある。
発現ベクターは、ＴＦＰＩ抗体の直接発現に使用することができる。当業者は、ｉｎ ｖｉｖｏで外来タンパク質を発現させるための発現ベクターの投与をよく知っている。例えば、米国特許第６，４３６，９０８号、同第６，４１３，９４２号、および同第６，３７６，４７１号を参照。発現ベクターの投与としては、注射、経口投与、粒子銃またはカテーテル挿入投与、および局部投与を含めた局所または全身投与がある。ある特定の限定されない実施形態によれば、発現ベクターは、肝臓、骨格筋、骨髄、または他の組織に直接投与される。
発現ベクターまたはサブゲノムポリヌクレオチドを含有する治療用組成物の標的化送達も使用することができる。受容体媒介ＤＮＡ送達技法は、例えば、Ｆｉｎｄｅｉｓら、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１９９３、１１：２０２；Ｃｈｉｏｕら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｏｆ Ｄｉｒｅｃｔ Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ、Ｊ．Ａ．Ｗｏｌｆｆ編、１９９４；Ｗｕら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９８８、２６３：６２１；Ｗｕら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９９４、２６９：５４２；Ｚｅｎｋｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９９０、８７：３６５５；Ｗｕら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９９１、２６６：３３８に記載されている。ポリヌクレオチドを含有する治療用組成物は、遺伝子療法プロトコールにおける局所投与について、約１００ｎｇ〜約２００ｍｇのＤＮＡの範囲内で投与される。約５００ｎｇ〜約５０ｍｇ、約１μｇ〜約２ｍｇ、約５μｇ〜約５００μｇ、および約２０μｇ〜約１００μｇの濃度範囲のＤＮＡも遺伝子療法プロトコール中に使用することができる。治療用ポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、遺伝子送達媒体を使用して送達することができる。遺伝子送達媒体は、ウイルスまたは非ウイルス起源のものであり得る（一般に、Ｊｏｌｌｙ、Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、１９９４、１：５１；Ｋｉｍｕｒａ、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、１９９４、５：８４５；Ｃｏｎｎｅｌｌｙ、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、１９９５、１：１８５；およびＫａｐｌｉｔｔ、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１９９４、６：１４８を参照）がある。このようなコード配列の発現は、内因性哺乳動物または異種プロモーターを使用して誘導することができる。コード配列の発現は、構成的であり得、または調節され得る。
所望のポリヌクレオチドの送達および所望の細胞内での発現のためのウイルス系ベクターは、当技術分野で周知である。例示的なウイルス系媒体としては、それだけに限らないが、組換えレトロウイルス（例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ９０／０７９３６号、同第ＷＯ９４／０３６２２号、同第ＷＯ９３／２５６９８号、同第ＷＯ９３／２５２３４号、同第ＷＯ９３／１１２３０号、同第ＷＯ９３／１０２１８号、同第ＷＯ９１／０２８０５号、米国特許第５，２１９，７４０号および同第４，７７７，１２７号、ＧＢ特許第２，２００，６５１、およびＥＰ特許第０３４５２４２号を参照）、アルファウイルス系ベクター（例えば、シンドビスウイルスベクター、セムリキ森林ウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ−６７、ＡＴＣＣ ＶＲ−１２４７）、ロスリバーウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ−３７３、ＡＴＣＣ ＶＲ−１２４６）、およびベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ−９２３、ＡＴＣＣ ＶＲ−１２５０、ＡＴＣＣ ＶＲ １２４９、ＡＴＣＣ ＶＲ−５３２））、ならびにアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター（例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ９４／１２６４９号、同第ＷＯ９３／０３７６９号、同第ＷＯ９３／１９１９１号、同第ＷＯ９４／２８９３８号、同第ＷＯ９５／１１９８４号、および同第ＷＯ９５／００６５５号を参照）がある。Ｃｕｒｉｅｌ、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、１９９２、３：１４７に記載された死滅アデノウイルスに連結されたＤＮＡの投与も使用することができる。
それだけに限らないが、死滅アデノウイルス単独に連結されたまたは連結されていないポリカチオン凝縮ＤＮＡ（例えば、Ｃｕｒｉｅｌ、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、１９９２、３：１４７を参照）；リガンド連結ＤＮＡ（例えば、Ｗｕ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９８９、２６４：１６９８５を参照）；真核細胞送達媒体（例えば、米国特許第５，８１４，４８２号、ＰＣＴ公開第ＷＯ９５／０７９９４号、同第ＷＯ９６／１７０７２号、同第ＷＯ９５／３０７６３号、および同第ＷＯ９７／４２３３８号を参照）、ならびに核電荷中和または細胞膜との融合を含めた非ウイルス送達媒体ならびに方法も使用することができる。裸のＤＮＡも使用することができる。例示的な裸のＤＮＡ導入方法は、ＰＣＴ公開第ＷＯ９０／１１０９２号および米国特許第５，５８０，８５９号に記載されている。遺伝子送達媒体として作用し得るリポソームは、米国特許第５，４２２，１２０号、ＰＣＴ公開第ＷＯ９５／１３７９６号号、同第ＷＯ９４／２３６９７号、同第ＷＯ９１／１４４４５号、およびＥＰ０５２４９６８に記載されている。追加手法は、Ｐｈｉｌｉｐ、Ｍｏｌ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．、１９９４、１４：２４１１およびＷｏｆｆｅｎｄｉｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、１９９４、９１：１５８１に記載されている。
所望の抗体（またはその抗原結合性断片）およびこのような抗体（またはその抗原結合性断片）をコードする核酸の配列は、標準的なシーケンシング技法を使用して判定することができる。所望の抗体（または断片）をコードする核酸配列は、組換え産生および特徴付けのために他のベクター（クローニングおよび発現ベクターなど）中に挿入されてもよい。重鎖（または重鎖の断片）および軽鎖（または軽鎖の断片）は、同じベクターまたは異なるベクター中にクローン化することができる。
適切なクローニングおよび発現ベクターは、様々な成分、例えば、プロモーター、エンハンサー、および他の転写調節配列を含み得る。ベクターはまた、異なるベクター間での抗体可変ドメインの移動を可能にするように構築され得る。
抗体断片は、抗体のタンパク質分解もしくは他の分解、組換え法、または化学合成によって生成することができる。抗体のポリヌクレオチド、特に最大で約５０アミノ酸のより短いポリペプチドは、好都合なことには化学合成によって作製される。化学合成の方法は、当技術分野で公知であり、市販されている。
本明細書に開示の抗体またはその抗原結合断片は、親和性成熟されている場合がある。例えば、親和性成熟抗体は、当技術分野で公知の手順によって生成することができる（Ｍａｒｋｓら、１９９２、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１０：７７９−７８３；Ｂａｒｂａｓら、１９９４、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９１：３８０９〜３８１３；Ｓｃｈｉｅｒら、１９９５、Ｇｅｎｅ、１６９：１４７〜１５５；Ｙｅｌｔｏｎら、１９９５、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５５：１９９４〜２００４；Ｊａｃｋｓｏｎら、１９９５、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５４（７）：３３１０〜３３１９；Ｈａｗｋｉｎｓら、１９９２、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２６：８８９〜８９６；およびＷＯ２００４／０５８１８４）。
４．製剤および使用
本明細書に記載の抗体または抗原結合断片は、医薬製剤として製剤化することができる。医薬製剤は、凍結乾燥製剤または水溶液の形態で薬学的に許容できる担体、賦形剤、または安定剤をさらに含み得る（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ、２０版、２０００、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ ＷｉｌｌｉａｍｓおよびＷｉｌｋｉｎｓ、Ｋ．Ｅ．Ｈｏｏｖｅｒ編）。許容できる担体、賦形剤、または安定剤は、緒投与量および緒濃度でレシピエントに無毒性であり、緩衝液、例えば、リン酸、クエン酸、および他の有機酸など；アスコルビン酸およびメチオニンを含めた抗酸化剤；防腐剤（オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル、もしくはベンジルアルコール；メチルもしくはプロピルパラベンなどのアルキルパラペン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾールなど）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリンなど；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もしくはリシンなど；グルコース、マンノース、もしくはデキストランを含めた単糖、二糖、および他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート化剤；糖、例えばスクロース、マンニトール、トレハロース、もしくはソルビトールなど；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；ならびに／または非イオン性界面活性剤、例えば、ＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）、もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などを含み得る。薬学的に許容できる賦形剤は、本明細書でさらに記載されている。
本明細書に記載の抗体または抗原結合断片は、様々な治療または診断目的に使用することができる。例えば、抗体またはその抗原結合断片は、親和性精製剤（例えば、ＴＦＰＩのｉｎ ｖｉｔｒｏ精製用）として、診断剤（例えば、特異的な細胞、組織、または血清中のＴＦＰＩの発現を検出するため）として使用され得る。
本発明の抗体および抗体断片の例示的な治療的使用としては、血小板減少症、血小板障害（血小板機能または数の障害）、ならびに出血性障害（例えば、血友病Ａ、血友病Ｂ、および血友病Ｃ）の処置がある。抗体および抗体断片は、外傷および出血性脳卒中などの適応症における制御不能な出血の処置にも使用され得る。抗体および抗体断片は、予防的治療（例えば、手術前）でも使用され得る。
特に、本明細書に記載の抗体または抗原結合断片は、凝固不全または欠陥を処置するのに使用することができる。例えば、本明細書に記載の抗体または抗原結合断片は、ＴＦＰＩのＦＸａとの相互作用を低減もしくは阻害し、またはＴＦ／ＦＶＩＩａ／ＦＸａ活性のＴＦＰＩ依存性阻害を低減するのに使用され得る。
治療用途のために、本明細書に記載の抗体または抗原結合断片は、哺乳動物、特にヒトに、従来技法、例えば、静脈内に（ボーラスとして、もしくはある時間にわたる持続輸注によって）、筋肉内に、腹腔内に、脳脊髄内に、皮下に、関節内に、滑液包内に、クモ膜下に、経口的に、局所的に、または吸入によってなどより投与することができる。抗体または抗原結合断片は、腫瘍内、腫瘍周囲、病変内、または病変周囲経路によっても適切に投与される。
したがって、一態様では、本発明は、組織因子経路インヒビター（ＴＦＰＩ）の活性を低減する方法であって、それを必要とする対象に治療有効量の本明細書に記載の抗体または抗原結合断片を投与することを含む、方法を提供する。別の態様では、本発明は、出血時間を短縮する方法であって、それを必要とする対象に治療有効量の本明細書に記載の抗体または抗原結合断片を投与することを含む、方法を提供する。
ある特定の実施形態では、対象はヒトである。
ある特定の実施形態では、対象は、血液凝固の不全に罹患しており、または罹患しやすい。血液凝固の不全としては、例えば、フォンウィルブランド病（ｖＷＤ）、血友病Ａ、Ｂ、またはＣ、ならびに他の血小板障害（先天性血小板欠損、先天性および後天性貯蔵プール欠乏症、出血時間の延長など）がある。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の抗体または抗原結合断片は、皮下投与される。ある特定の実施形態では、本明細書に記載の抗体または抗原結合断片は、静脈内投与される。
医薬組成物は、出血エピソードの重症度によって変動し得る、または予防的療法の場合において、患者の凝固不全の重症度によって変動し得る頻度でそれを必要とする対象に投与され得る。
組成物は、必要のある患者にボーラスとして、または持続輸注によって投与されてもよい。例えば、Ｆａｂ断片として存在する抗体のボーラス投与は、０．００２５〜１００ｍｇ／体重１ｋｇ、０．０２５〜０．２５ｍｇ／ｋｇ、０．０１０〜０．１０ｍｇ／ｋｇ、または０．１０〜０．５０ｍｇ／ｋｇの量であり得る。持続輸注について、Ｆａｂ断片として存在する抗体は、１〜２４時間、１〜１２時間、２〜１２時間、６〜１２時間、２〜８時間、または１〜２時間の期間にわたって０．００１〜１００ｍｇ／体重１ｋｇ／分、０．０１２５〜１．２５ｍｇ／ｋｇ／分、０．０１０〜０．７５ｍｇ／ｋｇ／分、０．０１０〜１．０ｍｇ／ｋｇ／分、または０．１０〜０．５０ｍｇ／ｋｇ／分で投与され得る。
全長抗体（全定常領域）として存在する抗体の投与について、投与量は、約１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約４ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約４ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ以上、約２ｍｇ／ｋｇ以上、約３ｍｇ／ｋｇ以上、約４ｍｇ／ｋｇ以上、約５ｍｇ／ｋｇ以上、約６ｍｇ／ｋｇ以上、約７ｍｇ／ｋｇ以上、約８ｍｇ／ｋｇ以上、約９ｍｇ／ｋｇ以上、約１０ｍｇ／ｋｇ以上、約１１ｍｇ／ｋｇ以上、約１２ｍｇ／ｋｇ以上、約１３ｍｇ／ｋｇ以上、約１４ｍｇ／ｋｇ以上、約１５ｍｇ／ｋｇ以上、約１６ｍｇ／ｋｇ以上、約１７ｍｇ／ｋｇ以上、約１９ｍｇ／ｋｇ以上、または約２０ｍｇ／ｋｇ以上であり得る。投与の頻度は、状態の重症度に依存する。頻度は、週に３回〜２週間または３週間に１回の範囲とすることができる。
さらに、組成物は、患者に皮下注射を介して投与されてもよい。例えば、抗ＴＦＰＩ抗体１〜１００ｍｇの用量を、患者に皮下注射を介して、毎日１回、２日に１回、３日に１回、４日に１回、５日に１回、６日に１回、１週間に２回、毎週、隔週に、または毎月投与することができる。
ある特定の実施形態では、医薬組成物は、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約１．５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約８ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ〜約８ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約８ｍｇ／ｋｇ、約１．５ｍｇ／ｋｇ〜約８ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ〜約８ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約１．５ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ、約１．０ｍｇ／ｋｇ、約１．５ｍｇ／ｋｇ、約２．０ｍｇ／ｋｇ、約２．５ｍｇ／ｋｇ、約３．０ｍｇ／ｋｇ、約３．５ｍｇ／ｋｇ、約４．０ｍｇ／ｋｇ、約４．５ｍｇ／ｋｇ、約５．０ｍｇ／ｋｇ、約５．５ｍｇ／ｋｇ、約６．０ｍｇ／ｋｇ、約６．５ｍｇ／ｋｇ、約７．０ｍｇ／ｋｇ、約７．５ｍｇ／ｋｇ、約８．０ｍｇ／ｋｇ、約８．５ｍｇ／ｋｇ、約９．０ｍｇ／ｋｇ、約９．５ｍｇ／ｋｇ、または約１０．０ｍｇ／ｋｇの用量で、週１回スケジュールによって皮下投与される。
ある特定の実施形態では、医薬組成物は、約２．０ｍｇ／ｋｇの用量で週１回スケジュールにより皮下投与される。ある特定の実施形態では、医薬組成物は、約３．０ｍｇ／ｋｇの用量で週１回スケジュールにより皮下投与される。
本明細書に記載の抗体および抗体断片は、止血障害に対処するために、単剤療法として、または他の療法と組み合わせて使用することができる。例えば、本発明の１種または複数の抗体（または抗体断片）の凝血剤、例えば、第ＶＩＩａ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、またはトラネキサム酸などとの共投与が血友病を処置するのに有用であり得る。
一実施形態では、凝固不全を処置し、または出血時間を短縮する方法であって、（ａ）第１の量の本発明の抗体または抗原結合断片、および（ｂ）第２の量の第ＶＩＩＩ因子または第ＩＸ因子を投与することを含む、方法が提供されている。第ＶＩＩ因子は、共投与されなくてもよい。別の実施形態では、凝固不全を処置し、または出血時間を短縮する方法であって、（ａ）第１の量の本発明の抗体または抗原結合断片、および（ｂ）第２の量の第ＶＩＩＩ因子または第ＩＸ因子を投与することを含む、方法が提供されている。第ＶＩＩ因子は、共投与されなくてもよい。凝固不全の処置において、出血時間の短縮を凝血時間の短縮と呼ぶこともできることを当業者は認識しているはずである。
本発明は、治療有効量の本発明の抗体（または抗体断片）と第ＶＩＩＩ因子または第ＩＸ因子との組合せを含む医薬組成物であって、第ＶＩＩ因子を含まない、医薬組成物も含む。「第ＶＩＩ因子」には、第ＶＩＩ因子および第ＶＩＩａ因子が含まれる。
生物学的寄託
本発明の代表的な材料を、２０１５年７月２２日にアメリカンタイプカルチャーコレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）、１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖａ．２０１１０〜２２０９、米国に寄託した。ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１２２３２９を有するプラスミドベクターｍＡｂ−ＴＦＰＩ−１０６ ＶＨは、抗体ＴＦＰＩ−１０６の重鎖可変領域をコードするＤＮＡインサートを含み、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１２２３２８を有するプラスミドベクターｍＡｂ−ＴＦＰＩ−１０６ ＶＬは、抗体ＴＦＰＩ−１０６の軽鎖可変領域をコードするＤＮＡインサートを含む。寄託は、特許手続上の微生物の寄託の国際承認に関するブダペスト条約の条項とその下の規制（ｔｈｅ ｐｒｏｖｉｓｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｂｕｄａｐｅｓｔ Ｔｒｅａｔｙ ｏｎ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｄｅｐｏｓｉｔ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｕｒｐｏｓｅ ｏｆ Ｐａｔｅｎｔ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ ａｎｄ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｓ ｔｈｅｒｅｕｎｄｅｒ）（ブダペスト条約）の下で行った。これは、寄託の日から３０年間の寄託物の生存培養の維持を保証する。寄託物は、ブダペスト条約の条項の下で、かつＰｆｉｚｅｒ Ｉｎｃ．とＡＴＣＣとの同意に従ってＡＴＣＣにより入手可能にされることになり、この同意は、関連する米国特許が発行された際または任意の米国もしくは外国特許出願が公衆に公開された際のいずれか早い方に、公衆に寄託物の培養物の子孫の永続的かつ非制限的利用可能性を保証し、米国特許法第１２２条およびそれに従う長官規則（連邦規則法典第３７巻第１．１４条を含み、８８６ＯＧ６３８を特に参照して）に従って資格を与えると米国特許商標庁長官が決定した者に子孫の利用可能性を保証する。
本出願の譲受人は、寄託されている材料の培養物が、適切な条件下で培養された場合に死滅し、または喪失もしくは破壊された場合、材料を別の同じものと通知後即座に置き換えることに同意している。寄託された材料の利用可能性は、任意の政府の権限下でその特許法に従って付与された権利に違反して発明を実施するライセンスとして解釈されるべきでない。
本発明を、以下の実験例を参照して詳細にさらに記載する。これらの実施例は、例示の目的にためだけに提供されており、別段の指定のない限り限定的であるように意図されていない。よって、本発明は、以下の実施例に限定されると決して解釈されるべきでなく、むしろ、本明細書に提供される教示の結果として明白となる任意かつすべてのバリエーションを包含すると解釈されるべきである。
（実施例１）
実験の材料および方法
１．ＴＦＰＩタンパク質試薬
抗ＴＦＰＩ抗体の免疫化、ファージディスプレイ選択、および特徴付けに使用するタンパク質試薬を表１に列挙し、これらの配列番号を表２に列挙する。
ＴＦＰＩコンストラクト（ｐＳＭＥＤ２ベクター）をＨＥＫ２９３Ｆ細胞内で一過性に発現させ、馴化培地をトランスフェクションの１２０時間後に回収した。目的のタンパク質を、ニッケルセファロースＨＰを使用して馴化培地から捕捉し、サイズ排除クロマトグラフィによりさらに精製した。第Ｘａ因子および第Ｘ因子は、Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．から得た。第Ｘａ因子のアミド分解アッセイのための発色基質、Ｓｐｅｃｔｒｏｚｙｍｅ（登録商標）ＦＸａは、Ｓｅｋｉｓｕｉ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓから得た。
Figure 2020096627
Figure 2020096627
２．抗体試薬
比較による目的のために使用したモノクローナル抗体（参照抗体２Ａ８、２Ａ８−２００、３Ｆ１８、ｈｚ４Ｆ３６）を表３に列挙する。抗体の説明、源、および配列を表４（図５）に列挙する。軽鎖および重鎖配列を適切なベクター中にクローン化し、ヒト胚腎臓−２９３（ＨＥＫ−２９３）細胞内で一活性に発現させ、プロテインＡセファロースおよびサイズ排除クロマトグラフィにより精製した。Ｍａｂ ２９７４は、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（カタログ＃ＭＡＢ２９７４）から得た。
Figure 2020096627
３．ＴＦＰＩ結合ＥＬＩＳＡ
組換えｈｕｍＴＦＰＩ Ｋ１Ｋ２、ｍｕｒＴＦＰＩ Ｋ１Ｋ２、ｃｙｎＴＦＰＩ Ｋ１Ｋ２、ｒａｔＴＦＰＩ Ｋ１Ｋ２、ｒａｂＴＦＰＩ Ｋ１Ｋ２、またはＴＦＰＩ２を、ＡｖｉＴａｇ（商標）システムを使用してビオチン化し、ＥＬＩＳＡアッセイ緩衝液中１×１０−８Ｍの濃度でＧｒｅｉｎｅｒストレプトアビジン被覆９６ウェルプレート上に捕捉した。精製した抗ＴＦＰＩ抗体をＥＬＩＳＡアッセイ緩衝液中１μｇ／ｍｌに希釈し、次いで３倍に連続希釈して８点希釈系列を生成した。希釈した抗体を、１ウェル当たり１００μＬの体積で添加した。プレートを室温で２時間インキュベートした。ＰＢＳ／０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０でプレートを洗浄した後、１：１０，０００希釈で西洋ワサビペルオキシダーゼ（Ｐｉｅｒｃｅ）とコンジュゲートされたヤギ抗マウスＩｇＧ−Ｆｃポリクローナル抗体とともにプレートをインキュベートした。インキュベーションの１時間後、結合した抗体を、ＴＭＢ基質溶液を添加して検出した。吸光度を４５０ｎｍで読み取り、データをＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアで分析した。
４．表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）
抗ヒトＦｃセンサーチップを、抗ヒトＩｇＧ抗体（カタログ番号ＢＲ−１００８−３９、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）をカルボキシメチル化デキストラン被覆センサーチップ（ＣＭ５）（カタログ番号ＢＲ１００５３０、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）の４つすべてのフローセルにアミンカップリングして調製した。フローセルを、４００ｍＭ １−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドヒドロクロリド（ＥＤＣ）とＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）との１：１混合物を１０μｌ／分の流量で７分間注入して活性化した。抗ヒトＩｇＧ抗体を１０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ５．０中２５μｇ／ｍｌに希釈し、１０μｌ／分で７分間、すべてのフローセル上に注入した。すべてのフローセルを１Ｍエタノールアミン−ＨＣＬ（ＥＴＨ）で１０μｌ／分にて７分間ブロックした。捕捉抗体の最終固定化レベルは、およそ１０，０００共鳴単位（ＲＵ）であった。固定化および動態のためのランニング緩衝液は、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０（ＨＢＳ−ＥＰ＋）であった。抗ＴＦＰＩ抗体のヒトＴＦＰＩへの結合を特徴付けるために、抗体をＨＢＳ−ＥＰ＋中０．５μｇ／ｍＬに希釈し、フローセル２、３、および４に固定化した抗ヒトＩｇＧにより、５μＬ／分の流量で３０秒〜１分間捕捉して７０〜３００ＲＵの捕捉レベルを実現した。フローセル１は、参照表面として使用した。抗体捕捉後、流量を５０μＬ／分に増やし、緩衝液またはＨＢＳ−ＥＰ＋中０．２ｎＭ〜２００ｎＭの濃度範囲のヒトＴＦＰＩを１．０分の会合についてすべてのフローセル上に注入し、１０〜１５分間解離させた。各捕捉抗体を収集した緩衝液サイクルを二重参照のために使用した（Ｍｙｓｚｋａ，Ｄ．Ｇ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．、１２、２７９〜２８４（１９９９））。各サイクルの最後に、抗ＩｇＧ表面全体を３Ｍ ＭｇＣｌ２の６０秒パルスにより再生した。動態アッセイを、ＢＩＡｃｏｒｅ Ｔ２００計測器（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）により１０Ｈｚの収集率で２５℃にて行った。速度定数および親和性を、ＢＩＡｃｏｒｅ Ｔ２００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアバージョン１．０（ＧＥ）でデータを１：１モデルにフィッティングすることにより判定した。
５．第Ｘａ因子ＴＦＰＩ阻害解除アッセイ
阻害濃度のＴＦＰＩの存在下で第Ｘａ因子活性を回復させる精製抗ＴＦＰＩ抗体の能力をｉｎ ｖｉｔｒｏで査定した。１ｎＭ〜５００ｎＭ濃度範囲でＰＢＳ中に希釈した抗ＴＦＰＩ抗体を、活性緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＣａＣｌ２、０．５ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ）中の１０ｎＭ組換えヒトＴＦＰＩ Ｋ１Ｋ２または１０ｎＭウサギＴＦＰＩ Ｋ１Ｋ２タンパク質とともに、３７℃で３０分間プレインキュベートした。２ｎＭヒト血漿由来第Ｘａ因子を添加し、反応物を３７℃で３０分間インキュベートした。発色基質Ｓｐｅｃｔｒｏｚｙｍｅ Ｘａを、１００μＬの最終反応体積について５００μＭの最終濃度まで添加した。対照反応物には、アッセイバックグラウンドを制御するために第Ｘａ因子を含まない、ＴＦＰＩを含まず、ＦＸａの最大生成（１００％活性）を可能にする、または抗ＴＦＰＩ抗体を含まない（ＰＢＳ単独）反応物が含まれた。反応物の吸光度を、６０分の期間にわたって２分間隔で４０５ｎｍの波長にてＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ５ｅマルチモードプレートリーダーで直ちに読み取った。ＥＣ５０をＰｒｉｓｍ Ｇｒａｐｈ Ｐａｄソフトウェアで算出した。
６．２段階ＴＦ−ＦＶＩＩａ−ＦＸ阻害解除アッセイ
阻害濃度のＴＦＰＩの存在下で第ＶＩＩａ因子−組織因子活性を回復させる精製抗ＴＦＰＩ抗体の能力をｉｎ ｖｉｔｒｏで査定した。１ｎＭ〜５００ｎＭの濃度範囲の抗ＴＦＰＩ抗体を、活性緩衝液中の１０ｎＭ組換えＴＦＰＩタンパク質とともに、３７℃で３０分間プレインキュベートした。およそ１ｐＭの脂質化組織因子および１ｎＭ組換え第ＶＩＩａ因子（ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ）を反応物に添加し、３７℃で５分間インキュベートした。１５０ｎＭヒト第Ｘ因子を反応物に導入した。発色基質Ｓｐｅｃｔｒｏｚｙｍｅ Ｘａを、１００μＬの最終反応体積について各ウェルに５００μＭの最終濃度まで添加した。対照反応物には、第ＶＩＩａ因子を含まない、組織因子を含まない、第Ｘ因子を含まない、ＴＦＰＩを含まない、または抗ＴＦＰＩ抗体を含まない（ＰＢＳ単独）反応物が含まれた。反応物の吸光度を、６０分の期間にわたって２分間隔で４０５ｎｍの波長にてＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ５ｅマルチモードプレートリーダーで直ちに読み取った。ＥＣ５０をＰｒｉｓｍ Ｇｒａｐｈ Ｐａｄソフトウェアで算出した。
７．トロンビン産生アッセイ（ＴＧＡ）
第ＶＩＩＩ因子活性が減弱された血漿中のトロンビン産生を回復させる精製抗ＴＦＰＩ抗体の能力を、較正済み自動化トロンボグラム（ＣＡＴ）システムを使用してトロンビン産生アッセイにおいて査定した。ＰＢＳ中に希釈した１ｎＭ〜５００ｎＭの濃度の抗ＴＦＰＩ抗体を、ヒト第ＶＩＩＩ因子欠乏血漿、ならびに４μＭリン脂質および１ｐＭ組織因子を含有するＰＰＰ−Ｌｏｗ試薬を含有する反応物中に導入した。対照反応物は、抗体を含まないＰＢＳを使用した。反応は、蛍光発生トロンビン基質およびＣａＣｌ２を含有するＦｌｕｃａ緩衝液を添加して誘発した。各反応の蛍光を、６０分にわたって２０秒間隔でＴｈｒｏｍｂｉｎｏｓｃｏｐｅソフトウェアを用いてＦｌｕｏｒｏｓｋａｎ Ａｓｃｅｎｔプレートリーダーを使用して直ちに読み取った。各反応を、ＰＢＳ、トロンビンキャリブレーター、ＦＶＩＩＩ欠乏血漿、およびＦＬＵＣＡ緩衝液を含有するキャリブレーター対照ウェルと比較した。Ｔｈｒｏｍｂｉｎｏｓｃｏｐｅトロンビン産生曲線（ｎＭトロンビン対時間）を、Ｔｈｒｏｍｂｉｎｏｓｃｏｐｅソフトウェア（Ｔｈｒｏｍｂｉｎｏｓｃｏｐｅ ＢＶバージョン）を使用して分析して、遅延時間、ピーク高さ、ピークまでの時間、および曲線下面積または内因性トロンビンポテンシャル（ＥＴＰ）を抽出した。データを使用して速度指数（ピークトロンビン濃度／ピークまでの時間−遅延時間）を算出した。
ＦＶＩＩＩａ活性が減弱されたウサギ血漿中のトロンビン産生を回復させる精製抗ＴＦＰＩ抗体の能力も査定した。正常なニュージーランド白ウサギ血漿を、１００μｇ／ｍｌの最終濃度の抗ＦＶＩＩＩ抗体（ＧＭ−８０１５）または１００μｇ／ｍＬの対照マウス抗ヒトＩｇＧ２ａで３７℃にて６０分間処置した。反応ウェルに添加する直前に、ウサギ血漿を緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１４０ｍＭ ＮａＣｌ）中に１：３に希釈した。ＦＶＩＩＩ中和ウサギ血漿を用いたトロンビン産生アッセイを上述した通りに実施した。
８．構造研究のためのカニクイザルＴＦＰＩ Ｋ２ドメインの生成
カニクイザル（ｃｙｎｏ）ＴＦＰＩ Ｋ１Ｋ２（表１）をＨＥＫ２９３細胞内で発現させ、馴化培地をトランスフェクションの１２０時間後に回収した。精製カニクイザルＴＦＰＩ Ｋ１Ｋ２を、切断が起こるようにヒト好中球エラスターゼ（ＨＮＥ）とともにＲＴにて１２０分間、１：７０（モル比ＨＮＥ：ＴＦＰＩ）でインキュベートした。カニクイザルＫ２からのカニクイザルＫ１の分離を、ＨＱ５０（Ｐｏｒｏｓ）上の陰イオン交換クロマトグラフィを使用して実施した。Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５を使用するサイズ排除クロマトグラフィを、最終精製ステップとして実施した。エンドプロテイナーゼＡｓｐＮを使用してカニクイザルＫ２ドメインのＣ末端から残留ＡｖｉＴａｇを切り取った。
９．構造研究のための抗体Ｆａｂ／カニクイザルＴＦＰＩ Ｋ２複合体の生成
抗ＴＦＰＩ抗体４Ｄ８．ｂ１、ＴＦＰＩ−２３、ＴＦＰＩ−２４、２Ａ８−２００（表３）、およびＭａｂ２９７４（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）を、製造者のプロトコール（Ｔｈｅｒｍｏ／Ｐｉｅｒｃｅ）に従って固定化パパインで消化した。ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅを使用して消化物からＦａｂを精製し、次いでこれをカニクイザルＴＦＰＩ Ｋ２との複合体形成に使用した。次いでＦａｂ／カニクイザル ＴＦＰＩ Ｋ２複合体をおよそ１６ｍｇ／ｍｌまで濃縮した。次いで濃縮された複合体を使用してタンパク質結晶化条件についてスクリーニングした。
（実施例２）
マウス抗ＴＦＰＩ抗体の生成
１．マウス免疫化およびハイブリドーマ生成
ＢＡＬＢ／ｃマウス５匹のコホートをそれぞれ、完全フロイントアジュバント中に乳化したｈｕｍＴＦＰＩ Ｋ１Ｋ２ ５μｇおよびｍｕｒＴＦＰＩ Ｋ１Ｋ２タンパク質５μｇの混合物で皮下に免疫した。マウスを、不完全フロイントアジュバント中に乳化した、またはＰＢＳ中に希釈したタンパク質混合物を交互に１週間当たり２回引き続いて免疫した。血液試料を１７日目および２７日目（それぞれ５回目および７回目の免疫化の後）に採取し、血清をＥＬＩＳＡにより循環抗ＴＦＰＩ抗体の存在について試験した。２７日目までに、各マウスは、タンパク質混合物（１０μｇ）の最終追加免疫を腹腔内に受けた。４日後、流入領域リンパ節（腋窩、鼠径部、および膝窩）を回収し、プールしたリンパ節細胞をＰ３Ｘ６３．Ａｇ８．６５３細胞と１：１の比で混合し、電気細胞融合に付した。融合細胞を、ＦＢＳ（２５％）、ＮＣＴＣ−１０９（１２．５％）、Ｇｌｕｔａｍａｘ（１％）、ペニシリン−ストレプトマイシン（１％）、ハイブリドーマクローニングサプリメント（５％）、ならびにＨＡＴ（１×１０−４Ｍヒポキサンチン、４×１０−７Ｍアミノプテリン、および１．６×１０−５Ｍチミジン）を補充したＲＰＭＩ１６４０培地に蒔いた。融合の１４日後、ハイブリドーマ培養上清を、ＥＬＩＳＡによりｈｕｍＴＦＰＩ Ｋ１Ｋ２への結合について試験した。機能アッセイにおけるこれらの結合活性およびこれらの効力に基づいて、３種のハイブリドーマ、４Ｄ８、６Ｂ７、および７Ａ４由来の抗体を選択してさらに特徴付けた。
２．ハイブリドーマ由来抗ＴＦＰＩ抗体のクローニングおよびシーケンシング
ハイブリドーマ４Ｄ８、６Ｂ７、および７Ａ４由来のＲＮＡを調製し、発現抗体由来の可変領域ＤＮＡ配列をＲＴ−ＰＣＲクローニングによって得た。ＰＣＲ産物をＴＯＰＯ−ＴＡクローニングベクター中にクローン化し、次いで従来法によりシーケンシングした。１つの重鎖／軽鎖ｃＤＮＡ対がハイブリドーマ６Ｂ７および７Ａ４から検出された。２つの重鎖／軽鎖ｃＤＮＡ対が４Ｄ８から検出された。
（実施例３）
マウスハイブリドーマ抗ＴＦＰＩ抗体の特徴付け
親ハイブリドーマ４Ｄ８、６Ｂ７、および７Ａ４を限界希釈によりサブクローン化してモノクローナルハイブリドーマ細胞株を得た。陽性サブクローンをｈｕｍＴＦＰＩ Ｋ１Ｋ２との反応性についてＥＬＩＳＡスクリーニングにより同定し、エクスパンドした。各ハイブリドーマの１つのサブクローン由来の精製抗体をさらに特徴付けた。
１．ＴＦＰＩ結合
精製抗ＴＦＰＩ抗体４Ｄ８．Ｂ１、６Ｂ７．Ｃ５、および７Ａ４．Ｄ９を、タンパク質−結合ＥＬＩＳＡにより組換えヒトおよびウサギＴＦＰＩタンパク質への結合について試験した。ｈｕｍＴＦＰＩ Ｋ１Ｋ２−ａｖｉＨｉｓ１０およびｒａｂＴＦＰＩ Ｋ１Ｋ２の両方の各抗体のＥＣ５０値を表５に示す。
Figure 2020096627
表面プラズモン共鳴実験を実行してヒトおよびウサギＴＦＰＩ Ｋ１Ｋ２タンパク質の精製マウス抗ＴＦＰＩ抗体の親和性を査定した。ヒトおよびウサギＴＦＰＩ Ｋ１Ｋ２への各抗体結合のｋａ、ｋｄ、およびＫＤ値を表６に示す。
Figure 2020096627
２．ｉｎ ｖｉｔｒｏ活性アッセイ
抗ＴＦＰＩマウスモノクローナル抗体をＦＸａおよびＴＦ−ＦＸａ−ＦＶＩＩａ阻害解除アッセイならびにトロンビン産生アッセイ（ＴＧＡ）において活性について試験した。最も強力な抗体、４Ｄ８．Ｂ１を選択してさらなる研究に進めた。
Figure 2020096627
（実施例４）
クローン４Ｄ８からのキメラおよびヒト化抗体の生成
１．マウスヒトキメラ抗体４Ｄ８の生成
ハイブリドーマ４Ｄ８に由来する可変領域ｃＤＮＡを哺乳動物発現ベクター中にサブクローン化して、マウス重鎖可変領域をヒトＩｇＧ１ ３Ｍ（ＳＥＱ２０、表４）にインフレームで融合させ、マウス軽鎖可変領域をヒトＩｇカッパ定常領域（ＳＥＱ６２、表４）にインフレームで融合させたキメラ抗体を生成した。キメラコンストラクトをＨＥＫ２９３細胞内に一過性にトランスフェクトした。ハイブリドーマ４Ｄ８から正しい重鎖／軽鎖対を同定するために、合計４つの一過性トランスフェクションを、すべての可能な重鎖および軽鎖組合せを用いて実行した。トランスフェクションの１つから生成した抗体をｈｕ−ｍｕ ４Ｄ８キメラと呼んだ（表３および４）。
２．マウス−ヒトキメラ抗体４Ｄ８（ｍｕ−ｈｕ ４Ｄ８）の特徴付け
Ｍｕ−ｈｕ ４Ｄ８キメラを、タンパク質結合ＥＬＩＳＡ（表８）およびＳＰＲ（表９）によりヒトおよびウサギＴＦＰＩ Ｋ１Ｋ２タンパク質をともに結合させるその能力について試験した。ＫＤおよびＥＣ５０値は、精製マウスＭＡｂ ４Ｄ８．Ｂ１について測定したものと密接に匹敵し、ヒトＩｇＧ１バックグラウンドに移植したマウス可変領域の移植が結合活性を保持したことを実証した。
Figure 2020096627
Figure 2020096627
３．ｈｕ−ｍｕ ４Ｄ８キメラのヒト化
ｈｕ−ｍｕ ４Ｄ８キメラ配列をヒトアクセプターフレームワーク配列へのＣＤＲ移植によりヒト化した。ＤＰ５４フレームワークおよびＤＰＫ９フレームワークを選択した。次いで重鎖および軽鎖コンストラクトの組合せ（表３を参照）を発現させた。抗体を、ＥＬＩＳＡ結合アッセイにおいてヒトおよびウサギＴＦＰＩ結合（表１０）ならびにＳＰＲ結合アッセイにおいてヒトＴＦＰＩ結合（表１１）について試験した。
Figure 2020096627
Figure 2020096627
これらのデータに基づいて、４Ｄ８ Ｖｋ１．１×ＶＨ１．４をさらに特徴付けるために選択し、ｈｚ４Ｄ８と指定した（表３）。ヒト化抗ＴＦＰＩ抗体（ｈｚ４Ｄ８）を、ＦＸａ阻害解除アッセイ、２段階ＴＦ−ＦＶＩＩａ−ＦＸ阻害アッセイ、およびトロンビン産生アッセイにおいて活性についてマウス４Ｄ８．Ｂ１と比較した。表１２のデータは、ヒト化抗体が、マウス抗体と比較して３つすべてのアッセイにおいて活性が改善されており、ＴＦＰＩ結合活性がヒト化抗体内で完全に保持されたことを示すことを示す。
Figure 2020096627
（実施例５）
ファージディスプレイによる追加の抗ＴＦＰＩ抗体の生成
１．ファージディスプレイによる抗ＴＦＰＩ抗体の選択
組換えヒトおよびマウスＴＦＰＩ Ｋ１Ｋ２に結合する単鎖断片可変（ｓｃＦｖ）抗体を、非免疫化ヒトドナーに由来するｓｃＦｖ抗体断片のファージディスプレイライブラリを使用する４ラウンドの選択に従って同定した。ファージ選択は、ストレプトアビジンビーズを使用して溶液中で実施した。結合ファージを、ロータリーシェーカーで室温にて１０分間、１４０ｍＭトリエタノールアミン（ＴＥＡ）ｐＨ１１．５または５０ｍＭ ＭＥＳ ｐＨ５．５とともにインキュベートすることによって溶出し、１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５で中和した。
溶出したファージプールを使用して中期対数期（およそ０．５のＯＤ６００に対応する）まで増殖させた大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＥＲ２７３８培養液１０ｍＬに感染させた。細菌にファージを振盪することなく３７℃で３０分間感染させ、遠心分離によって濃縮し、蒔き、その後３０℃で一晩増殖させた。次ラウンドの選択について、ファージを、２×ＴＹＡＧ／テトラサイクリン２５ｍＬを接種して約０．１のＯＤ６００までレスキューし、０．３〜０．５のＯＤ６００まで３７℃で増殖させた。細胞にＭＫ１３Ｋ０７ヘルパーファージを１：２０の細胞／ヘルパーファージ比で重感染させ、３７℃で振盪することなく３０分間、次いで１５０ｒｐｍで振盪して６０分間インキュベートした。次いで細胞を遠心分離し、ペレットをカナマイシン／非グルコース含有培地中で再懸濁させた。この培養物を２５℃で一晩増殖させた。ファージを遠心分離後に上清中で回収し、次ラウンドの選択で使用した。
２．ＥＬＩＳＡアッセイで使用するための粗製ペリプラズム材料の調製。
ｓｃＦｖ抗体断片は、使用する増殖条件に応じてファージ粒子の表面上または細菌ペリプラズム間隙内の溶液中で発現させることができる。ペリプラズム中へのｓｃＦｖ抗体断片の放出を誘導するために、０．１％グルコース／１００μｇ／アンピシリン１ｍＬを含む２×ＴＹ培地を含有する９６ディープウェルプレートに解凍グリセロールストックから接種し、３７℃でおよそ４時間増殖させた。細菌ペリプラズムの内容物（ペリプレップ）を浸透圧衝撃によって放出させた。プレートを遠心分離し、ｓｃＦｖ含有上清を回収した。
３．ペリプラズム内で発現されたｓｃＦｖのヒトおよびマウスＴＦＰＩ Ｋ１Ｋ２への結合を測定するためのＥＬＩＳＡ。
合計１９８４のクローンを、すべての分岐選択のラウンド２、３、および４からランダムに精選した。ＴＦＰＩ ｓｃＦｖバインダーをペリプラズム調製物（ペリプレップ）結合ＥＬＩＳＡによって同定した。ビオチン化ヒトおよびマウスＴＦＰＩ Ｋ１Ｋ２を３８４ウェルＮｕｎｃ ＭａｘｉｓｏｒｐストレプトアビジンプレートにＰＢＳ中１μｇ／ｍＬの濃度で被覆した。ＴＦＰＩ Ｋ１Ｋ２溶液を除去し、プレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０／１％ ＢＳＡ／ＰＢＳ中で室温にて１時間ブロックした。ペリプレップを調製し、等体積の６％乳／１％ ＢＳＡ中で室温にて１時間ブロックした。２０μｌ／ウェルのブロック済みペリプラズムｓｃＦｖおよび対照抗体を適切なプレートに移し、室温で１時間インキュベートした。１：２，０００希釈の抗ｍｙｃ西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）または１：１０，０００希釈のヤギ抗ヒトＨＲＰ二次抗体を添加して結合したｓｃＦｖまたは抗ＴＦＰＩ対照抗体を検出した。信号を、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジンを使用して発色させ、吸光度をＥｎｖｉｓｉｏｎプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）で４５０ｎｍにて読み取った。合計８８３のｓｃＦＶクローンをＴＦＰＩバインダーとして同定した。８８３のＴＦＰＩ結合ｓｃＦＶをシーケンシングしてユニーククローンを同定した。２８８のユニーククローンを選択してＴＦＰＩ／ＦＸａ競合的結合について試験した。
４．ＦＸａとヒトおよびマウスＴＦＰＩ Ｋ１Ｋ２への結合を競合するｓｃＦｖを同定するためのＥＬＩＳＡ。
合計２８８のユニーククローンをＦＸａ／ＴＦＰＩ競合的結合ＥＬＩＳＡにおいて試験した。ヒトＦＸａを３８４ウェルＮｕｎｃ ＭａｘｉｓｏｒｐプレートにＰＢＳ中１μｇ／ｍＬの濃度で一晩被覆した。ＦＸａ溶液を除去し、プレート表面を０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０／１％ ＢＳＡ／ＰＢＳ中で室温にて１時間ブロックした。ペリプレップを調製し、等体積の６％乳／１％ ＢＳＡ中で室温にて１時間ブロックした。２０μｌ／ウェルのブロック済みペリプラズムｓｃＦｖおよび対照抗体をビオチン化ｈｕｍＴＦＰＩ Ｋ１Ｋ２と混合し、室温で１時間インキュベートさせた。混合物をＦＸａ被覆プレートに移し、室温で１時間インキュベートした。１：２０００希釈のストレプトアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼを添加して結合したＴＦＰＩを検出した。信号を、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジンを使用して発色させ、吸光度をＥｎｖｉｓｉｏｎプレートリーダーで４５０ｎｍにて読み取った。合計４８のｓｃＦＶ抗体がＴＦＰＩ／ＦＸａ結合の競合性インヒビターとして分類された。
５．ヒトＩｇＧへのＳｃＦｖ変換
ＴＦＰＩ／ＦＸａ競合ＥＬＩＳＡにおいてＴＦＰＩへの結合および阻害を実証したユニーク配列を有する合計４８のＳｃＦｖ抗体を選択して、ヒトＩｇＧ−３Ｍクローニングベクター中にサブクローニングした。手短に言えば、断片を標準的なＰＣＲによって増幅した。ＶＨまたはＶＬ断片をゲル精製し、ヒトＩｇＧ１−３Ｍ（ＶＨ）またはカッパもしくはラムダ定常領域（ＶＫ／ＶＬ）を含有する哺乳動物発現ベクター中にライゲーションした。次いでＶＨおよびＶＫ／ＶＬ対の発現ベクターをＨＥＫ２９３細胞内での一過性哺乳動物発現および精製のために使用した。
６．ヒトＩｇＧ−３Ｍ抗ＴＦＰＩ抗体の特徴付け
４８の抗ＴＦＰＩ抗体を、ＦＸａおよびＴＦ／ＦＶＩＩａ／ＦＸａ阻害解除アッセイを含む様々なアッセイでランク付けした。ＴＦＰＩ−３、ＴＦＰＩ−２１、ＴＦＰＩ−２３、ＴＦＰＩ−２４、およびＴＦＰＩ−２６は、ｈｕｍＴＦＰＩ２ Ｋ１Ｋ２Ｋ３へのＴＦＰＩ異種間の低結合または結合無しなどの望ましい性質を有していた（表１３）。これらの同じ５つの抗体についてのＦＸａおよびＴＦ／ＦＶＩＩａ／ＦＸａ阻害解除アッセイデータを表１４に示し、ＳＰＲ結合データを表１５に示す。
Figure 2020096627
Figure 2020096627
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（実施例６）
ＳＰＲによる抗ＴＦＰＩ抗体のエピトープマッピング
サンドイッチＳＰＲアッセイを使用して、本文書において発見および開示された抗ＴＦＰＩ抗体（ＴＦＰＩ−２１、ＴＦＰＩ−２３、ＴＦＰＩ−２４、４Ｄ８、６Ｂ７．ｃ５、および７Ａ４．Ｄ９）のエピトープをマッピングした。他の公知の参照抗体（ｈｚ４Ｆ３６、２Ａ８−２００、およびＭａｂ２９７４）もエピトープマッピング実験に含めた。抗体１を、ＮＨＳ化学を使用してＣＭ５ ｂｉａｃｏｒｅチップに固定化した。ヒトＴＦＰＩ（ｈｕｍＴＦＰＩ Ｋ１Ｋ２）を、結合が見かけ上の平衡状態付近になるまでチップ上に最初に注入した。ヒトＴＦＰＩ注入を停止した直後に、抗体２をチップ上に注入した。抗体２が、ＣＭ５チップの表面で抗体１とヒトＴＦＰＩとの複合体と結合する場合、抗体２は、抗体１に対して別個の重複しない結合エピトープを有する（＋とスコア付けした）。抗体２が結合を示さない場合、それは、抗体１に対して有意に重複するエピトープ（陰性（−））としてスコア付けされる。抗体２が弱い結合を示す場合、抗体１および２は、ＴＦＰＩエピトープにおいて何らかの部分的な重複を有すると見なされる（＋／−とスコア付けした）。表１６に示した通り、ＴＦＰＩ−２１およびＴＦＰＩ−２３は、同様のエピトープを有し、データは、ＴＦＰＩ−２１およびＴＦＰＩ−２３がｍａｂ２９７４およびｈｚ４Ｆ３６と完全に別個のエピトープを有することも示す。
Figure 2020096627
（実施例７）
ＴＦＰＩ−２３抗体の生殖系列化ヒトフレームワーク
ＴＦＰＩ−２３の２つのバリアントを、ヒトフレームワーク生殖系列残基の含有量を増大させるように作製した。ＴＦＰＩ−１０６は、Ｈ１ＱからＥおよびＨ５ＶからＬへの突然変異（Ｋａｂａｔ番号付け）を含有する。ＴＦＰＩ−１０７（表３および４）は、Ｈ１ＱからＥ、Ｈ５ＶからＬ、およびＨ９４ＩからＫへの突然変異（Ｋａｂａｔ番号付け）を含有した。ＴＦＰＩ−１０６、ＴＦＰＩ−１０７、およびＴＦＰＩ−２３を発現させ、精製し、ＳＰＲによってｈｕｍＴＦＰＩ Ｋ１Ｋ２への結合について試験した。表１７のデータは、ＴＦＰＩ−２３親抗体と比較したとき、ＴＦＰＩ−１０６生殖系列バリアントが完全な結合親和性を保持したことを示す。
Figure 2020096627
（実施例８）
ＴＦＰＩ−２４抗体の生殖系列化ヒトフレームワーク
４つのＴＦＰＩ−２４ ＶＬバリアントを作製し（ＴＦＰＩ−１１０、ＴＦＰＩ−１１１、ＴＦＰＩ−１１２、ＴＦＰＩ−１１３）、ＴＦＰＩ−２４ ＶＨ配列と対合させた。３つのＴＦＰＩ−２４ ＶＨバリアント（ＴＦＰＩ−１０８、ＴＦＰＩ−１０９、ＴＦＰＩ−１１４）を作製し、ＴＦＰＩ−２４ ＶＬ配列と対合させた。これらのデータに基づいて、最良のＶＬバリアント、ＴＦＰＩ−１１３と最良のＶＨバリアント、ＴＦＰＩ−１０８とを対合させて抗体ＴＦＰＩ−１１８を生成した。ＴＦＰＩ−１１８およびＴＦＰＩ−２４を、ＳＰＲによってヒトＴＦＰＩへの結合について試験したところ、表１８の結果は、同等の結合動態を示す。
Figure 2020096627
（実施例９）
抗ＴＦＰＩ抗体の様々な種由来のＴＦＰＩへのＳＰＲ結合動態
抗ＴＦＰＩ抗体（ＴＦＰＩ−１０６、ＴＦＰＩ−１１８、およびｈｚ４Ｆ３６）をＳＰＲによって分析して異なる動物種（ヒト（ｈｕＴＦＰＩ Ｋ１Ｋ２）、カニクイザル（ｃｙｎＴＦＰＩ Ｋ１Ｋ２）、ウサギ（ｒａｂＴＦＰＩ Ｋ１Ｋ２）、マウス（ｍｕｒＴＦＰＩ Ｋ１Ｋ２）、およびラット（ｒａｔＴＦＰＩ Ｋ１Ｋ２）；（表１）由来のＴＦＰＩへの結合動態を判定した。３つのコンパレータ抗体（ｈｚ４Ｆ３６、２Ａ８、および２Ａ８−２００）もこの実験に含めた。
Figure 2020096627
（実施例１０）
抗ＴＦＰＩ抗体／ＴＦＰＩ複合体構造
１．４Ｄ８．ｂ１ Ｆａｂ／カニクイザルＴＦＰＩ Ｋ２複合体構造
４Ｄ８．ｂ１ ＦａｂおよびカニクイザルＴＦＰＩ Ｋ２を１：１のモル比で混合して複合体を形成した。最終精製は、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラムを使用して実施した。複合体を構造研究のために濃縮して１２．６ｍｇ／ｍｌにした。ＴＦＰＩ Ｋ２＋４Ｄ８ Ｆａｂ複合体の結晶を、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．５、２０％ ＰＥＧ１００００中に得た。それは、２．９Åまで回折した棒状結晶を生じた。結晶を一過性に凍結保護し、シンクロトロンデータ収集をＡｄｖａｎｃｅｄ Ｐｈｏｔｏｎ Ｓｏｕｒｃｅにおいてリモートで実施した。画像フレームを、ソフトウェアＡｕｔｏＰＲＯＣ（Ｇｌｏｂａｌ Ｐｈａｓｉｎｇ Ｌｔｄ）を使用して処理した。データは、空間群Ｐ２１２１２１に属し、単位格子は、以下：ａ＝６２．１０２Å、ｂ＝８２．２８４Å、ｃ＝１０３．６２８Å、α＝β＝γ＝９０°の通りであり、非対称単位１つ当たり複合体１つである。４Ｄ８ Ｆａｂのホモロジーモデル、ならびにＴＦＰＩ Ｋ２ドメインの公的に入手可能な構造（ＲＳＣＢタンパク質データバンク、ＰＤＢコード１ＴＦＸおよび４ＤＴＧ）を使用する分子置換検索により、各成分について説得力のある解答が得られた。精密化を、ソフトウェアａｕｔｏＢＵＳＴＥＲ（Ｇｌｏｂａｌ Ｐｈａｓｉｎｇ Ｌｔｄ）を使用して実施したところ、２．９Åにおける最終のＲ／Ｒｆｒｅｅ因子はそれぞれ、０．１７０７および０．２４２４であり、結合のＲＭＳＤは０．０１０Åであり、角度のＲＭＳＤは１．２６°である。Ｆａｂ／ＴＦＰＩ Ｋ２界面における残基の埋没表面積（ＢＳＡ）およびパーセントＢＳＡ（％ＢＳＡ）に基づいて、４Ｄ８ Ｆａｂのエピトープおよびパラトープを判定した。ＴＦＰＩのＫ２ドメイン中の以下の残基が４Ｄ８ Ｆａｂとの直接接触に関与している（ＢＳＡによるエピトープ）：Ｅ１０１、Ｐ１０３、Ｙ１０９、Ｉ１１０、Ｔ１１１、Ｙ１１３、Ｆ１１４、Ｓ１１９、Ｑ１２１、Ｃ１２２、Ｅ１２３、Ｒ１２４、Ｆ１２５、Ｋ１２６、およびＬ１４０。４Ｄ８ Ｆａｂの重鎖中の以下の残基が重鎖パラトープを含む：Ｄ５０、Ｔ５７、Ｌ５８、Ｙ５９、Ｑ６１、Ｋ６４、Ｄ９８、Ｙ９９、およびＤ１００。４Ｄ８ Ｆａｂの軽鎖中の以下の残基が軽鎖パラトープを含む：Ｈ３０、Ｗ５０、Ｈ９１、Ｙ９２、Ｔ９３、Ｔ９４、Ｐ９５、およびＹ９６。エピトープおよびパラトープ残基のＢＳＡおよび％ＢＳＡ値を表２０に示す。
Figure 2020096627
２．２Ａ８＆２Ａ８−２００ Ｆａｂ／カニクイザルＫ１Ｋ２複合体構造
２Ａ８ ＦａｂおよびカニクイザルＴＦＰＩ Ｋ１Ｋ２を１：１のモル比で混合して複合体を形成した。最終精製は、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラムを使用して実施した。複合体を構造研究のために濃縮して１０．８ｍｇ／ｍｌにした。２Ａ８ ＦａｂおよびＴＦＰＩ Ｋ１Ｋ２を含有する複合体の結晶を、以下の２つの条件：（１）３．０Åまで回折した針状結晶を生じた１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、１２．５％ ＰＥＧ８０００；（２）３．３Åまで回折したブロック状結晶を生じた１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、１６００ｍＭ硫酸アンモニウム、２％ ＰＥＧ１０００で得られた。結晶を一過性に凍結保護し、シンクロトロンデータ収集をＡｄｖａｎｃｅｄ Ｐｈｏｔｏｎ Ｓｏｕｒｃｅにおいてリモートで実施した。画像フレームを、ソフトウェアＡｕｔｏＰＲＯＣ（Ｇｌｏｂａｌ Ｐｈａｓｉｎｇ Ｌｔｄ）を使用して処理した。データは、空間群Ｐ３２２１に属し、単位格子は、以下：ａ＝ｂ＝１９６．１４６Å、ｃ＝４１．２６２Å、α＝β＝９０°、γ＝１２０°の通りであり、非対称単位１つ当たり複合体１つである。２Ａ８ Ｆａｂのホモロジーモデル、ならびにＴＦＰＩ Ｋ２ドメインの公的に入手可能な構造（ＲＳＣＢタンパク質データバンク、ＰＤＢコード１ＴＦＸおよび４ＤＴＧ）を使用する分子置換検索により、各成分について説得力のある解答が得られた。精密化を、ソフトウェアＰＨＥＮＩＸを使用して実施したところ３．０Åにおける最終のＲ／Ｒｆｒｅｅ因子はそれぞれ０．１６６７および０．２０８８であり、結合のＲＭＳＤは０．０１１Åであり、角度のＲＭＳＤは１．４７４°である。Ｆａｂ ＴＦＰＩ Ｋ１Ｋ２界面における残基の埋没表面積（ＢＳＡ）およびパーセントＢＳＡ（％ＢＳＡ）に基づいて、複合体のエピトープおよびパラトープを判定した。ＴＦＰＩのＴＦＰＩ Ｋ１Ｋ２ドメイン中の以下の残基が２Ａ８ Ｆａｂとの直接接触に関与している（ＢＳＡによるエピトープ）：Ｄ３１、Ｄ３２、Ｇ３３、Ｐ３４、Ｃ３５、Ｋ３６、Ｅ１００、Ｅ１０１、Ｐ１０３、Ｇ１０４、Ｉ１０５、Ｃ１０６、Ｒ１０７、Ｇ１０８、Ｙ１０９、Ｅ１２３、Ｋ１２６、Ｙ１２７、およびＧ１２８。４Ｄ８ Ｆａｂの重鎖中の以下の残基が重鎖パラトープを含む：Ｇ２６、Ｔ２８、Ｓ３１、Ｙ３２、Ｙ９６、Ｒ９７、Ｙ９８、Ｗ９９、およびＤ１０１（Ｋａｂａｔ番号付け）。２Ａ８ Ｆａｂの軽鎖中の以下の残基が軽鎖パラトープを含む：Ｌ２８、Ｒ２９、Ｎ３０、Ｙ３１、Ｙ３２、Ｙ４９、Ｙ５０、Ｄ５１、およびＮ６６（Ｋａｂａｔ番号付け）。エピトープおよびパラトープ残基のＢＳＡおよび％ＢＳＡ値を表２１に示す。非常に密接に関連している抗体、２Ａ８−２００も、本質的に同一の方法を使用してＴＦＰＩ Ｋ１Ｋ２との複合体中で解明された。この抗体のエピトープおよびパラトープは、２Ａ８のものと同一であった。
Figure 2020096627
３．Ｍａｂ ２９７４ Ｆａｂ／ＴＦＰＩ Ｋ２複合体構造
Ｍａｂ ２９７４（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）ＦａｂおよびカニクイザルＴＦＰＩ Ｋ１Ｋ２を１：１．２のモル比で混合して複合体を形成した。最終精製は、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラムを使用して実施した。複合体を構造研究のために濃縮して１７．５ｍｇ／ｍｌにした。Ｍａｂ ２９７４ ＦａｂおよびＴＦＰＩ Ｋ２を含有する複合体の結晶を、１００ｍＭクエン酸ナトリウムｐＨ５．６、２０％イソプロパノール、２０％ ＰＥＧ４０００中に得た。それは、２．１５Åまで回折したブロック状結晶を生じた。結晶を一過性に凍結保護し、シンクロトロンデータ収集をＡｄｖａｎｃｅｄ Ｐｈｏｔｏｎ Ｓｏｕｒｃｅにおいてリモートで実施した。画像フレームを、ソフトウェアＡｕｔｏＰＲＯＣ（Ｇｌｏｂａｌ Ｐｈａｓｉｎｇ Ｌｔｄ）を使用して処理した。複合体のデータは、空間群Ｐ２１２１２１に属し、単位格子は、以下：ａ＝８２．０７５Å、ｂ＝１１７．８２９Å、ｃ＝１７０．９４５Å、α＝β＝γ＝９０°の通りであり、非対称単位１つ当たり複合体３つである。Ｍａｂ ２９４７ Ｆａｂの配列を利用できなかったので、Ｆａｂ単独の高分解能データセット（１．６３Å）をバイオインフォマティクス分析と連動して収集し、タンパク質配列を解読した。Ｍａｂ ２９７４ Ｆａｂの構造、ならびにＴＦＰＩ Ｋ２ドメインの公的に入手可能な構造（ＲＳＣＢタンパク質データバンク、ＰＤＢコード１ＴＦＸおよび４ＤＴＧ）を使用する分子置換検索により、各成分について説得力のある解答が得られた。精密化を、ソフトウェアａｕｔｏＢＵＳＴＥＲを使用して実施したところ２．１５Åにおける最終のＲ／Ｒｆｒｅｅ因子はそれぞれ０．１７０２および０．２１６１であり、結合のＲＭＳＤは０．０１０Åであり、角度のＲＭＳＤは１．１３°である。Ｆａｂ ＴＦＰＩ Ｋ２界面における残基の埋没表面積（ＢＳＡ）およびパーセントＢＳＡ（％ＢＳＡ）に基づいて、複合体のエピトープを判定した。ＴＦＰＩのＴＦＰＩ Ｋ２ドメイン中の以下の残基がＭａｂ ２９７４ Ｆａｂとの直接接触に関与している（ＢＳＡによるエピトープ）：Ｅ１００、Ｅ１０１、Ｐ１０３、Ｒ１０７、Ｙ１０９、Ｔ１１１、Ｎ１１６、Ｑ１１８、Ｓ１１９、Ｑ１２１、Ｅ１２３、Ｒ１２４、Ｆ１２５、およびＫ１２６。エピトープ残基のＢＳＡおよび％ＢＳＡ値を表２２に示す。
Figure 2020096627
４．ＴＦＰＩ−２３ Ｆａｂ／カニクイザルＴＦＰＩ Ｋ２複合体構造
ＴＦＰＩ−２３ ＦａｂおよびカニクイザルＴＦＰＩ Ｋ２を１：２のモル比で混合して複合体を形成した。最終精製は、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラムを使用して実施した。複合体を構造研究のために濃縮して１２．４ｍｇ／ｍｌにした。ＴＦＰＩ Ｋ２＋４Ｄ８ Ｆａｂ複合体の結晶を１００ｍＭ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ ｐＨ６．５、２０％ ＰＥＧＭＭＥ５０００中に得た。それは、２．９Åまで回折した繊維状結晶を生じた。結晶を一過性に凍結保護し、シンクロトロンデータ収集をＡｄｖａｎｃｅｄ Ｐｈｏｔｏｎ Ｓｏｕｒｃｅにおいてリモートで実施した。画像フレームを、ソフトウェアＡｕｔｏＰＲＯＣ（Ｇｌｏｂａｌ Ｐｈａｓｉｎｇ Ｌｔｄ）を使用して処理した。データは、空間群Ｐ１に属し、単位格子は、以下：ａ＝７４．６６９Å、ｂ＝１０１．３７２Å、ｃ＝１１９．２７５Å、α＝１０１．８３°、β＝９２．２７°、γ＝９６．７８°の通りであり、非対称単位１つ当たり複合体６コピーである。ＴＦＰＩ−２３ Ｆａｂのホモロジーモデル、ならびにＴＦＰＩ Ｋ２ドメインの公的に入手可能な構造（ＲＳＣＢタンパク質データバンク、ＰＤＢコード１ＴＦＸおよび４ＤＴＧ）を使用する分子置換検索により、各成分について説得力のある解答が得られた。精密化を、ソフトウェアａｕｔｏＢＵＳＴＥＲを使用して実施したところ２．９Åにおける最終のＲ／Ｒｆｒｅｅ因子はそれぞれ０．１９６１および０．２３４４であり、結合のＲＭＳＤは０．０１０Åであり、角度のＲＭＳＤは１．２２°である。Ｆａｂ ＴＦＰＩ Ｋ２界面における残基の埋没表面積（ＢＳＡ）およびパーセントＢＳＡ（％ＢＳＡ）に基づいて、複合体のエピトープおよびパラトープを判定した。ＴＦＰＩのＫ２ドメイン中の以下の残基がＴＦＰＩ−２３ Ｆａｂとの直接接触に関与している（ＢＳＡによるエピトープ）：Ｄ１０２、Ｉ１０５、Ｃ１０６、Ｒ１０７、Ｇ１０８、Ｒ１１２、Ｙ１２７、Ｇ１２９、Ｃ１３０、Ｌ１３１、Ｇ１３２、Ｍ１３４、およびＥ１３８。４Ｄ８ Ｆａｂの重鎖中の以下の残基が重鎖パラトープを含む：Ａ３３、Ｗ４７、Ａ５０、Ｉ５１、Ｓ５２、Ｓ５６、Ｙ５８、Ｌ９５、Ｇ９６、Ａ９７、Ｔ９８、Ｓ９９、Ｌ１００、およびＳ１００Ａ。４Ｄ８ Ｆａｂの軽鎖中の以下の残基が軽鎖パラトープを含む：Ａ２９、Ｙ３１、Ｙ９１、Ｓ９５Ａ、Ｇ９５Ｂ、およびＳ９５Ｃ。エピトープおよびパラトープ残基のＢＳＡおよび％ＢＳＡ値を表２３に示す。
Figure 2020096627
５．ＴＦＰＩ−２４ Ｆａｂ／カニクイザルＴＦＰＩ Ｋ２複合体構造
ＴＦＰＩ−２４ ＦａｂおよびカニクイザルＴＦＰＩ Ｋ２を１：２のモル比で混合して複合体を形成した。最終精製は、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラムを使用して実施した。複合体を構造研究のために濃縮して１２．２ｍｇ／ｍｌにした。ＴＦＰＩ Ｋ２／ＴＦＰＩ−２４ Ｆａｂ複合体の結晶を２０％ ＰＥＧ３３５０、２００ｍＭ硝酸アンモニウム中に得た。それは、１．７５Åまで回折した結晶を生じた。結晶を一過性に凍結保護し、シンクロトロンデータ収集をＡｄｖａｎｃｅｄ Ｐｈｏｔｏｎ Ｓｏｕｒｃｅにおいてリモートで実施した。画像フレームを、ソフトウェアＡｕｔｏＰＲＯＣを使用して処理した。データは、空間群Ｐ２１２１２１に属し、単位格子は、以下：ａ＝４２．８１７Å、ｂ＝７１．３６２Å、ｃ＝１４８．７２９Å、α＝β＝γ＝９０°の通りであり、非対称単位１つ当たり複合体１つである。ＴＦＰＩ−２４ Ｆａｂのホモロジーモデル、ならびにＴＦＰＩ Ｋ２ドメインの公的に入手可能な構造（ＲＳＣＢタンパク質データバンク、ＰＤＢコード１ＴＦＸおよび４ＤＴＧ）を使用する分子置換検索により、各成分について説得力のある解答が得られた。精密化を、ソフトウェアａｕｔｏＢＵＳＴＥＲを使用して実施したところ１．７５Åにおける最終のＲ／Ｒｆｒｅｅ因子はそれぞれ０．１９００および０．２２６９であり、結合のＲＭＳＤは０．０１０Åであり、角度のＲＭＳＤは１．１８°である。Ｆａｂ／ＴＦＰＩ Ｋ２界面における残基の埋没表面積（ＢＳＡ）およびパーセントＢＳＡ（％ＢＳＡ）に基づいて、複合体のエピトープおよびパラトープを判定した。ＴＦＰＩのＫ２ドメイン中の以下の残基がＴＦＰＩ−２４ Ｆａｂとの直接接触に関与している（ＢＳＡによるエピトープ）：Ｅ１００、Ｅ１０１、Ｄ１０２、Ｇ１０４、Ｉ１０５、Ｃ１０６、Ｒ１０７、Ｇ１０８、Ｙ１０９、Ｉ１１０、Ｇ１２９、Ｃ１３０、Ｌ１３１、およびＧ１３２。ＴＦＰＩ−２４ Ｆａｂの重鎖中の以下の残基が重鎖パラトープを含む：Ａ３３、Ｑ３５、Ｗ４７、Ｇ５０、Ｉ５１、Ｓ５２、Ｎ５３、Ｒ５５、Ｓ５６、Ｉ５７、Ｇ５８、Ｆ９５、Ｌ９６、Ｈ９７、Ｓ９９、およびＤ１０１。ＴＦＰＩ−２４ Ｆａｂの軽鎖中の以下の残基が軽鎖パラトープを含む：Ｍ３１、Ｙ３２、Ｈ３４、Ｙ３６、Ｌ４６、Ｒ５０、Ｗ９１、およびＹ９６。エピトープおよびパラトープ残基のＢＳＡおよび％ＢＳＡ値を表２４に示す。
Figure 2020096627
６．ｈｚ４Ｆ３６のエピトープ分析
ヒトＴＦＰＩ Ｋ２ドメインとの複合体中のｈｚ４Ｆ３６ ｆａｂの構造は、タンパク質データバンク（ＰＤＢ受託コード４ＤＴＧ）において入手可能である。ｈｚ４Ｆ３６／ＴＦＰＩ Ｋ２複合体構造における界面残基のＢＳＡおよびパーセントＢＳＡ（％ＢＳＡ）に基づいて、エピトープ残基を表２５に示した通り定義した。
Figure 2020096627
７．抗ＴＦＰＩ抗体エピトープの比較
表２０〜２５に示した抗ＴＦＰＩ抗体エピトープが表２６および２７において比較されている。表２６は、ＴＦＰＩ Ｋ２ドメインに特異的である抗体のエピトープを示す。表２７は、Ｋ１およびＫ２ドメインの両方と結合する２つの追加の抗体（２Ａ８および２Ａ８−２００）を含む。
Figure 2020096627
Figure 2020096627
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Figure 2020096627
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（実施例１１）
希釈プロトロンビン時間（ｄＰＴ）
抗ＴＦＰＩ抗体のヒトＦＶＩＩＩ欠乏血漿（血友病Ａ）中の内因性ＴＦＰＩを阻害する能力を、希釈プロトロンビン時間（ＰＴ）アッセイを使用して研究した。希釈ＰＴは、凝血時間を延長するために希釈された組織因子（インノビン）を使用する改変ＰＴアッセイである。
ヒトＦＶＩＩＩ欠乏血漿（Ｇｅｏｒｇｅ Ｋｉｎｇ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ）中のｄＰＴ分析のために、Ｉｎｎｏｖｉｎ（登録商標）試薬を希釈緩衝液（イミダゾール５０ｍＭ、塩化ナトリウム０．１Ｍ、ＢＳＡ １ｍｇ／ｍＬ、塩化カルシウム８．３４ｍＭ、ｐＨ７．４）中で１：３０００に希釈し、３７℃でプレインキュベートした。血漿を３７℃水浴中で５分間解凍し、直後にアッセイした。抗ＴＦＰＩ抗体の希釈液は、ＰＢＳで調製し、血漿に添加し、血漿を室温で２０分間インキュベートした。このインキュベーションの後、血漿５０μＬを３７℃で１分間インキュベートし、凝血反応を、３７℃に加温したＩｎｎｏｖｉｎ（登録商標）試薬の１：３０００希釈液５０μＬを添加して直ちに開始した。凝血するまでの時間を、ＳＴａｒｔ（登録商標）４ Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ Ａｎａｌｙｚｅｒを使用して３７℃で実施した。データ点を２通りに収集し、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ ｅｘｃｅｌに入力し、５０％における有効濃度（ＥＣ５０）をＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（登録商標）を使用して推定した。結果を表３０に示す。
ＴＦＰＩは、凝固の外因性ＦＶＩＩａ／ＴＦ／ＦＸａ経路を下方調節し、ＦＸａおよび最終的にトロンビンの産生を低下させる。ｄＰＴにより、凝固の外因経路に対する効果が測定される。データは、抗ＴＦＰＩ抗体を血友病Ａ血漿に添加すると、凝血時間が用量依存的に短縮されたことを示す。３００ｎＭの対照ＩｇＧは、凝血時間に対して効果を有さなかった。
Figure 2020096627
（実施例１２）
トロンボエラストグラフィ（ＴＥＧ）
トロンボエラストグラフィ（ＴＥＧ）は、全血中の血餅形成の動態を測定する包括的止血アッセイである。全血は、３．２％クエン酸ナトリウムを含有するプラスチック採血管に引き込んで健康ヒトドナーから単離し、組織因子などの凝固活性化因子の導入を最小限にするために、血液の最初の引き込んだ管を廃棄した。クエン酸全血を対照マウス抗ヒトＩｇＧ２（１００ｍｃｇ／ｍＬ）または阻害ＦＶＩＩＩ抗体（ＧＭ１８０５（Ｇｒｅｅｎ Ｍｏｕｎｔａｉｎ）、１００ｍｃｇ／ｍＬ）とともに１時間処置して内因性ＦＶＩＩＩを阻害し、血友病Ａ様表現型を誘導した。抗ＴＦＰＩ抗体またはＩｇＧ１対照抗体を投薬した全血（３２０μＬ）を、０．２Ｍ塩化カルシウム２０μＬ、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ中に希釈した脂質化組織因子（インノビン（登録商標））２０μＬ、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．４を含有するＴＥＧ（登録商標）反応カップに添加し、各反応において１：２００，０００の最終脂質化組織因子希釈液をもたらした。反応を２通りにランさせ、ＴＥＧカップに全血を添加して直ちに始めた。分析は、レベルＩおよびレベルＩＩ対照（Ｈａｅｍｏｎｅｔｉｃｓ）を用いて較正した後、製造者の指示書に従ってＴＥＧ（登録商標）ソフトウェアを使用してＴＥＧ（登録商標）５０００ Ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ分析器で実施した。反応は、３７℃で６０分間実施した。表３１を参照。
Figure 2020096627
表３１は、ＦＶＩＩＩ抗体で全血を処置すると、ＴＥＧ−Ｒ値が４１．５分まで有意に延長されたことを示す。全血の存在下で、抗ＴＦＰＩ１０６は、２Ａ８−２００および４Ｆ３６と比べて好都合なプロファイルを示した。ＴＦＰＩ−１０６、２Ａ８−２００、または４Ｆ３６（３００ｎＭ）を添加すると、ＴＥＧ−Ｒ値がそれぞれ１７．８５分、２０．４分、および２４．０５分短縮された。抗ＴＦＰＩ１０６は、ＴＥＧ−Ｒ値の低下およびＴＥＧ−アルファ角の観察された増大によって示されたように血友病血液の凝固を促進した。
（実施例１３）
ＴＦＰＩの中和およびトロンビン産生
ＴＦＰＩ抗体によるＴＦＰＩの中和を、２つの発色アッセイ、直接的な第Ｘａ因子活性アッセイ、およびＴＦ−ＦＶＩＩａによるＦＸａ産生のＴＦＰＩ阻害に基づく２段階ＦＶＩＩａ／ＴＦ／ＦＸａアッセイを使用して測定した。第１のアッセイでは、ＴＦＰＩ−１０６、ＴＦＰＩ−１１８、ｈｚ４Ｄ８、および２つの参照抗体、４Ｆ３６または２Ａ８−２００を、様々な濃度（０〜５００ｎＭ）で固定濃度のヒト組換えＴＦＰＩ Ｋ１Ｋ２およびＦＸａとともにプレインキュベートして複合体を形成させた。ＦＸａ活性は、発色性ＦＸａ基質を使用して評価した。本発明のＴＦＰＩ抗体を添加すると、このアッセイにおいてＦＸａ活性が用量依存的に増大した（表３２、Ｘａ阻害アッセイ、ＥＣ５０値を参照）。
ｉｎ ｖｉｖｏでは、ＴＦＰＩの２つの支配的な形態は、ＴＦＰＩ−アルファ（Ｋ１Ｋ２Ｋ３）およびＴＦＰＩベータ（Ｋ１Ｋ２）である。ＴＦＰＩ抗体の組換えＴＦＰＩ Ｋ１Ｋ２またはＴＦＰＩ Ｋ１Ｋ２Ｋ３を阻害する能力を、２段階ＦＶＩＩａ／ＴＦ／ＦＸａアッセイで査定した。このアッセイは、ＦＸａおよびＦＶＩＩａ／ＴＦ／ＦＸａの両方のＴＦＰＩ阻害の中和という複合効果を測定する。抗体を漸増濃度（０〜５００ｎＭ）でＴＦＰＩとともにインキュベートし、ＦＶＩＩａ／ＴＦ／ＦＸとともにアッセイに加え、ＦＸａ活性を、ＦＸａ発色性基質を使用して測定した。本発明のＴＦＰＩ抗体は、ＦＶＩＩａ／ＴＦ媒介ＦＸ活性化のＴＦＰＩ Ｋ１Ｋ２阻害を中和した（表３２、ＦＶＩＩａ／ＴＦ／Ｘａ ＥＣ５０値を参照）。本発明の例示的な抗体は、ＴＦＰＩ Ｋ１Ｋ２Ｋ３の阻害においても有効であった（ＴＦＰＩ−１０６のＥＣ５０は、ＴＦＰＩ Ｋ１Ｋ２Ｋ３によるＦＶＩＩａ／ＴＦ／ＦＸａ阻害の中和について８．４７ｎＭである）。データは、全長およびトランケートされたＴＦＰＩの阻害を実証する。
血友病の臨床的重症度は、凝固因子活性の残留レベルに関係している。１％未満の因子活性は、重度の表現型に関連し、中等度の血友病は、２〜５％の因子活性に関連し、軽度は、５％超〜４０％未満の因子活性に関連する。血友病における内因性凝固経路の欠陥は、トロンビンの不十分な産生をもたらす。トロンビン産生アッセイ（ＴＧＡ）を利用して乏血小板血友病血漿中の内因性ＴＦＰＩの阻害を検査した。ＴＧＡアッセイは、トロンビン産生の開始相、活性化相、および不活性化相を測定する。ＴＦＰＩ抗体の乏血小板血友病血漿中のトロンビン産生を回復させる能力を、較正済み自動化トロンビン（ＣＡＴ）産生アッセイを使用して試験した。ＴＦＰＩ−１０６、ＴＦＰＩ−１１８、ｈｚ４Ｄ８、および２つの参照抗体、４Ｆ３６または２Ａ８−２００（０〜５００ｎＭ）を血友病血漿中でインキュベートしてＴＦＰＩを中和した後、アッセイに加えた。正常なヒトプール血漿と比較して、トロンビン産生は、ヒト血友病血漿中で著しく低下する。用量依存的応答が、正常な対照、１Ｕ／ｍＬ ＦＶＩＩＩで標準化されているＦＡＣＴを血友病Ａ血漿中にスパイクしたとき観察された。同様に、２００ｎｇ／ｍＬ（１Ｕ／ｍｌ）のＢ−ドメイン欠失ＦＶＩＩＩを添加すると、トロンビン産生が１００ｎＭに回復した。６０分のアッセイの時間経過にわたって、最小限のトロンビン産生が血友病血漿中で観察された。本発明の抗体とともに血漿をインキュベートすると、ピークトロンビン、内因性トロンビンポテンシャル、および速度指数が用量依存的に増大した。参照抗体２Ａ８−２００および４Ｆ３６も比較のためにアッセイした（表３２、ＴＧＡ速度ＥＣ５０値）。
（実施例１４）
血友病マウスモデルにおけるｉｎ ｖｉｖｏ効力
凝固促進剤としてのある特定の抗ＴＦＰＩ抗体の効力を、血友病マウスにおける急性尾切断アッセイを使用して試験した。このアッセイでは、尾の遠位部分を切断し（ａｍｐｕｔａｔｅｄ）、実質的な失血をもたらした。この失血は、止血剤が、切断（ｔｒａｎｓｅｃｔｉｏｎ）が行われる前または直後に投与される場合低減され得る。血友病マウスは、抗ＴＦＰＩ抗体（６ｍｇ／ｋｇ）、非特異的ＩｇＧ対照（６ｍｇ／ｋｇ）、または生理食塩水媒体の尾静脈を介した４ｍｌ／ｋｇの体積での単回静脈内（ＩＶ）用量を受けた。投薬後の異なる時間に、出血に対する抗体の効果を以下の通り査定した。
マウスを腹腔内にケタミン／キシラジンカクテルを用いて麻酔した。尾を、予加温したリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）５０ｍＬ中に３７℃で２分間浸漬した。３ｍｍの尾切断を行い、血液を１０分の期間にわたってＰＢＳ中に収集した。次いで失血の体積を、以下の技法を使用してＰＢＳのヘモグロビン含有量を測定することにより定量化した。管を遠心分離して赤血球を収集し、溶解緩衝液（８．３ｇ／ｌアンモニウムクロリド、１．０ｇ／ｌ炭酸水素カリウム、および０．０３７ｇ／ｌ ＥＤＴＡ）５ｍＬ中に再懸濁させ、試料の５７５ｎｍにおける吸光度を分光光度計によって測定した。吸光度値を、検量線を使用して全失血（μＬ）に変換した。平均間の差異の統計的有意性を、ＧｒａｐｈＰａｄ（登録商標）Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して分散分析（ＡＮＯＶＡ）、その後ダネット多重比較検定により査定した。結果を平均±平均の標準誤差（ＳＥＭ）として表現する。以下に記載の図において、統計的有意性は、Ｐ値＜０．０５として定義され、データの上のアステリスクによって示されている。
図３Ａは、媒体対照（生理食塩水）と比較した２Ａ８−２００抗体を尾切断前の異なる時間に投薬することの尾切断後の血友病Ａマウス（ＦＶＩＩＩ−／−と表されている）における失血に対する効果を示す。図３Ｂは、媒体対照（生理食塩水）および非特異的ヒトＩｇＧ１（ｈＩｇＧ１と表されている）と比較した２Ａ８抗体を尾切断前の異なる時間に投薬することの尾切断後の血友病Ａマウス（ＦＶＩＩＩ−／−と表されている）における失血に対する効果を示す。図３Ｂは、尾切断前の２つの異なる時間に２Ａ８抗体を投薬することの尾切断後の正常マウス（ＦＶＩＩＩ＋／＋と表されている）における失血に対する効果も示す。図３Ｃは、媒体対照（生理食塩水）と比較した抗体４Ｄ８、２１、２３、および２４を尾切断前の異なる時間に投薬することの尾切断後の血友病Ａマウスにおける失血に対する効果を示す。図３Ｄは、媒体対照（生理食塩水）と比較した抗体１０６を尾切断前の異なる時間に投薬することの尾切断後の血友病Ａマウスにおける失血に対する効果を示す。図３Ｅは、媒体対照（生理食塩水）と比較した抗体１１８を尾切断前の異なる時間に投薬することの尾切断後の血友病Ａマウスにおける失血に対する効果を示す。図４は、媒体対照（生理食塩水）と比較した抗体１０６を尾切断前の異なる時間に投薬することの尾切断後の血友病Ｂマウスにおける失血に対する効果を示す。
図３Ｄおよび図４に示した通り、６ｍｇ／ｋｇ抗ＴＦＰＩ抗体１０６を血友病Ａまたは血友病Ｂマウスに投与すると、抗体が尾切断傷害前の異なる時間に投与されたとき、急性外傷モデルにおいて失血が低下した。血友病Ａマウスにおいて、止血効果は、投与後少なくとも１８９時間も持続したが、投与して２４０時間後までに効果は対照レベルに戻った。血友病Ｂマウスでは、効果は、投与後少なくとも７２時間も持続し、投与して１９２時間後までにベースラインに戻っていた。
上述したデータおよび結果は、抗体ＴＦＰＩ１０６を含めた試験した抗体を、血友病Ａまたは血友病Ｂの対象に予防的に投与して、外傷または他のタイプの出血エピソードの前に出血を低減することができることを示唆する。
血友病Ａマウスにおける止血剤としての抗体ＴＦＰＩ１０６の効果も試験して、それが尾切断直後に投与されたとき出血を低減することができるか否かを判定した。これらの実験は、尾切断前に投与されたときの抗体の効果を試験するものと、尾切断直後にＩＶ用量のＴＦＰＩ１０６（６ｍｇ／ｋｇ）または組換え第ＶＩＩＩ因子（２００ユニット／ｋｇ）を頸静脈内に挿入したカニューレを介して輸注し、その後血液を失血の定量化前に１０分間収集したことを除いて同様の方法を使用して実行した。第２の一連の実験では、異なる用量のＴＦＰＩ１０６および第ＶＩＩＩ因子（２００Ｕ／ｋｇ）を、尾クリップの２分後に血友病Ａマウスに別個に投与し、次いで血液を１０分間収集した後失血を定量化した。
図９Ａは、尾切断直後に投与した６ｍｇ／ｍｌの抗体ＴＦＰＩ１０６が、媒体対照と比較して血友病Ａマウスにおける失血を低減するのに有効であったが、同様に投与した２００Ｕ／ｋｇ第ＶＩＩＩ因子と同じ程度までではなかったことを示す。図９Ｂは、抗体ＴＦＰＩ１０６が、尾切断による傷害の２分後に投与されたとき血友病Ａマウスにおける出血を用量応答的に低減し、試験した最高用量（６ｍｇ／ｋｇ）で、ＴＦＰＩ１０６が、両方が尾切断の２分後に投与されたとき、２００Ｕ／ｋｇの組換え第ＶＩＩＩ因子とほぼ同じぐらい有効であったことを示す。これらの図に記載のデータおよび結果は、抗体ＴＦＰＩ１０６が外傷またはいくつかの他の原因に起因して対象において既に始まっている出血のオンデマンド処置として有効であり得ることを示唆する。
（実施例１５）
薬物動態および産物の代謝
ＴＦＰＩ−１０６の薬物動態（ＰＫ）および／または毒物動態（ＴＫ）を、Ｗｉｓｔａｒ Ｈａｎラット、ニュージーランド白ウサギ、およびカニクイザルに静脈内（ＩＶ）および／または皮下（ＳＣ）投薬した後に特徴付けた。
クエン酸ナトリウムウサギ血漿中の抗ＴＦＰＩを、Ｇｙｒｏｌａｂでサンドイッチイムノアッセイを使用して定量化した。応答単位を、１％光電子増倍管（ＰＭＴ）設定でＧｙｒｏｌａｂ計測器によって読み取った。試料濃度は、１／ｙ２応答重み付け付き５パラメータロジスティック曲線フィットを使用してフィッティングした検量線から内挿して判定した。アッセイ緩衝液における標準点は、０．７８ｎｇ／ｍＬ〜８９１ｎｇ／ｍＬの範囲の５％プールクエン酸ナトリウムウサギ血漿を含有し、１００％ウサギ血漿マトリックスにおける定量化の範囲は、９０ｎｇ／ｍＬ〜５５００ｎｇ／ｍＬであった。５％プールクエン酸ナトリウムウサギ血漿を含有するアッセイ緩衝液中の０．４５、８．０、４７．１５、１５３、および２７５ｎｇ／ｍＬの抗ＴＦＰＩの５つの試料は、品質対照として機能を果たした。
クエン酸ナトリウムラット血漿中の抗ＴＦＰＩも、上述した通りＧｙｒｏｌａｂでサンドイッチイムノアッセイを使用して定量化した。アッセイ緩衝液における標準点は、０．７８ｎｇ／ｍＬ〜８９１ｎｇ／ｍＬの範囲の５％プールクエン酸ナトリウムウサギ血漿を含有し、１００％ラット血漿マトリックスにおける定量化の範囲は、９０ｎｇ／ｍＬ〜５５００ｎｇ／ｍＬであった。５％プールクエン酸ナトリウムラット血漿を含有するアッセイ緩衝液中の０．４５、８．１、４７．１５、１５３、および２７５ｎｇ／ｍＬの抗ＴＦＰＩの５つの試料は、品質対照として機能を果たした。
Ｍｅｓｏ−Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）アッセイプラットフォームを使用する総ヒトＩｇ定量的リガンド結合アッセイを使用して、カニクイザル血漿中の抗ＴＦＰＩ抗体を定量化した。結合抗ＴＦＰＩ抗体を、ルテニウム化（ｒｕｔｈｅｎｙｌａｔｅｄ）マウス抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ抗体を用いて検出してＭＳＤ計測器内で電気化学発光信号を生じさせた。試料濃度は、検量線についての重み付け式が１／ｙ２である、５パラメータロジスティック方程式を使用してフィッティングされる検量線から内挿して判定した。５％サル血漿における標準点は、０．９９９ｎｇ／ｍＬ〜１１５６ｎｇ／ｍＬの抗ＴＦＰＩ抗体の範囲であり、１００％ラット血漿における定量化の範囲は、６４．８ｎｇ／ｍＬ〜７１３６ｎｇ／ｍＬであった。１：２０のＭＲＤに希釈された１００％血漿中の６４．８、１１７、６８０、３９６４、および７１３６ｎｇ／ｍＬの抗ＴＦＰＩ抗体の５つの試料（それぞれ５％血漿中３．２４、５．８３、３４．０、１９８および３５７ｎｇ／ｍＬ）は、品質対照として機能を果たした。
ニュージーランド白ウサギでは、ＴＦＰＩ−１０６は、アイソタイプ対照モノクローナル抗体（ｍＡｂ）と比較してより速いクリアランス（ＣＬ）を呈した。カニクイザルでは、ＴＦＰＩ−１０６は、抗ＴＦＰＩ抗体について観察された標的媒介薬物体内動態（ＴＭＤＤ）と一致して低用量で非線形ＰＫ動態を呈した。表３２を参照。
表３２は、本発明の例示的な抗ＴＦＰＩ抗体（ｈｕｍ４Ｄ８、ＴＦＰＩ−１０６、およびＴＦＰＩ−１０８）、ならびに２つの参照抗体（４Ｆ３６および２Ａ８−２００）のある特定の薬物動態学的性質および薬理活性を要約するものである。
Figure 2020096627
（実施例１６）
ＴＦＰＩの抗体阻害の止血効果は、血友病マウスのレーザー誘導傷害モデルにおいてｉｎ ｖｉｖｏで血小板蓄積およびフィブリン産生を増強する
本明細書の他の場所で以前に述べたように、組織因子経路インヒビター（ＴＦＰＩ）は、組織因子（ＴＦ）／第ＶＩＩａ因子／第Ｘａ因子複合体を直接結合させ、阻害し、ＴＦにより誘導される凝固の開始をモジュレートする血漿セリンプロテアーゼインヒビターである。ＴＦＰＩをブロックすると、ＴＦ／ＦＶＩＩａによって開始される止血が潜在的に促進され、血友病ＡまたはＢにおける第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）または第ＩＸ因子の喪失を補償することができる。本発明の抗体は、広い種交差反応性を伴ってＴＦＰＩを阻害する。本明細書で、ｉｎ ｖｉｖｏでの血小板血餅形成およびフィブリン沈着に対するＴＦＰＩ−１０６の止血効果を、血友病ＡおよびＢマウスにおいて生体内顕微鏡観察（ＩＶＭ）を使用して査定した。
材料および方法：ＴＦＰＩ−１０６抗体、組換え第ＶＩＩＩ因子、および媒体（リン酸緩衝溶液）は、本明細書の他の場所で以前に記載した通り調製した。Ｄｙｌｉｇｈｔ−６４９抗ＣＤ４２ｃ抗体は、Ｅｍｆｒｅｔ Ａｎａｌｙｔｉｃｓ（ドイツ）から得た。フィブリン抗体クローン５９Ｄ８（Ｈｕｉ ＫＹら（１９８３）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２２（４６２８）：１１２９〜１１３２）を、製造者の指示書（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）に従ってタンパク質標識キットを使用してＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８で標識した。体重が平均で３０〜３５グラムの雄血友病Ａマウス（Ｆ８ ＫＯ）は、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）で維持されている独自ラインから得た。マウスを実験手順の前に少なくとも３日間順応させた。
雄血友病Ａ、血友病Ｂ、またはＣ５７ＢＬ／６Ｊ野生型（ＷＴ）マウスに、単回静脈内用量のＴＦＰＩ−１０６（６ｍｇ／ｋｇ）、媒体、組換えヒトＦＶＩＩＩ（ｒＦＶＩＩＩ、２００ＩＵ／ｋｇ）、またはＡｌｅｘａ４８８標識ＴＦＰＩ−１０６（０．７ｍｇ／ｋｇ）を投薬した。麻酔したマウスにおける挙睾筋微小循環を、ＩＶＭを使用して観察した。血小板蓄積およびフィブリン産生を、挙睾筋動脈の血管壁へのレーザー熱傷後に定量化した。血小板を、Ｄｙｌｉｇｈｔ−６４９抗ＣＤ４２ｃ（ＧＰ１ｂβ）を使用して可視化し、フィブリンをＡｌｅｘａ−４８８抗フィブリンクローン５９Ｄ８で検出した。
より具体的には、生体内顕微鏡観察イメージング用血友病Ａマウスを準備するために、動物を、ケタミン／キシラジンカクテルを腹腔内に送達して麻酔した。頸静脈をカニューレ処置し、ペントバルビタールナトリウム（５ｍｇ／ｋｇ、静脈内）を維持麻酔として使用した。気管をカニューレ処置して開放気道を維持した。次いで挙睾筋を露出して微小血管系を可視化した。動物は、イメージング期間全体にわたって露出した挙睾筋組織を温かい緩衝液に浸しながら温かい加温パッド上で維持した。血小板Ｄｙｌｉｇｈｔ６４９ＣＤ４２ｃ（ＧＰ１ｂβ）に対する標識抗体およびフィブリノーゲン（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８抗フィブリンクローン５９Ｄ８）と交差反応しないフィブリン抗体を、頸静脈カニューレを介して輸注した。レーザーの集束ビーム（５３２ナノメートル）でマウス挙睾筋微小血管系に傷害を開始した。各マウスは、２回のレーザー誘導傷害を受けた。第１の傷害を、対照として機能を果たすように未処置のマウスに行った。第２の傷害を同じマウスに行い、ＴＦＰＩ−１０６（６ｍｇ／ｋｇの）を、頸静脈カニューレを介して直ちに静脈内投与した。両方の傷害において、血餅形成を血小板蓄積およびフィブリン沈着の蛍光強度からモニターした。
データ点（蛍光強度）は、ＳｌｉｄｅＢｏｏｋソフトウェア（バージョン６．０）を使用して収集および分析した。蛍光強度中央値を各個々の血餅について時間の関数としてプロットし、対応する曲線下面積を、ＧｒａｐｈＰａｄ（登録商標）Ｐｒｉｓｍソフトウェア（バージョン番号６．０３）を使用して測定した。統計的有意性は、ＧｒａｐｈＰａｄ（登録商標）Ｐｒｉｓｍソフトウェア（バージョン番号６．０３）を使用して、マン−ホイットニー検定を使用して判定した。
結果：ＴＦＰＩを、ＷＴマウスにおいてＡｌｅｘａ４８８標識ＴＦＰＩ−１０６を使用して血小板血餅および内皮の裏層内の血小板蓄積の部位で検出した（図５）。図５Ａは、レーザー誘導傷害後０（パネル５Ａ−１）、１５（図５Ａ−２）、３０（図５Ａ−３）、６０（図５Ａ−４）、９０（図５Ａ−５）、および１２０（図５Ａ−６）秒での、Ａｌｅｘａ４８８を使用して標識した対照ＩｇＧを投与されたＷＴマウスにおけるＤｙｌｉｇｈｔ６４９ ＣＤ４２ｃを使用した血小板の検出を示す６つの上のパネル（１〜６と番号付けられた）を含む。Ａｌｅｘａ４８８標識は、傷害部位における血小板血栓中に検出されなかった（Ｄｙｌｉｇｈｔ６４９ ＣＤ４２ｃを使用して検出した）。図５Ｂは、図の下に沿って６つのパネル（１〜６と番号付けられた）を含み、Ａｌｅｘａ４８８標識ＴＦＰＩ−１０６が、ＷＴマウスにおいてレーザー誘導傷害後に内皮に沿って血小板血栓中で、約１５秒から始まって検出され（図５Ｂ−２）、約３０（図５Ｂ−３）、６０（図５Ｂ−４）、および９０（図５Ｂ−５）秒で蛍光強度が増大し、次いで約１２０秒で強度を持続した（図５Ｂ−６）ことを示し、この場合、血小板は、Ｄｙｌｉｇｈｔ６４９標識ＣＤ４２ｃを使用して検出した。
ＴＦＰＩ−１０６は、約０．５時間において、媒体で処置した血友病マウスＡと比較して、血友病Ａ（Ｆ８ ＫＯ）マウスにおいて血小板蓄積およびフィブリン産生を増強し、効果は、約１６８時間持続した。より具体的には、ＴＦＰＩ−１０６処置Ｆ８ ＫＯマウス（血友病Ａ）において、ＩＶＭは、約０．５時間において傷害部位で緑色蛍光（Ａｌｅｘａ４８８抗フィブリンクローン５９Ｄ８）および赤色蛍光（血小板を検出するＤｙｌｉｇｈｔ６４９標識ＣＤ４２ｃ抗ＧＰ１ｂβ）の増大を示し、それは、約１６８時間において持続し、蛍光パターンは、媒体で処置したＷＴマウスにおいて観察されたものと同様であった。しかし、このような蛍光は、媒体処置血友病Ａマウスにおいて検出されず、血小板蓄積もフィブリン産生も観察されなかった。
血友病Ａマウスは、ＴＦＰＩ−１０６を投薬して約０．５時間後において、ｒＦＶＩＩＩによって実現されるレベルと同様の血小板蓄積（図６Ａ）およびフィブリン沈着（図６Ｂ）の増大を呈した（＊＝Ｐ＜０．００５が各グラフに示されている）。止血効果は、血友病ＡマウスにおいてＴＦＰＩ−１０６について最大で１６８時間持続性であった。同様に、ＴＦＰＩ−１０６処置血友病Ｂマウスも、投薬して約３０分後に止血の改善を同様に実証し、媒体対照と比較して血小板蓄積およびフィブリン産生の増大を伴った。ＴＦＰＩ−１０６投薬血友病マウスも、ｒＦＶＩＩＩ投薬血友病マウスも非血友病ＷＴマウスにおいて観察されたフィブリン沈着の最大レベルに到達しなかった。よって、データは、内皮へのレーザー傷害後、ＴＦＰＩが傷害部位で検出されたことを示す。より重要なことに、データは、ＴＦＰＩ−１０６を血友病マウスに投与すると、レーザー傷害モデルにおいて著しい、かつ持続性の止血の改善がもたらされることを実証する。
（実施例１７）
血友病ＡおよびＢ ＴＧＡにおけるＦＶＩＩａと組み合わせた抗ＴＦＰＩ阻害のトロンビン産生効果
方法：トロンビン産生アッセイ（ＴＧＡ）
トロンビン産生に対する抗ＴＦＰＩ抗体ＴＦＰＩ−１０６の効果を、トロンビン産生アッセイ（ＴＧＡ）を使用して血友病血漿中で、単独で、および組換えＦＶＩＩａ（ｒＦＶＩＩａ）と組み合わせて評価した。クエン酸乏血小板重度血友病Ａ（ＦＶＩＩＩ欠乏）、インヒビターを有する重度血友病Ａ、または血友病Ｂ（ＦＩＸ欠乏）血漿は、Ｇｅｏｒｇｅ Ｋｉｎｇ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ（Ｏｖｅｒｌａｎｄ Ｐａｒｋ、ＫＳ）およびＨＲＦ（Ｒａｌｅｉｇｈ、ＮＣ）から得た先天性欠乏症を有するドナー由来であった。正常なプール血漿（非血友病）は、Ｇｅｏｒｇｅ Ｋｉｎｇ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌから得た。トロンビン産生試薬、ＰＰＰ−試薬ＬＯＷ（反応の最後でリン脂質４μｌおよび１ｐＭ組織因子）、ＦｌｕＣａ緩衝液（塩化カルシウムおよび蛍光発生基質を含有する）、ならびにトロンビンキャリブレーターは、Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ Ｓｔａｇｏ（Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、ＮＪ）から得た。トロンビン産生アッセイは、Ｆｌｕｏｒｏｓｋａｎ Ａｓｃｅｎｔ蛍光プレートリーダー（Ｔｈｒｏｍｂｉｎｏｓｃｏｐｅ ＢＶ、Ｍａａｓｔｒｉｃｈｔ、オランダ）を含む較正済み自動化トロンボグラム（ＣＡＴ）を使用して実施した。
組換えＦＶＩＩａ（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ｐＨ７．４中のｒＦＶＩＩａ）を、血友病Ａ血漿７０μｌに最大で２０μｇ／ｍＬの濃度で添加した。ＰＰＰ−試薬ＬＯＷ ２０μｌおよび抗ＴＦＰＩ１０６ １０μｌを、反応ウェルに１６μｇ／ｍＬの最終濃度で添加した。参照較正済み対照反応は、血漿７０μｌとともにトロンビンキャリブレーター２０μｌを含んでいた。媒体（リン酸緩衝溶液（ＰＢＳ））を使用して０μｇ／ｍＬ濃度を試験した。媒体１０μｌを参照キャリブレーターウェルに添加した。第２のセットの反応では、ＨＥＰＥＳ緩衝液中のｒＦＩＩａ（５μｌ）またはＨＥＰＥＳ緩衝液（５μｌ）を血友病血漿試料（血友病Ａ、インヒビターを有する血友病Ａ、または血友病Ｂ）７０μｌに添加して２μｇ／ｍＬの血漿中のｒＦＶＩＩａの最終濃度にした。ＰＰＰ試薬ＬＯＷ ２０μｌ、および抗ＴＦＰＩ１０６（ＰＢＳ中に希釈した）５μＬまたはＰＢＳ（５μｌ）をｒＦＶＩＩａ投薬血友病血漿試料（７５μｌ）およびＨＥＰＥＳ緩衝液処置血友病血漿（７５μｌ）に添加して１６μｇ／ｍＬの最終濃度にした。さらに、抗ＴＦＰＩ１０６（１６μｇ／ｍＬの）をＨＥＰＥＳ緩衝液処置非血友病血漿（７５μｌ）中でアッセイした。対照未処置非血友病血漿（８０μｌ）を分析に含めた。参照較正済み反応（媒体投薬血友病もしくは非血友病血漿８０μｌまたは未処置非血友病血漿８０μｌを伴ったトロンビンキャリブレーター）を並行してランさせた。すべての反応を２通りにランさせた。試料を３７℃で５分間インキュベートし、次いで反応を、ＦｌｕＣａ ２０μｌを添加することにより１２０μｌの総反応体積で開始した。血漿反応の蛍光をＦｌｕｏｒｏｓｋａｎ Ａｓｃｅｎｔ蛍光光度計で、２０秒間隔で３７℃にて読み取り、参照トロンビンキャリブレーター反応と比較してトロンビン濃度を判定した。蛍光信号の強度を、ＣＡＴを使用して３７℃で連続的にモニターした。
結果：凝固因子ＦＶＩＩＩ（血友病Ａ）およびＦＩＸ（血友病Ｂ）が欠乏すると、安定な血餅を発生させるためにフィブリノーゲンをフィブリンに変換するのに十分なトロンビン産生が妨げられる。抗ＴＦＰＩ−１０６、ＴＦＰＩに特異的に結合し、ＴＦＰＩの阻害活性を阻害および／または中和する新規モノクローナル抗体は、凝固の外因性組織因子／ＦＶＩＩａ経路を標的にする。ＴＦＰＩ−１０６を受けているインヒビターを有する患者は、破綻出血を処置するのにｒＦＶＩＩａも受ける場合がある。よって、血友病血漿中のｒＦＶＩＩａの存在および非存在下でのトロンビン産生に対するＴＦＰＩ−１０６の効果を、当技術分野で認識されているＴＧＡ（トロンビン産生アッセイ）を使用してｉｎ ｖｉｔｒｏで検査した。
クエン酸乏血小板第ＶＩＩＩ因子欠乏ヒト血漿中でトロンビン産生アッセイを使用するｉｎ ｖｉｔｒｏ研究を実施して、ｒＦＶＩＩａの存在下でＴＦＰＩ−１０６の活性を研究した。１つの研究では、抗ＴＦＰＩ１０６を固定濃度（１６μｇ／ｍＬ）、血友病Ａ血漿中でトロンビン産生を増大させることが知られているｒＦＶＩＩａの濃度で第ＶＩＩＩ因子欠乏ヒト血漿に添加した。ｒＦＶＩＩａを最大で２０μｇ／ｍＬまでの漸増濃度でアッセイに添加した。意外にも、ＴＦＰＩ−１０６とｒＦＶＩＩａとの組合せは、トロンビン産生を正常血漿中で観察されるレベルまで回復させた。ＴＦＰＩ−１０６と０．２、２、および２０ｍｇ／ｍＬからの一連のｒＦＶＩＩａ（エプタコグアルファ）との組合せで観察されたピークトロンビンレベルは、同様であった。データは、図７に示した通り、ＴＦＰＩ−１０６がｒＦＶＩＩａを投薬した重度血友病Ａ血漿のトロンビン産生応答を改善したことを実証する（図７、黒色、暗灰色、および薄灰色の実線）。
トロンビン産生に対するＴＦＰＩ−１０６（１６μｇ／ｍＬ；図７、暗灰色点線）は、凝固因子の完全な補体を有するはずである非血友病血漿中でも測定した。ＴＦＰＩ−１０６のＴＦＰＩ外因経路阻害活性と一致して、抗ＴＦＰＩ１０６を添加すると、遅延時間の低下およびピークトロンビンの増大を伴ってトロンビン産生が増大した。ＴＦＰＩ−１０６およびｒＦＶＩＩａの添加によるピークトロンビン約２００ｎＭは、正常な非血友病血漿について報告された範囲内である。
ｒＦＶＩＩａの存在および非存在下でのトロンビン産生に対するＴＦＰＩ−１０６のＴＦＰＩ阻害活性を、追加の血友病Ａ血漿（図８Ａ、１ｐＭ組織因子および４μＭリン脂質）、血友病Ｂ血漿（図８Ｃ、３ＢＵのインヒビター）、ならびにインヒビターを有する血友病Ａ血漿（図８Ｂ、３ＢＵのインヒビター）中でさらに研究したので結果をそれぞれ図８Ａ、８Ｃ、および８Ｂにグラフで示す。ＴＦＰＩ−１０６を血漿に添加して１６μｇ／ｍＬの最終濃度にした。これらの研究におけるｒＦＶＩＩａの最終濃度は、２ｍｇ／ｍＬであった。２μｇ／ｍＬ ｒＦＶＩＩａを血友病血漿に添加すると、媒体対照と比較してトロンビン産生が中程度に増大した。１６μｇ／ｍＬ ＴＦＰＩ−１０６を単独で、またはｒＦＶＩＩａと組み合わせて添加すると、ｒＦＶＩＩａ単独の添加と比較してより高いピークトロンビン濃度および遅延時間の短縮を含みつつトロンビン産生が増大した。トロンビン産生の最小限の相加効果がｒＦＶＩＩａおよびＴＦＰＩ−１０６の共処置後に観察された。１６μｇ／ｍＬ ＴＦＰＩ−１０６を単独で、またはｒＦＶＩＩａと組み合わせて実現されたピークトロンビンレベルは、非血友病血漿中で観察されたものと同等であり、ＴＦＰＩ−１０６を投薬した非血友病血漿中で観察されたレベルを超えなかった。これらのデータは、ＴＦＰＩ−１０６が、血友病Ａ、血友病Ｂ、およびインヒビターを有する血友病Ａ血漿中のトロンビン産生の欠乏を迂回するのに有効であったことを実証する。
（実施例１８）
ヒト血友病血液および血漿中の凝固促進活性
本実施例は、組換え凝固因子の第ＶＩＩＩ因子および第ＩＸ因子と比較した、血友病ＡおよびＢを有するヒト対象から得た全血および血漿を使用して試験したときの抗体ＴＦＰＩ−１０６の止血活性を実証する。
材料および方法。全血および血漿（多血小板および乏血小板）は、施設内倫理委員会承認プロトコール下で年齢が少なくとも１８歳のボランティア血友病患者から得た。対象は、阻害抗体の有無にかかわらず中等度または重度の第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）または第ＩＸ因子（ＦＩＸ）欠乏症を有していたが、その他は健康であり、非出血状態にあった。ボランティアが試験エントリー前の先の４８時間以内に任意の因子補充療法を使用していた、活動性の出血を有していた、または血栓形成の医療歴もしくは家族歴を有していた場合、彼らを除外した。１１人のボランティアのうち、５人が重度のＦＶＩＩＩ欠乏症を有し、２人が中等度のＦＶＩＩＩ欠乏症を有し、１人が中等度のＦＩＸ欠乏症を有し、３人がＦＶＩＩＩインヒビターを有する重度のＦＶＩＩＩ欠乏症を有していた。研究のすべての目的を完了するために、血液４６ｍＬ（１０本の血液管）を、無菌静脈穿刺を介して各ボランティアから収集して３．２％クエン酸ナトリウムを含有する真空管に入れた。
試験品は、ＴＦＰＩ１０６、陰性対照アイソタイプマッチ抗ヒトＩｇＧ１、組換えヒト第ＶＩＩＩ因子、および組換えヒト第ＩＸ因子を含んでおり、これらを実験に応じて全血または血漿に添加した。アッセイに応じて、ＴＦＰＩ１０６を１、５、２０、５０、または１００ｎＭで試験し、対照ＩｇＧ１抗体を１００ｎＭで試験し、組換えＦＶＩＩＩまたはＦＩＸを活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）アッセイに基づいて正常な因子活性の５％、１０％、または４０％を実現するレベルで試験した。所望の濃度を実現するために、試験品を、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、および０．５％ウシ血清アルブミンを含むｐＨ７．４の希釈緩衝液で希釈した。
回転トロンボエラストグラフィ（ＲＯＴＥＭ）、トロンビン産生アッセイ（ＴＧＡ）、および希釈プロトロンビン時間（ｄＰＴ）アッセイを含む３タイプのアッセイを使用して試験品の凝固促進効果を判定した。
ＲＯＴＥＭは、全血試料が低せん断条件下で凝血する際のその粘弾性性質を測定する。凝血が進行するにつれて、試料の粘性が増大し、それをグラフで分析することができる。ＲＯＴＥＭを、Ｐｅｎｔａｐｈａｒｍソフトウェア１．０．０４を使用するＲＯＴＥＭ分析器（Ｐｅｎｔａｐｈａｒｍ ＧｍｂＨ、Ｍｕｎｉｃｈ、ドイツ）を使用して実施して全血中の凝固を査定した。凝血は、１：４２０００の最終反応希釈液のための脂質化組織因子（インノビン、Ｓｉｅｍｅｎｓ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）の１：２３３３希釈液０．０２０ｍＬおよびＣａＣｌ２ ０．０２０ｍＬをクエン酸全血０．３００ｍｌに添加することによって開始した。すべての反応を２通りにランさせた。ＲＯＴＥＭパラメータをモニターし、ＲＯＴＥＭ凝血時間（ＣＴ）を分析した。デバイスソフトウェアで収集したデータをＭｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ ２０１０および／またはＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（バージョン６）にエクスポートして分析した。各ボランティアについて、処置試料のＲＯＴＥＭ凝血時間のパーセント変化を、同じボランティア由来の未処置試料に対して算出した。
トロンビン産生アッセイ（ＴＧＡ）を使用して、トロンビン産生の動態を、Ｈｅｍｋｅｒら、Ｃａｌｉｂｒａｔｅｄ ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｔｈｒｏｍｂｉｎ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｉｎ ｃｌｏｔｔｉｎｇ ｐｌａｓｍａ．、Ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｌ Ｈａｅｍｏｓｔ Ｔｈｒｏｍｂ、３３：４〜１５（２００３）の方法に従ってボランティアの血液から調製した多血小板血漿（ＰＲＰ）および乏血小板血漿（ＰＰＰ）中で査定した。手短に言えば、試験品を投薬した全血の試料を、１５０×ｇで室温にて１０分間遠心分離してＰＲＰを得、または２５００×ｇで室温にて１５分間遠心分離してＰＰＰを得た。未使用血漿を凍結し、−８０℃で貯蔵した。ＰＲＰ血漿では、血小板数を自己のＰＰＰを用いて１マイクロリットル当たり１５０，０００個の血小板に調整した。トロンビン産生を新鮮なＰＲＰ中で直ちに測定した。ＰＲＰ試料については、１ｐＭ組織因子（ＰＲＰ試薬、Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ Ｓｔａｇｏ，Ｉｎｃ．、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、ＮＪ）２０μＬおよびＰＲＰ ８０μＬを９６ウェルマイクロタイタープレートのウェルに三つ組みで添加した。トロンビン産生を、ＦＬＵＣａ緩衝液（１６．７ｍｍｏｌ／ｌの最終濃度のＣａＣｌ２および４１７ｍｍｏｌ／Ｌ Ｚ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＡＭＣ蛍光発生トロンビン基質）２０μｌを添加することによって開始した。蛍光強度を、Ｆｌｕｏｒｏｓｋａｎ Ａｓｃｅｎｔ蛍光光度計を使用して検出した。ＰＰＰ試料については、ＰＰＰ試薬−ＬＯＷ（１ｐＭ組織因子および４マイクロモル凝固促進性リン脂質の最終濃度）をＰＲＰ試薬の代わりに使用し、ＰＲＰ試料について記載した通りにランさせた。トロンビン産生を、Ｔｈｒｏｍｂｉｎｏｓｃｏｐｅソフトウェアバージョン５．０．０．７４２（Ｔｈｒｏｍｂｉｎｏｓｃｏｐｅ ＢＶ、Ｍａａｓｔｒｉｃｈｔ、オランダ）を使用して算出した。Ｔｈｒｏｍｂｉｎｏｓｃｏｐｅソフトウェアから得たデータをＭｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ ２０１０および／またはＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（バージョン６）にエクスポートして分析した。各ボランティアについて、処置試料のＴＧＡピークトロンビン濃度のパーセント変化を、同じボランティア由来の未処置試料に対して算出した。
希釈プロトロンビン時間（ｄＰＴ）アッセイを、ＳＴａｒｔ４凝固分析器（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ Ｓｔａｇｏ、Ｐａｒｓｉｐａｎｎｙ、ＮＪ）で実施した。凍結ＰＰＰを解凍し、１、５、２０および１００ｎＭの濃度の抗ＴＦＰＩ１０６または１００ｎＭの濃度のアイソタイプ対照抗体を投薬した。投薬された血漿を３７℃で３０分間インキュベートした後ｄＰＴアッセイ分析を行った。血漿５０マイクロリットルをＳＴａｒｔ４キュベットに添加し、３７℃で６０秒間インキュベートした。反応を、希釈緩衝液（５０ｍＭイミダゾール、０．１Ｍ塩化ナトリウム、１ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン、および８．３４ｍＭ ＣａＣｌ２、ｐＨ７．４）中に調製し、３７℃でプレインキュベートした組織因子試薬（インノビン）の１：６０００希釈液を添加して活性化した。凝血するまでの時間を、反応を２通りにランさせて３７℃で測定した。凝血時間をＭｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ ２０１０またはＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（バージョン６）にエクスポートして分析した。試験品処置試料のｄＰＴ凝血の変化率を、各ボランティアについて未処置試料のｄＰＴ凝血時間を参照して算出した。
図に記載した通り、抗体ＴＦＰＩ−１０６は、ＲＯＴＥＭ法を使用して測定した場合、血友病ＡまたはＢのボランティアから得た全血の凝血を用量依存的に増大させた。具体的には、抗体は、陰性対照と比較して凝血時間を低減し、最大血餅硬度を増大させた。さらに、ＴＦＰＩ−０１０６は、陰性対照と比較して、遅延時間の低減および生じるピークトロンビン濃度の増大によって証明されるように、血友病患者から得た多血小板および乏血小板血漿の両方に添加したとき、トロンビン産生を用量依存的に増大させた。
図１０Ａおよび１０Ｂは、重度血友病Ａのボランティアから得た全血および血漿中のＴＦＰＩ−１０６の凝固促進効果を例示する。図１０Ａは、陰性対照ＩｇＧならびに正常な活性の５％、１０％、および４０％を実現するのに十分な濃度の組換えＦＶＩＩＩと比較した２つの濃度のＴＦＰＩ１０６のＲＯＴＥＭアッセイにおける凝血に対する効果を示す。図１０Ｂは、陰性対照およびＦＶＩＩＩと比較した３つの濃度のＴＦＰＩ−１０６の多血小板血漿中のピークトロンビン産生を示す。アッセイは、ＴＦＰＩ１０６に起因する凝血時間の低減およびピークトロンビン産生の増大の用量依存効果を示す。
図１１Ａ、１１Ｂ、および１１Ｃは、重度血友病ＡおよびＦＶＩＩＩに対する阻害抗体（インヒビター）を有するボランティア由来の全血および血漿中のＴＦＰＩ−１０６の凝固促進効果を例示する。図１１Ａは、陰性対照ＩｇＧと比較した２つの濃度のＴＦＰＩ１０６のＲＯＴＥＭアッセイにおける凝血に対する効果を示す。図１１Ｂは、陰性対照ＩｇＧと比較した３つの濃度のＴＦＰＩ１０６の多血小板血漿中のピークトロンビン産生を示す。図１１Ｃは、陰性対照ＩｇＧと比較した４つの濃度のＴＦＰＩ１０６の希釈ＰＴアッセイにおける乏血小板血漿からの血餅形成に対する効果を示す。アッセイは、ＴＦＰＩ１０６に起因する凝血時間の低減およびピークトロンビン産生の増大の用量依存効果を示す。
図１２Ａ、１２Ｂ、および１２Ｃは、中等度血友病Ａのボランティア由来の全血および血漿中のＴＦＰＩ−１０６の凝固促進効果を例示する。図１２Ａは、陰性対照ＩｇＧならびに正常な活性の５％、１０％、および４０％を実現するのに十分な濃度の組換えＦＶＩＩＩと比較した２つの濃度のＴＦＰＩ１０６のＲＯＴＥＭアッセイにおける凝血に対する効果を示す。図１２Ｂは、陰性対照およびＦＶＩＩＩと比較した３つの濃度のＴＦＰＩ１０６の多血小板血漿中のピークトロンビン産生を示す。図１２Ｃは、陰性対照ＩｇＧと比較した４つの濃度のＴＦＰＩ１０６の希釈ＰＴアッセイにおける乏血小板血漿からの血餅形成に対する効果を示す。アッセイは、ＴＦＰＩ１０６に起因する凝血時間の低減およびピークトロンビン産生の増大の用量依存効果を示す。
図１３Ａ、１３Ｂ、および１３Ｃは、中等度血友病Ｂのボランティア由来の全血および血漿中のＴＦＰＩ−１０６の凝固促進効果を例示する。図１３Ａは、陰性対照ＩｇＧならびに正常な活性の５％、１０％、および４０％を実現するのに十分な濃度の組換え第ＩＸ因子（ＦＩＸ）と比較した２つの濃度のＴＦＰＩ１０６のＲＯＴＥＭアッセイにおける凝血に対する効果を示す。図１３Ｂは、陰性対照およびＦＩＸと比較した３つの濃度のＴＦＰＩ１０６の多血小板血漿中のピークトロンビン産生を示す。図１３Ｃは、陰性対照ＩｇＧと比較した４つの濃度のＴＦＰＩ１０６の希釈ＰＴアッセイにおける乏血小板血漿からの血餅形成に対する効果を示す。アッセイは、ＴＦＰＩ１０６に起因する凝血時間の低減およびピークトロンビン産生の増大の用量依存効果を示す。
図１４Ａ、１４Ｂ、および１４Ｃは、中等度血友病Ａのボランティア由来の全血および血漿中のＴＦＰＩ−１０６の凝固促進効果を例示する。図１４Ａは、正常な活性の５％、１０％、および４０％を実現するのに十分な濃度の組換えＦＶＩＩＩと比較した３つの濃度のＴＦＰＩ１０６のＲＯＴＥＭアッセイにおける凝血に対する効果を示す。各データ点は、ＴＦＰＩ−１０６またはＦＶＩＩＩで処置した単一ボランティアの血液試料の凝血時間の、同じボランティア由来の未処置血液試料の凝血時間と比べたパーセント低下を表す。各処置のデータ点の中の最も広い水平バーは、試験したすべてのボランティア試料の凝血時間の平均パーセント低減を表す。図１４Ｂは、ＦＶＩＩＩと比較した３つの濃度のＴＦＰＩ１０６の多血小板血漿中のピークトロンビン産生を示す。各データ点は、ＴＦＰＩ−１０６またはＦＶＩＩＩで処置した単一ボランティアの血漿試料のピークトロンビン産生の、同じボランティア由来の未処置血漿試料のピークトロンビン産生と比べたパーセント増大を表す。各処置のデータ点の中の最も広い水平バーは、試験したすべてのボランティア試料のピークトロンビン産生の平均パーセント増大を表す。図１４Ｃは、４つの濃度のＴＦＰＩ１０６の希釈ＰＴアッセイにおける乏血小板血漿からの血餅形成に対する効果を示す。各データ点は、ＴＦＰＩ−１０６で処置した単一ボランティアの血漿試料の凝血時間の、同じボランティア由来の未処置血漿試料の凝血時間と比べたパーセント低下を表す。各処置のデータ点の中の最も広い水平バーは、試験したすべてのボランティア試料の凝血時間の平均パーセント低減を表す。希釈ＰＴアッセイは、ＴＦＰＩ−１０６によってもたらされる凝血時間の用量依存的低下を示し、トロンビン産生アッセイは、ＴＦＰＩ−１０６によってもたらされるピークトロンビン産生の用量依存的増大を示した。
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上記で個々のセクションにおいて言及した本発明の様々な特徴および実施形態は、変更すべきところは変更して他のセクションにも必要に応じて適用される。したがって、１つのセクションで特定された特徴は、必要に応じて他のセクションで特定された特徴と組み合わせてもよい。特許、特許出願、論文、教科書、および引用した配列受託番号を含めた本明細書で引用したすべての参考文献、ならびにその中で引用された参考文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。文献および同様の資料の１つまたは複数が本出願と異なる、または矛盾する場合、それだけに限らないが、定義される用語、用語使用法、記載された技法などを含めて、本出願が支配する。

Claims (1)

  1. 組織因子経路インヒビター（ＴＦＰＩ）のＫｕｎｉｔｚドメイン２（Ｋ２）中のエピトープに特異的に結合する単離抗体またはその抗原結合断片であって、エピトープは、
    （ａ）配列番号２の番号付けによる残基Ｉｌｅ１０５、Ａｒｇ１０７、およびＬｅｕ１３１からなる群から選択される残基を含むか、
    （ｂ）配列番号２の番号付けによる残基Ｉｌｅ１０５、Ａｒｇ１０７、Ｌｅｕ１３１からなる群から選択される残基と、Ｃｙｓ１０６、Ｇｌｙ１０８、Ｃｙｓ１３０、およびＧｌｙ１３２からなる群から選択される１個または複数の残基とを含むか、
    （ｃ）配列番号２の番号付けによる残基Ｉｌｅ１０５、Ａｒｇ１０７、Ｌｅｕ１３１からなる群から選択される残基と、Ａｓｐ１０２、Ａｒｇ１１２、Ｔｙｒ１２７、Ｇｌｙ１２９、Ｍｅｔ１３４、およびＧｌｕ１３８からなる群から選択される１個または複数の残基とを含むか、
    （ｄ）配列番号２の番号付けによる残基Ｉｌｅ１０５、Ａｒｇ１０７、Ｌｅｕ１３１からなる群から選択される残基と、Ｃｙｓ１０６、Ｇｌｙ１０８、Ｃｙｓ１３０、およびＧｌｙ１３２からなる群から選択される１個または複数の残基とを含み、Ａｓｐ１０２、Ａｒｇ１１２、Ｔｙｒ１２７、Ｇｌｙ１２９、Ｍｅｔ１３４、およびＧｌｕ１３８からなる群から選択される１個または複数の残基をさらに含む、抗体またはその抗原結合断片。
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