JP2020072708A - 細胞を分離するためのデバイス - Google Patents

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Abstract

【課題】細胞の大きさが近似していることから、大きさによる分離が難しい細胞を、細胞の表面特性の相違を利用して、精度良く、迅速、簡便に分離する方法の提供。【解決手段】マイクロ流路構造を備える微小凝集物除去デバイスであって、前記マイクロ流路構造は、３０μｍより大きい間隔で設置されたピラーにより構成され、前記マイクロ流路構造の前方には試料導入口を、前記マイクロ流路構造の後方には試料排出口を有することを特徴とする微小凝集物除去デバイスに関する。【選択図】図１

Description

本発明は、それぞれに異なる表面特性を備える複数の細胞群の中から、特定の表面特性を有する細胞群を選択的に分離する方法に関する。また、本発明は、血液等、細胞を含む細胞懸濁液に含まれる微小凝集物を除去する方法、及びこの微小凝集物除去機構を備えたデバイス、並びに細胞分離部分を備えたデバイスに関する。
特定の細胞を液性の混合試料（例えば血液や培養液）から分離することは、基礎研究、診断及び治療を行うために必要とされる手法である。一般的には、遠心分離法等を用いて固有密度（比重）を有する細胞（例えば、白血球と赤血球）を分離するのに有用であることが知られている。他にも、フローサイトメトリー法や磁気分離方法といった方法も当該目的に有用であることが判明しており、また、特許文献１にあるように液性の混合試料から、細胞をその大きさによってフィルター構造によって分離する方法も知られている。更に、特許文献２にあるように細胞をその大きさによって決定論的横置換法（Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｓｔｉｃ Ｌａｔｅｒａｌ Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ：ＤＬＤ）と呼ばれる原理を用いた流体デバイスを用いて分離する方法も知られている。
しかしながら、特許文献１、２に記載の分離方法では、液性の混合試料から細胞自身の大きさによって分離を行う方法であるため、異なる種類の細胞であっても、大きさが近似している細胞を分離することは困難である。また、特許文献３に記載の分離方法では、細胞を複合粒子とした後にふるい膜を用いた分離方法を用いているが、このような分離方法をもちいた場合、洗浄の工程を伴うなどの処理に手間がかかることや細胞のロスが生じることなどが問題となっており、迅速で簡便かつ高精度の分離精製方法が必要とされる。このほかにも、特許文献４〜６のような方法が提案されている。
また、血液中の細胞についても、細胞の大きさ等により分離することも試みられている。しかしながら、血液中の循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）の分離は、白血球細胞（１０−２０μｍ）と大きさが近似しているため、上記ＤＬＤ原理に基づく方法では、分離が困難であった。
更に、特許文献１、２に記載の分離方法では、試料中に存在する微小凝集物の影響により、分離の基本原理部分で目詰まりを生じるため、分離の精度を低下させ、または分離を不可能にさせる場合がある。
微小凝集物は、フィブリン、その他の変性タンパク質、脂肪等が凝集して出来る。そして、微小凝集物は白血球等の血球細胞と同等程度の大きさのものから、２００μｍを超えるものもあり、粘性を有していることが特徴である。これらの微小凝集物は、採取直後の新鮮な試料中においても存在しており、保存期間が長いほど、保存温度が低いほど、その数が増し、大きさも増していく傾向がある。また、採取時に抗凝固剤等を混合した試料であっても、この微小凝集物が存在していることが特徴である。
このため、これらの微小凝集物を除去せずに、公知の細胞分離処理を実施すると、微小凝集物によってデバイス中の一部において目詰まりが生じ、目的とする細胞の分離精度が低下することや、処理そのものが困難となる場合がある。
これに対し、特許文献７、特許文献８にあるような微小凝集物除去フィルターを用いた微小凝集物除去の方法が開示されている。しかしながら、これらの方法では、大量の試料を処理できるが、目的とする細胞の損失が生じ、試料中に含まれる希少な細胞を損失することなく分離する際には不適である。また、市販のナイロンメッシュフィルターを用いたろ過除去方法では、目的とする細胞の損失が生じる得ることや、微小凝集物が完全に除去できない場合がある。
国際公報第２００９／０９７２４７号 米国特許第７７３５６５２号 特表２００８−５０７９５６号公報 国際公報第２０１１／１１１７４０号 特表２０１３−５０１９２４号公報 特開２０１３−１４２５４０号公報 特開２０１０−２１３８２０ 特開２００５−２０４７８１
D.W.Inglis, et al, Critical particle size for fractionation by deterministic lateral displacement, Lab on a Chip, 6, 655-658 (2006).
本発明は、細胞の大きさが近似していることから、大きさによる分離が難しい細胞を、細胞の表面特性の相違を利用して、精度良く、迅速、簡便に分離する方法を提供することを課題とするものである。また、本発明は、血液等、細胞を含む細胞懸濁液から、含まれる目的細胞を精度良く分取する際の前処理に用いる方法であり、試料中の目的細胞を損失なく、かつ試料中の微小凝集物を精度良く除去することで、その後の細胞分離において、より精度良く目的の細胞を分取することができる方法、およびデバイスを提供することを課題とするものである。
本発明の一つの態様は、決定論的横置換法（ＤＬＤ）の原理を応用し、担体に目的細胞又は目的外細胞を捕捉させて粒子サイズを増加させた後に、ＤＬＤ原理に基づいて粒子サイズにより細胞を分離する方法に関する。
まず、本発明の第一の態様は、目的細胞及び目的外細胞の２種類以上の細胞を含む細胞懸濁液から、連続的な液体の流れ中で、サイズにより細胞を分離する方法であって、
前記目的細胞の細胞表面に特徴的な構造を認識する対象捕捉物質を、前記細胞懸濁液に加えて、前記目的細胞と前記対象捕捉物質との複合体を生成する工程と、
前記複合体を含む細胞懸濁液を、ＤＬＤマイクロ流路構造を有する分離エリアを備える細胞分離デバイスに導入する工程であって、前記細胞分離デバイスのバッファー導入口にバッファーを加えて流し、および前記細胞懸濁液をサンプル導入口に加えて流し、前記細胞分離デバイスの複数の分離エリア中を通過させる工程と、
前記細胞懸濁液から、決定された閾値以上のサイズを有する複合体を分離する工程であって、閾値よりも小さいサイズを有する細胞は細胞懸濁液の流れと一緒に移動し、且つ閾値以上のサイズを有する複合体は流れに対し斜め方向に変位して移動することで分離する工程と、および、
分離された前記複合体を排出口から回収する工程と、
を備える細胞の分離方法である。
また、本発明の第二の態様は、目的細胞及び目的外細胞の２種類以上の細胞を含む細胞懸濁液から、連続的な液体の流れ中で、サイズにより細胞を分離する方法であって、
前記目的外細胞の細胞表面に特徴的な構造を認識する対象捕捉物質を、前記細胞懸濁液に加えて、前記目的外細胞と前記対象捕捉物質との複合体を生成する工程と、
前記複合体を含む細胞懸濁液を、ＤＬＤマイクロ流路構造を有する分離エリアを備える細胞分離デバイスに導入する工程であって、前記細胞分離デバイスのバッファー導入口にバッファーを加えて流し、および前記細胞懸濁液をサンプル導入口に加えて流し、前記細胞分離デバイスの複数の分離エリア中を通過させる工程と、
前記細胞懸濁液から、決定された閾値以上のサイズを有する複合体を分離する工程であって、閾値よりも小さいサイズを有する細胞は細胞懸濁液の流れと一緒に移動し、且つ閾値以上のサイズを有する複合体は流れに対し斜め方向に変位して移動することで分離する工程と、および、
分離された前記目的細胞を排出口から回収する工程と、
を備える細胞の分離方法である。
さらに、本発明では、前記対象捕捉物質が、前記目的細胞又は前記目的外細胞の細胞表面に特徴的な構造を認識する対象捕捉分子と、前記対象捕捉分子を担持する物質との結合体からなることが好ましく、前記対象捕捉分子が、抗体、ペプチドアプタマー、レクチン、細胞間接着分子、糖鎖、細胞認識性の高分子であることが好ましく、前記対象捕捉分子を担持する物質が、ポリスチレン又はラテックスであることが好ましい。
また、本発明では、決定された閾値が２０〜６０μｍであることが好ましく、３０〜５０μｍであることが更に好ましい。さらに、本発明では、前記細胞懸濁液が血液であることが好ましく、前記目的細胞が腫瘍細胞であることが好ましく、循環腫瘍細胞であること、または上皮系腫瘍細胞であることが更に好ましい。
また、本発明の別の態様は、目的細胞および微小凝集物を含む細胞懸濁液から、連続的な液体の流れ中で微小凝集物を除去する方法であって、第２のマイクロ流路構造を有する除去機構を備える微小凝集物除去デバイスに、細胞懸濁液または細胞懸濁液とバッファー液との混合液を流し、微小凝集物除去デバイスのマイクロ流路中を通過させて、微小凝集物を捕捉する工程、を備えた、微小凝集物を除去する方法である。この微小凝集物を除去する方法は、微小凝集物を含む細胞懸濁液（血液等）中の微小凝集物を除去する方法して有用である。また、この微小凝集物を除去する方法を、上記細胞の分離方法と組み合わせて使用すると、より好適に細胞を分離方法することが出来る。
この目的細胞は、目的細胞と担体物質との複合体を含有しても良い。また、この第２のマイクロ流路構造は、３０μｍより大きい間隔で設置されたピラーにより構成されていることが好ましい。また、この第２のマイクロ流路構造のピラー設置間隔は、微小凝集物を含む細胞懸濁液から目的細胞（例えば、血液から循環腫瘍細胞[ＣＴＣ]）を分離する場合、上記細胞を分離方法と組み合わせて使用する際、ピラー設置間隔は、例えば、８０μｍ〜２５０μｍと設定すればよく、１００μｍ〜２３０μｍと設定することがより好ましく、１２０μｍ〜２２０μｍと設定することが、更に好ましい。
また、この細胞懸濁液は血液であることが好ましく、さらに、この血液は、抗血液凝固試薬が添加されていることが好ましく、この抗血液凝固剤は、トロンビンインヒビターであることがより好ましく、このトロンビンインヒビターは、ＰＰＡＣＫであることが、特に好ましい。
さらに、本発明の別の態様は、第２のマイクロ流路構造を有する除去機構を備える微小凝集物除去デバイスであって、第２のマイクロ流路構造は、３０μｍより大きい間隔で設置されたピラーにより構成され、第２のマイクロ流路の前方には試料導入口を、マイクロ流路の後方には試料排出口を有することを特徴とする微小凝集物除去デバイスである。この第２のマイクロ流路構造は、２つの別々のマイクロ流路構造部分から構成されることが好ましく、この２つの別々のマイクロ流路構造部分の中間には、流れ幅を収束させる部分を有することが好ましい。
さらに、本発明の別の態様は、第２のマイクロ流路構造を有する微小凝集物除去部分と、細胞を分離する細胞分離部分とを連続して備える一体型細胞分離デバイスであって、第２のマイクロ流路構造は、３０μｍより大きい間隔で設置されたピラーにより構成され、第２のマイクロ流路構造の前方には試料導入口を、細胞分離部分の後方には試料排出口を有し、微小凝集物を除去する部分の後方に、細胞を分離する部分を連続して備えることを特徴とする一体型細胞分離デバイスである。この細胞を分離する部分が、決定論的横置換法（ＤＬＤ）に基づくサイズ分画による分離構造であることを特徴とする一体型細胞分離デバイスであることが好ましい。
本発明によれば、従来技術に比較し、細胞自身の大きさの差による分離が困難な細胞を精度良く、迅速、簡便に分離することができる。また、本発明の方法によれば、流路に導入された目的細胞と、目的外細胞に大きさの差異を生じさせて、目的細胞を目的外細胞と分離することにより、細胞自体に加わるダメージが小さいうえに、目的細胞を高精度でかつ選択的に分離することもできる。また、目的細胞の分離に際して、複雑な装置、工程を必要とせず、単純な構造の流路によって目的細胞を分離できる。
また、本発明によれば、従来技術に比較し、目的とする細胞の損失が無く、含まれる微小凝集物を精度良く除去することができる。また、本発明によれば、細胞分離デバイスを用いた手法において、一体型の連続した流路構造とすることにより、微小凝集物を除去した後に目的の細胞を精度良く分離することができる。さらに、本発明の一体型細胞分離デバイスを使用すると、微小凝集物除去機構を有しないデバイスと比較して、送液中の詰まりを防止し、比較的多くの溶液から細胞を分離して処理することが出来る。
本発明の実施形態に係る分離方法の基本原理を説明する模式図である。 本発明の実施形態に係るＤＬＤマイクロ流路の基本構造（分離エリア）を備えた分離デバイスを説明する模式図である。 本発明の実施形態に係るＤＬＤマイクロ流路の基本構造を備えた分離デバイスの鉛直方向断面模式図である。 本発明の実施形態に係る送液部および回収部を備えた分離装置を説明する模式図である。 本発明の実施形態に係る細胞を含む細胞懸濁液及び対象捕捉物質を説明する模式図である。 本発明の実施形態に係る目的細胞を捕捉する分離方法を説明する模式図である。 本発明の実施形態に係る目的外細胞を捕捉する分離方法を説明する模式図である。 本発明の実施例１〜３を説明するための模式図である。 本発明の実施例４を説明するための模式図である。 本発明の実施形態に係る微小凝集物を除去する方法を説明する模式図である。 本発明の実施形態に係る微小凝集物除去デバイスのピラー構造を説明する模式図である。 本発明の実施形態に係る微小凝集物除去デバイスを説明する模式図である。 本発明の実施形態に係る微小凝集物除去デバイス（２つのマイクロ流路構造を有する態様）を説明する模式図である。 本発明の実施形態に係る微小凝集物除去デバイスの側面方向の断面模式図である。 本発明の実施形態に係る微小凝集物除去機構を備えた細胞分離デバイスを説明する模式図である。 本発明の実施例を説明するための模式図である。 本発明の実施例を説明するための微小凝集物の除去の様子（デバイス導入口近傍）を示す図である。 本発明の実施例を説明するための微小凝集物の除去の様子（デバイス中間部）を示す図である。 本発明の実施例を説明するための微小凝集物の除去の様子（デバイス排出口近傍）を示す図である。 本発明の実施例を説明するための微小凝集物の除去の様子（処理前の試料）を示す図である。 本発明の実施例を説明するための微小凝集物の除去の様子（処理後の試料）を示す図である。 本発明の実施例を説明するための分離デバイスにおいて詰まりが解消された様子を示す図である。 本発明の実施例を説明するための分離デバイスにおいて詰まりが解消された様子を示す図である。 本発明の比較例を説明するための分離デバイスにおける詰まりの様子を示す図である。 一体型の細胞分離デバイスの一例を示す平面図である。 一体型の細胞分離デバイスの一例を示す側面図である。 一体型の細胞分離デバイスの平面図、流れ幅を収束させる部分の拡大図および、細胞分離部分の拡大図である。 血液サンプルに特定の抗体を付着させたビーズを加えたサンプルの希釈溶液および、その拡大図である（細胞分離前）。 本発明の分離方法により、目的細胞（ビーズ[黒色部分]および腫瘍細胞[白色部分]の複合体：(c)および拡大図(d)）と目的外細胞（赤血球等(a)）が分離されたことを示す図である。なお、写真(c)と写真(d)の撮影条件は異なる。 分離前の希釈溶液と、本発明の細胞分離方法により分離された目的細胞およびその他血球細胞等を示す。
１．本発明の細胞を分離する原理
本発明は、決定論的横置換法（ＤＬＤ）の原理を応用し、担体に目的細胞又は目的外細胞を捕捉させて粒子サイズを増加させた後に、ＤＬＤ原理に基づいて粒子サイズにより細胞を分離する方法に関するものである。
図１は、本発明の実施形態に係る分離方法の基本原理を説明する模式図である。分離の基本原理には決定論的横置換法（Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｓｔｉｃ Ｌａｔｅｒａｌ Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ：ＤＬＤ）と呼ばれる手法を用いている。
１−１．決定論的横置換法（ＤＬＤ）
決定論的横置換法（ＤＬＤ）とは、わずかにずれたピラー構造に粒子の分散液を流した際、大きい粒子はピラー周囲に生じる流れの変化より斜めに流れるのに対し、小さい粒子は層流に乗って大域的には直線的に進む性質を利用して、寸法によるソーティングを実現する方法である（非特許文献１、図１を参照）。決定論的横置換法とよばれる、規則的な障害物（マイクロピラー）をずらしながら配置した流路を用いる方法では、小さい粒子は流れに乗って直進する一方、大きな粒子は障害物周囲に生じる流れの変化に従い、障害物のずれに沿って斜めに進むことになる。
一般的に、このＤＬＤ原理は、細胞の分離、例えば、血液中の成分、赤血球、白血球、ＣＴＣの分離にも応用されている。寸法選別マイクロポスト構造上に血液細胞を流すことで、ＤＬＤを用いたマイクロ流体デバイス中を通過させることで、細胞の大きさにより、ＤＬＤマイクロ流路により大きめの細胞を選び出すことが出来る。しかしながら、血液中に存在する腫瘍細胞は、白血球と細胞の大きさが近似しているため、両者を分けて分離することは困難である。
本発明では、後述するように、目的細胞又は目的外細胞の細胞表面に特徴的な構造を認識する対象捕捉物質を、細胞懸濁液に加えて、目的細胞又は目的外細胞と対象捕捉物質との複合体を生成させることにより、大きさに差異を設けた後に、ＤＬＤマイクロ流路の基本構造を有する細胞分離デバイスを利用して、細胞を分離するものである。
１−２．ＤＬＤ原理における斜方向に変位する粒子直径の閾値、細胞分離デバイス
非特許文献１に記載のＤＬＤ原理に基づいて、分離をしたい粒径により、斜方向に変位する粒子直径の閾値（Ｄｃ）を設定することが出来る。より具体的には、閾値Ｄｃの設定は、以下の式から求めることが出来る。
Ｄｃ＝２ηＧε 式１
Ｄｃ：斜方向に変位する粒子直径の閾値
η：変数
Ｇ：ピラー間ギャップ
ε：ピラーのずれ角度（tanθ）
そして、上記式１を解くと、下記の近似式２が得られる。
Ｄｃ＝１．４Ｇε0.48 式２
そして、経験則から、０．０６＜ε＜０．１程度の場合に良好であることから、
ε＝tanθ＝１／１５＝０．０６７を用いて、以下の関係式を導くことが出来る。
Ｇ≒２．６２０５７Ｄｃ 式３
そして、上記の式から、斜方向に変位する粒子直径の閾値Ｄｃに基づいて、ピラー間ギャップＧを算出して、特定のピラー間ギャップのピラー（障害物構造）が設置された基本構造部分を有する細胞分離デバイスを作製することが出来る。このようにして、目的の閾値Ｄｃを有するＤＬＤマイクロ流路を有する細胞分離デバイスを作製することが出来る。
まず、図１では、ＤＬＤマイクロ流路の基本構造２０（分離エリア）が示され、矢印方向に向かう流体の流れ方法に対し、一定の規則に従い斜めに配列した障害物構造２１が設けられている。矢印方向に向かう流体中において、障害物構造２１周辺部においては流れ速度の変化が生じる。この連続して配列された障害物構造２１による流れ速度の変化を利用し、ある一定の大きさを閾値として、流体中に含まれる粒子について大きさ依存的に進行方向を変化させることができる。
進行方向の変化について、ある一定の大きさ以上の粒子２２は、連続して配列された障害物構造２１の配置に従い斜め方向に変位していく。一方、ある一定の大きさ（閾値）未満の粒子２３は前述の粒子の振る舞いに従わず、流れ方向に沿って障害物構造２１を迂回しながら直進する。
このように、目的とする大きさを分離可能な閾値設定を行った障害物構造２１の配列パターンを公知の方法（非特許文献１）に従い設計することにより、様々な目的の粒子の大きさ依存的に、流れ方向に対して直行する方向に粒子を分離することができる。更には流れ方向下流部にそれぞれ異なる回収流路を設けることにより、分離した粒子をそれぞれ回収することが可能である。
なお、障害物構造２１の形状は図示のような円柱構造のみに限定されず、目的とする流れ速度変化を生じさせることのできる形状であれば、例えば三角柱のような、多角柱構造とすることも可能である。
図２は、本発明の実施形態に係るＤＬＤマイクロ流路の基本構造を備えた細胞分離デバイス３０を説明する模式図である。以下、細胞分離デバイス３０の基本構造について上面から見た図によって説明を行う。まず、流体の入口構造としては、サンプル導入口３１及び、バッファー導入口３２とを備えている。
また、流体の出口構造としては、斜めに配列された障害物構造部の配置に従った方向に変位して進んだ、閾値（ある一定の大きさ）以上の粒子を含む画分を排出する第一の排出口３３と流れ方向に沿って直進した、ある一定の大きさ未満の粒子を含む画分を排出する第二の排出口３４と、とを備えている。なお、第一の排出口３３及び第二の排出口３４は模式図のようにそれぞれ一つのみには限定されず、目的に応じて複数の出口を有していても良い。
細胞分離デバイスのサンプル導入口３１及びバッファー導入口３２と、第一の排出口３３及び第二の排出口３４との間には、マイクロピラー構造を有するＤＬＤマイクロ流路の基本構造２０が連続的に配置をされており、この連続構造部分により、混合液に含まれる粒子を大きさ流れ方向に対して直交する方向に大きさ依存的に分離することができる。基本構造２０の連続配置部分に関しては、一定して同じ設計の基本構造が連続していても良く、目的に応じて、徐々に設計を変化させた領域を設定することも可能である。バッファー液としては、細胞への影響を避けるために、等張液を一種または複数組合せて使用することが出来、例えば、生理食塩水、ＰＢＳ等を使用すれば良い。
サンプル導入口３１から流体デバイス３０内への入口部分の構造については、混合液を後述のように流す必要がある為、図示のような一定幅の隔壁構造を設けることが好ましい。サンプル導入口３１から送液した混合液はバッファー導入口３２から送液したバッファー溶液と層流（流れ方向に平行して層を成す流れ）を保持しながら、例えば図１８Ａに示すように流れて行き、一定の閾値より大きい粒子は前述の分離原理に従い、流れ方向に対して斜め方向へ変位する事で、図１８Ｂに示すように混合液の層から分離される。一方、一定の閾値未満の大きさの粒子は混合液の層の流れに従い直進して流れる。このように、細胞の分離を行う目的から、サンプル導入口３１の位置は流体デバイス３０における第二の排出口３４側に寄せて設置をする必要がある。
また、第一の排出口３３及び第二の排出口３４の構造は、排出される液量を調整するために、目的に応じて設計を適宜変更することが可能である。例えば、排出口付近の隔壁３８を図面上部から下部に向かって１：１の間隔となるように設けた場合、それぞれの排出口から得られる液量は概ね１：１となる。これに対して、同様に隔壁３８を４９：１の間隔となるように設けた場合、第一の排出口３３から得られる液量を概ね５０倍に濃縮する事が可能である。このように、用途に応じて混合液中の粒子の分離だけでなく、液量の濃縮にも用いることが可能である。例として、図２の隔壁３８や図２１の分岐部３９に示す、ｙとｘの比率を１：１や４９：１などに設定することで実現することが可能である。
図３は、本発明の実施形態に係る細胞分離デバイスの鉛直方向断面の模式図である。細胞分離デバイス３０は、ＤＬＤマイクロ流路の基本構造２０を構成し、それぞれの導入口、排出口構造部等の形状を備えた流路構造部３６と、平面構造部３７との接合によって作成され、その空間に流路空間３５を有している。また、それぞれサンプル導入口３１、バッファー導入口３２、第一の排出口３３、第二の排出口３４部分には、適宜チューブを接合させ、またシリンジ等との接合部を設けることにより、適宜変更を加えて使用することもできる。
流路空間３５の高さは複合体５が通過可能な高さに設定されていれば何ら限定は無いが、精度の良い分離を行う為に、好ましくは複合体５が流路空間３５の高さ方向に同時に２つ以上存在し得ない高さに設定する事が望ましい。
流路構造部３６の部材、及び流路構造の作製方法は公知のいずれかの方法を適宜選択して作製することができる。部材の材料としては、例えば、ガラス、シリコーン、ジメチルポリシロキサン、プラスチック等を用いることができる。また、平面構造部３７については、平坦かつ流路構造部３６と接合可能な材料であれば特に限定されないが、強度を有している、ガラス、プラスチック等を使用することが好ましい。
なお、本細胞分離デバイス３０はそれぞれ基本構造及び導入口、排出口構造部等の形状を備え、流路空間が形成されていれば何ら問題無く、例えば図示の平面構造部３７側の部材にそれぞれ基本構造及び導入口、排出口構造部等の形状を備えている構造とする事もできる。
図４は本発明の実施形態に係る送液部および回収部を備えた分離装置を説明する模式図である。分離装置４０は、ＤＬＤマイクロ流路の基本構造を有する細胞分離デバイス３０に、それぞれサンプル導入口３１にサンプル送液部４１、バッファー導入口３２にバッファー送液部４２を設けている。また、第一の排出口３３に第一の回収部４３、第二の排出口３４に第二の回収部４４を設けている。
サンプル送液部４１とバッファー送液部４２はそれぞれ送液系を備えた機構を有しており、一定の速度でそれぞれ独立した送液が可能である。これらは一定の速度で送液可能な機構であれば特に限定はされないが、例えば、シリンジポンプ等による送液が好適である。また、必要に応じてサンプル送液部４１には複合体５の沈殿、及び凝集を防ぐための攪拌機構や、混合液４を調整する自動化機構を備えていても良い。
第一の回収部４３、第二の回収部４４に関しては排出液を回収できる機構であれば特に限定されないが、分離開始直前、直後で排出液の分画ができる機構等を備えていても良い。
２．本発明の細胞分離方法
以下、本発明の分離方法について、図を参照しながら説明する。
本発明は、上記のように、目的細胞及び目的外細胞の２種類以上の細胞を含む細胞懸濁液を、連続的な液体の流れ中で、サイズにより細胞を分離する方法である。なお、「細胞懸濁液」としては、目的細胞及び目的外細胞の２種類以上の細胞を含むものであれば、特に限定されないが、例えば、血液、リンパ液、唾液、尿、涙等の体液を例示できる。
２−１．目的細胞又は目的外細胞と対象捕捉物質との複合体を生成する工程
図５は、本発明の実施形態に係る細胞を含む細胞懸濁液及び対象捕捉物質を説明する模式図である。まず、目的細胞２および目的外細胞３を含む細胞懸濁液１に対して、目的細胞の細胞表面に特徴的な構造を認識する対象捕捉分子１０と、対象捕捉分子１０を担持する物質１１との結合体である対象捕捉物質１２を、細胞懸濁液１中に混合させることにより、得られた混合液４中では、目的細胞２と対象捕捉物質１２との複合体５が形成される。
なお、細胞懸濁液１中に含まれる目的外細胞３は１種類に限定されず、対象捕捉分子１０が認識する目的細胞の細胞表面に特徴的な構造を有していない細胞であれば、種類や数は限定されない。また、対象捕捉分子１０は、目的細胞２の細胞表面に特徴的な構造を認識する分子であり、かつ目的細胞２以外の細胞の細胞表面に特徴的な構造を認識しない分子であれば１種類に限定されず、適宜必要な種類や数を、複数選択して使用することもできる。
より詳しくは、対象捕捉分子１０を担持する物質１１に、同一または異なる種類の複数の対象捕捉分子１０を担持させて対象捕捉物質１２を作成しても良い。また、複数の対象捕捉分子１０を担持させる物質１１に、同一種類または、異なる種類の対象捕捉分子１０を担持しても良く、目的の用途に応じて、適宜選択して、対象捕捉物質１２を作成できる。なお、精度良く目的細胞を得るためには、前述の条件を充足する対象捕捉分子１０を複数組み合わせて、使用することが好ましい。更に、対象捕捉分子を担持する物質１１の大きさも目的用途に応じて複数種類の大きさを使い分けて使用することができる。
例えば、目的細胞２が更にａ、ｂ、…、とそれぞれ細胞表面に特徴的な構造を有している場合、対象捕捉分子１０ａを備える物質１１ａ、対象捕捉分子１０ｂを備える物質１１ｂ、…、とをそれぞれ用いることにより、対象捕捉分子を担持する物質１１ａ及び、対象捕捉分子を担持する物質１１ｂ、…、との大きさが違うことを利用し、後の分離工程において複数の分離閾値エリアを通過させることにより、それぞれａ、ｂ、…、の特徴的構造を有する目的細胞をそれぞれの排出口へと分離して、回収することも可能である。
また、目的の用途に応じては、目的外細胞３と対象捕捉分子との複合体粒子を形成させて分離して、目的外細胞を除去することもできる。
より詳しくは、目的細胞２および目的外細胞３を含む細胞懸濁液１に、目的外細胞表面に特徴的な構造を認識する対象捕捉分子１０と、対象捕捉分子１０を担持する物質１１との結合体である対象捕捉物質１２を加えることにより、混合液４中にて、目的外細胞３と対象捕捉物質１２との複合体５を形成させることが可能である（図示せず）。
なお、この場合でも同様に対象捕捉分子１０に関しては、目的外細胞表面に特徴的な構造を認識する分子であり、かつ目的細胞２の細胞表面に特徴的な構造を認識しない分子であれば１種類に限定されず、適宜必要な種類や数を、複数選択して使用することもできる。
対象捕捉分子１０は、複合体５を形成させる細胞の細胞表面に特徴的な構造を認識する分子であり、かつそれ以外の細胞の細胞表面に特徴的な構造を認識しない分子であれば、特に限定はされない。対象捕捉分子１０としては、例えば、抗体、ペプチドアプタマー、レクチン、細胞間接着分子、糖鎖、その他細胞認識性の高分子等のいずれか、または、これらから複数を組み合わせて適宜使用することができる。
対象捕捉分子を担持する物質１１は、金属、無機材料、樹脂などの高分子から形成された部材を使用することが出来る。この部材は、単一材料から形成しても良いし、複数の種類を組合せて使用しても良い。複数の種類の材料を使用する場合、各成分が、均一に混練されるようにして形成された部材を使用することが好ましい。また、対象捕捉分子を担持する物質１１の材質として、高分子ポリマーが選択されてよく、具体的には、ポリスチレンやラテックス等を使用することができる。
この対象捕捉分子を担持する物質１１は、上記の材料からなるものであれば特に部材は限定されないが、この後の分離の段階において重要な要素となるため、比重が均一であるものを使用することが好ましい。更には細胞懸濁液１中での反応の際に、比重が小さい場合、細胞懸濁液中への分散が均一にならない場合があるため、水に近いまたは水よりも比重がやや大きい部材を選択することが好ましい。
対象捕捉物質１２は、上記のように対象捕捉分子１０と、対象捕捉分子１０を担持する物質１１との結合体である。対象捕捉分子１０と、それを担持する物質１１とは、公知の方法により結合させることが出来る。例えば、対象捕捉分子としての抗体を物質１１に固定化するには、物理的吸着による方法、化学結合による方法等を使用することが出来る。化学結合による場合、例えば、表面に水酸基を含む材質から出来ている場合、抗体中のカルボキシル基を活性エステル化した後、水酸基とこのエステル基とを反応させることで、抗体を表面に固定化させることが出来る。また、ＰｒｏｔｅｉｎＡやＰｒｏｔｅｉｎＧを介した結合方法も使用することが可能である。なお、対象捕捉物質１２は、市販されているもの、例えば、抗体を担持させたビーズを購入して使用することも出来る。
対象捕捉物質１２の大きさは、複合体５の大きさが，区別するその他の細胞の大きさよりも、大きくなり且つ区別できるサイズとなるように選択する必要がある。例えば、目的細胞２と対象捕捉物質１２の複合体５を形成し、目的外細胞３との分離を行う場合には、複合体５の大きさを目的外細胞３よりも大きくなければならない。
より詳しくは、目的細胞２の直径が１０〜１４μｍであり、かつ目的外細胞３の直径が８〜１２μｍである場合には、少なくとも対象捕捉物質の直径は２μｍ以上であることが必要であり、より精度良く分離するためには５μｍ以上が好ましく、後の実験に支障をきたさない範囲であれば、更に直径の大きいものを用いることが好ましい。また、ＤＬＤ原理に基づく細胞分離装置、一般的な細胞の大きさ等から、より具体的には、対象捕捉物質１２の大きさは、７μｍ〜６０μｍであり、好ましくは、１５μｍ〜５０μｍであり、更に好ましくは、２０μｍ〜４０μｍである。特に、血液中の循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）は、白血球細胞（１０−２０μｍ）と大きさが近似しているため、血液中からの循環腫瘍細胞を分離する際には、２０μｍ〜４０μｍの直径の対象捕捉物質を使用することが好ましい。
２−２．複合体を、細胞分離デバイスを使用して分離する工程
本発明は、複合体を含む細胞懸濁液を、ＤＬＤマイクロ流路構造を有する分離エリアを備える細胞分離デバイスに導入する工程であって、細胞分離デバイスのバッファー導入口にバッファーを加えて流し、および細胞懸濁液をサンプル導入口に加えて流し、細胞分離デバイスの複数の分離エリア中を通過させる工程、および、細胞懸濁液から、決定された閾値以上のサイズを有する複合体を分離する工程であって、閾値よりも小さいサイズを有する細胞は細胞懸濁液の流れと一緒に移動し、且つ閾値以上のサイズを有する複合体は流れに対し斜め方向に変位して移動することで分離する工程を含む。
２−２−１．目的細胞との複合体を作成して分離する工程
まず、本発明の第一の態様は、目的細胞との複合体を作成したのち、ＤＬＤマイクロ流路構造を有する分離エリアを備える細胞分離デバイスを使用して、決定された閾値以上のサイズを有する複合体を分離するものである。
図６は、本発明の実施形態に係る目的細胞を捕捉する分離方法を説明する模式図である。この方法ではまず、目的細胞２および目的外細胞３を含む細胞懸濁液に対して、目的細胞の細胞表面に特徴的な構造を認識する対象捕捉物質１２を混合させることにより、目的細胞２と対象捕捉物質１２との複合体５を形成させる。
次に、流路空間部を予めバッファーで満たして気泡を除去した状態に準備しておいた細胞分離デバイス３０に対し、前記目的外細胞３及び複合体５を有する混合液４をサンプル導入口３１から細胞分離デバイス３０中に導入し、かつ同時にバッファー導入口３２からバッファーを連続して導入する。その後、細胞分離デバイス３０中では、細胞分離デバイス３０中に連続して設けられたＤＬＤマイクロ流路構造を有する基本構造２０（分離エリア）により目的外細胞３は直進し、一方、複合体５は流れと斜め方向に変位して移動し分離がなされる。この結果、第一の排出口３３から目的細胞２を有する複合体粒子５が得られ、第二の排出口３４からは目的外細胞３が得られる。以上のように、細胞の分離を行うことができる。
本発明では、第一工程で目的細胞との複合体を形成させた後、決定された閾値以上のサイズを有する複合体を分離するものである。この際、閾値は、複合体の大きさにより依存するが、複合体の大きさ、対象捕捉物質の大きさ、目的細胞、および、区別すべき目的外細胞の大きさ等との関係から、好適な範囲を選択することが出来る。
例えば、血液中の細胞の分離に利用する場合を想定すると、赤血球は、６〜８μｍであるが、白血球は９〜１５μｍと比較的大きく、血液中に存在しうる循環性腫瘍細胞（ＣＴＣ）は、１０〜２０μｍ程度であるため、目的外細胞となる白血球と分離するため、閾値は２０μｍ以上であることが好ましく、３０μｍ以上であることが更に好ましい。一方、精度良く分離するためには、比較的大きいサイズの対象捕捉物質を使用することが好ましく、対象捕捉物質の大きさは、上記のように、好ましくは、１５μｍ〜５０μｍであり、更に好ましくは、２０μｍ〜４０μｍである。このため、例えば、大きさが３０μｍの対象捕捉物質を使用した場合には、目的細胞である循環性腫瘍細胞（ＣＴＣ）との複合体は、４０〜５０μｍ程度の大きさになると想定できる。また、好ましい範囲である大きさが２０μｍ〜４０μｍの対象捕捉物質を使用した場合には、複合体の大きさは、３０μｍ〜６０μｍになると想定できる。以上を総合すると決定すべき閾値は、区別すべき目的外細胞の大きさ以上であり、かつ、目的細胞と対象捕捉物質の大きさから想定される複合体の大きさの上限以下であることが、簡易かつ精度良く、目的細胞を分離するためには好ましい。具体的には、決定する閾値Ｄｃは、２０〜６０μｍに設定することが好ましく、３０〜５０μｍに設定することが更に好ましい。
なお、この閾値Ｄｃの範囲は、対象捕捉物質、目的細胞、目的外細胞、および複合体の大きさにより変わることから、目的細胞、目的外細胞、および対象捕捉物質を適宜選択することにより、決定することが出来る。
２−２−２．目的外細胞との複合体を作成して分離する工程
本発明の第二の態様は、目的外細胞との複合体を作成したのち、ＤＬＤマイクロ流路構造を有する分離エリアを備える細胞分離デバイスを使用して、決定された閾値以上のサイズを有する複合体を分離するものである。
図７は、本発明の実施形態に係る目的外細胞を捕捉する分離方法を説明する模式図である。前述の方法に対し、この方法ではまず、目的細胞２および目的外細胞３を含む細胞懸濁液に対して、目的外細胞の細胞表面に特徴的な構造を認識する対象捕捉物質１２を混合させることにより、目的外細胞３と対象捕捉物質１２との複合体５を形成させる。
次に、前述の方法と同様に、流路空間部を予めバッファーで満たして気泡を除去した状態に準備しておいた細胞分離デバイス３０に対し、前記目的細胞２および複合体５を含む混合液４をサンプル導入口３１から細胞分離デバイス３０中に導入し、かつ同時にバッファー導入口３２からバッファーを連続して導入する。その後、細胞分離デバイス３０中では、細胞分離デバイス３０中に連続して設けられた基本構造２０部により目的細胞２及び複合体５は流れ方向と鉛直方向に分離がなされる。その結果、第一の排出口３３から目的外細胞３を有する複合体５が得られ、第二の排出口３４からは目的細胞２が得られる。以上のように、細胞の分離を行うことが出来る。
上記の２つの方法は、目的に応じて適宜使い分けることができる。例えば、目的細胞２に対する対象捕捉分子１０が明確かつ特異性が高い場合には、図６で説明の方法を好適に用いることができる。一方、目的細胞２に対する対象捕捉分子１０が明確でない場合には、図７で説明の方法を用いて目的細胞２を分離することが可能である。また、目的外細胞３の種類や数に応じて、適宜それぞれの手法を使い分けることができる。
更に、分離後の目的に応じて、前記２つの方法を使い分けることができる。例えば、目的細胞２について、複合体５を形成させずそのままの状態で分取したい目的の場合には、図７で説明の方法で実施することができる。また、図６で説明の方法で実施した場合も、公知のいずれかの方法を用いて複合体５を解離させて、目的細胞２と対象捕捉物質１２とに分け、更に公知のいずれかの方法を用いて目的細胞２のみを分離する手法をとることも可能であるが、手順が煩雑であることから、この場合は、図７で説明の方法で実施することが好ましい。
２−３．回収する工程
本発明では、分離された目的細胞を含む複合体を排出口から回収する工程、または、分離された目的細胞を排出口から回収する工程、を含む。本発明の第一の態様のように、目的細胞と対象捕捉物質との複合体を生成させた場合は、複合体を排出口から回収し、本発明の第二の態様のように、目的外細胞と対象捕捉物質との複合体を生成させた場合は、目的細胞を排出口から回収する。これらの回収は、例えば、排出口にチューブを取付けてポンプで吸引する等、適宜公知の方法を使用して行うことが出来る。
２−４．微小凝集物を除去する工程
本発明の細胞を分離する方法において、血液等の微小凝集物を含む細胞懸濁液から、目的細胞を分離する場合、分離工程の前に、後述する微小凝集物を除去する工程を、追加することが好ましい。この工程は、血液等の前処理として行うことも出来るが、上記細胞を分離する方法と組合せる場合、血液等と前記複合体を生成する工程の後で、且つ、細胞分離デバイスに導入する工程の前に、この微小凝集物を除去する工程を設けると、目的細胞の分離を有効に行うことが出来る。
本発明の別の態様は、マイクロ流路構造を有する除去機構を備える微小凝集物除去デバイスにより、血液等に含まれる微小凝集物を除去する方法、及び微小凝集物除去デバイスに関するものである。
３．本発明のデバイスを使用した微小凝集物の除去原理
３−１．本発明の微小凝集物除去デバイス
図１０は、本発明の微小凝集物を除去する方法で使用する、微小凝集物除去機構の基本構造１１０を説明する模式図である。矢印方向に向かう流体の流れ方向に対して、鉛直方向に構造物１１１が設置されており、流れによって試料中の微小凝集物１１２が構造物１１１に捕捉されていく。この構造物１１１を、流れ方向に対して水平方向に、一定間隔で複数設けることにより、順次微小凝集物が構造物により捕捉され、流れ方向の下流に行くに従って試料中の微小凝集物が除去される。
図１１は、微小凝集物除去機構が一定間隔のピラー構造１２１により構成されていることを示す説明図である。一定の規則に従ったピラー構造を配置することにより、順次微小凝集物を捕捉した部分を迂回する流れが生じ、効率的に順次微小凝集物を除去することができる。このように、流れが迂回することで、目的とする細胞等の損失が回避でき、かつ流速の減少を伴わずに処理することが可能である。
このピラーの形状は、例えば、円柱構造としても良いが、目的とする微小凝集物を捕捉できる構造であれば、特に形状は限定されず、例えば、その水平方向断面形状がひし形となるような、多角柱構造とすることも可能である。各ピラーの直径は、例えば、５〜３０μｍ程度の大きさとすることができる。
さらに、このピラー構造は形状の基本構造を一定間隔で連続して配置しても良く、目的に応じて、徐々に形状および配置を変化させて設置することも可能である。このように、ピラー構造は、微小凝集物除去機構全体に規則的な間隔で配置される場合に限定されず、ランダムに設置されてもよい。例えば、流れ方向の上流部では、設置間隔が広く、下流部に行くに従い徐々に設置間隔が狭くするような配置としても良い。更に、除去機構の一部のみにピラー構造を設置したり、除去機構の特定の部分に異なる基本構造のピラー構造を設置しても良い。また流路全体の幅も一様でなくても良く、必要に応じて途中で流路幅を狭めた形状としても良い。
このピラーの設置間隔は、狭くし過ぎると流れ方向の上流部から順次微小凝集物が捕捉されていくため、上流部から優先的に詰まりが生じやすい。このため、試料中に大きい微小凝集物が存在したり、微小凝集物が多く含まれる場合には、流れ方向の上流部ではピラーの設置間隔を広めにとることが好ましく、流れ方向の下流部では、流れ方向の上流部で捕捉しきれなかった小さめの微小凝集物を捕捉するように、上流部に比較し、設置間隔を徐々に狭くする配置が好ましい。上流部のピラー設置間隔が初めから狭い場合には、捕捉された微小凝集物により、除去機構に詰まりが生じ、処理が不可能になる可能性や、目的の細胞等が捕捉されてしまい、損失が生じる可能性がある。
ピラー構造が流れ方向に対して直線状に配置されると、微小凝集物が捕捉されることなく下流までそのまま到達する可能性がある。このため、本発明の微小凝集物を捕捉して除去する目的からは、流れ方向に対して、ピラー構造が直線状に配置されないようにすることが好ましい。例えば、ピラーは流れ方向に対して、概ね、５〜３０個のピラーが流れ方向に設置される毎に１列ずれた配置することができ、１０〜２０個のピラーが流れ方向に設置される毎に１列ずれた配置とすることが、流れを維持して、効率良く微小凝集物を分離するためには好ましい。
ピラーの設置間隔は、細胞懸濁液中に含まれる目的細胞（その目的細胞と担体物質との複合体を含む）の大きさ以上であることが好ましい。設置間隔が、目的細胞の大きさより小さい場合、目的細胞（その目的細胞と担体物質との複合体）がピラー間に捕捉されてしまうため、目的細胞の損失が生じてしまう。
例えば、一般的に血液中に含まれる細胞の大きさは大きいもので３０μｍ程度となることから、血液中の全ての細胞を対象とした分離をする目的であれば、これ以上の大きさにすることが好ましく、例えば、赤血球、血小板の分離が目的であり、白血球を除去する必要がある場合などは、これら細胞を区分する大きさである、８μｍ以上の大きさと設定することができる。
また、予め細胞懸濁液中の目的の細胞に対し、担体物質を結合させ複合体とした後に、微小凝集物の除去を行うこともできる。この場合については、目的細胞（その目的細胞と担体物質との複合体）がピラー間に捕捉されて目的細胞の損失が生じることから、この複合体の大きさ以上であることが好ましい。具体的には、担体物質としては抗体等が標識されたビーズ等が挙げられるが、これに限定されず、任意の物質を担体物質として考えて良い。
例えば、３０μｍの大きさの担体物質を用いて概ね２０μｍの大きさの細胞との複合体とした場合には、ピラーの設置間隔は５０μｍ以上とすることが好ましい。
また、ピラーの設置間隔は、２００μｍ以下の部分を有することが好ましい。微小凝集物の中には、比較的小さい大きさのものも存在するため、除去機構のピラー設置間隔をすべて２００μｍ以上とした場合には、微小凝集物を完全に除けない可能性がある。ただし、すべてのピラー設置間隔が２００μｍ以下である必要は無く、目的に応じてそれ以上の設置間隔のピラー構造を設けることができる。
上記のように、本発明の微小凝集物除去デバイスにおいて、微小凝集物除去機構となるマイクロ流路構造（本明細書中において、「第２のマイクロ流路構造」という場合がある）は、３０μｍより大きい間隔で設置されたピラーにより構成されることが好ましく、また、２００μｍ以下の間隔で設置されたピラーにより構成されることが好ましい。このマイクロ流路構造のピラー設置間隔は、目的細胞（その目的細胞と担体物質との複合体）と、除去する微小凝集物の大きさに依存するが、血液を対象として、血液中の微小凝集物を除去する場合、ピラー設置間隔は、例えば、５０μｍ〜２００μｍと設定すればよく、７０μｍ〜１７０μｍと設定することがより好ましく、９０μｍ〜１５０μｍと設定することが、更に好ましい。なお、このピラー設置間隔は、マイクロ流路構造中に、２つ以上の異なる間隔でピラーが設置される場合、平均の間隔を意味する。
一方、目的細胞と担体物質とを結合させた複合体は、目的細胞と比較して、担体物質の大きさだけ大きくなる。このため、血液中で、この複合体を形成させた場合、血液中の微小凝集物を除去し、且つ、この複合体を回収する（詰まりを防止する）ためには、ピラー設置間隔は、担体物質の大きさだけ広くすることが好ましい。例えば、直径３０〜５０μｍの担体物質を使用した場合、ピラー設置間隔は、例えば、８０μｍ〜２５０μｍと設定すればよく、１００μｍ〜２３０μｍと設定することがより好ましく、１２０μｍ〜２２０μｍと設定することが、更に好ましい。
微小凝集物除去デバイスでは、上記のように、複数のマイクロ流路構造部分を設けても良い。複数のマイクロ流路構造部分を設けることにより微小凝集物の除去効率は上がるが、目的細胞（その目的細胞と担体物質との複合体）の回収効率や、デバイスの構造を単純化するという点からは、２つのマイクロ流路構造部分を設けることが好ましい。
２つのマイクロ流路構造部分を設けた場合、その中間に流れ幅を収束させる部分を設けることが好ましい（図１３）。この部分は、マイクロ流路構造部分よりも狭く、ピラーは設置されていない。この部分には、最初のマイクロ流路構造部分（構造部α）を通過した微小凝集物が集積され、次のマイクロ流路構造部分（構造部β）へと流れていく（図１３、図２０Ａ）。このような流れ幅を収束させる部分を設けることにより、微小凝集物を効率良く除去することが出来る。
上記のように、２つ以上のマイクロ流路構造部分を設けた場合、微小凝集物除去デバイスでは、目的細胞が排出される下流部側のマイクロ流路構造部分（構造部β）のピラー設置間隔を、上記のように、８０μｍ〜２５０μｍと設定すればよく、１００μｍ〜２３０μｍと設定することが好ましく、１２０μｍ〜２２０μｍと設定することがより好ましい。そして、目的細胞を含む溶液が導入される上流部側のマイクロ流路構造部分（構造部α）のピラー設置間隔は、下流部側のマイクロ流路構造部分（構造部β）と同等に設定するか、それよりも広くすることにより、微小凝集物の除去効率を上げ、微小凝集物による詰まりを防止しつつ、比較的多くの試料の処理が可能となる。
そして、本発明の一つの態様は、上記のようなマイクロ流路構造を有する除去機構を備える微小凝集物除去デバイスであり、マイクロ流路の前方には試料導入口を、マイクロ流路の後方には試料排出口を有することが出来る。
３−２．本発明の微小凝集物除去デバイスの具体例
図１２は、本発明の一実施形態である微小凝集物除去デバイスを説明する模式図である。
以下、微小凝集物除去デバイス１３０のマイクロ流路の基本構造について、上面から見た図によって説明する。まず、試料の入口構造としては、サンプル導入口１３１と、流体の出口構造としてサンプル排出口１３２、とを備えており、サンプル導入口１３１及びサンプル排出口１３２との間に微小凝集物を除去するためのマイクロ流路の基本構造１１０（微小凝集物除去機構）が連続して設けられている。このマイクロ流路の基本構造は、上記のように、例えば、２つのマイクロ流路構造部分を設けることが出来る（図１３）。
図１４は、本発明の実施形態に係る微小凝集物除去デバイスの鉛直方向断面の模式図である。微小凝集物除去デバイス１３０は、マイクロ流路の基本構造１１０から構成され、それぞれ導入口１３１、排出口１３２等の形状を備えたマイクロ流路構造部１４１と、平面構造部１４２との接合によって作製され、その空間に流路空間１４３を有している。また、それぞれ導入口１３１、排出口１３２部分には、適宜送液用のチューブを接合させ、またシリンジ等との接合部を設けることにより、適宜変更を加えて使用することもできる。さらに導入口１３１、排出口１３２に関しては、試料の導入、排出液を回収できる構造であれば特に限定されないが、処理開始直前または直後に、分画ができる機構等を備えていても良い。
マイクロ流路構造部１４１の流路構造（例えば、ピラーの配置）は、公知の方法を適宜選択して作製することができる。流路構造部の部材の材料としては、例えば、ガラス、シリコーン、ジメチルポリシロキサン、プラスチック等を用いることができる。また、平面構造部１４２については、平坦かつ流路構造部１４１と接合可能な材料であれば特に限定されないが、強度を有している、ガラス、プラスチック等を使用することが好ましい。また、透明な部材であると流路内部の観察が容易であり、微小凝集物の除去や目的細胞の損失の有無が把握できるため好ましい。
なお、本発明の微小凝集物除去デバイス１３０は、それぞれマイクロ流路の基本構造１１０、導入口１３１、及び排出口１３２等の形状を備え、マイクロ流路の流路空間１４３が形成されたもの、例えば、図示の平面構造部１４２側の部材にそれぞれ基本構造１１０及び導入口１３１、排出口１３２等の形状を備えている構造とすることもできる。
本発明の微小凝集物除去デバイス１３０は、単独で使用できるが、排出口１３２に備えた送液用のチューブ等を用いて、任意の細胞分離デバイスに接続することで、連続したシステムとして使用でき目的に応じて使用方法を選択することができる。
３−３．一体型の細胞分離デバイス
図１５は、本発明の別の実施形態を示す、一体型の微細胞分離デバイス１５０を説明する模式図である。上記のように、本発明の微小凝集物除去デバイスは、細胞分離デバイスに接続させて連続したシステムとして使用できる。この際、使用の簡便性や、製造コストの観点から、微小凝集物除去デバイスと、細胞分離デバイスとを一体として備えた細胞分離デバイスとして使用することが好ましい。また、接続に用いるチューブ内での試料ロスも低減できることから、必要に応じてこのように、一体型のデバイスとすることもできる。
また、この細胞分離デバイスは、分離する細胞のサイズにより分画する（サイズ分画）分離機構であることが好ましい。試料中の微小凝集物を除くことにより、分画に与える影響を無くすことができるため、分離機構の効果が最大限に発揮され、分離精度を高めることができる。サイズ分画による分離機構としては、例えば、ＤＬＤ原理に基づく細胞分離デバイスが挙げられる。ＤＬＤ原理に基づく細胞分離デバイスは、上記に述べた方法により製造することが出来る。そして、この一体型の細胞分離デバイスの中では、上記のように、２つの別々のマイクロ流路構造部分を備えた微小凝集物除去デバイスの後方に、ＤＬＤ原理に基づく細胞分離デバイスを連結した一体型の細胞分離デバイスが好ましい（図２０Ａおよび図２０Ｂ）。図２０Aのような一体型の細胞分離デバイスにおいて、バッファー液は、バッファー導入口３２から導入され、微小凝集物除去機構（構造部α、β）の外側を流れ、微小凝集物が除去された細胞懸濁液と合流して細胞分離機構（細胞分離部分）に流れ込む。すなわち、図２０Aの形態では、バッファー導入口３２から導入されたバッファー液は、微小凝集物除去機構には導入されない。
４．本発明の微小凝集物を除去する方法
本発明の微小凝集物を除去する方法は、上記のように、連続的な液体の流れ中で、血液等の細胞懸濁液（試料）から微小凝集物を除去する方法である。なお、細胞懸濁液（試料）としては、特に限定されないが、例えば、血液、リンパ液、唾液、尿、涙等の体液を例示できる。これらは、そのまま使用しても良く、任意のバッファー液での希釈を行っても良い。また、使用するバッファー液に関しても、対象とする細胞懸濁液（試料）や、分離する目的細胞、含まれる微小凝集物により適宜選択して使用することができる。バッファー液としては、細胞への影響を避けるために、等張液を一種または複数組合せて使用することが出来、例えば、生理食塩水、ＰＢＳ等を使用すれば良い。
本発明で除去される微小凝集物は、培養細胞の懸濁液等にも含まれるが、本発明の微小凝集物を除去する方法は、細胞懸濁液（試料）として、特に血液を用いた場合において好適である。血液中の微小凝集物は、フィブリン、その他の変性タンパク質、脂肪等が凝集したものに由来しており、特に粘性を有していることから、除去機構のピラー構造に捕捉されやすく、一度ピラー構造に捕捉された後に、脱離して流れ方向の下流に流出することが少ないため、本発明の方法で対象とする試料として好適である。
本発明の第一の態様は、目的細胞および微小凝集物を含む細胞懸濁液から、連続的な液体の流れ中で微小凝集物を除去する方法であって、マイクロ流路構造（微小凝集物除去機構）を備える微小凝集物除去デバイスに、細胞懸濁液または細胞懸濁液とバッファー液との混合液を流し、微小凝集物除去デバイスのマイクロ流路中を通過させて、微小凝集物を捕捉する工程、を備えた、微小凝集物を除去する方法である。なお、微小凝集物を捕捉する工程の後、目的細胞を回収する工程を設けることも出来る。
本発明では、上記本発明の微小凝集物除去デバイスに、細胞懸濁液およびバッファー液を加える。この際、予めバッファー液を流しておき、その後細胞懸濁液を加えても良いし、細胞懸濁液をバッファー液に混合し希釈した後に、加えても良い。そして、上記のように、本発明の除去方法では、微小凝集物を捕捉する工程により、細胞懸濁液中の微小凝集物が捕捉されて除去され、目的細胞を含む細胞懸濁液は、除去デバイスの排出口から回収される。また、除去デバイスの排出口に送液用のチューブ等を備えた場合には、チューブ等を通して回収される。また、上記のように、細胞分離デバイスに接続させて連続したシステムとした場合（一体型の細胞分離デバイスを含む）には、微小凝集物が除去されて回収された細胞懸濁液は、その後、細胞の分離が行われる。なお、バッファー液に対する細胞懸濁液の量は特に限定されず、また、細胞懸濁液を流す速度についても、特に限定されない。この流速については、本発明の微小凝集物除去デバイスの導入口または排出口の何れか一方、または両方にポンプ等を設置することで、適宜速度を調整できる。
本発明の方法は、血液等、細胞を含む細胞懸濁液から、含まれる目的細胞を精度良く分取する際の前処理に用いる方法であり、試料中の目的細胞を損失なく、かつ試料中の微小凝集物を精度良く除去することで、その後の細胞分離において、より精度良く目的の細胞を分取することができる。
本発明の別の態様では、本発明の血液から微小凝集物を除去する方法において、抗血液凝固試薬を添加する態様を含む。血液中には、既に微小凝集物が存在している他、血液を処理する過程で、新たに微小凝集物が生成してしまう可能性がある。このため、上記の本発明の方法により、既に存在する微小凝集物の除去はできるが、血液を処理中に新たに微小凝集物が生じること防止するために、その希釈バッファー液の組成中に抗血液凝固試薬を加えることが好ましい。そして、抗血液凝固試薬を加えることにより、本発明の微小凝集物を除去する方法により、微小凝集物を除去した血液を、その後の血液検査、各種の処理（血液成分の分離等を含む）に好適に使用することができる。
抗血液凝固試薬としては、クエン酸ナトリウム、ＥＤＴＡ、ヘパリン等が例示されるが、これらの中では、トロンビンインヒビターを使用することが好ましく、ＰＰＡＣＫ等の試薬を使用することが、更に好ましい。
クエン酸ナトリウム、ＥＤＴＡ等は、カルシウムイオンを阻害して間接的に血液凝固作用を阻害するが、直接的に凝固因子であるトロンビンを阻害する方が効果的である。また、トロンビンインヒビターとしては、ヘパリンは遊離トロンビンのみを阻害するが、ＰＰＡＣＫ（Ｃ21Ｈ31ＣｌＮ6Ｏ3．２ＨＣｌ）[1-(2-Amino-3-phenylpropanoyl)-N-[1-chloro-6-(diaminomethylideneamino)-2-oxohexan-3-yl]pyrrolidine-2-carboxamide]は遊離トロンビン、結合トロンビンの双方に作用するためより効果的である。
本発明の除去方法は、血液中に既に存在する微小凝集物を除去するものであり、ＰＰＡＣＫ等のトロンビンインヒビターを併用することにより、血液中の微小凝集物を新たな生成を抑制しつつ、血液中に既に存在する微小凝集物を除去することが出来るという特徴を有する。
本発明では、上記のマイクロ流路構造を有する微小凝集物除去デバイスと、トロンビンインビターを含む希釈バッファー液とを併用することで、本発明の微小凝集物除去デバイス、および、任意選択的に接続される細胞分離装置の使用時において、微小凝集物の目詰まりを好適に解消することが出来る。その結果、本発明の微小凝集物除去デバイスを使用した除去方法により、効率的且つ継続的な、微小凝集物の除去、および、細胞成分の分離を行うことができる。
以上、本発明の実施形態を詳述してきたが、実際には、上記の実施形態に限られるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲の変更があっても本発明に含まれる。
以下、本実施形態について、実施例を示して詳細に説明する。但し、実際には、本実施形態は、下記の実施例に限定されるものではない。
１．細胞分離の実施例
（１）実施例で使用した細胞分離デバイス
本実施例では、血液中の腫瘍細胞の分離を目的とした。このため、対象捕捉分子としては、抗体を担持させた３０μｍのビーズを使用した。そして、決定論的横置換法の原理に基づき、ジメチルポリシロキサン（ＰＤＭＳ）を使用して、粒径４０μｍを分離の閾値Ｄｃとして設定したＤＬＤマイクロ流路構造を有する基本構造（分離エリア）を備える細胞分離デバイスを作製した。
具体的には、細胞分離デバイスは、
Ｇ≒２．６２０５７Ｄｃ 式３
上記式３にＤｃ＝４０μｍを代入して得られたＧ＝１０４．８μｍから、直径１５μｍのピラーが、間隔１０４．８μｍで配列され、また、好適な分離条件であるε＝tanθ＝１／１５から、このピラーを１５段で一列ずれるように配置した基本構造を有するものである（図１参照）。また、流路空間の高さは５０μｍとした。
より具体的には、上記基本構造を有するように、マスクを使用してレジスト型を作製した後に、ジメチルポリシロキサン（ＰＤＭＳ）をモールディングして、ピラーが等間隔で配置されるＰＤＭＳ製流路を作製して、マイクロピラー構造を有するＤＬＤマイクロ流路の基本構造部３６とした。そして、この基本構造部３６の両端の一方には、ポート穴をあけサンプル導入口３１とバッファー導入口３２を、他方には第一の排出口３３と第二の排出口３４を設けた。そして、ガラスの基板３７に接合させ、基本構造部と基板の空間に流路空間３５が形成されるようにした。そして、サンプル導入口３１とバッファー導入口３２、および、第一の排出口３３と第二の排出口３４にチューブを取付けて細胞分離装置を作製した。この細胞分離装置を実施例１〜３では使用した。
実施例４では、粒径１０μｍを分離の閾値として設定した構造部ａ（６０ａ）、及び粒径４０μｍを分離の閾値として設定した構造部ｂ（６０ｂ）の基本構造を備えた以外は、同様の構成を有する細胞分離デバイスを作製して使用した。
（２）細胞が分離されたか否かの評価
実施例の細胞分離は、顕微鏡試料台の上で行い目視により分離されたか否かを確認した。具体的には、バッファー流路口からＰＢＳを１００μｌ／ｍｉｎで流し、試料流入口から細胞懸濁液を１００μｌ／ｍｉｎで１０分間流した。選別後、回収した試料を透過型の光学顕微鏡、及び蛍光顕微鏡で観察した。
（実施例１）
図８は、本実施例の説明を行うための図である。本実施例は全血中に混入させたヒト乳がん由来細胞（ＭＣＦ−７）を分離する目的で行った。まず、ヒト乳がん由来細胞（ＤＳファーマバイオメディカル）５１を、ＰＢＳバッファーにて希釈した正常全血内に加えて試料サンプルとした。この試料サンプルに対し、対象捕捉分子としてヒトＥｐＣＡＭに対するモノクローナル抗体（抗ＥｐＣＡＭ抗体）を担持した粒径３０μｍの抗ＥｐＣＡＭ抗体標識ビーズ（ＣＤ３２６（ＥｐＣＡＭ）, Ｈｕｍａｎ, ｐｌｕｒｉＢｅａｄｓ、ｓ−ｂｅａｄｓ：ｐｌｕｒｉｓｅｌｅｃｔ）５５を添加し、室温にて攪拌しながらインキュベートしてサンプル５０を得た。粒径４０μｍを分離の閾値として設定した上記細胞分離デバイス３０を、予めＰＢＳで満たしておき、反応後のサンプル５０をサンプル導入口３１へ１００μｌ／ｍｉｎの速度でシリンジポンプを用いて送液を行った。また、同時にＰＢＳをバッファー導入口３２へ１００μｌ／ｍｉｎの速度で送液した。回収した試料の顕微鏡観察については、透過型の光学顕微鏡にて形態による観察を行った他、細胞の性質による区別を行う為、がん細胞及び白血球細胞を染色する為の有核細胞染色試薬(Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２ ｓｏｌｕｔｉｏｎ：タカラバイオ）による染色、がん細胞を染色する為の抗サイトケラチン抗体（Ａｎｔｉ-ｐａｎ Ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ 抗体 [ＰＣＫ−２６] (ＦＩＴＣ)：Ａｂｃａｍ）による染色、及び、白血球細胞を染色する抗ＣＤ４５抗体（Ａｎｔｉ−ＣＤ４５−ＡＰＣ, Ｍｏｎｏ(ＭＬ２)：フナコシ）による染色を行った後、蛍光顕微鏡での観察、確認を行った。
その結果、全血中の成分のうち白血球５２、赤血球５３、血小板５４等が第二の排出口３４から回収されたことを確認した。また、抗ＥｐＣＡＭ抗体標識ビーズ５５と複合体５を形成したヒト乳がん由来細胞５１は第一の排出口３３から選択的に排出された。本実施例では以上のように、抗ＥｐＣＡＭ抗体標識ビーズ５５と複合体５を形成したヒト乳がん由来細胞５１を選択的に分離できたことを顕微鏡により確認した（図８）。
（実施例２）
実施例１と同様に、ヒト乳がん由来細胞（ＭＣＦ−７）のかわりにヒト前立腺がん由来細胞（ＬＮＣａｐ）（ＤＳファーマバイオメディカル）を正常全血に加えたサンプルを用いて同様に実施した結果、全血中の成分のうち白血球、赤血球、血小板等が第二の排出口から回収されたことを確認した。また、抗ＥｐＣＡＭ抗体標識ビーズと複合体を形成したヒト前立腺がん由来細胞は第一の排出口から選択的に排出された。本実施例では以上のように、抗ＥｐＣＡＭ抗体標識ビーズ５５と複合体５を形成したヒト前立腺がん由来細胞を選択的に分離できたことを顕微鏡により確認した。
（実施例３）
実施例１及び２と同様に、ヒト由来がん細胞を正常全血に加えたサンプルのかわりに担がん患者由来の血液を用いて、同様に実施した結果、ＥｐＣＡＭを発現している上皮系腫瘍細胞を精度良く分離できたことを顕微鏡により確認した。
（比較例１）
比較例として、抗ＥｐＣＡＭ抗体標識ビーズを用いずに、希釈した担がん患者由来の血液を細胞分離デバイスにて分離を試みたところ、一部サイズがオーバーラップしている白血球と上皮系腫瘍細胞との分離を行うことができなかった。
（実施例４）
担がん患者血液中に存在する上皮系腫瘍細胞の中には、ＥｐＣＡＭの発現が弱い細胞群が存在することが知られている。そのため、抗ＥｐＣＡＭ抗体標識ビーズを用いた手法では目的とする上皮系腫瘍細胞の取り逃しが懸念された。そこで、より高精度に、担がん患者血液中に存在する上皮系腫瘍細胞を分離することを試みた。図９は本実施例の説明を行うための図である。
まず、塩化アンモニウム処理により溶血処理を行い、赤血球を除去した担がん患者血液に対し、対象捕捉分子としてヒトＣＤ４５に対するモノクローナル抗体（抗ＣＤ４５抗体）を担持した粒径３０μｍの抗ＣＤ４５抗体標識ビーズ（ｐｌｕｒｉＳｅｌｅｃｔ：ＣＤ４５, Ｈｕｍａｎ, ｐｌｕｒｉＢｅａｄｓ、ｓ−ｂｅａｄｓ）６２を添加し、室温にて攪拌しながらインキュベートしてサンプル５０を得た。粒径１０μｍを分離の閾値として設定した構造部ａ（６０ａ）、及び粒径４０μｍを分離の閾値として設定した構造部ｂ（６０ｂ）の構造を備えた細胞分離デバイス３０を、予めＰＢＳで満たしておき、反応後のサンプルをサンプル導入口３１へ１００μｌ／ｍｉｎの速度でシリンジポンプを用いて送液を行った。また、同時にＰＢＳをバッファー導入口３２へ１００μｌ／ｍｉｎの速度で送液した。
その結果として、まず構造部ａ（６０ａ）により全血中の成分のうち、１０μｍ未満の大きさである血小板５４及び細胞残渣が排出口Ａ（Ａ）から回収されたことを確認した。また、構造部ｂ（６０ｂ）により、粒径が４０μｍより大きい、白血球５２及び抗ＣＤ４５抗体標識ビーズ６２との複合体５が排出口Ｂ（Ｂ）から回収されたことを確認した。更に、粒径が４０μｍより小さい上皮系腫瘍細胞６１が排出口Ｃ（Ｃ）より回収されたことを顕微鏡により確認した。
２．微小凝集物除去の実施例
本実施例では、正常ヒト全血[コージンバイオ（株）製]を試料として、試料中に含まれる微小凝集物の除去を目的とした。
（実施例５）
図１６は、本発明の実施例を説明するための模式図である。以下、実施例で用いた微小凝集物除去デバイス１６０のマイクロ流路構造を有する除去機構の構造について、上面から見た図によって説明を行う。微小凝集物除去デバイスの微小凝集物除去機構は、図１６に示すピラー構造 [ピラー直径：１５μｍ、ピラー間隔：６０μｍ、ピラーは流れ方向に対して１５段で１列ずれた配置、流路深さ：５０μｍ] を有している。
より具体的には、上記マイクロ流路構造を有するように、マスクを使用してレジスト型を作製した後に、ジメチルポリシロキサン（ＰＤＭＳ）をモールディングして、ピラーが等間隔で配置されるＰＤＭＳ製流路を作製して、図１４の模式図で示すピラー構造を有する基本構造部１４１とした。そして、この基本構造部１４１にポート穴をあけ、導入口１３１と排出口１３２とを設けた。そして、ガラス基材からなる平面構造部１４２に接合させ、基本構造部と基板の空間に流路空間１４３が形成されるようにした。そして、導入口１３１と排出口１３２にチューブを取付けて微小凝集物除去デバイスを作製した。この微小凝集物除去デバイスを実施例にて使用した。
微小凝集物除去の様子は、倒立顕微鏡ステージ上から、目視及び画像として観察し、また、動画として撮影した。具体的には、前述の微小凝集物除去デバイスの導入口に対して、０．０５％Ｔｗｅｅｎ含有ＰＢＳバッファーを事前に通水し、流路中から気泡を除去した後、前述の血液を０．０５％Ｔｗｅｅｎ含有ＰＢＳバッファーにて２倍希釈したものを、シリンジポンプにて２０μＬ／ｍｉｎの一定速度にて１ｍＬ処理した。
その結果、図１７Ａ〜図１７Ｅに示すように、微小凝集物除去デバイス内にて微小凝集物が捕捉される様子が観察された。導入口近傍においては微小凝集物が多く捕捉されており（図１７Ａ）、排出口に近づくにつれて微小凝集物が減少し（図１７Ｂ）、排出口近傍においては微小凝集物が無くなっている（図１７Ｃ）ことを確認した。また、この微小凝集物除去デバイスを通過させる前後の試料を倒立顕微鏡下にて比較して観察した。デバイス通過前においては微小凝集物が存在していた（図１７Ｄ）が、デバイス通過処理後においては微小凝集物が除去されている（図１７Ｅ）ことが確認できた。
（比較例２）
前述の実施例５に記載の方法と同様にし、ピラー間隔のみを１０μｍとして作製した微小凝集物除去デバイスを用いて、同様に試料の処理を行った。その結果、微小凝集物以外にも、ピラー間に白血球等の大型の細胞が堆積してしまう様子が観察された。また、１ｍＬの全量を処理し終わる前にデバイス内に詰まりが生じ、全量の処理を行うことができなかった。
（実施例６〜１０）および（比較例３）
実施例５と同様に、ピラーの間隔（Ｇａｐ）が、それぞれ５０μｍ、６０μｍ、１００μｍ、１５０μｍおよび、２００μｍの微小凝集物除去デバイスを作製した（それぞれ、実施例２〜６）。また比較例２として、ピラー間隔が６０μｍであるが、ピラーの配置が一直線であるデバイスを作製した。そして、上記の様に調整した血液試料に対して、大きめの細胞を模した直径３０μｍのビーズを試料に添加し、実施例１と同様の方法にて、それぞれのデバイスを通過させ、その結果を表１に示す。それぞれ、微小凝集物（異物）の除去ができたものを◎、概ねできたものを○、一部できたものを△と標記し、またビーズの損失（詰まり）があったものを×、損失（詰まり）が無かったものを○、と標記している。
（実施例１１）
実施例１０（Gap幅：２００μｍ）、実施例８（Gap幅：１００μｍ）、実施例７（Gap幅：６０μｍ）で用いた微小凝集物除去デバイスを、この順番で直列に接続した構造の微小凝集物除去デバイスを用いて、上記の血液試料を処理した結果、１ｍＬ以上の血液試料からビーズの損失が無く、微小凝集物を除去することができた。
（実施例１２）
まず、実施例１１で用いた微小凝集物除去デバイスの排出口に、分離閾値３０μｍとしたＤＬＤを分離原理とした分離デバイスのサンプル導入口を接続して、一体型の細胞分離デバイスとした。この一体型の細胞分離デバイスを、予め１％ＢＳＡ、５ｍＭ ＥＤＴＡ 含有ＰＢＳバッファーで満たしておいた。次に、この一体型の細胞分離デバイスに、血液希釈バッファーとして１％ＢＳＡ、５ｍＭ ＥＤＴＡを含むＰＢＳを用いて血液を２倍希釈し、最終濃度８０μＭのＰＰＡＣＫを添加したものを用いて、細胞を模した直径３０μｍのビーズを添加した試料を微小凝集物除去デバイスの導入口から流した。また、分離デバイスのバッファー導入口から、バッファー（１％ＢＳＡ、５ｍＭ ＥＤＴＡを含むＰＢＳ）を流した。その結果、図１８Ａに示すように分離デバイスにおける詰まりが全く無く、かつ図１８Ｂの破線で囲った部分に示すように３０μｍのビーズを分離することができた。
なお、分離閾値３０μｍとしたＤＬＤを分離原理とした分離デバイスは、以下のようにして作製した。上記の決定論的横置換法（ＤＬＤ）の原理に基づき、ジメチルポリシロキサン（ＰＤＭＳ）を使用して、粒径３０μｍを分離の閾値Ｄｃとして設定したＤＬＤマイクロ流路構造を有する基本構造（分離機構）を備える細胞分離デバイスを作製した。
具体的には、この細胞分離デバイスは、
Ｇ≒２．６２０５７Ｄｃ 式３
上記式３にＤｃ＝３０μｍを代入して得られたＧ＝７８．６μｍから、直径１５μｍのピラーが、間隔７８．６μｍで配列され、また、好適な分離条件であるε＝tanθ＝１／１５から、このピラーを１５段で一列ずれるように配置した基本構造を有するものである。また、流路空間の高さは５０μｍとした。
具体的には、上記基本構造を有するように、マスクを使用してレジスト型を作製した後に、ジメチルポリシロキサン（ＰＤＭＳ）をモールディングして、ピラーが等間隔で配置されるＰＤＭＳ製流路を作製して、マイクロピラー構造を有するＤＬＤマイクロ流路の基本構造部とした。
（比較例４）
血液希釈バッファーとして１％ＢＳＡ、５ｍＭ ＥＤＴＡを含むＰＢＳを使用し、血液を２倍希釈したものを微小凝集物除去デバイスに通さずに、直接上記の分離デバイスに通じたところ、図１９に示すように分離デバイスの上流部において詰まりが生じてしまい、分離を行うことができなかった。
３．一体型分離デバイスの実施例
（１）一体型分離デバイスの作成
まず、上記実施例５同様に、２つのマイクロ流路構造部分（構造部α：ピラーの間隔は２００μｍ、構造部β：ピラーの間隔は１５０μｍ）を直列に接続した微小凝集物除去デバイスを設計した（図１３）。なお、構造部α、構造部βの外側の側面は、流路端部での詰まりを防止するため、流路壁面から８０μｍ以内の部分にはピラーを設けていない。また、構造部α、構造部βの間には、流れ幅を収束させる部分が設けられている。この２つの構造部分を有する微小凝集物除去デバイスに、分離閾値３０μｍとしたＤＬＤを分離原理とした分離デバイスとを一体化した設計として、一体型の細胞分離デバイスを作製した（図２０Ａおよび２０Ｂ）。
（２）試料サンプルの調製
上記実施例１と同様に、正常ヒト全血（コージンバイオ（株））に対し、ヒト乳がん由来細胞株（ＭＣＦ−７）（ＤＳファーマバイオメディカル）をスパイクし、模擬がん患者血液検体を調整し、試料サンプルとした。この試料サンプルに対し、対象捕捉分子としてヒトＥｐＣＡＭに対するモノクローナル抗体（抗ＥｐＣＡＭ抗体）を担持した粒径３０μｍの抗ＥｐＣＡＭ抗体ビーズ（ＣＤ３２６（ＥｐＣＡＭ）、Ｈｕｍａｎ,ｐｌｕｒｉＢｅａｄｓ、ｓ−ｂｅａｄｓ：ｐｌｕｒｉｓｅｌｅｃｔ）を添加し、室温にて攪拌しながらインキュベートしてサンプルを得た。得られたサンプルを１％ＢＳＡ、５ｍＭ ＥＤＴＡ含有ＰＢＳバッファーで２倍希釈し、最終濃度が８０μＭとなるように、トロンビンインヒビター （ＰＰＡＣＫ）を添加したものをサンプル溶液とした（図２２、図２４[分離前]）。
（実施例１３）
上記一体型細胞分離デバイスを、予め１％ＢＳＡ、５ｍＭ ＥＤＴＡ 含有ＰＢＳバッファーで満たしておいた。そして、上記サンプル溶液をサンプル導入口３１へ５０μｌ／ｍｉｎの速度でシリンジポンプを用いて送液を行った。また同時に１％ＢＳＡ、５ｍＭＥＤＴＡ 含有ＰＢＳバッファーをバッファー導入口３２へ５００μｌ／ｍｉｎの速度で送液し、それぞれの回収口（３３、３４）から回収を行った。
回収した試料の顕微鏡観察については、透過型の光学顕微鏡にて形態による観察を行った。また、細胞の性質による区別を行う為、がん細胞及び白血球細胞を染色する為の有核細胞染色試薬(Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２ ｓｏｌｕｔｉｏｎ：タカラバイオ）による染色、がん細胞を染色する為の抗サイトケラチン抗体（Ａｎｔｉ-ｐａｎ Ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ 抗体 [ＰＣＫ−２６] (ＦＩＴＣ)：Ａｂｃａｍ）による染色、及び、白血球細胞を染色する抗ＣＤ４５抗体（Ａｎｔｉ−ＣＤ４５−ＡＰＣ, Ｍｏｎｏ(ＭＬ２)：フナコシ）による染色を行った後、蛍光顕微鏡下での観察、確認を行った。一体型細胞分離デバイスの、分離構造部の拡大を図２３ｂに示す。
その結果、デバイス内に詰まりを生じさせること無く、全血中の成分のうち白血球、赤血球、血小板等が第二の排出口（３４）から回収されたことを確認した（図２３ａ、図２４[その他血球細胞]）。また、抗ＥｐＣＡＭ抗体標識ビーズと複合体を形成したヒト乳がん由来細胞（ＭＣＦ−７）は第一の排出口（３３）から選択的に排出された（図２３ｃおよび図２３ｄ、図２４[目的細胞]）。本実施例では以上のように、抗ＥｐＣＡＭ抗体標識ビーズと複合体を形成したヒト乳がん由来細胞（ＭＣＦ−７）を選択的に分離できたことを顕微鏡下での評価及び目視により確認した。
（実施例１４）
上記実施例１３と同様に、ヒト乳がん由来細胞（ＭＣＦ−７）のかわりにヒト前立腺がん由来細胞（ＬＮＣａｐ）（ＤＳファーマバイオメディカル）を正常全血に加えたサンプルを用いて同様に実施した結果、全血中の成分のうち白血球、赤血球、血小板等が第二の排出口（３４）から回収されたことを確認した。また、抗ＥｐＣＡＭ抗体標識ビーズと複合体を形成したヒト前立腺がん由来細胞は第一の排出口（３３）から選択的に排出された。本実施例では以上のように、抗ＥｐＣＡＭ抗体標識ビーズと複合体を形成したヒト前立腺がん由来細胞を選択的に分離できたことを顕微鏡下での評価により確認した。
（実施例１５）
上記実施例１３と同様に、ヒト由来がん細胞を正常全血に加えたサンプルのかわりに担がん患者由来の血液を用いて、同様に実施した結果、ＥｐＣＡＭを発現している上皮系腫瘍細胞を精度良く分離できたことを顕微鏡により確認した。
（実施例１６−１８）
この実施例１６では、２つのマイクロ流路構造部分（構造部α：ピラーの間隔は２００μｍ、構造部β：ピラーの間隔は２００μｍ）を直列に接続した微小凝集物除去デバイスに、分離閾値３０μｍとしたＤＬＤを分離原理とした分離構造部とを接続して、一体型の細胞分離デバイスを作製した。そして、上記実施例１３[ヒト乳がん由来細胞（ＭＣＦ−７）]、実施例１４[ヒト前立腺がん由来細胞（ＬＮＣａｐ）]、および実施例１５[担がん患者由来の血液]のサンプルについて、この一体型の細胞分離デバイスを使用して、同様に微小凝集物を除去、および、細胞分離を行った（実施例１６−１８）。その結果、何れの場合も、詰まりが生じることなく、目的とする細胞を分離できたことを確認した。
（実施例１９−２１）
実施例１９では、代わりに、２つのマイクロ流路構造部分（構造部α：ピラーの間隔は３００μｍ、構造部β：ピラーの間隔は２００μｍ）を直列に接続した微小凝集物除去デバイスに、分離閾値３０μｍとしたＤＬＤを分離原理とした分離構造部とを接続して、一体型の細胞分離デバイスを作製した。そして、上記実施例１３[ヒト乳がん由来細胞（ＭＣＦ−７）]、実施例１４[ヒト前立腺がん由来細胞（ＬＮＣａｐ）]、および実施例１５[担がん患者由来の血液]のサンプルについて、この一体型の細胞分離デバイスを使用して、同様に微小凝集物を除去、および、細胞分離を行った（実施例１９−２１）。何れの場合も、詰まりが生じることなく、目的とする細胞を分離できたことを確認した。
（比較例５−７）
比較例５−７として、微小凝集物除去構造（微小凝集物除去デバイス）を有しない、分離閾値３０μｍとしたＤＬＤを分離原理とした分離構造部のみを有する細胞分離デバイスを作製して、上記実施例１３−１５で使用したサンプルについて、実施例１３−１５と同様の細胞分離を行った。結果は、少量のサンプルの分離は出来たが、溶液量を増加させたところ、分離構造部において詰まりが生じて、継続的な分離は出来なかった。
本発明の細胞分離方法、微小凝集物除去方法、微小凝集物除去部分および細胞分離部分を備えたデバイスは、研究用途、診断用途、医薬品の製造等における細胞の分離、精製に利用することが可能である。
１ 細胞懸濁液
２ 目的細胞
３ 目的外細胞
４ 混合液
５ 複合体
１０ 対象捕捉分子
１１ 対象捕捉分子を担持する物質
１２ 対象捕捉物質
２０ ＤＬＤマイクロ流路の基本構造
２１ 障害物構造
２２ 一定の大きさ以上の粒子
２３ 一定の大きさ未満の粒子
３０ ＤＬＤマイクロ流路を備えた細胞分離デバイス
３１ サンプル導入口
３２ バッファー導入口
３３ 第一の排出口
３４ 第二の排出口
３５ 流路空間
３６ 流路構造部
３７ 平面構造部
３８ 隔壁
３９ 分岐部
４０ 送液部および回収部を備えた細胞分離装置
４１ サンプル送液部
４２ バッファー送液部
４３ 第一の回収部
４４ 第二の回収部
５０ サンプル
５１ ヒト乳がん由来細胞
５２ 白血球
５３ 赤血球
５４ 血小板
５５ 抗ＥｐＣＡＭ抗体標識ビーズ
６０ａ 構造部ａ
６０ｂ 構造部ｂ
６１ 上皮系腫瘍細胞
６２ 抗ＣＤ４５抗体標識ビーズ
Ａ 排出口Ａ
Ｂ 排出口Ｂ
Ｃ 排出口Ｃ
１１０ 基本構造
１１１ 構造物
１１２ 微小凝集物
１２１ ピラー構造部
１３０ 微小凝集物除去デバイス
１３１ 導入口
１３２ 排出口
１４１ 流路構造部
１４２ 平面構造部
１４３ 流路空間
１５０ 微小凝集物除去構造を備えた細胞分離デバイス
１５１ 微小凝集物除去機構
１５２ 細胞分離機構
１６０ 実施例で使用の微小凝集物除去デバイス

Claims (14)

  1. マイクロ流路構造を備える微小凝集物除去デバイスであって、
    前記マイクロ流路構造は、一定の間隔で設置されたピラーにより構成され、前記マイクロ流路構造の前方には試料導入口を、前記マイクロ流路構造の後方には試料排出口を有することを特徴とする微小凝集物除去デバイス。
  2. 前記微小凝集物除去デバイスの前記マイクロ流路構造は、８０μｍ〜２５０μｍの間隔で設置されたピラーにより構成されることを特徴とする請求項１に記載の微小凝集物除去デバイス。
  3. 前記マイクロ流路構造は、２つの別々のマイクロ流路構造部分から構成されることを特徴とする請求項１又は２に記載の微小凝集物除去デバイス。
  4. 前記２つの別々のマイクロ流路構造部分のそれぞれは、３０μｍより大きい間隔で設置されたピラーにより構成されていることを特徴とする請求項３に記載の微小凝集物除去デバイス。
  5. 前記２つの別々のマイクロ流路構造部分の中間に、流れ幅を収束させる部分を有することを特徴とする請求項３又は４に記載の微小凝集物除去デバイス。
  6. 前記収束部にはピラーが設置されていないことを特徴とする請求項５に記載の微小凝集物除去デバイス。
  7. 前記２つの別々のマイクロ流路構造部分の一つは上流部側にあり、他方は下流部側にあり、上流部側のマイクロ流路構造部分（構造部α）のピラー設置間隔は、下流部側のマイクロ流路構造部分（構造部β）よりも広いことを特徴とする請求項３〜６の何れか一項に記載の微小凝集物除去デバイス。
  8. マイクロ流路構造を有する微小凝集物除去部分と、細胞を分離する細胞分離部分とを連続して備える一体型細胞分離デバイスであって、
    前記マイクロ流路構造は、一定の間隔で設置されたピラーにより構成され、前記マイクロ流路構造の前方には試料導入口を、前記細胞分離部分の後方には試料排出口を有し、
    前記微小凝集物を除去する部分の後方に、前記細胞を分離する部分を連続して備えることを特徴とする一体型細胞分離デバイス。
  9. 前記細胞を分離する部分が、決定論的横置換法（ＤＬＤ）に基づくサイズ分画による分離構造であることを特徴とする請求項８に記載の一体型細胞分離デバイス。
  10. 前記マイクロ流路構造は、２つの別々のマイクロ流路構造部分から構成されることを特徴とする請求項８又は９に記載の一体型細胞分離デバイス。
  11. 前記２つの別々のマイクロ流路構造部分のそれぞれは、３０μｍより大きい間隔で設置されたピラーにより構成されていることを特徴とする請求項１０に記載の一体型細胞分離デバイス。
  12. 前記２つの別々のマイクロ流路構造部分の中間に、流れ幅を収束させる部分を有することを特徴とする請求項１１に記載の一体型細胞分離デバイス。
  13. 前記収束部にはピラーが設置されていないことを特徴とする請求項１２に記載の一体型細胞分離デバイス。
  14. 前記２つの別々のマイクロ流路構造部分の一つは上流部側にあり、他方は下流部側にあり、上流部側のマイクロ流路構造部分（構造部α）のピラー設置間隔は、下流部側のマイクロ流路構造部分（構造部β）よりも広いことを特徴とする請求項１０〜１３の何れか一項に記載の一体型細胞分離デバイス。
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