JP2020068734A - Recombinant vector containing polynucleotide encoding SPR, and composition containing the same - Google Patents

Abstract

To provide a novel agent that can be used for the treatment and prevention of SPR-related disease.SOLUTION: The present invention relates to a recombinant vector containing polynucleotide encoding SPR.SELECTED DRAWING: None

Description

本発明は、セピアプテリンレダクターゼ（ＳＰＲ）をコードするポリヌクレオチドを含む組換えベクター、及びそれを含む組成物に関する。   The present invention relates to a recombinant vector containing a polynucleotide encoding sepiapterin reductase (SPR), and a composition containing the same.

ＳＰＲは、セピアプテリンから７，８−ジヒドロプテリン（ＢＨ２）への変換を触媒する酸化還元酵素である（図１を参照）。ＢＨ２はその後、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）によってテトラヒドロビオプテリン（ＢＨ４）へと変換される。またＳＰＲは、６−ピルボイルテロラヒドロプテリン（ＰＴＰ）からＢＨ４への変換も触媒する。生体内におけるＳＰＲ遺伝子の異常、ＳＰＲの産生量の低下及びＳＰＲの不活性化は、ＢＨ４の産生量の低下につながる。   SPR is a redox enzyme that catalyzes the conversion of sepiapterin to 7,8-dihydropterin (BH2) (see Figure 1). BH2 is then converted to tetrahydrobiopterin (BH4) by dihydrofolate reductase (DHFR). SPR also catalyzes the conversion of 6-pyruvoyltelorahydropterin (PTP) to BH4. Abnormality of the SPR gene, reduction of SPR production amount, and inactivation of SPR in vivo lead to reduction of BH4 production amount.

ＢＨ４は、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）及びトリプトファンヒドロキシラーゼ（ＴＰＨ）の補酵素として機能することが知られている。生体内におけるＢＨ４の産生量の低下は、これらのヒドロキシラーゼの活性の低下につながる。ＰＡＨはフェニルアラニンをチロシンへと変換する酵素である。ＰＡＨの不活性化は、生体内におけるフェニルアラニンの蓄積につながり、高フェニルアラニン血症の原因となり得る。ＴＨはチロシンをＬ−ドーパ（Ｌ−ＤＯＰＡ）へと変換する。Ｌ−ＤＯＰＡはドーパミン、ノルアドレナリン及びアドレナリンの前駆体である。ＴＨの不活性化は、生体内におけるＬ−ＤＯＰＡの減少につながり、ジストニア、パーキンソン病などの原因となり得る。ＴＰＨは、トリプトファンを５−ヒドロキシトリプトファン（５−ＨＴＰ）へと変換する。５−ＨＴＰはセロトニン（５−ＨＴ）の前駆体である。ＴＰＨの不活性化は、生体内におけるセロトニンの減少につながり、摂食障害（例えば肥満）、アルツハイマー病、統合失調症、疼痛、性的不全、てんかん、および排尿障害などの原因となり得る。ＢＨ４はまた、一酸化窒素合成酵素（ＮＯＳ）の補酵素として機能することが知られている。ＮＯＳの不活性化は、活性酸素種の増加及び一酸化窒素生物活性の減少につながり、心血管疾患（心臓病、不整脈、動脈硬化など）、虚血性心疾患（狭心症、心筋梗塞など）、脳血管障害（脳梗塞など）、高血圧、糖尿病、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、糖尿病性神経障害などの原因となり得る。   BH4 is known to function as a coenzyme for phenylalanine hydroxylase (PAH), tyrosine hydroxylase (TH) and tryptophan hydroxylase (TPH). A decrease in the amount of BH4 produced in vivo leads to a decrease in the activity of these hydroxylases. PAH is an enzyme that converts phenylalanine to tyrosine. Inactivation of PAH leads to the accumulation of phenylalanine in the body and can cause hyperphenylalanineemia. TH converts tyrosine to L-DOPA (L-DOPA). L-DOPA is a precursor of dopamine, noradrenaline and adrenaline. Inactivation of TH leads to a decrease in L-DOPA in vivo and may cause dystonia, Parkinson's disease and the like. TPH converts tryptophan to 5-hydroxytryptophan (5-HTP). 5-HTP is a precursor of serotonin (5-HT). Inactivation of TPH leads to a decrease in serotonin in vivo and can cause eating disorders (eg obesity), Alzheimer's disease, schizophrenia, pain, sexual dysfunction, epilepsy, and dysuria. BH4 is also known to function as a coenzyme for nitric oxide synthase (NOS). Inactivation of NOS leads to increase of reactive oxygen species and decrease of nitric oxide biological activity, and cardiovascular disease (heart disease, arrhythmia, arteriosclerosis, etc.), ischemic heart disease (angina pectoris, myocardial infarction, etc.) It can cause cerebrovascular disorder (cerebral infarction, etc.), hypertension, diabetes, diabetic nephropathy, diabetic retinopathy, diabetic neuropathy, and the like.

ＳＰＲをコードする遺伝子の異常に起因する先天性代謝異常症として、ＳＰＲ欠損症が知られている。ＳＰＲ関連疾患であるＳＰＲ欠損症の治療法として、Ｌ−ドーパ（Ｌ−ＤＯＰＡ）と５−ヒドロキシトリプトファン（５−ＨＴＰ）の補充療法が知られている。   SPR deficiency is known as an inborn error of metabolism caused by an abnormality in the gene encoding SPR. Replacement therapy of L-DOPA (L-DOPA) and 5-hydroxytryptophan (5-HTP) is known as a therapeutic method for SPR deficiency which is an SPR-related disease.

ＳＰＲ関連疾患である心血管疾患の治療法として、ＢＨ４の経口投与が検討された（非特許文献１）。しかし、経口投与されたＢＨ４は血中で速やかに酸化されてジヒドロビオプテリン（ＢＨ２）に変換されてしまい、有効ではなかった。   Oral administration of BH4 has been studied as a treatment method for cardiovascular disease which is an SPR-related disease (Non-patent Document 1). However, BH4 orally administered was not effective because it was rapidly oxidized in blood and converted into dihydrobiopterin (BH2).

特開２０１７−１２３８４０号公報JP, 2017-123840, A 国際公開第２００８／１２４７２４号International Publication No. 2008/124724 国際公開第２０１２／０５７３６３号International Publication No. 2012/057363

Ｃｕｎｎｉｎｇｔｏｎ，Ｃ．ｅｔ．ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，２０；１２５（１１）：ｐｐ．１３５６−６６Cunnington, C.I. et. al. , Circulation, 20; 125 (11): pp. 1356-66

本発明は、ＳＰＲ関連疾患の治療及び予防に使用し得る新規医薬の提供を目的とする。   The present invention aims to provide a novel drug that can be used for treatment and prevention of SPR-related diseases.

本発明者らは上記課題に鑑み、鋭意検討した結果、ＳＰＲ欠損症の疾患動物モデルであるＳＰＲ ＫＯマウスに対して、ＳＰＲをコードするポリヌクレオチドを含む組換えベクターが有効に作用することを見出し、本発明に至った。   In view of the above problems, the present inventors have conducted extensive studies and found that a recombinant vector containing a polynucleotide encoding SPR effectively acts on SPR KO mice, which are disease animal models of SPR deficiency. The present invention has been reached.

本発明の一以上の実施形態は、以下の＜１＞〜＜１４＞を包含する。
＜１＞
セピアプテリン還元酵素（ＳＰＲ）をコードするポリヌクレオチドを含む、組換えベクター。
＜２＞
前記ポリヌクレオチドが、
配列番号１、３又は５のアミノ酸配列から成るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであるか、あるいは
配列番号１、３又は５のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列から成り、かつセピアプテリン還元活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、＜１＞に記載の組換えベクター。
＜３＞
組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、＜１＞又は＜２＞に記載の組換えベクター。
＜４＞
野生型ＡＡＶ１カプシドタンパク質（配列番号７）のアミノ酸配列中４４５位のチロシンがフェニルアラニンに置換されている変異アミノ酸配列を有するタンパク質、野生型のＡＡＶ２カプシドタンパク質（配列番号８）のアミノ酸配列中４４４位のチロシンがフェニルアラニンに置換されている変異アミノ酸配列を有するタンパク質、または野生型のＡＡＶ９カプシドタンパク質（配列番号９）のアミノ酸配列中４４６位のチロシンがフェニルアラニンに置換されている変異アミノ酸配列を有するタンパク質を含む、＜３＞に記載の組換えベクター。
＜５＞
前記ポリヌクレオチドが、ＣＭＶプロモーター、ＣＡＧプロモーター、シナプシンＩプロモーター配列、ミエリン塩基性タンパク質プロモーター配列、ニューロン特異的エノラーゼプロモーター配列、カルシウム／カルモジュリンー依存性蛋白キナーゼＩＩ（ＣＭＫＩＩ）プロモーター配列、チュブリンαＩプロモーター配列、血小板由来成長因子β鎖プロモーター配列、グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモーター配列、Ｌ７プロモーター配列（小脳プルキンエ細胞特異的プロモーター）、グリア線維酸性タンパク質（ｈＧｆａ２）プロモーター配列、およびグルタミン酸受容体デルタ２プロモーター（小脳プルキンエ細胞特異的プロモーター）配列から成るグルタミン酸脱炭酸酵素（ＧＡＤ６５／ＧＡＤ６７）プロモーター配列からなる群より選択されるプロモーター配列を含む、＜３＞又は＜４＞に記載の組換えベクター。
＜６＞
前記ポリヌクレオチドが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ８、およびＡＡＶ９からなる群より選択されるインバーテッドターミナルリピート（ＩＴＲ）を含む、＜３＞〜＜５＞のいずれか１つに記載の組換えベクター。
＜７＞
＜１＞〜＜６＞のいずれか１つに記載の組換えベクターを含む、ＳＰＲ関連疾患の治療又は予防用組成物。
＜８＞
前記ＳＰＲ関連疾患は、ＳＰＲ欠損症、高フェニルアラニン血症、ジストニア、パーキンソン病、摂食障害、アルツハイマー病、統合失調症、疼痛、性的不全、てんかん、排尿障害、心血管疾患、虚血性心疾患、脳血管障害、高血圧、糖尿病、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、糖尿病性神経障害、睡眠障害、気分障害（うつ病性障害及び双極性障害など）及び自律神経障害からなる群から選択される、＜７＞に記載の組成物。
＜９＞
皮内投与、皮下投与、筋肉内投与、腹腔内投与、静脈内投与、脳室内投与、髄腔内投与、径鼻投与、又は吸入投与される、＜７＞又は＜８＞に記載の組成物。
＜１０＞
他の医薬と組み合わせて投与される、＜７＞〜＜９＞のいずれか１つに記載の組成物。
＜１１＞
前記他の医薬が、Ｌ−ドーパ、５−ヒドロキシトリプトファン、セピアプテリン、向精神薬又は糖尿病治療薬である、＜１０＞に記載の組成物。
＜１２＞
それを必要とする患者に＜１＞〜＜６＞のいずれか１つに記載の組換えベクター又は＜７＞〜＜１１＞のいずれか１つに記載の組成物を投与することを含む、ＳＰＲ関連疾患の治療又は予防方法。
＜１３＞
ＳＰＲ関連疾患の治療又は予防における使用のための、＜１＞〜＜６＞のいずれか１つに記載の組換えベクター。
＜１４＞
＜１＞〜＜６＞のいずれか１つに記載の組換えベクターを含む、ＳＰＲ関連疾患の治療又は予防用医薬の製造のための、＜１＞〜＜６＞のいずれか１つに記載の組換えベクターの使用。 One or more embodiments of the present invention include the following <1> to <14>.
<1>
A recombinant vector comprising a polynucleotide encoding sepiapterin reductase (SPR).
<2>
The polynucleotide is
A polynucleotide encoding a polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, 3 or 5, or consisting of an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, 3 or 5, and The recombinant vector according to <1>, which comprises a polynucleotide encoding a polypeptide having sepiapterin reducing activity.
<3>
The recombinant vector according to <1> or <2>, which is a recombinant adeno-associated virus (AAV) vector.
<4>
A protein having a mutant amino acid sequence in which tyrosine at position 445 in the amino acid sequence of wild-type AAV1 capsid protein (SEQ ID NO: 7) is substituted with phenylalanine, and at a position at position 444 in the amino acid sequence of wild-type AAV2 capsid protein (SEQ ID NO: 8) Includes a protein having a mutant amino acid sequence in which tyrosine is replaced by phenylalanine, or a protein having a mutant amino acid sequence in which tyrosine at position 446 in the amino acid sequence of wild-type AAV9 capsid protein (SEQ ID NO: 9) is replaced by phenylalanine The recombinant vector according to <3>.
<5>
The polynucleotide is a CMV promoter, CAG promoter, synapsin I promoter sequence, myelin basic protein promoter sequence, neuron-specific enolase promoter sequence, calcium / calmodulin-dependent protein kinase II (CMKII) promoter sequence, tubulin αI promoter sequence, Platelet-derived growth factor β chain promoter sequence, glial fibrillary acidic protein (GFAP) promoter sequence, L7 promoter sequence (cerebellar Purkinje cell-specific promoter), glial fibrillary acidic protein (hGfa2) promoter sequence, and glutamate receptor delta2 promoter ( Glutamate decarboxylase (GAD65 / GAD67) promoter sequence comprising cerebellar Purkinje cell-specific promoter) sequence The recombinant vector according to <3> or <4>, which comprises a promoter sequence selected from the group consisting of:
<6>
The set according to any one of <3> to <5>, wherein the polynucleotide comprises an inverted terminal repeat (ITR) selected from the group consisting of AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV8, and AAV9. Replacement vector.
<7>
A composition for treating or preventing an SPR-related disease, which comprises the recombinant vector according to any one of <1> to <6>.
<8>
The SPR-related disease is SPR deficiency, hyperphenylalanemia, dystonia, Parkinson's disease, eating disorder, Alzheimer's disease, schizophrenia, pain, sexual dysfunction, epilepsy, dysuria, cardiovascular disease, ischemic heart disease. , Cerebrovascular disorder, hypertension, diabetes, diabetic nephropathy, diabetic retinopathy, diabetic neuropathy, sleep disorders, mood disorders (such as depressive disorders and bipolar disorders) and autonomic neuropathy. The composition according to <7>.
<9>
The composition according to <7> or <8>, which is administered intradermally, subcutaneously, intramuscularly, intraperitoneally, intravenously, intraventricularly, intrathecally, intranasally, or by inhalation. ..
<10>
The composition according to any one of <7> to <9>, which is administered in combination with another drug.
<11>
The composition according to <10>, wherein the other drug is L-dopa, 5-hydroxytryptophan, sepiapterin, a psychotropic drug or an antidiabetic drug.
<12>
Administering the recombinant vector according to any one of <1> to <6> or the composition according to any one of <7> to <11> to a patient in need thereof. A method for treating or preventing an SPR-related disease.
<13>
The recombinant vector according to any one of <1> to <6>, for use in treatment or prevention of an SPR-related disease.
<14>
<1> to <6> for the production of a medicament for treating or preventing SPR-related diseases, which comprises the recombinant vector according to any one of <1> to <6>. Use of recombinant vector.

本発明の組換えベクターを使用することによって、ＳＰＲ関連疾患を効果的に治療及び予防することができる。本発明の組換えベクターは脳内移行性を有するようにその性質を調整することが可能であり、またＢＨ４よりも生体内で安定である点などから、ＳＰＲ関連疾患に対して有効な医薬として使用可能である。   By using the recombinant vector of the present invention, SPR-related diseases can be effectively treated and prevented. Since the recombinant vector of the present invention can be adjusted in its properties so that it has transferability into the brain and is more stable in vivo than BH4, it is an effective drug for SPR-related diseases. It can be used.

図１は、ＢＨ４の生合成経路を示した図である。FIG. 1 is a diagram showing the biosynthetic pathway of BH4. 図２は、野生型マウス及びＳｐｒ ＫＯマウスにｒＡＡＶベクター又はＰＢＳを投与した後の体重変化を示す。各群ｎ＝３。ＷＴ−ＰＢＳ：野生型マウスにＰＢＳを投与；ＫＯ−ＰＢＳ：Ｓｐｒ ＫＯマウスにＰＢＳを投与；ＷＴ−ＡＡＶ：野生型マウスにｒＡＡＶベクターを投与；ＫＯ−ＡＡＶ：Ｓｐｒ ＫＯマウスにｒＡＡＶベクターを投与。なお、ＷＴ−ＰＢＳ、ＫＯ−ＰＢＳ、ＷＴ−ＡＡＶ、ＫＯ−ＡＡＶは、他の図でも同様の意味である。FIG. 2 shows changes in body weight after administration of rAAV vector or PBS to wild type mice and Spr KO mice. Each group n = 3. WT-PBS: PBS administered to wild-type mice; KO-PBS: Spr Administration of PBS to KO mice; WT-AAV: rAAV vector administered to wild-type mice; KO-AAV: Spr KO mice administered rAAV vector. Note that WT-PBS, KO-PBS, WT-AAV, and KO-AAV have the same meanings in other figures. 図３は、野生型マウス及びＳｐｒ ＫＯマウスにｒＡＡＶベクター又はＰＢＳを投与した後の体長変化を示す。FIG. 3 shows changes in body length after administration of rAAV vector or PBS to wild type mice and Spr KO mice. 図４は、野生型マウス及びＳｐｒ ＫＯマウスにｒＡＡＶベクター又はＰＢＳを投与した後の総ビオプテリン量の変化を示す。FIG. 4 shows changes in the total amount of biopterin after administration of rAAV vector or PBS to wild type mice and Spr KO mice. 図５は、野生型マウス及びＳｐｒ ＫＯマウスにｒＡＡＶベクター又はＰＢＳを投与した後のモノアミン量の変化を示す。FIG. 5 shows changes in the amount of monoamine after administration of rAAV vector or PBS to wild type mice and Spr KO mice. 図６は、野生型マウス及びＳｐｒ ＫＯマウスにｒＡＡＶベクター又はＰＢＳを投与した後のＰｈｅ／Ｔｙｒ値の変化を示す。FIG. 6 shows changes in Phe / Tyr levels after administration of rAAV vector or PBS to wild type mice and Spr KO mice. 図７は、野生型マウス及びＳｐｒ ＫＯマウスにｒＡＡＶベクター又はＰＢＳを投与した後におけるＳＰＲタンパク質の発現量変化をウェスタンブロッティングによって定量した結果を示す。FIG. 7 shows the results of quantification by Western blotting of changes in the expression level of SPR protein after administration of rAAV vector or PBS to wild type mice and Spr KO mice. 図８は、ＢＨ４を野生型マウス及びＳｐｒ ＫＯマウスに腹腔内投与した後の体重変化を示す。FIG. 8 shows changes in body weight after intraperitoneal administration of BH4 to wild type mice and Spr KO mice.

＜本発明の組換えベクター＞
本発明の組換えベクターは、セピアプテリン還元酵素（ＳＰＲ）をコードするポリヌクレオチドを含む、組換えベクターである。 <Recombinant vector of the present invention>
The recombinant vector of the present invention is a recombinant vector containing a polynucleotide encoding sepiapterin reductase (SPR).

本発明において、「セピアプテリン還元酵素（ＳＰＲ）」は、天然のＳＰＲのみならず、天然のＳＰＲと高い同一性を有し、かつセピアプテリン還元活性を有するポリペプチドを含む。本発明におけるＳＰＲは特に限定されないが、ヒト、マウス、ラット、サル、イヌ、ブタ、ウシ、ウマなどの哺乳動物由来であり得る。ヒトＳＰＲ、マウスＳＰＲ及びラットＳＰＲのアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１、３及び５で示される。一実施形態において、本発明の組換えベクターは、配列番号１、３又は５のアミノ酸配列から成るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであるか、あるいは、配列番号１、３又は５のアミノ酸配列と７０％以上、８０％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列から成り、かつセピアプテリン還元活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。   In the present invention, “sepapterin reductase (SPR)” includes not only natural SPR but also a polypeptide having high identity with natural SPR and having sepiapterin reducing activity. The SPR in the present invention is not particularly limited, but may be derived from mammals such as humans, mice, rats, monkeys, dogs, pigs, cows and horses. The amino acid sequences of human SPR, mouse SPR and rat SPR are shown in SEQ ID NOs: 1, 3 and 5, respectively. In one embodiment, the recombinant vector of the invention is a polynucleotide encoding a polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, 3 or 5, or alternatively the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, 3 or 5 and 70. % Or more, 80% or more, 90% or more, 91% or more, 92% or more, 93% or more, 94% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more or 99% or more sequence identity And a polynucleotide encoding a polypeptide having a sepiapterin-reducing activity.

また一実施形態において、本発明の組換えベクターは、配列番号１、３又は５のアミノ酸配列において、１個以上（例えば１〜５０個、１〜４０個、１〜３９個、１〜３８個、１〜３７個、１〜３６個、１〜３５個、１〜３４個、１〜３３個、１〜３２個、１〜３１個、１〜３０個、１〜２９個、１〜２８個、１〜２７個、１〜２６個、１〜２５個、１〜２４個、１〜２３個、１〜２２個、１〜２１個、１〜２０個、１〜１９個、１〜１８個、１〜１７個、１〜１６個、１〜１５個、１〜１４個、１〜１３個、１〜１２個、１〜１１個、１〜１０個、１〜９個、１〜８個、１〜７個、１〜６個、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１〜２個又は１個）のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加したアミノ酸配列から成り、かつセピアプテリン還元活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。アミノ酸の欠失、置換、挿入及び付加のうち２種以上が同時に生じてもよい。   Further, in one embodiment, the recombinant vector of the present invention has one or more (for example, 1 to 50, 1 to 40, 1 to 39, 1 to 38 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, 3 or 5). , 1-37, 1-36, 1-35, 1-34, 1-33, 1-32, 1-31, 1-30, 1-29, 1-28 , 1-27, 1-26, 1-25, 1-24, 1-23, 1-22, 1-21, 1-20, 1-19, 1-18 , 1-17, 1-16, 1-15, 1-14, 1-13, 1-12, 1-11, 1-10, 1-9, 1-8 , 1-7, 1-6, 1-5, 1-4, 1-3, 1-2 or 1) amino acid deletion, substitution, insertion and / or addition amino acid sequence And sepiaputeri Comprising a polynucleotide encoding a polypeptide having reducing activity. Two or more kinds of amino acid deletion, substitution, insertion and addition may occur simultaneously.

本発明の組換えベクターに含まれるポリヌクレオチドがコードするポリペプチドにおいて、相互に置換可能なアミノ酸残基の例は以下の通りである。同一群に含まれるアミノ酸残基は相互に置換可能である。
Ａ群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、２−アミノブタン酸、メチオニン、ｏ−メチルセリン、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン。
Ｂ群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、２−アミノアジピン酸、２−アミノスベリン酸。
Ｃ群：アスパラギン、グルタミン。
Ｄ群：リジン、アルギニン、オルニチン、２，４−ジアミノブタン酸、２，３−ジアミノプロピオン酸；Ｅ群：プロリン、３−ヒドロキシプロリン、４−ヒドロキシプロリン；Ｆ群：セリン、スレオニン、ホモセリン；Ｇ群：フェニルアラニン、チロシン。
アミノ酸残基が置換されたＳＰＲは、通常の遺伝子操作技術など、当業者に公知の方法に従って作製することができる。このような遺伝子操作手順については、例えば、Molecular Cloning 3rd Edition, J.Sambrook et al.,Cold Spring Harbor Lab. Press. 2001、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1987-1997などを参照することができる。 In the polypeptide encoded by the polynucleotide contained in the recombinant vector of the present invention, examples of mutually replaceable amino acid residues are as follows. Amino acid residues included in the same group can be substituted with each other.
Group A: leucine, isoleucine, norleucine, valine, norvaline, alanine, 2-aminobutanoic acid, methionine, o-methylserine, t-butylglycine, t-butylalanine, cyclohexylalanine.
Group B: Aspartic acid, glutamic acid, isoaspartic acid, isoglutamic acid, 2-aminoadipic acid, 2-aminosuberic acid.
Group C: asparagine, glutamine.
Group D: lysine, arginine, ornithine, 2,4-diaminobutanoic acid, 2,3-diaminopropionic acid; group E: proline, 3-hydroxyproline, 4-hydroxyproline; group F: serine, threonine, homoserine; G Group: Phenylalanine, Tyrosine.
The SPR in which the amino acid residue is substituted can be prepared by a method known to those skilled in the art, such as ordinary gene manipulation techniques. For such genetic manipulation procedures, see, for example, Molecular Cloning 3rd Edition, J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press. 2001, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1987-1997. You can

また一実施形態において、本発明の組換えベクターは、配列番号２、４又は６のヌクレオチド配列から成るポリヌクレオチドであるか、あるいは、配列番号２、４又は６のヌクレオチド配列と７０％以上、８０％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列から成り、かつセピアプテリン還元活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。   In one embodiment, the recombinant vector of the present invention is a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2, 4 or 6, or 70% or more, 80% or more with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2, 4 or 6. Nucleotide sequence having sequence identity of% or more, 90% or more, 91% or more, 92% or more, 93% or more, 94% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more or 99% or more. And a polynucleotide encoding a polypeptide having sepiapterin-reducing activity.

また一実施形態において、本発明の組換えベクターは、配列番号２、４又は６のヌクレオチド配列において、１個以上（例えば、１〜５０個、１〜４０個、１〜３０個、１〜２５個、１〜２０個、１〜１５個、１〜１０個、１〜９個、１〜８個、１〜７個、１〜６個、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１〜２個又は１個）のヌクレオチドの欠失、置換、挿入及び／又は付加を有するヌクレオチド配列から成り、かつセピアプテリン還元活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。   Further, in one embodiment, the recombinant vector of the present invention has one or more (eg, 1 to 50, 1 to 40, 1 to 30, 1 to 25 in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2, 4 or 6). 1 to 20, 1 to 15, 1 to 10, 1 to 9, 1 to 8, 1 to 7, 1 to 6, 1 to 5, 1 to 4, 1 to 3. , 1-2 or 1) nucleotides having deletions, substitutions, insertions and / or additions of nucleotides and which encode a polypeptide having sepiapterin reducing activity.

また一実施形態において、本発明の組換えベクターは、配列番号２、４又は６のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドであって、かつセピアプテリン還元活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。   In one embodiment, the recombinant vector of the present invention is a polynucleotide capable of hybridizing to a polynucleotide consisting of a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2, 4 or 6 under stringent hybridization conditions. And a polynucleotide encoding a polypeptide having a sepiapterin reducing activity.

ハイブリダイゼーションは、公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、モレキュラー・クローニング（Molecular Cloning 3rd Edition, J.Sambrook et al.,Cold Spring Harbor Lab. Press. 2001）に記載の方法などに従って行うことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、製造業者により提供される使用説明書などに記載の方法に従って行うことができる。ここで、「ストリンジェントな条件」は、低ストリンジェントな条件、中ストリンジェントな条件及び高ストリンジェントな条件のいずれでもよい。「低ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、３２℃の条件である。また、「中ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、４２℃の条件である。「高ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、５０℃の条件である。これらの条件において、温度を上げるほど高い相同性を有するＤＮＡが効率的に得られることが期待できる。ただし、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度、プローブ濃度、プローブの長さ、イオン強度、時間、塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。   Hybridization can be performed according to a known method or a method analogous thereto, for example, the method described in Molecular Cloning (Molecular Cloning 3rd Edition, J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press. 2001). When a commercially available library is used, it can be performed according to the method described in the instruction manual provided by the manufacturer. Here, the “stringent conditions” may be any of low stringent conditions, medium stringent conditions and high stringent conditions. “Low stringent conditions” are, for example, 5 × SSC, 5 × Denhardt's solution, 0.5% SDS, 50% formamide, and 32 ° C. The "moderate stringent conditions" are, for example, 5 x SSC, 5 x Denhardt's solution, 0.5% SDS, 50% formamide, and 42 ° C. The “highly stringent conditions” are, for example, 5 × SSC, 5 × Denhardt's solution, 0.5% SDS, 50% formamide, and 50 ° C. Under these conditions, it can be expected that DNA having high homology can be efficiently obtained as the temperature is increased. However, factors that affect the stringency of hybridization include temperature, probe concentration, probe length, ionic strength, time, salt concentration, and other factors, and those skilled in the art should appropriately select these factors. It is possible to achieve a similar stringency in.

ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドとしては、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴなどの相同性検索ソフトウェアにより、デフォルトのパラメーターを用いて計算したときに、配列番号２、４又は６のヌクレオチド配列と、例えば、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上の同一性を有するポリヌクレオチドを挙げることができる。   The hybridizable polynucleotide is, for example, 70% or more, 80% or more, when compared with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2, 4 or 6 when calculated by using homology search software such as FASTA and BLAST using default parameters. %, 90% or more, 91% or more, 92% or more, 93% or more, 94% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more or 99% or more of a polynucleotide having identity Can be mentioned.

アミノ酸配列やポリヌクレオチド配列の同一性は、ＢＬＡＳＴ（Kalin, S. and Altschul, SF., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990, 87 (6), pp 2264-2268； Proc. Natl. Acad. Sci USA, 1993, 90(12), pp 5873-5877）を用いて決定できる。ＢＬＡＳＴのアルゴリズムに基づいたＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸと呼ばれるプログラムが開発されている（Altschul SF, et al., J Mol Biol, 1990, 215(3), pp 403-410）。ＢＬＡＳＴＮを用いてヌクレオチド配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばｓｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２とする。また、ＢＬＡＳＴＸを用いてアミノ酸配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３とする。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合は、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。   BLAST (Kalin, S. and Altschul, SF., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990, 87 (6), pp 2264-2268; Proc. Natl. Acad) Sci USA, 1993, 90 (12), pp 5873-5877). Programs called BLASTN and BLASTX based on the BLAST algorithm have been developed (Altschul SF, et al., J Mol Biol, 1990, 215 (3), pp 403-410). When the nucleotide sequence is analyzed using BLASTN, the parameters are, for example, score = 100 and wordlength = 12. When BLASTX is used to analyze the amino acid sequence, the parameters are, for example, score = 50 and wordlength = 3. When using BLAST and Gapped BLAST programs, the default parameters for each program are used.

本発明において「組換えベクター」は、目的のポリヌクレオチド（本発明では、ＳＰＲをコードするポリヌクレオチド）を目的の標的細胞に導入する１つの手段である。本発明において使用される組換えベクターは特に限定されないが、例えばアデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、センダイウィルスベクター、プラスミドベクター、リポソームやポリマーとの複合体などが挙げられる。好ましくは、本発明の組換えベクターは組換えＡＡＶベクター（以下で、「本発明のｒＡＡＶベクター」とも呼ぶ）である。目的のベクターを得る又は構築するための方法として、当前記分野で公知であるような、標準的な遺伝子操作技術、配列決定法、制限酵素消化、ポリメラーゼ反応、ＰＣＲ、ＰＣＲ ＳＯＥｉｎｇ、ライゲーション、組換え反応（例えば、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＧＡＴＥＷＡＹ（登録商標）技術）、部位特異的突然変異誘発プロトコールなどを利用できるが、これらに限定されるわけではない。   In the present invention, a “recombinant vector” is one means for introducing a target polynucleotide (in the present invention, a polynucleotide encoding SPR) into a target cell of interest. The recombinant vector used in the present invention is not particularly limited, and examples thereof include adenovirus vector, retrovirus vector, lentivirus vector, adeno-associated virus (AAV) vector, Sendai virus vector, plasmid vector, complex with liposome and polymer. And so on. Preferably, the recombinant vector of the present invention is a recombinant AAV vector (hereinafter, also referred to as "rAAV vector of the present invention"). As a method for obtaining or constructing a vector of interest, standard gene manipulation techniques, sequencing methods, restriction enzyme digestion, polymerase reaction, PCR, PCR SOEing, ligation, recombination, as known in the art, are performed. Reactions (eg, Invitrogen's GATEWAY® technology), site-directed mutagenesis protocols, and the like can be used, but are not limited thereto.

野生型ＡＡＶゲノムは、全長が約５ｋｂのヌクレオチド長を有する一本鎖ＤＮＡ分子であり、センス鎖又はアンチセンス鎖である。ＡＡＶゲノムは、一般に、ゲノムの５’側及び３’側の両末端に約１４５ヌクレオチド長のインバーテッドターミナルリピート（ＩＴＲ）配列を有する。このＩＴＲは、ＡＡＶゲノムの複製起点としての機能及びこのゲノムのビリオン内へのパッケージングシグナルとしての機能等の多様な機能を有することが知られている。ＩＴＲに挟まれた野生型ＡＡＶゲノムの内部領域（以下、単に「内部領域」とも呼ぶ）は、ＡＡＶ複製（ｒｅｐ）遺伝子及びカプシド（ｃａｐ）遺伝子を含む。これらｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子は、それぞれ、ウイルスの複製に関与するタンパク質Ｒｅｐ及び正２０面体構造の外殻であるキャプソメアを形成するカプシドタンパク質（例えば、ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３の少なくとも１つ）をコードする。   The wild-type AAV genome is a single-stranded DNA molecule having a nucleotide length of about 5 kb in total length, which is a sense strand or an antisense strand. The AAV genome generally has inverted terminal repeat (ITR) sequences approximately 145 nucleotides long at both the 5'and 3'ends of the genome. It is known that this ITR has various functions such as a function as an origin of replication of the AAV genome and a function as a packaging signal into the virion of this genome. The internal region of the wild-type AAV genome flanked by ITRs (hereinafter, also simply referred to as “internal region”) contains the AAV replication (rep) gene and the capsid (cap) gene. These rep gene and cap gene respectively encode a protein Rep involved in viral replication and a capsid protein (eg, at least one of VP1, VP2, and VP3) forming a capsomere that is an outer shell of an icosahedral structure. ..

本発明の組換えベクターは、好ましくは天然由来のアデノ随伴ウイルス１型（ＡＡＶ１）、２型（ＡＡＶ２）、３型（ＡＡＶ３）、４型（ＡＡＶ４）、５型（ＡＡＶ５）、６型（ＡＡＶ６）、７型（ＡＡＶ７）、８型（ＡＡＶ８）、９型（ＡＡＶ９）などから作製できるｒＡＡＶベクターである。これらのアデノ随伴ウイルスゲノムのヌクレオチド配列は公知であり、それぞれ、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＦ０６３４９７．１（ＡＡＶ１）、ＡＦ０４３３０３（ＡＡＶ２）、ＮＣ＿００１７２９（ＡＡＶ３）、ＮＣ＿００１８２９．１（ＡＡＶ４）、ＮＣ＿００６１５２．１（ＡＡＶ５）、ＡＦ０２８７０４．１（ＡＡＶ６）、ＮＣ＿００６２６０．１（ＡＡＶ７）、ＮＣ＿００６２６１．１（ＡＡＶ８）、ＡＹ５３０５７９（ＡＡＶ９）のヌクレオチド配列を参照できる。これらのうち、２型、３型、５型及び９型がヒト由来である。本発明において、特にＡＡＶ１、ＡＡＶ２又はＡＡＶ９に由来するカプシドタンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３など）を利用することが好ましい。ＡＡＶ１とＡＡＶ９はヒト由来のＡＡＶのうちで神経細胞への感染効率が比較的高いことが報告されている(Taymans, et al., Hum Gene Ther 18:195-206, 2007など)。   The recombinant vector of the present invention is preferably a naturally-occurring adeno-associated virus type 1 (AAV1), type 2 (AAV2), type 3 (AAV3), type 4 (AAV4), type 5 (AAV5), type 6 (AAV6). ), Type 7 (AAV7), type 8 (AAV8), type 9 (AAV9) and the like. The nucleotide sequences of these adeno-associated virus genomes are known, and GenBank accession numbers: AF063497.1 (AAV1), AF043303 (AAV2), NC_001729 (AAV3), NC_001829.1 (AAV4), NC_006152.1 (AAV5), respectively. , AF0288704.1 (AAV6), NC_006260.1 (AAV7), NC_006261.1 (AAV8), AY530579 (AAV9) nucleotide sequences can be referred to. Of these, types 2, 3, 5 and 9 are of human origin. In the present invention, it is particularly preferable to use capsid proteins derived from AAV1, AAV2 or AAV9 (VP1, VP2, VP3, etc.). It has been reported that AAV1 and AAV9 have relatively high efficiency of infecting nerve cells among human-derived AAV (Taymans, et al., Hum Gene Ther 18: 195-206, 2007 etc.).

本発明のｒＡＡＶベクターは、特に限定されないが、例えば特許文献２（国際公開２００８／１２４７２４）に記載のＡＡＶベクターや、特許文献３（国際公開２０１２／０５７３６３）に記載のＡＡＶベクターであり得る。これらの文献に開示されたＡＡＶベクターは生体内の血液脳関門を通過可能であり、末梢投与（例えば静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与、心腔内投与、筋肉内投与、臍帯血管内投与など）によっても神経細胞に効率的に遺伝子送達することができる。したがって、脳実質内投与などの慎重な操作を必要とする投与形態が不要であるので、より高い安全性が期待できる。   The rAAV vector of the present invention is not particularly limited, but may be, for example, the AAV vector described in Patent Document 2 (International Publication 2008/124724) or the AAV vector described in Patent Document 3 (International Publication 2012/057363). The AAV vectors disclosed in these documents are capable of crossing the blood-brain barrier in vivo, and are administered peripherally (for example, intravenous administration, intraarterial administration, intraperitoneal administration, intracardiac administration, intramuscular administration, intraumbilical cord administration). (Eg, administration) can also efficiently deliver genes to nerve cells. Therefore, a dosage form that requires careful operation such as intraparenchymal administration is unnecessary, and higher safety can be expected.

本発明のｒＡＡＶベクターに含まれるカプシドタンパク質は、好ましくは特許文献２や特許文献３に記載されるように、野生型のアミノ酸配列と比較して、少なくとも１つのチロシンがフェニルアラニンなどの別のアミノ酸に置換されているアミノ酸配列を有する変異体タンパク質である。例えば、野生型ＡＡＶ１カプシドタンパク質のアミノ酸配列（配列番号７）中の４４５位のチロシンがフェニルアラニンに置換されているアミノ酸配列、野生型のＡＡＶ２カプシドタンパク質のアミノ酸配列（配列番号８）中の４４４位のチロシンがフェニルアラニンに置換されているアミノ酸配列、又は野生型のＡＡＶ９カプシドタンパク質のアミノ酸配列（配列番号９）中の４４６位のチロシン残基がフェニルアラニン残基に置換されているアミノ酸配列を有し、キャプソメア (capsomere)を形成可能である変異タンパク質が挙げられる（特許文献２及び特許文献３参照）。また、本発明のＡＡＶベクターに含まれるカプシドタンパク質は、上記アミノ酸配列７〜９のいずれか１つのアミノ酸配列に対して９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつキャプソメアを形成可能であるタンパク質が含まれる。また、例えば、配列番号７〜９のいずれかのアミノ酸配列において、例えば、１〜５０個、１〜４０個、１〜３５個、１〜３０個、１〜２５個、１〜２０個、１〜１５個、１〜１４個、１〜１３個、１〜１２個、１〜１１個、１〜１０個、１〜９個、１〜８個、１〜７個、１〜６個、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１〜２個又は１個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、かつキャプソメアを形成可能であるタンパク質が挙げられる。これら欠失、置換、挿入及び付加のうち２種以上の組み合わせを同時に含んでもよい。別の実施形態において、本発明のｒＡＡＶベクターに含まれるカプシドタンパク質は、単独で又は他のカプシドタンパク質メンバー（例えば、ＶＰ２、ＶＰ３など）と一緒になってキャプソメアを形成する機能を有する。また、当該キャプソメア内には、ＳＰＲをコードするポリヌクレオチドがパッケージングされる。   The capsid protein contained in the rAAV vector of the present invention preferably has at least one tyrosine in another amino acid such as phenylalanine as compared to the wild-type amino acid sequence, as described in Patent Document 2 and Patent Document 3. It is a mutant protein having a substituted amino acid sequence. For example, in the amino acid sequence of the wild-type AAV1 capsid protein (SEQ ID NO: 7), the amino acid sequence in which tyrosine at position 445 is replaced with phenylalanine, or in the amino acid sequence of the wild-type AAV2 capsid protein (SEQ ID NO: 8) at position 444 It has an amino acid sequence in which tyrosine is replaced with phenylalanine, or an amino acid sequence in which the tyrosine residue at position 446 in the amino acid sequence of the wild-type AAV9 capsid protein (SEQ ID NO: 9) is replaced with a phenylalanine residue. (Patent Document 2 and Patent Document 3). The capsid protein contained in the AAV vector of the present invention has 90% or more, 91% or more, 92% or more, 93% or more, 94% or more of the amino acid sequence of any one of the amino acid sequences 7 to 9 above. A protein having an amino acid sequence having 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more or 99% or more identity, and capable of forming capsomeres is included. In addition, for example, in the amino acid sequence of any of SEQ ID NOs: 7 to 9, for example, 1 to 50, 1 to 40, 1 to 35, 1 to 30, 1 to 25, 1 to 20, 1 ~ 15, 1-14, 1-13, 1-12, 1-11, 1-10, 1-9, 1-8, 1-7, 1-6, 1 ~ 5, 1 to 4, 1 to 3, 1 to 2 or 1 amino acid residue contains a deleted, substituted, inserted and / or added amino acid sequence, and is capable of forming capsomeres Examples include proteins. A combination of two or more of these deletions, substitutions, insertions and additions may be included at the same time. In another embodiment, the capsid protein comprised in the rAAV vector of the invention has the function of forming capsomeres, alone or in combination with other capsid protein members (eg, VP2, VP3, etc.). In addition, a polynucleotide encoding SPR is packaged in the capsomere.

本発明のｒＡＡＶベクターにおいて用いられるＲｅｐタンパク質は、ＩＴＲ配列を認識してその配列に依存してゲノム複製を行う機能、ウイルスベクター内へと野生型ＡＡＶゲノム又はｒＡＡＶゲノムをリクルートしてパッケージングする機能、本発明のｒＡＡＶベクターを形成する機能など公知の機能を同程度に有する限り、上記と同様の数のアミノ酸配列同一性を有してもよいし、上記と同様の数のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入及び／又は付加を含み得る。本発明において、好ましくは、公知のＡＡＶ３由来のＲｅｐタンパク質が使用される。   The Rep protein used in the rAAV vector of the present invention has a function of recognizing an ITR sequence and performing genome replication depending on the sequence, and a function of recruiting and packaging a wild-type AAV genome or rAAV genome into a viral vector. As long as it has the same degree of known function as the function of forming the rAAV vector of the present invention, it may have the same number of amino acid sequence identities as described above, or may lack the same number of amino acid residues as described above. It may include loss, substitution, insertion and / or addition. In the present invention, a known AAV3-derived Rep protein is preferably used.

本発明において用いられるＲｅｐタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、ＩＴＲ配列を認識してその配列に依存してゲノム複製を行う機能、ウイルスベクター内へと野生型ＡＡＶゲノム（又はｒＡＡＶゲノム）をパッケージングする機能、本発明のｒＡＡＶベクターを形成する機能などの公知の機能を同程度に有するＲｅｐタンパク質をコードする限り、上記と同様の数の同一性を有してもよいし、上記と同様の数のヌクレオチドの欠失、置換、挿入及び／又は付加を含んでもよい。本発明において、好ましくは、ＡＡＶ２又はＡＡＶ３由来のｒｅｐ遺伝子が使用される。   The polynucleotide encoding the Rep protein used in the present invention has a function of recognizing an ITR sequence and performing genome replication depending on the sequence, and packages a wild-type AAV genome (or rAAV genome) into a viral vector. As long as it encodes a Rep protein having the same level of functions, known functions such as the function of forming the rAAV vector of the present invention, it may have the same number of identities as described above, or the same number as the above. It may include nucleotide deletions, substitutions, insertions and / or additions. In the present invention, the rep gene derived from AAV2 or AAV3 is preferably used.

本発明の一実施形態において、野生型ＡＡＶゲノムの内部領域にコードされるカプシドタンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２及び／又はＶＰ３）並びにＲｅｐタンパク質は、それらをコードするポリヌクレオチドをＡＡＶヘルパープラスミドに組み込んで用いられる。本発明で用いるカプシドタンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２及び／又はＶＰ３）並びにＲｅｐタンパク質は、必要に応じて１種、２種、３種又はそれ以上のプラスミドに組込まれていてもよい。場合によって、これらのカプシドタンパク質及びＲｅｐタンパク質のうちの１種以上がＡＡＶゲノムに含まれてもよい。本発明において、好ましくは、カプシドタンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２及び／又はＶＰ３）及びＲｅｐタンパク質は全て、１種のポリヌクレオチドにコードされ、ＡＡＶヘルパープラスミドとして提供される。   In one embodiment of the present invention, a capsid protein (VP1, VP2 and / or VP3) encoded by an internal region of the wild-type AAV genome and Rep protein are used by incorporating a polynucleotide encoding them into an AAV helper plasmid. .. The capsid protein (VP1, VP2 and / or VP3) and Rep protein used in the present invention may be incorporated into one, two, three or more plasmids, if necessary. Optionally, one or more of these capsid and Rep proteins may be included in the AAV genome. In the present invention, preferably, the capsid protein (VP1, VP2 and / or VP3) and Rep protein are all encoded by one polynucleotide and provided as an AAV helper plasmid.

本発明のｒＡＡＶベクター中にパッケージングされるポリヌクレオチドは、野生型ゲノムの５’側および３’側に位置するＩＴＲの間に位置する内部領域（すなわち、ｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子の一方または両方）のポリヌクレオチドを、目的のタンパク質をコードするポリヌクレオチドおよびこのポリヌクレオチドを転写するためのプロモーター配列などを含む遺伝子カセットで置換することにより作製できる。好ましくは、５’側および３’側に位置するＩＴＲは、それぞれＡＡＶゲノムの５’末端および３’末端に位置する。好ましくは、本発明のｒＡＡＶゲノムは、５’末端および３’末端に位置するＩＴＲは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９のゲノムに含まれる５’側ＩＴＲおよび３’側ＩＴＲを含む。一般的に、ＩＴＲ部分は容易に相補配列が入れ替わった配列（flip and flop structure）を採るため、本発明のｒＡＡＶゲノムに含まれるＩＴＲは、５’と３’の方向が逆転していてもよい。本発明のｒＡＡＶゲノムにおいて、内部領域と置き換えられるポリヌクレオチドの長さは、元のポリヌクレオチドの長さと同程度が実用上好ましい。すなわち、本発明のｒＡＡＶゲノムは、全長が野生型の全長である５ｋｂと同程度、例えば約２〜６ｋｂ、好ましくは約４〜６ｋｂであることが好ましい。   The polynucleotide packaged in the rAAV vector of the present invention has an internal region located between the ITRs located on the 5 ′ and 3 ′ sides of the wild-type genome (ie, one or both of the rep gene and the cap gene). Can be prepared by substituting a polynucleotide encoding the protein of interest with a gene cassette containing a promoter sequence for transcribing this polynucleotide. Preferably, the ITRs located on the 5'side and the 3'side are located on the 5'and 3'ends of the AAV genome, respectively. Preferably, the rAAV genome of the present invention, wherein the ITRs located at the 5 ′ and 3 ′ ends include a 5 ′ ITR and a 3 ′ ITR contained in the AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV8 or AAV9 genome. .. Generally, the ITR portion has a sequence (flip and flop structure) in which complementary sequences are easily replaced, so that the ITRs contained in the rAAV genome of the present invention may have their 5'and 3'directions reversed. .. In the rAAV genome of the present invention, the length of the polynucleotide that replaces the internal region is practically preferably the same as the length of the original polynucleotide. That is, it is preferable that the rAAV genome of the present invention has a total length of about the same as the wild type full length of 5 kb, for example, about 2 to 6 kb, preferably about 4 to 6 kb.

一般的に、組換えＡＡＶベクター内にパッケージングされるポリヌクレオチドは、一本鎖である場合には目的の治療用タンパク質（本発明ではＳＰＲタンパク質）を発現するまで時間（数日）を要する場合がある。この場合、導入される治療用遺伝子（本発明ではＳＰＲをコードする遺伝子）を、自己相補性を有するｓｃ（self-complementary)型となるように設計して、より短期間に効果を示すことも可能である。具体的な詳細については、例えば、Foust KD, et al.(Nat Biotechnol. 2009 Jan;27(1):59-65)などに記載されている。本発明のｒＡＡＶベクター中にパッケージングされているポリヌクレオチドは、非ｓｃ型であってもよいしｓｃ型であってもよい。   Generally, when the polynucleotide packaged in the recombinant AAV vector is single-stranded, it takes time (several days) to express the therapeutic protein of interest (SPR protein in the present invention). There is. In this case, the therapeutic gene to be introduced (the gene encoding SPR in the present invention) may be designed so as to be of sc (self-complementary) type having self-complementarity to show the effect in a shorter period of time. It is possible. Specific details are described in, for example, Foust KD, et al. (Nat Biotechnol. 2009 Jan; 27 (1): 59-65). The polynucleotide packaged in the rAAV vector of the present invention may be non-sc type or sc type.

一実施形態において、本発明のｒＡＡＶベクターは、ＳＰＲをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーター配列を含む。例えばプロモーターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＣＡＧプロモーターなどの通常使用される強力なプロモーター配列であってもよい。またプロモーターは、神経系細胞特異的なプロモーター配列であってもよい。神経系細胞特異的なプロモーター配列としては、例えば、シナプシンＩプロモーター配列、グルタミン酸脱炭酸酵素（ＧＡＤ６５／ＧＡＤ６７）プロモーター配列、Ｔｉｅ２プロモーター配列（脳毛細血管特異的プロモーター）、ミエリン塩基性タンパク質プロモーター配列、ニューロン特異的エノラーゼプロモーター配列、グリア線維性酸性タンパク質プロモーター配列、Ｌ７プロモーター配列（小脳プルキンエ細胞特異的プロモーター）、グルタミン酸受容体デルタ２プロモーター（小脳プルキンエ細胞特異的プロモーター）を含むプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。また、本発明のｒＡＡＶベクターにおいて、カルシウム／カルモジュリンー依存性蛋白キナーゼＩＩ（ＣＭＫＩＩ）プロモーター、チュブリンαＩプロモーター、血小板由来成長因子β鎖プロモーターなどのプロモーター配列も使用され得る。プロモーター配列は、単独であっても任意の複数の組み合わせであってもよい。発明のｒＡＡＶベクターは、ｍＲＮＡの転写、タンパク質への翻訳などを補助するエンハンサー配列、Ｋｏｚａｋ配列、適切なポリアデニル化シグナル配列などの公知の配列をさらに含んでもよい。   In one embodiment, the rAAV vector of the invention comprises a promoter sequence operably linked to a polynucleotide encoding SPR. For example, the promoter may be a commonly used strong promoter sequence such as cytomegalovirus (CMV) promoter or CAG promoter. The promoter may be a neural cell-specific promoter sequence. Examples of neural cell-specific promoter sequences include synapsin I promoter sequence, glutamate decarboxylase (GAD65 / GAD67) promoter sequence, Tie2 promoter sequence (brain capillary-specific promoter), myelin basic protein promoter sequence, neuron. Examples of the promoter include a specific enolase promoter sequence, a glial fibrillary acidic protein promoter sequence, an L7 promoter sequence (cerebellar Purkinje cell-specific promoter), and a glutamate receptor delta2 promoter (cerebellar Purkinje cell-specific promoter). Not limited. In the rAAV vector of the present invention, promoter sequences such as calcium / calmodulin-dependent protein kinase II (CMKII) promoter, tubulin αI promoter, and platelet-derived growth factor β chain promoter can also be used. The promoter sequences may be used alone or in any combination of plural types. The rAAV vector of the invention may further include known sequences such as an enhancer sequence for assisting transcription of mRNA, translation into protein, etc., Kozak sequence, and appropriate polyadenylation signal sequence.

本発明のｒＡＡＶベクターを調製する方法としては一般的なものを利用することができ、例えば、（ａ）カプシドタンパク質をコードする第１のポリヌクレオチド（一般に、ＡＡＶヘルパープラスミドと称される）、および（ｂ）本発明のｒＡＡＶベクター内にパッケージングされる第２のポリヌクレオチド（ＳＰＲをコードするポリヌクレオチドを含む）を、培養細胞にトランスフェクトする工程を含むことができる。本発明における調製方法はさらに、（ｃ）アデノウイルス（ＡｄＶ）ヘルパープラスミドと称されるアデノウイルス由来因子をコードするプラスミドを培養細胞にトランフェクトする工程、またはアデノウイルスを培養細胞に感染させる工程も含むことができる。さらに、上記のトランスフェクトされた培養細胞を培養する工程、および培養上清よりｒＡＡＶベクターを収集する工程を含むこともできる。このような方法は既に公知であり、本明細書の実施例においても利用される。   As a method for preparing the rAAV vector of the present invention, a general method can be used. For example, (a) a first polynucleotide encoding a capsid protein (generally referred to as AAV helper plasmid), and (B) A step of transfecting a cultured cell with a second polynucleotide (including a polynucleotide encoding SPR) packaged in the rAAV vector of the present invention can be included. The preparation method of the present invention further comprises (c) a step of transfecting a cultured cell with a plasmid encoding an adenovirus-derived factor called an adenovirus (AdV) helper plasmid, or a step of infecting the cultured cell with adenovirus. Can be included. Furthermore, it can also include the step of culturing the above-mentioned transfected cultured cells and the step of collecting the rAAV vector from the culture supernatant. Such a method is already known and used in the examples of the present specification.

第１のポリヌクレオチド（ａ）において、本発明のカプシドタンパク質をコードするヌクレオチドは、好ましくは、培養細胞において作動可能である公知のプロモーター配列に作動可能に結合される。このようなプロモーター配列としては、例えば、ＣＭＶプロモーター、ＥＦ−１αプロモーター、ＳＶ４０プロモーターなどを適宜使用することができる。さらに、公知のエンハンサー配列、Ｋｏｚａｋ配列、ポリＡ付加シグナル配列などを適宜含み得る。   In the first polynucleotide (a), the nucleotide encoding the capsid protein of the present invention is preferably operably linked to a known promoter sequence that is operable in cultured cells. As such a promoter sequence, for example, CMV promoter, EF-1α promoter, SV40 promoter and the like can be appropriately used. Furthermore, a known enhancer sequence, Kozak sequence, poly A addition signal sequence, etc. may be appropriately contained.

第２のポリヌクレオチド（ｂ）は、プロモーターが作動可能である位置にＳＰＲをコードするポリヌクレオチドを含む。さらに、公知のエンハンサー配列、Ｋｏｚａｋ配列、ポリＡ付加シグナル配列などを適宜含み得る。この第２のポリヌクレオチドはさらに、プロモーター配列の下流に、種々の公知の制限酵素のよって切断可能なクローニングサイトを含み得る。複数の制限酵素認識部位を含むマルチクローニングサイトがより好ましい。当業者は、公知の遺伝子操作手順に従って、ＳＰＲをコードするポリヌクレオチドをプロモーターの下流に組込むことができる。このような遺伝子操作手順については、例えば、モレキュラー・クローニング（Molecular Cloning 3rd Edition, J.Sambrook et al.,Cold Spring Harbor Lab. Press. 2001）などを参照のこと。   The second polynucleotide (b) contains a polynucleotide encoding SPR at a position where the promoter is operable. Furthermore, a known enhancer sequence, Kozak sequence, poly A addition signal sequence, etc. may be appropriately contained. This second polynucleotide may further contain a cloning site downstream of the promoter sequence, which is cleavable by various known restriction enzymes. A multi-cloning site containing a plurality of restriction enzyme recognition sites is more preferable. Those skilled in the art can incorporate a polynucleotide encoding SPR downstream of the promoter according to known genetic engineering procedures. For such a genetic manipulation procedure, see, for example, molecular cloning (Molecular Cloning 3rd Edition, J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press. 2001).

本発明のｒＡＡＶベクターの調製において、ヘルパーウイルスプラスミド（例えば、アデノウイルス、ヘルペスウイルス又はワクシニア）を使用して、上記第１および第２のポリヌクレオチドと同時に培養細胞に導入され得る。好ましくは、本発明の調製方法は、アデノウイルス（ＡｄＶ）ヘルパープラスミドを導入する工程をさらに含む。本発明において、好ましくは、ＡｄＶヘルパーは、培養細胞と同じ種のウイルスに由来する。例えば、ヒト培養細胞２９３Ｔを用いる場合、ヒトＡｄＶ由来のヘルパーウイルスベクターを用いることができる。このようなＡｄＶヘルパーベクターとして、市販されているもの（例えば、Agilent Technologies社のAAV Helper-Free System (カタログ番号240071)）を使用することができる。   In the preparation of the rAAV vector of the present invention, a helper virus plasmid (eg, adenovirus, herpes virus or vaccinia) can be used to introduce into the cultured cells simultaneously with the first and second polynucleotides. Preferably, the preparation method of the present invention further comprises a step of introducing an adenovirus (AdV) helper plasmid. In the present invention, preferably, the AdV helper is derived from a virus of the same species as the cultured cells. For example, when using human cultured cells 293T, a human AdV-derived helper virus vector can be used. As such an AdV helper vector, a commercially available one (for example, AAV Helper-Free System (catalog number 240071) manufactured by Agilent Technologies) can be used.

本発明のｒＡＡＶベクターの調製において、上記の１種以上のプラスミドを培養細胞にトランスフェクションする方法は、例えば、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法など、公知の種々の方法を使用することができる。このような方法は、例えばMolecular Cloning 3rd Ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1987-1997などに記載されている。   In the preparation of the rAAV vector of the present invention, various known methods such as calcium phosphate method, lipofection method, electroporation method and the like can be used as the method for transfecting the cultured cells with the above-mentioned one or more plasmids. it can. Such a method is described in, for example, Molecular Cloning 3rd Ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1987-1997.

＜本発明の組成物＞
本発明の組成物は、ＳＰＲ関連疾患の治療又は予防用組成物であって、本発明の組換えベクターを含む。 <Composition of the present invention>
The composition of the present invention is a composition for treating or preventing SPR-related diseases, which comprises the recombinant vector of the present invention.

本発明において「ＳＰＲ関連疾患」とは、ＳＰＲタンパク質の産生量の低下、ＳＰＲタンパク質の不活性化又はＳＰＲタンパク質をコードする遺伝子の異常に起因して生じる全ての疾患を含む。ＳＰＲ関連疾患には、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）、トリプトファンヒドロキシラーゼ（ＴＰＨ）及び／又は一酸化窒素シンターゼ（ＮＯＳ）の活性低下によって引き起る疾患を含む。ＳＰＲ関連疾患は、特に限定されないが、例えば、ＳＰＲ欠損症、高フェニルアラニン血症、ジストニア、パーキンソン病、喫食障害、アルツハイマー病、統合失調症、疼痛、性的不全、てんかん、排尿障害、心血管疾患、虚血性心疾患、脳血管障害、高血圧、糖尿病、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、糖尿病性神経障害、睡眠障害、気分障害（例えばうつ病性障害又は双極性障害）、自律神経障害などが挙げられる。   In the present invention, the “SPR-related disease” includes all diseases caused by a decrease in the production amount of SPR protein, inactivation of SPR protein, or an abnormality in the gene encoding SPR protein. SPR-related diseases include diseases caused by decreased activity of phenylalanine hydroxylase (PAH), tyrosine hydroxylase (TH), tryptophan hydroxylase (TPH) and / or nitric oxide synthase (NOS). The SPR-related disease is not particularly limited, and examples thereof include SPR deficiency, hyperphenylalanineemia, dystonia, Parkinson's disease, eating disorder, Alzheimer's disease, schizophrenia, pain, sexual dysfunction, epilepsy, dysuria, cardiovascular disease. , Ischemic heart disease, cerebrovascular disorder, hypertension, diabetes, diabetic nephropathy, diabetic retinopathy, diabetic neuropathy, sleep disorder, mood disorder (eg, depressive disorder or bipolar disorder), autonomic neuropathy, etc. Is mentioned.

本発明の組成物は、常法に従って製剤化することができ（例えば、Remington's Pharmaceutical Science, latest edition, Mark Publishing Company, Easton, U.S.Aを参照）、有効成分に加えて薬学的に許容される担体及び／又は添加物を含むものであってもよい。本発明の組成物中に、有効成分である本発明のベクターは、０．１〜９９．９重量％含まれ得る。   The composition of the present invention can be formulated according to a conventional method (see, for example, Remington's Pharmaceutical Science, latest edition, Mark Publishing Company, Easton, USA), and in addition to the active ingredient, a pharmaceutically acceptable carrier and And / or may include additives. The vector of the present invention, which is an active ingredient, may be contained in the composition of the present invention in an amount of 0.1 to 99.9% by weight.

薬学的に許容される担体又は添加物としては、例えば賦形剤、崩壊剤、崩壊補助剤、結合剤、滑沢剤、コーティング剤、色素、希釈剤、溶解剤、溶解補助剤、等張化剤、ｐＨ調整剤、安定化剤等を用いることができるが、これらに限定されない。   Examples of the pharmaceutically acceptable carrier or additive include excipients, disintegrants, disintegration aids, binders, lubricants, coating agents, dyes, diluents, solubilizers, solubilization aids, isotonic agents. Agents, pH adjusters, stabilizers and the like can be used, but are not limited thereto.

経口投与に適する製剤の例としては、例えば散剤、錠剤、カプセル剤、細粒剤、顆粒剤、液剤またはシロップ剤等を挙げることが出来る。経口投与の場合、微晶質セルロース、クエン酸ナトリウム、炭酸カルシウム、リン酸ジカリウム、グリシンのような種々の賦形剤を、澱粉、好適にはとうもろこし、じゃがいもまたはタピオカの澱粉、およびアルギン酸やある種のケイ酸複塩のような種々の崩壊剤、およびポリビニルピロリドン、蔗糖、ゼラチン、アラビアゴムのような顆粒形成結合剤と共に使用することができる。また、ステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、タルク等の滑沢剤も錠剤形成に非常に有効であることが多い。同種の固体組成物をゼラチンカプセルに充填して使用することもできる。これに関連して好適な物質としてラクトースまたは乳糖の他、高分子量のポリエチレングリコールを挙げることができる。経口投与用として水性懸濁液および／またはエリキシルにしたい場合、活性成分を各種の甘味料または香味料、着色料または染料と併用する他、必要であれば乳化剤および／または懸濁化剤も併用し、水、エタノール、プロピレングリコール、グリセリン等、およびそれらを組み合わせた希釈剤と共に使用することができる。   Examples of formulations suitable for oral administration include powders, tablets, capsules, fine granules, granules, solutions or syrups. For oral administration, various excipients such as microcrystalline cellulose, sodium citrate, calcium carbonate, dipotassium phosphate, glycine, starch, preferably corn, starch of potato or tapioca, and alginic acid and certain Can be used with various disintegrating agents such as silicic acid double salts and granulating binders such as polyvinylpyrrolidone, sucrose, gelatin, gum arabic. Lubricants such as magnesium stearate, sodium lauryl sulfate and talc are also often very effective in tablet formation. The same type of solid composition can be used by filling it into a gelatin capsule. Suitable substances in this connection include lactose or milk sugar as well as high molecular weight polyethylene glycols. When it is desired to prepare an aqueous suspension and / or elixir for oral administration, the active ingredient is used in combination with various sweeteners or flavors, colorants or dyes, and if necessary, an emulsifier and / or suspending agent is also used. However, it can be used with diluents such as water, ethanol, propylene glycol, glycerin, and the like, and combinations thereof.

非経口投与に適する製剤としては、例えば注射剤、坐剤等を挙げることが出来る。非経口投与の場合、本発明の有効成分をゴマ油または落花生油のいずれかに溶解するか、あるいはプロピレングリコール水溶液に溶解した溶液を使用することができる。水溶液は必要に応じて適宜に緩衝し（好適にはｐＨ８以上）、液体希釈剤をまず等張にする必要がある。このような液体希釈剤としては、例えば、生理食塩水を使用できる。これらすべての溶液を無菌状態で製造するには、当業者に周知の標準的な製薬技術で容易に達成することができる。さらに、本発明の組成物は皮膚などに局所的に投与することも可能である。この場合は、標準的な医薬慣行によりクリーム、ゼリー、ペースト、軟膏の形で局所投与するのが望ましい。   Formulations suitable for parenteral administration include, for example, injections and suppositories. For parenteral administration, a solution prepared by dissolving the active ingredient of the present invention in either sesame oil or peanut oil, or in an aqueous propylene glycol solution can be used. The aqueous solution should be suitably buffered if necessary (preferably pH 8 or above) and the liquid diluent first rendered isotonic. As such a liquid diluent, for example, physiological saline can be used. Sterile preparation of all these solutions can be readily accomplished by standard pharmaceutical techniques well known to those skilled in the art. Furthermore, the composition of the present invention can be topically administered to the skin or the like. In this case, topical administration in the form of creams, jellies, pastes, ointments is desirable according to standard pharmaceutical practice.

本発明の組成物の投与量は特に限定されず、疾患の種類、患者の年齢や症状、投与経路、治療の目的、併用薬剤の有無等の種々の条件に応じて適切な投与量を選択することが可能である。本発明の組成物の投与量は、例えば、成人（例えば、体重６０ｋｇ）１日当たり１〜５０００ｍｇ、好ましくは１０〜１０００ｍｇであるが、これらに限定されない。これらの１日投与量は２回から４回に分けて投与されても良い。また、投与単位としてｖｇ（ｖｅｃｔｏｒ ｇｅｎｏｍｅ）を利用する場合、例えば、体重１ｋｇあたり、１０９〜１０１４ｖｇ、好ましくは１０１０〜１０１３ｖｇ、さらに好ましくは１０１０〜１０１２ｖｇの範囲の投与量を選択することが可能であるが、これらに限定されない。   The dose of the composition of the present invention is not particularly limited, and an appropriate dose is selected according to various conditions such as the type of disease, the age and symptoms of the patient, the administration route, the purpose of treatment, the presence or absence of a concomitant drug. It is possible. The dose of the composition of the present invention is, for example, 1 to 5000 mg, preferably 10 to 1000 mg per day for an adult (for example, a body weight of 60 kg), but is not limited thereto. These daily doses may be administered in two to four divided doses. When vg (vector genome) is used as a dosage unit, for example, it is possible to select a dosage in the range of 109 to 1014 vg, preferably 1010 to 1013 vg, and more preferably 1010 to 1012 vg per kg of body weight. However, it is not limited to these.

＜本発明のベクター及び組成物の投与経路＞
本発明のベクター及び組成物は、経口投与又は非経口投与される。非経口投与の例としては、皮内投与、皮下投与、筋肉内投与、腹腔内投与、静脈内投与、脳室内投与、髄腔内投与、径鼻投与及び吸入投与が挙げられるが、これらに限定されない。 <Route of administration of vector and composition of the present invention>
The vectors and compositions of the invention are administered orally or parenterally. Examples of parenteral administration include, but are not limited to, intradermal administration, subcutaneous administration, intramuscular administration, intraperitoneal administration, intravenous administration, intracerebroventricular administration, intrathecal administration, intranasal administration and inhalation administration. Not done.

＜併用投与＞
本発明のベクター又は組成物は、他の医薬と組み合わせて投与されて投与されても良い。当該他の医薬としては特に限定されないが、例えばＬ−ドーパ、５−ヒドロキシトリプトファン、セピアプテリン、向精神薬又は糖尿病治療薬が挙げられる。他の医薬は、本発明のベクター又は組成物との配合剤の形態で投与されてもよい。あるいは、他の医薬と本発明のベクター又は組成物とは別々の製剤として投与されてもよい。他の医薬と本発明のベクター又は組成物とが別々の製剤として投与される場合には、同時投与および時間差による投与が含まれる。また、時間差による投与は、本発明のベクター又は組成物を先に投与し、他の医薬を後に投与してもよいし、他の医薬を先に投与し、本発明のベクター又は組成物を後に投与してもよい。それぞれの投与方法は同じでも異なっていてもよい。一実施形態において、本発明のベクター又は組成物を投与して体内のＳＰＲ量が増大した後に、セピアプテリンが投与される。セピアプテリンは、体内でＳＰＲによって還元されてＢＨ２となる。ＢＨ２はその後、ＤＨＦＲによってＢＨ４へと変換される。したがって、セピアプテリンを投与することによって生体内のＢＨ４量が増大し、ＳＰＲ関連疾患を良好に治療及び予防し得る。 <Combination administration>
The vector or composition of the present invention may be administered in combination with other drugs. The other drug is not particularly limited, and examples thereof include L-dopa, 5-hydroxytryptophan, sepiapterin, psychotropic drug, and antidiabetic drug. Other drugs may be administered in the form of a combination with the vector or composition of the present invention. Alternatively, the other drug and the vector or composition of the present invention may be administered as separate formulations. When the other drug and the vector or composition of the present invention are administered as separate formulations, simultaneous administration and staggered administration are included. Further, the administration by the time difference may be such that the vector or the composition of the present invention is administered first, and then the other drug may be administered later, or the other drug is administered first and the vector or composition of the present invention is administered later. May be administered. Each administration method may be the same or different. In one embodiment, sepiapterin is administered after administration of the vector or composition of the invention to increase the amount of SPR in the body. Sepiapterin is reduced by SPR in the body to BH2. BH2 is then converted to BH4 by DHFR. Therefore, the administration of sepiapterin increases the amount of BH4 in the body and can successfully treat and prevent SPR-related diseases.

本明細書において言及される全ての文献はその全体が引用により本明細書に取り込まれる。   All documents mentioned in this specification are incorporated herein by reference in their entirety.

以下に説明する本発明の実施例は例示のみを目的とし、本発明の技術的範囲を限定するものではない。本発明の技術的範囲は特許請求の範囲の記載によってのみ限定される。本発明の趣旨を逸脱しないことを条件として、本発明の変更、例えば、本発明の構成要件の追加、削除及び置換を行うことができる。   The embodiments of the present invention described below are for illustrative purposes only and are not intended to limit the technical scope of the present invention. The technical scope of the present invention is limited only by the description of the claims. Modifications of the present invention, for example, addition, deletion, and replacement of the constituent features of the present invention can be made provided that they do not depart from the spirit of the present invention.

実施例１
ｒＡＡＶベクターの調製
特許文献３に記載の方法に従って、ＡＡＶ９由来の変異カプシドタンパク質、ＡＡＶ３由来のＩＴＲ配列などを含むｒＡＡＶベクターを調製した。詳細は以下の通りである。
（ａ）ベクターゲノムプラスミドの作成
マウスＳＰＲ遺伝子をインサートＤＮＡとしてＡＡＶベクターに組み込み、治療用ＡＡＶ９−ｍＳＰＲ（配列番号１０）を作成した。ＡＡＶベクターは、特許文献３に記載される、実験動物において経静脈投与で良好な脳への遺伝子導入が確認されている９型ベクター（ＡＡＶ９由来の変異カプシドタンパク質、ＡＡＶ３由来のＩＴＲ配列などを含む）を用いた。本研究では、広い組織で遺伝子の発現を誘導できるＣＭＶプロモーターの下流にＳＰＲ遺伝子を導入した。 Example 1
Preparation of rAAV Vector According to the method described in Patent Document 3, an rAAV vector containing a mutant capsid protein derived from AAV9, an ITR sequence derived from AAV3, etc. was prepared. Details are as follows.
(A) Preparation of vector genomic plasmid The mouse SPR gene was incorporated into an AAV vector as an insert DNA to prepare a therapeutic AAV9-mSPR (SEQ ID NO: 10). The AAV vector includes a type 9 vector described in Patent Document 3 in which good gene transfer to the brain has been confirmed by intravenous administration in experimental animals (including a mutant capsid protein derived from AAV9, an ITR sequence derived from AAV3, etc.). ) Was used. In the present study, the SPR gene was introduced downstream of the CMV promoter that can induce gene expression in a wide range of tissues.

（ｂ）ＨＥＫ ２９３細胞へのトランスフェクション
ｍＳＰＲ遺伝子を挿入したベクタープラスミドと、ウイルス複製やウイルス粒子の形成に必要とされるタンパク質（Ｒｅｐ，Ｃａｐ）を発現するＡＡＶヘルパープラスミド、および、アデノウイルスヘルパープラスミドの３つをＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクションすることにより、組換えＡＡＶ−ｍＳＰＲを産生するＨＥＫ２９３細胞を作製した。 (B) Transfection of HEK 293 cells Vector plasmid having mSPR gene inserted therein, AAV helper plasmid expressing proteins (Rep, Cap) required for virus replication and virus particle formation, and adenovirus helper plasmid HEK293 cells producing recombinant AAV-mSPR were produced by transfecting HEK293 cells with HEK293 cells.

（ｃ）ウイルスベクターの生成
以下の手順に従って、塩化セシウムＣｓＣｌの密度勾配による超遠心を行い、ｒＡＡＶベクターを精製した。超遠心チューブ内に１．５Ｍおよび１．２５ＭのＣｓＣｌを重層し密度勾配を作製した。ｒＡＡＶベクターを含む細胞破砕溶液を重層後、超遠心（３０，０００ｒｐｍ、２．５時間）を行った。屈折率を計測してＲＩ：１．３６５〜１．３８０のｒＡＡＶベクターを含む画分を回収した。この分画を再度ＣｓＣｌ溶液上に重層し、超遠心（３６，０００ｒｐｍ、２．５時間）を行ってｒＡＡＶを含む分画を得た。 (C) Generation of Viral Vector According to the following procedure, ultracentrifugation with a density gradient of cesium chloride CsCl was performed to purify the rAAV vector. A density gradient was created by overlaying 1.5 M and 1.25 M CsCl in an ultracentrifuge tube. After overlaying the cell disruption solution containing the rAAV vector, ultracentrifugation (30,000 rpm, 2.5 hours) was performed. The refractive index was measured and the fraction containing RI: 1.365 to 1.380 rAAV vector was collected. This fraction was again layered on the CsCl solution and subjected to ultracentrifugation (36,000 rpm, 2.5 hours) to obtain a fraction containing rAAV.

（ｄ）ウイルスベクター力価の測定（リアルタイムＰＣＲ）
精製したｒＡＡＶの１０^-2〜１０^-6の希釈系列を作製した。ＧＦＰ配列をスタンダードとしたプライマーセット（配列番号１１及び１２）を使用して、Applied Biosystems 7900HT Fast リアルタイムＰＣＲシステム（Applied Biosystems社）で定量した。 (D) Measurement of virus vector titer (real-time PCR)
A 10 ⁻² to 10 ⁻⁶ dilution series of purified rAAV was prepared. The primer set (SEQ ID NOS: 11 and 12) using the GFP sequence as a standard was used to quantify with an Applied Biosystems 7900HT Fast real-time PCR system (Applied Biosystems).

実施例２
マウスへのｒＡＡＶベクターの腹腔内投与
生後４週齢の野生型ＢＡＬＢ／ｃマウス（日本クレア社）、及び、ＢＡＬＢ／ｃマウスとの交配を繰り返して遺伝的背景をＢＡＬＢ／ｃとしたＳｐｒ ＫＯマウス（Lexicon Pharmaceuticals社）に対して、実施例１で調製されたｒＡＡＶベクター（2.2 x 10¹³ vg/ml, 5μl）及びＰＢＳ(15μl)の混合液、又はコントロールであるＰＢＳ(20μl)を腹腔内投与した（いずれも単回投与）。試料投与後のマウスの体重変化及び体長変化を測定した。結果を図２及び３に示す。Ｓｐｒ ＫＯマウスにｒＡＡＶベクターを投与することで、投与開始２〜３日後から体重の上昇が確認された。投与開始２週間後には、ｒＡＡＶベクターを投与したＳｐｒ ＫＯマウスの体重及び体長は、野生型マウスと同程度となった。生体内のドーパミン量が増大すると体重増加することが知られている。したがって本実施例の結果は、本発明のｒＡＡＶベクターの投与によってマウス体内のＳＰＲ及びＢＨ４の量が増大し、チロシンのＬ−ドーパへの変換が良好に進行して最終的にドーパミン量の増大につながったためであると考えられる。 Example 2
Intraperitoneal administration of rAAV vector to mouse 4-week-old wild-type BALB / c mouse (CLEA Japan, Inc.) and Spr KO mouse whose genetic background was BALB / c by repeated mating with BALB / c mouse (Lexicon Pharmaceuticals) was intraperitoneally administered with a mixed solution of the rAAV vector (2.2 x 10 ¹³ vg / ml, 5 µl) prepared in Example 1 and PBS (15 µl) or a control PBS (20 µl). (All were single doses). Changes in body weight and length of the mice after the administration of the sample were measured. The results are shown in Figures 2 and 3. By administering the rAAV vector to Spr KO mice, an increase in body weight was confirmed from 2 to 3 days after the start of administration. Two weeks after the start of administration, the body weight and body length of the Spr KO mouse to which the rAAV vector was administered were similar to those of the wild-type mouse. It is known that weight increases as the amount of dopamine in the body increases. Therefore, the results of this example show that administration of the rAAV vector of the present invention increases the amounts of SPR and BH4 in the body of the mouse, favorably progressing the conversion of tyrosine to L-dopa, and finally increases the amount of dopamine. It is thought that it was because they were connected.

実施例３
マウスにおける総ビオプテリン量の変化
実施例２と同様にして、野生型マウス及びＳｐｒ ＫＯマウスに対して実施例１で調製されたｒＡＡＶベクター（2.2 x 10¹³ vg/ml, 5μl）又はコントロールであるＰＢＳ(15μl)を腹腔内投与した（いずれも単回投与）。投与してから４週間後、マウスの脳及び肝臓を採取し、中脳、線条体及び肝臓における総プテリジン量を測定した。プテリジン量の測定は、0.1 mM EDTA, 1 mM アスコルビン酸を含む0.2 M過塩素酸溶液でタンパク質成分を除いた組織抽出液を、HPLC-蛍光検出器で分離定量することにより行った。プテリジン類の分離にはInertsil ODS-3カラムを用い、励起波長375nm、蛍光波長465nmにて検出した。総プテリジン量は、生体内におけるＢＨ４の量を反映している。結果を図４に示す。ｒＡＡＶベクターの投与によって、Ｓｐｒ ＫＯマウスの肝臓における総ビオプテリン量が、野生型マウスの肝臓における総ビオプテリン量と同程度となった。Ｓｐｒ ＫＯマウスの脳における総ビオプテリン量も、ｒＡＡＶベクターの投与によって増加傾向が確認された。 Example 3
Change in total amount of biopterin in mouse In the same manner as in Example 2, rAAV vector (2.2 × 10 ¹³ vg / ml, 5 μl) prepared in Example 1 for wild type mouse and Spr KO mouse or PBS as a control. (15 μl) was administered intraperitoneally (all were single doses). Four weeks after the administration, the brain and liver of the mouse were collected, and the total amount of pteridine in the midbrain, striatum and liver was measured. The amount of pteridine was measured by separating and quantifying a tissue extract solution obtained by removing a protein component with a 0.2 M perchloric acid solution containing 0.1 mM EDTA and 1 mM ascorbic acid using an HPLC-fluorescence detector. An Inertsil ODS-3 column was used for separation of pteridines, and detection was performed at an excitation wavelength of 375 nm and a fluorescence wavelength of 465 nm. The total pteridine amount reflects the amount of BH4 in vivo. The results are shown in Fig. 4. Administration of the rAAV vector resulted in a total biopterin content in the liver of Spr KO mice that was comparable to that in wild-type mice. It was confirmed that the total amount of biopterin in the brain of Spr KO mice also tended to increase by administration of the rAAV vector.

実施例４
マウスにおけるモノアミン量の変化
実施例２と同様にして、野生型マウス及びＳｐｒ ＫＯマウスに対して実施例１で調製されたｒＡＡＶベクター（2.2 x 10¹³ vg/ml, 5μl）又はコントロールであるＰＢＳ(15μl)を腹腔内投与した（いずれも単回投与）。投与してから４週間後、マウスの脳を採取し、中脳及び線条体におけるドーパミンの量、並びに中脳におけるセロトニンの量を測定した。モノアミン量の測定は、0.1 mM EDTAを含む0.2 M 過塩素酸溶液を加えてタンパク質成分を除いた組織抽出液を、HPLC-電気化学検出器で分離定量することにより行った。モノアミン類の分離にはEICOMPAK SC-5ODSカラムを用い、750 mVの印加電圧にて測定した。結果を図５に示す。ｒＡＡＶベクターの投与によって、Ｓｐｒ ＫＯマウスの脳内ドーパミン量及びセロトニン量は顕著に増大した。 Example 4
Change in monoamine amount in mouse In the same manner as in Example 2, rAAV vector (2.2 x 10 ¹³ vg / ml, 5 µl) prepared in Example 1 for wild type mouse and Spr KO mouse or control PBS ( 15 μl) was administered intraperitoneally (all were single doses). Four weeks after the administration, the brains of the mice were collected, and the amount of dopamine in the midbrain and striatum and the amount of serotonin in the midbrain were measured. The amount of monoamine was measured by adding 0.2 M perchloric acid solution containing 0.1 mM EDTA to remove the protein component and separating and quantifying the tissue extract with an HPLC-electrochemical detector. An EICOMPAK SC-5ODS column was used for separation of monoamines, and measurement was performed at an applied voltage of 750 mV. Results are shown in FIG. Administration of the rAAV vector markedly increased the brain dopamine and serotonin levels in Spr KO mice.

実施例５
マウスにおけるフェニルアラニン代謝の変化
実施例２と同様にして、野生型マウス及びＳｐｒ ＫＯマウスに対して実施例１で調製されたｒＡＡＶベクター（2.2 x 10¹³ vg/ml, 5μl）又はコントロールであるＰＢＳ(15μl)を腹腔内投与した（いずれも単回投与）。投与してから４週間後、マウスの脳及び肝臓を採取し、線条体及び肝臓におけるＰｈｅ／Ｔｙｒ値（チロシンの量に対するフェニルアラニンの比率）を測定した。PheとTyrの定量は、過塩素酸でタンパク質成分を除いた組織抽出液を、HPLC-蛍光検出器で分析することにより行なった。PheとTyrの分離にはInertsil ODS-3カラムを用い、励起波長240 nm、蛍光波長287 nmにて検出した。結果を図６に示す。ｒＡＡＶベクターの投与によって、Ｓｐｒ ＫＯマウスのＰｈｅ／Ｔｙｒ値は顕著に減少した。本発明のｒＡＡＶベクターの投与によってマウス体内のＳＰＲ及びＢＨ４の量が増大し、フェニルアラニンからチロシンへの変換が良好に進行したためであると考えられる。 Example 5
Changes in Phenylalanine Metabolism in Mice In the same manner as in Example 2, rAAV vector (2.2 x 10 ¹³ vg / ml, 5 µl) prepared in Example 1 for wild type mice and Spr KO mice, or PBS (control) was used. 15 μl) was administered intraperitoneally (all were single doses). Four weeks after the administration, the brain and liver of the mouse were collected, and the Phe / Tyr value (ratio of phenylalanine to tyrosine amount) in the striatum and liver was measured. Phe and Tyr were quantified by analyzing a tissue extract from which protein components were removed with perchloric acid with an HPLC-fluorescence detector. An Inertsil ODS-3 column was used to separate Phe and Tyr, and detection was performed at an excitation wavelength of 240 nm and a fluorescence wavelength of 287 nm. Results are shown in FIG. Administration of the rAAV vector markedly reduced the Phe / Tyr level in Spr KO mice. It is considered that this is because the administration of the rAAV vector of the present invention increased the amounts of SPR and BH4 in the mouse body and promoted the conversion of phenylalanine to tyrosine favorably.

実施例６
マウスにおけるＳＰＲの量の変化
実施例２と同様にして、野生型マウス及びＳｐｒ ＫＯマウスに対して実施例１で調製されたｒＡＡＶベクター（2.2 x 10¹³ vg/ml, 5μl）又はコントロールであるＰＢＳ(15μl)を腹腔内投与した（いずれも単回投与）。投与してから４週間後、マウスの脳、肝臓及び副腎を採取し、肝臓及び副腎におけるＳＰＲの発現を、抗ＳＰＲ抗体（Ikemoto K. et al., Brain Res 954: 237-46 に記載の方法に従って調製）を使用するウェスタンブロッティングによって定量した。それぞれの組織から組織抽出液を作製しタンパク質量を測定して、一定量のタンパク質（１００μｇ）をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離した。タンパク質量は、Bradofordの試薬と組織抽出液の一部を混合し、595 nmの吸光度を測定することにより定量した。分離後にタンパク質をＰＶＤＦ膜に転写し、目的タンパク質をそれぞれの特異的抗体を用いて検出した。結果を図７に示す。ｒＡＡＶベクターの投与によってＳＰＲタンパク質の増加傾向が確認された。 Example 6
Changes in the amount of SPR in mice In the same manner as in Example 2, rAAV vector (2.2 x 10 ¹³ vg / ml, 5 µl) prepared in Example 1 for wild-type mice and Spr KO mice or PBS as a control. (15 μl) was administered intraperitoneally (all were single doses). Four weeks after the administration, the brain, liver and adrenal gland of the mouse were collected, and the expression of SPR in the liver and adrenal gland was determined by the method described in Ikemoto K. et al., Brain Res 954: 237-46. (Prepared according to) according to Western blotting. A tissue extract was prepared from each tissue, the amount of protein was measured, and a certain amount of protein (100 μg) was separated by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis. The amount of protein was quantified by mixing a reagent of Bradoford and a part of the tissue extract and measuring the absorbance at 595 nm. After the separation, the proteins were transferred to a PVDF membrane, and the target proteins were detected using each specific antibody. The results are shown in Fig. 7. The increase tendency of SPR protein was confirmed by the administration of rAAV vector.

参考例
ＢＨ４の腹腔内投与
４２日齢の野生型マウスおよびＳｐｒ−ＫＯマウスに対して、ＢＨ４−２ＨＣｌ（５０ｍｇ／ｋｇ，サントリー）を含むリン酸緩衝液に溶解し、１日２回、１１時間から１３時間の間隔をあけて腹腔内に７日間連続投与した。対照群にはＢＨ４を含まないＰＢＳをマウスの体重１グラム当たり0.01 mL(1匹あたり約0.1〜0.2 mL)投与した。マウスの体重変化を図８に示す。ＢＨ４の投与によってＳｐｒ−ＫＯマウスにおいて体重増加が認められたが、１週間後でも野生型の半分程度の体重までにしか回復しなかった。これは、ＡＡＶ−Ｓｐｒでは持続的にＢＨ４が増加し続けるのに対して、ＢＨ４投与ではＢＨ４が体内で速やかに分解排出されてしまうので、１日２回の投与でも十分な効果が得られないためであると考えられる。 Reference Example Intraperitoneal administration of BH4 42-day-old wild-type mice and Spr-KO mice were dissolved in a phosphate buffer containing BH4-2HCl (50 mg / kg, Suntory), and twice a day for 11 hours. Was continuously administered for 7 days intraperitoneally at an interval of 13 hours. To the control group, PBS containing no BH4 was administered in an amount of 0.01 mL per gram of mouse body weight (about 0.1 to 0.2 mL per mouse). The change in body weight of the mouse is shown in FIG. Weight increase was observed in Spr-KO mice by administration of BH4, but even after 1 week, the weight was recovered to about half that of the wild type. This is because BH4 continues to increase continuously in AAV-Spr, whereas BH4 is rapidly decomposed and excreted in the body by administration of BH4, and thus sufficient administration cannot be obtained even by administration twice a day. It is thought to be because of this.

本発明のベクター及び組成物を使用することによって、ＳＰＲ関連疾患を治療及び予防することができる。   By using the vector and composition of the present invention, SPR-related diseases can be treated and prevented.

配列番号１：ヒトＳＰＲのアミノ酸配列（ＮＰ＿００３１１５．１）
配列番号２：ヒトＳＰＲｃＤＮＡのヌクレオチド配列 （ＮＭ＿００３１２４．４）
配列番号３：マウスＳＰＲのアミノ酸配列（ＮＰ＿０３５５９７．２）
配列番号４：マウスＳＰＲのヌクレオチド配列
配列番号５：ラットＳＰＲのアミノ酸配列（ＮＰ＿０６２０５４．１）
配列番号６：ラットＳＰＲｃＤＮＡのヌクレオチド配列（ＮＭ＿０１９１８１．１）
配列番号７：野生型ＡＡＶ１カプシドタンパク質のアミノ酸配列
配列番号８：野生型ＡＡＶ２カプシドタンパク質のアミノ酸配列
配列番号９：野生型ＡＡＶ９カプシドタンパク質のアミノ酸配列
配列番号１０：実施例１で製造されたＡＡＶベクターゲノムプラスミドのヌクレオチド配列
配列番号１１：ＧＦＰ検出用プライマー１ヌクレオチド配列
配列番号１２：ＧＦＰ検出用プライマー２ヌクレオチド配列
配列番号１３：実施例１で製造されたｒＡＡＶベクターの５’−ＩＴＲ配列
配列番号１４：実施例１で製造されたｒＡＡＶベクターのＣＭＶプロモーター配列
配列番号１５：実施例１で製造されたｒＡＡＶベクターのｈＧＨイントロン配列
配列番号１６：実施例１で製造されたｒＡＡＶベクターのＳＶ４０ ｐｏｌｙＡ配列
配列番号１７：実施例１で製造されたｒＡＡＶベクターの３’−ＩＴＲ配列 SEQ ID NO: 1 amino acid sequence of human SPR (NP_003115.1)
SEQ ID NO: 2: Nucleotide sequence of human SPR cDNA (NM_003124.4)
SEQ ID NO: 3: Amino acid sequence of mouse SPR (NP — 0355977.2)
SEQ ID NO: 4: Nucleotide sequence of mouse SPR SEQ ID NO: 5: Amino acid sequence of rat SPR (NP — 062054.1)
SEQ ID NO: 6: Nucleotide sequence of rat SPR cDNA (NM_019181.1)
SEQ ID NO: 7: Amino acid sequence of wild type AAV1 capsid protein SEQ ID NO: 8: Amino acid sequence of wild type AAV2 capsid protein SEQ ID NO: 9: Amino acid sequence of wild type AAV9 capsid protein SEQ ID NO: 10: AAV vector genome produced in Example 1 Nucleotide sequence of plasmid SEQ ID NO: 11: GFP detection primer 1 nucleotide sequence SEQ ID NO: 12: GFP detection primer 2 nucleotide sequence SEQ ID NO: 13: 5′-ITR sequence of SEQ ID NO: 14 of the rAAV vector produced in Example 1 CMV promoter sequence of rAAV vector produced in Example 1 SEQ ID NO: 15: hGH intron sequence of rAAV vector produced in Example 1 SEQ ID NO: 16: SV40 polyA sequence of SEQ ID NO: 17 of rAAV vector produced in Example 1 3'-ITR sequence of the rAAV vector prepared in Example 1

Claims (11)

セピアプテリン還元酵素（ＳＰＲ）をコードするポリヌクレオチドを含む、組換えベクター。   A recombinant vector comprising a polynucleotide encoding sepiapterin reductase (SPR). 前記ポリヌクレオチドが、
配列番号１、３又は５のアミノ酸配列から成るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであるか、あるいは
配列番号１、３又は５のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列から成り、かつセピアプテリン還元活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、請求項１に記載の組換えベクター。 The polynucleotide is
A polynucleotide encoding a polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, 3 or 5, or consisting of an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, 3 or 5, and The recombinant vector according to claim 1, which comprises a polynucleotide encoding a polypeptide having sepiapterin reducing activity. 組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、請求項１又は２に記載の組換えベクター。   The recombinant vector according to claim 1 or 2, which is a recombinant adeno-associated virus (AAV) vector. 野生型ＡＡＶ１カプシドタンパク質（配列番号７）のアミノ酸配列中４４５位のチロシンがフェニルアラニンに置換されている変異アミノ酸配列を有するタンパク質、野生型のＡＡＶ２カプシドタンパク質（配列番号８）のアミノ酸配列中４４４位のチロシンがフェニルアラニンに置換されている変異アミノ酸配列を有するタンパク質、または野生型のＡＡＶ９カプシドタンパク質（配列番号９）のアミノ酸配列中４４６位のチロシンがフェニルアラニンに置換されている変異アミノ酸配列を有するタンパク質を含む、請求項３に記載の組換えベクター。   A protein having a mutant amino acid sequence in which tyrosine at position 445 in the amino acid sequence of wild-type AAV1 capsid protein (SEQ ID NO: 7) is substituted with phenylalanine, and at a position at position 444 in the amino acid sequence of wild-type AAV2 capsid protein (SEQ ID NO: 8) Includes a protein having a mutant amino acid sequence in which tyrosine is replaced by phenylalanine, or a protein having a mutant amino acid sequence in which tyrosine at position 446 in the amino acid sequence of wild-type AAV9 capsid protein (SEQ ID NO: 9) is replaced by phenylalanine The recombinant vector according to claim 3. 前記ポリヌクレオチドが、ＣＭＶプロモーター、ＣＡＧプロモーター、シナプシンＩプロモーター配列、ミエリン塩基性タンパク質プロモーター配列、ニューロン特異的エノラーゼプロモーター配列、カルシウム／カルモジュリンー依存性蛋白キナーゼＩＩ（ＣＭＫＩＩ）プロモーター配列、チュブリンαＩプロモーター配列、血小板由来成長因子β鎖プロモーター配列、グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモーター配列、Ｌ７プロモーター配列（小脳プルキンエ細胞特異的プロモーター）、グリア線維酸性タンパク質（ｈＧｆａ２）プロモーター配列、およびグルタミン酸受容体デルタ２プロモーター（小脳プルキンエ細胞特異的プロモーター）配列から成るグルタミン酸脱炭酸酵素（ＧＡＤ６５／ＧＡＤ６７）プロモーター配列からなる群より選択されるプロモーター配列を含む、請求項３又は４に記載の組換えベクター。   The polynucleotide is a CMV promoter, CAG promoter, synapsin I promoter sequence, myelin basic protein promoter sequence, neuron-specific enolase promoter sequence, calcium / calmodulin-dependent protein kinase II (CMKII) promoter sequence, tubulin αI promoter sequence, Platelet-derived growth factor β chain promoter sequence, glial fibrillary acidic protein (GFAP) promoter sequence, L7 promoter sequence (cerebellar Purkinje cell-specific promoter), glial fibrillary acidic protein (hGfa2) promoter sequence, and glutamate receptor delta2 promoter ( Glutamate decarboxylase (GAD65 / GAD67) promoter sequence comprising cerebellar Purkinje cell-specific promoter) sequence The recombinant vector according to claim 3 or 4, comprising a promoter sequence selected from the group consisting of: 前記ポリヌクレオチドが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ８、およびＡＡＶ９からなる群より選択されるインバーテッドターミナルリピート（ＩＴＲ）を含む、請求項３〜５のいずれか１項に記載の組換えベクター。   The recombinant vector according to any one of claims 3 to 5, wherein the polynucleotide comprises an inverted terminal repeat (ITR) selected from the group consisting of AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV8, and AAV9. .. 請求項１〜６のいずれか１項に記載の組換えベクターを含む、ＳＰＲ関連疾患の治療又は予防用組成物。   A composition for treating or preventing an SPR-related disease, which comprises the recombinant vector according to any one of claims 1 to 6. 前記ＳＰＲ関連疾患は、ＳＰＲ欠損症、高フェニルアラニン血症、ジストニア、パーキンソン病、摂食障害、アルツハイマー病、統合失調症、疼痛、性的不全、てんかん、排尿障害、心血管疾患、虚血性心疾患、脳血管障害、高血圧、糖尿病、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、糖尿病性神経障害、睡眠障害、気分障害（例えばうつ病性障害及び双極性障害）及び自律神経障害からなる群から選択される、請求項７に記載の組成物。   The SPR-related diseases include SPR deficiency, hyperphenylalanineemia, dystonia, Parkinson's disease, eating disorders, Alzheimer's disease, schizophrenia, pain, sexual dysfunction, epilepsy, dysuria, cardiovascular disease, ischemic heart disease. , Cerebrovascular disorders, hypertension, diabetes, diabetic nephropathy, diabetic retinopathy, diabetic neuropathy, sleep disorders, mood disorders (eg depressive disorders and bipolar disorders) and autonomic neuropathy. The composition of claim 7, wherein 皮内投与、皮下投与、筋肉内投与、腹腔内投与、静脈内投与、脳室内投与、髄腔内投与、径鼻投与又は吸入投与される、請求項７又は８に記載の組成物。   The composition according to claim 7 or 8, which is administered intradermally, subcutaneously, intramuscularly, intraperitoneally, intravenously, intraventricularly, intrathecally, intranasally or by inhaling. 他の医薬と組み合わせて投与される、請求項７〜９のいずれか１項に記載の組成物。   The composition according to any one of claims 7 to 9, which is administered in combination with another drug. 前記他の医薬が、Ｌ−ドーパ、５−ヒドロキシトリプトファン、セピアプテリン、向精神薬又は糖尿病治療薬である、請求項１０に記載の組成物。   The composition according to claim 10, wherein the other drug is L-dopa, 5-hydroxytryptophan, sepiapterin, a psychotropic drug or an antidiabetic drug.