JP2020048565A - 糖尿病を治療するためのトランスジェニックブタ膵島およびその使用 - Google Patents
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Abstract
【課題】膵内分泌部またはβ細胞の機能不全に関連する疾患、障害、または病態を治療するための、トランスジェニックブタβ細胞、トランスジェニックブタ膵島を提供する。【解決手段】本発明は、PKC経路およびPKA経路が構成的に活性化されている単離されたトランスジェニックブタβ細胞;上記トランスジェニックブタβ細胞を含むトランスジェニックブタ膵島;および上記トランスジェニックブタβ細胞または上記トランスジェニックブタ膵島を含むトランスジェニックブタに関する。本発明の別の目的は、本発明のトランスジェニックブタβ細胞またはトランスジェニックブタ膵島を含むデバイス、または上記デバイスの使用にも関する。【選択図】なし
Description
本発明は、糖尿病の治療分野に関する。具体的に本発明は、PKA経路およびPKC経路がトランスジェニック技術により改変されて、好ましくは構成的に活性化されているブタ由来のランゲルハンス島の移植による、糖尿病の治療に関する。
I型糖尿病は、インスリン依存性糖尿病(IDDM)または若年性糖尿病とも呼ばれている慢性疾患である。主な症状は通常よりも高い血糖であり、インスリンを産生するランゲルハンス島のβ細胞の不全からもたらされる。大多数の患者では、β細胞はT細胞媒介型の自己免疫発作により破壊されている。
通常の治療は、膵臓による産生の不足を補うために、毎日インスリンを注射することにある。しかしながらインスリンを用いた治療は、救命するものではあるが、多くの場合、寿命を縮める疾患の合併症を予防するほど十分な血糖コントロールを提供するものではない。よって現在、他の治療が開発されている。その一部として、インスリンの正常な産生を回復するための膵臓またはランゲルハンス島の移植に基づく治療がある。同種移植(ヒトへのヒト由来の臓器の移植)は、ヒトの膵島組織の不足により、および各レシピエントに数個の膵臓(pancrease)が必要であることから、限定されている。よって、インスリン産生細胞の代替的な供給源が必要とされている。
ブタ膵島は、高まる倫理的な問題を伴うことなく大量に得ることができることから、ヒトの膵島移植に対する有望な代替物である。ブタβ細胞により産生されるインスリンは、ヒトのインスリンとはアミノ酸1個が異なるに過ぎず、糖尿病のヒトを治療するために長い間使用されてきた。さらに、ブタ細胞の遺伝的な改変が技術的に可能であり、たとえば、必要とされる膵島の数および血栓症のリスクの両方を最小限にすることにより、不一致の膵島異種移植に関連するいくつかの問題を解決するはずである(Dufrane & Gianello, Transplantation, 2008, 86(6), 753 :60)。さらに、異種移植モデルにおける免疫抑制は、マイクロ/マクロカプセル化方法により、克服することができる(Dufrane et al., 2010, Transplantation, 90(10): 1054−1062;国際特許公開公報第2007/144389号および国際特許公開公報第2010/032242号)。
ブタ対非ヒト霊長類に関するいくつかの前臨床試験が、過去十年のあいだに公開されており、レシピエントのインスリン産生に関して有望な結果を示している。(一覧に関しては、Dufrane & Gianello, Transplantation, 2008, 86(6), 753:60参照)。特に、たとえばLiving Cell Technologiesにより開発されたアルギン酸塩カプセル化ブタ膵島を含む製品DIABECELL(登録商標)を使用する臨床試験などが、ヒトの糖尿病患者で現在進行中である。
しかしながら、ブタ膵島は、グルコースの刺激に対する応答が比較的弱い。グルコース濃度を静止レベル(1〜2mM)から刺激レベル(8〜15mM)まで上昇させることにより単離ブタ膵島を刺激しても、インスリン分泌の増加は、1.5〜3倍である(Crowther et al. 1989, Horm. Metabol. Res, 21 : 590−595; Bertuzzi et al. 1995, FEBES Letters 379 : 21−25; Dufrane et al. 2007, Diabetes & Metabolism 33: 430−438; Mueller et al. 2013, Xenotransplantation, 20 : 75−81)。対して、ヒト、霊長類、または齧歯類の膵島を、グルコース濃度の同様の増加によりチャレンジすると、インスリンの分泌は12〜16倍上昇する(Dufrane et al. 2007; Mueller et al. 2013)。ブタ膵島のこの特性により、場合により、非ヒト霊長類およびおそらくはヒトなどのより多くのインスリンを要求する生物に移植する場合、糖尿病の治療としてその有用性に関して懸念が生じる。特に、ヒト膵島と比較してブタ膵島の血中グルコースに対する応答が低いことは、それによってヒトのグルコースレベルを適切に補正するために多くのブタ膵島を移植する必要性が生じ、現在1人の患者を移植するために数匹のブタが使用されることから、欠点のある治療でもある。
よって、ブタ膵島の異種移植を介して糖尿病患者を治療する改善された方法が必要とされている。
ヒトのβ細胞では、血中グルコースレベルに応答したインスリンの合成および分泌は、2つの経路:(i)PKC経路および(ii)PKA経路を含み得る。本明細書中、本出願人は、意外にもこの両方の経路の構成的活性化がインスリン分泌の相乗的増加をもたらすことを示した。この結果は、マウスのインスリン分泌に及ぼすPKCおよびPKAの効果が相加的ですらなかったことが従来技術ですでに示されていたため、特に予測外であった(Yang & Gillis, J. Gen. Physiol., 2004, 124:641−651; Wan et al, J; Gen. Physiol., 2004, 124:653−663)。
よって本発明は、PKC経路及びPKA経路が構成的に活性化されている、トランスジェニックブタβ細胞、トランスジェニックブタ膵島、およびトランスジェニックブタ、ならびにその必要のある対象の糖尿病を治療するためのそれらの使用に関する。
よって本発明は、PKC経路およびPKA経路が構成的に活性化されている単離されたトランスジェニックブタβ細胞に関する。
一実施形態では、この細胞は、構成的に活性なアセチルコリン受容体、好ましくはムスカリン受容体、より好ましくはIII型ムスカリン受容体を含む。一実施形態では、構成的に活性なIII型ムスカリン受容体は、配列番号4のアミノ酸配列、または配列番号4と少なくとも70%の配列同一性を有する配列を有する。
一実施形態では、細胞はGLP−1を発現する。一実施形態では、GLP1は、配列番号6のアミノ酸配列、または配列番号6と少なくとも70%の配列同一性を有する配列を有する。
また本発明は、本発明のブタβ細胞を含む単離トランスジェニックブタ膵島に関する。
本発明の別の目的は、本発明のトランスジェニックブタβ細胞または本発明の単離トランスジェニックブタ膵島を得るためのex vivoでの方法であって、上記方法が、構成的に活性のIII型ムスカリン受容体をコードする核酸配列を含む発現ベクターおよびGLP−1をコードする核酸配列を含む発現ベクターを使用する、方法に関する。
本発明の別の目的は、本発明の単離トランスジェニックブタβ細胞または本発明の単離トランスジェニックブタ膵島を得るためのex vivoでの方法により得た、単離トランスジェニックブタβ細胞または単離トランスジェニックブタ膵島である。
また本発明は、本発明の単離トランスジェニックブタβ細胞または単離トランスジェニックブタ膵島を含む、トランスジェニックブタに関する。
また本発明は、本発明の単離トランスジェニックブタβ細胞または単離トランスジェニックブタ膵島を含むデバイスに関する。一実施形態では、上記単離トランスジェニックブタβ細胞または上記単離トランスジェニックブタ膵島は、アルギン酸塩組成物でカプセル化されている。
本発明の別の目的は、膵内分泌部またはβ細胞の機能不全に関連する疾患、障害、または病態を治療するための、単離トランスジェニックブタβ細胞、または単離トランスジェニックブタ膵島、またはデバイスである。一実施形態では、膵内分泌部またはβ細胞の機能不全に関連する疾患、障害、または病態は、I型糖尿病、II型糖尿病、妊娠糖尿病、潜在性自己免疫性糖尿病、1.5型糖尿病、脂肪萎縮性糖尿病、若年発症成人型糖尿病、新生児糖尿病(たとえば持続性新生児糖尿病または一過性新生児糖尿病)、前糖尿病、ステロイド誘導型糖尿病、膵癌、特に、たとえば内分泌性膵腫瘍および膵性神経内分泌癌などの膵内分泌部癌を含む群から選択される。
本発明の別の目的は、その必要がある対象の血中グルコースレベルを調節するための、本発明の単離トランスジェニックブタβ細胞、または単離トランスジェニックブタ膵島、またはデバイスである。
本発明の別の目的は、その必要がある対象の正常なインスリン分泌レベルを回復させるための、本発明の単離トランスジェニックブタβ細胞、または単離トランスジェニックブタ膵島、またはデバイスである。
定義
本発明では、以下の用語は以下の意味を有する。
本発明では、以下の用語は以下の意味を有する。
「単離された」は、天然の環境から分離されており、天然に共に存在する他の細胞を少なくとも約75%含まず、80%含まず、85%含まず、好ましくは約90%、95%、96%、97%、98%、99%含まないが、それに基づいて細胞が単離される細胞表面マーカーを欠如する臓器、組織、または細胞を意味する。この用語は、たとえばドナーの動物からの除去、および解離によってその隣接する細胞との、または直接的に接触している臓器、組織、または細胞の関係の変化などの、天然の環境からの全体的な物理的分離を含む。細胞集団の単離方法は、当該分野で良く知られており、限定するものではないが、フローサイトメトリー、磁性的な選択、アフィニティクロマトグラフィー、パニング、またはそれらの組み合わせによるセルソーティングが挙げられる。
「相乗作用」は、単独で作用する各薬剤の効果の合計よりも大きな効果をもたらす、共に正の作用を示す2つ以上の薬剤の相互作用を定義する。
ある数字の前の「約」は、上記数字の±10%の値を意味する。
「治療する」は、標的となる病態または障害を予防または遅延(減弱)することが目的である治療的治療を意味する。治療を必要とするヒトは、障害をすでに有しているヒトを含む。本発明のトランスジェニックブタ膵島またはブタβ細胞の治療量を投与した後、対象が、以下:インスリン分泌の改善;および/または特定の疾患もしくは病態に関連する1つまたは複数の症状のある程度までの軽減;罹患率および死亡率の低下、血糖コントロールの改善、クオリティオブライフの問題の改善、のうちの1つまたは複数の観察可能および/または測定可能な減少または非存在を示す場合、対象の疾患、障害、または病態がうまく「治療されている」。疾患の治療の成功および改善を評価する上記のパラメータは、医師に知られている定例的な手法により容易に測定可能である。
「治療上有効量」は、標的に対して重篤な負の作用または有害な副作用を引き起こすことなく、(1)膵内分泌部もしくはβ細胞の機能の欠損もしくは非存在に関連する疾患、障害、もしくは病態の1つもしくは複数の症状の進行、増悪、もしくは悪化を遅延もしくは停止させること、(2)膵内分泌部もしくはβ細胞の機能の欠損もしくは非存在に関連する疾患、障害、もしくは病態の症状の改善をもたらすこと、(3)膵内分泌部もしくはβ細胞の機能の欠損もしくは非存在に関連する疾患、障害、もしくは病態の重症度もしくは発生を減少させること、または(4)膵内分泌部もしくはβ細胞の機能の欠損もしくは非存在に関連する疾患、障害、もしくは病態を治癒することを目的とする、トランスジェニックブタ膵島またはβ細胞のレベルまたは量を意味する。本発明によると、治療上有効量は、通常、治療作用のため、膵内分泌部またはβ細胞の機能の欠損または非存在に関連する疾患、障害、または病態の開始後に投与される。
「埋め込む」または「移植する」(互換可能に使用される)は、臓器、組織、細胞、または組成物の所望の部位での局在化をもたらす方法または経路により、対象、たとえば異種の対象に、臓器、組織、細胞、または組成物を留置することを指す。本明細書中で使用されるように、異種の対象は、別の種の細胞が導入される、または導入される予定のレシピエントを指す。特に、本発明の文脈では、異種の対象は、ブタの細胞が導入される、または導入される予定の霊長類、好ましくはヒトを指し得る。
「膵内分泌部またはβ細胞の機能の欠損または非存在に関連する疾患、障害、または病態」は、異常な膵内分泌部またはβ細胞の機能が存在する障害を含む。このような異常な膵内分泌部の機能は、正常な膵内分泌部の機能の機能不全もしくは非存在、または異常な膵内分泌部の機能の存在を含み得る。膵内分泌部またはβ細胞の機能の機能不全または非存在に関連する疾患、障害、または病態の例として、限定するものではないが、I型糖尿病、II型糖尿病、妊娠糖尿病、潜在性自己免疫性糖尿病、1.5型糖尿病、脂肪萎縮性糖尿病、若年発症成人型糖尿病、新生児糖尿病(たとえば持続性新生児糖尿病または一過性新生児糖尿病)、前糖尿病、ステロイド誘導型糖尿病、膵癌、好ましくは膵内分泌部癌、たとえば内分泌性膵腫瘍および膵性神経内分泌癌が挙げられる。
「血中グルコースレベルを調節すること」は、同様の年齢および体重の正常な非糖尿病個体のパラメータ内に、血中グルコースレベルを維持することである。一実施形態では、血中グルコースレベルを調節することは、正常な空腹時血中グルコースレベルを回復させることを意味する。一実施形態では、正常な空腹時血中グルコースレベルは、110mg/dL(6.1mmol/L)未満、好ましくは100mg/dL(5.6mmol/L)未満である。
「アルギン酸塩」:アルギン酸の塩。アルギン酸は、海藻から単離されており、2つのウロン酸:D−マンヌロン酸およびL−グルロン酸から作製されたポリウロン酸である。アルギン酸は、実質的に水に不溶性である。アルギン酸は、ナトリウム、カリウム、およびリチウムなどのアルカリ金属;マグネシウム;アンモニウム;ならびにメチルアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、およびトリエタノールアミンなどの低級アミン由来の置換アンモニウムカチオンと共に、水溶性の塩を形成する。この塩は、pH4を超える水性媒体に可溶であるが、pHが約4より下に低下すると、アルギン酸に変換される。熱に不可逆性の水に不溶性のアルギン酸塩のゲルが、たとえば適切な濃度のカルシウム、バリウム、ストロンチウム、亜鉛、銅(+2)、アルミニウム、およびその混合物といったゲル形成イオンの存在下で形成される。アルギン酸塩のゲルは、たとえばEDTA、クエン酸塩などの、ゲル形成イオン用の可溶性のカチオンまたはキレート剤の溶液に浸すことにより、可溶化することができる。
よって本発明は、ブタβ細胞、好ましくは単離ブタβ細胞であって、PKC経路およびPKA経路が構成的に活性化されることにより、上記細胞によるインスリン分泌の増加を誘導する、ブタβ細胞、好ましくは単離ブタβ細胞に関する。本発明によると、PKC経路およびPKA経路の構成的な活性化は、本発明のブタβ細胞のトランスジェニック技術を用いた改変からもたらされる。
膵臓の膵島は、副交感神経、交感神経、および感覚神経により神経支配されている。よって、インスリンの分泌は、副交感神経系により刺激され、交感神経系により阻害される。アセチルコリン(ACh)は、PKC経路を介してのβ細胞の副交感神経の制御に関与する主な神経伝達物質である。頭相、すなわち血中グルコースレベルの何等かの増加の前の感覚刺激に応答したインスリンの分泌は、食事のあいだじゅう持続する副交感神経の刺激に依存する。AChは、β細胞の細胞膜に存在するM3ムスカリン受容体に結合し得る。これらの受容体は、活性化されると、たとえばホスファチジルイノシトール−4,5−ビスホスファート(PIP2)などの膜のホスホイノシチドを加水分解するホスホリパーゼ(phosholipase)C(PLC)に、(Gqを介して)結合する。他の細胞と同じく膵島では、この加水分解は、2つの主な産物:イノシトール−1,4,5−トリホスファート(IP3)、およびジアシルグリセロール(DAG)の形成をもたらす。DAGは、PKC経路を活性化することにより、インスリンの合成および分泌を高めることができる。並行して、IP3は、小胞体上のIP3感受性Ca2+チャネルに結合することにより、細胞質の中のCa2+の排出を誘導し、これによってインスリンの合成および分泌を増強する。本発明によると、「PKC経路」は、M3ムスカリン受容体および下流のエレメント(Gqタンパク質、PLC、DAG、PKC…)を含む。
グルカゴン様ペプチド‐1(GLP−1)は、回腸および結腸の粘膜からL細胞により分泌され、グルコース依存性インスリン分泌性ポリペプチド(GIP)は、十二指腸空腸の粘膜からK細胞により分泌される。これら2つのホルモンは、それぞれのGタンパク質共役型受容体(GPCR)に結合し、食事の最中に起こり、所定のグルコース負荷を静脈内注射ではなくて経口投与する場合にインスリン分泌がより大きく刺激されることにより実験的に例証されている、インクレチン効果の原因である。これら2つのホルモンの作用は、主に、タンパク質キナーゼAおよびEpac2を介して作用するcAMPにより、すなわちPKA経路により媒介されている。グルコーストランスポーター2(Glut2)、K−ATPチャネルのKir6.2サブユニットおよびSUR1サブユニットは、分泌プロセスに関連するタンパク質と同様に、PKAによりリン酸化されている。低分子GTPアーゼであるRap1は、特にグルコース誘導型インスリン分泌の第1相の間、容易に放出可能なインスリンの顆粒の数を増加させることにより、Epac2依存的経路のエフェクターであり得る。本発明によると、「PKA経路」は、GLP−1、GPCR、および下流のエレメント(アデニリルシクラーゼ、cAMP、PKA...)を含む。
一実施形態では、PKC経路の構成的な活性化は、M3ムスカリン受容体の構成的な活性化によるものである。よって、PKC経路の構成的な活性化は、細胞からのイノシトール三リン酸(IP3)の流出を測定することにより、検証され得る。実際に、ホスホリパーゼCの活性化によってPKCの活性化が起こり、膜ホスホイノシチドをIP3およびジアシルグルセロール(DAG)に分解する。一実施形態では、PKC経路の構成的な活性化は、試験Aにより検証でき、ここで試験Aは、細胞にmyo−[2−3H]イノシトールを2時間負荷することによりイノシトールプールを標識する第1のステップと、流出液の3Hを測定し、細胞中の残りのシグナルを定量することにより、PKC経路の活性化の検証を可能にする第2のステップとを含む(Garcia et al, 1988, Biochem J., 254, 211−218)。
一実施形態では、PKC経路の構成的な活性化は、試験Aの条件で測定した総IP3の、対照と比較して少なくとも5倍、好ましくは10倍、15倍、20倍、25倍、または30倍以上の増加を誘導する。ここで対照は、好ましくはPKC経路が構成的に活性化されていない細胞に対応する。
別の実施形態では、PKC経路の構成的な活性化は、タンパク質のリン酸化型の量を測定することによるPKCの構成的な活性化を評価することにより検証できる(リン酸化PKCは酵素の活性型である)。これは、たとえば、本発明のトランスジェニックブタβ細胞由来のタンパク質抽出物のウェスタンブロットにより達成できる。リン酸化PKCを特異的に認識する抗体を使用して、トランスジェニックβ細胞における総PKCを野生型のブタβ細胞と比較して、活性化PKCの量を決定することができる。このような抗体の例として、限定するものではないが、ab59411、ab75837、ab76016およびab32502(Abcam)が挙げられる。一実施形態では、リン酸化PKC/非リン酸化PKC(すなわち活性PKC/不活性PKC)の比率を測定してもよい。一実施形態では、PKCの構成的な活性化は、野生型細胞で測定した比率と比較して、この比率の2倍の増加、好ましくは3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍またはそれ以上の増加をもたらす。
一実施形態では、アデニリルシクラーゼの活性化によって、ATPの分解からcAMPが形成されることから、PKA経路の構成的な活性化を、試験Bにより検証することができる。ここで試験Bは、市販のアッセイキットを使用してβ細胞における総cAMPの濃度を測定することにより、その膜受容体に対するGLP−1の結合によってアデニリルシクラーゼの活性化を検出する(Ramos et al, 2008, J Gen Physiol, 132(3): 329−338)。
一実施形態では、PKA経路の構成的な活性化は、試験Bの条件で測定した総cAMPの、対照と比較して少なくとも20倍、25倍、30倍、または35倍、またはそれ以上の増加に対応し、ここでの対照は、好ましくは、PKAが構成的に活性化されていない細胞に対応する。
別の実施形態では、PKA経路の構成的な活性化は、タンパク質のリン酸化型(リン酸化PKAは酵素の活性型である)を測定することによりPKAの構成的活性化を評価することにより、検証され得る。これは、たとえば、本発明のトランスジェニックブタβ細胞由来のタンパク質抽出物のウェスタンブロットにより得ることができる。リン酸化PKAを特異的に認識する抗体を使用して、野生型のブタβ細胞と比較して、トランスジェニックβ細胞における、総PKAに対する活性化PKAの量を決定することができる。このような抗体の例として、限定するものではないが、ab5815、ab118531およびab39218(Abcam)が挙げられる。一実施形態では、リン酸化PKA/非リン酸化PKA(すなわち活性PKA/不活性PKA)の比率を測定してもよい。一実施形態では、PKAの構成的な活性化は、野生型の細胞で測定した比率と比較して、この比率の2倍の増加、好ましくは、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、またはそれ以上の増加をもたらす。
本発明の一実施形態では、トランスジェニックブタβ細胞は、試験Cの条件で、天然のブタβ細胞よりも、少なくとも約2倍、2.5倍、2.6倍、2.7倍、2.8倍、2.9倍、3倍、3.1倍、3.2倍、3.3倍、3.4倍、3.5倍、3.6倍、3.7倍、3.8倍、3.9倍、4倍、4.1倍、4.2倍、4.3倍、4.4倍、4.5倍、4.6倍、4.7倍、4.8倍、4.9倍、5倍、5.1倍、5.2倍、5.3倍、5.4倍、5.5倍、5.6倍、5.7倍、5.8倍、5.9倍、6倍、6.1倍、6.2倍、6.3倍、6.4倍、6.5倍、6.6倍、6.7倍、6.8倍、6.9倍、7倍、7.1倍、7.2倍、7.3倍、7.4倍、7.5倍、7.6倍、7.7倍、7.8倍、7.9倍、8倍、8.1倍、8.2倍、8.3倍、8.4倍、8.5倍、8.6倍、8.7倍、8.8倍、8.9倍、9倍、9.1倍、9.2倍、9.3倍、9.4倍、9.5倍、9.6倍、9.7倍、9.8倍、9.9倍、10倍以上、好ましくは少なくとも15倍以上、より好ましくは少なくとも20倍以上、およびさらにより好ましくは少なくとも25倍以上多くのインスリンを分泌することができる。
インスリンの分泌レベルを決定する試験Cの方法は、たとえば以下:
1)10%の熱不活化FCS、100IU/mlのペニシリン、100μg/mlのストレプトマイシン、5mmol/lのグルコースを含むRMPI培地中、37℃、5%のCO2/95%のO2で、トランスジェニックブタのβ細胞を一晩培養することと
2)クレブス・リンゲルバッファー1ml中で、上記トランスジェニックブタβ細胞を1mmol/lまたは15mmol/lのグルコースと共に2時間インキュベートすることと、
3)ラジオイムノアッセイによる、回収した培地およびインキュベートしたトランスジェニックブタのβ細胞におけるインスリンの定量
であり得る。
1)10%の熱不活化FCS、100IU/mlのペニシリン、100μg/mlのストレプトマイシン、5mmol/lのグルコースを含むRMPI培地中、37℃、5%のCO2/95%のO2で、トランスジェニックブタのβ細胞を一晩培養することと
2)クレブス・リンゲルバッファー1ml中で、上記トランスジェニックブタβ細胞を1mmol/lまたは15mmol/lのグルコースと共に2時間インキュベートすることと、
3)ラジオイムノアッセイによる、回収した培地およびインキュベートしたトランスジェニックブタのβ細胞におけるインスリンの定量
であり得る。
一実施形態では、PKC経路の構成的活性化は、アセチルコリン受容体、好ましくはムスカリン受容体、より好ましくはIII型ムスカリン受容体の構成的活性化からもたらされる。一実施形態では、トランスジェニックブタβ細胞は、β細胞膜にある構成的に活性化されたIII型ムスカリン受容体を含む。
トランスジェニックブタのβ細胞膜にある構成的に活性化されたIII型ムスカリン受容体の発現は、当業者に知られているin vitroでの方法により、検証され得る。このような方法の例として、限定するものではないが、III型ムスカリン受容体に対する抗体、または構成的に活性化されたIII型ムスカリン受容体の配列に結合したタグに対する抗体のいずれかを使用するウェスタンブロットが挙げられる(タグのリストは以下を参照されたい)。
一実施形態では、トランスジェニックブタのβ細胞のゲノムへの構成的に活性化されたIII型ムスカリン受容体の配列の組み込みは、当業者に知られたin vitroでの方法により検証され得る。このような方法の例として、限定するものではないが、例えば以下のプライマー対:フォワードプライマー:5’CCCAATTGATGTACCCATAC 3’(SEQ ID NO:17)−リバースプライマー:5’ GTGATCTGACTTCTGGTCTC 3’(SEQ ID NO:18)を使用したRT−PCRが挙げられる。
ブタ(イノシシ(Sus scrofa))由来のIII型ムスカリン受容体は、アクセッション番号NP_001116570.1(タンパク質配列、SEQ ID NO:1)およびNM_001123098.1(cDNA配列、SEQ ID NO:2)に対応するアセチルコリン受容体である。III型ムスカリン受容体の活性化は、細胞膜のリン脂質を加水分解するホスホリパーゼCの活性化を誘導し、それによってジアシルグリセロール(DAG)および/またはイノシトール三リン酸(IP3)の産生をもたらし得る。DAGは、PKC経路を活性化して、インスリンの合成および分泌を増強し得る。並行して、IP3は、小胞体上のIP3感受性Ca2+チャネルに結合することにより、細胞質内のCa2+の排出を誘導する。この両方が、インスリンの合成および分泌を増強する。
一実施形態では、構成的に活性化されたIII型ムスカリン受容体は、配列番号1であって、点突然変異(Gln490→Leu、490位は、第1のMetアミノ酸(開始コドンに対応する)を有しない配列に位置し、よって配列番号1の491位に関連する)が、構成的活性化を引き起こし、発現を増加させる領域が増加欠失している、配列番号1を有する。一実施形態では、上記欠失は、配列番号1のアミノ酸275〜4701位を含む。
一実施形態では、構成的に活性化されたIII型ムスカリン受容体は、配列番号3の核酸配列により、または配列番号3と少なくとも70%、好ましくは75%、80%、85%、90%、95%、もしくはそれ以上の配列同一性を有する核酸配列により、コードされている。一実施形態では、構成的に活性化されたIII型ムスカリン受容体は、配列番号4のアミノ酸、または配列番号4と少なくとも70%、好ましくは75%、80%、85%、90%、95%、もしくはそれ以上の配列同一性を有する配列を有する。
一実施形態では、構成的に活性化されたIII型ムスカリン受容体は、たとえばHAタグ(たとえば配列番号13を有する、配列番号12のヌクレオチド配列によりコードされている)などのタグを含む。好ましくはHA−タグ化された、構成的に活性化されたIII型ムスカリン受容体は、配列番号21の配列を有する。
用語「同一性」または「同一の」は、2つ以上の核酸配列間または2つ以上のポリペプチド配列間の関係で使用する場合、2つ以上の核酸またはアミノ酸の残基の鎖の間のマッチ数により決定される、核酸配列間またはポリペプチド間の配列の関係性の度合いを指す。「同一性」は、特定の数学モデルまたはコンピュータプログラム(すなわち「アルゴリズム」)により提示されるギャップアライメント(任意)を用いて、2つ以上の配列の小さいほうの間の同一のマッチのパーセントを測定する。関連する核酸配列またはポリペプチドの同一性は、既知の方法により容易に計算することができる。このような方法として、限定するものではないが、Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M. Stockton Press, New York, 1991; and Carillo et al., SIAM J. Applied Math. 48, 1073 (1988)に記載される方法が挙げられる。同一性を決定する好ましい方法は、試験される配列間で最大のマッチを提供するように設計されている。同一性を決定する方法は、公開されているコンピュータプログラムに記載されている。2つの配列間の同一性を決定する好ましいコンピュータプログラム方法として、GAP(Devereux et al., Nucl. Acid. Res. \2, 387 (1984); Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, Wis.)、BLASTP、BLASTN、およびFASTA(Altschul et al., J. MoI. Biol. 215, 403−410 (1990))を含む、GCGプログラムパッケージが挙げられる。BLASTXプログラムは、国立生物工学情報センター(NCBI)および他のソース(BLAST Manual, Altschul et al. NCB/NLM/NIH Bethesda, Md. 20894; Altschul et al., supra)から、公開されている。また、既知のSmith Watermanアルゴリズムを、同一性を決定するために用いられ得る。
一実施形態では、PKA経路の構成的活性化は、本発明のブタβ細胞によるGLP−1の発現からもたらされる。一実施形態では、トランスジェニックブタβ細胞は、そのゲノムに組み込まれたGLP−1配列を含む。
トランスジェニックブタβ細胞のゲノムにおけるGLP−1配列の組み込みは、当業者に知られたin vitroでの方法により検証することができる。このような方法の例として、限定するものではないが、たとえば以下のプライマー対:フォワードプライマー:5’ CCCGCCCAATTGATGGAGAC 3’(SEQ ID NO: 15)−リバースプライマー:5’ TCCTCGGCCTTTCACCAGCC 3’(SEQ ID NO:16)を使用するRT−PCRが挙げられる。
一実施形態では、GLP−1は、配列番号5の核酸配列、または配列番号5と少なくとも70%、好ましくは75%、80%、85%、90%、95%もしくはそれ以上の配列同一性を有する核酸配列により、コードされている。一実施形態では、GLP−1は、配列番号6のアミノ酸配列、または配列番号6と少なくとも70%、好ましくは75%、80%、85%、90%、95%、もしくはそれ以上の配列同一性を有する配列を有する。
一実施形態では、GLP−1配列は、GLP−1の半減期を向上するように変異されている。一実施形態では、上記GLP−1の半減期を向上するための変異は、セリン残基による、配列番号6の2位のアラニン残基の置換に対応する(A8S変異)。
一実施形態では、GLP−1は、A8S変異を含み、かつ配列番号19の核酸配列、または配列番号19と少なくとも70%、好ましくは75%、80%、85%、90%、95%、もしくはそれ以上の配列同一性を有する核酸配列により、コードされている。一実施形態では、GLP−1は、A8S変異を含み、かつ、配列番号20のアミノ酸配列、または配列番号20と少なくとも70%、好ましくは75%、80%、85%、90%、95%、もしくはそれ以上の配列同一性を有する配列を有する。
一実施形態では、GLP1配列は、分泌を可能にする追加的な配列をさらに含む。一実施形態では、上記追加的な配列は、IgK鎖シグナル(配列番号7の核酸配列および配列番号8のアミノ酸配列)に対応する。一実施形態では、配列番号7の核酸配列は、GLP−1をコードする核酸配列内に1番目のATGの後に挿入されている。
一実施形態では、GLP1配列は、A8S変異およびIgK−鎖シグナルの両方を含む。この実施形態によると、GLP−1のアミノ酸配列は、配列番号9によりコードされる配列番号10であり得る。
一実施形態では、GLP−1配列は、IgK鎖シグナルと、GLP−1ペプチドの1番目のヒスチジンをコードするCATとの間に挿入されたフューリン切断部位を含む。このフューリン部位の存在により、合成されたペプチドがゴルジ体でプロセシングを受けて切断され、確実にGLP1−1の生理活性型が産生される。このフューリン切断部位のDNA配列は、CGG GGC AGG CGGであり、配列番号9に含まれている。このフューリン切断部位のペプチド配列は、Arg Gly Arg Argであり、配列番号10に含まれている。
よって、本発明は、トランスジェニックブタβ細胞、好ましくは単離トランスジェニックブタβ細胞であって、
変異したアセチルコリン受容体の配列、好ましくは変異したムスカリン受容体の配列、より好ましくは変異したIII型ムスカリン受容体の配列、およびさらにより好ましくは配列番号4の配列であって、上記変異した受容体が構成的に活性化されている、配列と、
ヒトGLP−1をコードする、好ましくは配列番号10の配列を有する、配列と
を含む、
トランスジェニックブタβ細胞、好ましくは単離トランスジェニックブタβ細胞に関する。
変異したアセチルコリン受容体の配列、好ましくは変異したムスカリン受容体の配列、より好ましくは変異したIII型ムスカリン受容体の配列、およびさらにより好ましくは配列番号4の配列であって、上記変異した受容体が構成的に活性化されている、配列と、
ヒトGLP−1をコードする、好ましくは配列番号10の配列を有する、配列と
を含む、
トランスジェニックブタβ細胞、好ましくは単離トランスジェニックブタβ細胞に関する。
一実施形態では、両方の配列(変異したアセチルコリン受容体の配列およびヒトGLP−1をコードする配列)は、同じベクター(すなわちバイシストロン性ベクター)上にある。
また、本発明は、上述の少なくとも1つのトランスジェニックβ細胞を含む、トランスジェニックブタ膵島、好ましくは単離トランスジェニックブタ膵島に関する。
本発明の一実施形態では、トランスジェニックブタ膵島は、試験Dの条件で、天然のブタの膵島よりも、少なくとも約2倍、2.5倍、2.6倍、2.7倍、2.8倍、2.9倍、3倍、3.1倍、3.2倍、3.3倍、3.4倍、3.5倍、3.6倍、3.7倍、3.8倍、3.9倍、4.1倍、4.2倍、4.3倍、4.4倍、4.5倍、4.6倍、4.7倍、4.8倍、4.9倍、5倍、5.1倍、5.2倍、5.3倍、5.4倍、5.5倍、5.6倍、5.7倍、5.8倍、5.9倍、6倍、6.1倍、6.2倍、6.3倍、6.4倍、6.5倍、6.6倍、6.7倍、6.8倍、6.9倍、7倍、7.1倍、7.2倍、7.3倍、7.4倍、7.5倍、7.6倍、7.7倍、7.8倍、7.9倍、8倍、8.1倍、8.2倍、8.3倍、8.4倍、8.5倍、8.6倍、8.7倍、8.8倍、8.9倍、9倍、9.1倍、9.2倍、9.3倍、9.4倍、9.5倍、9.6倍、9.7倍、9.8倍、9.9倍、10倍、好ましくは少なくとも15倍以上、より好ましくは20倍以上、およびさらにより好ましくは少なくとも25倍以上多くのインスリンを分泌することができる。
インスリンの分泌レベルを決定する試験Dの方法は、たとえば、以下
1)10%の熱不活化FCS、100IU/mlのペニシリン、100μg/mlのストレプトマイシン、5mmol/lのグルコースを含むRMPI培地中、37℃、5%のCO2/95%のO2で、トランスジェニックブタ膵島を一晩培養することと、
2)クレブス・リンゲルバッファー1ml中で、上記トランスジェニックブタ膵島を1mmol/lまたは15mmol/lのグルコースと共に2時間インキュベートすることと、
3)ラジオイムノアッセイにより、回収した培地およびインキュベートした膵島におけるインスリンを定量することと
であり得る。
1)10%の熱不活化FCS、100IU/mlのペニシリン、100μg/mlのストレプトマイシン、5mmol/lのグルコースを含むRMPI培地中、37℃、5%のCO2/95%のO2で、トランスジェニックブタ膵島を一晩培養することと、
2)クレブス・リンゲルバッファー1ml中で、上記トランスジェニックブタ膵島を1mmol/lまたは15mmol/lのグルコースと共に2時間インキュベートすることと、
3)ラジオイムノアッセイにより、回収した培地およびインキュベートした膵島におけるインスリンを定量することと
であり得る。
本発明によると、本発明のトランスジェニックブタ膵島は、上述のトランスジェニックβ細胞を含む。
本発明の一実施形態では、本発明のトランスジェニックブタ膵島は、ブタ膵島の正常で生理的な構造を示し、ここでα細胞は、膵島の周辺に環状で位置しており、対してβ細胞は膵島の中心に位置している。一実施形態では、本発明のトランスジェニックブタ膵島は、50〜500μm、好ましくは150〜250μmの大きさを有する。一実施形態では、本発明のトランスジェニックブタ膵島のβ/α細胞の比率は、約5/1〜約20/1、好ましくは約10/1〜約12.5/の範囲にあり、より好ましくは約11.25/1である。
また本発明は、膵臓の中の、本発明の少なくとも1つのトランスジェニックβ細胞および/または少なくとも1つのトランスジェニックブタ膵島を含むトランスジェニックブタに関する。
本発明の一実施形態では、トランスジェニックブタは、異種移植の間での疾患の伝染のリスクを限定するために、感染性微生物を含まない。例として膵島は、参照として本明細書中に援用されている国際特許公開公報第2006/110054号に記載されているAIブタから、摘出され得る。これらのブタは、遠く離れたオークランド諸島(ニュージーランド)に定住しており、ブタの内在性レトロウイルス(PERV)、ならびにPCMV、PLHV、EMCV、HEV、およびPCVを含む他の一般的なブタの感染性ウイルスを含まない、またはほとんど含まない。別の例として、厳密なバイオセキュリティ下で生育させた特定病原体不在(SPF)のNZのラージホワイトブタがある。
本発明の一実施形態では、トランスジェニック技術による改変は、in vivoで行われる。
一実施形態では、トランスジェニック技術による改変は、本発明のトランスジェニックブタを作製するために、ex vivoで行われる。ex vivoでの方法を使用してトランスジェニックブタを作製する方法は、当業者に良く知られている。一実施形態では、トランスジェニックブタを得るために、以下の方法が使用され得る。
ブタのインスリンプロモーターおよびトランスジーンの配列を担持する発現ベクターは、以下に記載するように作製する。初代培養Gal−/−および野生型の線維芽細胞を、ブタ耳の生検から確立しており、in vitro、好ましくは、5%のCO2および5%のO2において、10%のFCSおよび10ng/mlのFGFを含むDMEM/TCM199中で培養する。
次に、増殖している培養物をトランスフェクトする。一実施形態では、トランスフェクションは、エレクトロポレーションにより行われる。一実施形態では、トランスフェクションは、化学的なトランスフェクションにより行われる。好ましい実施形態では、トランスフェクションは、たとえばNucleofector(Amaxa)を使用するなどした、最新のエレクトロポレーションおよび化学的なトランスフェクションの組み合わせにより、行われる。
次に、トランスフェクトした細胞を増殖させ、核移植のために凍結する。上記細胞のアリコートを増殖させて、導入遺伝子の組み込みを決定するためにPCR解析を行ってもよい。
地域の屠殺場で屠殺した繁殖周期の雌性動物の卵巣から、卵母細胞を回収した。選択した卵母細胞を、in vitroで、好ましくは5%のCO2、38.5℃で、42〜44時間、ゴナドトロピンの存在下で、10%のFCSを含むDMEM/F12培地中で、成熟させる。成熟が完了した際に、卵丘細胞を除去し、第1の極体を伴う卵母細胞を、さらなる処理のために選択する。
本発明の一実施形態では、核移植で使用する方法は、透明帯がない系(透明帯が溶解しはじめるまでの短いインキュベーション時間でのプロナーゼ消化により、透明帯が取り除かれている)に基づく。次に、透明帯のない卵母細胞を、ヘキストで染色し、除核の前にサイトカラシン(cytochalasine)Bに曝露する。卵母細胞を、マイクロドロップの列に個々に重ねて、先の尖っていないマイクロピペットを用いて除核する。
本発明の別の実施形態では、卵母細胞を、従来の透明帯封入法(zona−enclosed method)(核移植に使用する細胞をコンフルエンスまで増殖させ、かつ/または血清を24〜48時間枯渇させて、これらの細胞周期を同期する)により、調製する。マニピュレーションの前に、細胞を、トリプシン処理して単細胞浮遊液にし、使用するまで室温で保存する。核移植のために、使用する直前に、培養皿(培地のドロップ)上で細胞を高希釈で広げ、除核した卵母細胞を最初にフィトヘムアグルチニンを含む培地中で洗浄し、直後に細胞の上に滴下し、2つのユニットの間で強力な接触ができるまで転がす(Vajta et al., 2003, Biology of reproduction, 68:571−8)。
その後、このカプレット(除核した卵母細胞‐体細胞)を、細胞融合に供した。カプレットを、陰イオン性培地、好ましくは0.3Mのマンニトール、0.01MのMg、PVAを含む陰イオン性培地に移し、次に融合チャンバーに移す。二重DCパルス(たとえば1,2Kv/cmで30μ秒間)を送達することにより、融合体を得る。融合していないカプレットに、第2ラウンドの融合を再度行う。一実施形態では、融合したカプレットを、1mMのCaを含む融合培地中で30μ秒間、1.2KV/cmの二重DCパルスによる融合後、1〜2時間以内に活性化し、mSOFaa培地中5μMのサイトカラシンBで3.5〜4時間インキュベートする。
活性化後、再構成した透明帯のない胚は、胚どうしの接着を予防するために鉱物油を重層したマイクロドロップ中で、改変した「WOW(well of the well)」系で培養され得る(Vajta et al., 2000, Molecular Reproduction and Development, 55:256−64)
一実施形態では、in vitroの培養のために、油を重層したmSOFaaの20μlのマイクロドロップ(Galli et al., 2003, Cloning Stem Cells, 5: 223−232)を調製し、次に、10〜15個の小さいくぼみを、尖っていない小さな金属デバイスを使用して作製する。全培養期間の間、各くぼみに1つの胚を収容する。培養3日目に、培地の半分を新鮮な培地と交換する。5日目に胚の発達を評価する。密集した桑実胚および初期胚盤胞を、同期したレシピエントの子宮に移す。
妊娠は、たとえば妊娠期間の25日目などに超音波により診断され得る。一実施形態では、回収した胎児または新生児の動物に、たとえば免疫細胞化学によるなどして、膵島におけるトランスジーンの発現を決定するための解析を行う。一実施形態では、膵臓の細胞を、さらなるクローニングのため、液体窒素に保存する。トランスジーンの発現の知見に基づき、最良に発現する胎児を再クローニングして、トランスジェニックブタ膵島の単離に必要なトランスジェニック動物を作製する。この場合、すべての妊娠は満期産に至り、生存する動物が産まれた。
一実施形態では、トランスジェニック技術を用いた改変は、ウイルスベクターを使用して、好ましくはウイルスを使用して、より好ましくは、たとえば異なるエンベロープを有するHIVベクターなどのレンチウイルス:VSV、ガンマレトロウイルス(MLV−A、RD114、GALV)、ロスリバーウイルス、狂犬病ウイルス、麻疹ウイルス;アデノ随伴ウイルス(AAV)を含む群から選択されるウイルスを使用して行われる。好ましい実施形態では、トランスジェニック改変のためのベクターはレンチウイルスである。
一実施形態によると、ブタ膵島細胞のトランスジェニック改変に使用される遺伝子を、UCOEプロモーター(サイレンシングに抵抗性である)、CAGGSプロモーター(サイトメガロウイルス(CMV)の初期エンハーサーエレメントおよびニワトリβアクチンプロモーターの組み合わせ)、またはCMV(サイトメガロウイルス)プロモーターなどのユニバーサルプロモーターを用いて、または用いることなく、β細胞特異的ブタインスリンプロモーターの制御下に置く。一実施形態では、トランスジーンは、ブタインスリンプロモーターの制御下にあり、好ましくは、上記インスリンプロモーターはブタ膵島β細胞に特異的であり、これにより、β細胞のみにトランスジーンを発現させる。インスリンプロモーターの核酸配列の例として、限定するものではないが、配列番号11が挙げられる。
一実施形態では、トランスジェニックタンパク質を、追加的な配列に融合する。一実施形態では、上記追加的な配列は、トランスジェニックタンパク質のC末端に融合している。別の実施形態では、上記追加的な配列は、トランスジェニックタンパク質のN末端に融合している。
一実施形態では、上記追加的な配列は、分泌経路にタンパク質を指向させる。このような配列の例として、限定するものではないが、IgK鎖分泌シグナル(配列番号8のアミノ酸配列を有し、配列番号7によりコードされている)が挙げられる。
一実施形態では、上記追加的な配列は、たとえば上記トランスジェニックタンパク質の同定および単離を可能にするタグである。タグの例は、当業者に良く知られており、限定するものではないが、ヘマグルチニン(Hemaglutinin)タグ(HAタグ)、ポリアルギニンタグ、ポリヒスチジンタグ、Mycタグ、Strepタグ、S−タグ、HATタグ、3×Flagタグ、カルモジュリン−結合ペプチドタグ、SBPタグ、キチン結合ドメインタグ、GSTタグ、マルトース結合タンパク質タグ、蛍光タンパク質タグ、T7タグ、V5タグおよびXpressタグが挙げられる。一実施形態では、トランスジェニックタンパク質は、たとえば配列番号12の核酸配列によりコードされている、アミノ酸配列YPYDVPDYA(配列番号13)を有するHAタグなどのHAタグを含む。
一実施形態では、トランスジーンは、転写の効率的な終結を可能にする追加的な配列に3’末端で融合されている。
一実施形態では、トランスジーンは、ポリA配列に融合されている。一実施形態では、トランスジーンは、たとえば配列番号14を有する、ポリA配列を含むウサギのβグロブリンフラグメントに融合されている。
本発明の別の目的は、構成的に活性化されたアセチルコリン受容体、好ましくは構成的に活性化されたムスカリン受容体、より好ましくは構成的に活性化されたIII型ムスカリン受容体の配列を含むベクター、さらにより好ましくは、配列番号3のヌクレオチド配列を有するベクターである。好ましくは、上記ベクターは、異なるエンベロープを有するHIVベクターなどのレンチウイルス:VSV、ガンマレトロウイルス(MLV−A、RD114、GALV)、ロスリバーウイルス、狂犬病ウイルス、麻疹ウイルス、およびアデノ随伴ウイルス(AAV)を含む群から選択される。好ましくは、構成的に活性化されたアセチルコリン受容体のヌクレオチド配列は、たとえば配列番号11の配列を有するインスリンプロモーターなどのβ細胞特異的ブタインスリンプロモーターの制御下にある。
一実施形態では、ベクターは、ブタのインスリンプロモーターの制御下で、この配列に融合したHAタグおよびポリAの配列を含む、構成的に活性化されたIII型のムスカリン受容体のヌクレオチドの配列を含み、かつ配列番号22の配列を含む。
本発明の別の目的は、好ましくはA8S変異および/またはコードされたポリペプチドの分泌を可能にする追加的な配列を含み、さらにより好ましくは、配列番号9のヌクレオチド配列を有する、GLP−1のヌクレオチド配列を含むベクターである。好ましくは、上記ベクターは、たとえば異なるエンベロープを有するHIVベクターなどのレンチウイルス:VSV、ガンマレトロウイルス(MLV−A、RD114、GALV)、ロスリバーウイルス、狂犬病ウイルス、麻疹ウイルス、およびアデノ随伴ウイルス(AAV)を含む群から選択される。好ましくは、GLP−1のヌクレオチド配列は、たとえばインスリンプロモーターなどのβ細胞特異的ブタインスリンプロモーターの制御下にある。一実施形態では、上記インスリンプロモーターは、ブタ膵島β細胞に特異的であり、β細胞のみにトランスジーンの発現をもたらす。インスリンプロモーターの核酸配列の例として、限定するものではないが、配列番号11が挙げられる。
一実施形態では、ベクターは、ブタインスリンプロモーターの制御下、および配列に融合したポリA配列を含む、A8S変異およびIgK鎖分泌シグナルの両方を含むGLP1のヌクレオチド配列を含み、かつ配列番号23の配列を有する。
一実施形態では、本発明のトランスジェニックブタ膵島またはトランスジェニックブタβ細胞は、少なくとも生後6ヶ月、好ましくは8ヶ月、より好ましくは18ヶ月、さらにより好ましくは生後2年の成年のブタから単離されている。トランスジェニックブタ膵島は、遅滞なく患者に移植するために使用され得るが、限定された期間の間、機能的である(たとえばアルギン酸塩のパッチでカプセル化されている場合、成年のブタから単離されたブタ膵島は、一般的に、約4〜6か月間、好ましくは約8か月間、in vivoで機能的であり得る)。
別の実施形態では、本発明のトランスジェニックブタ膵島、またはトランスジェニックブタβ細胞は、生後約3〜4週間の新生仔ブタから単離されている。これらのブタ膵島は、成熟させるために約1週間培養しなければならないが、成年のブタから単離したブタ膵島と比較して、長い期間機能的である。
一実施形態では、新生仔ブタから単離されたトランスジェニックブタ膵島は、少なくとも6か月間、好ましくは少なくとも8か月間、より好ましくは少なくとも12か月間以上の期間、in vivoで機能的である。
本明細書中で使用されるように、成熟したブタ膵島は、(i)分化した細胞、特に分化したα細胞およびβ細胞を含み、かつ(ii)グルコースで刺激すると、インスリンを分泌することができる(試験Dの条件で測定され得る)、ブタ膵島に対応する。
新生仔ブタから単離した、トランスジェニックブタ膵島を成熟化させるために適用され得る培養条件は、当業者によく知られている。使用し得る培養培地の非限定的な例として、以下:0.25%のBSA、10mMのIBMX、100U/mLのペニシリン‐ストレプトマイシン、10mMのグルコース、2mMのグルタミンおよび10mMのニコチンアミドを補充したHAM F10培地がある。
トランスジェニックブタからブタ膵島を単離する方法は、当業者に良く知られている。一実施形態では、トランスジェニックブタ膵島の単離は、以下に簡単にまとめられている、Dufrane et al., Xenotransplantation, 2006およびDufrane et al., Transplantation, 2006に記載されるプロトコルに従って行われる。
一実施形態では、単離プロトコルは、膵臓の血液の含有量を減らすためにブタを瀉血するステップを含む。簡単に述べると、脳死後、動物の心拍動を内臓摘除術時まで維持する。血液の瀉血を、頸動脈および頸静脈の切開により行い、動物を、後肢によって1〜10分間、好ましくは4〜7分間吊り下げる。
簡単に述べると、膵臓をex vivoで解剖する。一実施形態では、膵臓の分析は、5〜25分の範囲の温虚血血で行われる。次に、膵管を確認して、18ゲージカテーテルを挿入する。次に膵腺を、灌流溶液により冷却保存溶液を用いて拡張させる。一実施形態では、組織1gあたり灌流溶液1mlを使用する。膵臓を、保存溶液に浸して保存する。一実施形態では、保存溶液は、従来のウィスコンシン大学保存液(UW、n=6)または改変UW保存液(UW−M;ヒドロキシエチルデンプンなしおよび低K+/高NA+)である。
次に、摘出した膵臓を消化させる。好ましい実施形態では、膵臓の解離を、リベラーゼDLリサーチグレード(ディスパーゼ低濃度)酵素、好ましくはロシュ/ベーリンガーインゲルハイムにより提供される酵素を用いて行う。この酵素を、低温、好ましくは約4〜12℃の範囲の温度、好ましくは約8℃で、約0.1〜約1mg/mlの範囲の濃度、好ましくは約0.5mg/mlの濃度のUW−M溶液に溶解する。
一実施形態では、膵臓を、Ricordiら(1986, Diabetes, 35: 649−653)により記載される動的方法を使用して消化する。簡単に述べると、酵素で膨張させたブタ膵臓をスライスして、Ricordiチャンバー(好ましくは、7つの原料ガラスを含む316 lステンレス鋼で作製)に充填し、加熱回路を用いて37℃で消化させ、チャンバーを手動で攪拌する。有意な数の単離した膵島が試料に現れた際に、好ましくは、10%のNCSを含む冷却したHam−F10培地を添加することにより消化回路を冷却して、酵素活性を低減させる。次に、冷却した培地を、約25〜40分間灌流する。膵島、細胞、およびデブリを250mlのチューブに回収し、4℃(630gで3分間)で遠心沈降させる。全細胞のペレットを集め、Ham−F10培地200mlに浮遊させる。
別の実施形態では、膵臓を、O’Neil et al., 2001により記載されるような静的な方法を使用して消化する。簡単に述べると、膵臓に、2〜4倍容量(mL/g)のリベラーゼPIを注入する。適切な膨満を達成するように、膵臓に注入し、滅菌性の1LのNalgeneジャーに入れ、37℃で45〜60分間、静置してインキュベーションすることにより、消化させた。肉眼の腺を調べることに基づき、Ham−F10+20%のNCSを添加することにより、消化を終了させる。細胞浮遊液を、1000μmの大きさの孔を有するステンレス鋼のメッシュを通してろ過し、Ham−F10+20%のNCSに希釈する。次に、消化された組織を、6mmのガラスビーズの層の上にステンレス鋼のメッシュスクリーンを介して通過させる。組織の流出液を、3〜4lの冷却したHam−F10+10%のNCSとともに250mlの円錐管に回収し、4℃、700rpmで遠心沈降させる。膵島、細胞、およびデブリを、250mlのチューブに回収し、4℃(630gで3分間)で遠心沈降させる。すべての細胞ペレットをプールして、200mlのHam−F10培地に浮遊させる。
一実施形態では、単離後に、トランスジェニックブタ膵島を精製する。一実施形態では、トランスジェニックブタ膵島の精製は、Dufrane et al., Xenotransplantation, 2006に記載されるような、不連続なフィコール勾配を使用して行われる。簡単に述べると、フィコール勾配、好ましくはフィコール ユーロコリンズ(Ficoll Euro−Collins)勾配を使用して、単離した膵島を4℃で精製する。消化後の細胞のペレットを、フィコール ユーロコリンズ溶液75ml(密度1.1g/cm3)に懸濁し、平底チューブに入れる。より密度の低い勾配のフィコールを連続的に添加する(1.096g/cm3、50ml;1.060g/cm3、50ml;およびHam−F10培地、20ml)。Ham−F10培地は、F−10栄養素混合培地であり、市販されており、たとえばN.V. Invitrogen(ベルギー)により提供されている。856gで17分間、勾配チューブを遠心分離した後、膵島を、1.1/1.096および1.096/1.060の界面から回収する。各界面からの膵島を、50mLのHam−F10+10%のNCSの血清(NCSは、新生仔ウシ血清を意味し、市販されており、たとえばBiochrom AG(ドイツ)により提供されている)を含む2つのチューブに浮遊させる。このチューブを、280gで3分間遠心沈降させ、上清を除去し、細胞を、150mlのHam−F10培地で洗浄する。この手法を、たとえば3回反復し、最終的に、膵島を、200mlのHam−F10培地に浮遊させる。
本発明の別の目的は、本発明のトランスジェニックブタ膵島またはトランスジェニックβ細胞を含むデバイスである。好ましくは、本発明のデバイスは、上述のトランスジェニックブタ膵島を含む。
一実施形態では、本発明のデバイスは、埋め込み可能または移植可能なデバイスである。別の実施形態では、本発明のデバイスは、注射可能なデバイスである。
一実施形態では、本発明のデバイスは、生体非吸収性であり、このことは、対象に埋め込んだまたは注射した場合に、本デバイスが生物学的安定性の改善を示すことを意味する。この生物学的安定性の改善により、デバイスに存在する細胞が、現在の事例よりも長い期間生体内にとどまることが可能となり、これにより、治療の有効性が改善する。
本発明の一実施形態では、本デバイスは、トランスジェニックブタ膵島またはトランスジェニックブタβ細胞を留置するためのあらかじめ血管形成させた自家コラーゲンリザーバーを形成することができるように、国際特許公開公報第02/32437号に記載される血管形成した皮下コラーゲンチューブであり得る。簡単に述べると、ゆるく適合しているテフロンロッドを含むステンレス鋼のメッシュの封止管を、意図するグラフトのレシピエントの皮下に挿入する。6週間後、ロッドを取り外し、高度に血管形成したコラーゲンのチューブはそのままにする。一実施形態では、本発明のトランスジェニックブタ膵島またはトランスジェニックβ細胞を、血管チューブに挿入し、次にテフロンストッパーで封止する。
本発明の別の実施形態では、デバイスは、ゼラチン、コラーゲン、および天然の炭水化物のポリマーの調製物を含む、マトリックスの調製物であり得る。
本発明の別の実施形態では、デバイスは、同種のトロンビンで作製した血漿トロンビンの血餅−自家凝固血漿であり得る。
本発明の別の実施形態では、デバイスは、移植したトランスジェニックブタ膵島またはβ細胞の追加的な免疫防御を提供するためのカプセルなどの、適切な生物適合性の材料であり得る。カプセル化システムは当業者に良く知られている。好ましくは、カプセルは、半透過膜から作られており、グルコース、栄養素、およびインスリンに対しては透過性であるが、体液性/細胞性の免疫成分に対しては透過性ではない。
一実施形態では、半透過膜は、アルギン酸塩、ニトロセルロース、アクリロニトリル、アガロース、およびポリテトラフルオロエチレンを含む群から選択される材料で作製されている。好ましい実施形態では、半透過膜は、アルギン酸塩から作製されている。
別の実施形態では、本デバイスは、国際特許公開公報第2007/046719号に記載の、生細胞用のカプセル化システムであり得る。この実施形態では、カプセル化システムは、具体的には約50%〜95%のマンヌロン酸残基を含むマンヌロン酸を多く含むアルギン酸塩と、ポリ‐L−オルニチンなどの、1.5超の多分散指数を有するポリカチオンとを含む、生体非吸収性の組成物を含む。カプセル化システムは、上述の組成物を使用して調製されている生体適合性マイクロカプセルであり得て、カチオン性架橋剤で架橋した高マウンヌロン酸アルギン酸塩のコア層、半透過膜を形成する約1.5未満の多分散指数を有するポリカチオンの中間層と、高マンヌロン酸アルギン酸塩の外層とを含み、コア層の中に生細胞を含む。
別の実施形態では、デバイスは、国際特許公開公報第02/032437号に記載されるマイクロカプセルであり得る:この手法で使用されるアルギン酸ナトリウムは、原材料の供給源(海藻)から抽出されており、超高純度の粉末の形態で調製されている。カプセル化の手法は、カチオン(塩化カルシウム)をゲル化する槽に液滴作製針(droplet generating needle)を介して、トランスジェニックブタ膵島またはβ細胞とアルギン酸ナトリウム溶液(1.6%)の混合物を押し出すことを含む。次に、カルシウム‐アルギン酸塩のゲルに捕捉された膵島またはβ細胞を、陽性荷電のポリ‐L‐オルニチンでコーティングし、次いでアルギン酸塩(0.05%)で外側をコーティングする。次に、アルギン酸塩の中心のコアを、クエン酸ナトリウムを添加することにより液状にする。好ましくは、ほとんどのカプセルが、トランスジェニックブタ膵島3個を含み、かつ300〜400μmの直径を有する。
別の実施形態では、デバイスは、国際特許公開公報第2010/032242号に記載されるマクロカプセルであり得る。国際特許公開公報第2010/032242号は、アルギン酸塩マトリックスなどのハイドロゲル中での細胞のマクロカプセル化により提供される人工的な膜により、細胞を移植して免疫学的に隔離するためのシステムを開示する。膵島をマクロカプセル化するハイドロゲルは、平面の幾何学的な構成、たとえば平板、シート、またはディスクを有するように形成されている。概してアルギン酸塩の構造は、少なくとも1つの実質的に平坦な表面を有する。アルギン酸塩は、超高純度のアルギン酸塩と、ハイドロゲルに細胞または組織のセグメントをカプセル化するように架橋された定義された組成物とを含む。典型的に、アルギン酸塩の平板は、膵島2,000〜8,000個/cm2の密度でトランスジェニックブタ膵島を有する。膵島をマクロカプセル化するアルギン酸塩は、典型的に、平板が腎臓の形状に一致し、かつ腎被膜下腔の中に適合ためには十分可撓性であるが、全体の物理学的な特徴を維持するためには十分強くあるように、50%未満の濃度のグルクロン酸を有する。さらに、アルギン酸塩は、平板が、力に抵抗するために十分強くかつ安定であるように、1.5%超の乾燥物質含有量を含む。典型的に、マクロカプセル化された膵島の平板は、少なくとも1:10の、膵島の体積:アルギン酸塩の体積の比率(すなわち、膵島の体積が10%)を提供する。一部の応用では、膵島をカプセル化するために使用されるアルギン酸塩に、コラーゲンを補充する。一部の応用では、膵島は、基本のアルギン酸塩の平板の中央に配置されており、補助的なアルギン酸塩の層が、基本のアルギン酸塩の平板の中のカプセル化された膵島を囲んでいる。このような応用では、医療用のコラーゲンの層を、補助的なアルギン酸塩の層と併用して使用してもよい。
本発明の別の実施形態では、デバイスは、国際特許公開公報第2007/144389号に記載される細胞デバイスであり得て、上記デバイスは、(a)第1の側部および第2の側部を有するコラーゲンマトリックスと、(b)コラーゲンマトリックスの第1の側部に吸収された第1の細胞層と、(c)第1のゲル化アルギン酸塩の層および第2のゲル化アルギン酸塩の層であって、第1のゲル化アルギン酸塩の層がコラーゲンマトリックスの第1の側部および第1の細胞層を完全に被覆し、第2のゲル化アルギン酸塩の層がコラーゲンマトリックスの第2の側部を完全に被覆する、第1のゲル化アルギン酸塩の層および第2のゲル化アルギン酸塩の層とを含む。
一実施形態では、新たに単離したトランスジェニックブタ膵島またはβ細胞を、Inotech Encapsulation AG Device(スイスドッティコン)を用いて、SLP100アルギン酸塩マトリックス(FMC BioPolymer(ノルウェイ))にカプセル化する。
好ましくは、本発明のデバイスは、患者の体内に埋め込むまたは注射する前に、滅菌されている。好ましくは、滅菌は、γ線照射、電子線、エチレンオキシド、オートクレーブ、または、液体成分を添加する前でのアルコールとデバイスの接触、またはNOXガスとの接触、水素ガスプラズマ滅菌が挙げられる。
好ましくは、デバイスは、エンドトキシンの含有量が少ない。一部の実施形態では、細胞デバイスは、100EU/gの単位未満のエンドトキシンレベル、90EU/g未満、80EU/g未満、70EU/g未満、60EU/g未満、50EU/g未満、40EU/g未満、30EU/g未満、20EU/g未満、10EU/g未満、5EU/g未満、または1EU/g未満のエンドトキシンレベルを有する。
本発明の別の実施形態では、デバイスは、国際特許公開公報第02/060409号に記載されるカプセル化チャンバーであり得て、このデバイスは、たとえばイスリンなどの生物学的に活性な物質を産生する細胞、たとえばトランスジェニックブタ膵島またはβ細胞などの細胞を含み、かつ、少なくとも1つの半透過膜を含む。上記デバイスの半透過性膜は、生体適合性の多孔性ポリカーボネートフィルムを含み、この多孔性ポリカーボネートフィルムは、極性部位の作成により表面で修飾されており、多孔性ポリカーボネートフィルムは、少なくとも1つの親水性ポリマー、たとえばセルロース、ポリアクリルアミド、ポリビニルピロリドン、酢酸ビニルのコポリマー、ポリエチレングリコール、親水性ポリメタクリレート、多糖(polyoside)、およびキトサンなどによりコーティングされている。
また本発明は、本発明のトランスジェニックブタβ細胞、トランスジェニックブタ膵島、またはデバイスを含む組成物に関する。
また本発明は、本発明のトランスジェニックブタβ細胞、トランスジェニックブタ膵島またはデバイスと、少なくとも1つの薬学的に許容可能な賦形剤とを含む、医薬組成物に関する。本明細書中に使用されるように、「薬学的に許容可能な賦形剤」は、動物、好ましくはヒトに投与される場合に、有害反応、アレルギー性反応、または他の望ましくない反応を生成しない賦形剤を指す。本医薬組成物は、任意のすべての溶媒、分散培地、コーティング剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを含む。ヒトの投与では、調製物は、たとえばFDA局またはEMAなどの規制局により必要とされる滅菌性、発熱性、一般的な安全性、および純度の基準を満たさなければならない。
また本発明は、本発明のトランスジェニックブタβ細胞、トランスジェニックブタ膵島、またはデバイスを含む薬剤に関する。
本発明の別の目的は、膵内分泌部のβ細胞の機能の欠損または非存在に関連する疾患、障害、または病態を治療するため、または治療に使用するための、本発明のトランスジェニックブタ膵島、トランスジェニックβ細胞、デバイス、または組成物、医薬組成物、もしくは薬剤の使用に関する。このような疾患の例として、限定するものではないが、I型糖尿病、II型糖尿病、妊娠糖尿病、潜在性自己免疫性糖尿病、1.5型糖尿病、脂肪萎縮性糖尿病、若年発症成人型糖尿病、新生児糖尿病(たとえば持続性新生児糖尿病または一過性新生児糖尿病)、前糖尿病、ステロイド誘導型糖尿病、膵癌、特に、たとえば内分泌性膵腫瘍および膵性神経内分泌癌などの膵内分泌部癌が挙げられる。
一実施形態では、上記疾患、障害、または病態は、I型糖尿病、II型糖尿病、妊娠糖尿病、潜在性自己免疫性糖尿病、1.5型糖尿病、脂肪萎縮性糖尿病、若年発症成人型糖尿病、新生児糖尿病(たとえば持続性新生児糖尿病または一過性新生児糖尿病)、前糖尿病、ステロイド誘導型糖尿病などの糖尿病である。
本発明の別の目的は、その必要がある対象の血中グルコースレベルを調節するための、本発明のトランスジェニックブタ膵島、トランスジェニックβ細胞、デバイス、または組成物、医薬組成物、もしくは薬剤である。一実施形態では、血中グルコースレベルを調節することは、正常な空腹時血中グルコースレベルを回復させることを意味し、ここで正常な空腹時血中グルコースレベルは、好ましくは、正常な、すなわち、同様の年齢および体重の非糖尿病性個体で測定した空腹時血中グルコースレベルに対応する。一実施形態では、正常な空腹時血中グルコースレベルは、110mg/dL(すなわち6.1mmol/L)未満、好ましくは100mg/dL(すなわち5.6mmol/L)未満である。
本発明の別の目的は、その必要がある対象の正常なインスリン分泌レベルを回復させるための、本発明のトランスジェニックブタ膵島、トランスジェニックβ細胞、デバイス、または組成物、医薬組成物、もしくは薬剤である。一実施形態では、正常なインスリン分泌レベルは、同様の年齢および体重の正常な非糖尿病性の個体における所定のグルコース摂取により誘導されるインスリン分泌レベルに対応する。一実施形態では、グルコース摂取に応答したインスリン分泌は、糖負荷試験(たとえば経口糖負荷試験(OGTT)または静脈内耐糖試験(IVGTT)など)により測定され得る。一実施形態では、非糖尿病性の対象のIVGTTでは、0.3〜0.5g/kgのグルコース量を投与した後、インスリン分泌は、100μU/mlの最大値に達し得るが、その後基底値(15〜20μU/ml)まで減少する。
また、本発明は、膵内分泌部のβ細胞機能の欠損または非存在に関連する疾患、障害、または病態を治療する方法であって、本発明のトランスジェニックブタ膵島、トランスジェニックブタβ細胞、デバイス、または組成物、医薬組成物、もしくは薬剤の治療上有効量をその必要がある患者に投与することを含む、または投与することからなる方法に関する。このような疾患の例として、限定するものではないが、I型糖尿病、II型糖尿病、妊娠糖尿病、潜在性自己免疫性糖尿病、1.5型糖尿病、脂肪萎縮性糖尿病、若年発症成人型糖尿病、新生児糖尿病(たとえば持続性新生児糖尿病または一過性新生児糖尿病)、前糖尿病、ステロイド誘導型糖尿病、膵癌、特に、たとえば内分泌性膵腫瘍および膵性神経内分泌癌などの膵内分泌部癌が挙げられる。
一実施形態では、上記疾患、障害、または病態は、たとえばI型糖尿病、II型糖尿病、妊娠糖尿病、潜在性自己免疫性糖尿病、1.5型糖尿病、脂肪萎縮性糖尿病、若年発症成人型糖尿病、新生児糖尿病(たとえば持続性新生児糖尿病または一過性新生児糖尿病)、前糖尿病、ステロイド誘導型糖尿病などの糖尿病である。
本発明の別の目的は、その必要がある対象の血中グルコースレベルを調節する方法であって、本発明のトランスジェニックブタ膵島、トランスジェニックβ細胞、デバイス、または組成物、医薬組成物、もしくは薬剤の治療上有効量を上記対象に投与することを含む、方法である。一実施形態では、血中グルコースレベルを調節することは、正常な空腹時血中グルコースレベルを回復させることを意味し、ここで正常な空腹時血中グルコースレベルは、好ましくは、同様の年齢および体重の正常な非糖尿病性の個体で測定した空腹時血中グルコースレベルに対応する。一実施形態では、正常な空腹時血中グルコースレベルは、110mg/dL(すなわち6.1mmol/L)未満、好ましくは100mg/dL(すなわち5.6mmol/L)未満である。
本発明の別の目的は、その必要がある対象の正常なインスリン分泌レベルを回復させる方法であって、本発明のトランスジェニックブタ膵島、トランスジェニックβ細胞、デバイス、または組成物、医薬組成物、もしくは薬剤の治療上有効量を上記対象に投与することを含む、方法に関する。一実施形態では、正常なインスリン分泌レベルは、正常な個体、すなわち、同様の年齢および体重の非糖尿病性の正常な個体における所定のグルコース摂取により誘導されるインスリン分泌レベルに対応する。一実施形態では、グルコース摂取に応答するインスリン分泌は、糖負荷試験(たとえば経口糖負荷試験(OGTT)または静脈内耐糖試験(IVGTT)など)により測定され得る。一実施形態では、非糖尿病性の対象のIVGTTにおいて、0.3〜0.5g/kgのグルコース量を投与した後、インスリンの分泌は、100μU/mLの最大値に達し得るが、その後基底値(15−20μU/mL)まで減少する。
本発明の別の目的は、その必要がある対象における、膵内分泌部のβ細胞の機能の欠損または非存在に関連する疾患、障害、もしくは病態を治療するため、血中グルコースレベルを調節するため、または正常なインスリン分泌レベルを回復させるための方法であって、上記方法が、PKA経路およびPKC経路が構成的に活性化されているトランスジェニックブタβ細胞またはトランスジェニックブタ膵島の治療上有効量を上記対象に投与することにより、上記対象によるインスリン分泌が増加する、方法である。
一実施形態では、上記インスリン分泌の増加は、トランスジェニック細胞または膵島により構成的に活性化されたM3ムスカリン受容体の発現からもたらされ、これにより、PIP2の加水分解が増加し、IP3およびDAGの合成が増加することにより、PKA経路を活性化し、細胞質内のCa2+の排出を増加させ、これにより、インスリンの合成および分泌を増強する。
一実施形態では、上記インスリン分泌の増加は、トランスジェニック細胞または膵島によるGLP−1の発現からもたらされ、これにより、アデニルシクラーゼ酵素を活性化させ、cAMPの産生を増加させ、これにより、
(i)酵素タンパク質キナーゼA(PKA)を活性化させることにより、インスリン分泌プロセスに関与するタンパク質(たとえばPDX−1など)を活性化させ、かつ
(ii)Gタンパク質のRap1への立体化学的(conformal)な変化を誘導することにより、直接放出に使用できる顆粒のプールの大きさを拡大することにより、インスリンの開口分泌を促進する。
(i)酵素タンパク質キナーゼA(PKA)を活性化させることにより、インスリン分泌プロセスに関与するタンパク質(たとえばPDX−1など)を活性化させ、かつ
(ii)Gタンパク質のRap1への立体化学的(conformal)な変化を誘導することにより、直接放出に使用できる顆粒のプールの大きさを拡大することにより、インスリンの開口分泌を促進する。
一実施形態では、本発明のトランスジェニックブタ膵島、トランスジェニックブタβ細胞、デバイス、または組成物、医薬組成物もしくは薬剤を、埋め込み、移植、または注射を介して投与する。好ましくは、投与は、皮下、腹腔内、筋肉内、または腎被膜内もしくは被膜下に行う。
一実施形態では、投与されるトランスジェニックブタβ細胞またはブタ膵島の数(治療上有効量)は、10000〜50000IEQ/kg体重、好ましくは30000〜50000IEQ/kg体重の範囲にある。IEQは、ブタの膵島の当量を意味する。
一実施形態では、デバイスを使用する場合、1つまたは複数、たとえば1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個、またはそれ以上などのデバイスを投与してもよい。
一実施形態では、その必要がある対象は、さらに免疫抑制療法を受ける。一実施形態では、トランスジェニックブタ膵島、トランスジェニックブタβ細胞、デバイス、または組成物、医薬組成物、もしくは薬剤の投与と、免疫抑制療法は、同時または連続的であり得る。好ましくは、免疫抑制療法は、ダクリズマブ、タクロリムス、ラパマイシン、ミコフェノール酸モフェチル、シクロスポリン、デオキシスペルグアリンもしくはデオキシスペルグアリン類似体、可溶性補体受容体1、抗CD154抗体、ATG、メチルプレドニゾロン、抗IL−2R抗体、バシリキシマブ、FTY720、エベロリムス、レフルノミド、シロリムス、ベラタセプト、CTLA4−Ig、コブラ毒を含む群から選択される少なくとも1つの生成物の投与を含む、またはからなる。
好ましくは、改変したブタ膵島を、デバイスを用いることなく投与する場合には、免疫抑制療法を行う。
好ましくは、対象は哺乳類、好ましくはヒトおよび非ヒト霊長類を含む霊長類、より好ましくはヒトである。一実施形態では、対象は雄性である。別の実施形態では、対象は雌性である。別の実施形態では、対象は、たとえばイヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウス、フェレット、ウサギなどのペットをも指してよい。
一実施形態では、対象は、膵内分泌部またはβ細胞の機能の欠損または非存在に関連する疾患、障害、または病態に罹患している。好ましくは、対象は、I型糖尿病、またはII型糖尿病に罹患している。
実施例
本発明を、以下の実施例によりさらに例示する。
本発明を、以下の実施例によりさらに例示する。
実施例1
単離したブタ膵島を、10%の熱不活化FCS、100IU/mlのペニシリン、100μg/mlのストレプトマイシン、5mmol/lのグルコースを含むRMPI培地中、37°C、5%のCO2/95%のO2で一晩培養した。次に、単離したブタ膵島を、任意に20nMのホルボールミリステートアセタート(PMA、PKC経路の直接的なアクチベーター)および/または1μMのフォルスコリン(PKA経路の間接的なアクチベーター)を補充した、1mmol/Lまたは15mmol/Lのグルコースのクレブス・リンゲルバッファー1mlで2時間インキュベートした。最後に、インスリンを、ラジオイムノアッセイにより、回収した培地およびインキュベートした膵島において定量した。
単離したブタ膵島を、10%の熱不活化FCS、100IU/mlのペニシリン、100μg/mlのストレプトマイシン、5mmol/lのグルコースを含むRMPI培地中、37°C、5%のCO2/95%のO2で一晩培養した。次に、単離したブタ膵島を、任意に20nMのホルボールミリステートアセタート(PMA、PKC経路の直接的なアクチベーター)および/または1μMのフォルスコリン(PKA経路の間接的なアクチベーター)を補充した、1mmol/Lまたは15mmol/Lのグルコースのクレブス・リンゲルバッファー1mlで2時間インキュベートした。最後に、インスリンを、ラジオイムノアッセイにより、回収した培地およびインキュベートした膵島において定量した。
図1に示すように、PMAによる直接的なPKCの活性化は、グルコース誘導型のインスリンの分泌を、成年のブタから単離した、単離ブタ膵島で2倍、新生仔ブタから単離したブタ膵島で最大8倍増加させ、よって、グルコースに対するブタの膵島の応答性が改善された。また本出願人らは、β細胞のcAMPがフォルスコリンにより上昇して、PKAおよびEpac2を活性化すると、わずかに小さな増加を観察した。興味深いことに、本出願人らは、15mMのグルコースの存在下でPMAおよびフォルスコリンの両方にトランスジェニックブタ膵島を曝露した後に、成年の膵島でほぼ6倍、新生仔の膵島で25倍増加する、分泌応答の予期しない相乗作用を観察した。よって、これらの結果は、インスリンの分泌に及ぼす、PKCの活性化およびPKAの活性化の予期しない相乗作用を証明する。
実施例2
トランスジェニックタンパク質の発現、標的化した経路の活性化、およびグルコース誘導型のインスリン分泌に及ぼすこのような活性化の効果を検証するために、マウスのβ細胞株(MIN6)にトランスフェクトした。
トランスジェニックタンパク質の発現、標的化した経路の活性化、およびグルコース誘導型のインスリン分泌に及ぼすこのような活性化の効果を検証するために、マウスのβ細胞株(MIN6)にトランスフェクトした。
トランスジェニックタンパク質の発現を、RT−PCRによりmRNAレベルで検証した。活性化ムスカリン受容体の配列は、野生型の受容体と大きく異なり、よって、タンパク質の発現は、受容体配列に付加されたタグに特異的な抗体を使用して、トランスフェクトしたMIN6細胞抽出物のウェスタンブロッティングにより、検証することができる。GLP−1の産生は、トランスジェニック細胞および対照の細胞における細胞内GLP−1の量を測定することと、培養培地中のGLP−1の分泌を測定することにより、検証した。
インスリンの分泌に及ぼすトランスジェニックタンパク質の効果を検証するために、トランスフェクトしたMIN6細胞および対照のMIN6細胞に、静的なインキュベーション実験の間に、グルコース濃度の増加をチャレンジした。インスリンの分泌を測定し、刺激指数、すなわちトランスジェニック細胞および対照細胞の、高グルコースでのインスリン分泌と低グルコースでのインスリン分泌との間の比率を、計算した。簡単に述べると、2.105個の細胞を、12ウェルプレートに播種し、48時間培養した後、GLP−1(7−37)遺伝子(GLP−1)、変異型GLP−1(7−A8S−37)遺伝子(GLP−1 Ser8)または構成的に活性化されたムスカリン受容体遺伝子(M3)を有するプラスミドの1つをトランスフェクトした。対照の細胞は、プラスミドDNAを全く用いることなく、単にリポフェクタミンに曝露した。トランスフェクションから48時間後、細胞を飢餓状態にし、次に、1mMまたは15mMのグルコースを含むクレブス・リンゲルバッファー1ml中で、2時間インキュベートした。インスリンの分泌を、インキュベーション培地で測定し、細胞の総インスリン含有量のパーセンテージとして表した。
図2は、Min6細胞におけるGLP−1のトランスジーンの発現が、グルコース誘導型インスリン分泌のわずかな有意でない増加(刺激指数は、対照の2.2に対し2.6)を引き起こすことを示す。興味深いことに、より半減期の長い改変GLP−1(GLP−1 Ser8)をコードするトランスジーンは、15mMのグルコースに対する分泌応答のより有意な増加(刺激指数3.2に対して、対照細胞では2.2)を誘導した。Min6細胞における構成的に活性化された3型のムスカリン受容体(M3)の発現は、15mMのグルコースにより誘導されるインスリン分泌を有意に増加させた(刺激指数は、対照の2.2に対し、3.9)。
よってこれらの結果は、使用したプラスミドが関心対象の分子の発現を首尾よく誘導し、かつ、この発現がグルコースに対する分泌応答を増加させることを示す。
実施例3
PKA経路およびPKC経路のトランスジーンの活性化の効果を、単離したブタ膵島で評価した。この目的のために、GLP−1 Ser8およびM3Rの配列を、pENTCMVアデノウイルスベクターに挿入して、初代培養膵島細胞に、トランスジェニックGLP−1(GLP−1 Ser8)および活性化ムスカリン受容体(M3R)を発現させた。GLP−1およびM3Rを同時発現させるため、これら2つの配列を、ブタ膵島のインスリン分泌に及ぼすPKAおよびPKCの同時活性化の効果を試験するために、同じバイシストロン性ベクターに挿入した。HAM F10で培養した新生仔ブタ膵島(パネルA)およびRPMIで培養した成年ブタ膵島(パネルB)を、感染多重度200(MOI=200)でGLP−1、M3RまたはGLP−1+M3Rのウイルス発現ベクターに48時間曝露した後、グルコースチャレンジを行った。次に、膵島を、1mMまたは15mMのグルコースを含むクレブス・リンゲルバッファー1ml中で2時間インキュベートした。次に、インスリンを、ラジオイムノアッセイにより、回収した培地およびインキュベートした膵島で、定量した。
PKA経路およびPKC経路のトランスジーンの活性化の効果を、単離したブタ膵島で評価した。この目的のために、GLP−1 Ser8およびM3Rの配列を、pENTCMVアデノウイルスベクターに挿入して、初代培養膵島細胞に、トランスジェニックGLP−1(GLP−1 Ser8)および活性化ムスカリン受容体(M3R)を発現させた。GLP−1およびM3Rを同時発現させるため、これら2つの配列を、ブタ膵島のインスリン分泌に及ぼすPKAおよびPKCの同時活性化の効果を試験するために、同じバイシストロン性ベクターに挿入した。HAM F10で培養した新生仔ブタ膵島(パネルA)およびRPMIで培養した成年ブタ膵島(パネルB)を、感染多重度200(MOI=200)でGLP−1、M3RまたはGLP−1+M3Rのウイルス発現ベクターに48時間曝露した後、グルコースチャレンジを行った。次に、膵島を、1mMまたは15mMのグルコースを含むクレブス・リンゲルバッファー1ml中で2時間インキュベートした。次に、インスリンを、ラジオイムノアッセイにより、回収した培地およびインキュベートした膵島で、定量した。
図3に示すように、対照の膵島の刺激指数は、新生仔ブタ膵島では3.3であり、成年では3であった。GLP−1 Ser8を発現する膵島は改善を示したが、しかしながら、新生仔において4.4の刺激指数を有する対照のインスリン分泌と有意に異なるものではなく、成年の分泌に関しては効果がなかった(刺激指数:2.7)。M3R発現ベクターを膵島に感染させると、インスリンの分泌はさらに増加し、対照と比較した差異は有意であり、新生仔および成年の刺激数はそれぞれ、5.4および4.1であった。最終的に、実施例1に示される結果から予測されるように、GLP−1およびM3Rを同時発現する新生仔の膵島は、刺激指数が7.3であったため、インスリン分泌の観点から相乗的な応答を示した。また、この効果は、成年の膵島においても少ない度合ではあるが、観察された(刺激指数:5.5)。
また、グルコース誘導型のインスリン分泌に及ぼすトランスジェニックPKAおよびPKCの活性化の効果を、動的な膵島の灌流(perifusion)実験の間に試験した。対照のおよびウイルスで処理した成年の膵島を、0.2μmのフィルタで密閉した灌流チャンバーに入れた。膵島を、最初に、平衡のために30分間、1mMのグルコース(G1)のクレブス培地で灌流し、次に、2分ごとに培地を回収してG1中で10分間灌流し、次いで、G15で30分間刺激した。図4に示されるように、静的なインキュベーションでの本出願人の観察と一致して、GLP−1の発現は、急性インスリン分泌に関して実質的に効果を有さなかった。M3R発現は、グルコース誘導型インスリン分泌の両方の相を増加させたが、この増加は、成年ブタ膵島が、GLP−1およびM3Rを同時発現する場合ではより大きかった。
よって、これらの結果は、ブタ膵島細胞におけるPKA経路およびPKC経路の薬理学的な活性化を使用して得たデータを確認するものである。本出願人の結論は、ブタβ細胞において両経路を同時に活性化することが、機能を高めたブタの膵島を得るための最良の戦略であるとのことである。
Claims (15)
- PKC経路およびPKA経路が構成的に活性化されている、単離されたトランスジェニックブタβ細胞。
- 構成的に活性のあるアセチルコリン受容体、好ましくはムスカリン受容体、より好ましくはIII型ムスカリン受容体を含む、請求項1に記載の単離トランスジェニックブタβ細胞。
- 前記構成的に活性のあるIII型ムスカリン受容体が、配列番号4のアミノ酸配列、または配列番号4と少なくとも70%の配列同一性を有する配列を有する、請求項2に記載の単離トランスジェニックブタβ細胞
- GLP−1を発現する、請求項1〜3のいずれか1項に記載の単離トランスジェニックブタβ細胞。
- GLP1が、配列番号6のアミノ酸配列、または配列番号6と少なくとも70%の配列同一性を有する配列を有する、請求項4に記載の単離トランスジェニックブタβ細胞。
- 請求項1〜5のいずれか1項に記載のブタβ細胞を含む、単離トランスジェニックブタ膵島。
- 請求項1〜5のいずれか1項に記載の単離トランスジェニックブタβ細胞または請求項6に記載の単離トランスジェニックブタの膵島を得るためのex vivoでの方法であって、前記方法が、構成的に活性のあるIII型ムスカリン受容体をコードする核酸配列を含む発現ベクター、およびGLP―1をコードする核酸配列を含む発現ベクターを使用する、方法。
- 請求項7に記載の方法により得られた、単離トランスジェニックブタβ細胞または単離トランスジェニックブタ膵島。
- 請求項1〜5もしくは8のいずれか1項に記載の単離トランスジェニックブタβ細胞または請求項6もしくは8に記載の単離トランスジェニックブタ膵島を含む、トランスジェニックブタ。
- 請求項1〜5もしくは8のいずれか1項に記載の単離トランスジェニックブタβ細胞または請求項6もしくは8に記載の単離トランスジェニックブタ膵島を含む、デバイス。
- 前記単離トランスジェニックブタβ細胞または前記単離トランスジェニックブタ膵島が、アルギン酸塩組成物にカプセル化されている、請求項10に記載のデバイス。
- 膵内分泌部またはβ細胞の機能不全に関連する疾患、障害または病態を治療するための請求項1〜5もしくは8のいずれか1項に記載の単離トランスジェニックブタβ細胞または請求項6もしくは8に記載の単離トランスジェニックブタ膵島または請求項10もしくは11に記載のデバイス。
- 前記膵内分泌部またはβ細胞の機能不全に関連する疾患、障害または病態が、I型糖尿病、II型糖尿病、妊娠糖尿病、潜在性自己免疫性糖尿病、1.5型糖尿病、脂肪萎縮性糖尿病、若年発症成人型糖尿病、新生児糖尿病(たとえば持続性新生児糖尿病または一過性新生児糖尿病)、前糖尿病、ステロイド誘導型糖尿病、膵癌、特に、たとえば内分泌性膵腫瘍および膵性神経内分泌癌などの膵内分泌部癌を含む群から選択される、請求項12に記載の使用のための単離トランスジェニックブタβ細胞、単離トランスジェニックブタ膵島またはデバイス。
- その必要がある対象の血中グルコースレベルを調節するための請求項1〜5もしくは8のいずれか1項に記載の単離トランスジェニックブタβ細胞または請求項6もしくは8に記載の単離トランスジェニックブタ膵島または請求項10もしくは11に記載のデバイス。
- その必要がある対象の正常なインスリン分泌レベルを回復するための請求項1〜5もしくは8のいずれか1項に記載の単離トランスジェニックブタβ細胞または請求項6もしくは8に記載の単離トランスジェニックブタ膵島または請求項10もしくは11に記載のデバイス。
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