JP2020039326A - 間葉系幹細胞の凍害保護液とその利用 - Google Patents
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(1)細胞
本実施例に用いた細胞は、次の通りである。ヒト骨髄由来間葉系幹細胞(hMSC−BM)(Lonza、製品コード:PT−2501)、ヒト脂肪組織由来間葉系幹細胞(hMSC−AT)(PromoCell、製品コードC−12977)、ヒト新生児皮膚繊維芽細胞(NHDF−Neo)。
MSCGM BulletKit(Lonza、ref:PT−3001)をヒト骨髄由来間葉系幹細胞の培養に使用した。間葉系幹細胞増殖培地(PromoCell、製品コード:C−28009)をヒト脂肪組織由来間葉系幹細胞の培養に使用した。DMEM(L)(Thermo Fisher Scientific、ref:11885084)をNHDF−Neoの培養に使用した。
用いた凍害保護液は、以下の通りである(表1)。
(1)フリーザー(日本フリーザー VT−78HC)
−80℃または−60℃に設定して使用した(実際の温度は、設定温度±2℃程度)。
予め4℃に冷却した状態で使用した。使用前に重量がカタログ値である190g〜200gに収まっている事を確認した。
トリパンブルー染色法で500μLのサンプルを染色した後、サンプルを50回に分けて測定し、その生細胞密度及び生存率の平均値を算出した。
各種細胞を解凍して培養を開始し数継代を実施した後に、対数増殖期の細胞を回収し、1x106cells/mLの密度でCP−1若しくは対照(10%DMSO、4% HSA)で凍結した。凍結には日本フリーザー社のBICELLを使用し、−80℃フリーザーにて緩慢凍結を実施した。緩慢凍結24時間後に細胞をLN2タンクに移動させ、そのままLN2タンクで1週間以上保存した後、細胞を各温度に設定したフリーザー(−80、−60℃)へ移動させた。フリーザーで一定期間(例えば、1週間)保存した後に各細胞を解凍し、解凍直後生存率、24時間後の生存率及び培養器への接着率等を確認した。
15mL遠心管に、9mLの培地(w/10%FBS)を分注した(洗浄用培地)。LN2タンクで保管していた細胞を37℃水浴にて振盪解凍した。解凍した細胞全量を洗浄用培地へ加え、遠心した(500g、5分間、室温)。上清をアスピレートし、ペレットをタッピングした。ペレットに培地(w/10%FBS)を5mL加え、Vi−CELL XRでセルカウントした(550μL使用)。細胞を適切な密度でフラスコに播種し、37℃、5%CO2にて、インキュベーターで培養した。
フラスコから培地をアスピレートした。細胞にD−PBS(−)を適量加え、洗浄した。D−PBS(−)をアスピレートし、0.25%トリプシンを適量加えた。ここで、顕微鏡下で細胞の剥離を確認しつつトリプシン反応時間を調整した。フラスコを軽く叩き、細胞をフラスコから剥離させ、培地(w/10%FBS)を適量加えた。細胞全量を15mL遠心管に回収し、遠心(500g、5分、室温)を行った。上清をアスピレートし、ペレットをタッピングした。ペレットに培地(w/10%FBS)を適量加え、Vi−CELL XRでセルカウントした(550μL使用)。適切な密度で細胞をフラスコに播種し、37℃、5%CO2にて、インキュベーターで培養した。
フラスコから培地をアスピレートした。細胞にD−PBS(−)を適量加え、洗浄した。D−PBS(−)をアスピレートし、0.25%トリプシンを適量加えた。ここで、顕微鏡下で細胞の剥離を確認しつつトリプシン反応時間を調整した。フラスコを軽く叩き、細胞をフラスコから剥離させた。細胞に培地(w/10%FBS)を適量を加えた。空になったフラスコに培地(w/10%FBS)を適量加え、洗浄した。細胞全量を遠心管に回収し、セルカウントした(550μL使用)。凍結に必要な細胞量(1x106cells/cryotube)を2本の遠心管に分注し、遠心(500g、5分、室温)を行った。上清をアスピレートし、ペレットをタッピングした。ペレットにCP−1若しくは対照を加え、1x106cells/mLの密度にした。細胞を1mLずつクライオチューブに分注した。予め4℃に冷やしておいたBICELLにクライオチューブを入れ、−80℃フリーザーにて緩慢凍結した。24時間後、凍結した細胞をLN2タンクへ移動させた。
LN2タンクで1週間以上保存した細胞を、−60℃に設定したフリーザーに移動し、そのまま1週間静置した。
15mL遠心管に9mLの培地(w/10%FBS)を分注した(洗浄用培地)。−60℃で一定期間保存した細胞を37℃温水浴にて振盪解凍した。解凍した細胞全量を洗浄用培地へ加え、遠心(500g、5分、室温)を行った。上清をアスピレートし、ペレットをタッピングした。ペレットに培地(w/10%FBS)を5mL加え、Vi−CELL XRでセルカウントした(550μL使用)。細胞を適切な密度でフラスコに播種し、37℃、5%CO2にて、インキュベーターで培養した。
顕微鏡接続カメラで細胞像を記録した。フラスコ内の培地をアスピレートし、細胞にD−PBS(−)を適量加え、洗浄した。D−PBS(−)をアスピレートし、0.25%トリプシンを適量加えた。ここで、顕微鏡下で細胞の剥離を確認しつつトリプシン反応時間を調整した。フラスコを軽く叩き、細胞をフラスコから剥離させ、細胞に培地(w/10%FBS)を適量を加えた。空になったフラスコに培地(w/10%FBS)を適量加え、洗浄した。細胞全量を遠心管に回収し、遠心(500g、5分、室温)を行った。上清をアスピレートし、ペレットをタッピングした。ペレットに培地(w/10%FBS)を加え、Vi−CELl XRでセルカウントした。生存率及び生細胞数、接着率(接着細胞数/播種細胞数x100)を記録した。
各細胞ともCP−1若しくは対照で凍結したどちらの条件においても、LN2タンク内保存と比較して、−60℃に設定したフリーザーで保存後に生存率が急激に減少することは無かった(表2)。
Claims (6)
- ヒドロキシルエチルデンプン及びジメチルスルホキシドを有効成分とする、間葉系幹細胞を凍害から保護するための溶液。
- 間葉系幹細胞を凍結保存する方法であって、間葉系幹細胞を、ヒドロキシルエチルデンプン及びジメチルスルホキシドを含む溶液に懸濁して凍結させることを特徴とする方法。
- 溶液が、さらに、血清アルブミンまたは血清を含む、請求項2に記載の方法。
- 間葉系幹細胞の凍結細胞を輸送する方法であって、当該凍結細胞がヒドロキシルエチルデンプン及びジメチルスルホキシドを含む溶液中で凍結されたものであり、当該輸送における当該凍結細胞の温度を−80℃よりも高い温度とする方法。
- 溶液が、さらに、血清アルブミンまたは血清を含む、請求項4に記載の方法。
- 輸送における当該凍結細胞の冷却手段としてドライアイスを利用する、請求項4に記載の方法。
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CN112391342A (zh) * | 2020-12-07 | 2021-02-23 | 山东省齐鲁干细胞工程有限公司 | 一种脐带血干细胞高效复苏方法 |
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Non-Patent Citations (1)
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