CN112391342A - 一种脐带血干细胞高效复苏方法 - Google Patents

一种脐带血干细胞高效复苏方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种脐带血干细胞高效复苏方法，包括以下操作步骤：(1)将脐带血复苏保护液预冷处理，然后将冻存脐带血从液氮罐里取出，将脐带血放入水浴锅中缓慢摇晃水浴复苏；(2)将融化后的复苏脐带血加入至复苏保护液中，进行离心；(3)离心后吸弃上清，去除红细胞与冻存液后再次加入复苏保护液，再次离心；(4)离心后吸弃上清，去除红细胞后加入复苏保护液重悬，取样记录细胞活率并计数；(5)继续向其中加入复苏保护液进行离心、弃上清，将复苏后的脐带血干细胞加入培养基中培养。本发明提供的一种脐带血干细胞高效复苏方法，可保证脐带血干细胞在复苏的过程中具有较高的成活率，有效的提升了脐带血干细胞复苏后的活性。

Description

一种脐带血干细胞高效复苏方法
技术领域
本发明属于临床用脐带血干细胞处理技术领域，具体涉及一种脐带血干细胞高效复苏方法。
背景技术
干细胞(stem cells,SC)是一类具有自我复制能力(self-renewing)的多潜能细胞，在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞，医学界称为“万能细胞”。脐带血是胎儿娩出、脐带结扎并离断后残留在胎盘和脐带中的血液，通常是废弃不用的。每个婴儿脐带中的血液里含有大量的干细胞，是成体干细胞的主要来源之一。上世纪70年代发现脐带血中富含干细胞，特别是造血干细胞含量可与骨髓相媲美，可代替骨髓进行干细胞移植，治疗白血病、再生障碍性贫血等疾病。与骨髓干细胞和外周血干细胞相比，新生儿脐带血干细胞的异体排斥反映小，免疫原性低，再生能力和速度是前者的10—20倍。另外，脐带血中也含有间充质干细胞(MSC)，可以分化为皮肤、肌肉、骨髓、心肌、神经细胞等，因此，脐带血已成为造血干细胞的重要来源，是一种非常重要的人类生物资源，脐带血复苏保存液具有显著的意义和作用。
脐带血富含大量的造血干细胞，可代替骨髓进行干细胞移植。目前医学上可治疗的疾病超过80余种，现用的脐带血复苏保护液仅仅只是维持细胞的渗透压，不能很好地维持细胞状态，其复苏后与冻存前比较，细胞数量差距较大，因此探究一种高效且不含任何动物源成分的可对细胞进行保护，减少细胞碎裂的脐带血复苏保护液，具有良好的应用前景和经济效益。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有良好复苏效果、高效且不含任何动物源成分的脐带血干细胞高效复苏方法。
本发明是通过以下技术方案实现的。
一种脐带血干细胞高效复苏方法，包括以下操作步骤：
(1)为了减少与融化状态的脐带血的温度差，将脐带血复苏保护液预冷处理，然后将冻存脐带血从液氮罐里取出，水浴锅预热至35-40℃，将脐带血放入水浴锅中缓慢摇晃水浴复苏，所述复苏保护液由以下重量份的组分制成：40-60份人血白蛋白、410-420份右旋糖酐、20-28份果糖二磷酸钠、75-85份PBS缓冲液；
(2)将融化后的复苏脐带血加入至复苏保护液中，并进行离心；
(3)离心后吸弃上清，去除红细胞与冻存液后再次加入复苏保护液，再次进行离心；
(4)离心后吸弃上清，去除红细胞后加入复苏保护液重悬，取样记录细胞活率并计数；
(5)继续向其中加入复苏保护液进行离心、弃上清，重复上述步骤3-5次后，将复苏后的脐带血干细胞加入培养基中培养。
具体地，上述步骤(1)中，预冷处理的温度为3-5℃，预冷处理的时间为25-35min。
具体地，上述步骤(2)中，复苏保护液的体积为复苏脐带血体积的1.5-2.5倍。
具体地，上述步骤(2)至步骤(5)中，离心时离心机的转速为1400-1600r/min，离心时间为8-12min，离心时的温度为3-5℃。
具体地，上述步骤(4)中，取样计数的具体操作为：取出1ml细胞悬液至EP管中进行台盼蓝染色计数，记录细胞活率并按照计数结果。
由以上的技术方案可知，本发明的有益效果是：
本发明提供的一种脐带血干细胞高效复苏方法，操作简单高效，可保证脐带血干细胞在复苏的过程中具有较高的成活率，有效的提升了脐带血干细胞复苏后的活性。其中，本发明提供的复苏保护液，右旋糖酐、果糖二磷酸钠的添加，能有效的提升细胞的活性，能有效的避免细胞在温度变化时，由于温差的变化对细胞的活力造成损失；本发明在离心的过程中，加入复苏保护液对脐带血干细胞进行保护，能有效的避免离心过程对脐带血干细胞造成物理损伤，进而造成细胞活力下降。
附图说明
图1为实施例1复苏后的脐带血干细胞利用流式细胞仪进行凋亡检测的结果。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售获得的常规产品。
实施例1
一种脐带血干细胞高效复苏方法，包括以下操作步骤：
(1)为了减少与融化状态的脐带血的温度差，将脐带血复苏保护液在3℃的温度下预冷处理25min，然后将冻存脐带血从液氮罐里取出，水浴锅预热至35℃，将脐带血放入水浴锅中缓慢摇晃水浴复苏，所述复苏保护液由以下重量份的组分制成：40份人血白蛋白、410份右旋糖酐、20份果糖二磷酸钠、75份PBS缓冲液；
(2)将融化后的复苏脐带血加入至其体积1.5倍的复苏保护液中，并进行离心，离心时离心机的转速为1400r/min，离心时间为8min，离心时的温度为3℃；
(3)离心后吸弃上清，去除红细胞与冻存液后再次加入复苏保护液，再次进行离心，离心时离心机的转速为1400r/min，离心时间为8min，离心时的温度为3℃，；
(4)离心后吸弃上清，去除红细胞后加入复苏保护液重悬，取出1ml细胞悬液至EP管中进行台盼蓝染色计数，记录细胞活率并按照计数结果；
(5)继续向其中加入复苏保护液进行离心、弃上清，离心时离心机的转速为1400r/min，离心时间为8min，离心时的温度为3℃，重复上述步骤3次后，将复苏后的脐带血干细胞加入培养基中培养。
实施例2
一种脐带血干细胞高效复苏方法，包括以下操作步骤：
(1)为了减少与融化状态的脐带血的温度差，将脐带血复苏保护液在4℃的温度下预冷处理30min，然后将冻存脐带血从液氮罐里取出，水浴锅预热至38℃，将脐带血放入水浴锅中缓慢摇晃水浴复苏，所述复苏保护液由以下重量份的组分制成：50份人血白蛋白、415份右旋糖酐、24份果糖二磷酸钠、80份PBS缓冲液；
(2)将融化后的复苏脐带血加入至其体积2.0倍的复苏保护液中，并进行离心，离心时离心机的转速为1500r/min，离心时间为10min，离心时的温度为4℃；
(3)离心后吸弃上清，去除红细胞与冻存液后再次加入复苏保护液，再次进行离心，离心时离心机的转速为1500r/min，离心时间为10min，离心时的温度为4℃，；
(4)离心后吸弃上清，去除红细胞后加入复苏保护液重悬，取出1ml细胞悬液至EP管中进行台盼蓝染色计数，记录细胞活率并按照计数结果；
(5)继续向其中加入复苏保护液进行离心、弃上清，离心时离心机的转速为1500r/min，离心时间为10min，离心时的温度为4℃，重复上述步骤4次后，将复苏后的脐带血干细胞加入培养基中培养。
实施例3
一种脐带血干细胞高效复苏方法，包括以下操作步骤：
(1)为了减少与融化状态的脐带血的温度差，将脐带血复苏保护液在5℃的温度下预冷处理35min，然后将冻存脐带血从液氮罐里取出，水浴锅预热至40℃，将脐带血放入水浴锅中缓慢摇晃水浴复苏，所述复苏保护液由以下重量份的组分制成：60份人血白蛋白、420份右旋糖酐、28份果糖二磷酸钠、85份PBS缓冲液；
(2)将融化后的复苏脐带血加入至其体积2.5倍的复苏保护液中，并进行离心，离心时离心机的转速为1600r/min，离心时间为12min，离心时的温度为5℃；
(3)离心后吸弃上清，去除红细胞与冻存液后再次加入复苏保护液，再次进行离心，离心时离心机的转速为1600r/min，离心时间为12min，离心时的温度为5℃，；
(4)离心后吸弃上清，去除红细胞后加入复苏保护液重悬，取出1ml细胞悬液至EP管中进行台盼蓝染色计数，记录细胞活率并按照计数结果；
(5)继续向其中加入复苏保护液进行离心、弃上清，离心时离心机的转速为1600r/min，离心时间为12min，离心时的温度为5℃，重复上述步骤5次后，将复苏后的脐带血干细胞加入培养基中培养。
对比例1
步骤(1)中，复苏保护液中不含有果糖二磷酸钠，其余操作步骤与实施例1完全相同。
对比例2
步骤(2)中离心时，将复苏保护液替换为等量的生理盐水，其余操作步骤与实施例2完全相同。
分别用各实施例和对比例的方法对脐带血干细胞进行高效复苏，然后检测复苏后细胞活率，试验结果如表1所示：
表1脐带血干细胞复苏后活率
项目 细胞活率，％
实施例1 93
对比例1 81
实施例2 94
对比例2 85
实施例3 96
由表1可知，本发明提供的脐带血干细胞高效复苏方法，可有效的提升脐带血干细胞复苏后的活率。
将实施例1复苏后的脐带血干细胞利用流式细胞仪进行凋亡检测，检测结果如图1所示，复苏后的间充质干细胞细胞，死亡细胞少，凋亡老化细胞较少，细胞状态好。
通过血细胞计数仪检测淋巴细胞数量，将实施例1复苏前的淋巴细胞数与复苏后的淋巴细胞数进行对比，计算回收的比例，如表2所示，发现本实施例的淋巴细胞回收率高，细胞损伤较小，可以达到70％以上，而对比例的淋巴细胞回收率仅有54％左右，进一步验证实施例1的方法对细胞复苏具有保护作用。
表2淋巴细胞回收率高
Figure BDA0002820055510000071
Figure BDA0002820055510000081
当然，上述说明并非是对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例，本技术领域的普通技术人员，在本发明的实质范围内，作出的变化、改变、添加或替换，都应属于本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种脐带血干细胞高效复苏方法，其特征在于，包括以下操作步骤：
(1)将脐带血复苏保护液预冷处理，然后将冻存脐带血从液氮罐里取出，水浴锅预热至35-40℃，将脐带血放入水浴锅中缓慢摇晃水浴复苏，所述复苏保护液由以下重量份的组分制成：40-60份人血白蛋白、410-420份右旋糖酐、20-28份果糖二磷酸钠、75-85份PBS缓冲液；
(2)将融化后的复苏脐带血加入至复苏保护液中，并进行离心；
(3)离心后吸弃上清，去除红细胞与冻存液后再次加入复苏保护液，再次进行离心；
(4)离心后吸弃上清，去除红细胞后加入复苏保护液重悬，取样记录细胞活率并计数；
(5)继续向其中加入复苏保护液进行离心、弃上清，重复上述步骤3-5次后，将复苏后的脐带血干细胞加入培养基中培养。
2.根据权利要求1所述的一种脐带血干细胞高效复苏方法，其特征在于，上述步骤(1)中，预冷处理的温度为3-5℃，预冷处理的时间为25-35min。
3.根据权利要求1所述的一种脐带血干细胞高效复苏方法，其特征在于，上述步骤(2)中，复苏保护液的体积为复苏脐带血体积的1.5-2.5倍。
4.根据权利要求1所述的一种脐带血干细胞高效复苏方法，其特征在于，上述步骤(2)至步骤(5)中，离心时离心机的转速为1400-1600r/min，离心时间为8-12min，离心时的温度为3-5℃。
5.根据权利要求1所述的一种脐带血干细胞高效复苏方法，其特征在于，上述步骤(4)中，取样计数的具体操作为：取出1ml细胞悬液至EP管中进行台盼蓝染色计数，记录细胞活率并按照计数结果。
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