ES2700160T3 - Anticuerpos humanos contra GFR 3 y métodos de uso de los mismos - Google Patents

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Lynn Macdonald
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Abstract

Un anticuerpo aislado o fragmento de unión al antígeno del mismo que se une específicamente a GFRα3 humano, en el que el anticuerpo comprende las tres CDR de cadena pesada (HCDR1, HCDR2 y HCDR3) y las tres CDR de cadena ligera (LCDR1, LCDR2 y LCDR3) contenidas en un par de secuencias de aminoácidos de HCVR/LCVR seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NO: 2/10, 18/26, 34/42, 50/58, 66/74, 82/90, 98/106, 114/122, 130/138, 146/154, 162/170, 178/186, 194/202, 210/218, 226/234, 242/250, 258/266, 274/282, 290/298, 306/314, 322/330, 338/346, 354/362, 381/389 y 397/405.

Description

DESCRIPCIÓN
Anticuerpos humanos contra GFR 3 y métodos de uso de los mismos
Campo de la invención
La presente invención se refiere a anticuerpos humanos y a fragmentos de unión al antígeno de anticuerpos humanos que se unen específicamente al receptor alfa 3 de la familia del factor neurotrófico humano derivado de la estirpe de células gliales (GDNF) (GFRa3), y a los usos terapéuticos de esos anticuerpos.
Exposición de la técnica relacionada
La familia relacionada con el factor neurotrófico derivado de la estirpe de células gliales se compone del factor neurotrófico derivado de la estirpe de células gliales (GDNF), la neurturina (NRTN), la artemina (ARTN) y la persefina (PSPN). Cada miembro de la familia del GDNF se une a un receptor anclado a glicosilfosfatidilinositol (GPI) asociado con la membrana plasmática. Esta familia de receptores se conoce como los receptores alfa de la familia del GDNF (GFRa). Esta familia de receptores se compone de cuatro receptores GFRa diferentes, GFRa1-4. El GDNF se une preferentemente a GFRa1, la NRTN se une preferentemente a GFRa2, la ARTN se une preferentemente a GFRa3, y la PSPN se une preferentemente a GFRa4. Cada ligando de la familia de GDNF señaliza a través del receptor tirosina quinasa RET ("reorganizado durante la transfección"), que se descubrió por primera vez como un protooncogén. El RET es activado por los miembros de la familia de GDNF solo si el ligando se une primero a su receptor GFRa (Airaksinen, M. S., et al. Nature Reviews Neuroscience (2002), 3:383-394).
Tanto la ARTN como el GFRa3 se expresan a un nivel alto durante el desarrollo y participan en el desarrollo del sistema nervioso simpático. En los adultos, la expresión de GFRa3 se limita en gran medida a las neuronas sensoriales de los ganglios de la raíz dorsal (DRG) (Orozco, O. E., et al., European J. Neuroscience, (2001), 13:2177-2182). En el ratón adulto, la artemina se expresa en los testículos, el útero, la tiroides, la próstata y el epidídimo, así como en los bulbos olfatorios y en las arteriolas del intestino y el mesenterio (Airaksinen, M. S., et al. Nature Reviews Neuroscience (2002), 3:383-394; Airaksinen, M. S. et al., “Brain, Behavior and Evolution”, (2006), 68:181-190).
En varios estudios, se ha demostrado un posible papel del GFRa3 y de la artemina en la hiperalgesia. Por ejemplo, se ha demostrado que una inyección de la proteína artemina en la pata trasera de un roedor causó hiperalgesia térmica, y que esta nocicepción se mejoró al inyectarse artemina junto con NGF (Malin, S. A., et al., J. Neuroscience, (2006), 26(33): 8588-8599). Otros estudios mostraron que la expresión del ARNm de la artemina estaba regulada positivamente en un modelo inflamatorio murino (Elitt, C. M., et al., J. Neuroscience, (2006), 26(33): 8578-8587). Además, otros estudios mostraron que los ratones transgénicos para la artemina tienen una expresión elevada de TRPV1 y TRPA1, y tienen una mayor sensibilidad conductual hacia el calor y el frío (Elitt, C. M., et al., J. Neuroscience, (2006), 26(33): 8578-8587). Además, se ha demostrado un posible papel de GFRa3 en la hipersensibilidad visceral mediante los estudios de ratones con desactivación de GFRa3, mediante el que estos ratones mostraron atenuación de la hipersensibilidad visceral tras el tratamiento intracolónico con TNBS (ácido 2,4,6-trinitrobenceno-sulfónico) en comparación con ratones C57BL/6 de tipo silvestre (Tanaka, T., et al., Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. (2011), 300:G418-G424). También se ha demostrado un posible papel de la artemina y de su receptor GFRa3 en el dolor asociado con la pancreatitis mediante un estudio realizado en pacientes sometidos a resección de la cabeza pancreática (Ceyhan, G. O., et al., Gut, (2007), 56:534-544). Basándose en lo anterior, se requieren estudios adicionales para determinar si los pacientes que padecen dolor/hiperalgesia e/o hipersensibilidad podrían beneficiarse del tratamiento con un inhibidor de la actividad de GFRa3.
Los anticuerpos que se unen a GFRa3 se describen en el documento US 6.861.509. Además, el documento US 6.677.135 desvela una secuencia de GFRa3 de longitud completa, mientras que, en los documentos US 7.026.138; US2007/0232535 y US2006/0216289, se describen variantes de corte y empalme de la molécula de GFRa3. El documento US 7.138.251 desvela secuencias que tienen una identidad del 99 % con GFRa3 de longitud completa, y, en dicha patente, se describe la preparación de anticuerpos monoclonales humanizados contra esta molécula. El documento WO2006/138721 se refiere a un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo que se une selectivamente a GFRa3 e inhibe la formación de un complejo ternario de neublastina-GFRa3-Ret.
Breve sumario de la invención
En el presente documento, se describen anticuerpos monoclonales (mAb) completamente humanos y sus fragmentos de unión al antígeno, que se unen a GFRa3 humano e inhiben o bloquean su actividad, por ejemplo, bloquean la unión de GFRa3 al factor neurotrófico derivado de la estirpe de células gliales, a la artemina, y bloqueando posiblemente la activación subsiguiente del receptor tirosina quinasa RET y/o bloqueando la señalización a través de RET y/o bloqueando la señalización a través de un mediador distinto de r Et . Los anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno de los mismos pueden ser útiles para tratar la hiperalgesia, la alodinia y/o la hipersensibilidad hacia cualquier estímulo sensorial, incluyendo, pero sin limitación, la presión, el calor y/o el frío. Los anticuerpos también pueden usarse para tratar el dolor/la hipersensibilidad asociados con una amplia selección de afecciones y trastornos en los que se desee bloquear la interacción de GFRa3 con la artemina. Los anticuerpos también pueden usarse para inhibir el crecimiento, la proliferación y/o la metástasis de las células tumorales.
En un primer aspecto, la invención proporciona un anticuerpo aislado o un fragmento de unión al antígeno del mismo que se une específicamente al GFRa3 humano, en el que el anticuerpo comprende las tres CDR de cadena pesada (HCDR1, HCDR2 y HCDR3) y las tres CDR de cadena ligera (LCDR1 , LCDR2 y LCDR3) contenidas en un par de secuencias de aminoácidos de HCVR/LCVR seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NO: 2/10, 18/26, 34/42, 50/58, 66/74, 82/90, 98/106, 114/122, 130/138, 146/154, 162/170, 178/186, 194/202, 210/218, 226/234, 242/250, 258/266, 274/282, 290/298, 306/314, 322/330, 338/346, 354/362, 381/389 y 397/405.
En una realización, el anticuerpo aislado o fragmento de unión al antígeno comprende un par de secuencias de aminoácidos de HCVR/LCVR seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NO: 2/10, 18/26, 34/42, 50/58, 66/74, 82/90, 98/106, 114/122, 130/138, 146/154, 162/170, 178/186, 194/202, 210/218, 226/234, 242/250, 258/266, 274/282, 290/298, 306/314, 322/330, 338/346, 354/362, 381/389 y 397/405.
En una realización, el anticuerpo aislado o fragmento de unión al antígeno comprende un par de secuencias de aminoácidos de HCVR/LCVR seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NO: 50/58, 146/154, 210/218 y 290/298.
En una realización, el anticuerpo monoclonal aislado o un fragmento de unión al antígeno que se une específicamente al GFRa3 humano tiene una o más de las siguientes características:
(i) presenta una Kd que varía de aproximadamente 10-8 M a aproximadamente 10-13 M medida mediante resonancia de plasmón superficial;
(ii) demuestra la capacidad de bloquear aproximadamente el 50-100 % de la unión de GFRa3 a su ligando, la artemina, con un valor de CI50 que varía de aproximadamente 40 pM a aproximadamente 15 nM;
(iii) demuestra la capacidad de bloquear entre el 20 % y el 100 % de la unión de GFRa3 a un soporte sólido recubierto con una mezcla de artemina y RET;
(iv) bloquea o inhibe la activación de RET dependiente de la artemina con una CI50 que varía de aproximadamente 200 pM a aproximadamente 50 nM;
(v) inhibe o reduce una o más respuestas nociceptivas en un modelo in vivo de dolor por cáncer de huesos; (vi) inhibe o reduce la hiperalgesia térmica sensibilizada con artemina in vivo; o
(vii) inhibe o reduce la alodinia en un modelo in vivo de artrosis; no reacciona de forma cruzada con otros receptores conjuntos GFR para RET (viii).
En una realización, la invención proporciona un anticuerpo monoclonal aislado o fragmento de unión al antígeno de la invención, en la que:
(a) el anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado y un anticuerpo humano; y/o
(b) el anticuerpo no reacciona de forma cruzada con GFRa1 humano o GFRa2 humano; y/o
(c) el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal humano que comprende (a) una región variable de cadena pesada (HCVR) que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 2, 18, 34, 50, 66, 82, 98, 114, 130, 146, 162, 178, 194, 210, 226, 242, 258, 274, 290, 306, 322, 338, 354, 381 y 397; y (b) una región variable de cadena ligera (LCVR) que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 122, 138, 154, 170, 186, 202, 218, 234, 250, 266, 282, 298, 314, 330, 346, 362, 389 y 405.
En una realización, la invención proporciona un anticuerpo monoclonal aislado o fragmento de unión al antígeno de la invención, en la que:
(a) el anticuerpo demuestra la capacidad de bloquear aproximadamente el 50-95 % de la unión de GFRa3 humano a su ligando, la artemina, con un valor de CI50 que varía de aproximadamente 40 pM a aproximadamente 750 pM; (b) el anticuerpo o el fragmento de unión al antígeno del mismo bloquea aproximadamente el 75-100 % de la unión de GFRa3 humano a su ligando, la artemina, con un valor de CI50 que varía de aproximadamente 400 pM a aproximadamente 15 nM;
(c) el anticuerpo o el fragmento de unión al antígeno del mismo bloquea o inhibe la activación dependiente de la artemina de RET humano con una CI50 que varía de aproximadamente 300 pM a aproximadamente 5 nM; o (d) el anticuerpo o el fragmento de unión al antígeno del mismo bloquea o inhibe la activación dependiente de la artemina de RET de macaco cangrejero con una CI50 que varía de aproximadamente 0,7 nM a aproximadamente 2,5 nM.
En otro aspecto, la invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que codifica el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de la invención.
En otro aspecto, la invención proporciona un vector de expresión que comprende la molécula de ácido nucleico de la invención.
En otro aspecto, la invención proporciona un método para producir un anticuerpo anti-GFRa3 o un fragmento de unión al antígeno del mismo que comprende las etapas de introducir el vector de expresión de la invención en una célula hospedadora aislada, cultivar la célula en condiciones que permitan la producción del anticuerpo o fragmento del mismo, y recoger el anticuerpo así producido.
En otro aspecto, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo de la invención y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.
En otro aspecto, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de la invención y un segundo agente terapéutico seleccionado del grupo que consiste en un opioide, un inhibidor de COX2, un anestésico local, un modulador de NMDA, un agonista del receptor cannabinoide, un modulador de la familia de P2X, un antagonista de VR1, un antagonista de la sustancia P, un antagonista del segundo GFRa3, un antagonista de citocinas o de receptor de citocinas, un inhibidor del factor de crecimiento nervioso (NGF) (un inhibidor de bajo peso molecular o un anticuerpo anti-NGF), un inhibidor de BDNF, TrkA, TrkB o p75, aspirina, un AINE, un esteroide, morfina, un inhibidor selectivo de la recaptación de serotonina (ISRS), un inhibidor de la recaptación de serotonina y norepinefrina (SNRI), un tricíclico, un inhibidor de un canal de sodio controlado por tensión (Nav), un inhibidor de los canales de calcio, un inhibidor de los canales de potasio, un factor de necrosis tumoral (TNF) o inhibidor del receptor de TNF, un inhibidor de TWEAK (inductor de apóptosis WEAK relacionado con TNF), un inhibidor de RET, un inhibidor de un ligando de la familia de GDNF, un inhibidor de GFRa1, GFRa2 o GFRa4, un inhibidor de un canal iónico de detección de ácido (ASIC1 o ASIC3), un anticonvulsivo (gabapentina o pregabalina), un inhibidor de un receptor de prequineticina (PROK1 y PROK2), un inhibidor de caspasa, un inhibidor de p38, un inhibidor de IKK1/2, CTLA-4Ig y un corticosteroide; y un vehículo o vehículo farmacéuticamente aceptable; opcionalmente, en el que el segundo antagonista de GFRa3 es una pequeña molécula orgánica, un antagonista de polipéptido, un segundo anticuerpo específico de GFRa3, un ARNip o una molécula antisentido específica de GFRa3; o en el que el antagonista de citocinas o del receptor de citocinas es un antagonista de interleucina-1 (IL-1), un antagonista de IL-6 y un antagonista de IL-18.
En otro aspecto, la invención proporciona el anticuerpo aislado o su fragmento de unión al antígeno de la invención, o la composición farmacéutica de la invención, para su uso en el tratamiento de una afección o enfermedad relacionada con GFRa3, o el dolor asociado con la afección o enfermedad relacionada con GFRa3, en el que la afección o enfermedad relacionada con GFRa3 se previene, se mejora o se reduce su gravedad o frecuencia de aparición, o el dolor asociado con la afección o enfermedad se previene, se mejora o se reduce su gravedad o frecuencia de aparición;
en el que la afección o enfermedad relacionada con GFRa3 se selecciona del grupo que consiste en dolor agudo, dolor crónico, dolor neuropático, dolor inflamatorio, un síndrome de dolor funcional, artritis, pancreatitis, artrosis, dolor articular, cefaleas en racimo, neuralgia del trigémino, neuralgia herpética, neuralgias generales, trastornos neurodegenerativos, trastornos del movimiento, trastornos neuroendocrinos, ataxia, dolor visceral, gota, neuralgia posherpética, neuropatía diabética, ciática, dolor de espalda, dolor de cabeza o cuello, dolor intenso o intratable, dolor irruptivo, dolor postoperatorio, eritromelalgia hereditaria, dolor dental, rinitis, dolor oncológico, síndrome de dolor regional complejo ( CRPS), enfermedad inflamatoria del intestino (por ejemplo, enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa) y trastornos de la vejiga.
En una realización, el síndrome de dolor funcional se selecciona del grupo que consiste en dolor lumbar crónico, síndrome del intestino irritable (SII), fibromialgia (FM), síndrome de fatiga crónica, dolor abdominal, trastorno de la articulación temporomandibular (TMJD), síndrome de vejiga dolorosa (cistitis intersticial), trastornos/síndromes gastrointestinales funcionales, síndrome de dolor torácico funcional, migrañas y cefaleas de tipo tensional, síndrome de dolor pélvico crónico, síndrome de próstata dolorosa (prostatitis crónica), síndrome de sensibilidad química múltiple y síndrome de la Guerra del Golfo; o el dolor oncológico se asocia con un cáncer seleccionado del grupo que consiste en cáncer de endometrio, cáncer de próstata, cáncer de mama, cáncer de cuello uterino, cáncer de hígado, cáncer pancreático, cáncer de colon, cáncer de estómago, cáncer de útero, cáncer de ovarios, cáncer de riñón, cáncer de pulmón no microcítico, cáncer de cerebro, una leucemia, un linfoma, cáncer de huesos y dolor asociado con la metástasis de un cáncer.
En una realización, el anticuerpo, el fragmento de unión al antígeno o la composición farmacéutica para su uso en el tratamiento de una afección o enfermedad relacionada con GFRa3, o el dolor asociado con la afección o enfermedad relacionada con GFRa3, es para la administración a un paciente en combinación con un segundo agente terapéutico; en el que dicho segundo agente terapéutico se selecciona opcionalmente del grupo que consiste en un opioide, un inhibidor de COX-2, un anestésico local, un modulador de NMDa , un agonista del receptor cannabinoide, un modulador de la familia de P2X, un antagonista de VR1, un antagonista de la sustancia P, un antagonista del segundo GFRa3, un antagonista de citocinas o de receptor de citocinas, un inhibidor del factor de crecimiento nervioso (NGF) (un inhibidor de bajo peso molecular o un anticuerpo anti-NGF), un inhibidor de BDNF, TrkA, TrkB o p75, aspirina, un AINE, un esteroide, morfina, un inhibidor selectivo de la recaptación de serotonina (ISRS), un inhibidor de la recaptación de serotonina y norepinefrina (SNRI), un tricíclico, un inhibidor de un canal de sodio controlado por tensión (Nav), un inhibidor de los canales de calcio, un inhibidor de los canales de potasio, un factor de necrosis tumoral (TNF) o inhibidor del receptor de TNF, un inhibidor de TWEAK (inductor de apóptosis WEAK relacionado con TNF), un inhibidor de RET, un inhibidor de un ligando de la familia de GDNF, un inhibidor de GFRa1, GFRa2 o GFRa4, un inhibidor de un canal iónico de detección de ácido (ASIC1 o ASIC3), un anticonvulsivo (gabapentina o pregabalina), un inhibidor de un receptor de prequineticina (PROK1 y PROK2), un inhibidor de caspasa, un inhibidor de p38, un inhibidor de IKK1/2, CTLA-4Ig y un corticosteroide; y un vehículo o vehículo farmacéuticamente aceptable; opcionalmente, en el que el segundo antagonista de GFRa3 es una pequeña molécula orgánica, un antagonista de polipéptido, un segundo anticuerpo específico de GFRa3, un ARNip o una molécula antisentido específica de GFRa3; o en el que el antagonista de citocinas o del receptor de citocinas es un antagonista de interleucina-1 (IL-1), un antagonista de IL-6 y un antagonista de IL-18.
En una realización, el anticuerpo monoclonal aislado o un fragmento de unión al antígeno del mismo se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo murino, quimérico, humanizado y humano.
En una realización, el anticuerpo monoclonal aislado o un fragmento de unión al antígeno del mismo no reacciona de forma cruzada con GFRa1 humano ni con GFRa2 humano.
Un anticuerpo monoclonal aislado o un fragmento de unión al antígeno del mismo descrito en el presente documento puede comprender (a) una región variable de cadena pesada (HCVR) que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 2, 18, 34, 50, 66, 82, 98, 114, 130, 146, 162, 178, 194, 210, 226, 242, 258, 274, 290, 306, 322, 338, 354, 381 y 397; (b) una región variable de cadena ligera (LCVR) que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 122, 138, 154, 170, 186, 202, 218, 234, 250, 266, 282, 298, 314, 330, 346, 362, 389 y 405.
En una realización, el anticuerpo monoclonal aislado o un fragmento de unión al antígeno del mismo demuestra la capacidad de bloquear aproximadamente el 50-95 % de la unión de GFRa3 humano a su ligando, la artemina, con un valor de CI50 que varía de aproximadamente 40 pM a aproximadamente 750 pM.
En una realización, el anticuerpo monoclonal aislado o un fragmento de unión al antígeno del mismo bloquea aproximadamente el 75-100 % de la unión de GFRa3 humano a su ligando, la artemina, con un valor de CI50 que varía de aproximadamente 400 pM a aproximadamente 15 nM.
En una realización, el anticuerpo monoclonal aislado o un fragmento de unión al antígeno del mismo bloquea o inhibe la activación dependiente de la artemina de RET humano con una CI50 que varía de aproximadamente 300 pM a aproximadamente 5 nM.
En una realización, el anticuerpo monoclonal aislado o un fragmento de unión al antígeno del mismo bloquea o inhibe la activación dependiente de la artemina de RET de macaco cangrejero con una CI50 que varía de aproximadamente 0,7 nM a aproximadamente 2,5 nM.
Un anticuerpo monoclonal aislado o un fragmento de unión al antígeno del mismo descrito en el presente documento puede comprender las tres CDR de cadena pesada (HCDR1, HCDR2 y HCDR3) contenidas dentro de una secuencia de aminoácidos de HCVR del grupo que consiste en SEQ ID NO: 2, 18, 34, 50, 66, 82, 98, 114, 130, 146, 162, 178, 194, 210, 226, 242, 258, 274, 290, 306, 322, 338, 354, 381 y 397; y las tres CDR de cadena ligera (LCDR1, LCDR2 y LCDR3) contenidas dentro de una secuencia de aminoácidos de LCVR seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 122, 138, 154, 170, 186, 202, 218, 234, 250, 266, 282, 298, 314, 330, 346, 362, 389 y 405.
Un anticuerpo monoclonal aislado o un fragmento de unión al antígeno del mismo descrito en el presente documento puede comprender una región variable de cadena pesada (HCVR) que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 2, 18, 34, 50, 66, 82, 98, 114, 130, 146, 162, 178, 194, 210, 226, 242, 258, 274, 290, 306, 322, 338, 354, 381 y 397.
Un anticuerpo monoclonal aislado o un fragmento de unión al antígeno del mismo descrito en el presente documento puede comprender una región variable de cadena ligera (LCVR) que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 122, 138, 154, 170, 186, 202, 218, 234, 250, 266, 282, 298, 314, 330, 346, 362, 389 y 405.
En una realización, el anticuerpo monoclonal aislado o un fragmento de unión al antígeno del mismo comprende un par de secuencias de aminoácidos de HCVR/LCVR seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NO: s Eq ID NO: 2/10, 18/26, 34/42, 50/58, 66/74, 82/90, 98/106, 114/122, 130/138, 146/154, 162/170, 178/186, 194/202, 210/218, 226/234, 242/250, 258/266, 274/282, 290/298, 306/314, 322/330, 338/346, 354/362, 381/389 y 397/405.
En una realización, el anticuerpo monoclonal aislado o un fragmento de unión al antígeno del mismo comprende un par de secuencias de aminoácidos de HCVR/LCVR seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NO: 50/58, 146/154, 210/218 y 290/298.
Un anticuerpo monoclonal aislado o un fragmento de unión al antígeno del mismo descrito en el presente documento puede comprender:
(a) un dominio de HCDR1 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 4, 20, 36, 52, 68, 84, 100, 116, 132, 148, 164, 180, 196, 212, 228, 244, 260, 276, 292, 308, 324, 340, 356, 383 y 399;
(b) un dominio de HCDR2 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 6, 22, 38, 54, 70, 86, 102, 118, 134, 150, 166, 182, 198, 214, 230, 246, 262, 278, 294, 310, 326, 342, 358, 385 y 401;
(c) un dominio de HCDR3 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 8, 24, 40, 56, 72, 88, 104, 120, 136, 152, 168, 184, 200, 216, 232, 248, 264, 280, 296, 312, 328, 344, 360, 387 y 403;
(d) un dominio de LCDR1 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 12, 28, 44, 60, 76, 92, 108, 124, 140, 156, 172, 188, 204, 220, 236, 252, 268, 284, 300, 316, 332, 348, 364, 391 y 407;
(e) un dominio de LCDR2 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 14, 30, 46, 62, 78, 94, 110, 126, 142, 158, 174, 190, 206, 222, 238, 254, 270, 286, 302, 318, 334, 350, 366, 393 y 409; y
(f) un dominio de LCDR3 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 16, 32, 48, 64, 80, 96, 112, 128, 144, 160, 176, 192, 208, 224, 240, 256, 272, 288, 304, 320, 336, 352, 368, 395 y 411.
En una realización, el anticuerpo monoclonal aislado o un fragmento de unión al antígeno del mismo compite por la unión específica a GFRa3 humano con un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno que comprende pares de secuencias de las cadenas pesada y ligera seleccionados del grupo que consiste en SEQ ID NO: 2/10, 18/26, 34/42, 50/58, 66/74, 82/90, 98/106, 114/122, 130/138, 146/154, 162/170, 178/186, 194/202, 210/218, 226/234, 242/250, 258/266, 274/282, 290/298, 306/314, 322/330, 338/346 y 354/362, 381/389 y 397/405.
En una realización, el anticuerpo monoclonal aislado o un fragmento de unión al antígeno del mismo se une al mismo epítopo en el GFRa3 humano que es reconocido por un anticuerpo que comprende pares de secuencias de cadena pesada y ligera seleccionados del grupo que consiste en SEQ ID NO: 2/10, 18/26, 34/42, 50/58, 66/74, 82/90, 98/106, 114/122, 130/138, 146/154, 162/170, 178/186, 194/202, 210/218, 226/234, 242/250, 258/266, 274/282, 290/298, 306/314, 322/330, 338/346 y 354/362, 381/389 y 397/405.
Los anticuerpos de la invención pueden ser de longitud completa (por ejemplo, un anticuerpo IgG1 o IgG4) o pueden comprender únicamente una parte de unión a antígeno (por ejemplo, un fragmento Fab, F(ab')2 o scFv) y pueden modificarse para afectar a la funcionalidad, por ejemplo, para eliminar las funciones efectoras residuales (Reddy et al., 2000, J. Immunol. 164:1925-1933).
Un anticuerpo aislado o fragmento de unión al antígeno del mismo que se une específicamente al GFRa3 humano descrito en el presente documento puede comprender una HCVR que comprende las tres CDR de cadena pesada (HCDR1, HCDR2 y HCDR3) contenidas dentro de las secuencias de aminoácidos de HCVR seleccionadas del grupo que consiste en SEQ ID NO: 2, 18, 34, 50, 66, 82, 98, 114, 130, 146, 162, 178, 194, 210, 226, 242, 258, 274, 290, 306, 322, 338, 354, 381 y 397; y/o una LCVR que comprende las tres CDR de cadena ligera (LCDR1, LCDR2 y LCDR3) contenidas dentro de las secuencias de aminoácidos de LCVR seleccionadas del grupo que consiste en SEQ ID NO: 10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 122, 138, 154, 170, 186, 202, 218, 234, 250, 266, 282, 298, 314, 330, 346, 362, 389 y 405. Los métodos y técnicas para identificar las CDR dentro de las secuencias de aminoácido de HCVR y LCVR son bien conocidas en la técnica y pueden usarse para identificar las CDR dentro de las secuencias de aminoácidos de HCVR y/o LCVR específicas divulgadas en el presente documento. Las convenciones ilustrativas que pueden usarse para identificar los límites de las CDR incluyen, por ejemplo, la definición de Kabat, la definición de Chothia y la definición de AbM. En términos generales, la definición de Kabat se basa en la variabilidad de secuencia, la definición de Chothia se basa en la ubicación de las regiones de bucles estructurales y la definición de AbM es un compendio entre las estrategias de Kabat y Chothia. Véase, por ejemplo, Kabat, "Sequences of Proteins of Immunological Interest", National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991); Al-Lazikani et al., J. Mol. Biol. 273:927-948 (1997); y Martin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 86:9268-9272 (1989). También están disponibles bases de datos públicas para identificar las secuencias de CDR dentro de un anticuerpo.
Un anticuerpo aislado o fragmento de unión al antígeno que se une específicamente a GFRa3 humano descrito en el presente documento puede comprender:
(a) un dominio de HCDR3 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 8, 24, 40, 56, 72, 88, 104, 120, 136, 152, 168, 184, 200, 216, 232, 248, 264, 280, 296, 312, 328, 344, 360, 387 y 403; y
(b) un dominio de LCDR3 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 16, 32, 48, 64, 80, 96, 112, 128, 144, 160, 176, 192, 208, 224, 240, 256, 272, 288, 304, 320, 336, 352, 368, 395 y 411.
Un anticuerpo aislado o fragmento de unión al antígeno que se une específicamente a GFRa3 humano, como se describe en (a) y (b) anterior, puede comprender además:
(c) un dominio de HCDR1 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 4, 20, 36, 52, 68, 84, 100, 116, 132, 148, 164, 180, 196, 212, 228, 244, 260, 276, 292, 308, 324, 340, 356, 383 y 399;
(d) un dominio de HCDR2 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 6, 22, 38, 54, 70, 86, 102, 118, 134, 150, 166, 182, 198, 214, 230, 246, 262, 278, 294, 310, 326, 342, 358, 385 y 401;
(e) un dominio de LCDR1 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 12, 28, 44, 60, 76, 92, 108, 124, 140, 156, 172, 188, 204, 220, 236, 252, 268, 284, 300, 316, 332, 348, 364, 391 y 407; y
(f) un dominio LCDR2 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 14, 30, 46, 62, 78, 94, 110, 126, 142, 158, 174, 190, 206, 222, 238, 254, 270, 286, 302, 318, 334, 350, 366, 393 y 409.
Se describe además en el presente documento un anticuerpo monoclonal completamente humano o un fragmento de unión al antígeno del mismo que se une específicamente al GFRa3 humano, anticuerpo o fragmento del mismo que presenta una o más de las siguientes características: (i) comprende una HCVR que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 2, 18, 34, 50, 66, 82, 98, 114, 130, 146, 162, 178, 194, 210, 226, 242, 258, 274, 290, 306, 322, 338, 354, 381 y 397; (ii) comprende una LCVR que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 122, 138, 154, 170, 186, 202, 218, 234, 250, 266, 282, 298, 314, 330, 346, 362, 389 y 405; (iii) comprende un dominio de HCDR3 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 8, 24, 40, 56, 72, 88, 104, 120, 136, 152, 168, 184, 200, 216, 232, 248, 264, 280, 296, 312, 328, 344, 360, 387 y 403, o una secuencia esencialmente similar a las mismas que tiene al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de identidad de secuencia; y un dominio de LCDR3 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 16, 32, 48, 64, 80, 96, 112, 128, 144, 160, 176, 192, 208, 224, 240, 256, 272, 288, 304, 320, 336, 352, 368, 395 y 411, o una secuencia esencialmente similar a las mismas que tiene al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de identidad de secuencia; (iv) comprende un dominio de HCDR1 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 4, 20, 36, 52, 68, 84, 100, 116, 132, 148, 164, 180, 196, 212, 228, 244, 260, 276, 292, 308, 324, 340, 356, 383 y 399, o una secuencia esencialmente similar a las mismas que tiene al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de identidad de secuencia; un dominio de HCDR2 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 6, 22, 38, 54, 70, 86, 102, 118, 134, 150, 166, 182, 198, 214, 230, 246, 262, 278, 294, 310, 326, 342, 358, 385 y 401, o una secuencia esencialmente similar a las mismas que tiene al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de identidad de secuencia; un dominio LCDR1 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 12, 28, 44, 60, 76, 92, 108, 124, 140, 156, 172, 188, 204, 220, 236, 252, 268, 284, 300, 316, 332, 348, 364, 391 y 407, o una secuencia esencialmente similar a las mismas que tiene al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de identidad de secuencia; y un dominio de LCDR2 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 14, 30, 46, 62, 78, 94, 110, 126, 142, 158, 174, 190, 206, 222, 238, 254, 270, 286, 302, 318, 334, 350, 366, 393 y 409, o una secuencia esencialmente similar a las mismas que tiene al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de identidad de secuencia; (v) presenta una Kd que varía de aproximadamente 10-8 M a aproximadamente 10-13 M medida mediante resonancia de plasmón superficial; (vi) demuestra la capacidad de bloquear aproximadamente el 50-100 % de la unión de GFRa3 a su ligando, la artemina, con un valor de CI50 que varía de aproximadamente 40 pM a aproximadamente 15 nM; (vii) demuestra la capacidad de bloquear entre el 20 % y el 100 % de la unión de GFRa3 a un soporte sólido recubierto con una mezcla de artemina y RET; (vuuuiv) bloquea o inhibe la activación de RET dependiente de la artemina con una CI50 que varía de aproximadamente 200 pM a aproximadamente 50 nM; (ix) inhibe o reduce una o más respuestas nociceptivas en un modelo in vivo de dolor por cáncer de huesos; (x) inhibe o reduce la hiperalgesia térmica sensibilizada con artemina in vivo; (xi) inhibe o reduce la alodinia en un modelo in vivo de artrosis; (xii) no reacciona de forma cruzada con otros receptores conjuntos GFR para RET.
En el presente documento, se describe un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de un anticuerpo que comprende un dominio de HCDR3 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de cualquiera de las mostradas en la Tabla 1, o una secuencia esencialmente similar a las mismas que tiene al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de identidad de secuencia; y un dominio de LCDR3 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de cualquiera de las mostradas en la Tabla 1, o una secuencia esencialmente similar a las mismas que tiene al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de identidad de secuencia.
En el presente documento se describe un anticuerpo o fragmento del mismo que comprende además un dominio de HCDR1 que tiene una secuencia de aminoácidos de cualquiera de las mostradas en la Tabla 1, o una secuencia esencialmente similar a las mismas que tiene al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de identidad de secuencia; un dominio de HCDR2 que tiene una secuencia de aminoácidos de cualquiera de las mostradas en la Tabla 1, o una secuencia esencialmente similar a las mismas que tiene al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de identidad de secuencia; un dominio de LCDR1 que tiene una secuencia de aminoácidos de cualquiera de las mostradas en la Tabla 1, o una secuencia esencialmente similar a las mismas que tiene al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de identidad de secuencia; y un dominio de LCDR2 que tiene una secuencia de aminoácidos de cualquiera de las mostradas en la Tabla 1, o una secuencia esencialmente similar a las mismas que tiene al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de identidad de secuencia.
En determinadas realizaciones, el anticuerpo o la parte de unión al antígeno de un anticuerpo que se une específicamente a GFRa3 humano comprende un par de secuencias de aminoácidos HCDR3/LCDR3 seleccionado de cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCDR3/LCDR3 mostradas en la Tabla 1. De acuerdo con determinadas realizaciones, el anticuerpo o la parte de unión al antígeno de un anticuerpo comprende un par de secuencias de aminoácidos de HCDR3/LCDR3 seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NO: 8/16, 24/32, 40/48, 56/64, 72/80, 88/96, 104/112, 120/128, 136/144, 152/160, 168/176, 184/192, 200/208, 216/224, 232/240, 248/256, 264/272, 280/288, 296/304, 312/320, 328/336, 344/352, 360/368, 387/395 y 403/411.
En una realización, el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo comprende las secuencias de HCDR1, HCDR2 y HCDR3 de SEQ ID NO: 4, 6 y 8, respectivamente, y las secuencias de LCDR1, LCDR2 y LCDR3 de SEQ ID NO: 12, 14 y 16, respectivamente.
En una realización, el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo comprende las secuencias de HCDR1, HCDR2 y HCDR3 de SEQ ID NO: 20, 22 y 24, respectivamente, y las secuencias de LCDR1, LCDR2 y LCDR3 de SEQ ID No: 28, 30 y 32, respectivamente.
En una realización, el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo comprende las secuencias de HCDR1, HCDR2 y HCDR3 de SEQ ID NO: 36, 38 y 40, respectivamente, y las secuencias de LCDR1, LCDR2 y LCDR3 de SEQ ID No: 44, 46 y 48, respectivamente.
En una realización, el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo comprende las secuencias de HCDR1, HCDR2 y HCDR3 de SEQ ID NO: 52, 54 y 56, respectivamente, y las secuencias de LCDR1, LCDR2 y LCDR3 de SEQ ID No: 60, 62 y 64, respectivamente.
En una realización, el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo comprende las secuencias de HCDR1, HCDR2 y HCDR3 de SEQ ID NO: 68, 70 y 72, respectivamente, y las secuencias de LCDR1, LCDR2 y LCDR3 de SEQ ID No: 76, 78 y 80, respectivamente.
En una realización, el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo comprende las secuencias de HCDR1, HCDR2 y HCDR3 de SEQ ID NO: 84, 86 y 88, respectivamente, y las secuencias de LCDR1, LCDR2 y LCDR3 de SEQ ID No: 92, 94 y 96, respectivamente.
En una realización, el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo comprende las secuencias de HCDR1, HCDR2 y HCDR3 de SEQ ID No: 100, 102 y 104, respectivamente, y las secuencias de LCDR1, LCDR2 y LCDR3 de SEQ ID NO: 108, 110 y 112, respectivamente.
En una realización, el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo comprende las secuencias de HCDR1, HCDR2 y HCDR3 de SEQ ID No: 116, 118 y 120, respectivamente, y las secuencias de LCDR1, LCDR2 y LCDR3 de SEQ ID NO: 124, 126 y 128, respectivamente.
En una realización, el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo comprende las secuencias de HCDR1, HCDR2 y HCDR3 de SEQ ID No: 132, 134 y 136, respectivamente, y las secuencias de LCDR1, LCDR2 y LCDR3 de SEQ ID NO: 140, 142 y 144, respectivamente.
En una realización, el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo comprende las secuencias de HCDR1, HCDR2 y HCDR3 de SEQ ID No: 148, 150 y 152, respectivamente, y las secuencias de LCDR1, LCDR2 y LCDR3 de SEQ ID NO: 156, 158 y 160, respectivamente.
En una realización, el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo comprende las secuencias de HCDR1, HCDR2 y HCDR3 de SEQ ID No: 164, 166 y 168, respectivamente, y las secuencias de LCDR1, LCDR2 y LCDR3 de SEQ ID NO: 172, 174 y 176, respectivamente.
En una realización, el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo comprende las secuencias de HCDR1, HCDR2 y HCDR3 de SEQ ID No: 180, 182 y 184, respectivamente, y las secuencias de LCDR1, LCDR2 y LCDR3 de SEQ ID NO: 188, 190 y 192, respectivamente.
En una realización, el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo comprende las secuencias de HCDR1, HCDR2 y HCDR3 de SEQ ID No: 196, 198 y 200, respectivamente, y las secuencias de LCDR1, LCDR2 y LCDR3 de SEQ ID NO: 204, 206 y 208, respectivamente.
En una realización, el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo comprende las secuencias de HCDR1, HCDR2 y HCDR3 de SEQ ID No: 212, 214 y 216, respectivamente, y las secuencias de LCDR1, LCDR2 y LCDR3 de SEQ ID NO: 220, 222 y 224, respectivamente.
En una realización, el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo comprende las secuencias de HCDR1, HCDR2 y HCDR3 de SEQ ID No: 228, 230 y 232, respectivamente, y las secuencias de LCDR1, LCDR2 y LCDR3 de SEQ ID NO: 236, 238 y 240, respectivamente.
En una realización, el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo comprende las secuencias de HCDR1, HCDR2 y HCDR3 de SEQ ID No: 244, 246 y 248, respectivamente, y las secuencias de LCDR1, LCDR2 y LCDR3 de SEQ ID NO: 252, 254 y 256, respectivamente.
En una realización, el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo comprende las secuencias de HCDR1, HCDR2 y HCDR3 de SEQ ID No: 260, 262 y 264, respectivamente, y las secuencias de LCDR1, LCDR2 y LCDR3 de SEQ ID NO: 268, 270 y 272, respectivamente.
En una realización, el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo comprende las secuencias de HCDR1, HCDR2 y HCDR3 de SEQ ID No: 276, 278 y 280, respectivamente, y las secuencias de LCDR1, LCDR2 y LCDR3 de SEQ ID NO: 284, 286 y 288, respectivamente.
En una realización, el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo comprende las secuencias de HCDR1, HCDR2 y HCDR3 de SEQ ID No: 292, 294 y 296, respectivamente, y las secuencias de LCDR1, LCDR2 y LCDR3 de SEQ ID NO: 300, 302 y 304, respectivamente.
En una realización, el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo comprende las secuencias de HCDR1, HCDR2 y HCDR3 de SEQ ID No: 308, 310 y 312, respectivamente, y las secuencias de LCDR1, LCDR2 y LCDR3 de SEQ ID NO: 316, 318 y 320, respectivamente.
En una realización, el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo comprende las secuencias de HCDR1, HCDR2 y HCDR3 de SEQ ID No: 324, 326 y 328, respectivamente, y las secuencias de LCDR1, LCDR2 y LCDR3 de SEQ ID NO: 332, 334 y 336, respectivamente.
En una realización, el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo comprende las secuencias de HCDR1, HCDR2 y HCDR3 de SEQ ID No: 340, 342 y 344, respectivamente, y las secuencias de LCDR1, LCDR2 y LCDR3 de SEQ ID NO: 348, 350 y 352, respectivamente.
En una realización, el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo comprende las secuencias de HCDR1, HCDR2 y HCDR3 de SEQ ID No: 356, 358 y 360, respectivamente, y las secuencias de LCDR1, LCDR2 y LCDR3 de SEQ ID NO: 364, 366 y 368, respectivamente.
En una realización, el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo comprende las secuencias de HCDR1, HCDR2 y HCDR3 de SEQ ID No: 383, 385 y 387, respectivamente, y las secuencias de LCDR1, LCDR2 y LCDR3 de SEQ ID NO: 391, 393 y 395, respectivamente.
En una realización, el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo comprende las secuencias de HCDR1, HCDR2 y HCDR3 de SEQ ID No: 399, 401 y 403, respectivamente, y las secuencias de LCDR1, LCDR2 y LCDR3 de SEQ ID NO: 407, 409 y 411, respectivamente.
Determinados anticuerpos ilustrativos no limitantes y fragmentos de unión al antígeno descritos en el presente documento comprenden los dominios HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 y LCDR3, respectivamente, seleccionados de cualquiera de las secuencias de aminoácidos que se muestran en la Tabla 1.
En otro aspecto, la invención proporciona moléculas de ácido nucleico que codifican anticuerpos anti-GFRa3 o fragmentos de los mismos de la invención. Los vectores de expresión recombinante que portan los ácidos nucleicos de la invención, y células hospedadoras en que se han introducido dichos vectores, también están abarcados por la invención, así como métodos de producción de los anticuerpos por cultivo de las células hospedadoras en condiciones que permiten la producción de los anticuerpos y recuperar los anticuerpos producidos.
En una realización, la invención proporciona un anticuerpo o fragmento del mismo que comprende una HCVR codificada por una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, 17, 33, 49, 65, 81, 97, 113, 129, 145, 161, 177, 193, 209, 225, 241, 257, 273, 289, 305, 321, 337, 353, 380 y 396, o una secuencia esencialmente idéntica que tiene al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 %, o al menos el 99 % de homología con las mismas. En una realización, la HCVR está codificada por una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 49, 145, 209 y 289.
En una realización, el anticuerpo o fragmento del mismo comprende además una LCVR codificada por una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en s Eq ID NO: 9, 25, 41,57, 73, 89, 105, 121, 137, 153, 169, 185, 201, 217, 233, 249, 265, 281, 297, 313, 329, 345, 361, 388 y 404, o una secuencia esencialmente idéntica que tiene al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 %, o al menos el 99 % de homología con las mismas. En una realización, la LCVR está codificada por una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 57, 153, 217 y 297.
También se describe en el presente documento un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de un anticuerpo que comprende un dominio de HCDR3 codificado por una secuencia de nucleótidos ubicada dentro de las regiones variables de cualquiera de los anticuerpos mostrados en la Tabla 1, o una secuencia esencialmente similar a las mismas que tiene al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de identidad de secuencia; y un dominio de LCDR3 codificado por una secuencia de nucleótidos seleccionada de cualquiera de las mostradas en la Tabla 1, o una secuencia esencialmente similar a las mismas que tiene al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de identidad de secuencia.
En el presente documento, también se describe un anticuerpo o fragmento del mismo que comprende además un dominio de HCDR1 codificado por una secuencia de nucleótidos de cualquiera de las mostradas en la Tabla 1, o una secuencia esencialmente similar a las mismas que tiene al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de identidad de secuencia; un dominio de HCDR2 codificado por una secuencia de nucleótidos de cualquiera de las mostradas en la Tabla 1, o una secuencia esencialmente similar a las mismas que tiene al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de identidad de secuencia; un dominio de LCDR1 codificado por una secuencia de nucleótidos de cualquiera de las mostradas en la Tabla 1, o una secuencia esencialmente similar a las mismas que tiene al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de identidad de secuencia; y un dominio de LCDR2 codificado por una secuencia de nucleótidos mostrada en la Tabla 1, o una secuencia esencialmente similar a las mismas que tiene al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de identidad de secuencia.
Se describe además en el presente documento un anticuerpo anti-hGFRa3 humano o un fragmento de unión al antígeno de un anticuerpo que comprende una HCVR codificada por segmentos de secuencia de nucleótidos derivados de secuencias de estirpe germinal de VH, DH y JH, y una LCVR codificada por segmentos de secuencia de nucleótidos derivados de secuencias de estirpe germinal de VK y JK, con combinaciones como las mostradas en la Tabla 2.
La invención engloba anticuerpos anti-hGFRa3 que tienen un patrón de glicosilación modificado. En algunas aplicaciones, puede ser útil la modificación para eliminar sitios de glicosilación no deseados o, por ejemplo, la eliminación de un resto de fucosa para aumentar la función de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) (véase, Shield et al., (2002) JBC 277:26733). En otras aplicaciones, puede hacerse modificación de la galactosilación para modificar la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC).
En otro aspecto, la invención presenta una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo humano recombinante o fragmento del mismo de la invención, que se une específicamente a hGFRa3 y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En una realización, la invención presenta una composición, que es una combinación de un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de un anticuerpo de la invención, y un segundo agente terapéutico. El segundo agente terapéutico puede ser cualquier agente que se combine ventajosamente con el anticuerpo o fragmento del mismo de la invención, por ejemplo, un agente capaz de reducir el dolor, tales como, pero sin limitación, opioides, morfina, un inhibidor de COX-2, aspirina u otros agentes antiinflamatorios no esteroideos, acetaminofeno, duloxetina, anestésicos locales, moduladores de NMDA, agonistas del receptor cannabinoide, moduladores de la familia de P2X, antagonistas de VR1 y antagonistas de la sustancia P. El segundo agente terapéutico puede ser un inhibidor de la interleucina 1 (IL-1), por ejemplo, una proteína de fusión (documento US 6.927.044); o un fármaco antiepiléptico/anticonvulsivo, tal como gabapentina, pregabalina, topiramato; o un antidepresivo tricíclico, tal como la amitriptilina; un inhibidor o antagonista de citocinas, tal como un antagonista de IL-6, IL-6R, IL-18 o IL-18R, o un inhibidor de un canal de sodio controlado por tensión, tal como un inhibidor de Nav1.7, o un inhibidor de Nav1.8, o un inhibidor Nav1.9; un inhibidor de un canal de potasio o un canal de calcio; o un inhibidor de NGF (un inhibidor de molécula pequeña o un anticuerpo anti-NGF), o un segundo inhibidor o antagonista de GFRa3, un factor de necrosis tumoral (TNF) o inhibidor del receptor de TNF, un inhibidor de TWEAK (inductor de apóptosis WEAK relacionado con TNF), un inhibidor de RET, un inhibidor de un ligando de la familia de GDNF, un inhibidor de GFRa1, GFRa2 o GFRa4, un inhibidor de un canal iónico de detección de ácido (por ejemplo, ASIC1 o ASIC3), o un inhibidor selectivo de la recaptación de serotonina (ISRS), o un inhibidor de la recaptación de serotonina y norepinefrina (SNRI), o un inhibidor de un receptor de prequineticina (por ejemplo, PROK1 y PROK2), o un inhibidor de caspasa, un inhibidor de p38, un inhibidor de IKK1/2, CTLA-4Ig o un corticosteroide. El segundo agente terapéutico puede ser un fármaco de molécula pequeña o un inhibidor de proteínas/polipéptidos. El segundo agente terapéutico puede ser sintético o derivado de manera natural. El segundo agente terapéutico puede ser un segundo anticuerpo específico de GFRa3, un antagonista de polipéptido, un ARNip o una molécula antisentido específica de GFRa3. También se apreciará que los anticuerpos y las composiciones farmacéuticamente aceptables de la presente invención pueden emplearse en tratamientos combinados, es decir, los anticuerpos y las composiciones farmacéuticamente aceptables se pueden administrar simultáneamente con, antes de, o posteriormente a, uno o más de los diferentes procedimientos terapéuticos o médicos deseados. La combinación concreta de tratamientos (o procedimientos terapéuticos) emplean un régimen combinado tendrá en cuenta la compatibilidad de los tratamientos y/o procedimientos terapéuticos y el efecto terapéutico deseado que se va a conseguir. También se apreciará que los tratamientos empleados pueden conseguir un efecto deseado para el mismo trastorno (por ejemplo, se puede administrar un anticuerpo de forma simultánea con otro agente usado en el tratamiento del mismo trastorno), o se pueden conseguir diferentes ejemplos (por ejemplo, el control de cualquier efecto adverso). Como se usa en el presente documento, los agentes terapéuticos adicionales que se administran normalmente para tratar o evitar una enfermedad, o dolencia concreta, son apropiados para la enfermedad o afección que se está tratando.
En el presente documento se describen además métodos para inhibir la actividad hGFRa3 usando un anticuerpo antihGFRa3 o parte de unión al antígeno de un anticuerpo de la invención, métodos que comprenden administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de uno o más anticuerpos de la invención, o fragmentos de unión al antígeno de los mismos, o una composición farmacéutica que comprende uno o más anticuerpos de la invención o fragmentos de unión al antígeno de los mismos.
También se describe en el presente documento un método para tratar una afección o enfermedad relacionada con GFRa3, o el dolor asociado con una afección o enfermedad relacionada con GFRa3, método que comprende administrar un anticuerpo anti-GFRa3 o parte de unión al antígeno de un anticuerpo de la invención, o una composición que comprende un anticuerpo anti-GFRa3 o un fragmento del mismo, a un paciente que lo necesita, en el que la afección o enfermedad relacionada con GFRa3 se previene, se mejora o se reduce su gravedad o frecuencia de aparición, o el dolor asociado con la afección o enfermedad se previene, se mejora o se reduce su gravedad o frecuencia de aparición.
En una realización, la invención proporciona el anticuerpo aislado de la invención o fragmento de unión al antígeno del mismo, o una composición farmacéutica que comprende al menos un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo de la invención para su uso en el tratamiento de una afección o enfermedad relacionada con GFRa3, o el dolor asociado con la afección o enfermedad relacionada con GFRa3, en el que la afección o enfermedad relacionada con GFRa3 se previene, se mejora o se reduce su gravedad o frecuencia de aparición, o el dolor asociado con la afección o enfermedad se previene, se mejora o se reduce su gravedad o frecuencia de aparición.
En el presente documento, se describe el uso de un anticuerpo aislado o fragmento de unión al antígeno del mismo de la invención, o una composición farmacéutica que comprende al menos un anticuerpo de la invención en la fabricación de un medicamento para tratar una afección o enfermedad relacionada con GFRa3, o el dolor asociado con la afección o enfermedad relacionada con GFRa3, en el que la afección o enfermedad relacionada con GFRa3 se previene, se mejora o se reduce su gravedad o frecuencia de aparición, o el dolor asociado con la afección o enfermedad se previene, se mejora o se reduce su gravedad o frecuencia de aparición.
En una realización, la afección o enfermedad relacionada con GFRa3 se selecciona del grupo que consiste en dolor agudo, dolor crónico, dolor neuropático, dolor inflamatorio, un síndrome de dolor funcional, artritis, pancreatitis, artrosis, cefaleas en racimo, neuralgia del trigémino, neuralgia herpética, neuralgias generales, trastornos neurodegenerativos, trastornos del movimiento, trastornos neuroendocrinos, ataxia, dolor visceral, gota aguda, neuralgia posherpética, neuropatía diabética, ciática, dolor de espalda, dolor de cabeza o cuello, dolor intenso o intratable, dolor irruptivo, dolor postoperatorio, eritromelalgia hereditaria, dolor dental, rinitis, dolor oncológico, síndrome de dolor regional complejo ( CRPS), enfermedad inflamatoria del intestino (por ejemplo, enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa) y trastornos de la vejiga.
En una realización, el síndrome de dolor funcional se selecciona del grupo que consiste en dolor lumbar crónico, síndrome del intestino irritable (SII), fibromialgia (FM), síndrome de fatiga crónica, dolor abdominal, trastorno de la articulación temporomandibular (TMJD), síndrome de vejiga dolorosa (cistitis intersticial), trastornos/síndromes gastrointestinales funcionales, síndrome de dolor torácico funcional, migrañas y cefaleas de tipo tensional, síndrome de dolor pélvico crónico, síndrome de próstata dolorosa (prostatitis crónica), síndrome de sensibilidad química múltiple y síndrome de la Guerra del Golfo.
En una realización, el dolor oncológico se asocia con un cáncer seleccionado del grupo que consiste en cáncer de endometrio, cáncer de próstata, cáncer de mama, cáncer de cuello uterino, cáncer de hígado, cáncer pancreático, cáncer de colon, cáncer de estómago, cáncer de útero, cáncer de ovarios, cáncer de riñón, cáncer de pulmón no microcítico, cáncer de cerebro, una leucemia, un linfoma, cáncer de huesos y dolor asociado con la metástasis de un cáncer.
En una realización, el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno se administra al paciente en combinación con un segundo agente terapéutico.
En una realización, el segundo agente terapéutico se selecciona del grupo que consiste en un opioide, un inhibidor de COX-2, un anestésico local, un modulador de NMDA, un agonista del receptor cannabinoide, un modulador de la familia de P2X, un antagonista de VR1, un antagonista de la sustancia P, un antagonista del segundo GFRa3, un antagonista de citocinas o de receptor de citocinas, un inhibidor del factor de crecimiento nervioso (NGF) (un inhibidor de bajo peso molecular o un anticuerpo anti-NGF), aspirina, un AINE, un esteroide, morfina, un inhibidor selectivo de la recaptación de serotonina (ISRS), un inhibidor de la recaptación de serotonina y norepinefrina (SNRI), un tricíclico, un inhibidor de un canal de sodio controlado por tensión (Nav), un inhibidor de los canales de calcio, un inhibidor de los canales de potasio, un factor de necrosis tumoral (TNF) o inhibidor del receptor de TNF, un inhibidor de TWEAK (inductor de apóptosis WEAK relacionado con TNF), un inhibidor de RET, un inhibidor de un ligando de la familia de GDNF, un inhibidor de un canal iónico de detección de ácido (ASIC1 o ASIC3), un anticonvulsivo (gabapentina o pregabalina), un inhibidor de un receptor de prequineticina (PROK1 y PROK2), un inhibidor de caspasa, un inhibidor de p38, un inhibidor de IKK1/2, CTLA-4Ig y un corticosteroide.
En una realización, el segundo antagonista de GFRa3 es una pequeña molécula orgánica, un segundo anticuerpo específico de GFRa3, un antagonista de polipéptido, un ARNip o una molécula antisentido específica de GFRa3.
En una realización, el antagonista de citocinas o del receptor de citocinas es un antagonista de interleucina-1 (IL-1), un antagonista de IL-6 y un antagonista de IL-18.
El trastorno tratado es cualquier enfermedad o afección, que se mejora, se mitiga, se inhibe o se previene mediante la eliminación, inhibición o reducción de la actividad hGFRa3. Las poblaciones específicas que se pueden tratar mediante los métodos terapéuticos descritos en el presente documento incluyen una enfermedad, un trastorno o una afección seleccionado entre dolor agudo, crónico, isquémico, neuropático o inflamatorio, hipersensibilidad, tal como hipersensibilidad visceral, térmica o mecánica, pancreatitis crónica, artritis, migraña, cefaleas en racimo, neuralgia del trigémino, neuralgia herpética, neuralgias generales, epilepsia o afecciones epilépticas, miotonía, arritmias, trastornos del movimiento, trastornos neuroendocrinos, ataxia, enfermedad inflamatoria del intestino, inflamación del bazo, dolor de estómago, trigonitis, fibroides, peritonitis, urgencia fecal, incontinencia, hipersensibilidad rectal, dolor visceral, dolor por artrosis, neuralgia posherpética, neuropatía diabética, dolor radicular, ciática, dolor de espalda, dolor de cabeza o cuello, dolor irruptivo, dolor postoperatorio, dolor oncológico o dolor inducido por la quimioterapia. Otras afecciones que se pueden tratar mediante los métodos terapéuticos descritos en el presente documento incluyen la enfermedad de Hirschsprung, eritromelalgia hereditaria, trastornos de la vejiga, rinitis, cáncer de próstata, cáncer de mama, cáncer de cuello uterino, cáncer de hígado, cáncer pancreático, cáncer de colon, cáncer de estómago, cáncer de útero, cáncer de ovarios, cáncer de riñón, cáncer hematológico (transmitido por la sangre), tales como una leucemia o un linfoma, cáncer de huesos o dolor asociado con la metástasis de un cáncer, por ejemplo, dolor asociado con la metástasis de un cáncer en el hueso. Los anticuerpos de la invención o fragmentos de unión al antígeno de los mismos también pueden usarse para tratar las siguientes afecciones: dolor óseo agudo, crónico o de fractura no maligno; artritis reumatoide, estenosis espinal; dolor lumbar neuropático; síndrome de dolor miofascial; pancreático; cefalea crónica; cefalea tensional; neuropatía diabética; neuropatía asociada al VIH; neuropatía de Charcot-Marie Tooth; neuropatías sensoriales hereditarias; lesión del nervio periférico; neuromas dolorosos; descargas ectópicas proximales y distales; radiculopatía; dolor neuropático inducido por quimioterapia; dolor neuropático inducido por radioterapia; dolor tras una mastectomía; dolor central; dolor por lesión de la médula espinal; dolor tras apoplejía; dolor talámico; síndrome de dolor regional complejo (CRPS, también conocido como distrofia simpática refleja); dolor fantasma; dolor intratable; dolor musculoesquelético agudo; dolor articular; dolor agudo de gota; dolor lumbar mecánico; dolor de cuello; tendinitis; dolor por lesión/ejercicio; dolor abdominal; pielonefritis; apendicitis; colecistitis; obstrucción intestinal; hernias; etc.; dolor pectoral, incluyendo, dolor cardíaco; dolor pélvico, dolor cólico renal, dolor obstétrico agudo, incluyendo, dolor de parto; dolor de cesárea; dolor por quemadura y traumatismo; endometriosis; dolor de herpes zóster; anemia falciforme; pancreatitis aguda; dolor irruptivo; dolor orofacial incluyendo dolor de sinusitis, dolor dental; dolor de esclerosis múltiple; dolor de lepra; dolor de la enfermedad de Behcet; adiposis dolorosa; dolor flebítico; dolor de Guillain-Barre; dolor de piernas y de dedos en movimiento; síndrome de Haglund; dolor de la enfermedad de Fabry; enfermedad vesical y urogenital; e hiperactividad vesical. En una realización, los anticuerpos de la invención se pueden usar para tratar un síndrome de dolor funcional, en el que el síndrome de dolor funcional se selecciona del grupo que consiste en dolor lumbar crónico, síndrome del intestino irritable (SII), fibromialgia (FM), síndrome de fatiga crónica, dolor abdominal, trastorno de la articulación temporomandibular (TMJD), síndrome de vejiga dolorosa (cistitis intersticial), trastornos/síndromes gastrointestinales funcionales, síndrome de dolor torácico funcional, migrañas y cefaleas de tipo tensional, síndrome de dolor pélvico crónico, síndrome de próstata dolorosa (prostatitis crónica), síndrome de sensibilidad química múltiple y síndrome de la Guerra del Golfo.
Los anticuerpos de la invención o fragmentos de unión al antígeno de los mismos también se pueden usar para inhibir el crecimiento/la proliferación de células tumorales, o metástasis de células tumorales. En determinadas realizaciones, los anticuerpos de la invención o fragmentos de unión al antígeno de los mismos, se pueden usar para tratar un cáncer, o el "dolor asociado con un cáncer" o "dolor asociado con el cáncer", incluyendo, por ejemplo, pero sin limitación, cáncer de endometrio, cáncer de próstata, cáncer de mama, cáncer de cuello uterino, cáncer de hígado, cáncer pancreático, cáncer de colon, cáncer de estómago, cáncer de útero, cáncer de ovarios, cáncer de riñón, cáncer pulmonar microcítico, cáncer de pulmón no microcítico, cáncer de cerebro, cáncer hematológico (transmitido por la sangre), tales como una leucemia o un linfoma, cáncer de huesos o dolor asociado con la metástasis de un cáncer, por ejemplo, dolor asociado con la metástasis de un cáncer en el hueso. El "dolor asociado con el cáncer" también incluye el dolor asociado más generalmente con afecciones cancerosas tales como, por ejemplo, carcinoma de células renales, carcinoma pancreático, cáncer de cabeza y cuello, gliomas malignos, osteosarcoma, cáncer colorrectal, cáncer gástrico, mesotelioma maligno, mieloma múltiple, sarcoma sinovial, cáncer de tiroides o melanoma. Los anticuerpos de la presente invención también son útiles para tratar o prevenir el dolor causado por o asociado con la terapia del cáncer o tratamientos médicos contra el cáncer, por ejemplo, dolor neuropático inducido por quimioterapia, tal como el dolor causado por o asociado con el tratamiento con paclitaxel (Taxol™), docetaxel (Taxotere®); nitrosourea, ciclofosfamida, doxorrubicina, epirubicina, 5-fluorouracilo, topotecán, irinotecán, carmustina, estramustina y compuestos quimioterapéuticos a base de platino, tales como cisplatino, carboplatino e iproplatino.
Otras realizaciones llegarán a ser evidentes a partir de la revisión de la consiguiente descripción detallada.
Breve descripción de las figuras
Figura 1. Inhibición de la hiperalgesia térmica de la capsaicina sensibilizada con la artemina en animales inyectados con anticuerpos GFRa3 de ratón (bloqueador indirecto M1 M6977N o bloqueador directo M1 M6986N, n = 8 cada uno) o anticuerpo de control de isotipo (negativo) (M2M180N, n = 8) a 30 mg/kg sc 2 días antes de recibir capsaicina (1 día antes de recibir 0,5 pg de artemina).
Figura 2A y 2B. Alodinia táctil medida por von Frey Hairs en animales de dos experimentos (A y B) inyectados con fibrosarcoma y tratados con anticuerpo de control de isotipo (negativo) (M2M180N) o anticuerpos anti-GFRa3 de ratón M1M6977N o M1M6986N (n = 8-11 por grupo). *p < 0,05, **p< 0,01 o ***p< 0,001 en comparación con el control de isotipo en el mismo momento.
Figura 3A y 3B. Porcentaje de peso ipsilateral portado en animales de dos experimentos (A y B) inyectados con fibrosarcoma y tratados con anticuerpo de control de isotipo (negativo) (M2M180N) o anticuerpos anti-GFRa3 de ratón M1 M6977N o M1 M6986N (n = 8-11 por grupo).
Figura 4A y 4B. Puntuaciones de vigilancia en animales de dos experimentos (A y B) inyectados con células de fibrosarcoma y tratados con anticuerpo de control de isotipo (negativo) (M2M180N) o anticuerpos anti-GFRa3 de ratón M1 M6977N o M1 M6986N (n = 8-11 por grupo). **p< 0,01 en comparación con el control de isotipo en el mismo momento.
Figura 5. Alodinia táctil medida por von Frey Hairs en animales inyectados con carcinoma y tratados con anticuerpo de control de isotipo (negativo) (M2M180N) o anticuerpos anti-GFRa3 de ratón M1 M6977N o M1 M6986N (n = 9­ 10 por grupo). *p < 0,05, **p< 0,01 o ***p< 0,001 en comparación con el control de isotipo (negativo) en el mismo momento.
Figura 6A y 6B. Porcentaje de peso ipsilateral portado en animales en dos puntos de tiempo (A = 11 días y B = 18 días) inyectados con carcinoma y tratados con anticuerpo de control de isotipo (negativo) (M2M180N) o anticuerpos anti-GFRa3 de ratón M1 M6977N o M1 M6986N (n = 9-10 por grupo). * p <0,05 en comparación con el anticuerpo de control de isotipo según el análisis post hoc de Dunnett.
Figura 7. Puntuaciones de vigilancia en animales inyectados con carcinoma y tratados con anticuerpo de control de isotipo (negativo) (M2M180N) o anticuerpos anti-GFRa3 de ratón M1M6977N o M1M6986N (n = 9-10 por grupo). *p < 0,05, ***p< 0,01 en comparación con el control de isotipo en el mismo momento.
Figura 8. Alodinia táctil medida por von Frey Hairs en animales con DMM tratados con anticuerpo de control de isotipo (negativo) (M2M180N) o anticuerpos anti-GFRa3 de ratón M1M6977N o M1M6986N (n = 10 por grupo). **p< 0,01 o ***p< 0,001 en comparación con el control de isotipo en el mismo momento.
Figura 9. Análisis de competencia cruzada de anticuerpos anti- GFRa3 para la unión a Biotina-hGFRa3-mmH.
Descripción detallada
Antes de describir los presentes métodos, se ha de entender que la presente invención no se limita a los métodos ni a las condiciones experimentales descritos en particular, ya que dichos métodos y condiciones pueden variar. También debe entenderse que la terminología usada en el presente documento es con el fin de describir realizaciones particulares únicamente, y no pretende ser limitante, ya que el alcance de la presente invención se limitará únicamente por las reivindicaciones adjuntas.
Salvo que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que el que entiende comúnmente un experto habitual en la materia a la que pertenece la presente invención. Aunque puede usarse cualquier método y material similar o equivalente a los descritos en el presente documento en la práctica o ensayo de la presente invención, ahora se describen los métodos y materiales preferidos.
Definiciones
"GFRa3", o "hGFRa3", como se usa en el presente documento, se refiere al receptor de proteína anclada a glicosilfosfatidilinositol (GPI) para la artemina, que pertenece a la familia de factores neurotróficos derivados de la estirpe de células gliales (GDNF). Es una de las proteínas alfa receptoras de la familia de GDNF que, una vez unida a su ligando, la artemina, media la activación del receptor tirosina quinasa RET ("reorganizado durante la transfección"). Hasta la fecha, se han reconocido cuatro miembros de la familia de GFRa, GFRa-1-4 (Lindsay RM et al., Neuron, (1996), 17:571-574; Airaksinen, M. S., et al., Mol. Cell Neurosci., (1999), 13:313-325). GFRa3 también se conoce en la técnica como receptor alfa 3 de la familia de GDNF, receptor unido a GPI o receptor alfa-3 del factor neurotrófico derivado de la estirpe de células gliales. El término "GFRa3" o "hGFRa3", o fragmentos de la misma, como se usa en el presente documento, se refiere a la proteína GFRa3 humana o fragmento de la misma, a menos que se especifique que sea de una especie no humana, por ejemplo, "GFRa3 de ratón", "GFRa3 de rata" o "GFRa3 de mono". Por otra parte, "GFRa3", o "hGFRa3", como se usa en el presente documento, se refiere a GFRa3 humano codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en SEQ ID NO: 374 (número de acceso del Genbank NM_001496) y tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 375 (número de acceso del Genbank NP_001487.2) o un fragmento biológicamente activo de la misma. La secuencia señal abarca los restos de aminoácido 1-31 de SEQ ID NO: 375, la proteína madura engloba los restos de aminoácidos 32-382 de SEQ ID NO: 375, mientras que la región Pro C-terminal engloba los restos de aminoácidos 383-400 de SEQ ID NO: 375. El sitio de escisión de GPI se encuentra en el resto de aminoácido 374 de SEQ ID NO: 375 (asparagina). La secuencia de aminoácidos de la artemina humana se encuentra en el Genbank como número de acceso Q5T4W7 y la secuencia de aminoácidos de la artemina humana (de los aminoácidos A108-G220 del número de acceso Q5T4W7) con un marcador myc-mychexahistidina se muestra como SEQ ID NO: 369 (siendo los restos de aminoácidos 114-141 de SEQ ID NO: 369 el marcador myc-myc-hexahistidina).
Aunque GFRa3 es estructural y funcionalmente similar a los otros miembros de la familia de GFRa, GFRa3 es el que se relaciona más distantemente de los cuatro miembros de la familia. GFRa1 y GFRa2 comparten aproximadamente el 50 % de identidad (Sanicola, M. et al., PNAS, EE.UU., (1997), 94:6238-43; Klein, R. D., et al., (1997), Nature, 387:717-21; Buj-Bello, A. et al., Nature (1997), 387:721-4; Baloh, R. H., et al., Neuron, (1997), 18:793-802), mientras que GFRa3 solo tiene el 32 y el 37 % de identidad, respectivamente, con estas proteínas (Masure, S. et al., Eur. J. Biochem., (1998), 251:622-30; Nomoto, S. et al., BBRC, (1998), 244:849-53). La secuencia de aminoácidos de GFRa3 de ratón tiene el siguiente número de acceso del Genbank: NP_034410.3. La secuencia de aminoácidos de GFRa1 humano tiene el siguiente Número de Acceso del Genbank: NP_005255.1, y también se encuentra como SEQ ID NO: 376. La secuencia de aminoácidos de GFRa3 de mono cangrejero se muestra en SEQ ID NO: 377, y la secuencia de aminoácidos de RET de mono cangrejero se muestra en SEQ ID NO: 378.
El término "anticuerpo", como se usa en el presente documento, pretende hacer referencia a moléculas de inmunoglobulina compuestas de cuatro cadenas polipeptídicas, dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas por enlaces disulfuro (es decir, "moléculas de anticuerpo completo"), así como multímeros de las mismas (por ejemplo, IgM) o sus fragmentos de unión al antígeno. Cada cadena pesada se compone de una región variable de cadena pesada ("HCVR" o "Vh") y una región constante de cadena pesada (que se compone de los dominios Ch1, Ch2 y Ch3). Cada cadena ligera se compone de una región variable de cadena ligera ("LCVR o "Vl") y una región constante de cadena ligera (Cl). Las regiones Vh y Vl pueden subdividirse además en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de complementariedad (CDR), intercaladas con regiones que están más conservadas, llamadas regiones flanqueantes (FR). Cada Vh y Vl está compuesta por tres CDR y cuatro FR, dispuestas del extremo amino al extremo carboxi en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. En determinadas realizaciones de la invención, las FR del anticuerpo antiGFRa3 (o fragmento de unión al antígeno del mismo) pueden ser idénticas a las secuencias de la línea germinal humana, o pueden estar modificarse de forma natural o artificial. Una secuencia consenso de aminoácidos se puede definir basándose en un análisis paralelo de dos o más CDR.
También es posible la sustitución de uno o más restos de CDR o la omisión de una o más CDR. En la bibliografía científica, se han descrito anticuerpos en los que se puede prescindir de una o dos CDR para la unión. Padlan et al. (1995 FASEB J. 9:133-139) analizaron las regiones de contacto entre los anticuerpos y sus antígenos, basándose en estructuras cristalinas publicadas, y concluyeron que solo de aproximadamente un quinto a un tercio de los restos de CDR realmente entran en contacto con el antígeno. Padlan también encontró muchos anticuerpos en los que una o dos CDR no tenían aminoácidos en contacto con un antígeno (véase también, Vajdos et al. 2002 J Mol Biol 320:415-428).
Los restos de CDR que no entran en contacto con el antígeno se pueden identificar basándose en estudios previos (por ejemplo, los restos H60-H65 de CDRH2 no suelen ser necesarios), de regiones de CDR de Kabat que se encuentran fuera de las CDR de Chothia, mediante modelización molecular y/o empíricamente. Si se omite una CDR, o uno o más restos de la misma, normalmente se sustituye con un aminoácido que ocupa la posición correspondiente en otra secuencia de anticuerpo humano o un consenso de dichas secuencias. Las posiciones para la sustitución dentro de las CDR y los aminoácidos para sustituir también pueden seleccionarse empíricamente. Las sustituciones empíricas pueden ser sustituciones conservativas o no conservativas.
Los anticuerpos anti-hGFRa3 completamente humanos desvelados en el presente documento pueden comprender una o más sustituciones, inserciones y/o eliminaciones de aminoácidos en la región marco conservada y/o las regiones CDR de los dominios variables de cadena pesada y ligera en comparación con secuencias germinales correspondientes. Dichas mutaciones pueden averiguarse fácilmente comparando las secuencias de aminoácidos divulgadas en el presente documento con secuencias de la línea germinal disponibles en, por ejemplo, bases de datos de secuencias de anticuerpos públicas. La presente invención incluye anticuerpos y fragmentos de unión al antígeno de los mismos, que se obtienen de cualquiera de las secuencias de aminoácidos desveladas en el presente documento, en los que uno o más aminoácidos dentro de una o más regiones marco y/o CDR están retromutados al/a los restos de la estirpe germinal correspondiente o a una sustitución de aminoácido conservativa (natural o no natural) del/de los resto/s de la estirpe germinal correspondiente (siendo dichos cambios de secuencia denominados en el presente documento "retromutaciones a la estirpe germinal"). Un experto en la materia, partiendo con las secuencias de la región variable de cadena pesada y ligera divulgadas en el presente documento, puede producir fácilmente numerosos anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno que comprenden una o más retromutaciones de la estirpe germinal individuales o combinaciones de las mismas. En determinadas realizaciones, todos los restos de la región marco y/o CDR de los dominios Vh y/o Vl son retromutados a la secuencia de la estirpe germinal. En otras realizaciones, solo se pueden retromutar determinados restos a la secuencia de la estirpe germinal, por ejemplo, solo los restos mutados encontrados dentro de los primeros 8 aminoácidos de FR1 o dentro de los últimos 8 aminoácidos de FR4, o únicamente los restos mutados encontrados dentro de FR1, FR2, FR3, FR4, o solo los restos mutados encontrados dentro de CDR1, CDR2 o CDR3. Además, los anticuerpos de la presente invención pueden contener cualquier combinación de dos o más retromutaciones de la estirpe germinal dentro de las regiones marco conservadas y/o CDR, es decir, en las que ciertos restos individuales se vuelven a mutar a la secuencia de la estirpe germinal, mientras que otros restos que difieren de la secuencia de la estirpe germinal se mantienen. Una vez obtenidos, los anticuerpo y fragmentos de unión a antígeno que contienen una o más retromutaciones de la estirpe germinal pueden ensayarse fácilmente para una o más propiedades deseadas tales como, especificidad de unión mejorada, afinidad de unión aumentada, propiedades biológicas antagonista o agonistas mejoradas o potenciadas (según pueda ser el caso), inmunogenicidad reducida, etc. Los anticuerpos y fragmentos de unión al antígeno obtenidos de esta manera general están incluidos dentro de la presente invención.
La expresión "anticuerpo humano", como se usa en el presente documento, pretende incluir anticuerpos que tienen regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana. Los anticuerpos monoclonales humanos de la invención pueden incluir restos de aminoácidos no codificados por las secuencias de inmunoglobulinas de la línea germinal humana (por ejemplo, mutaciones introducidas por mutagénesis aleatoria y de sitio in vitro o mediante mutación somática in vivo), por ejemplo, en las CDR y, en particular, en CDR3. Sin embargo, la expresión "anticuerpo humano", como se usa en el presente documento, no pretende incluir anticuerpos monoclonales en que las secuencias CDR derivadas de la estirpe germinal de otra especie de mamífero (por ejemplo, ratón), se han injertado en secuencias FR humanas. Los anticuerpos anti-GFRa3 humanos de la invención pueden denominarse "anti-hGFRa3" o "anti-GFRa3".
La expresión "se une específicamente", o similares, significa que un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo forma un complejo con un antígeno que es relativamente estable en condiciones fisiológicas. La unión específica se puede caracterizar por una constante de disociación de equilibrio de al menos aproximadamente 1 x 10­ 6 M o inferior (por ejemplo, una Kd menor denota una unión más fuerte). Los métodos para determinar si dos moléculas se unen específicamente son bien conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, diálisis en equilibrio, resonancia de plasmones superficiales y similares. Un anticuerpo aislado que se une específicamente a hGFRa3 puede, sin embargo, presentar reactividad cruzada con otros antígenos, tales como las moléculas de GFRa3 de otras especies. Por otra parte, los anticuerpos multiespecíficos que se unen a hGFRa3 y uno o más antígenos adicionales o un biespecífico que se une a dos regiones diferentes de hGFRa3 se consideran anticuerpos que "se unen específicamente" a hGFRa3, como se usa en el presente documento.
Como se usa en el presente documento, la expresión "no se une" a una molécula diana específica (por ejemplo, un péptido GFRa3 particular ) significa que el anticuerpo, cuando se ensaya para determinar la unión a la molécula diana a 25 °C en un ensayo de resonancia de plasmón, muestra una Kd superior a 500 nM, o si se ensaya para determinar la unión a la molécula diana a 25 °C en un ensayo de inmunoabsorción ligado a una enzima (ELISA) presenta una CE50 superior a 50 nM, o no presenta ninguna unión en ninguno de los dos. tipos de ensayo o equivalente del mismo.
La expresión anticuerpo de "alta afinidad" se refiere a aquellos anticuerpos monoclonales que tienen una afinidad de unión a hGFRa3 de al menos 10-9 M; preferentemente 10-10 M; más preferentemente 10-11 M, incluso más preferentemente 10-12 M, medida en un ensayo de resonancia de plasmón superficial, por ejemplo, BIACORE™ o ELISA de afinidad en solución.
La expresión "velocidad de disociación lenta", "Koff" o "kd" pretenden significar un anticuerpo que se disocia de hGFRa3 con una constante de velocidad de 1 x 10-3 s-1 o inferior, preferentemente 1 x 10-4 s-1 o inferior, determinada en un ensayo de resonancia de plasmón superficial, por ejemplo, BlACORE™.
Las expresiones "parte de unión al antígeno" de un anticuerpo, "fragmento de unión al antígeno" de un anticuerpo y similares, como se usa en el presente documento, incluyen cualquier polipéptido o glucoproteína de origen natural, obtenible enzimáticamente, sintético o modificado por ingeniería genética que se une específicamente a un antígeno para formar un complejo. Las expresiones "parte de unión al antígeno" de un anticuerpo o "fragmento de anticuerpo", como se usa en el presente documento, se refieren a uno o más fragmentos de un anticuerpo que conservan la capacidad de unirse específicamente a hGFRa3.
En realizaciones específicas, el anticuerpo o los fragmentos de anticuerpos de la invención se pueden conjugar con un resto terapéutico ("inmunoconjugado"), tal como un opioide, un inhibidor de COX-2, un anestésico local, un antagonista de citocinas, tal como inhibidor de IL-1 o IL-6, un segundo inhibidor de GFRa3, un modulador de NMDA, un agonista del receptor cannabinoide, un modulador de la familia de P2X, un antagonista de VR1, un antagonista de la sustancia P, un agente quimioterapéutico o un radioisótopo.
Un "anticuerpo aislado", como se usa en el presente documento, pretende hacer referencia a un anticuerpo que está esencialmente libre de otros anticuerpos que tienen diferentes especificidades antigénicas (por ejemplo, un anticuerpo aislado que se une específicamente a hGFRa3 o un fragmento del mismo, está esencialmente libre de anticuerpos que se unen específicamente a antígenos diferentes de hGFRa3).
Un "anticuerpo neutralizante", como se usa en el presente documento (o un "anticuerpo que neutraliza la actividad GFRa3"), se refiere a un anticuerpo cuya unión a hGFRa3 produce la inhibición de al menos una actividad biológica de GFRa3. Esta inhibición de la actividad biológica de GFRa3 se puede evaluar midiendo uno o más indicadores de actividad biológica de GFRa3 mediante uno o más de varios ensayos convencionales in vitro o in vivo conocidos en la técnica (véanse los ejemplos a continuación).
La expresión "resonancia de plasmón superficial", como se usa en el presente documento, se refiere a un fenómeno óptico que permite el análisis de interacciones biomoleculares en tiempo real mediante la detección de las alteraciones a concentraciones de proteína dentro de una matriz biodetectora, por ejemplo, usando el sistema BIACORE ™ (Pharmacia Biosensor Ab, Uppsala, Sweden y Piscataway, N.J.).
El término "KD", como se usa en el presente documento, pretende hacer referencia a la constante de disociación en equilibrio de una interacción particular de anticuerpo-antígeno.
El término "epítopo" se refiere a un determinante antigénico que interactúa con un sitio de unión a antígeno específico en la región variable de una molécula de anticuerpo conocida como parátopo. Un único antígeno puede tener más de un epítopo. Por tanto, diferentes anticuerpos pueden unirse a diferentes áreas en un antígeno o puede tener diferentes efectos biológicos. El término "epítopo"también se refiere a un sitio en un antígeno al que responden los linfocitos B y/o T. También se refiere a una región de un antígeno que está unida por un anticuerpo. Los epítopos pueden definirse como estructurales o funcionales. En general, los epítopos funcionales son un subconjunto de los epítopos estructurales y tienen aquellos restos que contribuyen directamente a la afinidad de la interacción. Los epítopos también pueden ser conformacionales, es decir, compuestos de aminoácidos no lineales. En determinadas realizaciones, los epítopos pueden incluir determinantes que son grupos de moléculas químicamente activas en la superficie tales como aminoácidos, cadenas laterales de azúcar, grupos fosforilo o grupos sulfonilo, y en determinadas realizaciones, pueden tener características estructurales tridimensionales específicas y/o características de carga específicas.
La expresión "identidad sustancial" o "esencialmente idéntico", cuando hace referencia a un ácido nucleico o fragmento del mismo, indica que, cuando se alinean de forma óptima con inserciones o eliminaciones de nucleótidos apropiadas con otro ácido nucleico (o su hebra complementaria), existe identidad de secuencia de nucleótidos en al menos aproximadamente el 90 %, y más preferentemente al menos aproximadamente el 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de las bases nucleotídicas, medida por cualquier algoritmo bien conocido de identidad de secuencia, tal como FASTA, BLAST o GAP, como se analiza a continuación. Una molécula de ácido nucleico que tiene una identidad sustancial con una molécula de ácido nucleico de referencia puede, en determinados casos, codificar un polipéptido que tenga la misma secuencia de aminoácidos o una secuencia de aminoácidos esencialmente similar al polipéptido codificado por la molécula de ácido nucleico de referencia.
Aplicada a los polipéptidos, la expresión "similitud sustancial" o "esencialmente similar" significa que dos secuencias peptídicas, cuando se alinean de forma óptima, tal como mediante los programas GAP o BESTFIT usando ponderaciones de hueco por defecto, comparten al menos el 90 % de identidad de secuencia, incluso más preferentemente al menos el 95 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia. Preferentemente, las posiciones de los restos, que no son idénticas, difieren en sustituciones conservativas de aminoácidos. Una "sustitución de aminoácido conservativa" es una en que un resto de aminoácido está sustituido por otro resto de aminoácido que tiene una cadena lateral (grupo R) con propiedades químicas similares (por ejemplo, carga o hidrofobicidad). En general, una sustitución de aminoácido conservativa no cambiará sustancialmente las propiedades funcionales de una proteína. En casos donde dos o más secuencias de aminoácidos difieren entre sí por sustituciones conservativas, el porcentaje o grado de similitud puede ajustarse al alza para corregir la naturaleza conservativa de la sustitución. Los medios para realizar este ajuste son bien conocidos para los expertos en la materia (véase, por ejemplo, Pearson (1994) Methods Mol. Biol.
24: 307-331). Los ejemplos de grupos de aminoácidos que tienen cadenas laterales con propiedades químicas similares incluyen 1) cadenas laterales alifáticas: glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; 2 ) cadenas secundarias de hidroxilo alifáticas: serina y treonina; 3 ) cadenas secundarias que contienen amida: asparagina y glutamina; 4) cadenas laterales aromáticas: fenilalanina, tirosina y triptófano; 5) cadenas laterales básicas: lisina, arginina e histidina; 6) cadenas laterales ácidas: aspartato y glutamato; y 7) cadenas laterales que contienen azufre: cisteína y metionina. Los grupos de sustitución de aminoácidos conservativa preferidos son: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina-valina, glutamato-aspartato y asparagina-glutamina. Como alternativa, un reemplazo conservativo es cualquier cambio que tenga un valor positivo en la matriz de probabilidad logarítmica PAM250 descrita en Gonnet et al. (Véase Gonnet et al., Science, (1992), 256:144345). Un remplazo "moderadamente conservativo" es cualquiera cambio que tenga un valor no negativo en la matriz de probabilidad logarítmica PAM250.
La similitud de secuencia para los polipéptidos se mide normalmente usando un software de análisis de secuencia. El programa informático de análisis de proteínas acopla secuencias similares usando medidas de similitud asignadas a diversas sustituciones, eliminaciones y otras modificaciones, incluyendo sustituciones de aminoácidos conservativas. Por ejemplo, el programa informático GCG contiene programas tales como GAP y BESTFIT que pueden usarse con parámetros por defecto para determinar la homología de secuencia o la identidad de secuencia entre polipéptidos muy relacionados, tales como polipéptidos homólogos de diferentes especies de organismos o entre una proteína de tipo silvestre y una muteína de la misma. Véase, por ejemplo, GCG Versión 6.1. Las secuencias polipeptídicas también pueden compararse usando FASTA con parámetros por defecto o recomendados; un programa en GCG Versión 6.1. FASTA (por ejemplo, FASTA2 y FASTA3) proporciona alineaciones y porcentajes de identidad de secuencia de las regiones del mejor solapamiento entre las secuencias de consulta y de búsqueda (Pearson (2000) supra). Otro algoritmo preferido cuando se compara una secuencia de la invención con una base de datos que contiene una gran cantidad de secuencias de diferentes organismos es el programa informático BLAST, especialmente BLASTP o TBLASTN, usando parámetros por defecto. (Véase, por ejemplo, Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403 410 y (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389402).
En realizaciones específicas, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo para su uso en el presente documento puede ser monoespecífico, biespecífico o multiespecífico. Los anticuerpos multiespecíficos pueden ser específicos para diferentes epítopos de un polipéptido diana o pueden contener dominios de unión al antígeno específicos de epítopos de más de un polipéptido diana. Un formato de anticuerpo biespecífico ilustrativo que puede usarse en el contexto de la presente invención implica el uso de un primer dominio Ch3 de inmunoglobulina (Ig) y un segundo dominio Ch3 de Ig, en el que el primer y el segundo dominio Ch3 de Ig difieren entre sí en al menos un aminoácido, y en el que al menos una diferencia de aminoácido reduce la unión del anticuerpo biespecífico a proteína A en comparación con un anticuerpo biespecífico que carece de la diferencia de aminoácido. En una realización, el primer dominio Ch3 de Ig se une a proteína A y el segundo dominio Ch3 de Ig contiene una mutación que reduce o anula la unión a proteína A tal como una modificación H95R (por numeración de exones IMGT; H435R por numeración EU). El segundo Ch3 puede comprender además una modificación Y96F (por IMGT; Y436F por EU). Modificaciones adicionales que pueden encontrarse dentro del segundo Ch3 incluyen: D16E, L18M, N44S, K52N, V57M y V82I (por IMGT; D356E, L358M, N384S, K392N, V397M y V422I por EU) en el caso de anticuerpos monoclonales IgG1; N44S, K52N y V82I (IMGT; N384S, K392N y V422I por EU) en el caso de anticuerpos monoclonales IgG2; y Q15R, N44S, K52N, V57M, R69K, E79Q y V82I (por IMGT; Q355R, N384S, K392N, V397M, R409K, E419Q y V422I por EU) en el caso de anticuerpos monoclonales IgG4. Las variaciones en el formato de anticuerpo biespecífico descrito anteriormente se contemplan dentro del alcance de la presente invención.
La expresión "cantidad terapéuticamente eficaz" pretende significar una cantidad que produce el efecto deseado a quien se administra. La cantidad exacta dependerá del objetivo del tratamiento, y serán discernibles por un experto en la materia usando las técnicas conocidas (véanse, por ejemplo, Lloyd (1999) “The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding”).
La expresión "síndrome/s de dolor funcional" se refiere a los síndromes basados en síntomas crónicos que afectan hasta al 15 % de la población mundial. Se caracterizan por el dolor crónico y las molestias a las que se hace referencia en diferentes partes del cuerpo. No se han identificado anomalías estructurales, inflamatorias o bioquímicas acordadas en general que puedan explicar completamente los síntomas. Los pacientes muestran una calidad de vida muy reducida, pero las opciones de tratamiento son limitadas, y el desarrollo de los nuevos enfoques terapéuticos ha sido decepcionante. Algunos de los trastornos comunes que se incluyen en esta categoría incluyen el dolor crónico y agudo, síndrome del intestino irritable (SII), fibromialgia (FM), síndrome de fatiga crónica, síndrome de dolor abdominal funcional, trastorno de la articulación temporomandibular (TMJD), síndrome de vejiga dolorosa (cistitis intersticial), trastornos/síndromes gastrointestinales funcionales, síndrome de dolor rectal funcional, síndrome de dolor torácico funcional, migrañas y cefaleas de tipo tensional, síndrome de dolor pélvico crónico, síndrome de próstata dolorosa (prostatitis crónica), síndrome de sensibilidad química múltiple y síndrome de la Guerra del Golfo.
Descripción general
La familia relacionada con el factor neurotrófico derivado de la estirpe de células gliales incluye el factor neurotrófico derivado de la estirpe de células gliales (GDNF), la neurturina (NRTN), la persefina (PSPN) y la artemina (ARTN). Las proteínas de la familia de GDNF participan diferencialmente en el desarrollo y mantenimiento de las neuronas sensoriales, entéricas, simpáticas y parasimpáticas, y en una variedad de tejidos no neurales (Henderson, C. E., et al., (1994), Science 266:1062-1064; Kotzbauer, P. T. et al., (1996), Nature 384:467-470; Springer, J. E., et al. (1994), Exp. Neurol. 127:167-170; Schaar. D. G., et al., (1993), Exp. Neurol. 124:368-371). El GDNF es un factor de supervivencia especialmente potente para las neuronas motoras dopaminérgicas, noradrenérgicas y espinales (Yan, Q. et al. (1995), Nature, 373:341-344; Henderson, C. E., et al., (1994), Science, 266:1062-1064; Buj-Bello, A. et al., (1995), Neuron, 15:821-828). Otros miembros del crecimiento de la familia de GDNF tienen funciones fuera del sistema nervioso (Trupp, M. et al., (1995), J. Cell Biol. 130:137-148; Kotzbauer, P. T. et al., (1996), Nature 384:467-470; Springer, J. E., et al. (1994), Exp. Neurol. 127:167-170; Schaar. D. G., et al., (1993), Exp. Neurol. 124:368-371). Por ejemplo, NRTN, ARTN y PSPN también se expresan en el riñón en desarrollo. GDNF también tiene papeles fundamentales fuera del sistema nervioso en la regulación de la morfogénesis renal y la espermatogénesis (Airaksinen, M. S. et al., (2002), Nature Reviews 3:383-392).
Cada miembro de la familia de GDNF se une preferentemente a (es decir, es un ligando para) un receptor de proteína anclada a glicosilfosfatidilinositol (GPI) asociado dinámicamente con la membrana plasmática. La familia del receptor alfa de la familia de GDNF se compone de cuatro receptores diferentes: GFRalfa1 (GFRa1, GDNFR-alfa); GFRalfa2 (GFRa2/TrnR2/GDNFR-beta/NTNR-alfa/RETL2); GFRalfa3 (GFRa3); y GFRalfa4 (GFRa4). El GDNF se une preferentemente a GFRa1, la NRTN se une preferentemente a GFRa2, la ARTN se une preferentemente a GFRa3 y la PSPN se une preferentemente a GFRa4 (Airaksinen, M. S., et al. Nature Reviews Neuroscience (2002), 3:383-394).
GFRa2 se expresa a un alto nivel en la corteza, cerebro anterior basal y capas específicas del bulbo olfativo, y se expresa a un bajo nivel en la sustancia negra, el cerebelo y los núcleos motores. GFRa3 se expresa en los nervios del ratón fetal y adulto, ganglios simpáticos y sensoriales, intestino, corazón, cerebro, pulmón y riñón. GFRa4 se expresa a niveles bajos en diferentes áreas del cerebro adulto, así como en algunos tejidos periféricos, incluyendo los testículos y el corazón. Aunque las preferencias de unión de los miembros de la familia de GDNF se muestran anteriormente como GDNF por GFRa1; neurturina por GFRa2; artemina por GFRa3; y persefina por GFRa4, el emparejamiento de receptores con ligandos no es riguroso (Airaksinen, M. S., et al. Nature Reviews Neuroscience (2002), 3:383-394). Por ejemplo, GDNF se une a GFRa2 y a GFRa3 con menores eficacias que a GFRa1.
Los ligandos de la familia de GDNF, normalmente, pero no exclusivamente, transmiten sus señales a través de complejos de múltiples componentes compuestos de un ligando, su receptor GFR alfa y el receptor tirosina quinasa, c-Ret. Ret es un elemento común de estos complejos de señalización de ligandos. Ret es un protooncogén que activa fuertemente las señales antiapoptóticas a través de la activación de las fosfoinositol-3 quinasas (PI3-K)/PDK/AKT (PKB) y las vías Ras/Raf/MEK/ERK. Ret también puede activar la fosfolipasa C gamma (PLCgamma) que eleva el calcio intracelular y facilita la activación de los miembros de la familia de la proteína quinasa C convencional y novedosa (PKC). Los complejos de receptores de ligandos de la familia de GDNf no se limitan a la señalización a través de Ret. GDNF:GFRalfa1 puede unirse a NCAM en células que carecen de RET, y activar Fyn y FAK. En determinadas condiciones, los complejos de GDNF:GFRalfa activan directamente la quinasa src.
En determinadas realizaciones de la presente invención, se pueden usar uno cualquiera o más de los tres dominios globulares ricos en cisteína (1,2 o 3) de GFRa3, o un fragmento de la misma, para preparar anticuerpos que se unen a GFRa3 e inhibir su función, o inhibir su capacidad para unirse a su ligando, tal como, la artemina. En determinadas realizaciones, un anticuerpo de la invención específico de GFRa3 puede unirse a un dominio de unión al ligando en GFRa3, y como tal, puede bloquear la unión del complejo de ligando (artemina)-GFRa3 a RET. La secuencia de aminoácidos de longitud completa del GFRa3 humano se muestra como SEQ ID NO: 375. El ácido nucleico que codifica el GFRa3 humano se muestra en SEQ ID NO: 374. El dominio 1 engloba los restos 44-124 de SEQ ID NO: 375; el dominio 2 engloba los restos 162-239 de SEQ ID NO: 375; el dominio 3 engloba los restos 248-340 de SEQ ID NO: 375. (Véase la SEQ ID NO: 375 o el Genbank NP_001487.2).
Cualquiera de estos dominios, 1, 2 o 3, o fragmentos derivados de los mismos, se pueden usar para preparar anticuerpos que se unan específicamente a GFRa3 e inhiban su actividad, o al menos una función asociada con GFRa3. En determinadas realizaciones, los anticuerpos de la invención se unen específicamente a GFRa3 y pueden prevenir la señalización mediada por GFRa3. En determinadas realizaciones, los anticuerpos que se unen específicamente a GFRa3 pueden prevenir la unión de GFRa3 a su ligando, tal como la artemina (Wang, X. et al. Structure, (2006), 14:1083-1092). En determinadas realizaciones, los anticuerpos que se unen específicamente a GFRa3 pueden prevenir la activación del receptor tirosina quinasa RET. En determinadas realizaciones, los anticuerpos de la invención pueden unirse específicamente a GFRa3 sin prevenir la activación del receptor tirosina quinasa RET. En determinadas realizaciones, los anticuerpos de la invención pueden unirse específicamente a GFRa3 y evitar la señalización a través de RET, o a través de un mediador distinto de RET. En determinadas realizaciones, los anticuerpos de la invención pueden usarse para inhibir el crecimiento/la proliferación de células tumorales y, como tales, pueden ser útiles para tratar ciertos cánceres/tumores malignos, o el dolor asociado con dichos cánceres/tumores malignos, o el dolor asociado con la metástasis de dichos cánceres/tumores malignos (véase Tang, J-Z, et al. Mol Cancer Ther (2010), 9(6): 1697-1708; Kang, J. et al. Oncogene, (2009), 28:2034-2045; Ceyhan, G.O. et al. Annals of Surgery, (2006), 244(2):274-281; Banerjee, A., et al. Breast Cancer Res (2011), 13:R112; Pandey, V. et al., Endocrinology, (2010), 151(3):909-920; Kang, J. et al., Oncogene, (2010), 29:3228-3240; Li, S. et al. J Biomed Sci (2011), 18:24). En determinadas realizaciones, los anticuerpos que se unen específicamente a GFRa3 pueden prepararse usando fragmentos de las regiones indicadas anteriormente, o péptidos que se extienden más allá de las regiones designadas en de aproximadamente 10 a aproximadamente 50 restos de aminoácidos de cualquiera o ambos, los extremos terminales N o C de las regiones descritas en el presente documento. En determinadas realizaciones, cualquier combinación de las regiones anteriormente indicadas o fragmentos de las mismas puede usarse en la preparación de anticuerpos específicos para GFRa3. Como se ha señalado anteriormente, la longitud o el número de restos de aminoácidos que engloban los tres dominios de hGFRa3 pueden variar entre aproximadamente diez y cincuenta restos de aminoácidos que se extienden desde cualquiera o ambos extremos, al extremo N terminal o al extremo C terminal del dominio de longitud completa, o un fragmento del mismo, para la preparación de anticuerpos específicos anti-hGFRa3.
Fragmentos de anticuerpos de unión al antígeno
Salvo que se indique específicamente de otro modo, el término "anticuerpo", como se usa en el presente documento, se entenderá que engloba moléculas de anticuerpo que comprenden dos cadenas pesadas de inmunoglobulina y dos cadenas ligeras de inmunoglobulina (es decir, "moléculas de anticuerpo completas"), así como sus fragmentos de unión al antígeno. Las expresiones "parte de unión al antígeno" de un anticuerpo, "fragmento de unión al antígeno" de un anticuerpo y similares, como se usan en el presente documento, incluyen cualquier polipéptido o glicoproteína de origen natural, obtenible enzimáticamente, sintético o modificado por ingeniería genética que se une específicamente a un antígeno para formar un complejo. Las expresiones "parte de unión al antígeno" de un anticuerpo o "fragmento de anticuerpo", como se usan en el presente documento, se refieren a uno o más fragmentos de un anticuerpo que conservan la capacidad de unirse específicamente a hGFRa3. Un fragmento de anticuerpo puede incluir un fragmento Fab, un fragmento F(ab')2, un fragmento Fv, un fragmento dAb, un fragmento que contiene una CDR, o una CDR aislada. Los fragmentos de unión al antígeno de un anticuerpo pueden obtenerse, por ejemplo, de moléculas de anticuerpo completas usando cualquier técnica convencional adecuada tal como digestión proteolítica o técnicas de ingeniería genética recombinantes que implica la manipulación y expresión de ADN que codifica dominios variables de anticuerpo y (opcionalmente) constantes. Dicho ADN se conoce y/o se puede obtener fácilmente de, por ejemplo, fuentes comerciales, genotecas de ADN (incluyendo, por ejemplo, fagotecas de anticuerpos), o pueden sintetizarse. El ADN puede secuenciarse y manipularse químicamente o usando técnicas de biología molecular, por ejemplo, para disponer uno o más dominios variables y/o constantes en una configuración adecuada, o para introducir codones, crear restos de cisteína, modificar, añadir o eliminar aminoácidos, etc.
Los ejemplos no limitantes de fragmentos de unión al antígeno incluyen: (i) fragmentos Fab; (ii) fragmentos F(ab')2; (iii) fragmentos Fd; (iv) fragmentos Fv; (v) moléculas Fv de cadena sencilla (scFv); (vi) fragmentos dAb; y (vii) unidades de reconocimiento mínimas que consisten en los restos de aminoácidos que imitan la región hipervariable de un anticuerpo (por ejemplo, una región determinante de la complementariedad (CDR) aislada). Otras moléculas modificadas por ingeniería genética, como diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos y minicuerpos, también se incluyen dentro de la expresión "fragmento de unión al antígeno", como se usa en el presente documento.
Un fragmento de unión al antígeno de un anticuerpo normalmente comprenderá al menos un dominio variable. El dominio variable puede ser de cualquier tamaño o composición de aminoácidos y, en general, comprenderá al menos una CDR que es adyacente o está en fase con una o más secuencias marco. En fragmentos de unión al antígeno que tienen un dominio Vh asociado con un dominio Vl, los dominios Vh y Vl pueden situarse entre sí en cualquier disposición adecuada. Por ejemplo, la región variable puede ser dimérica y contener los dímeros Vh-Vh, Vh-Vl o Vl-Vl. Como alternativa, el fragmento de unión al antígeno de un anticuerpo puede contener un dominio Vh o Vl monomérico.
En determinadas realizaciones, un fragmento de unión al antígeno de un anticuerpo puede contener al menos un dominio variable unido covalentemente a al menos un dominio constante. Los ejemplos, no limitantes, de configuraciones de dominios variables y constantes que se pueden encontrar dentro de un fragmento de unión al antígeno de un anticuerpo de la presente invención incluyen: (i) Vh-Ch1; (ii) Vh-Ch2; (iii) Vh Ch3; (iv) Vh-Ch1-Ch2; (v) Vh-Ch1-Ch2-Ch3; (vi) Vh-Ch2-Ch3; (vii) Vh-Cl; (viii) Vl Ch1; (ix) Vl-Ch2; (x) Vl-Ch3; (xi) Vl-Ch1-Ch2; (xii) Vl-Ch1-Ch2-Ch3; (xiii) Vl-Ch2-Ch3; y (xiv) Vl-Cl. En cualquier configuración de dominios variables y constantes, incluyendo cualquiera de las configuraciones ilustrativas enumeradas anteriormente, los dominios variables y constantes pueden estar unidos directamente entre sí o pueden estar unidos mediante una bisagra o región conectora total o parcial. Una región de bisagra puede consistir en al menos 2 (por ejemplo, 5, 10, 15, 20, 40, 60 o más) aminoácidos, que producen una unión flexible o semiflexible entre dominios variables y/o constantes adyacentes en una sola molécula polipeptídica. Por otra parte, un fragmento de unión al antígeno de un anticuerpo de la presente invención puede comprender un homodímero o heterodímero (u otro multímero) de cualquiera de las configuraciones de dominio variable y constante enumeradas anteriormente en asociación no covalente entre sí y/o con uno o más dominios Vh o Vl monoméricos (por ejemplo, mediante uno o más enlaces disulfuro).
Como con las moléculas de anticuerpo completas, los fragmentos de unión al antígeno pueden ser monoespecíficos o multiespecíficos (por ejemplo, biespecíficos). Un fragmento de unión al antígeno multiespecífico de un anticuerpo normalmente comprenderá al menos dos dominios variables diferentes, en los que cada dominio variable puede unirse específicamente a un antígeno diferente o a un epítopo diferente en el mismo antígeno. Cualquier formato de anticuerpo multiespecífico, incluyendo los formatos de anticuerpo biespecíficos ilustrativos desvelados en el presente documento, puede adaptarse para su uso en el contexto de un fragmento de unión al antígeno de un anticuerpo de la presente invención usando técnicas rutinarias disponibles en la técnica.
Preparación de anticuerpos humanos
Los métodos para generar anticuerpos humanos en ratones transgénicos son conocidos en la técnica. Cualquiera de dichos métodos conocidos puede usarse en el contexto de la presente invención para preparar anticuerpos humanos que se unan específicamente a GFRa3 humano.
Usando la tecnología VELOCIMMUNE™ o cualquier otro método conocido para generar anticuerpos monoclonales, inicialmente se aíslan anticuerpos quiméricos de alta afinidad contra GFRa3 que tienen una región variable humana y una región constante de ratón. Como en la siguiente sección experimental, los anticuerpos se caracterizan y seleccionan para las características deseables, incluyendo la afinidad, selectividad, epítopo, etc. Las regiones constantes de ratón se remplazan por una región constante humana deseada para generar el anticuerpo completamente humano de la invención, por ejemplo, IgG1 o IgG4 de tipo silvestre o modificada. Aunque la región constante seleccionada puede variar de acuerdo con el uso específico, las características de unión al antígeno de alta afinidad y especificidad de diana residen en la región variable.
En general, los anticuerpos de la presente invención poseen afinidades muy altas, que normalmente poseen Kd de aproximadamente 10-13 a aproximadamente 10-8 M, o de aproximadamente 10-12 a aproximadamente 10-9 M cuando se miden mediante unión al antígeno inmovilizado en fase sólida o en fase de solución. Las regiones constantes de ratón se remplazan por regiones constantes humanas deseadas para generar los anticuerpos completamente humanos de la invención. Aunque la región constante seleccionada puede variar de acuerdo con el uso específico, las características de unión al antígeno de alta afinidad y especificidad de diana residen en la región variable.
Bioequivalentes
Los anticuerpos anti-GFRa3 y fragmentos de anticuerpos descritos en el presente documento abarcan proteínas que tienen secuencias de aminoácidos que varían de las de los anticuerpos descritos, pero que conservan la capacidad de unirse a GFRa3. Dichos anticuerpos variantes y fragmentos de anticuerpo comprenden una o más adiciones, eliminaciones o sustituciones de aminoácidos cuando se comparan con la secuencia precursora, pero muestran actividad biológica que es esencialmente equivalente a la de los anticuerpos descritos. Asimismo, las secuencias de ADN que codifican el anticuerpo anti-GFRa3 de la presente invención engloban secuencias que comprenden una o más adiciones, eliminaciones o sustituciones de nucleótidos en comparación con la secuencia divulgada, pero que codifican un anticuerpo anti-GFRa3 o fragmento de anticuerpo que es esencialmente bioequivalente a un anticuerpo anti-GFRa3 o fragmento de anticuerpo de la invención.
Dos proteínas de unión al antígeno o anticuerpos, se consideran bioequivalentes si, por ejemplo, son equivalentes farmacéuticos o alternativas farmacéuticas cuya tasa y grado de absorción no muestran una diferencia significativa cuando se administran a la misma dosis molar en condiciones experimentales similares, bien en una sola dosis o en múltiples dosis. Algunos anticuerpos se considerarán equivalentes o alternativas farmacéuticas si son equivalentes en el grado de su absorción, pero no en su tasa de absorción y aún pueden considerarse bioequivalentes porque dichas diferencias en la tasa de absorción son intencionadas y se reflejan en el marcaje, no son esenciales para obtener las concentraciones eficaces del fármaco en el organismo en, por ejemplo, uso crónico, y se consideran médicamente insignificantes para el producto farmacológico particular estudiado.
En una realización, dos proteínas de unión al antígeno son bioequivalentes si no hay diferencias clínicamente importantes en su seguridad, pureza y potencia.
En una realización, dos proteínas de unión al antígeno son bioequivalentes si un paciente puede cambiarse una o más veces entre el producto de referencia y el producto biológico sin un aumento esperado en el riesgo de efectos adversos, incluyendo un cambio clínicamente significativo en la inmunogenicidad, o eficacia disminuida, en comparación con tratamiento continuado sin dicho cambio.
En una realización, dos proteínas de unión al antígeno son bioequivalentes si ambas actúan por un mecanismo o mecanismos comunes de acción para la afección o afecciones de uso, en la medida en que dichos mecanismos sean conocidos.
La bioequivalencia puede demostrarse mediante métodos in vivo y/o /in vitro. Las medidas de bioequivalencia incluyen, por ejemplo, (a) un ensayo in vivo en seres humanos u otros mamíferos, en el que se mide la concentración del anticuerpo o sus metabolitos en sangre, plasma, suero u otro líquido biológico en función del tiempo; (b) un ensayo in vitro que se ha correlacionado con y es razonablemente predictivo de datos de biodisponibilidad in vivo en seres humanos; (c) un ensayo in vivo en seres humanos u otros mamíferos en el que se mide el efecto farmacológico agudo apropiado del anticuerpo (o su diana) en función del tiempo; y (d) en un ensayo clínico bien controlado que establece la seguridad, eficacia o biodisponibilidad o bioequivalencia de un anticuerpo.
Las variantes bioequivalentes de anticuerpos anti-GFRa3 de la invención pueden construirse, por ejemplo, generando diversas sustituciones de restos o secuencias o eliminando restos terminales o internos o secuencias no necesarias para la actividad biológica. Por ejemplo, los restos de cisteína no esenciales para la actividad biológica pueden eliminarse o remplazarse con otros aminoácidos para evitar la formación de puentes disulfuro intramoleculares innecesarios o incorrectos tras la renaturalización. En otros contextos, los anticuerpos bioequivalentes pueden incluir variantes de anticuerpos anti-GFRa3 que comprenden cambios de aminoácidos, que modifican las características de glicosilación de los anticuerpos, por ejemplo, mutaciones que eliminan o retiran la glucosilación.
Anticuerpos anti-GFRa3 que comprenden variantes de Fc
De acuerdo con determinadas realizaciones de la presente invención, se proporcionan anticuerpos anti-GFRa3 que comprenden un dominio Fc que comprende una o más mutaciones, que potencian o disminuyen la unión del anticuerpo al receptor FcRn, por ejemplo, a pH ácido en comparación con el pH neutro. Por ejemplo, la presente invención incluye anticuerpos anti-GFRa3 que comprenden una mutación en la región CH2 o CH3 del dominio Fc, en la que la/s mutación/es aumenta/n la afinidad del dominio Fc hacia FcRn en un ambiente ácido (por ejemplo, en un endosoma en el que el pH varía de aproximadamente 5,5 a aproximadamente 6,0). Dichas mutaciones pueden dar lugar a un aumento de la semivida en suero del anticuerpo cuando se administra a un animal. Los ejemplos no limitantes de dichas modificaciones de Fc incluyen, por ejemplo, una modificación en la posición 250 (por ejemplo, E o Q); 250 y 428 (por ejemplo, L o F); 252 (por ejemplo, L/Y/F/W o T), 254 (por ejemplo, S o T), y 256 (por ejemplo, S/R/Q/E/D o T); o una modificación en la posición 428 y/o 433 (por ejemplo, H/l/R/S/P/Q o K) y/o 434 (por ejemplo, H/F o Y); o una modificación en la posición 250 y/o 428; o una modificación en la posición 307 o 308 (por ejemplo, 308F, V308F) y 434. En una realización, la modificación comprende una modificación de 428L (por ejemplo, M428L) y 434S (por ejemplo, N434S); una modificación 428L, 2591 (por ejemplo, V259I) y 308F (por ejemplo, V308F); una modificación 433K (por ejemplo, H433K) y una modificación 434 (por ejemplo, 434Y); una modificación 252, 254 y 256 (por ejemplo, 252Y, 254T y 256E); una modificación 250Q y 428L (por ejemplo, T250Q y M428L); y una modificación 307 y/o 308 (por ejemplo, 308F o 308P).
Por ejemplo, la presente invención incluye anticuerpos anti-GFRa3 que comprenden un dominio Fc que comprende uno o más pares o grupos de mutaciones seleccionadas del grupo que consiste en: 250Q y 248L (por ejemplo, T250Q y M248L); 252Y, 254T y 256E (por ejemplo, M252Y, S254T y T256E); 428L y 434S (por ejemplo, M428L y N434S); y 433K y 434F (por ejemplo, H433K y N434F). Todas las combinaciones posibles de las anteriores mutaciones del dominio Fc, y otras mutaciones dentro de los dominios variables de anticuerpos desvelados en el presente documento, se contemplan dentro del alcance de la presente invención.
Características biológicas de los anticuerpos
En general, los anticuerpos de la presente invención pueden funcionar uniéndose a uno o más de los tres dominios globulares ricos en cisteína (1, 2 o 3) de hGFRa3. En determinadas realizaciones, los anticuerpos de la presente invención pueden unirse a un epítopo ubicado en al menos uno de los dominios ricos en cisteína de hGFRa3. En determinadas realizaciones, un anticuerpo de la invención puede unirse a los restos de aminoácidos del dominio 1 de GFRa3, que varían de aproximadamente el resto 44 a aproximadamente el resto 124 de SEQ ID NO: 375. En determinadas realizaciones, un anticuerpo de la invención puede unirse a los restos de aminoácidos del dominio 2 de GFRa3, que varían de aproximadamente el resto 162 a aproximadamente el resto 239 de SEQ ID NO: 375. En determinadas realizaciones, un anticuerpo de la invención puede unirse a los restos de aminoácidos del dominio 3 de GFRa3, que varían de aproximadamente el resto 248 a aproximadamente el resto 340 de SEQ ID NO: 375. En determinadas realizaciones, los anticuerpos de la presente invención pueden funcionar bloqueando o inhibiendo la actividad de GFRa3 mediante la unión a una región en una cualquiera de los dominios que actúa como el dominio de unión al ligando, evitando así la unión del ligando, tal como, la artemina, a ese sitio. En determinadas realizaciones, un anticuerpo de la invención puede unirse al sitio de unión al ligando en uno de los dominios de GFRa3 y prevenir la posterior unión del complejo de artemina-GFRa3 a RET. En una realización, un anticuerpo de la invención puede unirse a uno cualquiera o más de los epítopos en el complejo de artemina-GFRa3 que puede determinar o desempeñar un papel en la especificidad entre el ligando y GFRa3, tal como en la región que varía de los restos 167-184 de la SEQ ID NO: 375. En determinadas realizaciones, un anticuerpo de la invención puede unirse a uno o más de los restos del dominio 2 que son responsables de la especificidad entre la artemina y GFRa3, por ejemplo, los restos de aminoácidos de las posiciones 167 (met), 176 (asp) y/o la posición 184 (glu), de SEQ ID NO: 375 y, por lo tanto, la unión puede evitar la unión del ligando a su receptor y, posteriormente, puede evitar la señalización a través del receptor tirosina quinasa RET, o a través de un mediador o modulador de la señalización distinto de RET. En determinadas realizaciones, los anticuerpos de la invención pueden unirse a la forma unida a la membrana de GFRa3 o a la forma soluble de GFRa3. En determinadas realizaciones, los anticuerpos de la invención pueden unirse a GFRa3, pero no reaccionar de forma cruzada con GFRa1, GFRa2 o GFRa4. En determinadas realizaciones, los anticuerpos de la presente invención pueden ser anticuerpos biespecíficos. Los anticuerpos biespecíficos de la invención pueden unirse a un epítopo en una región rica en cisteína de un dominio y también pueden unirse a una región rica en cisteína en un segundo dominio de hGFRa3. En determinadas realizaciones, los anticuerpos biespecíficos de la invención pueden unirse a dos regiones diferentes dentro del mismo dominio. En determinadas realizaciones, un brazo de un anticuerpo biespecífico de la invención puede unirse a una región rica en cisteína de un dominio de hGFRa3 y el otro brazo puede unirse a RET, o a un modulador distinto de RET. En determinadas realizaciones, los anticuerpos biespecíficos pueden unirse a un dominio en GFRa3 y un dominio en GFRa1 o GFRa2.
Más específicamente, los anticuerpos anti-GFRa3 de la invención pueden presentar una o más de las siguientes características:
(i) presenta una Kd que varía de aproximadamente 10'(i) *8 *M a aproximadamente 10'13 M medida mediante resonancia de plasmón superficial;
(ii) demuestra la capacidad de bloquear aproximadamente el 50-100 % de la unión de GFRa3 a su ligando, la artemina, con un valor de CI50 que varía de aproximadamente 40 pM a aproximadamente 15 nM;
(iii) demuestra la capacidad de bloquear entre el 20 % y el 100 % de la unión de GFRa3 a un soporte sólido recubierto con una mezcla de artemina y RET;
(iv) bloquea o inhibe la activación de RET dependiente de la artemina con una CI50 que varía de aproximadamente 200 pM a aproximadamente 50 nM;
(v) inhibe o reduce una o más respuestas nociceptivas en un modelo in vivo de dolor por cáncer de huesos; (vi) inhibe o reduce la hiperalgesia térmica sensibilizada a la artemina in vivo;
(vii) inhibe o reduce la alodinia en un modelo in vivo de artrosis; o
(viii) no reacciona de forma cruzada con otros receptores conjuntos GFR para RET.
Ciertos anticuerpos anti-GFRa3 de la presente invención son capaces de inhibir o atenuar la actividad de GFRa3 en un ensayo in vitro. La capacidad de los anticuerpos de la invención para unirse e inhibir la unión de GFRa3 a su ligando artemina solo o en presencia de RET se puede medir usando cualquier método convencional conocido por los expertos en la materia, incluyendo los ensayos de unión o ensayos para determinar si los anticuerpos bloquean la activación de RET mediante la inhibición de la unión de GFRa3 a su receptor artemina, tal como los descritos en el presente documento. Más adelante, en los ensayos Ejemplos 4 y 5, se ilustran ensayos in vitro ilustrativos, no limitantes, para medir la actividad GFRa3.
La presente invención incluye anticuerpos anti-GFRa3 y fragmentos de unión al antígeno de los mismos que se unen a uno o más de los dominios globulares ricos en cisteína de GFRa3, como se muestra en SEQ ID NO: 375, o un fragmento de la misma. Los anticuerpos específicos de GFRa3 pueden no contener marcadores o restos adicionales, o pueden contener un marcador o resto N-terminal o C-terminal. En una realización, el marcador o resto es biotina. En un ensayo de unión, la ubicación de un marcador (si existe) puede determinar la orientación del péptido con respecto a la superficie sobre la que se une el péptido. Por ejemplo, si una superficie está recubierta con avidina, un péptido que contenga una biotina N-terminal se orientará de manera que la parte C-terminal del péptido sea distal a la superficie.
En el presente documento, se describe un anticuerpo monoclonal completamente humano o un fragmento de unión al antígeno del mismo que se une específicamente a hGFRa3 y neutraliza la actividad hGFRa3, anticuerpo o fragmento del mismo que presenta una o más de las siguientes características: (i) comprende una HCVR que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID n O: 2, 18, 34, 50, 66, 82, 98, 114, 130, 146, 162, 178, 194, 210, 226, 242, 258, 274, 290, 306, 322, 338, 354, 381 y 397; (ii) comprende una LCVR que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 122, 138, 154, 170, 186, 202, 218, 234, 250, 266, 282, 298, 314, 330, 346, 362, 389 y 405; (iii) comprende una cualquiera o más de las secuencias de cadena pesada o ligera de CDR1, CDR2 y CDR3 representadas en la Tabla 1 y sus combinaciones; (iv) es específico de la unión a y/o el bloqueo de la actividad GFRa3 sin unirse a ni/o bloquear otros receptores de GFR alfa, incluyendo GFRa1, GFRa2 y GFRa4; (v) demuestra la especificidad de unión hacia uno o más de los dominios globulares ricos en cisteína de GFRa3; (vi) bloquea la activación de y señalización a través del receptor tirosina quinasa RET; (vii) inhibe o reduce la hiperalgesia térmica sensibilizada con artemina in vivo; (viii) inhibe o reduce la alodinia en un modelo in vivo de artrosis; o inhibe o reduce una o más respuestas nociceptivas en un modelo in vivo de dolor por cáncer de huesos.
Cartografía de epítopos y tecnologías relacionadas
Diversas técnicas conocidas para los expertos en la materia pueden usarse para determinar si un anticuerpo "interactúa con uno o más aminoácidos" dentro de un polipéptido o de una proteína. Las técnicas ilustrativas incluyen, por ejemplo, se puede realizar un ensayo de bloqueo cruzado rutinario tal como el descrito en “Antibodies”, Harlow y Lane (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harb., NY). Otros métodos incluyen el análisis mutacional de rastreo de alanina, análisis de transferencia de péptidos (Reineke (2004) Methods Mol Biol 248: 443-63), estudios cristalográficos de análisis de escisión de péptidos y análisis de RMN. Además, pueden emplearse métodos tales como escisión de epítopos, extracción de epítopos y modificación química de antígenos (Tomer (2000) Protein Science 9: 487-496). Otro método que puede usarse para identificar los aminoácidos dentro de un polipéptido con que interactúa un anticuerpo es el intercambio de hidrógeno/deuterio detectado por espectrometría de masas. En términos generales, el método de intercambio de hidrógeno/deuterio implica marcar con deuterio la proteína de interés, seguido de la unión del anticuerpo a la proteína marcada con deuterio. A continuación, el complejo de proteína/anticuerpo se transfiere a agua y los protones intercambiables dentro de los aminoácidos que están protegidos por el complejo de anticuerpo experimentan un intercambio de deuterio a hidrógeno a una velocidad más lenta que los protones intercambiables dentro de los aminoácidos que no forman parte de la superficie de contacto. Como resultado, los aminoácidos que forman parte de la superficie de contacto de proteína/anticuerpo pueden retener el deuterio y, por lo tanto, presentan una masa relativamente superior en comparación con los aminoácidos no incluidos en la superficie de contacto. Tras la disociación del anticuerpo, la proteína diana se somete a escisión de proteasas y análisis de espectrometría de masas, revelando así los restos marcados con deuterio que corresponden a los aminoácidos específicos con los que interactúa el anticuerpo. Véase, por ejemplo, Ehring (1999) Analytical Biochemistry 267(2):252-259; Engen y Smith (2001) Anal. Chem. 73:256A-265A.
El término "epítopo"se refiere a un sitio en un antígeno al que responden los linfocitos B y/o T. Los epítopos de linfocitos B pueden formarse tanto a partir de aminoácidos contiguos como a partir de aminoácidos no contiguos yuxtapuestos mediante el plegamiento terciario de una proteína. Los epítopos formados a partir de aminoácidos contiguos normalmente se mantienen al tratarlos con disolventes desnaturalizantes, mientras que los epítopos formados mediante plegamiento terciario normalmente se pierden en el tratamiento con disolventes desnaturalizantes. Un epítopo normalmente incluye al menos 3, y más generalmente, al menos 5 u 8-10 aminoácidos en una configuración espacial única.
La caracterización asistida por modificaciones (MAP), también conocida como caracterización de anticuerpos basada en la estructura del antígeno (ASAP) es un método que categoriza grandes números de anticuerpos monoclonales (mAb) dirigidos contra el mismo antígeno de acuerdo con las similitudes del perfil de unión de cada anticuerpo a superficies de antígenos modificados química o enzimáticamente (véase, por ejemplo, el documento US 2004/0101920). Cada categoría puede reflejar un solo epítopo bien diferente de o parcialmente superpuesto con el epítopo representado por otra categoría. Esta tecnología permite el filtrado rápido de anticuerpos genéticamente idénticos, de modo que la caracterización puede centrarse en anticuerpos genéticamente distintos. Cuando se aplica a la selección de hibridomas, la MAP puede facilitar la identificación de clones de hibridomas raros que producen anticuerpos monoclonales que tienen las características deseadas. La MAP se puede usar para clasificar los anticuerpos de la invención en grupos de anticuerpos que se unen a diferentes epítopos.
En determinadas realizaciones, el anticuerpo anti-GFRa3 o fragmento de unión al antígeno de un anticuerpo se une a un epítopo dentro de al menos uno de los dominios ricos en cisteína 1, 2 o 3 de GFRa3, o un fragmento del mismo, en el que el dominio 1 varía de aproximadamente el número de resto 44 a aproximadamente el número de resto 124 de SEQ ID NO: 375; el dominio 2 varía de aproximadamente el resto 162 a aproximadamente el resto 239 de SEQ ID NO: 375; el dominio 3 varía de aproximadamente el resto 248 a aproximadamente el resto 340 de SEQ ID NO: 375.
En determinadas realizaciones, el anticuerpo anti-GFRa3 o fragmento de unión al antígeno de un anticuerpo se une a un epítopo dentro del dominio 1 o un fragmento del mismo, de GFRa3 humano.
En determinadas realizaciones, el anticuerpo anti-GFRa3 o fragmento de unión al antígeno de un anticuerpo se une a un epítopo dentro del dominio 2 o un fragmento del mismo, de GFRa3 humano.
En determinadas realizaciones, el anticuerpo anti-GFRa3 o fragmento de unión al antígeno de un anticuerpo se une a un epítopo dentro del dominio 3 o un fragmento del mismo, de GFRa3 humano.
En determinadas realizaciones, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo se une a un epítopo, que incluye más de uno de los epítopos enumerados de GFRa3 dentro del dominio 1,2 o 3, y/o dentro de dos dominios diferentes (por ejemplo, epítopos dentro de los dominios 1 y 2, o dentro de los dominios 2 y 3, o dentro de los dominios 1 y 3).
En determinadas realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo biespecífico que se une a un epítopo dentro de un dominio de GFRa3 y otro epítopo dentro de un dominio diferente de GFRa3. En una realización, el anticuerpo es un anticuerpo biespecífico que se une a un epítopo en el dominio 1 de GFRa3 y otro epítopo en el dominio 2 de GFRa3. En una realización, el anticuerpo es un anticuerpo biespecífico que se une a un epítopo en el dominio 1 de GFRa3 y a otro epítopo en el dominio 3 de GFRa3. En una realización, el anticuerpo es un anticuerpo biespecífico que se une a un epítopo en el dominio 2 de GFRa3 y a otro epítopo en el dominio 3 de GFRa3.
La presente invención incluye anticuerpos anti-GFRa3 que se unen al mismo epítopo que cualquiera de los anticuerpos ilustrativos específicos descritos en el presente documento (por ejemplo, H4H2207N, h 4h 2212N, H4H2236N3, H4H2243N2, H4H2210N, H4H2234N, H4H2291S, H4H2292S, H4H2293P, H4H2294S, H4H2295S, H4H2296S, H4H2341S, H4H2342P, H4H2344S, H4H2345S, H4H2346S, H4H2350P, H4H2352S, H4H2354S, H4H2355S, H4H2357S, H4H2364S, H1M2243N y H1M2236N). Asimismo, la presente invención también incluye anticuerpos anti-GFRa3 que compiten por la unión a GFRa3 o un fragmento de GFRa3 con cualquiera de los anticuerpos ilustrativos específicos descritos en el presente documento.
Se puede determinar fácilmente si un anticuerpo se une al mismo epítopo que, o compite por la unión con, un anticuerpo anti-GFRa3 de referencia usando métodos rutinarios conocidos en la técnica. Por ejemplo, para determinar si un anticuerpo de ensayo se une al mismo epítopo que un anticuerpo anti-GFRa3 de referencia de la invención, se permite que el anticuerpo de referencia se una a una proteína o péptido GFRa3 en condiciones de saturación. A continuación, se evalúa la capacidad de un anticuerpo de ensayo de unirse a la molécula GFRa3. Si el anticuerpo de ensayo puede unirse a GFRa3 después de unión por saturación con el anticuerpo anti-GFRa3 de referencia, puede concluirse que el anticuerpo de ensayo se une a un epítopo diferente del anticuerpo anti-GFRa3 de referencia. Por otro lado, si el anticuerpo de ensayo no puede unirse a la molécula GFRa3 después de la unión por saturación con el anticuerpo anti-GFRa3 de referencia, entonces el anticuerpo de ensayo puede unirse al mismo epítopo que el epítopo al que se une el anticuerpo anti-GFRa3 de referencia de la invención.
Para determinar si un anticuerpo compite por la unión con un anticuerpo anti-GFRa3 de referencia, se realiza la metodología de unión descrita anteriormente en dos orientaciones: En una primera orientación, se permite que el anticuerpo de referencia se una a una molécula GFRa3 en condiciones de saturación seguido de la evaluación de la unión del anticuerpo de ensayo a la molécula GFRa3. En una segunda orientación, se permite que el anticuerpo de ensayo se una a una molécula GFRa3 en condiciones de saturación seguido de la evaluación del anticuerpo de referencia a la molécula GFRa3. Si, en ambas orientaciones, únicamente el primer anticuerpo (de saturación) puede unirse a la molécula GFRa3, entonces se concluye que el anticuerpo de ensayo y el anticuerpo de referencia compiten por la unión a GFRa3. Como apreciará un experto en la materia, un anticuerpo que compite por la unión con un anticuerpo de referencia puede que no se una necesariamente al epítopo idéntico al anticuerpo de referencia, sino que puede bloquear estéricamente la unión del anticuerpo de referencia mediante la unión a un epítopo solapante o adyacente.
Dos anticuerpos se unen al mismo epítopo o al epítopo solapante si cada uno inhibe competitivamente (bloquea) la unión del otro al antígeno. Es decir, un exceso de 1, 5, 10, 20 o 100 veces de un anticuerpo inhibe la unión del otro en al menos un 50 %, pero preferentemente en un 75 %, 90 % o incluso 99 % medida en un ensayo de unión competitiva (véase, por ejemplo, Junghans et al., Cáncer Res. 1990 50:1495-1502). Como alternativa, dos anticuerpos tienen el mismo epítopo si esencialmente todas las mutaciones de aminoácido en el antígeno que reducen o eliminan la unión de un anticuerpo reducen o eliminan la unión del otro. Dos anticuerpos tienen epítopos solapantes si algunas de las mutaciones de aminoácido que reducen o eliminan la unión de un anticuerpo reducen o eliminan la unión del otro.
Entonces, puede realizarse experimentación rutinaria adicional (por ejemplo, mutación de péptidos y análisis de unión) para confirmar si la ausencia observada de unión del anticuerpo de ensayo se debe, de hecho, a la unión al mismo epítopo que el anticuerpo de referencia o si el bloqueo estérico (u otro fenómeno) es responsable de la ausencia de la unión observada. Los experimentos de este tipo pueden realizarse usando ELISA, RIA, resonancia de plasmón superficial, citometría de flujo o cualquier otro ensayo cuantitativo o cualitativo de unión de anticuerpos disponible en la técnica.
Selectividad de especie y reactividad cruzada de especie
De acuerdo con determinadas realizaciones de la invención, los anticuerpos anti-GFRa3 se unen a GFRa3 humano, pero no a GFRa3 de otras especies. Como alternativa, los anticuerpos anti-GFRa3 de la invención, en determinadas realizaciones, se unen a GFRa3 humano y a GFRa3 de una o más especies no humanas. Por ejemplo, los anticuerpos anti-GFRa3 de la invención pueden unirse a GFRa3 humano y pueden unirse o no unirse, según sea el caso, a uno o más de GFRa3 de ratón, rata, cobaya, hámster, jerbo, cerdo, gato, perro, conejo, cabra, ovejas, vaca, caballo, camello, mono cangrejero, tití, macaco de la India o chimpancé.
Inmunoconjugados
En el presente documento, se describe un anticuerpo monoclonal anti-GFRa3 conjugado a un resto terapéutico ("inmunoconjugado"), tal como un agente que puede reducir el dolor y/o la inflamación, un fármaco quimioterapéutico o un radioisótopo. El tipo de resto terapéutico que puede conjugarse con el anticuerpo anti-GFRa3 tendrá en cuenta la afección que se vaya a tratar y el efecto terapéutico deseado que se logrará. Por ejemplo, para tratar el dolor agudo o crónico, un agente tal como un AINE, un opioide o un inhibidor de Cox-2, un agente anestésico local o un segundo inhibidor de GFRa3 puede conjugarse con el anticuerpo GFRa3. Como alternativa, si el efecto terapéutico deseado es tratar la inflamación asociada con una afección dolorosa, puede ser ventajoso conjugar un agente antiinflamatorio con el anticuerpo anti-GFRa3, tal como, pero sin limitación, celecoxib, o un antagonista de citocinas, tal como un inhibidor de IL-1 o IL-6. Si la afección que se va a tratar es una afección cancerosa, puede ser beneficioso conjugar un fármaco quimioterapéutico o un radioisótopo al anticuerpo GFRa3. Los ejemplos de agentes adecuados para formar inmunoconjugados son conocidos en la técnica, véase por ejemplo, documento WO 05/103081.
Anticuerpos multiespecíficos
Los anticuerpos de la presente invención pueden ser monoespecíficos, biespecíficos o multiespecíficos. Los anticuerpos multiespecíficos pueden ser específicos de diferentes epítopos de un polipéptido diana o pueden contener dominios de unión al antígeno específicos de más de un polipéptido diana. Véase, por ejemplo, Tutt et al., 1991, J. Immunol. 147:60-69; Kufer et al., 2004, Trends Biotechnol. 22:238-244. Los anticuerpos anti-GFRa3 de la presente invención pueden unirse a o expresarse junto con otra molécula funcional, por ejemplo, otro péptido u otra proteína. Por ejemplo, un anticuerpo o fragmento del mismo puede unirse de forma funcional (por ejemplo, por acoplamiento químico, fusión genética, asociación no covalente u otra manera) a una o más entidades moleculares diferentes, tales como otro anticuerpo o fragmento de anticuerpo para producir un anticuerpo biespecífico o multiespecífico con una segunda especificidad de unión. Por ejemplo, la presente invención incluye anticuerpos biespecíficos en los que un brazo de una inmunoglobulina es específico del GFRa3 humano o un fragmento del mismo, y el otro brazo de la inmunoglobulina es específico de una segunda diana terapéutica o está conjugado con un resto terapéutico. En determinadas realizaciones de la invención, un brazo de una inmunoglobulina es específico de un epítopo en un dominio de hGFRa3 o un fragmento del mismo, y el otro brazo de la inmunoglobulina es específico de un epítopo en un segundo dominio de hGFRa3. En ciertas realizaciones, un brazo de una inmunoglobulina es específico de un epítopo en un dominio de hGFRa3 y el otro brazo es específico de un segundo epítopo en el mismo dominio de hGFRa3.
Un formato de anticuerpo biespecífico ilustrativo que puede usarse en el contexto de la presente invención implica el uso de un primer dominio Ch3 de inmunoglobulina (Ig) y un segundo dominio Ch3 de Ig, en el que el primer y el segundo dominio Ch3 de Ig difieren entre sí en al menos un aminoácido, y en el que al menos una diferencia de aminoácido reduce la unión del anticuerpo biespecífico a proteína A en comparación con un anticuerpo biespecífico que carece de la diferencia de aminoácido. En una realización, el primer dominio Ch3 de Ig se une a proteína A y el segundo dominio Ch3 de Ig contiene una mutación que reduce o anula la unión a proteína A tal como una modificación H95R (por numeración de exones IMGT; H435R por numeración EU). El segundo Ch3 puede comprender además una modificación Y96F (por IMGT; Y436F por EU). Modificaciones adicionales que pueden encontrarse dentro del segundo Ch3 incluyen: D16E, L18M, N44S, K52N, V57M y V82I (por IMGT; D356E, L358M, N384S, K392N, V397M y V422I por EU) en el caso de anticuerpos IgG1; N44S, K52N y V82I (IMGT; N384S, K392N y V422I por EU) en el caso de anticuerpos IgG2; y Q15R, N44S, K52N, V57M, R69K, E79Q y V82I (por IMGT; Q355R, N384S, K392N, V397M, R409K, E419Q y V422I por EU) en el caso de anticuerpos IgG4. Las variaciones en el formato de anticuerpo biespecífico descrito anteriormente se contemplan dentro del alcance de la presente invención.
Administración terapéutica y formulaciones
La invención proporciona composiciones terapéuticas que comprenden los anticuerpos anti-GFRa3 o fragmentos de unión al antígeno de los mismos de la presente invención. La administración de composiciones terapéuticas de acuerdo con la invención se realizará con vehículos, excipientes y otros agentes adecuados que se incorporen en formulaciones para proporcionar transferencia, suministro, tolerancia y similares mejoradas. Puede encontrarse una multitud de formulaciones apropiadas en el formulario conocido para todos los químicos farmacéuticos: “Remington's Pharmaceutical Sciences”, Mack Publishing Company, Easton, PA. Estas formulaciones incluyen, por ejemplo, polvos, pastas, pomadas, gelatinas, ceras, aceites, lípidos, lípidos (catiónicos o aniónicos) que contienen vesículas (tales como LIPOFECTIN™), conjugados de ADN, pastas de absorción anhidras, emulsiones de grasa en agua y agua en grasa, emulsiones de Carbowax (polietilenglicoles de diversas masas moleculares), geles semisólidos y mezclas semisólidas que contiene Carbowax. Véase también, Powell et al., "Compendium of excipients for parenteral formulations" PDA (1998) J Pharm Sci Technol 52:238-311.
La dosis de anticuerpo puede variar dependiendo de la edad y de la talla del sujeto a quien se vaya a administrar, la enfermedad diana, las condiciones, la vía de administración y similares. Cuando el anticuerpo de la presente invención se usa para tratar el dolor asociado con la actividad GFRa3 en diversas afecciones o enfermedades, produciendo la afección o enfermedad dolor agudo o crónico, dolor inflamatorio, dolor neuropático y similares, en un paciente adulto, es ventajoso administrar por vía intravenosa el anticuerpo de la presente invención normalmente en una sola dosis de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 20 mg/kg de peso corporal, más preferentemente de aproximadamente 0,02 a aproximadamente 7, de aproximadamente 0,03 a aproximadamente 5 o de aproximadamente 0,05 a aproximadamente 3 mg/kg de peso corporal. Dependiendo de la gravedad de la afección, la frecuencia y la duración del tratamiento, pueden ajustarse.
Se conocen diversos sistemas de suministro y pueden usarse para administrar la composición farmacéutica de la invención, por ejemplo, encapsulación en liposomas, micropartículas, microcápsulas, células recombinantes capaces de expresar los virus mutantes, endocitosis mediada por receptor (véase, por ejemplo, Wu et al. (1987) J. Biol. Chem.
262:4429-4432). Los métodos de introducción incluyen, aunque sin limitación, las vías intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutánea, intranasal, epidural y oral. La composición puede administrarse por cualquier vía conveniente, por ejemplo, por infusión o inyección en bolo, por absorción a través del revestimiento epitelial o mucocutáneos (por ejemplo, mucosa oral, mucosa rectal e intestinal, etc.) y puede administrarse junto con otros agentes biológicamente activos. La administración puede ser sistémica o local.
La composición farmacéutica también puede administrarse en una vesícula, en particular, un liposoma (véase, por ejemplo, Langer (1990) Science 249:1527-1533).
En determinadas situaciones, la composición farmacéutica puede suministrarse en un sistema de liberación controlada. En una realización, se puede usar una bomba. En otra realización, pueden usarse materiales poliméricos. En otra realización más, un sistema de liberación controlada puede ubicarse en proximidad de la diana de la composición, requiriendo, por tanto, solo una fracción de la dosis sistémica.
Los preparados inyectables pueden incluir formas farmacéuticas para inyecciones intravenosas, subcutáneas, intracutáneas e intramusculares, infusiones por goteo, etc. Estos preparados inyectables pueden prepararse mediante métodos conocidos para el público. Por ejemplo, los preparados inyectables pueden prepararse, por ejemplo, disolviendo, suspendiendo o emulsionando el anticuerpo o su sal, descrita anteriormente, en un medio acuoso estéril o un medio oleoso convencionalmente usado para inyecciones. Como medio acuoso para inyecciones, existen, por ejemplo, solución salina fisiológica, una solución isotónica que contiene glucosa y otros agentes auxiliares, etc., que puede usarse en combinación con un agente solubilizante apropiado tal como un alcohol (por ejemplo, etanol), un polialcohol (por ejemplo, propilenglicol, polietilenglicol), un tensioactivo no iónico [por ejemplo, polisorbato 80, HCO-50 (aducto de polioxietileno (50 mol) de aceite de ricino hidrogenado)], etc. Como medio oleaginoso, se emplean, por ejemplo, aceite de sésamo, aceite de soja, etc., que pueden usarse en combinación con un agente solubilizante tal como benzoato de bencilo, alcohol bencílico, etc. La inyección así preparada se llena preferentemente en una ampolla apropiada.
Una composición farmacéutica de la presente invención puede suministrarse por vía subcutánea o intravenosa con una aguja y una jeringa convencionales. Además, con respecto al suministro subcutáneo, un dispositivo de suministro de pluma ya tiene aplicaciones en el suministro de una composición farmacéutica de la presente invención. Dicho dispositivo de suministro de pluma puede ser reutilizable o desechable. Un dispositivo de suministro de pluma reutilizable generalmente utiliza un cartucho reemplazable que contiene una composición farmacéutica. Una vez que se ha administrado toda la composición farmacéutica dentro del cartucho y que el cartucho está vacío, el cartucho vacío puede desecharse fácilmente y remplazarse con un nuevo cartucho que contiene la composición farmacéutica. El dispositivo de suministro de pluma entonces puede reutilizarse. En un dispositivo de suministro de pluma desechable, no hay un cartucho reemplazable. En su lugar, el dispositivo de suministro de pluma desechable viene prellenado con la composición farmacéutica mantenida en un depósito dentro del dispositivo. Una vez que el depósito se vacía de la composición farmacéutica, el dispositivo completo se desecha.
Numerosos dispositivos de suministro de pluma y autoinyector reutilizables tienen aplicaciones en el suministro subcutáneo de una composición farmacéutica de la presente invención. Los ejemplos incluyen, aunque ciertamente sin limitación, AUTOPEN™ (Owen Mumford, Inc., Woodstock, UK), bolígrafo DISETRONlC™ (Disetronic Medical Systems, Burghdorf, Suiza), bolígrafo HUMALOG MIX 75/25™, bolígrafo HUMALOG™, bolígrafo HUMALIN 70/30™ (Eli Lilly y Co., Indianápolis, IN), NOVOPEN™ I, II y III (Novo Nordisk, Copenhague, Dinamarca), NOVOPEN JUNIOR™ (Novo Nordisk, Copenhague, Dinamarca), bolígrafo BD™ (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ), OPTIPEN™, OPTIPEN PRO™, OPTIPEN STARLET™ y OPTICLIK™ (sanofi-aventis, Frankfurt, Alemania), por nombrar solo algunos. Los ejemplos de dispositivos de suministro de pluma desechables que tienen aplicaciones en suministro subcutáneo de una composición farmacéutica de la presente invención incluyen, aunque ciertamente sin limitación, la pluma SOLOSTAR™ (sanofi-aventis), el FLEXPEN™ (Novo Nordisk) y el KWIKPEN™ (Eli Lilly), el autoinyector Su RECLICK™ (Amgen, Thousands Oaks, CA), el PENLET™ (Haselmeier, Stuttgart, Alemania), el EPIPEN (Dey, L.P.) y el bolígrafo HUMIRA™ (Abbott Labs, Abbott Park, IL), por nombrar solo algunos.
Ventajosamente, las composiciones farmacéuticas para uso oral o parenteral descritas anteriormente se preparan en formas de dosificación en una dosis unitaria adecuada para ajustarse a una dosis de los ingredientes activos. Dichas formas de dosificación en una dosis unitaria incluyen, por ejemplo, comprimidos, píldoras, cápsulas, inyecciones (ampollas), supositorios, etc. La cantidad del anticuerpo mencionado anteriormente contenida generalmente es de aproximadamente 5 a aproximadamente 500 mg por forma de dosificación en una dosis unitaria; especialmente en forma de inyección, Se prefiere que el anticuerpo mencionado anteriormente esté contenido en aproximadamente 5 a aproximadamente 100 mg y en aproximadamente 10 a aproximadamente 250 mg para las otras formas de dosificación.
Usos terapéuticos de los anticuerpos
Los anticuerpos de la invención son útiles en el tratamiento, en la prevención o la mejoría de una enfermedad, trastorno o afección asociado con la actividad GFRa3, o para la mejoría de al menos un síntoma asociado con la enfermedad, el trastorno o la afección, o para aliviar el dolor asociado con dicha afección, trastorno o afección. Las afecciones, enfermedades y/o trastornos ilustrativos y/o el dolor asociado con dichas afecciones, enfermedades o trastornos, que pueden tratarse con los anticuerpos anti-GFRa3 de la presente invención incluyen dolor agudo, crónico, neuropático o inflamatorio, artritis, cistitis intersticial, pancreatitis, migraña, cefaleas en racimo, neuralgia del trigémino, neuralgia herpética, neuralgias generales, epilepsia o afecciones epilépticas, miotonía, arritmias, trastornos del movimiento, trastornos neuroendocrinos, ataxia, síndrome del intestino irritable, síndrome inflamatorio intestinal, urgencia fecal, incontinencia, hipersensibilidad rectal, dolor visceral, dolor por artrosis, gota, neuralgia posherpética, neuropatía diabética, dolor radicular, ciática, dolor de espalda, dolor de cabeza o cuello, dolor irruptivo, dolor postoperatorio, dolor oncológico, incluyendo el dolor asociado con el cáncer de huesos o el cáncer de páncreas.
Otras afecciones que se pueden tratar mediante los métodos terapéuticos descritos en el presente documento incluyen eritromelalgia hereditaria, rinitis, cáncer de próstata, cáncer de mama, cáncer de huesos, cáncer de cuello uterino o trastornos de la vejiga. Los anticuerpos de la invención o fragmentos de unión al antígeno de los mismos también pueden usarse para tratar las siguientes afecciones: dolor óseo agudo, crónico o de fractura no maligno; artritis reumatoide, estenosis espinal; dolor lumbar neuropático; síndrome de dolor miofascial; fibromialgia; dolor articular temporomandibular; dolor visceral, incluyendo, dolor abdominal; pancreático; cefalea crónica; cefalea tensional, incluyendo, cefaleas en racimo; neuropatía diabética; neuropatía asociada al VIH; neuropatía de Charcot-Marie Tooth; neuropatías sensoriales hereditarias; lesión del nervio periférico; neuromas dolorosos; descargas ectópicas proximales y distales; radiculopatía; dolor neuropático inducido por quimioterapia; dolor neuropático inducido por radioterapia; dolor tras una mastectomía; dolor central; dolor por lesión de la médula espinal; dolor tras apoplejía; dolor talámico; síndrome de dolor regional complejo (CRPS); dolor fantasma; dolor intratable; dolor musculoesquelético; dolor articular; dolor agudo de gota; dolor lumbar mecánico; dolor de cuello; tendinitis; dolor por lesión/ejercicio; dolor abdominal; pielonefritis; apendicitis; colecistitis; obstrucción intestinal; hernias; etc.; dolor pectoral, incluyendo, dolor cardíaco; dolor pélvico, dolor cólico renal, dolor obstétrico agudo, incluyendo, dolor de parto; dolor de cesárea; dolor por quemadura y traumatismo; endometriosis; dolor de herpes zóster; anemia falciforme; pancreatitis aguda; dolor irruptivo; dolor orofacial incluyendo dolor de sinusitis, dolor dental; dolor de esclerosis múltiple; dolor de lepra; dolor de la enfermedad de Behcet; adiposis dolorosa; dolor flebítico; dolor de Guillain-Barre; dolor de piernas y de dedos en movimiento; síndrome de Haglund; dolor de la enfermedad de Fabry; enfermedad vesical y urogenital; e hiperactividad vesical.
En una realización, los anticuerpos de la invención se pueden usar para tratar un síndrome de dolor funcional, en el que el síndrome de dolor funcional se selecciona del grupo que consiste en dolor lumbar crónico, síndrome del intestino irritable (SII), fibromialgia (FM), síndrome de fatiga crónica (SFC), dolor abdominal, trastorno de la articulación temporomandibular (TMJD), síndrome de vejiga dolorosa (cistitis intersticial), trastornos/síndromes gastrointestinales funcionales, síndrome de dolor torácico funcional, migrañas y cefaleas de tipo tensional, síndrome de dolor pélvico crónico, síndrome de próstata dolorosa (prostatitis crónica), síndrome de sensibilidad química múltiple y síndrome de la Guerra del Golfo.
Los anticuerpos de la invención o fragmentos de unión al antígeno de los mismos también se pueden usar para inhibir el crecimiento/la proliferación de células tumorales o metástasis de células tumorales. Por consiguiente, en determinadas realizaciones, los anticuerpos de la invención o fragmentos de unión al antígeno de los mismos, pueden usarse para tratar un cáncer, incluyendo, pero sin limitación, cáncer de endometrio, cáncer de próstata, cáncer de mama, cáncer de cuello uterino, cáncer de hígado, cáncer pancreático, cáncer de colon, cáncer de estómago, cáncer de útero, cáncer de ovarios, cáncer de riñón, cáncer de pulmón no microcítico, cáncer de cerebro, una leucemia, un linfoma, cáncer de huesos o dolor asociado con la metástasis de un cáncer, por ejemplo, metástasis de un cáncer en el hueso. (Véase Tang, J-Z, et al. Mol Cáncer Ther (2010), 9(6): 1697-1708; Kang, J. et al. Oncogene, (2009), 28:2034-2045; Ceyhan, G.O. et al. Annals of Surgery, (2006), 244(2):274-281; Banerjee, A., et al. Breast Cáncer Res (2011), 13:R112; Pandey, V. et al., Endocrinology, (2010), 151(3):909-920; Kang, J. et al., Oncogene, (2010), 29:3228-3240; Li, S. et al. J Biomed Sci (2011), 18:24).
Los anticuerpos de la presente invención también son útiles para tratar o prevenir el dolor asociado con el cáncer. El "dolor asociado con el cáncer" incluye, por ejemplo, dolor oncológico óseo, incluyendo el dolor por un cáncer que ha formado metástasis en el hueso (por ejemplo, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de pulmón, sarcoma, cáncer de riñón, mieloma múltiple, etc.). El "dolor asociado con el cáncer" también incluye el dolor asociado más generalmente con afecciones cancerosas tales como, por ejemplo, carcinoma de células renales, carcinoma pancreático, cáncer de mama, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de próstata, gliomas malignos, osteosarcoma, cáncer colorrectal, cáncer gástrico, mesotelioma maligno, mieloma múltiple, cáncer de ovarios, cáncer pulmonar microcítico, cáncer de pulmón no microcítico, sarcoma sinovial, cáncer de tiroides o melanoma. Los anticuerpos de la presente invención también son útiles para tratar o prevenir el dolor causado por o asociado con la terapia del cáncer o tratamientos médicos contra el cáncer, por ejemplo, dolor neuropático inducido por quimioterapia, tal como el dolor causado por o asociado con el tratamiento con paclitaxel (Taxol™), docetaxel (Taxotere®); nitrosourea, ciclofosfamida, doxorrubicina, epirubicina, 5-fluorouracilo, topotecán, irinotecán, carmustina, estramustina y compuestos quimioterapéuticos a base de platino, tales como cisplatino, carboplatino e iproplatino.
Tratamientos de combinación
Los tratamientos de combinación pueden incluir un anticuerpo anti-hGFRa3 de la invención y, por ejemplo, otro antagonista de GFRa3 (por ejemplo, anticuerpo anti-GFRa3 o inhibidor de molécula pequeña de GFRa3); un inhibidor de COX-2; un anestésico local; un modulador de NMDA; un agonista del receptor cannabinoide; un modulador de la familia de P2X; un antagonista de VR1; un antagonista de la sustancia P; un inhibidor de un canal de sodio activado por la tensión (Nav), por ejemplo, un antagonista de Nav1.7, o un antagonista de Nav1.8 (por ejemplo,anticuerpo anti-Nav1.7 o anti-Nav1.8 o inhibidor de molécula pequeña), un antagonista de Nav1.9 (por ejemplo, un anticuerpo anti-Nav1.9 o un inhibidor de molécula pequeña de Nav1.9); un inhibidor de los canales de calcio; un inhibidor de los canales de potasio; un inhibidor de citocinas o un antagonista del receptor de citocinas (por ejemplo, un inhibidor de interleucina-1 (IL-1) (tal como rilonacept ("trampa de IL-1"; Regeneron) o anakinra (KINERET®, Amgen), un antagonista de IL-1 de molécula pequeña o un anticuerpo anti-IL-1); un inhibidor de IL-18 (tal como un antagonista de IL-18 de molécula pequeña o un anticuerpo anti-IL-18); un inhibidor de IL-6 o de IL-6R (tal como un antagonista de IL-6 de molécula pequeña, un anticuerpo anti-IL-6 o un anticuerpo anti-receptor de IL-6); un fármaco antiepiléptico/anticonvulsivo (por ejemplo, gabapentina, pregabalina); un inhibidor del factor de crecimiento nervioso (NGF) (por ejemplo, un antagonista de NGF de molécula pequeña o un anticuerpo anti-NGF), un inhibidor de BDNF, TrkA, TrkB o p75; un opioide; morfina; cochicina a dosis baja; aspirina u otro AINE; esteroides (por ejemplo, prednisona, metotrexato, etc.); ciclosporina A a dosis baja; un inhibidor selectivo de la recaptación de la serotonina (SSRI); un inhibidor de la recaptación de la serotonina y la norepinefrina (SNRI); un tricíclico; un factor de necrosis tumoral (TNF) o inhibidor del receptor de TNF (por ejemplo, un antagonista de TNF o de TNFR de molécula pequeña, o un anticuerpo anti-TNF o TNFR); un inhibidor de TWEAK (inductor de la apóptosis WEAK relacionado con TNF); un inhibidor de RET; un inhibidor de un ligando de la familia de GDNF; un inhibidor de GFRa1, GFRa2 o GFRa4; un inhibidor de un canal iónico de detección de ácido (por ejemplo, ASIC1 o ASIC3; inhibidores de la síntesis de ácido úrico (por ejemplo, alopurinol); promotores de la excreción de ácido úrico (por ejemplo, probenecid, sulfinpirazona, benzbromarona, etc.); un inhibidor de un receptor de prequineticina (PROK1 y PROK2); otros inhibidores inflamatorios (por ejemplo, inhibidores de caspasa-1, p38, IKK1/2, CTLA-4Ig, etc.) y/o corticosteroides.
Regímenes de administración
Se pueden administrar múltiples dosis de un anticuerpo anti-GFRa3 a un sujeto durante un curso de tiempo definido. Los métodos descritos en el presente documento comprenden administrar secuencialmente a un sujeto múltiples dosis de un anticuerpo anti-GFRa3. Como se usa en el presente documento, "administrar secuencialmente" significa que cada dosis de anticuerpo anti-GFRa3 se administra al sujeto en un diferente punto en el tiempo, por ejemplo, en diferentes días separados durante un intervalo predeterminado (por ejemplo, horas, días, semanas o meses). La presente invención incluye métodos que comprenden administrar secuencialmente al paciente una sola dosis inicial de un anticuerpo anti-GFRa3, seguida por una o más dosis secundarias del anticuerpo anti-GFRa3, y opcionalmente seguidas por una o más dosis terciarias del anticuerpo anti-GFRa3.
Las expresiones "dosis inicial", "dosis secundarias", y "dosis terciarias", se refieren a la secuencia temporal de administración del anticuerpo anti-GFRa3. Por tanto, la "dosis inicial" es la dosis que se administra al inicio del régimen de tratamiento (también mencionada como la "dosis basal"); las "dosis secundarias" son las dosis que se administran después de la dosis inicial; y las "dosis terciarias" son las dosis que se administran después de las dosis secundarias. Las dosis iniciales, secundarias y terciarias pueden contener todas la misma cantidad de anticuerpo anti-GFRa3, pero generalmente pueden diferir entre sí en términos de frecuencia de administración. En determinadas realizaciones, sin embargo, la cantidad de anticuerpo anti-GFRa3 contenida en la dosis inicial, secundaria y/o terciaria varía entre sí (por ejemplo, se ajusta hacia arriba o hacia abajo según corresponda) durante el tratamiento. En determinadas realizaciones, se administran dos o más (por ejemplo, 2, 3, 4 o 5) dosis al inicio del régimen de tratamiento como "dosis de carga" seguidas por dosis posteriores que se administran con menor frecuencia (por ejemplo, "dosis de mantenimiento").
Por ejemplo, cada dosis secundaria y/o terciaria se administra de 1 a 26 (por ejemplo, 1, 1 / , 2, 2 / , 3, 3 / , 4, 4 / , 5, 5 / , 6, 6 / , 7, 71/ 2, 8, 81/ 2, 9, 9 / , 10, 101/ 2, 11, 11 /, 12, 121/ 2, 13, 131/ 2, 14, 141/ 2, 15, 151/ 2, 16, 161/ 2, 17, 171/ 2, 18, 181/ 2, 19, 19 /, 20, 20 /, 21, 21 /, 22, 22 /, 23, 23 /, 24, 24 /, 25, 25 /, 26, 26 / o más) semanas después de la dosis inmediatamente anterior. La expresión "la dosis inmediatamente anterior", como se usa en el presente documento, significa, en una secuencia de administraciones múltiples, la dosis de anticuerpo anti-GFRa3, que se administra a un paciente antes de la administración de la siguiente dosis en la secuencia sin dosis intermedias.
Los métodos descritos en el presente documento pueden comprender administrar a un paciente cualquier cantidad de dosis secundarias y/o terciarias de un anticuerpo anti-GFRa3. Por ejemplo, en determinadas realizaciones, se administra únicamente una sola dosis secundaria al paciente. En otras realizaciones, dos o más (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o más) dosis secundarias se administran al paciente. Asimismo, en determinadas realizaciones, se administra únicamente una sola dosis terciaria al paciente. En otras realizaciones, dos o más (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o más) dosis terciarias se administran al paciente.
En realizaciones que implican múltiples dosis secundarias, cada dosis secundaria puede administrarse a la misma frecuencia que las otras dosis secundarias. Por ejemplo, cada dosis secundaria puede administrarse al paciente de 1 a 2 semanas después de la dosis inmediatamente anterior. De manera similar, en realizaciones que implican múltiples dosis terciarias, cada dosis terciaria puede administrarse a la misma frecuencia que las otras dosis terciarias. Por ejemplo, cada dosis terciaria puede administrarse al paciente de 2 a 4 semanas después de la dosis inmediatamente anterior. Como alternativa, la frecuencia a la que se administran las dosis secundarias y/o terciarias a un paciente puede variar sobre el curso del régimen de tratamiento. La frecuencia de administración también puede ajustarse durante el curso de tratamiento por un médico dependiendo de las necesidades del paciente individual.
Usos de diagnóstico de los anticuerpos
Los anticuerpos anti-GFRa3 de la presente invención también pueden usarse para detectar y/o medir GFRa3 en una muestra, por ejemplo, con fines de diagnóstico. Por ejemplo, un anticuerpo anti-GFRa3, o fragmento del mismo, se puede usar para diagnosticar una afección o enfermedad caracterizada por la expresión anómala (por ejemplo, la sobreexpresión, infraexpresión, la ausencia de expresión, etc.) de la GFRa3. Los ensayos de diagnóstico ilustrativos para GFRa3 pueden comprender, por ejemplo, poner en contacto una muestra, obtenida de un paciente, con un anticuerpo anti-GFRa3 de la invención, en los que el anticuerpo anti-GFRa3 se marca con un marcador detectable o molécula indicadora. Como alternativa, puede usarse un anticuerpo anti-GFRa3 no marcado en aplicaciones de diagnóstico en combinación con un anticuerpo secundario que está marcado de forma detectable por sí mismo. el marcado detectable o molécula indicadora puede ser un radioisótopo, tales como 3H, 14C, 32P, 35S o 125I; un resto fluorescente o quimioluminiscente tal como isotiocianato de fluoresceína o rodamina; o una enzima tal como una fosfatasa alcalina, p-galactosidasa, peroxidasa de rábano rusticano o luciferasa. Los ensayos ilustrativos específicos que pueden usarse para detectar o medir GFRa3 en una muestra incluyen ensayo de inmunoadsorción enzimática (ELISA), radioinmunoensayo (RIA) y clasificación celular activada por fluorescencia (FACS).
Las muestras que pueden usarse en ensayos de diagnóstico de GFRa3 de acuerdo con la presente invención incluyen cualquier muestra de tejido o fluido que se puede obtener de un paciente, que contiene cantidades detectables de proteína GFRa3, o fragmentos de la misma, en condiciones normales o patológicas. En general, los niveles de GFRa3 en una muestra en particular obtenida de un paciente sano (por ejemplo, un paciente que no padece una enfermedad o afección asociada con niveles o actividad anómalos de GFRa3) se medirán para establecer inicialmente un nivel de referencia, o convencional, de GFRa3. Este nivel de referencia de GFRa3 puede compararse con los niveles de GFRa3 medidos en muestras obtenidas de individuos sospechosos de tener una enfermedad o afección relacionada con GFRa3, o dolor asociado con esta enfermedad o afección.
Ejemplos
Se han hecho esfuerzos por asegurar la precisión con respecto a los números usados (por ejemplo, cantidades, temperatura, etc.) pero deben tenerse en cuenta algunos errores y desviaciones experimentales. Salvo que se indique de otro modo, las partes son partes en peso, la masa molecular es la masa molecular promedio, la temperatura es en grados Celsius y la presión es en o cerca de atmosférica.
Ejemplo 1. Generación de anticuerpos humanos contra GFRa3 humano
Se puede utilizar un inmunógeno que comprende uno cualquiera de los péptidos GFRa3 que tienen las secuencias de aminoácidos mostradas como SEQ ID NO: 370, 371,372 y 373, o fragmentos de las mismas, para generar anticuerpos contra GFRa3 humano. Estos péptidos se conjugan a un vehículo, por ejemplo, KLH, luego se administran con un adyuvante para estimular la respuesta inmunitaria, a un ratón VELOCIm m Un E® que comprende ADN que codifica las regiones variables de cadena pesada y cadena ligera kappa de inmunoglobulina humana. La respuesta inmunitaria de anticuerpo se controla por un inmunoensayo específico de GFRa3. Cuando se logra una respuesta inmune deseada, se recogen los esplenocitos y se fusionan con células de mieloma de ratón para conservar su viabilidad y formar estirpes celulares de hibridoma. Las estirpes celulares de hibridoma se examinan y se seleccionan para identificar las estirpes celulares que produzcan anticuerpos específicos para GFRa3. Usando esta técnica, se obtuvieron varios anticuerpos quiméricos anti-GFRa3 (es decir, anticuerpos que poseen dominios variables humanos y dominios constantes de ratón). Los anticuerpos anti-GFRa3 generados usando este método se designaron como H1M2207N, H1M2212N, H1M2236N, H1M2236N3, H1M2243N, H1M2243N2, H1M2210N y H1M2234N.
Los anticuerpos anti-GFRa3 también se aislaron directamente de linfocitos B positivos a antígenos sin fusión a células de mieloma, como se describe en el documento U.S. 2007/0280945A1. Usando este método, se obtuvieron varios anticuerpos anti-GFRa3 completamente humanos (es decir, anticuerpos que poseen dominios variables humanos y dominios constantes humanos); los anticuerpos ilustrativos generados de esta manera se denominaron del siguiente modo: H4H2207N, H4H2212N, H4H2236N, H4H2243N, H4H2210N, H4H2234N, H4H2291S, H4H2292S, H4H2293P, H4H2294S, H4H2295S, H4H2296S, H4H2341S, H4H2342P, H4H2344S, H4H2345S, H4H2346S, H4H2350P, H4H2352S, H4H2354S, H4H2355S, H4H2357S y H4H2364S.
Las propiedades biológicas de los anticuerpos anti-GFRa3 ilustrativos generados de acuerdo con los métodos del presente ejemplo se describen en detalle en los ejemplos expuestos a continuación.
Ejemplo 2. Secuencias de aminoácidos de la región variable de cadena pesada y ligera
La tabla 1 expone las parejas de secuencias de aminoácidos de la región variable de cadena pesada y ligera de anticuerpos anti-GFRa3 seleccionados y sus identificadores de anticuerpo correspondientes. Los anticuerpos se mencionan normalmente en el presente documento de acuerdo con la siguiente nomenclatura: prefijo de Fc (por ejemplo, "H4H", "H1M, "H2M"), seguido por un identificador numérico (por ejemplo, "2207" como se muestra en la Tabla 1), seguido por un sufijo "P", “S” o "N". Por tanto, de acuerdo con esta nomenclatura, un anticuerpo puede mencionarse como, por ejemplo, “H4H2207N”. Los prefijos H4H, H1M y H2M en las denominaciones de anticuerpo usadas en el presente documento indican la región Fc particular del anticuerpo. Por ejemplo, un anticuerpo "H2M" tiene una Fc de IgG2 de ratón, mientras que un anticuerpo "H4H" tiene una Fc de IgG4 humana. Como apreciará un experto en la materia, un anticuerpo H1M o H2M puede convertirse en un anticuerpo H4H, y viceversa, pero en cualquier caso, los dominios variables (incluyendo las CDR), que están indicados por los identificadores numéricos mostrados en la Tabla 1, seguirán siendo los mismos. Los anticuerpos que tienen la misma designación de anticuerpo numérica, pero que se diferencian en un sufijo de letra de N, B, S o P, se refieren a anticuerpos que tienen cadenas pesadas y ligeras con secuencias de CDR idénticas, pero con variaciones de secuencia en las regiones que están fuera de las secuencias de CDR (es decir, las regiones marco conservadas). Así pues, las variantes de N, B, S y P de un determinado anticuerpo tienen secuencias de CDR idénticas dentro de sus regiones variables de cadena pesada y ligera, pero difieren entre sí dentro de sus regiones marco conservadas.
Tabla 1
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Ejemplo 2. Análisis de utilización de genes variables
Para analizar la estructura de los anticuerpos producidos, se clonaron y secuenciaron los ácidos nucleicos que codifican las regiones variables de anticuerpos. A partir de la secuencia de ácido nucleico y la secuencia de aminoácidos predicha de los anticuerpos, se identificó el uso del gen para cada región variable de cadena pesada (HCVR) y región variable de cadena ligera (LCVR). La Tabla 2 expone el uso del gen para anticuerpos seleccionados de acuerdo con la invención.
Tabla 2
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Ejemplo 3. Afinidades de unión de los anticuerpos GFRa3
Las constantes de velocidad asociativa y disociativa de unión (ka y kd, respectivamente), y las constantes de disociación de equilibrio y las semividas disociativas (Kd y t1/2, respectivamente) calculadas para la unión del antígeno a los anticuerpos anti-GFRa3 se determinaron usando un ensayo de biosensor de resonancia de plasmón superficial en tiempo real (Biacore T200) a 25 °C y 37 °C. Los anticuerpos se ensayaron para determinar la unión al GFRa3 humano expresado con bien un marcador myc-myc-hexahistidina C-terminal (hGFRa3-mmh; SEQ ID: 370, un marcador hFc C-terminal (hGFRa3-hFc; SEQ ID:371), o un marcador mFc C-terminal (hGFRa3-mFc; SEQ ID:372), así como GFRa3 de mono expresado con un marcador myc-myc-hexahistidina C-terminal (MfGFRa3-mmh; SEQ ID:373). Los anticuerpos anti-GFRa3 se capturaron en una superficie de bien un anticuerpo policlonal de cabra anti-IgG de ratón (GE Healthcare, n.° BR-1008-38) o de un anticuerpo monoclonal de ratón anti-IgG humana (GE Healthcare, n.° BR-1008-39) creada mediante acoplamiento directo de amina a un chip sensor Biacore CM5. Los experimentos cinéticos se llevaron a cabo usando HBS-EP (HEPES 10 mM, NaCl 150 mM, EDTA 3 mM, tensioactivo P20 al 0,05 %, a pH 7,4) o un tampón de PBS que contiene tensioactivo P20 al 0,05 % v/v como tampón de procesamiento y tampón de muestra. La unión a GFRa3-mmh humano o GFRa3-mmh de mono se evaluó mediante la inyección de varias concentraciones que variaban de 200 a 7,4 nM (diluciones con factor de dilución de 3) a través de la superficie del anticuerpo capturado. La unión a GFRa3-mFc humano o a GFRa3-hFc humano se evaluó mediante la inyección de varias concentraciones que variaban de 100 a 3,7 nM (diluciones de factor de dilución de 3) a través de la superficie del anticuerpo capturado. La asociación de anticuerpo-antígeno se controló durante hasta 4 minutos, mientras que la disociación en el tampón se controló durante hasta 20 minutos. Las constantes de velocidad de asociación (ka) y disociación (kd) cinéticas se determinaron procesando y ajustando los datos a un modelo de unión 1:1 usando el programa informático de ajuste de curvas Scrubber 2.0c. Las constantes en equilibrio de disociación de unión (Kd) y las semividas disociativas (ti/2) se calcularon a partir de las constantes de velocidad cinéticas como: Kd (M) = kd / ka y t / (min) = [In2/(60*kd)].
Tal como se muestra en la Tabla 3, a 25 °C, todos los 25 anticuerpos anti-GFRa3 se unieron a hGFRa3-mmh con valores de Kd que varían de 82,0 pM a 29,7 nM. A 37 °C, todos los 25 anticuerpos anti-GFRa3 se unieron a hGFRa3-mmh con valores de Kd que varían de 118 pM a 47,3 nM. Tal como se muestra en la Tabla 4, a 25 °C, todos los 23 anticuerpos anti-GFRa3 se unieron a MfGFRa3-mmh con valores de Kd que varían de 2,90 pM a 97,2 nM. A 37 °C, todos los 23 anticuerpos anti-GFRa3 se unieron a MfGFRa3-mmh con valores de Kd que varían de 11,7 pM a 145 nM. Tal como se muestra en la Tabla 5, a 25 °C y 37 °C, 6 de los 23 anticuerpos anti-GFRa3 se ensayaron para determinar la unión a hGFRa3-hFc, mientras que otros 17 anticuerpos se ensayaron para determinar la unión a hGFRa3-mFc. A 25 °C, los 6 anticuerpos anti-GFRa3 ensayados para determinar la unión a hGFRa3-hFc se unieron con valores de Kd que variaban de 7,50 pM a 220 nM. A 37 °C, los 6 anticuerpos anti-GFRa3 ensayados para determinar la unión a hGFRa3-hFc se unieron con valores de Kd que variaban de 41,3 pM a 531 nM. A 25 °C, los 17 anticuerpos anti-GFRa3 ensayados para determinar la unión a hGFRa3-mFc se unieron con valores de Kd que variaban de 0,467 pM a 58,4 nM. A 37 °C, los 17 anticuerpos anti-GFRa3 ensayados para determinar la unión a hGFRa3-mFc se unieron con valores de Kd que variaban de 13,2 pM a 106 nM.
Tabla 3: Cinéticas de unión de hGFRa3-mmH a diferentes anticuer os anti-GFRa3 a 25 °C a 37 °C
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Tabla 4: Cinéticas de unión de MfGFRa3-mmH a diferentes anticuerpos anti-GFRa3 a 25 °C a 37 °C
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Tabla 5: Cinéticas de unión dehGFRa3-hFc o hGFRa3-mFc a diferentes anticuer os anti-GFRa3 a 25 °C a 37 °C
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Ejemplo 4. Bloqueo de la unión de GFRa3 humano a ARTEMINA humana mediante anticuerpos anti-GFRa3
La capacidad de los anticuerpos anti-GFRa3 para bloquear la unión de GFRa3 humano a la ARTEMINA humana en presencia o ausencia de correceptor RET humano se determinó usando dos formatos de ELISA de bloqueo diferentes.
En el primer formato, se recubrió la proteína ARTEMINA humana recombinante con un marcador myc-mychexahistidina C-terminal (hARTEMINA-mmH; SEQ ID: 369) a 2 ug/ml en placas de microtitulación de 96 pocillos en tampón PBS durante la noche a 4 °C y luego se bloqueó con una solución de BSA al 0,5 % (p/v). Se mezcló previamente una cantidad constante de GFRa3 fusionada con un marcador de Fc humano C-terminal (HGFRa3-hFc; SEQ ID: 371) a 120 pM con cantidades variables de anticuerpos, que variaban de 0 a ~10 nM en diluciones en serie, seguidas de una incubación de 1 hora a temperatura ambiente (TA) para permitir que la unión del anticuerpo-hGFRa3-hFc alcanzara el equilibrio. Las soluciones de muestra equilibradas se transfirieron luego a la placa recubierta con hARTEMINA-mmH. Tras 1 hora de unión, la placa se lavó, luego se detectó el hGFRa3-hFc unido usando anticuerpo específico de Fc anti-IgG humana conjugado con HRP (Jackson Immunochemical, n.° 109-035-098) y las señales colorimétricas se desarrollaron usando un sustrato TMB HRP (BD Biosciences, n.° 51-2606KC y n.° 51-2607KC). La absorbancia se registró a 450 nm en un lector de placas Victor X5 (Perkin Elmer) para determinar la cantidad de hGFRa3-hFc de las soluciones de hGFRa3-hFc-anticuerpo previamente equilibradas que era capaz de unirse a la placa recubierta con hARTEMINA-mmH. Los valores de CI50 , definidos como la concentración de anticuerpo requerida para reducir la señal de una concentración constante de hGFRa3-hFc en un 50 %, se calcularon a partir de los datos usando el software Prism de GraphPad. La absorbancia medida a la cantidad constante de 120 pM de hGFRa3-hFc en ausencia de anticuerpo anti-GFRa3 se define como un bloqueo del 0 % y la absorbancia sin hGFRa3-hFc añadido se define como un bloqueo del 100 %. La absorbancia observada en los pocillos que contienen la mayor concentración de anticuerpos se usó para calcular el porcentaje de bloqueo máximo que se muestra en la tabla. Los resultados se resumen en la tabla 6.
En el segundo formato de ELISA, las placas, las muestras y los datos se procesaron de manera similar a los del primer formato, excepto que tanto hARTEMINA-mmH como RET humano con un marcador de histidina C-terminal 10 (hRET-10His; R&D Systems, n.° 1168-CR/CF) se recubrieron para el experimento de ELISA de bloqueo. Las placas de microtitulación de 96 pocillos se recubrieron con una mezcla de 1,2 ug/ml de hARTEMINA-mmH y 6,9 ug/ml de proteínas hRET-10His en PBS durante la noche a 4 °C y luego se bloquearon con una solución de BSA al 0,5 % (p/v). Se mezcló previamente una cantidad constante de GFRa3 humano biotinilado con un marcador de myc-mychexahistidina C-terminal (biotina-hGFRa3-mmH; SEQ ID: 370) a 1 nM con cantidades variadas de anticuerpos anti-GFRa3, que variaban de 0 a ~100 nM en diluciones en serie, seguido de una incubación de 1 hora a TA para permitir que la unión de anticuerpo-biotina-hGFRa3-mmH alcanzara el equilibrio. Las muestras equilibradas se transfirieron luego a la placa recubierta. T ras 1 hora de unión, la placa se lavó, luego se detectó la proteína de biotina-hGFRa3mmH unida usando estreptavidina conjugada con HRP (Pierce, n.° N200), y se desarrollaron señales colorimétricas usando sustratos de TMB HRP. Los valores de CI50 y el bloqueo máximo por cada anticuerpo se muestran en la Tabla 6.
Como se muestra en la Tabla 6, 9 de los 23 anticuerpos anti-GFRa3 bloquearon el 51-94 % de la unión de hGFRa3-hFc a hARTEMINA-mmH recubierto con valores de CI50 que variaban de 43,8 pM a 723 pM en el primer formato de ELISA. Ocho de los 23 anticuerpos anti-GFRa3 hicieron que la señal de unión de hGFRa3-hFc aumentara ("potenciador" en la Tabla 6) en muchas de las concentraciones de anticuerpos más ensayadas en el primer formato de ELISA. Seis de los 23 anticuerpos ensayados en el primer formato de ELISA no bloquearon ni aumentaron la señal de unión de hGFRa3-h Fc a hARTEMINA-mmH recubierta. Tal como se muestra en la Tabla 6, para el segundo formato de ELISA, 17 de los 23 anticuerpos anti-GFRa3 bloquearon el 75-100 % de la unión de biotina-hGFRa3-mmH a hARTEMINA-mmH recubierto doblemente y hRET-10His con valores de CI50 que variaban de 403 pM a 14,6 pM. También en el segundo formato de ELISA, cinco de los 23 anticuerpos anti-GFRa3 hicieron que la señal de unión de biotina-hGFRa3-mmH aumentara a menores concentraciones de anticuerpos, pero bloqueara el 28-95 % de la unión de biotina-hGFRa3-mmH a hARTEMINA-mmH y hRET-10HiS A concentraciones de anticuerpo de 1 nM y superiores ("potenciador" en la Tabla 6). Un anticuerpo anti-GFRa3 hizo que la señal de unión de biotina-hGFRa3-mmH aumentara ("potenciador" en la Tabla 6) a concentraciones más altas de anticuerpo ensayadas, sin bloqueo a ninguna concentración, en el segundo formato de ELISA.
T l : Bl ELI A FR h m n ARTEMINA h m n l ARTEMINA h m n RET h m n
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Ejemplo 5. Medición de la capacidad de los anticuerpos anti-GFRa3 para bloquear la activación de GFRa3 y RET por parte del ligando ARTEMINA in vitro
La capacidad de los anticuerpos anti-GFRa3 para bloquear la activación de GFRa3 y RET por su ligando ARTEMINA in vitro se determinó usando un ensayo basado en células. Se generaron células HEK293 modificadas para expresar de manera estable tanto el GFRa3 humano (aminoácidos 1-400 del número de acceso NP_001487.2) como el RET humano (aminoácidos 1-1072 del número de acceso NP_065681) y luego se transdujeron con un indicador de luciferasa sensible a SRE. (SRE-luc; Sabiosciences, CCS-010L) (células HEK293/hGFRa3/hRET).
Se sembraron veinte mil células HEK293/hGFRa3/hRET/SRE-luc en placas de 96 pocillos recubiertos con Poly D-Lisina (Greiner, n.° 35-4620) en Optimem (GIBCO, n.° 31985) que contenía FBS al 0,5 % y luego se cultivaron durante la noche en CO2 al 5 % a 37 °C. Las células se incubaron luego durante 1 hora a temperatura ambiente con diluciones en serie de anticuerpos anti-GFRa3 que variaban de 5 pM a 300 nM. A continuación, se añadió una dosis constante (100 pM) de ARTEMINA humana expresada con un marcador de myc-myc-hexahistidina C-terminal (SEQ ID: 369) a las células y se incubaron durante 6 horas más. La actividad de la luciferasa se midió como unidades de luz relativas (ULR) en un luminómetro Victor (Perkin Elmer) después de la adición del reactivo OneGlo (Promega, n.° E6051). Los valores de CE50 e CI50 se calcularon a partir de una ecuación logística de cuatro parámetros sobre una curva de respuesta de 12 puntos usando el software de análisis de datos GraphPad Prism.
Se analizaron veintitrés anticuerpos anti-GFRa3 para determinar su capacidad para inhibir la activación dependiente de la ARTEMINA de las células HEK293/hGFRa3/hRET/SRE-luc. Tal como se muestra en la Tabla 7, los 23 anticuerpos ensayados bloquearon la actividad de la luciferasa con valores de CI50 que variaban de 0,2 nM a 48,3 nM, y 19 de los 23 anticuerpos bloquearon hasta el valor de referencia a una concentración de 300 nM. Cuatro de los 23 anticuerpos (H4H2344S, H4H2345S, H4H2346S y H4H2354S-1) no bloquearon hasta el valor de referencia a ninguna de las concentraciones de anticuerpos ensayadas.
Tabla 7: Inhibición de la estimulación dependiente de la ARTEMINA de las células HEK293/hGFRa3/hRET/SRE-luc or anticuer os anti-GFRa3
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Ejemplo 6. Inhibición de la hiperalgesia térmica de capsaicina sensibilizada con ARTEMINA
Para inducir la hiperalgesia térmica sensibilizada con artemina en ratones, se trató previamente cada ratón con una inyección intraplantar de 0,5 microgramos de ARTEMINA recombinante de ratón (R&D Systems, n.° 1085-AR) 24 horas antes de administrar una inyección intraplantar de 0,5 microgramos de capsaicina (una dosis subóptima) desde una solución 100 mM en DMSO (Sigma-Aldrich, n.° M-2028). La hiperalgesia térmica se evaluó mediante la prueba de Hargreaves, en la que se dirige un haz de luz hacia la pata inyectada hasta que el animal retira la pata. La latencia hasta la retirada se registra como una medida del comportamiento de la nocicepción. La hiperalgesia térmica se sensibiliza sistemáticamente a la ARTEMINA 3 días después de la administración de capsaicina basándose en una disminución significativa de las latencias de retirada de la pata. Para estos estudios, se midió un valor de referencia para la latencia hasta la retirada antes de la administración de la ARTEMINA o capsaicina, seguido de una segunda medición tres días después del tratamiento con capsaicina. El experimentador que realizó estos ensayos lo hizo con ocultación del grupo de tratamiento de los animales.
Para todos los experimentos que evaluaron la eficacia de los anticuerpos anti-GFRa3 humanos en la hiperalgesia sensibilizada con ARTEMINA, se usaron ratones adultos homocigotos para la expresión de GFRa3 humano en lugar de GFRa3 de ratón ("GFRa3" humanizado). Se usaron ratones machos y hembras en cada ensayo, con el sexo equilibrado entre los grupos de tratamiento (un total de 8 ratones por grupo de tratamiento o de control). Se determinó previamente que los ratones GFRa3 humanizados tenían respuestas de latencia de hiperalgesia térmica de capsaicina inducida por ARTEMINA similares a las observadas en ratones de tipo silvestre.
En el modelo, se ensayaron seis anticuerpos anti-GFRa3 (H4H2212N, H4H2243N2, H4H2292S, H4H2294S, H4H2342P y H4H2352S-1). Todos los anticuerpos se diluyeron en solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se administraron por vía subcutánea a 25 mg/kg en un volumen de peso corporal de 1 ml/100 g 24 horas antes de la inyección de ARTEMINA en la pata trasera. En todos los experimentos, un grupo de animales recibió un anticuerpo de control de isotipo.
La sensibilidad al dolor para cada grupo de tratamiento o grupo de control se definió como el porcentaje de la latencia hasta la retirada de referencia (% LRP), calculado como el cambio fraccionario para la latencia hasta la retirada (LR) basada en el tiempo de cada animal tres días después del tratamiento con capsaicina en comparación con su latencia hasta la retirada de referencia sin tratamiento con capsaicina:
% L R P = [ ( L R ( c a p s a i c i n a ) - L R ( s i n c a p s a i c i n a ) ) / L R ( s in c a p s a ic in a ) ] x 1 0 0
Usando el % LRP, los valores negativos mayores indican una mayor hiperalgesia térmica.
La Tabla 8 muestra el resumen de las medias de los grupos (en negrita) y el error típico de las medias (en cursiva) para el porcentaje de latencia hasta la retirada de referencia (% LRP) en el modelo de hiperalgesia térmica de capsaicina sensibilizado con ARTEMINA evaluado tres días después de la inyección de capsaicina.
Tal como se muestra en la Tabla 8, los ratones tratados con anticuerpos anti-hGFRa3 presentaron aumentos en el % de LRP (valores negativos o positivos menores) en comparación con los ratones tratados con el anticuerpo de control de isotipo. Cuatro anticuerpos, H4H2352S, H4H2243N2, H4H2294S y H4H2342P potenciaron la mayor resistencia a la hiperalgesia térmica en todos los experimentos realizados.
Tabla 8: Resumen de los datos del modelo de hiperalgesia térmica de capsaicina sensibilizada con ARTEMINA evaluada tres días des ués de la in ección de ca saicina.
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Ejemplo 7. Ensayo de anticuerpos anti-GFRa3 para determinar la reactividad cruzada con GFRal y GFRa2
Se evaluó la capacidad de los anticuerpos anti-GFRa3 para unirse a los receptores de la familia de GDNF usando un biosensor Octet Red (Fortebio, Inc.). Los anticuerpos se analizaron para determinar su unión a GFRa1 humano expresado con una marcador de Fc humano C-terminal y un marcador de hexahistidina (hGFRa1-hFc-6His, R&D Systems n.° 714-GR), GFRa1 humano expresado con solo un marcador de Fc humano C-terminal (hGFRa1-hFc; SEQ ID: 376), GFRa2 humano expresado con una marcador de Fc humano C-terminal y un marcador de hexahistidina (hGFRa2-hFc-6His, R&D Systems n.° 613-FR), GFRa3 humano expresado con un marcador de Fc humano C-terminal (hGFRa3-hFc, SEQ ID: 371), o una proteína marcada con Fc humano irrelevante. Los antígenos se capturaron en puntas de sensores anti-Fc humano a partir de soluciones a 10 ug/ml durante 5 minutos. Las puntas del sensor recubiertas se bloquearon con una solución a 100 ug/ml de anticuerpos de Fc humanos irrelevantes durante 5 minutos. Las puntas del sensor bloqueadas se sumergieron luego en pocillos que contenían 667 uM de cada anticuerpo anti-GFRa3 o tampón solo durante 10 minutos. El experimento se realizó a 25 °C con un caudal de 1.000 rpm usando el tampón de HBST BSA (HEPES 10 mM, NaCl 150 mM, EDTA 3 mM, tensioactivo P20 al 0,05 % p/v, BsA a 0,1 mg/ml, pH 7,4). Se controló y registró la respuesta de unión (medida en unidades de nm) en cada etapa del experimento.
Los seis anticuerpos anti-GFRa3 ensayados mostraron una unión por encima de 1,0 nm a la proteína hGFRa3-hFc, pero no demostraron ninguna unión medible a los otros receptores de la familia de GDNF ni a la proteína marcad con Fc humano irrelevante, tal como se muestra en la Tabla 9.
Tabla 9. Reactividad de los anticuer os anti-GFRa3 con GFRa1 GFRa2 GFRa3
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Ejemplo 8. Medición de la capacidad de los anticuerpos anti-GFRa3 para bloquear la estimulación con ARTEMINA en un bioensayo de HEK293/MfGFRa3/MfRet/SRE-Luc
Se determinó la capacidad de los anticuerpos anti-GFRa3 para el bloqueo de la activación de GFRa3 de macaco cangrejero y RET de macaco cangrejero por su ligando ARTEMINA in vitro usando un ensayo basado en células. Se generaron células HEK293 modificadas para expresar de manera estable tanto el GFRa3 de mono cangrejero (MfGFRa3; SEQ ID: 377) como RET de mono cangrejero (MfRET; SEQ ID: 378) y luego se transdujeron con un indicador de SRE Cignal Lenti (SA Biosciences, n.° CLS- 010L) que expresaba el gen de luciferasa de luciérnaga bajo el control de un promotor mínimo de CMV y repeticiones en tándem del elemento de respuesta sérica para generar la estirpe celular HEK293/MfGFRa3/MfRet/SRE-Luc.
Para el bioensayo, se sembraron 20.000 células HEK293/MfGFRa3/MfRet/SRE-Luc en placas de 96 pocillos recubiertas con Poly D-Lisina (Greiner, n.° 35-4620) en Optimem (GIBCO, n.° 31985) que contenía FBS al 0,5 % y luego se cultivaron durante la noche en CO2 al 5 % a 37 °C. Las células se incubaron luego durante 1 hora con diluciones en serie de anticuerpos anti-GFRa3 que variaban de 5 pM a 300 nM. Se añadió una dosis constante (500 pM) de ARTEMINA humana expresada con un marcador de myc-myc-hexahistidina C-terminal (ARTEMINA humana-MMH; SEQ ID: 369) a las células y se incubaron durante 6 horas más. Para determinar el valor de CE50 de ARTEMINA humana-MMH a partir de las curvas de respuesta a la dosis, se añadieron diluciones en serie de ARTEMINA humana-MMH de 0,5 pM a 10 nM a las células sin anticuerpos y se incubaron durante 6 horas a 37 °C. La actividad de la luciferasa se midió como unidades de luz relativas (ULR) en un luminómetro Victor (Perkin Elmer) tras la adición del reactivo OneGlo (Promega, n.° E6051). Los valores de CE50 e CI50 se calcularon a partir de una ecuación logística de cuatro parámetros sobre una curva de respuesta de 12 puntos usando el software de análisis de datos GraphPad Prism.
Se analizaron seis anticuerpos anti-GFRa3 para determinar su capacidad para inhibir la activación dependiente de la ARTEMINA de las células HEK293/MfGFRa3/MfRET/SRE-luc. Tal como se muestra en la Tabla 10, los seis anticuerpos ensayados bloquearon completamente la actividad de la luciferasa con valores de CI50 que variaban de 0,7 nM a 2,5 nM. ARTEMINA humana-MMH estimuló la actividad de la luciferasa dependiente de s Re en la estirpe celular HEK293/mfGFRa3/mfRet/SRE-LUC con un valor de CE50 de 70 pM.
Tabla 10: Inhibición de la estimulación dependiente de la ARTEMINA de las células HEK293/MfGFRa3/MfRET/ RE-l r n i r n i- FR
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Ejemplo 9. Generación de un anticuerpo anti-GFRa3 biespecífico
Se generan diversos anticuerpos biespecíficos para su uso en la práctica de los métodos descritos en el presente documento. Por ejemplo, se generan anticuerpos específicos de GFRa3 en un formato biespecífico (un "biespecífico") en el que las regiones variables que se unen a distintos epítopos en GFRa3 se unen entre sí para conferir especificidad de epítopo doble dentro de una sola molécula de unión. Los biespecíficos adecuadamente diseñados pueden mejorar la eficacia global del bloqueo de GFRa3 al aumentar tanto la especificidad de GFRa3 como la avidez de unión. Las regiones variables con especificidad hacia diferentes epítopos individuales dentro de cualquiera de las tres repeticiones de cisteína o que pueden unirse a diferentes regiones dentro de un epítopo de cualquiera de las tres repeticiones de cisteína se emparejan en un armazón estructural que permite que cada región variable se una simultáneamente a los epítopos separados o a regiones diferentes dentro de un epítopo. En un ejemplo para regiones variables de cadena pesada (Vh) biespecíficas de un aglutinante con especificidad por un epítopo dentro de una repetición de cisteína, se recombinan con las regiones variables de cadena ligera (Vl) de una serie de aglutinantes que tienen especificidad por un segundo epítopo dentro de cualquiera de las otras dos repeticiones de cisteína para identificar parejas de Vl no afines que puedan emparejarse con una Vh original sin interrumpir la especificidad original de esa Vh. De esta manera, un solo segmento Vl (por ejemplo, Vl1) se puede combinar con dos dominios de Vh diferentes (por ejemplo, Vh1 y Vh2) para generar un biespecífico compuesto por dos "brazos" de unión (Vh1-Vl1 y Vh2-Vl1). El uso de un solo segmento de Vl reduce la complejidad del sistema y, por lo tanto, simplifica y aumenta la eficacia en los procesos de clonación, expresión y purificación usados para generar el biespecífico (véase, por ejemplo, documentos USSN13/022759 y US2010/0331527).
Como alternativa, los anticuerpos que se unen tanto a GFRa3 como a una segunda diana, tales como, pero sin limitación, por ejemplo, RET pueden prepararse en un formato biespecífico usando técnicas descritas en el presente documento, u otras técnicas conocidas por los expertos en la materia. Las regiones variables del anticuerpo que se unen a distintas regiones de GFRa3 que están expuestas extracelularmente se unen entre sí con regiones variables que se unen a sitios relevantes de, por ejemplo, el ligando, la artemina, otros receptores de GFRa, o RET, para conferir especificidad por el antígeno doble dentro de una sola molécula de unión. Las regiones variables con especificidad por epítopos individuales de GFRa3, se combinan con una región variable con especificidad por, por ejemplo, la artemina y se emparejan en un armazón estructural que permite que cada región variable se una a los antígenos separados.
Los aglutinantes biespecíficos se ensayan para determinar la unión y el bloqueo funcional de los antígenos diana, por ejemplo, GFRa3 y/o la artemina, otros receptores de GFRa, o RET, en cualquiera de los ensayos descritos anteriormente para los anticuerpos. Por ejemplo, se usan métodos convencionales para medir la unión de proteínas solubles para evaluar la interacción biespecífica con su/s antígeno/s, tales como BIAcore, ELISA, cromatografía de exclusión molecular, dispersión de luz láser de múltiples ángulos, calorimetría de barrido directo y otros métodos. La unión de anticuerpos biespecíficos a células que expresan TFGa3 se determina mediante citometría de flujo usando un anticuerpo secundario marcado con fluorescencia que reconoce el antígeno diana en las células. Los experimentos de unión con péptidos también pueden llevarse a cabo usando experimentos de resonancia de plasmón superficial, en los que la interacción de unión del péptido al anticuerpo en tiempo real se mide haciendo fluir un péptido o biespecífico a través de una superficie del sensor en la que el biespecífico o péptido, respectivamente, se capturan. El bloqueo funcional in vitro del receptor de GFRa3 por un biespecífico se determina usando cualquier bioensayo tal como el que se describe en el presente documento, o mediante la determinación in vivo de la reacción al dolor en modelos animales apropiados, tal como los descritos en el presente documento. El bloqueo funcional in vitro de GFRa3 o su ligando, la artemina, por un biespecífico se determina usando cualquier ensayo biológico tal como el descrito en el documento WO2010/077854, o en el documento US2010/0166768, o mediante la determinación in vivo de hipersensibilidad a los estímulos térmicos en modelos animales apropiados, tal como los descritos en el presente documento.
Ejemplo 10. Afinidades de unión derivadas de la resonancia de plasmón superficial y constantes cinéticas de anticuerpos monoclonales anti-GFRa3 de ratón
Las constantes de velocidad asociativa y disociativa de unión (ka y kd, respectivamente), y las constantes de disociación de equilibrio y las semividas disociativas (Kd y t1/2, respectivamente) calculadas para la unión del antígeno a los anticuerpos anti-GFRa3 de ratón se determinaron usando un ensayo de biosensor de resonancia de plasmón superficial en tiempo real (Biacore 3000) a 25 °C. Los anticuerpos se ensayaron para determinar la unión al GFRa3 de ratón expresado con un marcador de myc-myc-hexahistidina (mGFRa3-MMH; SEQ ID: 379,). Los anticuerpos anti-GFRa3 de ratón se capturaron en una superficie de un anticuerpo policlonal de cabra anti-IgG de ratón (GE Healthcare, n.° BR-1008-38) creada mediante acoplamiento directo de amina a un chip sensor Biacore CM5. Los experimentos cinéticos se llevaron a cabo usando HBS-EP (HEPES 10 mM, NaCl 150 mM, EDTA 3 mM, tensioactivo P20 al 0,05 %, a pH 7,4) como tampón de procesamiento y tampón de muestra. La unión a GFRa3-MMH de ratón se evaluó mediante la inyección de varias concentraciones que variaban de 100 nM a 6,25 nM (diluciones con factor de dilución de 2) a través de la superficie del anticuerpo capturado. La asociación de anticuerpo-antígeno se controló durante hasta 5 minutos, mientras que la disociación en el tampón se controló durante hasta 10 minutos. Las constantes de velocidad de asociación (ka) y disociación (kd) cinéticas se determinaron procesando y ajustando los datos a un modelo de unión 1:1 usando el programa informático de ajuste de curvas Scrubber 2.0c. Las constantes en equilibrio de disociación de unión (Kd) y las semividas disociativas (ti/2) se calcularon a partir de las constantes de velocidad cinéticas como: Kd (M) = kd / ka y t / (min) = [In2/(60*kd)].
Tal como se muestra en la Tabla 11, los dos anticuerpos anti-GFRa3 de ratón ensayados, M1M6986N y M1M6977N, se unieron a mGFRa3-MMH a 25 °C con valores de Kd de 23,1 pM y 107 pM, respectivamente.
Tabla 11: Cinéticas de unión de mGFRa3-MMH a diferentes anticuer os anti-GFRa3 de ratón a 25 °C
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Ejemplo 11. ELISA de bloqueo de GFRa3 de ratón
La capacidad de los anticuerpos anti-GFRa3 de ratón para bloquear la unión de GFRa3 de ratón a la ARTEMINA de ratón en presencia o ausencia de correceptor RET de ratón se determinó usando dos formatos de ELISA de bloqueo diferentes. En el primer formato, se recubrió proteína ARTEMINA (R&D cat n.° 1085-AR/CF) de ratón recombinante a 2 ug/ml (166 nM) en placas de microtitulación de 96 pocillos en tampón PBS durante la noche a 4 °C y luego se bloqueó con una solución de BSA al 0,5 % (p/v). Se mezcló previamente una cantidad constante (3,5 nM) de GFRa3 de ratón biotinilado con un marcador de myc-myc-hexahistidina C-terminal (biotina-hGFRa3-MMH, SEQ ID: 379) con cantidades variadas de anticuerpos, que variaban de 100 nM a 1,6 pM en diluciones en serie, seguidas de una incubación de 1 hora a temperatura ambiente (TA) para permitir que la unión del anticuerpo-biotina-mGFRa3-MMH alcanzara el equilibrio. Las soluciones de muestra equilibradas se transfirieron luego a la placa recubierta con mARTEMINA. Tras 1 hora de unión, la placa se lavó, luego se detectó la proteína de biotina-mGFRa3-MMH unida usando estreptavidina-HRP (Pierce, n.° N200), y se desarrollaron señales colorimétricas usando sustratos de TMB HRP (BD Biosciences, n.° 51-2606KC y n.° 51-2607KC). La absorbancia se registró a 450 nm en un lector de placas Victor X5 (Perkin Elmer) para determinar la cantidad de biotina-mGFRa3-MMH libre de las soluciones de biotinamGFRa3-MMH-anticuerpo previamente equilibradas que era capaz de unirse a la placa recubierta con mARTEMINA. Los valores de CI50, definidos como la concentración de anticuerpo requerida para reducir la señal de una concentración constante de biotina-mGFRa3-MMH en un 50 %, se calcularon a partir de los datos usando el software Prism de GraphPad. La absorbancia medida a la cantidad constante de biotina-mGFRa3-MMH en ausencia de anticuerpo anti-GFRa3 de ratón se define como un bloqueo del 0 % y la absorbancia sin biotina-mGFRa3-MMH añadido se define como un bloqueo del 100 %. La absorbancia observada en los pocillos que contienen la mayor concentración de anticuerpos se usó para calcular el porcentaje de bloqueo máximo que se muestra en la tabla. Los resultados se resumen en la tabla 12.
En el segundo formato de ELISA, las placas, las muestras y los datos se procesaron de manera similar a la del primer formato, excepto tanto RET de ratón expresado con hFc C-terminal como los marcadores de hexahistidina (mRET-hFc-6His; R&D cat n.° 482-RT/CF) y mARTEMINA (R&D cat n.° 1085-AR/CF) se recubrieron para el experimento de ELISA de bloqueo. Las placas de microtitulación de 96 pocillos se recubrieron con una mezcla de 1,2 ug/ml (100 nM) de mARTENINA y 9,5 ug/ml de proteínas mRET-hFc-6His (100 nM) en PBS durante la noche a 4 °C y luego se bloquearon con una solución de BSA al 0,5 % (p/v). Se mezcló previamente una cantidad constante (350 pM) de biotina-mGFRa3-MMH con cantidades variadas de anticuerpos anti-GFRa3 de ratón, que variaban de 100 nM a 1,6 pM en diluciones en serie, seguido de una incubación de 1 hora a TA para permitir que la unión de anticuerpo-biotinamGFRa3-MMH alcanzara el equilibrio. Las muestras equilibradas se transfirieron luego a la placa recubierta. Tras 1 hora de unión, la placa se lavó, luego se detectó la proteína de biotina-mGFRa3-MMH unida usando estreptavidina conjugada con HRP y se desarrollaron señales colorimétricas usando sustratos de TMB HRP. Los valores de CI50 y el bloqueo máximo por cada anticuerpo se muestran en la Tabla 12.
Tal como se muestra en la Tabla 12, solo un anticuerpo anti-GFRa3 de ratón ensayado, M1M6986N, demostró la capacidad de bloquear la unión de biotina-mGFRa3-MMH a la placa recubierta con mARTEMINA con un valor de Ci50 de 69,1 pM. El otro anticuerpo anti-GFRa3 de ratón ensayado, M1M6977N, no demostró ningún bloqueo medible en este formato de ELISA. Ambos anticuerpos anti-GFRa3 de ratón ensayados, M1M6986N y M1M6977N, demostraron la capacidad de bloquear completamente la unión de biotina-mGFRa3-MMH a las placas recubiertas con mARTEMINA y mRET-hFc-6His, con una CI50 de 47,2 pM y 366 pM, respectivamente.
Tabla 12: Blo ueo de ELISA de GFRa3 de ratón a ARTEMINA de ratón sola o ARTEMINA de ratón RET de ratón
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Ejemplo 12. Bioensayo de luciferasa basado en células
La capacidad de los anticuerpos anti-GFRa3 de ratón para bloquear la activación de GFRa3 de ratón y RET de ratón por su ligando ARTEMINA de ratón in vitro se determinó usando un ensayo basado en células. Se generaron células HEK293 modificadas para expresar de manera estable tanto el GFRa3 de ratón (aminoácidos 1-397 del número de acceso AAH66202.1) como el RET de ratón (aminoácidos 1-1115 del número de acceso NP_033076.2) y luego se transdujeron con un indicador de luciferasa sensible a SRE. (SRE-luc; Sabiosciences, CCS-010L) (células 293/mGFRa3/mRET/SRE-luc).
Se sembraron veinte mil células 293/mGFRa3/mRET/SRE-luc en placas de 96 pocillos recubiertos con Poly D-Lisina (Greiner, n.° 35-4620) en Optimem (GIBCO, n.° 31985) que contenía FBS al 0,5 % y luego se cultivaron durante la noche en CO2 al 5 % a 37 °C. Las células se incubaron luego durante 1 hora a temperatura ambiente con diluciones en serie de anticuerpos anti-GFRa3 de ratón que variaban de 3 nM a 44 nM. A continuación, se añadió una dosis constante (100 pM) de ARTEMINA de ratón (R&D, n.° 1085-AR/CF) a las células y se incubó durante 6 horas más. La actividad de la luciferasa se midió como unidades de luz relativas (ULR) en un luminómetro Victor (Perkin Elmer) después de la adición del reactivo OneGlo (Promega, n.° E6051). Los valores de CE50 e CI50 se calcularon a partir de una ecuación logística de cuatro parámetros sobre una curva de respuesta de 12 puntos usando el software de análisis de datos GraphPad Prism.
Tal como se muestra en la Tabla 13, ambos anticuerpos anti-GFRa3 de ratón ensayados, M1M6986N y M1M6977N demostraron la capacidad de inhibir la estimulación dependiente de la ARTEMINA de ratón de células 293/mGFRa3/mRET/SRE-luc con valores de CI50 de aproximadamente 44 nM y 3 nM, respectivamente.
Tabla 13: Inhibición de la estimulación dependiente de la ARTEMINA de las células 293/mGFRa3/mRET/SRE-luc or anticuer os anti-GFRa3 de ratón
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Ejemplos 13, 14 y 15: Efecto de los anticuerpos anti-GFRa3 de ratón en modelos animales de dolor de cáncer de huesos y dolor artrósico
Los anticuerpos descritos en el presente documento son anticuerpos humanos de alta afinidad contra el receptor alfa unido a GPI para la artemina, GFRa3. Dado que estos anticuerpos contra GFRa3 humano no reaccionan de forma cruzada con GFRa3 de ratón, los ensayos in vivo con estos anticuerpos solo se puede realizar en ratones alterados genéticamente para reemplazar la secuencia de GFRa3 de ratón con la de GFRa3 humano. Los primeros experimentos in vivo en estos ratones GFRa3hu/hu usando inhibición farmacológica de capsaicina sensibilizada con artemina reveló la eficacia de cuatro anticuerpos humanos en este ensayo in vivo. Para acelerar la generación de datos de eficacia, se generaron anticuerpos GFRa3 de ratón para servir como sustitutos de los anticuerpos humanos. Se inmunizaron ratones de una cepa C57BL6/129Sv mixta que eran homocigotos para la eliminación del gen GFRa3 endógeno con el dominio extracelular de GFRa3 de ratón recombinante expresado en células de ovario de hámster chino. Se confirmó una respuesta inmune específica hacia GFRa3 mediante inmunoensayos de suero de ratones inmunizados. Se recogieron los bazos de ratones que mostraban una respuesta inmune específica alta y se generaron células de hibridoma productoras de anticuerpos mediante la fusión de los esplenocitos aislados con células de mieloma de ratón siguiendo procedimientos de hibridoma convencionales. Se examinaron los sobrenadantes de hibridoma además en inmunoensayos para determinar la unión a GFRa3 y su capacidad para bloquear la unión de GFRa3 a artemina o a artemina/Ret recubiertas sobre una superficie sólida en un formato de inmunoensayo. Los sobrenadantes también se examinaron para determinar su capacidad para bloquear la estimulación con artemina de la vía del correceptor GFRa3/Ret en un ensayo biológico basado en células. Se obtuvieron secuencias de anticuerpos de región variable mediante amplificación por PCR de clones de hibridoma seleccionados cuyas proteínas de anticuerpo mostraron un bloqueo potente en el ensayo basado en células, y estas secuencias se usaron para producir anticuerpos anti-GFRa3 de ratón recombinantes de longitud completa con un isotipo de IgG1 de ratón. Se seleccionaron dos anticuerpos para los ensayos in vivo que inhibieron potentemente la señalización de la artemina en el ensayo basado en células. En el inmunoensayo de unión in vitro, el anticuerpo M1M6986N bloqueó la unión de GFRa3 tanto a artemina como a artemina/Ret recubiertas en una superficie sólida, y se denomina en el presente documento bloqueador directo. El anticuerpo M1M6977N bloqueó la unión de GFRa3 a artemina/Ret recubierta, pero no a la artemina sola en el inmunoensayo in vitro y se denomina en el presente documento bloqueador indirecto. Estos dos anticuerpos de ratón, M1M6986N y M1M6977N, se seleccionaron para ensayarlos en el modelo de analgesia térmica de capsaicina sensibilizada con artemina (descrito en el Ejemplo 6), ya que estos dos anticuerpos demostraron perfiles de unión y de bloqueo similares a los anticuerpos humanos eficaces. Estos dos anticuerpos se seleccionaron por su capacidad para bloquear la sensibilización inducida por la artemina de la hiperalgesia in vivo en ratones de tipo silvestre. Al igual que sus homólogos de anticuerpos humanos, ambos anticuerpos inhibieron significativamente el efecto sensibilizador de la artemina sobre la hiperalgesia térmica con capsaicina tres días después de la inyección de capsaicina (Figura 1).
Ejemplo 13: Modelo de fibrosarcoma de la metodología del dolor del cáncer de huesos
Sujetos
Se usaron ratones macho adultos en una cepa de fondo C57BI6 para dos experimentos de fibrosarcoma a aproximadamente 12 semanas de vida. Los experimentadores que midieron los datos de resultados para este experimento tuvieron ocultación del grupo de tratamiento de los animales durante la recogida, compilación y análisis de los datos.
Modelo de cáncer de huesos
Para inducir el dolor por cáncer de huesos, los ratones se anestesiaron y luego se inyectaron por vía intrafemoral 1,0 x 106 células de fibrosarcoma MC57G. Estas células se derivan de una estirpe de tumor de fibrosarcoma de ratón C57BI/6. Los tumores suelen crecer agresivamente en este modelo, de modo que la destrucción ósea es evidente 14 días después de la implantación del tumor. Las radiografías se tomaron los días 7, 10 y 14 después de la implantación para verificar el crecimiento del tumor y la destrucción ósea. La destrucción ósea se calificó en una escala de tres puntos, de manera que 0 representaba ninguna destrucción y 3 representaba la destrucción completa del fémur en la región del tumor.
Tratamiento con anticuerpos
Cada animal recibió 30 mg/kg de inyecciones de anticuerpos sc administrados el día anterior a la implantación de las células cancerosas y, de nuevo, en el día 7. Los animales fueron asignados pseudo-aleatoriamente a uno de dos o tres grupos de tratamiento: 1) Anticuerpo de control de isotipo M2M180N (negativo) en dos experimentos separados; 2) anticuerpo anti-GFRa3 de ratón M1M6977N en dos experimentos separados; o 3) anticuerpo anti-GFRa3 de ratón M1M6986N en el segundo experimento solamente. M1M6986 bloquea la interacción de la artemina con GFRa3 y, por lo tanto, se considera un bloqueador "directo" de la acción de la artemina. Por el contrario, M1M6977N inhibe la acción de la artemina a través del complejo GFRa3/RET y, por lo tanto, se considera un inhibidor "indirecto".
Medidas de la nocicepción
Las respuestas nociceptivas al tumor óseo se midieron usando la prueba de von Frey Hair para determinar la alodinia mecánica (táctil) generada, la prueba de soporte dinámico de peso (DWB) para determinar la disposición a soportar peso en una extremidad y el comportamiento de vigilancia. Los resultados de la prueba de Von Frey se expresan en gramos de presión requeridos para la retirada de la pata. Los resultados de soporte de peso se expresan como el porcentaje de peso corporal colocado en la extremidad ipsilateral. El comportamiento de vigilancia se expresa como el tiempo empleado en proteger la extremidad durante un período de dos minutos.
Resultados
Destrucción ósea
No hubo un efecto significativo del tratamiento con anticuerpos en la puntuación de destrucción ósea en ninguno de los dos experimentos, lo que sugirió que el tratamiento con anticuerpos no tuvo impacto en la gravedad del cáncer de huesos en sí (no se muestran los datos).
Comportamiento nociceptivo
Hubo una disminución estadísticamente significativa en la alodinia táctil con el tratamiento con el anticuerpo GFRa3 tras la inyección de fibrosarcoma en el primer experimento (F (1,20) = 9,189, p = 0,007, Figura 2A) y una tendencia estadística hacia la eficacia global en el segundo experimento (F (2,29) = 3,069, p < 0,062, Figura 2B), con comparaciones individuales que, en ocasiones, alcanzan significación en el segundo estudio (Figura 2B).
No hubo un efecto estadísticamente significativo de los anticuerpos GFRa3 sobre el peso dinámico soportado por la extremidad ipsilateral medido 14 días después de la implantación del hueso con células de fibrosarcoma en cualquiera de los experimentos, aunque el primer experimento reveló una tendencia estadística hacia la eficacia con el tratamiento con M1M6977N (t (10) = 2,047, P== 0,068, Figura 3A; F(2,28) = 1,598, p = 0,220, Figura 3B).
Los anticuerpos de GFRa3 redujeron significativamente la vigilancia de la extremidad después de la implantación del cáncer de hueso en ambos experimentos de fibrosarcoma (F (1,20) = 12,270, p = 0,002, Figura 4A; F(2,29) = 3,576, p = 0,041, Figura 4B).
Conclusión
El tratamiento con anticuerpos anti-GFRa3 de ratón redujo significativamente los comportamientos nociceptivos en este modelo de dolor por cáncer de hueso medido por la evaluación de la vigilancia y la prueba de von Frey de la alodinia táctil. Además, hubo una tendencia estadística hacia la eficacia del anticuerpo M1M6977N en el diferencial de soporte de peso en un experimento. Las puntuaciones de destrucción ósea no fueron diferentes en los grupos que recibieron anticuerpos anti-GFRa3 de ratón, lo que sugiere que las diferencias en las medidas relacionadas con el dolor no se deben a las diferencias en la gravedad del cáncer. Por lo tanto, los presentes datos sugieren que los anticuerpos neutralizantes contra GFRa3 podrían ser eficaces contra el dolor del cáncer de huesos. Debido a que las células de sarcoma suelen ser más a menudo tumores primarios que las metástasis en los huesos, y debido a que la mayoría de los cánceres de hueso se derivan de las metástasis de tumores primarios de otros sitios, estos anticuerpos también se ensayaron en un modelo de dolor por cáncer de huesos inducido por carcinoma de mama (mamario). Los tumores de mama y de próstata se encuentran entre los tumores más comúnmente forman metástasis en los huesos.
Ejemplo 14: Modelo de carcinoma de mama de la metodología del dolor del cáncer de huesos
Sujetos
Se usaron ratones macho adultos de una cepa de fondo Balb/c para un experimento de cáncer de huesos de carcinoma de mama de aproximadamente 12 semanas de vida. Los experimentadores que midieron los datos de resultados para este experimento tuvieron ocultación del grupo de tratamiento de los animales durante la recogida, compilación y análisis de los datos.
Modelo de cáncer de huesos
Para inducir el dolor por cáncer de huesos, los ratones se anestesiaron y luego se inyectaron por vía intrafemoral 10.000 células de carcinoma de mama 4T-1. Estas células se derivan de una estirpe de tumor de carcinoma de mama de ratón Balb/c. Los tumores suelen crecer agresivamente en este modelo, de modo que los tumores son graves 18 días después de la implantación. Las radiografías se tomaron los días 10, 14 y 19 después de la implantación para verificar el crecimiento del tumor y la destrucción ósea. La destrucción ósea se calificó en una escala de tres puntos, de manera que 0 representaba ninguna destrucción y 3 representaba la destrucción completa del fémur en la región del tumor.
Tratamiento con anticuerpos
Cada animal recibió 30 mg/kg de inyecciones de anticuerpos sc administrados el día anterior a la implantación de las células cancerosas y, después, dos veces a la semana. Los animales fueron asignados pseudo-aleatoriamente a uno de tres grupos de tratamiento: 1) anticuerpo de control de isotipo M2M180N (negativo); 2) anticuerpo anti-GFRa3 de ratón M1M6977N; o 3) anticuerpo anti-GFRa3 de ratón M1M6986N. M1M6986n bloquea la interacción de la artemina con GFRa3 y, por lo tanto, se considera un bloqueador "directo" de la acción de la artemina. Por el contrario, M1M6977N inhibe la acción de la artemina a través del complejo GFRa3/RET y, por lo tanto, se considera un inhibidor "indirecto".
Medidas de la nocicepción
Las respuestas nociceptivas al tumor óseo se midieron usando la prueba de von Frey Hair para determinar la alodinia mecánica (táctil) generada, la prueba de soporte dinámico de peso (DWB) para determinar la disposición a soportar peso en una extremidad y el comportamiento de vigilancia. Los resultados de la prueba de Von Frey se expresan en gramos de presión requeridos para la retirada de la pata. Los resultados de soporte de peso se expresan como el porcentaje de peso corporal colocado en la extremidad ipsilateral. El comportamiento de vigilancia se expresa como el tiempo empleado en proteger la extremidad durante un período de dos minutos.
Resultados
Destrucción ósea
No hubo un efecto significativo del tratamiento con anticuerpos en la puntuación de destrucción ósea en este modelo, lo que sugiere que el tratamiento con anticuerpos no tuvo impacto en la gravedad del cáncer de huesos en sí.
Comportamiento nociceptivo
Hubo una disminución estadísticamente significativa en la alodinia táctil con el tratamiento con el anticuerpo GFRa3 tras el carcinoma (F (2,25) = 8,626, p = 0,001, Figura 5).
No hubo efectos globales estadísticamente significativos de los anticuerpos GFRa3 en el peso dinámico sobre la extremidad ipsilateral, aunque el efecto global del tratamiento logró una tendencia estadística y M1M6977N logró una eficacia significativa en la comparación post hoc a los 11 días (A), pero no a los 18 días (B), después de la implantación del hueso con células de carcinoma (11 día F (2,25) = 2,939, p = 0,071, Figura 6A; Día 18 F(2,25)=0,149, p = 0,862, Figura 6B).
Los anticuerpos GFRa3 redujeron significativamente la vigilancia de la extremidad después de la implantación del cáncer de hueso en este experimento (F (2,25) = 4,222, p = 0,026, Figura 7).
Conclusión
El tratamiento con anticuerpos anti-GFRa3 de ratón redujo significativamente los comportamientos nociceptivos en este modelo de dolor por cáncer de hueso medido por la evaluación de la vigilancia y la prueba de von Frey de la alodinia táctil. Además, hubo evidencias de eficacia del anticuerpo REGN1967 en el diferencial de soporte de peso en un punto de tiempo. Las puntuaciones de destrucción ósea no fueron diferentes en los grupos que recibieron anticuerpos anti-GFRa3 de ratón, lo que sugiere que las diferencias en las medidas relacionadas con el dolor no se deben a las diferencias en la gravedad del cáncer. Por lo tanto, los presentes datos sugieren que los anticuerpos neutralizantes contra GFRa3 podrían ser eficaces contra el dolor del cáncer de huesos en este modelo de dolor por cáncer de huesos metastásico.
Ejemplo 15. Desestabilización del modelo de menisco medial (DMM) de la metodología del dolor artrósico Sujetos
Se usaron ratones macho adultos en una cepa de fondo C57BI6 para los experimentos de DMM partiendo a aproximadamente 12 semanas de vida. Los experimentadores que midieron los datos de resultados para este experimento tuvieron ocultación del grupo de tratamiento de los animales durante la recogida, compilación y análisis de los datos.
Modelo de DMM
En el modelo de DMM, se desestabiliza el menisco medial de una rodilla y se deja que el animal desarrolle la enfermedad durante 16 semanas. Durante el período de 16 semanas, los animales desarrollan alodinia táctil y aumentos del volumen óseo y en el contenido mineral del hueso en la rodilla lesionada que se asemeja a la artrosis humana precoz. La alodinia táctil se verificó en los animales mediante el ensayo de von Frey 16 semanas antes del inicio del tratamiento con anticuerpos.
Tratamiento con anticuerpos
Cada animal recibió 30 mg/kg de inyecciones de anticuerpo sc administradas semanalmente a partir de las 16 semanas posteriores a la cirugía de d Mm . Los animales fueron asignados pseudo-aleatoriamente a uno de tres grupos de tratamiento: 1) anticuerpo de control de isotipo M2M180N (negativo); 2) anticuerpo anti-GFRa3 de ratón M1M6977N; o 3) anticuerpo anti-GFRa3 de ratón M1M6986N. M1M6986N bloquea la interacción de la artemina con GFRa3 y, por lo tanto, se considera un bloqueador "directo" de la acción de la artemina. Por el contrario, M1M6977N inhibe la acción de la artemina a través del complejo GFRa3/RET y, por lo tanto, se considera un inhibidor "indirecto".
Medidas de la nocicepción
Las respuestas nociceptivas a la patología de rodilla se midieron usando la prueba de von Frey Hair para determinar la alodinia mecánica (táctil) generada.
Resultados
Comportamiento nociceptivo
Hubo una disminución estadísticamente significativa en la alodinia táctil con el tratamiento con el anticuerpo GFRa3 tras la DMM (F(2, 27)=21,68, p = 0,0001, Figura 8).
Conclusión
El tratamiento con anticuerpos GFRa3 de ratón tuvo un efecto estadísticamente significativo sobre la alodinia táctil, de manera que los grupos tratados con los dos anticuerpos GFRa3 mostraron sistemáticamente menos alodinia que el control de isotipos que comenzó 14 días después del inicio del tratamiento semanal. Estos datos sugieren la posibilidad de que los anticuerpos GFRa3 sean eficaces contra el dolor artrósico humano crónico.
Ejemplo 16. Análisis de competitividad cruzada de anticuerpos anti-GFRa3
Se realizó un ensayo de competitividad cruzada para evaluar la capacidad de los anticuerpos seleccionados para competir entre sí por la unión a GFRa3 humano usando un biosensor Octet RED384 (Fortebio Inc.). El experimento completo se realizó a 25 °C con un caudal de 1000 rpm en el tampón Octet HBST (HEPES 0,01 M, pH 7,4, NaCl 0,15 M, EDTA 3 mM, tensioactivo P20 al 0,05 % v/v, BSA a 0,1 mg/ml). Para evaluar si 2 anticuerpos eran capaces de competir entre sí por la unión a sus respectivos epítopos en GFRa3 humano recombinante biotinilado expresado

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Un anticuerpo aislado o fragmento de unión al antígeno del mismo que se une específicamente a GFRa3 humano, en el que el anticuerpo comprende las tres CDR de cadena pesada (HCDR1, HCDR2 y HCDR3) y las tres CDR de cadena ligera (LCDR1, LCDR2 y LCDR3) contenidas en un par de secuencias de aminoácidos de HCVR/LCVR seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NO: 2/10, 18/26, 34/42, 50/58, 66/74, 82/90, 98/106, 114/122, 130/138, 146/154, 162/170, 178/186, 194/202, 210/218, 226/234, 242/250, 258/266, 274/282, 290/298, 306/314, 322/330, 338/346, 354/362, 381/389 y 397/405.
2. El anticuerpo aislado o fragmento de unión al antígeno de la reivindicación 1, que comprende un par de secuencias de aminoácidos de HCVR/LCVR seleccionado del grupo que consiste en la SEQ ID n O: 2/10, 18/26, 34/42, 50/58, 66/74, 82/90, 98/106, 114/122, 130/138, 146/154, 162/170, 178/186, 194/202, 210/218, 226/234, 242/250, 258/266, 274/282, 290/298, 306/314, 322/330, 338/346, 354/362, 381/389 y 397/405.
3. El anticuerpo aislado o fragmento de unión al antígeno de la reivindicación 2, que comprende un par de secuencias de aminoácidos de HCVR/LCVR seleccionado del grupo que consiste en Se Q ID NO: 50/58, 146/154, 210/218 y 290/298.
4. El anticuerpo monoclonal aislado o un fragmento de unión al antígeno del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que tiene una o más de las siguientes características:
(i) presenta una Kd que varía de aproximadamente 10-8 M a aproximadamente 10-13 M medida mediante resonancia de plasmón superficial;
(ii) demuestra la capacidad de bloquear aproximadamente el 50-100 % de la unión de GFRa3 a su ligando, la artemina, con un valor de CI50 que varía de aproximadamente 40 pM a aproximadamente 15 nM;
(iii) demuestra la capacidad de bloquear entre el 20 % y el 100 % de la unión de GFRa3 a un soporte sólido recubierto con una mezcla de artemina y RET;
(iv) bloquea o inhibe la activación de RET dependiente de la artemina con una CI50 que varía de aproximadamente 200 pM a aproximadamente 50 nM;
(v) inhibe o reduce una o más respuestas nociceptivas en un modelo in vivo de dolor por cáncer de huesos; (vi) inhibe o reduce la hiperalgesia térmica sensibilizada con artemina in vivo;
(vii) inhibe o reduce la alodinia en un modelo in vivo de artrosis; o
(viii) no reacciona de forma cruzada con otros receptores conjuntos GFR para RET.
5. El anticuerpo monoclonal aislado o un fragmento de unión al antígeno del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que:
(a) el anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo quimérico y un anticuerpo humano; y/o (b) en el que el anticuerpo no reacciona de forma cruzada con GFRa1 humano o GFRa2 humano; y/o
(c) en el que el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal humano que comprende (a) una región variable de cadena pesada (HCVR) que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 2, 18, 34, 50, 66, 82, 98, 114, 130, 146, 162, 178, 194, 210, 226, 242, 258, 274, 290, 306, 322, 338, 354, 381 y 397; y (b) una región variable de cadena ligera (LCVR) que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 122, 138, 154, 170, 186, 202, 218, 234, 250, 266, 282, 298, 314, 330, 346, 362, 389 y 405.
6. El anticuerpo monoclonal aislado o un fragmento de unión al antígeno del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que:
(a) el anticuerpo demuestra la capacidad de bloquear aproximadamente el 50-95 % de la unión de GFRa3 humano a su ligando, la artemina, con un valor de CI50 que varía de aproximadamente 40 pM a aproximadamente 750 pM; (b) el anticuerpo o el fragmento de unión al antígeno del mismo bloquea aproximadamente el 75-100 % de la unión de GFRa3 humano a su ligando, la artemina, con un valor de CI50 que varía de aproximadamente 400 pM a aproximadamente 15 nM;
(c) el anticuerpo o el fragmento de unión al antígeno del mismo bloquea o inhibe la activación dependiente de la artemina de RET humano con una CI50 que varía de aproximadamente 300 pM a aproximadamente 5 nM; o (d) el anticuerpo o el fragmento de unión al antígeno del mismo bloquea o inhibe la activación dependiente de la artemina de RET de macaco cangrejero con una CI50 que varía de aproximadamente 0,7 nM a aproximadamente 2,5 nM.
7. Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de cualquiera de las reivindicaciones 1-6.
8. Un vector de expresión que comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 7.
9. Un método para producir un anticuerpo anti-GFRa3 o un fragmento de unión al antígeno del mismo que comprende las etapas de introducir el vector de expresión de la reivindicación 8 en una célula hospedadora aislada, cultivar la célula en condiciones que permitan la producción del anticuerpo o fragmento del mismo, y recoger el anticuerpo así producido.
10. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.
11. Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-6 y un segundo agente terapéutico seleccionado del grupo que consiste en un opioide, un inhibidor de COX-2, un anestésico local, un modulador de NMDA, un agonista del receptor cannabinoide, un modulador de la familia de P2X, un antagonista de VR1, un antagonista de la sustancia P, un antagonista del segundo GFRa3, un antagonista de citocinas o de receptor de citocinas, un inhibidor del factor de crecimiento nervioso (NGF) (un inhibidor de bajo peso molecular o un anticuerpo anti-NGF), un inhibidor de BDNF, TrkA, TrkB o p75, aspirina, un AINE, un esteroide, morfina, un inhibidor selectivo de la recaptación de serotonina (ISRS), un inhibidor de la recaptación de serotonina y norepinefrina (SNRI), un tricíclico, un inhibidor de un canal de sodio controlado por tensión (Nav), un inhibidor de los canales de calcio, un inhibidor de los canales de potasio, un factor de necrosis tumoral (TNF) o inhibidor del receptor de TNF, un inhibidor de TWEAK (inductor de apóptosis WEAK relacionado con TNF), un inhibidor de RET, un inhibidor de un ligando de la familia de GDNF, un inhibidor de GFRa1, GFRa2 o GFRa4, un inhibidor de un canal iónico de detección de ácido (ASIC1 o ASIC3), un anticonvulsivo (gabapentina o pregabalina), un inhibidor de un receptor de prequineticina (PROK1 y PROK2), un inhibidor de caspasa, un inhibidor de p38, un inhibidor de IKK1/2, CTLA-4Ig y un corticosteroide; y un vehículo o vehículo farmacéuticamente aceptable; opcionalmente, en el que el segundo antagonista de GFRa3 es una pequeña molécula orgánica, un antagonista de polipéptido, un segundo anticuerpo específico de GFRa3, un ARNip o una molécula antisentido específica de GFRa3; o en el que el antagonista de citocinas o del receptor de citocinas es un antagonista de interleucina-1 (IL-1), un antagonista de IL-6 y un antagonista de IL-18.
12. El anticuerpo aislado o fragmento de unión al antígeno del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, o la composición farmacéutica de la reivindicación 10 u 11, para su uso en el tratamiento de una afección o enfermedad relacionada con GFRa3, o el dolor asociado con la afección o enfermedad relacionada con GFRa3, en el que la afección o enfermedad relacionada con GFRa3 se previene, se mejora o se reduce su gravedad o frecuencia de aparición, o el dolor asociado con la afección o enfermedad se previene, se mejora o se reduce su gravedad o frecuencia de aparición;
en el que la afección o enfermedad relacionada con GFRa3 se selecciona del grupo que consiste en dolor agudo, dolor crónico, dolor neuropático, dolor inflamatorio, un síndrome de dolor funcional, artritis, pancreatitis, artrosis, dolor articular, cefaleas en racimo, neuralgia del trigémino, neuralgia herpética, neuralgias generales, trastornos neurodegenerativos, trastornos del movimiento, trastornos neuroendocrinos, ataxia, dolor visceral, gota, neuralgia posherpética, neuropatía diabética, ciática, dolor de espalda, dolor de cabeza o cuello, dolor intenso o intratable, dolor irruptivo, dolor postoperatorio, eritromelalgia hereditaria, dolor dental, rinitis, dolor oncológico, síndrome de dolor regional complejo ( CRPS), enfermedad inflamatoria del intestino (por ejemplo, enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa) y trastornos de la vejiga.
13. El anticuerpo aislado, el fragmento de unión al antígeno del mismo o la composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 12, en el que el síndrome de dolor funcional se selecciona del grupo que consiste en dolor lumbar crónico, síndrome del intestino irritable (SII), fibromialgia (FM), síndrome de fatiga crónica, dolor abdominal, trastorno de la articulación temporomandibular (TMJD), síndrome de vejiga dolorosa (cistitis intersticial), trastornos/síndromes gastrointestinales funcionales, síndrome de dolor torácico funcional, migrañas y cefaleas de tipo tensional, síndrome de dolor pélvico crónico, síndrome de próstata dolorosa (prostatitis crónica), síndrome de sensibilidad química múltiple y síndrome de la Guerra del Golfo; o en el que el dolor oncológico se asocia con un cáncer seleccionado del grupo que consiste en cáncer de endometrio, cáncer de próstata, cáncer de mama, cáncer de cuello uterino, cáncer de hígado, cáncer pancreático, cáncer de colon, cáncer de estómago, cáncer de útero, cáncer de ovarios, cáncer de riñón, cáncer de pulmón no microcítico, cáncer de cerebro, una leucemia, un linfoma, cáncer de huesos y dolor asociado con la metástasis de un cáncer.
14. El anticuerpo, el fragmento de unión al antígeno o la composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 12 o 13, en el que dicho anticuerpo, fragmento de unión al antígeno o composición farmacéutica es para la administración a un paciente en combinación con un segundo agente terapéutico; en el que dicho segundo agente terapéutico se define opcionalmente en la reivindicación 11.
15. El anticuerpo aislado o fragmento de unión al antígeno de la reivindicación 1, que comprende una secuencia de aminoácidos de HCDR1 de SEQ ID NO: 148; una secuencia de aminoácidos de Hc DR2 de SEQ ID NO: 150; una secuencia de aminoácidos de HCDR3 de SEQ ID NO: 152; una secuencia de aminoácidos de LCDR1 de SEQ ID NO: 156; una secuencia de aminoácidos de LCDR2 de SEQ ID NO: 158; y una secuencia de aminoácidos de LCDR3 de SEQ ID NO: 160.
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