JP2020028277A - グリコサミノグリカン分解酵素又はその阻害物質の検出方法 - Google Patents
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Abstract
Description
被検試料中のグリコサミノグリカン分解酵素又は該酵素の阻害物質を検出する方法であって、以下の工程:
(a)グリコサミノグリカン複合体を基質として含有した電気泳動用ゲルを被検試料存在下で電気泳動する工程、
(b)電気泳動後のゲルをインキュベーションする工程、及び
(c)インキュベーション後のゲルを染色剤で処理する工程
を含む方法。
項2.
グリコサミノグリカン複合体がプロテオグリカンである項1に記載の方法。
項3.
プロテオグリカンがサケ鼻軟骨プロテオグリカンである項2に記載の方法。
項4.
染色剤がアルシアンブルーである項1〜3のいずれかに記載の方法。
項5.
グリコサミノグリカン複合体を基質として含有する、電気泳動を使用してグリコサミノグリカン分解酵素又は該酵素の阻害物質を検出するためのゲル。
項6.
グリコサミノグリカン複合体がプロテオグリカンである項5に記載のゲル。
項7.
プロテオグリカンがサケ鼻軟骨プロテオグリカンである項6に記載のゲル。
項8.
項5〜7のいずれかに記載のゲルを含む、グリコサミノグリカン分解酵素又は該酵素の阻害物質の検出用キット。
本発明の一実施形態は、被検試料中のグリコサミノグリカン分解酵素又は該酵素の阻害物質を検出する方法であって、以下の工程:
(a)グリコサミノグリカン複合体を基質として含有した電気泳動用ゲルを被検試料存在下で電気泳動する工程、
(b)電気泳動後のゲルをインキュベーションする工程、及び
(c)インキュベーション後のゲルを染色剤で処理する工程
を含む方法、である(以下、単に本発明の検出方法と称することがある)。
本発明の一実施形態は、グリコサミノグリカン複合体を基質として含有する、電気泳動を使用してグリコサミノグリカン分解酵素又は該酵素の阻害物質を検出するためのゲル、である(以下、単に本発明のゲルと称することがある)。
本発明の一実施形態は、本発明のゲルを含む、グリコサミノグリカン分解酵素又は該酵素の阻害物質の検出用キット、である(以下、単に本発明のキットと称することがある)。本発明のキットは、本発明のゲルの他に、緩衝液、洗浄液、染色液、pH調整剤、エタノール、使用説明書など、電気泳動用キット又はザイモグラフィー用キットに必要な他の任意の構成要素を適宜含めることができる。
コンドロイチナーゼとして、コンドロイチナーゼABC(Proteus vulgaris由来酵素、Sigma-Aldrichから入手可能)を使用した。
ヒアルロニダーゼとして、ウシ精巣ヒアルロニダーゼ(Sigma-Aldrichから入手可能)を使用した。
30%アクリルアミドストック溶液として、29gのアクリルアミド及び1gのN’,N’−メチレンビスアクリルアミドを純水100mlに溶解したものを使用した。
アルシアンブルー染色液(pH1.0)として、0.5%アルシアンブルー、20%エタノール及び10%酢酸の組成で調製したものを使用した。塩基性色素であるアルシアンブルーは、酸性ムコ物質のカルボキシル基及び/又は硫酸基とイオン結合して青色へ変色する。アルシアンブルー染色液中のpHが2.5では両基に、pH1.0以下の溶液中では硫酸基にのみ結合する。
クマシーブルー染色液として、0.25%クマシーブリリアントブルー R-250、5%エタノール及び7.5%酢酸の組成で調製したものを使用した。クマシーブリリアントブルーは、酸性バッファー条件下において、タンパク質の塩基性又は疎水性残基に結合し、鈍い赤褐色から濃い青色へと変色する。
電気泳動バッファーとして、25mM Tris-HCl(pH8.3)、192mMグリシン及び0.1%SDSの組成で調製したものを用いた。
洗浄液として、20%エタノール及び10%酢酸の組成の水溶液を使用した。
プロテオグリカン又はゼラチンを含有するポリアクリルアミドゲル
常法に従って、表1及び表2に示す材料から、プロテオグリカンを1mg/mlで含む分離ゲルとこれを含まない濃縮ゲル(ともに7.5%SDS−ポリアクリルアミドゲル;90mm×80mm×1mmサイズ)を作製し、分離ゲルに濃縮ゲルを重層した。
コンドロイチナーゼ活性の検出
分離ゲルにおけるプロテオグリカン濃度を0.1mg/ml又は0.5mg/mlに代えた以外は実施例1と同様にして、分離ゲルと濃縮ゲルを作製し重層した。所定量のコンドロイチナーゼをSDSサンプル緩衝液(62.5mM Tris-HCl(pH6.8)、2%SDS及び5%ショ糖)に希釈したサンプル液を作製した。1アプライ当たりのコンドロイチナーゼ量(mU)は第1レーンから順に次のとおりである。
10、5、2.5、1.25、0.63、0.31、0.16、0.08、0.04、0.02(mU)
ヒアルロニダーゼ活性の検出
実施例1と同様にして、プロテオグリカンを0.1mg/mlで含む分離ゲルと濃縮ゲルを作製し重層した。所定量のヒアルロニダーゼ(Sigma-Aldrichから入手可能)をSDSサンプル緩衝液(62.5mM Tris-HCl(pH6.8)、2%SDS、5%ショ糖及び0.005%ブロモフェノールブルー)に希釈したサンプル液を作製した。1アプライ当たりのヒアルロニダーゼ量(ng)は第1レーンから順に次のとおりである。
500、250、125、62.5、31.3、15.6、7.8、3.9、2.0、1.0(ng)
。
反応液のpHによる影響(コンドロイチナーゼ)
実施例1と同様にして、プロテオグリカンを0.1mg/mlで含む分離ゲルと濃縮ゲルを作製し重層した。2mUのコンドロイチナーゼ又は100ngのヒアルロニダーゼをSDSサンプル緩衝液(62.5mM Tris-HCl(pH6.8)、2%SDS、5%ショ糖及び0.005%ブロモフェノールブルー)に希釈したサンプル液を作製した。
阻害物質の検出モデル(リバースザイモグラフィーへの適用)
実施例2と同様にして、プロテオグリカンを0.1mg/mlで含む分離ゲルと濃縮ゲルを作製し重層し、電気泳動し、再生用緩衝液処理した。次いで、ゲルを、ヒアルロニダーゼを0.5mg/mlで含み、150mM NaCl、50mM Tris-HCl(pH7.5)及び1mM MgCl2のインキュベーション用緩衝液に浸し、37℃で16時間振とうした。次いで、ゲルを、1.0mg/mlアクチナーゼE(科研製薬製)を含むリン酸緩衝液に浸して37℃で4時間振とうした。次いで、実施例2と同様にしてアルシアンブルー染色及び洗浄を行った。ヒアルロニダーゼを含まないこと以外は同じ用緩衝液を使用した場合についても同様に染色及び洗浄を行った。ゲルの染色の様子を図5に示す。
そうすると、コンドロイチナーゼやヒアルロニダーゼ等の酵素の阻害物質を含む被検試料をアプライしたゲルを電気泳動した場合、該酵素を含有するインキュベーション用緩衝液に電気泳動したゲルを浸すことによって、酵素活性が阻害されてコンドロイチン硫酸が分解されず、したがって染色処理によってコンドロイチン硫酸が染色されて、阻害活性を検出できることが確認できることとなる。
Claims (8)
- 被検試料中のグリコサミノグリカン分解酵素又は該酵素の阻害物質を検出する方法であって、以下の工程:
(a)グリコサミノグリカン複合体を基質として含有した電気泳動用ゲルを被検試料存在下で電気泳動する工程、
(b)電気泳動後のゲルをインキュベーションする工程、及び
(c)インキュベーション後のゲルを染色剤で処理する工程
を含む方法。 - グリコサミノグリカン複合体がプロテオグリカンである請求項1に記載の方法。
- プロテオグリカンがサケ鼻軟骨プロテオグリカンである請求項2に記載の方法。
- 染色剤がアルシアンブルーである請求項1〜3のいずれかに記載の方法。
- グリコサミノグリカン複合体を基質として含有する、電気泳動を使用してグリコサミノグリカン分解酵素又は該酵素の阻害物質を検出するためのゲル。
- グリコサミノグリカン複合体がプロテオグリカンである請求項5に記載のゲル。
- プロテオグリカンがサケ鼻軟骨プロテオグリカンである請求項6に記載のゲル。
- 請求項5〜7のいずれかに記載のゲルを含む、グリコサミノグリカン分解酵素又は該酵素の阻害物質の検出用キット。
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