CN112147092A - 水体中酸性多糖的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了水体中酸性多糖的检测方法，属于分析检测领域。本发明提供的水体中总酸性多糖的检测方法，将检测过程简化为染色后直接进行二波长测定，通过测定待测水体在标准溶液的两个特征峰波长处的吸光度值，然后利用计算得到的吸光度比值来表征染色反应后水体中总酸性多糖的浓度，提高了检测的准确度，实现省略过滤的同时避免水体中悬浮物的干扰，并缩短了检测时间和成本，实现了操作简单、高效的检测水体中总酸性多糖的目的，且本申请提供的检测方法环保高效，不需要加入有毒化学试剂，避免了二次污染。实施例的结果显示，利用本申请提供的检测方法，省略了过滤操作，与常规检测方法相比，相对误差低至2.5％。
Description
技术领域
本发明涉及分析检测领域，尤其涉及水体中酸性多糖的检测方法。
背景技术
酸性多糖因其生物活性强，具有降血脂、免疫调节、抗凝血、保肝等作用，是生命科学、医学领域应用最为广泛的一类生物活性多糖。其中，在水生态领域，自然水体中的酸性多糖具有高黏性，是水体中大型凝胶体的主要粘结剂，影响着水体中碳循环过程，其含量对水体中碳循环具有重要的作用，同时对气候变化的影响也不容小觑。
目前，现有技术中主要采用单波长紫外-可见光谱法检测水体中酸性多糖的含量，该方法在酸性条件下利用阿尔辛蓝染色后，还需要过滤除去水体中的悬浮物来减少干扰，然后再使用单波长紫外-可见分光光度计测定。但是在过滤过程中不可避免地带来其他干扰，例如过滤膜吸收染色物质、过滤装置和容器的吸附等。尽管可通过同水样、相同的测定步骤来控制误差，但操作步骤的增加，势必会带来干扰，会增加检测的不确定性和工作量，不能实现快速方便地检测。此外，用于检测高含量的酸性多糖的咔唑法和间羟基联苯法需要用到有毒试剂，会产生二次污染，不适用于酸性多糖含量较低的自然水体。因此，需要提供一种如何减少检测过程中的干扰、操作简单、高效的检测水体中酸性多糖的方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种减少检测过程中的干扰、操作简单、高效的检测水体中酸性多糖的方法，本发明提供的检测方法，将检测过程简化为染色—酸化—二波长测定，避免了过滤过程造成的干扰，并缩短了检测时间和成本，且环保高效，不需要加入有毒化学试剂，避免了二次污染。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种水体中总酸性多糖的检测方法，包括以下步骤：
(1)配制梯度浓度的标准溶液，所述标准溶液中的标准物包括黄原胶、海藻酸和糖醛酸中的一种；
(2)对所述步骤(1)中标准溶液进行预处理，所述预处理包括：将所述标准溶液与染色剂混合后，依次进行酸化处理、静置得到上清液；
(3)使用紫外-可见分光光度计确定所述步骤(2)中上清液的两个特征峰波长λ1和λ2，并测得所述上清液在所述两个波长λ1和λ2处的吸光度，计算得到所述标准溶液在两个波长λ1和λ2处的吸光度比值；以所述吸光度比值为横坐标，以相应标准溶液的浓度为纵坐标，建立标准曲线，获得线性回归方程；
(4)采用与所述步骤(2)中相同的方法对待测水体进行预处理，测得待测水体在两个波长λ1和λ2处的吸光度比值，代入所述步骤(3)中线性回归方程，得到水体中总酸性多糖的浓度。
优选地，所述步骤(2)中染色剂为质量浓度为0.02％的酸性阿尔辛蓝。
优选地，所述染色剂和标准溶液的体积比为1:(3～15)。
优选地，所述步骤(2)中酸化处理为调节标准溶液与染色剂混合后得到的溶液的pH为2～5。
优选地，所述步骤(2)中静置的时间为20～120min。
优选地，所述待测水体为溶解性有机碳的浓度小于10mg/L的水体。
本发明还提供了一种水体中溶解态酸性多糖的检测方法，包括以下步骤：首先利用微孔滤膜过滤处理待测水体，得到预处理水体；利用上述技术方案所述水体中总酸性多糖的对所述预处理水体进行检测，得到的酸性多糖的浓度为水体中溶解态酸性多糖的浓度。
优选地，所述微孔滤膜的材质包括尼龙、尼龙混合材质和聚碳酸酯膜中的一种。
优选地，所述微孔滤膜的孔径为0.2～0.5μm。
本发明还提供了一种水体中颗粒态酸性多糖的检测方法，包括以下步骤：将待测水体分为两份，利用上述技术方案所述水体中总酸性多糖的检测方法对其中一份待测水体进行检测，得到水体中总酸性多糖的浓度；利用上述技术方案所述水体中溶解态酸性多糖的对另一份待测水体进行检测，得到水体中溶解态酸性多糖的浓度；将所述水体中总酸性多糖的浓度减去所述水体中溶解态酸性多糖的浓度，得到水体中颗粒态酸性多糖的浓度。
本发明提供了一种水体中总酸性多糖的检测方法，包括以下步骤：首先配制梯度浓度的标准溶液，然后将其与染色剂混合后，依次进行酸化处理、静置的预处理后，利用紫外-可见分光光度计确定所述标准溶液的两个特征峰波长λ1和λ2，以及在两个波长λ1和λ2处的吸光度，再以所述标准溶液在两个波长λ1和λ2处的吸光度比值为横坐标，以相应标准溶液的浓度为纵坐标，建立标准曲线，获得线性回归方程；利用同样的方法获得待测水体在两个波长λ1和λ2处的吸光度比值，代入所述线性回归方程，从而最终获得水体中的总酸性多糖的浓度。本发明提供的水体中总酸性多糖的检测方法，将检测过程简化为酸性条件下染色后直接进行二波长测定，通过测定待测水体在标准溶液的两个特征峰波长处的吸光度值，然后利用计算得到的吸光比值来表征染色反应后水体中总酸性多糖的浓度，提高了检测的准确度，实现省略过滤的同时避免水体中悬浮物的干扰，并缩短了检测时间和成本，实现了操作简单、高效的检测水体中总酸性多糖的目的，且本申请提供的检测方法环保高效，不需要加入有毒化学试剂，避免了二次污染。实施例的结果显示，利用本申请提供的检测方法，省略了过滤操作，与常规检测方法相比，相对误差低至2.5％。
附图说明
图1为本发明实施例1中获得标准曲线图以及线性回归方程；
图2为本发明实施例5中获得标准曲线图以及线性回归方程。
具体实施方式
本发明提供了一种水体中总酸性多糖的检测方法，包括以下步骤：
(1)配制梯度浓度的标准溶液，所述标准溶液中的标准物包括黄原胶、海藻酸和糖醛酸中的一种；
(2)对所述步骤(1)中标准溶液进行预处理，所述预处理包括：将所述标准溶液与染色剂混合后，依次进行酸化处理、静置得到上清液；
(3)使用紫外-可见分光光度计确定所述步骤(2)中上清液的两个特征峰波长λ1和λ2，并测得所述上清液在所述两个波长λ1和λ2处的吸光度，计算得到所述标准溶液在两个波长λ1和λ2处的吸光度比值；以所述吸光度比值为横坐标，以相应标准溶液的浓度为纵坐标，建立标准曲线，获得线性回归方程；
(4)采用与所述步骤(2)中相同的方法对待测水体进行预处理，测得待测水体在两个波长λ1和λ2处的吸光度比值，代入所述步骤(3)中线性回归方程，得到水体中总酸性多糖的浓度。
本发明配制梯度浓度的标准溶液，所述标准溶液中的标准物包括黄原胶、海藻酸和糖醛酸中的一种。本发明对所述梯度浓度的范围和梯度值没有特殊的限定，浓度范围在本领域常规范围内即可。在本发明的实施例中，所述梯度浓度的配制范围为0～10mg/L；所述梯度浓度为0mg/L、2mg/L、4mg/L、6mg/L、8mg/L和10mg/L。本发明对所述标准溶液的配制方法没有特殊的限定，采用本领域熟知的方法配制即可。在本发明中，所述标准溶液的溶剂优选为纯水。本发明对所述黄原胶、海藻酸和糖醛酸的来源没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的市售产品即可。
得到标准溶液后，本发明对所述标准溶液进行预处理，所述预处理包括：将所述标准溶液与染色剂混合后，依次进行酸化处理、静置得到上清液。在本发明中，所述酸化处理过程中，酸性试剂将标准物与染色剂的混合液调至酸性环境下，使得染色剂与标准物中的酸性基团形成盐键，促进标准物与染色剂反应充分，以使标准物与染色剂反应后的混合液在紫外-可见光谱仪扫描时出现特征吸收峰。
在本发明中，所述染色剂优选为质量浓度为0.02％的酸性阿尔辛蓝。本发明对所述酸性阿尔辛蓝的来源没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的市售产品即可。
在本发明中，所述染色剂和标准溶液的体积比优选为1:(3～15)，更优选为1:(5～10)。
在本发明中，所述酸化处理优选为调节标准溶液与染色剂混合后得到的溶液的pH为2～5，所述pH更优选为2.5。本发明将标准溶液与染色剂混合后得到的溶液的pH控制在上述范围内，能够避免pH值过高或过低时，染色剂与标准物反应不充分。本发明对所述酸化处理采用的pH调节剂没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的pH调节剂即可。在本发明中，所述酸化处理采用的pH调节剂优选为冰乙酸。
在本发明中，所述静置的时间优选为20～120min，更优选为30～60min。
得到上清液后，本发明使用紫外-可见分光光度计确定所述上清液的两个特征峰波长λ1和λ2，并测得所述上清液在所述两个波长λ1和λ2处的吸光度，计算得到所述标准溶液在两个波长λ1和λ2处的吸光度比值。本发明对所述紫外-可见分光光度计没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的市售产品即可。在本发明中，所述确定上清液的两个特征峰波长λ1和λ2优选通过使用紫外-可见分光光度计对上清液进行全波长范围内扫描，获得标准溶液的紫外-可见光光谱图，然后从光谱图中选择标准物的特征吸收峰，确定两个特征峰波长λ1和λ1。
得到标准溶液在两个波长λ1和λ2处的吸光度比值后，本发明以所述吸光度比值为横坐标，以相应标准溶液的浓度为纵坐标，建立标准曲线，获得线性回归方程。本发明对所述线性回归方程的获得方法没有特殊的限定，采用本领域熟知的方法获得即可。
得到线性回归方程后，本发明采用与标准溶液相同的预处理方法对待测水体进行预处理，得到待测水体的上清液。在本发明中所述待测水体优选为溶解性有机碳的浓度小于10mg/L的水体。在本发明中，所述待测水体的体积优选为与标准溶液的体积相同。
得到待测水体的上清液后，本申请测得所述待测水体的上清液在两个波长λ1和λ2处的吸光度比值，代入所述线性回归方程，得到水体中总酸性多糖的浓度。在本发明中，所述水体中总酸性多糖包括水体中溶解态酸性多糖和水体中颗粒态酸性多糖。
本发明提供的水体中总酸性多糖的检测方法，将检测过程简化为染色—酸化—二波长测定，避免了过滤过程造成的干扰，并缩短了检测时间和成本，且环保高效，不需要加入有毒化学试剂，避免了二次污染
本发明还提供了一种水体中溶解态酸性多糖的检测方法，包括以下步骤：首先利用微孔滤膜过滤处理待测水体，得到预处理水体；利用上述技术方案中所述水体中总酸性多糖的检测方法对所述预处理水体进行检测，得到的酸性多糖的浓度为水体中溶解态酸性多糖的浓度。
在本发明中，所述微孔滤膜的材质优选包括尼龙、尼龙混合材质和聚碳酸酯膜中的一种，更优选为聚碳酸酯膜。本发明对所述微孔滤膜的来源没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的市售产品即可。
在本发明中，所述微孔滤膜的孔径优选为0.2～0.5μm，更优选为0.4μm。
本发明还提供了一种水体中颗粒态酸性多糖的检测方法，包括以下步骤：将待测水体分为两份，利用上述技术方案中所述水体中总酸性多糖的检测方法对其中一份待测水体进行检测，得到水体中总酸性多糖的浓度；利用上述技术方案中所述水体中溶解态酸性多糖的检测方法对另一份待测水体进行检测，得到水体中溶解态酸性多糖的浓度；将所述水体中总酸性多糖的浓度减去所述水体中溶解态酸性多糖的浓度，得到水体中颗粒态酸性多糖的浓度。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
取春季碟形湖的湖水A作为待测水体，具体检测过程如下：
一、湖水A中总酸性多糖的检测
(1)将黄原胶溶解至纯水中，配制成浓度分别为0mg/L、2mg/L、4mg/L、6mg/L、8mg/L和10mg/L的梯度浓度标准溶液；
(2)对所述步骤(1)中标准溶液进行预处理，所述预处理包括：分别取5ml每一浓度的标准溶液，然后分别加入1mL染色剂，再使用冰乙酸酸化至溶液的pH为2.5后摇匀，静置30min后，分别取每一浓度的标准溶液的上清液；
(3)使用紫外-可见分光光度计对所述步骤(2)中上清液进行全波长范围内扫描，确定两个特征峰波长λ1和λ2分别为340nm和620nm，并测得所述上清液在所述两个波长λ1和λ2处的吸光度，计算得到所述标准溶液在两个波长λ1和λ2处的吸光度比值a(由λ1处的吸光度比λ2处的吸光度获得)；以所述吸光度比值a为横坐标，以相应标准溶液的浓度为纵坐标，建立标准曲线，获得线性回归方程；
图1为实施例1中获得标准曲线图以及线性回归方程，其中线性回归方程为y＝479.5a-500.3(R2＝0.986)，吸光度比值a为横坐标，相应标准溶液的浓度y为纵坐标；
(4)采用与所述步骤(2)中相同的方法对湖水A进行预处理，测得湖水A在波长340nm和620nm处的吸光度比值，代入所述步骤(3)中线性回归方程，得到湖水A中总酸性多糖的浓度。
二、湖水A中溶解态酸性多糖的检测
首先利用孔径为0.4μm的聚碳酸酯微孔滤膜过滤处理湖水A，得到预处理水体；利用上述湖水A中总酸性多糖的检测方法对所述预处理水体进行检测，得到的酸性多糖的浓度为湖水A中溶解态酸性多糖的浓度。
实施例2
取冬季碟形湖的湖水B作为待测水体，按照实施例1的方法，检测该处湖水B中总酸性多糖的浓度以及溶解态酸性多糖的浓度，具体实验结果见表1。
实施例3
取秋季艾溪湖湾部的湖水C作为待测水体，按照实施例1的方法，检测该处湖水C中总酸性多糖的浓度以及溶解态酸性多糖的浓度，具体实验结果见表1。
实施例4
取夏季鄱阳湖的湖水D作为待测水体，按照实施例1的方法，检测该处湖水D中总酸性多糖的浓度以及溶解态酸性多糖的浓度，具体实验结果见表1；
实施例5
取春季信江中游的河水E作为待测水体，按照实施例1的方法，检测该处湖水E中总酸性多糖的浓度以及溶解态酸性多糖的浓度，其中，加入0.5ml染色剂，具体实验结果见表1。
图2为实施例5中获得标准曲线图以及线性回归方程，其中线性回归方程为y＝188.0a'-195.5(R2＝0.987)，吸光度比值a'为横坐标，相应标准溶液的浓度y为纵坐标。
实施例6
取春季信江下游的河水F作为待测水体，按照实施例5的方法，检测该处河水F中总酸性多糖的浓度以及溶解态酸性多糖的浓度，具体实验结果见表1。
对比例
以实施例1中湖水A作为待测水体，按照常规方法测定实施例1中湖水A中总酸性多糖的浓度以及溶解态酸性多糖的浓度，具体检测过程如下：
一、常规方法测定湖水A中总酸性多糖
(1)将黄原胶溶解至纯水中，配制成浓度分别为0mg/L、2mg/L、4mg/L、6mg/L、8mg/L和10mg/L的梯度浓度标准溶液；
(2)对所述步骤(1)中标准溶液进行预处理，所述预处理包括：分别取5ml每一浓度的标准溶液，然后分别加入1ml染色剂，再使用冰乙酸酸化至溶液的pH为2.5后摇匀，静置30min后，使用孔径为0.4μm的聚碳酸酯滤膜过滤，获得每一浓度的标准溶液的过滤液；
(3)使用紫外-可见分光光度计对所述步骤(2)中过滤液进行全波长范围内扫描，并测得所述过滤液在波长610nm处的吸光度；以所述吸光度为横坐标，以相应标准溶液的浓度为纵坐标，建立标准曲线，获得线性回归方程；
(4)采用与所述步骤(2)中相同的方法对湖水A进行预处理，测得湖水A在波长610nm处的吸光度，代入所述步骤(3)中线性回归方程，得到湖水A中总酸性多糖的浓度，具体实验结果见表1。
二、常规方法测定湖水A中溶解态酸性多糖
首先利用孔径为0.4μm的聚碳酸酯滤膜过滤处理湖水A，得到预处理水体；利用上述湖水A中总酸性多糖的常规检测方法对所述预处理水体进行检测，得到的酸性多糖的浓度为湖水A中溶解态酸性多糖的浓度；
分别以实施例2～6中湖水B、湖水C、湖水D、河水E和河水F作为待测水体，按照上述常规步骤分别测定实施例2～6中湖水B、湖水C、湖水D、河水E和河水F中总酸性多糖的浓度以及溶解态酸性多糖的浓度，具体实验结果见表1。
表1不同水体中利用本申请中二波长法与常规方法测定结果的比较
相对误差由(二波长测定浓度-常规方法测定浓度)/常规方法测定浓度计算得到。
由实施例、对比例和表1可知，本发明提供的水体中酸性多糖的检测方法，将检测过程简化为酸性条件下染色后直接进行二波长测定，实现省略过滤的同时避免水体中悬浮物的干扰，并缩短了检测时间和成本，实现了操作简单、高效的检测水体中总酸性多糖的目的，与常规检测方法相比，相对误差低至2.5％，且本申请提供的检测方法环保高效，不需要加入有毒化学试剂，避免了二次污染。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种水体中总酸性多糖的检测方法，包括以下步骤：
(1)配制梯度浓度的标准溶液，所述标准溶液中的标准物包括黄原胶、海藻酸和糖醛酸中的一种；
(2)对所述步骤(1)中标准溶液进行预处理，所述预处理包括：将所述标准溶液与染色剂混合后，依次进行酸化处理、静置得到上清液；
(3)使用紫外-可见分光光度计确定所述步骤(2)中上清液的两个特征峰波长λ1和λ2，并测得所述上清液在所述两个波长λ1和λ2处的吸光度，计算得到所述标准溶液在两个波长λ1和λ2处的吸光度比值；以所述吸光度比值为横坐标，以相应标准溶液的浓度为纵坐标，建立标准曲线，获得线性回归方程；
(4)采用与所述步骤(2)中相同的方法对待测水体进行预处理，测得待测水体在两个波长λ1和λ2处的吸光度比值，代入所述步骤(3)中线性回归方程，得到水体中总酸性多糖的浓度。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤(2)中染色剂为质量浓度为0.02％的酸性阿尔辛蓝。
3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述染色剂和标准溶液的体积比为1:(3～15)。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤(2)中酸化处理为调节标准溶液与染色剂混合后得到的溶液的pH为2～5。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤(2)中静置的时间为20～120min。
6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述待测水体为溶解性有机碳的浓度小于10mg/L的水体。
7.一种水体中溶解态酸性多糖的检测方法，包括以下步骤：首先利用微孔滤膜过滤处理待测水体，得到预处理水体；利用权利要求1～6任一项所述检测方法对所述预处理水体进行检测，得到的酸性多糖的浓度为水体中溶解态酸性多糖的浓度。
8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述微孔滤膜的材质包括尼龙、尼龙混合材质和聚碳酸酯膜中的一种。
9.根据权利要求7或8所述的检测方法，其特征在于，所述微孔滤膜的孔径为0.2～0.5μm。
10.一种水体中颗粒态酸性多糖的检测方法，包括以下步骤：将待测水体分为两份，利用权利要求1～6任一项所述检测方法对其中一份待测水体进行检测，得到水体中总酸性多糖的浓度；利用权利要求7～9任一项所述检测方法对另一份待测水体进行检测，得到水体中溶解态酸性多糖的浓度；将所述水体中总酸性多糖的浓度减去所述水体中溶解态酸性多糖的浓度，得到水体中颗粒态酸性多糖的浓度。
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