JP2019533718A - がんの処置における使用のための組換え免疫毒素 - Google Patents

がんの処置における使用のための組換え免疫毒素 Download PDF

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Abstract

本明細書において提供されるものは、がんを処置するための方法、および関係する組成物である。例えば、がんであるなどの対象において新生物形成に中立な寛容原性環境を作り出すための、および組換え免疫毒素を投与するための方法が提供されている。

Description

がんの処置のための方法および組成物
関連出願
本出願は、米国特許法第１１９条の下で、２０１６年９月２７日に出願された米国仮特許出願第６２／４００，６０９号、２０１６年１０月４日に出願された米国仮特許出願第６２／４０３，８８９号、２０１６年１０月５日に出願された米国仮特許出願第６２／４０４，７５４号、２０１６年１０月６日に出願された米国仮特許出願第６２／４０５，２２１号、２０１６年１０月１９日に出願された米国仮特許出願第６２／４１０，２２６号、２０１６年１０月２５日に出願された米国仮特許出願第６２／４１２，７８６号の優先権の利益を主張するものであり、これらのそれぞれの内容全体が、参照により本明細書において援用される。
本明細書において提供されるものは、がんを処置することのための方法、および関連する組成物である。例えば、がんを有するものなどの対象において新生物形成に中立な寛容原性環境を作り出すための方法、および組換え免疫毒素を投与することが提供される。
一側面において、対象において新生物形成に中立な寛容原性環境を作り出すこと、および組換え免疫毒素を、がんを処置する対象へと投与することを含む、がんを有する対象を処置することのための方法が提供される。
本明細書において提供される方法または組成物のいずれか１つの一態様において、がんは、非血液細胞がんである。本明細書において提供される方法または組成物のいずれか１つの一態様において、がんは、メソテリン発現がん細胞を含む。本明細書において提供される方法または組成物のいずれか１つの一態様において、がんは、中皮腫、膵臓腺がん、卵巣がん、肺腺がん、乳がんまたは胃がんである。
本明細書において提供される方法のいずれか１つの一態様において、組換え免疫毒素は、対象、または試験対象に免疫抑制療法を一切伴わずに投与されたときであれば、対象、または試験対象における望ましくない免疫応答を生成するか、または生成すると予期される。本明細書において提供される方法のいずれか１つの一態様において、組換え免疫毒素は、対象、または試験対象に免疫抑制剤を含む合成ナノキャリアを一切伴わずに投与されたときであれば、対象、または試験対象における望ましくない免疫応答を生成するか、または生成すると予期される。
本明細書において提供される方法のいずれか１つの一態様において、望ましくない免疫応答は、組換え免疫毒素に対する望ましくない抗体産生である。本明細書において提供される方法のいずれか１つの一態様において、望ましくない免疫応答は、組換え免疫毒素の毒素に対する望ましくない抗体産生である。
本明細書において提供される方法のいずれか１つの一態様において、対象において新生物形成に中立な寛容原性環境は、対象への免疫抑制剤を含む合成ナノキャリアの投与により作り出される。
本明細書において提供される方法のいずれか１つの一態様において、作り出される新生物形成に中立な寛容原性環境は、その中において、がんの成長を高めることなく、組換え免疫毒素に対する望ましくない免疫応答が低減するか、または除去されるものである。
本明細書において提供される方法のいずれか１つの一態様において、組換え免疫毒素の投与は繰り返される。本明細書において提供される方法のいずれか１つの一態様において、組換え免疫毒素の投与は、少なくとも２、３回またはそれ以上の回数繰り返される。
本明細書において提供される方法のいずれか１つの一態様において、新生物形成に中立な寛容原性環境は、組換え免疫毒素のそれぞれの投与の間中存在する。本明細書において提供される方法のいずれか１つの一態様において、新生物形成に中立な寛容原性環境は、組換え免疫毒素のそれぞれの投与の間中作り出される。
本明細書において提供される方法のいずれか１つの一態様において、免疫抑制剤を含む合成ナノキャリアは、組換え免疫毒素の繰り返し投与の間中、対象に少なくとも１回投与される。本明細書において提供される方法のいずれか１つの一態様において、免疫抑制剤を含む合成ナノキャリアは、組換え免疫毒素の繰り返し投与の間中、対象に少なくとも２回投与される。本明細書において提供される方法のいずれか１つの一態様において、免疫抑制剤を含む合成ナノキャリアは、組換え免疫毒素の繰り返し投与の間中、対象に少なくとも３回投与される。
本明細書において提供される方法のいずれか１つの一態様において、免疫抑制剤を含む合成ナノキャリアは、組換え免疫毒素の第一の投与と共にのみ投与される。
本明細書において提供される方法のいずれか１つの一態様において、組換え免疫毒素の投与が少なくとも２回あるとき、免疫抑制剤を含む合成ナノキャリアは、第一および第二の投与と共にのみ投与される。
本明細書において提供される方法のいずれか１つの一態様において、免疫抑制剤を含む合成ナノキャリアは、組換え免疫毒素のそれぞれの投与と共に投与される。本明細書において提供される方法のいずれか１つの一態様において、免疫抑制剤を含む合成ナノキャリアの投与（単数または複数）は、組換え免疫毒素の投与と併用される。本明細書において提供される方法のいずれか１つの一態様において、免疫抑制剤を含む合成ナノキャリアの投与（単数または複数）は、組換え免疫毒素の投与と同時である。本明細書において提供される方法のいずれか１つの一態様において、合成ナノキャリアは、組換え免疫毒素より前に投与される。
本明細書において提供される方法のいずれか１つの一態様において、方法は、免疫抑制剤と含む合成ナノキャリアを伴わない組み換え免疫毒素を投与することをさらに含む。本明細書において提供される方法のいずれか１つの一態様において、組換え免疫毒素は、免疫抑制剤を含む合成ナノキャリアを伴わずに、少なくとも２、３回またはそれ以上の回数が投与される。
本明細書において提供される方法のいずれか１つの一態様において、免疫抑制剤を含む合成ナノキャリアと組み合わせた組換え免疫毒素の繰り返し投与が、２または３サイクルあり、繰り返し投与のそれぞれのサイクルは、本明細書において提供される方法のいずれか１つにおいて定義されるものとしての繰り返し投与のいずれか１つのセットにおいて定義されているものである。
本明細書において提供される方法のいずれか１つの一態様において、方法は、少なくとも２または３サイクルの後に、免疫抑制剤を含む合成ナノキャリアを伴わずに組換え免疫毒素を投与することをさらに含む。本明細書において提供される方法のいずれか１つの一態様において、組換え免疫毒素は、少なくとも２または３サイクルの後に、免疫抑制剤を含む合成ナノキャリアを伴わずに、少なくとも２、３回またはそれ以上の回数が投与される。
本明細書において提供される方法または組成物のいずれか１つの一態様において、組換え免疫毒素は、抗体、またはそれらの抗原結合性フラグメント、および毒素を含む。本明細書において提供される方法または組成物のいずれか１つの一態様において、組換え免疫毒素の抗体またはそれらの抗原結合性フラグメントなどのリガンドは、がんの細胞上で発現する抗原に特異的に結合する。本明細書において提供される方法または組成物のいずれか１つの一態様において、抗原はメソテリンである。
本明細書において提供される方法または組成物のいずれか１つの一態様において、組換え免疫毒素の毒素は、細菌起源の毒素である。本明細書において提供される方法または組成物のいずれか１つの一態様において、細菌起源の毒素は、Pseudomonas毒素である。本明細書において提供される方法または組成物のいずれか１つの一態様において、毒素は、Pseudomonas外毒素Ａである。本明細書において提供される方法または組成物のいずれか１つの一態様において、組換え免疫毒素は、ＬＭＢ−１００である。
本明細書において提供される方法のいずれか１つの一態様において、方法は、組換え免疫毒素の少なくとも１回の投与と併用して、チェックポイント阻害剤を投与することをさらに含む。本明細書において提供される方法のいずれか１つの一態様において、チェックポイント阻害剤は、組換え免疫毒素の少なくとも一回の投与と同時に投与される。本明細書において提供される方法のいずれか１つの一態様において、チェックポイント阻害剤は、組換え免疫毒素の少なくとも１回の投与の２４時間以内に投与される。本明細書において提供される方法のいずれか１つの一態様において、チェックポイント阻害剤は、組換え免疫毒素のそれぞれの投与と併用して投与される。本明細書において提供される方法のいずれか１つの一態様において、チェックポイント阻害剤の投与またはそれぞれの投与は、組換え免疫毒素の投与またはそれぞれの投与の後に投与される。
本明細書において提供される方法または組成物のいずれか１つの一態様において、チェックポイント阻害剤は、抗ＣＬＴＡ４抗体である。本明細書において提供される方法または組成物のいずれか１つの一態様において、チェックポイント阻害剤は抗ＯＸ−４０抗体である。
本明細書において提供される方法のいずれか１つの一態様において、新生物形成に中立な寛容原性環境は、免疫抑制療法を伴わない組換え免疫毒素の投与の後に作り出される。本明細書において提供される方法のいずれか１つの一態様において、組換え免疫毒素に対する望ましくない免疫応答は、免疫抑制療法を伴わない組換え免疫毒素の投与後に、対象において存在する。
本明細書において提供される方法のいずれか１つの一態様において、方法は、新生物形成に中立な寛容原性環境を作り出す前に、免疫抑制療法を伴わずに組換え免疫毒素を対象に投与することをさらに含む。本明細書において提供される方法のいずれか１つの一態様において、望ましくない免疫応答は、組換え免疫毒素に対する望ましくない抗体産生である。本明細書において提供される方法のいずれか１つの一態様において、望ましくない免疫応答は、組換え免疫毒素の毒素に対する望ましくない抗体産生である。
本明細書において提供される方法のいずれか１つの一態様において、方法は、がんを有する対象を同定することをさらに含む。本明細書において提供される方法のいずれか１つの一態様において、対象は、新生物形成に中立な寛容原性環境を必要とするものである。本明細書において提供される方法のいずれか１つの一態様において、方法は、新生物形成に中立な寛容原性環境を必要とするものとして対象を同定することをさらに含む。
本明細書において提供される方法のいずれか１つの一態様において、方法は、対象における組換え免疫毒素に対する望ましくない免疫応答を評価することをさらに含む。
本明細書において提供される方法または組成物のいずれか１つの一態様において、免疫抑制剤は、ｍＴＯＲ阻害剤である。本明細書において提供される方法または組成物のいずれか１つの一態様において、ｍＴＯＲ阻害剤は、ラパマイシンである。
本明細書において提供される方法または組成物のいずれか１つの一態様において、免疫抑制剤は、合成ナノキャリアに封入されている。
本明細書において提供される方法または組成物のいずれか１つの一態様において、合成ナノキャリアは、ポリマーナノキャリアを含む。本明細書において提供される方法または組成物のいずれか１つの一態様において、ポリマーナノキャリアは、ポリエステルまたはポリエーテルに接着したポリエステルを含む。本明細書において提供される方法または組成物のいずれか１つの一態様において、ポリエステルは、ポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）、ポリ（乳酸−コ−グリコール酸）またはポリカプロラクトンを含む。本明細書において提供される方法または組成物のいずれか１つの一態様において、ポリマーナノキャリアは、ポリエステルおよびポリエーテルに接着したポリエステルを含む。本明細書において提供される方法または組成物のいずれか１つの一態様において、ポリエーテルは、ポリエチレングリコールまたはポリプロピレングリコールを含む。
本明細書において提供される方法または組成物のいずれか１つの一態様において、合成ナノキャリアの集団の動的光散乱を使用して得られた粒子サイズ分布の平均は、１１０ｎｍより大きい直径である。本明細書において提供される方法または組成物のいずれか１つの一態様において、直径は、１５０ｎｍより大きい。本明細書において提供される方法または組成物のいずれか１つの一態様において、直径は、２００ｎｍより大きい。本明細書において提供される方法または組成物のいずれか１つの一態様において、直径は、２５０ｎｍより大きい。本明細書において提供される方法または組成物のいずれか１つの一態様において、直径は、５μｍより小さい。本明細書において提供される方法または組成物のいずれか１つの一態様において、直径は、４μｍより小さい。本明細書において提供される方法または組成物のいずれか１つの一態様において、直径は、３μｍより小さい。本明細書において提供される方法または組成物のいずれか１つの一態様において、直径は、２μｍより小さい。本明細書において提供される方法または組成物のいずれか１つの一態様において、直径は、１μｍより小さい。本明細書において提供される方法または組成物のいずれか１つの一態様において、直径は、５００ｎｍより小さい。本明細書において提供される方法または組成物のいずれか１つの一態様において、直径は、４５０ｎｍより小さい。本明細書において提供される方法または組成物のいずれか１つの一態様において、直径は、４００ｎｍより小さい。本明細書において提供される方法または組成物のいずれか１つの一態様において、直径は、３５０ｎｍより小さい。本明細書において提供される方法または組成物のいずれか１つの一態様において、直径は、３００ｎｍより小さい。
本明細書において提供される方法または組成物のいずれか１つの一態様において、合成ナノキャリア中に含まれる免疫抑制剤の負荷量(load)は、合成ナノキャリア全体の平均で、０．１％と５０％（重量／重量）との間である。本明細書において提供される方法または組成物のいずれか１つの一態様において、負荷量は、０．１％と２５％との間である。本明細書において提供される方法または組成物のいずれか１つの一態様において、負荷量は、１％と２５％との間である。本明細書において提供される方法または組成物のいずれか１つの一態様において、負荷量は、２％と２５％との間である。本明細書において提供される方法または組成物のいずれか１つの一態様において、負荷量は、２％と１０％との間である。
本明細書において提供される方法または組成物のいずれか１つの一態様において、合成ナノキャリアの集団のアスペクト比は、１：１、１：１．２、１：１．５、１：２、１：３、１：５、１：７または１：１０よりも大きい。
本明細書において提供される方法のいずれか１つの一態様において、方法は、対象に投与する前に、投与する間中に、投与する後に、組換え免疫毒素に対する免疫応答を、対象において評価することをさらに含む。
本明細書において提供される方法のいずれか１つの一態様において、投与することは静脈内、腹腔内、または皮下投与によりなされる。
本明細書において提供される方法のいずれか１つの一態様において、ｒＩＴの用量は、本明細書において提供される免疫抑制剤を含む合成ナノキャリアを併用して投与されなかったときの類似の効果のレベルに到達するｒＩＴの用量より少ない。本明細書において提供される方法のいずれか１つの一態様において、ｒＩＴの用量は、少なくとも１０％少ない。本明細書において提供される方法のいずれか１つの一態様において、ｒＩＴの用量は、少なくとも２０％少ない。本明細書において提供される方法のいずれか１つの一態様において、方法は、免疫抑制剤を含む合成ナノキャリアと併用して投与されなかったときの類似の治療効果レベルに到達するｒＩＴの用量よりも少なくなるようにｒＩＴの用量を選択することをさらに含む。
一側面において、組換え免疫毒素を含む１以上の用量および免疫抑制剤を含む合成ナノキャリアを含む１以上の用量を含むキットが提供される。
本明細書において提供されるキットのいずれか１つの一態様において、キットは、チェックポイント阻害剤を含む１以上の用量をさらに含む。
本明細書において提供されるキットのいずれか１つの一態様において、キットは、使用のための指示をさらに含む。本明細書において提供されるキットのいずれか１つの一態様において、使用のための指示は、本明細書において提供される方法のいずれか１つを実行するための指示を含む。
本明細書において提供されるキットのいずれか１つの一態様において、免疫抑制剤を含む合成ナノキャリアは、本明細書において提供されるかかる組成物のいずれか１つについての記載のとおりのものである。
本明細書において提供されるキットのいずれか１つの一態様において、組換え免疫毒素は、本明細書において提供されるかかる組成物のいずれか１つについての記載のとおりのものである。
一側面において、提供される方法のいずれか１つまたは例のいずれか１つにおいて記載のとおりの組成物が提供される。一態様において、組成物は提供される方法のいずれか１つに従った投与についての組成物のいずれか１つである。
別の側面において、組成物のいずれか１つは、提供される方法のいずれか１つにおいての使用のためのものである。
図１は、シクロホスファミドおよびペントスタチン（ＣＰ／ＰＳ）ならびにＳＳ１Ｐを伴う処置後数か月における高い全腫瘍応答を伴う患者における、中皮腫腫瘍応答を示す。上端のグラフは８人の患者を伴う２つの処置サイクルを示し、中央のグラフは１人の患者を伴う４つの処置サイクルを示し、および下端のグラフは１人の患者を伴う６つの処置サイクルを示している。 図２Ａ〜２Ｆは、ＬＭＢ−１００およびＳＶＰ−Ｒの組み合わせがＬＭＢ−１００に対するＡＤＡ応答を妨げることを示している。図２Ａは、ＬＭＢ−１００のリボンダイアグラムおよびＳＶＰ−Ｒの図説である。図２Ｂは、ＬＭＢ−１００またはＬＭＢ−１００および１、３、または７回のＳＶＰ−Ｒとの組み合わせ（矢印により示される）で７回注入されたマウスを示す。抗ＬＭＢ−１００抗体は、ＥＬＩＳＡにより評価された（ｎ＝８）。
図２Ｃは、ＬＭＢ−１００およびＳＶＰ−Ｒを矢印により示されるように注入されたマウスを示す（ｎ＝７）。図２Ｄは、ＬＭＢ−１００およびＳＶＰ−Ｒを矢印により示されるように注入されたマウスを示す。１０週目における最終的な平均力価が示される（ｎ＝７）。 図２Ｅは、処置されたマウスからの血漿を使用した中和アッセイを示す（ｎ＝７）。ＫＬＭ−１細胞は、播種され、血漿とＬＭＢ−１００の混合物で処置された。細胞生存率は、７２時間後に評価された。曲線は、７つの生存能力曲線の平均を表している（ｎ＝７、試料毎に６つのレプリカ）。図２Ｆは、矢印により示されるようにＬＭＢ−１００およびＳＶＰ−Ｒを注入されたマウスを示す（ｎ＝８）。ＥＬＩＳＡプレートは、ＬＭＢ−１００、Ｆａｂまたは抗ＴＡＣ−ＰＥ２４でコーティングされた。６週目からの血漿試料が評価された。５０％の結合についての希釈係数が示されている。直線は、平均エラーバーＳＥＭを示す。図２Ｂおよび２Ｃにおける統計解析のために、それぞれの曲線についてのＡＵＣは、ｏｎｅ ｗａｙ ＡＮＯＶＡを使用して計算および比較された。
図３Ａ〜３Ｃは、図２Ｂにおいて示された隔週の注入の後のマウスの体重およびＡＵＣを示す。図３Ａは、ＬＭＢ−１００（２．５ｍｇ／ｋｇ）またはＬＭＢ−１００および１、３、または７回のＳＶＰ−Ｒ（２．５ｍｇ／ｋｇ）の組み合わせで７回注入された雌のＢａｌｂ／ｃマウスを示す。血漿は、収集されＥＬＩＳＡにより抗ＬＭＢ−１００抗体について分析された。統計分析について、それぞれの曲線のＡＵＣは、ｏｎｅ ｗａｙ ＡＮＯＶＡを使用して計算および分析された。エラーバーＳＥＭ、ｎ＝８。図３Ｂは、それぞれの注入前のマウスの重量を示す。 図３Ｃは、ＬＭＢ−１００（２．５ｍｇ／ｋｇ）およびＳＶＰ−Ｒ（２．５ｍｇ／ｋｇ）を隔日で３回の静脈内注入を含む隔週のサイクルで注入されたマウスを示す（ＯＯＤ）。マウスの重量は、それぞれの注入の前に評価された。注入時間は、矢印により示される（ｎ＝７）。 図４は、ＳＳ１Ｐペアレント免疫毒素（parent immunotoxin）に対するＡＤＡ形成上のＳＶＰ−Ｒの効果を示す。雌のＢａｌｂ／ｃマウスは、９用量のＳＳ１Ｐ（０．２５ｍｇ／ｋｇ）、９用量のＳＳ１Ｐおよび３用量のＳＶＰ−Ｒ（２．５ｍｇ／ｋｇ）の組み合わせ、またはビヒクルのいずれかを注入された（ｎ＝１０）。血漿は、収集されＥＬＩＳＡにより抗ＳＳ１Ｐ抗体について分析された。統計分析のために、それぞれの曲線のＡＵＣが計算された。エラーバーは、ＳＥＭを示す。注入時間は、矢印により示される。
図５Ａ〜５Ｂは、ＬＭＢ−１００ ＩＣ５０のマウス血漿における中和抗体の効果を示す。マウスは、１５用量のＬＭＢ−１００（２．５ｍｇ／ｋｇ）、１５用量のＬＭＢ−１００および６用量のＳＶＰ−Ｒ（２．５ｍｇ／ｋｇ）の 組み合わせ、またはビヒクルのいずれかを、図２Ｅにおいて示されているスケジュール毎に注入された（ｎ＝７）。マウスからの血漿は、希釈され、ＬＭＢ−１００と混合された。ＫＬＭ−１細胞は、９６ウェルプレートに播種され、血漿と免疫毒素の混合物を処置された。７２時間後、細胞生存率は、ＷＳＴ−８を使用して評価された。生存能力曲線は、それぞれの試料に適ったものであり、ＩＣ５０が計算された。図５Ａは、それぞれの試料のＩＣ５０を示す。図５Ｂは、それぞれの試料における力価とＩＣ５０の相関を示す。四角は、ＬＭＢ−１００処置マウスからの血漿試料を表し、および三角は、ＬＭＢ−１００＋ＳＶＰ−Ｒ処置マウスからの血漿試料を示す。エラーバーは、ＳＥＭを示す。Ｐ値は、ｏｎｅ ｗａｙ ＡＮＯＶＡを使用するＩＣ５０の比較である。
図６Ａ〜６Ｄは、ＬＭＢ−１００とＳＶＰ−Ｒの組み合わせが、特異的、移植可能、および制御性Ｔ細胞を介する免疫応答を誘導することを示す。図６Ａは、ＬＭＢ−１００（ｉ．ｖ．２．５ｍｇ／ｋｇ）またはＬＭＢ−１００とＳＶＰ−Ｒ（２．５ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｖ．）との組み合わせを毎週３回注入されたマウスを示す。４〜８週目において、マウスはＬＭＢ−１００（ｉ．ｖ．）およびオボアルブミン（ｓ．ｃ．）の毎週の用量を抗原投与された。血漿は収集され、ＥＬＩＳＡにより抗ＬＭＢ−１００抗体および抗ＯＶＡ抗体について分析された。統計分析のために、それぞれの曲線についてのＡＵＣは、マン・ホイットニーのＵ検定を使用して計算および分析された。エラーバーは、ＳＥＭ、ｎ＝１３を示す。 図６Ｂは、ビヒクル、ＬＭＢ−１００、ＳＶＰ−Ｒまたは両方を６回注入されたマウスを示す。４週目において、ドナーマウスからの脾細胞が単離され、レシピエントナイーブマウスに養子移入された。レシピエントマウスは、ＬＭＢ−１００を６回注入された。血漿は収集され、ＥＬＩＳＡにより抗ＬＭＢ−１００抗体について分析された。エラーバーはＳＥＭを示し、同一のスケジュールである２つの別個の実験からの結果が結合された（ｎ＝５〜１０）。
図６Ｃは、ＬＭＢ−１００を１、３、５、２９、３１、３３、４３、４５および４７日目に注入されたマウスを示す。ＳＶＰ−Ｒは、１、３および５日目に与えられた。抗マウスＣＤ−２５枯渇性抗体（ＰＣ６１）またはアイソタイプ制御を１５および１６日目に腹腔内に注入された。５５日目の力価が示された。 図６Ｄは、ＬＭＢ−１００またはＬＭＢ−１００およびＳＶＰ−Ｒの組み合わせを７回注入されたマウスからの血漿を示す。抗ＬＭＢ−１００アイソタイプは、ＬＭＢ−１００に特異的なＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３およびＩｇＭのサブクラスを用いたサンドイッチＥＬＩＳＡを使用して分析された（ｎ＝８）。 図７は、養子移入に使用したドナーマウスにおけるＡＤＡ応答を示す。マウスは、ビヒクル、ＬＭＢ−１００（２．５ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｖ．）、ＳＶＰ−Ｒ（２．５ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｖ．）またはＬＭＢ−１００およびＳＶＰ−Ｒの組み合わせを６回注入された。血漿試料は、最後の注入の３日後に採取された。
図８Ａ〜８Ｄは、ＬＭＢ−１００およびＳＶＰ−Ｒが樹状細胞およびマクロファージ上に優先的に共存することを示す。図８Ａは、実験プロトコルを示す。色素が共役したＳＶＰ−Ｃｙ５およびＬＭＢ−１００−Ａｌｅｘａ４８８は、単独で、または組み合わせて静脈内に注入された（ｎ＝グループごとに３〜４マウス）。脾臓細胞は、共役色素の取り込みについて注入の２時間後にＦＡＣＳにより分析された。 図８Ｂ〜８Ｃは、代表的なＦＡＣＳプロットがマクロファージ（Ｆ４／８０＋ＣＤ１１ｂ＋）および樹状細胞（ＣＤ１１ｃ＋ＭＨＣ−ＩＩ＋）についてのゲーティング、およびゲーティングされた集団によるｉｎ ｖｉｖｏでの取り込みを示すことを示す。太字の象限は、それぞれの実験条件について分析された陽性細胞の割合を示す。 図８Ｄは、マクロファージ、ＤＣ、単核球、ＣＤ４＋Ｔ細胞、Ｂ細胞、好中球およびＣＤ８＋Ｔ細胞によるＳＶＰ−ＲおよびＬＭＢ−１００のｉｎ ｖｉｖｏでの取り込みの要旨を示す。すべての細胞についてのゲーティング戦略は、表１において示される。
図９Ａ〜９Ｃは、ＬＭＢ−１００−Ａｌｅｘａ４８８およびＳＶＰ−Ｒ−ＣＹ５の注入後のマウス脾細胞の代表的なゲーティング戦略を示す。マウスは、ＬＭＢ−１００−Ａｌｅｘａ４８８およびＳＶＰ−Ｒ−ＣＹ５を連続して注入された。注入後２時間に、脾細胞は単離され、標識され、FACS CANTO IIフローサイトメーター上で分析された。図９Ａは、ＤＣおよびマクロファージを示す。 図９Ｂは、ＢおよびＴ細胞リンパ球を示す。 図９Ｃは、好中球および単球を示す。
図１０Ａ〜１０Ｄは、ＬＭＢ−１００とＳＶＰ−Ｒの組み合わせが、免疫毒素に特異的である抗体が以前から存在するマウスにおいて免疫寛容原性を誘導することを示す。図１０Ａは、１および３週目にＬＭＢ−１００（ｉ．ｖ．２．５ｍｇ／ｋｇ）を６回注入され、ＬＭＢ−１００に対するＡＤＡの力価を誘導した雌のＢＡＬＢ／ｃマウスを示す。１０週目に、マウスは、ＬＭＢ−１００、ビヒクル（ＰＢＳ）またはＬＭＢ−１００＋ＳＶＰ−Ｒのいずれかの３用量を抗原投与された。ＬＭＢ−１００およびＳＶＰ−Ｒを処置されたマウスは、１２週目にＬＭＢ−１００の追加の３用量を抗原投与された。血漿は収集され、ＥＬＩＳＡによりＬＭＢ−１００ＡＤＡについて分析された。エラーバーは、ＳＥＭ、ｎ＝７または１２を示す。図１０Ｂは、１４週にわたってＬＭＢ−１００を１２回注入され、ＬＭＢ−１００に対するＡＤＡの高い力価を誘導した雌のＢＡＬＢ／ｃマウスを示す。１５週目において、マウスは、ＬＭＢ−１００またはＬＭＢ−１００＋ＳＶＰ−Ｒで免疫化された。抗原投与前および抗原投与後のＡＤＡ力価が示されている。 図１０Ｃ〜１０Ｄは、以前から存在するＡＤＡを有するマウスから単離されたＢＭおよび脾臓であって、ＰＢＳ、ＬＭＢ−１００、ＳＶＰ−ＲまたはＬＭＢ−１００およびＳＶＰ−Ｒの組み合わせのいずれかを抗原投与されたものを示している。ＢＭ細胞および脾細胞（１００，０００細胞／ウェル）は、ＬＭＢ−１００にて事前にコーティングされたＥＬＩＳｐｏｔプレート内に播種された（ｎ＝８）。
図１１Ａ〜１１Ｂは、ＡＢ１−Ｌ９の発達を示す。図１１Ａは、ヒトメソテリンを安定して遺伝子導入されたマウス中皮腫細胞株を示す。ＡＢ−１（非ヒトメソテリン遺伝子導入、ライトグレー）およびＡＢ１−Ｌ９（ヒトメソテリン遺伝子導入、ダークグレー）は、ＭＮ抗体、およびＰＥ標識二次抗体により標識された。ＭＦＩは、ＦＡＣＳを使用して検出され、FLOWJOソフトウェアを使用して分析された。図１１Ｂは、さまざまな濃度のＬＭＢ−１００でインキュベートされ、WST-8 cell counting kitを使用して細胞生存率を評価したＡＢＩ−Ｌ９細胞を示す。実験は３レプリカ実行され、エラーバーはＳＥＭを示す。
図１２Ａ〜１２Ｆは、ＳＶＰ−ＲとＬＭＢ−１００の組み合わせが、無効にされた抗腫瘍活性を復元することを示す。図１２Ａは、マウス内に接種され、矢印により示されるようにＰＢＳ、ＬＭＢ−１００、またはＳＶＰ−Ｒを処置されたＡＢ１−Ｌ９細胞を示す（ｎ＝７）。図１２Ｂは、ＬＭＢ−１００で４回免疫化され、ベースライン力価を誘導し、ＡＢ１−Ｌ９を接種されたマウスを示す。マウスは、矢印により示されるようにビヒクル、ＬＭＢ−１００、またはＬＭＢ−１００およびＳＶＰ−Ｒを処置された。腫瘍サイズは、カリパスを使用して測定された（ｎ＝７）。図１２Ｃは、ＥＬＩＳＡにより抗ＬＭＢ−１００抗体について分析された５および１９日からの血漿を示す。力価は、信号の１０％で補間された。 図１２Ｄは、図１２Ｃにおいて記載されたように処置されたマウスを示す。実験は３１日で終結した。カプラン―メイヤープロットは、実験のエンドポイント（ひとたび腫瘍の体積が、４００ｍｍ３よりも大きくなった場合に、またはマウスが自身の体重の＞３０％を損失した場合（１マウス））までの時間を示す（ｎ＝７）。図１２Ｅは、１日目にＣＴ２６細胞を接種され、１０および１６日目にＳＶＰ−Ｒまたはビヒクルを処置されたマウスを示す。値は、平均腫瘍サイズを示し（ｎ＝７）、エラーバーはＳＥＭを示す。図１２Ｆは、１日目に６６Ｃ１４細胞を接種され、１０、１２および１４日目にＳＶＰ−Ｒまたはビヒクルを処置されたマウスを示す。値は、平均腫瘍サイズを示す（ｎ＝５）。統計分析のために、それぞれの曲線についてのＡＵＣがｏｎｅ ｗａｙ ＡＮＯＶＡを使用して計算および比較された。エラーバーはＳＥＭを示す。
図１３Ａ〜１３Ｂは、図１０Ａにおいて示される処置後のマウスに生じている腫瘍の力価および重量を示す。ＡＢ１−Ｌ９細胞が、ＢＡＬＢ／ｃマウスに接種された。マウスは、７、９、１１、１４、１６および１８日目に、ＰＢＳ、ＬＭＢ−１００、ＳＶＰ−Ｒまたは後ろ２つの組み合わせを処置された。エラーバーは、ＳＥＭを示す。図１３Ａは、１９および２４日目に採取され、ＬＭＢ−１００のＡＤＡについて評価された血清試料を示す。全般的に低い力価に起因して、力価は曲線の１０％で補間された。図１３Ｂは、免疫化の期間の間にわたるマウスの重量を示す。 図１４は、図１０Ｂにおいて示された処置後の、免疫毒素への以前から存在する抗体を有するマウスに生じている腫瘍の重量を示す。４回のＬＭＢ−１００の免疫化およびＡＢ１−Ｌ９の接種後のＢＡＬＢ／ｃの重量が示される。マウスは、５、７、９、１２、１４および１６日目にＰＢＳまたはＬＭＢ−１００を、５および９日目にＳＶＰ−Ｒまたはビヒクルを処置された（ｎ＝７）。エラーバーは、ＳＥＭを示す。
図１５Ａ〜１５Ｄは、ＳＶＰ−Ｒがヒト細胞株においてＬＭＢ−１００の細胞毒性活性を高めることを示す。ＫＬＭ−１およびＨＡＹ細胞は、９６ウェルプレートに播種されて、さまざまな濃度のＳＶＰ−Ｒ、ＬＭＢ−１００またはその両方で処置された。７２時間後、細胞生存率は、ＷＳＴ−８またはクリスタルヴァイオレットを使用して評価された。生存能力曲線は、それぞれの試料に適ったものであり、ＩＣ５０が計算された。図１５Ａは、両方の細胞株におけるＳＶＰ−Ｒの細胞毒性活性を示す。図１５Ｂは、ＳＶＰ中に封入された５μｇ／ｍＬのラパマイシンを用いての、または用いないでの、ＫＬＭ−１細胞におけるＬＭＢ−１００の活性を示す。図１５Ｃは、ＳＶＰ中に封入された１μｇ／ｍＬのラパマイシンを用いての、または用いないでの、ＨＡＹ細胞におけるＬＭＢ−１００の活性を示す。曲線は、６つのレプリカの平均を示し、エラーバーは、ＳＥＭを示す。図１５Ｄは、ＨＡＹ細胞がクリスタルヴァイオレットを用いて固定および染色された後に撮られた代表的なウェルイメージを示す。
図１６Ａ〜１６Ｂは、ＳＶＰ−Ｒ活性が、チェックポイント阻害抗体により減少しないことを示す。ＢＡＬＢ／ｃマウスは、ＬＭＢ−１００またはＬＭＢ−１００およびＳＶＰ−Ｒについて毎週５回（２．５ｍｇ／ｋｇ）免疫化され（ｉ．ｖ．）、およびそれぞれの注入の５日後に、抗マウスＣＬＡＴ−４アンタゴニスト（図１６Ａ）または抗ＯＸ−４０アンタゴニスト（図１６Ｂ）またはビヒクルで免疫化された（ｉ．ｐ．）。血漿試料は、それぞれの週の６日目に収集され、ＬＭＢ−１００のＡＤＡ力価が、ＥＬＩＳＡの直接法を使用して評価された。エラーバーは、ＳＥＭ、ｎ＝８を示す。これらの実験は、ｎ＝５およびｎ＝３でそれぞれ繰り返され、類似の結果となった。
図１７は、ＬＭＢ−１００およびラパマイシンを含む合成ナノキャリアを使用した抗ＬＭＢ−１００抗体応答の阻害を示す。 図１８Ａ〜１８Ｄは、抗原投与の前後からの血清試料の抗ＬＭＢ−１００抗体の力価を示す。 図１８Ａ〜１８Ｄは、抗原投与の前後からの血清試料の抗ＬＭＢ−１００抗体の力価を示す。 図１９は、３つのグループについての抗ＬＭＢ−１００抗体の力価を示す（出血３）。 図２０Ａは、同系腫瘍マウスモデル（ＢＡＬＢ／ｃマウス）を試験することを用いた投与レジメンの概要図である。 図２０Ｂは、図２０Ａのレジメンを経たマウスの腫瘍サイズを示す。第一列の矢印（グレー）は、ＬＭＢ−１００の投与を示し、および第二列の矢印（黒）は、ラパマイシンを含むナノキャリアの投与を示す。
図２１は、図２０Ａのレジメンを経たマウスの重量を示す。第一列の矢印（グレー）は、ＬＭＢ−１００の投与を示し、および第二列の矢印（黒）は、ラパマイシンを含むナノキャリアの投与を示す。 図２２は、図２０Ａのレジメンを経たマウスの抗体力価および腫瘍サイズとのそれらの相関を示す。 図２３Ａは、同系のメソテリン遺伝子導入マウスのモデルを試験することを用いた投与レジメンの概要図である。 図２３Ｂは、図２３Ａのレジメンを経験したマウスの腫瘍サイズを示す。第一列の矢印（グレー）は、ＬＭＢ−１００の投与を示し、第二列の矢印（黒）はラパマイシンを含むナノキャリアの投与を示す。
図２４は、図２３Ａのレジメンを経たマウスの重量を示す。第一列の矢印（グレー）は、ＬＭＢ−１００の投与を示し、第二列の矢印（黒）はラパマイシンを含むナノキャリアの投与を示す。 図２５は、図２３Ａのレジメンを経たマウスの抗体力価および腫瘍サイズとのそれらの相関を示す。 図２６は、中皮腫を有する対象において、サイクル１〜４の間中の１日目のＬＭＢ−１００の注入の後のピークＬＭＢ−１００の血中レベルを示す。
発明の詳細な説明
本発明を詳細に記載する前に、本発明は特に例示された材料またはプロセスに限定されず、パラメーターのようなものは無論変化し得ることが理解されるべきである。また、本明細書において用いられる用語は、本発明の特定の態様のみを記載することを目的とし、本発明を記載する代替的用語の使用を限定することを意図しないことが理解されるべきである。
上記または下記のいずれであっても、本明細書において引用される全ての刊行物、特許および特許出願は、その全体において全ての目的のために本明細書により参考として援用される。
本明細書および添付の請求の範囲において用いられる場合、単数形「a」、「an」および「the」は、内容が明らかに他を指示しない限り、複数の参照対象を含む。例えば、「ポリマー(a polymer)」についての参照は、２以上のかかる分子の混合物または異なる分子量の単一のポリマー種の混合物を含み、「合成ナノキャリア(a synthetic nanocarrier)」についての参照は、２以上のかかる合成ナノキャリアの混合物または複数のかかる合成ナノキャリアなどを含む。
本明細書において用いられる場合、用語「含む(comprise)」または「含む(comprises)」もしくは「含むこと(comprising)」などのそのバリエーションは、任意の列記される完全体(integer)（例えば、特色、要素、特徴、特性、方法／プロセスステップもしくは限定）または完全体のグループ（例えば特色、要素、特徴、特性、方法／プロセスステップもしくは限定）の包含を示すが、任意の他の完全体または完全体のグループの除外を示すものではないと読まれるべきである。したがって、本明細書において用いられる場合、用語「含むこと(comprising)」は、包括的であり、さらなる列記されていない完全体または方法／プロセスステップを除外しない。
本明細書において提供される組成物および方法のいずれか１つの態様において、「含むこと(comprising)」は、「から本質的になる(consisting essentially of)」または「からなる(consisting of)」で置き換えることができる。句「から本質的になる」は、本明細書において、特定された完全体（単数または複数）またはステップ、ならびに請求される発明の特徴または機能に実質的には影響を及ぼさないものを要求するために用いられる。本明細書において用いられる場合、用語「からなる」は、列記される完全体（例えば特色、要素、特徴、特性、方法／プロセスステップもしくは限定）または完全体のグループ（例えば特色、要素、特徴、特性、方法／プロセスステップもしくは限定）単独での存在を示すために用いられる。
Ａ．序論
がんを標的としている組換え免疫毒素（ｒＩＴ）などの、ｒＩＴは、強力な治療法であるが、かかる治療法は、非常に免疫原性になり、免疫原性応答を誘導し得る。免疫原性応答は、ｒＩＴの毒素などのｒＩＴに特異的な抗薬剤抗体（ＡＤＡ）の形成により特徴づけられ得る。ＡＤＡは、治療の１サイクル後でさえ、かかる治療の効力は制限され得、患者において激しい過敏反応を引き起こし得る。ｒＩＴに対する応答は、例えば、細菌起源の毒素の場合、すべてではないにしてもほとんどの患者において、その処置が一般的に進展することができないほど強力であり得る。一例として図２６は、中皮腫を有する対象において、１日目のＬＭＢ−１００の注入後のサイクル１〜４の間中のＬＭＢ−１００のピーク血中レベルがどのくらいであるか説明する。すべての対象が、サイクル１の間中にＬＭＢ−１００の血中レベルを有したが、レベルは、サイクル２の間に半分に減少し、サイクル３および４を受けた患者でｒＩＴの望ましい血中レベルを有するものはいなかった。これは、本明細書において提供される教示の利益なしには、現在、かかるｒＩＴの使用、例えば複数の処置サイクルにわたっての使用を、効果的に行うことができないことを説明している。
免疫原性を除去しようと努めるために、いくつかの免疫抑制療法が試みられているが、うまくいっていない。例えば、図１は、シクロホスファミドおよびペントスタチン（ＣＰ／ＰＳ）、免疫抑制療法、および免疫毒素、ＳＳ１（ｄｓＦｖ）ＰＥ３８（ＳＳ１Ｐ）の処置後数か月以内の患者における最も高い全体の中皮腫の腫瘍応答を示す。しかしながら、ほとんどの患者において、ＳＳ１Ｐを伴う今なお制限された数の処置サイクルでの、重度の免疫抑制の処置は、免疫毒素への応答を遅延させるのみである。
しかしながら、本発明者らは、驚くべきことに、本明細書において提供される方法および組成物を用いて、本明細書において提供される免疫抑制剤を含む合成ナノキャリアを用いた処置の不在下においてでさえ、長期に望ましくない免疫応答が遅延するだけでなく、著しく低減または除去することができることを見出した。加えて、驚くべきことに、ｒＩＴへの寛容が、免疫抑制剤を含む合成ナノキャリアを用いた免疫調節の結果、がんの成長が促進されないような特異的な様式において達成され得ることが見出された。これらの結果は、上記および図１に示されるなどの免疫抑制療法によっては達成されなかった。
したがって、本発明者らによりなされた発見は、その後に本明細書において提供されるような免疫抑制剤を含む合成ナノキャリアなどの免疫を調節する治療が与えられなかった場合においてでさえ、長期の、および繰り返しのｒＩＴの処置を可能にし得る。本明細書において提供される方法および組成物は、ｒＩＴに対する免疫原性が低減または除去され、処置の効果が長期に、および／またはｒＩＴを用いた複数のサイクルの処置（例えば、少なくとも２、３、４またはそれ以上の処置サイクル）において著しく改善し得るような、新生物形成に中立な寛容原性環境が作り出され得る。
例において示されるように、ラパマイシンなどの免疫抑制剤を含む合成ナノキャリアをＬＭＢ−１００などのｒＩＴと投与することは、短期（例えば、免疫化後２〜３週間）および長期（例えば、免疫化後８週間）の両方において、その後のＬＭＢ−１００の抗原投与でさえ、ＡＤＡを阻害するのに有効である。例はまた、本明細書において提供される免疫抑制剤を伴うがんの成長の促進の欠如と同様に本明細書において提供される方法および組成物を使用した腫瘍サイズにおける減少を説明する。興味深いことに、ｒＩＴを伴うチェックポイント阻害剤と免疫抑制剤を含む合成ナノキャリアの組み合わせが、処置について熟慮され得るように、免疫抑制剤を含む合成ナノキャリアにより誘導される寛容は、逆にチェックポイント阻害剤、免疫促進剤により影響を及ぼさない。これらの結果は、しかしながら、３つの剤の組み合わせに特異的であり、それによってＡＤＡ形成がチェックポイント阻害剤により高められず、腫瘍サイズの減少もまた組み合わせで説明された。
さらに、驚くべきことに、本明細書において提供される方法が、ｒＩＴに対して望ましくない免疫応答をすでに経ているか、または細菌毒素などのｒＩＴの免疫原性部分に以前に暴露されている対象について有効であり得ることが見出された。例えば、ラパマイシンなどの免疫抑制剤を含む合成ナノキャリアの投与が、高い抗ＬＭＢ−１００抗体力価（希釈＞１０，０００）が以前から存在しているマウスにおいてでさえＡＤＡが３〜７倍低減したことが見出された。したがって、免疫抑制剤を含む合成ナノキャリアは、本明細書において提供されるように使用され、ｒＩＴにナイーブであり、敏感であるマウスにおいて抑制性のＡＤＡの形成をやわらげることができ、その結果として抗腫瘍活性の復元がなされる。したがって、本明細書において提供される方法のいずれか１つの対象は、毒素またはそれらの部分などの、ｒＩＴまたはそれらの免疫原性部分へ以前に暴露されたものであり得る。本明細書において提供される対象のいずれか１つは、ｒＩＴを用いた処置をすでに受けているものであり得、または以前に何か他の様式でそれらの免疫原性部分に暴露された処置未経験の対象であり得る。通常は、本明細書において提供される方法および組成物なしには、かかる対象におけるｒＩＴを用いた処置は、大部分効果のないものであるだろうと予期されるだろう。
したがって、本明細書において提供されるものは、例えば、本明細書において提供されるような対象において新生物形成に中立な寛容原性環境を作り出し、がんの処置のために対象にｒＩＴを投与することによる、がんを有する対象を処置するための方法および関連する組成物である。内で説明するように、かかる方法および組成物は、望ましくない免疫応答を阻害または低減させ、および／またはｒＩＴの効果を増大させることが見出された。本発明者らは、驚くべきことに、かつ予想外のことに、上記の問題および制限は、本明細書において開示される発明を実施することにより克服することができることを見出した。がんの処置のためなどのｒＩＴの免疫原性および使用に対する前述の障害に対する解決方法を提供する方法および組成物が提供される。
本発明をここで、以下により詳細に記載する。
Ｂ．定義
「投与すること(administering)」または「投与(administration)」または「投与する(administer)」は、薬理学的に有用である様式で材料を対象へ提供することを意味する。用語は、投与させることを含む。「投与させること(Causing to be administered)」は、直接的にまたは間接的に、別の当事者に材料を投与するよう、引き起こすこと、促すこと、助長すること、補助すること、誘導すること、または指示することを意味する。
「有効量」は、ｒＩＴまたはｒＩＴの免疫原性部分に対する免疫原性を低減させることを含む、１以上の所望される免疫応答などの１以上の所望される応答をもたらす、本明細書に提供される組成物のいずれかの量である。この量は、in vitroまたはin vivoでの目的のためであり得る。in vivoでの目的のために、量は、ｒＩＴの投与の結果として所望されない免疫応答を経験するであろう対象などのそれらを必要とする対象にとって臨床的有益性を有してもよいと臨床医が考えるであろうものであり得る。本明細書において提供される方法のいずれか１つにおいて、投与される組成物は、本明細書において提供される有効量のいずれか１つにおいてであり得る。
有効量は、所望されない免疫応答のレベルを低減させることを含み得るが、いくつかの態様において、それは、所望されない免疫応答を完全に予防することを含む。有効量はまた、所望されない免疫応答の発生を遅延させることを含んでもよい。有効量は、所望される治療的エンドポイントまたは所望される治療効果をもたらす量であってもよい。有効量は、好ましくは、対象において、ｒＩＴに対して、寛容原性免疫応答をもたらす。前述のもののいずれかの達成は、慣用的な方法によりモニタリングすることができる。
一態様において、低減した免疫原性は、対象において持続する。さらに別の態様において、低減した免疫原性は、本明細書において提供されるようなプロトコルまたは処置レジメンに従った本明細書において提供される組成物の投与に起因して、生じるかまたは持続する。有効量は、無論、処置されている特定の対象；状態、疾患または障害の重篤度；年齢、身体条件、サイズおよび体重を含む個々の患者のパラメーター；処置の期間；併用治療の性質（あれば）；投与の特定の経路、ならびに保健実施者の知識および経験の範囲内の類似の要因に依存するであろう。これらの要因は、当業者に周知であり、慣用的な実験のみを用いて取り組むことができる。最大用量、すなわち、健全な医学的判断に従って最も高い安全な用量が用いられることが一般的に好ましい。しかし、当業者は、患者が、医学的な理由、心理学的な理由のために、または実質的にあらゆる他の理由のために、より低い用量または耐用可能な用量を主張する場合があることを理解するであろう。
一般に、本発明の組成物中の免疫抑制剤および／またはｒＩＴの用量は、免疫抑制剤および／またはｒＩＴの量を指す。あるいは用量は、所望される量の免疫抑制剤を提供する合成ナノキャリアの数に基づいて投与され得る。免疫抑制剤および／またはｒＩＴおよび／または本明細書において提供される方法または組成物のいずれか１つの合成ナノキャリアの量のいずれか１つが、有効量であり得る。
「免疫応答を評価すること」は、in vitroまたはin vivoでの免疫応答のレベル、存在または不在、減少、増大などの任意の測定または決定を指す。かかる測定または決定は、対象から得られた１以上の試料に対して行うことができる。かかる評価は、本明細書において提供されるかまたは当該分野において公知の他の方法のいずれか１つにより行うことができる。評価は、対象からの試料においてなどの抗体またはＴ細胞の数またはパーセンテージ、サイトカイン生産のレベルを評価することであってもよい。
「平均」とは、他に示されないかぎり、平均値を指す。
「併用して(concomintantly)」とは、対象に、時間的に相関する、好ましくは、生理学的または免疫性の応答の調節を提供するために時間的に十分に相関する様式において、２以上の材料／剤を投与すること、およびさらにより好ましくは２以上の材料／剤が組み合わせて投与されることを意味する。態様において、併用しての投与は、２以上の組成物の、特定された期間内、好ましくは１か月間以内、より好ましくは１週間以内、なおより好ましくは１日以内、さらにより好ましくは１時間以内の投与を包含してもよい。態様において、組成物は、繰り返し併用して投与してもよい；それは、本明細書において提供されるような、１回より多くの機会における併用された投与であってもよい。
提供される方法のいずれか１つのいくつかの態様において、併用しての投与は、「同時」であり、それは投与が、臨床医が投与間のいずれの時間も所望される治療成績上の影響に関して事実上ゼロまたは無視できるほどのものであると考えるほど同時に、または実質的に同時の投与であることを意味する。提供される方法のいずれか１つのいくつかの態様において、同時投与は、互いに５分またはそれより少ない時間以内である。
「カップリングする（Couple）」または「カップリングされた（Coupled）」（およびそのようなもの）は、ある実態（例えば部分）と別のものとが化学的に会合することを意味する。いくつかの態様において、カップリングは、共有結合的であり、２つの実体間での共有結合の存在という状況においてカップリングが生じるということを意味する。非共有結合的な態様において、非共有結合的なカップリングは、限定されないが、電荷相互作用、親和性相互作用、金属配位、物理吸着、ホスト−ゲスト相互作用、疎水性相互作用、ＴＴスタッキング相互作用、水素結合相互作用、ファン・デル・ワールス相互作用、磁性相互作用、静電相互作用、双極子間相互作用、および／またはそれらの組み合わせを含む非共有結合的相互作用により介される。態様において、封入は、カップリングの一形態である。
「サイクル」は、剤または投与もしくは投与のセットの期間にわたって対象にあるレベルの臨床利益があることを予期される剤（単数または複数）の投与もしくは投与のセットを指す。処置のサイクルの終わりは、投与しない期間のある場合に生じ、好ましくは、本明細書において提供される方法のいずれか１つの一態様において、処置のサイクルの終わりは、投与または投与のセットの期間後に、対象において追加の著しい臨床利益が見受けられると予期されない期間がある場合に生じる。かかる態様において、サイクル間にかかる期間がある。本明細書において提供される方法のいずれか１つの一態様において、それぞれのサイクルが例において記載されるものを含む本明細書において提供される投与のサイクルのいずれか一つ（例えば、ｒＩＴおよび／または免疫抑制剤を含む合成ナノキャリアの用量および頻度）であってもよい。
「作り出すこと」は、自身で直接的に、または、限定されないが、ある者の言動を信頼して行動を起こす無関係な第三者などによって間接的に、のいずれかで、作用を引き起こさせることを意味する。
「投与形態」とは、培地、対象への投与のために好適なキャリア、ビヒクルまたはデバイス中の薬理学的におよび／または免疫学的に活性な材料を意味する。本明細書において提供される組成物または用量のいずれか１つは、投与形態におけるものであってもよい。
「用量」とは、所与の時間にわたる対象への投与のための特定の量の薬理学的および／または免疫学的に活性な材料を指す。
「封入する」とは、合成ナノキャリア内の物質の少なくとも一部を囲い込むことを意味する。いくつかの態様において、物質は、合成ナノキャリア内に完全に囲い込まれる。他の態様において、封入される物質の殆どまたは全てが、合成ナノキャリアの外の局所環境に暴露されない。他の態様において、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％または５％（重量／重量）以下が、局所環境に暴露される。封入は、吸収とは別のものであり、吸収は、物質の殆どまたは全てを合成ナノキャリアの表面上に配置し、物質を合成ナノキャリアの外部の局所環境に暴露させる。
「対象を同定すること」は、臨床医が、対象を本明細書において提供される方法または組成物からの利益を得るであろうものとして認識することが可能であるいずれかの行動もしくは行動のセットまたは提供されるいくつかの他の指標である。好ましくは、同定される対象は、ｒＩＴへの寛容原性な免疫応答を必要としているものである。かかる対象は、がんを有するかまたはがんを有するリスクのある、いずれかの対象を含む。行動または行動のセットは、自身に直接的にまたは、限定されないが、あるものの言葉もしくは行為を信頼して行動を起こす第三者などに、間接的にのいずれかであってもよい。本明細書において提供される方法のいずれか１つの一態様において、方法は、本明細書において提供されるような組成物または方法を必要とする対象を同定することをさらに含む。本明細書において提供される方法のいずれか１つの一態様において、方法は、本明細書において提供されるような新生物形成に中立な寛容原性環境を必要とする対象を同定することをさらに含む。
「免疫チェックポイント阻害剤」は、直接的にかまたは間接的に免疫チェックポイント経路を部分的にかまたは完全に阻害するいずれかの分子である。本開示の側面は、免疫抑制剤を含む合成ナノキャリアおよびｒＩＴが共同したかかる免疫チェックポイント経路の阻害が、ｒＩＴへの免疫原性の低減および／またはＡＤＡ応答の存在下におけるｒＩＴ単独と比較して改善された処置効果をさらにもたらし得るという観察に関連している。免疫チェックポイント経路の例は、限定されないが、ＢＭＳ−９３６５５８／ＭＤＸ−１１０６、ＢＭＳ−９３６５５９／ＭＤＸ−１１０５、イピリムマブ／ヤーボイ、およびトレメリムマブなどのモノクローナル抗体；ＣＴ−０１１およびＭＫ−３４７５などのヒト化抗体；ＡＭＰ−２２４などの融合タンパク質、および例における抗体と同様にＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ４／Ｂ７−１、ＴＩＭ−３、ＬＡＧ３、Ｂｙ−Ｈｅ、Ｈ４、ＨＡＶＣＲ２、ＩＤＯ１、ＣＤ２７６およびＶＴＣＮ１を含む。
「免疫抑制剤」は、好ましくはＡＰＣに対する効果を通して、寛容原性効果を引き起こし得る化合物を意味する。寛容原性効果は、一般に、ＡＰＣまたは他の免疫細胞による、調節であって、耐久的な様式において抗原に対する所望されない免疫応答を阻害または予防するものを指す。提供される方法または組成物のいずれか１つの一態様において、免疫抑制剤は、ＡＰＣに、１以上の免疫エフェクター細胞における調節性の表現型を促進させるものである。例えば、調節性の表現型は、抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞またはＢ細胞の産生、誘導、刺激または動員の阻害、抗原特異的抗体の産生の阻害、Ｔｒｅｇ細胞（例えば、ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉｇｈＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇ細胞）の産生、誘導、刺激または動員などにより特徴づけられ得る。このことは、ＣＤ４＋Ｔ細胞またはＢ細胞の調節性の表現型への変換の結果であってもよい。このことはまた、ＣＤ８＋Ｔ細胞、マクロファージおよびｉＮＫＴ細胞などの他の免疫細胞におけるＦｏｘＰ３の誘導の結果であってもよい。提供される方法または組成物のいずれか１つの一態様において、免疫抑制剤は、ＡＰＣが抗原をプロセッシングした後の応答に影響を及ぼすものである。提供される方法または組成物のいずれか１つの別の態様において、免疫抑制剤は、抗原のプロセッシングに干渉するものではない。提供される方法または組成物のいずれか１つのさらなる態様において、免疫抑制剤は、アポトーシスシグナル分子ではない。提供される方法または組成物のいずれか１つの別の態様において、免疫抑制剤は、リン脂質ではない。
免疫抑制剤として、これらに限定されないが、以下が挙げられる：ラパマイシンまたはラパマイシンアナログ（すなわち、ラパログ(rapalog)）などのｍＴＯＲ阻害剤；ＴＧＦ−βシグナル伝達剤；ＴＧＦ−β受容体アゴニスト；トリコスタチンＡなどのヒストンデアセチラーゼ阻害剤；副腎皮質ステロイド；ロテノンなどのミトコンドリアの機能の阻害剤；Ｐ３８阻害剤；６Ｂｉｏ、デキサメタゾン、ＴＣＰＡ−１、ＩＫＫ ＶＩＩなどのＮＦ−κβ阻害剤；アデノシン受容体アゴニスト；ミソプロストールなどのプロスタグランジンＥ２アゴニスト（ＰＧＥ２）；ホスホジエステラーゼ阻害剤、ロリプラムなどのホスホジエステラーゼ４阻害剤（ＰＤＥ４）；プロテアソーム阻害剤；キナーゼ阻害剤などが挙げられる。本明細書において使用されるものとしての「ラパログ」とは、ラパマイシン（シロリムス）に構造的に関連する（そのアナログである）分子を指す。ラパログの例として、限定することなく、テムシロリムス（ＣＣＩ−７７９）、エベロリムス（ＲＡＤ００１）、リダフォロリムス（ＡＰ−２３５７３）、およびゾタロリムス（ＡＢＴ−５７８）が挙げられる。ラパログのさらなる例は、例えばＷＯ公開ＷＯ１９９８／００２４４１および米国特許第８，４５５，５１０号において見出すことができ、それらのラパログは、本明細書においてその全体において参考として援用される。さらなる免疫抑制剤は、当業者にとって公知であり、本発明はこの点に限定されない。
態様において、合成ナノキャリアにカップリングされる場合、免疫抑制剤は、合成ナノキャリアの構造を構築する材料に追加される要素である。例えば、１つのかかる態様において、合成ナノキャリアが１つ以上のポリマーから構築される場合、免疫抑制剤は、当該１つ以上のポリマーに追加されてこれにカップリングされる化合物である。別の例として、１つのかかる態様において、合成ナノキャリアが１つ以上の脂質から構築される場合、免疫抑制剤は、１以上の脂質に追加されてこれにカップリングしている。別のかかる態様において、合成ナノキャリアの材料もまた寛容原性効果をもたらすような態様の場合、免疫抑制剤は、寛容原性効果をもたらす合成ナノキャリアの材料に追加されて存在する要素である。
「負荷量(load)」とは、合成ナノキャリアとカップリングする場合、合成ナノキャリア全体における材料の乾燥処方重量（重量／重量）に基づいた、合成ナノキャリアとカップリングする免疫抑制剤の量である。一般に、かかる負荷量は、合成ナノキャリアの集団全体の平均として計算される。提供される方法または組成物のいずれか１つの一態様において、負荷量は、合成ナノキャリア全体の平均で０．１％と５０％との間である。提供される方法または組成物のいずれか１つの別の態様において、負荷量は、０．１％と２０％との間である。提供される方法または組成物のいずれか１つのさらなる態様において、負荷量は、０．１％と１０％との間である。提供される方法または組成物のいずれか１つのなおさらなる態様において、負荷量は、１％と１０％との間である。提供される方法または組成物のいずれか１つのなおさらなる態様において、負荷量は、７％と２０％との間である。提供される方法または組成物のいずれか１つのさらに別の態様において、負荷量は、合成ナノキャリアの集団全体の平均で少なくとも０．１％、少なくとも０．２％、少なくとも０．３％、少なくとも０．４％、少なくとも０．５％、少なくとも０．６％、少なくとも０．７％、少なくとも０．８％、少なくとも０．９％、少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも６％、少なくとも少なくとも７％、少なくとも８％、少なくとも９％、少なくとも１０％、少なくとも１１％、少なくとも１２％、少なくとも１３％、少なくとも１４％、少なくとも１５％、少なくとも１６％、少なくとも１７％、少なくとも１８％、少なくとも１９％、少なくとも２０％である。提供される方法または組成物のいずれか１つのさらに別の態様において、負荷量は、合成ナノキャリアの集団全体の平均で、０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％または２０％である。上の態様のいずれか１つのいくつかの態様において、負荷量は、合成ナノキャリアの集団全体の平均で、２５％以下である。提供される方法または組成物のいずれか１つの態様において、負荷量は、当該分野において公知なものとして計算される。
「合成ナノキャリアの最大寸法」とは、合成ナノキャリアの任意の軸に沿って測定されるナノキャリアの最大寸法を意味する。「合成ナノキャリアの最小寸法」とは、合成ナノキャリアの任意の軸に沿って測定される合成ナノキャリアの最小寸法を意味する。例えば、球体の合成ナノキャリアについて、合成ナノキャリアの最大および最小寸法は、実質的に同一であり、その直径のサイズである。同様に、立方状合成ナノキャリアについて、合成ナノキャリアの最小寸法は、その高さ、幅または長さのうちの最小のものであり、一方、合成ナノキャリアの最大寸法は、その高さ、幅または長さのうちの最大のものである。一態様において、試料中の合成ナノキャリアの合計数に基づいた、試料中の合成ナノキャリアの少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％の最小寸法は、１００ｎｍと等しいか、またはこれより大きい。一態様において、試料中の合成ナノキャリアの合計数に基づいた、試料中の合成ナノキャリアの少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％の最大寸法は、５μｍと等しいか、またはこれより小さい。好ましくは、試料中の合成ナノキャリアの合計数に基づいた、試料中の合成ナノキャリアの少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％の最小寸法は、１１０ｎｍより大きく、より好ましくは１２０ｎｍより大きく、より好ましくは１３０ｎｍより大きく、より好ましくはなお、１５０ｎｍより大きい。
発明の合成ナノキャリアの最大および最小寸法のアスペクト比は、態様に依存して変化し得る。例えば、合成ナノキャリアの最小寸法に対する最大寸法のアスペクト比は、１：１〜１，０００，０００：１、好ましくは１：１〜１００，０００：１、より好ましくは１：１〜１０，０００：１、より好ましくは１：１〜１０００：１、なおより好ましくは１：１〜１００：１、およびさらにより好ましくは１：１〜１０：１の間で変化し得る。好ましくは、試料中の合成ナノキャリアの合計数に基づいた、試料中の合成ナノキャリアの少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％の最大寸法は、３μｍと等しいか、またはこれより小さく、より好ましくは２μｍと等しいか、またはこれより小さく、より好ましくは１μｍと等しいか、またはこれより小さく、より好ましくは８００ｎｍと等しいか、またはこれより小さく、より好ましくは６００ｎｍと等しいか、またはこれより小さく、およびより好ましくはなお、５００ｎｍと等しいか、またはこれより小さい。好ましい態様において、試料中の合成ナノキャリアの合計数に基づいた、試料中の合成ナノキャリアの少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％の最小寸法は、１００ｎｍと等しいか、またはこれより大きく、より好ましくは１２０ｎｍと等しいか、またはこれより大きく、より好ましくは１３０ｎｍと等しいか、またはこれより大きく、より好ましくは１４０ｎｍと等しいか、またはこれより大きく、およびより好ましくはなお、１５０ｎｍと等しいか、またはこれより大きい。
合成ナノキャリアの寸法（例えば直径）の測定は、合成ナノキャリアを液体（通常は水性）媒体中に懸濁して、動的光散乱（ＤＬＳ）を用いること（例えばBrookhaven ZetaPALS装置を用いること）により、得ることができる。例えば、合成ナノキャリアの懸濁液を、約０．０１〜０．１ｍｇ／ｍＬの最終合成ナノキャリア懸濁液濃度を達成するために、水性バッファーから精製水中で希釈することができる。希釈された懸濁液は、ＤＬＳ分析のために好適なキュベット中で直接調製しても、またはこれに移してもよい。キュベットを、次いで、ＤＬＳ内に置き、制御された温度まで平衡化させて、次いで、媒体の粘度および試料の屈折率のための適切なインプットに基づいて、安定で再現性のある分布を得るために十分な時間にわたりスキャンすることができる。有効直径、または分布の平均を、次いで報告させることができる。合成ナノキャリアの「寸法」または「サイズ」または「直径」は、いくつかの態様において動的光散乱を用いて得られる粒子サイズ分布の平均を意味する。
「メソテリン発現がん」は、メソテリンを発現する細胞を有するいずれかのがんを指す。一般的に、メソテリンは、中皮細胞の表面上に見受けられ、肺、胸膜、卵巣、***、胃、胆管、子宮、および胸腺（Pastan et al., Cancer Res. 2014; 74: 2907-2912）と関連する固形腫瘍上に発現される、４０ｋＤａのＧＰＩに結びついた糖タンパク質抗原と考えられる。したがって、メソテリン発現がんの例は、限定されることはないが、すぐ上で記載したそれらのいずれかと同様に、中皮腫、膵臓腺がん、卵巣がん、肺腺がん、乳がん、および胃がんを含む。
「新生物形成に中立な寛容原性環境」は、それによって、免疫の低減ががんの成長の促進をもたらさない一方で、がんを処置するために使用されるｒＩＴに対する望ましくない免疫応答が、低減または除去される環境を作り出すことを指す。一般的に、ｒＩＴが単独で投与されたときでさえ、ひとたびこの環境が作り出されると、望ましくない免疫応答は低減または除去される。本明細書において提供される方法のいずれか１つの一態様において、かかる環境を作り出すことは、長期のｒＩＴを用いた処置および／または複数回投与（例えば、少なくとも２、３、４またはそれ以上）もしくは投与サイクル（例えば、少なくとも２、３、４またはそれ以上）を含むそれを可能にする。
「非血液細胞がん」は、血液または骨髄から始まらないそれらであり、当該分野において公知のものである。かかるがんは、限定されることはないが、脳がん、頭および首のがん、肺がん、乳がん、生殖器系のがん、胃腸管系のがん、膵がん、および泌尿器系のがん、上部消化管のがんまたは結腸直腸がん、膀胱がんまたは腎細胞がん、および前立腺がんを含む。
「薬学的に許容し得る賦形剤」または「薬学的に許容し得るキャリア」とは、組成物を処方するために活性な材料と一緒に用いられる薬理学的に不活性な材料を意味する。薬学的に許容し得る賦形剤またはキャリアは、当該分野において公知の多様な材料を含み、これは、限定されないが、糖（例えばグルコース、ラクトースなど）、抗菌剤などの保存剤、再構成補助剤、色素、食塩水（例えばリン酸緩衝化食塩水）およびバッファーを含む。
「プロトコル」とは、１以上の物質の対象への任意の投薬レジメンを指す。投薬レジメンは、投薬の量、頻度、速度、期間および／またはモードを含んでもよい。いくつかの態様において、かかるプロトコルは、１以上の本発明の組成物を、１以上の試験対象に投与するために用いることができる。これらの試験対象における免疫応答を、次いで、ｒＩＴに対する寛容原性である免疫応答などの所望される免疫応答を生じることにおいてプロトコルが有効であったか否かを決定するために評価することができる。任意の他の治療効果および／または予防効果もまた、前述の免疫応答に代えて、またはそれに加えて評価することができる。プロトコルが所望される効果を有したか否かは、本明細書において提供されるかまたは他の当該分野において公知の方法のうちのいずれかを用いて決定することができる。例えば、細胞の集団は、特定の免疫細胞、サイトカイン、抗体などが、産生され、活性化されたか否かなどを決定するために、本明細書において提供される組成物が特定のプロトコルに従って投与された対象から得ることができる。免疫細胞の存在および／または数を検出するために有用な方法として、これらに限定されないが、フローサイトメトリー法（例えば、ＦＡＣＳ）および免疫組織化学法が挙げられる。免疫細胞マーカーの特異的染色のための抗体および他の結合剤は、市販されている。かかるキットは、典型的には、ＦＡＣＳベースの検出、異種の細胞の集団からの所望される細胞集団の分離および／または定量化を可能にする、多抗原についての染色試薬を含む。本明細書において提供される方法のいずれか１つは、プロトコルを決定するステップを含み得、および／または投与することは本明細書において提供されるような有益な結果のいずれか１つを有するように決定されたプロトコルに基づいてなされる。
「組換え免疫毒素」は、リガンドおよび毒素を含む対象の、がんの処置などの、処置のための化合物を意味する。いくつかの態様において、免疫抑制剤を含む合成ナノキャリアを用いずに、対象へｒＩＴが投与されたときに、ｒＩＴは、ｒＩＴに対する望ましくない抗体などの望ましくない免疫応答を生じるか、または生じると予期される。いくつかの態様において、ｒＩＴは、抗体、またはそれらの抗原結合性フラグメントおよび毒素を含む。いくつかの態様において、ｒＩＴは、ＬＭＢ−１００である。態様において、本明細書において提供される方法または組成物のいずれか１つのｒＩＴは、新生物形成に中立な環境が、対象における処置が有効であるために必要とされているものである。かかるｒＩＴは、一般的に毒素が非常に免疫原性であるものである。かかるｒＩＴは、細菌起源の毒素、植物毒、または昆虫のものなどの毒液の毒素を含むそれらを含む。他の例は、当該分野において公知であるか、本明細書において提供される他のものである。本明細書において提供されるｒＩＴのいずれか１つは、本明細書において提供される方法または組成物のいずれか１つのｒＩＴであってもよい。
「組換え免疫毒素の免疫応答」は、ｒＩＴに対するいずれかの免疫応答を指す。一般的に、かかる免疫応答は所望されないか、または望ましくなく、ｒＩＴの治療効果に干渉し得る。したがって、免疫応答は、ｒＩＴに特異的であり得、それは毒素またはその一部などの、ｒＩＴまたはその一部の存在に起因する免疫応答を指す。一般的に、かかる応答がｒＩＴまたはその一部に対して測定できるほどのものである一方、応答は他の抗原に関しては、低減されるか、または無視できるほどである。本明細書において提供される方法または組成物のいずれか１つのいくつかの態様において、ｒＩＴまたはその一部への免疫応答は、本明細書において提供される抗体の免疫応答である。
「類似のレベル」は、当業者が同等の結果を予期するだろう応答のレベルを指す。いくつかの態様における類似の応答は、統計学的に異なるとは考えられない。類似の応答が生じているか否かは、in vitroまたはin vivo技術で決定され得る。例えば、類似のレベルの細胞死滅が生じているか否かは、in vitroのＩＣ５０レベルを決定することにより決定され得る。別の例として、ｒＩＴのin vitroでの細胞毒性の評価は、ｒＩＴを９６ウェルプレート中の標的細胞に接触させることにより始められ、２４〜９６時間後に分析され得る。細胞死の定量は、生細胞による３Ｈ−チミジンの取り込みを決定することにより成し遂げられ得る。特異性は、過剰な未標識抗体でブロッキングした対照細胞、または対照ｒＩＴの使用により決定され得る。
別の例として、治療効果などの類似の効果のレベルが生じているか否かは、かかる効果のいずれかの指標を測定するさまざまな技術により決定され得る。かかる指標は、動物または臨床試験の対象において測定し得、および組成物が本明細書において提供される方法に従って投与される対象は、同じか、または異なっていることができる。例えば、マウスは、ｒＩＴが腫瘍サイズに与える効果を決定するために使用され得る。動物の生存率もまた、決定されるだろう。効果の他の指標は、がん細胞の数の減少、血清中のがん細胞の存在を示すバイオマーカーのレベルの減少、骨痛などの症状の徴候または減少、転移の徴候または増加などを含む。治療効果などの効果の指標を評価するためのアッセイおよび技術は、当該分野において公知である。
「対象」とは、ヒトおよび霊長類などの温血哺乳動物；鳥類；ネコ、イヌ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ウマおよびブタなどの家庭内または家畜動物；マウス、ラットおよびモルモットなどの実験動物；魚類；爬虫類；動物園および野生の動物などを含む動物を意味する。
「合成ナノキャリア（単数または複数）」とは、天然では見出されない個別の物体であって、サイズが５マイクロメートルより小さいか、またはこれと等しい、少なくとも１つの寸法を有するものを意味する。アルブミンナノ粒子は、一般に合成ナノキャリアとして含まれるが、しかし、ある態様においては、合成ナノキャリアは、アルブミンナノ粒子を含まない。態様において、合成ナノキャリアは、キトサンを含まない。ある他の態様において、合成ナノキャリアはキトサンを含まない。他の態様において、発明の合成ナノキャリアは、脂質ベースのナノ粒子ではない。さらなる態様において、発明の合成ナノキャリアは、リン脂質を含まない。
合成ナノキャリアは、これらに限定されないが、１つまたは複数の脂質ベースのナノ粒子（また本明細書において液体ナノ粒子、すなわち、それらの構造を構成する材料の大部分が脂質であるナノ粒子としても言及される）、ポリマーナノ粒子、金属ナノ粒子、界面活性剤ベースのエマルション、デンドリマー、バッキーボール、ナノワイヤー、ウイルス様粒子（すなわち、主にウイルスの構造タンパク質からなるが、感染性ではないか、低い感染性を有する粒子）、ペプチドまたはタンパク質ベースの粒子（また本明細書において、タンパク質粒子、すなわち、それらの構造を構成する材料の大部分がペプチドもしくはタンパク質である粒子としても言及される）（アルブミンナノ粒子など）および／または脂質−ポリマーナノ粒子などのナノ材料の組み合わせを用いて開発されるナノ粒子であってもよい。合成ナノキャリアは、多様な異なる形状であってよく、これは、限定されないが、球体、立方状、錐体、長方形、円柱状、ドーナツ型などを含む。本発明による合成ナノキャリアは、１以上の表面を含む。
本発明の実施における使用のために適応させることができる例示的な合成ナノキャリアは、以下を含む：（１）Grefらに対する米国特許5,543,158において開示される生分解性ナノ粒子、（２）Saltzmanらに対する米国特許出願公開20060002852のポリマーナノ粒子、（３）DeSimoneらに対する米国特許出願公開20090028910のリソグラフィーにより構築されるナノ粒子、（４）von Andrianらに対するWO 2009/051837の開示、（５）Penadesらに対する米国特許出願公開2008/0145441において開示されるナノ粒子、（６）de los Riosらに対する米国特許出願公開20090226525において開示されるタンパク質ナノ粒子、（７）Sebbelらに対する米国特許出願公開20060222652において開示されるウイルス様粒子、（８）Bachmannらに対する米国特許出願公開20060251677において開示される核酸結合ウイルス様粒子、（９）WO2010047839A1またはWO2009106999A2において開示されるウイルス様粒子、（１０）P. Paolicelli et al., 「Surface-modified PLGA-based Nanoparticles that can Efficiently Associate and Deliver Virus-like Particles」Nanomedicine. 5(6):843-853 (2010)において開示されるナノ沈殿させたナノ粒子、（１１）米国公開2002/0086049において開示されるアポトーシス細胞、アポトーシス小体または合成もしくは半合成模倣物、あるいは（１２）Look et al., Nanogel-based delivery of mycophenolic acid ameliorates systemic lupus erythematosus in mice」J. Clinical Investigation 123(4):1741-1749 (2013)のもの。
約１００ｎｍと等しいかこれより小さい、好ましくは１００ｎｍと等しいかこれより小さい最小寸法を有する、本発明による合成ナノキャリアは、補体を活性化するヒドロキシル基を有する表面を含まないか、あるいは、補体を活性化するヒドロキシル基ではない部分から本質的になる表面を含む。好ましい態様において、約１００ｎｍと等しいかこれより小さい、好ましくは１００ｎｍと等しいかこれより小さい最小寸法を有する、本発明による合成ナノキャリアは、補体を実質的に活性化する表面を含まないか、あるいは、補体を実質的に活性化しない部分から本質的になる表面を含む。より好ましい態様において、約１００ｎｍと等しいかこれより小さい、好ましくは１００ｎｍと等しいかこれより小さい最小寸法を有する、本発明による合成ナノキャリアは、補体を活性化する表面を含まないか、あるいは、補体を活性化しない部分から本質的になる表面を含む。態様において、合成ナノキャリアは、１：１、１：１．２、１：１．５、１：２、１：３、１：５、１：７より高い、または１：１０より高いアスペクト比を有してもよい。
「治療効果」とは、ｒＩＴを用いるなどの処置の所望される効果のいずれかを指す。かかる効果は、がんなどの疾患、またはそれらの症状の徴候もしくは進行における阻害を含む。治療効果の指標の他の例は、本明細書の他の部分において提供されるか、さもなければ当業者にとって明らかであろう。
組成物および関連する方法
抗薬剤抗体（ＡＤＡ）の発生は、ｒＩＴなどの治療の効力を制限し、患者において激しい過敏反応を引き起こし得る。ＡＤＡの形成は、例えば、がん治療のためのｒＩＴの臨床効果における制限要因となっている。大部分の免疫能の正常な（immune-competent）患者は、１サイクルの処置の後に、抗ｒＩＴ抗体を無効にすることを発揮し、そのことが抗がん効果を低減させ、さらなる処置を不可能にする。P. aeruginosaのものなどの、毒素への事前の暴露は、１つのメカニズムであり、それによって処置未経験の患者が外毒素Ａに対する以前から存在する抗体を有して存在し得、初回のｒＩＴ処置のサイクルでさえ無効にさせ得る。本明細書において提供されるものは、かかるｒＩＴへの望ましくない免疫応答を低減させるための組成物または方法であり、それによってがんの処置においてなどのｒＩＴの効果を増加させる。ラパマイシンなどの免疫抑制剤を含む合成ナノキャリアの投与などを用いて、新生物形成に中立な寛容原性環境を作り出すことを通して、ｒＩＴの免疫原性は低減され得、ｒＩＴの効果は一巡の投与または投与サイクルを通して（および／または複数の周回の投与または投与サイクルさえも可能にして）増大することが見出された。
いくつかの態様において、ｒＩＴは、がん細胞により発現した、またはそれら上に発現した抗原を介してなど、がん細胞を標的化し得る。がん抗原は、１種類のがんのみと関連するか、または特有であり得る。しかしながら、がん抗原は、１つより多い種類のがんと関連するか、または特有であり得る。がん抗原の例は、限定されないが、メソテリン、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ６６、ＥｐＣＡＭ、ＣＥＡ、ｇｐＡ３３、ムチン、ＭＡＧＥ（メラノーマ関連抗原）、ＰＲＡＭＥ（メラノーマ優先発現抗原）、ＴＡＧ−７２、炭酸脱水酵素ＩＸ、ＰＳＭＡ、チロシナーゼ腫瘍抗原、ＮＹ−ＥＳＯ−１、テロメラーゼ、ｐ５３、葉酸結合タンパク質、ガングリオシド（ＧＤ２、ＧＤ３、ＧＭなど）、Ｌｅｗｉｓ−Ｙ抗原（炭水化物抗原）、ＩＬ２Ｒ、ＩＬ４Ｒ、ＩＬ１３Ｒ、ＴｆＲ（トランスフェリン受容体）、ＧＭ−ＣＳＦＲ、ＥｒｂＢ１／ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２／ＨＥＲ２、ＥｒｂＢ３、ｃ−Ｍｅｔ、ＩＧＦ１Ｒ、ＥＧＦＲ、上皮成長因子受容体バリアントＩＩＩの変異体、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ、αＶβ３、α５β１、ＧＰＮＭＢ（糖タンパク質非転移性メラノーマタンパク質Ｂ）、ＨＭＷ−ＭＡＡ（高分子量メラノーマ関連抗原）、ＥｐｈＡ２、ＥｐｈＡ３、ｕＰＡＲ（ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化受容体）、プロテオグリカン、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＲＡＮＫＬ、ＦＡＰ、およびテネイシンを含む。
ｒＩＴのリガンドは、いずれかの標的分子であってもよい。例えば、リガンドは抗体、単一鎖抗体などの抗体フラグメント、またはサイトカイン、成長因子、もしくはペプチドホルモンなどの天然のリガンド（Weng et al., Mol Oncol. 2012, 6(3): 323-332）であってもよい。標的リガンドが、抗体またはそれらの抗原結合性フラグメントである場合に、それはモノクローナルであっても組換えであってもよく、キメラまたは可変領域フラグメントを含んでいてもよい。
本明細書において使用される、「抗体」とは、ジスルフィド結合により相互結合した少なくとも２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖を含む糖タンパク質を指す。それぞれの重鎖は、重鎖可変領域（本明細書においてＨＣＶＲまたはＶＨと略して書かれる）および重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３の３つのドメインを含む。それぞれの軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書においてＬＣＶＲまたはＶＬと略して書かれる）および軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は、ＣＬの１つのドメインを含む。ＶＨおよびＶＬ領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性領域、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存された領域が散在しているものとにさらに細分され得る。ＶＨおよびＶＬはそれぞれ、アミノ末端からカルボキシ末端まで以下の順：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４で配列された３つのＣＤＲおよび４つのＦＲから構成されている。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合領域を含有する。抗体の定常領域は、免疫系の様々な細胞（例えば、エフェクター細胞）および古典的補体系の第一因子（Ｃ１ｑ）を含むホスト組織または因子への免疫グロブリンの結合を仲介してもよい。
本明細書において使用される、抗体の「抗原結合性フラグメント」は、抗原に特異的に結合する能力を保持している抗体の１つ以上の部分を指す。抗体の抗原結合機能は、全長抗体のフラグメントにより実行され得る。抗体の用語「抗原結合性フラグメント」に包含される結合フラグメントの例は、以下を含む：（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価のフラグメントであるＦａｂフラグメント；（ｉｉ）ヒンジ領域にてジスルフィド架橋により結びついた２つのＦａｂフラグメントであるＦ（ａｂ’）２フラグメント；（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント；（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖフラグメント、（ｖ）ＶＨドメインからなる、ｄＡｂフラグメント（Ward et al., (1989) Nature 341:544-546）；および（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）。
さらに、Ｆｖフラグメントの２つのドメインである、ＶおよびＶＨが別々の遺伝子によりコードされているにもかかわらず、それらは、組換え法を使用して、それらがＶＬおよびＶＨ領域が対となって一価の分子を形成する単一タンパク質鎖（単一鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られている、例えば、Bird et al. (1988) Science 242:423-426; and Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883を参照する）として作られることを可能にする合成リンカーによりつながれ得る。かかる単一鎖抗体はまた、抗体の用語「抗原結合タ部位」内に包含されることが意図される。これらの抗体フラグメントは、J. Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp 98-118 (N.Y. Academic Press 1983)において記載されるようなタンパク質分解フラグメント手順などの、従来の手順を使用して得られ、それは当業者に公知である他の技術と同様に、参照により本明細書に援用される。フラグメントは、完全な抗体と同じように、実用性についてスクリーニングされる。
いずれかの毒素が本明細書において提供されるリガンドと共役してｒＩＴを形成するであろう。いくつかの態様において、リガンドおよび毒素は、共有結合的に結びついている。毒素は、植物、昆虫、脊椎動物、細菌、および真菌を含む様々な起源に由来するか、または基づくものであってもよい。毒素の例は、限定されないが、Pseudomonas aeruginosa外毒素Ａ（ＰＥ）、Corynebacterium diphtheria由来のジフテリア毒素（ＤＴ）、Saponaria officinalis由来のサポニン、志賀毒素、Abrus precatoriusの種子由来のアブリン、ダイアンシン−３０、リシンＡ鎖（ＲＴＡ）、ヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質（ＰＡＰ）、ゲロニン、ブリオジン１、カリケアマイシン毒素などを含む。
いくつかの態様において、毒素は、細菌起源であるか、またはかかる毒素に基づくものであってもよく、例えば、Pseudomonas aeruginosa外毒素Ａ（ＰＥ）、Pseudomonas aeruginosa内毒素、ジフテリア毒素（ＤＴ；Corynebacterium diphtheria、Clostridium perfringensエンテロトキシン（ＣＰＥ）、アルファ毒素（例えば、Staphylococcus aureus、Clostridium perfringens、またはPseudomonas aeruginosa由来）、ブドウ球菌エンテロトキシン−Ａ、αサルシン（Aspergillus giganteus）、志賀毒素（例えば、Escherichia coliまたはShigella dysenteriae由来）、カリケアマイシン毒素（Micromonospora echinospora）、およびシクロモジュリン（細胞毒性壊死因子、ＣＮＦなど）などの細胞毒素であってもよい。
いくつかの態様において、毒素は、植物起源のものであるか、またはかかる毒素に基づいていてもよく、例えば、ホロ毒素（例えば、クラスＩリボソーム不活性化タンパク質）またはヘミトキシン（例えば、クラスＩＩリボソーム不活性化タンパク質）などの植物毒素であってもよい。ホロ毒素の例は、限定されないが、リシン、アブリン、モデシン、およびヤドリギレクチンを含む。ヘミトキシンの例は、限定されないが、ヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質（ＰＡＰ）、ゲロニン、サポリン、ボウガニン（bouganin）、およびブリオジンを含む。
毒素はまた、真菌由来のものか、または真菌に基づくものであってもよい。真菌毒素の例は、限定されないが、アスペルギニンおよびレストリクトシンを含む。
いくつかの態様において、毒素は毒液の毒素であり、例えば、昆虫の毒素に由来するものか、または昆虫の毒素に基づくものであってもよい。使用されるだろう昆虫の毒素の例は、限定されないが、マストパラン（ＭＰ）（Polybia paulista由来のＰｏｌｙｂｉａ−ＭＰ１、Ｐｏｌｙｂｉａ−ＭＰＩＩ、およびＰｏｌｙｂｉａ−ＭＰＩＩＩ）、７，８−セコ−パラ−フェルギノン（ＳＰＦ；Vespa simillima由来）、メリチン（Apis mellifera由来）、およびホスホリパーゼＡ２（ＰＬＡ２；Apis mellifera由来）を含む。
ｒＩＴの例は、本明細書において提供される毒素のいずれか１つ（またはその一部）を含む。ｒＩＴの追加の例は、血液がんを処置するためのｒＩＴと同様に固形腫瘍を処置するためのｒＩＴであるそれらを含む。ｒＩＴのさらなる例は、限定されないが、イノツズマブオゾガマイシン（ヒト化抗ＣＤ２２抗体およびカリケアミシンであるオゾガマイシン）、モキセツモマブパスードトクス（抗ＣＤ２２モノクローナル抗体およびシュードモナス属外毒素Ａの３８ｋＤａフラグメントであるＰＥ３８）、ＬＭＢ−２（抗ＣＤ２５ ｏ ＩＬ−２４抗体およびＰＥ３８）、およびＶＢ４−８４５（抗ＥｐＣＡＭ単鎖型抗体フラグメントおよびＰＥ３８）を含む。ｒＩＴのさらなる例は以下を含む：ＬＭＢ−１、ＬＭＢ−７、ＬＭＢ−９、ＢＬ２２／ＣＡＴ−３８８８、ＳＳ１Ｐ（ＳＳ１（ｄｓＦｖ）−ＰＥ３８）、ＤＴ３８８−ＩＬ３、ＨＡ２２／ＣＡＴ−８０１５、脱グリコシル化リシンＡ鎖共役抗ＣＤ１９／抗ＣＤ２２、ＤＴ２２１９、Ｄ２Ｃ７−ＩＴ、Ａ−ｄｍＤＴ３９０−ｂｉｓＦｖ（ＵＣＨＴ１）、ＡＢ３８９ＩＬ２、ＤＴ３８８ ＧＭＣＳＦ、ＲＦＢ４−ｄｇＡ、ＨＤ３７−ｄｇＡ、コンボトックス（Combotox）（ＲＦＢ４−ｄｇＡ＋ＨＤ３７−ｄｇＡ）、ＲＦＴ５−ｄｇＡ（ＩＭＴＯＸ−２５）、Ｋｉ−４．ｄｇＡ、ＨｕＭ１９５／ｒＧｅｌ、Ｅｒｂ３８、ｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）−ＥＴＡ、ＳＧＮ−１０、ＯｖＢ３−ＰＥ、ＴＰ４０、Ｄ２Ｃ７−（ｓｃｄｓＦｖ）−ＰＥ３８ＫＤＥＬ（Ｄ２Ｃ７−ＩＴ）、ＭＲ１（Ｆｖ）−ＰＥ３８（ＭＲ１）、ＭＲ１−１（Ｆｖ）−ＰＥ３８（ＭＲ１−１）、ＴＧＦα−ＰＥ３８（ＴＰ３８）、ＴＧＦα−ＰＥ４０（ＴＰ４０）、ＤＡＢ３８９ＥＧＦ、ＤＴ３９０−ＢｉｓｃＦｖ８０６、ＳｃＦｖ（１４Ｅ１）−ＥＴＡ、抗ＥＧＦＲ／ＬＰ１、ＩＬ−１３ＰＥ３８ＱＱＲ（ＩＬ−１３ＰＥ）、ＩＬ１３Ｅ１３Ｋ−ＰＥ３８、抗ＩＬ−１３Ｒａ２（ｓｃＦｖ）−ＰＥ３８、ＤＴ３９０ＩＬ１３、ＩＬ４（３８−３７）−ＰＥ３８ＫＤＥＬ（ｃｐＩＬ４−ＰＥ）、ＤＴ３９０−ｍＩＬ４、ＤＴ３９０−ＡＴＦ（ＤＴＡＴ）、ＤＴ３９０−ＩＬ−１３−ＡＴＦ（ＤＴＡＴ１３）、ＥＧＦＡＴＦＫＤＥＬ、ＥＧＦＡＴＦＫＤＥＬ７ｍｕｔ、ＤＴＥＧＦ１３、８Ｈ９ｓｃＦｖ−ＰＥ３８、ＥｐｈｒｉｎＡ１−ＰＥ３８ＱＱＲ、ＮＺ−１−（ｓｃｄｓＦｖ）−ＰＥ３８ＫＤＥＬ、ＤｍＡｂ１４ｍ−（ｓｃＦｖ）−ＰＥ３８ＫＤＥＬ（ＤｍＡｂ１４ｍ−ＩＴ）、およびＩＴ−８７。
いくつかの態様において、ｒＩＴは、例えば、共有結合的に細菌起源のものなどの毒素（例えば、Pseudomonas aeruginosa外毒素Ａのドメイン）へと結びついている腫瘍抗原標的化抗体の可変ドメイン（Ｆｖ）を有するものである。したがって、本明細書において提供される方法または組成物のいずれか１つにおいて、ｒＩＴは、修飾された毒素に融合したヒト化Ｆａｂ標的化メソテリンを含む第二世代ｒＩＴである、ＬＭＢ−１００であり得る（図２Ａ）。本発明の側面にしたがった追加の有用なｒＩＴは当業者にとって明らかであるだろうし、本発明はこの点で限定されない。
本明細書において提供される方法は、免疫抑制剤を含む合成ナノキャリアの投与を含む。一般に、免疫抑制剤は、合成ナノキャリアの構造を構成する材料へと加えられる要素である。例えば、提供される方法または組成物のいずれか１つの一態様において、合成ナノキャリアが１つ以上のポリマーから構成される場合に、免疫抑制剤は、提供される方法または組成物のいずれか１つのいくつかの態様において、１つ以上のポリマーに加えられ、および接着する化合物である。合成ナノキャリアの材料もまた、寛容原性効果をもたらす場合の態様において、免疫抑制剤は、寛容原性効果をもたらす合成ナノキャリアの材料に加えて存在する要素である。
本発明により、提供される方法または組成物のいずれか１つのいくつかの態様において、広範な他の合成ナノキャリアを免疫抑制剤とカップリングさせて用いることができる。いくつかの態様において、合成ナノキャリアは、球体または球状体である。いくつかの態様において、合成ナノキャリアは、扁平または平板状である。いくつかの態様において、合成ナノキャリアは、立方体または立方である。いくつかの態様において、合成ナノキャリアは、卵円または楕円である。いくつかの態様において、合成ナノキャリアは、円柱、円錐または錐体である。
提供される方法または組成物のいずれか１つのいくつかの態様において、各々の合成ナノキャリアが類似の特性を有するように、サイズまたは形状に関して比較的均一である合成ナノキャリアの集団の使用が望ましい。例えば、提供される組成物または方法のいずれか１つの合成ナノキャリアの、合成ナノキャリアの合計数に基づいて、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％は、合成ナノキャリアの平均直径または平均寸法の５％、１０％、または２０％以内に該当する最小寸法または最大寸法を有していてもよい。
合成ナノキャリアは、中実であっても中空であってもよく、１以上の層を含んでもよい。いくつかの態様において、各層は、他の層（単数または複数）と比較してユニークな組成およびユニークな特性を有する。一例のみを挙げると、合成ナノキャリアは、コア／シェル構造を有していてもよく、ここで、コアは１つの層であり（例えばポリマーのコア）、シェルは第２の層である（例えば脂質二重層または単層）。合成ナノキャリアは、複数の異なる層を含んでもよい。
いくつかの態様において、合成ナノキャリアは、１以上の脂質を任意に含んでもよい。いくつかの態様において、合成ナノキャリアは、リポソームを含んでもよい。いくつかの態様において、合成ナノキャリアは、脂質二重層を含んでもよい。いくつかの態様において、合成ナノキャリアは、脂質単層を含んでもよい。いくつかの態様において、合成ナノキャリアは、ミセルを含んでもよい。いくつかの態様において、合成ナノキャリアは、脂質層（例えば、脂質二重層、脂質単層など）に囲まれたポリマーマトリックスを含むコアを含んでもよい。いくつかの態様において、合成ナノキャリアは、脂質層（例えば、脂質二重層、脂質単層など）に囲まれた非ポリマー性のコア（例えば、金属粒子、量子ドット、セラミック粒子、骨粒子、ウイルス粒子、タンパク質、核酸、炭水化物など）を含んでもよい。
他の態様において、合成ナノキャリアは、金属粒子、量子ドット、セラミック粒子などを含んでもよい。いくつかの態様において、非ポリマー性合成ナノキャリアは、金属原子（例えば金原子）の凝集物などの、非ポリマー性成分の凝集物である。
提供される方法または組成物のいずれか1つのいくつかの態様において、合成ナノキャリアは、1つ以上のポリマーを含み得る。提供される方法または組成物のいずれか１つのいくつかの態様において、合成ナノキャリアは、非メトキシ末端、プルロニックポリマー（pluronic polymer）である1つ以上のポリマーを含む。提供される方法または組成物のいずれか１つのいくつかの態様において、合成ナノキャリアを構成するポリマーの少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、または９９％（重量／重量）が、非メトキシ末端、プルロニックポリマーである。提供される方法または組成物のいずれか１つのいくつかの態様において、合成ナノキャリアを構成するポリマーの全てが、非メトキシ末端、プルロニックポリマーである。提供される方法または組成物のいずれか１つのいくつかの態様において、合成ナノキャリアは、非メトキシ末端ポリマーである１つ以上のポリマーを含む。
提供される方法または組成物のいずれか１つのいくつかの態様において、合成ナノキャリアを構成するポリマーの少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、または９９％（重量／重量）が、非メトキシ末端ポリマーである。提供される方法または組成物のいずれか１つのいくつかの態様において、合成ナノキャリアを構成するポリマーの全てが、非メトキシ末端ポリマーである。提供される方法または組成物のいずれか１つのいくつかの態様において、合成ナノキャリアは、プルロニックポリマーを含まない１つ以上のポリマーを含む。提供される方法または組成物のいずれか１つのいくつかの態様において、合成ナノキャリアを構成するポリマーの少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、または９９％（重量／重量）は、プルロニックポリマーを含まない。提供される方法または組成物のいずれか１つのいくつかの態様において、合成ナノキャリアを構成するポリマーの全てが、プルロニックポリマーを含まない。提供される方法または組成物のいずれか１つのいくつかの態様において、かかるポリマーは、コーティング層（例えば、リポソーム、脂質単層、ミセルなど）により囲まれ得る。提供される方法または組成物のいずれか１つのいくつかの態様において、合成ナノキャリアの要素は、ポリマーに接着し得る。
免疫抑制剤は、多数の方法のうちのいずれかにより合成ナノキャリアにカップリングすることができる。一般に、接着は、免疫抑制剤と合成ナノキャリアとの間の結合の結果である。この結合により、免疫抑制剤の合成ナノキャリアの表面への接着、および／または合成ナノキャリア中での包含（封入）をもたらすことができる。提供される方法または組成物のいずれか１つのいくつかの態様において、しかし、免疫抑制剤は、合成ナノキャリアへの結合よりもむしろ合成ナノキャリアの構造の結果として、合成ナノキャリアにより封入される。提供される方法または組成物のいずれか１つの好ましい態様において、合成ナノキャリアは、本明細書において提供されるポリマーを含み、免疫抑制剤はポリマーにカップリングしている。
カップリングが、免疫抑制剤と合成ナノキャリアとの間の結合の結果として生じる場合、カップリングは、カップリング部分を介して生じてもよい。カップリング部分は、それを通して免疫抑制剤が合成ナノキャリアに結合する任意の部分であってよい。かかる部分は、アミド結合またはエステル結合などの共有結合、ならびに免疫抑制剤を合成ナノキャリアに（共有的または非共有的に）結合する別の分子を含む。かかる分子は、リンカーまたはポリマーまたはその単位を含む。例えば、カップリング部分は、免疫抑制剤が静電気的に結合する荷電したポリマーを含んでもよい。別の例として、カップリング部分は、それが共有結合しているポリマーまたはその単位を含んでもよい。
提供される方法または組成物のいずれか１つの好ましい態様において、合成ナノキャリアは、本明細書において提供されるポリマーを含む。これらの合成ナノキャリアは、完全にポリマー性のものであっても、ポリマーと他の材料との混合物であってもよい。
提供される方法または組成物のいずれか１つのいくつかの態様において、合成ナノキャリアのポリマーは、会合してポリマーマトリックスを形成する。提供される方法または組成物のいずれか１つのこれらの態様のいくつかにおいて、免疫抑制剤などの成分は、ポリマーマトリックスの１以上のポリマーと共有結合的に会合することができる。提供される方法または組成物のいずれか１つのいくつかの態様において、共有結合的会合は、リンカーにより媒介される。提供される方法または組成物のいずれか１つのいくつかの態様において、成分は、ポリマーマトリックスの１以上のポリマーに、非共有結合的に会合していてもよい。例えば、提供される方法または組成物のいずれか１つのいくつかの態様において、成分は、ポリマーマトリックス中に封入されていても、ポリマーマトリックスにより囲まれていても、および／またはポリマーマトリックス全体に分散していてもよい。あるいはまたは加えて、成分は、疎水性相互作用、電荷相互作用、ファン・デル・ワールス力などにより、ポリマーマトリックスの１以上のポリマーに会合することができる。それらからポリマーマトリックスを形成するための広範なポリマーおよび方法が、慣習的に知られている。
ポリマーは、天然または非天然の（合成の）ポリマーであってよい。ポリマーは、ホモポリマーであっても、２以上のモノマーを含むコポリマーであってよい。配列に関して、コポリマーは、ランダムであっても、ブロックであっても、またはランダムおよびブロック配列の組み合わせを含んでもよい。典型的には、本発明によるポリマーは、有機ポリマーである。
提供される方法または組成物のいずれか１つのいくつかの態様において、ポリマーは、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリアミドまたはポリエーテル、またはこれらの単位を含む。提供される方法または組成物のいずれか１つの他の態様において、ポリマーは、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、ポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）、ポリ（乳酸−コ−グリコール酸）、またはポリカプロラクトン、またはこれらの単位を含む。提供される方法または組成物のいずれか１つのいくつかの態様において、ポリマーは、生分解性であることが好ましい。したがって、提供される方法または組成物のいずれか１つのこれらの態様において、ポリマーが、ポリ（エチレングリコール）またはポリプロピレングリコールまたはこれらの単位などのポリエーテルを含む場合、ポリマーが生分解性となるように、ポリマーが、ポリエーテルのブロックコポリマーおよび生分解性ポリマーを含むことが好ましい。提供される方法または組成物のいずれか１つの他の態様において、ポリマーは、ポリ（エチレングリコール)またはポリプロピレングリコールまたはその単位などのポリエーテルまたはその単位を単独では含まない。
本発明における使用のために好適なポリマーの他の例として、限定されないが、ポリエチレン、ポリカーボネート（例えばポリ（１，３−ジオキサン−２オン））、ポリ酸無水物（例えばポリ（セバシン酸無水物））、フマル酸ポリプロピル（polypropylfumerates）、ポリアミド（例えばポリカプロラクタム）、ポリアセタール、ポリエーテル、ポリエステル（例えば、ポリ乳酸、ポリグリコリド、ポリラクチド−グリコリドコポリマー、ポリカプロラクトン、ポリヒドロキシ酸(polyhydroxyacid)（例えばポリ（β−ヒドロキシアルカノアート）））、ポリ（オルトエステル）、ポリシアノアクリラート、ポリビニルアルコール、ポリウレタン、ポリホスファゼン、ポリアクリラート、ポリメタクリラート、ポリウレア、ポリスチレンおよびポリアミン、ポリリジン、ポリリジン−ＰＥＧコポリマー、およびポリ（エチレンイミン）、ポリ（エチレンイミン）−ＰＥＧコポリマーが挙げられる。
提供される方法または組成物のいずれか１つのいくつかの態様において、本発明によるポリマーは、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）により２１ Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１７７．２６００下においてヒトにおける使用について承認されているポリマーを含み、これは、限定されないが、ポリエステル（例えば、ポリ乳酸、ポリ（乳酸−コ−グリコール酸）コポリマー、ポリカプロラクトン、ポリバレロラクトン、ポリ（１，３−ジオキサン−２オン））；ポリ酸無水物（例えばポリ（セバシン酸無水物））；ポリエーテル（例えば、ポリエチレングリコール）；ポリウレタン；ポリメタクリラート；ポリアクリラート；およびポリシアノアクリラートを含む。
提供される方法または組成物のいずれか１つのいくつかの態様において、ポリマーは、親水性であってよい。例えば、ポリマーは、アニオン基（例えば、リン酸基、硫酸基、カルボン酸基）；カチオン基（例えば、四級アミン基）；または極性基（例えば、ヒドロキシル基、チオール基、アミン基）を含んでもよい。提供される方法または組成物のいずれか１つのいくつかの態様において、親水性ポリマーマトリックスを含む合成ナノキャリアは、合成ナノキャリア中に親水性環境を生じる。提供される方法または組成物のいずれか１つのいくつかの態様において、ポリマーは、疎水性であってもよい。提供される方法または組成物のいずれか１つのいくつかの態様において、疎水性ポリマーマトリックスを含む合成ナノキャリアは、合成ナノキャリア中に疎水性環境を生じる。ポリマーの親水性または疎水性の選択は、合成ナノキャリア中に組み込まれる材料の性質に対して影響を有し得る。
提供される方法または組成物のいずれか１つのいくつかの態様において、ポリマーは、１以上の部分および／または官能基により修飾されていてもよい。本発明により多様な部分または官能基を用いることができる。提供される方法または組成物のいずれか１つのいくつかの態様において、ポリマーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）により、炭水化物により、および／または多糖から誘導される非環式ポリアセタールにより修飾することができる（Papisov, 2001, ACS Symposium Series, 786:301）。いくつかの態様は、Grefらに対する米国特許第５５４３１５８号またはvon AndrianらによるＷＯ公開ＷＯ２００９／０５１８３７の一般的教示を用いて行ってもよい。
提供される方法または組成物のいずれか１つのいくつかの態様において、ポリマーは、ポリエステルであってよく、これは、乳酸およびグリコール酸の単位を含むコポリマー、例えばポリ（乳酸−コ−グリコール酸）およびポリ（ラクチド−コ−グリコリド）（本明細書において集合的に「ＰＬＧＡ」として言及される）；ならびにグリコール酸単位を含むホモポリマー（本明細書において「ＰＧＡ」として言及される）、ならびにポリ−Ｌ−乳酸、ポリ−Ｄ−乳酸、ポリ−Ｄ，Ｌ−乳酸、ポリ−Ｌ−ラクチド、ポリ−Ｄ−ラクチド、およびポリ−Ｄ，Ｌ−ラクチドなどの乳酸単位を含むホモポリマー（本明細書において集合的に「ＰＬＡ」として言及される）を含む。提供される方法または組成物のいずれか１つのいくつかの態様において、例示的なポリエステルとして、例えば、ポリヒドロキシ酸；ＰＥＧコポリマーおよびラクチドとグリコリドとのコポリマー（例えば、ＰＬＡ−ＰＥＧコポリマー、ＰＧＡ−ＰＥＧコポリマー、ＰＬＧＡ−ＰＥＧコポリマー）およびそれらの誘導体が挙げられる。提供される方法または組成物のいずれか１つのいくつかの態様において、ポリエステルとして、例えば、ポリ（カプロラクトン）、ポリ（カプロラクトン）−ＰＥＧコポリマー、ポリ（Ｌ−ラクチド−Ｌ−リジン）コポリマー、ポリ（セリンエステル）、ポリ（４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンエステル）、ポリ［α−（４−アミノブチル）−Ｌ−グリコール酸］およびそれらの誘導体が挙げられる。
提供される方法または組成物のいずれか１つのいくつかの態様において、ポリマーは、ＰＬＧＡであってよい。ＰＬＧＡは、乳酸とグリコール酸との生体適合性かつ生分解性のコポリマーであり、ＰＬＧＡの多様な形態は、乳酸：グリコール酸の比により特徴づけられる。乳酸は、Ｌ−乳酸、Ｄ−乳酸またはＤ，Ｌ−乳酸であってよい。ＰＬＧＡの分解速度は、乳酸：グリコール酸比を変更することにより調節することができる。提供される方法または組成物のいずれか１つのいくつかの態様において、本発明により用いられるべきＰＬＧＡは、約８５：１５、約７５：２５、約６０：４０、約５０：５０、約４０：６０、約２５：７５または約１５：８５の乳酸:グリコール酸の比により特徴づけられる。
いくつかの態様において、ポリマーは、カチオン性側鎖を有する分解性ポリエステルであってもよい（Putnam et al., 1999, Macromolecules, 32:3658；Barrera et al., 1993, J. Am. Chem. Soc., 115:11010；Kwon et al., 1989, Macromolecules, 22:3250；Lim et al., 1999, J. Am. Chem. Soc., 121:5633；およびZhou et al., 1990, Macromolecules, 23:3399）。これらのポリエステルの例として、ポリ（Ｌ−ラクチド−Ｌ−リジン）コポリマー（Barrera et al., 1993, J. Am. Chem. Soc., 115:11010）、ポリ（セリンエステル）（Zhou et al., 1990, Macromolecules, 23:3399）、ポリ（４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンエステル）（Putnam et al., 1999, Macromolecules, 32:3658；およびLim et al., 1999, J. Am. Chem. Soc., 121:5633）、ならびにポリ（４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンエステル）（Putnam et al., 1999, Macromolecules, 32:3658; and Lim et al., 1999, J. Am. Chem. Soc., 121:5633）が挙げられる。
これらのおよび他のポリマーの特性およびそれらを調製するための方法は、当該分野において周知である（例えば、米国特許第６，１２３，７２７号；同第５，８０４，１７８号；同第５，７７０，４１７号；同第５，７３６，３７２号；同第５，７１６，４０４号；同第６，０９５，１４８号；同第５，８３７，７５２号；同第５，９０２，５９９号；同第５，６９６，１７５号；同第５，５１４，３７８号；同第５，５１２，６００号；同第５，３９９，６６５号；同第５，０１９，３７９号；同第５，０１０，１６７号；同第４，８０６，６２１号；同第４，６３８，０４５号；および同第４，９４６，９２９号；Wang et al., 2001, J. Am. Chem. Soc., 123:9480；Lim et al., 2001, J. Am. Chem. Soc., 123:2460；Langer, 2000, Acc. Chem. Res., 33:94；Langer, 1999, J. Control. Release, 62:7；およびUhrich et al., 1999, Chem. Rev., 99:3181を参照）。より一般的には、特定の好適なポリマーを合成するための多様な方法は、Concise Encyclopedia of Polymer Science and Polymeric Amines and Ammonium Salts、Goethals編、Pergamon Press, 1980；OdianによるPrinciples of Polymerization、John Wiley & Sons、第４版、2004；AllcockらによるContemporary Polymer Chemistry、Prentice-Hall、1981；Deming et al., 1997, Nature, 390:386において；および米国特許第６，５０６，５７７号、同第６，６３２，９２２号、同第６，６８６，４４６号および同第６，８１８，７３２号において記載される。
提供される方法または組成物のいずれか１つのいくつかの態様において、ポリマーは、直鎖状または分枝状ポリマーであってよい。いくつかの態様において、ポリマーは、デンドリマーであってよい。提供される方法または組成物のいずれか１つのいくつかの態様において、ポリマーは、互いに実質的に架橋されていてもよい。提供される方法または組成物のいずれか１つのいくつかの態様において、ポリマーは、実質的に架橋を含まなくてもよい。いくつかの態様において、ポリマーは、架橋するステップを経ることなく本発明により用いることができる。さらに、合成ナノキャリアは、前述のおよび他のポリマーのいずれかのブロックコポリマー、グラフトコポリマー、ブレンド、混合物および／または付加物を含んでもよいことが、理解されるべきである。当業者は、本明細書において列記されるポリマーは、本発明による使用のものである例示的なポリマーのリストを代表するが、包括的なものではないことを認識するであろう。
いくつかの態様において、合成ナノキャリアは、ポリマー成分を含まない。いくつかの態様において、合成ナノキャリアは、金属粒子、量子ドット、セラミック粒子などを含んでもよい。いくつかの態様において、非ポリマー性合成ナノキャリアは、金属原子（例えば金原子）の凝集物などの、非ポリマー性成分の凝集物である。
本明細書において提供される任意の免疫抑制剤は、提供される方法または組成物のいずれか１つのいくつかの態様においては、合成ナノキャリアにカップリングされていてもよい。免疫抑制剤として、これらに限定されないが、以下が挙げられる：スタチン；ラパマイシンまたはラパマイシンアナログ（ラパログ）などのmTOR阻害剤；TGF−βシグナル伝達剤；TGF−β受容体アゴニスト；ヒストンデアセチラーゼ（HDAC）阻害剤；副腎皮質ステロイド；ロテノンなどのミトコンドリアの機能の阻害剤；P38阻害剤；NF-κβ阻害剤；アデノシン受容体アゴニスト；プロスタグランジンＥ２アゴニスト；ホスホジエステラーゼ４阻害剤などのホスホジエステラーゼ阻害剤；プロテアソーム阻害剤；キナーゼ阻害剤；Ｇタンパク質共役受容体アゴニスト；Ｇタンパク質共役受容体アンタゴニスト；糖質コルチコイド；レチノイド；サイトカイン阻害剤；サイトカイン受容体阻害剤；サイトカイン受容体アクチベーター；ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体アンタゴニスト；ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体アゴニスト；ヒストンデアセチラーゼ阻害剤；カルシニューリン阻害剤；ホスファターゼ阻害剤ならびに酸化ATP。免疫抑制剤はまた、IDO、ビタミンＤ３、シクロスポリンＡ、アリール炭化水素受容体阻害剤、レスベラトロール、アザチオプリン、６−メルカプトプリン、アスピリン、ニフルミン酸、エストリオール、トリポリド（tripolide）、インターロイキン（例えば、IL-1、IL-10）、シクロスポリンＡ、サイトカインまたはサイトカイン受容体などを標的とするsiRNAを含む。
ｍＴＯＲ阻害剤の例として、ラパマイシンおよびそのアナログ（例えば、ＣＣＬ−７７９、ＲＡＤ００１、ＡＰ２３５７３、Ｃ２０−メタリルラパマイシン（Ｃ２０−Ｍａｒａｐ）、Ｃ１６−（Ｓ）−ブチルスルホンアミドラパマイシン（Ｃ１６−ＢＳｒａｐ）、Ｃ１６−（Ｓ）−３−メチルインドールラパマイシン（Ｃ１６−ｉＲａｐ）（Bayle et al. Chemistry & Biology 2006、13:99-107）、ＡＺＤ８０５５、ＢＥＺ２３５（ＮＶＰ−ＢＥＺ２３５）、クリソファン酸（クリソファノール）、デフォロリムス（ＭＫ−８６６９）、エベロリムス（ＲＡＤ０００１）、ＫＵ−００６３７９４、ＰＩ−１０３、ＰＰ２４２、テムシロリムス、およびＷＹＥ−３５４（Selleck、Houston、TX、ＵＳＡから入手可能）が挙げられる。
免疫抑制剤にカップリングした合成ナノキャリアに関しては、成分を合成ナノキャリアへとカップリングさせるための方法は、有用であるだろう。合成ナノキャリアの要素は、例えば、１つ以上の共有結合によって、合成ナノキャリア全体にカップリングされていてもよく、または１つ以上のリンカーという手段によって接着されていてもよい。合成ナノキャリアに機能を持たせる追加の方法は、Saltzman et alの公開米国特許出願２００６／０００２８５２、DeSimone et alの公開米国特許出願２００９／００２８９１０、またはMurthy et alの公開国際特許出願ＷＯ／２００８／１２７５３２ Ａ１を出典としてもよい。
いくつかの態様において、カップリングは、共有結合的リンカーであってよい。態様において、本発明による免疫抑制剤は、外側表面に、アルキン基を含む免疫抑制剤とのアジド基の１，３−双極性環化付加反応により、またはアジド基を含む免疫抑制剤とのアルキンの１，３−双極性環化付加反応により形成された、１，２，３−トリアゾールリンカーを介して、共有的にカップリングしていてもよい。かかる環化付加反応は、好ましくは、好適なＣｕ（Ｉ）−リガンドおよびＣｕ（ＩＩ）化合物を触媒活性Ｃｕ（Ｉ）化合物に還元するための還元剤と共に、Ｃｕ（Ｉ）触媒の存在下において行う。このＣｕ（Ｉ）により触媒されたアジド−アルキン環化付加（ＣｕＡＡＣ）はまた、クリック反応としても言及される。
加えて、共有結合的カップリングは、共有結合的リンカーを含んでもよく、これは、アミドリンカー、ジスルフィドリンカー、チオエーテルリンカー、ヒドラゾンリンカー、ヒドラジドリンカー、イミンまたはオキシムリンカー、ウレアまたはチオウレアリンカー、アミジンリンカー、アミンリンカー、およびスルホンアミドリンカーを含む。
あるいは、またはさらに、合成ナノキャリアは、成分に直接、または非共有結合的な相互作用を介して間接的にカップリングし得る。非共有結合的な態様において、非共有結合的な接着は、限定されないが、電荷相互作用、親和性相互作用、金属配位、物理吸着、ホスト−ゲスト相互作用、疎水性相互作用、ＴＴスタッキング相互作用、水素結合相互作用、ファン・デル・ワールス相互作用、磁性相互作用、静電相互作用、双極子―双極子相互作用、および／またはそれらの組み合わせを含む、非共有結合的な相互作用によって仲介される。かかるカップリングは、合成ナノキャリアの外側表面に、または内側表面に配置されてもよい。提供される方法または組成物のいずれか１つの態様において、封入および／または吸収は、カップリングの一形態である。
利用可能な共役方法の詳細な記載については、Hermanson G T「Bioconjugate Techniques」、第２版、Academic Press, Inc.刊行、2008年を参照。共有的接着に加えて、成分は、予め形成された合成ナノキャリアに吸着させることによりカップリングさせても、または合成ナノキャリアの形成の間の封入によりカップリングさせてもよい。
合成ナノキャリアは、当該分野において公知の広範な方法を用いて調製することができる。例えば、合成ナノキャリアは、ナノ沈殿、流体チャネルを用いるフローフォーカシング(flow focusing)、スプレー乾燥、シングルおよびダブルエマルション溶媒蒸発、溶媒抽出、相分離、製粉、マイクロエマルション法、微細加工(microfabrication)、ナノ加工(nanofabrication)、犠牲層、単純および複合コアセルベーションなどの方法、ならびに当業者に周知の他の方法により形成することができる。あるいはまたは加えて、単分散半導体のための水性および有機性の溶媒合成、伝導性、磁性、有機および他のナノ材料が記載されている（Pellegrino et al., 2005, Small, 1:48; Murray et al., 2000, Ann. Rev. Mat. Sci., 30:545; and Trindade et al., 2001, Chem. Mat., 13:3843）。さらなる方法は、文献において記載されている（例えば、Doubrow編、「Microcapsules and Nanoparticles in Medicine and Pharmacy」、CRC Press, Boca Raton, 1992；Mathiowitz et al., 1987, J. Control. Release, 5:13; Mathiowitz et al., 1987, Reactive Polymers, 6:275；ならびにMathiowitz et al., 1988, J. Appl. Polymer Sci., 35:755；米国特許第５５７８３２５号および同第６００７８４５号；P. Paolicelli et al., 「Surface-modified PLGA-based Nanoparticles that can Efficiently Associate and Deliver Virus-like Particles」Nanomedicine. 5(6):843-853 (2010)を参照）。
材料を、望ましい場合には、限定されないが以下を含む多様な方法を用いて、合成ナノキャリア中に封入してもよい：C. Astete et al., 「Synthesis and characterization of PLGA nanoparticles」J. Biomater. Sci. Polymer Edn、第１７巻、第３号、pp. 247-289（2006）；K.Avgoustakis「Pegylated Poly(Lactide) and Poly(Lactide-Co-Glycolide) Nanoparticles：Preparation, Properties and Possible Applications in Drug Delivery」Current Drug Delivery 1:321-333（2004）；C. Reis et al., 「Nanoencapsulation I. Methods for preparation of drug-loaded polymeric nanoparticles」Nanomedicine 2:8- 21（2006）；P. Paolicelli et al., 「Surface-modified PLGA-based Nanoparticles that can Efficiently Associate and Deliver Virus-like Particles」Nanomedicine. 5(6):843-853（2010）。材料を合成ナノキャリア中に封入するために好適な他の方法を用いてもよく、これらは、限定することなく、２００３年１０月１４日に発行されたUngerに対する米国特許第６，６３２，６７１号において開示される方法を含む。
いくつかの態様において、合成ナノキャリアは、ナノ沈殿法またはスプレー乾燥により調製される。合成ナノキャリアを調製することにおいて用いられる条件は、所望されるサイズまたは特性（例えば、疎水性、親水性、外側の形態、「粘着性」、形状など）の粒子を得るために改変することができる。合成ナノキャリアを調製する方法および用いられる条件（例えば、溶媒、温度、濃度、気体の流速など）は、合成ナノキャリアにカップリングさせるべき材料および／またはポリマーマトリックスの組成に依存し得る。
上記の方法のいずれかにより調製される合成ナノキャリアが所望される範囲の外のサイズ範囲を有する場合、合成ナノキャリアを、例えば篩を用いて、サイズ分類することができる。
本明細書において提供される組成物は、無機または有機のバッファー（例えば、リン酸、炭酸、酢酸またはクエン酸のナトリウムまたはカリウム塩）およびｐＨ調節剤（例えば、塩酸、水酸化ナトリウムまたはカリウム、クエン酸または酢酸の塩、アミノ酸およびそれらの塩）、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、アルファ−トコフェロール）、界面活性剤（例えば、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、ポリオキシエチレン９−１０ノニルフェノール、デオキシコール酸ナトリウム）、溶液および／または低温(cryo)／凍結安定化剤（例えば、スクロース、ラクトース、マンニトール、トレハロース）、浸透圧調節剤（例えば、塩または糖）、抗菌剤（例えば、安息香酸、フェノール、ゲンタマイシン）、消泡剤（例えば、ポリジメチルシロキサン）、保存剤（例えば、チメロサール、２−フェノキシエタノール、ＥＤＴＡ）、ポリマー性安定化剤および粘度調節剤（例えば、ポリビニルピロリドン、ポロキサマー４８８、カルボキシメチルセルロース）および共溶媒（例えば、グリセロール、ポリエチレングリコール、エタノール）を含んでもよい。
本発明による組成物は、薬学的に許容し得る、保存剤、バッファー、食塩水、またはリン酸緩衝化食塩水などの賦形剤を含んでもよい。組成物は、有用な投与形態を達成するために、慣用的な医薬の製造および配合技術を用いて製造することができる。提供される方法または組成物のいずれか１つの一態様において、組成物は、保存剤と共に注射用の無菌食塩水溶液中に懸濁する。本発明の実施における使用のために好適な技術は、Handbook of Industrial Mixing：Science and Practice、Edward L. Paul, Victor A. Atiemo-ObengおよびSuzanne M. Kresta編、２００４年、John Wiley & Sons, Inc.；ならびにPharmaceutics: The Science of Dosage Form Design、第２版M. E. Auten編、２００１年、Churchill Livingstoneにおいて見出すことができる。提供される方法または組成物のいずれか１つの一態様において、組成物を、注射のために、保存剤と共に、無菌の食塩水溶液中に懸濁する。
本発明の組成物は任意の好適な様式において製造することができることが、理解されるべきであり、本発明は、本明細書において記載される方法を用いて製造することができる組成物に決して限定されない。適切な製造の方法の選択は、関連する特定の部分の特性に対する注意を必要とする場合がある。
提供される方法または組成物のいずれか１つのいくつかの態様において、組成物は、無菌条件下において製造されるか、最終的に無菌化される。このことにより、結果として生じる組成物が無菌であり、非感染性であることを確実にすることができ、それにより、非無菌の組成物と比較して安全性を改善する。このことは、特に組成物を投与されている対象が免疫欠損を有するか、感染症を罹患しているか、および／または感染に対して感受性である場合に、有益な安全性の指標を提供する。
本発明による投与は、多様な経路によるものであってよく、これは、限定されないが、皮下、静脈内、および腹腔内経路を含む。本明細書において言及される組成物は、投与のために、従来の方法を用いて製造および調製することができる。
本発明の組成物は、本明細書において記載される有効量などの、有効量において投与され得る。提供される方法または組成物のいずれか１つのいくつかの態様において、免疫抑制剤を含む合成ナノキャリアの投与を伴うか、または伴わないｒＩＴの投与の繰り返しの複数のサイクルが着手される。投与形態の用量は、本発明に従う免疫抑制剤および／またはｒＩＴの様々な量を含有してもよい。投与形態中に存在する免疫抑制剤および／またはｒＩＴの量は、ｒＩＴ、合成ナノキャリアおよび／または免疫抑制剤の性質、達成されるべき治療効果、および他のかかるパラメーターに従って変えられ得る。態様において、用量範囲試験は、投与形態中に存在する成分（単数または複数）の最適な治療量を確立するよう実施され得る。態様において、成分（単数または複数）は、ｒＩＴに寛容原性免疫応答を生ずる有効量において、投与形態中に存在する。好ましい態様において、成分（単数または複数）は、対象に併用して投与される際などに、ｒＩＴへの免疫応答を低減させる有効量において投与形態中に存在する。従来の用量範囲試験および対象における技術を使用して、所望される免疫応答を生じるか、または望ましくない免疫応答を低減させるために有効である成分（単数または複数）の量を決定することは可能であるだろう。投与形態は、さまざまな頻度で投与されてもよい。
本発明の側面は、本明細書において提供される投与の方法のためのプロトコルを決定することに関する。プロトコルは、ｒＩＴおよび／または免疫抑制剤を含む合成ナノキャリアの少なくとも頻度、投与量を変化させ、その後に所望されるかまたは望ましくない免疫応答を評価することにより、決定することができる。本発明の実施のための好ましいプロトコルは、ｒＩＴに対する免疫応答を低減させ、および／または本明細書において提供される免疫抑制剤を含む合成ナノキャリアを伴う投与なしの同じ投与方法と比べて、繰り返し投与することを可能にする。プロトコルは、ｒＩＴおよび／または免疫抑制剤を含む合成ナノキャリアの少なくとも投与頻度および用量を含み得る。本明細書において提供される方法のいずれか１つは、プロトコルを決定するステップを含み得るかまたは、投与ステップは、本明細書において提供される所望される結果のいずれか１以上を達成するために決定されたプロトコルにより実施される。
本明細書において記載される組成物および方法は、がんなどの状態を有しているか、または有するリスクのある対象について使用され得る。がんの例は、限定されないが、乳がん；胆道がん；膀胱がん；神経膠芽腫および髄芽腫を含む脳がん；子宮頚がん；絨毛がん；結腸がん；子宮内膜がん；食道がん；胃がん；急性リンパ性白血病および例えば、Ｂ細胞ＣＬＬなどの骨髄性白血病を含む血液腫瘍；Ｔ−細胞急性リンパ性白血病／リンパ腫；ヘアリー細胞白血病；慢性骨髄性白血病、多発性骨髄腫；ＡＩＤＳ関連白血病および成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫；ボーエン病およびパジェット病を含む上皮内新生物；肝がん；肺がん；ホジキン病およびリンパ球性リンパ腫を含むリンパ腫；神経芽細胞種；扁平上皮細胞がんを含む口腔がん；上皮細胞、間質細胞、生殖細胞および間葉系細胞に由来して発生するそれらを含む卵巣 がん；膵がん； 前立腺がん；直腸がん；平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、脂肪肉腫、線維肉腫、および骨肉腫を含む肉腫；黒色腫、メルケル細胞がん、カポジ肉腫、基底細胞がん、および扁平上皮細胞がん、を含む皮膚がん；セミノーマ、非セミノーマ（奇形腫、絨毛腫）、間質性腫瘍、および生殖細胞腫瘍などの胚性腫瘍を含む精巣がん；甲状腺の腺がんおよび髄様がんを含む甲状腺がん；および腺がんならびにウィルムス腫瘍を含む腎がんを含む。
本開示の別の側面は、キットに関する。いくつかの態様において、キットは、本明細書において提供される組成物のいずれか1つ以上を含む。いくつかの態様において、キットは、免疫抑制剤、合成ナノキャリアおよびｒＩＴを含む。キットは、いくつかの態様において、チェックポイント阻害剤をさらに含んでいてもよい。一態様において、免疫抑制剤は、合成ナノキャリアにカップリングしている。キットの様々な成分は、キット中の別々の容器内にそれぞれ含有され得る。いくつかの態様において、容器は、バイアルまたはアンプルである。いくつかの態様において、キットの成分は、成分がその後に容器に加えられてもよくあるために、容器とは別の溶液中に含有されている。いくつかの態様において、キットの成分は、その後に再構成されてもよくあるために、別の容器において凍結乾燥形態中にある。いくつかの態様において、キットは、カップリング、再構成、混合、投与などについての指示をさらに含む。いくつかの態様において、指示は、本明細書において記載される方法の説明をさらに含む。指示は、例えば、印刷された折込みまたはラベルといったいずれかの好適な形態であり得る。いくつかの態様において、キットはさらに１つ以上のシリンジまたは合成ナノキャリアおよびｒＩＴおよび／またはチェックポイント阻害剤の投与のための他の手段をさらに含む。好ましくは、組成物（単数または複数）は、本明細書において提供されるようないずれか1つ以上の用量を提供するための量である。
例
例１：免疫抑制剤を含む合成ナノキャリアの合成（仮想）
ラパマイシンなどの免疫抑制剤を含む合成ナノキャリアは、当業者にとって公知のいずれかの方法を使用して産生される。好ましくは、本明細書において提供される方法または組成物のいずれか１つのいくつかの態様において、免疫抑制剤を含む合成ナノキャリアは、米国公開番号ＵＳ２０１６／０１２８９８６Ａ１および米国公開番号ＵＳ２０１６／０１２８９８７Ａ１に記載の方法のいずれか１つにより産生され、かかる産生の記載された方法およびもたらされた合成ナノキャリアは、その全体において参照により本明細書に援用される。本明細書において提供される方法または組成物のいずれか１つにおいて、免疫抑制剤を含む合成ナノキャリアは、かかる援用された合成ナノキャリアである。
例２：組換え免疫毒素と免疫抑制剤にカップリングされた合成ナノキャリアとの併用された投与（仮想）
ｒＩＴを、例のいずれか１つの合成ナノキャリア組成物として、共に、例えば同じ日に、臨床治験のために集められた対象に投与する。ｒＩＴに対する１以上の免疫応答を評価する。ｒＩＴに対する１以上の免疫応答のレベルは、合成ナノキャリア組成物の不在下（例えばｒＩＴが単独で投与される場合）においてｒＩＴを投与された対象、または対象の別のグループにおける１以上の免疫応答のレベルとの比較により、評価することができる。態様において、投与のいずれかのプロトコルを、同様の様式において評価する。
かかる治験の間に確立された情報の適用において、ｒＩＴ治療を必要とする対象に、かかる対象が、合成ナノキャリア組成物と共投与されなかった場合にｒＩＴに対する望ましくない免疫応答を有することが予測される場合に、ｒＩＴと合成ナノキャリア組成物とを共に投与することができる。さらなる態様において、ｒＩＴによる処置を必要とし、ｒＩＴに対する望ましくない免疫応答を有するか、合成のナノキャリア組成物の利益なしではこれを有することが予測される対象の、ｒＩＴおよび合成ナノキャリアの共投薬をガイドするために、治験の間に確立された情報を用いるプロトコルを準備することができる。このようにして準備されたプロトコルを、次いで、対象、特にヒト対象を処置するために用いることができる。
例３：寛容原性な合成ナノキャリアは、免疫原性を軽減することにより組換え免疫毒素の抗腫瘍活性を復元する。
ｒＩＴの免疫応答は、完全な免疫系を有するがん患者における、例えば、固形腫瘍に対するそれらの効果を制限する主要な要因である。ここで、合成ナノキャリアに封入されたラパマイシン（ＳＶＰ−Ｒ）を使用するｒＩＴについての抗原特異的な免疫寛容が研究された。これらのナノキャリアは、ＰＥＧ化表面のコロナを有する生分解性のポリ（乳酸）コアを含んでいる。ＳＶＰ−Ｒは、ナイーブマウスにおいて、ＬＭＢ−１００に対するＡＤＡ形成を妨げる、長続きする、特異的で、移植可能な免疫寛容を産生すること、およびｒＩＴへの以前から存在する抗体を有するマウスにおいてＡＤＡを低減させることが示された。ＬＭＢ−１００への免疫寛容の誘導は、そうでなければＡＤＡによる無効化されるだろう正常な免疫応答を有するマウスにおいて、同系の中皮腫腫瘍モデルにおける抗腫瘍活性の復元をもたらした。
ＬＭＢ−１００とＳＶＰ−Ｒの組み合わせにより、ＡＤＡ応答が妨げられる。
ラパマイシンを含む合成ナノキャリアのＬＭＢ−１００へのＡＤＡ応答上の効果を評価する（図２Ａ）ために、ＢＡＬＢ／ｃマウスに隔週で、ＬＭＢ−１００またはＬＭＢ−１００＋ＳＶＰ−Ｒの組み合わせを注入した。ＬＭＢ−１００は、マウスではなくヒトで応答を減じる変異を有する。１４週目に平均力価１０，９７５±２３７２のＬＭＢ−１００（図２Ｂ）を注入したマウスは、強力で迅速なＬＭＢ−１００への応答を有し、ＬＭＢ−１００がＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて免疫原性であることを示している。
ＬＭＢ−１００＋ＳＶＰ−Ｒを注入したすべてのマウスは、実験の全過程の間中検出感度以下の力価を有しており、ＡＤＡ形成の効果的な防止を示している。さらに、ＬＭＢ−１００を７回注入し、ＳＶＰ−Ｒを最初の３回の注入と共にのみ与えたマウスは、１４週目に平均力価３７１±３０１を有しており、免疫寛容の誘導を示していた。４用量のみの後の８週目（ｐ＝０．０３）および７用量の後の１４週目（ｐ＝０．０００６）の両方で、この力価は、ＬＭＢ−１００を単独で処置された対照マウスの力価よりも著しく低かった。実験を通したそれぞれのマウスの曲線下面積（ＡＵＣ）は、ＡＤＡ応答を比較するために計算され（図３Ａ）、３用量（ｐ＝０．００１）または７用量（ｐ＝０．００２）のＳＶＰ−Ｒを与えたマウスにおいて、著しく減少していることを説明した。マウスは、重量の減少が有意に観察されず、処置に十分に耐えた（図３Ｂ）。
ＳＶＰ−Ｒ免疫化のタイミングは、免疫寛容のために重要である。
患者において使用されるものと類似したＳＶＰ−ＲとＬＭＢ−１００のレジメンの効果を決定するために、マウスに連続的なサイクルでＬＭＢ−１００を処置した。それぞれのサイクルは週当たり３用量（ＱＯＤｘ３）を隔週でからなり、第一および第二サイクル中に、マウスにＳＶＰ−Ｒを１回、２回または３回注入した（図２Ｃ）。サイクル毎のＳＶＰ−Ｒの単一用量が、ＡＤＡ形成の防止において３用量と同じ有効性である（ｐ＝０．００３）ことが見出された。ＬＭＢ−１００を単独で受けたマウスにおける力価の中央値は、４７，９２６であり、２処置サイクルにわたってＬＭＢ−１００＋ＳＶＰ−Ｒをそれぞれ２、４、または６回与えられて免疫化されたマウスにおける８８１、１９５８および９９３しかないものと比較した。さらなるＳＶＰ−Ｒの処置なしのＬＭＢ−１００を３回追加した抗原投与をマウスに行ったときに、ＡＤＡ抑制もまた維持されていた。６用量のＬＭＢ−１００＋ＳＶＰ−Ｒに、マウスは著しい重量の損失なしに良好な耐用性を示した（図３Ｃ）。
ＳＶＰ−Ｒ処置のタイミングの効果は、ＳＶＰ−Ｒを注入した日のよろめきにより評価された。５サイクルのそれぞれ１、３、および５日目にＬＭＢ−１００を注入し、それぞれのサイクルの１日目、３日目、１＋３日目、３＋５日目、または１＋３＋５日目にＳＶＰ−Ｒを併用して投与した（図２Ｄ）。ＬＭＢ−１００を処置された対照マウスは、５処置サイクルの終わりに４４，１３２の平均力価を示した。これに対して、１日目にＳＶＰ−Ｒを受けたマウスは、それぞれのサイクルの間中の１、２または３用量のＳＶＰ−Ｒを受けたかどうかに関わらず、ＡＤＡ形成において、それぞれ平均力価１，４１３±４９５（ｐ＝０．０００７）、２，９５２±１，３２０（ｐ＝０．００１）および１，９７９±８０７（ｐ＝０．０００７）と著しい減少を示した。３日目または３＋５日目にＳＶＰ−Ｒを受けたマウスは、それぞれ２９，３４１±１１，７０５および４１，９３４±９，７２５という最終力価を有し、このことはそれぞれのサイクルの１日目のＳＶＰ−Ｒとの併用処置がＡＤＡ形成を妨げるために重要であることを示している。
ＳＶＰ−Ｒを、ＬＭＢ−１００、ＳＳ１Ｐの免疫原性前駆体の多さにおいてもまた評価した。マウスに、１、３および７日目に３用量のＳＳ１Ｐを注入し（図４）、１日目にＳＶＰ−Ｒを与えた。３サイクルのＳＳ１Ｐは平均ＡＤＡ力価３７，７３４±２１，７４８を誘導し、単一サイクルのＳＶＰ−Ｒは、これらのＡＤＡを完全に妨げる（ｐ＝０．０００１）。
ＡＤＡ応答は、Ｆａｂおよび毒素の両方を無効化し、標的化する。
ＡＤＡが免疫毒素を無効化できているかどうか検出するために、機能的なin vitroの無効化アッセイを、ＬＭＢ−１００（１５用量）、ＳＶＰ−Ｒ（６用量）を伴うＬＭＢ−１００（１５用量）またはビヒクルのいずれかを注入したマウスからの血漿試料を使用して実施した。血漿試料を様々な濃度のＬＭＢ−１００と混合し、ＫＬＭ−１ヒト膵臓細胞に加えた。細胞は、ＬＭＢ−１００に対し感受性が非常に高く、ＩＣ５０が１．１ｎｇ／ｍｌであった（図２Ｅ）。ＬＭＢ−１００単独で免疫化されたマウスからの血漿は、ＬＭＢ−１００の活性を阻害し、ＩＣ５０が９３．２ｎｇ／ｍｌ（ｐ＜０．０００１）に変化した。このことは、ＡＤＡが無効化されたことを示している。これに対して、ＬＭＢ−１００＋ＳＶＰ−Ｒ血漿とＬＭＢ−１００のインキュベーションは、ＩＣ５０が５０倍低く（ｐ＜０．０００１）、ビヒクル処置されたマウスからの血漿とＬＭＢ−１００をインキュベーションしたＩＣ５０と著しく異ならない（図５Ａ）ことを示した。抗ＬＭＢ−１００力価およびＩＣ５０との間の強い相関（Ｒ２＝０．９６）が、観察された（図５Ｂ）。
ＬＭＢ−１００に対するＡＤＡが、Ｆａｂ、毒素フラグメントまたは両方を標的化するかどうか決定するために、毎週ＬＭＢ−１００単独で、またはＳＶＰ−Ｒと組み合わせて５用量注入されたマウスからの血漿（ｎ＝８）を、ＬＭＢ−１００、ヒトＦａｂまたはＬＭＢ−１００において見出された、マウスＦｖと融合した、外毒素Ａ（ＰＥ２４）の同じドメインＩＩＩを含有する免疫毒素（抗ＴａｃＦｖ−ＰＥ２４）でコーティングされたプレート上でアッセイした。抗ＬＭＢ−１００血漿は、免疫毒素の成分の両方と反応した（図２Ｆ）。予期していいた通り、ＳＶＰ−Ｒは両方の成分の応答を低減させた。
ＬＭＢ−１００とＳＶＰ−Ｒの組み合わせは、特異的な、および移植可能な免疫寛容を誘導する。
ＡＤＡ形成の抑制が、古典的免疫抑制よりむしろ抗原特異的な免疫寛容の結果であることを決定するために、マウスに週８回のＬＭＢ−１００の注射および１、２、および３週目の３用量のＳＶＰ−Ｒ（ｉ．ｖ．）により免疫化した。４週目に、マウスに週４回のオボアルブミンおよびＬＭＢ−１００（ｓ．ｃ．）の注入を抗原投与した（図６Ａ）。ＬＭＢ−１００＋ＳＶＰ−Ｒの組み合わせは、選択的にＬＭＢ−１００に対するＡＤＡ形成を阻害するが、オボアルブミンへの抗体応答に影響せず、４，３６２および４，０２４の類似の抗オボアルブミン力価という結果をもたらした。これらの結果は、ＳＶＰ−Ｒを伴うＬＭＢ−１００の組み合わせが、投与後に別の抗原に対する免疫応答をしかけるマウスの能力を抑制しない、特異的免疫寛容を誘導することを示す。
免疫寛容が、寛容マウスからナイーブマウスへと移植され得るかどうか、テストするために、ドナーマウスに、２サイクルのＬＭＢ−１００、ＳＶＰ−ＲまたはＬＭＢ−１００＋ＳＶＰ−Ｒのいずれかを処置した。ＬＭＢ−１００＋ＳＶＰ−Ｒを処置したマウスの５１±２５と比べて、ＬＭＢ−１００単独で免疫化されたマウスは、平均力価４５２１±１９９４を示した（図７）。脾細胞を単離し、集め、およびナイーブレシピエントマウスに移植された（図６Ｂ）。細胞の注入の１週間後、すべてのレシピエントマウスに、２サイクルのＬＭＢ−１００を抗原投与した。レシピエントマウスのＬＭＢ−１００抗原投与に続いてＬＭＢ−１００で免疫化したマウスからの細胞の養子移入は、平均力価４８８４±１５４８を誘導し、このことはビヒクル処置されたマウスからの細胞を受けた、または細胞を受けていないマウスにおける力価（それぞれ、平均力価４５７１±１４９４および６５４１±３０７９）と大きく異なっていなかった。養子移入は、強固な免疫記憶を誘導しなかった。３つのマウスのグループは、類似の平均力価を有していたため、これらのマウスを対照と呼ぶ。
これに対して、ＬＭＢ−１００＋ＳＶＰ−Ｒの組み合わせで免疫化されたマウスからの１０ｘ１０６の脾細胞の養子移入は、対照と比べて７８％〜８５％力価が減少した（それぞれ、ｐ＝０．００７、０．００３および０．０２）。２．５ｘ１０６の脾細胞の養子移入は、力価が４４％〜６１％低減したが、統計的に有意ではなかった（ｐ＝０．５）。ＳＶＰ−Ｒを処置されたマウスからの脾細胞を受けたマウスの平均力価は、対照マウスと異ならなず、このことは寛容の誘導が、ドナーマウスにおいて、ＬＭＢ−１００およびＳＶＰ−Ｒの両方を必要とし、一般的な免疫抑制に起因しないことを示した。
Ｔｒｅｇ細胞の枯渇
ＳＶＰ−Ｒ誘導性免疫寛容におけるＴｒｅｇ細胞の役割を研究するために、Ｔｒｅｇ細胞を、ＳＶＰ−Ｒ寛容誘導の後にin vivoで枯渇した。マウスにＬＭＢ−１００またはＬＭＢ−１００＋ＳＶＰ−Ｒを３回注入した。１５および１６日目に、抗ＣＤ２５（ＰＣ６１）枯渇性抗体２３を使用して、Ｔｒｅｇ細胞を枯渇させ、さらに２サイクルのＬＭＢ−１００を抗原投与した（図６Ｃ）。Ｔｒｅｇの枯渇は、ＳＶＰ−Ｒの寛容原性効果を無効にし、平均力価を４１６±１５７から１０９４±３０４へと増加させた（ｐ＝０．０４）。この力価１０９４は、ＳＶＰ−Ｒを受けていないマウスにおける力価（１３４８±３９９）と類似していた。
Ｉｇサブクラス
クラススイッチ上のＳＶＰ−Ｒの効果を研究するために、血漿試料をＬＭＢ−１００特異的ＩｇＧおよびＩｇＭ抗体について特徴づけた（図６Ｄ）。ＬＭＢ−１００の免疫化により、ＩｇＧ１をもっとも有力なものとして、すべてのＩｇＧサブクラスにわたって分布したＡＤＡを誘導された。このサブクラス分布は、ペアレント免疫毒素ＳＳ１Ｐの免疫化後に前もって記載されたＩｇＧサブクラス分布に類似している２４。ＬＭＢ−１００＋ＳＶＰ−Ｒの免疫化は、ＬＭＢ−１００特異的なＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂまたはＩｇＧ３抗体の検出感度以下のシグナルを誘導した。興味深いことに、抗ＬＭＢ−１００ＩｇＭ抗体のレベルは、ＬＭＢ−１００単独で免疫化されたマウスにおけるレベルと類似していた。これらの結果は、ＳＶＰ−Ｒが、アイソタイプスイッチを妨げるが、ＩｇＭ産生を妨げないことを示す。
ＬＭＢ−１００とＳＶＰ−Ｒは、樹状細胞およびマクロファージ上に優先的に共存する。
脾臓におけるＳＶＰ−ＲおよびＬＭＢ−１００の結末を決定するために、in vivoでの注入の後に、Ａｌｅｘａ−４８８標識ＬＭＢ−１００およびＣｙ５標識ＳＶＰ−Ｒを連続して注入し、脾細胞を注入２時間後に単離した（図８Ａ）。示されたゲーティング戦略に従い細胞マーカーを使用して細胞表現型を分析した。ＬＭＢ−１００およびＳＶＰ−Ｒの取り込みを、マクロファージ、ＤＣ、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞、Ｂ細胞、好中球および単球において比べた（図８Ｂ〜８Ｄ）。マクロファージおよびＤＣにおいて、ＬＭＢ−１００およびＳＶＰ−Ｒ両方の取り込みが最も高いことが見出され、ＬＭＢ−１００については、３８％のマクロファージおよび１３％のＤＣが陽性であり、ＳＶＰ−Ｒについては、２９％のマクロファージおよび１１％のＤＣが陽性であった。興味深いことに、２２％マクロファージのおよび９％のＤＣにおいて両方が陽性に染まっていた。この共存は、２剤が別個に注入されたときであっても発生した。相対的な細胞数は、変化しなかった（表１）。ＣＤ１１ｂｈｉｇｈ、Ｌｙ６Ｃ＋およびＬｙ６Ｇ−を発現する単核球細胞は、免疫抑制活性に関係する２５、２６。これらの細胞の３％が、ＬＭＢ−１００およびＳＶＰ−Ｒ両方の取り込みを実証することが見出された。最終的に、リンパ球および好中球において、最も低い共存のパーセンテージを表示した（図８Ｄ）。これらの結果をあわせると、ＳＶＰ−ＲおよびＬＭＢ−１００のプロフェッショナル抗原提示細胞による優先的な取り込みが、免疫寛容を仲介するだろうことを示唆している。
表１．マウス脾臓におけるＬＭＢ−１００およびラパマイシンを含む合成ナノキャリアの注入２時間後の細胞充実度
ＬＭＢ−１００とＳＶＰ−Ｒの組み合わせは、以前から存在する抗体を有するマウスにおいて、ＡＤＡ応答を妨げる。
ＳＶＰ−Ｒが、免疫原性を低減し、ｒＩＴへのＡＤＡが以前から存在するマウスにおいて、免疫寛容を誘導し得ることを確認するために、以前から存在するＡＤＡを誘導するために、１および３週の間にマウスにＬＭＢ−１００を６回免疫化した。９週目に、マウスは平均力価７４１±６６を有しており、類似の平均力価を有する３グループに分けた。１０週目に、該グループを、ビヒクル（ＰＢＳ）、ＬＭＢ−１００またはＬＭＢ−１００＋ＳＶＰ−Ｒで免疫化した。力価を１２週目に評価した。ＬＭＢ−１００単独での抗原投与は、強い免疫応答記憶を誘導し、平均ＡＤＡ力価９８０８±３６０８をもたらした。これに対して、ＬＭＢ−１００＋ＳＶＰ−Ｒの抗原投与は、抗体の増加を妨げるだけでなく、増大前の力価（７３８±３２０、ｐ＝０．００３）と比べて、および１２週目にＰＢＳを注入したマウス（力価＝５０２±１４３、ｐ＝０．００２）と比べて、減少した（力価＝２５７±１２１）。この応答は、８グループ、８および４匹のマウスを用いた３つの追加実験において観察された。
ＳＶＰ−Ｒが、かかるマウスにおける後の抗原投与への応答を妨げ得る長期的な免疫寛容を誘導し得るかどうか評価するために、１３週目にマウスに３用量の追加のＬＭＢ−１００（ＳＶＰ−Ｒはなしで）を抗原投与した（図１０Ａ）。１４週目の力価の評価は、１０週目のＬＭＢ−１００＋ＳＶＰ−Ｒの投与が、ＬＭＢ−１００単独で処置されたマウスの力価（１１５０５±４１７２、ｐ＝０．０００１）より著しく低い、６３４±２６９という低い力価を維持することを示した。これは１０週目のＳＶＰ−Ｒ＋ＬＭＢ−１００の組み合わせが、後のＬＭＢ−１００の抗原投与への応答を妨げる免疫寛容を誘導したことを示している。
次に、ＳＶＰ−Ｒが、以前から存在するｒＩＴへの抗体の高い力価を低減するために使用することもまたできるかどうか評価した。１４週にわたる１２用量のＬＭＢ−１００により誘導された抗ＬＭＢ−１００抗体力価＞１０，０００を有する図１０Ａからの対照マウスに、ＬＭＢ−１００またはＬＭＢ−１００＋ＳＶＰ−Ｒを注入した（図１０Ｂ）。組み合わせの処置をされたマウスは、３１，１１４±１３，７３０から７，７９７±４，５５８という力価の著しい減少を有した（ｐ＝０．０２）。
以前から存在する抗体を有するマウスの組み合わせによる処置が骨髄（ＢＭ）中の抗体分泌血漿細胞の数に影響するかどうかを決定するために、マウスに以前から存在するｒＩＴへの抗体と、ＰＢＳ、ＬＭＢ−１００、ＳＶＰ−Ｒまたは２つの組み合わせで処置した。細胞を注入２４時間後のＢＭおよび脾臓から収集し、抗ＬＭＢ−１００抗体を産生する細胞の数をＥＬＩＳｐｏｔによりアッセイした（図１０Ｃ〜１０Ｄ）。すべてのマウスにおいてＢＭ中の抗体分泌細胞の数（平均＝９．６±６．７ＳＦＣ／１Ｅ６細胞）は類似しており、脾臓には検出可能なスポットはなかた。これらの結果は、ＳＶＰ−ＲはＢＭ中に存在する抗体分泌細胞に影響しないことを示している。
ＬＭＢ−１００とＳＶＰ−Ｒの組み合わせは、以前から存在する抗ＬＭＢ−１００抗体を有するマウスにおけるＬＭＢ−１００の抗腫瘍活性を復元する
腫瘍を有するマウスの免疫応答性におけるＬＭＢ−１００およびＳＶＰ−Ｒの活性を研究するために、ＡＢ−１マウス中皮腫細胞株２７にヒトメソテリンを安定的に遺伝子導入した（ＡＢ１−Ｌ９、図１１Ａ〜１１Ｂ）。ＢＡＬＢ／ｃマウスに接種されたＡＢ１−Ｌ９細胞は、急速に成長し、１５日で６００ｍｍ３のサイズに至った（図１２Ａ）。抗腫瘍活性を評価するために、腫瘍を有するマウスに、腫瘍が平均サイズ１９９ｍｍ３に至ったときに、ＬＭＢ−１００、ＳＶＰ−Ｒまたは２つの組み合わせを６回治療的に処置した。ＬＭＢ−１００を処置したマウス（黒い線）は、著しい腫瘍成長阻害を示し（ｐ＝０．００３、ＰＢＳで処置したマウスと比べた腫瘍成長曲線のＡＵＣについて）、１／７のマウスが完全に緩解した。ＳＶＰ−Ｒを処置したマウスは、少ない腫瘍成長の遅延のみ示した（ｐ＝０．０５）。しかしながら、ＬＭＢ−１００＋ＳＶＰ−Ｒは、最も著しい腫瘍成長阻害を誘導し（ｐ＝０．０００３）、２０日目の腫瘍サイズにおいて、１３倍の減少をもたらした。比較的短い免疫化のスケジュールに起因して、実験の１８日目に評価した際、すべてのマウスが非常に低いかまたは検出感度以下の力価のいずれかを有し（図１３Ａ）、したがってin vivo におけるＬＭＢ−１００の著しい無効化は観察されなかった。
ｒＩＴへの以前から存在する抗体を有するマウスにおいて、ＬＭＢ−１００およびＳＶＰ−Ｒの活性を研究するために、マウスに４回のＬＭＢ−１００を用いて最初の免疫化をし、ＡＢ１−Ｌ９の接種前に２５９７±２０８０の平均ベースライン力価を誘導した。腫瘍の接種５日後で、腫瘍が平均１３５ｍｍ３に至った際に、マウスにＬＭＢ−１００またはビヒクル（図１２Ｂ）を３回の注入を２サイクル、（隔週で）それぞれのサイクルの初日にＳＶＰ−Ｒの投与を伴ってかまたは伴わないで処置した。ＬＭＢ−１００単独で処置した腫瘍が、処置に応答せず、ＰＢＳで処置した腫瘍と類似の成長速度を有することを見出した。ＬＭＢ−１００への応答の欠如は、ＬＭＢ−１００の活性を無効化する高いＡＤＡ力価（図１２Ｃ）に起因すると考えられる。これに対して、ＳＶＰ−Ｒ＋ＬＭＢ−１００を処置したマウスは、ＬＭＢ−１００に優れた応答を有し、高いＡＤＡ力価を発揮しなかった。ＬＭＢ−１００＋ＳＶＰ−Ｒを処置したマウスは、より高い生存率を有した（６００ｍｍ３に至る時間）（ｐ＝０．０００１）（図１２Ｄ）。これらの実験は、１グループ当たり７匹のマウスを使用して２回以上繰り返し、類似の結果を得た。しかしながら、おそらくＡＤＡの無効化を妨げる結果としてＬＭＢ−１００への暴露が増加したことに起因して、ＬＭＢ−１００＋ＳＶＰ−Ｒを処置したマウスには、重量の減少が示された（図１４）。
ＳＶＰ−Ｒは腫瘍の成長速度を加速しない。
ＳＶＰ−Ｒをマウスに処置することが、腫瘍免疫に干渉し、および／または腫瘍成長を増強するかどうか試験するために、ＣＴ２６（マウスの結腸がん）および６６Ｃ１４（マウスの乳がん）細胞株を、免疫能の正常なＢＡＬＢ／ｃマウスの脇腹に接種し、ＳＶＰ−Ｒを処置したマウスにおける成長速度を、ＰＢＳ処置マウスのものと比較した（図１２Ｅ〜１２Ｆ）。ＳＶＰ−Ｒは、ＣＴ−２６の腫瘍の腫瘍成長を遅延させ、６６Ｃ１４の腫瘍の腫瘍成長において変化を示さなかった。
ＳＶＰ−Ｒは、ヒト細胞株においてＬＭＢ−１００の細胞毒性を増強する。
ラパマイシンが、抗腫瘍活性を有することもまた報告されたため、in vitroのヒト中皮腫細胞（ＨＡＹ）およびヒト膵細胞（ＫＬＭ−１）上の組み合わせの細胞毒性活性を測定した。両方の細胞株において、ＳＶＰ−Ｒはそれ自身によって（図１５Ａ）控えめな細胞毒性活性を有することを見出した。しかしながら、ＬＭＢ−１００と結びつけたとき、５μｇ／ｍｌのＳＶＰ−ＲはＬＭＢ−１００の細胞毒性活性を改善し、ＫＬＭ−１細胞のＩＣ５０を１．１ｎｇ／ｍｌから０．１ｎｇ／ｍｌへと（図１５Ｂ）、ＨＡＹ細胞上で１μｇ／ｍｌのＳＶＰ−ＲはＩＣ５０を２．９ｎｇ／ｍｌから０．９ｎｇ／ｍｌへと改善した（図１５Ｃ）。ＨＡＹ細胞生存率はまた、ＳＶＰ−Ｒ（２μｇ／ｍｌ）およびＬＭＢ−１００（０．４ｎｇ／ｍｌ）と共に７２時間のインキュベーション、次いで剤なしで７２時間のインキュベーションの後にクリスタルヴァイオレットで染色することにより評価された（図１５Ｄ）。組み合わせは、いずれかの単独の剤よりも、細胞を殺すことにおいて有効であった。
ＳＶＰ−Ｒ活性は、チェックポイント阻害剤または共刺激アゴニストによって減少しない。
抗ＣＴＬＡ−４アンタゴニスト抗体および抗ＯＸ−４０アゴニスト抗体が、ＬＭＢ−１００に対するＡＤＡの形成を増強し得ることを、このようなＡＤＡがＳＶＰ−Ｒによって阻害され得るかどうかと同様に調査した。マウスに毎週５用量のＬＭＢ−１００を注入し、抗マウスＣＴＬＡ−４抗体または抗ＯＸ−４０抗体を毎週５日目に与えた（図１６Ａ〜１６Ｂ）、ｎ＝８。両方の抗体が、ＬＭＢ−１００単独の処置に比べて、実質的に抗ＬＭＢ−１００ＡＤＡ力価の形成を増強することを見出した（抗ＣＴＬＡ−４および抗ＯＸ−４０についてそれぞれｐ＝０．００１およびｐ＝０．０２）。ＬＭＢ−１００と同日のＳＶＰ−Ｒの注入は、抗ＣＴＬＡ−４または抗ＯＸ−４０を処置したマウスにおいて、それぞれ力価の除去（平均力価が、検出限界未満であった）または飛躍的に１２倍の減少をもたらした。ＳＶＰ−Ｒ活性は、免疫チェックポイント阻害剤または共刺激アゴニストの活性によって、損なわれなかった。これらの実験は、ｎ＝５およびｎ＝３で２回以上繰り返され、類似の結果を得た。
免疫抑制対寛容
以前の研究において、患者においてｒＩＴの免疫原性を低減させるいくつかの免疫抑制アプローチを評価した。これらのアプローチは、リツキシマブを使用したＢ細胞の枯渇も含み、そのことが患者における、抗免疫毒素の免疫応答の予防２８またはシクロホスファミドおよびペントスタチンの組み合わせを使用したＢおよびＴ細胞の抑制を無効にした１４。このアプローチの成功は、免疫抑制剤の毒性により制限され、患者のうちのいくつかはＡＤＡ形成において遅延を有する一方で、ほとんどの患者において、処置を停止させる激しいＡＤＡ応答が発現した。
免疫寛容メカニズム
本研究において、ＳＶＰ−ＲがマクロファージおよびＤＣならびに比較的程度が低いものの単球などの専門の食細胞を特異的に標的化することを示している。これは、一般的な免疫抑制治療とは異なる。ＬＭＢ−１００は、専門の食細胞を特異的に標的化し、ＳＶＰ−Ｒと共存することが見出された（図８）。寛容は、Ｔｒｅｇの枯渇の後に無効になり（図６Ｃ）、Ｔｒｅｇ細胞により仲介される骨髄系細胞寛容のメカニズムを支持した。加えて、ＳＶＰ−Ｒが効果的にＩｇＧ抗体の応答を阻害する一方で、特異的ＩｇＭ抗体はＳＶＰ−Ｒにより阻害されなかった（図６Ｄ）。これは、Ｔｒｅｇ仲介メカニズムもまた支持する。
免疫抑制と寛容の間の主要な差別化要因は、他の抗原に対して免疫応答をしかける能力である。ＬＭＢ−１００およびＳＶＰ−Ｒの注入により寛容化されたマウスが、皮下注入された二次抗体へと免疫応答をしかけたことが見出された（図６Ａ）。マウスが、抗原投与の段階の間に両方が同時に、同容量、および同頻度で投与されたにも関わらず、ＬＭＢ−１００ではなく二次免疫原に免疫応答するという事実は、免疫系の全体的な抑制よりむしろＬＭＢ−１００に特異的な寛容を誘導することを示す。免疫抑制は、治療の中断の後に免疫系に長続きしない効果を与える薬剤により通例仲介される。免疫寛容は一方、薬剤の不在化において寛容を積極的に維持する調節性の細胞の誘導を伴う。ＬＭＢ−１００およびＳＶＰ−Ｒの組み合わせを処置したマウスから単離された脾細胞の移植は、ナイーブレシピエントマウス（図６Ｂ）においてＡＤＡ形成を妨げることが見出された。併せてデータは、ＬＭＢ−１００とＳＶＰ−Ｒの組み合わせが免疫寛容を誘導することを示唆している。
以前から存在する抗体モデルにおける活性
本発見は、ＳＶＰ−Ｒが抗ＬＭＢ−１００力価における増大を制御することに有効であっただけでなく、ｒＩＴとＳＶＰ−Ｒの組み合わせを伴う目立った長期の寛容（図１０Ａ〜１０Ｄ）を実際に説明していたことを示す。したがって、本明細書において提供される方法および組成物は、以前から存在するｒＩＴへの抗体を有する患者において（あるいはＳＳ１Ｐ、ＬＭＢ−１００またはモキセツモマブパスードトクスの以前の臨床試験に参加した患者においてでさえ）有益なものであるだろう。これらの試験における多くの患者は、はじめは免疫毒素治療に応答するが、応答はＡＤＡ形成に起因して停止した７、３０。
ラパマイシンおよびがん
ｍＴＯＲシグナルネットワークは、多数の腫瘍抑制遺伝子およびＰＴＥＮ、ＰＩＫ３およびＡＫＴ（３２において見直される）を含むがん原遺伝子を含有する。ここで、ＳＶＰ−Ｒが細胞毒性および免疫毒素の抗腫瘍活性を改善することが見出された（図１２Ａおよび１５Ａ〜１５Ｄ）。腫瘍部位での合成ナノキャリアからのラパマイシンの放出は、標的化された免疫毒素と協同することができる。
ＳＶＰ−Ｒは、腫瘍免疫原性に影響を与えない。
重要なことに、ＳＶＰ−Ｒ単独で免疫能の正常であるマウスにおける腫瘍の成長をより早めることを引き起こさなかった（図１２Ａ、１２Ｅ〜１２Ｆ）。これらの観察は、腫瘍に対する寛容を誘導するかまたは腫瘍の成長をより早めるＳＶＰ−Ｒの潜在的な安全性への懸念を緩和する。
チェックポイント阻害剤の３重の組み合わせ
ＬＭＢ−１００に対するＡＤＡ形成の徴候ならびに強度、およびＳＶＰ−Ｒのこれらの応答を妨げる能力における抗ＣＴＬＡ−４および抗ＯＸ−４０抗体の効果を評価した。抗ＣＴＬＡ−４チェックポイント阻害および抗ＯＸ−４０共刺激アゴニストの両方が、ＬＭＢ−１００のＡＤＡの形成を促進し、増強することが見出された（図１６Ａ〜１６Ｂ）。重要なことに、ＬＭＢ−１００の注入の日に与えられたＳＶＰ−Ｒは、これらの悪化した免疫原性応答を完全に根絶した。これらの免疫刺激性ｍＡｂが、ＳＶＰ−Ｒの寛容原性活性を損なわなかったという事実は、寛容原性シグナルが、本明細書において提供されるような組み合わせの治療の状況においてこれらの免疫療法の抗体により無効にされないことを示唆する。
材料および方法
ＬＭＢ−１００およびＳＶＰ−Ｒ
ＬＭＢ−１００を以前に記載したように製造した４１。ＳＶＰ−Ｒを、５００μｇ／ｍｌのラパマイシン含有量で以前に記載したように製造した１９。
動物実験
雌のＢＡＬＢ／ｃＡｎＣｒマウス（８〜１４週齢）を使用した。マウスに、他に記載がない限りは、抗原およびＳＶＰ−Ｒを静脈内に注入した。マウスに、それぞれの実験に示されたスケジュールに従って注入し（ｒＩＴをＳＶＰ−Ｒの後に５回注入した）、下顎の出血により血漿試料を収集した。マウスの重量を毎週測定した。あらゆるマウスの研究は、同齢の対照グループを用いて実施した。
腫瘍実験について、雌のＢＡＬＢ／ｃに、ＲＰＭＩ中の１ｘ１０６のＡＢ１−Ｌ９細胞または１ｘ１０６のＣＴ２６細胞（ＡＴＣＣ）を脇腹に、もしくはＩＭＤＭ培地中の０．５ｘ１０６の６６Ｃ１４細胞を***体に接種した。腫瘍サイズを２または３日ごとにカリパスを使用して測定した。腫瘍の負担が体重の１０％を超える経験をした場合に、マウスを安楽死させた。統計分析から除外された動物はなかった３７。
Ｔｒｅｇ細胞の枯渇について、２００μｇの抗マウスＣＤ２５枯渇性抗体（クローンＰＣ６１）またはアイソタイプ対照（クローンＴＮＰ６Ａ７）（共にBioXCellから購入した）を以前に記載したように腹腔内（ｉ．ｐ．）の注入により実施した２３。
抗ＣＴＬＡ−４（Roche ＩｇＧ２Ａ、クローン９Ｄ９）が提供され、抗ＯＸ４０（クローンＯＸ−８６、InVivoPlus、BioXCell）を購入した。抗体をＰＢＳで希釈し、示すスケジュールのように５ｍｇ／ｋｇを腹腔内に注入した。
同系のマウスモデルの開発
細胞を、免疫能の正常なＢＡＬＢ／ｃマウスの脇腹の皮下に（ｓ．ｃ．）接種した。しかしながら腫瘍の５０％のみが、おそらくはヒト導入遺伝子の免疫拒絶に起因して成長した。ひとたびマウスのいくつかにおいて腫瘍の体積が２００ｍｍ３に至ると、腫瘍を切除し、ダイジェストし、選別のためにピューロマイシンを含む９６ウェルプレートでクローニングした。１５の単一クローンを得て、＞９５％の移植成功を有するマウスにおいて、最も高い幾何平均値を有するクローン（図１３Ａ）を、成長について評価した。
細胞をＬＭＢ−１００で処置することおよびWST-8 cell counting kitを使用して７２時間後のそれらの生存能力を評価することにより、ＡＢ１−Ｌ９細胞の細胞毒性活性を評価した（図１３Ｂ）。ＬＭＢ−１００がＡＢ１−Ｌ９を１０．６ｎｇ／ｍｌのＩＣ５０で死なせることが見出された。
細胞毒性および無効化アッセイ
ＫＬＭ１膵臓細胞株が提供された（NCI、Bethesda、MD）。ＨＡＹ中皮腫細胞がthe Stehlin Foundation for Cancer Research（Houston、TX）により提供された。細胞を、１０％のＦＣＳ、１％のＬ−グルタミンおよび１％のペニシリン／ストレプトマイシンを付加したＲＰＭＩ培地にて培養した。細胞を、９６ウェル平底プレートに２４時間播種した（５，０００細胞／ウェル）。細胞を、様々な濃度のＬＭＢ−１００、ＳＶＰ−Ｒまたは４つのレプリカの両方で処置した。７２時間後の細胞生存率を、ＷＳＴ細胞生存率アッセイ（Dojindo Molecular Technologies Inc,）を製造元の指示に従って使用して評価した。色の変化を、吸光度（Ｏ．Ｄ．）４５０ｎｍで評価した。Ｏ．Ｄの読み取りを生存能力０〜１００％の間に標準化した。１００％の生存能力は処置がないことを表しており、０％はスタウロスポリン（Sigma-Aldrich）陽性対照を表している。
無効化アッセイを以前に記載したようにＫＬＭ１細胞を使用して実施した４２。２１匹のマウスからの血清試料を１：５０に希釈した。
ＥＬＩＳＡ
総Ｉｇ抗ＬＭＢ−１００および抗Ｏｖａ抗体：血漿試料をヘパリン処置したチューブ中に収集し、スピンし、力価の評価まで凍結した。総Ｉｇ抗ＬＭＢ−１００および抗Ｏｖａ抗体を以前に記載したようにＥＬＩＳＡ直接法により測定した４２。
抗ＬＭＢ−１００および総Ｉｇのアイソタイプ決定：ＥＬＩＳＡプレート（Thermo Fisher）を、２μｇ／ｍｌのＬＭＢ−１００またはポリクローナルロバ抗マウスＩｇＧ（Jackson Immuno Research Laboratories, Inc.）でコーティングした。プレートをブロッキングし、連続希釈した血漿を１時間インキュベートした。血漿中の捕捉抗体を、それぞれ１：３，０００、１：４，０００、１：４，０００、１：３０００および１：１６，０００の希釈のヤギ抗マウスＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３およびＩｇＭアイソタイプキット（Sigma）に結合させて、抗ヤギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ＨＲＰ（１：１５，０００）（Jackson Immuno Research Laboratories, Inc.）を検出に用いた。
Ｆａｂまたは毒素フラグメントに対するＡＤＡ：２μｇ／ｍＬのＬＭＢ−１００のＦａｂ部位、またはＬＭＢ−１００の脱免疫化された（deimmunized）毒素フラグメントに結びついた無関係のエピトープ（抗Ｔａｃ）を標的化するマウスｓｃＦｖを含有する２μｇ／ｍＬのＲＩＴで、ＥＬＩＳＡプレートをコーティングした。ＡＤＡの決定は、上記に記載されたように実施された。ウェルのＯ．Ｄ．を、Ｈ２ＳＯ４停止溶液を加えた後に６５０ｎｍを引いた４５０ｎｍの波長で直接に読み取った。力価を、４パラメータロジスティック曲線適合グラフおよび抗ＬＭＢ−１００（ＩＰ１２）１５または抗Ｏｖａ（クローンＴＯＳＧ１Ｃ６、Biolegend）標準曲線の最大値の半値上の補間に基づいて計算した。
細胞株のヒトメソテリン遺伝子導入および腫瘍接種
ＡＢ−１マウス中皮腫細胞株（Sigma）に、ヒトメソテリンｃＤＮＡ３７を製造者のプロトコルに従ってLipofectamine LTX/PLUS reagent（Invitrogen）により安定して遺伝子導入した。遺伝子導入された細胞について、上位５％の高発現細胞をＦＡＣＳにより３回区分した。ＬＭＢ−１００／ＳＳ１Ｐ感受性の単一クローンを、次いで区分された細胞の集団から単離した。クローンＡＢ１−Ｌ９（５ｘ１０６）を１００μｌのＰＢＳ中で、ＢＡＬＢ／ｃマウスに接種した。腫瘍の体積が２００ｍｍ３に至ったときに、腫瘍を切除した。ダイジェストした腫瘍を以前に記載したように調製した４３。ＡＢ１−Ｌ９細胞の単一クローンを作るために、ダイジェストした腫瘍を、希釈し（０．５細胞／１００μｌ）、選択試薬を含む９６ウェル培養皿上に１００μｌずつ分画した。１５単一クローンを得て、最も高い幾何平均値を有するクローンを選択した。最終クローンを、ＢＡＬＢ／ｃマウスの皮下に注入し、９５％以上の腫瘍がＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて成長したことを確認した。
Ｂ細胞ＥＬＩＳｐｏｔ
基底膜（ＢＭ）を、８匹の免疫化されたマウスの大腿部から抽出した。ＢＭを洗浄し、７０ｍｍのメッシュのフィルターを通し、レーザー照射してＲＢＣを除去した。細胞を、熱不活性化ＦＣＳ、１％のＬ−グルタミンおよび１％のペニシリン／ストレプトマイシンを付加した加温したＲＰＭＩ中で再懸濁した。ＰＶＤＦプレート（０．４５ｕｍ）（Mabtech）を２μｇ／ｍｌのＬＭＢ−１００で１８時間コーティングし、洗浄し、アッセイ培地で３７℃２時間ブロッキングした。６レプリカのそれぞれのＢＭ試料を、１００，０００細胞／ウェルの濃度で播種し、４時間インキュベートした。抗ＬＭＢ−１００抗体を分泌するＢ細胞を示すスポットを、捕捉抗マウスＩｇビオチン化抗体（Mabtech）で、続いてＡＬＰおよびＢＣＩＰ／ＮＴＰ基質（KPL）を使用して検出した。
コンピュータ支援画像解析（Immunospot5.0; Cellular Technology Limited）によりスポットを計数した。結果は、ＳＦＣ／１Ｅ６細胞において示される。
フローサイトメトリー
脾臓は、Ａｌｅｘａ４８８で標識されたＬＭＢ−１００、Ｃｙ５で標識されたＳＶＰ−Ｒまたは両方のいずれかで免疫化されたマウス、または未処置マウスから解剖された。脾細胞は、リベラ―ゼ（Roche）、ＤＮＡａｓ（Roche）およびコラゲナーゼ（Roche）を付加された培地３ｍｌを脾臓へ注入することにより、抽出され、続いて３７℃で１０分のインキュベーションをした。脾臓は細かく切り刻まれ、７０ｍｍのメッシュを通し、洗浄し、ＲＢＣをライセートした。全細胞は、トリパン（trypen）ブルーにより＞９０％生存していた。細胞を、固定し、洗浄し、Biolegendから得た以下の抗体を使用して以前に記載したように４４染色した：ＣＤ３（クローン１７Ａ２）、ＣＤ４（クローンＧＫ１．５）、ＣＤ８（クローン５３−５．８）、ＣＤ１９（クローン６Ｄ５）、Ｂ２２０（クローンＲＡ３，６Ｂ２）、ＣＤ１１ｃ（クローンＮ４１８）、ＩＡＩＥ（クローンＭ５／１１４．１５．２）、ＣＤ１１ｂ（クローンＭ１／７０，）、Ｌｙ６Ｇ（クローン１Ａ８５）、およびＬｙ６Ｃ（クローンＨＫ１．４）。データは、FACS CANTO IIフローサイトメーター（BD Bioscience）で収集され、FLOWJOバージョンＸ（Treestar）で分析した。
統計分析
統計分析およびグラフを、Graph Pad Prismを使用して計算した。パラメーター変数の多重比較について、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を使用した。２つのノンパラメトリックな変数の比較について、マン・ホイットニーを使用し、多重ノンパラメトリックな変数について、フリードマン試験とダンの多重比較を使用した。
例４：ラパマイシン含有ナノキャリアは、長期のＬＭＢ−１００の免疫原性を妨げる。
図１７において示されるように、ＬＭＢ−１００およびラパマイシンを含む合成ナノキャリアの両方の投与が、抗ＬＭＢ−１００抗体の応答を阻害した。さらに、および重要なことに、ラパマイシンを含む合成ナノキャリアは、ＰＢＳと比べて腫瘍の成長を増強させなかった（図１２Ｆ）。
長期記憶想起応答を妨げることにおける、ＬＭＢ−１００およびラパマイシン含有ナノキャリアの組み合わせの効力を評価するために、初期免疫応答とＬＭＢ−１００およびラパマイシン含有ナノキャリアの抗原投与との間の時間を増加させた。雌の免疫能の正常なＢＡＬＢ／ｃマウスに以下のスケジュールに従って処置した（表２）：
それぞれのグループには８匹のマウスがいた。用量は、５０μｇ／ｍＬのＬＭＢ−１００および１００μＬのラパマイシン含有ナノキャリア（静脈内に最初に注入されたナノキャリア）であった。血清を、血液試料から単離し、ＥＬＩＳＡにより抗ＬＭＢ−１００抗体について分析した。第２の出血からの血清を、抗ＬＭＢ−１００抗体について分析し、次いでマウスを、１１週目の処置の前に類似の平均抗ＬＭＢ−１００抗体力価を有するようにグループ分けをした。
抗原投与の前後の血清試料を分析し、結果を図１８Ａ〜１８Ｄおよび１９に示す。抗ＬＭＢ−１００抗体力価は、初回の免疫化に続く８週間の間衰えることはなかった。グループ１において、ＬＭＢ−１００およびラパマイシン含有ナノキャリアを伴う抗原投与は、抗原投与前の力価（出血２）（マン・ホイットニーのＵ検定、ｐ＜０．００５）に比べて、抗ＬＭＢ−１００抗体力価（出血３）を著しく低減させた。ＰＢＳの抗原投与は、抗体力価には影響がないことが見出された（マン・ホイットニーのＵ検定、ｐ＞０．０５）。さらに、ＬＭＢ−１００およびラパマイシン含有ナノキャリアを伴う抗原投与は、ＰＢＳの抗原投与およびＬＭＢ−１００の抗原投与の対照に比べて、抗ＬＭＢ−１００抗体力価を著しく低減させた（マン・ホイットニーのＵ検定、ｐ＜０．００５）。
例５：同系腫瘍のマウスモデル
ＢＡＬＢ／ｃおよびそのゲノムおよびいくつかの細胞中でヒトメソテリンを発現する遺伝子組換えマウスの２つのマウスモデルは、図２０Ａおよび２３Ａにおいて説明されたスケジュールに従って免疫化された。抗体が以前から存在する同系のＢＡＬＢ／ｃマウスモデルが、最初に調査された（図２０Ａ）。結果（図２０Ｂ）は、以前から存在する抗体は、ＬＭＢ−１００の飛躍的な無効化効果を誘導し、効果の損失をもたらす一方で、ＬＭＢ−１００がＡＢ−１細胞上の良好な抗腫瘍活性を有した。ラパマイシン含有ナノキャリアを伴うＬＭＢ−１００の投与（５０μＬの注入量において１ｍｇ／ｍＬ）は、ＡＤＡの形成を妨げ、抗腫瘍活性の飛躍的な復元をもたらした。しかしながら、このレジメンは対象における重量の損失をもたらした（図２１）。
抗体力価（図２２）に関しては、全３つのグループにおいて５日目の類似の平均力価から始めた。６用量のＬＭＢ−１００の後に、力価は５００倍に増加した。重要なことに、ＬＭＢ−１００（６回）およびラパマイシン含有ナノキャリア（２回）の組み合わせは、力価において著しい変化をもたらさず、ビヒクル対照グループにおいて見られた結果と類似していた。力価とＬＭＢ−１００の効果（腫瘍サイズによって反映された）において相関が観察された。
遺伝子組換えマウスモデルを使用して、類似のプロトコルに従事した（図２３Ａ）。ＢＡＬＢ／ｃモデルにおいて見られたものとの類似の結果が認められた（図２３Ｂ）。マウス重量に関して、組み合わせグループにおけるマウスで重量の損失が観察された（図２４）。ＬＭＢ−１００用量は、このモデルにおいてより低く（４０μｇ／マウス）、ＬＭＢ−１００およびラパマイシン含有合成ナノキャリアを処置した７匹のマウスのうち１匹が１５日目に死亡した。抗体力価に関して、異なる処置グループ間の力価の違いが、遺伝子組換えモデルにおいて観察された（図２５）。しかしながら、モデルにおける全体の力価は、ＢＡＬＢ／ｃモデルにおけるものよりも低かった。
例６：免疫毒素およびチェックポイント阻害剤の投与
マウスに、それぞれの週の第一日目にラパマイシンを含む合成ナノキャリアを伴って、または伴わないで毎週ＬＭＢ−１００を処置した。グループ２および３もまた、それぞれの週の第５日目に抗ＣＬＴＡ４抗体を受けた。結果は、ＬＭＢ−１００を単独で受けたマウス（グループ１）は５週目で約２０００の力価を発揮することを示す。ＬＭＢ−１００に抗ＣＴＬＡ４を加えたレジメンは、実質的に抗ＬＭＢ−１００応答を増加した（グループ２）。驚くべきことに、ＬＭＢ−１００と共にラパマイシンを含む合成ナノキャリアを投与することは、免疫賦活性のチェックポイント阻害剤の存在下（グループ３）においてさえ、抗毒素抗体応答を阻害した（図１６Ａ）。したがって、ラパマイシンを含む合成ナノキャリアは、逆にこれらの対象中の免疫賦活性のチェックポイント阻害剤によって影響を受けていない。
参照

Claims (85)

  1. がんを有する対象を処置するための方法であって、以下：
    ａ）対象において新生物形成に中立な寛容原性環境を作り出すこと、および
    ｂ）がんを処置する対象に組換え免疫毒素を投与すること、
    を含む、前記方法。
  2. がんが、非血液細胞がんである、請求項１に記載の方法。
  3. がんが、メソテリン発現がん細胞を含む、請求項１または２に記載の方法。
  4. がんが、中皮腫、膵臓腺がん、卵巣がん、肺腺がん、乳がんまたは胃がんである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 組換え免疫毒素が、免疫抑制療法を一切伴わずに対象または試験対象に投与されたときであれば、対象または試験対象において望ましくない免疫応答を生成するか、または生成すると予期される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 組換え免疫毒素が、免疫抑制剤を含む合成ナノキャリアを一切伴わずに対象または試験対象に投与されたときであれば、対象または試験対象において望ましくない免疫応答を生成するか、または生成すると予期される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 望ましくない免疫応答が、組換え免疫毒素に対する望ましくない抗体産生である、請求項５または６に記載の方法。
  8. 対象における新生物形成に中立な寛容原性環境が、対象に免疫抑制剤を含む合成ナノキャリアの投与により作り出される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
  9. 作り出された新生物形成に中立な寛容原性環境が、がんの成長を高めることなく組換え免疫毒素に対する望ましくない免疫応答が減少するか、または除去されるものである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
  10. 組換え免疫毒素の投与が繰り返される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
  11. 組換え免疫毒素の投与が少なくとも２、３回またはそれ以上の回数繰り返される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
  12. 新生物形成に中立な寛容原性環境が、組換え免疫毒素のそれぞれの投与の間中存在する、請求項１０または１１に記載の方法。
  13. 新生物形成に中立な寛容原性環境が、組換え免疫毒素のそれぞれの投与の間中作り出される、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の方法。
  14. 免疫抑制剤を含む合成ナノキャリアが、組換え免疫毒素の繰り返し投与の間中対象に少なくとも１回投与される、請求項１０〜１３のいずれか一項に記載の方法。
  15. 免疫抑制剤を含む合成ナノキャリアが、組換え免疫毒素の繰り返し投与の間中対象に少なくとも２回投与される、請求項１４に記載の方法。
  16. 免疫抑制剤を含む合成ナノキャリアが、組換え免疫毒素の繰り返し投与の間中対象に少なくとも３回投与される、請求項１５に記載の方法。
  17. 免疫抑制剤を含む合成ナノキャリアが、組換え免疫毒素の第一の投与と共にのみ投与される、請求項１０〜１３のいずれか一項に記載の方法。
  18. 組換え免疫毒素の投与が少なくとも２回あるとき、免疫抑制剤を含む合成ナノキャリアが、第一および第二の投与と共にのみ投与される、請求項１０〜１３のいずれか一項に記載の方法。
  19. 免疫抑制剤を含む合成ナノキャリアが、組換え免疫毒素のそれぞれの投与と共に投与される、請求項１０〜１６のいずれか一項に記載の方法。
  20. 免疫抑制剤を含む合成ナノキャリアの投与（単数または複数）が、組換え免疫毒素の投与と併用される、請求項８〜１９のいずれか一項に記載の方法。
  21. 免疫抑制剤を含む合成ナノキャリアの投与（単数または複数）が、組換え免疫毒素の投与と同時である、請求項８〜２０のいずれか一項に記載の方法。
  22. 合成ナノキャリアが、組換え免疫毒素より前に投与される、請求項２０または２１に記載の方法。
  23. 方法が、免疫抑制剤を含む合成ナノキャリアを伴わずに組換え免疫毒素を投与することをさらに含む、請求項８〜２２のいずれか一項に記載の方法。
  24. 組換え免疫毒素が、免疫抑制剤を含む合成ナノキャリアを伴わずに、少なくとも２、３回またはそれ以上の回数投与される、請求項２３に記載の方法。
  25. 免疫抑制剤を含む合成ナノキャリアと組み合わせた組換え免疫毒素の繰り返し投与が、少なくとも２または３サイクルあって、繰り返し投与のそれぞれのサイクルが請求項８〜２２のいずれか１つにおいて定義されているものである、請求項８〜２２のいずれか一項に記載の方法。
  26. 方法が、少なくとも２または３サイクル後に、免疫抑制剤を含む合成ナノキャリアを伴わずに組換え免疫毒素を投与することをさらに含む、請求項２５に記載の方法。
  27. 組換え免疫毒素が、少なくとも２または３サイクル後に、免疫抑制剤を含む合成ナノキャリアを伴わずに少なくとも２、３またはそれ以上の回数投与される、請求項２６に記載の方法。
  28. 組換え免疫毒素が、抗体、またはそれらの抗原結合性フラグメント、および毒素を含む、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の方法。
  29. 組換え免疫毒素のリガンドが、がんの細胞上で発現した抗原に特異的に結合する、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の方法。
  30. 抗原が、メソテリンである、請求項２９に記載の方法。
  31. 組換え免疫毒素の毒素が、細菌起源の毒素である、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の方法。
  32. 細菌起源の毒素が、Pseudomonasの 毒素である、請求項３１に記載の方法。
  33. 毒素が、Pseudomonasの外毒素Ａである、請求項３２に記載の方法。
  34. 組換え免疫毒素が、ＬＭＢ−１００である、請求項１〜３３のいずれか一項に記載の方法。
  35. 方法が、組換え免疫毒素の少なくとも１回の投与と併用して、チェックポイント阻害剤を投与することをさらに含む、請求項１〜３４のいずれか一項に記載の方法。
  36. チェックポイント阻害剤が、組換え免疫毒素の少なくとも１回の投与と同時には投与されない、請求項３５に記載の方法。
  37. チェックポイント阻害剤が、組換え免疫毒素の少なくとも１回の投与の２４時間以内に投与される、請求項３５または３６に記載の方法。
  38. チェックポイント阻害剤が、組換え免疫毒素のそれぞれの投与と併用して投与される、請求項３５〜３７のいずれか一項に記載の方法。
  39. チェックポイント阻害剤の投与またはそれぞれの投与が、組換え免疫毒素の投与またはそれぞれの投与の後に投与される、請求項３５〜３８のいずれか一項に記載の方法。
  40. チェックポイント阻害剤が、抗ＣＬＴＡ４抗体である、請求項３５〜３９のいずれか一項に記載の方法。
  41. チェックポイント阻害剤が、抗ＯＸ−４０抗体である、請求項３５〜３９のいずれか一項に記載の方法。
  42. 新生物形成に中立な寛容原性環境が、免疫抑制療法を伴わない組換え免疫毒素の投与後に作り出される、請求項１〜４１のいずれか一項に記載の方法。
  43. 組換え免疫毒素に対する望ましくない免疫応答が、免疫抑制療法を伴わない組換え免疫毒素の投与後に対象において存在する、請求項４２に記載の方法。
  44. 方法が、新生物形成に中立な寛容原性環境を作り出す前に、免疫抑制療法を伴わずに組換え免疫毒素を投与することをさらに含む、請求項４２または４３に記載の方法。
  45. 望ましくない免疫応答が、組換え免疫毒素に対する望ましくない抗体の産生である、請求項４２または４３に記載の方法。
  46. 方法が、がんを有するものとして対象を同定することをさらに含む、請求項１〜４５のいずれか一項に記載の方法。
  47. 対象が、新生物形成に中立な寛容原性環境を必要とするものである、請求項１〜４６のいずれか一項に記載の方法。
  48. 方法が、新生物形成に中立な寛容原性環境を必要とするものとして対象を同定することをさらに含む、請求項１〜４７のいずれか一項に記載の方法。
  49. 方法が、対象における組換え免疫毒素に対する望ましくない免疫応答を評価することをさらに含む、請求項１〜４８のいずれか一項に記載の方法。
  50. 免疫抑制剤が、ｍＴＯＲ阻害剤である、請求項６〜４９のいずれか一項に記載の方法。
  51. ｍＴＯＲ阻害剤が、ラパマイシンである、請求項５０に記載の方法。
  52. 免疫抑制剤が、合成ナノキャリアに封入されている、請求項６〜５１のいずれか一項に記載の方法。
  53. 合成ナノキャリアが、ポリマーナノキャリアを含む、請求項〜５２のいずれか一項に記載の方法。
  54. ポリマーナノキャリアが、ポリエステルまたはポリエーテルに接着したポリエステルを含む、請求項５３に記載の方法。
  55. ポリエステルが、ポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）、ポリ（乳酸−コ−グリコール酸）またはポリカプロラクトンを含む、請求項５４に記載の方法。
  56. ポリマーナノキャリアが、ポリエステルおよびポリエーテルに接着したポリエステルを含む、請求項５４または５５に記載の方法。
  57. ポリエーテルが、ポリエチレングリコールまたはポリプロピレングリコールを含む、請求項５４〜５６のいずれか一項に記載の方法。
  58. 合成ナノキャリアの集団の動的光散乱を使用して得られた粒子サイズ分布の平均が、１１０ｎｍより大きい直径である、請求項６〜５７のいずれか一項に記載の方法。
  59. 直径が、１５０ｎｍより大きい、請求項５８に記載の方法。
  60. 直径が、２００ｎｍより大きい、請求項５９に記載の方法。
  61. 直径が、２５０ｎｍより大きい、請求項６０に記載の方法。
  62. 直径が、５μｍより小さい、請求項５８〜６１のいずれか一項に記載の方法。
  63. 直径が、４μｍより小さい、請求項６２に記載の方法。
  64. 直径が、３μｍより小さい、請求項６３に記載の方法。
  65. 直径が、２μｍより小さい、請求項６４に記載の方法。
  66. 直径が、１μｍより小さい、請求項６５に記載の方法。
  67. 直径が、５００ｎｍより小さい、請求項６６に記載の方法。
  68. 直径が、４５０ｎｍより小さい、請求項６７に記載の方法。
  69. 直径が、４００ｎｍより小さい、請求項６８に記載の方法。
  70. 直径が、３５０ｎｍより小さい、請求項６９に記載の方法。
  71. 直径が、３００ｎｍより小さい、請求項７０に記載の方法。
  72. 合成ナノキャリア中に含まれる免疫抑制剤の負荷量が、合成ナノキャリア全体の平均で、０．１％と５０％（重量／重量）との間である、請求項６〜７１のいずれか一項に記載の方法。
  73. 負荷量が、０．１％と２５％との間である、請求項７２に記載の方法。
  74. 負荷量が、１％と２５％との間である、請求項７３に記載の方法。
  75. 負荷量が、２％と２５％との間である、請求項７４に記載の方法。
  76. 負荷量が、２％と１０％との間である、請求項７５に記載の方法。
  77. 合成ナノキャリアの集団のアスペクト比が、１：１、１：１．２、１：１．５、１：２、１：３、１：５、１：７または１：１０よりも大きい、請求項６〜７６のいずれか一項に記載の方法。
  78. 方法が、対象における組換え免疫毒素に対する免疫応答を、対象への投与前、投与中、または投与後に評価することをさらに含む、請求項１〜７７のいずれか一項に記載の方法。
  79. 投与することが、静脈内、腹腔内、または皮下投与によるものである、請求項１〜７８のいずれか一項に記載の方法。
  80. 組換え免疫毒素を含む１以上の用量、および免疫抑制剤を含む合成ナノキャリアを含む１以上の用量、
    を含むキット。
  81. キットが、チェックポイント阻害剤を含む１以上の用量をさらに含む、請求項８０に記載のキット。
  82. キットが、使用のための指示をさらに含む、請求項８０または８１に記載のキット。
  83. 使用のための指示が、請求項１〜７９のいずれか一項に記載の方法を実行するための指示を含む、請求項８２に記載キット。
  84. 免疫抑制剤を含む合成ナノキャリアが、請求項６〜７９のいずれか一項において記載されているものである、請求項８０〜８３のいずれか一項に記載のキット。
  85. 組換え免疫毒素が、請求項１〜７９のいずれか一項において記載されているものである、請求項８０〜８４のいずれか一項に記載のキット。
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