JP2010523656A - ミセルおよび粒子を用いた、活性物質の送達のための新規の戦略 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、活性物質(例えば、(i)ワクチン;(ii)免疫調節剤(生得免疫細胞(例えば、樹状細胞)の機能を調節するTLRリガンドもしくは合成分子、または細胞(例えば、樹状細胞もしくは他の抗原提示細胞)内のシグナリングネットワークを調節する合成分子もしくはsiRNAを含む)および/あるいは;(iii)生得免疫および獲得免疫を調節するように、治療用環境または予防用環境において、抗原提示細胞を標的化する薬物)を送達するための戦略に基づいた粒子およびミセルに関する。
ポリエステルおよびポリ無水物に基づいた薬物送達媒体は、それらの優れた生物適合性プロフィールおよび遅い加水分解速度に起因して、治療薬の持続型放出のために広く用いられてきた(非特許文献1;非特許文献2;非特許文献3;非特許文献4)。しかしながら、多数の医学的適用(例えば、リソソームおよび腫瘍の酸性環境を標的化すること)は、迅速なpH感受性の分解を受ける薬物送達システムを必要とする(非特許文献5;非特許文献6)。薬物送達のために用いられる分解性重合体の大部分は、生理学的pH値で塩基により触媒される加水分解によって分解するエステル結合から構成されているので、この必要条件を満たすことができない。エステルベースの物質(例えば、ポリ(乳酸グリコール酸)(PLGA)、ポリオルトエステル、およびポリ無水物)から作製される粒子は全て、分解する際に、多量の酸を生じる。このことは、タンパク質治療薬およびDNA治療薬の分解を引き起こし、この分解はまた、何週間から何ヶ月もかかる。成熟DCの寿命は、約2日なので、これらの物質は、ワクチン開発にとって理想的ではない。最近、ポリ(オルトエステル)およびポリ(β−アミノエステル)に基づくpH感受性疎水性マイクロ粒子が、細胞内薬物送達および腫瘍標的化のために首尾よく用いられてきており、従って、薬物送達のための酸感受性の生体材料の可能性を有することを示している(非特許文献7;非特許文献8;非特許文献9;非特許文献10)。結果として、pH感受性生分解性重合体の合成のための新しい戦略を開発することにおける多大な関心が、存在する。
免疫系の特徴は、質的に異なる型の免疫反応を惹起する能力である。従って、例えば、Tヘルパー1(すなわちTh1)免疫反応は、ウイルス感染細胞または腫瘍を殺傷する細胞傷害性「キラー」T細胞を刺激する。反対に、Tヘルパー2(すなわち、Th2)反応は、抗体産生(特に、細胞外の寄生虫もしくは細菌または毒素に対する保護を付与するIgE抗体の分泌)と関連している。さらに、T調節性反応は、強すぎる免疫反応を抑制し得、従って、アレルギー、自己免疫、移植片拒絶、またはセプシス様症状により引き起こされる免疫病理学症状を制限する。このような広範な型の免疫反応の存在、ならびにウイルス、腫瘍、細胞外の寄生虫および細菌に対する有効な保護を付与すること、ならびにアレルギー、自己免疫、移植およびセプシスにおける有害な免疫反応を調節することにおけるそれらの特異な役割を考慮に入れると、近代免疫学の「ロゼッタ石」は、様々な臨床上環境における有効な免疫反応を最適に誘導する方法を学ぶことである。
特定の炎症性サイトカインは、梗塞後の心筋層において大幅に増加している(Bolli,R., Oxygen−derived free radicals and myocardial reperfusion injury:an overview. Cardiovasc Drugs Ther, 1991. 5 Suppl 2:249−68、Bolliら、Direct evidence that oxygen−derived free radicals contribute to postischemic myocardial dysfunction in the intact dog. Proc Natl Acad Sci U S A,1989. 86(12):4695−9、Torella,ら、Cardiac stem cell and myocyte aging, heart failure, and insulin−like growth factor−1 overexpression Circ Res, 2004. 94(4):514−24)。これらのサイトカインは、成体の心筋細胞および局所的な幹細胞の集団の死を導く、特異的なシグナリング経路を活性化する。
本発明は、被験体に送達するための活性物質をカプセル化するために用いられ得る生分解性の粒子(例えば、三次元粒子)およびミセルを提供する。本発明はさらに、このような粒子およびミセルを生成および送達するための方法を提供する。さらに、本発明は、これらの新規の粒子およびミセルの使用を含むワクチン接種の戦略を提供する。
本発明は、重合体の骨格内にケタール基を含む新規の型の疎水性重合体に向けられている。ここで、上記ケタール基は、両方の酸素原子が上記重合体の骨格内に位置する様式で、配置されている。
本発明はさらに、多数の重合体を含む新規の生分解性の架橋されたミセルを提供する。ここで、上記重合体は例えば、外部(external)架橋剤(すなわち、重合体鎖内に導入されない薬剤)により架橋されている。外部薬剤を用いることの利点は、重合体内の架橋可能部分のみが用いられる反応と比較して、架橋反応がより速いことである。上記外部架橋剤はまた、カプセル化されたタンパク質が破壊される機会を減少させる。
(定義)
本出願において用いられている全ての科学用語および専門用語は、そうでないことが記載されない限り、当該分野において一般的に用いられている意味を有する。本出願において用いられている、以下の語または句は、記載されている意味を有する。
本発明のポリケタール重合体
本発明は、各ケタール基が重合体骨格内に2つの酸素原子を有する多数のケタール基を含む、生分解性疎水性ポリケタール重合体を提供する。一実施形態において、本発明の生分解性疎水性ポリケタール重合体は、固体分子の形態である。
本発明はさらに、本発明のポリケタール重合体を含む生分解性粒子を提供する。この粒子のサイズは変動し得る。例えば、生分解性粒子は、ナノメートル(nm)またはミクロン(μm)スケールで作製され得、例えば、ナノ粒子またはマイクロ粒子を形成し得る。本発明の粒子は、約50nm〜1000μmのサイズの範囲であり得る。一実施形態において、この粒子は、約200nm〜600μmのサイズの範囲である。別の実施形態において、この粒子は、約1μm〜10μm、10μm〜20μm、20μm〜30μm、30μm〜40μmまたは40μm〜50μmのサイズの範囲である。なお別の実施形態において、この粒子は、約1μm〜50μmのサイズの範囲である。好ましい粒径は、約50nmと1000nmとの間であり、より好ましくは約200nmと600nmとの間である。別の好ましい粒径は、約30μmである。
本明細書中に用いられている、用語「活性物質」は、タンパク質、ペプチド、核酸(DNAもしくはRNA)または有機分子、および他の合成核酸分子、siRNA分子、またはアンチセンス分子を指す。上記活性物質は、治療剤、予防剤または診断用薬剤であり得る。この治療剤は、免疫調節剤(例えば、RIG−1またはTLR、またはC型レクチン(例えば、dectin−1およびDC−SIGN)またはキャタピラタンパク質に対する特異的リガンド、あるいは特異的TLRリガンドの組み合わせ、あるいはDCおよびマクロファージによる調節性シグナリングネットワークを阻害する合成分子またはsiRNA)であり得る。上記活性物質はさらに、タンパク質(例えば、組換えタンパク質)、ペプチド、炭水化物、核酸、低分子(例えば、キナーゼインヒビター、ホスファターゼインヒビター、サイトカインインヒビター、低分子抗酸化物質模倣物、レセプターブロッカー、細胞骨格再構成インヒビター、低分子レセプター活性化剤)、イメージング剤、ワクチン抗原、DNAワクチン、またはワクチン自体(例えば、インフルエンザワクチン)を含み得る。最終的に、活性物質は、DCのサブセット(ランゲルハンス細胞、皮膚のDC、骨髄のDC、腸管のDC、形質細胞様DCを含む)、または単球およびマクロファージのサブセットを標的化するか、刺激するか、調節するかまたは阻害する抗体を含み得る。従って、これらの粒子の表面は、標的群(例えば、樹状細胞のサブセットに対する抗体、または樹状細胞もしくはマクロファージのサブセットを刺激するタンパク質(例えば、CD40L、DEC−205、CD11c、langerin、MARCO、33D1など)など)を含むように改変され得る。
本発明のポリケタール(例えば、粒子の実施形態において)はさらに、1つ以上のリンカーを含み得る。このリンカーは、同一の型であっても、ポリケタール重合体に付着される種々の型の混合物を含んでもよい。このリンカーは、ポリケタール重合体の表面に付着され得る。例えば、このリンカーは、この粒子の周りの溶媒または水溶液に曝露され得る。
本発明はさらに、本発明の多数の重合体を含む生分解性の架橋されたミセルを提供する。上記重合体は、外部架橋剤により架橋され得る。本明細書中に用いられている外部架橋剤は、上記重合体鎖に導入されない薬剤である。外部薬剤を用いることの利点は、重合体内の架橋可能部分のみが用いられる反応と比較して、架橋反応がより速いことである。上記外部架橋剤はまた、カプセル化されたタンパク質が破壊される機会を減少させる。
上記生分解性粒子またはミセルはさらに、(1)DCもしくはマクロファージもしくは単球の特定のサブセット(ランゲルハンス細胞、皮膚のDC、骨髄のDC、形質細胞様DCを含む)上の特異的なレセプター、または(2)抗原提示細胞上の特異的なレセプター(例えば、DEC205、Langerin、DC−SIGN、dectin−1、33D1、MARCO)を標的化する抗体または他の分子を組み込むように改変され得る。
本発明は、本発明の重合体(これは、必要に応じてリンカーを含み得る)を含む薬学的組成物を提供する。一実施形態において、本発明は、本発明の粒子(これは、必要に応じてリンカーを含み得る)を含む薬学的組成物を提供する。別の実施形態において、本発明は、本発明のミセル(これは、必要に応じてリンカーを含み得る)を含む薬学的組成物を提供する。本発明の重合体はさらに、粒子の形態であろうとミセルの形態であろうと、活性物質を含み得る。例えば、一実施形態において、本発明は、活性物質に結合されるリンカーを有するPCADK、PK1、PK2、PK3、PK4、PK5および/またはPK6粒子を含む薬学的組成物を提供する。
本発明の粒子およびミセルを生成する方法
本発明は、本発明の粒子を生成するための方法を提供する。一実施形態において、上記方法は、a)ケタールおよびジオールまたは不飽和アルコールの疎水性重合体を形成する工程;b)1つ以上の活性物質の存在下で、a)の重合体の重合体粒子を形成し、それによって、上記物質をカプセル化する工程を包含する。ケタールおよびジオールまたは不飽和アルコールの疎水性重合体を形成するための適切な化学の例としては、単一エマルジョンまたは二重エマルジョンおよび非環式ジエン複分解を用いたアセタール交換反応(Heffernan MJ および Murthy N.,2005 Bioconjug.Chem.16(6):1340−2;Jain RA.,2000 Biomaterials.21(23):2475−90:Wagener K.B. および Gomez F.J.,「ADMET Polymerization」,Encyclopedia of Materials:Science and Technology,EJ.Kramer および C. Hawker編集,Elsevier,Oxford,5,48(2002))が挙げられる。
本発明はさらに、例えば、疾患または障害に罹患した被験体を処置する(例えば、この疾患に関連する症状を緩和する)ように、活性物質を送達するために、被験体に本発明の粒子または本発明のミセルを介して本発明の活性物質を送達するための方法を提供する。次に、この粒子(例えば、PCADK、PK1、PK2、PK3、PK4、PK5またはPK6重合体から作製される)またはミセルは、被験体への送達のために活性物質を放出するように、被験体内で分解または溶解され得る。本発明の粒子またはミセルは、種々のpH範囲で可変の分解速度を有し、所望のプロフィールにしたがって活性物質を放出するように設計され得る。例えば、PK3重合体から形成された粒子は、PK6重合体から形成された粒子よりも速く分解し、活性物質を放出する。
本発明のポリケタール粒子は、小さなインヒビターから大型のタンパク質まで、広範な範囲の活性物質を含むか、またはそれらをカプセル化でき、疾患または状態に罹患する被験体へ活性物質を送達するためにか、あるいは予防手段として使用され得る。
抗原を含む架橋されたミセルの合成
タンパク質抗原のオボアルブミンおよび免疫刺激性DNAを含む架橋されたミセルを、2工程のプロセスで合成した。最初に、ミセルを、陽イオン性ブロック共重合体のPEG−ポリリジン−チオピリダールと負に荷電したFITC−オボアルブミン(FITC−OVA)および免疫刺激性DNA(ISS−DNA)との間で形成した。これらのミセルは、濃度10mg/mlのPEG−ポリリジン−チオピリダール、濃度0.5mg/mlのFITC−OVAおよび濃度0.5mg/mlのISS−DNAを含んでいた。上記ミセルを1時間形成させ、次いで、このミセルを0.4mg/mlのジチオ−エチレン グリコールで架橋した。上記架橋反応をU.V.活性(342nm)によりモニタリングしたところ、チオピリダール基が1時間後に室温で定量的に反応したことを示した。100kD spin−filter(centricon)により上記ミセルを遠心分離し、回収した溶液をFITC蛍光(励起 494nm、放射 510nm)について解析することにより、上記ミセル中のFITC−OVAのカプセル化効率を決定した。このことは、FITC−OVAの95%より多くが、上記ミセル中にカプセル化されたことを示した。
ポリケタール粒子の合成(疎水性薬物の送達のための単一エマルジョン方法)
水中油型エマルジョン方法を用いて、粒子を、ポリ(l,4−フェニレン−アセトン ジメチレン ケタール)により合成した。簡単に言えば、10mgの2.1mgのERKインヒビターUO126および0.1gのクロロ−メチル フルオレセイン ジアセタート(CMFDA)を、0.5mLのCHCl3(0.1%のトリエチルアミンを含む)中に溶解させた。次いで、この溶液を、2mg/mlのポリビニル アルコール(PVA,31〜50 kDa,Aldrich)を含む5mLのpH 9緩衝液(10mM NaHCO3)に添加した。この油−水混合物を、少しの間振とうし、次いで、2〜3分間40ワットで超音波処理して(Branson Sonifier 250)、微細な油/水エマルジョンを形成した。上記エマルジョンを、N2流れ下で少なくとも3時間攪拌して、その溶媒を蒸発させ、そして粒子懸濁物を生成した。粒子サイズを、動的光散乱(dynamic light scattering)(DLS)により解析したところ、その平均直径が282nmであることを示した。
オボアルブミンをカプセル化するポリケタール粒子の合成(親水性薬物の合成のための二重エマルジョン方法)
ポリケタール粒子の合成
FITC−オボアルブミンを含むポリケタール粒子(PKN)を、二重エマルジョン方法を用いて作製した。最初に、500μLのクロロホルム中に溶解させた20mgのポリ(1,4−フェニレン アセトン ジメチレン ケタール)(PPADK)を、100μLのFITC−Ova溶液(約0.7mg)に添加した。この混合物を、40ワットで1分間超音波処理して、一次エマルジョンを形成した。次に、5mLの10mM pH9 リン酸ナトリウム緩衝液中の0.2% w/v ポリビニル アルコール(PVA, Aldrich)を添加し、そしてこの混合物を、40ワットで少なくとも1分間超音波処理して、二次エマルジョンを形成した。上記エマルジョンを、窒素通気下で4時間混合し、その後、その容量を、緩衝液を用いて5mLにした。2バッチのFITC−Ova含有PKNを、2バッチの無添加(plain)PKN(FITC−Ovaを含まない)と同様の様式で調製した。上記PKN懸濁物を、4℃で保管した。
鶏卵アルブミン(オボアルブミン)を、次の通りに、フルオレセインを用いて標識した。オボアルブミンを、10mg/mLで200mM pH9 NaHCO3緩衝液中に溶解した。イソチオシアン酸フルオレセイン(FITC)を、10mg/mLでDMSO中に溶解した。次に、2.5mLのオボアルブミン溶液(25mg、0.56mmol)を、50μLのFITC/DMSO(0.5mg、1.28mmol)と共に少なくとも1時間30℃で混合した。この生成物を、Sephadex PD−10カラム中で濾過し、遊離色素を除去した;このカラムに、2.5mLの生成物をロードし、そして2.5mLの水で溶出した。得られたオボアルブミンの濃度は、約7mg/mLであった。497nmでのFITCの吸収を測定することにより、かつオボアルブミンの推定濃度を用いて、標識の程度を1.09と算出した。
2つのFITC−Ova PKNバッチを、5倍の水により希釈し、そして希釈した試料各々の一部分を、0.1μm Supor syringe filter (Pall Acrodisc)を通して濾過した。これらの濾過された試料および濾過されていない試料をさらに、10倍のpH9 リン酸ナトリウム緩衝液中に希釈し、そして蛍光を、494nmの励起波長および520nmの放射波長で測定した(図1)。
図2は、以下を示す:(A)ケタール中間体 1を生成するための1,4−ベンゼンジメタノールと2,2−ジメトキシプロパンとの間のケタール交換反応。(B)ポリケタール 2を生成するための1の段階的重合。副生成物のメタノールを蒸留することにより、反応工程AおよびBを進める。(C)溶媒蒸発方法による薬物をロードした粒子の形成。粒子は、低分子量の排出可能な化合物へのpH感受性の分解を表す。
上記ポリケタールを、ケタール交換反応(Lorette,N.B.;Howard,W.L. J.Org.Chem.1960,25,521−525)に基づいた新規の重合戦略により合成する。この反応は一般的に、低分子量のアルコールに保護基を導入するために用いられており、これまでは、重合体を合成するために用いられていなかった。しかしながら、本発明者らはここで、簡単に2,2−ジメトキシプロパン(DMP)をジオールと反応させることにより、上記ケタール交換反応が、酸感受性の重合体を合成するために用いられ得ることを明らかにする。本発明者らは、上記重合が図2の反応機構により起こることを提唱する。上記ケタール交換反応は、DMPのプロトン化およびその後のアルコールによる求核攻撃を含む平衡反応である。副生成物のメタノールを蒸留して除くことにより、この平衡を、上記ケタール中間体 1の形成に対してシフトさせる。この反応が進むにつれて、1の分子は、段階的様式で結合して、ポリケタール2を形成する。
2の加水分解の速度論を、リソソーム(pH 5.0)および血流(pH 7.4)に対するpH値で測定した。ポリケタール 2を細かい粉末にひき、そしてこの粉末を、pH 7.4(ホスファート緩衝液)、pH 5.0(アセタート緩衝液)、およびpH 1.0(DCl)の重水素を入れた溶液に添加することにより、上記加水分解の速度を測定した。この懸濁物を37℃で攪拌し、データの点を3時間、24時間、48時間、および72時間でとった。各懸濁物を4分間、1800gで遠心分離し、そしてその上清を1H NMRにより解析した。これらのスペクトルは、BDMについてのピーク(7.24ppmおよび4.47ppm)ならびにアセトンについてのピーク(2.05ppm)を含んでいた。2つのBDMピークの積分の平均を用いて、加水分解の相対的な程度を決定した。この加水分解のパーセントを、pH 7.4または5.0の試料のBDMピークの平均をpH 1.0 対コントロールバッチのBDMピークの平均で除算することにより算出した。
ミクロンサイズの粒子の合成
また、ポリケタール2(実施例4、上記からの)を、ミクロンサイズの粒子を合成するために用いた。水中油型エマルジョン方法(Panyam,J.;Williams,D.;Dash,A.;Leslie−Pelecky,D.;Labhasetwar,V. J.Pharm.Sci.2004,93,1804−1814)を、上記粒子を形成するために用いた。簡単に言うと、1mLのCHCl3(0.1% トリエチルアミンを含む)中に溶解させた50mgの2を、乳化剤として様々な量のポリビニル アルコール(PVA、31〜50kDa、Aldrich)を含む5mLの10mM NaHCO3 pH9緩衝液に添加した。この油−水混合物を、少しの間振とうし、次いで、2〜3分間40ワットで超音波処理して(Branson Sonifier 250)、微細な油/水エマルジョンを形成した。上記エマルジョンを、N2フロー下で少なくとも3時間攪拌して、その溶媒を蒸発させ、そして粒子懸濁物を生成した。
ミセルとポリケタール粒子の合成および性質決定
材料と方法
ポリケタール粒子中のデキサメタゾンのカプセル化
抗炎症薬デキサメタゾン(Dex,Sigma)を、上記のポリケタール2を用いて作製された粒子中にカプセル化した。油相が5mg/mlの濃度のDexを含んでいたこと、およびPVA:ポリケタールの比率 1:1を用いたことを除いて上記の手順と同じ手順を用いて、Dexをロードした粒子を処方した。これらの粒子のSEM画像は、これらの粒子が直径200〜600nmであることを明らかにする(図5C)。DLSによる粒子のサイジングは、Dexをロードした粒子のバッチについての有効な直径 250nmを示した。上記Dexのカプセル化効率は、43〜53%の間の範囲にわたった。コントロールバッチを、ポリケタール/PVAのみおよびDexのみを用いて調製した。Dexのカプセル化を測定するために、各粒子バッチをpH 9緩衝液中に再懸濁し、次いで、アリコートをさらに希釈した。一部分を0.1μm Supor membrane Acrodisc syringe filter(Pall Corp.)を通して濾過し、そしてその濾液の242nmでの吸光度を、Shimadzu UV− 1700 spectrophotometerにより記録した。上記カプセル化効率を、(ADex−ADexPoly)/(ADex−APoly)として算出した。ここで、Aは242nmでの吸光度であり、下付き文字「Poly」、「Dex」、および「DexPoly」は、「ポリケタールのみ」、「Dexのみ」、および「Dex+ポリケタール」の試料を各々指す。これらの算出により、様々な試料についてのDexカプセル化効率 43%〜53%を得た。
図8は、ペプチド架橋されたミセルの設計および合成を示す概略図である。工程1:ISS DNAとIとを混合して、ミセル(架橋されていないミセル)を形成する。工程2:次いで、これらのミセルを抗原性ペプチド(II)で架橋して、免疫刺激分子とペプチド抗原との両者をカプセル化し得る送達システムを生成する。APCによるファゴサイトーシスの後、ペプチド架橋されたミセルは、それらの構成成分を放出する。
図19は、シクロヘキサン ジメタノール由来のポリケタールを示す。A.シクロヘキサン ジメタノール由来のポリケタール(PCADKと呼ばれる)は、分解して、シクロヘキサン ジメタノールおよびアセトンになり、どちらも、ヒトの使用のためのFDA承認を有する。B.PCADKは酸感受性様式で分解する。PCADK内のケタール結合は、生理的pH条件下、週単位で加水分解する。PCADK内のケタール結合の加水分解を、4.5および7.4のpHでのH−NMRにより測定した。ファゴソームのpH 4.5で、PCADKのケタール結合は、10日後に約30%が加水分解される。この結果に基づいて、本発明者らは、CAT−PKNが、マクロファージによるファゴサイトーシス後4〜5週間以内に、完全に加水分解されると予想する。
図6は、粒子形成の工程を示す概略図である。A.工程1:ポリケタールおよび薬物をクロロホルム中に溶解する;ポリビニル アルコールを水中に溶解する。B.工程2:クロロホルム溶液を水に添加し、そして超音波処理し、ミクロンサイズの小滴を生成する。工程3:クロロホルムを蒸発させ、粒子を生成する。
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Fife,T.H.;Jao,L.K.J.Org.Chem.1965,30,1492−1495.
Kwon,Y.J.;Standley,S.M.;Goodwin,A.P.;Gillies,E.R.;Frechet,J.M.J.Mol Pharm.2005,2,83−91.
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Lorette,N.B.;Howard,W.L.J.Org.Chem.1960,25,521−525.
Panyam,J.;Williams,D.;Dash,A.;Leslie−Pelecky,D.;Labhasetwar,V.J.Pharm.Sci.2004,93,1804−1814 。
この実施例において、心筋層への低分子インヒビターの送達にポリケタール(PK)粒子を使用することを記載する。PKを、心臓に治療薬を送達し、急性心筋梗塞を処置するように設計する。PKを、新規なクラスの重合体であるポリケタール(これは、その骨格内にケタール結合を含む)から処方する(図30)。
ポリ(シクロヘキサン−1,4−ジイル アセトン ジメチレン ケタール)(PCADK)の合成
PCADKを、短経路蒸留ヘッド(short−path distilling head)に接続した50mLの2ツ首フラスコ内で合成した。最初に、6.82mLの酢酸エチル中に溶解させた、5.5mgの再結晶させたp−トルエンスルホン酸(0.029mmol、Aldrich)を、1,4−シクロヘキサンジメタノール(12.98g、90.0mmol、Aldrich)を含有する30mLのベンゼン溶液(100℃に保持)に添加した。この酢酸エチルを蒸発させ、蒸留した2,2−ジメトキシプロパン(10.94mL、90.0mmol、Aldrich)を、このベンゼン溶液に添加し、重合反応を開始した。次に、さらなる用量の2,2−ジメトキシプロパン(5mL)およびベンゼン(25mL)を、6時間にわたって、1時間毎に計量漏斗を介して反応物に添加し、蒸留除去された2,2−ジメトキシプロパンおよびベンゼンを埋め合わせた。8時間後、反応を、500μLのトリエチルアミンを添加することによって停止させた。重合体を、冷ヘキサン(−20℃で保存)での沈殿、その後の真空濾過によって単離した。PCADKの分子量を、図31に示されるUV検出器を装備したゲル透過クロマトグラフィー(GPC)(Shimadzu)によって決定した。THFを、1mL/分の流速での移動相として使用した。Polymer Laboratories(Amherst、MA)製のポリスチレン標準を、分子量較正曲線を確立するために使用した。この化合物を使用して、全ての続く実験においてPCADK粒子を生成した。
SB239063は、p38のインヒビターである。図29は、上流のエフェクターの活性化および活性化の結果を含むp38活性化の概略図である。
より大きな粒子を作製する実行可能性を実証するために、本発明者らは、元のプロトコール(上記)を使用して、低減された均質化速度を使用して、または低減されたPVAパーセンテージを使用してエマルジョンを実行した。次に、本発明者らは、室温で4時間攪拌して、塩化メチレンを蒸発させ、数回洗浄した後、このポリケタールを凍結乾燥させ、それらのサイズについてSEMを用いて調べた。図33に示されるように、元のプロトコールによって、本発明者らは、<10μmの範囲の粒子を得た。しかしながら、均質化速度(60秒間、15,000RPM)を低減することによってか、またはPVAパーセンテージを低減(8%から4%へ)することによって、本発明者らは、20μm以上の粒子を生成することができた。このデータは、より大きな粒子が、均質化の速度を低減するか、または水溶液のパーセンテージを低減することによって生成され得ることを示す。このことは、十分な心筋での保持が得られない場合、代替的なアプローチとしての、より大きな粒子を生成する実行可能性を示す。
肺薬物送達に関して、最近、サイズが20〜30ミクロンの多孔質マイクロ粒子が魅力的な関心をもたれている。なぜなら、依然としてそれらの大きなサイズは、マクロファージによってファゴサイトーシスされることを妨げるが、それらの低密度は、spinhalerを介する、吸入されるべき空力的特性をそれらの多孔質マイクロ粒子に与えるからである。PLGAを使用したLangerらによる研究は、20〜30ミクロンのサイズの粒子が、肺の肺胞領域の細胞外空間へ治療薬を送達することに最適であることを示した(Chengら、Formulation of functionalized PLGA−PEG nanoparticles for in vivo targeted drug delivery. Biomaterials(2007)28(5):869−76;Edwardsら、Large porous particles for pulmonary drug delivery. Science(1997)276(5320):1868−71;Perezら、Poly(lactic acid)−poly(ethylene glycol) nanoparticles as new carriers for the delivery of plasmid DNA. J Control Release(2001)75(1−2):211−24)。
この研究において、ポリケタール共重合体の加水分解の速度論に対する疎水性の影響を調べた。2つのセットの共重合体を合成し、それらの加水分解速度を調べた。最初に、1,4−シクロヘキサンジメタノールおよび1,5−ペンタンジオールから構成される一連のポリケタール共重合体(これらは、種々の比の1,5−ペンタンジオールを含む)を合成した。これらの共重合体の親水性は、1,5−ペンタンジオールと1,4−シクロヘキサンジメタノールとの間の疎水性の大きな差(これらのそれぞれのLog P値は0.27および1.75である)に基づいて、それらの1,5−ペンタンジオール含量に対応する(scale)。本発明者らは、1,5−ペンタンジオールが劇的に1,4−シクロヘキサンジメタノールベースのポリケタールの加水分解の速度論を加速することを実証する。例えば、pH4.5において、PCADKは、20日の加水分解半減期を有するが、2%ペンタンジオールを含む共重合体であるPK1は、pH4.5において12.5日の半減期を有し、そして13%モルの1,5−ペンタンジオールを含む共重合体であるPK3は、たった2日の加水分解半減期を有する。種々の親水性のジオールを含んだ、1,4−シクロヘキサンジメタノールに基づく第二のシリーズの共重合体も合成した。まとめると、表3のデータは、ポリケタールの加水分解の速度論が、それらの親水性を変化させることによって調整され得ることを実証し、ポリマーマトリクスへの水の拡散が、ケタールの加水分解を支配する律速工程(rate determining step)であることを示唆する。PCADKのこれらの共重合体を本発明者らの研究に使用する。なぜなら、これらが「調整可能な」加水分解速度を有し、数週間にわたってゆっくりと加水分解する粒子が心臓の再生に最適であるからである。
実験プロトコールを、SODをPLGAベースのマイクロ粒子に処方するために使用された手順に基づいて開発した。簡潔に述べると、100μLのSOD水溶液(40mg/mL)を、均質化(21,500rpm、30秒間)によって125mgのPCADKを含む1.0mLの塩化メチレンに分散させ、油中水(w/o)エマルジョンを生成した。次に、このw/oエマルジョンを、5mLの8%(w/v)ポリビニルアルコール(PVA)水溶液に滴下し、ホモジナイザーを用いて6,000rpmで5分間攪拌した。その後、生じたw/o/wエマルジョンを、25mLのpH7.4緩衝液に注ぎ、この混合物を数時間攪拌し、塩化メチレンを蒸発させた。生じた粒子を、遠心分離によって単離し、凍結乾燥させ、白色の固体粉末を生成した。SOD−PCADKマイクロ粒子のタンパク質カプセル化効率は、280nmでのU.V.吸光度によって決定した場合に36.7%であった。図35に示される、SOD−PCADKマイクロ粒子のSEM画像は、これらが直径3〜15μmであり、細胞内送達および細胞外送達の両方に適切であることを実証する。このことは、SOD送達の場合に有益であり得る。なぜなら、スーパーオキシドは、炎症の間に細胞内毒性と細胞外組織損傷の両方を引き起こすからである。これらのデータは、本発明者らの代替的なアプローチに関して、低分子インヒビターに加え、より大きな、親水性のタンパク質をカプセル化するそれらの能力における、ポリケタールの多用途性を実証する。
マクロファージからスーパーオキシドを除去するSOD−PCADKマイクロ粒子の能力を、細胞培養物で調べた。TIB−186マクロファージ(1×105細胞/ウェル、96ウェルプレート)を、0.1mg/mL SOD−PCADKマイクロ粒子、遊離SOD(1.14μg/mL SOD)、または空のPCADKマイクロ粒子のいずれかと2時間インキュベートし、次に0.2μg/mLホルボールミリステートアセテート(PMA)で30分間刺激した。その後、これらのマクロファージからのスーパーオキシド産生を、20nmolシトクロムc(550nmでの吸光度)を使用して測定した。図36は、遊離SOD単独では、スーパーオキシド産生のほんのわずかな阻害しか生じなかったが、SOD−PCADKマイクロ粒子は、スーパーオキシド産生において60%の低減を生じたことを実証する。空のマイクロ粒子はまた、マクロファージによるスーパーオキシド産生をおよそ20%低減した。これらのデータは、酵素タンパク質が、細胞送達のためにカプセル化された場合にその活性を保持し得ることを示す。別の計画のために処方される一方で、これらのデータは、代替的な方法として、細胞へのタンパク質のポリケタール媒介送達の実行可能性を実証する。
一般的に、マクロファージは、ファゴサイトーシスを介して外来性の粒子を貪食するが、SB239063を含有する本発明者らのポリケタールは、ファゴサイトーシスを受けるには大きすぎる(>5μm)可能性があり、放出の主要な方法は、マクロファージによる粒子の加水分解に続く小さな分子の取り込みである可能性がある。ポリケタールがマクロファージによって保持されるか否かを決定するために、本発明者らは、FITCをロードしたポリケタールとRAWマクロファージとを2時間インキュベートし、PBSで3回洗浄し、蛍光顕微鏡法を使用して画像化した。図37が示すように、FITCをロードしたポリケタール(そして、ロードされていないポリケタール)を、細胞の外側に見出すことができる。さらに、図37は、FITCを取り込んだ細胞(矢印)を示す。これらのデータは、ポリケタールが培養されたマクロファージに「粘着」し、それらの内容物が取り込みのための加水分解に続いて放出され得ることを実証する。
サイトカイン媒介性のp38のリン酸化およびスーパーオキシド放出に対するPK−p38iの影響を決定するために、RAWマクロファージを、血清を含まない培地において集密度でプレートし、20分間のTNF−α刺激の前に、2、4または6時間、空のPKまたはPK−p38iを含有する、血清を含まない培地に切り替えた。タンパク質を、試料緩衝液で回収し、20μgを、ウェスタン分析のために12%SDS−ポリアクリルアミドゲル上で泳動(run)した。タンパク質を、PVDFメンブレンに移し、ホスホ特異的p38に対する抗体(Cell Signaling)でプローブした。ブロットを、Bio−Rad製のQuantity Oneソフトウェアを使用してスキャンおよび定量化した。図38が実証するように、PK−p38i(0.1mg/mLすなわち2μM)は、時間依存的な様式でTNF−αによるp38のリン酸化を防止した。種々の時点において、空のPKによる影響はなかったが、PK−p38iでのマクロファージの4または6時間の処理は、TNF−αによるp38のリン酸化を完全に防止した。これらのデータは、PK−p38iが、マクロファージにおけるサイトカイン媒介性のp38の活性化およびスーパーオキシド産生を防止し得ることを示唆した。
心筋梗塞後の増大したスーパーオキシド産生は、梗塞後の心臓のアポトーシスおよび機能不全において一定の役割を果たし得る。TNF−α刺激は、マクロファージにおいて細胞外スーパーオキシド産生をもたらし得、この応答はp38依存的であることが示されている。
ポリケタールが、数日後にインビボで検出され得るか否かを決定するために、本発明者らは、C57BL/6Jマウスの肢の筋肉に25mg/mLの空のポリケタールまたはポリ(乳酸−コ−グリコール酸)(PLGA)を注射した。注射から3日後、筋肉を単離し、4%パラホルムアルデヒド中に固定し、組織学のために包埋した。ヘマトトキシリン&エオジン染色を、5μm切片上で実行し、光学顕微鏡法を使用して画像を取得した。図41の代表的な画像が実証するように、粒子は、注射から3日後に検出可能であった。興味深いことに、異常に高い濃度の粒子(25mg/mLは、本発明者らが提唱する実験よりも25倍〜250倍高い)にもかかわらず、粒子の周囲にはほんのわずかな炎症しか存在しないようであった。対照的に、PLGA粒子で注射された肢の筋肉は、続く図によって観察されるように、激しい線維症と炎症細胞の浸潤の可能性を示した。注記、PCADK試料での暗色の染色は、DAPI染色によって確認されるように、大半は粒子のようであり、細胞ではない。これらのデータは、PCADK粒子の注射は光学顕微鏡法によって確認され得、激しい炎症反応をもたらさないようである点において原理の重要な証拠を実証する。
炎症に対するポリケタールの注射の効果を決定するために、上記の肢の注射実験からの切片を、CD45(一般的な炎症細胞のマーカー)に対する蛍光抗体で染色した。具体的には、パラフィン除去および再水和の後、切片を、抗原回復(antigen retrieval)のためにプロテイナーゼKとともにインキュベートした。回復の後、切片を10%ウマ血清でブロックし、次に蛍光タグ付き抗マウスCD45抗体(eBioscience)とともにインキュベートした。徹底的な洗浄の後、切片を、DAPI(1μg/mL)とともにインキュベートし、カバースリップをかけた(coverslip)。適切なFITC結合体化アイソタイプをコントロールとして使用し、染色がないことが明らかだった。画像を、正確に同一の曝露時間で取得し、Matlabソフトウェアを使用して組み合わせた。図42の画像が実証するように、左側のポリケタール注射された筋肉と比較して、PLGA処置された筋肉の注射領域全体にわたって確固とした染色が存在した。本発明者らは、CD14(炎症細胞の別のマーカー)についての染色を使用してこのデータを確認した。PLGA処置された筋肉において激しい細胞応答が存在したが、本発明者らは、PCADK処置された筋肉におけるDAPI染色の大半が非特異的であると考える。高濃度のポリケタールの注射に対する炎症反応がわずかなことを実証する、これらのデータは、この提案に対して必須である。この実験で使用された濃度が本発明者らが提唱する注射よりも数桁大きい可能性があったにも関わらず、CD45およびCD14染色によって測定される炎症細胞の応答はわずかだった。これらのデータは、PK−p38iに関連して炎症において本発明者らが観察したあらゆる低下が、粒子自体によって引き起こされたあらゆる炎症を弱めたこと(offsetting)に起因しないという確信を提供する。
SB239063をカプセル化するポリケタールがインビボにおいて活性であるか否かを決定するために、冠状動脈結紮を受け、梗塞直後のC57BL/6マウスに、空のポリケタール(PK)またはSB239063を含むポリケタール(PK−p38i 0.1mg/mL)のいずれかを二重盲検様式(double−blinded manner)で心筋内に与えた。心臓を梗塞から3日後に切除し、左心室の自由壁の梗塞ゾーンを単離し、プロテアーゼおよびホスファターゼインヒビターを含むTriton−X緩衝液で均質化した。500μgのタンパク質を、ポリクローナルp38抗体(Cell Signaling)で一晩インキュベートし、その後、プロテイン−Aアガロースとともにインキュベートした。ビーズを洗浄し、そして試料緩衝液とともにインキュベートし、その後12%ゲル上で泳動した。タンパク質をPVDFメンブレンに移し、ホスホ特異的p38抗体(Cell Signaling)を用いてプローブした。現像(development)後、メンブレンを、ストリッピングし、総p38抗体で再プローブ(re−probe)した。ブロットを、スキャンし、Quantity Oneソフトウェアを使用して定量化し、データをホスホ−p38対総p38の比として表現し、ANOVAを使用して統計的に比較した。図43のブロットおよびデータが実証するように、梗塞から3日後、左心室のホスホ−p38に有意な増大が存在した。この増大は、空のPKによって阻害されなかったが、PK−p38i処置によって完全になくなった。これらのデータは、ポリケタール内にカプセル化されたSB239063が、インビボで活性であり、急性心筋梗塞後の梗塞ゾーン内のp38のリン酸化を有意に低減させることを実証する。
上記の二重盲検実験からのタンパク質ホモジネート(50μg)を、12%ゲル上で泳動し、ウェスタン分析のためにPVDFメンブレンに移した。メンブレンを、インターロイキン−5(IL−5;AbCam)(梗塞後心機能不全に関連する炎症促進性サイトカイン(Weiら、Subacute and chronic effects of quinapril on cardiac cytokine expression, remodeling, and function after myocardial infarction in the rat J Cardiovasc Pharmacol, 2002. 39(6):842−50)に対する抗体とともにインキュベートした。その後、メンブレンをストリッピングし、正規化のためにβ−アクチンに対する抗体で再−再プローブした。図44において代表的なブロットおよび群分けしたデータが示すように、梗塞から3日後に、IL−5発現に有意な増大が存在した。この増大は、空のPK処置によって妨害されなかったが、PK−p38i処置によって完全になくなった。これらのデータは、ポリケタール内のSB239063が、急性心筋梗塞後の炎症促進性サイトカイン産生を阻害する可能性を実証する。
上記のデータの大半は、マウスモデルを使用して集めたが、本発明者らは、ラットにおける本発明者らの二重盲検研究からのデータを分析し始めた。TNF−α放出を測定するために、成体の雄性Sprague−Dawleyラットに偽手術または冠状動脈結紮手術を施し、50μLの0.5mg/mLの空のPK、PK−p38iまたは遊離のSB239063(1μM;0.5mg/mL PK−p38iに相当する)のいずれかを注射した。左心室の自由壁を、結紮から3日後に回収および均質化し、タンパク質レベルを、Bradfordアッセイ(Bio−Rad)によって決定した。次に、試料を、市販のELISAキット(eBioscience)を使用してTNF−α含量について分析した。データを、補正後にpg/mgタンパク質として表現した。図45のデータが示すように、結紮から3日後に梗塞した動物において、TNF−α産生に2倍の増大が存在した。数が少ないので(1群あたり、n=3〜4)、統計的に有意ではないが、PK−p38iによる阻害の傾向(約33%の低下)が存在した。また、空のポリケタール(PK)、または匹敵する量の遊離のSB239063の注射に明らかな効果は存在しなかった。これらのデータは、マウスにおける本発明者らの最初の肯定的な知見を支持し、ポリケタール内でのSB239063カプセル化が、ラットにおいて、心筋梗塞後の炎症促進性サイトカインの産生を阻害し得ることを示唆する。
この実施例において、本発明者らは、粒子の合成および試験の両方、ならびにある程度の細胞および梗塞後の効果からなるデータを提示した。本発明者らのデータは、p38インヒビターであるSB239063をカプセル化する粒子が、比較的単純な単一エマルジョンプロトコールから生成され得ることを示す。さらに、本発明者らのデータは、粒子の特性を容易に変更することができることを明らかに示す。具体的には、均質化速度または水溶液を変更することによって、粒径が増大され得、心筋での保持を確実にし得る。さらに、種々の共重合体を添加することによって、本発明者らは、加水分解の速度論を細かく調整し、梗塞後の治癒過程の必要性に適合し得る。最終的に、低分子インヒビターのカプセル化に加えて、本発明者らは、本発明者らの必要性がそれを要求する場合に、大型の酵素タンパク質もカプセル化することができる。
p38インヒビターであるSB239063を含むポリケタール(PK)は、培養細胞において、p38のリン酸化、炎症促進性サイトカインの産生およびアポトーシスを阻害し得る。
PKにカプセル化されたSB239063は、ラットにおいて心筋梗塞後、最大7日間、梗塞ゾーン内のp38のリン酸化およびアポトーシスを阻害し得、心機能を救済し得る
実験設計:PK−p38iを、上記の方法セクションに記載されるように生成する。成体の雄性Sprague−Dawleyラットに、上記方法に記載されるように偽手術または冠状動脈結紮を施し、空のPK、PK−p38iまたは遊離のSB293063の投与で無作為化かつ盲検様式で注射する。手術から3日後および7日後、動物を、軽い麻酔下で訓練をつんだ技術者による心エコー検査およびMRIに供し、心臓を、示された時点でタンパク質研究(n≧5)または免疫組織学研究(n≧5)のいずれかのために回収する。タンパク質研究のために、左心室の自由壁を切除し、洗剤緩衝液で均質化し、そしてタンパク質をSDS−PAGEゲル上で泳動し、ホスホレベルおよび総レベルのp38の両方を認識する抗体でプローブする。この方法は、梗塞後にインビボでホスホ−タンパク質を確実に検出するために、本発明者らの研究室およびその他によって使用されている(Hsiehら、Controlled delivery of PDGF−BB for myocardial protection using injectable self−assembling peptide nanofibers. J Clin Invest(2006)116(1):237−48)。タンパク質試料もまた開裂カスパーゼ−3レベルについて調べ、アポトーシスのレベルを決定する。ホスホ−p38測定に加えて、ブロットもまた、TNF−αおよびインターロイキンファミリーのうちの数種のメンバー(IL−1、IL−5、IL−6およびIL−8が挙げられる)のような炎症促進性サイトカインに対する抗体でプローブする。デンシトメトリーを、Bio−Rad製のQuantity Oneソフトウェアを使用して実行し、データを、ANOVA、その後の適切な後検定を使用して統計的に比較する。本発明者らの動物の数は、続く脊椎動物の切片において正当化されるが、本発明者らが発表した変動性を使用する検出力分析(power analysis)がこれらの数を決定している。
上記の実験に加えて、本発明者らはまた、無作為化かつ二重盲検様式での空のPK、PK−p38iまたは遊離のSB239063の注射の前に、成体の雄性ラット(n≧10)を偽手術または冠状動脈結紮に供する。梗塞から28日後および90日後に、ラットに、軽い麻酔下で、訓練をつんだ技術者による心エコー検査およびMRIを施し、回復が慢性期に明らかであるか否かを決定する。示された時点において、心臓を、免疫組織学的評価のためにパラホルムアルデヒド中に回収する。線維症を、ピクロシリウスレッド(picrosirius red)染色、続いて、Matlabソフトウェアで書かれた特製プログラムを使用する染色の定量化によって決定する。このプログラムは、数個の領域をわたってピクセル強度を調べ、試料中のバックグラウンドを低減するように設計されている。群を、ANOVA、その後の適切な後検定を使用して統計的に比較する。線維症の染色に加えて、免疫組織化学を、結合組織増殖因子およびトランスホーミング増殖因子を含む心臓線維症の一般的なマーカーについて実施する。
PK−p38iは、培養された心臓の幹細胞の生存および分化を改善し得る
実験設計:本発明者らは、このセクションの最後における方法に記載されるように、心臓の幹細胞を単離する。本発明者らの予備的な単離は、この方法に示されるように、高純度のc−kit+の心臓の幹細胞を実証した。培養された心臓の幹細胞を、集密度で血清を含まない培地にプレートし、0mg/mL、0.1mg/mL、0.5mg/mLおよび1mg/mLの空のPKまたはPK−p38iとともに6時間インキュベートする。PKインキュベーションに続いて、細胞を洗浄し、TNF−αとともに30分間インキュベートする。タンパク質を、試料緩衝液に回収し、ウェスタン分析をホスホ−p38および総−p38について実行する。加えて、細胞をTNF−αとともに18時間インキュベートし、細胞を、アポトーシスの一般的なマーカー(開裂カスパーゼ−3および開裂ポリ(ADP−リボース)ポリメラーゼ(PARP)が挙げられる)について染色する。アポトーシスもまた、TUNELおよびアネキシン−V染色を使用して測定する。全ての画像を、Matlabプログラムを使用して定量化し、%陽性として表現する。ウェスタンブロットをスキャンし、Bio−Rad製のQuantity Oneソフトウェアを使用して定量化する。全ての実験を、少なくとも3回繰り返し、その後、ANOVA、続いて適切な後検定を使用して群間の統計的な比較を行う。
実験設計:PK−p38iを、上記の方法に記載されるように生成する。成体の雄性Sprague−Dawleyラットを、冠状動脈結紮、その直後に空のPK、PK−p38iまたはSB239063単独の注射に供する。冠状動脈結紮から1日後、7日後、14日後および28日後に、ラットを屠殺し、心臓を4%パラホルムアルデヒドで固定し、免疫組織学的評価のために包埋する(n≧5)。梗塞ゾーンにおける、c−Kit陽性細胞およびSca−1陽性細胞の存在およびサイズを、免疫蛍光検査およびイメージングソフトウェアを使用して分析し、盲検かつ無作為化様式で実行する。その上、心臓の幹細胞マーカーであるc−KitまたはSca−1および生存因子(survival factor)ホスホ−Aktについての二重染色を、二重免疫蛍光検査を使用して調べる。さらに、TUNELおよび開裂カスパーゼ−3染色もまた、c−KitおよびSca−1と共局在し、PK−p38i送達が、これらの内因性幹細胞の生存を改善するか否かを決定する。成熟/分化を測定するために、本発明者らは、心臓マーカーであるα−サルコメアアクチニン、トロポニンTの発現について、そしてサルコメアの存在について、これらの先祖細胞を調べる。最後に、複製を測定するために、本発明者らは、BrdU取り込みならびにc−kitおよびsca−1陽性幹細胞のKi67染色を調べる。本発明者らの先の研究は、屠殺の2時間前の、BrdUの単回のボーラス注射が、増殖する細胞を測定するために十分であることを実証する。上記の免疫組織学的評価のために、陽性細胞を、手動およびMatlabで書かれたプログラムで数え、%陽性として表現する。さらに、本発明者らは、Matlabでの、細胞のサイズを計数するためのプログラム(本発明者らが、移植した細胞のサイズを測定するために以前に使用した)を作製した(Davisら、Local myocardial insulin−like growth factor 1(IGF−1) delivery with biotinylated peptide nanofibers improves cell therapy for myocardial infarction Proc Natl Acad Sci U S A(2006)103(21):8155−60)。本発明者らの発表した研究において、この方法は信頼でき、標準化アッセイにおいてわずかな変動性しか有さない。群を、ANOVA比較(適切な後検定を使用する)を使用することによって統計的に比較する。全ての動物の数を、免疫組織化学染色、その後の細胞計数のための本発明者らの以前に発表した標準偏差を使用する検出力分析を実行することによって正当化した。
実験設計:方法のセクションに記載されるように、心臓の幹細胞を単離し、培養する。使用する前に、細胞に、追跡のために、血球凝集素(hemagglutanin)をコードするアデノウイルスで感染させる。無作為化かつ二重盲検の様式で、成体の雄性Sprague−Dawleyラット(群あたりn≧5)での冠状動脈結紮の直後に、細胞のみ、細胞と空のPK、細胞と遊離のSB239063または細胞とPK−p38iを、目視で検査するように梗塞ゾーンに注射する。全ての研究において、注射あたり500,000個の細胞を使用する。なぜなら、本発明者らは、以前にこの量の注射で成功しているからである(Davisら、Local myocardial insulin−like growth factor 1 (IGF−1) delivery with biotinylated peptide nanofibers improves cell therapy for myocardial infarction. Proc Natl Acad Sci U S A(2006)103(21):8155−60)。心エコー検査および心臓のMRIを、軽い麻酔下で、梗塞から3日後、14日後および28日後に、訓練をつんだ技術者によって二重盲検様式で実施する。心機能に加えて、心臓を、3日および28日に回収し、4%パラホルムアルデヒドで固定し、免疫組織学的評価のために包埋する(時点あたり、群あたりn≧5)。切片を、血球凝集素(hemagglutanin)、ならびにアポトーシスの評価のために開裂カスパーゼ−3およびTUNELについて共染色する。本発明者らは、細胞を追跡するために血球凝集素(hemaglutanning)およびGFPアデノウイルスを以前に使用し、細胞のうちの95%超を染色することが可能である(図47)。データを、これらのマーカーについて陽性の移植された幹細胞のパーセンテージとして表現する。アポトーシスマーカーの測定に加えて、本発明者らはまた、心臓の成熟マーカー(心ミオシン、α−サルコメアアクチニンおよびトロポニンTが挙げられる)についても染色し、分化/成熟を決定する。最後に、切片を血球凝集素(hemagglutanin)で染色し、サイズをMatlabで書かれたプログラムを使用して測定する。全てのデータを、ANOVA、続いて適切な後検定を使用して統計的有意性について評価する。本発明者らは、空のPKと比較して、PK−p38iがTNF−α処理された細胞における開裂カスパーゼ−3の活性化を有意に阻害するが、遊離のSB239063が適切なコントロールであるはずであることを予測する。このことは、TUNELおよびアネキシン−V染色を含む、アポトーシスについての他のマーカーにおいて明らかであるはずである。生存に対する影響に加えて、本発明者らはまた、この保護が、成熟心臓のマーカー染色によって測定される場合に、子ウシ血清/デキサメタゾンに誘導される分化の増大に移されることも予測する。
この実施例において、ポリ(シクロヘキサン−1,4−ジイル アセトン ジメチレン ケタール)(PCADK)の加水分解の速度論を、種々の親水性を有する他のジオールとの共重合を介して、その親水性を制御することによって操作するための戦略を提示する。PCADKに基づく、6つのポリケタール共重合体PK1〜PK6を合成した。
ポリケタール共重合体を、短経路蒸留ヘッドに接続した25mL 2ツ首フラスコ内で合成した。ジオールである1,4−シクロヘキサンジメタノール(1.04g、7.25mmol)と、1,4−ブタンジオール、1,5−ペンタンジオール、1,6−ヘキサンジオールまたは1,8−オクタンジオールのいずれかとを、20mLの蒸留ベンゼン中に溶解し、100℃に保持した。550μLの酢酸エチルに溶解させた、再結晶させたp−トルエンスルホン酸(5.5mg、0.029mmol)を、このベンゼン溶液に添加した。酢酸エチルを蒸留して除去し、蒸留した2,2−ジメトキシプロパン(2つのジオールを合わせたモル量と等しい)を添加して反応を開始した。次に、さらなる用量の2,2−ジメトキシプロパン(500μL)およびベンゼン(2mL)を、6時間にわたって、1時間毎に計量漏斗を介して反応物に添加し、蒸留除去された2,2−ジメトキシプロパンおよびベンゼンを埋め合わせた。24時間後、反応を、100μLのトリエチルアミンを添加することによって停止させた。重合体を、冷ヘキサンへの沈殿によって単離し、1H−NMRおよびGPCによって分析した。一般的に、生じた重合体は、2000〜4000Daの間の数平均分子量を有した。表1は、合成したポリケタール共重合体の組成および分子量を列挙する。1H NMRスペクトルを、溶媒としてCDCl3を使用するVarian Mercury VX 400 MHz NMR分光計(Palo Alto、CA)を使用して取得した。これらのポリケタール共重合体のH−NMRスペクトルを、代表的な例として以下にまとめ、PK3の1H−NMRを図50に示す。1,5−ペンタンジオール対1,4−シクロヘキサンジメタノールのモル比を、ピークaおよびb下のそれぞれの面積の比を取得することによって取得した。
PCADKに基づく6つのポリケタール共重合体PK1〜PK6(表1、下記)を、アセタール交換反応を使用して合成した。PCADKの共重合体を、1,4−シクロヘキサンジメタノールとブタンジオール、ペンタンジオール、ヘキサンジオールおよびオクタンジオールのいずれかとを共重合することによって合成した。これらのジオールの親水性は、それらの各々のlogP値(表2、下記)によって証明されるように、1,4−シクロヘキサンジメタノール(logP=1.46)の親水性とは異なる。図51は、上記のポリケタールを作製するために使用したアセタール交換反応の合成スキーム、およびそれらの加水分解から生成された分解産物を示す。これら全てのポリケタール共重合体の合成は、一工程、多グラム(multi−gram)のスケール、50%〜60%の収率で達成した。一般的に、CDMではなくジオールの導入は、合成にいかなる複雑化も生じず、PCADKの合成のために開発した手順は、共重合体の合成のために適していた。重要なことに、合成した全てのコポリケタール(copolyketal)は結晶性であり、したがって、マイクロ粒子への処方の可能性を有する。
この実施例において、本発明のポリケタール分子を、活性物質を結合し得るリンカーを使用して改変した。具体的には、ニトリロ三酢酸(NTA)リンカーをPCADKに添加した。ニッケル(Ni)でロードした場合、NTAリンカーは、ヒスチジンタグ付きタンパク質の結合を可能にした(図54)。次に、改変したPCADKは、活性物質(例えば、増殖因子)の迅速な送達に理想的なマイクロスフェアを形成した(図55)。
NTAリンカーを含むPCADK粒子の合成
PCADKは、上記に記載されるように以前に合成されている(Lee Sら、Polyketal microparticles:a new delivery vehicle for superoxide dismutase. Bioconjug Chem.(2007)Jan〜Feb;18(1):4〜7、ならびにHeffeman MJおよびMurthy N. Polyketalnanoparticles:a new pH−sensitive biodegradable drug delivery vehicle. Bioconjug Chem.(2005)Nov−Dec;16(6):1340−2(これらは、参考として本明細書に援用される)もまた参照のこと)。
His−タグ付きタンパク質に結合し得る粒子を得るために、粒子にニッケルをロードする必要があった。したがって、粒子を、10mg/mLの50mM NiCl2とともにインキュベートし、室温で2時間攪拌した。ニッケルの取り込みを決定するために、本発明者らは、粒子をNiCl2とともに一晩インキュベートし、そして粒子を遠心分離し、上清内の未結合のニッケルを分光光度的に測定した。図57のデータが実証するように、種々のNTAローディングにおいて、溶液中の遊離のニッケルが減少し、粒子にニッケルがロードしたことを示した。
粒子上のNiNTAがHis−タグ付きタンパク質を結合し得るか否かを決定するために、種々の濃度のHis−GFPを、4℃で一晩、PCADK−NiNTA(1%溶液w/v)とともにインキュベートした。粒子を遠心分離し、PBSで数回洗浄し、その後、分析のために再懸濁した。図58は、表示のためにグレースケールに変換した、GFPについての代表的な蛍光染色である。画像が示すように、これらの粒子は、その表面にGFPを保持した。結合したHis−GFPの量をさらに定量化するために、粒子に、増加量のHis−GFPをロードし、数回洗浄し、結合のレベルを決定するためにこれらの粒子に対してELISAを実行した。図59のデータ(1% NTA)および図60のデータ(10% NTA)が示すように、PCADK−NiNTAは、用量依存的にHis−タグ付きタンパク質を結合した。1% NTAにおいて、これらの粒子は、60ng His−GFPのローディングで結合が飽和し、一方、10% NTAでは、120ng His−GFPのローディングで飽和に達した。線形範囲の大半の点において、結合は、おおよそ50%有効(efficient)であった。図62のデータは、His−GFPのパーセント結合が、NTAの量とともに増大する(encrease)ことを示す。図28は、NTAへのHis−GFP結合が少なくとも15時間安定であることを示す。
Claims (44)
- PK1、PK2、PK3、PK4、PK5またはPK6である、ポリケタール重合体。
- 請求項1に記載のポリケタール重合体を含む生分解性粒子。
- 1つ以上の活性物質をさらに含む、請求項2に記載の粒子。
- (a)1つ以上のPK1、PK2、PK3、PK4、PK5またはPK6、および
(b)活性物質、
を含む、生分解性粒子。 - ナノ粒子またはマイクロ粒子である、請求項2または4に記載の粒子。
- 約50nm〜1000μmのサイズまたは約200nm〜600μmのサイズである、請求項2または4に記載の粒子。
- 前記活性物質が、治療剤、予防剤または診断用薬剤である、請求項3または4に記載の粒子。
- 前記治療剤が、免疫調節剤である、請求項7に記載の粒子。
- 請求項8に記載の粒子であって、前記免疫調節剤が、
a.TLR2、3、4、5、7、8、9、10および11のいずれかに対するリガンドまたはその組み合わせ、
ならびに
b.樹状細胞、マクロファージまたは抗原提示細胞内の調節経路のインヒビター
c.RIG−1、dectin−1およびDC−SIGNを含む任意のC型レクチン、またはキャタピラタンパク質に対するリガンド
からなる群から選択される、粒子。 - 請求項9に記載の粒子であって、前記インヒビターが、(a)ERK、c−Fos、Foxp3、PI3キナーゼ、Akt、JNK、p38、NF−Kb、STAT 1、STAT2、IRF3、IRF7、IFN−αのシグナリングのインヒビター;または(b)SOCS 1、2、3、もしくは他のSOCSタンパク質のインヒビターからなる群から選択される、粒子。
- 前記活性物質が、タンパク質、ペプチド、炭水化物、核酸、低分子、イメージング剤、ワクチン抗原および/またはワクチンである、請求項3または4に記載の粒子。
- 前記タンパク質が、増殖因子、サイトカイン、抗酸化タンパク質(antoxidant protein)、抗体、エリスロポエチン(EPO)、レセプターリガンドである、請求項11に記載の粒子。
- 前記核酸が、DNA、RNA、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはsiRNAである、請求項11に記載の粒子。
- 前記低分子が、キナーゼインヒビター、ホスファターゼインヒビター、レセプターブロッカー、低分子抗酸化物質模倣物、細胞骨格再構成インヒビター、レセプターリガンドである、請求項11に記載の粒子。
- さらにリンカーを含む、請求項2または4に記載の粒子。
- 前記リンカーが、ストレプトアビジン、RDG、GST、ssDNA、ヘモグロビン、アミノ酸配列、抗体、ポリカルボン酸および/またはキレート剤である、請求項15に記載の粒子。
- 前記キレート剤が、ニトリロ三酢酸(NTA)リガンド、ビピラドールまたはEDTAである、請求項16に記載の粒子。
- 前記リンカーが、タンパク質、ペプチドおよび/または炭水化物に結合する、請求項15に記載の粒子。
- 前記タンパク質、ペプチドおよび/または炭水化物が、ヒスチジンタグを含む、請求項18に記載の粒子。
- 前記ヒスチジンタグが、約2〜8個のヒスチジンを含む、請求項19に記載の粒子。
- 前記ヒスチジンタグが、約6個のヒスチジンを含む、請求項19に記載の粒子。
- 前記タンパク質が、治療用タンパク質、予防用タンパク質または診断用タンパク質である、請求項18に記載の粒子。
- 前記治療用タンパク質、予防用タンパク質または診断用タンパク質が、増殖因子、サイトカイン、抗酸化酵素または抗体、エリスロポエチン(EPO)、レセプターリガンドである、請求項22に記載の粒子。
- 請求項1に記載のポリケタール重合体を含む、薬学的組成物。
- 請求項3または4に記載の粒子を含む、薬学的組成物。
- 被験体に活性物質を送達するための方法であって、該被験体に請求項3または4に記載の粒子を投与する工程を含み、該粒子は、活性物質が、放出され、そして該被験体へ送達されるように該被験体内で分解される、方法。
- 請求項26に記載の方法により、疾患または障害に影響し得る活性物質を送達することによって、該疾患または障害に罹患した被験体を処置する方法。
- 前記疾患または障害が、自己免疫疾患、アレルギー疾患、感染症、移植、糖尿病および癌に関連する障害または合併症からなる群より選択される、請求項27に記載の方法。
- 前記感染症が、HIV、マラリア、TB、SARS、炭疽、エボラ、インフルエンザ、トリインフルエンザおよびHCVからなる群より選択される、請求項28に記載の方法。
- 前記自己免疫疾患が、狼瘡、慢性関節リウマチ、乾癬、喘息およびCOPDからなる群より選択される、請求項28に記載の方法。
- 被験体にタンパク質、ペプチドおよび/または炭水化物を送達するための方法であって、該被験体に請求項18に記載の粒子を投与する工程を含み、該粒子は、該タンパク質、ペプチドおよび/または炭水化物が放出され、そして該被験体に送達されるように該被験体内で分解される、方法。
- 請求項31に記載の方法により、疾患または障害に影響し得るタンパク質、ペプチドおよび/または炭水化物を送達することによって、該疾患または障害に罹患した被験体を処置する方法。
- 前記疾患または障害が、自己免疫疾患、アレルギー疾患、感染症、移植、糖尿病および癌に関連する障害または合併症からなる群より選択される、請求項32に記載の方法。
- 前記感染症が、HIV、マラリア、TB、SARS、炭疽、エボラ、インフルエンザ、トリインフルエンザおよびHCVからなる群より選択される、請求項33に記載の方法。
- 前記自己免疫疾患が、狼瘡、慢性関節リウマチ、乾癬、喘息およびCOPDからなる群より選択される、請求項33に記載の方法。
- 請求項3または4に記載の粒子を作製するための方法であって、該方法は、
a.PK1、PK2、PK3、PK4、PK5および/またはPK6重合体を形成する工程;ならびに、
b.1つ以上の活性物質の存在下で、1つ以上のa)の重合体の粒子を形成する工程、
を包含し、それによって請求項3または4に記載の粒子を作製する、方法。 - 前記活性物質が、治療剤、予防剤または診断用薬剤である、請求項36に記載の方法。
- 前記治療剤が、免疫調節剤である、請求項37に記載の方法。
- 請求項38に記載の方法であって、前記免疫調節剤が、
a.TLR2、3、4、5、7、8、9、10および11のいずれかに対するリガンドまたはその組み合わせ、
b.樹状細胞、マクロファージまたは抗原提示細胞内の調節経路のインヒビター、
c.RIG−1、dectin−1およびDC−SIGNのような任意のC型レクチン、または任意のキャタピラタンパク質に対するリガンド
からなる群から選択される、方法。 - 請求項39に記載の方法であって、前記インヒビターが、(a)ERK、c−Fos、Foxp3、PI3キナーゼ、Akt、JNK、p38、NF−Kb、STAT1、STAT2、IRF3、IRF7、IFN−αのシグナリングのインヒビター;または(b)SOCS 1、2、3、もしくは他のSOCSタンパク質のインヒビターからなる群から選択される、方法。
- 前記活性物質が、タンパク質、ペプチド、炭水化物、核酸、低分子、イメージング剤、ワクチン抗原および/またはワクチンである、請求項36に記載の方法。
- 前記タンパク質が、増殖因子、サイトカイン、抗酸化タンパク質(antoxidant protein)、抗体、エリスロポエチン(EPO)またはレセプターリガンドである、請求項41に記載の方法。
- 前記核酸が、DNA、RNA、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはsiRNAである、請求項41に記載の粒子。
- 前記低分子が、キナーゼインヒビター、ホスファターゼインヒビター、レセプターブロッカー、低分子抗酸化物質模倣物、細胞骨格再構成インヒビターまたはレセプターリガンドである、請求項41に記載の粒子。
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