JP2019530705A - 腎がんの治療のための方法及び医薬組成物 - Google Patents

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Abstract

本発明は、腎がんの治療のための方法及び医薬組成物に関する。発明者らは、Elabela(ELA)は主に腎臓で発現されるが、ヒト腎がんではその発現が低下することを示した。異種移植片動物モデル(皮下又は被膜下注射)において、Elaは腫瘍の進行を阻害する。特に本発明は、必要とする対象の腎がんを治療する方法であって、配列番号1(QRPVNLTMRRKLRKHNCLQRRCMPLHSRVPFP)と少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列を含む治療有効量のELAポリペプチドを対象に投与する工程を含み、9、10、20又は21位のアルギニン残基(R)が任意選択で突然変異する、方法に関する。

Description

本発明は、腎がんの治療のための方法及び医薬組成物に関する。
腎臓におけるがんは、全ての固形腫瘍の約3%を占める。腎腫瘍の約85%は腎細胞癌(RCC)に分類される。診断されたRCCの約80%が、腎臓の尿形成管である尿細管の近位部分を裏打ちする上皮細胞に起源をもつ。顕微鏡下での外観より、このがん型には、腎明細胞癌(RCCC、65%)又は腎乳頭細胞癌(renal papillary cell carcinoma)(RPCC、15%)のいずれかが知られる。腎細胞癌(RCC)は米国で8番目に多い悪性腫瘍であり、2016年の推定される新規症例は62,700例あり、推定死亡者数は14,240名であった。過去10年間でRCCの遺伝子的及び代謝的基礎についての理解が進んだことで、転移性RCC(mRCC)を治療するいくつかの新たな標的療法の開発につながった。転移性疾患の環境では、血管新生を標的とするチロシンキナーゼ阻害剤(TKI)及び/又は哺乳類ラパマイシン標的タンパク質(mTOR)阻害剤の連続使用により、40カ月の範囲での無増悪生存期間及び全生存期間の延長がもたらされうる。この進歩にもかかわらず、これらの薬物に対する持続的応答は非常にまれである。したがって、代替の治療戦略を見つける必要がある。Toddler又はApelaとしても公知のElabela(ELA)は、APJ、アペリン受容体の第2のリガンドとして最近特定されたペプチドホルモンである。ELAは32アミノ酸(aa)の前駆体として産生されるが、21aa及び11aaとしても見いだされる。ELAは、ヒト多能性幹細胞並びに成人の腎臓及び前立腺において限定的に発現される。
米国特許第6,013,516号 米国特許第5,994,136号
Smith及びWaterman、Adv. Appl. Math.、2:482頁、1981 Needleman及びWunsch、J. Mol. Biol、48:443頁、1970 Pearson及びLipman、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.、85:2444頁、1988 Higgins及びSharp、Gene、73:237〜244頁、1988 Higgins及びSharp、CABIOS、5: 151〜153頁、1989 CorpetらNuc. Acids Res.、16: 10881〜10890頁、1988 Huangら、Comp. Appls Biosci.、8: 155〜165頁、1992 Pearsonら、Meth. Mol. Biol、24:307〜31頁、1994 Altschulら、Nat. Genet.、6: 119〜129頁、1994 Myers及びMiller、CABIOS 4: 11〜17頁、1989 Altschulら、J. Mol. Biol、215:403〜410頁、1990 Gish. & States、Nature Genet.、3:266〜272頁、1993 MaddenらMeth. EnzymoL、266: 131〜141頁、1996 Altschulら、Nucleic Acids Res.、25:3389〜3402頁、1997 Zhang & Madden、Genome Res.、7:649〜656頁、1997
本発明は、腎がんの治療のための方法及び医薬組成物に関する。特に、本発明は特許請求の範囲により定義される。
発明者らは、Elabela(ELA)は主に腎臓で発現されるが、ヒト腎がんではその発現が低下することを示す。異種移植片動物モデル(皮下又は被膜下注射)において、Elaは腫瘍の進行を阻害する。これらの発見により、Elaが腎臓における新たな腫瘍サプレッサー遺伝子として特定される。
したがって、本発明の第1の目的は、必要とする対象の腎がんを治療する方法であって、配列番号1(QRPVNLTMRRKLRKHNCLQRRCMPLHSRVPFP)と少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列を含む治療有効量のELAポリペプチドを対象に投与する工程を含み、9、10、20又は21位のアルギニン残基(R)が任意選択で突然変異する、方法に関する。
本明細書で使用される場合、「腎がん」という用語は、当技術分野での一般的な意味を有し、腎臓で生じたがんを指す。一部の実施形態において、腎がんは、腎細胞癌である。「腎細胞がん」又は「腎細胞癌」(RCC)という用語は、本明細書で使用される場合、近位曲尿細管の裏打ち(lining)を起源とするがんを指す。より具体的には、RCCはいくつかの比較的一般的な組織学的サブタイプを包含する:明細胞腎細胞癌、乳頭(好色素性)癌、嫌色素性癌、集合管癌、及び髄様癌。明細胞腎細胞癌(ccRCC)はRCCの最も一般的なサブタイプである。
本明細書で使用される場合、「治療」又は「治療する」という用語は、疾患にかかるリスクがあるか疾患にかかっている疑いがある患者、及び病気であるか疾患又は医学的状態を患っていると診断された患者の治療を含む、予防的(prophylactic)すなわち予防的(preventive)治療、及び治療用又は疾患修飾治療の両方を指し、臨床での再発の抑制を含む。障害又は障害の再発の、発症を予防し、治癒し、遅らせ、重症度を低下させ、又は1つ若しくは複数の症状を寛解させるために、又はこのような治療の非存在下で予期される生存期間を超えて対象の生存期間を延長させるために、医学的障害を有するか障害を最終的に獲得する可能性のある対象に治療が投与されうる。「治療レジメン」により、病気の治療パターン、例えば、療法中使用される投与パターンが意図される。治療レジメンは、導入レジメン及び維持レジメンを含みうる。「導入レジメン」又は「導入期間」という用語は、疾患の初期の治療に使用される治療レジメン(又は治療レジメンの一部)を指す。導入レジメンの一般的な目標は、治療レジメンの初期の期間中に高レベルの薬物を患者に与えることである。導入レジメンでは、維持レジメン中に医師が使用するよりも大きい用量の薬物を投与すること、維持レジメン中に医師が薬物を投与するよりも高頻度に薬物を投与すること、又はその両方を含みうる「負荷レジメン」を(一部又は全体において)使用することができる。「維持レジメン」又は「維持期間」という用語は、例えば、患者を長期間(数カ月又は数年)寛解状態に維持するため、病気治療中の患者の維持に使用される治療レジメン(又は治療レジメンの一部)を指す。維持レジメンでは、継続的な療法(例えば、定期的な間隔、例えば、毎週、毎月、毎年等、で薬物を投与すること)又は間欠的な療法(例えば、断続的治療、間欠的治療、再発時の治療、又は特定の所定の基準[例えば、疾患の徴候等]達成時の治療)を使用することができる。
本発明によれば、第2のアミノ酸配列と少なくとも90%の同一性を有する第1のアミノ酸配列は、第1の配列が第2のアミノ酸配列と90;91;92;93;94;95;96;97;98;99又は100%の同一性を有することを意味する。配列同一性は、パーセンテージ同一性(又は類似性又は相同性)の観点から頻繁に測定され、パーセンテージが高ければ高いほど、2つの配列は類似性が高い。比較のための配列アラインメント方法は当技術分野で周知である。各種プログラム及びアラインメントアルゴリズムが以下に記載される:Smith及びWaterman、Adv. Appl. Math.、2:482頁、1981; Needleman及びWunsch、J. Mol. Biol、48:443頁、1970; Pearson及びLipman、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.、85:2444頁、1988; Higgins及びSharp、Gene、73:237〜244頁、1988; Higgins及びSharp、CABIOS、5: 151〜153頁、1989; CorpetらNuc. Acids Res.、16: 10881〜10890頁、1988; Huangら、Comp. Appls Biosci.、8: 155〜165頁、1992;並びにPearsonら、Meth. Mol. Biol、24:307〜31頁、1994)。Altschulら、Nat. Genet.、6: 119〜129頁、1994は、配列アラインメント方法及び相同性算出の詳細な検討について提示する。例として、アラインメントツールALIGN(Myers及びMiller、CABIOS 4: 11〜17頁、1989)又はLFASTA(Pearson及びLipman、1988)を使用して、配列比較(Internet Program(登録商標)1996、W. R. Pearson及びUniversity of Virginia、fasta20u63バージョン2.0u63、公開日付1996年12月)を実施することができる。ALIGNは配列全体を互いに比較し、LFASTAは局所的類似領域を比較する。これらのアラインメントツール及びその各手引きはインターネットで、例えばNCSAウェブサイトで利用可能である。或いは、アミノ酸約30超のアミノ酸配列の比較には、デフォルトパラメータ(ギャップ存在コスト11、及び残基あたりギャップコスト1)に設定したデフォルトBLOSUM62マトリックスを使用して、Blast 2 sequences機能を使用することができる。短鎖ペプチド(アミノ酸約30未満)をアラインメントする場合は、デフォルトパラメータ(オープンギャップ9、伸長ギャップ1ペナルティ)に設定したPAM30マトリックスを使用するBlast 2 sequences機能を使用して、アラインメントを実施すべきである。BLAST配列比較システムは、例えばNCBIウェブサイトより利用可能である。Altschulら、J. Mol. Biol、215:403〜410頁、1990; Gish. & States、Nature Genet.、3:266〜272頁、1993; MaddenらMeth. Enzymol、266: 131〜141頁、1996; Altschulら、Nucleic Acids Res.、25:3389〜3402頁、1997;及びZhang & Madden、Genome Res.、7:649〜656頁、1997も参照のこと。
本明細書で使用される場合、突然変異という用語は当技術分野での一般的な意味を有し、置換、欠失又は挿入を指す。「置換」という用語は、特定の位置の特定のアミノ酸残基が除去され、別のアミノ酸残基が同じ位置に挿入されることを意味する。「欠失」という用語は、特定のアミノ酸残基が除去されることを意味する。「挿入」という用語は、1つ又は複数のアミノ酸残基が、特定のアミノ酸残基の前又は後ろに挿入されることを意味し、より具体的には、1つ又は複数の、好ましくは1つ又は数個のアミノ酸残基が、特定のアミノ酸残基のカルボキシル基又はアミノ基に結合することを意味する。
一部の実施形態において、突然変異した9、10、20又は21位のアルギニン残基は、pH=7.4の側鎖電荷が反転する(例えば負電荷から正電荷へ)か、中性となる(例えば負電荷から中性電荷へ)ように置換される。一部の実施形態において、重量及びハイドロパシー指標は同じ範囲のままである。
一部の実施形態において、9、10、20又は21位のアルギニン残基(R)は、アラニン(A)及び/又はセリン(S)からなる群から選択されるアミノ酸残基により置換される。
本発明によれば、本発明のELAポリペプチドは、従来の自動ペプチド合成法又は組換え発現により産生される。タンパク質を設計及び作製する一般的な原理は当業者に周知である。本発明のELAポリペプチドは、従来の技術に従って、溶液中又は固体支持体上で合成することができる。各種自動合成機が市販されており、Stewart及びYoung; Tarnら、1983; Merrifield、1986並びにBarany及びMerrifield、Gross及びMeienhofer、1979に記載される公知のプロトコールに従って使用可能である。本発明のELAポリペプチドは、Applied Biosystems Inc社のModel 433A等の例示的なペプチド合成機を使用する固相技術により合成することもできる。自動ペプチド合成又は組換え法により生成された任意の所与のタンパク質の純度は、逆相HPLC分析を使用して決定することができる。各ペプチドの化学的確実性は、当業者に周知の任意の方法により確立することができる。自動ペプチド合成の代替として、最適なタンパク質をコードするヌクレオチド配列が発現ベクターに挿入され、適切な宿主細胞に形質転換又はトランスフェクトされ、本明細書で以下に記載される発現に適した条件下で培養される組換えDNA技術を使用することができる。組換え法は、より長鎖のポリペプチドを産生するのに特に好ましい。ペプチド又はタンパク質コード配列を含み、発現するのに、様々な発現ベクター/宿主系が利用可能である。これらには、組換えバクテリオファージ、プラスミド又はコスミドDNA発現ベクターで形質転換させた細菌等の微生物;酵母発現ベクターで形質転換させた酵母(Giga-Hamaら、1999);ウイルス発現ベクター(例えば、バキュロウイルス、Ghoshら、2002を参照のこと)に感染させた昆虫細胞系;ウイルス発現ベクター(例えば、カリフラワーモザイクウイルス、CaMV;タバコモザイクウイルス、TMV)でトランスフェクトした、又は細菌発現ベクター(例えば、Ti又はpBR322プラスミド;例えば、Babeら、2000を参照のこと)で形質転換させた植物細胞系;又は動物細胞系が含まれるがこれらに限定されない。当業者は、タンパク質の哺乳類での発現を最適化するための各種技術に精通しており、例えば、Kaufman、2000; Colosimoら、2000を参照のこと。組換えタンパク質産生に有用な哺乳類細胞には、VERO細胞、HeLa細胞、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞株、COS細胞(COS-7等)、W138、BHK、HepG2、3T3、RIN、MDCK、A549、PC12、K562及び293細胞が含まれるがこれらに限定されない。細菌、酵母及びその他の無脊椎動物におけるペプチド基質又は融合ポリペプチドの組換え発現のための例示的なプロトコールは当業者に公知であり、本明細書で以下に簡潔に記載される。組換えタンパク質の発現のための哺乳類宿主系も当業者に周知である。宿主細胞株は、発現されたタンパク質をプロセシングする特定の能力、又はタンパク質活性をもたらすのに有用な特定の翻訳後修飾を生ずる特定の能力について選択されうる。このようなポリペプチド修飾には、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化及びアシル化が含まれるがこれらに限定されない。タンパク質の「プレプロ」形態を切断する翻訳後プロセシングも、的確な挿入、フォールディング及び/又は機能にとって重要となりうる。CHO、HeLa、MDCK、293、WI38等の様々な宿主細胞は、このような翻訳後活性のための特定の細胞機構及び特有の機序を有し、導入された外来性タンパク質の的確な修飾及びプロセシングを確実にするように選択されうる。
一部の実施形態において、本発明の治療方法に使用される本発明のELAポリペプチドが、その治療有効性を改善するために修飾されうることが企図される。このような治療用化合物の修飾は、毒性を低下させ、循環時間を増加させ、又は体内分布を改変するために使用されうる。例えば、潜在的に重要な治療用化合物の毒性を、体内分布を改変する様々な薬物担体媒体との組み合わせにより顕著に低下させることができる。薬物残存率を改善するための戦略は水溶性ポリマーの利用である。各種水溶性ポリマーが、体内分布を改変し、細胞による取り込みの様式を改善し、生理的バリアを介しての透過性を変化させ、体からのクリアランス速度を改変することが示される。標的化又は持続放出効果のいずれかを達成するため、末端基として、主鎖の一部として、又はポリマー鎖のペンダント基として薬物部分を含む水溶性ポリマーが合成されてきた。高度な生体適合性及び修飾の容易さを前提として、ポリエチレングリコール(PEG)が薬物担体として広く使用されてきた。各種薬物、タンパク質、及びリポソームに結合させることで、滞留時間が改善され、毒性が低下することが示される。PEGは、鎖の末端でヒドロキシル基を介して、その他の化学的方法により活性薬剤に結合しうる。しかし、PEG自体は1分子あたり最大でも活性薬剤2つに制限される。異なる手法では、PEGの生体適合特性を維持しており、かつ1分子あたりの結合点が多い(薬物担持量の増加がもたらされる)という追加の利点を有し、様々な応用に適合するように合成により設計されうる新たな生体材料として、PEG及びアミノ酸のコポリマーが探索された。
本発明の第2の目的は、必要とする対象の腎がんを治療する方法であって、本発明のELAポリペプチドをコードする治療有効量の核酸分子を対象に投与する工程を含む、方法に関する。
本明細書で使用される場合、「核酸分子」という用語は当技術分野での一般的な意味を有し、DNA又はRNA分子を指す。しかしこの用語は、以下に限定されないが、4-アセチルシトシン、8-ヒドロキシ-N6-メチルアデノシン、アジリジニルシトシン、シュードイソシトシン、5-(カルボキシヒドロキシルメチル)ウラシル、5-フィウオロウラシル、5-ブロモウラシル、5-カルボキシメチルアミノメチル-2-チオウラシル、5-カルボキシメチル-アミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、イノシン、N6-イソペンテニルアデニン、1-メチルアデニン、1-メチルシュードウラシル、1-メチルグアニン、1-メチルイノシン、2,2-ジメチルグアニン、2-メチルアデニン、2-メチルグアニン、3-メチルシトシン、5-メチルシトシン、N6-メチルアデニン、7-メチルグアニン、5-メチルアミノメチルウラシル、5-メトキシアミノ-メチル-2-チオウラシル、ベータ-D-マンノシルケオシン、5'-メトキシカルボニルメチルウラシル、5-メトキシウラシル、2-メチルチオ-N6-イソペンテニルアデニン、ウラシル-5-オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル-5-オキシ酢酸、オキシブトキソシン(oxybutoxosine)、シュードウラシル、ケオシン、2-チオシトシン、5-メチル-2-チオウラシル、2-チオウラシル、4-チオウラシル、5-メチルウラシル、-ウラシル-5-オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル-5-オキシ酢酸、シュードウラシル、ケオシン、2-チオシトシン、及び2,6-ジアミノプリン等の、DNA及びRNAの公知の塩基アナログのいずれかを含む配列を表す。
一部の実施形態において、本発明の核酸分子は、プラスミド、コスミド、エピソーム、人工染色体、ファージ又はウイルスベクター等の適切なベクターに含まれる。ゆえに、本発明の更なる目的は、本発明のELAポリペプチドをコードする核酸を含むベクターに関する。概してベクターは、アデノ随伴ウイルス(AAV)、レトロウイルス、ウシパピローマウイルス、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、ワクシニアウイルス、ポリオーマウイルス、又は感染性ウイルスであるウイルスベクターである。一部の実施形態において、ベクターはAAVベクターである。本明細書で使用される場合、「AAVベクター」という用語は、これに限定されないが、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、及びその突然変異形態を含むアデノ随伴ウイルスセロタイプ由来のベクターを意味する。AAVベクターは、AAV野生型遺伝子のうち1つ又は複数、好ましくはrep及び/又はcap遺伝子が全体的又は部分的に欠失するが、機能性の隣接ITR配列は維持しうる。レトロウイルスは、その遺伝子を宿主ゲノムに組み込み、多量の外来性の遺伝子材料を導入し、幅広い種及び細胞型を感染させ、特殊な細胞株にパッケージングされる能力ゆえに、遺伝子送達ベクターとして選択されうる。レトロウイルスベクターを構築するため、目的の遺伝子をコードする核酸が、複製欠損性のウイルスを産生するように、ウイルスゲノムの特定のウイルス配列の箇所に挿入される。ビリオンを産生するため、gag、pol、及び/又はenv遺伝子を含むがLTR及び/又はパッケージング成分を含まないパッケージング細胞株が構築される。レトロウイルスLTR及びパッケージング配列とともにcDNAを含む組換えプラスミドがこの細胞株に(例えばリン酸カルシウム沈殿により)導入されると、パッケージング配列により、組換えプラスミドのRNA転写物がウイルス粒子にパッケージングされ、次いで培養培地に分泌される。次いで組換えレトロウイルスを含む培地が収集され、任意選択で濃縮され、遺伝子導入に使用される。レトロウイルスベクターは、広範な細胞型を感染させることができる。レンチウイルスは、一般的なレトロウイルス遺伝子gag、pol、及びenvに加えて、調節又は構造的機能を有するその他の遺伝子を含む複合
レトロウイルス(complex retrovirus)である。より高度に複雑であることにより、ウイルスは、潜伏感染の過程でそうするように、その生活環を調節することができる。レンチウイルスの一部の例には、ヒト免疫不全ウイルス(HIV1、HIV2)及びサル免疫不全ウイルス(SIV)が含まれる。レンチウイルスベクターはHIV病原性遺伝子を多重弱毒化すること(multiply attenuating)により生成され、例えば、遺伝子env、vif、vpr、vpu及びnefを欠失させてベクターを生物学的に安全にする。レンチウイルスベクターは当技術分野で公知であり、例えば、ともに参照により本明細書に組み込まれる米国特許第6,013,516号及び5,994,136号を参照のこと。一般的に、ベクターはプラスミドベース又はウイルスベースであり、外来性核酸の組み込み、選択、及び核酸の宿主細胞への導入に必須の配列を保有するように構成される。目的のベクターのgag、pol及びenv遺伝子も当技術分野で公知である。したがって、適切な遺伝子が選択されたベクターにクローニングされ、次いで目的の標的細胞を形質転換するのに使用される。適切な宿主細胞が、パッケージング機能、すなわちgag、pol及びenv、並びにrev及びtatを保有する2つ以上のベクターでトランスフェクトされる、非***性の細胞を感染させることができる組換えレンチウイルスが、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第5,994,136号に記載される。これは、ウイルスのgag及びpol遺伝子をコードする核酸をもたらしうる第1のベクター、並びにパッケージング細胞を産生するためのウイルスのenvをコードする核酸をもたらしうる別のベクターについて記載する。そのパッケージング細胞に、異種遺伝子をもたらすベクターを導入することで、目的の外来性遺伝子を保有する感染性ウイルス粒子を放出する産生細胞が生じる。envは好ましくは、ヒト及びその他の種の細胞の形質導入を可能にするアンフォトロピックなエンベロープタンパク質である。概して、本発明の核酸分子又はベクターは、レシピエント細胞におけるコード配列の複製、転写及び翻訳を集合的にもたらす、プロモーター配列、ポリアデニル化シグナル、転写終結配列、上流調節ドメイン、複製起点、配列内リボソーム進入部位(「IRES」)、エンハンサー等を集合的に指す「制御配列」を含む。選択されたコード配列が、適切な宿主細胞において複製、転写及び翻訳されうる限り、これらの制御配列が必ずしも全て存在する必要はない。別の核酸配列は、DNA調節配列を含むヌクレオチド領域を指す通常の意味で本明細書において使用される「プロモーター」配列であり、ここで調節配列は、RNAポリメラーゼと結合して下流(3'方向)コード配列の転写を開始することができる遺伝子に由来する。転写プロモーターには、「誘導性プロモーター」(プロモーターに作動可能に連結したポリヌクレオチド配列の発現が、分析物、補因子、調節タンパク質等により誘導される場合)、「抑制性プロモーター」(プロモーターに作動可能に連結したポリヌクレオチド配列の発現が、分析物、補因子、調節タンパク質等により誘導される場合)、及び「構成的プロモーター」が含まれうる。
「治療有効量」により、任意の医学的処置に適用可能である妥当なベネフィット/リスク比での、疾患(例えば腎がん)の治療のための方法における使用のための、予防するのに十分な量のELAポリペプチド又はそれをコードする核酸分子が意図される。本発明の化合物及び組成物の1日の総使用量は、主治医により適切な医学的判断の範囲内で決定されることが理解されるはずである。任意の特定の対象に対する具体的な治療有効用量レベルは、対象の年齢、体重、全身の健康状態、性別及び食事;使用される特定の化合物の投与時間、投与経路、及び***率;治療期間;使用される特定のポリペプチドと組み合わせて、又は同時に使用される薬物;及び医学分野で周知の因子等を含む様々な因子によって決まる。例えば、望ましい治療効果を達成するのに必要なレベルよりも低いレベルで化合物の用量で開始し、望ましい効果が達成されるまで投与量を徐々に増加させることが、当技術分野の技術の範囲内で周知である。しかし、産物の1日投与量は、成人1人あたりで1日あたり0.01〜1,000mgという広範囲にわたって変動しうる。好ましくは、組成物は、治療を受ける対象に合わせて投与量を症状によって調節するため、活性成分0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、2.5、5.0、10.0、15.0、25.0、50.0、100、250及び500mgを含む。医薬は概して、活性成分約0.01mg〜約500mg、好ましくは活性成分1mg〜約100mgを含む。有効量の薬物は通常、1日あたり0.0002mg/体重1kg〜約20mg/体重1kg、特に1日あたり約0.001mg/体重1kg〜7mg/体重1kgの投与量レベルで与えられる。
本発明によれば、本発明のELAポリペプチド又は核酸分子(ベクターに挿入されるか又は挿入されない)は、医薬組成物の形態で対象に投与される。概して、本発明のELAポリペプチド又は核酸分子(ベクターに挿入されるか又は挿入されない)は、薬学的に許容される添加剤、及び任意選択で生分解性ポリマー等の持続放出マトリックスと組み合わされて、医薬組成物を形成することができる。「薬学的に」又は「薬学的に許容される」は、必要に応じて哺乳類、特にヒトに投与されても、有害反応、アレルギー反応又はその他の不適当な反応を生じない分子実体及び組成物を指す。薬学的に許容される担体又は添加剤は、任意の種類の、非毒性の固体、半固体又は液体の充填剤、希釈剤、封入物質又は製剤補助剤を指す。経口、舌下、皮下、筋肉内、静脈内、経皮、局所又は直腸投与用の本発明の医薬組成物では、単独の、又は別の活性成分と組み合わせた活性成分が、従来の医薬支持体との混合物として単位投与形態で動物及びヒトに投与されうる。適切な単位投与形態は、錠剤、ゲルカプセル剤、散剤、顆粒剤、及び経口懸濁剤又は液剤等の経口経路形態、舌下及びバッカル投与形態、エアロゾル剤、留置用剤、皮下、経皮、局所、腹腔内、筋肉内、静脈内、真皮下、経皮、髄腔内及び経鼻投与形態、並びに直腸投与形態を含む。概して医薬組成物は、注射可能な製剤用に薬学的に許容される媒体を含む。これらは特に、等張性の滅菌生理食塩水溶液(リン酸一ナトリウム若しくは二ナトリウム、塩化ナトリウム、カリウム、カルシウム若しくはマグネシウム等、又はこのような塩の混合物)、又は、場合に応じて滅菌水若しくは生理食塩水を添加すると注射溶液が構成される、乾燥した、特に凍結乾燥させた組成物であってよい。注射用途に適した医薬形態には、滅菌水溶液又は分散体;ゴマ油、ピーナッツ油又は水性プロピレングリコールを含む製剤;及び滅菌注射溶液又は分散体を即座に調製するための滅菌粉末が含まれる。全ての場合で、形態は滅菌済みでなければならず、容易に注射可能な程度に流動性でなければならない。形態は製造及び保存条件下で安定でなければならず、細菌及び真菌等の微生物の混入作用に対抗して保存されなければならない。遊離塩基又は薬理学的に許容される塩として本発明の化合物を含む溶液は、ヒドロキシプロピルセルロース等の界面活性剤と適切に混合された水で調製することができる。分散体も、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、及びそれらの混合物、及び油で調製することができる。通常の保存及び使用条件下で、これらの製剤は、微生物の増殖を防止するための保存料を含む。本発明のELAポリペプチド又は核酸分子(ベクターに挿入されるか又は挿入されない)は、中性又は塩の形態の組成物に製剤化することができる。薬学的に許容される塩には、例えば塩酸若しくはリン酸等の無機酸、又は酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸等の有機酸により形成される酸付加塩(タンパク質の遊離アミノ基で形成される)が含まれる。遊離カルボキシル基で形成される塩も、例えば、水酸化ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、又は第二鉄等の無機塩基、及びイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカイン等の有機塩基に由来するものであってよい。担体も、例えば、水、エタノール、ポリオール(例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコール等)、適切なそれらの混合物、及び植物油を含む溶媒又は分散媒体であってよい。例えば、レシチン等のコーティングの使用、分散体の場合は必要な粒径の維持、及び界面活性剤の使用により、適切な流動性が維持されうる。微生物の作用の防止は、各種抗細菌及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール等によりもたらされうる。多くの場合、等張剤、例えば、糖又は塩化ナトリウムを含むことが好ましい。注射組成物の吸収の延長は、吸収を遅らせる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを組成物に使用することによりもたらされうる。滅菌注射溶液は、必要な量の活性化合物を、必要に応じて、先に列挙されたその他の成分のうちいくつかを有する適切な溶媒に組み込み、その後濾過滅菌することにより調製される。一般的に分散体は、各種滅菌活性成分を、基本的な分散媒体及び先に列挙された成分のうち必要なその他の成分を含む滅菌媒体に組み込むことにより調製される。滅菌注射溶液を調製するための滅菌粉末の場合、一般的な調製方法は、活性成分及び任意の更なる望ましい成分の粉末を、あらかじめ滅菌濾過されたその溶液から得る、真空乾燥及び凍結乾燥技術である。直接注射用の、より濃縮された、又は高度に濃縮された溶液の調製も企図され、溶媒としてDMSOを使用することにより、極めて迅速な浸透がもたらされ、小さい腫瘍領域に高濃度の活性薬剤が送達されることが想定される。製剤されると、溶液は、剤形に適合するように、治療上有効な量で投与される。製剤は、上記の注射溶液型等の様々な剤形として容易に投与されるが、薬物放出カプセル剤等も使用可能である。水溶液での非経口投与では、例えば、溶液を必要に応じて適切に緩衝化するべきであり、まず液体希釈剤を十分な生理食塩水又はグルコースで等張にするべきである。これらの特定の水溶液は特に、静脈内、筋肉内、皮下及び腹腔内投与に適する。これに関連して、使用可能な滅菌水性媒体が、本開示の観点から当業者に公知である。治療を受ける対象の状態に応じて、投与量のある程度の変動が必ず発生する。いずれにせよ、投与に関与する人は個々の対象に適した用量を決定する。
本発明の更なる目的は、対象の腎がんを診断する方法であって:
i)前記対象から得られた試料中のElabela(ELA)発現レベルを測定する工程;
ii)工程i)で測定された発現を、その所定の参照値と比較する工程;
iii)Elabela(ELA)発現レベルがその所定の参照値より低ければ、対象は腎がんを患っていると結論付け、Elabela(ELA)発現レベルがその所定の参照値より大きければ、対象は腎がんを患っていないと結論付ける工程
を含む、方法に関する。
「診断すること」という用語は、本明細書で使用される場合、対象が腎がんを患っているか否かを評価することを意味する。
本発明は、以下の図及び実施例により更に説明される。しかし、これらの実施例及び図は決して、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
ヒトのがんの腎臓におけるElabelaの発現低下についてのグラフである。リアルタイムPCR分析により、同じ患者由来の偽正常組織と比較して、腎腫瘍組織ではelabelaがダウンレギュレートされることが明らかとなった。 腎腫瘍細胞(Renca)におけるElabela発現の、皮下腫瘍の進行に対する効果についてのグラフである。シンジェニックマウスへの播種前に、Elabela野生型(ela wt)、突然変異体(Ela mut)又は対照レンチウイルスを使用して、Renca細胞においてEla wt、ela mutを発現させた。 腎腫瘍細胞(Renca)におけるElabela発現の、腎腫瘍の進行に対する効果についてのグラフである。シンジェニックマウスへの被膜下播種前に、Elabela野生型(ela wt)又は対照レンチウイルスを使用して、Renca細胞においてela wtを発現させた。 ProElaプロセシングについての図である。野生型proEla32ペプチド、並びに2つの切断部位R31/R32及びR42/R43をそれぞれS31/S32及びS42/S43で置き換えたmut proEla32を合成し、フューリン(0.2×10-4U)とともに4時間インキュベートした。抗Ela抗体を使用するウェスタンブロッティングにより評価すると、フューリンは野生型proEla32を対応する生理的切断部位でプロセシングする。このペプチドをフューリンとともにインキュベートするとEla11aaのみが生成され、proEla32が2つの切断部位で効率的に切断されることが示唆される。mut proEla32をフューリンとともにインキュベートしても産物は生成されなかった。 マウス成体組織におけるEla、フューリン及びAPJの発現分析についてのグラフである。示された組織から総RNAを抽出し、マウスEla(A)、フューリン(B)、及びAPJ(C)に特異的なプライマーを使用してリアルタイムPCR分析を実施した。各試料において評価されたハウスキーピング遺伝子発現を、本文に記載される条件下での内在性対照として使用した。示される結果は3回の実験を表す。比較のため、分析を行った遺伝子発現のレベルに応じて、肝臓(Ela及びAPJ)又は腸(フューリン)に1の値を割り当てた。データは平均±SD(1群あたりn=3)である。 腎がん患者におけるEla、フューリン及びAPJの発現についてのグラフである。n=7の患者由来の腎臓臨床試料の腫瘍組織及び周辺の非腫瘍組織から総RNAを抽出し、ヒトEla、フューリン及びAPJに特異的なプライマーを使用してリアルタイムPCR分析を実施した。各試料において評価されたハウスキーピング遺伝子発現を、本文に記載される条件下での内在性対照として使用した。グラフは、値「1」を正常な組織に割り当て、示される転写物の発現が何倍差であるかを示す。腫瘍組織では、正常な対応物と比較してEla mRNAの発現が低下したことに留意されたい。 腎がん患者におけるEla、フューリン及びAPJの発現についてのグラフである。n=7の患者由来の腎臓臨床試料の腫瘍組織及び周辺の非腫瘍組織から総RNAを抽出し、ヒトEla、フューリン及びAPJに特異的なプライマーを使用してリアルタイムPCR分析を実施した。各試料において評価されたハウスキーピング遺伝子発現を、本文に記載される条件下での内在性対照として使用した。グラフは、値「1」を正常な組織に割り当て、示される転写物の発現が何倍差であるかを示す。腫瘍組織では、正常な対応物と比較してEla mRNAの発現が低下したことに留意されたい。 腎がん患者におけるEla、フューリン及びAPJの発現についてのグラフである。n=7の患者由来の腎臓臨床試料の腫瘍組織及び周辺の非腫瘍組織から総RNAを抽出し、ヒトEla、フューリン及びAPJに特異的なプライマーを使用してリアルタイムPCR分析を実施した。各試料において評価されたハウスキーピング遺伝子発現を、本文に記載される条件下での内在性対照として使用した。グラフは、値「1」を正常な組織に割り当て、示される転写物の発現が何倍差であるかを示す。腫瘍組織では、正常な対応物と比較してEla mRNAの発現が低下したことに留意されたい。 野生型及びmut proElaによる腫瘍増殖阻害についてのグラフである。腎臓Rencaがん細胞(Ela発現を欠く)に、空レンチウイルスベクター(対照)、又は野生型若しくは突然変異体proElaヒト構築物を含む同じベクターを安定に感染させた。これらの細胞におけるヒト野生型及びmut proElaの発現を、リアルタイムPCR及びヒトプライマーを使用して、ARNレベルで確認した。マウスElaプライマーの使用は、比較のために行った(A)。雄のシンジェニックBalb/cマウスの群3つに、1×105個の対照Renca細胞、及び野生型proEla32又は突然変異体proEla32を発現する同じ細胞を皮下接種した。示される期間中、動物を腫瘍形成についてモニタリングした。野生型proEla又はmut ProElaを発現する腫瘍細胞では、より小さいサイズの腫瘍が誘導されたことに留意されたい。野生型proEla32は、突然変異体proEla32と比較してより効率的に腫瘍増殖を阻害した。結果は、示されるレンチウイルスベクターに独立に感染させたRenca細胞を用いて実施された2回の実験を表す。値は平均±SEM(1群あたりn=6)である。***はP0.001未満。 野生型及びmut proElaによる腫瘍増殖阻害についてのグラフである。腎臓Rencaがん細胞(Ela発現を欠く)に、空レンチウイルスベクター(対照)、又は野生型若しくは突然変異体proElaヒト構築物を含む同じベクターを安定に感染させた。これらの細胞におけるヒト野生型及びmut proElaの発現を、リアルタイムPCR及びヒトプライマーを使用して、ARNレベルで確認した。マウスElaプライマーの使用は、比較のために行った(A)。雄のシンジェニックBalb/cマウスの群3つに、1×105個の対照Renca細胞、及び野生型proEla32又は突然変異体proEla32を発現する同じ細胞を皮下接種した。示される期間中、動物を腫瘍形成についてモニタリングした。野生型proEla又はmut ProElaを発現する腫瘍細胞では、より小さいサイズの腫瘍が誘導されたことに留意されたい。野生型proEla32は、突然変異体proEla32と比較してより効率的に腫瘍増殖を阻害した。結果は、示されるレンチウイルスベクターに独立に感染させたRenca細胞を用いて実施された2回の実験を表す。値は平均±SEM(1群あたりn=6)である。***はP0.001未満。 RENCA(20,000細胞4細胞/ウェル)細胞を96ウェルプレートにプレーティングし、IncuCyte ZOOM(商標)生細胞イメージングシステム(Essen BioScience社、MI USA)を使用して増殖アッセイを実施した。このシステムは細胞密度を測定する。細胞を、2%ウシ胎児血清を有するRPMI1640培地(Life Technologies社)において37℃で常法通り増殖させる。細胞をマイコプラズマ(Mycoplasma)(ATCC)について定期的にスクリーニングする。プレートをIncuCyte ZOOM(商標)装置に入れ、集団細胞伸展(collective cell spreading)の画像を50時間の総期間中、2時間ごとに記録する。
実施例１：
Toddler又はApelaとしても公知のElabela(ELA)は、APJ、アペリン受容体の第2のリガンドとして最近特定されたペプチドホルモンである。ELAは32アミノ酸(aa)の前駆体として産生されるが、21aa及び11aaとしても見いだされる。本発明者らの結果は、Elaは主に腎臓で発現され、ヒト腎がんではその発現が低下することを示す(図1)。ジェノグレフ動物モデル(皮下又は被膜下注射)で、Elaは腫瘍の進行を阻害する(図2及び図3)。更に本発明者らは、9、10、20及び21位のアルギニン残基がシステイン残基で置換された突然変異体ELAポリペプチドを生成した。本発明者らは、突然変異体ELAポリペプチドも腫瘍の進行を阻害することができることを示す(図2)。これらの発見により、Elaが腎臓における新たな腫瘍サプレッサー遺伝子として特定される。
実施例２：
材料及び方法
患者試料
新鮮な試料及びそれに対応する正常な組織をヒト腎腫瘍から得た。患者全員が書面によるインフォームドコンセントを提出した。患者材料は匿名化され、フランスの国家研究倫理審査委員会(national research ethics review committee)が試験プロトコールを承認した。外科手術後、組織検体を氷上に速やかに移し、RNA抽出に使用するまで液体窒素で急速冷凍した。
レンチウイルスベクター産生、細胞感染及び培養
野生型及び突然変異体proEla(プロセシング部位R31/R32及びR42/R43をS31/S32及びS42/S43aaで置き換えた)を、骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサーの制御下で、tdTomatoレポーター遺伝子(pRRLsin-MND-hPGK-tdTomato-WPRE)を含む多重シストロン(multicistronic)自己不活型レンチウイルスベクターにクローニングした。構築物は全て配列決定により検証した。レンチウイルスベクターの構築及び産生は、Bordeaux UniversityのTMB-Coreの「Vect'UB」施設により実施された。HEK293T細胞での三重一過性トランスフェクションによりVSV-Gシュードタイプレンチベクターを産生し、限外濾過(Vivaspin 20、Sartorius Biotech SA社、USA)により濃縮した。ウイルス上清の段階希釈液をHEK293T細胞に形質導入することにより、pLVレンチベクターのウイルス力価を決定し、5日後にフローサイトメトリー分析によりtdTomato発現を定量化した。感染日に、マウス腎腺癌Renca細胞(5×104細胞/ウェル)を、8μg/mlのポリブレンを有する24ウェルプレートに播種した。野生型proEla、突然変異体proEla、又はtdTomatoのみをコードするレンチウイルスを、MOI 10(感染多重度)で培地に添加した。蛍光顕微鏡を使用して、72時間後の細胞感染率を観察した。10%FCS、100ユニット/mlペニシリン/ストレプトマイシン及び2mM L-グルタミンを添加したRPMI1640培地でRenca細胞を維持した。
リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応分析
NucleoSpin RNAキット(Macherey-Nagel社)を使用し、製造業者の説明書に従ってヒト試料由来の総RNAを抽出した。TRI試薬(MRC Inc.社、US)を使用し、製造業者の説明書に従ってマウス試料由来の総RNAを抽出した。high capacity cDNA reverse transcription kit(Applied Biosystems社、Courtaboeuf、France)を使用して、1μgの総RNAでcDNA合成を行った。Agilent RNA 6000 Nanoキットを使用し、製造業者の説明書(Agilent社)に従ってヒト試料におけるRNAの質を検査した。StepOnePlusTM Real-Time PCR System(Applied Biosystems社、Courtaboeuf、France)、PCR Master Mix(Eurogentec社)及び特定のプライマーを使用するリアルタイムPCRにより、製造業者の説明書に従って、特定のmRNAの相対定量化を実施した。反応条件は以下の通りであった。SYBR Green qPCRでは:95℃で10分、95℃で15秒を40サイクル、60℃で60秒、次いで95℃で15分、60℃で60秒及び95℃で15分;Taqman qPCRでは:50℃で2分、95℃で10分、95℃で15秒を40サイクル、及び60℃で60秒。以前に記載されたように(Scamuffaら、2008)、ヒト又はマウスの細胞及び組織における内在性対照として、GAPDH、HPRT1又はS16ハウスキーピング遺伝子を使用した。
ペプチド合成及びin vitro酵素消化
Ela11、野生型proEla32及び突然変異体proEla32ペプチドはClinisciences社により合成された。以前に記載されたように(Sfaxiら、2014、Scamuffaら、2008)、Elaペプチドをフューリンで4時間消化し、ウェスタンブロッティング分析を行った。
ウェスタンブロッティング分析
生成されたin vitro酵素消化産物で、13%ゲルでのSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。使用した一次抗体は抗Ela11(Eurogentec社)であった。化学発光イメージングシステム(GeneGnome、Syngene社)(Sfaxiら、2014、Scamuffaら、2008)を使用し、製造業者の説明書に従って、西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート二次抗体及び増強化学発光(ECL+Plus、Amersham社)を一次抗体顕色に使用した。
受容体内部移行アッセイ
ヒトGFP-APJ融合タンパク質を安定に発現するHEK293A細胞を24時間血清飢餓状態にし、1μM Ela11、野生型proEla32又は突然変異体proEla32ペプチドで30分間処理した。4%パラホルムアルデヒドで細胞を室温で10分間固定し、Nikon社落射蛍光顕微鏡を使用してAPJ受容体内部移行を分析した。
ERK、AKT及びP70活性化分析
ヒトGFP-APJ融合タンパク質細胞を過剰発現するHEK293Aを、血清不含培地条件に24時間維持し、(1μM)Ela11、野生型proEla若しくは突然変異体proElaとともに、又はこれら無しで、37℃で5、15及び30分間インキュベートした。細胞をRIPA緩衝液(150mM NaCl、50mMトリス、1mM EDTA、1%NP40、0.25%デオキシコール酸ナトリウム、pH8)に溶解させ、12%ゲルでSDS-PAGEを行った。ウェスタンブロッティングにより、ERK、AKT及びP70リン酸化について、それぞれ抗ホスホERK;抗ホスホAKT及び抗ホスホP70(Cell Signaling社)を使用して細胞ライセートを分析した。データ標準化のため、ブロットをストリッピングし、ERK、AKT又はP70(Cell Signaling社)でリプローブした。西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート二次抗体(Amersham社)を使用して一次抗体を可視化し、ECLPlus化学発光システムを使用し、製造業者の説明書(Amersham社)に従ってシグナルを検出した。
mTORシグナル伝達経路
野生型proEla、突然変異体proEla、又はtdTomatoのみをコードするレンチウイルスを過剰発現するRENCA細胞を、血清不含培地で様々な時間維持した。細胞をRIPA緩衝液(150mM NaCl、50mMトリス、1mM EDTA、1%NP40、0.25%デオキシコール酸ナトリウム、pH8)に溶解させ、12%ゲルでSDS-PAGEを行った。ウェスタンブロッティングにより、LC3、NFkB、Erk1/2、AKT、S6K又はアクチンについて、抗ホスホNFkB、抗ホスホErk、抗ホスホAkt、抗ホスホS6Kを使用して細胞ライセートを分析した。データ標準化のため、ブロットをストリッピングし、ERK、AKT又はP70(Cell Signaling社)でリプローブした。西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート二次抗体(Amersham社)を使用して一次抗体を可視化し、ECLPlus化学発光システムを使用し、製造業者の説明書(Amersham社)に従ってシグナルを検出した。
腫瘍原性アッセイ
Janvier Laboratories社の7〜8週齢Balb/cマウスを換気式回転ラックに収容し、滅菌した食料及び飲料水を与えた。フランス政府の動物収容及び実験委員会(Animal Housing and Experiment Board)は本明細書で報告されるマウス実験を全て承認した。野生型proEla及び突然変異体proEla発現が、Renca細胞の、腫瘍増殖を誘導する能力に及ぼす効果を評価するため、1×105のRenca細胞、又は野生型proEla若しくは突然変異体proElaを安定に発現する同じ細胞をシンジェニックBalb/cマウスに皮下注射した。2〜3日ごとに腫瘍形成をモニタリングし、実験終了時にマウスを屠殺した。以前に記載されたように(Sfaxiら、2014)腫瘍体積を算出した。
創傷治癒アッセイ
Renca細胞をサブコンフルエントな状態まで培養した。各ウェルに対しチップで引っ掻き傷を実現し、血清飢餓から8又は24時間後に創傷治癒を観察する。
統計学
データは全て平均±標準偏差(SD)で表し、Graphpad Prism 5.0(GraphPad Software Inc.社、San Diego、CA)を使用して統計解析を実施した。p値0.05未満を有意とみなした。
結果
プロタンパク質転換酵素フューリンによるProEla32プロセシング。
ヒトELAのcDNA構造から、54アミノ酸(aa)のpre-proElaが予測される。22aaのシグナルペプチドが除去された後、32aaのproElaとしてホルモンが放出される。proEla32には2つの塩基性アミノ酸モチーフR31/R32及びR42/R43が存在することから、そのプロセシングにPCが関与することが示唆される(データは示さない)。Genbankデータベースより、本発明者らは、proEla配列が、特にPC様切断部位RX(K/R)RQの周辺において高度に保存されることを発見した(データは示さない)。preEla32の機能の媒介における、PCでのタンパク質分解によるpreEla32の成熟化の重要性を試験するため、本発明者らはまず、in vitro消化アッセイを使用して、フューリンによるproEla32プロセシングを実験的に評価した。この件について本発明者らは、proElaのプロセシング部位(R31/R32及びR42/R43)を含む野生型proEla32aa、並びにプロセシング部位をS31/S32及びS42/S43に突然変異させた突然変異体ペプチドproEla32をそれぞれ合成した。図4に示すように、野生型proElaを組換えヒトフューリン(0.2×10-4U)とともにインキュベートすると主に成熟Ela11aaが生成され、R31/R32及びR42/R43部位がフューリンにより効率的かつ同時に切断されることが示唆され、これらの条件下では中間体ELA22aa形態の生成が回避された。対照的に、突然変異体ペプチドProEla32(S31/S32及びS42/S43)をフューリンとともにインキュベートしても、成熟Ela産物は生成されず、PCによりR31/R32及びR42/R43生理的切断部位でproElaが特異的にプロセシングされることが支持された。
成体マウス及び腎がん患者の組織におけるEla、フューリン及びAPJの発現分析。
各種成体マウス組織のリアルタイムPCR分析により、フューリン及びAPJが分析を行った組織全てで発現されるのに対し、Elaは主に腎臓で発現されることが明らかとなった(図5)。正常なマウス腎臓上皮においてEla、その受容体APJ及びその転換酵素フューリンが協調的に発現することから、本発明者らは、ヒト腎がんにおけるこれらの遺伝子発現レベルの程度を調べ、この疾患におけるEla及びそのプロセシングの役割を評価するに至った。それにより、腎がん患者から得られた組織のリアルタイムPCR分析の使用で、Ela、APJ及びフューリンの遍在発現が明らかとなった(図6)。正常な組織と比較して、分析を行った腎がん組織患者ではEla及びフューリンの発現低下が検出された。分析を行った患者7名の組織のうち、患者6名でElaがダウンレギュレートされた。
APJ内部移行及びElaペプチド
リガンドに誘導される受容体内部移行は、リガンド結合及びその活性化に対するAPJの細胞応答である。成熟ELA11、野生型及び突然変異体proEla32がAPJ内部移行を誘導するかどうかを調べるため、本発明者らは、増強緑色蛍光タンパク質との融合タンパク質としてのAPJ(GFP-APJ、データは示さない)を、レンチウイルス感染によりHEK293細胞において安定に発現させ、示されるElaペプチドに応答してのAPJ細胞内局在化を試験した。基底レベルでは、融合タンパク質は主に細胞表面に局在した。Elaペプチド処理後には、30分後に細胞質において大きい小胞が形成され、全てのElaペプチド形態がAPJ受容体を活性化し、その内部移行を媒介することができることが示唆された。同様に、Ela11及びmut proEla32、又は野生型proEla及びmut proElaによる細胞処理でもAPJ内部移行が誘導された。
ERK、AKT及びp70活性化分析
ERK、AKT及びp70シグナル伝達の媒介におけるproElaプロセシングの重要性を評価するため、本発明者らは、野生型、mut proEla32又は成熟Ela11で、APJを発現するHEK293細胞を処理した。これらのElaペプチド(1μM)は全て、処理から5分以内にERKのリン酸化を誘導することができた(データは示さない)。ウェスタン分析により明らかとなったところによると、この効果は15分後に低下した。興味深いことに、同じ条件下で、ERK活性化に対する野生型proElaの効果は、mut proEla及びEla11の効果と比較して高かった(データは示さない)。AKT活性化の分析では、試験を行ったペプチド全てが、そのERK活性化に対する効果と比較して低いAKT活性化を誘導したことが明らかとなった。弱い視認可能なAKTリン酸化が5分後に見られ、約15分時点でピークとなり、その後低下した(データは示さない)。同様にAKT下流エフェクターP70s6Kの分析では、試験を行った1μMペプチド全てが、同じ条件下で有意な効果を誘導しなかったことが明らかとなった(データは示さない)。
mTORシグナル伝達経路
腎がん進行に対するElabelaの役割を評価するため、本発明者らは、elabela又はフューリン部位で突然変異させたelabelaを発現するRENCA細胞を使用した。細胞を1、3、6、12又は24時間血清飢餓状態にし、mTOR経路に対するElabelaの効果を、リン酸化又はnfkB、Erk1/2、akt、又はS6Kを調べることにより観察した。
血清飢餓中のRENCA細胞におけるELABELAのWT及びMUTバージョンいずれかの発現により:
1. LC3IIレベルの低下により推定される、オートファジー誘導の遮断
2. S6K及びS6リン酸化の持続により決定される、mTORC1経路活性化の持続
3. ERKリン酸化の増大により決定される、ERKシグナル伝達阻害の増強
が誘導され、
4. P(473)AKTにより決定される、mTORC2シグナル伝達への効果
5. P(308)AKTにより決定される、PI3Kシグナル伝達への効果
6. NFkBシグナル伝達への効果
が誘導されなかった。
腫瘍形成におけるEla及びproElaプロセシングの役割。
野生型及び突然変異体proEla32の、腫瘍の進行に対する役割を調べるため、本発明者らは、Ela発現を欠くマウス腎臓Rencaがん細胞、並びにこれらの細胞に野生型及び突然変異体proEla32を送達し、安定に発現させるためのレンチウイルスベクターpRRLsin-MND-hPGK-tdTomato-WPREの使用を利用した。分析の前に、野生型及び突然変異体ヒトproElaを安定に発現するRencaがん細胞を、リアルタイムPCRを使用して(図7A)、かつtdTomato蛍光タンパク質の存在により(データは示さない)、これらの構築物の発現について評価した。雄のシンジェニックBalb/cマウスの群3つに、1×105個の対照細胞、及び野生型proEla32又は突然変異体proEla32を発現する同じ細胞を皮下接種した。図7Bに示すように、これらの腫瘍細胞における野生型又は突然変異体proElaの発現により、空ベクターを発現する対照細胞と比較して、腫瘍増殖が有意に減少した。野生型proEla32の発現では、突然変異体proEla32と比較して、腫瘍増殖がより効率的に阻害されるように思われた。これらのデータを、創傷治癒実験により確認する(データは示さない)。Elabelaはin vitroでの創傷治癒及び細胞増殖アッセイについての図8でもRenca細胞を阻害する。Elabelaはrenca細胞の増殖を阻害する。
考察
フューリンの普遍的な発現、及びEla前駆体(proEla32)における二塩基性切断モチーフの存在から、PCがproElaプロセシングのプロテアーゼ候補であることが示唆される(データは示さない)。現在の試験で、本発明者らは、PC(フューリン)が、2つの切断部位すなわちR31/R32及びR42/R43でのproElaのタンパク質分解プロセシングに関与することを実証する。本発明者らのモデルで、野生型及び突然変異体proElaペプチドの突然変異誘発及びin vitro酵素消化により、proElaの切断部位を確認した(図4)。これらの2つの切断部位でのproEla(32aa)切断ではEla22及びEla11ペプチド形態が生成されることが想定されるが、これらの条件下ではEla11形態のみが検出され、フューリン存在下ではEla22がEla11に迅速に転換される可能性があることが示唆された(図4)。各種成体マウス組織の分析により、Ela、その受容体APJ及びフューリンのmRNAの共発現が示され(図5)、この3つの機能的関連性が強まった。これらのデータは、胚発生中、Ela、APJ及びフューリンの発現の間に一時的に顕著な相関関係があること(Scamuffaら、2006、Helkerら、2015)により更に実証され、これらのプロセス中のこれらの遺伝子の重要な役割が示唆される。したがって、以前の報告は、ELA突然変異体表現型がゼブラフィッシュのAPJ突然変異体と類似しており、マウスにおいて相同組換えによりfur遺伝子座を不活性化させるとe10.5直後に胚性致死が引き起こされることを示す(Scamuffaら、2006)。したがって、ELA、その転換プロテアーゼフューリン及び受容体APJが、正常な胚発生に必要な生物的機能に関与することが示唆される。しかし、本試験で本発明者らは、proEla前駆体プロセシングを阻害してもその生物的機能にはほとんど影響がないことを発見した。実際、ELAは元々、脊椎動物において、特にPC切断部位の周辺(データは示さない)がよく保存されることが判明しており(Pauliら、2014、Chngら、2013)、APJに特異的なリガンドとして記載されており、哺乳類におけるELA-APJ経路の機能的保存が示唆された。最近、Elaが、ヘテロ核リボヌクレオタンパク質L(hnRNPL)、p53の阻害性調節因子(Liら、2015)との相互作用を介してその他の機能を媒介することが報告され、in vitro及びin vivoでのElaの別個の効果を決定する機序について疑問が提起された。proElaのプロセシング、及び機能性、及びAPJシグナル伝達との関係の重要性を調べるため、本発明者らはGFP-APJを安定に発現するHEK細胞を生成した。本発明者らは、合成ヒト成熟ELA、野生型proEla及び突然変異体proElaペプチドがヒトAPJの内部移行を引き起こし(データは示さない)、これらのペプチドによるAPJの活性化によりERKの有意な活性化がもたらされる(データは示さない)ことを実証し、ゆえに、これらの条件下で、プロセシング済み又は未プロセシングELAがAPJを活性化することができることを確立した。ERK活性化と比較して、試験を行ったElaペプチドは全て、AKT及びその下流エフェクターP70の活性化をほとんど誘導しなかった(データは示さない)。以前に、APJ及びフューリンの過剰発現が、各種がん及び転移性腫瘍に関連付けられた。腎がん患者7名由来の正常及び腫瘍組織試料におけるEla発現レベルの分析により、6/7の患者でElaがダウンレギュレートされたことが実証され、Elaに腫瘍サプレッサー作用の見込みがあることが示唆された(図6)。それにより、腫瘍増殖におけるEla及びproElaプロセシングの生物的役割を直接調べるため、本発明者らはEla発現を欠くマウス腎臓Renca細胞を利用し、Balb/cマウスにおいて腫瘍を誘導する。本発明者らは、これらの細胞における野生型又は突然変異体proElaの発現により、マウスにおいて腫瘍増殖を誘導する腫瘍細胞の能力が阻害されたことを発見した(図7B)。いかにしてElaが腫瘍増殖の抑制に関与するのかは現時点で明らかになっていないが、いくつかの機序が仮定されうる。Elaペプチドの、AKT及びERK活性化を誘導する能力の差が要因である可能性がある。以前に、ERK活性化の結果が、その発現レベル及び活性によって決まることが発見された。正常な細胞では高レベルのERK活性化により細胞老化が誘導される一方で、ERK活性が低下すると細胞が老化から救われ、rasがん遺伝子による細胞の形質転換が促進されることが発見され、ERKシグナル伝達の腫瘍サプレッサーとしての役割が示唆された(Deschenes-Simardら、2013)。ERKに媒介される老化が、細胞増殖及び遊走、RNA代謝、並びに細胞シグナル伝達を含む様々な生物的機能に必要な各種タンパク質の、プロテアソームによる分解を伴うことが報告された。したがって、乳癌(Milde-Langoschら、2005)、脳腫瘍(Mawrinら、2003、Mawrinら、2005)、前立腺腫瘍(Malikら、2002)、膵臓腫瘍(Yip-Schneiderら、2001)及び腎腫瘍(Leeら、2009、Svenssonら、2009)を含む各種ヒトがんにおいて、ホスホERKレベルは非常に低い。同様に、高いERKレベルを有する患者は、良好な予後、悪性の低い表現型(Milde-Langoschら、2005;Leeら、2009、Svenssonら、2009)と相関し、より良好な生存期間を有し、治療に対しより良好に応答した(Chadhaら、2006)。対照的に、いくつかの進行性がんが、低いホスホERK及び高いAKTレベルと相関することが発見された(Malikら、2002、Dengら、2015)。実際、AKT経路はヒトがんにおいて最もよく撹乱されるシグナル伝達経路であり(Millisら、2016)、全ての腫瘍型のうち最大40%でAKT経路異常が確認される。AKTを直接的に標的とする化合物(Yapら、2008)を含む、AKT経路を全てのレベルで阻害する数多くの化合物が現在臨床開発される。これらの試験は、AKTではなくERK経路の腫瘍サプレッサー機能のいくつかが、がん患者において再活性化されうることを示唆する。高いERK及び低いAKT活性を誘導するElaの能力が、腎がん治療のための見込みある戦略を構成する可能性がある。結論として、本発明者らは、Elaを見込みある新たな腫瘍サプレッサー遺伝子として特定し、ERKを活性化し腫瘍増殖を阻害するElaの能力に関連する、信頼に足る機序について記載する。
RENCA細胞において、ELABELA(WT及びMUTともに)は、mTORC1経路に関与するS6Kリン酸化を阻害することによりmTORC1活性化を誘導し、mTORC1がmTORの直接の阻害因子であることから、この効果はERK経路にも作用する(データは示さない)。
本発明者らは、ElabelaがmTORを介して腫瘍サプレッサーとして作用すると結論付けた。
参考文献:
本出願を通して、各種参考文献が、本発明が関連する最新技術について記載する。これらの参考文献の開示は、本開示に参照によって組み込まれる。

Claims (8)

  1. それを必要とする対象における腎がんを治療する方法であって、治療有効量のELAポリペプチド又はそれをコードする核酸を前記対象に投与する工程を含み、前記ELAポリペプチドが、配列番号1(QRPVNLTMRRKLRKHNCLQRRCMPLHSRVPFP)と少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列を含み、9、10、20又は21位のアルギニン残基(R)が、任意選択で突然変異する、方法。
  2. 前記対象が、腎細胞癌を患う、請求項1に記載の方法。
  3. 9、10、20又は21位のアルギニン残基(R)が、アラニン残基(A)又はセリン残基(S)で置換される、請求項1に記載の方法。
  4. 前記核酸分子が、プラスミド、コスミド、エピソーム、人工染色体、ファージ又はウイルスベクター等の適切なベクターに含まれる、請求項1に記載の方法。
  5. 配列番号1(QRPVNLTMRRKLRKHNCLQRRCMPLHSRVPFP)と少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、9、10、20又は21位のアルギニン残基(R)が、突然変異する、ポリペプチド。
  6. 9、10、20又は21位のアルギニン残基(R)が、アラニン残基(A)又はセリン残基(S)で置換される、請求項5に記載のポリペプチド。
  7. 請求項5に記載のポリペプチドをコードする核酸分子。
  8. 腎がんの治療のための方法における使用のための、請求項5に記載のポリペプチド又は請求項7に記載の核酸分子。
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