JP2019530470A - γδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞のエクスビボ生成及びその治療的使用 - Google Patents

γδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞のエクスビボ生成及びその治療的使用 Download PDF

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Abstract

本発明は、γδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞をエクスビボで生成及び増殖させるための方法、ならびにその治療的使用に関する。本発明者らは、エクスビボでのヒト誘導性腫瘍抗原特異的ＣＤ４＋ＴＣＲγδ非制限Ｔ細胞におけるＦｏｘｐ３＋発現の誘導及び腫瘍抗原特異的ＦＯＸＰ３発現ＣＤ４＋ＴＣＲγδ非制限Ｔ細胞に対する自己ＣＤ８媒介性Ｔ細胞応答の誘導を実施した。本発明者らは、いずれの刺激の培養条件であっても、排他的に調節活性を発揮するようにコミットされた、エクスビボで生成及び増殖された抗原特異的Ｆｏｘｐ３発現ＣＤ３＋ＴＣＲγδ＋非制限Ｔ細胞に対する方法を開発した。特に、本発明は、以下の表現型：ＣＤ３＋ＴＣＲγδ＋Ｆｏｘｐ３＋を有するエクスビボのγδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞を生成するための方法に関する。

Description

本発明は、γδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞を生成及び増殖させるためのエクスビボ方法及びその治療的使用に関する。
発明の背景
γδＴ細胞は循環Ｔ細胞の約１〜５%を占め、自然免疫と適応免疫の間の境界面で作用する。これらの細胞は、先天的免疫細胞と適応的免疫細胞の性質を組み合わせて持ち、治療、特に癌免疫療法における利用のために魅力的なものとなっている。実際に、γδＴ細胞は炎症性サイトカインを産生し、感染細胞又は悪性細胞を直接溶解し、再曝露時に攻撃病原体への記憶応答を確立することができる。古典的なαβＴ細胞とは異なり、Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞（循環γδＴ細胞プールの主要なサブセット）は未処理抗原（例えばホスホモノエステルなど）を認識する。この認識はＴＣＲにより媒介され、ＭＨＣ分子により制限されない。
Ｆｏｘｐ３を発現する調節性γδＴ細胞を、適切な抗原刺激及びサイトカインの下で誘導することができることが当技術分野において示されている（Casetti et al. JI 2009, 183:3574-3577）。これらのＦｏｘｐ３＋調節性γδＴ細胞は抑制活性が可能である。
今日の時点で、これらのＦｏｘｐ３＋調節性γδＴ細胞をそれらの治療的利用のためにエクスビボで増殖させる方法は、当技術分野において示唆されていない。
本発明は、このように、Ｆｏｘｐ３＋γδ調節性Ｔ細胞をエクスビボで生成及び増殖させる方法、ならびに前記Ｆｏｘｐ３＋γδ調節性Ｔ細胞の治療的使用を提供する。
要約
本発明は、以下の表現型：ＣＤ３＋ＴＣＲγδ＋Ｆｏｘｐ３＋を有するγδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞をエクスビボで生成するための方法に関し、以下を含む
−γδＴ細胞活性化剤及び以下の薬剤：ｉ）ｃＡＭＰ（環状アデノシン一リン酸）活性化剤、ｉｉ）ＴＧＦβ（形質転換成長因子ベータ）経路活性化剤、ｉｉｉ）ｍＴＯＲ 阻害剤、場合によりｉｖ）ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、及びＴＳＬＰの群において選択される少なくとも１つのサイトカイン、ならびに場合によりｖ）少なくとも１つのＴＥＴ酵素活性化剤（好ましくはビタミンＣ及びＮａＨＳ硫化水素放出薬剤より選択される）及び／又は少なくとも１つのＤＮＭＴ阻害剤（例えば、ＲＧ１０８、ＤＡＣ、又は５ＡＣなど）の存在において、少なくとも５日間ＣＤ３＋ＴＣＲγδ＋Ｔ細胞を培養すること。
一実施形態において、γδＴ細胞活性化剤はポリクローナルγδＴ細胞活性化剤、好ましくは抗ＴＣＲγδ抗体又は非ペプチドリン酸化抗原である。
別の実施形態において、γδＴ細胞活性化剤は抗原特異的γδＴ細胞活性化剤、好ましくは寛容原性樹状細胞（ＤＣ）であり、少なくとも１つのビスホスホネート、好ましくは少なくとも１つのアミノビホスホネートを用いてパルスされる。
本発明の一実施形態において、ｃＡＭＰ活性化剤は、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）、ＥＰ２もしくはＥＰ４アゴニスト、膜アデニンシクラーゼ活性化剤、又は代謝型グルタミン酸受容体アゴニストを含む群より選択される。
一実施形態において、ＴＧＦβ経路活性化剤は、ＴＧＦβ、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、成長及び分化因子（ＧＤＦ）、抗ミュラー管ホルモン（ＡＭＨ）、アクチビン、ならびにノダールを含む群より選択される。
一実施形態において、ｍＴＯＲ阻害剤は、ラパマイシン、ラパマイシン類似体、ウォルトマンニン；テオフィリン；カフェイン；エピガロカテキンガレート（ＥＧＣＧ）、クルクミン、レスベラトロール；ゲニステイン、３，３−ジインドリルメタン（ＤＩＭ）、ＬＹ２９４００２（２−（４−モルホリニル）−８−フェニル−４Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オン）、ＰＰ２４２、ＰＰ３０、Ｔｏｒｉｎ１、Ｋｕ−００６３７９４、ＷＡＹ−６００、ＷＹＥ−６８７、ＷＹＥ−３５４、ＧＮＥ４７７、ＮＶＰ−ＢＥＺ２３５、ＰＩ−１０３、ＸＬ７６５、及びＷＪＤ００８を含む群より選択される。
一実施形態において、本発明の方法は増殖工程をさらに含み、それにおいて、上に記載する生成方法により得られたγδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞を、γδＴ細胞活性化剤及び以下の薬剤：ｉ）ｃＡＭＰ（環状アデノシン一リン酸）活性化剤、ｉｉ）ＴＧＦβ（形質転換成長因子ベータ）経路活性化剤、ｉｉｉ）ｍＴＯＲ阻害剤、場合によりｉｖ）ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、及びＴＳＬＰの群において選択される少なくとも１つのサイトカイン、ならびに場合によりｖ）少なくとも１つのＴＥＴ酵素活性化剤（好ましくはビタミンＣ及びＮａＨＳ硫化水素放出剤より選択される）及び／又は少なくとも１つのＤＮＭＴ阻害剤（例えばＲＧ１０８、ＤＡＣ、又は５ＡＣなど）の存在において、少なくとも５日間培養する。
本発明の別の目的は、本明細書中の上で記載する方法により入手可能なエクスビボで生成されたγδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞集団である。
本発明のさらなる目的は、本発明に従った方法により入手可能な、エクスビボで生成及び増殖されたγδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞集団に関する。
本発明はまた、炎症状態において機能的に安定なままである、エクスビボで生成されたγδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞集団に関する。
本発明はさらに、不活化γδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞もしくはγδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞のブレブ、又はγδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞のブレブを負荷した免疫原性樹状細胞を含む免疫原性産物に関する。
本発明はまた、不活化γδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞及び少なくとも１つの医薬的に許容可能な賦形剤もしくはγδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞のブレブ、又はγδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞のブレブを負荷した免疫原性樹状細胞を含む医薬組成物を提供する。
本発明の別の目的は、不活化γδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞及び少なくとも１つのアジュバントもしくはγδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞のブレブ、又はγδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞のブレブを負荷した免疫原性樹状細胞を含むワクチン組成物である。
本発明のさらなる目的は、癌の処置における使用のための本発明に従った免疫原性産物、医薬組成物、又はワクチン組成物に関する。
本発明はまた、γδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞及び少なくとも１つの医薬的に許容可能な賦形剤を含む医薬組成物に関する。
本発明はさらに、細胞療法における使用のための、本明細書において上に記載する医薬組成物に関する。
本発明のさらなる目的は、炎症性疾患もしくは自己免疫疾患を処置する際での使用のための、又は移植拒絶反応もしくは移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を防止するための、本明細書において上に記載する医薬組成物である。
定義
本明細書において使用するように、「調節性Ｔ細胞」又は「Ｔｒｅｇ」は、細胞−細胞接触又はＭＬＲ抑制（混合リンパ球反応）のいずれかにより抑制活性（即ち、従来型Ｔ細胞の増殖を阻害すること）が可能な細胞を指す。これらの細胞は、異なる亜集団（ＭＨＣＩＩ制限ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞、γδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞、及びインバリアントＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞を含むが、これらに限定しない）を含む。
本明細書において使用するように、「インバリアントＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞」は、以下の表現型：ＣＤ３＋Ｖα２４＋Ｆｏｘｐ３＋を有する細胞を指す。これらの細胞は、ＣＤ１制限下で非ペプチド脂質抗原を認識する。
本明細書において使用するように、「γδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞」は、以下の表現型：γδＴＣＲ＋Ｆｏｘｐ３＋を有する細胞を指す。これらの細胞は、ＭＨＣ（主要組織適合遺伝子複合体）制限を伴わずに非ペプチドリン酸化抗原を認識する。
本明細書において使用するように、「ＭＨＣＩＩ制限ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞」は、以下の表現型：ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋を有する細胞を指す。これらの細胞は、それらのαβＴＣＲ（Ｔ細胞受容体）により同定され、制限ＭＨＣクラスＩＩ（主要組織適合遺伝子複合体クラスＩＩ）分子により提示されるペプチド（外来又は自己ペプチドを含む）を認識する。
本明細書において使用するように、用語「処置」は、治療的処置ならびに予防的及び防止的手段を指し、それにおいて、その目的は、標的とされる病理学的障害又は状態を防止又は減速（減少、軽減）することである。処置を必要とする人は、既にその障害を伴っている人ならびにその障害に罹りやすい人、又はその障害を防止すべき人を含む。被験体又は哺乳動物は、本発明に従った治療量のγδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞又は治療量の不活化γδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞を受けた後、患者が以下の１つ以上における観察可能及び／又は測定可能な低下又は非存在を示す場合、疾患について成功裏に処置されている：病原性細胞の数における低下；病原性である全細胞のパーセントにおける低下；及び／又は特定の疾患又は状態に関連する１つ以上の症状のある程度の緩和；罹患率及び死亡率の低下、ならびに生活の質の問題における改善。疾患における成功裏の処置及び改善を評価するための上のパラメータは、医師が精通している日常的な手順により容易に測定可能である。
本明細書において使用するように、「治療的な効果的な量」は、標的に対して有意な負の又は有害な副作用を起こすことなく治療応答を誘導することを目的とするγδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞又は不活化γδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞の数を指す。治療的に効果的な量を、予防的又は防止的な作用のために、処置される疾患の発症に先立ち投与してもよい。あるいは又は加えて、治療的に効果的な量は、治療作用のために、処置される疾患の開始後に投与してもよい。
本明細書において使用するように、「治療応答」は、被験体におけるγδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞治療又はγδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞ワクチン接種により誘導される治療上の利益を指す。治療応答は、（１）処置される疾患の発症を遅延又は防止する；（２）処置される疾患の１つ以上の症状の進行、増悪、又は悪化を減速又は停止させる；（３）処置される疾患の症状の寛解をもたらす；（４）処置される疾患の重症度又は発生率を低下させる；あるいは（５）処置される疾患を治癒するという事実を含みうる。
本明細書において使用するように、数値の前の「約」は、その数値の値の１０%より多いか又は少ないことを意味する。
本明細書において使用するように、「被験体又は患者」は哺乳動物、好ましくはヒトを指す。本発明において、用語、被験体及び患者を同じ意味で使用することがある。非ヒト哺乳動物の例は、ペット（例えばイヌ、ネコ、家畜のブタ、ウサギ、フェレット、ハムスター、マウス、ラットなど）；霊長類（例えばチンパンジー、サルなど）；経済的に重要な動物（例えばウシ、ブタ、ウサギ、ウマ、ヒツジ、ヤギなど）を含む。一実施形態において、被験体は、医療を受けるのを待っている、もしくは受けている、又は医学的手技の対象であった／である／になりうる、又は疾患の発症についてモニターされている。一実施形態において、被験体は成体である（例えば、１８を上回る被験体）。別の実施形態において、被験体は子である（例えば、１８歳未満の被験体）。一実施形態において、被験体は雄である。別の実施形態において、被験体は雌である。
本明細書において使用するように、「同種異系細胞」は、１つの被験体（ドナー）から単離され、別の被験体（レシピエント又は宿主）に注入された細胞を指す。
本明細書において使用するように、「自己細胞」は、単離され、同じ被験体（レシピエント又は宿主）に注入される細胞を指す。
詳細な説明
本発明は、エクスビボでγδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞を生成するための方法に関する。
一実施形態において、エクスビボでγδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞を生成するための方法は以下を含む：
−γδＴ細胞活性化剤及び以下の薬剤：ｉ）ｃＡＭＰ（環状アデノシン一リン酸）活性化剤、ｉｉ）ＴＧＦβ（形質転換成長因子ベータ）経路活性化剤、ｉｉｉ）ｍＴＯＲ阻害剤、場合によりｉｖ）ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、及びＴＳＬＰ（胸腺ストローマリンホポエチン）の群において選択される少なくとも１つのサイトカイン、ならびに、場合によりｖ）少なくとも１つのＴＥＴ酵素活性化剤及び／又は少なくとも１つのＤＮＭＴ阻害剤の存在においてＣＤ３＋ＴＣＲγδ＋Ｔ細胞、好ましくはＣＤ３＋ＴＣＲγδ＋ＣＤ４５ＲＡ＋Ｔ細胞を、少なくとも５日間培養すること、
−それにより、好ましくはγδナイーブ（ＣＤ４５ＲＡ＋）Ｔ細胞から、エクスビボで生成されたγδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞の集団を得ること。
一実施形態において、ＣＤ３＋ＴＣＲγδ＋Ｔ細胞、好ましくはＣＤ３＋ＴＣＲγδ＋ＣＤ４５ＲＡ＋Ｔ細胞は、血液サンプルから当技術分野において周知の任意の技術により得る。一実施形態において、ＣＤ３＋ＴＣＲγδ＋Ｔ細胞、好ましくはＣＤ３＋ＴＣＲγδ＋ＣＤ４５ＲＡ＋Ｔ細胞は、フローサイトメトリーによりＰＢＭＣ（末梢血単核球）から単離する。一実施形態において、ＣＤ３＋ＴＣＲγδ＋Ｔ細胞、好ましくはＣＤ３＋ＴＣＲγδ＋ＣＤ４５ＲＡ＋Ｔ細胞を凍結ＰＢＭＣから単離してもよい。
一実施形態において、単離ＣＤ３＋ＴＣＲγδ＋Ｔ細胞、好ましくはＣＤ３＋ＴＣＲγδ＋ＣＤ４５ＲＡ＋Ｔ細胞の取得は、任意の最初の精製工程により改善されうる。ＣＤ３＋ＴＣＲγδ＋Ｔ細胞、好ましくはＣＤ３＋ＴＣＲγδ＋ＣＤ４５ＲＡ＋Ｔ細胞を、可溶性抗ＣＤ２８及び抗ＣＤ４０抗体の存在において抗原パルス寛容原性ＤＣ（例えば、オボアルブミンパルス寛容原性ＤＣ）を用いて刺激する。一実施形態において、刺激の時間は１時間〜２４時間の間、好ましくは１０時間〜２０時間の間、より好ましくは約１６時間の間の範囲である。刺激後、細胞を、例えばＰＢＳを用いて洗浄し、選別のために抗ＣＤ１５４及び抗ＣＤ４抗体を用いて染色する。精製ＣＤ３＋ＴＣＲγδ＋ＣＤ１５４＋Ｔ細胞を濃縮し、以下の活性化工程のために使用してもよい。
一実施形態において、ＣＤ３＋ＴＣＲγδ＋Ｔ細胞をγδＴ細胞活性化剤の存在において活性化する。前記γδＴ細胞活性化剤は、ポリクローナルγδＴ細胞活性化剤又は抗原特異的γδＴ細胞活性化剤でありうる。
本発明において、ポリクローナルγδＴ細胞活性化剤はＴＣＲγδ活性化剤である。ＴＣＲγδ活性化剤の例は、抗ＴＣＲγδ抗体、例えば精製マウス抗ヒトＴＣＲγδクローンＢ１（参照５５５７１５、BD Biosciences）、抗ヒトＴＣＲγδ抗体（参照３３１２０９、Biolegend）、モノクローナルＴＣＲγδ抗体（参照ＮＢＰ２−２２４８９又はＮＢＰ２−２２５１０、Novus Biologicals）、抗マウスγδＴＣＲ抗体（参照１２−５７１１−８１、eBioscience）、ＴＣＲγδ抗体（参照ＭＡＢ７２９７、R&D Systems）、抗Ｔ細胞受容体γδ抗体（参照ＡＢＩＮ２３７２９９０、抗体オンライン）、抗ＴＣＲガンマ＋ＴＣＲデルタ抗体（参照ａｂ２５６６３、Abcam）、抗γδＴＣＲ抗体クローンＩＭＭＵ５１０（Beckman Coulter）；非ペプチドリン酸化抗原（リン酸化非ペプチド抗原とも呼ばれる）、イソプレニルピロリン酸（ＩＰＰ）、（Ｅ）−４−ヒドロキシ−３−メチル−ブタ−２−エニル二リン酸（ＨＭＢ−ＰＰ）及びそれらの類似体（例えばブロモヒドリン二リン酸（ＢｒＨＰＰ）及び２−メチル−３−ブテニル−１−ピロリン酸（２Ｍ３Ｂ１ＰＰ）など）を含むが、これらに限定しない；Ｆ１−ＡＴＰアーゼ；アポリポタンパク質Ａ−１；結核菌；ＵＬ１６結合タンパク質４（ＵＬＢＰ４）；ＣＤ１ｃ；スルファチドを負荷したＣＤ１ｄ四量体；内皮プロテインＣ受容体（ＥＰＣＲ）、リポエキサペプチド；フィコエリトリン、ヒスチジルｔＲＮＡシンターゼ及びブチロフィリン３Ａ１などを含むが、これらに限定しない。
別の実施形態において、ポリクローナルγδＴ細胞活性化剤は、ＭＨＣクラスＩ関連Ａ（ＭＩＣＡ）である。
別の実施形態において、ポリクローナルγδＴ細胞活性化剤は、癌細胞からの免疫原性アポトーシス小体又は癌細胞からの、もしくは組織溶解物から由来するブレブである。
癌細胞は、腫瘍生検から又は循環癌細胞の増殖から由来しうる。
癌細胞からの免疫原性アポトーシス小体は、例えばアントラサイクリン（ドキソルビシン、ダウノルビシン、イダルビシン、及びミトキサントロンを含む）；オキサリプラチン、アポトーシス小体を放出するＵＶＣ又はγ線処理癌細胞を用いて得てもよい、あるいはアントラサイクリン（ドキソルビシン、ダウノルビシン、イダルビシン、及びミトキサントロンを含む）；オキサリプラチン；ＵＶＣ又はγ線処置癌から直接単離することができる。
ブレブは重要な免疫原性粒子を構成する。それらはアポトーシス細胞の表面で形成された不均一な小胞である。一実施形態において、ブレブのサイズは０．０５〜５μm、好ましくは０．１〜１μmの範囲である。種々の免疫原性細胞死（ＩＣＤ）誘導物質が、アポトーシス細胞又は自食作用細胞からのブレブの放出を誘導することができ、例えば、５０００ｒａｄでの照射、ならびにいくつかの抗新生物剤（ドキソルビシン、オキサリプラチン、及びシスプラチンを含む）などである。免疫原性癌細胞ブレブは、特に、アポトーシス性癌細胞から、又は化学的もしくは物理的誘導物質による処理後の癌細胞オートファジーから得てもよい。
一実施形態において、ポリクローナルγδＴ細胞活性化剤は、抗ＴＣＲγδ抗体又は非ペプチドリン酸化抗原、例えばイソプレニルピロリン酸（ＩＰＰ）などである。
一実施形態において、ポリクローナルγδＴ細胞活性化剤、好ましくは、抗ＴＣＲγδ抗体は、培養培地中に可溶性である。別の実施形態において、ポリクローナルγδＴ細胞活性化剤を培養プレートにコーティングする。
一実施形態において、ポリクローナルγδＴ細胞活性化剤、好ましくは、抗ＴＣＲγδ抗体は、フィーダー細胞、好ましくは自己フィーダー細胞の存在において使用する。
フィーダー細胞は、ΔＣＤ３細胞（Ｔ細胞枯渇アクセサリー細胞）、照射ＰＢＭＣ、照射ＤＣ、人工ＡＰＣ（抗原提示細胞）、Ｓｆ９細胞、昆虫細胞、異なる被験体からのＰＢＭＣのプール又はＢ細胞のプール、ＫＣＤ４０Ｌ細胞、ＥＢＶ形質転換Ｂ細胞株、及びＥＢＶ形質転換リンパ芽球細胞（ＬＣＬ）を含むが、これらに限定しない。
好ましくは、本発明において使用するフィーダー細胞は、抗ＣＤ３コーティングビーズとのインキュベーションによるＰＢＭＣからのネガティブ選択により単離され、次に３０００ｒａｄで照射されるΔＣＤ３細胞である。
一実施形態において、Ｔ細胞／支持細胞の比率は約１：１００から約１：１００００、好ましくは１：１０００から１：５０００の範囲である。本発明の範囲内では、表現「１：１００から１：１００００」は、１：１００、１：２００、１：３００、１：４００、１：５００、１：６００、１：７００、１：８００、１：９００、１：１０００、１：１２５０、１：１５００、１：１７５０、１：２０００、１：２２５０、１：２５００、１：２７５０、１：３０００、１：３２５０、１：３５００、１：３７５０、１：４０００、１：４２５０、１：４５００、１：４７５０、１：５０００、１：５２５０、１：５５００、１：５７５０、１：６０００、１：６２５０、１：６５００、１：６７５０、１：７０００、１：７２５０、１：７５００、１：７７５０、１：８０００、１：８２５０、１：８５００、１：８７５０、１：９０００、１：９２５０、１：９５００、１：９７５０、及び１：１００００を含むが、これらに限定しない。
本発明において、抗原特異的γδＴ細胞活性化剤は寛容原性樹状細胞（ＤＣ）である。
本明細書において使用するように、「寛容原性ＤＣ」は、寛容を誘導することが可能なＤＣを指す。一実施形態において、寛容原性ＤＣは、前炎症誘発性サイトカイン（例えばＩＬ−１２、ＩＬ−２３、又はＴＮＦαなど）よりも抑制性のサイトカイン（例えばＩＬ−１０及びＴＧＦβなど）を分泌することが可能である。一実施形態において、ＤＣは、それらがＩＬ−１０：ＩＬ−１２＞１の比率においてＩＬ−１０及びＩＬ−１２を分泌する場合、寛容原性として定義する。
一実施形態において、寛容原性ＤＣはそれらの表面上に主要組織適合性（ＭＨＣ）クラスＩａ及び／又はＭＨＣクラスＩｂを発現する。ＭＨＣクラスＩａの提示は、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ及び／又はＨＬＡ−Ｃ分子を通じた「古典的」提示を指すのに対し、ＭＨＣクラスＩｂの提示は、ＨＬＡ−Ｅ、ＨＬＡ−Ｆ、ＨＬＡ−Ｇ、及び／又はＨＬＡ−Ｈ分子を通じた「非古典的」抗原提示を指す。
一実施形態において、寛容原性ＤＣは、それらの表面上に５０%のＭＨＣクラスＩａ分子及び５０%のＭＨＣクラスＩｂ分子を発現する。一実施形態において、寛容原性ＤＣは、それらの表面上に４５%のＭＨＣクラスＩａ分子及び５５%のＭＨＣクラスＩｂ分子を発現する。一実施形態において、寛容原性ＤＣは、それらの表面上に４０%のＭＨＣクラスＩａ分子及び６０%のＭＨＣクラスＩｂ分子を発現する。一実施形態において、寛容原性ＤＣは、それらの表面上に３５%のＭＨＣクラスＩａ分子及び６５%のＭＨＣクラスＩｂ分子を発現する。一実施形態において、寛容原性ＤＣは、それらの表面上に３０%のＭＨＣクラスＩａ分子及び７０%のＭＨＣクラスＩｂ分子を発現する。一実施形態において、寛容原性ＤＣは、それらの表面上に２５%のＭＨＣクラスＩａ分子及び７５%のＭＨＣクラスＩｂ分子を発現する。一実施形態において、寛容原性ＤＣは、それらの表面上に２０%のＭＨＣクラスＩａ分子及び８０%のＭＨＣクラスＩｂ分子を発現する。一実施形態において、寛容原性ＤＣは、それらの表面上に１５%のＭＨＣクラスＩａ分子及び８５%のＭＨＣクラスＩｂ分子を発現する。一実施形態において、寛容原性ＤＣは、それらの表面上に１０%のＭＨＣクラスＩａ分子及び９０%のＭＨＣクラスＩｂ分子を発現する。一実施形態において、寛容原性ＤＣは、それらの表面上に５%のＭＨＣクラスＩａ分子及び９５%のＭＨＣクラスＩｂ分子を発現する。一実施形態において、寛容原性ＤＣは、それらの表面上にＭＨＣクラスＩｂ分子だけを発現する。
一実施形態において、寛容原性ＤＣは、それらの表面上に５０%のＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、及び／又はＨＬＡ−Ｃ分子ならびに５０%のＨＬＡ−Ｅ分子を発現する。一実施形態において、寛容原性ＤＣは、それらの表面上に４５%のＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、及び／又はＨＬＡ−Ｃ分子ならびに５５%のＨＬＡ−Ｅ分子を発現する。一実施形態において、寛容原性ＤＣは、それらの表面上に４０%のＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、及び／又はＨＬＡ−Ｃ分子ならびに６０%のＨＬＡ−Ｅ分子を発現する。一実施形態において、寛容原性ＤＣは、それらの表面上に３５%のＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、及び／又はＨＬＡ−Ｃ分子ならびに６５%のＨＬＡ−Ｅ分子を発現する。一実施形態において、寛容原性ＤＣは、それらの表面上に３０%のＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、及び／又はＨＬＡ−Ｃ分子ならびに７０%のＨＬＡ−Ｅ分子を発現する。一実施形態において、寛容原性ＤＣは、それらの表面上に２５%のＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、及び／又はＨＬＡ−Ｃ分子ならびに７５%のＨＬＡ−Ｅ分子を発現する。一実施形態において、寛容原性ＤＣは、それらの表面上に２０%のＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、及び／又はＨＬＡ−Ｃ分子ならびに８０%のＨＬＡ−Ｅ分子を発現する。一実施形態において、寛容原性ＤＣは、それらの表面上に１５%のＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、及び／又はＨＬＡ−Ｃ分子ならびに８５%のＨＬＡ−Ｅ分子を発現する。一実施形態において、寛容原性ＤＣは、それらの表面上に１０%のＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、及び／又はＨＬＡ−Ｃ分子ならびに９０%のＨＬＡ−Ｅ分子を発現する。一実施形態において、寛容原性ＤＣは、それらの表面上に５%のＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、及び／又はＨＬＡ−Ｃ分子ならびに９５%のＨＬＡ−Ｅ分子を発現する。一実施形態において、寛容原性ＤＣは、それらの表面上にＨＬＡ−Ｅ分子だけを発現する。
寛容原性ＤＣを得るための方法は当技術分野において周知である。例示的な方法は、ＣＤ１４＋単球からの免疫寛容原性ＤＣの生成である。例えば、ＣＤ１４＋単球を、未成熟ＤＣの生成のために、ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４の存在において、又はＧＭ−ＣＳＦ及びＩＦＮαの存在において培養する。
寛容原性ＤＣの表面上のＭＨＣクラスＩａ分子発現を阻害する又はＨＬＡ−Ｅ分子の発現を誘導するための方法は周知である。
ＴＡＰトランスポーター（抗原プロセシングに関連するトランスポーター）の阻害は、ＭＨＣクラスＩａ分子の発現の減少に導き、それにより寛容原性ＤＣの表面上でのＨＬＡ−Ｅ分子発現が促進される。
小胞体におけるＴＡＰトランスポーターを阻害するための例示的な方法は、ＣＲＩＳＰＲ−ＣＡＳ−９技術、サイレンシングＲＮＡ、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）からのＵＬ−１０ウイルスタンパク質を用いたトランスフェクトＤＣ、又はウイルスタンパク質の使用を含むが、これらに限定しない。
ＴＡＰトランスポーターを阻害することができるウイルスタンパク質の例は、ＨＳＶ−１１ＣＰ４７タンパク質、水痘ウイルスＵＬ４９．５タンパク質、サイトメガロウイルスＵＳ６タンパク質、又はガンマヘルペスウイルスＥＢＶ ＢＮＬＦ２ａタンパク質を含むが、これらに限定しない。
別の方法は、寛容原性ＤＣの表面上のＨＬＡ−Ｅ発現を変化させることなくＭＨＣクラスＩａ分子の発現を阻害するための化学製品の使用である。化学製品の例は、５’−メチル−５’−チオアデノシン又はレプトマイシンＢを含むが、これらに限定しない。
寛容原性ＤＣを、少なくとも１つのビスホスホネート、好ましくはアミノビスホスホネート（aminobiphosphonate）の存在において約２４時間パルスする。ビスホスホネート（biphosphonate）の例は、ゾレドロン酸（又はゾレドロネート）、パミドロン酸、アレンドロン酸、リセドロン酸、イバンドロン酸、インカドロン酸、エチドロン酸、チルドロン酸、それらの組み合わせ、それらの塩、及びそれらの水和物を含むが、これらに限定しない。好ましくは、ビスホスホネート（biphosphonate）はゾレドロン酸又はゾレドロネートである。
一実施形態において、ビスホスホネート、特にゾレドロン酸を１０nMから５０μMの濃度で使用する。本発明の範囲内において、表現「１０nMから５０μM」は、５０nM、１００nM、２５０nM、５００nM、７５０nM、１μM、１０μM、２０μM、３０μM、４０μM、５０μMを含むが、これらに限定しない。
一実施形態において、培養物中に加えられたｃＡＭＰ活性化剤によって、ｃＡＭＰ経路の活性化が可能になる。ｃＡＭＰ活性化剤の例は、ＰＧＥ２（プロスタグランジンＥ２）、ＥＰ２又はＥＰ４アゴニスト、膜アデニンシクラーゼ活性化剤（例えばフォルスコリンなど）、又は代謝型グルタミン酸受容体アゴニストを含むが、これらに限定しない。ＰＧＥ２の例は、参照Ｐ５６４０又はＰ０４０９のＰＧＥ２（Sigma-Aldrich）、参照２２９６のＰＧＥ２（R&D Systems）、参照２２６８のＰＧＥ２（BioVision）、参照７２１９２のＰＧＥ２（Stemcell）、参照ａｂ１４４５３９のＰＧＥ２（Abcam）、及び参照１４０１０のＰＧＥ２（Cayman Chemical）を含むが、これらに限定しない。
一実施形態において、ｃＡＭＰ活性化剤、好ましくはＰＧＥ２を０．０１μMから１０μMの範囲の濃度で使用する。本発明の範囲内において、表現「０．０１μMから１０μM」は、０．０２μM、０．０３μM、０．０４μM、０．０５μM、０．０６μM、０．０７μM、０．０８μM、０．０９μM、０．１μM、０．２μM、０．３μM、０．４μM、０．５μM、０．６μM、０．７μM、０．８μM、０．９μM、１μM、１．５μM、２μM、２．５μM、３μM、３．５μM、４μM、４．５μM、５μM、６μM、７μM、８μM、９μMを含むが、これらに限定しない。特定の実施形態において、ＰＧＥ２は０．０３μMから１．５μMの範囲の濃度である。
一実施形態において、培養物中に加えたＴＧＦβ経路活性化剤によって、ＴＧＦβ経路の活性化が可能になる。ＴＧＦβ経路活性化剤の例は、ＴＧＦβファミリー（ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、成長及び分化因子（ＧＤＦ）、抗ミュラー管ホルモン（ＡＭＨ）、アクチビン、及びノダールを含むが、これらに限定しない。ＴＧＦβの例は、参照Ｔ７０３９のＴＧＦβ１（Sigma-Aldrich）、参照Ｔ２８１５のＴＧＦβ２（Sigma-Aldrich）、参照Ｔ５４２５のＴＧＦβ３（Sigma-Aldrich）、参照Ｐ０１１３７のヒトＴＧＦβ１（R&D systems）、参照５８０７０２のヒトＴＧＦβ１（Biolegend）、参照ＨＺ−１０１１のＴＧＦβ１（HumanZyme）、参照１４−８３４８−６２のＴＧＦβ１（Affymetrix eBioscience）を含むが、これらに限定しない。
一実施形態において、経路活性化因子を１ng/mlから２０ng/mlの範囲の濃度で使用する。本発明の範囲内において、表現「１ng/mlから２０ng/ml」は、２ng/ml、２．５ng/ml、３ng/ml、３．５ng/ml、４ng/ml、４．５ng/ml、５ng/ml、５．５ng/ml、６ng/ml、６．５ng/ml、７ng/ml、７．５ng/ml、８ng/ml、８．５ng/ml、９ng/ml、９．５ng/ml、１０ng/ml、１１ng/ml、１２ng/ml、１３ng/ml、１４ng/ml、１５ng/ml、１６ng/ml、１７ng/ml、１８ng/ml、１９ng/mlを含むが、これらに限定しない。特定の実施形態において、ＴＧＦβは２．５ng/mlから７．５ng/mlの範囲の濃度である。
一実施形態において、培養物中に加えられたｍＴＯＲ阻害剤によって、ｍＴＯＲ経路の阻害が可能になる。ｍＴＯＲ阻害剤の例は、ラパマイシン（シロリムスとも呼ばれる）及びその類似体（ラパログとも呼ばれる）；ウォルトマンニン；テオフィリン；カフェイン；エピガロカテキンガレート（ＥＧＣＧ）；クルクミン；レスベラトロール；ゲニステイン；３，３−ジインドリルメタン（ＤＩＭ）；ＬＹ２９４００２（２−（４−モルホリニル）−８−フェニル−４Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オン）；ＰＰ２４２；ＰＰ３０；Ｔｏｒｉｎ１；Ｋｕ−００６３７９４；ＷＡＹ−６００；ＷＹＥ−６８７；ＷＹＥ−３５４；ならびにｍＴＯＲ及びＰＩ３Ｋ二重特異性阻害剤（例えばＧＮＥ４７７、ＮＶＰ−ＢＥＺ２３５、ＰＩ−１０３、ＸＬ７６５、及びＷＪＤ００８など）を含むが、これらに限定しない。ラパマイシンの例は、参照Ｒ０３９５のラパマイシン（Sigma-Aldrich）、参照Ｓ１０３９のラパマイシン（Selleckchem）、参照１２９２のラパマイシン（Tocris）、参照Ｒ− ５０００のラパマイシン（LC Laboratories）、参照Ｔｌｒｌ−ｒａｐのラパマイシン（InvivoGen）、参照ａｂ１２０２２４のラパマイシン（Abcam）、参照Ｒ０３９５のラパマイシン（Sigma−Aldrich）を含むが、これらに限定しない。
臨床的に使用されるラパマイシンと同じ化学クラスの化合物の例は、エベロリムス（コード名ＲＡＤ００１）、テムシロリムス（コード名ＣＣＩ−７７９、ＮＳＣ ６８３８６４）、ゾタロリムス（コード名ＡＢＴ−５７８）を含むが、これらに限定しない。
一実施形態において、ｍＴＯＲ阻害剤、好ましくは、ラパマイシンを０．１nMから５０nMの範囲の濃度で使用する。本発明の範囲内において、表現「０．１nMから５０nM」は、０．２nM、０．３nM、０．４nM、０．５nM、０．６nM、０．７nM、０．８nM、０．９nM、１nM、２nM、３nM、４nM、５nM、６nM、７nM、８nM、９nM、１０nM、１１nM、１２nM、１３nM、１４nM、１５nM、１６nM、１７nM、１８nM、１９nM、２０nM、２１nM、２２nM、２３nM、２４nM、２５nM、２６nM、２７nM、２８nM、２９nM、３０nM、３１nM、３２nM、３３nM、３４nM、３５nM、３６nM、３７nM、３８nM、３９nM、４０nM、４１nM、４２nM、４３nM、４４nM、４５nM、４６nM、４７nM、４８nM、４９nMを含むが、これらに限定しない。
一実施形態において、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、及びＴＳＬＰより選択される少なくとも１つのサイトカインを培養物中に加えることができる。
一実施形態において、ＩＬ−２を１０IU/mlから１０００IU/mlの範囲の濃度で使用する。本発明の範囲内において、表現「１０IU/mlから１０００IU/ml」は、１５IU/ml、２０IU/ml、２５IU/ml、３０IU/ml、３５IU/ml、４０IU/ml、４５IU/ml、５０IU/ml、５５IU/ml、６０IU/ml、６５IU/ml、７０IU/ml、７５IU/ml、８０IU/ml、８５IU/ml、９０IU/ml、９５IU/ml、１００IU/ml、１５０IU/ml、２００IU/ml、２５０IU/ml、３００IU/ml、３５０IU/ml、４００IU/ml、４５０IU/ml、５００IU/ml、５５０IU/ml、６００IU/ml、６５０IU/ml、７００IU/ml、７５０IU/ml、８００IU/ml、８５０IU/ml、９００IU/ml、９５０IU/mlを含むが、これらに限定しない。特定の実施形態において、ＩＬ−２を５０IU/mlから２５０IU/mlの範囲の濃度で使用する。
一実施形態において、ＩＬ−７を１ng/mlから１００ng/mlの範囲の濃度で使用する。本発明の範囲内において、表現「１ng/mlから１００ng/ml」は、１ng/ml、５ng/ml、１０ng/ml、１５ng/ml、２０ng/ml、２５ng/ml、３０ng/ml、３５ng/ml、４０ng/ml、４５ng/ml、５０ng/ml、５５ng/ml、６０ng/ml、６５ng/ml、７０ng/ml、７５ng/ml、８０ng/ml、８５ng/ml、９０ng/ml、９５ng/ml、１００ng/mlを含むが、これらに限定しない。
一実施形態において、ＩＬ−１５を１ng/mlから５０ng/mlの範囲の濃度で使用する。本発明の範囲内において、表現「１ng/mlから５０ng/ml」は、２ng/ml、３ng/ml、４ng/ml、５ng/ml、６ng/ml、７ng/ml、８ng/ml、９ng/ml、１０ng/ml、１５ng/ml、２０ng/ml、２５ng/ml、３０ng/ml、３５ng/ml、４０ng/ml、４５ng/mlを含むが、これらに限定しない。特定の実施形態において、ＩＬ−１５を１０ng/mlから３０ng/mlの範囲の濃度で使用する。
一実施形態において、ＴＳＬＰを１ng/mlから１００ng/mlの範囲の濃度で使用する。本発明の範囲内において、表現「１ng/mlから１００ng/ml」は、１ng/ml、５ng/ml、１０ng/ml、１５ng/ml、２０ng/ml、２５ng/ml、３０ng/ml、３５ng/ml、４０ng/ml、４５ng/ml、５０ng/ml、５５ng/ml、６０ng/ml、６５ng/ml、７０ng/ml、７５ng/ml、８０ng/ml、８５ng/ml、９０ng/ml、９５ng/ml、１００ng/mlを含むが、これらに限定しない。
ＴＥＴ活性化剤の例は、ビタミンＣ及びＮａＨＳ硫化水素放出剤（Ｈ２Ｓ供与体としても公知である）を含むが、これらに限定しない。
一実施形態において、ビタミンＣを１から１００μg/mlの範囲の濃度で使用する。
一実施形態において、ＮａＨＳ硫化水素放出剤を０．２５から８mMの範囲の濃度で使用する。
ＤＮＭＴ阻害剤の例は、２−（１，３−ジオキソ−１，２−ジヒドロ−２Ｈ−イソインドール−２−イル）−３−（１Ｈ−インドール−３−イル）プロパン酸（ＲＧ１０８）、５−アザ−２’−デオキシシチジン（デシタビン又はＤＡＣ）、及び５−アザシチジン（５ＡＣ）を含むが、これらに限定しない。
一実施形態において、ＲＧ１０８を２０から５００μMの範囲の濃度で使用する。
一実施形態において、ＤＡＣを０．１から２μMの範囲の濃度で使用する。
一実施形態において、５ＡＣを０．１から１０μMの範囲の濃度で使用する。
一実施形態において、中和抗体を培養物に加え、調節性Ｔ細胞の他の集団の生成を防止することができる。
中和抗体の例は、抗ＩＦＮγ抗体、抗ＩＬ−４抗体、及び／又は抗ＩＬ１２抗体を含むが、これらに限定しない。
抗ＩＦＮγ抗体の例は、Affymetrix eBioscience（参照１４−７３１８）、R&D systems（参照ＭＡＢ２８５）、Novus Biologicals（参照ＡＦ−４８５−ＮＡ）を含むが、これらに限定しない。
抗ＩＬ−４抗体の例は、R&D Systems（参照ＭＡＢ３０４、ＭＡＢ２０４、又はＭＡＢ２０４）、Affymetrix eBioscience（参照１４−７０４８）、GeneTex（参照ＧＴＸ１０７５５）を含むが、これらに限定しない。
抗ＩＬ−１２抗体の例は、Affymetrix eBioscience（参照１６−７１２９又は１６−８１２６）、Biolegend（参照５０８８０３）、R&D Systems（参照ＭＡＢ２１９、ＡＦ−２１９、又はＡＢ−２１９）を含むが、これらに限定しない。
一実施形態において、本発明の培養物中に使用される培養培地は、（ｉ）１つ以上のｐＨ緩衝系；（ｉｉ）無機塩；（ｉｉｉ）微量元素；（ｉｖ）遊離アミノ酸；（ｖ）ビタミン；（ｖｉ）ホルモン；（ｖｉｉ）炭素／エネルギー源を含む。
無機塩の例は、臭化カルシウム、塩化カルシウム、リン酸カルシウム、硝酸カルシウム、亜硝酸カルシウム、硫酸カルシウム、臭化マグネシウム、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、重炭酸カリウム、臭化カリウム、塩化カリウム、二水素化リン酸カリウム、二硫酸カリウム、リン酸水素二カリウム、硝酸カリウム、亜硝酸カリウム、亜硫酸カリウム、硫酸カリウム、炭酸水素ナトリウム、臭化ナトリウム、塩化ナトリウム、二硫酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、硫酸ナトリウム及びそれらの混合物を含むが、これらに限定しない。
微量元素の例は、コバルト（Ｃｏ）、銅（Ｃｕ）、鉄（Ｆｅ）、マグネシウム（Ｍｇ）、マンガン（Ｍｎ）、モリブデン（Ｍｏ）、ニッケル（Ｎｉ）、セレン（Ｓｅ）、亜鉛（Ｚｎ）及びそれらの塩を含むが、これらに限定しない。
遊離アミノ酸の例は、Ｌ−アラニン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−システイン、Ｌ−シスチン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グルタミン酸、グリシン、Ｌ− ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、タウリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン及びそれらの混合物を含むが、これらに限定しない。
ビタミンの例は、ビオチン（ビタミンＨ）；Ｄ−パントテン酸カルシウム；塩化コリン；葉酸（ビタミンＢ９）；ミオイノシトール；ニコチンアミド；ピリドキサール（ビタミンＢ６）；リボフラビン（ビタミンＢ２）；チアミン（ビタミンＢ１）；コバラミン（ビタミンＢ１２）；アスコルビン酸；α−トコフェロール（ビタミンＥ）及びそれらの混合物を含むが、これらに限定しない。
炭素／エネルギー源の例は、Ｄ−グルコース；ピルビン酸；乳酸；ＡＴＰ；クレアチン；クレアチンホスファート及びそれらの混合物を含むが、これらに限定しない。
一実施形態において、培養培地は市販の細胞培養培地であり、特にGIBCO（登録商標）からのＩＭＤＭ（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ）又はGIBCO（登録商標）からのＲＰＭＩ１６４０培地を含む群において選択される。
他の実施形態において、培養培地は、無血清培養培地、例えばGIBCO（登録商標）からのＡＩＭ−Ｖ培地、ＬＯＮＺＡからのＸ−ＶＩＶＯ １０、１５、及び２０培地などである。
別の実施形態において、培養培地に、特にウシ胎児血清、プールされたヒトＡＢ血清、サイトカイン、及び成長因子を含む群において選択される追加の化合物；特にペニシリン、ストレプトマイシン、及びそれらの混合物を含む群において選択される抗生物質をさらに添加することができる。
一実施形態において、培養培地はＩＭＤＭである。
一部の特定の実施形態において、培養培地はＩＭＤＭ細胞培養培地；１%（ｗ／ｗ）から５%（ｗ／ｗ）のウシ胎児血清；１０IU/mlから２００IU/mlのペニシリン；１０IU/mlから２００IU/mlのストレプトマイシン；非必須アミノ酸、特にアラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、プロリン、セリン、及びチロシンを含む群において選択されるアミノ酸の０．１mMから１０mMの混合物；０．５mMから１０mMのグルタミン、１０mMから２５mMのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．６〜７．８）を含む。
一実施形態において、培地はｎＴｒｅｇ極性化培地である。本発明者らは、「ｎＴｒｅｇ極性化培地」を、本明細書の上に記載する少なくとも１つのｃＡＭＰ活性化剤、本明細書の上に記載する少なくとも１つのＴＧＦβ経路活性化剤、及び本明細書の上に記載する少なくとも１つのｍＴｏｒ阻害剤を含むＲＰＭＩ培地などの培地として定義する。好ましい実施形態において、「ｎＴｒｅｇ極性化培地」は、ＴＧＦβ、ラパマイシン、及びＰＧＥ２を含むＲＰＭＩ培地を指す。
他の実施形態において、培地は炎症性培地である。本発明者らは、「炎症性培地」を、炎症性サイトカイン、例えばＩＬ−１β（１０ng/ml）、ＩＬ−６（３０ng/ml）、ＩＬ−２１（５０ng/ml）、ＩＬ−２３（３０ng/ml）、ＩＬ−２（１００UI/ml）などを含む培地（例えばＩＭＤＭなど）として定義する。
一実施形態において、本発明のγδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞を生成するための培養は、少なくとも５日、少なくとも６日、少なくとも７日、少なくとも８日の間実施する。本発明の範囲内において、表現「少なくとも５日」は、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日を含むが、これらに限定しない。
一実施形態において、培養培地の一部を生成培地の時間経過の間に１回、２回、３回、４回、又は５回捨て、同容量の新鮮培養培地と交換する。本発明の範囲内において、用語「一部」は、培養培地の容量の少なくとも２０%（ｖ／ｖ）、少なくとも２５%（ｖ／ｖ）、少なくとも３０%（ｖ／ｖ）、少なくとも３５%（ｖ／ｖ）、少なくとも４０%（ｖ／ｖ）、少なくとも４５%（ｖ／ｖ）、少なくとも５０%（ｖ／ｖ）、少なくとも５５%（ｖ／ｖ）、少なくとも６０%（ｖ／ｖ） 少なくとも６５%（ｖ／ｖ）、少なくとも７０%（ｖ／ｖ）、少なくとも７５%（ｖ／ｖ）を意味することを意図する。特定の実施形態において、工程ａ）の培養培地の容量の４０%（ｖ／ｖ）から６０%（ｖ／ｖ）を捨てる。特定の実施形態において、捨てる容量を、同容量の新鮮培養培地と交換する。本発明の範囲内において、表現「新鮮培養培地」は、任意のＣＤ３＋Ｔ細胞と接触していない培養培地を指す。
一実施形態において、エクスビボでγδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞を生成するための方法は以下を含む：
−ＣＤ３＋ＴＣＲγδ＋Ｔ細胞、好ましくはＣＤ３＋ＴＣＲγδ＋ＣＤ４５ＲＡ＋Ｔ細胞を、自己ΔＣＤ３フィーダー細胞及びコーティングされた抗ＴＣＲγδ抗体の存在において、ならびに以下の薬剤：ｉ）ＰＧＥ２、ｉｉ）ＴＧＦβ、ｉｉｉ）ラパマイシン、場合によりｉｖ）ＩＬ−２及びＩＬ−１５の群において選択される少なくとも１つのサイトカイン、ならびに場合によりｖ）ビタミンＣの存在において、少なくとも５日間培養すること、
−それにより、好ましくはγδナイーブ（ＣＤ４５ＲＡ＋）Ｔ細胞から、エクスビボで生成されたγδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞の集団を得る。
一実施形態において、エクスビボでγδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞を生成するための方法は以下を含む：
−約２４時間ゾレドロネートを用いてパルスされた寛容原性ＤＣの存在において及びΔＣＤ３フィーダー細胞の存在において及び以下の薬剤：ｉ）ＰＧＥ２、ｉｉ）ＴＧＦβ、ｉｉｉ）ラパマイシン、場合によりｉｖ）ＩＬ−２及びＩＬ−１５の群において選択される少なくとも１つのサイトカイン、及び場合によりｖ）ビタミンＣの存在においてＣＤ３＋ＴＣＲγδ＋Ｔ細胞、好ましくはＣＤ３＋ＴＣＲγδ＋ＣＤ４５ＲＡ＋Ｔ細胞を、少なくとも５日間培養すること、
−それにより、好ましくはγδナイーブ（ＣＤ４５ＲＡ＋）Ｔ細胞から、エクスビボで生成されたγδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞の集団を得ること。
本発明はまた、γδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞の生成及び増殖のエクスビボでの方法に関し、以下を含む：
−本明細書において上に記載するようにγδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞を生成すること、
−それらを、γδＴ細胞活性化剤（好ましくは自己△ＣＤ３フィーダー細胞及びコーティングされた抗ＴＣＲγδ抗体又は約２４時間ゾレドロネートを用いてパルスされた寛容原性ＤＣのいずれか、及び△ＣＤ３フィーダー細胞の存在において）及び以下の薬剤：ｉ）ｃＡＭＰ（環状アデノシン一リン酸）活性化剤（好ましくはＰＧＥ２）、ｉｉ）ＴＧＦβ（形質転換成長因子ベータ）経路活性化剤（好ましくはＴＧＦβ）、ｉｉｉ）ｍＴＯＲ阻害剤（好ましくはラパマイシン）、場合によりｉｖ）ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、及びＴＳＬＰ（好ましくはＩＬ−２及び／又はＩＬ−１５）の群において選択される少なくとも１つのサイトカイン、ならびに場合によりｖ）少なくとも１つのＴＥＴ酵素活性化剤（好ましくはビタミンＣ及びＮａＨＳ硫化水素放出剤より選択される）及び／又は少なくとも１つのＤＮＭＴ阻害剤（例えばＲＧ１０８、ＤＡＣ、又は５ＡＣなど）の存在において接触させることにより生成されたγδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞を、少なくとも５日間増殖させること。
−それにより、γδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞の増殖集団を得ること。
一実施形態において、エクスビボで生成されたγδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞集団を、以下の表現型：ＣＤ３＋ＴＣＲγδ＋ＣＤ４５ＲＯ＋Ｆｏｘｐ３＋に基づくフローサイトメトリーにより単離する。
一実施形態において、このようにして得られた単離γδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞集団を、ポリクローナルγδＴ細胞活性化剤の存在においてこれらの細胞を培養することによりエクスビボで増殖させる。ポリクローナルγδＴ細胞活性化剤の例は本明細書において上に列挙する。あるいは、増殖の間に使用されうるポリクローナルＴ細胞活性化剤の他の例は、マイトジェン（例えばＰＭＡ／イオノマイシンなど）、スーパー抗原、抗ＣＤ３抗体・・・を含むが、これらに限定しない。好ましくは、抗ＣＤ３モノクローナル抗体をコーティングする。一実施形態において、ポリクローナルγδＴ細胞活性化剤を、本明細書において上に記載するようにフィーダー細胞の存在において使用することができる。
別の実施形態において、このようにして得られた単離γδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞集団を次に、本明細書において上に記載するように抗原特異的γδＴ細胞活性化剤の存在においてこれらの細胞を培養することによりエクスビボで増殖させる。一実施形態において、抗原特異的γδＴ細胞活性化剤を、本明細書において上に記載するようにフィーダー細胞の存在において使用することができる。
一実施形態において、本発明のエクスビボで生成されたγδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞を増殖させるための培養は、少なくとも５日、少なくとも６日、少なくとも７日、少なくとも８日の間実施する。本発明の範囲内において、表現「少なくとも５日」は、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２２日、２３日、２４日、２５日、２６日、２７日、２８日、２９日、３０日又はそれ以上を含むが、これらに限定しない。
一実施形態において、培養培地の一部を生成培地の時間経過の間に１回、２回、３回、４回、又は５回捨て、同容量の新鮮培養培地と交換する。本発明の範囲内において、用語「一部」は、培養培地の容量の少なくとも２０%（ｖ／ｖ）、少なくとも２５%（ｖ／ｖ）、少なくとも３０%（ｖ／ｖ）、少なくとも３５%（ｖ／ｖ）、少なくとも４０%（ｖ／ｖ）、少なくとも４５%（ｖ／ｖ）、少なくとも５０%（ｖ／ｖ）、少なくとも５５%（ｖ／ｖ）、少なくとも６０%（ｖ／ｖ） 少なくとも６５%（ｖ／ｖ）、少なくとも７０%（ｖ／ｖ）、少なくとも７５%（ｖ／ｖ）を意味することを意図する。特定の実施形態において、工程ａ）の培養培地の容量の４０%（ｖ／ｖ）から６０%（ｖ／ｖ）を捨てる。特定の実施形態において、捨てる容量を、同容量の新鮮培養培地と交換する。本発明の範囲内において、表現「新鮮培養培地」は、任意のＣＤ３＋Ｔ細胞と接触していない培養培地を指す。
一実施形態において、γδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞は、ＩＭＤＭ−５中のＰＧＥ２（１μM）、ＴＧＦβ（５ng/ml）、ラパマイシン（１０nM）、及びＩＬ−２（１００UI/ml）の存在における自己ΔＣＤ３フィーダー細胞（１２５ １０５細胞/ml）及びコーティングされた抗ＴＣＲγδ抗体（２μg/ml）の存在において、ＰＢＭＣからフローサイトメトリーにより得られたＣＤ３＋ＴＣＲγδ＋ＣＤ４５ＲＡ＋Ｔ細胞（５． １０３細胞/ml）を培養することによりエクスビボで生成する。１日目に、ＩＬ−２（１００UI/ml）及びＩＬ−１５（１０ng/ml）を培養物に加える。３日毎に、培地容量の半分を捨て、ＰＧＥ２（５０nM）、ＴＧＦβ（５ng/ml）、ラパマイシン（１nM）、ＩＬ−２（１００μl/ml）、及びＩＬ−１５（１０ng/ml）を含む新鮮培地により交換する。細胞が増殖し始めたら、２〜３日毎に細胞を分割し、ＰＧＥ２（１μM）、ＴＧＦβ（５ng/ml）、ラパマイシン（１０nM）、及びＩＬ−２（１００UI/ml）を含む培地中で９日毎にΔＣＤ３フィーダー細胞及びコーティングされた抗ＴＣＲγδ抗体の存在において培養することができる。
別の実施形態において、γδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞は、約２４時間ゾレドロネートを用いてパルスされた寛容原性ＤＣの存在において、ならびにＩＭＤＭ−５中のΔＣＤ３フィーダー細胞（１２５ １０５細胞/ml）、ＰＧＥ２（１μM）、ＴＧＦβ（５ng/ml）、ラパマイシン（１０nM）、及びＩＬ−２（１００UI/ml）の存在において、フローサイトメトリーによりＰＢＭＣから得られた（５． １０３細胞/ml）ＣＤ３＋ＴＣＲγδ＋ＣＤ４５ＲＡ＋Ｔ細胞（５． １０３細胞/ml）を培養することによりエクスビボで生成する。１日目に、ＩＬ−２（１００UI/ml）、ＩＬ−１５（１０ng/ml）、及びＴＧＦβ（５ng/ml）を培養物に加える。３日毎に、培地容量の半分を捨て、ＰＧＥ２（５０nM）、ＴＧＦβ（５ng/ml）、ラパマイシン（１nM）、ＩＬ−２（１００UI/ml）、及びＩＬ−１５（１０ng/ml）を含む新鮮培地により交換する。細胞が増殖し始めたら、それらを２又は３日毎に分割し、ΔＣＤ３フィーダー細胞及びＰＧＥ２（１μM）、ＴＧＦβ（５ng/ml）、ラパマイシン（１０nM）、及びＩＬ−２（１００UI/ml）の存在において、寛容原性ＤＣを用いて９日毎に再刺激することができる。
この実施形態において、寛容原性ＤＣは、ＧＭＣＳＦ（１００ng/ml）及びＩＬ−４（１０ng/ml）を添加したＡＩＭＶの存在においてＰＢＭＣから単離されたＣＤ１４＋単球を培養することにより得た。３日目及び６日目に、培地を捨て、ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４を含む新鮮培地により交換する。６日目に、寛容原性ＤＣをゾレドロネート（１００nM）の存在において２４時間にわたりパルスする。
本発明はまた、本明細書において上に記載するエクスビボでの生成方法により入手可能なγδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞に関する。
本発明はまた、本明細書において上に記載するエクスビボでの生成及び増殖方法により入手可能なγδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞に関する。
一実施形態において、本発明の生成及び増殖方法により得られたγδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞の集団は、少なくとも１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０個の細胞を含む。
一実施形態において、本発明の生成及び増殖方法により得られたγδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞の集団は以下の表現型：ＣＤ３＋ＴＣＲγδ＋Ｆｏｘｐ３＋を有する。
一実施形態において、本発明の方法により取得可能な又は得られたγδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞は、Ｖδ２アイソタイプを発現する。一実施形態において、本発明のγδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞は、Ｖδ２アイソタイプを発現しない。
別の実施形態において、本発明の方法により取得可能な又は得られたγδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞はＶγ９アイソタイプを発現する。一実施形態において、本発明のγδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞は、Ｖγ９アイソタイプを発現しない。
一実施形態において、本発明の方法により取得可能な又は得られたγδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞は、Ｖγ９Ｖδ２アイソタイプを発現する。一実施形態において、本発明のγδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞は、Ｖγ９Ｖδ２アイソタイプを発現しない。
一実施形態において、本発明のγδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞はＶδ３アイソタイプを発現する。一実施形態において、本発明のγδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞はＶδ４アイソタイプを発現する。一実施形態において、本発明のγδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞はＶδ５アイソタイプを発現する。一実施形態において、本発明のγδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞はＶδ６アイソタイプを発現する。
一実施形態において、γδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞の前記集団は、以下の表現型を有する：ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋ＴＣＲγδ＋。
一実施形態において、γδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞の前記集団は、以下の表現型を有する：ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋ＴＣＲγδ＋ＣＤ２５＋。
一実施形態において、γδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞の前記集団は、以下の表現型を有する：ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋ＴＣＲγδ＋ＣＴＬＡ４＋。
一実施形態において、γδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞の前記集団は、以下の表現型を有する：ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋ＴＣＲγδ＋ＣＤ４５ＲＯ＋。
一実施形態において、γδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞の前記集団は、以下の表現型を有する：ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋ＴＣＲγδ＋ＣＤ１２７＋。
一実施形態において、γδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞の前記集団は、以下の表現型を有する：ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋ＴＣＲγδ＋ＩＬ−１Ｒ１−。
一実施形態において、γδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞の前記集団は、以下の表現型を有する：ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋ＴＣＲγδ＋ＩＬ−６Ｒ−。
一実施形態において、γδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞の前記集団は以下の表現型を有する：ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋ＴＣＲγδ＋ＩＬ−２３Ｒ−。
一実施形態において、γδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞の前記集団は、以下の表現型を有する：ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋ＴＣＲγδ＋ＩＬ−３３Ｒ−。
一実施形態において、γδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞の前記集団は、以下の表現型を有する：ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋ＴＣＲγδ＋ＣＤ２５＋ＣＴＬＡ４＋。
一実施形態において、γδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞の前記集団は、以下の表現型を有する：ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋ＴＣＲγδ＋ＣＤ２５＋ＣＤ４５ＲＯ＋。
一実施形態において、γδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞の前記集団は、以下の表現型を有する：ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋ＴＣＲγδ＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７＋。
一実施形態において、γδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞の前記集団は、以下の表現型を有する：ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋ＴＣＲγδ＋ＣＴＬＡ４＋ＣＤ４５ＲＯ＋。
一実施形態において、γδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞の前記集団は、以下の表現型を有する：ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋ＴＣＲγδ＋ＣＴＬＡ４＋ＣＤ１２７＋。
一実施形態において、γδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞の前記集団は、以下の表現型を有する：ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋ＴＣＲγδ＋ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＤ１２７＋。
一実施形態において、γδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞の前記集団は、以下の表現型を有する：ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋ＴＣＲγδ＋ＣＤ２５＋ＩＬ−１Ｒ１−。
一実施形態において、γδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞の前記集団は、以下の表現型を有する：ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋ＴＣＲγδ＋ＣＤ２５＋ＩＬ−６Ｒ−。
一実施形態において、γδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞の前記集団は、以下の表現型を有する：ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋ＴＣＲγδ＋ＣＤ２５＋ＩＬ−２３Ｒ−。
一実施形態において、γδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞の前記集団は、以下の表現型を有する：ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋ＴＣＲγδ＋ＣＤ２５＋ＩＬ−３３Ｒ−。
一実施形態において、γδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞の前記集団は、以下の表現型を有する：ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋ＴＣＲγδ＋ＣＤ２５＋ＣＴＬＡ４＋ＣＤ４５ＲＯ＋。
一実施形態において、γδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞の前記集団は、以下の表現型を有する：ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋ＴＣＲγδ＋ＣＤ２５＋ＣＴＬＡ４＋ＣＤ１２７＋。
一実施形態において、γδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞の前記集団は、以下の表現型を有する：ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋ＴＣＲγδ＋ＣＤ２５＋ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＤ１２７＋。
一実施形態において、γδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞の前記集団は、以下の表現型を有する：ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋ＴＣＲγδ＋ＣＴＬＡ４＋ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＤ１２７＋。
一実施形態において、γδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞の前記集団は、以下の表現型を有する：ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋ＴＣＲγδ＋ＩＬ−１Ｒ１−ＣＴＬＡ４＋。
一実施形態において、γδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞の前記集団は、以下の表現型を有する：ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋ＴＣＲγδ＋ＩＬ−６Ｒ−ＣＴＬＡ４＋。
一実施形態において、γδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞の前記集団は、以下の表現型を有する：ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋ＴＣＲγδ＋ＩＬ−２３Ｒ−ＣＴＬＡ４＋。
一実施形態において、γδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞の前記集団は、以下の表現型を有する：ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋ＴＣＲγδ＋ＩＬ−３３Ｒ−ＣＴＬＡ４＋。
一実施形態において、γδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞の前記集団は、以下の表現型を有する：ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋ＴＣＲγδ＋ＩＬ−１Ｒ１−ＣＤ１２７＋。
一実施形態において、γδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞の前記集団は、以下の表現型を有する：ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋ＴＣＲγδ＋ＩＬ−６Ｒ−ＣＤ１２７＋。
一実施形態において、γδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞の前記集団は、以下の表現型を有する：ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋ＴＣＲγδ＋ＩＬ−２３Ｒ−ＣＤ１２７＋。
一実施形態において、γδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞の前記集団は、以下の表現型を有する：ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋ＴＣＲγδ＋ＩＬ−３３Ｒ−ＣＤ１２７＋。
一実施形態において、γδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞の前記集団は、以下の表現型を有する：ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋ＴＣＲγδ＋ＩＬ−１Ｒ１−ＣＤ４５ＲＯ＋。
一実施形態において、γδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞の前記集団は、以下の表現型を有する：ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋ＴＣＲγδ＋ＩＬ−６Ｒ−ＣＤ４５ＲＯ＋。
一実施形態において、γδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞の前記集団は、以下の表現型を有する：ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋ＴＣＲγδ＋ＩＬ−２３Ｒ−ＣＤ４５ＲＯ＋。
一実施形態において、γδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞の前記集団は、以下の表現型を有する：ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋ＴＣＲγδ＋ＩＬ−３３Ｒ−ＣＤ４５ＲＯ＋。
一実施形態において、γδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞の前記集団は、以下の表現型を有する：ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋ＴＣＲγδ＋ＩＬ−１Ｒ１−ＩＬ−６Ｒ−。
一実施形態において、γδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞の前記集団は、以下の表現型を有する：ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋ＴＣＲγδ＋ＩＬ−１Ｒ１−ＩＬ−２３Ｒ−。
一実施形態において、γδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞の前記集団は、以下の表現型を有する：ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋ＴＣＲγδ＋ＩＬ−１Ｒ１−ＩＬ−３３Ｒ−。
一実施形態において、γδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞の前記集団は、以下の表現型を有する：ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋ＴＣＲγδ＋ＩＬ−６Ｒ−ＩＬ−２３Ｒ−。
一実施形態において、γδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞の前記集団は、以下の表現型を有する：ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋ＴＣＲγδ＋ＩＬ−６Ｒ−ＩＬ−３３Ｒ−。
一実施形態において、γδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞の前記集団は、以下の表現型を有する：ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋ＴＣＲγδ＋ＩＬ−２３Ｒ−ＩＬ−３３Ｒ−。
一実施形態において、γδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞の前記集団は、以下の表現型を有する：ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋ＴＣＲγδ＋ＣＤ２５＋ＣＴＬＡ４＋ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＤ１２７＋。
一実施形態において、γδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞の前記集団は、以下の表現型を有する：ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋ＴＣＲγδ＋ＣＤ２５＋ＩＬ−１Ｒ１−ＣＴＬＡ４＋。
一実施形態において、γδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞の前記集団は、以下の表現型を有する：ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋ＴＣＲγδ＋ＣＤ２５＋ＩＬ−６Ｒ−ＣＴＬＡ４＋。
一実施形態において、γδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞の前記集団は、以下の表現型を有する：ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋ＴＣＲγδ＋ＣＤ２５＋ＩＬ−２３Ｒ−ＣＴＬＡ４＋。
一実施形態において、γδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞の前記集団は、以下の表現型を有する：ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋ＴＣＲγδ＋ＣＤ２５＋ＩＬ−３３Ｒ−ＣＴＬＡ４＋。
一実施形態において、γδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞の前記集団は、以下の表現型を有する：ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋ＴＣＲγδ＋ＣＤ２５＋ＩＬ−１Ｒ１−ＣＤ１２７＋。
一実施形態において、γδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞の前記集団は、以下の表現型を有する：ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋ＴＣＲγδ＋ＣＤ２５＋ＩＬ−６Ｒ−ＣＤ１２７＋。
一実施形態において、γδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞の前記集団は、以下の表現型を有する：ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋ＴＣＲγδ＋ＣＤ２５＋ＩＬ−２３Ｒ−ＣＤ１２７＋。
一実施形態において、γδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞の前記集団は、以下の表現型を有する：ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋ＴＣＲγδ＋ＣＤ２５＋ＩＬ−３３Ｒ−ＣＤ１２７＋。
一実施形態において、γδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞の前記集団は、以下の表現型を有する：ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋ＴＣＲγδ＋ＣＤ２５＋ＩＬ−１Ｒ１−ＣＤ４５ＲＯ＋。
一実施形態において、γδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞の前記集団は、以下の表現型を有する：ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋ＴＣＲγδ＋ＣＤ２５＋ＩＬ−６Ｒ−ＣＤ４５ＲＯ＋。
一実施形態において、γδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞の前記集団は、以下の表現型を有する：ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋ＴＣＲγδ＋ＣＤ２５＋ＩＬ−２３Ｒ−ＣＤ４５ＲＯ＋。
一実施形態において、γδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞の前記集団は、以下の表現型を有する：ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋ＴＣＲγδ＋ＣＤ２５＋ＩＬ−３３Ｒ−ＣＤ４５ＲＯ＋。
一実施形態において、γδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞の前記集団は、以下の表現型を有する：ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋ＴＣＲγδ＋ＣＤ２５＋ＩＬ−１Ｒ１−ＩＬ−６Ｒ−。
一実施形態において、γδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞の前記集団は、以下の表現型を有する：ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋ＴＣＲγδ＋ＣＤ２５＋ＩＬ−１Ｒ１−ＩＬ−２３Ｒ−。
一実施形態において、γδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞の前記集団は、以下の表現型を有する：ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋ＴＣＲγδ＋ＣＤ２５＋ＩＬ−１Ｒ１−ＩＬ−３３Ｒ−。
一実施形態において、γδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞の前記集団は、以下の表現型を有する：ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋ＴＣＲγδ＋ＣＤ２５＋ＩＬ−６Ｒ−ＩＬ−２３Ｒ−。
一実施形態において、γδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞の前記集団は、以下の表現型を有する：ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋ＴＣＲγδ＋ＣＤ２５＋ＩＬ−６Ｒ−ＩＬ−３３Ｒ−。
一実施形態において、γδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞の前記集団は、以下の表現型を有する：ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋ＴＣＲγδ＋ＣＤ２５＋ＩＬ−２３Ｒ−ＩＬ−３３Ｒ−。
一実施形態において、γδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞の前記集団は、以下の表現型を有する：ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋ＴＣＲγδ＋ＣＴＬＡ４＋ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＤ１２７＋ＩＬ−１Ｒ１−。
一実施形態において、γδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞の前記集団は、以下の表現型を有する：ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋ＴＣＲγδ＋ＣＴＬＡ４＋ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＤ１２７＋ＩＬ−６Ｒ−。
一実施形態において、γδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞の前記集団は、以下の表現型を有する：ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋ＴＣＲγδ＋ＣＴＬＡ４＋ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＤ１２７＋ＩＬ−２３Ｒ−。
一実施形態において、γδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞の前記集団は、以下の表現型を有する：ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋ＴＣＲγδ＋ＣＴＬＡ４＋ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＤ１２７＋ＩＬ−３３Ｒ−。
一実施形態において、γδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞の前記集団は、以下の表現型を有する：ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋ＴＣＲγδ＋ＣＴＬＡ４＋ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＤ１２７＋ＩＬ−１Ｒ１−ＩＬ−６Ｒ−。
一実施形態において、γδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞の前記集団は、以下の表現型を有する：ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋ＴＣＲγδ＋ＣＴＬＡ４＋ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＤ１２７＋ＩＬ−１Ｒ１−ＩＬ−２３Ｒ−。
一実施形態において、γδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞の前記集団は、以下の表現型を有する：ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋ＴＣＲγδ＋ＣＴＬＡ４＋ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＤ１２７＋ＩＬ−１Ｒ１−ＩＬ−３３Ｒ−。
一実施形態において、γδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞の前記集団は、以下の表現型を有する：ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋ＴＣＲγδ＋ＣＴＬＡ４＋ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＤ１２７＋ＩＬ−６Ｒ−ＩＬ−２３Ｒ−。
一実施形態において、γδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞の前記集団は、以下の表現型を有する：ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋ＴＣＲγδ＋ＣＴＬＡ４＋ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＤ１２７＋ＩＬ−６Ｒ−ＩＬ−３３Ｒ−。
一実施形態において、γδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞の前記集団は以下の表現型を有する：ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋ＴＣＲγδ＋ＣＴＬＡ４＋ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＤ１２７＋ＩＬ−２３Ｒ−ＩＬ−３３Ｒ−。
一実施形態において、γδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞の前記集団は、以下の表現型を有する：ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋ＴＣＲγδ＋ＣＴＬＡ４＋ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＤ１２７＋ＩＬ−６Ｒ−ＩＬ−２３Ｒ−ＩＬ−３３Ｒ−。
一実施形態において、γδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞の前記集団は、以下の表現型を有する：ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋ＴＣＲγδ＋ＣＴＬＡ４＋ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＤ１２７＋ＩＬ−１Ｒ１−ＩＬ−２３Ｒ−ＩＬ−３３Ｒ−。
一実施形態において、γδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞の前記集団は、以下の表現型を有する：ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋ＴＣＲγδ＋ＣＴＬＡ４＋ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＤ１２７＋ＩＬ−１Ｒ１−ＩＬ−６Ｒ−ＩＬ−３３Ｒ−。
一実施形態において、γδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞の前記集団は、以下の表現型を有する：ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋ＴＣＲγδ＋ＣＴＬＡ４＋ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＤ１２７＋ＩＬ−１Ｒ１−ＩＬ−６Ｒ−ＩＬ−２３Ｒ−。
一実施形態において、γδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞の前記集団は、以下の表現型を有する：ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋ＴＣＲγδ＋ＣＴＬＡ４＋ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＤ１２７＋ＩＬ−１Ｒ１−ＩＬ−６Ｒ−ＩＬ−２３Ｒ−ＩＬ−３３Ｒ−。
一実施形態において、γδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞の前記集団は、以下の表現型を有する：ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋ＴＣＲγδ＋ＣＤ２５＋ＣＴＬＡ４＋ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＤ１２７＋ＩＬ−１Ｒ１−。
一実施形態において、γδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞の前記集団は、以下の表現型を有する：ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋ＴＣＲγδ＋ＣＤ２５＋ＣＴＬＡ４＋ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＤ１２７＋ＩＬ−６Ｒ−。
一実施形態において、γδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞の前記集団は、以下の表現型を有する：ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋ＴＣＲγδ＋ＣＤ２５＋ＣＴＬＡ４＋ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＤ１２７＋ＩＬ−２３Ｒ−。
一実施形態において、γδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞の前記集団は、以下の表現型を有する：ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋ＴＣＲγδ＋ＣＤ２５＋ＣＴＬＡ４＋ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＤ１２７＋ＩＬ−３３Ｒ−。
一実施形態において、γδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞の前記集団は、以下の表現型を有する：ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋ＴＣＲγδ＋ＣＤ２５＋ＣＴＬＡ４＋ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＤ１２７＋ＩＬ−１Ｒ１−ＩＬ−６Ｒ−。
一実施形態において、γδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞の前記集団は、以下の表現型を有する：ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋ＴＣＲγδ＋ＣＤ２５＋ＣＴＬＡ４＋ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＤ１２７＋ＩＬ−１Ｒ１−ＩＬ−２３Ｒ−。
一実施形態において、γδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞の前記集団は、以下の表現型を有する：ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋ＴＣＲγδ＋ＣＤ２５＋ＣＴＬＡ４＋ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＤ１２７＋ＩＬ−１Ｒ１−ＩＬ−３３Ｒ−。
一実施形態において、γδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞の前記集団は、以下の表現型を有する：ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋ＴＣＲγδ＋ＣＤ２５＋ＣＴＬＡ４＋ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＤ１２７＋ＩＬ−６Ｒ−ＩＬ−２３Ｒ−。
一実施形態において、γδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞の前記集団は次の表現型を有する：ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋ＴＣＲγδ＋ＣＤ２５＋ＣＴＬＡ４＋ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＤ１２７＋ＩＬ−６Ｒ−ＩＬ−３３Ｒ−。
一実施形態において、γδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞の前記集団は、以下の表現型を有する：ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋ＴＣＲγδ＋ＣＤ２５＋ＣＴＬＡ４＋ＣＤ１２５ＲＯ＋ＣＤ１２７＋ＩＬ−２３Ｒ−ＩＬ−３３Ｒ−。
一実施形態において、γδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞の前記集団は、以下の表現型を有する：ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋ＴＣＲγδ＋ＣＤ２５＋ＣＴＬＡ４＋ＣＤ１２５ＲＯ＋ＣＤ１２７＋ＩＬ−６Ｒ−ＩＬ−２３Ｒ−ＩＬ−３３Ｒ−。
一実施形態において、γδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞の前記集団は、以下の表現型を有する：ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋ＴＣＲγδ＋ＣＤ２５＋ＣＴＬＡ４＋ＣＤ１２５ＲＯ＋ＣＤ１２７＋ＩＬ−１Ｒ１−ＩＬ−２３Ｒ−ＩＬ−３３Ｒ−。
一実施形態において、γδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞の前記集団は、以下の表現型を有する：ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋ＴＣＲγδ＋ＣＤ２５＋ＣＴＬＡ４＋ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＤ１２７＋ＩＬ−１Ｒ１−ＩＬ−６Ｒ−ＩＬ−３３Ｒ−。
一実施形態において、γδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞の前記集団は以下の表現型を有する：ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋ＴＣＲγδ＋ＣＤ２５＋ＣＴＬＡ４＋ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＤ１２７＋ＩＬ−１Ｒ１−ＩＬ−６Ｒ−ＩＬ−２３Ｒ−。
一実施形態において、γδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞の前記集団は、以下の表現型を有する：ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋ＴＣＲγδ＋ＣＤ２５＋ＣＴＬＡ４＋ＣＤ１２５Ｒ＋ＣＤ１２７＋ＩＬ−１Ｒ１−ＩＬ−６Ｒ−ＩＬ−２３Ｒ−ＩＬ−３３Ｒ−。
一実施形態において、本発明のγδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞は、遺伝子Ｆｏｘｐ３の調節性Ｔ細胞特異的な脱メチル化領域（ＴＳＤＲ）を提示しない。別の実施形態において、本発明のγδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞は、遺伝子Ｆｏｘｐ３の調節性Ｔ細胞特異的な脱メチル化領域（ＴＳＤＲ）を提示する。一実施形態において、γδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞は、少なくとも３０%、４０%、５０%を超える、遺伝子ＦＯＸＰ３のＴＳＤＲの脱メチル化のパーセンテージを提示する。プロモーター脱メチル化パーセンテージを測定するためのプロトコールを、実施例の材料及び方法のパートに示す。
別の実施形態において、γδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞は、少なくとも１０%、２０%、３０%、４０%、又は５０%を超える、Ｆｏｘｐ３プロモーター領域におけるアセチル化ヒストンの濃縮パーセンテージを提示する。アセチル化ヒストンの濃縮をパーセンテージで測定するためのプロトコールを、実施例の材料及び方法のパートに示す。
本発明のγδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞の集団の表現型の特徴の例を図１に示す。
一実施形態において、γδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞の前記集団は、ナイーブ調節性Ｔ細胞において測定されたＦｏｘｐ３ ＭＦＩと少なくとも等価の蛍光強度の中央値（ＭＦＩ）でＦｏｘｐ３を発現する。本明細書において使用するように、「ナイーブ調節性Ｔ細胞」は、表現型Ｆｏｘｐ３＋ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７−を有するＴ細胞を指す。
一実施形態において、γδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞は、少なくとも２０００の蛍光強度の中央値（ＭＦＩ）でＦｏｘｐ３を発現する。
一実施形態において、γδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞は、ナイーブ調節性Ｔ細胞において測定されるＦｏｘｐ３ ＭＦＩの少なくとも２又は３倍の蛍光強度の中央値（ＭＦＩ）でＦｏｘｐ３を発現する。
一実施形態において、γδ調節性Ｔ細胞は、少なくとも２０００、３０００、４０００、５０００、１００００、２００００、３００００、４００００、５００００、６００００、７００００の蛍光強度の中央値（ＭＦＩ）でＦｏｘｐ３を発現する。
一実施形態において、γδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞集団は、少なくとも６５%のＦｏｘｐ３を発現するＣＤ３＋ＣＤ４＋細胞を含む。表現「少なくとも６５%」は、６５%、６６%、６７%、６８%、６９%、７０%、７１%、７２%、７３%、７４%、７５２%、７６%、７７%、７８%、７９%、８０%、８１% 、８２%、８３%、８４%、８５%、８６%、８７%、８８%、８９%、９０%、９１%、８２%、９３%、９４%、９５%、９６%、９７%、９８%、９９%、及び１００%を含むが、これらに限定しない。
本明細書において使用するように、用語「発現」は、あるいは、分子の転写（即ち、ｍＲＮＡの発現）又は分子の翻訳（即ち、タンパク質の発現）を指しうる。一実施形態において、発現を検出することは、細胞内検出に対応しうる。別の実施形態において、発現を検出することは、表面検出、即ち、細胞表面で発現される分子の検出に対応しうる。別の実施形態において、発現を検出することは、細胞外検出、即ち、分泌の検出に対応しうる。別の実施形態において、発現を検出することは、細胞内検出、表面検出、及び／又は細胞外検出に対応しうる。発現レベルを決定するための方法は当業者に周知であり、細胞のトランスクリプトーム（発現が分子の転写に関連する実施形態において）又はプロテオーム（発現が細胞傷害性分子の翻訳に関連する実施形態において）の決定を含むが、これらに限定しない。
本発明の一実施形態において、分子の発現をｍＲＮＡレベルで評価する。分子の転写レベルを評価するための方法は先行技術において周知である。そのような方法の例は、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＴ−ｑＰＣＲ、ノーザンブロット、ハイブリダイゼーション技術（例えばマイクロアレイの使用など）、及びそれらの組み合わせ（ＲＴ−ＰＣＲにより得られたアンプリコンのハイブリダイゼーション、シークエンシング、例えば次世代ＤＮＡシークエンシング（ＮＧＳ）又はＲＮＡ−ｓｅｑ（「全トランスクリプトームショットガンシークエンシング」としても公知）などを含むが、これらに限定しない）を含むが、これらに限定しない。本発明の別の実施形態において、分子の発現をタンパク質レベルで評価する。サンプル中のタンパク質レベルを決定するための方法は当技術分野において周知である。そのような方法の例は、免疫組織化学、マルチプレックス方法（Ｌｕｍｉｎｅｘ）、ウエスタンブロット、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、サンドイッチＥＬＩＳＡ、蛍光結合免疫吸着検定法（ＦＬＩＳＡ）、酵素免疫検定法（ＥＩＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）などを含む。
別の実施形態において、少なくとも１つの分子の発現レベルを決定することは、分子へのリガンドの結合を検出及び／又は定量化することに対応する。一実施形態において、前記リガンドは前記分子に特異的な抗体であり、本発明の方法は前記抗体と前記分子の間に形成された複合体を検出及び／又は定量化することを含む。リガンドが、例えば、検出可能な分子、例えば抗体定常フラグメント（Ｆｃ）又は蛍光化合物（例、シアニン色素、Ａｌｅｘａ色素、Ｑｕａｎｔｕｍ色素など）などと共有結合されている場合、複合体を検出することができる。リガンドが当業者に周知の異なる手段でタグ付けされている場合も複合体を検出することができる。例えば、本発明と使用されるタグは、ヘマグルチニンタグ、ポリアルギニンタグ、ポリヒスチジンタグ、Ｍｙｃタグ、Ｓｔｒｅｐタグ、Ｓタグ、ＨＡＴタグ、３×フラグタグ、カルモジュリン結合ペプチドタグ、ＳＢＰタグ、キチン結合ドメインタグ、ＧＳＴタグ、マルトース結合タンパク質タグ、蛍光タンパク質タグ、Ｔ７タグ、Ｖ５タグ、及びＸｐｒｅｓｓタグを含むか又はそれらからなる群より選択されるタグでありうる。リガンドの使用によって、従って、一方では使用されるリガンドに依存して分子の同定及び検出が、他方では形成された複合体の定量化が可能になる。
一実施形態において、分子の発現レベルを決定することは、フローサイトメトリー、免疫蛍光法、又は画像分析、例えばハイコンテント分析により行う。好ましくは、分子の発現レベルの決定はフローサイトメトリーにより行う。一実施形態において、フローサイトメトリー分析を行う前に、細胞を固定して透過処理し、それにより細胞内タンパク質の検出を可能にする。
一実施形態において、細胞集団中の分子の発現レベルを決定することは、その分子を発現する細胞集団での細胞のパーセンテージ（即ち、その分子についての細胞「＋」）を決定することを含む。好ましくは、その分子を発現する細胞の前記パーセンテージをＦＡＣＳにより測定する。
用語「発現している（又は＋）」及び「発現していない（又は−）」は当技術分野において周知であり、目的の細胞マーカーの発現レベルを指し、それにおいて、「＋」に対応する細胞マーカーの発現レベルは高又は中程度であり、「＋／−」としても言及する。「−」に対応する細胞マーカーは、細胞マーカーのヌル発現レベルである、又は前記細胞マーカーを発現する細胞集団の１０%未満も指す。
目的の細胞マーカーの発現レベルは、このマーカーについて特異的な蛍光標識抗体を用いて染色された細胞集団からの細胞の蛍光強度中央値（ＭＦＩ）を、無関係な特異性を伴うが、同じアイソタイプ、同じ蛍光プローブを伴い、同じ種に由来する（アイソタイプ対照として言及する）蛍光標識抗体を用いて染色された同じ細胞集団からの細胞の蛍光強度（ＦＩ）と比較することにより決定する。このマーカーについて特異的な蛍光標識抗体を用いて染色され、アイソタイプ対照を用いて染色された細胞と等価のＭＦＩ又はより低いＭＦＩを示す集団からの細胞は、このマーカーを発現しておらず、従って（−）又は陰性と指定する。このマーカーについて特異的であり、アイソタイプ対照を用いて染色された細胞を超えるＭＦＩ値を示す集団からの細胞は、このマーカーを発現しており、従って（＋）又は陽性と指定する。
一実施形態において、γδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞は、ナイーブＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ１２７−調節性Ｔ細胞の抑制活性と同様の抑制活性が可能である。細胞集団の抑制活性の決定は当技術分野において周知であり、従来のアッセイ、例えば標準的なポリクローナル細胞−細胞接触Ｔｒｅｇ抑制アッセイ又は実施例に記載するような自己ＭＬＲ抑制アッセイなどにより実施することができる。
本発明の別の目的は、炎症状態に置かれた場合に機能的に安定なままであるγδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞の集団である。
一実施形態において、本発明のエクスビボでの生成及び増殖方法により取得可能な又は得られたγδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞の集団は、炎症状態に置かれた場合に機能的に安定なままであるという特性を有する。
本明細書において使用するように、「機能的に安定」は、ＩＬ−１７の無分泌又は低分泌、即ち、２００ng/ml、１００ng/ml、５０ng/mlより劣り、依然として抑制能力、即ち、実施例において示すように従来型Ｔ細胞の増殖を阻害することが可能であることを指す。
本明細書において使用するように、「炎症状態」は、炎症性サイトカイン、例えばＩＬ−１β（１０ng/ml）、ＩＬ−６（３０ng/ml）、ＩＬ−２１（５０ng/ml）、ＩＬ−２３（３０ng/ml）、ＩＬ−２（１００UI/ml）などを含む、芳香族酸、好ましくはトリプトファン、例えばＩＭＤＭなどに富む培地を指す。調節性Ｔ細胞の集団が炎症状態において機能的に安定なままであるか否かを決定するための方法は、好ましくはコーティングされた抗ＣＤ３（４μg/ml）、好ましくは可溶型の抗ＣＤ２８（４μg/ml）の存在において、本明細書において上に記載するように調節性Ｔ細胞を炎症状態培地中で培養することを含む。３６〜７２時間の培養後、培養上清中のＩＬ−１７の存在を測定する。培養上清中でのＩＬ−１７の認識は、当技術分野において公知の従来の方法、例えばサンドイッチＥＬＩＳＡ抗ＩＬ−１７などにより行うことができる。簡単には、プレートを捕捉抗ＩＬ−１７抗体でコーティングした後、培養上清を、希釈系列を伴う各々のウェルに加える。インキュベーション後、検出抗ＩＬ−１７抗体を各々のウェルに加える。ＥＬＩＳＡは、当技術分野において公知の任意の比色的手段、例えば、ビオチンを用いて標識された検出抗体、ポリストレプトアビジンＨＲＰ増幅システム、及びｏ−フェニレンジアミン二塩酸塩基質溶液を使用するなどにより開発する。２００ng/ml、１００ng/ml、５０ng/mlより劣るＩＬ−１７レベルは、ＩＬ−１７の無分泌又は低分泌に対応する。
理論に拘束されることを望まないが、本発明者らは、悪性腫瘍細胞の間質が、調節性Ｔ細胞が高度に豊富であり、特にＮＫ細胞に対して免疫抑制活性（局所癌の免疫逃避を説明する可能性が高い）を発揮するＴＩＬ（腫瘍浸潤リンパ球）を含むと述べている。不活化γδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞は、ＴＩＬ中に存在するγδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞に対して免疫応答を誘導する抗原性標的を表し、それにより、それらの免疫抑制活性を防止し、腫瘍細胞に対するエフェクター細胞（例えばＮＫ細胞など）の細胞傷害活性を可能にする。本発明者らは、このように、不活化γδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞を含むワクチン組成物を有効成分として使用することを示唆する。
本発明の１つの目的は、本明細書において上に記載するように、不活化γδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞を含む、それから本質的になる、又はそれからなる免疫原性産物である。
一実施形態において、免疫原性産物は、本明細書において上に記載するように、以下の表現型ＣＤ３＋ＴＣＲγδ＋Ｆｏｘｐ３＋を有する不活化γδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞を含む、それから本質的になる、又はそれからなる。
本明細書において使用するように、用語「から本質的になる」は、免疫原性産物、医薬組成物、ワクチン、又は医薬に関して、本発明の少なくとも１つのγδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞集団又は抗体が、前記免疫原性産物、医薬組成物、ワクチン、もしくは医薬内に生物学的活性を伴う唯一の治療薬剤又は薬剤であることを意味する。
一実施形態において、免疫原性産物は、本明細書において上に記載するように生成され、場合によりエクスビボで増殖される、以下の表現型ＣＤ３＋ＴＣＲγδ＋Ｆｏｘｐ３＋を有する不活化γδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞を含む、それから本質的になる、又はそれからなる。
本発明の１つの目的は、本明細書において上に記載するようにγδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞からのブレブを含む免疫原性産物である。
本発明の１つの目的は、本明細書において上に記載するようにγδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞からのブレブを負荷した免疫原性樹状細胞（免疫原性ＤＣ）を含む免疫原性産物である。
本明細書において使用するように、「免疫原性ＤＣ」は、免疫原性応答を誘導することが可能なＤＣを指す。一実施態様において、免疫原性ＤＣは以下の表現型：ＣＤ８０ｈｉｇｈＣＤ８３ｈｉｇｈＣＤ８６ｈｉｇｈＨＬＡクラスＩｈｉｇｈ及びＨＬＡクラスＩＩｈｉｇｈを有し、ＩＬ−１２／ＩＬ−１０＞１の比率でＩＬ−１０及びＩＬ−１２を分泌する。
免疫原性ＤＣを得るための方法は当技術分野において周知である。例示的な方法はＣＤ１４＋単球からの免疫原性ＤＣの生成である。例えば、ＣＤ１４＋単球は、ＭｏＤＣを得るためにＧＭ−ＣＳＦ（約２０ng/mL）及びＩＦＮα（約１０ng/mL）の存在において培養する。ＭｏＤＣの成熟は、ＩＬ−１β（約１０ng/ml）、ＩＬ−６（約１０ng/ml）ＴＮＦα（約２００Ｕ/ml）、及びＰＧＥ２（約１０ng/ml）からなるサイトカインカクテルにより誘導されうる。
本発明の別の目的は、本明細書において上に記載するように免疫原性産物及び少なくとも１つの医薬的に許容可能な賦形剤を含む、それから本質的になる、又はそれからなる医薬組成物である。
本発明の別の目的は、以下の表現型ＣＤ３＋ＴＣＲγδ＋Ｆｏｘｐ３＋を有する不活化γδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞及び少なくとも１つの医薬的に許容可能な賦形剤を含む、それから本質的になる、又はそれからなる医薬組成物である。
本発明の別の目的は、本明細書において上に記載する方法によりエクスビボで生成及び増殖させた、以下の表現型ＣＤ３＋ＴＣＲγδ＋Ｆｏｘｐ３＋を有する不活化γδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞及び少なくとも１つの医薬的に許容可能な賦形剤を含む、それから本質的になる、又はそれからなる医薬組成物である。
本発明の別の目的は、本明細書において上に記載するように以下の表現型ＣＤ３＋ＴＣＲγδ＋Ｆｏｘｐ３＋を有するγδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞のブレブ及び少なくとも１つの医薬的に許容可能な賦形剤を含む、それから本質的になる、又はそれからなる医薬組成物である。
本発明の別の目的は、本明細書において上に記載するように以下の表現型ＣＤ３＋ＴＣＲγδ＋Ｆｏｘｐ３＋を有するγδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞のブレブを負荷した免疫原性ＤＣ及び少なくとも１つの医薬的に許容可能な賦形剤を含む、それから本質的になる、又はそれからなる医薬組成物である。
本明細書において使用するように、用語「賦形剤」は、任意の及び全ての溶媒、分散媒質、充填剤、固体担体、水溶液、コーティング、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤などを指す。ヒトへの投与のためには、調製物は、規制当局（例えばFDA Office又はEMAなど）により要求されるように、無菌性、発熱性、一般的な安全性、及び純度基準を満たすべきである。
「医薬的に許容可能な」により、医薬組成物の成分が互いに親和性があり、それが投与される被験体に有害ではないことを意味する。医薬的に許容可能な賦形剤の例は、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、又はそれらの組み合わせを含むが、これらに限定しない。
本発明の別の目的は、本明細書において上に記載する免疫原性産物を含む、それから本質的になる、又はそれからなるワクチン組成物である。
本発明の別の目的は、以下の表現型ＣＤ３＋ＴＣＲγδ＋Ｆｏｘｐ３＋を有する不活化γδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞を含む、それから本質的になる、又はそれからなるワクチン組成物である。
本発明の別の目的は、本明細書において上に記載する方法によりエクスビボで生成及び増殖された、以下の表現型ＣＤ３＋ＴＣＲγδ＋Ｆｏｘｐ３＋を有する不活化γδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞を含む、それから本質的になる、又はそれからなるワクチン組成物である。
本発明の別の目的は、本明細書において上に記載するように以下の表現型ＣＤ３＋ＴＣＲγδ＋Ｆｏｘｐ３＋を有するγδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞のブレブを含む、それから本質的になる、又はそれからなるワクチン組成物である。
本発明の別の目的は、本明細書において上に記載するように以下の表現型ＣＤ３＋ＴＣＲγδ＋Ｆｏｘｐ３＋を有するγδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞のブレブを負荷した免疫原性ＤＣを含む、それから本質的になる、又はそれからなるワクチン組成物である。
本明細書において使用するように、「不活化」Ｔ細胞は、生存可能であるがエフェクター機能が低下しているか又は全くない、即ち、病原性の潜在力を喪失したＴ細胞を指す。不活化Ｔ細胞の細胞表面マーカーの例は、７−アミノアクチノマイシンＤ（７−ＡＡＤ）、カルレティキュリン及び熱ショックタンパク質９０（ＨＳＰ−９０）を含むが、これらに限定しない。従って、不活化Ｔ細胞は７−ＡＡＤ及び／又はカルレティキュリン及び／又はＨＳＰ−９０を発現する。本発明の不活化γδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞はそれらの抑制活性を喪失しているが、依然として免疫原性である。Ｔ細胞エフェクター機能アッセイの例は、Ｔ細胞増殖アッセイであるが、これに限定しない。Ｔ細胞増殖は、固定Ｔ細胞対非固定Ｔ細胞で評価してもよい。簡単には、Ｔ細胞増殖アッセイは、フローサイトメトリーにより、固定Ｔ細胞対非固定Ｔ細胞中の生存増殖細胞のパーセンテージを決定することを目的とする。Ｔ細胞をＣＦＳＥ、抗ＣＤ３抗体、及び７−ＡＡＤで染色した後、生増殖細胞を、ゲートＣＤ３＋７−ＡＡＤ−細胞中のＣＦＳＥ低画分として定義する。
一実施形態において、γδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞は、当技術分野において周知の任意の方法により不活化する。細胞を不活化するための方法の例は、好ましくは約２５００〜３０００ラドでの照射及び／又は化学的不活化、例えばシスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、マイトマイシンＣ、又はアントラサイクリンへの曝露などを含むが、これらに限定しない。
一実施形態において、本発明のワクチン組成物は、少なくとも１つのアジュバントをさらに含む。ワクチン組成物中に使用することができるアジュバントの例は、ＩＳＡ５１；乳剤、例えばＣＦＡ、ＭＦ５９、モンタニド、ＡＳ０３、及びＡＦ０３など；無機塩、例えばミョウバン、リン酸カルシウム、鉄塩、ジルコニウム塩、及びＡＳ０４など；ＴＬＲリガンド、例えばＴＬＲ２リガンド（例えば外表面タンパク質Ａ又はＯｓｐＡなど）、ＴＬＲ３リガンド（例えばポリＩ：Ｃなど）、ＴＬＲ４リガンド（例えばＭＰＬ及びＧＬＡなど）、ＴＬＲ５リガンド、ＴＬＲ７／８リガンド（例えばイミキモドなど）、ＴＬＲ９リガンド（例えばＣｐＧ ＯＤＮなど）；多糖類、例えばキチン、キトサン、α−グルカン、β−グルカン、フルクタン、マンナン、デキストラン、レンチナン、イヌリンベースのアジュバント（例えばガンマイヌリンなど）など；ＴＬＲ９及びＳＴＩＮＧリガンド、例えばＫ３ ＣｐＧ及びｃＧＡＭＰなどを含むが、これらに限定しない。本明細書において使用するように、「アジュバント」は、抗原への免疫応答を増強する、及び／又はそれを所望の免疫応答に向かって調節する薬剤を指す。
一実施形態において、不活化γδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞は、本明細書において上に記載するように少なくとも１つの非ペプチドリン酸化抗原に特異的である。
別の実施形態において、不活化γδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞は、癌細胞のアポトーシス小体上に存在した少なくとも１つの非ペプチドリン酸化抗原に特異的である。
別の実施形態において、不活化γδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞は、癌細胞のブレブ上に存在した少なくとも１つの非ペプチドリン酸化抗原に特異的である。
一実施形態において、本発明の免疫原性産物、医薬組成物、又はワクチン組成物中に存在する不活化γδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞は、ヒトγδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞である。
一実施形態において、本発明の免疫原性産物、医薬組成物、又はワクチン組成物中に存在する不活化γδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞は、自己γδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞である。
一実施形態において、本発明の免疫原性産物、医薬組成物、又はワクチン組成物中に存在する不活化γδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞は、同種γδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞である。
別の実施形態において、本発明の免疫原性産物、医薬組成物、又はワクチン組成物は、患者のために個別化してもよい。本明細書において使用するように、「個別化された」免疫原性産物又はワクチン組成物は、少なくとも１つの患者特異的なエピトープを用いてエクスビボで生成及び増殖させたγδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞の使用を指す。この実施形態において、免疫原性産物として又はワクチン組成物中で使用されるγδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞は、患者から得られた癌細胞のアポトーシス小体の存在において又は癌細胞のブレブの存在においてエクスビボで生成及び増殖され、それにより、少なくとも１つの患者特異的なエピトープを提供する。
一実施形態において、本発明の免疫原性産物、医薬組成物、又はワクチン組成物は、活性成分として不活化γδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞を含む、それから本質的になる、又はそれからなる。
一実施形態において、本発明の免疫原性産物、医薬組成物、又はワクチン組成物は、活性成分として少なくとも１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０個の不活化γδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞を含む、それから本質的になる、又はそれからなる。
一実施形態において、本発明の免疫原性産物、医薬組成物、又はワクチン組成物は、活性成分として約１０４、５×１０４、１０５、５×１０５、１０６、５×１０６、１０７、５×１０７、１０８、５×１０８、１０９、５×１０９、１０１０個の不活化γδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞を含む、それから本質的になる、又はそれらからなる。
一実施形態において、本発明のγδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞、不活化γδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞、免疫原性産物、医薬組成物、又はワクチン組成物は凍結されている。
一実施形態において、本発明の免疫原性産物、医薬組成物、又はワクチン組成物は、皮下注射、筋肉内注射、腹腔内注射、又は静脈内注射により、又は直接腫瘍中に投与してもよい。
一実施形態において、本発明の免疫原性産物、医薬組成物、又はワクチン組成物は、被験体に１年に少なくとも１回、２回、３回、４回、５回投与してもよい。投与計画の例は、０日目、０日の４週間後、０日の８週間後、０日の１２週間後、及び０日の２４週間後の免疫原性産物又はワクチン組成物の投与を含むが、これらに限定しない。
本発明の別の目的は、治療的に効果的な量の不活化γδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞、又は本発明の免疫原性産物、医薬組成物、もしくはワクチン組成物を被験体に投与することを含む、それを必要とする被験体において癌を処置するための方法である。
本発明の別の目的は、癌に罹患している被験体のＴＩＬ中に存在するγδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞に対して免疫応答を誘発するための方法であって、治療的に効果的な量の不活化γδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞又は 本明細書において上に記載する本発明の免疫原性産物、医薬組成物、もしくはワクチン組成物を被験体に投与することを含む。
本発明の免疫原性産物、医薬組成物、又はワクチン組成物を用いて処置することができる癌の例は、副腎皮質癌、肛門癌、膀胱癌、上衣腫、髄芽細胞腫、テント上原始神経外胚葉、松果体腫瘍、視床下部神経膠腫、乳癌、カルチノイド腫瘍、癌腫、子宮頸癌、結腸癌、子宮内膜癌、食道癌、肝外胆管癌、ユーイング家族性腫瘍（ｐｎｅｔ）、頭蓋外胚細胞腫瘍、眼癌、眼球内黒色腫、胆嚢癌、胃癌、生殖細胞腫瘍、性腺外腫瘍、妊娠性絨毛性腫瘍、頭頸部癌、下咽頭癌、膵島細胞癌、喉頭癌、白血病、急性リンパ芽球性白血病、口腔癌、肝臓癌、肺癌、小細胞リンパ腫、ＡＩＤＳ関連、リンパ腫、中枢神経系（原発性）リンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、ホジキン病、非ホジキン病、悪性中皮腫、黒色腫、メルケル細胞癌、転移性扁平上皮癌、多発性骨髄腫、形質細胞新生物、菌状息肉腫、骨髄異形成症候群、骨髄増殖性疾患、鼻咽頭癌、神経芽細胞腫、口腔咽頭癌、骨肉腫、卵巣上皮癌、卵巣胚細胞腫瘍、卵巣低悪性度腫瘍、膵臓癌、外分泌性、膵臓癌、副鼻腔癌及び鼻腔癌、副甲状腺癌、褐色細胞腫癌、下垂体癌、形質細胞新生物、横紋筋肉腫、直腸癌、腎細胞癌、唾液腺癌、セザリー症候群、カポジ肉腫、小腸癌、軟部組織肉腫、胸腺腫、悪性甲状腺癌、尿道癌、子宮癌 、肉腫、小児の異常癌、膣癌、外陰癌又はウィルムス腫瘍、化学療法の処置に関連する良性状態（例えばループス、関節リウマチ、及び皮膚疾患など）を含むが、これらに限定しない。
一実施形態において、本発明の免疫原性産物、医薬組成物、又はワクチン組成物を用いて処置することができる癌は、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、及び神経膠芽腫を含むが、これらに限定しない。
本発明の別の目的は、本発明の免疫原性産物を調製するための方法であって、以下を含む：
−処置される被験体からの生物学的サンプル、好ましくは血液サンプル、及び場合により処置される被験体からの腫瘍サンプルを提供すること、
−生物学的サンプルから単離されたＣＤ３＋ＴＣＲγδ＋Ｔ細胞、好ましくはＣＤ３＋ＴＣＲγδ＋ＣＤ４５ＲＡ＋Ｔ細胞からのγδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞を本明細書において上に記載するようにエクスビボで生成及び増殖させること、
−以前の工程において得られたγδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞を不活化すること、
−それにより本発明の免疫原性産物を得ること。
好ましい実施形態において、生成及び増殖工程は、寛容原性樹状細胞（ＤＣ）の存在において行い、被験体の腫瘍サンプルから得られたアポトーシス性腫瘍体又はブレブを用いてパルスする。
本発明の別の目的は、それを必要とする被験体において癌を処置するための方法であって、本発明の免疫原性産物、医薬組成物、又はワクチン組成物を被験体に投与することを含む。
本発明の別の目的は、それを必要とする被験体において癌を処置するための方法であって、以下を含む：
−本明細書において上に記載する免疫原性産物を調製すること、
−場合により、免疫原性産物を含む医薬組成物又はワクチン組成物を調製すること、
−場合により、被験体を血漿交換療法に供すること、
−本発明の免疫原性産物、医薬組成物、又はワクチン組成物を被験体に投与すること。
理論に拘束されることを望まないが、本発明者らは、本発明のγδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞は、免疫抑制機能を発揮するようにコミットしており、自己反応性病原性免疫エフェクター細胞（ＣＤ４＋細胞、ＣＤ８＋細胞、Ｂ細胞又は自然ＮＫ細胞を含む）を阻害することが可能でありうるが、それらは次に、自己細胞に対して細胞傷害特性を発揮できないことを示唆する。
本発明の１つの目的は、本明細書において上に記載するγδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞又はγδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞集団及び少なくとも１つの医薬的に許容可能な賦形剤を含む、それらから本質的になる、又はそれらからなる医薬組成物である。
本発明の別の目的は、以下の表現型ＣＤ３＋ＴＣＲγδ＋Ｆｏｘｐ３＋を有するγδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞及び少なくとも１つの医薬的に許容可能な賦形剤を含む、それらから本質的になる、又はそれらからなる医薬組成物である。
本発明の別の目的は、本明細書において上に記載する方法によりエクスビボで生成及び増殖させた以下の表現型ＣＤ３＋ＴＣＲγδ＋Ｆｏｘｐ３＋を有するγδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞及び少なくとも１つの医薬的に許容可能な賦形剤を含む、それらから本質的になる、又はそれらからなる医薬組成物である。
本発明の１つの目的は、養子療法における使用のための、本明細書において上に記載するγδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞もしくはγδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞集団又は医薬組成物である。
本発明の別の目的は、炎症性疾患又は自己免疫疾患を処置する際での使用のための、本明細書において上に記載するγδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞もしくはγδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞集団又は医薬組成物である。
炎症性疾患又は自己免疫疾患の例は、急性播種性脳脊髄炎、急性壊死性出血性白質脳炎、アディソン病、無ガンマグロブリン血症、円形脱毛症、アミロイドーシス、強直性脊椎炎、抗ＧＢＭ／抗ＴＢＭ腎炎、抗リン脂質症候群、自己免疫性血管性浮腫、自己免疫性再生不良性貧血、自己免疫性自律神経障害、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫性高脂血症、自己免疫性免疫不全、自己免疫性内耳疾患、自己免疫性心筋炎、自己免疫性卵巣炎、自己免疫性膵炎、自己免疫性網膜症、自己免疫性血小板減少性紫斑病、自己免疫性甲状腺疾患、自己免疫性蕁麻疹、軸索及び神経性神経障害、バロ病、ベーチェット病、水疱性類天疱瘡、心筋症、キャッスルマン病、セリアック病、シャーガス病、慢性疲労症候群、慢性炎症性脱髄性多発神経炎、慢性再発性多巣性骨髄炎、チャーグ・ストラウス症候群、瘢痕性類天疱瘡／良性粘膜類天疱瘡、クローン病、コーガン症候群、寒冷凝集素症、先天性心ブロック、コクサッキー心筋炎、ＣＲＥＳＴ病、本態性混合型クリオグロブリン血症、脱髄性ニューロパチー、疱疹性皮膚炎、皮膚筋炎、デヴィック病、円盤状狼瘡、ドスラー症候群、子宮内膜症、好酸球性食道炎、好酸球性筋膜炎、結節性紅斑、実験的アレルギー性脳脊髄炎、エヴァンス症候群、線維筋痛、線維性肺胞炎、巨大細胞性動脈炎、巨大細胞性心筋炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、多発性血管炎を伴う肉芽腫症（ウェゲナー症候群）、バセドウ病、ギラン・バレー症候群、橋本脳炎、橋本甲状腺炎、溶血性貧血、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、妊娠ヘルペス、低ガンマグロブリン血症、特発性肺線維症、特発性血小板減少性紫斑病、ＩｇＡ腎症、ＩｇＧ４関連硬化性疾患、免疫調節リポタンパク質、封入体筋炎、間質性膀胱炎、若年性関節炎、若年性糖尿病（１型糖尿病）、若年性筋炎、川崎症候群、ランバート・イートン症候群、白血球破砕性血管炎、扁平苔癬、硬化性苔癬、木質結膜炎、線形ＩｇＡ病、狼瘡、ライム慢性病、メニエール病、顕微鏡的多発血管炎、混合性結合組織病、モーレン潰瘍、ムッハ・ハーベルマン病、多発性硬化症、重症筋無力症、筋炎、ナルコレプシー、視神経脊髄炎、好中球減少症、眼瘢痕性類天疱瘡、視神経炎、回帰性リウマチ、連鎖球菌に関連する小児自己免疫性神経精神障害、傍腫瘍性小脳変性症、発作性夜間血色素尿症、パリーロンバーグ症候群、パーソネイジ・ターナー症候群、扁平部炎 （末梢ブドウ膜炎）、天疱瘡、末梢神経障害、静脈周囲脳脊髄炎、悪性貧血、ＰＯＥＭＳ 症候群、結節性多発動脈炎、Ｉ、ＩＩ、及びＩＩＩ型多腺性自己免疫症候群、リウマチ性多発筋痛症、多発性筋炎、心筋梗塞後症候群、心外膜剥離術症候群、プロゲステロン皮膚炎、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、乾癬、乾癬性関節炎、壊疽性膿皮症、赤芽球癆、レイノー現象、反応性関節炎、反射***感神経性ジストロフィー、ライター症候群、再発性多発性軟骨炎、下肢静止不能症候群、後腹膜線維症、リウマチ熱、関節リウマチ、サルコイドーシス、シュミット症候群、強膜炎、強皮症、シェーグレン症候群、***及び精巣自己免疫、スティッフパーソン症候群、亜急性細菌性心内膜炎、スザック症候群、交感性眼炎、全身性エリテマトーデス、高安動脈炎、側頭動脈炎／巨細胞性動脈炎、血小板減少性紫斑病、トロサ・ハント症候群、横断性脊髄炎、１型糖尿病、潰瘍性大腸炎、未分化結合組織病、ブドウ膜炎、血管炎、小水疱性皮膚病、及び白斑症を含むが、これらに限定しない。
炎症性疾患又は自己免疫疾患の例は、関節リウマチ、１型糖尿病、及び多発性硬化症を含むが、これらに限定しない。
本発明の別の目的は、移植拒絶、又は移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を防止する際での使用のための、本明細書において上に記載するγδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞もしくはγδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞集団又は医薬組成物である。
一実施形態において、γδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞は、本明細書において上に記載する少なくとも１つの非ペプチドリン酸化抗原に特異的である。
別の実施形態において、γδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞は、組織溶解物中に存在していた少なくとも１つの非ペプチドリン酸化抗原に特異的である。
一実施形態において、本発明の医薬組成物は、有効成分として少なくとも１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０個のγδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞を含む、それから本質的になる、又はそれからなる。
一実施形態において、本発明の医薬組成物は、有効成分として約１０４、５×１０４、１０５、５×１０５、１０６、５×１０６、１０７、５×１０７、１０８、５×１０８、１０９、５×１０９、１０１０個のγδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞を含む、それから本質的になる、又はそれからなる。
一実施形態において、本発明のγδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞、γδ調節性Ｔ細胞集団、又は医薬は凍結されている。
一実施形態において、本発明の医薬組成物中に存在するγδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞はヒトγδ調節性Ｔ細胞である。
一実施形態において、本発明の医薬組成物中に存在するγδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞は自己γδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞である。
一実施形態において、本発明の医薬組成物中に存在するγδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞は同種γδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞である。
一実施形態において、本発明の医薬組成物は、皮下注射、筋肉内注射、腹腔内注射、又は静脈内注射により被験体に投与してもよい。
一実施形態において、本発明の医薬組成物は、週に少なくとも１回、２回、３回、４回、５回、被験体に投与してもよい。
別の実施形態において、本発明の医薬組成物は、月に少なくとも１回、２回、３回、４回、５回、被験体に投与してもよい。
別の実施形態において、本発明の医薬組成物は、３ヶ月間に少なくとも１回、２回、３回、４回、５回、被験体に投与してもよい。
本発明の別の目的は、それを必要とする被験体において炎症性疾患又は自己免疫疾患を処置するための方法であって、本明細書において上に記載する、治療的に効果的な量のγδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞もしくはγδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞集団又はその医薬組成物を被験体に投与することを含む。
Ｔ細胞ワクチン接種は、クローン型特異的決定基について特異的なＴ細胞を活性化することにより免疫原性Ｔ細胞を特異的に抑制する調節ネットワークを誘導する（抗イディオタイプ応答）ことが当技術分野において示されている。また、活性化マーカー（エルゴトープに対応する）に向けられた抗エルゴタイプ応答もまた、標的とされる調節性Ｔ細胞集団の抑制を部分的に説明しうる。
本発明の別の目的は、本発明のγδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞のＴＣＲ（Ｔ細胞受容体）を認識する抗体である。
一実施形態において、本発明のγδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞のＴＣＲを認識する抗体は、ＴＣＲのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３（相補性決定領域１、２、及び３）の少なくとも１つを認識する。
別の実施形態において、本発明のγδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞のＴＣＲを認識する抗体は、ＴＣＲのＣＤＲ３を認識する。
本発明の別の目的は、前記抗体及び少なくとも１つの医薬的に許容可能な賦形剤を含む、それらから本質的になる、又はそれらからなる医薬組成物である。
本発明の別の目的は、それを必要とする被験体において癌を処置するための前記抗体の使用である。
一実施形態において、本発明のγδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞に対する抗体は、本明細書において上に記載する免疫原性組成物を用いた哺乳動物（ヒトを含む）の免疫化後に産生される抗体からなる。
別の実施形態において、抗体はまた、それらをコードする関連ＤＮＡ材料を、例えば前記哺乳動物から（前記ヒトからを含む）得られるＢ細胞から出発してクローニングすることにより得てもよい。
別の実施形態において、抗体はまた、本発明のγδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞に対する関連する組換え抗体を産生するために、前記哺乳動物から（前記ヒトからを含む）収集した抗体のアミノ酸配列をシークエンシングし、次に抗体をコードするＤＮＡ分子又はそのＣＤＲを含むその一部を合成することにより得てもよい。
本発明の免疫原性組成物を用いた免疫化により本発明のγδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞に対する抗体を調製することは、当技術分野からの一般的な技術的知識を使用し、当業者により簡単に実施されうる。
あるいは、本発明のγδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞に対する抗体は、それらを産生するヒトＢリンパ球の不死化後に得てもよい；それらのｃＤＮＡはまた、クローン化し、組換えＤＮＡ技術を通じてそれら又はそれらの誘導体を産生するためにさらに使用することができる。
本明細書における用語「抗体」は、有用な抗原結合特異性を有する分子を指すために使用する。当業者は、この用語が、抗体のフラグメント又は誘導体であるが、その上、同じ又は密接に類似した機能性を示しうるポリペプチドもカバーしうることを容易に理解するであろう。そのような抗体フラグメント又は誘導体は、本明細書において使用するように、用語「抗体」により包含されることを意図している。受動免疫療法の目的のための「抗体」又は「抗体分子」により、本明細書において全免疫グロブリン分子だけでなく、そのフラグメント、例えばＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、及びγδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞を結合し、不活化する能力を保持するそれらの他のフラグメントも意図する。同様に、用語「抗体」は、抗体の遺伝子操作された誘導体、例えば一本鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）及びドメイン抗体（ｄＡｂ）などを含む。
一部の実施形態において、本発明のγδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞に対する抗体はポリクローナル抗体からなる。
一部の実施形態において、本発明のγδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞に対する抗体はモノクローナル抗体からなる。
用語「モノクローナル抗体」は、本明細書において、任意の単離Ａｂ、例えば従来のモノクローナル抗体ハイブリドーマなどを包含するが、任意の細胞により産生された単離された単一特異性抗体、例えば哺乳動物細胞株において発現された同一のヒト免疫グロブリンのサンプルなども包含する。
抗体の可変重鎖（Ｖ Ｈ）及び可変軽鎖（Ｖ Ｌ）ドメインは抗原認識において含まれ、初期のプロテアーゼ消化実験により最初に認識された事実である。さらなる確認が、げっ歯類抗体の「ヒト化」により見出された。げっ歯類由来の可変ドメインを、結果として得られた抗体がげっ歯類親抗体の抗原特異性を保持するようにヒト由来の定常ドメインに融合させてもよい（Morrison et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 6851-6855）。抗原特異性は可変ドメインにより付与され、定常ドメインに非依存的であることは、抗体フラグメント（全てが１つ以上の可変ドメインを含む）の細菌発現を含む実験から公知である。これらの分子は、Ｆａｂ様分子（Better et al (1988) Science 240, 1041）；Ｆｖ分子（Skerra et al (1988) Science 240, 1038）；Ｖ．ｓｕｂ．Ｈ及びＶ．ｓｕｂ．Ｌパートナードメインが柔軟なオリゴペプチドを介して連結されている一本鎖Ｆｖ（ＳｃＦｖ）分子（Bird et al (1988) Science 242, 423; Huston et al (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 5879）及び単離Ｖドメインを含む単一ドメイン抗体（ｄａｂ）（Ward et al (1989) Nature 341, 544）を含む。それらの特異的結合部位を保持する抗体フラグメントの合成において含まれる技術の一般的な総説が、Winter & Milstein（1991, Nature 349, 293-299）に見出される。
用語「ＳｃＦｖ分子」は、Ｖ Ｈ及びＶ Ｌパートナードメインが柔軟なオリゴペプチドを介して連結された分子を包含する。操作された抗体（例えばＳｃＦｖ抗体など）は、J. Huston et al, (1988) "Protein engineering of antibody binding sites: recovery of specific activity in an anti-digoxin single chain Fv analogue produced in E. coli", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, pp. 5879-5883において、及びA. Pluckthun, (1991) "Antibody engineering; Advances from use of E. coli expression systems", Bio/technology 9 (6): 545-51（本明細書において参照により組み入れられる）において記載されている技術及び手法を使用して作製することができる。
本明細書において記載するように反応性である適切なモノクローナル抗体は、公知の技術、例えば、"Monoclonal Antibodies; A manual of techniques", H Zola (CRC Press, 1988)において、及び "Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Application", S G R Hurrell (CRC Press, 1982)において開示されている技術により調製してもよい。
さらなる実施形態は、抗原と接触したマウス抗体の領域である相補性決定領域（ＣＤＲ）がヒト抗体フレームワークに移されたヒト化抗体を包含する。そのような抗体はほぼ完全にヒト型であり、患者に投与した場合に有害な抗体反応を起こすことはほとんどない。いくつかのキメラ抗体又はヒト化抗体が治療用薬物として登録されており、現在では種々の適応症において広く使用されている（Borrebaeck & Carlsson, 2001, Curr. Opin. Pharmacol. 1: 404-408）。
抗体はヒト化抗体である場合が好ましい。適切に調製された非ヒト抗体は、公知の方法で、例えばマウス抗体のＣＤＲ領域をヒト抗体のフレームワーク中に挿入することにより「ヒト化」することができる。ヒト化抗体は、Verhoeyen et al (1988) Science, 239, 1534-1536において、及びKettleborough et al, (1991) Protein Engineering, 14 (7), 773-783において記載されている技術及び手法を使用して作製することができる。
別の実施形態において、抗体はまた、完全なヒト抗体を包含し、それは組換え技術を使用して産生しうる。典型的には、数十億の異なる抗体を含む大きなライブラリーを使用する。例えばマウス抗体のキメラ化又はヒト化を用いた過去の技術とは対照的に、この技術は、特異的抗体を生成するために動物の免疫化に頼らない。代わりに、組換えライブラリーは膨大な数の予め作製された抗体変異体を含み、それにおいて、ライブラリーは任意の抗原について特異的な少なくとも１つの抗体を有する可能性が高い。
投与の頻度は、経時的に患者の血清中での抗体価の低下を追跡することにより臨床的に決定してもよいが、任意の事象において、年に１〜５２回、最も好ましくは年に１〜１２回の頻度でありうる。抗体の量は、疾患の重症度、又は血清中での抗体の半減期に従って変動しうるが、好ましくは、１〜１０mg/kg患者の範囲内、好ましくは１〜５mg/kg患者の範囲内、最も好ましくは１〜２mg/kg患者である。
ヒト末梢血（ＰＢＭＣ）及び***腫瘍から単離されたＴＩＬにおけるそれらの可変的なＴＣＲ認識により定義される、Ｆｏｘｐ３＋とＦＯＸＰ３−ＣＤ３＋Ｔ細胞集団間での異なる頻度及び表現型の特徴。 ＣＤ４＋ＴＣＲγδ＋非制限Ｔ細胞を発現するエクスビボでのヒト誘導性腫瘍抗原特異的ＦＯＸＰ３におけるＦｏｘｐ３＋発現の分析。アポトーシス腫瘍抗原（Ａｇ）パルス免疫寛容原性ＤＣ（ｔＤＣ）を使用し、ＩＬ−２（１００IU/ml）及びＴＧＦβ（５ng/ml）、ＰＧＥ２（１μM）、及びＲａｐａ（１０nM）で構成されるｎＴｒｅｇ極性化培地の存在においてナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞から特異的ｐＴｒｅｇを生成及び増殖させた。無負荷のｔＤＣを対照として使用した。ＣＤ４＋Ｔ細胞培養におけるＦｏｘｐ３の（Ａ）頻度及び（Ｂ）発現レベル（ＭＦＩにより評価）。 ＢＣ生検から単離されたＦｏｘｐ３発現ＣＤ３＋ＣＤ４＋γδＴ細胞非制限Ｔ細胞と現在記載されているγδＴ細胞のサブタイプの間での表現型の違い。Ｆｏｘｐ３発現ＣＤ３＋ＣＤ４＋γδＴ細胞の表現型同定は、ＣＤ３（クローンＳＫ７）、ＣＤ４（クローンＳＫ３）、ＣＤ８（クローンＳＫ１）、汎γδＴ（クローンＩＭＭＵ５１０）、及びＦｏｘｐ３＋（クローン２５９Ｄ）に対する抗体を使用したフローサイトメトリーにより実施した。 ＢＣ生検から単離されたＦｏｘｐ３＋を発現するＣＤ３＋ＣＤ４＋γδＴ細胞の間でのＴＣＲＶδの使用。ＴＣＲＶγδ鎖の同定を、ＣＤ３（クローンＳＫ７）、ＣＤ４（クローンＳＫ３）、ＣＤ８（クローンＳＫ１）、汎γδＴ（クローンＩＭＭＵ５１０）、ＴＣＲＶδ１（ＲＥＡ１７３）、ＴＣＲＶδ２（ＲＥＡ７７１）、及びＦｏｘｐ３＋（クローン２５９Ｄ）に対する抗体を使用したフローサイトメトリーにより実施した。 ＢＣ生検から単離されたＦｏｘｐ３発現ＣＤ３＋ＣＤ４＋γδＴ細胞非制限Ｔ細胞の抑制能力。ＣＦＳＥ標識Ｔｃｏｎｖ（ＴｃｏｎｖＣＦＳＥ）を、異なる比率の選別したＣＤ３＋ＣＤ４＋γδＴ細胞と共培養した。ＣＤ４＋γδＴ細胞によるＴｃｏｎｖＣＦＳＥ増殖の阻害パーセントを示した。健常ドナーからの循環新鮮Ｔｒｅｇを対照として使用した。 特異的病原性ＣＤ４＋Ｔ細胞、即ち、腫瘍抗原特異的ＦＯＸＰ３発現ＣＤ４＋ＴＣＲγδ＋非制限Ｔ細胞を溶解するよう機能的にコミットされた自己ＣＤ８＋Ｔ細胞株の生成。その誘導性病原性ＣＤ４＋Ｔ細胞クローンを溶解するＣＤ８＋Ｔ細胞クローンの能力を、以前に記載されたように古典的な７−ＡＡＤ／ＣＦＳＥ細胞媒介性細胞傷害性アッセイを用いて評価する。簡単には、刺激後４日目に、病原性ＣＤ４＋標的細胞又は自己リンパ芽球細胞系をＣＦＳＥで標識し、９６ウェルＵ底プレート中に１ウェル当たり３×１０４個で三通りに配置した。ＣＤ８＋エフェクターＴ細胞（５：１のＥ：Ｔ比率）を加え、インキュベーションを３７℃で６時間にわたり行った。実験の終了時に、死細胞を７−ＡＡＤで標識して溶解細胞を検出した。標的細胞に対する細胞溶解活性を、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ機器を使用し、二重陽性染色ＣＦＳＥ及び７−ＡＡＤを示す領域に基づいて分析した。ＣＤ８＋Ｔ細胞クローンの細胞溶解活性（%）を、陰性対照における自然溶解（%）を差し引いた後、ＣＦＳＥ及び７−ＡＡＤの両方について陽性の細胞／全ＣＦＳＥ陽性細胞として算出した。細胞溶解活性のパーセンテージを次に、以下の式を使用して算出した：細胞溶解活性（%）［死んだ標的細胞（%）−自然死（%）］×１００／［１００−自然死（%）］。 内腔Ａ及び内腔Ｂ***サブタイプから抽出されたＴＩＬ中に存在するリンパ球におけるＦｏｘｐ３＋発現の分析。内腔Ａ及び内腔Ｂを伴う患者からの腫瘍組織を、メスを用いて細かく刻み、コラゲナーゼＩＶ型中での一晩のインキュベーションにより酵素的に消化した。単離されたＴＩＬ中に存在するリンパ球におけるＦＯＸＰ３マーカーの発現をフローサイトメトリー分析により決定した。 ３つの異なる乳癌のサブグループから抽出されたＴＩＬ中に存在するリンパ球におけるＦｏｘｐ３＋発現の分析：管腔Ａを伴う患者（ｎ＝３）、管腔Ｂを伴う患者（ｎ＝３）及びトリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）を伴う患者（ｎ＝２）からの腫瘍組織を、メスを用いて細かく刻み、コラゲナーゼＩＶ型中での一晩のインキュベーションにより酵素的に消化した。単離されたＴＩＬ中に存在するリンパ球におけるＦＯＸＰ３マーカーの発現をフローサイトメトリー分析により決定した。ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＴＣＲγδ＋非制限Ｔ細胞におけるＦＯＸＰ３発現のパーセンテージの表示。 内腔Ａ及びＢ***サブタイプからのＴＩＬ中に存在するリンパ球のマルチパラメトリックフローサイトメトリー分析。ＴＩＬ中に存在するリンパ球を、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ２５、ＣＤ５６、ＣＤ１６１に対するＡｂを使用して細胞表面で染色した。固定及び透過処理後、Ｆｏｘｐ３及びＣＴＬＡ４を細胞内で染色した。 刺激されたナイーブＣＤ３＋ＴＣＲγδ＋Ｔ細胞からの、エクスビボで生成されたＡｇ特異的ＣＤ３＋ＴＣＲγδ＋Ｔ細胞の表現型及び機能的抑制能力。ナイーブＣＤ３＋ＴＣＲγδ＋Ｔ細胞を、ｎＴｒｅｇ極性化培地ならびにＩＬ−２（１００IU/ml）及びＩＬ−１５（１０ng/ml）の存在においてゾレドロン酸処理自己ｔＤＣを用いて刺激した。（Ａ）Ｆｏｘｐ３発現プロファイルを呈するオーバーレイヒストグラム及び（Ｂ）２１又は４２日間にわたり増殖したＡｇ特異的ＣＤ３＋ＴＣＲγδ＋Ｔ細胞の抑制能力。
実施例
本発明を以下の実施例によりさらに例証する。
材料及び方法
ヒト血液サンプル。健常な個人からの血液サンプルは、Etablissement Francais du Sang（ＥＦＳ、パリ）から由来した。血球を標準的な手順を使用して収集する。
ヒト腫瘍サンプル。腫瘍組織サンプルは、管腔Ａ及び管腔Ｂの乳癌を伴う患者に由来した（Institut Jean Godinot、ランス）。
細胞の精製及び培養
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、Ficoll-Hypaque（Pharmacia）での密度勾配遠心分離により単離する。ＰＢＭＣは、新鮮な細胞として使用するか、又は液体窒素中で凍結保存する。Ｔ細胞サブセット及びＴ細胞枯渇アクセサリー細胞（ΔＣＤ３細胞）を新鮮又は凍結ＰＢＭＣから単離する。Ｔ細胞枯渇アクセサリー細胞（ΔＣＤ３細胞）を、抗ＣＤ３コーティングDynabeads（Dynal Biotech）とのインキュベーションによるＰＢＭＣからのネガティブ選択により単離し、３０００ラドで照射する（ΔＣＤ３フィーダーとして言及する）。
ＣＤ４＋Ｔ細胞を、ＣＤ４＋Ｔ細胞単離キット（Miltenyi Biotec、純度９６〜９９%のＣＤ４＋Ｔ細胞集団を生じる）を用いてネガティブ選択する。その後に、選択されたＣＤ４＋Ｔ細胞を、FACSAria III Cell Sorter（Becton Dickinson）を使用してＣＤ４＋ＣＤ１２７−／ｌｏＣＤ２５ｈｉｇｈ（ｐＴｒｅｇｓ）及びＣＤ４＋ＣＤ１２７＋ＣＤ２５ｎｅｇ／ｄｉｍ［従来型ヘルパーＣＤ４ Ｔ細胞（Ｔｃｏｎｖ）］亜集団に分類する前に、抗ＣＤ４（１３Ｂ８．２）−ＦＩＴＣ（Beckman Coulter）、抗ＣＤ２５（４Ｅ３）−ＡＰＣ（Miltenyi Biotec）、及び抗ＣＤ１２７（Ｒ３４．３４）−ＰＥ（Beckman Coulter）を用いて標識する。
ＣＤ１４＋単球を、ＭＡＣＳシステムを使用したポジティブセレクションによりＰＢＭＣから単離する。
ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ１２７＋ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ２５−ＴＣＲαβ＋ＭＨＣＩＩ制限（ナイーブ従来型ＣＤ４＋Ｔ細胞）を、磁気濃縮（ＭＡＣＳシステム：ＣＤ４マイクロビーズ）及びＦＡＣ選別後にＰＢＭＣから単離する。選別工程前に、濃縮されたＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞を、抗ＣＤ４（１３Ｂ８．２）−ＦＩＴＣ（Beckman Coulter）、抗ＣＤ２５（４Ｅ３）−ＡＰＣ（Miltenyi Biotec）、及び抗ＣＤ１２７（Ｒ３４．３４）−ＰＥ（Beckman Coulter）、抗ＴＣＲαβ−ＢＶ４２１（ＩＰ２６）（Biolegend）を用いて染色する。
ＣＤ３＋ＣＤ４５ＲＡ＋ｉｎｖＴＣＲ Ｖα２４＋ＣＤ１制限Ｔ細胞を、磁気濃縮（ＭＡＣＳシステム：抗ｉＮＫＴマイクロビーズ及びＦＡＣＳ選別）後にＰＢＭＣから単離する。選別工程前に、濃縮されたＣＤ３＋ｉｎｖＴＣＲ Ｖα２４＋Ｔ細胞を、抗ＣＤ３（ＵＣＨＴ−１）Ｖ４５０抗不バリアントＴＣＲ Ｖα２４−ＪαＱ（６Ｂ１１）−ＰＥ（ｉｎｖ ＴＣＲ）Ｖα２４−ＪαＱ（Becton Dickinson）、及び抗ＣＤ４５ＲＡ（Ｔ６Ｄ１１）−ＦＩＴＣ（Miltenyi Biotec）を用いて染色する 。
ＣＤ３＋ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ２７＋ＴＣＲγδ＋非制限Ｔ細胞を、磁気濃縮（ＭＡＣＳシステム：ＴＣＲγδ＋Ｔ細胞単離キット）及びＦＡＣＳ選別後にＰＢＭＣから単離する。選別工程前に、濃縮されたＣＤ３＋ＴＣＲγδ＋Ｔ細胞を、抗ＣＤ３（ＵＣＨＴ−１）Ｖ４５０、抗ＴＣＲ汎γδ＋ＰＥ（ＩＭＭＵ５１０）（Beckman Coulter）、抗ＣＤ２７−ＡＰＣ ｅｆｌｕｏｒ ７８０（Ｏ３２３）（ebioscience）、及び抗ＣＤ４５ＲＡ（Ｔ６Ｄ１１）−ＦＩＴＣ（Miltenyi Biotec）を用いて染色する。
Ｔ細胞サブセットを、５%ＳＶＦ、１００IU/mlペニシリン／ストレプトマイシン、１mMピルビン酸ナトリウム、１mM非必須アミノ酸、グルタマックス、及び１０mM ＨＥＰＥＳ（ＩＭＤＭ−５培地）を添加したＩＭＤＭ中で２%低酸素において培養する。
乳癌細胞株及び培養。ヒト乳癌細胞株ＭＣＦ−７をAmerican Type Culture Collection（ＵＳＡ）から入手した。細胞を、１０%ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ；Invitrogen、ＵＳＡ）中で維持する。ＭＣＦ−７細胞を、５μg/mlのドキソルビシンで２４時間又はγ線照射（２０Ｇｙ）により処理する。アポトーシスの程度はフローサイトメトリー分析（ＦＡＣＳ）によりモニターする。細胞を、ＤＣを供給する前に徹底的に洗浄する。
ＴＩＬ単離。腫瘍組織をメスで細かく刻み、２mMグルタミン（Gibco）、５０mg/mLゲンタマイシン、及び０．２５%ヒト血清アルブミンを添加したＤＭＥＭ高グルコース培地中のコラゲナーゼタイプＩＶ（２mg/mL、Roche Diagnostic GmbH）中で、３７℃のロータリーシェーカー上での一晩のインキュベーションにより酵素消化した。
ポリクローナルの機能的にコミットされたＦＯＸＰ３発現調節性Ｔ細胞のエクスビボでの生成。
ポリクローナルの機能的にコミットされたＦＯＸＰ３発現ＣＤ３＋ＴＣＲαβ＋ＭＨＣＩＩ制限Ｔ細胞のエクスビボでの生成：０日目に、Ｔ細胞を４８ウェルプレート中に２．５×１０５個／ウェルで播種し、ΔＣＤ３フィーダー（１Ｍ）の存在においてプレート結合抗ＣＤ３ ｍＡｂ（４μg/ml）で刺激する。細胞を、ＰＧＥ２ １μM、ＴＧＦβ ５ng/ml、Ｒａｐａ １０nMを伴うＩＭＤＭ−５培地（５%ＳＶＦ、１００IU/mlペニシリン／ストレプトマイシン、１mMピルビン酸ナトリウム、１mM非必須アミノ酸、グルタマックス、及び１０mM ＨＥＰＥＳを添加したＩＭＤＭ）中で培養する。２日目に、ＩＬ−２（１００IU/ml）を培養物に加える。３日毎に、上清容量の半分を捨て、ＩＬ−２（１００UI/ml）を伴う新鮮なＩＭＤＭ−５と交換する。１１日目に、これらのＣＤ４＋Ｔ細胞株を、プレート結合抗ＣＤ３ Ａｂ（４μg/ml）を用いた再刺激によりさらに増殖させた。この再刺激は、ΔＣＤ３フィーダー、ＰＧＥ２ １μM、ＴＧＦβ ５ng/ml、Ｒａｐａ １０nM、及びＩＬ−２（１００UI/ml）の存在において実施した。次に、３日毎に、上清容量の半分を捨て、ＩＬ−２を伴う新鮮なＩＭＤＭ−５（１００UI/ml）と交換する。２０日目に、増殖したＣＤ４＋Ｔ細胞の表現型をフローサイトメトリーにより評価した。ＣＤ４５ＲＯ＋になった、刺激されたナイーブ従来型Ｔ細胞の７５%がＦｏｘｐ３＋を発現する。
ポリクローナルの機能的にコミットされたＦＯＸＰ３発現インバリアントＴ細胞のエクスビボでの生成：０日目に、Ｔ細胞を９６ウェルプレート中に１×１０３個／ウェルで播種し、ΔＣＤ３フィーダー（２．５×１０５個）の存在においてプレート結合抗ｉｎｖ ＴＣＲ Ｖα２４−ＪαＱ（６Ｂ１１）ｍＡｂ（２μg/ml）で刺激する。細胞を、ＰＧＥ２ １μM、ＴＧＦβ ５ng/ml、Ｒａｐａ １０nM、ＩＬ−２（１００UI/ml）、及びＩＬ−１５（１０ng/ml）を伴うＩＭＤＭ−５培地中で培養する。３日毎に、ＩＬ−２（１００IU/ml）及びＩＬ−１５（１０ng/ml）を培養物に加える。１２日目に、Ｔ細胞を、ΔＣＤ３フィーダー、ＰＧＥ２ １μM、ＴＧＦβ ５ng/ml、Ｒａｐａ １０nM、ＩＬ−２（１００UI/ml）、及びＩＬ−１５（１０ng/ml）の存在において、プレート結合抗ｉｎｖ ＴＣＲ Ｖα２４−ＪαＱ（６Ｂ１１）ｍＡｂ（２μg/ml）を用いた再刺激によりさらに増殖させた。次に、３日毎に、上清容量の半分を捨て、ＩＬ−２（１００UI/ml）及びＩＬ−１５（１０ng/ml）を伴う新鮮なＩＭＤＭ−５と交換する。２１日目に、細胞をフローサイトメトリーにより分析した。ＣＤ４５ＲＯ＋になった、刺激されたＣＤ３＋ ｉｎｖＴＣＲ Ｖα２４＋ＲＡ＋Ｔ細胞の７０%がＦｏｘｐ３＋を発現する。
ポリクローナルの機能的にコミットされたＦＯＸＰ３発現ＴＣＲγδ＋Ｔ 細胞のエクスビボでの生成：０日目に、Ｔ細胞を９６ウェルプレート中に１×１０３個／ウェルで播種し、ΔＣＤ３フィーダー（２．５×１０５個）の存在においてプレート結合抗ＴＣＲγδ ｍＡｂ（２μg/ml）で刺激する。細胞を、ＰＧＥ２ １μM、ＴＧＦβ ５ng/ml、Ｒａｐａ １０nM、ＩＬ−２（１００UI/ml）、及びＩＬ−１５（１０ng/ml）を伴うＩＭＤＭ−５培地（５%ＳＶＦ、１００IU/mlペニシリン／ストレプトマイシン、１mMピルビン酸ナトリウム、１mM非必須アミノ酸、グルタマックス、及び１０mM ＨＥＰＥＳを添加したＩＭＤＭ）中で培養する。３日毎に、上清容量の半分を捨て、ＩＬ−２（１００UI/ml）及びＩＬ−１５（１０ng/ml）を伴う新鮮なＩＭＤＭ−５と交換する。１１日目に、Ｔ細胞を、プレート結合抗汎ＴＣＲγδ Ａｂ（２μg/ml）を用いた再刺激によりさらに増殖させた。この再刺激は、ΔＣＤ３フィーダー、ＰＧＥ２ １μM、ＴＧＦβ ５ng/ml、Ｒａｐａ １０nM、ならびにＩＬ−２（１００UI/ml）及びＩＬ−１５（１０ng/ml）の存在において実施した。次に、３日毎に、上清容量の半分を捨て、ＩＬ−２（１００UI/ml）及びＩＬ−１５（１０ng/ml）を伴う新鮮なＩＭＤＭ−５と交換する。２１日目に、細胞をフローサイトメトリーにより分析した。ＣＤ４５ＲＯ＋になった、刺激されたＣＤ３＋ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ２７＋ＴＣＲγδ＋Ｔ細胞の６５%がＦｏｘｐ３＋を発現する。
抗原特異的に機能的にコミットされたＦＯＸＰ３発現Ｔ細胞のエクスビボでの生成。
抗原（オボアルブミン）特異的に機能的にコミットされたＦｏｘｐ３発現ＣＤ３＋ＴＣＲαβ＋ＭＨＣＩＩ制限Ｔ細胞のエクスビボでの生成：
ａ）ＣＤ１４＋単球からのオボアルブミン負荷寛容原性ＤＣ（寛容原性単球由来ＤＣ（Ｔｏｌ−Ｍｏ−ＤＣ）と呼ぶ）のインビトロでの生成：単球を、未成熟ＤＣの生成のために１００ng/mlの組換えヒト顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）及び１０ng/mlのヒト組換えＩＬ−４を添加した１ウェル当たり０．５mlのＡＩＭＶを含む４８ウェル平底プレート中で培養する。３日目に、サイトカインを含む５００μlの培地を加えた。６日目に、Ｔｏｌ−Ｍｏ−ＤＣを、１）ウェルから取り出し、ＩＭＤＭ−５（５%ＳＶＦ、１００IU/mlペニシリン／ストレプトマイシン、１mMピルビン酸ナトリウム、１mM非必須アミノ酸、ｇｌｕｔａｍａｘ、及び１０mM ＨＥＰＥＳを添加したＩＭＤＭ）で２回洗浄し、２）ＩＭＤＭ−５中の３×１０５個/mlの濃度で４８ウェルプレートのウェルに加え、３）特異的Ａｇ（ＯＶＡ）を用いてＩＭＤＭ−５中でパルスした。
ｂ）特定の機能的にコミットされたＦＯＸＰ３発現ＣＤ３＋ＴＣＲαβ＋ＭＨＣＩＩ制限Ｔ細胞のエクスビボでの生成及び増殖：０日目に、オボアルブミンパルスｔＤＣを、１）ＩＭＤＭ−５で２回洗浄し、２）ＩＭＤＭ−５中の３×１０５個/mlの濃度で、２×１０５個の照射自己フィーダー、ＰＧＥ２ １μM、及びＲａｐａ １０nMの存在において４８ウェルプレートのウェルに加える。精製されたナイーブ従来型ＣＤ４＋Ｔ細胞（ＦＡＣＳにより以前に凍結されたＰＢＭＣから単離）をパルスｔＤＣに加える。１日目に、ＩＬ−２（１００IU/ml）及びＴＧＦβ（５ng/ml）を共培養物に加える。３日毎に、上清容量の半分を捨て、ＩＬ−２を伴う新鮮なＩＭＤＭ−５（１００UI/ml（Ｔ細胞クローニング培地））と交換する。１２日目に、これらのＴ細胞を、ΔＣＤ３−フィーダー、ＰＧＥ２ １μM、ＴＧＦβ ５ng/ml、Ｒａｐａ １０nM、ＩＬ−２（１００UI/ml）の存在においてｏｖａパルスｔＤＣを用いた再刺激によりさらに増殖させる。一度、Ｔ細胞が増殖し始めたら、それらをＴ細胞クローニング培地及び照射フィーダーを用いて２〜３日毎に分割することができる。２１日目に、細胞をフローサイトメトリーにより分析する。ＣＤ４５ＲＯ＋になった刺激されたナイーブ従来型ＣＤ４＋Ｔ細胞の８５%がＦｏｘｐ３＋を発現する。Ｏｖａ特異的記憶ＣＤ３＋ＴＣＲαβ＋ＭＨＣＩＩ制限Ｔ細胞が、刺激のいかなる培養条件においても、ｎＴｒｅｇ極性化培地中での２１日間の増殖後に、排他的に調節活性を発揮するようにコミットされていることを確認するために、Ｏｖａ特異的ｐＴｒｅｇを、ｎＴｒｅｇ極性化培地（ＩＬ−２、ＴＧＦβ、ＰＧＥ２、及びラパマイシンの組み合わせを含む）又はＴＨ−１７極性化培地（ＩＬ−２、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−２１、ＩＬ−２３サイトカインを含むＩＭＤＭ培地）のいずれかにおいてさらに３週間にわたり培養する。２１日増殖させたＦｏｘｐ３発現ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＴＣＲαβ＋ＭＨＣＩＩ制限Ｔ細胞を、４８ウェルプレート中で、ΔＣＤ３フィーダー（１Ｍ）の存在においてプレート結合抗ＣＤ３ｍＡｂ（４μg/ml）で３日毎に刺激し、上清容量の半分を捨て、新鮮なＴ細胞クローニング培地又はＴＨ−１７極性化培地と２１日間にわたり交換する。
機能的にコミットされたＦＯＸＰ３発現ＣＤ３＋ＴＣＲγδ＋非制限Ｔ細胞のエクスビボでの生成：
ＣＤ１４＋単球からの腫瘍負荷寛容原性ＤＣ（寛容原性単球由来ＤＣ（ｔＤＣ）と呼ぶ）のインビトロでの生成：単球を、１００ng/ml組換えヒト顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）及び１０ng/mlヒト組換えＩＬ−４を添加した１ウェル当たり０．５mlのＡＩＭＶを含む４８ウェル平底プレート中で培養する。３日目に、サイトカインを含む５００μlの培地を加える。５日目に、ｔＤＣの一部を、ＧＭ−ＣＳＦ（１００ng/mL）、ＩＬ−４（１０ng/mL）を伴うＡＩＭＶ中で、ＤＣ／腫瘍細胞比１：２で２４時間にわたりアポトーシスＭＣＦ−７細胞と共培養する。ｔＤＣの別の一部を９０%ＦＢＳ−１０%ＤＭＳＯ中の２×１０６個／バイアルで凍結する。
腫瘍リン酸化抗原特異的に機能的にコミットされたＦｏｘｐ３発現ＣＤ３＋ＴＣＲγδ＋非制限Ｔ細胞のエクスビボでの生成及び増殖。
０日目に、腫瘍抗原パルスｔＤＣを、１）ＩＭＤＭ−５で２回洗浄し、２）２×１０５個の照射自己フィーダー、ＰＧＥ２ １μM、及びＲａｐａ １０nMの存在においてＩＭＤＭ−５中の３×１０５個/mlの濃度で４８ウェルプレートのウェルに加える。精製ＣＤ３＋ＣＤ４５ＲＡ＋ＴＣＲγδ＋非制限Ｔ細胞（ＦＡＣＳにより以前に凍結したＰＢＭＣから単離）をパルスｔＤＣに加える。１日目に、ＩＬ−２（１００IU/ml）及びＴＧＦβ（５ng/ml）を共培養物に加える。３日毎に、上清容量の半分を捨て、ＩＬ−２を伴う新鮮なＩＭＤＭ−５（１００UI/ml）（Ｔ細胞クローニング培地）と交換する。１２日目に、これらのＴ細胞を、ΔＣＤ３フィーダー、ＰＧＥ２ １μM、ＴＧＦβ ５ng/ml、Ｒａｐａ １０nM、及びＩＬ−２（１００UI/ml）の存在において腫瘍ＡｇパルスｔＤＣを用いた再刺激によりさらに増殖させる。一度、Ｔ細胞が増殖し始めたら、それらをＴ細胞クローニング培地及び照射フィーダーで２〜３日毎に分割することができる。２１日目に、細胞をフローサイトメトリーにより分析する。ＣＤ４５ＲＯ＋になった刺激されたナイーブＣＤ３＋ＣＤ４５ＲＡ＋ＴＣＲγδ＋Ｔ細胞の７５%がＦｏｘｐ３＋を発現する。
腫瘍抗原特異的に機能的にコミットされたＦＯＸＰ３発現ＣＤ３＋ｉｎｖＴＣＲ Ｖα２４＋ＣＤ１ｄ制限Ｔ細胞のエクスビボでの生成。
ａ）ＣＤ１４＋単球からの腫瘍負荷寛容原性ＤＣ（寛容原性単球由来ＤＣ（ｔＤＣ）と呼ぶ）のインビトロでの生成：単球を、ＣＤ１ｄを発現する未成熟ＤＣの生成のために１００ng/ml組換えヒト顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）ならびに１０ng/mlヒト組換えＩＬ−４及びＡＭ５８０（１００nM）を添加した１ウェル当たり０．５mlのＡＩＭＶを含む４８ウェル平底プレート中で培養する。３日目に、サイトカインを含む５００μlの培地を加える。５日目に、ｔＤＣの一部を、ＧＭ−ＣＳＦ（１００ ng/mL）、ＩＬ−４（１０ng/mL）を伴うＡＩＭＶ中で、ＤＣ／腫瘍細胞比率１：２で２４時間にわたりアポトーシスＭＣＦ−７細胞と共培養する。ｔＤＣの他の一部を、２×１０６個／バイアルで９０%ＦＢＳ−１０%ＤＭＳＯ中に凍結する。
ｂ）腫瘍抗原特異的に機能的にコミットされたＦｏｘｐ３発現ＣＤ３＋ｉｎｖＴＣＲ Ｖα２４＋ＣＤ１ｄ制限Ｔ細胞のエクスビボでの生成及び増殖：０日目に、腫瘍抗原パルスｔＤＣを、１）ＩＭＤＭ−５で２回洗浄し、２）２×１０５個の照射自己フィーダー、ＰＧＥ２ １μM、及びＲａｐａ １０nMの存在においてＩＭＤＭ−５中の３×１０５個/mlの濃度で４８ウェルプレートのウェルに加える。精製ＣＤ３＋ＣＤ４５ＲＡ＋ｉｎｖＴＣＲ Ｖα２４＋ＣＤ１制限Ｔ細胞（ＦＡＣＳにより以前に凍結したＰＢＭＣから単離）をパルスｔＤＣに加える。１日目に、ＩＬ−２（１００IU/ml）、ＩＬ−１５（１０ng/ml）、及びＴＧＦβ（５ng/ml）を共培養物に加える。３日毎に、上清容量の半分を捨て、ＩＬ−２（１００UI/ml）及びＩＬ−１５（１０ng/ml）を伴う新鮮なＩＭＤＭ−５（Ｔ細胞クローニング培地）と交換する。１２日目に、これらのＴ細胞を、ΔＣＤ３フィーダー、ＰＧＥ２ １μM、ＴＧＦβ ５ng/ml、Ｒａｐａ １０nM、ＩＬ−２（１００UI/ml）、及びＩＬ−１５（１０ng/ml）の存在における腫瘍ＡｇパルスｔＤＣを用いた再刺激によりさらに増殖させる。Ｔ細胞が増殖し始めたら、それらをＴ細胞クローニング培地及び照射フィーダーを用いて２〜３日毎に分割することができる。２１日目に、細胞をフローサイトメトリーにより分析する。ＣＤ４５ＲＯ＋になった刺激ＣＤ３＋ＣＤ４５ＲＡ＋ｉｎｖＴＣＲ Ｖα２４＋細胞の７５%がＦｏｘｐ３＋を発現する。
リン酸化抗原特異的な機能的にコミットされたＦＯＸＰ３発現ＣＤ３＋ＴＣＲγδ＋非制限Ｔ細胞のエクスビボでの生成。
ａ）ＣＤ１４＋単球からの寛容原性ＤＣのインビトロでの生成（寛容原性単球由来ＤＣ（Ｔｏｌ−Ｍｏ−ＤＣ）と呼ぶ）：単球を、未成熟ＤＣの生成のための１００ng/ml組換えヒト顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）及び１０ng/mlヒト組換えＩＬ−４を添加した１ウェル当たり０．５mlのＡＩＭＶを含む４８ウェル平底プレート中で培養する。３日目に、サイトカインを含む５００μlの培地を加えた。６日目に、生成したＴｏｌ−Ｍｏ−ＤＣをウェルから取り出し、ＩＭＤＭ−５（５%ＳＶＦ、１００IU/mlペニシリン／ストレプトマイシン、１mMピルビン酸ナトリウム、１mM非必須アミノ酸、グルタマックス、及び１０mM ＨＥＰＥＳを添加したＩＭＤＭ）で２回洗浄し、凍結するか、又はリン酸化抗原特異的な機能的にコミットされたＦＯＸＰ３発現ＣＤ３＋ＴＣＲγδ＋非制限Ｔ細胞の生成及び増殖のために使用する。
ｂ）リン酸化抗原特異的な機能的にコミットされたＦＯＸＰ３発現ＣＤ３＋ＴＣＲγδ＋非制限Ｔ細胞のエクスビボでの生成及び増殖：０日目に、ｔＤＭを、２×１０５個照射自己フィーダー、ＰＧＥ２ １μM、ならびにＲａｐａ １０nM及びゾレドロン酸（１００nM）の存在において、ＩＭＤＭ中の３×１０５個/mlの濃度で４８ウェルプレートのウェルに加える。精製されたＣＤ３＋ＣＤ４５ＲＡ＋ＴＣＲγδ＋非制限Ｔ細胞（ＦＡＣＳにより以前に凍結したＰＢＭＣから単離）をパルスｔＤＣに加える。１日目に、ＩＬ−２（１００IU/ml）、ＩＬ−１５（１０ng/ml）、及びＴＧＦβ（５ng/ml）を共培養物に加える。３日毎に、上清容量の半分を捨て、ＩＬ−２（１００UI/ml）及びＩＬ−１５（１０ng/ml）を伴う新鮮なＩＭＤＭ−５（Ｔ細胞クローニング培地）と交換する。１２日目に、これらのＴ細胞を、ΔＣＤ３フィーダー、ＰＧＥ２ １μM、ＴＧＦβ ５ng/ml、Ｒａｐａ１０nM、ＩＬ−２（１００UI/ml）、ＩＬ−１５（１０ng/ml）、及びゾレドロン酸（１００nM）の存在においてｔＤＣでの再刺激によりさらに増殖させる。一度、Ｔ細胞が増殖し始めたら、それらをＴ細胞クローニング培地及び照射フィーダーを用いて２〜３日毎に分割することができる。２１日目に、細胞をフローサイトメトリーにより分析する。ＣＤ４５ＲＯ＋になった刺激されたＣＤ３＋ＣＤ４５ＲＡ＋ＴＣＲγδ＋Ｔ細胞の７５%がＦｏｘｐ３＋を発現する。
ＭＬＲアッセイ用の刺激細胞のインビトロでの生成：単球を、未成熟ＤＣ（ｉＤＣ）の生成のために、２０ng/ml組換えヒト顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）及び２０ng/mlヒト組換えＩＬ−４を添加した１ウェル当たり０．５ｍｌのＲＰＭＩ−５を含む４８ウェル平底プレート中で培養する。３日目に、サイトカインを含む５００μlの培地を加える。５日目に、ｉＭＤＣの一部を、ＧＭ−ＣＳＦ（２０ng/mL）、ＩＬ−４（２０ng/mL）、及び５%ＦＢＳを添加したＲＰＭＩ１６４０中で２４時間にわたりＤＣ／腫瘍細胞比率１：２でアポトーシスＭＣＦ−７細胞と共培養する。ｉＤＣの別の一部を２×１０６個／バイアル（９０%ＦＢＳ−１０%ＤＭＳＯ中）で凍結する。指示された場合、パルスＤＣを腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α；最終２０ng/mL）及びＰＧＥ ２（１μM）を用いて２日間にわたり成熟させる（ｍＤＣ）。一部の実験において、ＴＮＦ及びＰＧＥ２（同じ濃度で）、又はリポ多糖（ＬＰＳ；１０〜１０００ng/mL；Sigma）をＭＬＲに直接加える。抗原負荷ＤＣ刺激装置を３０Ｇｙで照射する。
ＭＬＲアッセイ用のＴＡＰ阻害刺激細胞のインビトロでの生成：上に記載するように得られた成熟ＤＣを、ＢＨＶ−１からのＵＬ４９．５遺伝子を含むｐＧｅｍ４Ｚベクターから合成された２０μgのＲＮＡを用いてエレクトロポレーションする（参考文献：Lampen MH, Verweij MC, Querido B, van der Burg SH, Wiertz EJ, van Hall T）。ＴＡＰ阻害細胞に対するＣＤ８＋Ｔ細胞応答は、ヒト集団において容易に検出される（J Immunol. 2010 Dec 1;185(11):6508-17.）。
アポトーシスＴ細胞−ＤＣ共培養：未成熟ＤＣを単独で又はアポトーシス細胞（３のアポトーシス細胞：１のｉＤＣ）と１６時間にわたり培養した。ＤＣを次に、抗ＣＤ３コーティングマイクロビーズ（Miltenyi Biotec）を使用したアポトーシスＴ細胞の免疫磁気枯渇により精製し、２０μgの合成ＲＮＡを用いてエレクトロポレーションし、又はすることなく、２０ng/ml ＧＭ−ＣＳＦ、２０ng/mlヒト組換えＩＬ−４、及び成熟化カクテル（ＴＮＦ−α２０ng/ml及びＰＧＥ２ １μM）を添加したＲＰＭＩ−５中で２４時間にわたりインキュベートした。
フローサイトメトリー分析
ｍＡｂ標識。以下のコンジュゲートｍＡｂを使用する。ａ）ＣＤ３＋Ｔ細胞について：抗ＣＤ４（ＳＫ３）−ＰｅｒＣＰ−ｅＦｌｕｏｒ ７１０、抗ＴＣＲαβ（ＩＰ２６）−ＡＰＣ（ebioscience）、抗ＣＤ２５（Ｂ１．４９．９）−ＰｅＣｙ５５、抗ＣＤ１２７（Ｒ３４．３４）−ＡＰＣ−ＡＦ７００（Beckman Coulter）、抗ＣＤ３（ＵＣＨＴ１）−ＢＢ５１５抗インバリアントＴＣＲ Ｖα２４−ＪａＱ（６Ｂ１１）−ＰＥ、抗Ｆｏｘｐ３（２５９Ｄ／Ｃ７）−ＰＥ−ＣＦ５９４及び抗ＣＤ１５２（ＢＮＩ３）−ＢＶ４２１、抗ＣＤ１６１（ＤＸ１２）ＢＶ６０５及び抗ＣＤ５６（ＮＣＡＭ １６．２）ＢＵ３９５（Becton Dickinson）、抗ＴＣＲαβ−ＢＶ４２１（ＩＰ２６）（Biolegend）、抗ＴＣＲ汎γδ＋ＰＥ（ＩＭＭＵ５１０）（Beckman Coulter）及び抗ＣＤ２７−ＡＰＣ ｅｆｌｕｏｒ ７８０（Ｏ３２３）（ebioscience）。細胞を、ＢＳＡ／ＮａＮ３（０．５%ＢＳＡ、０．０１%ＮａＮ３）を含むＰＢＳ（ＦＡＣＳ緩衝液）中で希釈したＡｂの混合物を使用して表面マーカーについて染色する（暗所で、４℃で３０分間）。Ｆｏｘｐ３及びＣＴＬＡ−４の細胞内染色を、ebioscienceから得られたＦＯＸＰ３染色キットを製造者の指示に従って用いて実施する。適当なアイソタイプ対照Ａｂを各々の染色の組み合わせについて使用する。サンプルは、BD FACSDIVA 8.0.1ソフトウェア（Becton Dickinson）を使用してBD LSR FORTESSAフローサイトメーターで取得する。結果をパーセンテージ（%）又は平均蛍光強度（ＭＦＩ）で表す。
ｂ） 誘導性の特異的Ｔｒｅｇについて：誘導性ＴｒｅｇでのＩＬ−１Ｒ１の存在を、モノクローナル抗Ｆｏｘｐ３（２５９Ｄ／Ｃ７）−ＰＥ−ＣＦ５９４Ａｂ及びポリクローナル抗ＩＬ１Ｒ１−ＰＥ（R&D Systems、ＦＡＢ２６９Ｐ）を用いて評価した。
ＣＦＳＥ染色。Ｔｃｏｎｖを、ＰＢＳ中の１μMカルボキシ−フルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）（CellTrace細胞増殖キット；Molecular Probes/Invitrogen）を用いて、３７℃で１×１０７細胞/mLの濃度で８分間にわたり染色する。標識化を、１０%ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培養培地を用いて２回細胞を洗浄することにより停止する。細胞を次に、所望の濃度で再懸濁し、その後に増殖アッセイのために使用する。
７−ＡＡＤ（７−アミノ−アクチノマイシンＤ）染色。刺激されたＣＦＳＥ標識又は非標識ｎＴｒｅｇ及びＴｃｏｎｖのアポトーシスを、７−ＡＡＤアッセイを使用して決定した。簡単には、培養細胞を２０μg/mLの核色素７−ＡＡＤ（Sigma-Aldrich）を用いて４℃で３０分間にわたり染色する。ＦＳＣ／７−ＡＡＤドットプロットによって、アポトーシス（ＦＳＣｈｉｇｈ／７−ＡＡＤ＋）細胞及びアポトーシス小体（ＦＳＣｌｏｗ／７−ＡＡＤ＋）ならびに細片（（ＦＳＣｌｏｗ／７−ＡＡＤ−）から生存（ＦＳＣｈｉｇｈ／７−ＡＡＤ−）を区別する。生細胞をＣＤ３＋７−ＡＡＤ−ＦＳＣ＋細胞として同定する。
ＢＣ生検から単離されたＦｏｘｐ３発現ＣＤ３＋ＣＤ４＋γδＴ細胞非制限Ｔ細胞の表現型の特徴：ＴＣＲγδＴ細胞サブセットの同定をフローサイトメトリーにより実施した。パネルには、ＣＤ３（クローンＳＫ７）、ＣＤ４（クローンＳＫ３）、ＣＤ８（クローンＳＫ１）、汎γδＴ（クローンＩＭＭＵ５１０）、ＴＣＲ Ｖδ１（ＲＥＡ１７３）、ＴＣＲ Ｖδ２（ＲＥＡ７７１）、及びＦｏｘｐ３＋（クローン２５９Ｄ）に対する抗体が含まれた。
機能アッセイ
Ｔ細胞増殖。Ｔ細胞増殖を、５%ＦＢＳ、１００IU/mlペニシリン／ストレプトマイシン、１mMピルビン酸ナトリウム、１mM非必須アミノ酸、グルタマックス、及び１０mM ＨＥＰＥＳ（ＲＰＭＩ−５培地）を添加したＲＰＭＩ中で酸素正常状態において評価する。共培養の完了時、刺激されたＣＦＳＥ標識Ｔｃｏｎｖを収集し、抗ＣＤ３ｍＡｂ及び７−ＡＡＤで共染色し、ゲートＣＤ３＋７−ＡＡＤ−細胞中の生増殖細胞のパーセンテージ（ＣＦＳＥ低画分として定義）をフローサイトメトリーにより決定する。
Ｔ細胞アポトーシス誘導：腫瘍抗原特異的な機能的にコミットされたＦＯＸＰ３発現ＣＤ３＋ＴＣＲγδ＋非制限Ｔ細胞を、上に記載するようにエクスビボで生成する。次に、腫瘍抗原特異的な刺激Ｔ細胞を２５４nm（ＵＶ−Ｃ）で照射し（２４０mJ/cm2）、未成熟ＤＣとの共培養の前に６時間にわたり培養した。アポトーシスを７−ＡＡＤ染色により確認した。平均して、細胞の７５%が７−ＡＡＤ＋である。
標準的なポリクローナル細胞−細胞接触Ｔｒｅｇ抑制アッセイ：レスポンダー細胞として使用されるＣＦＳＥ標識Ｔｃｏｎｖ（４×１０４個／ウェル）を、規定量のＦｏｘｐ３Ｔ細胞（血液Ｔｒｅｇ又はエクスビボで生成されたＴ細胞）の存在又は非存在においてΔＣＤ３−フィーダー（４×１０４個／ウェル）と４〜５日間にわたり培養する。培養は、２００μＬの完全ＲＰＭＩ培地中の０．２μg/mLの抗ＣＤ３ ｍＡｂでコーティングされた丸底プレート中で実施する。結果を、増殖ＣＦＳＥ低 Ｔ細胞のパーセンテージとして、又は以下のように算出される抑制のパーセンテージとして表す：（１００×［（Ｔｃｏｎｖ ＣＦＳＥ低細胞のパーセンテージ−ｎＴｒｅｇｓとの共培養中のＴｃｏｎｖ ＣＦＳＥのパーセンテージ）／Ｔｃｏｎｖ ＣＳＦＥ低細胞のパーセンテージ］。
自己ＭＬＲ抑制アッセイ：ＣＦＳＥ標識Ｔｃｏｎｖ ＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞（５×１０４個）を、ＲＰＭＩ−５培地中の１×１０４個のパルスｉＤＣを用いて、又はＩＬ−２（２０IU/ml）ＩＬ−１ｂ（１０ng/ml）、ＩＬ−６（３０ng/ml）、ＩＬ−２１（５０ng/ml）、及びＩＬ−２３（３０ng/ml）を添加したＩＭＤＭ−５培地中の５×１０３個のパルス−ｍＤＣを用いて、規定量のＦｏｘｐ３ Ｔ細胞（血液Ｔｒｅｇ又はエクスビボで生成されたＴ細胞）の存在又は非存在において５〜６日間にわたり刺激する。指示がある場合、培養を、ＩＬ−２（２０IU/ml）、ＩＬ−１β（１０ng/ml）、ＩＬ−６（３０ng /ml）、ＩＬ−２１（５０ng/ml）、及びＩＬ−２３（３０ng/ml）を添加したＩＭＤＭ−５培地中で実施する。結果を、増殖ＣＦＳＥ低 Ｔ細胞のパーセンテージとして、又は以下のように算出された抑制のパーセンテージとして表す：（１００×［（Ｔｃｏｎｖ ＣＦＳＥ低細胞のパーセンテージ−ｎＴｒｅｇｓとの共培養におけるＴｃｏｎｖ ＣＦＳＥのパーセンテージ）／Ｔｃｏｎｖ ＣＳＦＥ低細胞のパーセンテージ）。
古典的７−ＡＡＤ／ＣＦＳＥ細胞媒介性の細胞傷害性アッセイ：標的細胞を上に記載するようにＣＦＳＥで標識し、９６ウェルＵ底プレートに３通りに３×１０４個／ウェルで配置した。ＣＤ８＋エフェクターＴ細胞（５：１のＥ：Ｔ比率）を加え、インキュベーションを３７℃で６時間にわたり行った。実験の終了時に、死細胞を７−ＡＡＤで標識して溶解細胞を検出した。標的細胞に対する細胞溶解活性を、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ機器を使用し、二重陽性染色ＣＦＳＥ及び７−ＡＡＤを示す領域に基づいて分析した。ＣＤ８＋Ｔ細胞クローンの細胞溶解活性（%）を、陰性対照における自然溶解（%）を差し引いた後、ＣＦＳＥ及び７−ＡＡＤの両方について陽性の細胞／全ＣＦＳＥ陽性細胞として算出した。細胞溶解活性のパーセンテージを次に、以下の式を使用して算出した：細胞溶解活性（%）［死んだ標的細胞（%）−自然死（%）］×１００／［１００−自然死（%）］。
ＤＮＡメチル化の測定：古典的には、安定したＴｒｅｇ遺伝子シグネチャーは、Ｔｒｅｇ特異的脱メチル化領域（ＴＳＤＲ）の保存された非コード配列２（ＣＮＳ２）内の高度に脱メチル化されたＣｐＧアイランドからなった。遺伝子ＦＯＸＰ３のＴＳＤＲ領域のＤＮＡメチル化分析を、Christopher Fuhrman（Fuhrman et al, Divergent Phenotypes of Human Regulatory T Cells Expressing the Receptors TIGIT and CD226, 2015, Journal of immunology）により以前に記載されているように、ゲノムＤＮＡの亜硫酸水素塩処理後の定量的ＰＣＲにより評価した。簡単には、ヌクレオチドを、AllPrep DNA/RNA Mini Kit（Qiagen）又はDNeasy組織キット（Qiagen）を適宜用いて単離した。ゲノムＤＮＡの亜硫酸水素塩処理は、EZ DNA Methylation Kit（Zymo Research）を用いて５００ngのＤＮＡで実施した。ＤＮＡ標準は、非メチル化亜硫酸水素塩変換ヒトＥｐｉＴｅｃｔ対照ＤＮＡ（Qiagen）又は汎用メチル化亜硫酸水素塩変換ヒト対照ＤＮＡ（Zymo Research）から由来する。多量の標準を得るために、ＴＳＤＲを、以下の反応を使用してＰＣＲ増幅した：２５μlのZymoTaq PreMix緩衝液（Zymo Research）ならびに各々０．５μMのプライマーＦＯＸＰ３＿ＴＳＤＲｆｗｄ（５’−ＡＴＡＴＴＴＴＴＡＧＡＴＡＧＧＧＡＴＡＴＧＧＡＧＡＴＧＡＴＴＴＧＴＴＴＧＧ−３’−配列番号１）及びＦＯＸＰ３＿ＴＳＤＲｒｅｖ（５’−ＡＡＴＡＡＡＣＡＴＣＡＣＣＴＡＣＣＡＣＡＴＣＣＡＣＣＡＡＣＡＣ−３’−配列番号２）を含む５０μMの反応容量。９５℃で１０分間にわたるインキュベーション後、増幅を以下の通りに実施した：９５℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、及び７２℃で１分間の５０サイクル。増幅されたＰＣＲ産物を、QIAquick Gel Extraction Kit（Qiagen）を用いて精製した。精製された対照ＴＳＤＲ ＤＮＡの濃度を、GE NanoVue分光光度計（GE Healthcare Life Sciences）を用いて決定した。ＴＳＤＲリアルタイムＰＣＲを、メチル化又は脱メチル化標的配列を標的とするプローブを用いて実施した。反応は、Roche LightCycler 480システム（Roche Diagnostics）を用いて９６ウェル白色トレイ中で実施した。各々の反応液は、１０μlのLightCycler 480 Probes Master Mix（Roche）、１０ngの亜硫酸水素塩変換ＤＮＡサンプル又は標準、１μMの各々のプライマー、及び１５０nMの各々のプローブを含み、最終反応値は２０μlであった。増幅のために使用したプローブは、ＴＳＤＲ−フォワード５’−ＧＧＴＴＴＧＴＡＴＴＴＧＧＧＴＴＴＴＧＴＴＧＴＴＡＴＡＧＴ−３’（配列番号３）及びＴＳＤＲ−リバース５’−ＣＴＡＴＡＡＡＡＴＡＡＡＡＴＡＴＣＴＡＣＣＣＴＣＴＴＣＴＣＴＴＣＣＴ−３’（配列番号４）であった。標的配列検出用のプローブは、ＦＡＭ標識メチル化プローブ、ＦＡＭ−ＣＧＧＴＣＧＧＡＴＧＣＧＴＣ−ＭＧＢ−ＮＦＱ（配列番号５）、又はＶＩＣ標識非メチル化プローブ、ＶＩＣ−ＴＧＧＴＧＧＴＴＧＧＡＴＧＴＧＴＴＧ−ＭＧＢ−ＮＦＱ（配列番号６）であった。全てのサンプルを三通りに試験した。リアルタイム増幅用のプロトコールは以下の通りである：９５℃で１０分間の初期変性後、サンプルを９５℃で１５秒間及び６１℃で１分間の５０サイクルに供した。１４の異なる比率の完全メチル化及び脱メチル化鋳型をリアルタイム標準として使用した。６次多項式を使用して、各々のサンプルについて、ＴＳＤＲで脱メチル化された細胞のパーセンテージを推定した。
ヒストンアセチル化の測定：ＦＯＸＰ３遺伝子の４つの異なる部位のヒストンアセチル化分析を、以前にLing Lu（Ling Lu et al, PNAS 2014）により記載されているように、ＣｈＩＰアッセイにより評価した。簡単には、各々の処理ｎＴｒｅｇ細胞サンプルの５０，０００個の細胞を収集し、１%ホルムアルデヒドで架橋し、次に１２０μLの溶解緩衝液［５０mM Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１０mM ＥＤＴＡ、１%（ｗｔ／ｖｏｌ）ＳＤＳ、プロテアーゼ阻害剤混合物（１：１００希釈；Sigma）、１mM ＰＭＳＦ、２０mM酪酸Ｎａ］を用いて溶解した。溶解物中のクロマチンを５００〜８００bpのフラグメントに超音波処理し、次に８００μLのRIPA ChIP緩衝液［１０mM Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ、ｐＨ ７．５、１４０mM ＮａＣｌ、１mM ＥＤＴＡ、０．５mM ＥＧＴＡ、１%（ｖｏｌ／１）Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、０．１%（ｗｔ／ｖｏｌ）ＳＤＳ、０．１%（ｗｔ／ｖｏｌ）Ｎａ−デオキシコール酸、プロテアーゼ阻害剤混合物（１：１００希釈；Sigma）、１mM ＰＭＳＦ、及び２０mM酪酸Ｎａ］を用いて希釈した。DynabeadsプロテインＧ（１０μＬ；Invitrogen）を１μｇのＨ３Ｋ４ｍｅ３（Abcam）もしくはＨ３Ｋ９ａｃ（Cell Signaling）又は正常ウサギＩｇＧ陰性対照ＣｈＩＰグレード抗体と別々に２時間にわたりインキュベートした。次に、１００μLの剪断されたクロマチンを、全インプットＤＮＡ抽出のために、前処理された抗体−ビーズ複合体及び別の１００μＬの断片化されたクロマチンと別々に免疫沈降させた。免疫沈降したＤＮＡを、以下のプライマーを用いたリアルタイムＰＣＲにより定量化した：プロモーター、５’−ＡＣＣ ＧＴＡ ＣＡＧ ＣＧＴ ＧＧＴ ＴＴＴ ＴＣ−３’（配列番号７）及び５’−ＣＴＡ ＣＣＴ ＣＣＣ ＴＧＣ ＣＡＴ ＣＴＣ ＣＴ−３’（ 配列番号８）；ＣＮＳ１、５’−ＣＣＣ ＡＡＧ ＣＣＣ ＴＡＴ ＧＴＧ ＴＧＡＴＴ−３’（配列番号９）及び５’−ＧＴＧ ＴＧＴ ＣＡＧ ＧＣＣ ＴＴＧ ＴＧＣ ＴＡ−３’（配列番号１０）；ＣＮＳ２、５’−ＧＴＣ ＣＴＣ ＴＣＣ ＡＣＡＡＣＣ ＣＡＡ ＧＡ−３’（配列番号１１）及び５’−ＧＡＣ ＡＣＣ ＡＣＧ ＧＡＧ ＧＡＡ ＧＡＧ ＡＡ−３’（配列番号１２）；ＣＮＳ３、５’−ＡＧＧ ＴＧＣ ＣＧＡ ＣＣＴ ＴＴＡ ＣＴＧ ＴＧ−３’（配列番号１３）及び５’−ＡＣＡ ＡＴＡ ＣＧＧ ＣＣＴ ＣＣＴ ＣＣＴ ＣＴ−３’（配列番号１４）。
結果
ａ）エクスビボのヒト誘導性腫瘍抗原特異的ＣＤ４＋ＴＣＲγδ非制限Ｔ細胞におけるＦｏｘｐ３＋発現の誘導。
最適条件を、前に記載したように、腫瘍抗原特異的Ｆｏｘｐ３＋発現ＣＤ４＋ＴＣＲγδ非制限Ｔ細胞を誘導するために設定する。図２は、ＩＬ−２ならびにＴＧＦβ、ＰＧＥ２、及びラパマイシンで構成されるｎＴｒｅｇ極性化培地の存在におけるアポトーシス性腫瘍抗原パルスされた免疫寛容原性ＤＣ（「腫瘍Ａｇ負荷ｔＤＣ」）が、抗原特異的な刺激ナイーブ従来型ＣＤ４＋Ｔ細胞（「ナイーブＴｒｅｇ」）において高レベルのＦｏｘｐ３＋発現を誘導することができ（図２Ａ中の頻度及び図２Ｂ中のＭＦＩ）、非パルスｔＤＣ（「無負荷ｔＤＣ」）は、同じ極性化培地の存在において、ナイーブ従来型ＣＤ４＋Ｔ細胞においてＦｏｘｐ３＋発現を誘導することができないことを示す。
ｂ）ヒト乳癌におけるＦｏｘｐ３を発現する病原性ＣＤ４＋γδＴ細胞の特異的な動員。
ＣＤ４及びＦｏｘｐ３の発現を示す新規γδＴ細胞のサブセットが、乳癌（ＢＣ）生検から単離されたＴＩＬにおいて同定されている。実際に、Ｆｏｘｐ３を発現するγδＴ細胞は正常個体からのＰＢＭＣにおいては稀であるが（＜１%）、それらは、図３に示すように、ＢＣ生検から精製されたＴＩＬにおいて強く濃縮されている（約１０倍）。
一般的にヒトγδＴ細胞は、それらのＴＣＲδ鎖の用途に従って２つの主要な構造サブセット：Ｖδ１及びＶδ２Ｔ細胞（Ｖδ１は優勢な組織内在細胞であるのに対し、Ｖδ２は末梢血における主要なサブセットである）に分けられるため、本発明者らは、この新たなＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋γδＴサブセットにおけるＴＣＲ Ｖδ鎖をフローサイトメトリーにより検討してきた。図４は、Ｆｏｘｐ３を発現する病原性ＣＤ４＋γδＴ細胞の大半（＞８５%）が、Ｖδ１ｎｅｇＶδ２ｎｅｇであることを示す。
本発明者らは次に、ＢＣ生検から単離されたＦｏｘｐ３発現ＣＤ３＋ＣＤ４＋γδＴ細胞非制限Ｔ細胞の機能抑制能力を評価した。図５は、新鮮なＴｒｅｇと同様に、Ｆｏｘｐ３＋を発現するこれらのＣＤ４＋γδＴ細胞が、標準的なポリクローナル細胞−細胞接触Ｔｒｅｇ抑制アッセイを使用した場合に抑制活性を呈することを示す。
ｃ）腫瘍抗原特異的ＦＯＸＰ３発現ＣＤ４＋ＴＣＲγδ非制限Ｔ細胞に対する自己ＣＤ８媒介性Ｔ細胞応答の誘導。
培養系を確立し、それにおいて、自己ＣＤ３＋ナイーブＴ細胞と共培養したアポトーシス性病原性ＣＤ４＋Ｔ細胞を負荷した炎症性ＤＣ（ｉｎｆ ＤＣ）によって、樹状細胞を負荷するために使用した病原性ＣＤ４＋Ｔ細胞に対するＣＤ８＋Ｔ細胞株の生成を誘導することができる。図６は、それぞれ−ｉｎｆ ＤＣ（「ｍＤＣ」）又は−ＴＡＰ阻害ＤＣを負荷したアポトーシス性病原性ＣＤ４＋Ｔ細胞を用いて誘導された２つのＣＤ８＋クローンによって、それらの特異的標的、それらの誘導性病原性ＣＤ４＋Ｔ細胞クローンを溶解できることを示す。しかし、両方のＣＤ８＋クローンを自己ＥＢＶ細胞株に対して試験する場合、それらはこの標的を溶解することはできない（図６）。
ｄ）内腔Ｂ乳癌から分離された腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）におけるＦｏｘｐ３＋発現Ｔ細胞の存在。
内腔Ａ及びＢサブタイプは両方ともエストロゲン受容体陽性（ＥＲ＋）及び低悪性度であり、内腔Ａ腫瘍は非常にゆっくり成長し、内腔Ｂ腫瘍はより急速に成長する。内腔Ａ腫瘍は最良の予後を有する。内腔Ｂ腫瘍は不良な臨床転帰と関連付けられる。本発明者らは、両方の内腔サブタイプの乳癌から単離されたＴＩＬ中のリンパ球の表現型をフローサイトメトリーにより検証し、ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＴＣＲαβ＋ＭＨＣＩＩ制限及びＣＤ３＋ＣＤ４＋ＴＣＲγδ＋非制限Ｔ細胞におけるＦｏｘｐ３発現の存在を見出した。Ｆｏｘｐ３は内腔Ａ***腫瘍から抽出されたＴＩＬにおいて検出されなかった（図７）。さらに、正の相関が、ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＴＣＲγδ＋非制限Ｔ細胞における高いパーセンテージのＦｏｘｐ３発現と乳癌における不良な臨床転帰の間で観察される（図８）。
Ｆｏｘｐ３発現ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＴＣＲαβ＋ＭＨＣＩＩ制限Ｔ細胞及びＦｏｘｐ３発現ＣＤ３＋ＴＣＲαβ＋非制限Ｔ細胞はそれぞれ、試験サンプル中のＣＤ３＋ＴＣＲαβ＋Ｔ細胞の約２０%及びＣＤ３＋ＴＣＲγδ＋の２３%に相当する。Ｆｏｘｐ３発現ＣＤ３＋ＴＣＲγδ＋Ｔ細胞は、Ｆｏｘｐ３＋ＣＤ３＋ＴＣＲαβ＋Ｔ細胞と同じ表現型プロファイルを提示する。これらのＦｏｘｐ３＋ＴＣＲγδ＋Ｔ細胞集団は、Ｆｏｘｐ３＋ＣＤ３＋ＴＣＲαβ＋Ｔ細胞のレベルと同様のレベルのＦｏｘｐ３、ＣＤ２５、及びＣＴＬＡ４を発現する（図９）。
ｄ）排他的に調節活性を発揮するようにコミットされた、Ｆｏｘｐ３を発現する特異的ＣＤ３＋ＴＣＲγδ＋のエクスビボでの生成及び増殖。
抗原特異的Ｔｒｅｇの抑制能力が、ポリクローナルＴｒｅｇのそれよりもはるかに大きいことが試験によって示唆されたため、本発明者らは、いずれの刺激の培養条件であっても、排他的に調節活性を発揮するようにコミットされた、エクスビボで生成及び増殖された抗原特異的Ｆｏｘｐ３発現ＣＤ３＋ＴＣＲγδ＋非制限Ｔ細胞に対する方法を設定した。
図１０は、ＩＬ−１５、ＩＬ−２、ＴＧＦβ、ＰＧＥ２、及びラパマイシンの組み合わせを含むｎＴｒｅｇ極性化培地の存在において、ゾレドロン酸処理自己ｔＤＣで刺激されたナイーブＣＤ３＋ＴＣＲγδ＋Ｔ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ２７＋ＴＣＲγδ＋Ｔ細胞）が、２１日間の増殖後にＦｏｘｐ３を発現し、標準的なポリクローナル細胞−細胞接触Ｔｒｅｇ抑制アッセイにより評価されるように、有意な機能的抑制活性を示すことを示す。興味深いことに、２１日間増殖させたＦＯＸＰ３発現ＣＤ３＋ＴＣＲγδ＋Ｔ細胞は、ｎＴｒｅｇ極性化培地中でのさらに２１日間の培養後、それらのＦｏｘｐ３レベル及びそれらの抑制活性を維持している。

Claims (18)

  1. 以下の表現型：ＣＤ３＋ＴＣＲγδ＋Ｆｏｘｐ３＋を有するγδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞をエクスビボで生成するための方法であって、以下を含む方法
    γδＴ細胞活性化剤及び以下の薬剤：ｉ）ｃＡＭＰ（環状アデノシン一リン酸）活性化剤、ｉｉ）ＴＧＦβ（形質転換成長因子ベータ）経路活性化剤、ｉｉｉ）ｍＴＯＲ 阻害剤、場合によりｉｖ）ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、及びＴＳＬＰの群において選択される少なくとも１つのサイトカイン、ならびに場合によりｖ）少なくとも１つのＴＥＴ酵素活性化剤及び／又は少なくとも１つのＤＮＭＴ阻害剤の存在においてＣＤ３＋ＴＣＲγδ＋Ｔ細胞を、少なくとも５日間培養すること。
  2. γδＴ細胞活性化剤がポリクローナルγδＴ細胞活性化剤、好ましくは抗ＴＣＲγδ抗体又は非ペプチドリン酸化抗原である、請求項１記載の方法。
  3. γδＴ細胞活性化剤が抗原特異的γδＴ細胞活性化剤、好ましくは寛容原性樹状細胞（ＤＣ）であり、少なくとも１つのビスホスホネート、好ましくは少なくとも１つのアミノビスホスホネート（aminobiphosphonate）を用いてパルスされる、請求項１記載の方法。
  4. ｃＡＭＰ活性化剤が、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）、ＥＰ２もしくはＥＰ４アゴニスト、膜アデニンシクラーゼ活性化剤、又は代謝型グルタミン酸受容体アゴニストを含む群より選択される、請求項１〜３のいずれか一項記載の方法。
  5. ＴＧＦβ経路活性化剤が、ＴＧＦβ、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、成長及び分化因子（ＧＤＦ）、抗ミュラー管ホルモン（ＡＭＨ）、アクチビン、ならびにノダールを含む群より選択される、請求項１〜４のいずれか一項記載の方法。
  6. ｍＴＯＲ阻害剤が、ラパマイシン、ラパマイシン類似体、ウォルトマンニン；テオフィリン；カフェイン；エピガロカテキンガレート（ＥＧＣＧ）、クルクミン、レスベラトロール；ゲニステイン、３，３−ジインドリルメタン（ＤＩＭ）、ＬＹ２９４００２（２−（４−モルホリニル）−８−フェニル−４Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オン）、ＰＰ２４２、ＰＰ３０、Ｔｏｒｉｎ１、Ｋｕ−００６３７９４、ＷＡＹ−６００、ＷＹＥ−６８７、ＷＹＥ−３５４、ＧＮＥ４７７、ＮＶＰ−ＢＥＺ２３５、ＰＩ−１０３、ＸＬ７６５、及びＷＪＤ００８を含む群より選択される、請求項１〜５のいずれか一項記載の方法。
  7. 請求項１〜６の生成方法により得られたγδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞を、γδＴ細胞活性化剤及び以下の薬剤：ｉ）ｃＡＭＰ（環状アデノシン一リン酸）活性化剤、ｉｉ）ＴＧＦβ（形質転換成長因子ベータ）経路活性化剤、ｉｉｉ）ｍＴＯＲ 阻害剤、場合によりｉｖ）ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、及びＴＳＬＰの群において選択される少なくとも１つのサイトカイン、ならびに場合によりｖ）少なくとも１つのＴＥＴ酵素活性化剤及び／又は少なくとも１つのＤＮＭＴ阻害剤の存在において、少なくとも５日間培養する工程をさらに含む、請求項１〜６のいずれか一項記載の方法。
  8. 請求項１〜６のいずれか一項記載の方法により入手可能なエクスビボで生成されたγδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞集団。
  9. γδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞が、以下の表現型：ＣＤ３＋ＴＣＲγδ＋Ｆｏｘｐ３＋を有する、請求項７記載の方法により入手可能なエクスビボで生成及び増殖されたγδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞集団。
  10. γδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞が、以下の表現型：ＣＤ３＋ＴＣＲγδ＋Ｆｏｘｐ３＋を有する、炎症条件において機能的に安定なままである、エクスビボで生成されたγδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞集団。
  11. 調節性Ｔ細胞集団が以下の表現型：ＣＤ３＋ＴＣＲγδ＋Ｆｏｘｐ３＋ＩＬ−１Ｒ１−を有する、請求項１０記載のエクスビボで生成されたγδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞集団。
  12. 以下の表現型：ＣＤ３＋ＴＣＲγδ＋Ｆｏｘｐ３＋を有する不活化γδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞、又は以下の表現型：ＣＤ３＋ＴＣＲγδ＋Ｆｏｘｐ３＋を有するγδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞のブレブ、又は以下の表現型：ＣＤ３＋ＴＣＲγδ＋Ｆｏｘｐ３＋を有するγδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞のブレブを負荷した免疫原性樹状細胞を含む免疫原性産物。
  13. 以下の表現型：ＣＤ３＋ＴＣＲγδ＋Ｆｏｘｐ３＋を有する不活化γδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞、又は以下の表現型：ＣＤ３＋ＴＣＲγδ＋Ｆｏｘｐ３＋を有するγδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞のブレブ、又は以下の表現型：ＣＤ３＋ＴＣＲγδ＋Ｆｏｘｐ３＋を有するγδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞のブレブを負荷した免疫原性樹状細胞、及び少なくとも医薬的に許容可能な賦形剤を含む医薬的組成物。
  14. 以下の表現型：ＣＤ３＋ＴＣＲγδ＋Ｆｏｘｐ３＋を有する不活化γδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞、又は以下の表現型：ＣＤ３＋ＴＣＲγδ＋Ｆｏｘｐ３＋を有するγδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞のブレブ、又は以下の表現型：ＣＤ３＋ＴＣＲγδ＋Ｆｏｘｐ３＋を有するγδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞のブレブを負荷した免疫原性樹状細胞、及び少なくとも１つのアジュバントを含むワクチン組成物。
  15. 癌を処置する際での使用のための、請求項１０〜１２のいずれか一項記載の免疫原性産物、医薬組成物、又はワクチン組成物。
  16. 以下の表現型：ＣＤ３＋ＴＣＲγδ＋Ｆｏｘｐ３＋を有するγδＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞、及び少なくとも１つの医薬的に許容可能な賦形剤を含む医薬組成物。
  17. 細胞治療における使用のための、請求項１５記載の医薬組成物。
  18. 炎症性疾患もしくは自己免疫疾患を処置する際での使用のための、又は移植拒絶反応もしくは移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を防止するための、請求項１５記載の医薬組成物。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2019502725A (ja) * 2016-01-20 2019-01-31 フェイト セラピューティクス，インコーポレイテッド 養子免疫療法における免疫細胞調節のための組成物および方法

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113559103B (zh) * 2021-06-25 2023-05-16 浙江大学 一种mTOR抑制剂PP242的二十二碳六烯酸偶联前药、制剂及其应用
CN114149978B (zh) * 2022-02-09 2022-04-26 深圳博雅感知药业有限公司 制备car-t细胞的方法
CN115044553B (zh) * 2022-08-16 2022-11-08 首都医科大学附属北京朝阳医院 一种靶向mTOR的耐受性树突状细胞及其制备方法与应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009037723A1 (en) * 2007-08-10 2009-03-26 Istituto Nazionale Per Le Malattie Infettive Method for the generation and expansion of gamma/delta t regulatory cells, cells thus obtained and their uses
WO2013050596A1 (en) * 2011-10-06 2013-04-11 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Method of maintaining foxp3 expression in expanded t regulatory cell
JP2016517890A (ja) * 2013-05-03 2016-06-20 セレクタ バイオサイエンシーズ インコーポレーテッドＳｅｌｅｃｔａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ． 望ましくない液性免疫応答を低減するための投薬の組み合わせ

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009037723A1 (en) * 2007-08-10 2009-03-26 Istituto Nazionale Per Le Malattie Infettive Method for the generation and expansion of gamma/delta t regulatory cells, cells thus obtained and their uses
WO2013050596A1 (en) * 2011-10-06 2013-04-11 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Method of maintaining foxp3 expression in expanded t regulatory cell
JP2016517890A (ja) * 2013-05-03 2016-06-20 セレクタ バイオサイエンシーズ インコーポレーテッドＳｅｌｅｃｔａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ． 望ましくない液性免疫応答を低減するための投薬の組み合わせ

Non-Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BARATELLI F ET AL: "Prostaglandin E2 Induces FOXP3 Gene Expression and T Regulatory Cell Function in Human CD4+ T Cells", J IMMUNOL, vol. 175 (3), JPN6021000226, 2005, pages 1483 - 1490, ISSN: 0004503454 *
BLOOD, vol. 110, no. 13, JPN6021000231, 2007, pages 4293 - 4302, ISSN: 0004503459 *
EUR. J. IMMUNOL., vol. 39, JPN6021000230, 2009, pages 752 - 762, ISSN: 0004503458 *
GU Y ET AL: "Rapamycin together with TGF-β1, IL-2 and IL-15 induces the generation of functional regulatory γδ", JOURNAL OF IMMUNOLOGICAL METHODS, vol. 402（1-2）, JPN6021000225, 2014, pages 82 - 87, ISSN: 0004503453 *
INTERNATIONAL IMMUNOLOGY, vol. 19, no. 6, JPN6021000228, 2007, pages 785 - 799, ISSN: 0004503456 *
LI X ET AL: "Generation of Human Regulatory γδ T Cells by TCRγδ Stimulation in the Presence of TGF-β and The", J IMMUNOL, vol. 186 (12), JPN6021000224, 2011, pages 6693 - 6700, ISSN: 0004503452 *
NATURE REVIEWS IMMUNOLOGY, vol. 9, JPN6021000229, 2009, pages 480 - 490, ISSN: 0004503457 *
細胞工学, vol. 32, no. 12, JPN6021000227, 2013, pages 1232 - 1237, ISSN: 0004503455 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2019502725A (ja) * 2016-01-20 2019-01-31 フェイト セラピューティクス，インコーポレイテッド 養子免疫療法における免疫細胞調節のための組成物および方法

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