JP2019529565A - 養子細胞治療の方法 - Google Patents

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Abstract

本発明は、胸部障害を有する又は有するリスクがある対象の処置のための養子細胞治療の組成物及び経乳頭法に関する。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、2016年9月28日に出願された米国特許出願62/401040号の利益を主張するものであり、この出願は本明細書に参照によってその全体が組み込まれる。
配列表に関する陳述
本出願に関連する配列表は、紙へのコピーに代えてテキストフォーマットで提供され、参照により本明細書に組み込まれる。配列表を含むテキストファイルの名称は、64721_ST25.txtである。そのテキストファイルは、15KBあり;2017年9月21日に作成され;明細書の出願に伴いEFS-Webを介して提出されている。
様々な組換え受容体、例えば、キメラ抗原受容体(CAR)を発現する操作された細胞を使用する養子細胞治療が、がんの処置のため開発されている。養子細胞治療は、血液由来のがんの処置に一部では成功することが実証され、CD19 CARを白血病に使用した際に顕著であり、またリンパ腫及びミエローマを有する患者における適応が探究されている。固形腫瘍の処置は、種々の理由のため大変に問題がある。物理的な障壁の存在により、そのような細胞の経内皮の横断及び固形腫瘍の標的化及び浸潤(すなわち、腫瘍内遊走)を困難にしている。
加えて、悪条件の腫瘍微小環境が存在することにより、標的細胞に対して投与される細胞のアクセスを乏しくし、腫瘍逃避をもたらす。腫瘍微小環境には、高い組織圧、低酸素症、栄養飢餓(例えば、グルコースの低下及び他の代謝物に起因)、乳酸生成の増加と結果として生じるアシドーシス、制御性CD4+T細胞(Tレグ)、骨髄由来抑制細胞(MDSC)、及び腫瘍関連マクロファージ(TAM)の浸潤の増加、免疫抑制性サイトカイン(例えば、IL-10及びTGF-β)の存在、及び活性化T細胞(例えば、CTLA4及びPD-1)によって発現される免疫抑制性受容体を標的にするリガンドの発現、及びT細胞増殖の低下等の条件が含まれ、これは、免疫抑制性の微小環境を作り出すことを助け、腫瘍がそれら自体の免疫認識からの防御、耐性の維持、及び排除の回避を可能にする。固形腫瘍を有する対象において往々にして観察される他の課題は、導入された細胞に対するサイトカイン放出症候群(CRS)としても知られる「サイトカインストーム」、マクロファージ活性化症候群(MAS)、腫瘍崩壊症候群(TLS)、神経毒性、宿主免疫応答であり、これは、同調的に活性化し、急速に増殖するCAR-T細胞及びマクロファージからのサイトカインの制御の効かない放出をもたらし、血液がんを有する対象と比較して固形腫瘍を有する対象においても頻度は低いものの認められる。養子細胞治療、例えばCAR-T細胞治療の後に観察されるCRS等の有害事象は、CAR-T細胞を使用する間に慎重さが必要であることを強調している。CRS関連有害事象の極端な例には、ERBB2(HER-2/neu)抗原を標的とするCAR-T細胞の注入後5日間シクロホスファミドで前処理された結腸がん対象の死亡例が含まれる(Morganら Molecular therapy: J. Am. Soc. of Gene Therapy. 28 (4): 843-51)。そのケースでは、炎症誘発性サイトカインの臨床的に有意な放出、肺毒性、複数の臓器不全及び結果として患者の死へとつながった。このサイトカインストームは、低レベルのERBB2を発現することが知られている、正常な肺上皮細胞に対するCAR-T細胞の細胞毒性に起因すると考えられる(「on-target-off-tumor」)。追加の課題は、CAR細胞によるon-target-off tumor攻撃、例えば、心毒性、神経毒性、及びアナフィラキシーに残されている。
US2016/0045551 米国特許第9,365,641号 US2016/0206656 米国特許第6,413,228号 米国特許第6,689,070号 米国特許第6,638,727号 特許出願PCT/US2015/010808 米国特許第5,531,736号 米国特許第5,279,608号 米国特許第5,562,654号 米国特許第5,827,538号 米国特許第5,798,119号 米国特許第5,795,591号 米国特許第4,552,561号 米国特許第5,492,534号 米国特許第6,585,706号 WO2014031687 US8822647 US20140271635 US7052906 米国特許公開第2014/0099340号 WO200014257 WO2013126726 WO2012/129514 WO2013/166321 WO2013/071154 WO2013/123061 US2002131960 US2013287748 US20130149337 US20160158359 US20160151491 US8906682 米国特許第7,446,190号 国際特許出願公開WO/2014055668 A1号 米国特許第8,339,645号 米国特許第7,446,179号 米国特許第8,389,282号 US201/40314795 US2014/0314795 米国特許第5,219,740号 米国特許第6,207,453号 US20160207989 US20160046700 米国特許第4,683,195号
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このような養子細胞治療処置に対する課題が残っており、したがって固形腫瘍を処置するための新規の治療戦略は、満たされていない医学的必要性である。
本概要は、下記の「発明を実施するための形態」において更に記載される、単純化された形での概念の選択を導入するために提供される。本概要は、主張される主題の重要な特徴を識別することを意図していなく、主張される主題の範囲の決定に役立つものとして使用されることも意図していない。
様々な態様において、本開示は、胸部管に細胞を投与する工程を含む、胸部障害を有する又は有するリスクがある対象の処置のための養子細胞治療の経乳頭法を提供する。
様々な態様において、本開示は、対象の胸部管に細胞を投与する工程を含む、胸部障害を有する又は有するリスクがある対象の処置のための養子細胞治療の経乳頭法を提供する。細胞は、T細胞、NK細胞、CTL、TIL、単球、顆粒球、又はその前駆体であってもよい。
一態様において、細胞は、対象の胸部細胞における標的抗原に結合する1つ又は複数の組換え受容体を発現する改変細胞を含む。組換え受容体は、キメラ抗原受容体(CAR)又は操作された若しくは疾患特異的なT細胞受容体(TCR)であってもよい。一部の実施形態において操作された受容体は、トランスジェニックTCRである。一部の実施形態において、疾患特異的なTCRは、腫瘍特異的なTCRである。
一部の実施形態において、改変細胞は、2つ以上のCARを発現する。他の実施形態において、CAR等の組換え受容体は、独立に単一特異性、二重特異性又は多重特異性であってもよい。更に他の実施形態において、組換え受容体は、構成的に、一過性に若しくは切り替え可能に発現される又は条件的に活性である。
別の態様において、本開示は、改変細胞が、組換え受容体を発現する改変細胞の発現をスイッチオフする能力がある安全スイッチを含むことを提供する。一部の実施形態において、安全スイッチは、死遺伝子スイッチ、FITCベースのスイッチ、及びPNEベースのスイッチからなる群から選択される。少なくとも1つの実施形態において、安全スイッチは、死遺伝子スイッチである。他の実施形態において、死遺伝子スイッチは、HSV-tk、iCaspase9又はFADDである。
一態様において、本開示は、組換え受容体のAg結合ドメインが結合する標的抗原が、腫瘍特異性抗原、腫瘍関連抗原、多系統腫瘍関連抗原、癌胎児性抗原、新抗原、又は免疫抑制抗原であることを提供する。一部の実施形態において、標的抗原は、形質転換関連分子、例えばMUC、例えばMUC1、c-met、サイトケラチン、例えばCK5、CK6、CK14、CK7、CK8、CK14、CK17、CK18、CK19、p53、グリコシド、Tn、TF、及びシアリルTn(STn)、ルイスx、ルイスa、ルイスy、及びガングリオシド、例えばGM3、GD3、9-0-アセチルGD3、9-0-アセチルGT3、及びN-グリコリ-GM3、葉酸受容体アルファ、ROR1、新抗原、腫瘍特異的抗原及び癌胎児性抗原、腫瘍関連抗原、例えば癌胎児性抗原(CEA)、L1細胞接着分子(L1CAM)、CAFs-関連タンパク質、例えば線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)、FAP-α、FSP-1/S100A4、及びPDGFR-β、ジガングリオシドGD2、メソテリン、IL-13受容体IL13R、IL-13受容体α、エフリンB2、IGFR1、ELIGHT、WT1、TAG-72、Ep-CAM、LFA-1、EGFR、エストロゲン受容体(ER)、プロゲステロン受容体、MAGE1、MAGE-3、MAGE-A3/6、MAGE-Aファミリーメンバー、例えばMAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A6、MAGE-A12、MAGE-A9、MAGE-A11、MAGE-C1、及びMAGE-C2、RAGE、BCR-ABL、タンパク質チロシンキナーゼ、例えばPRL-2及びPRL3、腫瘍関連糖タンパク質、例えばTAG-72、CA19-9、CA27.29、CA72-4、CA50、PD-1、CTLA-4、CD47、受容体チロシンキナーゼ、例えばH4-RET、Ki-67、サイクリンD1、サイクリンA、サイクリンE、p16、p21、p27、p53、Bcl-2、Bax、サバイビン、c-myc、Rb、VEGF、HPR1、HER1、HER2、HER3、HER4、CD10、SPARC、COX-2、基礎サイトケラチン、CK5/6、CK14、及びCK17、上皮増殖因子受容体、c-kit、c-erbB-2、IL-10、TGFベータ、CCL17、CCL22、及びCCL24ストローマ放出因子、例えばEGF、HGF、MCP-1、CSF-1、VEGF、サイトカイン、例えばIL1、IL-8、TNF-アルファ、酵素、例えばMM2、MMP7、MMP8、MMP9、MMP12、MMP13、及びCOX2からなる群から選択される。一部の実施形態において、組換え受容体は、HER2-CAR、FR-α-CAR、又はFAP-CARである。
一態様において、組換え受容体は、TCRゼータ、FcRガンマ、FcRベータ、CD3ガンマ、CD3デルタ、CD3イプシロン、CD4、CD8、CD16、CD22、CD25、CD79a、CD79b、及びCD66dからなる群から選択される一次シグナル伝達分子を含む。別の態様において、組換え受容体は、1つ又は複数の共刺激分子を含む。一部の実施形態において、1つ又は複数の共刺激分子は、MHCクラスI分子、BTLA及びTollリガンド受容体、免疫グロブリンスーパーファミリー(IgSF)、例えばCD28、B7受容体ファミリーメンバー(B7-H2/B7RP-1/LICOS/GL50、B7-DC/PD-L2、B7-H3)、CD226、TIM、CD2/SLAM、BTN、LAIR、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー(TNFRSF)、例えばOX40、CD27、CD30、DR3、GITR、及びT細胞におけるHVEM、CD2及びSLAM、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、付着分子(CD54、CD58、CD70)、ICOS、CD40、CD40L、4-1BB(CD137)、CD70、CD80、CD86、DAP10、及び他のオーファン受容体ファミリー、例えばLAG3(CD223)及びCD160からなる群から独立に選択される。少なくとも1つの実施形態において、組換え受容体は、共刺激分子としてCD28及び4-1BBを含む。
一態様において、本開示は、改変細胞がT細胞、NK細胞、CTL、単球、顆粒球、又はその前駆体であることを提供する。
別の態様において、本開示は、改変細胞がガドリニウムキレート、超常磁性酸化鉄ナノ粒子(SPION)、19Fパーフルオロカーボンナノ粒子、及び他の磁気レポーター遺伝子、例えば金属タンパク質ベースMRIプローブからなる群から選択される色素又は造影剤を更に含むことを提供する。色素又は造影剤により、投与された細胞の遊走及び腫瘍浸潤の割合並びに血液及び他の組織中の細胞の出現のモニタリングが可能となる。
更に別の態様において、本開示は、細胞が、対象の胸部管に経乳頭投与するため適切な組成物中に製剤化されることを提供する。そのような組成物は、薬学的に許容される担体、緩衝剤、賦形剤又はその組合せを更に含む。少なくとも1つの実施形態において、担体は、乳酸加リンゲル溶液である。一部の実施形態において、組成物は、ゲル化剤を更に含む。
更に別の態様において、本開示は、胸部障害が、良性の胸部疾患、乳がん、乳首のパジェット病、又は葉状腫瘍であることを提供する。一部の実施形態において、胸部障害は、過形成、非定型性、導管過形成、小葉過形成、非定型導管過形成(ADH)、又は非定型小葉過形成(ALH)である。
他の実施形態において、胸部障害は、導管上皮内癌(DCIS)、小葉上皮内癌(LCIS)、侵襲性(又は浸潤性)小葉癌(ILC)、侵襲性(又は浸潤性)導管癌(IDC)、微小浸潤性乳癌(MIC)、炎症性乳がん、ER陽性(ER+)乳がん、プロゲステロン受容体陽性(PR+)乳がん、ER+/PR+乳がん、ER陰性(ER-)乳がん、HER2+乳がん、三重陰性乳がん(すなわち、ER-/PR-/Her2-乳がん;「TNBC」)、腺様嚢胞癌(腺様嚢胞)癌、低グレード腺扁平上皮癌、髄様癌、粘液(又はコロイド)癌、乳頭癌、管状腺癌、化生性癌、及び微小乳頭癌からなる群から選択される乳がんである。
更に他の実施形態において、乳がんは、前癌、早期段階のがん、非転移性がん、転移前がん、局所的に進行したがん、転移性がん又は再発性のがんである。
ある態様において、本開示は、細胞が、単回用量又は複数回用量で投与されることを提供する。細胞が複数回用量で投与される場合、複数回用量は、第一の用量及び1つ又は複数の引き続く用量を含む。本開示は、1つ又は複数の用量が、分割単位用量で投与されることを更に提供する。
別の態様において、対象は、1×103から1×109改変細胞/kg体重、1×103から5×108改変細胞/kg体重、0.5×103から1×107改変細胞/kg体重、1×104から0.5×106改変細胞/kg体重、0.5×104から1×106改変細胞/kg体重、1×105から0.5×106改変細胞/kg体重の範囲の細胞の単位用量を投与される。一部の実施形態において、第一の用量は、1×103細胞未満/kg、0.5×104細胞未満/kg、1×104細胞未満/kg、0.5×105細胞未満/kg、1×105細胞未満/kg、0.5×106細胞未満/kg、又は1×106細胞未満/kg等の低用量である。
他の実施形態において、第一の用量は、0.5×105細胞超/kg、1×105細胞超/kg、0.5×106細胞超/kg、1×106細胞超/kg、0.5×107細胞超/kg、1×107細胞超/kg、0.5×108細胞超/kg、1×108細胞超/kg、又は5×108細胞超/kg等の高用量である。
更に他の実施形態において、引き続く用量は、第一の用量の開始後、7日から28日(それぞれの端点を含めて)の間に投与される。更なる実施形態において、引き続く用量は、第一の用量と同じ、第一の用量より低い又は第一の用量より高い。
ある態様において、経乳頭養子治療は、一次治療、腫瘍免疫賦活薬治療、又はアジュバント治療であってもよい。一部の実施形態において、細胞は、一次治療、腫瘍免疫賦活薬治療、又はアジュバント治療として投与される。
ある態様において、本開示は、細胞の投与が、対象における胸部障害の疾患負担を低下させることを提供する。一部の実施形態において、細胞の投与は、腫瘍負担を低下させる。他の実施形態において、組換え受容体を含む改変細胞の投与は、対象における腫瘍負担を低下させる。更に他の実施形態において、細胞の投与は、CRS関連、MAS関連、TLS関連、神経毒性関連又は宿主免疫応答関連の転帰のリスクを低下させる。更に他の実施形態において、改変細胞の投与は、CRS関連、MAS関連、TLS関連、神経毒性関連又は宿主免疫応答関連の転帰のリスクを低下させる。改変細胞等の細胞の投与は、サイトカイン、例えばIFNγ、TNFα、IL-2、GM-CSF、IL-1ベータ、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、Flt-3、フラクタルカイン、MIP1、sIL-2Rα、及びIL-5の循環又は胸部組織レベルを低下させる。
本開示は、対象が、細胞の投与の前に、リンパ球枯渇剤又は化学療法剤で前処理されることを更に提供する。一部の実施形態において、リンパ球枯渇剤又は化学療法剤は、シクロホスファミド、シクロスポリン、フルダラビン、ベンダムスチン、レナリドマイド、ポマリドミド、ゲムシタビン、BTK阻害剤、例えばイブルチニブ、腫瘍溶解性アデノウイルス、及びその組合せからなる群から選択される。
一態様において、方法は、対象に対する追加の治療剤の投与又は治療を含む。一部の実施形態において、追加の治療剤は、アスパラギナーゼ、ブスルファン、カルボプラチン、シスプラチン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、メトトレキセート、パクリタキセル、リツキシマブ、ビンブラスチン、ビンクリスチン、腫瘍溶解性ウイルス、例えば腫瘍溶解性アデノウイルス、抗エストロゲン、例えばタモキシフェン、N-メチル-エンドキシフェン、ノルエンドキシフェン、エンドキシフェン、ラロキシフェン、フルベストラント及び/又はアロマターゼ阻害剤、例えばアナストロゾール、レトロゾール、及びエキセメスタンからなる群から選択される。
対象の胸部管にHER2-CAR、FAP-CAR、又はFR-αを発現する改変細胞を投与する工程を含む、胸部障害を有する又は有するリスクがある対象の処置のための養子細胞治療の経乳頭法が、本明細書に提供される。一部の実施形態において、HER2-CARは、図2に開示された配列番号1又はその変異体又は機能的な部分に対して少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、及び100%の相同性を有する。
他の実施形態において、FAP-CARは、図2に開示された配列番号2又はその変異体又は機能的な部分に対して少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、及び100%の相同性を有する。
別の態様において、本開示は、1つ又は複数の容器、パッケージング材料、ラベル又は添付文書、及び場合により装置を含む製品を提供する。一部の実施形態において、装置は、針及びシリンジ、カニューレ、カテーテル、マイクロカテーテル、浸透圧ポンプ、又は封入装置である。
上記の態様及び本発明の多くの付随する利点は、以下の添付の図面と併せて、以下の発明を実施するための形態を参照することで、より良く理解されるので、より容易に認識されよう:
上記の態様及び本発明の多くの付随する利点は、以下の添付の図面と併せて、以下の発明を実施するための形態を参照することで、より良く理解されるので、より容易に認識されよう:
末梢血リンパ球を導入するため使用される、ErbB2(HER2)CARベクター(ガンマ-レトロウイルスベクターMSGV1-4D5-CD8-28BBZ)を模式的に示す図である(Morganら、Molecular Therapy、2010、18(4)、843-851)。 HER2-CARベクター及びFAP-CARドメインについての配列を示す表である。 図２Ａの続きである。 図２Ｂの続きである。 図２Ｃの続きである。 図２Ｄの続きである。 図２Ｅの続きである。 図２Ｆの続きである。 図２Ｇの続きである。 図２Ｈの続きである。
処置の方法
養子細胞治療を使用して対象における胸部障害を処置する新規な方法が、本明細書に提供される。方法は、胸部障害を有する又は有するリスクがある対象の胸部乳管に対してする養子細胞治療を施す工程を含む。養子細胞治療に使用される細胞には、遺伝子改変細胞、例えばTリンパ球(T細胞)、ナチュラルキラー(NK)細胞又は細胞傷害性Tリンパ球(CTL)、単球、顆粒球、正常な免疫細胞、及びその前駆体が含まれるが、これらに限定されない。本明細書で提供される胸部障害の処置のための方法は、追加の治療剤の投与又は治療を更に含む。
本明細書で使用される「改変細胞」は、疾患又は状態に関連する「標的抗原」分子を認識する及び/又は特異的に結合するように設計され、標的抗原分子に対する結合に際して、そのような分子に対する免疫応答等の応答をもたらす、少なくとも1つの組換え受容体を発現する遺伝的に操作された細胞である。組換え受容体は、例えば、「キメラ抗原受容体」(CAR)及び他の操作された及び疾患特異的な抗原受容体、例えば腫瘍特異的及びトランスジェニックT細胞受容体(TCR)を含む。
対象は、これまで様々な臨床試験において固形腫瘍の処置のため静脈内、腫瘍内、及び非経口的な注射を介して遺伝子改変細胞で処置されてきたにもかかわらず、そのような組成物での処置は、固形腫瘍に首尾よく移動し、浸潤し、急速に標的腫瘍細胞と接触する細胞の能力の制限に起因して、難題のままである(Guoら、J. Immunol. Res. 2016、Article ID. 3850839)。これは、組織によって実施される障壁機能、投与後の改変細胞の持続性が低いこと、並びに身体上及び代謝上の両方での悪条件の腫瘍微小環境に起因する可能性がある(Newickら、Molecular Therapy - Oncolytics. (2016) 3、16006)。その結果、細胞の抗腫瘍性細胞毒性が低いことが、しばしば観察される。改変細胞中への共刺激分子の封入は一部の制限を緩和することができるが、胸部障害の処置のより良好な方法が、より有益であり、満たされていない必要性として残されている。
細胞又は組成物が対象の少なくとも1つの胸部乳管(以下「胸部管」又は「管」)に経乳頭的に投与される、養子細胞治療の新規な方法が本明細書に開示される。ある態様において、養子細胞治療の投与の経路は、経乳頭である。
本明細書で使用される用語「経乳頭」及び「経乳頭的に」は、養子細胞治療に関する細胞が、***乳頭(mammary papilla)の乳首における乳管開口部(管開口部)を通して胸部の内側深部に達する、対象の少なくとも1つの胸部乳管の管腔に送達される、処置の方法を指す。
一態様において、経乳頭投与は、組成物が、乳首における管開口部を通して、少なくとも1つの胸部乳管に送達される、***乳頭の乳首への本開示の養子細胞治療組成物の適用を指す。胸部管は、管開口部を介して予防及び治療剤を受けるため比類なく適している。
別の態様において、経乳頭投与は、***乳頭の乳首における管開口部を介して胸部乳管の管腔に直接的に、養子細胞治療用の細胞の管内送達を指す。本発明の目的のために、用語「管内」及び「管内に」は、組成物が、乳首に適用されない、経乳頭送達を指す。本明細書に開示される経乳頭法が、対象の胸部における胸部乳管の自然のままの開口部を通して養子細胞治療のための細胞の送達を含むこと、及び本発明の目的のための管内送達が経乳頭送達の形態であることは当業者に理解される。本発明の有利な態様は、経乳頭送達が、典型的には対象の皮膚又は組織又は細胞層の故意の侵害を伴わないものである。
乳がん等の胸部障害は、典型的には、個々の乳管を起源とする(Wellings SR. Pathol. Res. Prac. 1980; 166:515-535；Love and Barsky. Cancer. 2004、101(9):1947-1957)。したがって、組換え受容体(例えば、CAR及び操作されたTCR)を発現する改変細胞等の細胞を、胸部乳管(胸部管)内の罹患した部位の近くに、限局的に送達することが非常に望ましい。局所性の有効で投与が簡単な治療を提供する、そのような細胞又はそのような細胞を含む組成物の経乳頭投与は、改変細胞を含む組成物に対する全身性の曝露を低下させることによって全身性の処置の副作用を除去する。これは、on-target-off-tumorの可能性/リスクを低下させるとの利益を追加する。管内投与による胸部管への局所送達は、より大規模な細胞の局所的な拡大、遊走時間の低下、及びより短い期間で罹患した組織により速くアクセスすることも可能とし、それによって細胞傷害性活性及び効能を改善する。
本明細書で使用される「胸部障害」は、胸部における任意の異常又は異常の配置を意味する。そのような異常は、増殖性、非増殖性、良性又は悪性であってもよい。胸部障害には、胸部の良性の病変(例えば、過形成)、乳首のパジェット病、葉状腫瘍、及び乳がんが含まれる。良性の胸部病変には、過形成、非定型性、導管過形成、小葉過形成、非定型導管過形成(ADH)、及び非定型小葉過形成(ALH)が含まれるが、これらに限定されない。癌性ではないが、ADH及びALHは、乳がんに対する素因の指標でありうる。
本明細書で使用される「乳がん」は、胸部細胞の任意の悪性腫瘍を意味する。乳がんは、前癌、早期段階のがん、非転移性がん、転移前がん、局所的に進行したがん、転移性がん、及び転移性のがんの段階を含む、乳がんの任意の段階であってもよい。幾つかのタイプの乳がんが存在する。例示的な乳がんには、導管上皮内癌(DCIS)、小葉上皮内癌(LCIS)、侵襲性(又は浸潤性)小葉癌(ILC)、侵襲性(又は浸潤性)導管癌(IDC)、微小浸潤性乳癌(MIC)、炎症性乳がん、ER陽性(ER+)乳がん、プロゲステロン受容体陽性(PR+)乳がん、ER+/PR+乳がん、ER陰性(ER-)乳がん、HER2+乳がん、三重陰性乳がん(すなわち、ER-/PR-/Her2-乳がん;「TNBC」)、腺様嚢胞癌(腺様嚢胞)癌、低グレード腺扁平上皮癌、髄様癌、粘液(又はコロイド)癌、乳頭癌、管状腺癌、化生性癌、又は微小乳頭癌が含まれるが、これらに限定されない。単一の乳がん腫瘍は、これらのタイプの任意の組合せ若しくは混合物であってもよい又は侵襲性及びインサイチューがんの混合物であってもよい。
DCISは、最も一般的な非侵襲性乳がんである。それは、胸部管を覆う細胞に関与する。DCISでは、細胞は、周囲の胸部組織へと管の壁を越えて伝播しない。5つのうち約1つの新しい乳がんのケースが、DCISとなる。幾つかのバイオマーカーは、DCISに関連する。例示的なバイオマーカーには、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、アンドロゲン受容体、Ki-67、サイクリンD1、サイクリンA、サイクリンE、p16、p21、p27、p53、Bcl-2、Bax、サバイビン、c-myc、Rb、VEGF、HPR1、HER1、HER2、HER3、HER4、CD10、SPARC、COX-2、基礎サイトケラチン、CK5/6、CK14、及びCK17、上皮細胞増殖因子受容体、Tn、ER+、及びc-kitが含まれるが、限定されない。DCISは、IDCに対する絶対的な前駆体ではないと言われている。DCIS細胞中で援助する特定のHGF及び線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)を分泌する、がん関連線維芽細胞(CAF)等のストローマ細胞の関与により、侵襲性となり、IDCへと進行する。
LCISは、前癌性の新生物である。それは、浸潤癌の素因の指標となりうる。LCISは、約15%のインサイチュー(導管又は小葉)乳がんを占めるのみである。LCISバイオマーカーには、E-カドヘリン、ER、PgR、c-erbB-2、p53及びKi-67が含まれるが、これらに限定されない。
IDCは、最も侵襲性の乳がんである。名前が示すように、IDCは、胸部管において始まる癌であり、次に周囲の脂肪性組織に侵入する。10例のうち約8例の侵襲性乳がんが、浸潤性導管癌である。IDCは、しばしば手術で処置され、癌性組織が切除され、放射線療法で処置される。加えて、免疫療法(例えば、タモキシフェン及びトラツズマブ(tratuzumab))と組み合わせた化学療法を、しばしば使用してIDCを処置している。腫瘍が4cmより大きい場合、根治的***切断術を実施してもよい。IDCに関するバイオマーカーには、炭水化物抗原、例えばTn、Tf、シアリル-Tn、ルイスx、ルイスa、ルイスy、及びガングリオシド、例えばGM3、GD3、9-0-アセチルGD3、9-0-アセチルGT3、N-グリコリ-GM3が含まれるが、これらに限定されない。
ILCは、胸部の小葉に発生し、周囲の組織に侵入するがんである。10の侵襲性乳がんのうち約1つは、ILCである。ILCは、手術で処置され、癌性組織が切除され、放射線療法で処置される。加えて、化学療法及び免疫療法の組合せ(例えば、タモキシフェン及びトラツズマブ)を、アジュバント治療として、しばしば使用してILCを処置している。がん関連線維芽細胞(CAF)によって放出される増殖因子及びサイトカインの援助で侵襲するIDCのように、ILCもまたCAFs-関連タンパク質FAP-α、FSP-1/S100A4、及びPDGFR-βによって援助される。
炎症性乳がんは、全ての乳がんの約1%から3%を占める。炎症性乳がんでは、がん細胞は、皮膚中のリンパ管を遮断し、胸部を赤らめ、温かみを感じさせる。罹患した胸部は、大きく又は硬く、柔らく又は痒くなりうる。炎症性乳がんは、化学療法、免疫療法、放射線療法、及び一部のケースでは、手術で処置される。
エストロゲン受容体陽性(ER+)乳がんは、がん性細胞の表面上のエストロゲン受容体の存在によって特徴付けられる。ER+がん細胞の増殖は、エストロゲンの利用可能性に関連する(ホルモン依存性又はホルモン感受性乳がん)。およそ、全ての乳がんの80%は、ER+乳がんである。ER+乳がんに対する治療の選択肢には、エストロゲンを遮断する化学療法剤(例えば、タモキシフェン)が含まれる。
三重陰性の乳がんは、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、及びHER2受容体が存在しないことによって特徴付けられ、診断された乳がんの約10%から20%で生じる。TNBCは非常に攻撃的であることがあり、対象には再発のリスクがある。典型的には、選択肢には、腫瘍免疫賦活薬化学療法(ただし、抗エストロゲン、例えばタモキシフェン又は抗HER2、例えばトラスツズマブではない)、続いて、手術、例えば腫瘍摘出術(lumpectomy)が含まれる。更に、TNBCは、高度に多様なグループのがんであり、独自の遺伝子発現を提示する少なくとも6種のTNBCサブタイプ、並びに2種のベーサルライク(BL1及びBL2)、免疫調節性(IM)、間葉性(M)、間葉系幹細胞様(MSL)、及び管腔性アンドロゲン受容体(LAR)サブタイプを含むオントロジーに分類される(Lehrmannら、J. Clin. Invest、2011、121(7)、2750-2767本明細書に参照によってその全体が組み込まれる)。突然変異及びマーカーは、TNBCサブタイプを特異的に標的にすることができるものが記載されている(同文献)。TNBCに対する追加のバイオマーカーには、上皮細胞増殖因子受容体、葉酸受容体-α、血管内皮増殖因子、c-Myc、C-kit及び基礎サイトケラチン、ポリ(ADP-リボース)ポリメラーゼ-1、p53、チロシナーゼキナーゼ、m-TOR、ヒートアンドショックタンパク質及びTOP-2Aが含まれるが、これらに限定されない。更に、ストローマ細胞(がん関連線維芽細胞(CAF)及び免疫細胞、例えば腫瘍関連マクロファージ(TAM)及び腫瘍関連好中球(TAN))周囲腫瘍は、細胞外マトリックスの沈着及び様々な繊維形成誘発性増殖因子、例えばTGFベータ、bFGF、及びがん細胞増殖、侵襲及び転移(例えば、上皮から間葉転換を促進することによって)に影響する他の因子、例えば線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)、EGF、HGF、MCP-1、CSF-1、VEGF、サイトカイン、例えばIL1、IL-8、TNFアルファ、酵素、例えばMM2、MMP7、MMP8、MMP9、MMP12、MMP13、及びCOX2の放出の増加により、治療薬浸透に対する障壁を生み出すことにおいて重要な役割を担っている。TAMは、Tレグ細胞の動員及び免疫抑制微小環境の生成を支持する、サイトカイン及びケモカイン(例えば、IL-10、TGF-ベータ、CCL17、CCL22、及びCCL24)を分泌させることによって抗腫瘍免疫応答を更に抑制する。
一部の実施形態において、対象の胸部障害は、乳がん、乳首のパジェット病、又は葉状腫瘍である。更に他の実施形態において、乳がんは、前癌、早期段階のがん、非転移性がん、転移前がん、局所的に進行したがん、又は転移性がんである。
他の実施形態において、対象は、導管上皮内癌(DCIS)、小葉上皮内癌(LCIS)、侵襲性(又は浸潤性)小葉癌(ILC)、侵襲性(又は浸潤性)導管癌(IDC)、微小浸潤性乳癌(MIC)、炎症性乳がん、ER陽性(ER+)乳がん、プロゲステロン受容体陽性(PR+)乳がん、ER+/PR+乳がん、ER陰性(ER-)乳がん、HER2+乳がん、三重陰性乳がん(すなわち、ER-/PR-/Her2-乳がん;「TNBC」)、腺様嚢胞癌(腺様嚢胞)癌、低グレード腺扁平上皮癌、髄様癌、粘液(又はコロイド)癌、乳頭癌、管状腺癌、化生性癌、及び微小乳頭癌からなる群から選択される乳がんを有する。
一部の実施形態において、対象は、持続性又は再発性疾患を有する、すなわち、化学療法(例えば、ゲムシタビン、タモキシフェン、トラスツズマブ等)又は放射線照射を含む、別の治療的介入で処置後にこれを有する。他の実施形態において、対象は、別の治療薬に対して耐性になる。本明細書で使用される用語「耐性」は:(a)デノボ耐性、すなわち、処置の最初から治療又は治療手段(therapeutic)に対する非応答性、及び(b)獲得耐性、すなわち、受容体(又は治療に応じてリガンド)の発現を継続する間、初期応答性又は治療依存的な増殖/刺激増殖後の治療又は治療手段に対する非応答性の2つのクラスの耐性を指す。
一部の実施形態において、対象は、タモキシフェン耐性又はタモキシフェン不応性である。本明細書で使用される用語「タモキシフェン不応性」は、タモキシフェンで少なくとも2日間毎日投薬され、15nM未満(例えば、20nM未満、25nM未満、又は30nM未満)の血漿エンドキシフェンのレベルを有する対象を指す。タモキシフェンに対する獲得耐性は、早ければ3ヶ月から1年から遅ければ5から10年で発生しうる。一態様において、経乳頭法の処置は、前癌、早期段階のがん、非転移性がん、転移前がん、及び局所的に進行したがんの処置のために特に望ましい。別の態様において、経乳頭法の処置は、転移性がんの処置のためにも適切である。
したがって、胸部障害を有する又は有するリスクがある対象の処置のための養子細胞治療の経乳頭法が、初めて本明細書に開示される。本明細書に開示される細胞又は組成物は、対象の胸部乳管の管腔に投与される。新規な態様において、本明細書に開示される経乳頭法の処置は、非侵襲性又は最小の侵襲性であり、典型的には皮膚又は組織障壁の破壊を伴わない。代わりに、細胞は、典型的にはDCIS等の乳癌の起源である、***乳頭の乳首中の対象自身の自然のままの管開口部を介して対象に投与される。
別の新規な態様において、本発明は、胸部乳管中の腫瘍の先端表面に本明細書に開示される細胞又は組成物を送達することを包含する。胸部において、胸部管は、上皮細胞の二重層を有し;内層は、基底と接触する、外側筋上皮細胞層によって周囲を囲まれる極性を示す管腔細胞から作られる。胸部上皮細胞の先端表面は、母乳が妊娠期間中に分泌される管の中心腔に面する。側底側ドメインは、隣接する管腔細胞並びに筋上皮細胞及び基底膜と接触する(Chatterjee and McCaffrey. Breast Cancer: Targets & Therapy. 2014:6 15-27)。胸部管の管腔に投与される細胞は、胸部又は腫瘍組織へと先端部を通る管の管腔(及び/又は微管腔)内に移動することができる。したがって、一部の実施形態において、改変細胞は、側底側からの攻撃よりも、腫瘍に対して先端からの攻撃でアプローチして処理する。本明細書に開示される改変細胞による先端からの攻撃は、転移前がんの処置のため特に望ましい。現行の方法の処置は、典型的には、CAR-T細胞等の養子細胞治療の注射及び注入、一般には静脈内又は腫瘍内での非経口的な投与を伴う。当技術分野において知られている送達の追加の方法には、皮下、鼻腔内、腹腔内、肺内、動脈内、筋肉内、及び腹腔内等が含まれる(例えば、US2016/0045551;米国特許第9,365,641号、US2016/0206656を参照されたい)。これらのケースの各々では、導入された細胞は、長距離にわたって移動し、罹患した組織に対して接触するのに十分に長い期間で生存することが必要とされる。これらの方法でのアプローチは、腫瘍の側底側からの攻撃である。
胸部障害を有する又は有するリスクがある対象の胸部乳管に対する細胞又は改変細胞を含む組成物を投与する経乳頭法が、本明細書に開示される。一部の実施形態において、細胞又は組成物は、1つの胸部乳管に投与される。他の実施形態において、本明細書に開示される細胞又は組成物は、2から5の胸部管、4から8の胸部管、又は7から11の胸部管に投与される。
細胞又は細胞を含む組成物は、当技術分野において知られている任意の方法によって胸部管に経乳頭的に送達されてもよい。これらには、シリンジ/針(Krauseら、J. Vis. Exp. 2013; (80): 50692);カニューレ、カテーテル、プローブ、並びに米国特許第6,413,228号;同6,689,070号;同6,638,727号、特許出願PCT/US2015/010808)に開示されるもの、持続放出性カプセル及び封入装置等を使用する注射が含まれるが、これらに限定されない。
一部の実施形態において、非限定的な例として、本明細書に開示される細胞又は組成物は、対象の胸部乳管に投与されてもよく、(a)装置の処置チャンバー内に含有される、改変細胞を含む組成物を、胸部の乳首と接触させる工程;及び(b)陽圧を組成物に適用する工程を含む。一部の実施形態において、組成物は、陽圧をかけて胸部管に強制投入される。好ましくは、組成物は、1つ又は複数の胸部管に強制投入される。他の実施形態において、組成物は、2から5の胸部管、4から8の胸部管、又は7から11の胸部管に強制投入される。
例えば、米国特許第6,413,228号は、管液を収集し、管に洗浄液を注入する能力がある管アクセス装置を開示する。そのような装置は、本発明の細胞又は組成物の経乳頭送達に関する本開示の目的に適切に適合させる又は構成することができる。
一部の実施形態において、装置は、カニューレである。
管内投与の代替方法として、小型ポンプが、管又は管領域に対して改変細胞の緩徐で連続的な投与のための管へのアクセスを有する乳首の表面に取り付けられてもよく、例えば、ポンプは、その中に改変細胞を投与し、管の残部への細胞の拡散を引き起こすため乳管洞に取り付けられてもよく或いはポンプは、管へのアクセスを有する乳首表面に取り付けられてもよい。乳首表面で取り付けられるポンプは、例えば、タック(又はトップ若しくはタック部を有する円筒形部分及び処置を必要とする又は処置を必要とするリスクを有する管に伸長する部分を有する乳首表面上の残部)のように造形することができる。ポンプ機構は、例えば、Johnson&Johnsonによって買収されたAlza Corpによって製造されるDuros(登録商標)浸透(マイクロ)ポンプ(Viadur)、IntelliDrug、Alzet(登録商標)(Durect Corp.)、Ivomec SR(登録商標)ボーラス等(Herrlichら、Advanced Drug Delivery Reviews、2012、pages 1617-1626)を含むことができる。
浸透ポンプはまた、実質的に、米国特許第5,531,736号、米国特許第5,279,608号、米国特許第5,562,654号、米国特許第5,827,538号、米国特許第5,798,119号、米国特許第5,795,591号、米国特許第4,552,561号、又は米国特許第5,492,534号に記載のポンプのように、胸部の管への投与に関して、例えば、管(例えば、乳管洞)への配置に関して、又は乳首表面における配置に関して、サイズ及び容量の適切な修正を施して、組み立てられ又は構成されてもよい。(管にアクセスする)チップは、乳首表面上の様々な位置の管を適応させるため回転させることができてもよい。単一のタックヘッドポンプは、例えば、胸部中に2個以上の管がアクセスさせる必要がある、特定の管にアクセスするため、タックヘッド下に配置される1つ又は複数のチップを有することができる。そのように構成され、管内投与のため細胞を含む適切に製剤化された組成物を負荷したポンプは、記載されている通りに改変細胞を投与してもよいが、胸部管における前癌又はがん状態の処置の適切な治療目的のための細胞以外の剤も含有及び投与してもよい。おそらく、ポンプは、胸部に位置する全ての管に投与するため、一部サイズ及び容量を変更して、構成してもよい。
細胞封入装置は、別の魅力的な方法であり、マイクロカプセル及びマクロ封入装置が含まれる。自己フォールディング免疫保護細胞封入装置(Self-folding immune-protective cell encapsulation device)が開発されており、この装置では、細胞が、栄養及び治療手段の選択的な浸透を可能にする合成の半透性ナノ多孔性膜で、それらの周囲が囲まれることによって免疫単離される。そのような封入装置には、袋、繊維、ビーズ、及び細胞が収容される半透性材料から作られる任意の装置が含まれる。そのような装置は、養子細胞治療のため構成されてもよい。例えば、装置は、管内で細胞を放出するように、生分解性材料で調製することができる。
本発明の目的のため有用な装置が移植されてもよい。例えば、Stephanらは、養子細胞治療のためのバイオポリマーインプラントを記載している(Stephanら、Nature Biotechnology、2015、33、97-101)。ある態様において、カニューレ、カテーテル、マイクロカテーテル、ビーズ、封入装置等の移植可能な装置が、本明細書に提供される。移植可能な装置は、例えば、患部組織の近くに本発明の細胞及び組成物を放出し及び正常細胞に対するそれらの曝露を低下させるように構成することが可能である。
別の態様において、本明細書に開示される細胞又は組成物の経乳頭送達は、胸部に対する電流の適用を伴うイオン泳動によって援助され得、これにより胸部の管への及び/又は管内の細胞の遊走が援助される。
前処理
免疫枯渇(例えば、リンパ球枯渇)治療で対象を前処理することにより、投与された細胞の拡大がもたらされる。例えば、T細胞は、拡大し、養子細胞治療の効果を改善できる記憶表現型を獲得することができる(ACT)。リンパ球枯渇剤、例えばシクロホスファミド、シクロスポリン、フルダラビン、ベンダムスチン、レナリドマイド、ポマリドミド、ゲムシタビン、BTK阻害剤、例えばイブルチニブ、腫瘍溶解性ウイルス、例えば腫瘍溶解性アデノウイルス、その組合せでの前処理は、導入された細胞の応答性及び/又は持続性を改善することを含む、細胞治療において導入された腫瘍浸潤性リンパ球(TIL)細胞の効能の改善に効果がある。「サイトカインシンク」として知られている現象の排除、Tレグ細胞の抑制的な影響の根絶並びにAPC活性化及び利用可能性の増強により、IL-7及びIL-15等の恒常性サイトカインに対するアクセスを増加させることが、このパラダイムに関与する機構の根底にあると思われる。例えば、Dudleyら、2002 Science、298、850-54;Rosenbergら、Clin Cancer Res 2011、17(13):4550-4557を参照されたい。同様に、CAR-T細胞の関連において、幾つかの研究は、リンパ球枯渇剤、最も一般にはシクロホスファミド、フルダラビン、ベンダムスチン、又はその組合せを、時には低線量照射と併せて、導入している。Hanら、Journal of Hematology & Oncology 2013、6:47;Kochenderferら、Blood 2012; 119: 2709-2720;Kalosら、Sci Transl Med 2011、3(95):95ra73;臨床試験研究記録NCT02315612;NCT01822652を参照されたい。そのような前処理は、治療の効能を鈍らせる可能性がある1つ又は複数の様々な転帰のリスクを低下させるとの目標をもって行われてもよい。これらには、T細胞、B細胞、NK細胞が、恒常性及び活性化サイトカイン、例えばIL-2、IL-7、及び/又はIL-15に関してTILと競合するサイトカインシンク;制御性T細胞、NK細胞、又は免疫系の他の細胞によるTILの抑制;腫瘍微小環境の負の調節因子の影響が含まれる(Muranskiら、Nat Clin Pract Oncol. 2006 December; 3(12): 668-681)。
したがって、一部の実施形態において、方法には、前処理剤、例えばリンパ球枯渇又は化学療法剤、例えばシクロホスファミド、シクロスポリン、フルダラビン、ベンダムスチン、レナリドマイド、ポマリドミド、ゲムシタビン、BTK阻害剤、例えばイブルチニブ、腫瘍溶解性ウイルス、例えば腫瘍溶解性アデノウイルス、又はその組合せを、第一の又は引き続く用量の前に、対象に投与する工程が含まれる。例えば、対象は、第一の又は引き続く用量の、少なくとも2日前、例えば少なくとも3、4、5、6、又は7日前に前処理剤を投与されてもよい。一部の実施形態において、対象は、第一の又は引き続く用量の、7日以前、例えば6、5、4、3、又は2日以前に、前処理剤を投与される。
本明細書に記載されるリンパ球枯渇剤は、0.5g/m2から5g/m2の間、例えば1g/m2から4g/m2、1g/m2から3g/m2、又は2g/m2から4g/m2の間のリンパ球枯渇剤が対象に投与されてもよい。一部の態様において、対象は、2g/m2シクロホスファミド、2g/m2のシクロホスファミドを投与される。一部の実施形態において、対象は、20mg/kgから100mg/kgの間、例えば40mg/kgから80mg/kgの間の用量のシクロホスファミドで前処理される。一部の態様において、対象は、60mg/kgのシクロホスファミドで前処理される。投与されるリンパ球枯渇剤の量は、主治医によって決定される。
一部の実施形態において、リンパ球枯渇剤がフルダラビンを含む場合、対象は、1g/m2から100g/m2の間、例えば10g/m2から75g/m2、15g/m2から50g/m2、20g/m2から30g/m2、又は24g/m2から26g/m2の間の用量でフルダラビンを投与される。一部の例において、対象は、25g/m2のフルダラビンを投与される。一部の実施形態において、フルダラビンは、単回用量で投与することができる又は毎日、1日おき又は3日おきで与える等の複数回の用量で投与することができる。例えば、一部の例において、フルダラビン等の剤は、1から5回の間又は約1から5回の間、例えば3から5回の間又は約3から5回の間で投与される。一部の実施形態において、そのような複数用量は、同日に投与され、例えば毎日1から5回又は3から5回投与される。
一部の実施形態において、リンパ球枯渇は、1つ又は複数のリンパ球枯渇剤で行われてもよい。例えば、対象は、-7日及び-6日に1時間にわたって静脈内にシクロホスファミド及び-7日から-3日に30分間にわたって追加で静脈内にリン酸フルダラビンを受ける。次に、0日に、対象は、本明細書に開示される細胞又は組成物を投与される。
投薬
細胞及び組成物の投薬のタイミング及びサイズは、毒性の転帰のリスクを低下させる若しくは最小化する及び/又は効能を改善するため、一般的に設計されて、例えば、細胞に対する対象のより速い及び増加した曝露(例えば、長期にわたる)が提供される。適切な用量は主治医によって決定されうるが、投与の量及び頻度は、患者の状態、年齢、体重、腫瘍サイズ及びステージ、及び患者の疾患の重症度等の因子によって決定される。
至適な用量及び投薬レジメンは、疾患の徴候について患者をモニターすること及びそれに応じて処置を調整することによって医学の分野の当業者によって容易に決定されうる。細胞又は組成物は、これらの用量で複数回投与されうる。したがって、方法は、ある期間にわたる単回用量又は複数回用量又は、注入による等の持続的な用量を伴っていてもよい。一部の実施形態において、用量は、単回の単位用量であってもよい。他の実施形態において、単回用量は、分割単位用量であってもよい。本明細書で使用される用語「分割単位用量」は、分割されるため、それが、1日超にわたるものを含む、1日の間に1回超で投与される、単位用量を指す。本発明の目的のための分割単位用量は、単一であると考えられるので、すなわち、一単位用量である。用量を分割する例示的な方法には、25%の用量を最初の日に投与する工程及び残りを次の日に投与する工程が含まれる。別の実施形態において、単位用量は、2つに分割され得、各50%は2連続日で送達される。更に別の実施形態において、分割単位用量は、2日おきに与えてもよい。更に別の実施形態において、単位用量は、3連続日に等しく投与される3個に分割されてもよい。
本明細書に開示される方法は、1つ又は複数の細胞の連続的な用量を第一の用量を受けていてもよい対象の胸部管に投与する工程、及び/又は第一の及び1つ又は複数の引き続く用量を投与する工程を伴う。用量は、特定の量で、特定のタイミングスケジュール及びパラメータに従って投与される。
別の態様において、第一の用量は経乳頭に投与され、任意の引き続く用量は、注射による及び注入による経乳頭、例えば静脈内又は皮下注射、眼内注射、眼周囲注射、網膜下注射、硝子体内注射、経中隔注射、強膜下注射、脈絡膜内注射、眼房内注射、結膜下注射、結膜下注射、テノン下注射(sub-Tenon's injection)、眼球後注射、球周囲注射、又は後側強膜近傍送達(posterior juxtascleral delivery)を含む、任意の適切な手段によって投与される。一部の実施形態において、それらは、非経口、肺内、及び鼻腔内、並びに、必要に応じて、局所処置、病巣内投与によって投与される。非経口的な注入には、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、胸腔内、頭蓋内、又は皮下投与が含まれる。
一部の実施形態において、方法は、第一の用量の細胞を投与し、それによって疾患負担を低下させる工程を一般的に伴う。これは、第一の用量に関する特定の時間枠の間に投与される引き続く用量の細胞又は第一の用量を受けた対象に対する引き続く用量の投与が続いてもよい。一部の実施形態における第一の用量は、相対的に低い。投与される細胞の数及び細胞の投薬のタイミングは、例えばCRS、MAS、TLS、神経毒性等の毒性の可能性又は度合を低下させる等の1つ又は複数の転帰を改善するよう設計される。
一部の実施形態において、数を増加させた細胞の引き続く用量の投与(したがって、第一/初期用量よりもより高用量)を伴う方法が本明細書に開示される。
投薬レジメンが複数回用量を伴う場合、各用量は毎日、1日おき、2日、3日、5日、7日、14日、15日、28日おき、毎月、四半期おき、6月おき、毎年投与されうる。
一部の態様において、初期用量後の用量のタイミングは、初期(第一)用量の開始から次の用量の開始まで見積られる。他の実施形態において、初期用量後の投薬のタイミングは、初期(第一)用量の完了から見積られる。
本発明は、分割単位用量でありうる初期用量、続いて、その後に投与される第二の用量を包含する。一部の実施形態において、第二の又は引き続く用量は、分割単位用量でありうる。非限定的な例として、分割単位用量は3日にわたって投与されうる及び第二の単位用量はまさに次の日に投与される又は1年後に投与されうる。初期用量は、対象が細胞治療の投薬を前に決して受けていないこと又は更に対象が同じ組換え受容体を発現する又は同じ抗原を標的とする同じ細胞の投薬を前に受けていないことを示唆することによって、そのような投薬を必要とする対象に関して、何らかの制限を設けることを意図している。
一般に、本明細書に記載される改変細胞等の細胞を含む細胞又は組成物は、1×103から5×108改変細胞/kg体重、0.5×103から1×107改変細胞/kg体重、1×104から0.5×106改変細胞/kg体重、0.5×104から1×106改変細胞/kg体重、1×105から0.5×106改変細胞/kg体重の(それぞれの端点を含めた)範囲の単位用量で投与されうる。第一の用量は、1×103細胞未満/kg、0.5×104細胞未満/kg、1×104細胞未満/kg、0.5×105細胞未満/kg、1×105細胞未満/kg、0.5×106細胞未満/kg、1×106細胞未満/kg、0.5×107細胞未満/kg、1×107細胞未満/kg、0.5×108細胞未満/kg、1×108細胞未満/kg、5×108細胞未満/kgであってもよい。
一部の態様において、第一の用量は、1×103細胞未満/kg、0.5×104細胞未満/kg、1×104細胞未満/kg、0.5×105細胞未満/kg、1×105細胞未満/kg、0.5×106細胞未満/kg、又は1×106細胞未満/kg等の低用量である。少なくとも一部の実施形態において、第一の用量は、1×105細胞未満/kgである。
他の実施形態において、第一の用量は、0.5×105細胞超/kg、1×105細胞超/kg、0.5×106細胞超/kg、1×106細胞超/kg、0.5×107細胞超/kg、1×107細胞超/kg、0.5×108細胞超/kg、1×108細胞超/kg、又は5×108細胞超/kg等の高用量である。
一部の実施形態において、例えば、毒性及び/又は疾患負担のリスクが低く決定される場合、第一の用量は、例えば、0.5×105細胞超/kg、1×105細胞超/kg、0.5×106細胞超/kg、1×106細胞超/kg、0.5×107細胞超/kg、1×107細胞超/kg、0.5×108細胞超/kg、1×108細胞超/kg、及び5×108細胞超/kg等の相対的に高用量であってもよい。そのような細胞は、1つ又は複数の組換え受容体、例えばCAR又は操作されたTCRを発現する改変細胞であってもよい。そのような改変細胞は、T細胞、NK細胞、CTL、単球、顆粒球、又はその前駆体であってもよい。少なくとも1つの実施形態において、第一の用量は、相対的に高用量、例えば、1×107細胞超/kg体重であってもよい。
一部の実施形態において、例えば、毒性及び/又は疾患負担のリスクが高く決定される場合、第一の用量は、1×103細胞未満/kg、0.5×104細胞未満/kg、1×104細胞/kg、0.5×105細胞未満/kg、1×105細胞未満/kg、0.5×106細胞未満/kg、及び1×106細胞未満/kg等の相対的に低用量の細胞であってもよい。そのような細胞は、1つ又は複数の組換え受容体、例えばCAR又は操作されたTCRを発現する改変細胞であってもよい。そのような改変細胞は、T細胞、NK細胞、CTL、単球、顆粒球、又はその前駆体であってもよい。少なくとも1つの実施形態において、第一の用量は、相対的に低用量、例えば、1×105細胞未満/kg体重であってもよい。
一部の実施形態において、第一の用量は、疾患負担を低下させることに有効であるため十分に大きい。一部の実施形態において、第一の用量は、疾患のインビボ拡大及び減量させることに有効であるため十分に大きい。少なくとも1つの実施形態において、第一の用量は、腫瘍負担を低下させるため十分に大きい。別の実施形態において、第一の用量は、腫瘍サイズを低下させる。
一部の実施形態において、数及び/又は濃度は、キメラ受容体を発現する改変細胞の数を指す。他の実施形態において、数及び/又は濃度は、投与される全ての細胞の数を指す。
一部の実施形態において、第一の用量が相対的に高い場合、引き続く用量は、第一の用量よりも低くてもよい。他の実施形態において、第一の用量が相対的に低い場合、引き続く用量は、第一の用量よりも高くてもよい。更に他の実施形態において、初期用量に引き続く用量は、進行性に高い用量であってもよい。更に他の実施形態において、第二の用量は初期用量より高い及び引き続く用量は第二の用量と同じままである。更なる実施形態において、第一の用量が相対的に高い場合、引き続く用量は、進行性により低い用量であってもよい。
副作用及び毒性の転帰
キメラ受容体を発現する改変細胞での処置等の養子細胞治療の投与は、重篤な毒性の転帰又は副作用、例えばサイトカイン放出症候群(CRS)、マクロファージ活性化症候群(MAS)、腫瘍崩壊症候群(TLS)、神経毒性、及び/又は投与される細胞及び/又は組換え受容体に対する宿主免疫応答を誘発しうる(Bonifantら、Mol. Ther. Oncolytics (2016) 3、16011)。CRSの症状、例えば発熱及び増加CRPタンパク質レベルは、第一の用量後すぐ数時間以内に現われ、サイトカイン、例えば腫瘍壊死因子アルファ(TNFα)、IFNγ、IL-1β、IL-2、IL-6、IL-8、及びIL-10の発現の増加を伴う。処置には、抗IL-6処置が一般的に含まれる。
一部の態様において、初期用量及び/又は引き続く用量のサイズは、例えば、化学療法、疾患負担、腫瘍負担、バルクサイズ又は度合、程度及び転移のタイプ、段階並びに投与される細胞及び/又は組換え受容体に対するCRS関連、MAS関連、TLS関連、神経毒性関連等の毒性副作用の段階及び見込み及び/又は宿主免疫応答関連の転帰に関する、処置前の対象の応答等の1つ又は複数の判定基準に基づき決定される。対象の疾患負担が大きい場合、対象は、低用量の改変細胞を含む組成物を投与されてもよい。対象の疾患負担が低い場合、対象は、大用量の改変細胞を含む組成物を投与されてもよい。更に、用量は、腫瘍負担に応じて変動しうる。
ある態様において、本明細書に開示される経乳頭法は、細胞曝露を長期にわたって増加させて、毒性の転帰が低下させられる。高用量の初期投与は、高い疾患負担、例えば、高い腫瘍負担を有する対象に高い効能を必ずしももたらす必要がない。高用量はまた、投与された細胞の持続と解釈する必要がない。本明細書に開示される経乳頭法は、毒性の転帰のリスクを低下させる及び/又は効能を改善することを狙いとする、他の方法に対して利点を提供する。
一部の実施形態において、方法には、標的抗原の存在下で拡大し、疾患負担を低下させうる及び/又は毒性の転帰を低下させうるCAR等の組換え受容体を発現する改変細胞の初期用量を投与する工程が含まれる。そのような拡大は、胸部管若しくは小葉中の局所にあってもよい又は患部組織の近くにあってもよい。対象の状態は、初期用量の投与後にモニターすることができる。
一般的には、引き続く用量は、第一の用量(それぞれの端点を含める)の開始後の7日から28日(それぞれの端点を含める)の間に投与されてもよい。例えば、第一の又は前の用量の開始後少なくとも7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、若しくは27日又は第一の又は前の用量の開始後14又は15日若しくは21日超である。一部の実施形態において、引き続く用量のタイミングは、副作用又は毒性の転帰(例えばCRS、MAS、TILS、神経毒性、宿主免疫応答(体液性又は適応性)等)のリスクによって決定される。引き続く用量のタイミングは、1つ又は複数の症状、副作用、毒性転帰、及び/又は宿主免疫応答、並びにそのような症状、副作用、毒性の転帰、宿主免疫応答等の許容されるレベルの存在をモニター及び/又は評価することによって決定される。対象は、そのような症状、副作用、毒性の転帰、宿主免疫応答等が、許容されるレベルになった後に引き続く用量が投与される。一部の実施形態において、対象が第一の用量に対して宿主免疫応答を起こす前に或いは宿主免疫応答が検出可能である又は特定のレベル、度合若しくは段階に達する前に引き続く用量が投与されてもよい。一部の実施形態において、宿主免疫応答(体液性又は適応性)は、第一の用量の改変細胞後の28日、35日、又は42日前に検出可能ではない。他の実施形態において、引き続く用量は、第一の用量若しくは前の用量後の28日内若しくは35日内に又は第一の用量若しくは前の用量の開始後の24、25、26、又は27日前に投与される。
一部の実施形態において、第一の用量は、疾患負担を低下させるのに十分な量で細胞を含み、引き続く用量は、対象中のCRSの指標である因子の血清レベルが、第一の用量の直前に指標の血清レベルの10倍以下又は25倍以下であり、及び/又は、CRS関連転帰が、そのピークレベルに達し、第一の用量の投与後に減退を始めた後の時点で、対象が、第一の用量の改変細胞によって発現される組換え受容体に対して特異的な検出可能な適応性宿主免疫応答を示さない場合に、投与される。
細胞曝露及び持続
一部の実施形態において、用量の量及び/又はタイミングは、例えば、長期にわたっての、それらの拡大及び/又は持続によって、細胞に対する対象の曝露を促進するため設計される。一部の実施形態において、本明細書に提供される経乳頭法は、罹患した胸部組織に浸潤する遊走期間を低下させる。一部の実施形態において、本明細書に提供される経乳頭法は、投与された細胞又は組成物に対する対象の曝露を増加させる及び/又は養子細胞治療におけるそれらの効能及び治療転帰を改善する。一部の態様において、改変細胞に対するより大規模及びより速い曝露は、他の方法と比較して処置の転帰を改善する。そのような転帰には、患者生存及び緩解及び/又は毒性の転帰の低下が含まれうる。
ある態様において、改変細胞は、造影剤、例えばガドリニウムベース剤、例えばガドリニウムキレート、ガドリニウムフラーレノール(fullerenol)、超常磁性酸化鉄ナノ粒子(SPION)、19Fパーフルオロカーボンナノ粒子、及び他の磁気レポーター遺伝子、例えば金属タンパク質ベースMRIプローブでタグを付けられてもよい。これにより、改変細胞遊走の追跡及び改変細胞の局在化が可能になる。一部の実施形態において、改変細胞は、造影剤、例えばガドリニウムキレート、超常磁性酸化鉄ナノ粒子(SPION)、19Fパーフルオロカーボンナノ粒子、又は他の磁気レポーター遺伝子、例えば金属タンパク質ベースMRIプローブでタグを付けられている。少なくとも1つの実施形態において、造影剤は、ガドリニウムキレートである。ガドリニウムキレートは、実験的な細胞MRI研究において細胞を標識するため使用されている、臨床的に承認された造影剤である。それらは、エレクトロポレーションによる方法等、文献において知られている方法によって細胞に負荷されてもよい。
一部の実施形態において、第一の用量後及び/又は引き続く用量後に対象に組換え受容体(例えば、CAR)を発現させる細胞の存在及び/又は量が、検出される。組換え受容体を発現する細胞の存在及び/又は量は、当技術分野において知られている任意の方法によって検出されうる。例えば、検出は、定量的PCR(qPCR)アッセイ又は次世代シークエンシング法によって、1マイクログラムのDNA当たりの受容体をコードするDNA又はプラスミドのコピーを又は1マイクロリットルの試料(例えば、PBMCの総数当たりの、血液、血清、乳首吸引液)当たり改変細胞の数として又は組換え受容体を発現する改変細胞を対象とするELISA等の細胞ベースアッセイによって測定してもよい。一部の実施形態において、少なくとも50、少なくとも100、少なくとも500、少なくとも1×103、少なくとも0.5×104、少なくとも1×104、少なくとも0.5×105、少なくとも1×105、少なくとも0.5×106、少なくとも1×106又は少なくとも1×107、少なくとも1×108細胞が検出可能である。
一部の実施形態において、引き続く用量後に及び/又は第一の用量の投与後に、方法によって対象において受容体(例えば、CAR)を発現する細胞の持続性は、当技術分野において知られている他の経路の送達による比較投与によるものと比較して、より大きい。一部の実施形態において、引き続く用量後に及び/又は第一の用量の投与後に、方法によって対象において受容体(例えば、CAR)を発現する細胞の持続性は、代替の投薬レジメンによって投与されるものと比較して、より大きい。一部の実施形態において、胸部組織(例えば、患部組織)に投与された細胞の遊走及び/又は浸潤は、MRIスキャンによって又は***切除術又は免疫組織化学による手術後の腫瘍摘出術による胸部組織の切除によって検出されうる。
別の態様において、投与された細胞に対する対象の曝露の増加には、吸引又は管洗浄によって収集された乳首液中に存在する細胞のフローサイトメトリー定量によって測定される細胞のインビボ拡大の増加が含まれる。乳首吸引液又は管洗浄液の収集のための装置(例えば、Forecyte(登録商標)及びFullcyte)及び方法が、公開及び記載されている(US6,689,070;US6,585,706)。
一部の実施形態において、改変細胞は、第一の用量の投与後、少なくとも15、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、若しくは60日以上、又は少なくとも4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、21、22、23、24週の引き続く用量の投与後、胸部管において検出可能である。
細胞
本発明の目的に対する養子細胞治療に使用されうる細胞には、遺伝的に操作された細胞(改変細胞)及び無改変の免疫細胞、例えば末梢血単核細胞(PBMC)、T細胞、NK細胞、CTL、TIL、その前駆体等が含まれる。
本明細書で使用される「改変細胞」は、疾患又は状態(例えば、胸部障害)に関連する標的分子を認識する及び/又は特異的に結合するように設計され、そのような分子に対する結合に際して、そのような分子に対する免疫応答等の応答をもたらす、少なくとも1つの組換え受容体を発現する遺伝的に操作された細胞である。
本発明の目的のための改変細胞は、一般的に真核生物細胞、例えば哺乳動物細胞である。典型的には、哺乳動物細胞は、ヒト細胞である。一部の実施形態において、細胞は、血液、骨髄、リンパ又はリンパ様器官に由来する。細胞は、典型的には、免疫系、例えば適応性又は先天免疫の免疫系からの細胞である。そのような細胞は、Tリンパ球(T細胞)、ナチュラルキラー細胞(NK細胞)、腫瘍浸潤性リンパ球(TIL)、細胞傷害性リンパ球(CTL)、及びその前駆体を含む、リンパ様細胞又は骨髄球性細胞であってもよい。細胞は、幹細胞、例えば、誘導性多能性幹細胞(iPSC)を含む、多分化能性及び多能性幹細胞であってもよい。細胞は、典型的には初代細胞、例えば、対象から単離された細胞及び/又は対象及び凍結物から単離された細胞である。
改変細胞には、1つ又は複数のT細胞又は他の細胞タイプのサブセット、例えば全T細胞集団、CD4+、CD8+T細胞及びその亜集団が含まれうる。T細胞の亜集団及び/又はCD4+及び/又はCD8+T細胞の亜集団には、ナイーブT細胞、エフェクターT細胞、メモリーT細胞及びそのサブタイプ(例えば、幹細胞メモリーT細胞、セントラルメモリーT細胞、エフェクターメモリーT細胞、又は最終分化型メモリーT細胞)、腫瘍浸潤性T細胞(TIL)、未成熟T細胞、成熟T細胞、ヘルパーT細胞(例えば、TH1、TH2及びTH3、TH17、TH19、TH22細胞、濾胞性ヘルパーT細胞)、細胞傷害性T細胞(CTL)、粘膜関連インバリアントT細胞(MAIT細胞)、天然に存在する及び適応性制御性T細胞(Tレグ)、アルファ/ベータT細胞及びデルタ/ガンマT細胞が含まれる。改変細胞には、TCR欠損型T細胞も含まれうる。
細胞の亜集団は、分化、拡大、再循環、局在化、及び/又は持続能力、抗原特異性、特定の器官又は区画中の存在、マーカー又はサイトカイン分泌プロファイル、及び/又は分化の度合に関する機能、活性化、状態、成熟度、潜在性によって定義されてもよい。一部の実施形態において、改変細胞は、胸部組織に局在化する傾向があるものを含む。
一部の実施形態において、改変細胞は、T細胞である。他の実施形態において、改変細胞は、CTLである。更に他の実施形態において、改変細胞は、ナチュラルキラー(NK)細胞である。更に他の実施形態において、細胞は、単球又は顆粒球、例えば骨髄球性細胞、マクロファージ、好中球、樹状細胞、マスト細胞、好酸球、及び/又は好塩基球である。改変細胞はまた、本明細書に開示される任意の細胞の前駆体細胞であってもよい。一部の実施形態において、改変細胞は、T細胞、NK細胞、CTL、単球、及び顆粒球の前駆体細胞である。
対象に関連して、経乳頭的に投与される改変細胞は、自己、異種(アロジェニック)、又はキセノジェニックであってもよい。本明細書に使用される「自己」は、その材料が後に再導入される個体と同じ個体に由来する、任意の材料(例えば、細胞)を指す。本明細書に使用される「異種」及び「アロジェニック」は、その材料が導入される個体と同じ種の異なる動物に由来する、任意の材料(例えば、細胞)を指す。2以上の個体は、1つ又は複数の座位での遺伝子が同一ではない場合、互いにアロジェニックであるといえる。一部の態様において、同じ種の個体からのアロジェニック材料は、抗原的に相互作用するため遺伝的に十分に異なりうる。一部の細胞は、健常ドナーから得られる「規格の」又は「普遍的な」ドナー細胞でありうる(Torikaiら、Blood 2012 119:5697-5705)。本明細書に使用される「キセノジェニック」は、異なる種の動物に由来する、材料(例えば、細胞)を指す。
一部の実施形態において、細胞は、細胞株、例えばT細胞株及びNK細胞株に由来してもよい。一部の実施形態における細胞は、ブタ、マウス、ラット、及び非ヒト霊長類等からのキセノジェニック供給源由来である。他の実施形態において、細胞は、臍帯血に由来してもよい。
細胞は、循環血液から単離され、例えば、非親和性ベース技術、例えばアフェレーシス又は白血球分離及び密度ベース細胞分離法(例えば、パーコール又はフィコール勾配遠心分離)、親和性又は免疫親和性ベース技術、例えば、1つ又は複数の特異的な分子(例えば細胞表面分子)の細胞における発現又は存在による分離によって採取される。親和性ベースの分離のケースでは、分離は、ポジティブ選択(そのパートナーに対して結合する細胞が保持される)又はネガティブ選択(抗体又はその結合パートナーに対して結合していない細胞が保持される)であってもよい。後者は、マーカーに対する抗体が利用できない場合に有用である。分離は、100%の濃縮又は特定の細胞集団の除去をもたらす必要はない。1つ又は複数回の分離を、所望の濃縮集団を得るため行ってもよい。磁気ビーズ(例えばDYNABEADS又はMACSビーズ)とコンジュゲートされた結合パートナー又は抗体は、分離及び細胞の濃縮に利用されうる。分離及び/又は濃縮はまた、フローサイトメトリー、FACs、フルイディクス、MEM法によって実施してもよい。細胞選択は、ExPact Tregビーズ、TransActビーズ、Expamerを使用して及び/又は細胞ベースT細胞活性化、例えば抗原提示細胞(APC)、例えば樹状細胞、人工的なAPC等を使用して更に実施されてもよい。細胞の臨床製造(clinical manufacturing)のための方法は、Wang and Riviere in Molecular Therapy - Oncolytics (2016) 3、16015によって記載されており、その全体は参照によって本出願に組み込まれる。
複数の細胞タイプは、複数の結合パートナー又は抗体の一工程の使用によって同時に選択されてもよい。例えば、一部の態様において、T細胞の特異的な亜集団、例えば、高レベルの1つ又は複数の細胞表面マーカー、例えばCD3+、CD4+、CD8+、CD27+、CD28+、CD45RA+、CD45RO+及び/又はCCR7+を発現する細胞は、陽性又は陰性の親和性ベース選択法によって単離されてもよい。
一部の実施形態において、CD4+ヘルパー細胞が、濃縮され、適切な細胞表面抗原を有する細胞集団を識別することによってナイーブ(CD45RO/CD45RA+/CD62L+抗原を有する)、セントラルメモリーT(CD62L+/CD45RO+抗原を有する)及びエフェクター細胞(CD62L-/CD45RO-抗原を有する)へとソーティングされる。
組換え受容体
改変細胞は、キメラ受容体、例えば、キメラ抗原受容体(CAR)、及び他のトランスジェニック抗原受容体を含む、組換え受容体を発現し、これには疾患特異的なT細胞受容体(TCR)及び操作されたTCR、例えばトランスジェニックTCRが含まれる。一態様において、本明細書に開示される改変細胞は、1つ又は複数の組換え受容体を含んでもよい。例えば、改変細胞は、第一のCAR、第二のCAR、第三のCAR、その他を発現してもよく、その各々は、独立に単一特異性、二重特異性又は多重特異性であってもよい。少なくとも1つの実施形態において、改変細胞は、少なくとも2つのキメラ受容体を発現していてもよく、各キメラ受容体は異なる標的抗原を認識する。
別の態様において、経乳頭的に発現される改変細胞は、異なる組換え受容体を発現する細胞の混合物である細胞を含んでもよく、例えば改変細胞は、HER2-CARを発現する第一の細胞及びFAP-CAR又はPD-1-CARを発現する第二の細胞を含む。組換え受容体の発現は、構成的、誘導性、一過性又は切り替え可能であってもよい。一態様において、組換え受容体(CAR及び操作された又は疾患特異的なTCRを含む)は、細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン及び機能的なシグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含む少なくとも1つのキメラ組換えタンパク質を含む。
疾患特異的、例えば乳がん特異的であるTCRは、稀な腫瘍活性T細胞から単離されてもよいが、これが可能ではない場合、代替の技術を用いて高活性抗腫瘍性T細胞抗原を生成してもよい。一部の実施形態において、トランスジェニックマウスは、HLA拘束性ヒト腫瘍抗原を対象とするTCRを発現するT細胞を生成するため免疫してもよい(Stanislawskiら Nat. Immunol. 2001、2、962 - 970)。
一部の実施形態において、腫瘍特異的なT細胞が腫瘍緩解を経験している患者から単離される、アロジェニックTCR遺伝子導入、及び反応性TCR配列は、疾患を共有するが、非応答性である宿主T細胞のT細胞に導入される(Gaoら、Blood. 2000、95、2198-2203;de Wittら、2006、Blood、108、870-877)。他の実施形態において、インビトロ技術を用いて、TCRの配列を変化させて、標的抗原を有する弱く反応性の腫瘍特異的なTCRの相互作用の強度(アビディティ)を増加させることによってそれらの腫瘍殺傷活性を増強することができる(Robbinsら、2008、J. Immunol. 180、6116-6131)。一部の実施形態において、TCRを発現する改変細胞は自己TCRを欠如する、すなわち、TCRはTCRが欠損している細胞に導入された。
本明細書で使用される用語「キメラ抗原受容体」及び「CAR」は、細胞外の抗原結合ドメイン(Ag結合ドメイン)、膜貫通(Tm)ドメイン及び以下に定義される刺激分子に由来する機能的なシグナル伝達ドメインを含む細胞内の細胞質シグナル伝達ドメインを含む、組換えポリペプチド構築物を指す。CARは、抗体様認識とT細胞活性化機能の両方を組み合わせている。
組換え受容体、例えばCAR又は操作された若しくは疾患特異的なTCRは、細胞表面分子、細胞内の抗原(例えば、HLA拘束性提示を介して)、又は両方を標的としうる。
組換え受容体(例えば、CAR)のAg結合ドメインがその標的抗原に結合した後、細胞質シグナル伝達ドメインは持続、輸送、及びエフェクター機能を誘導する細胞内シグナル伝達を活性化する。例えば、Ag結合ドメインは、抗体の抗原結合特性を利用する、非MHC拘束性様式で選択した標的に向けたT細胞特異性及び反応性を転嫁させることができる。非MHC拘束性抗原認識は、CARを発現するT細胞に抗原プロセシング非依存性の抗原を認識する能力を与え、したがって、腫瘍逃避の主要な機構をバイパスする。そのうえ、T細胞において発現される場合、CARは、内因性TCRアルファ及びベータ鎖と二量体化しないとの追加の利益を提供する。
Ag結合ドメイン
組換え受容体(例示的な例として、CAR)に関する抗原ターゲティングモチーフを定義するのに使用される配列は、典型的にはモノクローナル抗体に由来するが、リガンドも使用されうる。例えば、HER2-CAR Ag結合ドメインは、HER2、例えば4D5(Herceptin)に結合する任意のモノクローナル抗体に由来してもよく、一態様において、細胞外の抗原結合ドメイン(Ag結合ドメイン)は、標的抗原を認識し、結合する。Ag結合ドメインには、抗体のAg結合ドメインが含まれうる。そのような抗体のAg結合ドメインは、抗体分子の一部、一般には抗体又は抗体断片の可変性重(VH)鎖領域及び/又は可変性軽(VL)鎖領域、例えばscFv抗体断片を含みうる。
本明細書で使用される用語「抗体」は、抗原と特異的に結合する免疫グロブリン分子を指す。抗体は、ポリクローナル又はモノクローナル、複数鎖又は単鎖、又は完全な免疫グロブリンであってもよく、天然の供給源又は組換え型の供給源に由来してもよい。抗体、例えばIgGは、典型的には、免疫グロブリン分子の四量体である。
用語「抗体断片」は、完全な抗体又はその組換え変異体の少なくとも一部を指し、また標的(例えば、抗原)に対する抗体断片の認識及び特異的な結合を付与するため十分である完全な抗体の抗原決定可変領域等の抗原結合ドメインを指す。抗体断片の例には、Fab、Fab'、F(ab')2、及びFv断片、scFv、直鎖状抗体、単一ドメイン抗体、例えばsdAb(VL又はVHのいずれか)、ラクダVHHドメイン、及び抗体断片から形成される多重特異性抗体が含まれるが、これらに限定されない。用語「scFv」は、軽鎖の可変領域を含む少なくとも1つの抗体断片及び重鎖の可変領域を含む少なくとも1つの抗体断片を含む融合タンパク質であって、軽鎖及び重鎖可変領域が、短い可動性ポリペプチドリンカーを介して隣接して連結され、単一鎖ポリペプチドとして発現される能力があり、scFvが由来する完全な抗体の特異性を保持する、融合タンパク質を指す。別の特定がない限り、本明細書で使用される、scFvは、例えば、ポリペプチドのN末端及びC末端に関して、いずれかの順序でVL及びVH可変領域を有していてもよく、scFvは、VL-リンカー-VHを含んでいてもよく又はVH-リンカー-VLを含んでいてもよい。
一部の実施形態において、Ag結合ドメインは、scFV抗体断片である。
CAR等の組換え受容体のAg結合ドメインは、単一特異性、二重特異性又は多重特異性(すなわち、3以上の異なる抗原が結合する)又はその任意の組合せであってもよい。ScFv、Fab、Fab2、Fab'は、所望の標的抗原、例えばHER2を標的とする抗体に由来するエピトープを含んでいてもよく、したがって、scFV、Fab、Fab2、Fab'は、胸部細胞においてHER2を認識して結合するエピトープ抗HER2/neu抗体トラスツマブ(trastzumab)を含んでいてもよい。
一態様において、Ag結合ドメインは、単一特異性、二重特異性、又は多重特異性であってもよく、Ag結合ドメインが、単一の標的抗原、2つの標的抗原又は3つ以上の標的抗原に結合しうることを意味している。したがって、本発明は、1つ又は複数の標的抗原結合配列を直列に含むCAR等の組換え受容体のAg結合ドメインを包含する。非限定的な例として、CAR等の組換え受容体の二重特異的なAg結合ドメインは、抗HER2及び抗IL-13Rアルファからの配列を直列に更に含む任意のScFvであってもよく、HER2及びIL-13の両方に結合する能力がある。三重特異的なモノクローナル抗体及びそれらを作製する方法は、記載されている(Castoldiら、Protein Engineering、Design、and Selection (2012) vol. 25(10): 551-559;Wangら、J Biochem. 2004 Apr;135(4):555-65;Dimasiら、Mol. Pharmaceutics、2015、12 (9)、pp.3490-3501)。別の例示的な例として、三重特異的なAg結合ドメインは、ErbB2(HER2)、c-Met、及びIGF1Rを標的とする三重特異的なモノクローナル抗体に由来する配列を含むScFv又はFabドメインであってもよい。そのような組換え受容体を含有している二重特異的及び多重特異的Ag結合ドメインは、より大規模な腫瘍特異性に関して非常に望ましい。
別の態様において、組換え受容体(例えば、CAR)のAg結合ドメインは、1つ又は複数のHLA拘束性エピトープを含む。
リーダー
組換え受容体のAg結合ドメインは、Ag結合ドメインのN末端でリーダー配列を更に含みうる。リーダー配列は、細胞プロセシング及び細胞膜へのCARの局在化の間に、例えば、scFvドメインに由来するAg結合ドメインから切断されうる。一部の実施形態において、リーダー配列は、Ag結合ドメインから(及び、それによってキメラ受容体、例えば、CARから)切断される。少なくとも1つの実施形態において、リーダー配列は、切断されず、Ag結合ドメインの一部が残される。保持されるリーダー配列は、Ag結合ドメインの機能を妨害しない、したがって、組換え受容体の機能を妨害しない。
スペーサー/ヒンジ
一部の実施形態において、Ag結合ドメイン組換え受容体(例えば、CAR)には、スペーサーが更に含まれうる。スペーサーには、少なくとも一部の免疫グロブリン定常領域(定常ドメイン)又は変異体又はその改変バージョン、例えばヒンジ領域が含まれうる。そのようなヒンジ領域の例は、当技術分野において知られている(例えば、IgG1又はIgG4ヒンジ、CH1/CL等)。少なくとも1つの実施形態において、ヒンジ領域は、ヒトヒンジ領域、例えば、ヒトIgG1、IgG2、IgG3又はIgG4である。別の実施形態において、スペーサーは、ヒンジ領域のヒト化バージョンである。別の実施形態において、スペーサーは、抗原認識部位と膜貫通ドメインの間の定常ドメインである。
スペーサーは、細胞に対して、抗原結合に際して反応する能力を提供する任意の適切な長さのものでありうる。スペーサーは、300アミノ酸までを含んでいてもよい。一部の実施形態において、スペーサーは、10から150アミノ酸である。他の実施形態において、スペーサーは、15から50アミノ酸である。更に他の実施形態において、スペーサーは、1から10アミノ酸である。
例示的なスペーサーには、IgG4ヒンジ単独、IgG1ヒンジ単独、CH2及びCH3ドメインに連結されたIgG4又はCH2ドメイン単独に連結されたIgG4又はCH3ドメイン単独に連結されたIgG4が含まれるが、これらに限定されない。一部の実施形態において、定常ドメイン又はその一部は、ヒトIgG(例えば、IgG1又はIgG4)、IgM又はIgAのものである。追加のスペーサーは、当技術分野において知られている(WO2014031687;US8822647、US20140271635を参照されたい)。
膜貫通ドメイン
一部の実施形態において、組換え受容体(例えば、CAR)の膜貫通(Tm)ドメインは、Ag結合ドメインに融合される。他の実施形態において、Tmドメインは、スペーサーによりAg結合ドメインから分離される。
Tmドメインは、天然の供給源又は合成の供給源に由来してもよい。Tmドメインが天然の供給源に由来する場合、任意の膜結合又は膜貫通タンパク質に由来してもよい。非限定的な例として、タンパク質、例えばT細胞受容体(TCR)のアルファ、ベータ又はゼータ鎖、CD28、CD3、CD3e、CD45、CD4、CD5、CDS、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD154及びその機能的変異体を含有する膜貫通領域は、本発明の目的のため有用である。一部の実施形態において、Tmドメインは、CD4、CD28、CD8又はその機能的変異体のTmドメインである。天然の供給源に由来するTmドメイン配列の突然変異及び他の改変が、本発明の範囲内であることが意図されることが当業者に理解される。
少なくとも1つの実施形態において、Tmドメインは、合成のものである。合成の膜貫通ドメインが、知られており、当技術分野において記載されている(US7052906)。一部の態様において、合成Tmドメインは、主に疎水性残基、例えばバリン及びロイシン、ロイシンジッパーを含む。
他の実施形態において、Tmドメインは、リンカー又はスペーサーによってシグナル伝達ドメインと連結される。リンカーは、細胞内シグナル伝達に適切な任意の長さのものでありうる。一部の実施形態において、リンカーは、1-15アミノ酸長の長さである。
シグナル伝達ドメイン
組換え受容体(例えば、CAR)には、典型的に少なくとも1つの細胞内シグナル伝達ドメインが含まれる。細胞内シグナル伝達ドメインには、天然の抗原受容体単独を通したシグナル、1つ又は複数の共刺激受容体と組み合わせた抗原受容体を通したシグナル、又は共刺激受容体単独を通したシグナルを模倣するものが含まれうる。一部の実施形態において、シグナル伝達ドメインは、一次刺激分子を含む。組換え受容体(例えば、CAR)の関連で本明細書において交換可能に使用される「一次刺激分子」及び「一次刺激ドメイン」は、T細胞シグナル伝達経路の少なくとも一部の態様に関して刺激性の様式でTCR複合体の一次活性化を制御する、一次細胞質シグナル伝達配列を提供する、改変細胞によって発現される分子又は部分、変異体又はその改変を意味する。
一態様において、一次シグナルは、例えば、ペプチドを負荷されたMHC分子を有するTCR/CD3複合体の結合によって開始され、これは、増殖、活性化、分化、サイトカイン放出等を含むが、これらに限定されないT細胞応答の仲介を導く。刺激様式で作用する又は刺激を誘導する一次細胞質シグナル伝達ドメインには、免疫レセプターチロシン活性化モチーフ(ITAM)に由来するもの、例えば、TCRゼータ、FcRガンマ、FcRベータ、CD3ガンマ、CD3デルタ、CD3イプシロン、CD4、CD8、CD16、CD22、CD25、CD79a、CD79b、及びCD66dに由来するものが含まれうるが、限定されない。本明細書に提供される刺激分子は、単に例としてリストに列挙される。リストは排他的であることが意図されず、更なる例が当業者には容易に明らかとなる。
一部の実施形態において、組換え受容体(例えば、CAR)には、TCR複合体の細胞内コンポーネント、例えばT細胞活性化及び細胞毒性を媒介するCD3鎖、例えばCD3ゼータ鎖が含まれる。したがって、少なくとも1つの実施形態において、刺激分子は、T細胞受容体複合体に関連するCD3ゼータ鎖である。一部の実施形態において、受容体は、CD3 Tmドメイン及びCD3ゼータ刺激ドメインを含む。他の実施形態において、受容体は、Fc受容体ガンマを更に含む。
何らかの特定の作用の理論に拘束されるものではないが、改変細胞の関連に使用される用語「刺激」により、刺激分子(例えば、TCR/CD3複合体)とその同族リガンドとの結合によって誘導され、それによって、例えば、TCR/CD3複合体を介するシグナル伝達に限定されないシグナル伝達イベントを媒介する、応答を意味する。刺激は、特定の分子の発現の変化、例えばTGFベータのダウンレギュレーション、及び/又は細胞骨格構造の再編成等を媒介することができる。
改変細胞がT細胞である場合、完全な活性化は、そのTCR複合体を通したシグナルばかりでなく、抗原提示細胞及びT細胞の膜に発現される共刺激分子により通常提供される、抗原非特異的である共刺激シグナルも必要とする。
ある態様において、組換え受容体には、1つ又は複数の共刺激ドメインが含まれる。第一世代のCAR-T細胞には、単一の共刺激ドメインが含まれる。第二世代CAR-T細胞には2つの刺激ドメインが含まれ、第三世代CAR-T細胞には複数の刺激ドメインが含まれる。したがって、一部の実施形態において、改変細胞には、1つ又は複数の共刺激ドメインが含まれる。一部の実施形態において、細胞質シグナル伝達ドメインは、少なくとも1つの共刺激分子に由来する機能的なシグナル伝達ドメインを更に含む。「共刺激分子」は、以下に定義される「共刺激リガンド」と特異的に結合し、それによって、例えば、増殖であるが、これに限定されない、改変細胞による共刺激応答を媒介する、改変細胞における同族の結合パートナーを指す。共刺激分子は、典型的には、効率的な免疫応答に必要とされる標的抗原受容体又はそれらのリガンド以外の細胞表面分子である。
一部の実施形態において、刺激ドメインには1つの組換え受容体(例えば、CAR)が含まれ、共刺激ドメインは第二の標的抗原を認識する第二の組換え受容体(例えば、CAR)により提供される。他の実施形態において、共刺激ドメインを含む、一次刺激ドメイン及びキメラ受容体(例えば、CAR)を含む、キメラ受容体(例えば、CAR)は、同じ改変細胞に発現される。更に他の実施形態において、刺激ドメイン及び1つ又は複数の共刺激ドメインは、同じ改変細胞に発現される場合に直列にある。
本発明の目的のための共刺激分子は、MHCクラスI分子、BTLA及びTollリガンド受容体、免疫グロブリンスーパーファミリー(IgSF)、例えばCD28、B7受容体ファミリーメンバー(B7-H2/B7RP-1/LICOS/GL50、B7-DC/PD-L2、B7-H3)、CD226、TIM、CD2/SLAM、BTN、LAIR、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー(TNFRSF)、例えばOX40、CD27、CD30、DR3、GITR、及びT細胞におけるHVEM、CD2及びSLAM、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、付着分子(CD54、CD58、CD70)、ICOS、CD40、CD40L、4-1BB(CD137)、CD70、CD80、CD86、DAP10、及び他のオーファン受容体ファミリー、例えばLAG3(CD223)及びCD160が含まれるが、これらに限定されない。
したがって、一部の実施形態において、共刺激分子は、MHCクラスI分子、BTLA及びTollリガンド受容体、免疫グロブリンスーパーファミリー(IgSF)、例えばCD28、B7受容体ファミリーメンバー(B7-H2/B7RP-1/LICOS/GL50、B7-DC/PD-L2、B7-H3)、CD226、TIM、CD2/SLAM、BTN、LAIR、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー(TNFRSF)、例えばOX40、CD27、CD30、DR3、GITR、及びT細胞におけるHVEM、CD2及びSLAM、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、付着分子(CD54、CD58、CD70)、ICOS、CD40、CD40L、4-1BB(CD137)、CD70、CD80、CD86、DAP10、及び他のオーファン受容体ファミリー、例えばLAG3(CD223)及びCD160からなる群から選択される。本明細書に提供される共刺激分子は、単に例としてリストに列挙される。リストは排他的であることが意図されず、更なる例が当業者には容易に明らかとなる。
「共刺激リガンド」は、免疫細胞(例えば、T細胞)の完全な活性化について重要な抗原特異的ではないシグナルを提供する分子を指す。共刺激リガンドには、腫瘍壊死因子(TNF)リガンド、免疫グロブリンスーパーファミリー(IgSF)リガンド及びサイトカイン(例えば、IL-2、IL-12、IL-15、及びIL21)が含まれるが、限定されない。TNFは、全身性炎症に関与し、急性期反応を刺激するサイトカインである。その主な役割は、免疫細胞の制御にあり、TNFリガンドは:大多数のリガンドは、短い細胞質セグメント及び相対的に長い細胞外領域を含有する、II型膜貫通タンパク質(細胞外C末端)として合成されるとの幾つかの共通の特徴を共有する。TNFリガンドには、神経成長因子(NGF)、CD40L、CD40L/CD154、CD137L/4-1BBL、TNFα、CD134L/OX40L/CD252、CD27L/CD70、Fasリガンド(FasL)、CD30L/CD153、TNFベータ(TNFβ)/リンホトキシンアルファ(LTα)、リンホトキシンベータ(LTβ)、CD257/B細胞活性化因子(NAFF)/Blys/THANK/Tall-1、糖質コルチコイド誘導性TNF受容体リガンド(GITRL)、及びTNF関連アポトーシス誘導性リガンド(TRAIL)、LIGHT(TNFSF14)並びにSLAMが含まれるが、これらに限定されない。Igスーパーファミリーは、細胞の認識、結合、又は付着プロセスに関与する細胞表面及び可溶性タンパク質の大きなグループである。これらのタンパク質は、免疫グロブリンドメイン(フォールド)等の免疫グロブリンと構造上の特徴を共有する。IgSFリガンドには、CD80(B7-1)及びCD86(B7-2)、CD28に対する各リガンドが含まれるが、限定されない。追加の共刺激分子/リガンドは、当技術分野において知られており(Chen and Files. Nat. Rev. Immunol. 2013 Apr. 13(4): 227-242)、本明細書に参照によってその全体が組み込まれる。
標的抗原
一部の実施形態において、組換え受容体(例えば、CAR)又は操作された又は疾患特異的なTCR(例えば、腫瘍特異的なTCR)のAg結合ドメインに結合する標的抗原は、細胞表面タンパク質/マーカーであってもよい。他の実施形態において、標的抗原は、細胞内分子であってもよい。標的抗原は胸部細胞に、好ましくは、乳がん等の疾患に罹患した胸部細胞に発現されうる。一部の抗原標的抗原(antigen target antigen)はまた、非胸部細胞及び組織に発現されうる。1つの実施形態において、キメラ受容体のAg結合ドメインは、乳がん等の胸部疾患に関連する抗原を標的とするように操作されてもよい。本開示のどこかで参照される及び文献に公開されるバイオマーカーは、本発明の目的のための標的抗原であってもよい。本明細書に提供される抗原は、単に例としてリストに列挙される。リストは排他的であることが意図されず、更なる例が当業者には容易に明らかとなる。抗原の選択は、処置される、特定のタイプの疾患、例えば、特定のタイプの乳がんに依存する。腫瘍抗原は、免疫応答、特にT細胞媒介免疫応答を誘発する腫瘍細胞によって産生されるタンパク質である。
標的抗原は、悪性腫瘍に関連する、1つ又は複数の抗原性エピトープ、例えば、抗原性がんエピトープを含む。悪性腫瘍は、免疫攻撃のための標的抗原として貢献しうる幾つかのタンパク質を発現する。別のグループの標的抗原は、癌胎児性抗原、例えば癌胎児性抗原(CEA)である。本発明において参照される腫瘍抗原のタイプには、腫瘍特異的抗原(TSA)及び腫瘍関連抗原(TAA)も含まれる。TSAは、腫瘍細胞に特有であり、身体中の他の細胞には発現されない。TAA抗原は、腫瘍細胞に特有ではなく、抗原及び腫瘍逃避に対する免疫耐性の発生を防止する条件下で正常細胞に発現されうる。しかし、腫瘍細胞におけるTAAの存在は、免疫耐性及び腫瘍逃避の発生を容認しうる。TAAは、免疫系が、未成熟で応答できない場合に、胎性発生の間に正常細胞に発現される抗原であってもよい又はそれらは、通常は正常細胞に極度に低レベルで存在するが、腫瘍細胞に高レベルで発現される、抗原であってもよい。
TSA又はTAAの非限定的な例には、腫瘍特異的な多系統抗原、例えばMAGE1、MAGE-3、MAGE-A3/6、MAGE-Aファミリーメンバー、例えばMAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A6、MAGE-A12、MAGE-A9、MAGE-A11、MAGE-C1、及びMAGE-C2、RAGE、BCR-ABL、タンパク質チロシンキナーゼ、例えばPRL-2及びPRL3、腫瘍関連糖タンパク質、例えばTAG-72、CA19-9、CA27.29、CA72-4、CA50、受容体チロシンキナーゼ、例えばH4-RET等が含まれる。
少なくとも1つの実施形態において、侵襲性乳がんに関する標的抗原は、MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A6、及び/又はMAGE-A12であってもよい。一部の実施形態において、標的抗原は、MAGE-A3/6である。MAGE-A3/6は、対象においてホルモン受容体(例えば、エストロゲン受容体及びプロゲステロン受容体)陰性状態である原発性乳がんに対して魅力的である。更に他の実施形態において、MAGE-A9及びMAGE-A11は、ER+乳がん及びHER2+乳がんに対して望ましい標的である。一部の実施形態において、TNBCの処置について望ましい標的には、Lehrmannら(J. Clin. Invest. 2011. 121(7)、2750-2767)によって記載されたものが含まれる。
少なくとも1つの実施形態において、標的抗原は、HER2である。本明細書に提供されるHER2-ターゲティング組換え受容体(例えば、HER2-CAR)は、図2に開示された配列番号1又はその変異体若しくは機能的な部分に対して少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、及び100%の相同性を有する。一部の実施形態において、HER2-CARは、図2に開示される配列番号1又はその変異体又は機能的な部分と少なくとも80%から100%の同一性を有する。少なくとも1つの実施形態において、HER2-CARは、図2に開示される配列番号1又はその変異体又は機能的な部分と少なくとも95%の同一性を有する。
一部の実施形態において、HER2-CARは、HER2エピトープに向けたヒト化4D5抗HER抗体に由来する配列を含む。CARのAg結合ドメインを標的とすることができ、CARのAg結合ドメインによって結合を受けうるHER2上の様々なエピトープは、文献に記載されており、これらは本開示の目的に有用である。少なくとも1つの実施形態において、HER2-CARは、HER2の細胞外ドメインのサブドメインIV上のエピトープに対して直接結合する。一部の実施形態において、HER2-CARは、HER2上のアミノ酸残基557-561、570-573及び593-603に対して結合する(Rockbergら、Molecular Oncology、3 (2009) 238-247、本明細書に参照によってその全体が組み込まれる)。他の実施形態において、HER2-CARは、HER2の細胞外ドメイン上のエピトープ((N1:YNTDTFES、N2:NPEGRYTFGA及びN3:VGSCTLVCPLHNQEVT、C1:LPESFDGD及びC2:LQVF)に対して結合する(同文献)。HER2-CARが結合することができる追加エピトープは、Rongcunら(J Immunol 1999; 163:1037-1044、本明細書に参照によってその全体が組み込まれる)によって記載されたものを含む。一部の実施形態において、HER2-CARは、HER2、CD8ヒンジ領域、CD8スペーサー、共刺激ドメインCD28及び4-1BB及び細胞内シグナル伝達ドメインとしてCD3zに向けた4D5抗体に由来するFabドメイン又はscFVを含む。
更に他の実施形態において、CA19-9は、早期及び再発性の管の乳癌に関する望ましい標的である。別の実施形態において、葉酸受容体α(FR-α)、メソテリン、ROR1、前立腺がん関連抗原からの糖配列は、三重陰性乳がん、侵襲性乳がん及び転移性乳がんに関する望ましい標的である。
FR-α-ターゲティング組換え受容体は、公開されている。例えば、FR-αに向けたMov18抗体に基づくFR-アルファ-CARを調製する方法は、Songら(Blood. 2012 Jan 19;119(3):696-706;Oncoimmunology. 2012 Jul 1; 1(4): 547-549;J. Hematology & Oncology (2016) 9:56)によって以前に記載されている。一部の実施形態において、FAP-CARは、抗-FR-α抗体MOv18抗原結合ドメイン、CD8ヒンジ領域、CD8Tm領域、並びにCD27及びCD3z細胞内ドメインを含む共刺激ドメインに由来するscFVを含む。組換え受容体の追加のAg結合ドメインは、FR-αに向けたモノクローナル抗体、例えば9F3、24F12、26B3、19D4(O'Shannessyら、Oncotarget. 2011 Dec; 2(12): 1227-1243.)、モノクローナル抗体IMGN853(US2012/0282175を参照されたい)及びファルレツズマブに由来してもよい。FR-α-CARが結合しうる様々なエピトープは、マッピングされ、記載されている(同文献)。一部の実施形態において、FR-α-CARは、構成的に、一過性に、誘導的に、若しくは切り替え可能に改変細胞において発現される又は条件的に活性である。
線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)は、侵襲性乳がん又は胸部組織間質に関与する任意のがんに関する望ましい標的である。本明細書に提供されるFAP-ターゲティング組換え受容体(例えば、FAP-CAR)は、図2に開示された配列番号2又はその変異体若しくは機能的な部分に対して少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、及び100%の相同性を有する。FAP-CARを作製する方法は、以前に記載されている(Kakarlaら、Mol Ther. (2013)、21 8、1611-1620;Wangら、Cancer Immunol Res. 2014 Feb; 2(2): 154-166)、Juneら(米国特許公開第2014/0099340号)。
別の態様において、標的抗原には、免疫抑制活性を有する抗原が含まれるが、限定されない。免疫抑制標的抗原に向けたCARを発現する細胞は、阻害性CAR(iCARs)と称される。例示的な免疫抑制標的抗原には、チェックポイント阻害剤、例えばPD-1、CTLA-4、CD47及びそれらのリガンドが含まれる。三重陰性乳がん等の乳がんは、PD-1リガンド((PD-1L)の設定における予後不良と相関することが報告されている。したがって、少なくとも1つの実施形態において、標的抗原には、PD-L1が含まれる。PD-1、CTLA-4、CD47及びそれらのリガンド、例えばPD-L1を標的とするCARは、単一特異性、二重特異性又は多重特異性であってもよい。抗原特異的な阻害性受容体(阻害性CAR-T細胞又はiCAR-Tsと称される)を発現する改変細胞は、免疫抑制、悪条件の腫瘍微小環境を低下させ、off-target免疫療法応答に転換するのに有用である。iCARsを作製する方法は、当技術分野において記載されている(Cherkassyら、J. Clin. Invest. 2016;126(8):3130-3144;Federovら、Science Translational Medicine 11 Dec 2013: Vol. 5、Issue 215、pp. 215ra172を参照されたい)。
組換え受容体の細胞外Ag結合ドメインによって認識される追加の例示的な標的抗原には、形質転換関連分子、例えばHER2/neu又はErbB-2(HER2)、MUC、例えばMUC1、c-met、サイトケラチン例えば、CK5、CK6、CK14、CK7、CK8、CK14、CK17、CK18、CK19、p53、グリコシド、Tn、TF、及びシアリルTn(STn)、葉酸受容体アルファ(FR-α)、ROR1、腫瘍関連抗原、例えば癌胎児抗原(CEA)、L1細胞接着分子(L1CAM)、線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)、ジガングリオシドGD2、メソテリン、IL-13受容体IL13R、IL-13受容体α、エフリンB2、IGFR1、eLIGHT、WT1、TAG-72、Ep-CAM、LFA-1、EGFR、エストロゲン受容体(ER)、プロゲステロン受容体等が含まれるが、限定されない。追加の抗原受容体及びこのような受容体を設計する及びこのような受容体を細胞に導入するための方法には、WO200014257、WO2013126726、WO2012/129514、WO2014031687、WO2013/166321、WO2013/071154、WO2013/123061、US2002131960、US2013287748、US20130149337、US20160206656、US20160045551、US20160158359、US20160151491、US9365641、US8906682等が含まれる。更なる標的及びCARには、各々が参照によってその全体が組み込まれる、Sadelainら、Cancer Discov. 2013、April 3(4):388-398;Davilaら、(2013) PLoS One 8(4):e61338;Turtleら、Curr. Opinion. Immunol. 2012 October; 24(5): 633-39;Wuら、Cancer、2012 March 18(2): 160-75によって記載されるものが含まれる。一部の態様において、抗原受容体には、米国特許第7,446,190号に記載されるCAR及び国際特許出願公開第WO/2014055668A1号に記載されるものが含まれる。CARの例には、前述の公開のいずれに開示されたもの、例えばWO2014031687、米国特許第8,339,645号、米国特許第7,446,179号、US2013/0149337、米国特許第7,446,190号、米国特許第8,389,282号、Kochenderferら、2013、Nature Reviews Clinical Oncology、10、267-276 (2013);Wangら (2012) J. Immunother. 35(9): 689-701;及びBrentjensら、Sci Transl Med. 2013 5(177)が含まれる。WO2014031687、米国特許第8,339,645号、米国特許第7,446,179号、US2013/0149337、米国特許第7,446,190号、及び米国特許第8,389,282号も参照されたい。
別の態様において、標的抗原は、細胞内である。一部の実施形態において、細胞内標的抗原に向けたHLA-A2拘束性エピトープを含むT細胞及びNK細胞等のCARを発現する細胞が望ましい。細胞内抗原には、アポトーシス促進因子/細胞死分子、BRCA1、BRCA2等が含まれうる。細胞内抗原を標的とするCARを作り出す方法は、文献(Tassevら、Cancer Gene Ther. 2011;Stewart-Jonesら、Proc Natl Acad Sci U S A. 2009;106:5784-5788)に記載されている。他の方法は、当業者には容易に明らかとなる。
更なる別の態様において、受容体には、乳がん細胞等の胸部細胞における1つ又は複数のFITC標識標的抗原に対して特異的なFITCコンジュゲート治療分子、例えばモノクローナル抗体、アプタマー、リガンド等を標的とする抗フルオレセインチオシアン酸(FITC)結合ドメインが含まれうる。そのような方法は、単一の標的抗原を下方制御することによって標的とされることを回避する腫瘍の能力を制限することができる、複数の標的抗原を標的とするため望ましい。これは、胸部細胞における標的抗原の結合の追跡及び胸部腫瘍等の罹患した胸部組織内に投与された細胞の遊走及び浸潤の割合/速度にも有利である。
キメラ受容体を調製する方法は、当技術分野において知られている。例示的な作製する方法は、US2016/0206656、US2016/0045551、US201/40314795、US2014/0314795に記載されている。RNA CARを調製する方法は、Barrettら(Barrettら、Hum. Gene Ther. 2011、22(12):1575-1586)によって記載されている。
追加のCAR及びそれらを作製する方法は:CEA(例えば、結腸)(Nolanら、Clin Cancer Res.、5:3928-3941 (1999));EGFRvIII Bullainら、J Neurooncol. (2009)、Morganら、Hum Gene Ther.、23:1043-1053 (2012));ErbB2(HER2) Zhaoら、J Immunol.、183:5563-5574 (2009)、Morganら、Mol Ther.、18:843-851 (2010)、Pinthusら、114:1774-1781 (2004)、Tengら、Hum Gene Ther.、15:699-708 (2004)、Stancovskiら、J Immunol.、151:6577-6582 (1993)、Ahmedら、Mol Ther.、17:1779-1787 (2009)、Ahmedら、Clin Cancer Res.、16:474-485 (2010)、Moritzら、Proc Natl Acad Sci U.S.A.、91:4318-4322 (1994);ErbB受容体ファミリー Daviesら、Mol Med.、18:565-576 (2012)、Sunら、Breast Cancer Res.16:R61;ErbB3/4 Muniappanら、Cancer Gene Ther.、7:128-134 (2000)、Altenschmidtら、Clin Cancer Res.、2:1001-1008 (1996);HLA-A1/MAGE1 Willemsenら、Gene Ther.、8:1601-1608 (2001)、Willemsenら、J Immunol.、174:7853-7858 (2005));HLA-A2/NY-ESO-1 Schuberthら、Gene Ther.、20:386-395 (2013);FR-α Songら Blood. 2012 Jan 19;119(3):696-706; Oncoimmunology. 2012 Jul 1; 1(4): 547-549; J. Hematology & Oncology (2016) 9:56; Hwuら、J Exp Med.、178:361-366 (1993)、Kershawら、Nat Biotechnol.、20:1221-1227 (2002)、Kershawら、Clin Cancer Res.、12:6106-6115 (2006)、Hwuら、Cancer Res.、55:3369-3373 (1995);FAP Kakarlaら、Mol Ther. (2013)、21 8、1611-1620);GD2 Puleら、Nat Med.、14:1264-1270 (2008)、Louisら、Blood、118:6050-6056 (2011)、Rossigら、Int J Cancer.、94:228-236 (2001);IL13R.アルファ.2 Kahlonら、Cancer Res.、64:9160-9166 (2004)、Brownら、Clin Cancer Res. (2012)、Kongら、Clin Cancer Res.、18:5949-5960 (2012)、Yaghoubiら、Nat Clin Pract Oncol.、6:53-58 (2009));ルイスY Peinertら、Gene Ther.、17:678-686 (2010)、Westwoodら、Proc Natl Acad Sci U.S.A.、102:19051-19056 (2005)、Mezzanzanicaら、Cancer Gene Ther.、5:401-407 (1998);メソテリン Lanitisら、Mol Ther.、20:633-643 (2012)、Moonら、Clin Cancer Res.、17:4719-4730 (2011);Muel Wilkieら、J Immunol.、180:4901-4909 (2008);NKG2Dリガンド Barberら、Exp Hematol.、36:1318-1328 (2008)、Lehnerら、PLoS One、7:e31210 (2012)、Songら、Gene Ther.、24:295-305 (2013)、Spearら、J Immunol.、188:6389-6398 (2012);TAG72(例えば、結腸)(Hombachら、Gastroenterology、113:1163-1170 (1997)、McGuinnessら、Hum Gene Ther.、10:165-173 (1999)に記載されている。
遺伝的な操作 - 組換え受容体を発現する改変細胞。
一部の実施形態において、細胞には、遺伝的な操作によって導入される1つ又は複数の核酸が含まれ、それによって、そのような核酸の組換え又は遺伝的に操作された産物、例えば組換えキメラ受容体(例えば、CAR)を発現する。遺伝的な操作には、典型的には、レトロウイルス、レンチウイルストランスダクション、トランスフェクション、又は形質転換等によって、細胞に組換えキメラ受容体をコードする核酸の導入が関与する((例えば、Wangら (2012)、J. Immunother. 35(9): 689-701;Cooperら (2003)、Blood. 101:1637-1644;Verhoeyenら (2009)、Methods Mol Biol. 506: 97-114;及びCavalieriら (2003)、Blood. 102(2): 497-505;Chicaybamら、(2013)、PLoS ONE 8(3): e60298及びVan Tedelooら (2000)、Gene Therapy 7(16): 1431-1437を参照されたい)。一部の実施形態において、細胞は、最初に刺激、すなわち、増殖、生存又は活性化等の応答を誘導する刺激で刺激されてもよい。そのような応答は、活性化マーカー又はサイトカイン放出の発現によって測定されてもよい。核酸導入は、次に、活性化した細胞のトランスダクション、トランスフェクション又は形質転換、続いて、臨床適用における使用のため十分な数まで細胞培養を拡大させることによって達成されてもよい。核酸導入のための方法は、当技術分野において知られている。
細胞への核酸導入は、組換え感染ウイルス粒子、例えばシミアンウイルス40(SV40)、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス(AAV)に由来するベクターを使用することによって実施されてもよい。一部の実施形態において、核酸導入は、組換えレンチウイルスベクター又はレトロウイルスベクター、例えばガンマレトロウイルスベクター(例えば、Kosteら (2014)、Gene Therapy 2014 Apr. 3. doi: 10.1038/gt.2014.25;Carlensら (2000)、Exp Hematol 28(10): 1137-46;Alonso-Caminoら (2013)、Mol Ther Nucl Acids 2、e93;Parkら、Trends Biotechnol. 2011 November 29(11): 550-557を参照されたい)を使用して行ってもよい。
一部の実施形態において、レトロウイルスには、任意のトリ又は哺乳動物細胞供給源に由来するものが含まれる。レトロウイルスは、典型的には、広宿主性(amphotropic)であり、これは、それらがヒトを含む幾つかの種の宿主細胞に感染する能力があることを意味している。1つの実施形態において、発現される遺伝子により、レトロウイルスgag、pol及び/又はenv配列が置き換えられる。幾つかの例示的なレトロウイルスシステムが、記載されている(例えば、米国特許第5,219,740号;同6,207,453号;同5,219,740号;Miller and Rosman (1989)、BioTechniques 7:980-990;Miller、A. D. (1990)、Human Gene Therapy 1:5-14;Scarpaら (1991)、Virology 180:849-852;Burnsら (1993)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:8033-8037;及びBoris-Lawrie and Temin (1993)、Cur. Opin. Genet. Develop. 3:102-109)。レンチウイルストランスダクションの方法は、知られている。例示的な方法は、例えば、Wangら (2012)、J. Immunother. 35(9): 689-701;Cooperら (2003)、Blood. 101:1637-1644;Verhoeyenら (2009)、Methods Mol Biol. 506: 97-114;及びCavalieriら (2003)、Blood. 102(2): 497-505に記載される。
本発明に有用な核酸には、ゲノム及びcDNAを含むDNA、mRNAを含むRNAが含まれる。一部の実施形態において、組換えキメラ受容体の発現は、構成的又は誘導性であってもよい。他の実施形態において、キメラ受容体の発現は、一過性、条件的に活性又は切り替え可能であってもよい。
条件的に活性なCARは、US20160207989に記載されているように調製されてもよい。誘導性のCARは、US20160046700に記載されているように調製されてもよい。本明細書において論じられる誘導性のキメラシグナル伝達分子により、細胞において共発現されるキメラ抗原受容体(CAR)の持続的なモジュレート調節が可能になる。誘導性のキメラシグナル伝達分子は、本明細書において論じられる誘導性の組換え受容体(例えば、CAR)を含む。胸部障害に関わる細胞抗原を標的とするように設計される、T細胞等の標的抗原特異的な細胞の活性化は、リガンド誘導因子の投与に依存性である。リガンド誘導因子は、誘導性のキメラシグナル伝達分子を多量体化することによってCAR発現細胞を活性化し、これが、次々に、NFkBシグナル伝達及び他の細胞内シグナル伝達経路を活性化し、これが、細胞、例えば、T細胞、腫瘍浸潤性リンパ球、ナチュラルキラー細胞、又はナチュラルキラーT細胞を活性化する。リガンド誘導因子の非存在下で、改変細胞は、静止状態である又は基礎レベルの活性を有する。リガンドの投薬は、CAR発現細胞増殖及び活性化の割合及び規模を決定する。
一過性発現は、典型的には、RNA CARで細胞を一過性に改変することによって操作される(US20160151491を参照されたい)。最小の発現カセットは追加のウイルス配列を必要としないため、RNA導入遺伝子は、細胞に送達され、そこで短期間のインビトロ細胞活性化後に発現される。RNA CAR配列は、染色体外に残ってもよい。インビトロ転写されたRNA(IVT-RNA)を上手に使用して細胞を改変した、IVT-RNAベクターも当技術分野において知られている(Barrettら、Hum. Gene Ther. 2011、22(12):1575-1586)。RNA導入は、トランスフェクション、エレクトロポレーション及び当業者に知られている様々な他の方法によって行うことができる(Singhら、Oncoimmunology 3:12.、e962974. December 2014;Schutskyら、Oncotarget 2015、6(3))28911-28を参照されたい)。IVT-RNAは、導入されたIVT-RNAの長期の発現を達成するための様々な改変を使用して安定化されてもよい。IVTベクターは、文献中にインビトロ転写について標準化様式で利用される場合が知られており、安定化されたRNAが産生される様式で遺伝的に改変されている。mRNAワクチン技術は、安定なmRNAの産生に対して最適化され、本発明の目的のため有用である(Schlakeら、RNA Biol. 2012 Nov 1; 9(11):1319-1330;Sahinら、Nature Reviews Drug Discovery 13、759-780 (2014))。
RNAは、より伝統的なプラスミド又はウイルスでのアプローチに対して幾つかの利点を有する。RNA供給源からの遺伝子発現は転写を必要としない、またタンパク質産物はトランスフェクション後に急速に産生される。RNAは核に入る必要がなく細胞質に残るので、トランスフェクション効率は典型的に高い。
CAR発現は、切り替え可能に作ってもよく、すなわち、CAR発現は、所望される又は必要な場合に細胞中でスイッチオフされてもよく及び/又は細胞は、CAR発現及び細胞(それら自体は、以下に記載される)の排除を可能にする導入された核酸配列エレメントに含ませることによって排除されてもよい。
場合により、核酸配列には、細胞が単離及び精製されることを可能にする、タグ、例えば、E-タグ又はFITCが含まれうる(PLOS One. 2014、9(4)、e93745)。組換え受容体(例えばCAR)の発現は、免疫組織化学、ELISA、FACs等の当技術分野において知られている任意の適切な方法によって確認されうる。
ある態様において、改変細胞には、例えば、受容体及びタンパク質と同時トランスフェクションすることによるウイルス、例えば、腫瘍細胞へのそれらの遊走を援助する、腫瘍溶解性ウイルス(van Seggelenら、Mol. Ther. - Oncolytics 2、Article number: 15014 (2015)が含まれうる。腫瘍溶解性ウイルス(OV)、例えば、水疱性口内炎ウイルスは、腫瘍細胞の特異的な溶解を誘導する及び血管シャットダウンを介して腫瘍増殖に間接的に影響する能力を有する。改変細胞(例えば、T細胞)は身体を通して容易に循環するため、これらの細胞を使用する腫瘍に直接的に腫瘍溶解性ウイルスを送達することにより、理想的な組合せが提供される。腫瘍溶解性ウイルスの負荷の方法は、van Seggelen(同文献)によって記載されている。OVは、養子細胞治療を施す前に改変細胞に負荷されてもよい。そのような腫瘍溶解性ウイルスは、組換え受容体(例えば、CAR)を発現する、改変細胞の免疫機能を増強する及び/又は相乗作用する(Nishioら、Cancer Res. 2014 Sep 15;74(18):5195-205;Walkerら 2016. posted online May. 30、2016; doi: http://dx.doi.org/10.1101/055988)。したがって、一部の実施形態において、改変細胞は、腫瘍溶解性ウイルスを含む。別の態様において、標的抗原には、関連性のある腫瘍分泌性ケモカイン、例えばGro-アルファ、CCL17、CCL2と一致する特異的なケモカイン受容体が含まれる。これらは、腫瘍細胞に移動する改変細胞を援助することに有利である。腫瘍部位に近い経乳頭投与は、インビボでの遊走のための時間及び距離を低下させることに有利である。
細胞拡大
一部の実施形態において、細胞は、エクスビボで拡大され、使用前に凍結及び保存されうる又は直ちに対象に投与されうる。一部の実施形態において、改変細胞は、対象の胸部管への経乳頭投与前に、エクスビボで拡大される。一般に、細胞は、培養開始組成物フィーダー細胞(culture-initiating composition feeder cell)、例えば、非***PBMCに細胞を添加することによって拡大されうるため、細胞の生じる集団は、拡大される初期集団中で各改変細胞(例えば、T細胞)のため、少なくとも5、10、15、20、30又は40以上のPBMCフィーダー細胞を含有する。インキュベーションはまた、非***EBV形質転換リンパ芽球腫細胞(LCL)をフィーダー細胞として添加することによって行ってもよい。培養は、少なくとも25℃、少なくとも30℃、又は一般に37℃で、改変細胞を拡大するため十分な時間インキュベートされる。フィーダー細胞は、細胞***を防止するためガンマ線照射されうる。
細胞のエクスビボ拡大の方法は、文献(Terakuraら 2012、Blood、119; 72-82;Cartellieriら、PLoS One、2014、Vol 9(4)、e93745)に記載される。非限定的な例として、組換え受容体(例えば、CAR)を発現するT細胞は、ガンマ線照射されたTM-LCL細胞と接触して懸濁させ、48時間毎にIL-2及びIL-15を補充される。刺激されたCAR発現細胞は、2種の亜集団に分けることができる。高発現のCARとCD25も発現する細胞(すなわち、CAR+/CD25+)集団が、望ましい(Changら、J. of Trans. Med. (2015) 13:161)。刺激された高及び低CAR発現集団は、1:1又は2:1等の特定のエフェクター対標的(E:T)比での標的細胞との同時インキュベーションの20時間後にFACsによって単離される。
一部の実施形態において、改変細胞は、組換え受容体(例えば、CAR)の高発現者である。他の実施形態において、改変細胞は、変化するレベルで組換え受容体(例えば、CAR)を発現してもよい(すなわち、そのような細胞は、高、中及び低発現者の組換え受容体の混合物であってもよい)。
任意の化学的な合成又は組換え変異誘発法を使用して、CAR及びCARを発現する改変細胞を生成してもよい。本発明の実践は、別の指示がない限り、当技術分野の範囲内にある細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組換えDNA、及び免疫学の従来の技術を用いることができる。そのような技術は、文献中に完全に説明される。例えば、Molecular Cloning A Laboratory Manual、2nd Ed.、ed. by Sambrook、Fritsch and Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1989);DNA Cloning、Volumes I and II (D. N. Glover、ed.、1985);Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait、ed.、1984);Mullisら、米国特許第4,683,195号;Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames & S. J. Higgins、eds. 1984);Transcription And Translation (B. D. Hames & S. J. Higgins、eds. 1984);Culture Of Animal Cells (R. I. Freshney、Alan R. Liss、Inc.、1987);Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press、1986);B. Perbal、A Practical Guide To Molecular Cloning (1984);the treatise、Methods In Enzymology (Academic Press、Inc.、N.Y.);Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J. H. Miller and M. P. Cabs、eds.、1987、Cold Spring Harbor Laboratory);Methods In Enzymology、Vols. 154 and 155 (Wuら、eds.)、Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer and Walker、eds.、Academic Press、London、1987);Handbook Of Experimental Immunology、Volumes 1-IV (D. M. Weir and C. C. Blackwell、eds.、1986);Manipulating the Mouse Embryo (Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、N. Y.、1986)を参照されたい。
安全性
キメラ受容体(例えば、CAR)を発現する改変細胞での処置等の養子細胞治療の投与は、重篤な毒性の転帰又は副作用、例えばサイトカイン放出症候群(CRS)、マクロファージ活性化症候群(MAS)、腫瘍崩壊症候群(TLS)、神経毒性、及び/又は投与される細胞及び/又は組換え受容体に対する宿主免疫応答を誘発しうる(Bonifantら Mol. Ther. - Oncolytics (2016) 3、16011)。
したがって、改変細胞におけるキメラ受容体の発現を制御する(例えば、CARの発現を低下させる)又はキメラ受容体(例えば、CAR)を発現する改変細胞を排除する(切り替え可能なCAR発現)ことが望ましい。一部の実施形態において、受容体の発現は、構成的、誘導性、一過性、又は切り替え可能であってもよい。少なくとも1つの実施形態において、改変細胞におけるキメラ受容体は、条件的に活性である。一部の実施形態において、CARは、切り替え可能なCARである。他の実施形態において、CARは、阻害性CAR(iCARs)である。更に他の実施形態において、CARは、(これらが、RNA導入によって発現させる及びそれらの発現は一過性であるという点で)自己制限性CARである。
したがって、操作された細胞には、細胞の安全性スイッチ、例えば、養子細胞治療の投与の際等に、細胞がインビボでのネガティブ選択に対して感受性となる原因の遺伝子セグメントが含まれうる。例えば、一部の態様において、細胞は、それらが投与される対象のインビボ状態の変化の結果として排除されうるように操作される。ネガティブ選択表現型は、投与される因子に感受性を付与する死遺伝子又は自殺遺伝子の挿入の結果であってもよい。例えば、***細胞に対して毒性である、ガンシクロビルからガンシクロビル三リン酸の変換を媒介する単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ(HSVtk)が、ドナー改変細胞に挿入されてもよい。ドナー改変細胞へのHSVtkの挿入は、それらが対象へのガンシクロビルの投与(細胞外スイッチシグナル)によって排除されることを可能にする。追加の例の死遺伝子又は自殺遺伝子には、様々なアポトーシス関連遺伝子、例えば、誘導性カスパーゼ9(iC9)及びFADDが含まれ、これは、AP20187(ARIAD Pharmaceuticalsから利用可能)及び/又はAP1903(ヒト対象に対する投薬に関して安全な小分子)等の、二量体化(CID)の化学的な誘導因子に対する応答において改変細胞を排除するため使用されてもよい(Siok-Keen Tey. Clin. Translational Immunology (2014) 3、e17;Straathofら Blood、2005 Jun 1; 105(11): 4247-4254)。そのような安全スイッチは、多能性幹細胞ベース治療(Wuら Molecular Therapy - Methods & Clinical Development 1、Article number: 14053 (2014) doi:10.1038/mtm.2014.53)についても使用することができる。
更に別の態様において、安全スイッチは、改変細胞の活性のスイッチオフ又はそのような細胞(例えば、切り替え可能なCAR-T細胞、CAR-NK細胞、又はCAR-CTL)を排除することを可能とする改変細胞によって発現されるキメラ受容体の細胞外Ag結合ドメインに包埋されていてもよい。スイッチは、半合成スイッチ又は完全な組換えスイッチであってもよい。適切な時間で導入される可溶性因子(細胞外スイッチシグナル)に対して応答性である例示的なスイッチには、FITCベース半合成スイッチ及び短ペプチドネオエピトープ(PNE)全体組換え細胞内スイッチが含まれる。スイッチ並びにそれらを作製する及び使用する方法は、(Caoら、Cancer Immunotherapy、Angew Chem. Int. Ed. 2016、55、1-6;Caoら、Angew. Chem. Int. Ed. 2016、55、7520-7524;Rodgersら、2016、Proceedings of the National Academy of Sciences of the U.S.A. vol 113(4)、E459-E468;Flemming、Alexandra、Nature Reviews Drug Discovery、15、157 (2016);Maら、PNAS. 2016. 113(4): E450-E458)に記載されており、各々は本明細書に参照によってその全体が組み込まれる。例えば、FITC及びPNEスイッチは、抗HER2 CARsの切り替え可能な発現を研究するため抗HER2 CARsに含まれた(Caoら、Angew. Chem. Int. Ed. 2016、55、7520-7524)。したがって、養子細胞治療は、切り替え可能であってもよい。一部の実施形態において、安全スイッチには、死遺伝子又は自殺遺伝子、例えばHSVtk、iC9、及びFADD、FITCベース合成スイッチ、及びPNEスイッチが含まれるが、これらに限定されない。
CARを発現する改変細胞は自己制限性であってもよく、例えば、キメラ受容体(CAR)は、改変細胞において一過性に発現されてもよい。一過性に組換えタンパク質を発現させる方法は、当技術分野において知られており、例えば、キメラ受容体をコードするRNA導入遺伝子でのトランスフェクションである。
低い度合の毒性、毒性の転帰又は症状、毒性促進プロファイル、CRS、MAS、TLS、及び神経毒性と関連する又はCRS、MAS、TLS、及び神経毒性の指標である症状又は転帰等の因子又は特性をもたらす方法が、本明細書に開示される。一部の実施形態において、毒性の転帰は、CRSである又はCRSと関連する。他の実施形態において、毒性は、MASと関連する。更に他の実施形態において、毒性は、神経毒性である。胸部障害を有する又は有するリスクがある対象の経乳頭処置は、そのような毒性作用を低下させるため望ましい。一部の態様において、より低い度合の毒性、転帰、症状、プロファイル、因子又は特性は、本明細書に開示される組成物が経乳頭的に投与される対象に観察される。
CRS、MAS、TLS等と関連する例示的な転帰は、当技術分野において知られており、医学の当業者には明らかである。例えば、CRSは、一部のケースでは、養子細胞治療及び他の生物学的産物の投与後に生じうる、並びに、典型的には、CRSは、CARを発現する細胞の注入後6-20日に典型的に生じる(Davilaら、Sci. Transl. Med. 6、224ra25 (2014);Brentjensら、Sci. Transl. Med. 5、177ra38 (2013);Xuら、Cancer Letters. 343 (2014) 172 -178)。そのような副作用又は転帰は、高レベルの循環型サイトカイン、例えばIFNγ、TNFα、及びIL-2が平行して認められ、これが観察される毒性の基礎をなしうる。同様に上昇する追加のサイトカインには、GM-CSF、IL-1ベータ、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、Flt-3、フラクタルカイン、MIP1、sIL-2Rα、及びIL-5が含まれるが、これらに限定されない。
本発明は、処置される対象のサイトカインレベルがモニターされることを意図しており、それに応じて、サイトカインレベルは、二倍より大きく増加する場合に主治医により用量が調整されてもよい。一部の実施形態において、第一の用量には、毒性又は毒性の転帰、例えばCRS関連、MAS関連、又はTLS関連転帰、又は投与される細胞及び/又は組換え受容体に対する宿主免疫応答、3日以上の少なくとも38℃の発熱及び20mg/dLの血漿CRPレベル、及び/又は神経毒性の原因とならない又は見込みを低下させない量で細胞が含まれる。他の実施形態において、用量は、初期用量後の副作用又は毒性の転帰、例えばCRS関連、MAS関連、又はTLS関連転帰、及び神経毒性のレベルに依存しうる。
CRSは、抗炎症治療、例えば抗IL6治療で処置されてもよい。そのような治療には、IL-6受容体に向けた抗IL-6抗体、例えばシルズマブ(siltuximab)及びトシリズマブ(tocilizumab)、又は抗生物質が含まれる。一部の実施形態において、対象は、処置レジメンの間の任意の時間にそのような治療で処置されてもよい。少なくとも1つの実施形態において、対象は、初期用量後の治療等で処置されてもよい。他の実施形態において、対象は、全ての用量の完了後の治療等で処置されてもよい。
養子細胞治療に観察されるCRS、MAS、TLS、神経毒性等はまた、本明細書に開示される(又は当技術分野において知られている)CID又はPNEトリガーを対象に投与すること及び/又は細胞を排除することによって、CAR投与された細胞(及びインビボ拡大された細胞)の発現をスイッチオフすることによって処置されてもよい。
併用療法
本発明は、本明細書に開示される経乳頭法が、併用療法を更に含むことを意図する。ある態様において、経乳頭法は、1つ又は複数の追加の治療剤又は治療を対象に施す工程を更に含む。追加の治療剤は、経乳頭的、経口的、経鼻的、注射又は注入による非経口的、皮下等を含むが、限定されない、当技術分野において知られている任意の適切な手段によって対象に投与されてもよい。追加の治療剤は、本明細書に開示される組成物に構成されてもよく又は独立に製剤化されてもよい。治療剤及び/又は治療の投与の順序は、投与の任意の順序であってもよい。例えば、本明細書に開示される細胞又は組成物は、治療剤と共に同時投与されてもよく又は治療剤は、最初に投与されてもよく又は治療剤は、本発明の細胞又は組成物が、投与された後に投与されてもよい。
追加の治療は、開示された方法の目的のため有用な任意のものでありうる。
例示的な追加の治療剤には、アスパラギナーゼ、ブスルファン、カルボプラチン、シスプラチン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、メトトレキセート、パクリタキセル、リツキシマブ、トラスツズマブ、ビンブラスチン、ビンクリスチン、腫瘍溶解性ウイルス、抗エストロゲン、例えばタモキシフェン、エンドキシフェン、N-メチル-エンドキシフェン、ノルエンドキシフェン、ラロキシフェン、フルベストラント及び/又はアロマターゼ阻害剤、例えばアナストロゾール、レトロゾール、及びエキセメスタンが含まれるが、限定されない。
追加の治療には、手術、放射線照射、化学療法、鍼、非経乳頭養子細胞治療等が含まれうる。本明細書に開示される方法は、一次治療、腫瘍免疫賦活薬治療(例えば、手術(例えば、***切除術又は腫瘍摘出術)又は化学療法前)、又はアジュバント治療(例示的な目的のみについて、化学療法又は養子細胞治療の他の方法での処置後)として使用されうる。
組成物及び製剤
投与用の改変細胞を含む組成物(医薬組成物及び製剤を含む)、例えば単位剤形組成物(所与の用量又はその一部分における投与のための細胞数を含む)も、本明細書に提供される。医薬組成物及び製剤には、1つ又は複数の任意選択の薬学的に許容される担体又は賦形剤が一般的に含まれる。一部の実施形態において、組成物には、少なくとも1つの追加の治療剤が含まれる。追加の治療剤は、アスパラギナーゼ、ブスルファン、カルボプラチン、シスプラチン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、メトトレキセート、パクリタキセル、リツキシマブ、ビンブラスチン、ビンクリスチン、腫瘍溶解性ウイルス、抗エストロゲン、例えばタモキシフェン、エンドキシフェン、ラロキシフェン、フルベストラント及び/又はアロマターゼ阻害剤、例えばアナストロゾール、レトロゾール、及びエキセメスタンからなる群から選択される。
本明細書で使用される用語「薬学的に許容される製剤」は、ここに含有される活性成分の生物活性が有効であることを容認する形態で、製剤が投与される対象に対して許容できない毒性がある追加の成分を含有しない調製物を指す。
本明細書で使用される用語「薬学的に許容される」又は「薬理学的に許容される」は、製剤の他の成分と適合性であり、対象に投与される場合に、毒性、アレルギー性、又は免疫学的な反応性等の有害な反応を実質的に産生しない、材料、組成物、又はビヒクルを意味する。それらは、米国連邦若しくは州政府等の規制当局に承認されていてもよい又は動物及び特にヒトにおける使用に関する米国薬局方又は他の一般に認識される薬局方に列挙されていてもよい。
本明細書で使用される用語「薬学的に許容される担体」又は「担体」は、薬学的に許容される材料又は対象に対して毒性ではない成分を意味する。薬学的に許容される担体には、緩衝剤、賦形剤、安定化剤、又は保存剤が含まれるが、限定されない。
経乳頭投与のための製剤は、胸部乳管への投与に適切な任意の製剤であってもよい。本明細書に開示される経乳頭投与の目的について、製剤は、溶液、ゲル、懸濁液、又はエマルジョンであってもよい。選択される担体は、特定の細胞によって及び/又は投与の方法によって部分的に決定されてもよい。担体は、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences、16th edition、Osol、A. Ed. (1980)によって記載されている。薬学的に許容される担体は、用いられる用量及び濃度でレシピエントに対して一般的に無毒であり:リン酸塩、クエン酸塩及びその他の有機酸等の緩衝剤;アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤;保存剤(例えば塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム;塩化ヘキサメトニウム;塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム;フェノール、ブチル若しくはベンジルアルコール;メチル若しくはプロピルパラベン等のアルキルパラベン;カテコール;レゾルシノール;シクロヘキサノール;3-ペンタノール;及びm-クレゾール);低分子量(約10残基未満)ポリペプチド;血清アルブミン、ゼラチン若しくは免疫グロブリン等のタンパク質;ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー;グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン若しくはリジン等のアミノ酸;グルコース、マンノース若しくはデキストリンを含む単糖、二糖及びその他の炭水化物;EDTA等のキレート化剤;スクロース、マンニトール、トレハロース若しくはソルビトール等の糖;ナトリウム等の塩形成性対イオン;金属錯体(例えばZn-タンパク質錯体);並びに/又はポリエチレングリコール(PEG)等の非イオン性界面活性剤が含まれるが、これらに限定されない。
適切な保存剤には、例えば、メチルパラベン、プロピルパラベン、安息香酸ナトリウム、及び塩化ベンザルコニウムが含まれうる。一部の態様において、2つ以上の保存剤の混合物が使用される。保存剤又はその混合物は、典型的には、総組成物の質量に対して、約0.0001質量%から約2質量%の量で存在する。
一部の態様において、緩衝剤が、組成物に含まれる。適切な緩衝剤には、例えば、クエン酸、クエン酸ナトリウム、リン酸、リン酸カリウム、及び様々な他の酸及び塩が含まれる。一部の態様において、2つ以上の緩衝剤の混合物が使用される。緩衝剤又はその混合物は、典型的には、総組成物の質量に対して、約0.001質量%から約4質量%の量で存在する。投与可能な医薬組成物を調製するための方法は、知られている。例示的な方法は、例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy、Lippincott Williams & Wilkins; 21st ed. (May 1、2005)により詳細に記載される。
製剤には、水性溶液が含まれうる。製剤又は組成物には、それぞれの活性が互いに悪く作用しない場合に、細胞、好ましくは、細胞に対して補足的な活性を有するもので処置される、特定の適応、疾患、又は状態に対して有用な、1つを超える活性成分も含有されうる。このような活性成分は、意図される目的にとって有効な量で、組み合わされて存在することが好適である。したがって、一部の実施形態において、医薬組成物には、他の薬学的に活性な剤又は薬物、例えば、化学療法剤、例えば、アスパラギナーゼ、ブスルファン、カルボプラチン、シスプラチン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、メトトレキセート、パクリタキセル、リツキシマブ、トラスツズマブ、ビンブラスチン、ビンクリスチン、腫瘍溶解性ウイルス、抗エストロゲン、例えばタモキシフェン、非エンドキシフェン、エンドキシフェン、ラロキシフェン、フルベストラント及び/又はアロマターゼ阻害剤、例えばアナストロゾール、レトロゾール、及びエキセメスタンが更に含まれる。
一部の実施形態において、医薬組成物は、胸部障害を処置又は予防するのに有効な量、例えば、治療的又は予防的に有効な量で細胞を含有する。治療的又は予防的な効能は、一部の実施形態において、処置される対象の周期的な評価によってモニターされる。
所望の用量は、細胞の単一のボーラス投与において、細胞の複数ボーラス投与(分割単位用量)によって又は細胞の連続投与によって、経乳頭的に投与されうる。細胞の投与は、自己又は異種性/アロジェニックであってもよい。例えば、細胞は、1つの対象から得られ、同じ対象又は異なる適合性の対象に投与することができる。末梢血由来の免疫細胞又はそれらの前駆体(インビボ、エクスビボ、又はインビトロ由来)は、経乳頭的に投与されうる。
経乳頭的に送達される製剤は、無菌液体調製物(例えば、無菌フィルター膜を通して濾過することによって滅菌される)、例えば、等張性水性溶液、懸濁液、エマルジョン剤、分散体、又は粘稠性組成物(ゲルを含む)として提供され、これは、選択されるpHに緩衝されてもよい。液体調製物は、ゲル及び他の粘稠性組成物よりも通常容易に調製される。加えて、液体組成物は、経乳頭的に投与するのに、いくらかより簡便である。
粘稠性組成物(ゲルを含む)は、特異的な組織、例えば胸部管内層でより長い接触期間を提供するため粘性の適切な範囲内で製剤化されてもよい。液体又は粘稠性組成物(ゲルを含む)は、担体を含んでもよく、これは、例えば、水、塩類溶液、リン酸緩衝生理食塩水、TRIS緩衝生理食塩水、乳酸加リンゲル溶液(USP)、ポリオール(例えば、グリセロール、プロピレングリセロール、ポリプロピレングリセロール、液体ポリプロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール)、及び適切なその混合物を含有する、溶媒又は分散媒であってもよい。
無菌の経乳頭的に投与可能な溶液は、適切な担体、希釈液、又は賦形剤、例えば、滅菌水、生理食塩水、グルコース、デキストロース等との混合物等の溶媒中に細胞を取り込むことによって調製されてもよい。組成物には、追加の物質、例えば湿潤剤、分散剤、又は乳化剤、例えばメチルセルロース、pH緩衝剤、ゲル化剤又は粘性増強剤、保存剤、矯味剤、着色剤又はその任意の組合せが更に含まれてもよい。
ゲル化剤は、Carbopol(登録商標)ポリマーの誘導体、例えばCarbopol(登録商標)Ultrez10、Carbopol(登録商標)940、Carbopol(登録商標)941、Carbopol(登録商標)954、Carbopol(登録商標)980、Carbopol(登録商標)981、Carbopol(登録商標)ETD2001、Carbopol(登録商標)EZ-2及びCarbopol(登録商標)EZ-3、カルボキシビニルポリマー(カルボマー)、ポロキソマー(polloxomer)、ポロキサミン、キトサン、デキストラン、ペクチン、天然ガム、Pemulen(登録商標)ポリマー性乳化剤、及びNoveon(登録商標)ポリカルボフィル、アクリルコポリマー、例えばアクリラート/アルキルアクリラートコポリマー、ポリアクリルアミド、セルロース誘導体、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース(HPMC)、及びカルボキシメチルセルロース(CMC)、ベントン、脂肪酸金属塩、例えばステアリン酸アルミニウム及び疎水性シリカ、又はエチルセルロース及びポリエチレンの誘導体を含む、ポリアクリル酸、(CARBOPOL(登録商標)、B.F.Goodrich Specialty Polymers and Chemicals Div. of Cleveland、Ohio)、カルボキシルポリメチレン、カルボキシメチルセルロース等からなる群から選択されうる。追加の濃縮剤、エンハンサー及びアジュバントは、Remington's The Science and Practice of Pharmacy、Meade Publishing Co.、United States Pharmacopeia/National Formularyに一般に見出されうる。親水性ゲル化剤には、ポリアクリル酸(カルボマー)、多糖、例えば、ヒドロキシプロピルセルロース、天然ガム及びクレイが含まれ、親油性ゲル化剤として、代表的なものは、改質クレイである。一部の実施形態において、ゲル化剤は、HPMCである。他の実施形態において、ゲル化剤は、CMCである。更に他の実施形態において、ゲル化剤は、Carbopolである。更に別の実施形態において、ゲル化剤は、アルギン酸塩又はゼラチンである。
ゲル化剤の濃度は、ゲルの粘性を変化させるため調整されうる。例えば、一部の実施形態において、製剤には、ゲル化剤の0.1%未満、0.5%、1%、2%未満、3%未満、4%未満、5%未満、10%未満が含まれる。或いは、ゲル化剤は、組成物の0.1%から80%w/wの範囲であってもよい。
微生物の保存剤、抗酸化剤、キレート化剤、及び緩衝剤を含む、組成物の安定性及び無菌性を増強する様々な添加物が、追加されてもよい。抗菌剤、例えば様々な抗細菌剤及び抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、及びソルビン酸が、取り込まれてもよい。
経乳頭の医薬品形態の長期吸収は、吸収を遅らせる剤、例えばモノステアリン酸アルミニウム、ポリエチレングリコール及びゼラチンの使用によって生じさせることができる。
別の態様において、組成物は、ガドリニウムキレート、超常磁性酸化鉄ナノ粒子(SPION)、19Fパーフルオロカーボンナノ粒子、及び他の磁気レポーター遺伝子、例えば金属タンパク質ベースMRIプローブを含む。
製品
製品、例えば、養子細胞治療について本明細書に開示される細胞及び組成物の投与のための並びに細胞及び組成物の貯蔵及び投与のためのキット及び装置も、本明細書に提供される。
製品には、1つ又は複数の容器、典型的には1つ又は複数の容器、パッケージング材料、及びラベル又は一般的には対象に対する細胞の投与についての指示書を含む添付文書が含まれる。
容器は、投与される細胞及び組成物の1つ又は複数の単位用量を含有する。一部の実施形態において、製品は、各々が単回の単位用量の細胞を含有する、1つ又は複数の容器を含む。単位用量は、第一の用量又は第一の若しくは引き続く用量で投与される細胞の二倍の数(以上)で対象に投与される細胞の量又は数であってもよい。投与方法に関連して対象に投与されるのは最低用量又は最低の可能な用量の細胞でありうる。
一部の実施形態において、単位用量は、最小細胞数又は本明細書の方法に従って任意の対象に対する単回用量において投与される細胞数である。一部の実施形態において、単位用量中の細胞数は、第一の用量において特定の対象(例えば、細胞が由来する対象)に対して投与することが所望される細胞数又は組換え受容体発現又はCAR発現細胞数である。
一部の実施形態において、細胞は、本明細書に提供される方法によって処置される又はそれを必要とする対象に由来する。
一部の実施形態において、1つ又は複数の単位用量は、同じ受容体(例えば、CAR)を発現する細胞を含有する。一部の態様において、1つ又は複数の単位用量は、1つ又は複数の他の単位用量と異なる受容体(例えば、CAR)を発現する細胞を含有する。
一部の実施形態において、各々の容器は、同じ又は実質的に同じ数の細胞を含有する、第一、又は第二、又は第三等の受容体を発現する細胞の単位用量を個々に含む。したがって、一部の実施形態において、各々の容器は、同じ若しくはおよそ若しくは実質的に同じ数の細胞又は同じ数の組換え受容体発現細胞を含む。一部の実施形態において、単位用量には、1×103未満、0.5×104未満、1×104未満、0.5×105未満、1×105未満、0.5×106未満、1×106未満、0.5×107未満、1×107未満、0.5×108未満、1×108未満、5×108未満の改変細胞、全細胞、T細胞、NK細胞、CTL、マクロファージ、単球、顆粒球、PBMC、又はその前駆体が含まれる。
一部の実施形態において、製品には、1つ又は複数の追加の他の薬学的に活性な剤又は薬物、例えば、化学療法剤、例えば、アスパラギナーゼ、ブスルファン、カルボプラチン、シスプラチン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、メトトレキセート、パクリタキセル、リツキシマブ、トラスツズマブ、ビンブラスチン、ビンクリスチン、腫瘍溶解性ウイルス、抗エストロゲン、例えばタモキシフェン、エンドキシフェン、ラロキシフェン、フルベストラント及び/又はアロマターゼ阻害剤、例えばアナストロゾール、レトロゾール、及びエキセメスタンが更に含まれる。
適切な容器には、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、及びフレキシブルバッグ、例えば、輸液バッグが含まれるが、限定されない。容器は、種々の材料、例えばガラス又はプラスチックから形成されてもよい。一部の実施形態において、容器は、例えば、1つ又は複数のチューブへのチューブの連結又はカニューレ挿入のための、例えば、経乳頭送達のための及び/又は細胞培養及び/又は貯蔵バッグ又は他の容器等の他の容器への及び他の容器からの導入の目的での連結のための、1つ又は複数のポート、例えば、無菌アクセスポートを有する。
製品には、1つ又は複数の識別情報及び/又は使用に関する指示を有する添付文書又はラベルが更に含まれうる。一部の実施形態において、情報又は指示は、内容が胸部障害を処置するため使用できる又はすべきであることを示す及び/又はそれに関する指示を提供する。ラベル又は添付文書は、製品の内容が、胸部障害を処置するため使用されることを示してもよい。一部の実施形態において、ラベル又は添付文書は、例えば、対象(例えば、細胞が由来する対象)を、(例えば、提供される方法の任意の実施形態に従って)第一の及び1つ又は複数の引き続く用量の細胞の投与が関与する方法を介して、処置するための指示書を提供する。一部の実施形態において、指示書は、1つの単位用量の第一の用量、例えば、製品中の単一の個々の容器の内容物、続いて特定の時点又は特定の時間枠内及び/又は1つ又は複数の因子の存在又は非存在又は量又は度合又は対象における転帰の検出後での1つ又は複数の引き続く用量における投与を特定する。
本明細書で使用される用語「1つの(a)」、「1つの(an)」及び「その(the)」は、文脈が別段の規定をしない限り、複数の指示物を含む。
本明細書で使用される用語「約」は、測定可能な値、例えば量、時間的な持続時間等を指し、特定の値からの±20%又は一部の例において±10%、又は一部の例において±5%、一部の例において±1%、及び一部の例において±0.1%の変更を包含することを意味し、それ自体で、変更は、開示される方法を実施するため適切である。
本明細書で使用される「活性化」は、検出可能な細胞増殖を誘導するため十分に刺激されている細胞の状態を指す。活性化はまた、サイトカイン産生及び検出可能なエフェクター機能の誘導と関連しうる。用語「活性化T細胞」は、とりわけ、細胞***を経験しているT細胞を指す。
本明細書で使用される「アジュバント治療」は、一次治療後に、再発のリスクがある対象に投与される治療を指す。これらは、胸部障害の病歴があり、別モードの治療で処置されている対象である。乳がんのケースのアジュバント全身治療は、再発を遅延させ、生存を延長させ、又は対象を治癒させるため、一次治療直後に通常開始される。本明細書で使用される「一次治療」は、対象における胸部障害の初期診断の際の第一選択の処置を指す。非限定的な例示的な一次治療には、手術、広範囲の化学療法、及び放射線治療を伴っていてもよい。
本明細書で使用される、用語「有するリスク」には、胸部障害を発症するリスク並びに胸部障害の再発のリスクが含まれる。
本明細書で使用される、用語「対象」、「患者」、及び「個体」は、本明細書において交換可能に使用されてもよく、ヒト等の哺乳動物を指す。哺乳動物には、愛玩動物、例えばイヌ、ネコ、実験動物、例えばラット、マウス、及び家畜、例えばウシ及びウマも含まれる。別の特定がない限り、哺乳動物は、任意のジェンダー又は性別であってもよい。
本明細書で使用される、本開示の養子細胞治療又は組成物に関する「投与の経路」又は「送達の経路」は、対象に本開示の細胞又は組成物を送達するための経路を指す。
特定の実施形態
1.対象の胸部管に細胞を投与する工程を含む、胸部障害を有する又は有するリスクがある対象の処置のための養子細胞治療の経乳頭法。
2.細胞が、T細胞、NK細胞、CTL、TIL、単球、顆粒球、又はその前駆体を含む、請求項1に記載の方法。
3.細胞が、胸部細胞における標的抗原に結合する1つ又は複数の組換え受容体を発現する改変細胞を含む、請求項1に記載の方法。
4.1つ又は複数の組換え受容体が、キメラ抗原受容体(CAR)又は操作された若しくは疾患特異的なTCRを含む、請求項3に記載の方法。
5.改変細胞が、2つ以上のCARを発現する、請求項3に記載の方法。
6.1つ又は複数の組換え受容体が、独立に単一特異性、二重特異性又は多重特異性である、請求項3から5のいずれか一項に記載の方法。
7.1つ又は複数の組換え受容体が、構成的に、一過性に、若しくは切り替え可能に発現される、又は条件的に活性である、請求項3から6のいずれか一項に記載の方法。
8.改変細胞が、死遺伝子スイッチ、FITCベースのスイッチ、及びPNEベースのスイッチからなる群から選択される安全スイッチを含む、請求項3から7のいずれか一項に記載の方法。
9.死遺伝子スイッチが、HSV-tk、iCaspase9又はFADDである、請求項8に記載の方法。
10.標的抗原が、腫瘍特異性抗原、腫瘍関連抗原、多系統腫瘍関連抗原、癌胎児性抗原、新抗原、又は免疫抑制抗原である、請求項3から9のいずれか一項に記載の方法。
11.標的抗原が、形質転換関連分子、例えばMUC、例えばMUC1、c-met、サイトケラチン、例えばCK5、CK6、CK14、CK7、CK8、CK14、CK17、CK18、CK19、p53、グリコシド、Tn、TF、及びシアリルTn(STn)、ルイスx、ルイスa、ルイスy、及びガングリオシド、例えばGM3、GD3、9-0-アセチルGD3、9-0-アセチルGT3、及びN-グリコリ-GM3、葉酸受容体アルファ、ROR1、新抗原、腫瘍特異的抗原及び癌胎児性抗原、腫瘍関連抗原、例えば癌胎児性抗原(CEA)、L1細胞接着分子(L1CAM)、CAFs-関連タンパク質、例えば線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)、FAP-α、FSP-1/S100A4、及びPDGFR-β、ジガングリオシドGD2、メソテリン、IL-13受容体IL13R、IL13受容体α、エフリンB2、IGFR1、ELIGHT、WT1、TAG-72、Ep-CAM、LFA-1、EGFR、エストロゲン受容体(ER)、プロゲステロン受容体、MAGE1、MAGE-3、MAGE-A3/6、MAGE-Aファミリーメンバー、例えばMAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A6、MAGE-A12、MAGE-A9、MAGE-A11、MAGE-C1、及びMAGE-C2、RAGE、BCR-ABL、タンパク質チロシンキナーゼ、例えばPRL-2及びPRL3、腫瘍関連糖タンパク質、例えばTAG-72、CA19-9、CA27.29、CA72-4、CA50、PD-1、CTLA-4、CD47、受容体チロシンキナーゼ、例えばH4-RET、Ki-67、サイクリンD1、サイクリンA、サイクリンE、p16、p21、p27、p53、Bcl-2、Bax、サバイビン、c-myc、Rb、VEGF、HPR1、HER1、HER2、HER3、HER4、CD10、SPARC、COX-2、基礎サイトケラチン、CK5/6、CK14、及びCK17、上皮増殖因子受容体、c-kit、c-erbB-2、IL-10、TGFベータ、CCL17、CCL22、及びCCL24ストローマ放出因子、例えばEGF、HGF、MCP-1、CSF-1、VEGF、サイトカイン、例えばIL1、IL-8、TNF-アルファ、酵素、例えばMM2、MMP7、MMP8、MMP9、MMP12、MMP13、及びCOX2からなる群から選択される、請求項3から10のいずれか一項に記載の方法。
12.組換え受容体が、HER2-CAR、FR-α-CAR、又はFAP-CARである、請求項3から10のいずれか一項に記載の方法。
13.組換え受容体が、TCRゼータ、FcRガンマ、FcRベータ、CD3ガンマ、CD3デルタ、CD3イプシロン、CD4、CD8、CD16、CD22、CD25、CD79a、CD79b、及びCD66dからなる群から選択される一次シグナル伝達分子を含む、請求項3から12のいずれか一項に記載の方法。
14.組換え受容体が、1つ又は複数の共刺激分子を含む、請求項3から13のいずれか一項に記載の方法。
15.共刺激分子が、MHCクラスI分子、BTLA及びTollリガンド受容体、免疫グロブリンスーパーファミリー(IgSF)、例えばCD28、B7受容体ファミリーメンバー(B7-H2/B7RP-1/LICOS/GL50、B7-DC/PD-L2、B7-H3)、CD226、TIM、CD2/SLAM、BTN、LAIR、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー(TNFRSF)、例えばOX40、CD27、CD30、DR3、GITR、及びT細胞におけるHVEM、CD2及びSLAM、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、付着分子(CD54、CD58、CD70)、ICOS、CD40、CD40L、4-1BB(CD137)、CD70、CD80、CD86、DAP10、及び他のオーファン受容体ファミリー、例えばLAG3(CD223)及びCD160からなる群から選択される、請求項3から14のいずれか一項に記載の方法。
16.組換え受容体が、共刺激分子としてCD28及び4-1BBを含む、請求項3から14のいずれか一項に記載の方法。
17.改変細胞が、T細胞、NK細胞、CTL、単球、顆粒球、又はその前駆体を含む、請求項3から16のいずれか一項に記載の方法。
18.改変細胞が、ガドリニウムキレート、超常磁性酸化鉄ナノ粒子(SPION)、19Fパーフルオロカーボンナノ粒子、及び他の磁気レポーター遺伝子、例えば金属タンパク質ベースMRIプローブからなる群から選択される色素又は造影剤を更に含む、請求項3から17のいずれか一項に記載の方法。
19.細胞が、薬学的に許容される担体、緩衝剤、賦形剤又はその組合せを更に含む組成物に製剤化される、請求項1から18のいずれか一項に記載の方法。
20.担体が、乳酸加リンゲル溶液である、請求項19に記載の方法。
21.組成物が、ゲル化剤を更に含む、請求項19に記載の方法。
22.胸部障害が、良性の胸部疾患、乳がん、乳首のパジェット病、又は葉状腫瘍である、請求項1から21のいずれか一項に記載の方法。
23.胸部障害が、過形成、非定型性、導管過形成、小葉過形成、非定型導管過形成(ADH)、又は非定型小葉過形成(ALH)である、請求項1から22のいずれか一項に記載の方法。
24.胸部障害が、導管上皮内癌(DCIS)、小葉上皮内癌(LCIS)、侵襲性(又は浸潤性)小葉癌(ILC)、侵襲性(又は浸潤性)導管癌(IDC)、微小浸潤性乳癌(MIC)、炎症性乳がん、ER陽性(ER+)乳がん、プロゲステロン受容体陽性(PR+)乳がん、ER+/PR+乳がん、ER陰性(ER-)乳がん、HER2+乳がん、三重陰性乳がん(すなわち、ER-/PR-/Her2-乳がん;「TNBC」)、腺様嚢胞癌(腺様嚢胞)癌、低グレード腺扁平上皮癌、髄様癌、粘液(又はコロイド)癌、乳頭癌、管状腺癌、化生性癌、又は微小乳頭癌からなる群から選択される乳がんである、請求項1から23のいずれか一項に記載の方法。
25.乳がんが、前癌、早期段階のがん、非転移性がん、転移前がん、局所的に進行したがん、転移性がん又は再発性のがんである、請求項1から24のいずれか一項に記載の方法。
26.細胞が、単回用量又は複数回用量で投与される、請求項1から25のいずれか一項に記載の方法。
27.複数回用量が、第一の用量及び1つ又は複数の引き続く用量を含む、請求項26に記載の方法。
28.1つ又は複数の用量が、分割単位用量で投与される、請求項26に記載の方法。
29.対象が、1×103から1×109改変細胞/kg体重、1×103から5×108改変細胞/kg体重、0.5×103から1×107改変細胞/kg体重、1×104から0.5×106改変細胞/kg体重、0.5×104から1×106改変細胞/kg体重、1×105から0.5×106改変細胞/kg体重の範囲の細胞の単位用量を投与される、請求項1から28のいずれか一項に記載の方法。
30.第一の用量が、1×103細胞未満/kg、0.5×104細胞未満/kg、1×104細胞未満/kg、0.5×105細胞未満/kg、1×105細胞未満/kg、0.5×106細胞未満/kg、又は1×106細胞未満/kg等の低用量である、請求項27に記載の方法。
31.第一の用量が、0.5×105細胞超/kg、1×105細胞超/kg、0.5×106細胞超/kg、1×106細胞超/kg、0.5×107細胞超/kg、1×107細胞超/kg、0.5×108細胞超/kg、1×108細胞超/kg、又は5×108細胞超/kg等の高用量である、請求項27に記載の方法。
32.引き続く用量が、第一の用量の開始後7日から28日の間に投与される、請求項27に記載の方法。
33.引き続く用量が、第一の用量と同じ、第一の用量より低い又は第一の用量より高い、請求項27に記載の方法。
34.細胞が、一次治療、腫瘍免疫賦活薬治療、又はアジュバント治療として投与される、請求項1から33のいずれか一項に記載の方法。
35.細胞の投与が、対象における胸部障害の疾患負担を低下させる、請求項1から34のいずれか一項に記載の方法。
36.組換え受容体を含む改変細胞の投与が、対象における腫瘍負担を低下させる、請求項1から35のいずれか一項に記載の方法。
37.細胞の投与が、腫瘍負担を低下させる、請求項1から36のいずれか一項に記載の方法。
38.改変細胞の投与が、腫瘍負担を低下させる、請求項1から37のいずれか一項に記載の方法。
39.投与が、CRS関連、MAS関連、TLS関連、神経毒性関連又は宿主免疫応答関連の転帰のリスクを低下させる、請求項1から38のいずれか一項に記載の方法。
40.細胞の投与が、サイトカイン、例えばIFNγ、TNFα、IL-2、GM-CSF、IL-1ベータ、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、Flt-3、フラクタルカイン、MIP1、sIL-2Rα、及びIL-5の循環又は胸部組織レベルを低下させる、請求項1から39のいずれか一項に記載の方法。
41.改変細胞の投与が、サイトカイン、例えばIFNγ、TNFα、IL-2、GM-CSF、IL-1ベータ、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、Flt-3、フラクタルカイン、MIP1、sIL-2Rα、及びIL-5の循環又は胸部組織レベルを低下させる、請求項1から40のいずれか一項に記載の方法。
42.対象が、細胞の投与の前に、リンパ球枯渇剤又は化学療法剤で前処理される、請求項1から41のいずれか一項に記載の方法。
43.リンパ球枯渇剤又は化学療法剤が、シクロホスファミド、シクロスポリン、フルダラビン、ベンダムスチン、レナリドマイド、ポマリドミド、ゲムシタビン、BTK阻害剤、例えばイブルチニブ、腫瘍溶解性アデノウイルス、又はその組合せからなる群から選択される、請求項42に記載の方法。
44.対象が、追加の治療剤又は治療を施される、請求項1から43のいずれか一項に記載の方法。
45.追加の治療剤が、アスパラギナーゼ、ブスルファン、カルボプラチン、シスプラチン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、メトトレキセート、パクリタキセル、リツキシマブ、ビンブラスチン、ビンクリスチン、腫瘍溶解性ウイルス、例えば腫瘍溶解性アデノウイルス、抗エストロゲン、例えばタモキシフェン、N-メチル-エンドキシフェン、ノルエンドキシフェン、エンドキシフェン、ラロキシフェン、フルベストラント及び/又はアロマターゼ阻害剤、例えばアナストロゾール、レトロゾール、及びエキセメスタンからなる群から選択される、請求項44に記載の方法。
46.対象の胸部管にHER2-CAR、FAP-CAR、又はFR-αを発現する改変細胞を投与する工程を含む、胸部障害を有する又は有するリスクがある対象の処置のための養子細胞治療の経乳頭法。
47.HER2-CARが、図2に開示された配列番号1又はその変異体若しくは機能的な部分に対して少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、及び100%の相同性を有する、請求項46に記載の方法。
48.FAP-CARが、図2に開示された配列番号2又はその変異体若しくは機能的な部分に対して少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、及び100%の相同性を有する、請求項46に記載の方法。
49.1つ又は複数の容器、パッケージング材料、ラベル又は添付文書、及び場合により装置を含む製品。
50.装置が、針及びシリンジ、カニューレ、カテーテル、マイクロカテーテル、浸透圧ポンプ、又は封入装置である、請求項49に記載の製品。
本開示の全体にわたって、主張される主題の様々な態様が、範囲の形式で又は絶対値若しくはパラメータで提示される。範囲の形式での記載は、単に簡便さ及び簡潔さのためであり、主張される主題の範囲に対する確固たる限定として解釈すべきでないことを、理解すべきである。したがって、範囲の記載は、全ての可能な下位範囲並びにその範囲内の個々の数値を具体的に開示したと考えるべきである。例えば、値の範囲が提供される場合、その範囲中の上限と下限の間の各介在値及びその記述範囲中の任意の他の記述された値又は介在値が、主張される主題内に包含されることが理解される。これらのより小さい範囲の上限と下限は、小さい範囲に独立に含まれてもよく、その記述範囲中の任意の具体的に除外される限定の対象になる、主張される主題内でも包含される。記述範囲に限定の一方又は両方が含まれる場合、それらの含まれる限定のいずれか又は両方を除外する範囲も、主張される主題に含まれる。これは、範囲の幅にかかわらず適用される。絶対値又はパラメータに対する参照がある場合、絶対値又はパラメータには、本技術分野の当業者が容易に知るそれぞれの値又はパラメータの通常の誤差範囲が含まれることが意図される。本明細書における絶対値又はパラメータへの参照には、その値又はパラメータ自体に向けられた実施形態が含まれる(及び記載される)。
本出願において参照される特許文献、科学論文及びデータベースを含む全ての公開は、あたかも各々個々の文献が、参照によって個々に組み込まれるように、全ての目的について同じ程度まで、参照によってその全体が組み込まれる。本明細書に述べた定義が、参照によって本明細書に組み込まれる特許、出願、公開出願及び他の公開において述べられた定義と反対である又はそうでなければ一致しない場合、本明細書に述べた定義が、本明細書中に参照によって組み込まれる定義に対して優先される。
本明細書で使用する段落の見出しは、単なる構成的な目的のためであり、記載される主題を限定するものと解釈されない。
本開示の本明細書に提供される実施例は、例示目的のみであることが意図され、本発明の範囲を限定することは意図されない。
(実施例1)
経乳頭的な養子細胞治療後の改変細胞輸送の動態
乳がんの処置のための手術を受けることが計画された八(8)名の対象が、以下の通り、経乳頭的な養子細胞治療後に胸部を移動及び通過する改変細胞の動態の研究に登録された:
対照細胞。改変T細胞は、タグ、例えばStrep-タグII又は抗flurescein-scFV(対照細胞)を含むベクターカセットが導入されたモックである。1×102から5×109 の範囲の用量での対照細胞が、四(4)名の対象の胸部管に経乳頭的に投与された。血液試料は、胸部管への対照細胞の経乳頭投与後のゼロ(0)、1、2、4、8、12、24、36、48、72時間、及び7日の対象から得られた。末梢血単核球(PBMC)は、Lymphocyte Separation Medium(Mediatech Inc社、Manassas、VA)を使用して製造業者の指示に従って単離された。単離された末梢血単核球(PBMC)を10μlの1.2%ヒトIgG溶液(Baxter社、Deerfield、IL)とインキュベートして非特異的な抗体結合をブロックした。PBMCはFACSによって細胞ソーティングされ、対照細胞が分離され、計数された。末梢循環中の対照細胞の出現数及びタイミングが決定された。
CAR-T細胞等の組換え受容体を発現する改変細胞:1×102から5×109の範囲の用量でのHER2-CAR発現T細胞が、四(4)名の対象の胸部管に経乳頭的に投与されて、末梢循環中の遊走及び出現の動態が決定された。改変細胞は、血液中での遅延出現及び対照細胞と比較して数の低下を示すことが期待された。
一部の対象に投与された対照細胞及びHER2発現改変細胞は、ガドリニウムキレートも負荷された。ガドリニウムキレートが負荷された対照細胞及びHER2発現改変細胞を投薬した対象は、経乳頭的に投与された細胞の遊走を追跡するため、0日及び7日にMRIスキャンを受けた。
計画された限定的な手術(主治医によって推奨される腫瘍摘出術又は***切除術のいずれか)後に、胸部組織試料が採取された。HER2を使用するELISAが胸部組織試料で実施され、T細胞表現型及び局所性細胞応答、例えばサイトカイン放出が決定された。センチネル又は他のリンパ節が場合により採取され、組織試料への投与された細胞の遊走に関して試験された。T細胞は、インビボで拡大し、メモリー表現型をとる及び/又は抗腫瘍性細胞傷害性活性を有することが期待された。
(実施例2)
HER2-CAR発現リンパ球を有する局所性乳がんの処置
臨床試験:フェーズI/II臨床試験は、リンパ球枯渇前処理、続いて抗HER-2遺伝子導入リンパ球(改変細胞)の管内投与を使用して、HER-2を発現する局所性乳がんを有する対象で実施された。
対象組み入れ基準には、Clinical Laboratory Improvement Amendments (CLIA)承認研究室での免疫組織化学によって評価される≧2+でErbB2(HER-2)を発現する、改変細胞の管内投与後に***切除術が実施される乳がんが含まれた。対象は、≧18歳。ヘルシンキプロトコールの宣言に従い、対象からの書面でのインフォームドコンセントが得られた。
改変細胞(導入された末梢血リンパ球(PBL))での処置を受ける前、対象は、シクロホスファミドを60mg/kgで2日続いてフルダラビンを25mg/m2で5日の静脈内投与での非骨髄機能廃絶リンパ球枯渇レジメンを使用して一過性にリンパ球枯渇させた。それらのリンパ球枯渇レジメンの完了後1日目、対象は、カテーテルを使用して管内に投与される改変細胞を受け取り、続いて高用量(720,000U/kg) IL-2(Aldesleukin;Chiron、Emeryville、CA)を8時間毎に受け取り、耐性を誘導させた。プロトコールは、各三名の患者のコホートにおける細胞用量漸増として設計された。最低の細胞用量コホートは、≦103細胞/管内投与。最高の用量は、5×109。
遺伝子導入手順:Herceptin mAbに基づくHER2特異的な単一鎖Fv断片(4D5-CD8-28BBZ)を発現するよう設計されたγレトロウイルスベクタープラスミド構築物は、文献(Zhao Yら、J Immunol. 2009;183:5563-5574及びその補遺S1)に記載されているように調製された。簡潔に述べると、mAb 4D5からの単一鎖Fv断片が、連結されて、CD8α鎖ヒンジ及び膜貫通領域とCD28、4-1BB、及びCD3ゼータ細胞内シグナル伝達ドメインを有する。このカセットが、MSGV-1 γレトロウイルスベクターに挿入された。
高力価PG13細胞ベースプロデューサー細胞株が選択され、現行のgood manufacturing practicesを使用して導入され、レトロウイルスベクター上清が収集された。ベクター上清は、試験され、臨床適用のための組換えγレトロウイルスベクターの産生に関する現在必要とされる米国食品医薬品局ガイドラインに合致した。
トランスダクション手順:PBMCは、5%ヒト血清(Surgery Branch、NCI)を含有するAIM-V培地(Invitrogen社、Carlsbad、CA)中で、抗CD3 mAb OKT3(Ortho Diagnostic Systems社、Raritan、NJ)を終濃度50ng/ml、組換えヒトIL-2を終濃度300IU/mlで刺激された。細胞は、2日にレトロウイルストランスダクションのため採取され、OKT3なしの同じ培地に再懸濁された。レトロウイルスベクター上清は、解凍され、RetroNectin(CH-296;Takara Bio社、Ohtsu、Japan)被覆(10mg/mlのCH-296を使用して被覆)非組織培養処理6ウェルプレートに負荷される前に、二部の培地で希釈された。ベクター上清は、2時間<32℃での2,000gの遠心分離によって被覆プレートに「スピン負荷(spun loaded)」された。レトロウイルスベクターは、ウェルから吸引され、1×106から2×106の活性化PBMCが、プレウェルに追加され、続いて1,000gで10分間遠心分離された。プレートは、37℃で一晩インキュベートされ、次の日に全てのウェルは、採取され、プールされ、トランスダクション手順が繰り返された。第二のトランスダクション後、細胞は、収集され、0.5×106から2.0×106細胞/mlで刺激後合計10日間培地に維持された。刺激後10日目、細胞は、6,000IU/ml IL-2と50ng/ml抗CD3 mAb OKT3及び100倍過剰の5Gyを照射したアロジェニックPBLフィーダー細胞を使用して追加の14日の急速な拡大手順に供された。処置細胞は、注入前に生理食塩水中で洗浄され、300IU/ml IL-2を含有する125ml中に再懸濁され、次に患者の管内に投与された。
インビトロアッセイ:注入前の2から4日、CAR導入PBLは、ERBB2-Fc融合タンパク質又は対照としてVEGFR2-Fc(R&D Systems社、Minneapolis、MN)続いてフィコエリトリンコンジュゲート抗ヒトIgG Fc抗体(eBioscience社、San Diego、CA)を使用して、ERBB2特異的CAR発現について評価された。免疫蛍光は、生細胞の相対log蛍光として分析され、FACSCaliburフローサイトメーター(Becton Dickinson社、Franklin Lakes、NJ)を使用して測定された。細胞機能は、HER2発現及び非発現標的細胞(1×105標的+1×105エフェクターT細胞)との一晩の共培養、続いてIFN-γの酵素結合免疫吸着検査法(ELISA)測定(Pierce Endogen社、Rockford、IL)によって評価された。HER2+標的細胞、例えばメラノーマ細胞株526、624、888、938(the Surgery Branch、NCIで生成された)及びATCCから得られた腫瘍株、SK-OV3、SK-BR3、MDA361(American Type Culture Collection、Rockville、MD)、並びにHER2-腫瘍株MDA468及びCCRF-CEM(CEM)。全ての腫瘍細胞株は、10%熱不活化ウシ胎児血清(Biofluids社、Rockville、MD)、100U/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシン(Invitrogen社)を補充されたRPMI-1640からなる培地で培養された。Lonza社(Walkersville、MD)から市販されている非形質転換ヒト細胞培養が、購入され、供給者が推奨する培地で維持された。自己樹状細胞及びマクロファージ培養は、対象のPBMCから得られた(Lassus Hら、J. Mol. Med. 2006;84: 671-681)。
ゲノムDNAは、Maxwell 16 Tissue DNA Purificationキット(Promega社、Madison、WI)を使用して製造業者の指示に従って急速冷凍した組織試料から単離された。各DNAの100ナノグラムが、Real-time定量的PCRアッセイ(TaqMan;Applied Biosystems社、Foster City、CA)のため使用された。全てのPCRは、ABI 7500 Fast Real-time PCR System機器(Applied Biosystems社)を使用して実施された。TaqMan遺伝子特異的アッセイは、ABI Assays-by-Designsソフトウェア(Applied Biosystems社)によって設計された。HER2-CARベクターの検出のため使用されたプライマー及びプローブは:4D5BBCD3Z-F TGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAG(配列番号9)、4D5BBCD3Z-R TGCGCTCCTGCTGAACT(配列番号10)、4D5BBCD3Z-M FAMプローブCACTCTCAGTTCACATCCT(配列番号11)である。参照標準曲線は対象に注入された細胞から抽出されたDNAを使用して確立され、未希釈の注入DNAは参照として100の値が与えられた。TaqManβアクチン対照試薬キット(Applied Biosystems社)を使用して、インプットDNA量に対して反応を標準化した。サイトカインゲノタイプは、市販されているPCR配列特異的プライマーキット(Cytokine Genotype Tray;One Lambda社、Canoga Park、CA)を使用して供給者による指導の通り決定された。
血清サイトカインレベルは、市販されている酵素結合免疫吸着検査法キット[IFN-γ、TNF-α、GM-CSF、及びIL-6(Endogen社、Cambridge、MA)]又はSearchlightサイトカインアレイ(Aushon Biosystems社、Billerica、MA)を使用してアッセイされる。サイトカイン分泌は、アッセイの直線範囲にあるよう希釈された試料において測定される。
改変細胞の管内投与。
乳首調製。対象が脱衣した後に、臨床医は胸部の乳首を洗浄して研究した。これには、若干顆粒状のゲル又は軟膏で乳首を清潔に拭いて、いかなる皮膚死細胞及び蓄積した油分をもゆるやかにして除去することが含まれる。これは、医療手順を踏む前に病院で頻繁に使用されるクレンザーである。その後、ある種の麻痺クリームが、乳首に適用される。
乳首麻酔。1mLのリドカインと0.1-0.2mLの青色色素の混合物が、微少針で乳頭の基部に注射された。
管識別。色素注射後且つカテーテル配置前に、小さい、可動性のワイヤーが、開口部に約1/2インチ挿入されて、管開口部が更に識別され、拡張された。管が識別されたら、結節縫合材の小断片が管に挿入され、それがマークされた。これは、少なくとも3つ(多ければ5つもの)の管開口部に行われた。臨床医が少なくとも3つの管開口部を見出すことができない場合、対象は研究を継続できず、中止させられた。これらの対象は、新しく登録された対象で置き換えられた。
カテーテル配置、トランスフェクトされたT細胞の点滴注入、及びX線検査。全ての乳首管開口部がマークされたら、臨床医は、管開口部を介してそのようにマークされた各々のマークされた胸部管へとカテーテルを挿入し、配置する。カテーテルが配置されたら、臨床医は、場合により、1mL未満の放射線不透過性色素を管に緩徐に(30秒間かけて)点滴注入して管の画像化を可能にしてもよい。
色素点滴注入後に、識別された管の数に応じて、トランスフェクトされた細胞の2mL(一般に0.5から2mLの範囲)までの懸濁液が、各管に緩徐(1分間かけて)に注射された。浸潤癌を含有する胸部だけが、処置された。細胞は、10mLまでの容量をバッチで又は処置される管の数に応じたセットで罹患した胸部管に経乳頭的に投与された。識別された罹患した管又は小葉の数に基づいて管ごとに均等に用量が分布するように試みた。
カテーテルは、一般的に各管中に、およそ1-5分間残る。その手順の間、対象は、視覚的なアナログスケールを使用して、彼らの疼痛を評価するため問診された。色素及び細胞が点滴注入された後、画像が撮られ、管への改変細胞の適切な注入が実証された。罹患した管の数が2管よりも多い場合、経乳頭養子細胞治療手順は、セットで行われてもよい。カテーテルは第一のセットの管(例えば、2つの隣接する管)から取り除かれ、これらの管は結節縫合材の小断片で各々マークされた。この点で、対象は、疼痛評価に関する疼痛スケールを使用して疼痛について評価された。
引き続いて、新しいカテーテルが、残りのマークされた管に挿入された。乳首管の次の半分へのカニューレ挿入並びに色素及び細胞の注入後、別の画像がX線透視装置で撮られ、管が記録された。対象は、彼らの疼痛を評価するため再び問診された。カテーテルは取り除かれ、管は結節縫合材の小断片で個々にマークされた。ベンゾイン軟膏及び透明なプラスチック包帯剤(生体閉塞性)が乳首に配置されて、手術までマーカーが定位置に留められた。全体の手順に、0.5から1.5時間が費やされた。手順の写真が撮られた。
疼痛の評価の期間に、対象が胸部にグレード3又は4の疼痛を報告し、それが改変細胞の注入後10分間以内に解決しない場合、研究関連の手順は、その対象については中断された。血液が取られ、追跡評価され、本明細書に記載される病理学的な評価が、プロトコールで実施された。このケースでは、対象は、統計学的な目的のため試験群中で置き換えられた。
初期のX線検査穿孔で副作用が記録された場合、直ちに評価された。対象が、何らかの好ましくない作用を報告しない場合、残りの管はカニューレ挿入され、改変細胞が投与された。研究関連して血液が取られ、評価され、以下に記載される病理学的な評価が、プロトコールで実施された。
(実施例3)
HER2-CAR発現自己T細胞での管上皮内癌の処置
研究は自己T細胞の経乳頭投与の安全性及び可能性を決定するため設計され、その細胞は、その細胞に導入された遺伝物質を有し、それらの通常の標的というよりむしろ標的乳がん細胞に対し、それらが転嫁させられる。適格な対象は、HER2+及び/又は一種の標準的な治療に対して耐性のある再発性乳がんを有する又は新しく診断されたHER2+乳がんを有する。
18歳超で、ベースラインのECOG状態が0又は1である15名の評価可能な患者は、段階的な様式で登録された。ステップ1では、HER2+及び/又は少なくとも1つの標準的な治療(例えば、タモキシフェン又は他の化学療法)に対して耐性のある再発性乳がんを有する対象が登録され、ステップ2では、新しく診断されたDCISの対象が登録された。対象は、自殺安全スイッチ、誘導性カスパーゼ9(iC9)を含み、対象中のDCIS細胞に発現されるHER2(HER2-CAR-T細胞)に特異的に結合する、改変T細胞発現キメラ抗原受容体(iC9-Her2scFV-CD8aヒンジ-CD28 Tm-CD28共刺激ドメイン及びCD3ζ細胞内シグナル伝達ドメイン)を受けた。
T細胞は、免疫親和性ベースの濃縮によってDCISを有する登録されたヒト対象の末梢血から単離され、細胞は、培養され、Sunら(Breast Cancer Research、2014、16:R61)によって記載されたHER2scFV-CD8aヒンジ-CD28Tm-CD28-CD3ζ構築物に接続されている死遺伝子安全スイッチiC9を含むベクターが導入された。HER2-CAR(iC9-HER2scFV-CD8aヒンジ-CD28Tm-CD28-CD3ζ)を発現する改変細胞は、個々のカニューレの培地中に凍結保存され、各々は単回の単位用量の細胞を含有し、これは、対象の体重1kg当たり約1×105細胞、1×106細胞、及び1×107細胞である。細胞は、経乳頭送達前に-130℃よりも低い温度で維持された。
対象は、HER2-CAR-T細胞の投与前に、シクロホスファミド(対象の体重1kg当たり40mgから80mgの範囲の用量)で-7日、-2日に前処理された。
0日に細胞治療を開始する直前に、血液が対象から得られ、場合により、サイトカイン放出症候群(CRS)、例えばTNF-α、インターフェロン-γ、及びIL-6の指標である1つ又は複数の血清の因子のレベルが、ELISAによって血清において決定された。腫瘍負担は、処置を開始する前に、例えば、PET若しくはCTスキャンによる又は乳首吸引液若しくは管洗浄液等におけるがんと関連する患者の細胞の数を測定することによる、癌のサイズ又は質量の測定によって場合により評価された。対象の胸部及びトルソーのMRIスキャンを実施して、投与された細胞の遊走の程度を後に決定するためのベースラインが確立された。
細胞は、およそ37℃に温めることによってベッドサイドで解凍された。対象の胸部乳首は、実施例1に記載されるように調製され、アルコールワイプで拭かれ、罹患した胸部の***乳頭からのケラチン栓(もしあれば)が取り除かれた。対象は、次に、5から15分間の期間にわたって胸部管の管腔への細胞の経乳頭投与によって、およそ1mL容量中のある用量の細胞を投与された。一部の対象について、その用量の量は、単回の単位用量である。他の対象について、その用量は、分割単位用量である。これは、容量制限が必要とされている場合に望ましい。そのような2つのアリコートにおける5×104細胞/kg体重の分割単位用量が、2日にわたって投与された。低い腫瘍負担を有するとみなされた対象について、追加の単回の単位用量等の1つの単回の単位用量を超えて送達させてもよい。
用量の投与後、対象は、身体検査され、発熱、低酸素症、及び神経学的な障害についてモニターされた。血液試料が、次の36時間にわたって周期的に取られ、サイトカイン、C反応性タンパク質(CRP)及び他の血清因子のレベルが決定され、これらのレベルが、その用量のHER-2CARを発現する改変細胞の投与前に観察されたレベルと比較された。投薬後レベルが投薬前レベルよりも高い場合に、副作用又はCRSの重症度に応じて、対象は、抗IL6治療又はCID分子、例えばAP1903又はAP20187を投与された。
投与された細胞による遊走及び/又は腫瘍浸潤は、例えば、対象に投薬した後1、2、3、及び/又は4週での1つ又は複数のMRIスキャンによって決定された。そのような細胞によって達成される腫瘍負担のパーセント低下は、PET、CT又はMRIスキャンによって測定された。
対象における抗CAR免疫応答の存在又は非存在は、場合により、胸部から取られた切開又は切除バイオプシー検体の免疫染色によりCARに向けられた抗体の存在を検出すること等によって、投与後1、2、3、又は4週等の細胞の投与後に検出された。
一部の対象は、上に記載されるように第一の用量、続いて1つ又は複数の引き続く用量のHER2-CARを発現する改変細胞を受けた。引き続く用量のサイズは、患者特異的である。一部の対象について、対象の体重1kg当たり1×106細胞の引き続く用量が、第一の用量の開始後3週、対象の胸部管に経乳頭的におよそ10-30分間にわたって投与された。対象は、第一の用量後にモニターされ、モニタリングは、任意の毒性の転帰及び/又はDCISの再発について、数年間の間で継続されうる。場合により、一部の対象は、1×107細胞/kg体重の第二の引き続く用量を受けてもよい。
HER2-CAR発現細胞に対する宿主免疫応答の発生及び/又はCRS、MAS、TLS、神経毒性等が、評価された。腫瘍に投与された細胞の遊走がMRIによって評価され、腫瘍負担が決定される。
CRS関連事象を有する対象の事象において、対象は、HER2-CAR発現のスイッチ及びHER2-CAR発現改変細胞の排除のため、CID分子、例えばAP1903又はAP20187が投与される。抗IL-6治療、例えばトシリズマブ(Actemra)、アチズマブ(RoActemra)も、CRS関連事象の重症度に応じて投与されてもよい。
例示的な実施形態を説明し、記載してきたが、様々な変更を本発明の精神及び範囲を逸脱しない範囲でなしうることが認識される。

Claims (50)

  1. 対象の胸部管に細胞を投与する工程を含む、胸部障害を有する又は有するリスクがある対象の処置のための養子細胞治療の経乳頭法。
  2. 細胞が、T細胞、NK細胞、CTL、TIL、単球、顆粒球、又はその前駆体を含む、請求項1に記載の方法。
  3. 細胞が、胸部細胞における標的抗原に結合する1つ又は複数の組換え受容体を発現する改変細胞を含む、請求項1に記載の方法。
  4. 1つ又は複数の組換え受容体が、キメラ抗原受容体(CAR)又は操作された若しくは疾患特異的なTCRを含む、請求項3に記載の方法。
  5. 改変細胞が、2つ以上のCARを発現する、請求項3に記載の方法。
  6. 1つ又は複数の組換え受容体が、独立に単一特異性、二重特異性又は多重特異性である、請求項3から5のいずれか一項に記載の方法。
  7. 1つ又は複数の組換え受容体が、構成的に、一過性に、若しくは切り替え可能に発現される、又は条件的に活性である、請求項3から6のいずれか一項に記載の方法。
  8. 改変細胞が、死遺伝子スイッチ、FITCベースのスイッチ、及びPNEベースのスイッチからなる群から選択される安全スイッチを含む、請求項3から7のいずれか一項に記載の方法。
  9. 死遺伝子スイッチが、HSV-tk、iCaspase9又はFADDである、請求項8に記載の方法。
  10. 標的抗原が、腫瘍特異性抗原、腫瘍関連抗原、多系統腫瘍関連抗原、癌胎児性抗原、新抗原、又は免疫抑制抗原である、請求項3から9のいずれか一項に記載の方法。
  11. 標的抗原が、形質転換関連分子、例えばMUC、例えばMUC1、c-met、サイトケラチン、例えばCK5、CK6、CK14、CK7、CK8、CK14、CK17、CK18、CK19、p53、グリコシド、Tn、TF、及びシアリルTn(STn)、ルイスx、ルイスa、ルイスy、及びガングリオシド、例えばGM3、GD3、9-0-アセチルGD3、9-0-アセチルGT3、及びN-グリコリ-GM3、葉酸受容体アルファ、ROR1、新抗原、腫瘍特異的抗原及び癌胎児性抗原、腫瘍関連抗原、例えば癌胎児性抗原(CEA)、L1細胞接着分子(L1CAM)、CAFs-関連タンパク質、例えば線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)、FAP-α、FSP-1/S100A4、及びPDGFR-β、ジガングリオシドGD2、メソテリン、IL-13受容体IL13R、IL13受容体α、エフリンB2、IGFR1、ELIGHT、WT1、TAG-72、Ep-CAM、LFA-1、EGFR、エストロゲン受容体(ER)、プロゲステロン受容体、MAGE1、MAGE-3、MAGE-A3/6、MAGE-Aファミリーメンバー、例えばMAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A6、MAGE-A12、MAGE-A9、MAGE-A11、MAGE-C1、及びMAGE-C2、RAGE、BCR-ABL、タンパク質チロシンキナーゼ、例えばPRL-2及びPRL3、腫瘍関連糖タンパク質、例えばTAG-72、CA19-9、CA27.29、CA72-4、CA50、PD-1、CTLA-4、CD47、受容体チロシンキナーゼ、例えばH4-RET、Ki-67、サイクリンD1、サイクリンA、サイクリンE、p16、p21、p27、p53、Bcl-2、Bax、サバイビン、c-myc、Rb、VEGF、HPR1、HER1、HER2、HER3、HER4、CD10、SPARC、COX-2、基礎サイトケラチン、CK5/6、CK14、及びCK17、上皮増殖因子受容体、c-kit、c-erbB-2、IL-10、TGFベータ、CCL17、CCL22、及びCCL24ストローマ放出因子、例えばEGF、HGF、MCP-1、CSF-1、VEGF、サイトカイン、例えばIL1、IL-8、TNF-アルファ、酵素、例えばMM2、MMP7、MMP8、MMP9、MMP12、MMP13、及びCOX2からなる群から選択される、請求項3から10のいずれか一項に記載の方法。
  12. 組換え受容体が、HER2-CAR、FR-α-CAR、又はFAP-CARである、請求項3から11のいずれか一項に記載の方法。
  13. 組換え受容体が、TCRゼータ、FcRガンマ、FcRベータ、CD3ガンマ、CD3デルタ、CD3イプシロン、CD4、CD8、CD16、CD22、CD25、CD79a、CD79b、及びCD66dからなる群から選択される一次シグナル伝達分子を含む、請求項3から12のいずれか一項に記載の方法。
  14. 組換え受容体が、1つ又は複数の共刺激分子を含む、請求項3から13のいずれか一項に記載の方法。
  15. 共刺激分子が、MHCクラスI分子、BTLA及びTollリガンド受容体、免疫グロブリンスーパーファミリー(IgSF)、例えばCD28、B7受容体ファミリーメンバー(B7-H2/B7RP-1/LICOS/GL50、B7-DC/PD-L2、B7-H3)、CD226、TIM、CD2/SLAM、BTN、LAIR、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー(TNFRSF)、例えばOX40、CD27、CD30、DR3、GITR、及びT細胞におけるHVEM、CD2及びSLAM、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、付着分子(CD54、CD58、CD70)、ICOS、CD40、CD40L、4-1BB(CD137)、CD70、CD80、CD86、DAP10、及び他のオーファン受容体ファミリー、例えばLAG3(CD223)及びCD160からなる群から選択される、請求項3から14のいずれか一項に記載の方法。
  16. 組換え受容体が、共刺激分子としてCD28及び4-1BBを含む、請求項3から14のいずれか一項に記載の方法。
  17. 改変細胞が、T細胞、NK細胞、CTL、単球、顆粒球、又はその前駆体を含む、請求項3から16のいずれか一項に記載の方法。
  18. 改変細胞が、ガドリニウムキレート、超常磁性酸化鉄ナノ粒子(SPION)、19Fパーフルオロカーボンナノ粒子、及び他の磁気レポーター遺伝子、例えば金属タンパク質ベースMRIプローブからなる群から選択される色素又は造影剤を更に含む、請求項3から17のいずれか一項に記載の方法。
  19. 細胞が、薬学的に許容される担体、緩衝剤、賦形剤又はその組合せを更に含む組成物に製剤化される、請求項1から18のいずれか一項に記載の方法。
  20. 担体が、乳酸加リンゲル溶液である、請求項19に記載の方法。
  21. 組成物が、ゲル化剤を更に含む、請求項19に記載の方法。
  22. 胸部障害が、良性の胸部疾患、乳がん、乳首のパジェット病、又は葉状腫瘍である、請求項1から21のいずれか一項に記載の方法。
  23. 胸部障害が、過形成、非定型性、導管過形成、小葉過形成、非定型導管過形成(ADH)、又は非定型小葉過形成(ALH)である、請求項1から22のいずれか一項に記載の方法。
  24. 胸部障害が、導管上皮内癌(DCIS)、小葉上皮内癌(LCIS)、侵襲性(又は浸潤性)小葉癌(ILC)、侵襲性(又は浸潤性)導管癌(IDC)、微小浸潤性乳癌(MIC)、炎症性乳がん、ER陽性(ER+)乳がん、プロゲステロン受容体陽性(PR+)乳がん、ER+/PR+乳がん、ER陰性(ER-)乳がん、HER2+乳がん、三重陰性乳がん(すなわち、ER-/PR-/Her2-乳がん;「TNBC」)、腺様嚢胞癌(腺様嚢胞)癌、低グレード腺扁平上皮癌、髄様癌、粘液(又はコロイド)癌、乳頭癌、管状腺癌、化生性癌、又は微小乳頭癌からなる群から選択される乳がんである、請求項1から23のいずれか一項に記載の方法。
  25. 乳がんが、前癌、早期段階のがん、非転移性がん、転移前がん、局所的に進行したがん、転移性がん又は再発性のがんである、請求項1から24のいずれか一項に記載の方法。
  26. 細胞が、単回用量又は複数回用量で投与される、請求項1から25のいずれか一項に記載の方法。
  27. 複数回用量が、第一の用量及び1つ又は複数の引き続く用量を含む、請求項26に記載の方法。
  28. 1つ又は複数の用量が、分割単位用量で投与される、請求項26に記載の方法。
  29. 対象が、1×103から1×109改変細胞/kg体重、1×103から5×108改変細胞/kg体重、0.5×103から1×107改変細胞/kg体重、1×104から0.5×106改変細胞/kg体重、0.5×104から1×106改変細胞/kg体重、1×105から0.5×106改変細胞/kg体重の範囲の細胞の単位用量を投与される、請求項1から28のいずれか一項に記載の方法。
  30. 第一の用量が、1×103細胞未満/kg、0.5×104細胞未満/kg、1×104細胞未満/kg、0.5×105細胞未満/kg、1×105細胞未満/kg、0.5×106細胞未満/kg、又は1×106細胞未満/kg等の低用量である、請求項27に記載の方法。
  31. 第一の用量が、0.5×105細胞超/kg、1×105細胞超/kg、0.5×106細胞超/kg、1×106細胞超/kg、0.5×107細胞超/kg、1×107細胞超/kg、0.5×108細胞超/kg、1×108細胞超/kg、又は5×108細胞超/kg等の高用量である、請求項27に記載の方法。
  32. 引き続く用量が、第一の用量の開始後7日から28日の間に投与される、請求項27に記載の方法。
  33. 引き続く用量が、第一の用量と同じ、第一の用量より低い又は第一の用量より高い、請求項27に記載の方法。
  34. 細胞が、一次治療、腫瘍免疫賦活薬治療、又はアジュバント治療として投与される、請求項1から33のいずれか一項に記載の方法。
  35. 細胞の投与が、対象における胸部障害の疾患負担を低下させる、請求項1から34のいずれか一項に記載の方法。
  36. 組換え受容体を含む改変細胞の投与が、対象における腫瘍負担を低下させる、請求項1から35のいずれか一項に記載の方法。
  37. 細胞の投与が、腫瘍負担を低下させる、請求項1から36のいずれか一項に記載の方法。
  38. 改変細胞の投与が、腫瘍負担を低下させる、請求項1から37のいずれか一項に記載の方法。
  39. 投与が、CRS関連、MAS関連、TLS関連、神経毒性関連又は宿主免疫応答関連の転帰のリスクを低下させる、請求項1から38のいずれか一項に記載の方法。
  40. 細胞の投与が、サイトカイン、例えばIFNγ、TNFα、IL-2、GM-CSF、IL-1ベータ、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、Flt-3、フラクタルカイン、MIP1、sIL-2Rα、及びIL-5の循環又は胸部組織レベルを低下させる、請求項1から39のいずれか一項に記載の方法。
  41. 改変細胞の投与が、サイトカイン、例えばIFNγ、TNFα、IL-2、GM-CSF、IL-1ベータ、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、Flt-3、フラクタルカイン、MIP1、sIL-2Rα、及びIL-5の循環又は胸部組織レベルを低下させる、請求項1から40のいずれか一項に記載の方法。
  42. 対象が、細胞の投与の前に、リンパ球枯渇剤又は化学療法剤で前処理される、請求項1から41のいずれか一項に記載の方法。
  43. リンパ球枯渇剤又は化学療法剤が、シクロホスファミド、シクロスポリン、フルダラビン、ベンダムスチン、レナリドマイド、ポマリドミド、ゲムシタビン、BTK阻害剤、例えばイブルチニブ、腫瘍溶解性アデノウイルス、又はその組合せからなる群から選択される、請求項42に記載の方法。
  44. 対象が、追加の治療剤又は治療を施される、請求項1から43のいずれか一項に記載の方法。
  45. 追加の治療剤が、アスパラギナーゼ、ブスルファン、カルボプラチン、シスプラチン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、メトトレキセート、パクリタキセル、リツキシマブ、ビンブラスチン、ビンクリスチン、腫瘍溶解性ウイルス、例えば腫瘍溶解性アデノウイルス、抗エストロゲン、例えばタモキシフェン、N-メチル-エンドキシフェン、ノルエンドキシフェン、エンドキシフェン、ラロキシフェン、フルベストラント及び/又はアロマターゼ阻害剤、例えばアナストロゾール、レトロゾール、及びエキセメスタンからなる群から選択される、請求項44に記載の方法。
  46. 対象の胸部管にHER2-CAR、FAP-CAR、又はFR-αを発現する改変細胞を投与する工程を含む、胸部障害を有する又は有するリスクがある対象の処置のための養子細胞治療の経乳頭法。
  47. HER2-CARが、図2に開示された配列番号1又はその変異体若しくは機能的な部分に対して少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、及び100%の相同性を有する、請求項46に記載の方法。
  48. FAP-CARが、図2に開示された配列番号2又はその変異体若しくは機能的な部分に対して少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、及び100%の相同性を有する、請求項46に記載の方法。
  49. 1つ又は複数の容器、パッケージング材料、ラベル又は添付文書、及び場合により装置を含む製品。
  50. 装置が、針及びシリンジ、カニューレ、カテーテル、マイクロカテーテル、浸透圧ポンプ、又は封入装置である、請求項49に記載の製品。
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