JP2019522489A - Ctla4に対する単一ドメイン抗体及びその誘導タンパク質 - Google Patents
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Abstract
Description
他に指示又は定義がない限り、使用される全ての用語は、当業者には明らかである当該技術分野におけるそれらの通常の意味を有する。例えば、標準ハンドブック、例えばSambrookら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual」(第2版)、1〜3巻、Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989年);Lewin、「Genes IV」、Oxford University Press、New York(1990年)、及びRoittら、「Immunology」(第2版)、Gower Medical Publishing、London、New York(1989年)、並びに本明細書において引用されている一般的な背景技術が参照される。さらに、他に指示がない限り、詳細に具体的に記載されていない全ての方法、ステップ、技術及び操作は、当業者には明らかであるように、それ自体が公知である方法で実施され得て及び実施されている。再度、例えば、標準ハンドブック、上記で言及された一般的な背景技術、及びそこに引用されているさらなる参考文献が参照される。
FR1は、1〜30位にアミノ酸残基を含み、
CDR1は、31〜35位にアミノ酸残基を含み、
FR2は、36〜49位にアミノ酸を含み、
CDR2は、50〜65位にアミノ酸残基を含み、
FR3は、66〜94位にアミノ酸残基を含み、
CDR3は、95〜102位にアミノ酸残基を含み、及び
FR4は、103〜113位にアミノ酸残基を含む。
VHHドメイン(自然において、軽鎖可変ドメインの存在なしに、及びそれとのいずれもの相互作用なしに抗原に機能的に結合するように「設計され」ている)は、単一の、比較的小さな、機能的な抗原結合構造単位、ドメイン又はポリペプチドとして機能することができる。これは、VHHドメインを、一般的に、単独では単一の抗原結合性タンパク質又は免疫グロブリン単一可変ドメインとしての実際の適用には適していないが、機能的な抗原結合性単位(例えば、Fab断片などの従来の抗体断片;VLドメインに共有結合したVHドメインからなるscFvのように)を提供するために、ある形態又は他のものと組み合わせる必要のある従来の4本鎖抗体のVH及びVLドメインと区別される。
単一のドメインのみが、高い親和性及び高い選択性で抗原に結合するため必要とされ、そのため、2つの別個のドメインが存在する必要もなく、これらの2つのドメインを(scFvと同様に、とりわけ設計されたリンカーの使用を介して)正しい空間的なコンフォメーション及び配置に存在させる必要もない;
VHHドメインは、単一の遺伝子から発現させることができ、翻訳後の折り畳み又は修飾を必要としない;
VHHドメインは、容易に、多価及び多重特異性フォーマットに操作できる(フォーマットされる);
VHHドメインは、溶解性が高く、凝集する傾向を有しない;
VHHドメインは、熱、pH、プロテアーゼ及び他の変性剤又は条件に対して非常に安定であり、したがって、冷凍設備を使用することなく、調製、貯蔵又は輸送され得、コスト、時間及び環境の救済をもたらす;
VHHドメインは、生産に必要とされるスケールにおいてさえ、調製が容易であり、比較的安価である;
VHHドメインは、従来の4本鎖抗体及びこれらの抗原結合性断片と比較して、より小さく(約15kDaであり、従来のIgGの約10倍小さい)、したがって、従来の4本鎖抗体及びこれらの抗原結合性断片と比較して、組織内に(より)高い浸透性を示し、より高い用量で投与することができる;
VHHドメインは、(とりわけ、従来のVHドメインと比較して、伸長したCDR3ループに起因する)いわゆる空孔結合性質を示すことができ、したがって、さらに、従来の4本鎖抗体及びこれらの抗原結合性断片が接近することができない標的及びエピトープに接近することができる。
第1の態様では、本発明は、CTLA4に特異的に結合することができる少なくとも1つの免疫グロブリン単一可変ドメインを含むCTLA4結合タンパク質を提供する。一部の実施形態では、上記CTLA4結合分子は、CTLA4に特異的に結合する1つの免疫グロブリン単一可変ドメインを含む。一部の実施形態では、上記CTLA4結合分子は、CTLA4に特異的に結合する2つ、3つ、4つ又はそれを超える免疫グロブリン単一可変ドメインを含む。一部の実施形態では、上記CTLA4結合タンパク質は、CTLA4に特異的に結合する2つ以上の同一の免疫グロブリン単一可変ドメインを含む。他の実施形態では、上記CTLA4結合タンパク質は、CTLA4に特異的に結合する2つ以上の異なる免疫グロブリン単一可変ドメインを含む。一部の実施形態では、CTLA4に特異的に結合する上記2つ以上の免疫グロブリン単一可変ドメインは、互いに直接連結される。一部の実施形態では、CTLA4に特異的に結合する上記2つ以上の免疫グロブリン単一可変ドメインは、リンカーによって互いに連結される。上記リンカーは、1〜20個又はそれを超えるアミノ酸の長さを有し、2次構造及びそれを超える構造を持たない非機能性アミノ酸配列であり得る。例えば、上記リンカーは、GGGGS、GS、GAP、(GGGGS)×3などのフレキシブルなリンカーである。
(1)配列番号1に示されるCDR1、配列番号2に示されるCDR2、配列番号3に示されるCDR3(抗体番号116のCDRに対応する);
(2)配列番号4に示されるCDR1、配列番号5に示されるCDR2、配列番号6に示されるCDR3(抗体番号119のCDRに対応する);
(3)配列番号7に示されるCDR1、配列番号8に示されるCDR2、配列番号9に示されるCDR3(抗体番号128のCDRに対応する);
(4)配列番号10に示されるCDR1、配列番号11に示されるCDR2、配列番号12に示されるCDR3(抗体番号138のCDRに対応する);
(5)配列番号13に示されるCDR1、配列番号14に示されるCDR2、配列番号15に示されるCDR3(抗体番号145のCDRに対応する);
(6)配列番号16に示されるCDR1、配列番号17に示されるCDR2、配列番号18に示されるCDR3(抗体番号155のCDRに対応する);
(7)配列番号19に示されるCDR1、配列番号20に示されるCDR2、配列番号21に示されるCDR3(抗体番号165のCDRに対応する);
(8)配列番号22に示されるCDR1、配列番号23に示されるCDR2、配列番号24に示されるCDR3(抗体番号188のCDRに対応する);
(9)配列番号25に示されるCDR1、配列番号26に示されるCDR2、配列番号27に示されるCDR3(抗体番号C1のCDRに対応する);
(10)配列番号28に示されるCDR1、配列番号29に示されるCDR2、配列番号30に示されるCDR3(抗体番号C2のCDRに対応する);
(11)配列番号31に示されるCDR1、配列番号32に示されるCDR2、配列番号33に示されるCDR3(抗体番号C16のCDRに対応する);
(12)配列番号34に示されるCDR1、配列番号35に示されるCDR2、配列番号36に示されるCDR3(抗体番号C22のCDRに対応する);
(13)配列番号37に示されるCDR1、配列番号38に示されるCDR2、配列番号39に示されるCDR3(抗体番号C27のCDRに対応する);
(14)配列番号40に示されるCDR1、配列番号41に示されるCDR2、配列番号42に示されるCDR3(抗体番号C29のCDRに対応する);
(15)配列番号43に示されるCDR1、配列番号44に示されるCDR2、配列番号45に示されるCDR3(抗体番号C38のCDRに対応する);
(16)配列番号46に示されるCDR1、配列番号47に示されるCDR2、配列番号48に示されるCDR3(抗体番号J5のCDRに対応する);
(17)配列番号49に示されるCDR1、配列番号50に示されるCDR2、配列番号51に示されるCDR3(抗体番号J17のCDRに対応する);
(18)配列番号52に示されるCDR1、配列番号53に示されるCDR2、配列番号54に示されるCDR3(抗体番号J29のCDRに対応する);
(19)配列番号55に示されるCDR1、配列番号56に示されるCDR2、配列番号57に示されるCDR3(抗体番号J35のCDRに対応する);
(20)配列番号58に示されるCDR1、配列番号59に示されるCDR2、配列番号60に示されるCDR3(抗体番号J37のCDRに対応する);
(21)配列番号61に示されるCDR1、配列番号62に示されるCDR2、配列番号63に示されるCDR3(抗体番号J38のCDRに対応する);
(22)配列番号64に示されるCDR1、配列番号65に示されるCDR2、配列番号66に示されるCDR3(抗体番号J39のCDRに対応する);
(23)配列番号67に示されるCDR1、配列番号68に示されるCDR2、配列番号69に示されるCDR3(抗体番号J42のCDRに対応する);
(24)配列番号70に示されるCDR1、配列番号71に示されるCDR2、配列番号72に示されるCDR3(抗体番号J69のCDRに対応する);及び
(25)配列番号73に示されるCDR1、配列番号74に示されるCDR2、配列番号75に示されるCDR3(抗体番号J78のCDRに対応する)。
(a)1×10−7M未満のKDでヒトCTLA4に結合する;
(b)CTLA4とCD80及び/又はCD86との相互作用をブロックする;
(c)PBMC及び/又はT細胞の活性化を増強する;
(d)腫瘍増殖を阻害する。
別の態様では、本発明は、本発明のCTLA4結合タンパク質をコードする核酸分子に関する。本発明の核酸は、RNA、DNA又はcDNAであり得る。本発明の一実施形態によれば、本発明の核酸は、本質的に単離された形態である。
本発明のCTLA4結合タンパク質の発現を可能にする条件下で本発明の宿主細胞を培養するステップ;及び
宿主細胞によって発現されたCTLA4結合タンパク質を培養物から回収するステップ;及び
場合により、本発明のCTLA4結合タンパク質をさらに精製及び/又は修飾するステップ。
別の態様では、本発明は、医薬として許容される担体とともに製剤化された、本発明のCTLA4結合タンパク質の1つ又は組合せを含有する組成物、例えば、医薬組成物を提供する。このような組成物には、1つ又は組合せの(例えば2つ若しくはそれ以上の異なる)本発明のCTLA4結合タンパク質が含まれ得る。例えば、本発明の医薬組成物は、標的抗原上の異なるエピトープに結合する抗体分子の組合せを含むことができる。
別の態様では、本発明は、CTLA4関連疾患の予防及び/又は治療のための、本発明のCTLA4結合タンパク質、核酸、宿主細胞、及び医薬組成物の使用、並びに対応する方法を提供する。本発明のCTLA4結合タンパク質を用いて予防及び/又は治療できるCTLA4関連疾患は、以下のように詳細に記載される。
本発明のCTLA4結合タンパク質によりCTLA4をブロックすることにより、がん細胞に対する患者の免疫応答を増強することができる。本発明のCTLA4結合タンパク質は、単独で使用されて、がん性腫瘍の増殖を阻害し得る。又は、以下に記載されるように本発明のCTLA4結合タンパク質は、他の抗腫瘍療法と組み合わせて、例えば、他の免疫原性物質、標準的ながん治療薬、又は他の抗体分子と組み合わせて使用され得る。
本発明の他の方法は、特定の毒素又は病原体に曝露された患者を治療するために使用される。したがって、本発明の別の態様は、対象における感染症を予防又は治療する方法であって、対象に本発明のCTLA4結合性タンパク質を投与することを含む、方法を提供し、それにより、対象は感染症のために治療される。
1.1 ライブラリー構築及びスクリーニング
免疫化のためのCTLA4−Fc融合タンパク質(配列番号129)をHEK293細胞(pCDNA4、Invitrogen、カタログV86220)により発現させ、プロテインAアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。1頭のフタコブラクダ(Camelus bactrianus)を免疫化のために選んだ。4回の免疫化後、リンパ球を100mlのラクダ末梢血から単離し、総RNAをRNA抽出キット(QIAGEN)により抽出した。抽出されたRNAは、指示書に従ってSuper−Script III FIRST STRANDSUPERMIXキットを用いてcDNAに逆転写された。重鎖抗体をコードする核酸断片を入れ子PCRによって増幅した:
第1ラウンドのPCR:
上流プライマー:GTCCTGGCTGCTCTTCTACAAGGC(配列番号110);
下流プライマー:GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCC(配列番号111)。
鋳型としての第1ラウンドのPCRからのPCR産物、
上流プライマー:GATGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGRGGAGG(配列番号112);
下流プライマー:GGACTAGTGCGGCCGCTGGAGACGGTGACCTGGGT(配列番号113)。
マルチウェルプレートは、5μg/ウェルでCTLA4−Fc融合タンパク質及びFcタンパク質を用いて、4℃で一晩、コーティングされた。翌日、室温で2時間、1%スキムミルクでブロックした後、100μlのファージ(8×1011tfu、1.1で構築されたラクダ重鎖単一ドメイン抗体のファージディスプレイライブラリー由来)を室温で1時間添加した。その後、Fc非結合ファージは、PBST(PBS中0.05%tween 20)を用いて室温で1時間洗浄することにより、CTLA4−Fc融合タンパク質でコーティングされたウェルに再度移された。CTLA4に特異的に結合したファージをトリエチルアンモニウム(100mM)で解離させ、大腸菌TG1を対数期で感染させてファージを生成し、次にこれを次のラウンドスクリーニング用に精製した。同じスクリーニングを3〜4回繰り返した。これにより、陽性クローンが濃縮され、ファージディスプレイ技術によって抗体ライブラリーからCTLA4特異的抗体を選択する目的を達成した。
3ラウンドのパンニング後に得られたCTLA4結合陽性ファージを用いて、空の大腸菌を感染させ、播種した。96個の単一コロニーを培養のためにランダムに選択し、ファージをそれぞれ産生させ、精製した。プレートを4℃で一晩、CTLA4−Fc融合タンパク質でコーティングした;得られた試料ファージを添加し(対照としてブランクファージ)、室温で1時間、インキュベートした。一次抗体であるマウス抗HAタグ抗体(Beijing Kangwei Shiji Biotech.Ltd.)を洗浄後に加え、反応のために室温で1時間、インキュベートした。二次抗体であるヤギ抗マウスアルカリホスファターゼ標識抗体(Amyject Scientific Ltd.)を洗浄後に添加し、反応のために室温で1時間、インキュベートした。アルカリホスファターゼ発色溶液を洗浄後に添加し、吸収値を405nmの波長で読み取った。試料ウェルのODが対照ウェルのODと比較して3倍である場合、試料は陽性として決定される。陽性ウェルの細菌は、プラスミド抽出及びその後の配列決定のために、100μg/mlアンピシリンを補足したLB液体培地に移して培養された。
2.1 大腸菌における重鎖単一ドメイン抗体の発現及びそれらの精製
配列決定分析により得られた34個の重鎖単一ドメイン抗体のコード配列を発現ベクターPET32b(Novagen、製品番号:69016−3)にサブクローニングし、正しい組換えプラスミドを発現宿主株BL1(DE3)(Tiangen Biotech、CB105−02)に形質転換し、100μg/mlアンピシリンを含有するLB固体培地上に37℃で一晩、播種した。単一コロニーを接種し、一晩培養し、翌日、移し、振とうして37℃で増殖させた。培養物が0.6−1のOD値に達したとき、0.5mMのIPTGを添加し、28℃で一晩、振とうしながら誘導した。翌日、遠心分離により細菌を回収し、溶解して抗体の粗抽出物を得た。次に、ニッケルイオンアフィニティークロマトグラフィーを用いて、抗体タンパク質を精製し、純度が90%を超える抗体タンパク質を得た。
プレートをCTLA4−Fc融合タンパク質で一晩、4℃でコーティングし、実施例2.1で得られた10ngの重鎖単一ドメイン抗体を各ウェルに添加し(対照はCTLA4−Fcタンパク質に結合しない単一ドメイン抗体である)、室温で1時間反応させた。洗浄後、一次抗体である抗Hisタグ抗体(Beijing Kangwei Century Biotechnology Co.,Ltd.から購入した)を添加し、1時間、室温で反応させた。洗浄後、二次ヤギ抗マウス西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗体(Yiqiao Shenzhou、カタログ:SSA007200)を添加し、1時間、室温で反応させた。洗浄後、発色剤を添加し、吸光度を405nmで読み取った。
CTLA4−Fcタンパク質及びCD80−Fcタンパク質(配列番号130)は、HEK293細胞(pCDNA4、Invitrogen、カタログV86220)における発現によって得られた。ビオチン化タンパク質であるCD80−Fc−ビオチンは、Thermo Biotinlytionキットを用いて得られた。
マウスCTLA4−Fcタンパク質(配列番号131)は、HEK293細胞(pCDNA4、Invitrogen、カタログV86220)における発現によって得られた。ビオチン化タンパク質であるmCTLA4−Fc−ビオチンは、Thermo Biotinlytionキットを使用して得られた。
プレートは、0.5μg/ウェルで、得られたCTLA4重鎖単一ドメイン抗体を用いて一晩、4℃でコーティングされ、続いて、勾配希釈系列のCTLA4−Fc融合タンパク質を添加し、1時間、室温で反応させた。洗浄後、ヤギ抗ヒトIgG−Fc西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗体(lakepharma)を添加し、1時間、室温で反応させた。洗浄後、西洋ワサビペルオキシダーゼc発色溶液を添加し、吸光度を波長405nmで読み取った。SotfMax Pro v5.4をデータ処理及びマッピング分析に用いて、CTLA4に対する抗体の結合曲線を得て、及び4パラメーター適合によりEC50値(抗体番号14については約50ng/ml;抗体番号155については約13ng/ml;抗体番号C1については約123ng/ml、抗体番号C27については約93ng/ml)を得た。145及び155の結果を図1Aに示し、C1及びC27の結果を図1Bに示す。
プレートは、0.5μg/ウェルのCTLA4−Fc融合タンパク質を用いて、一晩、4℃でコーティングされ、続いて、実施例2.1で得られた、ウェルあたり100uLの勾配希釈系列(250ng/mLのCD80−Fc−ビオチンを含有する)の100μLのCTLA4ブロッキング単一ドメイン抗体/ウェルを添加し、1時間、室温で反応させた。SA−HRP(Sigmaから購入した)を添加し、1時間、室温で反応させた。発色溶液を添加した後、吸光度を405nmの波長で読み取った。
ヒトIgG1−Fc領域(配列番号132)のアミノ酸配列は、タンパク質データベースUniprot(P01857)からのヒト免疫グロブリンガンマ1(IgG1)の定常領域アミノ酸配列に基づいて得られた。ヒトIgG1−Fcをコードする核酸断片は、ヒトPBMC総RNAから逆転写PCRにより得られ、上記実施例で得られたCTLA4単一ドメイン抗体とFcの融合タンパク質をコードする核酸断片は、オーバーラップPCRにより得られ、次に、ベクターpCDNA4(Invitrogen、カタログV86220)にサブクローニングされた。
プレートは、0.5μg/ウェルのCTLA4−Fc融合タンパク質を用いて、一晩、4℃でコーティングされ、続いて、実施例2.7で得られた、ウェルあたり100μLの勾配希釈系列(250ng/mLのCD80−Fc−ビオチンを含有する)のCTLA4ブロッキング単一ドメイン抗体を添加し、1.5時間、室温で反応させた。SA−HRP(Sigmaから購入した)を添加し、1.5時間、室温で反応させた。発色溶液を添加した後、吸光度を405nmの波長で読み取った。
ヒト化は、タンパク質表面アミノ酸ヒト化方法(再表面化)及びVHHヒト化のための普遍的なフレームワークグラフト法(普遍的なフレームワークへのCDRグラフト化)によって実施される。
4.1 CTLA4単一ドメイン抗体のFc融合タンパク質の調製
ヒトIgG1−Fc領域のアミノ酸配列(配列番号132)は、タンパク質データベースUniprot(P01857)からのヒト免疫グロブリンガンマ1(IgG1)の定常領域アミノ酸配列に基づいて得られた。ヒトIgG1−Fcをコードする核酸断片は、ヒトPBMC総RNAから逆転写PCRにより得られ、上記実施例で得られたCTLA4単一ドメイン抗体とFcの融合タンパク質をコードする核酸断片は、オーバーラップPCRにより得られ、次に、ベクターpCDNA4(Invitrogen、カタログV86220)にサブクローニングされた。
BMS Inc.からの抗CTLA4抗体であるイピリムマブの遺伝子は、米国特許出願公開第2002/0086041号の抗体10D1の方法によりクローニングされ、ベクターpCDNA4にクローニングされた。
同じ発現システム及び一過性トランスフェクション条件を用いると、本発明のCTLA4単一ドメイン抗体Fc融合タンパク質の発現レベルは400mg/Lより高かったが、一方、抗体10D1の発現レベルは約150mg/Lであった。この結果は、本発明のCTLA4単一ドメイン抗体Fc融合タンパク質が構造においてより安定であり、公知のCTLA4抗体よりも高い発現レベルをもたらすことができることを示す。
2つのタンデムCTLA4単一ドメイン抗体と1つのFc領域の融合タンパク質をコードする核酸断片は、オーバーラップPCRにより得られ、次に、ベクターpCDNA4(Invitrogen、カタログV86220)にサブクローニングされた。構築された組換えプラスミドを用いて、4.1に記載されているのと同じ方法により、一過性発現のためにHEK293細胞をトランスフェクトした。2つのタンデムなCTLA4単一ドメイン抗体と1つのFcの融合タンパク質が得られ、これは、4価CTLA4単一ドメイン抗体Fc融合タンパク質とも呼ばれる、4つのCTLA4結合ドメインを含む二量体分子を形成することができた。
5.1 CTLA4に対するCTLA4単一ドメイン抗体Fc融合タンパク質の結合能力(ELISAによる)
プレートは、実施例2.7及び4.1により得られた0.5μg/ウェルのCTLA4単一ドメインFc融合タンパク質、及び例4.2により得られた10D1タンパク質で一晩、4℃でコーティングされ、続いて、勾配希釈系列のCTLA4−Fc−ビオチンを添加し、1時間、室温で反応させた。SA−HRP(Sigmaから購入した)を添加し、1.5時間、室温で反応させた。発色溶液を添加した後、吸光度を405nmの波長で読み取った。
プレートは、実施例2.7及び4.1により得られた0.5μg/ウェルのCTLA4単一ドメインFc融合タンパク質を用いて一晩、4℃でコーティングされ、続いて、勾配希釈系列のCTLA4−Fc−ビオチンを添加し、1時間、室温で反応させた。SA−HRP(Sigmaから購入した)を添加し、1.5時間、室温で反応させた。発色溶液を添加した後、吸光度を405nmの波長で読み取った。
プレートは、0.5μg/ウェルのCTLA4−Fc融合タンパク質で一晩、4℃でコーティングされ、続いて、ウェルあたり、実施例4.1によって得られたCTLA4単一ドメインFc融合タンパク質又は実施例4.2によって得られた10D1タンパク質の勾配希釈系列(250ng/mLのCD80−Fc−ビオチンを含有する)を100uL添加し、1時間、室温で反応させた。SA−HRP(Sigmaから購入した)を添加し、1時間、室温で反応させた。発色溶液を添加した後、吸光度を405nmの波長で読み取った。
プレートは、実施例4.1により得られたCTLA4単一ドメインFc融合タンパク質及び実施例4.4により得られた四価CTLA4単一ドメイン抗体Fc融合タンパク質を0.5μg/ウェルで一晩、4℃でコーティングされ、続いて、勾配希釈系列のCTLA4−Fc−ビオチンを添加し、1時間、室温で反応させた。SA−HRP(Sigmaから購入した)を添加し、1.5時間、室温で反応させた。発色溶液を添加した後、吸光度を405nmの波長で読み取った。
組換えヒトCTLA4に対する、上記の実施例において得られたCTLA4単一ドメイン抗体Fc融合タンパク質の結合反応速度論は、BIAcore X100装置を用いた表面プラズモン共鳴(SRP)法により測定された。組換えラクダ抗ヒトFc抗体をCM5バイオセンサーチップに結合させて、約1000反応単位(RU)を得た。反応速度論測定について、抗体をHBS−EP+1×緩衝液(GE、カタログ番号BR−1006−69)を用いて一定濃度(1.37〜1000nm)に希釈し、25℃で120秒間注入して、CTLA4及びマウスFcの融合タンパク質について連続して3倍希釈し、25℃で120秒間注入して、解離時間を30分とし、10mMグリシン−HCl(pH2.0)で120秒間再生した。結合速度(kon)及び解離速度(koff)は、単純な1対1のLanguir結合モデル(BIAcore評価ソフトウェアバージョン3.2)を用いて計算された。平衡解離定数(kD)は、koff/kon比として計算される。
96ウェルプレートは、抗ヒトCD3(50ng/mL)を補足した1.5×105個のJurkat T細胞(中国科学アカデミーの上海細胞バンク)を接種され、37℃で15分間インキュベートした。次に、二価又は四価CTLA4単一ドメイン抗体Fc融合タンパク質(30ng/ml〜0.94ng/ml、100ng/mlのCTLA4−Fc融合タンパク質を希釈液に添加した)及び等密度のRaji細胞(中国科学アカデミーの上海細胞バンク)を添加した。培養24時間後、IL−2発現の検出のために上清を回収した。データをSoft Maxで処理して、CTLA4−Fc融合タンパク質の中和を介した、二価又は四価CTLA4単一ドメイン抗体Fc融合タンパク質によるIL−2の阻害効果を計算した。EC50を用いて効果を比較した。
ヒトHEK293細胞は、全長ヒトB7ファミリータンパク質遺伝子を有するプラスミド(pCDNA4、Invitrogen、カタログV86220)の一過性トランスフェクションにより、膜上にヒトCTLA4、CD28、PD1タンパク質を一過性に発現する。このプラスミドはまた、標的タンパク質のC末端がEGFPタンパク質に融合されるのを可能にし、それにより、膜上に発現されるB7ファミリータンパク質のレベルは緑色蛍光強度によって検査され得るようにする。構築された一過性にトランスフェクトされた細胞株には、293−CTLA4−EGFP、293−PD1−EGFP、293−CD28−EGFPが含まれる。
サルCTLA4−Fcタンパク質をYiqiao Shenzhouから購入した。ビオチン化タンパク質であるhuC1v4−tet−Fc−ビオチンは、実施例4.4において得られた四価CTLA4単一ドメイン抗体Fc融合タンパク質を用いて、Thermo Biotinlytionキットの使用により得られた。
末梢血単核細胞(PBMC)は、健常ドナーの末梢血から、ヒトリンパ球(Tianjin Hao Yang)用の単離溶液を用いた密度勾配遠心分離によって単離された。
末梢血単核細胞(PBMC)は、健常ドナーの末梢血から、ヒトリンパ球(Tianjin Hao Yang)用の単離溶液を用いた密度勾配遠心分離によって単離された。
末梢血単核細胞(PBMC)は、健常ドナー由来の末梢血の白血球から、ヒトリンパ球(Tianjin Hao Yang)用の単離溶液を用いた密度勾配遠心分離によって単離された。次に、それらを無血清RPMI 1640培地とともに1〜2時間インキュベートして、非付着性細胞を除去し、細胞を10%FBS、10ng/mlのGM−CSF及び20ng/mLのIL−4を含有するRPMI中で培養した。5〜6日間培養した後、10ng/mlのTNF−αを添加し、24時間インキュベートして、成熟樹状細胞を得た。
CTLA4ヒト化マウス(すなわち、ヒトCTLA4タンパク質を発現するマウス)に5×105個のMC38腫瘍細胞を接種した。
CTLA4単一ドメイン抗体Fc融合タンパク質をSDラットに単回静脈内(IV)投与し、血液試料を様々な時点で回収し、Elisaアッセイを用いて、試験物質の投与後、ラットの血漿中の試験物質の濃度を決定した。薬物動態パラメーターを計算した。
7.1 CTLA4単一ドメイン抗体Fc融合タンパク質の物理化学的性質
ヒト293HEK細胞により発現され、アフィニティー精製された四価CTLA4単一ドメイン抗体Fc融合タンパク質は、実施例4.4に記載される方法によって得られた。次に、そのドラッガビリティーは、SE−HPLC、還元性条件下でのCE、CE、WCX、非還元条件下でのDSCによる予備的な物理的及び化学的性質分析によって評価された。具体的な値を以下の表に記載する。これらのデータから、四価CTLA4単一ドメイン抗体Fc融合タンパク質は、良好な物理的及び化学的性質を有し、工業的規模の生産に適していることが予め決定され得る。
CTLA4単一ドメイン抗体Fc融合タンパク質をUF/DFによって濃縮し、PBS緩衝液に交換して20mg/mLの溶液を調製した。熱破壊試験は、40℃に上昇させて、30日間行われた。0日目、10日目、20日目、及び30日目の試料は、SE−HPLCによって純度について試験され、変化の傾向を以下の図に示す。40℃では、調製物を最適化することはなく、主ピークの純度はわずかに低下したが、凝集及び分解の明確な傾向は観察されなかったことが見てとれる。同時に、そのより高いTm値を考慮すると、タンパク質が良好な熱安定性を有することが決定され得る。
4匹のカニクイザルをランダムに2群に分け、さらに各群を2つに分け、半分が雄であり、半分が雌であり、それぞれ低用量群及び高用量群(それぞれ7.5及び30mg/kg)とした。四価CTLA4単一ドメイン抗体Fc融合タンパク質は、後肢静脈ボーラスを介して1回投与された。投与前(D−1)、投与後のD15及びD29に、体重、血球数、血液凝固能、血液生化学及び免疫原性の指標を検出した。
Claims (27)
- CTLA4に特異的に結合することができ、少なくとも1つの免疫グロブリン単一可変ドメインを含むCTLA4結合タンパク質であって、前記免疫グロブリン単一可変ドメインは、
(1)配列番号1に示されるCDR1、配列番号2に示されるCDR2、配列番号3に示されるCDR3;
(2)配列番号4に示されるCDR1、配列番号5に示されるCDR2、配列番号6に示されるCDR3;
(3)配列番号7に示されるCDR1、配列番号8に示されるCDR2、配列番号9に示されるCDR3;
(4)配列番号10に示されるCDR1、配列番号11に示されるCDR2、配列番号12に示されるCDR3;
(5)配列番号13に示されるCDR1、配列番号14に示されるCDR2、配列番号15に示されるCDR3;
(6)配列番号16に示されるCDR1、配列番号17に示されるCDR2、配列番号18に示されるCDR3;
(7)配列番号19に示されるCDR1、配列番号20に示されるCDR2、配列番号21に示されるCDR3;
(8)配列番号22に示されるCDR1、配列番号23に示されるCDR2、配列番号24に示されるCDR3;
(9)配列番号25に示されるCDR1、配列番号26に示されるCDR2、配列番号27に示されるCDR3;
(10)配列番号28に示されるCDR1、配列番号29に示されるCDR2、配列番号30に示されるCDR3;
(11)配列番号31に示されるCDR1、配列番号32に示されるCDR2、配列番号33に示されるCDR3;
(12)配列番号34に示されるCDR1、配列番号35に示されるCDR2、配列番号36に示されるCDR3;
(13)配列番号37に示されるCDR1、配列番号38に示されるCDR2、配列番号39に示されるCDR3;
(14)配列番号40に示されるCDR1、配列番号41に示されるCDR2、配列番号42に示されるCDR3;
(15)配列番号43に示されるCDR1、配列番号44に示されるCDR2、配列番号45に示されるCDR3;
(16)配列番号46に示されるCDR1、配列番号47に示されるCDR2、配列番号48に示されるCDR3;
(17)配列番号49に示されるCDR1、配列番号50に示されるCDR2、配列番号51に示されるCDR3;
(18)配列番号52に示されるCDR1、配列番号53に示されるCDR2、配列番号54に示されるCDR3;
(19)配列番号55に示されるCDR1、配列番号56に示されるCDR2、配列番号57に示されるCDR3;
(20)配列番号58に示されるCDR1、配列番号59に示されるCDR2、配列番号60に示されるCDR3;
(21)配列番号61に示されるCDR1、配列番号62に示されるCDR2、配列番号63に示されるCDR3;
(22)配列番号64に示されるCDR1、配列番号65に示されるCDR2、配列番号66に示されるCDR3;
(23)配列番号67に示されるCDR1、配列番号68に示されるCDR2、配列番号69に示されるCDR3;
(24)配列番号70に示されるCDR1、配列番号71に示されるCDR2、配列番号72に示されるCDR3;及び
(25)配列番号73に示されるCDR1、配列番号74に示されるCDR2、配列番号75に示されるCDR3
から選択されるCDR1、CDR2及びCDR3を含む、CTLA4結合タンパク質。 - 前記免疫グロブリン単一可変ドメインがVHHである、請求項1に記載のCTLA4結合タンパク質。
- 前記VHHがヒト化VHHである、請求項2に記載のCTLA4結合タンパク質。
- 前記VHHが、配列番号76〜100のいずれか1つのアミノ酸配列を含む、請求項2に記載のCTLA4結合タンパク質。
- 前記VHHが、配列番号76〜100のいずれか1つと少なくとも80%、好ましくは少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%、さらにより好ましくは少なくとも99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項3に記載のCTLA4結合タンパク質。
- 前記ヒト化VHHが、配列番号101〜109のいずれか1つのアミノ酸配列を含む、請求項3に記載のCTLA4結合タンパク質。
- 請求項1〜6のいずれか一項に記載のCTLA4結合タンパク質の親和性成熟によって得られるCTLA4結合タンパク質。
- 2つの前記免疫グロブリン単一可変ドメインを含む、請求項1〜7のいずれか一項に記載のCTLA4結合タンパク質。
- 免疫グロブリンFc領域をさらに含む、請求項1〜8のいずれか一項に記載のCTLA4結合タンパク質。
- 前記免疫グロブリンFc領域が、ヒト免疫グロブリンのFc領域、好ましくはヒトIgG1のFc領域である、請求項9に記載のCTLA4結合タンパク質。
- 前記免疫グロブリンFc領域のアミノ酸配列が、配列番号132に示されている、請求項10に記載のCTLA4結合タンパク質。
- 配列番号114〜128から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項9に記載のCTLA4結合タンパク質。
- 以下の特徴:
(a)1×10−7M未満のKDでヒトCTLA4に結合すること;
(b)CTLA4とCD80及び/又はCD86との相互作用をブロックすること;
(c)PBMC及び/又はT細胞の活性化を増強すること;
(d)腫瘍増殖を阻害すること
の少なくとも1つを有する、請求項1〜12のいずれか一項に記載のCTLA4結合タンパク質。 - 1×10−7M未満、好ましくは1×10−8M未満、より好ましくは1×10−9M未満、より好ましくは1×10−10M未満のKDでCTLA4に結合する、請求項1〜12のいずれか一項に記載のCTLA4結合タンパク質。
- 請求項1〜14のいずれか一項に記載のCTLA4結合タンパク質をコードする核酸分子。
- 発現調節エレメントに作動可能に連結されている、請求項15に記載の核酸分子を含む発現ベクター。
- 請求項15に記載の核酸分子を含むか、又は請求項16に記載の発現ベクターで形質転換されており、前記CTLA4結合タンパク質を発現することができる組換え細胞。
- 請求項1〜14のいずれかに一項に記載のCTLA4結合タンパク質を製造する方法であって、
a)CTLA4結合タンパク質の発現を可能にする条件下で、請求項17に記載の組換え細胞を培養するステップ;
b)工程a)の培養物から宿主細胞によって発現されたCTLA4結合タンパク質を回収する工程;並びに
c)任意選択で、工程b)から得られたCTLA4結合タンパク質をさらに精製及び/又は修飾するステップ
を含む方法。 - 請求項1〜14のいずれか一項に記載のCTLA4結合タンパク質、及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
- 対象におけるがんを予防及び/又は治療する方法であって、請求項1〜14のいずれか一項に記載のCTLA4結合タンパク質又は請求項19に記載の医薬組成物の有効量を、前記対象に投与するステップを含む、方法。
- 追加の抗腫瘍治療手段を前記対象に投与することをさらに含む、請求項20に記載の方法。
- 前記追加の抗腫瘍治療手段が、化学療法、放射線療法、腫瘍特異的抗原を標的とする抗体療法、他の腫瘍免疫療法又は腫瘍標的化小分子薬を含む、請求項21に記載の方法。
- 前記追加の抗腫瘍治療手段が、抗EGFR抗体、抗EGFR変異抗体、抗VEGFa抗体、抗HER2抗体、若しくは抗CMET抗体又はそれらの組み合わせを用いた抗体療法を含む、請求項21に記載の方法。
- 前記がんが、肺がん、卵巣がん、結腸がん、直腸がん、黒色腫、腎臓がん、膀胱がん、乳がん、肝臓がん、リンパ腫、血液悪性腫瘍、頭頸部がん、神経膠腫、胃がん、鼻咽頭がん、喉頭がん、子宮頚がん、子宮体癌、骨肉腫からなる群から選択される、請求項20に記載の方法。
- 対象における感染症を予防及び/又は治療する方法であって、請求項1〜14のいずれか一項に記載のCTLA4結合タンパク質又は請求項19に記載の医薬組成物の有効量を対象に投与するステップを含む、方法。
- 前記感染症が、HIV、肝炎ウイルス、インフルエンザウイルス、ヘルペスウイルス、ジアルジア属、マラリア原虫(plasmodium)、リーシュマニア、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)、緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)からなる群から選択される病原体によって引き起こされる、請求項25に記載の方法。
- がん又は感染症を予防及び/又は治療するための医薬の調製における、請求項1〜14のいずれか一項に記載のCTLA4結合タンパク質又は請求項19に記載の医薬組成物の使用。
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