JP2019522481A - 自己切断リボザイムを利用したｒｎａのウイルス送達およびそのｃｒｉｓｐｒベースの適用 - Google Patents

Abstract

本開示は、自己切断リボザイムを利用したRNAのウイルス送達、ならびにCRISPR-Cas関連の適用を含むがそれらに限定されない、その適用に関する。

Description

I. 関連出願の相互参照
本出願は、2016年6月22日に出願された米国仮特許出願第62/353,452号の優先権を主張するものであり、その開示の全体は参照により本明細書に組み入れられる。

II. 連邦政府の補助金に関する陳述
本発明は、米国国立衛生研究所（NIH）によって授与された助成金第R21 AI115226号の下で政府の支援を受けてなされたものである。米国政府は本発明に一定の権利を有する。

III. 発明の分野
本発明の分野は、一般に、自己切断リボザイムを利用したRNAのウイルス送達ならびにそのCRISPRベースの適用に関する。

IV. 発明の背景
遺伝子治療は、基礎的な疾患または症状を治療するために、核酸ポリマー（例えば、RNAまたはDNA）を細胞内に送達することと広く関係している。過去数年間にわたって多くの注目を集めているそのような遺伝子治療の1つは、CRISPR/Cas9である。CRISPR/Cas9技術は、宿主ゲノムへの点レベルの突然変異の導入を可能にすることによって、例えば、宿主ゲノムの所望の位置での切断を可能にし、次いで遺伝子の除去または付加を可能にすることによって、ゲノミクスおよび現代医学に革命を起こすことを約束するものである。CRISPR/Cas9システムは、一般に、切断のためにゲノムの適切な個所にガイドRNA（「gRNA」）によって誘導される特定のヌクレアーゼ、典型的にはCas9、の細胞内への送達に依存している。CRISPR/Cas9を送達するための公知のウイルスベクター系、例えばレンチウイルスおよびアデノ随伴ウイルス（AAV）は、エクスビボおよびインビボの両方で細胞をうまく改変してきた；しかしながら、これらのウイルスのDNAベースの複製は、宿主ゲノムへの望まれない組み込みのリスクと、それゆえに遺伝毒性または発癌のリスクを伴っている。この問題および組み込み欠損型レンチウイルスの使用などの技術革新に多くの注意が払われているにもかかわらず、望ましくない組み込みは、依然として注意深く監視されるリスクをはらんでおり、今後の遺伝子治療試験の成功に影響を与える可能性がある。これらの欠点は、断じてCRISPR/Cas9に固有のものではない。したがって、CRISPRベースの技術の送達を含めて、改善されたウイルスベクター送達システムに対する差し迫ったニーズがある。

V. 本発明の概要
本開示は、宿主細胞に送達される標的RNAに隣接する、RNAウイルスゲノムに挿入された自己切断リボザイムを利用したRNAのウイルス送達、ならびに特にCRISPRベースの技術におけるその使用に関する。したがって、いくつかの実施態様では、本開示は核酸に関する。いくつかの実施態様では、該核酸は一本鎖RNA（ssRNA）ウイルスのゲノム配列を含む。いくつかの実施態様では、該ゲノム配列はアンチセンスRNAを含む。いくつかの実施態様では、該核酸はアンチゲノム配列を含む。いくつかの実施態様では、該アンチゲノム配列はゲノム配列に相補的である。いくつかの実施態様では、該アンチゲノム配列はセンスRNAを含む。いくつかの実施態様では、該アンチゲノム配列は第1の領域を含む。いくつかの実施態様では、該ゲノム配列は第1の領域を含む。いくつかの実施態様では、第1の領域は、（i）標的セグメント、および（ii）第1の自己切断リボザイムを含む第1のセグメントを含む。いくつかの実施態様では、第1の領域は、（iii）第2の自己切断リボザイムをコードする第2のセグメントをさらに含む。いくつかの実施態様では、該標的セグメントは第1のセグメントに隣接する。いくつかの実施態様では、該標的セグメントは第1のセグメントのすぐ上流にある。いくつかの実施態様では、該標的セグメントは第1のセグメントのすぐ下流にある。いくつかの実施態様では、該標的セグメントは第2のセグメントのすぐ上流にある。いくつかの実施態様では、該標的セグメントは第2のセグメントのすぐ下流にある。いくつかの実施態様では、該標的セグメントは自己切断リボザイムのすぐ上流にある。いくつかの実施態様では、該標的セグメントは自己切断リボザイムのすぐ下流にある。いくつかの実施態様では、該標的セグメントは第1のセグメントと第2のセグメントとに隣接している。いくつかの実施態様では、第1の自己切断リボザイムは5'自己切断リボザイムである。いくつかの実施態様では、第1の自己切断リボザイムは3'自己切断リボザイムである。いくつかの実施態様では、第2の自己切断リボザイムは5'自己切断リボザイムである。いくつかの実施態様では、第2の自己切断リボザイムは3'自己切断リボザイムである。いくつかの実施態様では、該標的セグメントは5'自己切断リボザイムと3'自己切断リボザイムとに隣接している。いくつかの実施態様では、第1の領域はRNA発現カセットを含む。

いくつかの実施態様では、5'自己切断リボザイムはハンマーヘッド型リボザイムである。いくつかの実施態様では、3'自己切断リボザイムはハンマーヘッド型リボザイムである。いくつかの実施態様では、5'自己切断リボザイムと3'自己切断リボザイムの両方がハンマーヘッド型リボザイムである。いくつかの実施態様では、5'自己切断リボザイムと3'自己切断リボザイムはどちらもハンマーヘッド型リボザイムではない。いくつかの実施態様では、5'自己切断リボザイムはSEQ ID NO: 2を含む。いくつかの実施態様では、SEQ ID NO: 2は保存的置換を有する。いくつかの実施態様では、3'自己切断リボザイムはSEQ ID NO: 3を含む。いくつかの実施態様では、SEQ ID NO: 3は保存的置換を有する。いくつかの実施態様では、3'自己切断リボザイムはデルタ型肝炎ウイルス（HDV）リボザイムである。いくつかの実施態様では、5'自己切断リボザイムはハンマーヘッド型リボザイムであり、かつ3'自己切断リボザイムはデルタ型肝炎ウイルス（HDV）リボザイムである。いくつかの実施態様では、5'自己切断リボザイムはツイスター型リボザイム（twister ribozyme）である。いくつかの実施態様では、3'自己切断リボザイムはツイスター型リボザイムである。いくつかの実施態様では、5'自己切断リボザイムと3'自己切断リボザイムの両方がツイスター型リボザイムである。いくつかの実施態様では、5'自己切断リボザイムはツイスター・シスター型リボザイム（twister sister ribozyme）である。いくつかの実施態様では、3'自己切断リボザイムはツイスター・シスター型リボザイムである。いくつかの実施態様では、5'自己切断リボザイムと3'自己切断リボザイムの両方がツイスター・シスター型リボザイムである。いくつかの実施態様では、5'自己切断リボザイムはピストル型リボザイム（pistol ribozyme）である。いくつかの実施態様では、3'自己切断リボザイムはピストル型リボザイムである。いくつかの実施態様では、5'自己切断リボザイムと3'自己切断リボザイムの両方がピストル型リボザイムである。いくつかの実施態様では、5'自己切断リボザイムはハチェット型リボザイム（hatchet ribozyme）である。いくつかの実施態様では、3'自己切断リボザイムはハチェット型リボザイムである。いくつかの実施態様では、5'自己切断リボザイムと3'自己切断リボザイムの両方がハチェット型リボザイムである。いくつかの実施態様では、5'自己切断リボザイムはヘアピン型リボザイムである。いくつかの実施態様では、3'自己切断リボザイムはヘアピン型リボザイムである。いくつかの実施態様では、5'自己切断リボザイムと3'自己切断リボザイムの両方がヘアピン型リボザイムである。

いくつかの実施態様では、アンチゲノム配列は第2の領域を含む。いくつかの実施態様では、ゲノム配列は第2の領域を含む。いくつかの実施態様では、第1の領域は第2の領域の上流にある。いくつかの実施態様では、第1の領域は第2の領域の下流にある。いくつかの実施態様では、第2の領域は発現カセットを含む。いくつかの実施態様では、第2の領域はヌクレアーゼをコードする第3のセグメントを含む。いくつかの実施態様では、該ヌクレアーゼはCRISPR関連タンパク質（「Cas」）を含む。いくつかの実施態様では、該ヌクレアーゼはCas9を含む。いくつかの実施態様では、該ヌクレアーゼはCpf1を含む。いくつかの実施態様では、該ヌクレアーゼはCas9様タンパク質またはCas9様合成タンパク質を含む。いくつかの実施態様では、該ヌクレアーゼはCfp1様タンパク質またはCfp1様合成タンパク質を含む。いくつかの実施態様では、該ヌクレアーゼはC2c1タンパク質、C2c2タンパク質、C2c3タンパク質、またはそれらのバリアントおよび修飾体を含む。いくつかの実施態様では、該ヌクレアーゼはクラス2のCRISPR関連ヌクレアーゼを含む。いくつかの実施態様では、該ヌクレアーゼはクラス2タイプIIのCRISPR関連ヌクレアーゼを含む。いくつかの実施態様では、該ヌクレアーゼはクラス2タイプVのCRISPR関連ヌクレアーゼを含む。いくつかの実施態様では、第2の領域はリボソームスキッピング（ribosomal skipping）配列をさらに含む。いくつかの実施態様では、リボソームスキッピング配列はP2Aリボソームスキッピング配列である。いくつかの実施態様では、第2の領域はレポーター分子をコードする第4のセグメントを含む。いくつかの実施態様では、該レポーター分子はタンパク質を含む。いくつかの実施態様では、該レポーター分子は緑色蛍光タンパク質（GFP）である。いくつかの実施態様では、該レポーター分子は赤色蛍光タンパク質（RFP）である。いくつかの実施態様では、該レポーター分子はmCherryである。いくつかの実施態様では、標的セグメントは標的RNAを含む。いくつかの実施態様では、標的セグメントはガイドRNA（gRNA）を含む。いくつかの実施態様では、gRNAは足場配列およびターゲティング配列を有する。いくつかの実施態様では、標的セグメントはトランス活性化型crRNA（tracrRNA）をさらに含む。

いくつかの実施態様では、アンチゲノム配列は第3の領域を含む。いくつかの実施態様では、ゲノム配列は第3の領域を含む。いくつかの実施態様では、第3の領域は第1の領域の上流にある。いくつかの実施態様では、第3の領域は第1の領域の下流にある。いくつかの実施態様では、第3の領域は第2の領域の上流にある。いくつかの実施態様では、第3の領域は第2の領域の下流にある。いくつかの実施態様では、第3の領域は第1の領域の上流および第2の領域の下流にある。いくつかの実施態様では、第3の領域は第1の領域の下流および第2の領域の上流にある。いくつかの実施態様では、第3の領域は第1の領域と第2の領域とに隣接している。いくつかの実施態様では、第3の領域は第5のセグメントを含む。いくつかの実施態様では、第5のセグメントはP遺伝子を含む。いくつかの実施態様では、P遺伝子は変異型P遺伝子を含む。いくつかの実施態様では、変異型P遺伝子は次の変異の1つ以上を有する：D433A、R434A、K437A、およびそれらの組み合わせ。

いくつかの実施態様では、アンチゲノム配列は第4の領域を含む。いくつかの実施態様では、ゲノム配列は第4の領域を含む。いくつかの実施態様では、第4の領域は第1の領域の上流にある。いくつかの実施態様では、第4の領域は第1の領域の下流にある。いくつかの実施態様では、第4の領域は第2の領域の上流にある。いくつかの実施態様では、第4の領域は第2の領域の下流にある。いくつかの実施態様では、第4の領域は第1の領域の上流および第2の領域の下流にある。いくつかの実施態様では、第4の領域は第1の領域の下流および第2の領域の上流にある。いくつかの実施態様では、第4の領域は第1の領域、第2の領域、および第3の領域の上流にある。いくつかの実施態様では、第4の領域は第1の領域、第2の領域、および第3の領域の下流にある。いくつかの実施態様では、第4の領域は第1の領域、第2の領域の下流、および第3の領域の上流にある。いくつかの実施態様では、第4の領域は第1の領域、第2の領域の上流、および第3の領域の下流にある。いくつかの実施態様では、第4の領域は第1の領域、第3の領域の上流、および第2の領域の下流にある。いくつかの実施態様では、第4の領域は第1の領域、第3の領域の下流、および第2の領域の上流にある。いくつかの実施態様では、第3の領域は第6のセグメントを含む。いくつかの実施態様では、第6のセグメントはL遺伝子を含む。いくつかの実施態様では、L遺伝子は変異型L遺伝子を含む。いくつかの実施態様では、変異型L遺伝子は次の変異の1つ以上を有する：N1197S、L1558I、K1795E、およびそれらの組み合わせ。

いくつかの実施態様では、第1の領域は異種である。いくつかの実施態様では、第2の領域は異種である。いくつかの実施態様では、第3の領域は異種である。いくつかの実施態様では、第4の領域は異種である。いくつかの実施態様では、第1の領域および第2の領域は異種である。いくつかの実施態様では、第1の領域および第3の領域は異種である。いくつかの実施態様では、第1の領域および第4の領域は異種である。いくつかの実施態様では、第2の領域および第3の領域は異種である。いくつかの実施態様では、第2の領域および第4の領域は異種である。いくつかの実施態様では、第1の領域、第2の領域および第3の領域は異種である。いくつかの実施態様では、第1の領域、第2の領域および第4の領域は異種である。いくつかの実施態様では、第1の領域、第2の領域、第3の領域および第4の領域は異種である。いくつかの実施態様では、標的セグメントは異種である。いくつかの実施態様では、第1のセグメントは異種である。いくつかの実施態様では、第2のセグメントは異種である。いくつかの実施態様では、第3のセグメントは異種である。いくつかの実施態様では、第4のセグメントは異種である。いくつかの実施態様では、第5のセグメントは異種である。いくつかの実施態様では、第6のセグメントは異種である。

いくつかの実施態様では、本開示はRNA発現カセットに関する。いくつかの実施態様では、該発現カセットは標的配列、自己切断リボザイムをコードする第1のセグメント、および自己切断リボザイムをコードする第2のセグメントを含む。いくつかの実施態様では、標的セグメントは第1のセグメントと第2のセグメントとに隣接している。いくつかの実施態様では、第1の自己切断リボザイムは5'自己切断リボザイムである。他の実施態様では、第1の自己切断リボザイムは3'自己切断リボザイムである。いくつかの実施態様では、第2の自己切断リボザイムは5'自己切断リボザイムである。他の実施態様では、第2の自己切断リボザイムは3'自己切断リボザイムである。いくつかの実施態様では、標的セグメントは5'自己切断リボザイムと3'自己切断リボザイムとに隣接している。いくつかの実施態様では、5'自己切断リボザイムおよび3'自己切断リボザイムはハンマーヘッド型リボザイムである。いくつかの実施態様では、5'自己切断リボザイムはハンマーヘッド型リボザイムであり、3'自己切断リボザイムはデルタ型肝炎ウイルス（HDV）リボザイムである。いくつかの実施態様では、標的配列はガイドRNA（gRNA）を含む。いくつかの実施態様では、標的配列はトランス活性化型crRNA（tracrRNA）をさらに含む。

いくつかの実施態様では、本開示はウイルス粒子に関する。いくつかの実施態様では、ウイルス粒子は本開示のいずれかの局面に記載の核酸を含む。いくつかの実施態様では、ウイルス粒子は一本鎖RNA（ssRNA）ウイルスである。いくつかの実施態様では、ssRNAウイルスのゲノムはマイナス極性のものである。いくつかの実施態様では、ssRNAウイルスはモノネガウイルス目（order mononegavirales）に含まれる。いくつかの実施態様では、ssRNAウイルスはセンダイウイルス（Sendai virus）である。いくつかの実施態様では、ssRNAウイルスは弱毒化されている。いくつかの実施態様では、第1の領域は遺伝子間要素の間に挿入される。いくつかの実施態様では、その遺伝子間要素はP要素とM要素である。いくつかの実施態様では、第2の領域は遺伝子間要素の間に挿入される。いくつかの実施態様では、その遺伝子間要素はN要素とP要素である。いくつかの実施態様では、ウイルス粒子は本開示のいずれかの局面に記載のRNA発現カセットを含む。いくつかの実施態様では、RNA発現カセットはウイルスゲノムの3'領域に位置する。いくつかの実施態様では、ウイルス粒子は温度感受性変異体を含む。いくつかの実施態様では、ウイルス粒子はPL変異体を含む。いくつかの実施態様では、PL変異体は宿主インターフェロン産生を刺激しない。

いくつかの実施態様では、本開示は、標的RNAを宿主細胞に導入する方法に関する。いくつかの実施態様では、宿主細胞は原核細胞である。いくつかの実施態様では、原核細胞は細菌または古細菌の細胞を含む。いくつかの実施態様では、宿主細胞は真核細胞である。いくつかの実施態様では、真核細胞は植物細胞、動物細胞、原生生物、または真菌細胞を含む。いくつかの実施態様では、動物細胞は脊椎動物（脊索動物）細胞を含む。いくつかの実施態様では、動物細胞は無脊椎動物細胞を含む。いくつかの実施態様では、動物細胞は哺乳動物細胞を含む。いくつかの実施態様では、前記方法は、（i）本開示のいずれかの局面に記載のウイルス粒子を宿主細胞と接触させる段階；ならびに（ii）（a）標的RNAの産生、および（b）転写された第1の領域から第1の自己切断リボザイムが標的RNAを遊離させる、標的RNAの遊離を可能にする条件下で、該宿主細胞を培養する段階を含む。いくつかの実施態様では、該宿主細胞は、古細菌細胞、細菌細胞、および真核細胞からなる群より選択される。

いくつかの実施態様では、本開示は、宿主細胞中の標的DNAに部位特異的改変を導入する方法に関する。いくつかの実施態様では、宿主細胞は原核細胞である。いくつかの実施態様では、原核細胞は細菌または古細菌の細胞を含む。いくつかの実施態様では、宿主細胞は真核細胞である。いくつかの実施態様では、真核細胞は植物細胞、動物細胞、原生生物、または真菌細胞を含む。いくつかの実施態様では、動物細胞は脊椎動物（脊索動物）細胞を含む。いくつかの実施態様では、動物細胞は無脊椎動物細胞を含む。いくつかの実施態様では、動物細胞は哺乳動物細胞を含む。いくつかの実施態様では、前記方法は、（i）宿主細胞を本開示のいずれかの局面に記載のウイルス粒子と接触させる段階であって、該ウイルス粒子は5'自己切断リボザイム、gRNA、およびヌクレアーゼをコードするゲノムを有する、段階；（ii）（a）5'自己切断リボザイムに隣接しているgRNAおよびヌクレアーゼの産生、（b）5'自己切断リボザイムがgRNAを遊離させる、gRNAの遊離、（c）ヌクレアーゼの発現、（d）gRNAの足場配列がヌクレアーゼに結合する、ヌクレアーゼとgRNAの複合体の形成、および（e）プロトスペーサー隣接モチーフ（protospacer adjacent motif: PAM）に隣接する標的DNA上の配列にgRNAのターゲティング配列が結合する、標的DNAと複合体との接触を可能にする条件下で、該宿主細胞を培養する段階；ならびに（iii）標的DNAに部位特異的改変を導入する段階を含む。いくつかの実施態様では、部位特異的改変は挿入である。いくつかの実施態様では、部位特異的改変は欠失である。いくつかの実施態様では、部位特異的改変はフレームシフトである。いくつかの実施態様では、部位特異的改変は点変異である。いくつかの実施態様では、部位特異的改変は挿入、欠失、フレームシフト、および点変異のうちの1つである。いくつかの実施態様では、該DNAはゲノムである。いくつかの実施態様では、該DNAは染色体である。他の実施態様では、該DNAは染色体外にある。いくつかの実施態様では、該DNAはミトコンドリアDNAである。いくつかの実施態様では、該DNAは葉緑体DNAである。いくつかの実施態様では、該DNAはプラスミド上にある。

いくつかの実施態様では、本開示はベクターまたはベクター系に関する。いくつかの実施態様では、ベクターは本開示の任意の核酸をコードするDNAを含む。いくつかの実施態様では、ベクターは1つ以上のプラスミドである。いくつかの実施態様では、ベクターまたはベクター系は1つ以上のコスミドである。いくつかの実施態様では、少なくとも1つのプラスミドはT7駆動プロモーター要素を有する。いくつかの実施態様では、本開示は、本開示のいずれかの局面に記載のベクターまたはベクター系で形質転換された細胞に関する。いくつかの実施態様では、該細胞は細菌細胞である。いくつかの実施態様では、該細胞は大腸菌（E. coli）である。いくつかの実施態様では、該細胞は化膿レンサ球菌（S. pyogenes）である。いくつかの実施態様では、該細胞は真菌細胞である。いくつかの実施態様では、該細胞は出芽酵母（S. cerevisiae）または***酵母（S. pombe）である。いくつかの実施態様では、該細胞はピキア酵母（P. pastoris）である。いくつかの実施態様では、1つ以上のベクターの発現は同時に起こる。他の実施態様では、1つ以上のベクターの発現は別々に誘導可能である。

いくつかの実施態様では、本開示はキットに関する。いくつかの実施態様では、キットは本開示のいずれかの局面に記載のベクターを含む。いくつかの実施態様では、キットは薬学的に許容される防腐剤または担体を含む。いくつかの実施態様では、キットは、ゲノム配列、またはゲノム配列に相補的なアンチゲノム配列をコードするDNAを発現させるための試薬をさらに含む。いくつかの実施態様では、該試薬はポリメラーゼを含む。いくつかの実施態様では、ポリメラーゼはT7 RNAポリメラーゼである。いくつかの実施態様では、該試薬はプライマーを含む。いくつかの実施態様では、キットは使用説明書をさらに含む。

VI. 図面の簡単な説明
図1は、Cas9および自己切断リボザイムに隣接するガイドRNA（gRNA）を組み込んだセンダイウイルスが高力価に複製することを表す。図1A：マイナスセンスRNAゲノムは、ウイルスプロモーター（ゲノムプロモーターとして機能する3'リーダー（le）と、アンチゲノムプロモーターとして機能する5'トレーラー（tr））の間にはさまれている。センダイウイルスの遺伝子であるN（核タンパク質）、P（リンタンパク質）、M（マトリックス）、F（融合タンパク質）、HN（付着タンパク質）、およびL（ラージRNA依存性RNAポリメラーゼ）が示される。EGFP-P2A-Cas9カセット（5.1kb）はNとPの間に挿入され、自己切断リボザイム（rbz 1およびrbz 2）が隣接するガイドRNA（全部で0.2kb）はPとMの間に挿入された。リボザイムは、プラスセンス方向、つまり5'から3'の方向でのみ機能する。ゲノムは、完全長アンチゲノム、または個々のキャップ付加およびポリアデニル化mRNAのいずれかに3'から5'へと転写され得る。これらのmRNAは極性転写勾配（polar transcriptional gradient）で産生され、N mRNAが最も豊富であり、L mRNAが最も豊富でない。 図1は、Cas9および自己切断リボザイムに隣接するガイドRNA（gRNA）を組み込んだセンダイウイルスが高力価に複製することを表す。図1B：自己切断ハンマーヘッド型リボザイムの配列および構造を示す。キメラガイドRNAは、図1Aにおけるオレンジ色での強調表示に対応して、オレンジ色で示される。矢印は切断部位を示す。 図1は、Cas9および自己切断リボザイムに隣接するガイドRNA（gRNA）を組み込んだセンダイウイルスが高力価に複製することを表す。図1C：リボザイムの自己切断活性は、「材料および方法」に記載されるようにqRT-PCRでアッセイした。エラーバーは3回の独立した実験からの標準偏差を表す。 図1は、Cas9および自己切断リボザイムに隣接するガイドRNA（gRNA）を組み込んだセンダイウイルスが高力価に複製することを表す。図1D：rSeV-Cas9（WT）、または自己切断を無効にするように両方のリボザイムを変異させたrSeV-Cas9（Mut）は、プラスミドDNAからレスキューされた。EGFPはトランスフェクトされたアンチゲノムのゲノムへの変換およびその後のウイルスmRNA産生の際にのみ発現されるので、トランスフェクションの1〜2日後（1〜2dpt）にフローサイトメトリーによりGFP+細胞（レスキュー事象）を観察することによって、レスキュー効率を決定した。エラーバーは3回の反復実験からの標準偏差を表す。ns：有意でない。 図1は、Cas9および自己切断リボザイムに隣接するガイドRNA（gRNA）を組み込んだセンダイウイルスが高力価に複製することを表す。図1E：BSR-T7細胞に0.01の感染多重度（MOI）で感染させた。rSeV-Cas9（WT）中のリボザイムは、自己切断を示さない変異体（Mut）と比較して増殖に影響を与えるようであるが、それらは両方ともほぼ10⁸IU/mLの同じピーク力価に達する。 図1は、Cas9および自己切断リボザイムに隣接するガイドRNA（gRNA）を組み込んだセンダイウイルスが高力価に複製することを表す。図1F：6ウェル中のHEK293細胞を、2μgのpx330（rSeV-Cas9中のFLAGタグ付きCas9はこれに由来した）でトランスフェクトするか、または10のMOIでrSeV-Cas9に感染させた。細胞溶解物を2日後に回収し、Cas9上のFLAGエピトープの検出のためにSDS-PAGEおよびウェスタンブロット分析によって処理した。COX IVはローディング対照を表す。 図2は、mCherry遺伝子を標的とするrSeV-Cas9がレポーター細胞株のほぼ完全な変異誘発を達成することを表す。図2A：mCherry誘導性HEK293細胞に、rSeV-Cas9-対照（ガイドRNAなし）またはrSeV-Cas9-mCherry（mCherryを標的とするガイドRNA）をMOI 25で感染させた。感染後4日目にmCherryの発現をドキシサイクリン（dox）で誘導し、翌日フローサイトメトリーのために細胞を回収した。mCherry蛍光のノックアウト（KO）率を100*(1-(C/(C+D)/(A/(A+B))として求めた。3回の独立した実験からの結果を示す。 図2は、mCherry遺伝子を標的とするrSeV-Cas9がレポーター細胞株のほぼ完全な変異誘発を達成することを表す。図2B：図2Aのパネルのように処理した細胞を蛍光顕微鏡で画像化した。各条件に対して同じ露光量を使用した。 図2は、mCherry遺伝子を標的とするrSeV-Cas9がレポーター細胞株のほぼ完全な変異誘発を達成することを表す。図2C：rSeV-Cas9-mCherryを変異させて、Rbz 2（Rbz 2-mut）または両方のリボザイム（Rbz 1/2-mut）を非機能的にした。代替3'リボザイムのデルタ型肝炎ウイルス（HDV）リボザイムもまた、Rbz 2と置き換えて試験した。実験は図2Aのように実施した。 図2は、mCherry遺伝子を標的とするrSeV-Cas9がレポーター細胞株のほぼ完全な変異誘発を達成することを表す。図2D：HEK293細胞にrSeV-Cas9-対照またはrSeV-Cas9-mCherryをMOI 25で感染させ、感染後6日目にmCherry座位のディープシーケンシング（deep sequencing）のために細胞を回収した。エラーバーは、Jeffreys 95％信頼区間を表す。変異した標的の5つの最も豊富な種とそれらの相対存在率（relative abundance percentage）が示される。強調表示は20bpの標的配列を表し、矢印はCas9切断部位を表し、3bpのPAMモチーフが示される。 図3は、rSeV-Cas9が内因性ccr5およびefnb2を効率的に変異させることを表す。図3A：Affinofile細胞にrSeV-Cas9-対照またはrSeV-Cas9-CCR5をMOI 25で感染させた。CD4/CCR5の過剰発現を2日目に誘導し、翌日細胞にCCR5指向性HIV-1をさらに感染させた。p24およびCCR5についてのフローサイトメトリーを、rSeVによる感染の5日後に行った。示したデータはrSeV感染細胞（GFP+）についてゲートされている。 図3は、rSeV-Cas9が内因性ccr5およびefnb2を効率的に変異させることを表す。図3B：HEK293細胞にrSeV-Cas9-対照またはターゲティングウイルスrSeV-Cas9-CCR5もしくはrSeV-Cas9-EFNB2をMOI 25で感染させた。感染後2日目のフローサイトメトリーは、98％の感染を示した。ターゲット座位およびオフターゲット座位のディープシーケンシングのために、感染後6日目に細胞を回収した（ゲノム位置および配列については下記の表2を参照のこと）。エラーバーは、Jeffreys 95％信頼区間を表す。各標的について、変異した標的の5つの最も豊富な種とそれらの相対存在率が示される。 図3B-1の続きである。 図3B-2の続きである。 図4は、Ccr5を標的とするrSeV-Cas9が初代ヒト単球を高頻度で編集することを表す。図4A：初代ヒト単球にrSeV-Cas9-対照またはrSeV-Cas9-CCR5をMOI 50で感染させると同時にGM-CSFで刺激し、オンターゲットおよびオフターゲット座位のディープシーケンシングのために感染後5日目に細胞を回収した。フローサイトメトリーは98％の感染を示した。エラーバーは、Jeffreys 95％信頼区間を表す。各標的について、変異した標的の5つの最も豊富な種とそれらの相対存在率が示される。 図4A-1の続きである。 図4は、Ccr5を標的とするrSeV-Cas9が初代ヒト単球を高頻度で編集することを表す。図4B：独立したドナーからの初代ヒト単球にパネルaのように感染させ、細胞表面CCR5のフローサイトメトリーのために感染後5日目に細胞を回収した。示したデータは感染細胞（GFP+）についてゲートされている。 図5は、rSeV-Cas9-mCherryによるmCherry蛍光ノックアウトの経時変化を表す。図5A：mCherry誘導性HEK293細胞にrSeV-Cas9-対照またはrSeV-Cas9-mCherryをMOI 25で感染させた。感染後の示された日にドキシサイクリンを用いてmCherry発現を誘導し、翌日フローサイトメトリーのために細胞を回収した。 図5は、rSeV-Cas9-mCherryによるmCherry蛍光ノックアウトの経時変化を表す。図5B：mCherry発現（感染したGFP+細胞についてゲートされた）のヒストグラムを別の比較として下に示す。 図6は、単球（図6A）およびHEK293（図6B）におけるccr5変異バリアントの存在量を表す。ccr5の全変異バリアントの相対存在量が円グラフで示される。これらの特定のバリアントは、HEK293円グラフでも強調表示される。単球またはHEK293についての100の最も豊富なバリアントの存在量の分布が右に示される。 図6A-1の続きである。 図6は、単球（図6A）およびHEK293（図6B）におけるccr5変異バリアントの存在量を表す。ccr5の全変異バリアントの相対存在量が円グラフで示される。これらの特定のバリアントは、HEK293円グラフでも強調表示される。単球またはHEK293についての100の最も豊富なバリアントの存在量の分布が右に示される。 図6B-1の続きである。 図7は、リボザイム切断アッセイに使用されるqRT-PCRプライマーの略図を表す。 図8は、実施例2において作成されたPL変異体の概略図を表す。図8Aは、特定のPおよびL変異の概略図を示す。 図8は、実施例2において作成されたPL変異体の概略図を表す。図8Bは、PL変異体の温度感受性表現型を示す。 図9は、ヒト胎児肝臓と末梢血の両方からのヒトCD34+造血幹細胞（HSC）に感染するPL変異体（ts rSeV-Cas9-CCR5ベクター）の能力を表す。図9Aは、参考のために図8Aと同じ概略図を示す。gRNAはCCR5に対して標的化されており、実施例1で使用された、まさにそのgRNAである。 図9は、ヒト胎児肝臓と末梢血の両方からのヒトCD34+造血幹細胞（HSC）に感染するPL変異体（ts rSeV-Cas9-CCR5ベクター）の能力を表す。図9Bは、精製したヒト胎児肝臓CD34+ HSCと末梢血動員CD34+ HSCのPL変異体による形質導入/感染を示す（MOI＝5を使用して感染後2日目（2dpi）に＞90％のGFP+；感染を34℃で実施した）。 図9は、ヒト胎児肝臓と末梢血の両方からのヒトCD34+造血幹細胞（HSC）に感染するPL変異体（ts rSeV-Cas9-CCR5ベクター）の能力を表す。図9Cは、34℃対37℃での感染の経時変化を示す。CD34+ HSCを34℃で2日間感染させた後、34℃に維持するか、または2dpiで37℃にシフトさせた。GFP+細胞は着実に減少した。 図9は、ヒト胎児肝臓と末梢血の両方からのヒトCD34+造血幹細胞（HSC）に感染するPL変異体（ts rSeV-Cas9-CCR5ベクター）の能力を表す。図9Dは、2dpiでのPL変異体感染CD34+ HSCからのサンガー配列決定データを示す。19/24クローン（約80％）が標的CCR5座位にインデル(indel)を示した。 図10は、PL変異体（ts rSeV-Cas9-CCR5ベクター）がヒトCD34+/CD38-/CD45RA-/CD90+(Thy1+)/CD49fhigh細胞（LT-HSC、SCID再構築性（repopulating）細胞）を効率的に形質導入することを表す。感染CD34+ HSCの表現型検査は、PL変異体が、SCID（免疫不全）マウスを単一細胞レベルで再構築することができる、長期HSCまたはSCID再構築性細胞（すなわち、「真の」幹細胞）として文献中で知られているCD34+/CD38-/CD45RA-/CD90+ (Thy1+)/CD49f-high細胞の＞90％に感染することができることを示した。 図11は、広範囲のウイルス接種量にわたって「野生型」rSeV-Cas9ベクターまたはPL変異体のいずれかを感染させた293T細胞における2つの代表的なISG（インターフェロン刺激遺伝子）の誘導倍率（fold induction）を表す。IFIT1の誘導倍率を図11Aに示す。RIG-1の誘導倍率を図11Bに示す。ウイルス複製およびISG誘導はqRT-PCRにより測定した。高いウイルスゲノムコピー数でさえも、PL変異体ウイルスはISGを誘導するのに著しく欠陥があった。これは、含まれるgRNA（mCherryまたはCCR5）にかかわらず、当てはまった。データはCCR5 gRNAウイルスについて示される。 図12は、2つのgRNA、例えばCCR5 gRNAおよびHRPT gRNAを送達することができるrSeVベクターの概略図を表す。図12Aは、PL変異体の概略図を表す。図12Bは、融合タンパク質を欠くように改変され（ΔF）、かつ標的RNA送達領域が2つのgRNA、すなわちCCR5およびHRPT（両方とも両端にハンマーヘッド型リボザイムとHDV自己切断リボザイムが隣接している）を送達するように改変された、PL変異体の概略図を表す。

VII. 発明の詳細な説明
本開示の一実施態様は、RNA発現カセットを含むがこれに限定されない、新規核酸に関する。該核酸は一般に、ssRNAウイルス、例えばセンダイウイルス（SeV）、の遺伝的に改変されたゲノムまたは該ゲノムに相補的なアンチゲノムに関連する。パラミクソウイルスおよびSeVを含むがこれらに限定されない、モノネガウイルス目のゲノムはアンチセンスRNAである（すなわち、マイナス極性を有する）。したがって、本明細書が一本鎖RNA（ssRNA）ウイルスのゲノム配列を含む核酸に言及する場合、そのゲノム配列はアンチセンスRNAであると理解される。それゆえに、アンチゲノム配列はセンスRNAである。したがって、例えばセンダイウイルスの、マイナス極性ゲノムから転写されたRNAアンチゲノムはセンスRNAを含むであろう。ssRNAウイルスのゲノムから転写されたmRNAは、翻訳され得るセンスRNAを同様に含むであろう；あるいは、mRNAが1つ以上の自己切断リボザイムに隣接する（例えば、自己切断リボザイムと自己切断リボザイムにはさまれた）標的配列を含む場合には、その自己切断リボザイムは標的配列を遊離させることができるであろう。本開示のアンチゲノムは、マイナス極性ゲノムから転写された生物学的に活性なmRNAと同様に、5'から3'方向に配向するので、本開示の核酸の要素は、典型的には、それらのアンチゲノム成分により言及される。しかしながら、本明細書に記載の発明はアンチゲノム成分だけに明示的に限定されない。というのは、例えば（後述される）本開示のウイルス粒子内に含まれるような、ゲノム成分は、インビトロもしくはインビボでアンチゲノムもしくはそのアンチゲノム要素に転写され得るか、または生物学的に活性な役割を果たすmRNA断片に転写され得る新規核酸を表すからである。

本開示のアンチゲノム配列は、一般に、（i）標的セグメントと、（ii）第1の自己切断リボザイムをコードする第1のセグメントとを含む、第1の領域を含む。標的セグメントは、標的セグメントに隣接する1つ以上の自己切断リボザイムによって、ゲノムから転写されたmRNAから遊離させることができるペイロード（payload）、例えばRNAペイロード、であると理解されるべきである。この自己切断リボザイムは、5'自己切断リボザイムまたは3'自己切断リボザイムであり得る。本開示の好ましい実施態様は、細胞に送達される標的セグメントの両端に隣接する5'自己切断リボザイムと3'自己切断リボザイムの両方を利用する。図2Cは、5'および3'自己切断リボザイムの両方を存在させることが好ましいが、本発明がこの局面で作動するために真に必要なのは1つだけであることを示す。しかし、理論に拘束されることを望むものではないが、標的DNAに部位特異的改変を導入することを含む方法（すなわちCRISPR関連の適用）では、少なくとも1つの5'自己切断リボザイムが存在しなければならないと考えられる。それは、gRNAのターゲティング配列がgRNAの5'末端に位置しており、それに対するわずかな変更はターゲティング能力の喪失をもたらす可能性があるためである。しかしながら、細胞への標的セグメント、例えば標的RNA、の一般的な送達のためには、単一の5'自己切断リボザイムまたは3'自己切断リボザイムのいずれかで十分であろう。この局面に関する本開示の一般的な概念は、ゲノムおよびアンチゲノム配列が、1つ以上の自己切断リボザイムを活性ではないのに「保存」（すなわちコード）できることであり、それらは、ゲノム配列からmRNAに転写された時点で、生物学的に活性になるにすぎない。理論に拘束されることを望むものではないが、アンチゲノムはゲノムから転写されたmRNAと同じ配向でリボザイム（複数可）を含むが、自己切断リボザイムはアンチゲノムにおいては活性でないと考えられる。これは、ウイルスのヌクレオキャプシドタンパク質によるゲノムおよびアンチゲノムRNAの同時転写キャプシド形成によるものと考えられる。このことは重要である。なぜなら、アンチゲノムが自己切断性であったならば、アンチゲノムからのさらなる全長ゲノムの生成は不可能であると予想されるからである。したがって、本開示のリボザイムは、ゲノムから転写されたmRNAにおいてのみ活性であると考えられる；該mRNAは、ウイルスアンチゲノムを包み込むヌクレオキャプシドタンパク質（図1ではNで表される）によって包まれていない。mRNAがウイルスゲノムから転写されると、自己切断リボザイムは活性化してそれ自身を切断し、そうすることによって、（単一の自己切断リボザイムの場合には）それが隣接する標的セグメントを遊離させるか、または（2つの自己切断リボザイムの好ましい場合には）それらがはさんでいる標的セグメントを遊離させる。その後、標的セグメントはフリーとなって、ウイルスゲノムを転写した細胞内で特定の効用を果たす。

本開示の自己切断リボザイムはいくつかの形態を取り得る。例示的な自己切断リボザイムは、図1Aに示されるような、ハンマーヘッド型リボザイムである。しかし、デルタ型肝炎ウイルス（HDV）リボザイムを含めて、他の自己切断リボザイムを使用してもよい。本明細書に詳述するように、HDVリボザイムは3'自己切断リボザイムとしてのみ利用できるが、ハンマーヘッド型リボザイムは5'自己切断リボザイムと3'自己切断リボザイムの両方において利用できることに留意することが重要である。他の利用できる自己切断リボザイムとしては、ツイスター型（例えば、イネ（O. sativa）、env9、およびenv22由来のTwiser）、ツイスター・シスター型、ピストル型、ハチェット型、ヘアピン型、ニューロスポラ（Neurospora）VS、およびglmSリボザイムが挙げられる。自己切断リボザイムは一般に、異なる活性部位の構造、および分岐的であるが類似した生化学的性質によって特徴付けられる。自己切断リボザイムの切断活性は、切断部位周辺のヌクレオチド配置および/または静電ポテンシャルの変化を引き起こし得る、2価カチオン、pH、および塩基特異的変異に大きく依存している。自己切断リボザイムは、Weinberg et al., 2015, Nature Chemical Biology, “New classes of self-cleaving ribozymes revealed by comparative genomics analysis”およびLee et al., 2017, Molecules, “Structural and Biochemical Properties of Novel Self-Cleaving Ribozymes”に詳述されており、両方の参考文献は、それらの全体が参照により本明細書に組み入れられる。理論に拘束されることを望むものではないが、ほとんどの自己切断リボザイムの作用機序は、切断部位のすぐ近くにあるグアニンとアデニンの酸-塩基触媒作用に基づいている。さらに、いくつかの結晶構造が切断部位で非架橋リン酸酸素への直接的な金属イオン配位を示したという事実にもかかわらず、金属イオンは触媒的な役割ではなく構造的な役割を果たしていると考えられる。新しい自己切断リボザイムが出現するとき、それらもまた本開示の範囲内であるとみなされるが、ただし、ssRNAウイルスゲノムから転写されたときに、それらが自己切断して、標的セグメント（例えばRNAペイロード）を標的細胞にうまく送達できることを前提とする。

新規核酸を使用する例示的な方法として、標的セグメントはガイドRNA（gRNA）および/またはtracrRNAを含み得る。このような実施態様では、核酸は第2の領域をさらに含むことができる（しかし必ず含むとは限らない）。ゲノムの第2の領域は、転写されたとき、ヌクレアーゼ、例えばCas9（Cas9ホモログを含むがこれに限定されない）またはCpf1をコードするように翻訳され得るmRNAを生成するヌクレオチド配列を含むことができるが、他のヌクレアーゼが本開示への組み込みに適している可能性もある。この核酸の例示的な実施態様を図1Aに示す。このような実施態様では、第1の領域と第2の領域をssRNAウイルスゲノム内の異なる位置にサブクローニングすることができる。第1の領域/第2の領域をどこにサブクローニングするかについての1つの特定の考慮事項は、ゲノム位置に対する転写活性の速度である。例えば、典型的なssRNAウイルスであるSeVでは、ウイルスゲノムの3'領域において転写がより活発である；したがって、該ゲノムの3'領域に位置する領域（または発現カセット）は、ウイルスゲノムの5'領域内に位置する領域（または発現カセット）と比べて過剰発現されるだろう。この形質は全てのパラミクソウイルスに共通しており、これには、下記の実施例1に示されるように、SeVで達成された成功がパラミクソウイルス科の他のメンバーにも通用するという強い意味合いがついてくる。かくして、そのような領域をウイルスゲノムの5'もしくは3'末端により近づけてまたはそこからより遠ざけてクローニングすることには様々な利点がある。留意点は、第1の領域と第2の領域のウイルスゲノムへのクローニングの位置が任意であるということ、および重要視すべきことが、これらの領域自体の組成であって、ウイルスゲノム要素の残部ではないということである。

本開示の別の局面は、「核酸」と題する上記セクションにおいて考察された前述の核酸を含むウイルス粒子に関する。上述したように、本開示の核酸は、ssRNAウイルスの改変されたゲノムおよびアンチゲノムに関する。したがって、本開示のこの局面は改変型ssRNAウイルスに関する。先に述べたように、RNAがマイナス極性（すなわちアンチセンス）であるssRNAウイルスは、本開示の範囲内にあると考えられ、それゆえに使用に適している。明らかに、モノネガウイルス目のウイルスは本開示の範囲内にあると考えられる。それは、モノネガウイルス目のウイルスが本開示の核酸を組み込むのに向いている共通の属性を有するからである。モノネガウイルスは、線状で一本鎖の、マイナス極性を有する非感染性RNA鎖を保持する。モノネガウイルスは特徴的な遺伝子の順序を有し、極性逐次的転写（polar sequential transcription）を介して5〜10の異なるmRNAを産生し、かつ完全なアンチゲノムを合成することによって複製する。

モノネガウイルス目の科には、ボルナウイルス科、フィロウイルス科、ニアミウイルス科（nyamiviridae）、パラミクソウイルス科、およびラブドウイルス科が含まれる。ボルナウイルス科の属には、ボルナウイルスが含まれる。フィロウイルス科の属には、クエバウイルス、エボラウイルス、およびマールブルグウイルスが含まれる。ニアミウイルス科の属には、ニアウイルス（nyavirus）が含まれる。パラミクソウイルス科の属には、アクアパラミクソウイルス、アブラウイルス、フェラウイルス（feravirus）、ヘニパウイルス、モルビリウイルス、レスピロウイルス、ルブラウイルス、ニューモウイルス、およびメタニューモウイルスが含まれる。ラブドウイルス科の属には、アレムンドラウイルス（alemndravirus）、バイアウイルス（baiavirus）、クリオウイルス（curiovirus）、サイトラブドウイルス（cytorhabdovirus）、ジコルハウイルス（dichorhavirus）、エフェメロウイルス（ephemerovirus）、ハパウイルス（hapavirus）、レダンテウイルス（ledantevirus）、リッサウイルス（lyssavirus）、ノビラブドウイルス（novirhabdovirus）、ヌクレアラブドウイルス（nuclearhabdovirus）、ペラブドウイルス（perhabdovirus）、ソーグラウイルス（sawgravirus）、シグマウイルス（sigmavirus）、スプリビウイルス（sprivivirus）、チブロウイルス（tibrovirus）、ツパウイルス（tupavirus）、およびベシクロウイルス（vesiculovirus）が含まれる。当業者は、これらの候補の全てが、ニューカッスル病ウイルス（NDV）およびセンダイウイルスを含むがこれらに限定されないパラミクソウイルス科と同じくらい本開示の特定の実施態様への組み込みに適しているとは限らないことを容易に理解するであろうが、これらのウイルスのそれぞれは、本開示の核酸を組み込むための組成的観点から必要な特徴を保持している。

本開示のウイルス粒子は、当業者に公知のルーチンな方法によって作成することができる。例えば、本開示のウイルス粒子は、本開示の核酸をコードするDNA、例えば本開示のウイルスゲノムまたはアンチゲノムを含むベクター、例えば本開示の1つ以上のプラスミド、でトランスフェクトされたパッケージング細胞から作成され得る。これは、特にウイルス粒子が弱毒化されている、例えば複製能がない場合に、ウイルス粒子のスケーラブルな生産を可能にする。パッケージング細胞においてベクターの発現が誘導され、回収のためにウイルスが組み立てられる。このプロセスは実施例1に例示されており、そこでは大腸菌細胞がrSev-Cas9組み換えゲノム/アンチゲノムの要素を含むプラスミドでトランスフェクトされた。他のパッケージング細胞は当業者に知られており、限定するものではないが、HEK293細胞およびPA317細胞が含まれる。

本開示に適したssRNAウイルスのうち、センダイウイルス（SeV）は特に興味深いものであり、下記の実施例1を通して使用される典型的なウイルスである。本開示は、驚くべきことに、特定のssRNAウイルス、例えばセンダイウイルスによって例示されるパラミクソウイルスが、ゲノム内の自己切断リボザイムに耐えることができることを示した。理論に拘束されることを望むものではないが、上述したように、これはおそらく、核タンパク質によるゲノムおよびアンチゲノムRNAの同時転写キャプシド形成と、それゆえの全長RNAの複製中のリボザイム活性の防止によるものである。Cas9発現のさらなる組み込みと相まって、レスキューされた複製能のあるウイルスは、ゲノム内のガイドRNA標的配列の変異誘発を効率的に引き出すことができた。例えば、使用するガイドRNA配列および標的細胞が異なるため、ccr5標的化ウイルスの効率を他の研究と直接比較することはできないが、レンチウイルスまたはAAV CRISPR/Cas9形質導入を介して達成された変異誘発率と同等の、またはそれを上回るccr5変異誘発率（75〜88％）が達成された。さらに、センダイウイルスによる感染は非常に効率的であったので、こうした高い変異誘発率を達成することによって感染細胞のソーティングまたは選択が必要とされず、このことはもう一つの明白な利点である。

広範な指向性（tropism）、高力価への増殖、および前述の外来遺伝子のロバストな発現という利点に加えて、ssRNAウイルス、例えばセンダイウイルスは、遺伝子治療ベクターとしてさらなる重要な利点を有する。第一に、そのようなウイルスはエンベロープのスイッチング（switching）または改変を受け入れやすく、異なる細胞型特異性をもつエンベロープタンパク質を元のものに代えて使用することができるか、あるいは元の付着または融合タンパク質自体を異なる特異性をもつように改変することができる。第二に、センダイウイルスは、他のパラミクソウイルスと同様に、ポリメラーゼ複合体がゲノムの3'末端から5'末端に移動するにつれて転写産物レベルが減少する極性転写勾配（図1A）を有する。Cas9活性の効率 対 特異性はトレードオフのようであり、したがっておそらく、各CRISPR送達プラットフォームについてCas9およびガイドRNAの最適発現レベルを決定する必要がある。そのため、特にパラミクソウイルスについては、これらの導入要素の挿入される領域をゲノム内でシフトすることによって、または遺伝子開始シグナルの強度を改変することによって、Cas9およびガイドRNAの発現レベルを調節および微調整することができる。第三に、パラミクソウイルスは遺伝的組み換えまたは不安定性に陥りにくく、センダイウイルスに関して相同または異種の組み換えはこれまで検出されていない。第四に、関連するヒトパラインフルエンザウイルス-1に対する免疫が広く行き渡っているにもかかわらず、交差中和性の抗センダイウイルス力価は低い。したがって、マウス病原体としてのセンダイウイルスは、ヒトにおいて顕著な既存の特異免疫に遭遇することはないと考えられ、このことは、特にセンダイウイルスを遺伝子治療、例えばRNA標的の細胞への送達、のための非常に魅力的なターゲットにしている。

本開示は厳密にはセンダイウイルス（SeV）に限定されないが、センダイウイルスは、それを驚くほど有効にするいくつかの特徴を備えている。センダイウイルスは、広く研究されており、エクスビボおよびインビボ遺伝子治療の用途に有用である温度感受性の、非細胞変性の、複製能のないセンダイウイルスを開発するように改変されてきた。センダイウイルスの突然変異およびバリアントは、非許容温度に一時的にシフトするまで許容温度でセンダイウイルスの複製を可能にし、非許容温度へのシフト後に複製が阻止されて、もはや検出できないことを特徴としている。温度感受性によるセンダイウイルス複製のそのようなコントロールは、Cas9およびガイドRNA発現の一時的制御を可能にし、これは、編集が完了したらベクターを取り除くことでオフターゲット作用を減らすことになり、ここでも、センダイウイルスの特定の有用性が語られる。自然免疫応答および付随する細胞病原性の誘発を回避する能力をさらに付与する突然変異は、造血幹細胞または他の初代細胞などの感受性細胞型のかく乱を回避するであろう。最後に、センダイウイルスは、エンベロープおよび/またはマトリックス遺伝子の単一および複数の欠失を受け入れやすく、その結果、該ウイルスは、これらのウイルス因子がトランスで供給された場合にのみ、複製できるようになる。これらの外因的に供給される因子の非存在下で標的細胞に感染させると、該ウイルスはそのゲノム上にコードされた因子を産生することができるが、後続の感染性ウイルスの産生を介して増幅することはできない。

下記の実施例2には、PL変異体と命名された、変異型PおよびL遺伝子を有する組み換えセンダイウイルスベクターの好ましい実施態様が示される。PL変異体は温度感受性であり、34℃では効率的にトランスフェクトするが37℃ではトランスフェクトしない。しかし、さらに驚くべきことは、PL変異体が宿主インターフェロン（IFN）応答を誘導しない、すなわち、PL変異体ベクターを感染させたときに宿主におけるIFNの産生が刺激されないことである。IFNサイレント表現型は、IFNの誘導が分化へと駆り立てて「幹細胞らしさ」（stemness）を損なう可能性があるCD34+造血幹細胞のような、感受性細胞に該ウイルスベクターを適用する場合に特に重要である。したがって、PL変異体、特にセンダイウイルスのPL変異体は、宿主細胞、例えば幹細胞、におけるRNAトランスフェクションのための驚くほど効果的なビヒクルに相当する。

本開示のウイルス粒子は、RNAペイロード、例えばCRISPR関連の適用の場合にはgRNAペイロード、を標的細胞に導入するために利用され得る。一般的には、宿主細胞に本開示のウイルス粒子を感染させ、その宿主細胞を、標的RNAの遊離を可能にする条件下で培養する。細胞培養技術は当業者に知られている。上述したように、ウイルスゲノムまたはウイルスゲノムの一部の転写、例えばウイルスゲノムに挿入されたRNA発現カセットのmRNAへの転写は、1つ以上の自己切断リボザイムが、転写されたmRNAからそれ自身を切断し、かつそれと共に標的RNAを切断することを可能にする。そのような実施態様では、存在する自己切断リボザイムは1つだけ、例えば5'自己切断リボザイムまたは3'自己切断リボザイムが必要である。自己切断リボザイムは、ウイルスゲノムのmRNAへの転写時に標的RNAペイロードを遊離させることができるように、該ペイロードに隣接する、つまりその隣に位置する必要がある。

標的RNAは、例えば、マイクロRNA（miRNA）、gRNA、または任意の他のRNAであり得る。RNAペイロードは、特定の治療用途をもつ必要はないが、当業者であれば、そのような用途の多くを想定することができる。例えば、標的RNAはRNAサイレンシングに関与し得る。該RNAは、例えば転写後に、遺伝子発現を調節するために利用され得る。標的RNAのいくつかの非限定的な例には、siRNAおよびmiRNAが含まれ、これらには特定の治療用途があってもなくてもよい。siRNAは、遺伝子サイレンシングを促進するためにRNA干渉（RNAi）に利用され得る。miRNAは、同様の治療目的手段に使用され、本開示の特に有用な治療上の非CRISPR関連適用に相当し得る。miRNAは現在、自己免疫疾患から神経変性疾患、さらには癌に至るまでの、様々なタイプの疾患を治療するために利用されている。miRNAは、典型的には、植物および動物において配列特異的に遺伝子発現を調節する、内因性の17〜24塩基長の一本鎖非コードRNAである。内因的には、miRNAはより長いRNA転写産物からDroshaとDicerによって誘導される。得られたmiRNAは、典型的にはmRNAの3'非翻訳領域（UTR）内の、その標的配列に結合し、その結果として翻訳の抑制をもたらす。本開示は、転写されたアンチゲノムから、例えば隣接する自己切断リボザイム（複数可）によって、miRNAを単に切断することによるmiRNAの代替的送達メカニズムを提供する。当業者には理解されるように、こうした方法で送達され得るクラスのmiRNAは膨大であり、その治療上の使用によって限定されるとはみなされず、それどころか、それらは、本開示に従って標的RNAを細胞に送達する範囲内にあるとみなされるべきである。

本開示の核酸/ウイルス粒子の例示的な使用は、CRISPR関連技術による遺伝子編集（gene editing）に関連している。CRISPRは、クラスター化され、規則的な間隔で隣接した、短い回文構造のリピート配列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats）のタイプIIシステムの略である。CRISPRは遺伝子操作を目的として改変された細菌の免疫システムである。CRISPR以前には、最も一般的なゲノム操作手法はジンクフィンガーヌクレアーゼを利用していた。CRISPRは、ガイドRNA（gRNA）と非特異的CRISPR関連エンドヌクレアーゼ、例えばCas9、という2つの成分を当てにしている。gRNAは足場配列と標的配列とを有する合成RNAである。足場配列はヌクレアーゼ、例えばCas9、への結合に必要である。ターゲティング配列は、多くの場合（明らかに必ずしも当てはまらないが）約20ヌクレオチド長であり、改変されるゲノム標的を規定している。したがって、当業者は、gRNA中に存在するターゲティング配列を変えるだけで、ゲノム標的を変えることができる。ゲノム標的は、約20ヌクレオチドの任意のDNA配列であり得るが、ただし、それは次の2つの条件を満たす必要がある：1）その配列は他の生物のゲノムと比べてユニークであり、かつ2）その標的はプロトスペーサー隣接モチーフ（PAM）のすぐ上流に存在する。PAM配列は、ヌクレアーゼがもともと由来した、まさにその種に依存する。例えば、化膿レンサ球菌由来のCas9のためのPAMは5'-XGG-3'（ここでXは任意の核酸塩基）であるが、Cfp1のためのPAMは5'-TTX-3'である。当業者であれば、様々なヌクレアーゼ、例えばCas9および関連タンパク質、とそれらの対応するPAMに精通しているであろう。

Cas9はもともと化膿レンサ球菌から分離されたものであり、それは依然として本開示における典型的なヌクレアーゼであるが、本開示のこの局面での使用に適した多くの異なるヌクレアーゼが、Cas9バリアントを含めて、存在する。例えば、人工のPAM認識配列を有する合成Cas9タンパク質があり、これは、例えば、Kleinstiver BP et al., Nature, 2015 Jun 23;523(7561):481-5に記載されており、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。化膿レンサ球菌以外の生物に由来するCas9ホモログもあり、例えば、黄色ブドウ球菌（S. aureus）由来のCas9（SaCas9）がある。SaCas9は化膿レンサ球菌由来のCas9よりも約1キロベース小さいサイズであり、一部のウイルス粒子のゲノムサイズが限られるために、それは本開示のウイルス粒子への組み込みにとってより適したものとなり得るが、このことは、下記の実施例1に示されるようにセンダイウイルスでは問題とならない。当業者は、他の生物由来のCas9が、同じ宿主種由来のtracrRNAおよびcrRNAまたは合成gRNAとのみ適合性があることを理解するであろう。さらに、化膿レンサ球菌由来のCas9に代わるもの、合成Cas9、またはCas9ホモログが存在する。そのような選択肢の1つがCpf1であり、これは、Zetsche B et al., Cell. 2015 Oct 22;163(3):759-71およびKleinstiver B. P. et al., Nature Methods 2016 Aug. 30; 714(13)に記載されており、両方ともその全体が参照により本明細書に組み入れられる。Cas9の場合には標的DNAがPAMのすぐ上流にある代わりに、Cpf1は5'-TTX-3'（ここでXは任意の核酸塩基）のPAMを有し、標的DNAのすぐ上流に位置する。さらに、Cpf1切断はPAM配列から18塩基対で5ヌクレオチドの5'オーバーハングをもたらし、一方Cas9切断はPAM配列から3塩基対遠位で平滑DNA末端をもたらす。さらに、Cpf1はターゲティングを成功させるためにCRISPR RNA（crRNA）のみを必要とするが、Cas9はcrRNAとトランス活性化型crRNA（tracrRNA）の両方を必要とする。さらなるCRISPRタンパク質にはC2c1、C2c2、およびC2c3タンパク質が含まれ、これらは、例えばShmakov et al., Molecular Cell 2015 Oct. 22; 60(3): 385-397に開示されており、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。

CRISPR-Cas遺伝子編集システムは、最近、5つのタイプと16のサブタイプにまたがる2つの主要なクラスに再分類された；Makarova, K., et al., Nature Reviews Microbiology 13:1-15 (2015)に概説されており、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。分類は、CRISPR-Cas座位中の全てのcas遺伝子を同定し、続いて各座位中の鍵遺伝子を決定することに基づいていた。これは、現在知られているCRISPR-Casシステムが、干渉段階に関与するタンパク質をコードする遺伝子に応じて「クラス1」または「クラス2」のいずれかに分類できるという結論に導いた。6番目のCRISPR-Casシステムが最近同定された；これはAbudayyeh O., et al. Science 2016に記載されており、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。

「クラス1」システムは一般的にマルチサブユニットのcrRNA-エフェクター複合体を含み、一方「クラス2」システムは一般的に単一のタンパク質、例えばCas9、Cpf1、C2c1、C2c2、C2c3、またはcrRNA-エフェクター複合体を含む。クラス1システムは「タイプI」、「タイプIII」および「タイプIV」システムを含む。「クラス2」システムは、「タイプII」および「タイプV」システムを含む。クラス1のCRISPR-Casシステムは、複数のサブユニットからなるエフェクターモジュールを特徴とする。クラス1システムは、細菌および古細菌で同定された全てのCRISPR-Cas座位の約90％を占めており、DNAとRNAの両方を標的とすることができる；これはMakarova et al., Cell (2017) 168(5)に記載されており、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。

タイプIシステムは、ヘリカーゼ活性および切断活性を有するCas3タンパク質を特徴とする。タイプIシステムはさらに7つの特定のサブタイプ（I-A、I-B、I-C、I-D、I-E、I-F、およびI-U）に分けられる。各タイプIサブタイプは、シグネチャー遺伝子の規定された組み合わせおよび異なるオペロン構成を有する。タイプIシステムはさらに、CRISPR-Cas免疫系のプロセッシングおよび干渉段階に関与する多重タンパク質のcrRNA-エフェクター複合体を有し、該複合体は抗ウイルス防御のためのCRISPR関連複合体（「カスケード」（Cascade））として知られている。サブタイプI-Aは、小サブユニットタンパク質をコードするcsa5遺伝子、分解された大サブユニットと小サブユニットをコードするcas8遺伝子、および分断cas3遺伝子を含む。アルカエオグロブス・フルギダス（Archaeoglobus fulgidus）は、サブタイプI-AのCRISPR-Casシステムをもった例示的な生物である。サブタイプI-Bは、一連のcas1-cas2-cas3-cas4-cas5-cas6-cas7-cas8遺伝子配置を有するが、csa5遺伝子を欠く。クロストリジウム・クルイベリ（Clostridium kluyveri）は、サブタイプI-BのCRISPR-Casシステムをもった例示的な生物である。サブタイプI-Cはcas6遺伝子を欠く。バシラス・ハロデュランス（Bacillus halodurans）は、サブタイプI-CのCRISPR-Casシステムをもった例示的な生物である。サブタイプI-Dは、cas8遺伝子の代わりにcas10d遺伝子をもつ。シアノセイス属の菌種（Cyanothece spp.）は、サブタイプI-DのCRISPR-Casシステムをもった例示的な生物である。サブタイプI-Eはcas4遺伝子を欠く。大腸菌（Escherichia coli）は、サブタイプI-EのCRISPR-Casシステムをもった例示的な生物である。サブタイプI-Fはcas4遺伝子を欠き、cas3に融合したcas2を有する。エルシニア・シュードツベルクローシス（Yersinia pseudotuberculosis）は、サブタイプI-FのCRISPR-Casシステムをもった例示的な生物である。ジオバクター・サルファーレデュセンス（Geobacter sulfurreducens）は、サブタイプI-UのCRISPR-Casシステムをもった例示的な生物である。

全てのタイプIIIのCRISPR-Casシステムは、RNA認識モチーフ（RRM）の変異体であるPalmドメインを含むマルチドメインタンパク質をコードするcas10遺伝子を有し、該Palmドメインは、多数の核酸ポリメラーゼおよびシクラーゼのコアドメインと相同であって、タイプIIIのcrRNA-エフェクター複合体の最大のサブユニットである。タイプIII座位は、小サブユニットタンパク質、1つのCas5タンパク質および典型的にはいくつかのCas7タンパク質をコードする。タイプIIIはさらに、4つのサブタイプ（III-A、III-B、III-CおよびIII-D）に分けられる。サブタイプIII-Aは、小サブユニットをコードするcsm2遺伝子を有し、さらにcas1、cas2およびcas6遺伝子をも有する。表皮ブドウ球菌（Staphylococcus epidermidis）は、サブタイプIII-AのCRISPR-Casシステムをもった例示的な生物である。サブタイプIII-Bは、小サブユニットをコードするcmr5遺伝子を有し、cas1、cas2およびcas6遺伝子を欠く。ピュロコックス・フリオスス（Pyrococcus furiosus）は、サブタイプIII-BのCRISPR-Casシステムをもった例示的な生物である。サブタイプIII-CはCas10タンパク質をもつが、不活性なシクラーゼ様ドメインを有し、さらにcas1およびcas2遺伝子を欠く。メタノサーモバクター・サームオートトロフィカス（Methanothermobacter thermautotrophicus）は、サブタイプIII-CのCRISPR-Casシステムをもった例示的な生物である。サブタイプIII-Dは、HDドメインを欠くCas10タンパク質を有し、さらにcas1およびcas2遺伝子を欠くが、csx10として知られるcas5様遺伝子を有する。ロゼイフレクサス属の菌種（Roseiflexus spp.）は、サブタイプIII-DのCRISPR-Casシステムをもった例示的な生物である。

タイプIVのCRISPR-Casシステムは、部分的に分解された大サブユニット、Csf1、Cas5、Cas7、および場合によっては推定上の小サブユニットを含む、最小のマルチサブユニットcrRNA-エフェクター複合体をコードする。タイプIVシステムはcas1およびcas2遺伝子を欠く。タイプIVシステムはサブタイプをもたないが、2つのタイプIVシステムのバリアントが存在する。一方のタイプIVバリアントはDinGファミリーのヘリカーゼを有し、他方は有しないが、他方は小さいαヘリックスタンパク質をコードする遺伝子をもつ。鉄酸化細菌（Acidithiobacillus ferrooxidans）は、タイプIVのCRISPR-Casシステムをもった例示的な生物である。

タイプIIのCRISPR-Casシステムは、cas1、cas2およびcas9遺伝子をもつ。cas9遺伝子は、crRNA-エフェクター複合体の機能と標的DNAの切断とを組み合わせたマルチドメインタンパク質である、Cas9タンパク質をコードする。タイプIIシステムはtracrRNAをもコードする。タイプIIシステムはさらに3つのサブタイプ、サブタイプII-A、II-BおよびII-Cに分けられる。サブタイプII-Aは追加の遺伝子csn2を含む。ストレプトコッカス・サーモフィルス（Streptococcus thermophiles）は、サブタイプII-AのCRISPR-Casシステムをもった例示的な生物である。サブタイプII-Bはcsn2遺伝子を欠くが、cas4遺伝子をもつ。レジオネラ・ニューモフィラ（Legionella pneumophilai）は、サブタイプII-BのCRISPR-Casシステムをもった例示的な生物である。サブタイプII-Cは最も一般的なタイプIIシステムであって、Cas1、Cas2およびCas9の3つのタンパク質のみを有する。ナイセリア・ラクタミカ（Neisseria lactamica）は、サブタイプII-CのCRISPR-Casシステムをもった例示的な生物である。

タイプVシステムはcpf1遺伝子とcas1およびcas2遺伝子を有する。cpf1遺伝子はタンパク質Cpf1をコードし、該タンパク質は、Cas9の各ドメインに相同なRuvC様ヌクレアーゼドメインを有するが、Cas9タンパク質に存在するHNHヌクレアーゼドメインを欠く。タイプVシステムは、以下の細菌を含めて、いくつかの細菌において同定されている：パークバクテリア・バクテリウム（Parcubacteria bacterium）GWC2011_GWC2_44_17（PbCpf1）、ラクノスピラセアエ・バクテリウム（Lachnospiraceae bacterium）MC2017（Lb3 Cpf1）、ブチリビブリオ・プロテオクラスチクス（Butyrivibrio proteoclasticus）（BpCpf1）、ペレグリニバクテリア・バクテリウム（Peregrinibacteria bacterium）GW2011_GWA 33_10（PeCpf1）、アシダミノコッカス属菌種（Acidaminococcus spp.）BV3L6（AsCpf1）、ポルフィロモナス・マカカエ（Porphyromonas macacae）（PmCpf1）、ラクノスピラセアエ・バクテリウム（Lachnospiraceae bacterium）ND2006（LbCpf1）、ポルフィロモナス・クレビオリカニス（Porphyromonas crevioricanis）（PcCpf1）、プレボテーラ・ディシエンス（Prevotella disiens）（PdCpf1）、モラクセラ・ボボクリ（Moraxella bovoculi）237（MbCpf1）、スミセラ属菌種（Smithella spp.）SC_K08D17（SsCpf1）、レプトスピラ・イナダイ（Leptospira inadai）（LiCpf1）、ラクノスピラセアエ・バクテリウム（Lachnospiraceae bacterium）MA2020（Lb2Cpf1）、フランシセラ・ノビシダ（Franciscella novicida）U112（FnCpf1）、候補（Candidatus）メタノプラスマ・テルミツム（methanoplasma termitum）（CMtCpf1）、およびユウバクテリウム・エリゲンス（Eubacterium eligens）（EeCpf1）。また、Cpf1はRNase活性をも有し、それはpre-crRNAのプロセッシングに関与することが実証された；Fonfara, I et al., Nature 28; 532(7600):517-21 (2016)に開示されており、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。

クラス1システムでは、発現および干渉段階はマルチサブユニットCRISPR RNA（crRNA）-エフェクター複合体を必要とする。対照的に、クラス2システムでは、発現および干渉段階は単一の大きなタンパク質、例えばCas9、Cpf1、C2c1、C2c1またはC2c3を必要とし、これらはそれぞれが明らかに本発明の範囲内とみなされる。

クラス1システムでは、発現および干渉段階はマルチサブユニットCRISPR RNA（crRNA）-エフェクター複合体を必要とする。対照的に、クラス2システムでは、発現および干渉段階は単一の大きなタンパク質、例えばCas9、Cpf1、C2c1、C2c1またはC2c3を必要とする。

クラス1システムでは、pre-crRNAはマルチサブユニットcrRNA-エフェクター複合体に結合して、成熟crRNAにプロセッシングされる。タイプIおよびIIIシステムでは、これはRNAエンドヌクレアーゼ、例えばCas6を必要とする。クラス2タイプIIシステムでは、pre-crRNAはCas9に結合し、RNase IIIとtracrRNAが関与する工程で成熟crRNAにプロセッシングされる。しかしながら、少なくとも1つの記載されたタイプIIのCRISPR-Casシステムでは、成熟5'末端をもつcrRNAが内部プロモーターから直接転写され、その場合crRNAプロセッシングは起こらない。

クラス1システムでは、crRNAはcrRNA-エフェクター複合体として会合して、RNA結合ドメインをもつヌクレアーゼ活性と、crRNAおよび標的核酸間の塩基対形成とを組み合わせることによって干渉を達成する。

タイプIシステムでは、crRNA-エフェクター複合体のcrRNAおよび標的の結合は、Cas7、Cas5、および小サブユニットタンパク質に融合したCas8を必要とする。タイプIシステムの標的核酸の切断はHDヌクレアーゼドメインを必要とし、該ドメインはスーパーファミリー2ヘリカーゼCas3'に融合されるか、または別個の遺伝子cas3によってコードされる。

タイプIIIシステムでは、crRNA-エフェクター複合体のcrRNAおよび標的の結合は、Cas7、Cas5、Cas10および小サブユニットタンパク質を必要とする。タイプIIIシステムの標的核酸の切断はCas7およびCas10タンパク質の複合作用を必要とし、Cas10には異なるHDヌクレアーゼドメインが融合されていて、理論に拘束されることを望むものではないが、これが干渉中に一本鎖DNAを切断すると考えられる。

クラス2システムでは、crRNAは単一のタンパク質と会合して、RNA結合ドメインをもつヌクレアーゼ活性と、crRNAおよび標的核酸間の塩基対形成とを組み合わせることによって干渉を達成する。

タイプIIシステムでは、crRNAおよび標的の結合はCas9を必要とし、標的核酸の切断も同様である。タイプIIシステムでは、Cas9のRuvC様ヌクレアーゼ（RNase Hフォールド）ドメインとHNH（McrA様）ヌクレアーゼドメインが、それぞれ、標的核酸の一方の鎖を切断する。タイプIIシステムのCas9切断活性はまた、Cas9によるcrRNAおよび標的の結合を促進する二重鎖を形成するために、crRNAとtracrRNAのハイブリダイゼーションを必要とする。

タイプVシステムでは、crRNAおよび標的の結合はCpf1を必要とし、標的核酸の切断も同様である。タイプVシステムでは、Cpf1のRuvC様ヌクレアーゼドメインが標的核酸の一方の鎖を切断し、推定上のヌクレアーゼドメインが標的核酸の他方の鎖を突出形状（staggered configuration）で切断して5'オーバーハングを生成する；これは、Cas9切断によって生じる平滑末端とは対照的である。理論に拘束されることを望むものではないが、これらの5'オーバーハングは、非相同末端結合法によるDNAの挿入を容易にすることができる。

本明細書で述べるように、タイプVシステムのCpf1切断活性はまた、二重鎖を形成するためにcrRNAのtracrRNAへのハイブリダイゼーションを必要とせず、むしろタイプVシステムのcrRNAは、内部二重鎖を形成するステムループ構造を有する単一のcrRNAを使用する。Cpf1は配列および構造特異的にcrRNAに結合し、それは、ステムループと該ステムループに隣接する配列、最も注目すべきは、標的核酸にハイブリダイズするスペーサー配列の5'側のヌクレオチドを認識する。このステムループ構造は、典型的には15〜19ヌクレオチド長の範囲である。このステムループ二重鎖を破壊する置換は切断活性を無効にするが、ステムループ二重鎖を破壊しない他の置換は切断活性を無効にしない。タイプVシステムでは、crRNAは5'末端にステムループ構造を形成し、3'末端の配列は標的核酸中の配列に相補的である。

タイプVのcrRNAならびに標的の結合および切断に関連する他のタンパク質には、クラス2候補1（Class 2 candidate 1: C2c1）およびクラス2候補3（C2c3）が含まれる。C2c1およびC2c3タンパク質は、Cas9およびCpf1タンパク質と長さが類似しており、約1,100アミノ酸から約1,500アミノ酸の範囲である。C2c1およびC2c3タンパク質もまたRuvC様ヌクレアーゼドメインを含み、Cpf1と同様の構造をもつ。C2c1タンパク質は、標的の結合および切断のためにcrRNAとtracrRNAを必要とする点でCas9タンパク質に似ているが、50℃の最適切断温度を有する。C2c1タンパク質はATリッチPAMを標的とし、これはCpf1と同様に標的配列の5'側にある。対照的に、クラス2候補2（C2c2）は、他のCRISPRエフェクタータンパク質との配列類似性を共有しておらず、最近、タイプVIシステムとして同定された。C2c2タンパク質は、2つのHEPNドメインをもち、かつssRNA切断活性を示す。C2c2タンパク質は、標的の結合および切断のためにcrRNAを必要とするが、tracrRNAを必要としない点でCpf1タンパク質に似ている。またCpf1と同様に、C2c2タンパク質のためのcrRNAは、C2c2タンパク質との会合を助ける、安定したヘアピンまたはステムループ構造を形成する。

特に、クラス2タイプIIのCRISPR Casシステムに関して、多数のCas9オーソログならびにそれらの会合ポリヌクレオチド成分（tracrRNAおよびcrRNA）が当技術分野で公知である（例えば、Fonfara, I., et al., Nucleic Acids Research 42.4 (2014): 2577-2590；およびChylinski K., et al., Nucleic Acids Research, 2014; 42(10):6091-6105を参照されたい；両文献はその全体が参照により本明細書に組み入れられる）。Cas9様合成タンパク質は当技術分野で公知である（例えば、U.S. 2014/0315985およびU.S. 2016/0362667を参照されたい；両文献はその全体が参照により本明細書に組み入れられる）。本開示の局面は、タイプIIのCRISPR Casタンパク質およびCasタンパク質をコードするポリヌクレオチド（Cas9タンパク質、Cas9様タンパク質、Cas9オーソログによりコードされるタンパク質、Cas9様合成タンパク質、ならびにそれらのバリアントおよび修飾体を含むが、これらに限定されない）を使用するための本明細書の説明に従って、当業者により実施され得る。本開示の実施において使用するために、これらのCasタンパク質のコグネイトRNA成分を操作して改変することができる。

CRISPR-Cas関連の実施態様では、標的配列はgRNA配列を含む。標的配列はまた、トランス活性化型crRNA（tracrRNA）をさらに含むことができ、その他の要素を含んでもよい。さらに、そのようなCRISPR関連の実施態様では、ウイルスゲノムおよびアンチゲノムは、ヌクレアーゼ、例えばCas9、をコードする配列を含む第2の領域を含む。第2の領域は、レポーター分子をコードする配列または他のさらなる配列を含んでも含まなくてもよい。上で詳述したように、第2の領域は、第1の領域と同様に、ウイルスゲノムの実質的にどこにでもサブクローニングすることができる。しかしながら、パラミクソウイルス、例えばセンダイウイルスの場合には、当業者は、相対的な転写速度を考慮に入れるであろう。図1は、この実施態様についての例示的なゲノムを表す。このような実施態様では、gRNAと1つ以上のリボザイムをコードするウイルスゲノムの一部が、gRNAを含むmRNAに転写されると、gRNAは該リボザイムによって遊離される。少なくとも5'リボザイムは存在しなければならないが、好ましい実施態様では（必ずしもそうとは限らないが）、隣接する3'リボザイムも存在する。利用するリボザイムの種類（ハンマーヘッド、HDVなど）は、本明細書に記載の実施態様のいずれかに従うものであり得る。ひとたびgRNAが遊離されると、ヌクレアーゼをコードするmRNA配列が翻訳された後に、gRNAは足場配列を介してそのヌクレアーゼ、例えばCas9に結合する。ヌクレアーゼは、足場配列を介してgRNAに結合すると、立体構造の変化を受けて、ヌクレアーゼが不活性な立体構造から活性なDNA結合性の立体構造へとシフトする。重要なこととして、gRNAのターゲティング配列は、それがDNA結合部位と相互作用し得るように露出されたままである。次いで、gRNAは、結合した複合体を、PAMのすぐ上流の標的DNA配列に向かわせ、そこでヌクレアーゼが切断するであろう。その後、DNA配列に改変を導入することができる。

当業者であれば、二本鎖の切断が導入された後に標的DNAに改変をどのように導入するかについて一般的に精通しているが、例示目的では、最も一般的に利用される経路は、非相同末端結合（NHEJ）DNA修復経路と相同組み換え修復（HDR）経路である。これらの経路は改変の導入、最も一般的には挿入または欠失（「インデル」）（indel）の導入、を可能にするが、こうした改変には欠失、付加、置換、フレームシフト変異、または点挿入が含まれ得る。HDR経路と比べてNHEJ経路の1つの潜在的利点は、HDRと違って、NHEJ経路は細胞周期を通して活性であり、修復テンプレートの必要性がないので、より高い修復能力を有することである。さらに、NHEJは数分以内にほとんどのタイプの切断を修復するが、これはHDRよりもかなり速い。しかし、HDRは、DNAの損傷鎖と無傷ドナー鎖との間のより高い配列相同性の必要性のために、これら2つのうちではより正確な作用機構である。修復に使用されるDNAテンプレートが損傷位置の元のDNA配列と同一である場合、HDRは誤りのない（error-free）修復になり得る。したがって、HDRは損傷したDNAに非常に特異的な変異を導入することができる。HDR経路は一般に以下の工程をたどる。まず、5'末端のDNA鎖を切断部で削り込んで3'オーバーハングをつくる。これは鎖侵入（strand invasion）に必要なタンパク質の基質として、さらにDNA修復合成のためのプライマーとして役立つ。次いで侵入鎖は相同DNA二重鎖の1つの鎖と置き換わって、もう1つの鎖と対合する。これにより、置換ループ（Dループ）と呼ばれるハイブリッドDNAが形成される。その後、組み換え中間体が分割されて、DNA修復プロセスを完了する。対照的に、NHEJ経路は一般的に以下の工程をたどる。まず、二本鎖切断が導入された後、切断した末端がヘテロダイマー、例えばKu70/Ku80ヘテロダイマー、によって認識される。ヘテロダイマーは、キナーゼ、例えばDNA-PKcsおよびリガーゼ、ならびにいくつかの補助因子、例えばPAXX、XLF、を動員するための足場として作用する。これは、対合した末端複合体を形成し、次に適合性DNA末端同士を一緒に連結する。NHEJは多数のポリメラーゼ、例えばPolμおよびPolλ、ヌクレアーゼ、ならびに構造特異的酵素、例えばTdp2およびアプラタキシン（Aprataxin）を利用する。DNA末端のプロセッシングは、NHEJ経路において変異が導入されるところである。

本開示の別の局面は、本開示のウイルス粒子は別として、本開示の核酸を含むベクターに関する。ベクターはDNAまたはRNAベクターであり得る。例示的な実施態様では、ベクターには、ゲノムとアンチゲノムの両方をコードするDNAを含むプラスミドが含まれる。プラスミドはウイルス粒子を生成するように誘導することができる。ベクターは発現を増幅するための適切な配列を含み得る。さらに、発現ベクターは、形質転換された宿主細胞を選択するための表現型形質、例えば、真核細胞培養物ではジヒドロ葉酸レダクターゼまたはネオマイシン耐性など、大腸菌ではテトラサイクリンまたはアンピシリン耐性など、を提供する1つ以上の選択マーカー遺伝子を含むことが好ましい。

本開示のいくつかの実施態様は、プラスミドで形質転換された細胞に関する。外来ヌクレオチド配列を宿主細胞に導入するための当技術分野で公知の手法は、どれも使用することができる。例としては、リン酸カルシウムトランスフェクション、ポリブレン、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、ヌクレオフェクション（nucleofection）、リポソーム、マイクロインジェクション、裸のDNA、プラスミドベクター、ウイルスベクター、エピソーマルベクターと組込み型ベクターの両方、ならびにクローン化したゲノムDNA、cDNA、合成DNAまたは他の外来遺伝物質を宿主細胞に導入するための他の周知の方法の使用が含まれる。

本開示の別の局面は、本開示のベクターを含むキットに関する。キットはさらに試薬類を含むことができる。例示的な実施態様では、試薬はT7 RNAポリメラーゼを含む。キットは対照を含んでもよい。キットは使用上の説明書または指示書を含んでもよい。キットは1つ以上の容器で構成することができ、さらに、収集器具、例えば、ボトル、バッグ（静脈内輸液バッグなど）、バイアル、シリンジ、および試験管を含んでもよい。他の構成要素としては、針、希釈剤および緩衝剤が挙げられる。役立つように、キットは、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル液およびデキストロース溶液などの薬学的に許容される緩衝液を含む少なくとも1つの容器を含み得る。任意選択で、本開示のキットは、データの生成、分析および/または保存を迅速に処理しかつデータベースへのアクセスを容易にするためのソフトウェアをさらに含む。ソフトウェアは、データの収集、保存および/または分析に使用することができる論理演算命令、命令セット、または適切なコンピュータプログラムを含む。提供されたソフトウェアを使用して、データの比較分析および関係分析が可能である。

本明細書で使用する用語「保存的配列改変」または「保存的置換」は、本開示の自己切断リボザイムの活性または特徴に有意に影響を及ぼさないまたはそれらを変更しない、ヌクレオチド置換を指すことができる。

本明細書で使用する用語「CRISPR」は、「クラスター化され、規則的な間隔で隣接した、短い回文構造のリピート配列」（clustered regularly interspaced short palindromic repeats）を指すことができ、これは、本開示の範囲内では、標的DNA配列を編集するためにCas9などのヌクレアーゼと共に、例えばCRISPR/Cas9システムとして、利用されると理解される。本明細書で使用する用語「Cas」は、「CRISPR関連タンパク質」（CRISPR associated protein）を指すことができ、ヌクレアーゼCas9およびCas9タンパク質を含むが、これらに限定されない。本明細書で使用する「Cas9」または「Cas9タンパク質」は、CRISPR-Cas9システムからのCas9野生型タンパク質、Cas9タンパク質の修飾体、Cas9タンパク質のアナログ、Cas9タンパク質のバリアント、cas9オーソログによって発現されるタンパク質、およびそれらの組み合わせを含む。他の「Cas」タンパク質は当技術分野で公知であり、Cas9様合成タンパク質、Cpf1タンパク質（野生型Cpf1を含む）、Cpf1様合成タンパク質、C2c1タンパク質、C2c2タンパク質、C2c3タンパク質、ならびにそれらのバリアントおよび修飾体を含めて、本開示の範囲内であるとみなされる。本明細書で使用する「Cpf1」または「Cpf1タンパク質」は、CRISPR-Cpf1システムからのCpf1野生型タンパク質、Cpf1タンパク質の修飾体、Cpf1タンパク質のバリアント、Cpf1のアナログ、cpf1オーソログによって発現されるタンパク質、およびそれらの組み合わせを含む。

本明細書で使用する用語「ガイドRNA」または「gRNA」は、ヌクレアーゼに結合して、ヌクレアーゼを標的DNA内の特定の位置に誘導し得るRNA分子を指すことができる。ガイドRNAは、2つのセグメント、つまり「ターゲティング配列」と「足場配列」を含み得る。本明細書で使用する「ターゲティング配列」は、標的DNA配列に相補的であるか、または少なくともストリンジェントな条件下で標的DNA配列にハイブリダイズし得る、ヌクレオチド配列を指すことができる。タンパク質結合性セグメントがヌクレアーゼ、例えばCas9、Cpf1、または本明細書に開示されるCRISPR関連タンパク質（「Cas」）に結合する。ターゲティング配列と足場配列は、同じRNA分子に位置しても、2つ以上の別々のRNA分子に位置してもよい。

本明細書で使用する用語「異種」は、異なる起源に由来する生物学的要素、例えば、生物に導入された外来DNAまたはRNAを指すことができる。例えば、本開示では、ヌクレアーゼは第1の供給源に由来することができ、例えば、Cas9は化膿レンサ球菌由来である。あるいは、標的配列、例えばgRNAは、第2の生物由来であっても、合成であってもよい。当業者は、生物への外来遺伝物質の導入、例えば発現カセットの導入は、その生物に多くの異種要素を導入し得ることを理解するであろう。

本明細書で使用する用語「相同性」は、2つの組成物間で共有される構造の存在を指すことができる。タンパク質の文脈における用語「相同性」は、2つ以上のアミノ酸および/またはペプチド配列間のオーバーラップの量（例えば、パーセントで表される）を指す。核酸の文脈において、この用語は、2つ以上の核酸配列間のオーバーラップの量（例えば、パーセントで表される）を指す。本明細書で使用する場合、2つの配列間の相同性パーセント（％）は、2つの配列間の同一性パーセントに等しい。2つの配列間の同一性パーセントは、それらの配列によって共有される同一位置の数の関数であり（すなわち、相同性％＝同一位置の数／位置の総数×100）、2つの配列の最適なアラインメントのために導入する必要があるギャップの数と各ギャップの長さを考慮に入れる。2つの配列間の配列の比較および同一性パーセントの決定は、数学的アルゴリズムを用いて達成され得る。そのような相同性は、局所的アラインメントツールおよび/またはアルゴリズムによって当技術分野でよく表されており、ペアワイズアラインメント、多重配列アラインメント法、構造的アラインメント法、および/または系統発生解析法を含むことができる。

本明細書で使用する用語「発現」は、DNAテンプレートからのポリヌクレオチドの転写を指し、例えば、mRNAまたは他のRNA転写産物（例えば、構造または足場RNAなどの非コードのもの）をもたらす。この用語はさらに、転写されたmRNAがペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質に翻訳される過程を指す。転写産物およびコードされたポリペプチドは、まとめて「遺伝子産物」と呼ぶことができる。ポリヌクレオチドがゲノムDNAに由来する場合、発現は真核細胞におけるmRNAのスプライシングを含み得る。

本明細書で使用する用語「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド配列」または「核酸」は、ホスホジエステル結合を介して連結された多数のヌクレオチド単位（リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドまたは関連する構造バリアント）からなるポリマーを指し、DNAまたはRNAを含むが、これらに限定されない。この用語は、DNAおよびRNAの既知の塩基類似体のいずれかを含む配列を包含する。核酸の例としては、限定するものではないが、mRNA、miRNA、tRNA、rRNA、snRNA、siRNA、dsRNA、cDNAおよびDNA/RNAハイブリッドが挙げられる。核酸は一本鎖もしくは二本鎖であり得、または二本鎖配列と一本鎖配列の両部分を含み得る。核酸は、ゲノムおよびcDNAの両方のDNA、RNA、またはハイブリッドであり得、ハイブリッドの場合、核酸はデオキシリボ-およびリボ-ヌクレオチドの組み合わせ、ならびにウラシル（U）、アデニン（A）、チミン（T）、シトシン（C）、グアニン（G）、およびそれらの誘導体化合物を含む塩基の組み合わせを含み得る。核酸は化学合成法または組み換え法によって得ることができる。一本鎖の描写はまた、相補鎖の配列をも規定する。したがって、核酸はまた、描写された一本鎖の相補鎖をも包含する。核酸の多くのバリアントが所与の核酸と同じ目的のために使用され得る。こうして、核酸はまた、実質的に同一の核酸およびそれらの相補体を包含する。

本明細書で使用する用語「リボザイム」は、特定の生化学反応を触媒することができるRNA分子を指す。リボザイムの活性はタンパク質酵素のそれと類似しており、主な違いは両者の組成である。本明細書で使用する用語「自己切断リボザイム」は、RNAポリマー内の特定の部位での切断および関連する反応を触媒するRNA分子モチーフを指す。自己切断リボザイムの例としては、限定するものではないが、ハンマーヘッド型リボザイム、デルタ型肝炎ウイルス（HDV）リボザイム、ツイスター型リボザイム、ツイスター・シスター型リボザイム、ピストル型リボザイム、ヘアピン型リボザイム、およびハチェット型リボザイムが挙げられる。

疾患を「治療する」または「治療」という用語は、疾患の徴候または症状を緩和しようとして、患者（ヒトまたはその他）に1種以上の薬物を投与することを含むことができる、プロトコルの実行を指す。緩和は、疾患の徴候または症状が現れた後だけでなく、それらが現れる前にも起こり得る。かくして、疾患を「治療する」または「治療」には、疾患を「予防する」または「予防」が含まれる。用語「予防する」または「予防」は、その目的が、標的とする病態または障害を予防するまたは遅くすることにある、予防的および/または事前防止的手段を指す。さらに、「治療する」または「治療」は、徴候または症状の完全な緩和を必要とせず、治癒を必要とせず、特に、患者にごくわずかな効果を与えるプロトコルを含む。

本明細書中で使用する場合、「宿主細胞」とは一般に生物学的細胞を指す。細胞は、生体の基礎となる構造的、機能的および/または生物学的単位であり得る。細胞は、1つ以上の細胞を有する任意の生物に由来し得る。宿主細胞の例としては、限定するものではないが、原核細胞、真核細胞、細菌細胞、古細菌細胞、単細胞真核生物の細胞、原生動物細胞、植物由来の細胞、藻類細胞、真菌細胞（例：酵母細胞）、動物細胞、無脊椎動物由来の細胞、脊椎動物（例：魚類、両生類、爬虫類、鳥類、哺乳類）由来の細胞、哺乳動物（例：ブタ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、げっ歯類、ラット、マウス、非ヒト霊長類、ヒトなど）由来の細胞が挙げられる。宿主細胞は幹細胞または前駆細胞であり得る。

本明細書で使用する用語「患者」は、治療を施すことができる生物系を指すことができる。生物系は、例えば、個々の細胞、一群の細胞（例えば、細胞培養物）、器官、組織、または多細胞生物を含み得る。「患者」は、ヒト患者または非ヒト患者を指すことができる。

本明細書で使用する用語「プロトスペーサー隣接モチーフ」または「PAM」は、CRISPR適用の設定においてヌクレアーゼが標的とする標的DNA配列の直下のDNA配列を指す。PAMはヌクレアーゼ特異的であり、PAMが標的DNA配列の下流にないならば、ヌクレアーゼは標的DNA配列にうまく結合することも、それを切断することもできない。

本明細書で使用する用語「ベクター」は、複製起点を含む核酸配列を指すことができる。ベクターは、プラスミド、バクテリオファージ、細菌人工染色体、酵母人工染色体またはウイルスであり得る。ベクターはDNAまたはRNAベクターであり得る。ベクターは、自己複製性の染色体外ベクターまたは宿主ゲノムに組み込まれるベクターのいずれかであり得る。用語「発現ベクター」は、細胞内での関心対象の配列または遺伝子の発現を指令することができるプロモーターを含む核酸アセンブリを指す。ベクターは、典型的には、ベクターによってトランスフェクトされた細胞を選択するための選択マーカーをコードする核酸配列を含む。一般に、「ベクター構築物」、「発現ベクター」、および「遺伝子導入ベクター」は、関心対象の遺伝子の発現を指令することができる任意の核酸構築物を指し、遺伝子配列を標的細胞または宿主細胞に導入することができる。

本明細書および添付の特許請求の範囲で使用する場合、単数形「1つの（a）」、「および（and）」および「その（the）」は、文脈上そうでないとする明確な指示がない限り、複数形への言及を含む。

用語「約」は、当業者が基準値と実質的に異ならないとみなす値の範囲を指す。例えば、用語「約」は、記載された値、ならびにそのような記載された値の間に介在する値の20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.05％、または0.01％以内である値を指すことができる。

本明細書に開示された刊行物は、本開示の出願日より前にそれらが開示されたというだけで提供されている。

本文に引用された出願および特許のそれぞれ、ならびに出願および特許のそれぞれに引用された各文書または参考文献、特許または非特許文献（各発行特許の処理経過（prosecution）中を含む；「出願に引用された文書」）、これらの出願および特許のいずれかに対応しかつ/またはそれらからの優先権を主張するPCTおよび外国出願または特許のそれぞれ、出願に引用された文書のそれぞれにおいて引用または参照された文書のそれぞれは、その全体が参照により本明細書に明示的に組み入れられる。より一般的には、文書または参考文献は、本文では、特許請求の範囲の前の参考文献リストに、または本文それ自体の中に引用される；これらの文書または参考文献（「本明細書に引用された文献」）、ならびに本明細書に引用された文献のそれぞれに引用された各文書または参考文献（メーカーの仕様書、説明書などを含む）は、参照により本明細書に明示的に組み入れられる。

以下の非限定的な実施例は、本開示をさらに説明するのに役に立つものである。

VIII. 実施例
実施例1：センダイウイルスは遺伝子編集用のCRISPR/Cas9を送達する
A. 材料および方法
細胞株
Flp-In T-REx HEK293細胞（Invitrogen社）、Vero細胞（ATCC CCL-81）、BSR-T7細胞（T7ポリメラーゼを安定発現するBHKベースの細胞株）、およびAffinofile細胞（CD4およびCCR5の誘導性過剰発現を示すHEK293ベースの細胞株）は、10％ウシ胎児血清（FBS）（Atlanta Biologicals社）およびペニシリン/ストレプトマイシンを添加したダルベッコ改変イーグル培地（Invitrogen社）中で37℃にて増殖させた。Flp-In T-REx HEK293細胞はメーカーのプロトコルに従ってブラストサイジンとゼオシンの存在下でさらに維持し、BSR-T7細胞はT7導入遺伝子を維持するために1mg/mLのG418中でさらに維持し、Affinofile細胞は50μg/mLのブラストサイジン中でさらに維持した。mCherry誘導性細胞を作成するために、mCherry遺伝子をpcDNA5/FRT/TOに挿入して、親Flp-In T-REx HEK293細胞にpOG44（Flpリコンビナーゼ）と一緒に同時トランスフェクトした。メーカーのプロトコルに従ってハイグロマイシン（ゼオシンを置換）とブラストサイジンで選択すると、mCherryのドキシサイクリン誘導性発現を示す安定な細胞株が得られた。

ヒト全血をNew York Blood Centerから入手した。末梢血単核細胞をFicoll-Paque（GE Healthcare社）を用いて分離し、単球をCD14マイクロビーズ（Miltenyi Biotec社）を用いてさらに精製した。単球を、10％FBS（Atlanta Biologicals社）を添加したRPMI 1640培地（Invitrogen社）中で増殖させた。

センダイウイルス逆遺伝学的プラスミド
rSeV-Cas9の基礎は、NからPの遺伝子間領域の複製を介してNとPの遺伝子間にEGFPレポーターが挿入されている組み換えセンダイウイルスであり、トリプシン非依存性増殖を可能にするFおよびM遺伝子に突然変異を有するFushimi株SeV、RGV0に由来した。T7駆動アンチゲノムをコードするプラスミドに対する全ての改変は、Velocity DNAポリメラーゼ（Bioline社）による標準的PCRおよびオーバーラッピングPCRを用いて行い、続いてIn-Fusionライゲーション非依存性クローニング（Clontech社）によりユニーク制限部位で構築物に挿入した。全てのクローニングは、Stbl2大腸菌（Invitrogen社）を用いて30℃で増殖させて行った。FLAGタグ付きのコドン最適化した化膿レンサ球菌（S. pyogenes）Cas9をpx330（Addgene社, カタログ番号42230）から増幅し、P2Aリボソームスキッピング配列

と連結して、EGFPレポーターの直下でrSeVに挿入した。P2A配列の前にGSGリンカーを配置して、完全なリボソームスキッピングを確実にした。さらなる2個のヌクレオチドをCas9の終止コドンの後に追加し、パラミクソウイルスのゲノム長は効率的な複製を確実にするために正確に6の倍数でなければならないというルール・オブ・シックス（rule of six）を維持した。Cas9は、将来の改変に役立つように、ユニークなNotIおよびFseI制限部位間にはさまれている。ガイドRNAおよびリボザイムのカセットを作成するために、mCherryを標的とする20bp配列をpx330（上記）にクローニングし、次いで完全キメラガイドRNAカセット（SEQ ID NO: 1、下記の表1参照）をPCR増幅した。ハンマーヘッド型リボザイムを後続のPCRにおいて合成プライマー中のオーバーハングを介して組み込んだ。このカセットをPからMの遺伝子間領域の複製を介してPとMの遺伝子間に挿入した；ガイドRNA標的配列の変更を含む将来の改変に役立つように、ユニークなAsiSIおよびSnaBI制限部位が該カセットの両端に隣接している。ガイドRNA標的配列は、MITを通じてオンラインで入手可能なCRISPRデザインツールを用いて予測された高い特異性に基づいて選択された。

（表１）注釈付きのgRNAカセットの配列

切断アッセイ
qRT-PCRプライマーを、リボザイム1（産物A）、リボザイム2（産物B）、および下流のM遺伝子内部（産物C、全RNAに相当）の両端に隣接するように設計した（図7参照）。rSeV-Cas9-mCherry T7駆動アンチゲノムプラスミドをT7発現性のBSR-T7細胞にトランスフェクトし、2時間後TRIzol（Invitrogen社）中に回収した。サンプルを1mM MgCl₂でDNase（Invitrogen社）により処理し、EDTAで処理して、SuperScript III First-Strand Synthesis System（Invitrogen社）を用いて1mM MgCl₂で逆転写した。SensiFAST SYBR & Fluoresceinキット（Bioline社）を用いてqRT-PCRを実施し、テンプレートとしてrSeV-Cas9-mCherryアンチゲノムプラスミドを用いて標準曲線によりコピー数を決定した。リボザイム1の切断パーセントを100*((C-A)/C)として求めて、両方のリボザイムを変異させた構築物に対して正規化し、また、リボザイム2の切断パーセントを100*((C-B)/C)として求めて、リボザイム2を変異させた構築物に対して正規化した。

ウイルスおよび感染
6ウェル中のBSR-T7細胞を、リポフェクタミンLTX（Invitrogen社）をメーカーの推奨に従って用いて、4μgのT7駆動アンチゲノム、1.44μgのT7-N、0.77μgのT7-P、0.07μgのT7-L、および4μgのコドン最適化T7ポリメラーゼでトランスフェクトした。ウイルスのレスキューをEGFP蛍光の出現および広がりによってモニターし、レスキューされたウイルスをBSR-T7細胞でさらに増やした。清澄化したウイルスのストックを-80℃で保存した。ウイルス力価をVero細胞でのタイトレーションによって決定し、個々の感染事象をAcumenプレートリーダー（TTP Labtech社）で感染24時間後にEGFP蛍光により検出して、計数した。

HEK293ベースの細胞株のSeV感染のために、5×10⁴個の細胞をウイルス接種材料と混合し、その直後にポリ-L-リシン被覆ウェルにプレーティングした。培地を翌日交換し、その後は2日ごとに交換した。mCherryの誘導のために、100ng/mLのドキシサイクリンを使用した。Affinofile細胞では、2μg/mLのポナステロンAと8ng/mLのドキシサイクリンを使用して、それぞれCCR5とCD4を誘導した。Affinofile細胞のさらなるHIV-1感染のために、JR-FL HIV-1を、2μg/mLのポリブレン（Sigma社）の存在下に37℃で2時間、2000rpmで細胞にスピノキュレート（spinoculate）した。

単球のSeV感染のために、ウイルスストックを20％から65％の不連続ショ糖勾配への超遠心分離によってさらに精製した。界面を回収し、Vero細胞でタイトレーションして、使用するまで-80℃で保存した。無血清培地中の5×10⁵個の細胞を37℃で30分間平板培養して付着させてから、37℃で2時間、2000rpmでのスピノキュレーションを介してウイルス接種材料を感染させた。スピノキュレーション後、培地を10％FBS含有RPMIに交換し、その後は2日ごとに交換した。マクロファージへの分化および同時のCCR5アップレギュレーションを刺激するために、感染後に100ng/mLのGM-CSF（Peprotech社）を培地に含めた。

フローサイトメトリー
CCR5の染色のために、細胞を採取して、2％FBSを含むリン酸緩衝生理食塩水（PBS）中でブロックした。Alexa 647結合ラット抗ヒトCCR5（BioLegend社, カタログ番号313712）を1：100で4℃にて30分間添加した後、洗浄し、2％パラホルムアルデヒド（PFA）中に再懸濁した。p24の染色（RD1結合マウス抗p24クローンKC57, Beckman Coulter社, カタログ番号6604667, 1：100希釈）のために、細胞をCytofix/Cytopermキット（BD Biosciences社）を用いて固定および透過処理し、その後ブロックした。フローサイトメトリーは、マウント・サイナイ・アイカーン医科大学（Icahn School of Medicine at Mount Sinai）のフローサイトメトリーコア（Flow Cytometry Core）においてBD LSR IIで実施した。

変異誘発の特性解析
PureLink Genomic DNA Mini Kit（Invitrogen社）を用いてゲノムDNAを抽出した。Velocity DNAポリメラーゼ（Bioline社）および以下の表2に示されるプライマーを用いて、特定のゲノム座位を増幅した。オフターゲット座位は、CRISPRデザインツールで予測された上位のオフターゲット部位を表す。個々のアレルのサンガー配列決定のために、プライマーは、In-Fusionライゲーション非依存性クローニング（Clontech社）を介してpcDNA3のHindIII部位とXhoI部位の間に挿入するための適切なオーバーハングを含んでいた。PCR産物をゲル抽出し（NucleoSpin Gel and PCR Clean-upキット, Clontech社）、Stellarコンピテント大腸菌（Clontech社）に形質転換して、アンピシリンLB寒天上で選択した。個々のコロニーを調製して、配列決定した。ディープシーケンシングのために、ゲル抽出した産物をプールし、Genewiz社によるペアエンド（paired-end）2×300bp MiSeq（Illumina社）シーケンシングを介した塩基配列決定のために、さらに調製した。ユニークな配列を、マージ（merge）した配列決定リードから同定して定量した。オンターゲットおよびオフターゲットのそれぞれのアンプリコン参照配列のために、20bpガイドRNA標的配列からちょうど35bpを越えた上流および下流で18bp配列を選択した。これらの18bp配列の両方と完全に一致するユニーク配列を抽出して照合したところ、アンプリコンあたり平均170,432リードが得られた。各アンプリコンについて、参照配列とは異なる長さの配列を、挿入または欠失（インデル）を有するものとして同定した。

（表２）オンターゲットおよびオフターゲットのゲノム位置、配列、および利用した増幅プライマー

B. 結果
Cas9と自己切断リボザイムが隣接したガイドRNAとを組み込んでいるセンダイウイルスは高力価に複製する
パラミクソウイルスは一本鎖のマイナスセンスRNAゲノムをもつ。複製中に、ウイルス複製複合体（核タンパク質（N）、リンタンパク質（P）、およびラージRNA依存性RNAポリメラーゼ（L））は、完全長アンチゲノム（ゲノムの逆相補体）および個々のキャップおよびポリアデニル化されたmRNAの両方を産生するためのテンプレートとして、ゲノムを使用する（図1A）。アンチゲノムはさらにゲノムに転写され、したがって複製のためのゲノムが増幅される。mRNA産生中は、隣接する遺伝子間領域内の遺伝子開始および遺伝子終止シグナルがmRNA転写産物の両末端を決定する。この原理証明（proof-of-principle）実験のために、NからPの遺伝子間領域の複製を介してN遺伝子とP遺伝子の間にEGFPが挿入されている組み換えSeV（rSeV）を利用した。化膿レンサ球菌Cas9を、P2Aリボソームスキッピング配列を介してEGFPレポーターの下流に挿入した（図1A）。キメラガイドRNA（20bpの標的配列および76bpのトランス活性化型CRISPR RNA）を、PからMの遺伝子間領域の複製を介してP遺伝子とM遺伝子の間に新しいカセットとして挿入した（図1A）。ガイドRNAに正確な末端を提供するために、ガイドRNAには自己切断5'リボザイムと自己切断3'リボザイム、例えばハンマーヘッド型リボザイム、が隣接していた（図1Aおよび1B）。例示的な自己切断5'リボザイムおよび自己切断3'リボザイムの配列は、それらの立体的配向で図1Bに示され、かつ5'から3'の方向で以下のように示される：

これらのリボザイムは、T7駆動rSeV-Cas9プラスセンスアンチゲノム（リボザイムはRNAプラスセンス配向において機能的である）をコードするDNA構築物をBSR-T7細胞（BHK細胞はT7ポリメラーゼを安定に発現する）にトランスフェクトすることによって、切断に機能的であると確認された。トランスフェクト細胞から抽出されたT7転写アンチゲノムRNAのqRT-PCRは、両方のリボザイムについての効率的な自己切断を示した（図1C）。複製能のあるrSeV-Cas9は、アンチゲノム構築物を、ゲノム複製に、それゆえにウイルスレスキューに必要とされる補助的なSeV-N、-P、および-L発現構築物と同時トランスフェクトすることによって、レスキューされた。レスキュー効率および/またはゲノム複製は、アンチゲノム中の自己切断リボザイムの存在によって損なわれるか、または阻止さえされる可能性があると仮定された。しかしながら、アンチゲノムRNAの核タンパク質キャプシド形成が、リボザイム構造の形成とそれゆえにアンチゲノムの自己切断を妨げるのに十分な迅速さで起こるであろうとも仮定された；対照的に、mRNAはキャプシド形成されず、したがってガイドRNAをコードするmRNAはフリーで、リボザイム切断を受けるであろう。予想外に、驚くべきことに、rSeV-Cas9は、リボザイム活性を妨げる変異がリボザイム中にある対応する対照ウイルスと同程度に効率的にレスキューされた（図1D）。rSeV-Cas9の増殖動態は、ゲノム複製に対するリボザイムの若干の悪影響と一致して、対照ウイルスのそれよりも遅かったが、rSeV-Cas9は、それにもかかわらず、細胞培養でのSeVの標準的なピーク力価と一致して、ほぼ10⁸IU/mLの同じピーク力価に達した（図1E）。rSeV-Cas9は感染時にCas9タンパク質を産生することがさらに確認された。Cas9発現プラスミドでトランスフェクトした、またはrSeV-Cas9を感染させたHEK293細胞のウェスタンブロット分析は、Cas9タンパク質の発現を示した（図1F）。

mCherry遺伝子を標的とするrSeV-Cas9はレポーター細胞株のほぼ完全な変異誘発を達成する
最初のrSeV-Cas9は、mCherry遺伝子に特異的なガイドRNAを組み込んでいた（rSeV-Cas9-mCherry）。HEK293ベースのレポーター細胞株をmCherry誘導可能に作成し、この細胞株に、rSeV-Cas9-mCherry、またはCas9を発現するがガイドRNAカセットを欠く対照ウイルス（rSeV-Cas9-対照）のいずれかを感染多重度（MOI）25で感染させた。感染後様々な日数でmCherry発現を誘導すると、経時的なノックアウトの進行が示され、ノックアウトは感染後4日目からより顕著に現れた（図2Aおよび図5）。この時点（4日目の誘導および5日目のフローサイトメトリーのための回収）の定量化は、mCherry蛍光の約80％のノックアウトを示した（図2A）。蛍光顕微鏡により、ノックアウト時のmCherry蛍光の大幅な減少が視覚的に確認された（図2B）。

ガイドRNA機能を維持するためのリボザイムの必要性を確認するためにレポーター細胞株を利用した。3'リボザイム（rbz 2）の変異はレポーターノックアウト効率を著しく低下させ、一方5'および3'リボザイム（rbz 1/2）の両方の変異はノックアウト活性を無効にした（図2C、図2Aと比較）。既存のハンマーヘッド型リボザイムの代わりに、広く使用されるデルタ型肝炎ウイルスのリボザイムである代替3'リボザイムを試験した。rSeV-Cas9-mCherryのこのバージョンもまた、mCherry蛍光を効率的にノックアウトし、驚くべきことに、さらに高い効率となる可能性があった（図2C）。

rSeV-Cas9-mCherryによって誘導された変異誘発の程度を定量的に評価するために、感染後6日目に回収したレポーター細胞から増幅したmCherry座位に対してディープシーケンシングを行った。アレルの98％がインデルを有していたが、これはレポーターのほぼ完全な変異誘発を示している（図2D）。これらの結果は、rSeV-Cas9ベクターが内因性アレルを標的とするのに非常に効率がよいことを強く示していた。

rSeV-Cas9は内因性ccr5およびefnb2を効率的に変異させる
レポーター細胞株におけるmCherryの単一のアレルとは対照的に、ほとんどの内因性遺伝子のアレルは、細胞あたり2つ以上存在する。より豊富に存在する内因性アレルを標的とするセンダイウイルスベクターの能力を試験するために、ヒトccr5およびefnb2遺伝子のコードエクソンを標的とするrSeV-Cas9ウイルスを作成した。ccr5の機能的破壊をもたらす変異誘発を誘導するrSeV-Cas9-CCR5の能力の予備試験を実施した。HEK293細胞は無視できるレベルのCCR5を発現するのでHEK293細胞を利用したが、それらは、誘導性CD4およびCCR5導入遺伝子を、それらの内因性アレルに加えて含んでいる。CD4およびCCR5は、R5指向性HIV-1による感染に必要な細胞表面受容体であり、CCR5媒介HIV侵入を特徴付けるためにAffinofile細胞が広く使用されている。Affinofile細胞にrSeV-Cas9-CCR5を感染させ、感染後2日目にCD4/CCR5の過剰発現を誘導し、翌日、該細胞にR5指向性HIV-1分離株をさらに感染させた（図3A）。この早い時点で、rSeV-Cas9-CCR5を感染させた細胞は、誘導性ccr5導入遺伝子および内因性ccr5アレルの進行中の変異誘発のために、rSeV-Cas9-対照を感染させた細胞と比較して、より低レベルのCCR5を有すると予想された。さらに2日後、フローサイトメトリーは誘導されたCCR5の効率的なノックアウトを明らかにし、また、より早い時点でのHIV-1感染を示すp24染色は、rSeV-Cas9-対照感染と比較して、幾何平均蛍光強度の43％の減少を示した（図3A）。

内因性アレルの変異誘発を調べるために、HEK293細胞にccr5およびefnb2を標的とするrSeV-Cas9ウイルスをMOI 25で感染させ、感染後6日目に回収した。オンターゲット座位ならびに上位5つの予測されたオフターゲット部位をPCR増幅させた。HEK293細胞は、一般に、3番染色体（ccr5をコードする）に3コピーおよび13番染色体（efnb2をコードする）に2〜3コピーあることが知られている。ディープシーケンシングは、高いオンターゲット変異誘発率（ccr5およびefnb2についてそれぞれ75％および88％）を明らかにし（図3B）、これもまたrSeV-Cas9が有効であることを強く示唆している。オフターゲット変異誘発は、特異性を高めるための改変を含まないこの第一世代Cas9では顕著ではなく、検出可能な増加なしから非標的化対照の0.05％超までの範囲であった（図3B）。これらの結果から、CRISPR/Cas9のセンダイウイルス送達は内因性遺伝子を効率的に標的とし得ることが確認された。

ccr5を標的とするrSeV-Cas9は初代ヒト単球を高頻度で編集する
通常はレンチウイルス形質導入に抵抗性である初代ヒトCD14+単球にrSev-Cas9をMOI 50で感染させた。変異誘発時のCCR5発現の減少をよりよく視覚化するために、単球をGM-CSFで刺激して、マクロファージへの分化をCCR5の同時アップレギュレーションと共に誘導した。細胞を感染後5日で回収した；ディープシーケンシングは88％のオンターゲット変異誘発を明らかにした（図4A）。驚くべきことに、切断部位に隣接する2つの単一ヌクレオチド欠失は、合わせると、検出された全てのインデルの78％を占めていた（図4Aおよび図6）；対照的に、HEK293細胞では、同じ欠失が、合わせて、検出されたインデルの9％を占め、単一変異が全体の10％超を占めることはなかった（図3Bおよび図6）。独立したドナーからの単球の感染は同様の結果を示し、上記の欠失は変異アレルの約50％（19/38変異、サンガー配列決定による）を占めた；これは細胞型特異的現象を表し得ることを示している。単一の特定の変異がインデル全体のそのような大きな割合を占める場合、ミスマッチに基づくアッセイ、例えば、変異を検出するために高度に可変的な変異誘発に依存するT7E1エンドヌクレアーゼアッセイは、オンターゲット変異誘発の程度を強く過小評価する可能性がある。HEK293細胞と同様に、単球における予測されたオフターゲット座位の検出された変異誘発は無視できるほどであった（図4A）。独立したドナーからの感染した単球のフローサイトメトリーは、同じ時点で細胞表面CCR5のノックアウトを確認した（図4B）。

実施例2：rSeV-Cas9ベクターの温度感受性変異体
上記の実施例1に記載したrSeV-Cas9ベクターの温度感受性（ts）変異体を作成した。この変異体は、組み換えセンダイウイルスベクターのP遺伝子（D433A、R434A、K437A）およびL遺伝子（L1558I、N1197S、K1795E）にいくつかの変異を導入することによって作成され、本明細書では「PL変異体」と呼ばれる。PL変異体は許容温度、例えば34℃以下または約34℃の温度で効率的に編集するが、非許容温度、例えば37℃以上の温度、にシフトすると排除される。センダイウイルスのPL変異体は以前に文献で報告されているが、CRISPR-Cas遺伝子編集のためではなかった。PL変異体の作成は、例えば、Ban H. et al. PNAS 2011 Aug 23; 108(34): 14234-14239に見出され、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。Ban H. et al.において作成されたPL変異体はセンダイウイルスのZ株であったが、用いられる目下のrSeV-Cas9ベクターはFushimi F1R株であった。rSeV-Cas9ベクター（PL変異体）におけるBan H. et al.出典のts変異の概略図を図8Aおよび図9Aに示す。PL変異体の温度感受性表現型を図8Bに示す。

PL変異体は、ヒト胎児肝臓由来のヒトCD34+造血幹細胞（HSC）と末梢血動員CD34+ HSCの両方に80〜90％の効率で感染する能力があることが示された。さらに、これらのHSCにおける編集頻度は約80％であった。例えば、図9Bに示すように、PL変異体（ts rSeV-Cas9-CCR5ベクター）は、精製したヒト胎児肝臓CD34+ HSCと末梢血動員CD34+ HSCに首尾よく感染して形質導入した。感染の経時変化を図9Cに示す。図9Dに示した、2dpiの19/24クローン（約80％）で、ts rSeV-Cas9-CCR5感染CD34+ HSCからのサンガー配列決定データは、標的CCR5座位にインデルを示した。

感染CD34+ HSCを免疫不全SCID-Huマウスに移植した（各群につきn＝9）。1匹を除く全てのマウスが移植後10週で健康な状態を維持した。このことは、PL変異体がインビボで病原性ウイルスに復帰しなかったことを示した；野生型センダイウイルスは、正常免疫能の野生型マウスにおいてさえも高度に病原性があるので、PL変異体は免疫不全のSCID-Huマウスを殺傷していた可能性が高かった。感染CD34+ HSCの表現型検査（図10）は、PL変異体が、SCID-Huマウスを単一細胞レベルで再構築することができる、長期HSCまたはSCID再構築性細胞として知られているCD34+/CD38-/CD45RA-/CD90+(Thy1+)/CD49f-high細胞の＞90％に感染することができることを示した。

さらに、作成されたPL変異体は、非PL変異体（すなわち、非温度感受性rSeV-Cas9ベクター）と比較して、IFN応答を誘導するのに本質的にサイレントであった。これは非常に驚くべき表現型であるが、重要な表現型である。さらに、Ban H. et al.において作成されたPL変異体は、インターフェロン応答に対するPL変異体の効果（プラスまたはマイナス）について言及されなかった。さらに、センダイウイルス感染はIFNの産生を誘導することが知られているので、この実施例で作成されたPL変異体がなぜ「IFNサイレント」表現型を示すのかについての目下の指標は何もない。図11Aおよび11Bは、qRT-PCRにより測定された、広範囲のウイルス接種量にわたって実施例1のrSeV-Cas9ベクターまたは温度感受性PL変異体ベクターのいずれかを感染させた293T細胞における2つの代表的なインターフェロン刺激遺伝子（interferon stimulated gene:ISG）の誘導倍率を示す。ウイルスゲノムコピー数が多い場合、実施例1のrSeV-Cas9ベクターと比較して、PL変異体ベクターはISGを誘導するのに著しく欠陥がある。これは、gRNAがmCherryを含むかCCR5を含むかにかかわらず、当てはまった。

実施例3：rSeV-Cas9ベクターへのさらなる改変
実施例1に記載のrSeV-Cas9ベクターのさらなる欠失変異体を作成したが、それは融合タンパク質を欠いていた（すなわちΔF変異体）。これらはF補完細胞株でのみ増殖することができる。実施例2の温度感受性PL変異体がΔF変異体となるように作成される。2つのgRNAを送達することができるrSeV-Cas9ベクターが作成され、そのベクターを図12に示す。

前述の実施例および好ましい実施態様の説明は、添付の特許請求の範囲によって定義される本開示を限定するものとしてではなく、例示として解釈されるべきである。容易に理解されるように、特許請求の範囲に記載される本開示から逸脱することなく、上記の特徴の多数の変形および組み合わせを利用することが可能である。そのような変形は本開示の範囲からの逸脱とは見なされず、そのような全ての変形は添付の特許請求の範囲内に含まれるものとする。本明細書に引用された全ての参考文献は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。

Claims (41)

1. 一本鎖RNA（ssRNA）ウイルスのゲノム配列または該ゲノム配列に相補的なアンチゲノム配列を含む、核酸であって、
   該アンチゲノム配列が、
   （i）標的セグメント、および
   （ii）第1の自己切断リボザイムをコードする第1のセグメント
   を含む第1の領域を含み、
   該標的セグメントが第1のセグメントに隣接している、前記核酸。
2. 前記第1の領域が、（iii）第2の自己切断リボザイムをコードする第2のセグメントをさらに含み、前記標的セグメントが、第1のセグメントと第2のセグメントとに隣接している、請求項1に記載の核酸。
3. 前記ゲノム配列を含む、請求項1または2に記載の核酸。
4. 前記アンチゲノム配列を含む、請求項1または2に記載の核酸。
5. 前記第1の自己切断リボザイムが3'自己切断リボザイムである、請求項1〜4のいずれか一項に記載の核酸。
6. 前記第1の自己切断リボザイムが5'自己切断リボザイムである、請求項1〜4のいずれか一項に記載の核酸。
7. 前記アンチゲノム配列が、ヌクレアーゼをコードする第3のセグメントを含む第2の領域をさらに含む、請求項6に記載の核酸。
8. 前記第2の領域が、レポーター分子をコードする第4のセグメントをさらに含む、請求項6または7に記載の核酸。
9. 前記標的セグメントがガイドRNA（gRNA）を含み、該gRNAが足場配列およびターゲティング配列を有する、請求項6〜8のいずれか一項に記載の核酸。
10. 前記ヌクレアーゼがCas9を含む、請求項6〜9のいずれか一項に記載の核酸。
11. 前記ヌクレアーゼがCpf1を含む、請求項6〜9のいずれか一項に記載の核酸。
12. 前記第1の自己切断リボザイムがハンマーヘッド型リボザイムを含む、請求項6〜11のいずれか一項に記載の核酸。
13. 前記第1の自己切断リボザイムが、ハンマーヘッド型リボザイムおよびデルタ型肝炎ウイルス（HDV）リボザイムの一方を含む、請求項5に記載の核酸。
14. 第5のセグメントを含む第3の領域をさらに含み、該第5のセグメントが変異型P遺伝子を含む、請求項1〜13のいずれか一項に記載の核酸。
15. 第6のセグメントを含む第4の領域を含む第4の領域をさらに含み、該第6のセグメントが変異型L遺伝子を含む、請求項1〜14のいずれか一項に記載の核酸。
16. 請求項1〜13のいずれか一項に記載の核酸を含むウイルス粒子。
17. 請求項6〜13のいずれか一項に記載の核酸を含むウイルス粒子。
18. 請求項14または15に記載の核酸を含むウイルス粒子。
19. モノネガウイルス目（order mononegavirales）に含まれる、請求項16または17に記載のウイルス粒子。
20. パラミクソウイルス科（family paramyxoviridae）に含まれる、請求項16〜18のいずれか一項に記載のウイルス粒子。
21. センダイウイルス（SeV）である、請求項16〜19のいずれか一項に記載のウイルス粒子。
22. ニューカッスル病ウイルス（NDV）である、請求項16〜19のいずれか一項に記載のウイルス粒子。
23. 温度感受性変異体である、請求項18に記載のウイルス粒子。
24. 宿主におけるインターフェロン（IFN）産生を刺激しない、請求項23に記載のウイルス粒子。
25. 以下の段階を含む、標的RNAを宿主細胞に導入する方法：
    （i）請求項16〜24のいずれか一項に記載のウイルス粒子を宿主細胞と接触させる段階；ならびに
    （ii）（a）標的RNAの産生、および
    （b）転写された第1の領域から第1の自己切断リボザイムが標的RNAを遊離させる、標的RNAの遊離
    を可能にする条件下で、該宿主細胞を培養する段階。
26. 前記宿主細胞が、古細菌細胞、細菌細胞、および真核細胞からなる群より選択される、請求項25に記載の方法。
27. 前記宿主細胞が幹細胞である、請求項26に記載の方法。
28. 以下の段階を含む、宿主細胞中の標的DNAに部位特異的改変を導入する方法：
    （i）請求項16〜24のいずれか一項に記載のウイルス粒子を宿主細胞と接触させる段階；
    （ii）（a）5'自己切断リボザイムに隣接しているgRNAおよびヌクレアーゼの産生、
    （b）5'自己切断リボザイムがgRNAを遊離させる、gRNAの遊離、
    （c）ヌクレアーゼの発現、
    （d）gRNAの足場配列がヌクレアーゼに結合する、ヌクレアーゼとgRNAの複合体の形成、および
    （e）プロトスペーサー隣接モチーフ（PAM）に隣接する標的DNA上の配列にgRNAのターゲティング配列が結合する、標的DNAと複合体との接触
    を可能にする条件下で、該宿主細胞を培養する段階；ならびに
    （iii）標的DNAに部位特異的改変を導入する段階。
29. 部位特異的改変が、挿入、欠失、フレームシフト、および点変異のうちの1つである、請求項28に記載の方法。
30. 前記DNAがゲノムである、請求項28または29に記載の方法。
31. 前記宿主細胞が、古細菌細胞、細菌細胞、および真核細胞からなる群より選択される、請求項28〜30のいずれか一項に記載の方法。
32. 請求項1〜15のいずれか一項に記載の核酸をコードするDNAを含むベクター。
33. プラスミドである、請求項32に記載のベクター。
34. 請求項32または33に記載のベクターで形質転換された細胞。
35. 幹細胞である、請求項34に記載の細胞。
36. 細菌細胞である、請求項34に記載の細胞。
37. 大腸菌（E. coli）である、請求項34または36に記載の細胞。
38. 請求項26または27に記載のベクターを含むキット。
39. 薬学的に許容される防腐剤をさらに含む、請求項38に記載のキット。
40. ゲノム配列または該ゲノム配列に相補的なアンチゲノム配列をコードするDNAを発現させるための試薬をさらに含む、請求項38または39に記載のキット。
41. 前記試薬がT7 RNAポリメラーゼを含む、請求項40に記載のキット。

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