JP2019519247A - 抗ｐｄ−１のモノクローナル抗体 - Google Patents

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Abstract

抗ＰＤ−１のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片を提供する。（１）配列番号：１に示すアミノ酸配列、（２）配列番号：３に示すアミノ酸配列、（３）配列番号：５に示すアミノ酸配列、（４）（１）〜（３）と比べて、少なくとも１つの保守的アミノ酸突然変異を有するアミノ酸配列から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む。【選択図】なし

Description

本発明は、生物医薬分野に関し、特に、抗ＰＤ−１のモノクローナル抗体に関する。
プログラム化細胞死因子（ＰＤ−１）（別称：ＣＤ２７９、遺伝子名：ＰＤＣＤ１、登録番号：ＮＰ＿００５００９）は、免疫システムの刺激シグナルと阻害シグナルとのバランスの調節、及び末梢性トレランスの維持に対して、重要な作用を発揮する細胞表面受容体であり、同時にＣＤ２８と同一性を有する免疫グロブリンスーパーファミリーの阻害メンバーとする。ＰＤ−１は、モノマーＩ型膜貫通タンパク質であり、免疫グロブリン可変領域系細胞外構成域（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ−ｌｉｋｅ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｏｍａｉｎ）、及び免疫受容体チロシン依存性抑制モチーフ（ＩＴＩＭ）と免疫受容体チロシン依存性スイッチモチーフ（ＩＴＳＭ）を含有する細胞質ドメインからなる。Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラル・キラー（ＮＫ）細胞と単球にＰＤ−１の発現を誘導でき、例えば、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）またはＢ細胞受容体（ＢＣＲ）シグナル伝達によりリンパ球を活性化した。ＰＤ−１が既知の二つのリガンドを有し、即ち、ＰＤ−Ｌ１（Ｂ７−Ｈ１、ＣＤ２７４）とＰＤ−Ｌ２（Ｂ７−ＤＣ、ＣＤ２７３）であり、これらは、細胞表面に発現されるＢ７ファミリーのメンバーである。リガンドと結合する場合、ＰＤ−１がホスファターゼ（例えば、ＳＨＰ−１とＳＨＰ−２）をその細胞内のチロシンモチーフに動員する。その後、前記チロシンモチーフが、ＴＣＲまたはＢＣＲシグナル伝達により活性化されたエフェクタ分子を脱リン酸化させる。これにより、ＴＣＲまたはＢＣＲと同時に結合する場合のみ、ＰＤ−１が抑制性シグナルをＴ細胞とＢ細胞に伝達することができる。
しかしながら、現在、ＰＤ−１を特異的に認識する抗体を改善することが求められている。
本発明は、上記の技術課題の１つを一定の程度で解決し、または有用の商用利用可能な選択を提供することである。そのため、本発明の１つの目的は、抗ＰＤ−１のモノクローナル抗体を提供することである。
本発明の第１の側面において、本発明は、抗ＰＤ−１のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片を提供する。本発明の実施例によれば、前記抗体またはその抗原結合断片は、（１）配列番号：１に示すアミノ酸配列、（２）配列番号：３に示すアミノ酸配列、（３）配列番号：５に示すアミノ酸配列、（４）（１）〜（３）と比べて、少なくとも１つの保守的アミノ酸突然変異（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｍｕｔａｔｉｏｎ）を有するアミノ酸配列から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む。
本発明の実施例によれば、前記抗体またはその抗原結合断片は、（５）配列番号：２に示すアミノ酸配列、（６）配列番号：４に示すアミノ酸配列、（７）配列番号：６に示すアミノ酸配列、（８）（５）〜（７）と比べて、少なくとも１つの保守的アミノ酸突然変異を有するアミノ酸配列から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を更に含む。
本発明の実施例によれば、前記抗体またはその抗原結合断片は、
配列番号：１に示すアミノ酸配列（ＥＶＱＬＶＱＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＫＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＧＭＳＷＶＲＱＴＰＥＫＧＬＤＷＶＡＴＩＳＧＧＧＲＤＴＹＹＰＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＮＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＬＹＹＣＡＲＱＫＧＥＡＷＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ）を有する重鎖可変領域と、
配列番号：２に示すアミノ酸配列（ＤＩＶＬＴＱＳＰＡＳＬＡＶＳＰＧＱＲＡＴＩＴＣＲＡＳＥＳＶＤＮＹＧＩＳＦＭＮＷＦＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＡＡＳＮＫＧＴＧＶＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＮＩＨＰＭＥＥＮＤＴＡＭＹＦＣＱＱＳＫＥＶＰＷＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ）を有する軽鎖可変領域と、を含む。
本発明の実施例によれば、前記抗体またはその抗原結合断片は、
配列番号：３に示すアミノ酸配列（ＥＶＱＬＶＱＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＫＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＧＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＤＷＶＡＴＩＳＧＧＧＲＤＴＹＹＰＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＮＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＬＹＹＣＡＲＱＫＧＥＡＷＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ）を有する重鎖可変領域と、
配列番号：４に示すアミノ酸配列（ＤＩＶＬＴＱＳＰＡＳＬＡＶＳＰＧＱＲＡＴＩＴＣＲＡＳＥＳＶＤＮＹＧＩＳＦＭＮＷＦＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＡＡＳＮＫＧＴＧＶＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＮＩＮＰＭＥＥＮＤＴＡＭＹＦＣＱＱＳＫＥＶＰＷＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ）を有する軽鎖可変領域と、を含む。
本発明の実施例によれば、前記抗体またはその抗原結合断片は、
配列番号：５に示すアミノ酸配列（ＥＶＱＬＶＱＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＫＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＧＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＤＷＶＡＴＩＳＧＧＧＲＤＴＹＹＰＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＱＫＧＥＡＷＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ）を有する重鎖可変領域と、
配列番号：６に示すアミノ酸配列（ＤＩＶＬＴＱＳＰＡＳＬＡＶＳＰＧＱＲＡＴＩＴＣＲＡＳＥＳＶＤＮＹＧＩＳＦＭＮＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＡＡＳＮＫＡＴＧＶＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＮＩＮＰＭＥＡＮＤＴＡＶＹＦＣＱＱＳＫＥＶＰＷＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ）を有する軽鎖可変領域と、を含む。
本発明の実施例によれば、前記抗体またはその抗原結合断片の抗体は、モノクローナル抗体である。
本発明の実施例によれば、前記抗体またはその抗原結合断片が、ＰＤ−１と特異的、効率的に結合でき、Ｔ細胞の活性化と増殖を促進し、サイトカインの発現と分泌を調節し、または抗腫瘍細胞を刺激してより強い免疫応答を生成することに用いられる。
発明者が、本発明の実施例による抗体またはその抗原結合断片、ＰＤ−１を特異的に認識でき、かつＴ細胞の活性化と増殖を促進し、サイトカインの発現と分泌を調節し、抗腫瘍細胞を刺激してより強い免疫応答を生成できることを見出す。
本発明の第２の側面において、本発明が、単離ポリヌクレオチドを提供する。本発明の実施例によれば、前記ポリヌクレオチドが前記抗体またはその抗原結合断片をコードする。
本発明の実施例によれば、前記ポリヌクレオチドは、下記のヌクレオチド配列の少なくとも１つを有する。
本発明の具体的な実施例によれば、前記ポリヌクレオチドが、配列番号：１に示すアミノ酸配列（Ｈ１Ｌ１のヌクレオチド配列）をコードする配列番号：７に示すヌクレオチド配列またはその相補配列を有する。
ＧＡＡＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＣＡＧＡＧＣＧＧＡＧＧＧＧＧＡＣＴＧＧＴＧＣＡＧＣＣＣＧＧＣＧＧＧＴＣＴＣＴＧＡＡＧＣＴＧＡＧＴＴＧＣＧＣＣＧＣＴＴＣＡＧＧＡＴＴＣＡＣＴＴＴＴＡＧＣＴＣＣＴＡＣＧＧＣＡＴＧＴＣＣＴＧＧＧＴＧＣＧＡＣＡＧＡＣＣＣＣＣＧＡＧＡＡＡＧＧＧＣＴＧＧＡＣＴＧＧＧＴＣＧＣＴＡＣＣＡＴＣＴＣＴＧＧＡＧＧＣＧＧＧＡＧＡＧＡＣＡＣＡＴＡＣＴＡＴＣＣＴＧＡＴＡＧＴＧＴＣＡＡＧＧＧＣＣＧＧＴＴＣＡＣＡＡＴＴＡＧＣＡＧＡＧＡＣＡＡＣＴＣＣＡＡＡＡＡＣＡＡＴＣＴＧＴＡＴＣＴＧＣＡＧＡＴＧＡＡＴＡＧＣＣＴＧＡＧＧＧＣＡＧＡＡＧＡＴＡＣＣＧＣＣＣＴＧＴＡＣＴＡＴＴＧＴＧＣＣＣＧＣＣＡＧＡＡＡＧＧＡＧＡＧＧＣＴＴＧＧＴＴＴＧＣＡＴＡＣＴＧＧＧＧＡＣＡＧＧＧＧＡＣＡＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＡＧＣＡＧＣ（配列番号：７）。
本発明の具体的な実施例によれば、前記ポリヌクレオチドが配列番号：３に示すアミノ酸配列（Ｈ２Ｌ２のヌクレオチド配列）をコードする配列番号：８に示すヌクレオチド配列またはその相補配列を有する。
ＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＣＡＧＴＣＴＧＧＣＧＧＣＧＧＡＣＴＧＧＴＧＣＡＧＣＣＣＧＧＣＧＧＧＴＣＡＣＴＧＡＡＧＣＴＧＡＧＣＴＧＣＧＣＣＧＣＴＴＣＣＧＧＣＴＴＣＡＣＣＴＴＴＡＧＣＴＣＣＴＡＣＧＧＡＡＴＧＴＣＣＴＧＧＧＴＧＣＧＡＣＡＧＧＣＡＣＣＣＧＧＧＡＡＧＧＧＧＣＴＧＧＡＣＴＧＧＧＴＣＧＣＴＡＣＴＡＴＣＴＣＡＧＧＡＧＧＣＧＧＧＡＧＡＧＡＣＡＣＣＴＡＣＴＡＴＣＣＴＧＡＴＡＧＣＧＴＣＡＡＧＧＧＣＣＧＧＴＴＣＡＣＡＡＴＴＡＧＣＣＧＧＧＡＣＡＡＣＡＧＣＡＡＧＡＡＣＡＡＴＣＴＧＴＡＣＣＴＧＣＡＧＡＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＡＧＧＧＣＴＧＡＧＧＡＴＡＣＴＧＣＡＣＴＧＴＡＣＴＡＴＴＧＴＧＣＣＣＧＣＣＡＧＡＡＧＧＧＣＧＡＡＧＣＡＴＧＧＴＴＴＧＣＣＴＡＴＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＡＡＣＣＣＴＧＧＴＧＡＣＡＧＴＣＴＣＴＡＧＴ（配列番号：８）。
本発明の具体的な実施例によれば、前記ポリヌクレオチドが配列番号：５に示すアミノ酸配列（Ｈ３Ｌ３のヌクレオチド配列）をコードする配列番号：９に示すヌクレオチド配列またはその相補配列を有する。
ＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＣＡＧＡＧＴＧＧＡＧＧＣＧＧＧＣＴＧＧＴＧＣＡＧＣＣＣＧＧＣＧＧＧＴＣＡＣＴＧＡＡＧＣＴＧＡＧＣＴＧＣＧＣＣＧＣＴＴＣＣＧＧＣＴＴＣＡＣＣＴＴＴＡＧＣＴＣＣＴＡＣＧＧＡＡＴＧＴＣＣＴＧＧＧＴＧＣＧＡＣＡＧＧＣＡＣＣＣＧＧＧＡＡＧＧＧＧＣＴＧＧＡＣＴＧＧＧＴＣＧＣＴＡＣＴＡＴＣＴＣＡＧＧＡＧＧＣＧＧＧＡＧＡＧＡＣＡＣＣＴＡＣＴＡＴＣＣＴＧＡＴＡＧＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＣＧＧＴＴＣＡＣＡＡＴＴＡＧＣＣＧＧＧＡＣＡＡＣＡＧＣＡＡＧＡＡＣＡＣＴＣＴＧＴＡＣＣＴＧＣＡＧＡＴＧＡＡＣＴＣＴＣＴＧＡＧＧＧＣＴＧＡＧＧＡＴＡＣＡＧＣＡＧＴＣＴＡＣＴＡＴＴＧＴＧＣＣＣＧＣＣＡＧＡＡＧＧＧＣＧＡＡＧＣＡＴＧＧＴＴＴＧＣＣＴＡＴＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＡＡＣＣＣＴＧＧＴＧＡＣＡＧＴＣＴＣＴＡＧＴ（配列番号：９）。
本発明の具体的な実施例によれば、前記ポリヌクレオチドが配列番号：２に示すアミノ酸配列（Ｈ１Ｌ１のヌクレオチド配列）をコードする配列番号：１０に示すヌクレオチド配列またはその相補配列を有する
ＧＡＴＡＴＴＧＴＧＣＴＧＡＣＴＣＡＧＡＧＣＣＣＴＧＣＴＴＣＣＣＴＧＧＣＣＧＴＧＴＣＴＣＣＡＧＧＡＣＡＧＣＧＡＧＣＴＡＣＣＡＴＣＡＣＡＴＧＣＡＧＡＧＣＡＴＣＴＧＡＧＡＧＴＧＴＧＧＡＣＡＡＣＴＡＣＧＧＡＡＴＴＡＧＴＴＴＣＡＴＧＡＡＴＴＧＧＴＴＴＣＡＧＣＡＧＡＡＧＣＣＣＧＧＣＣＡＧＣＣＣＣＣＴＡＡＡＣＴＧＣＴＧＡＴＣＴＡＴＧＣＣＧＣＴＡＧＣＡＡＣＡＡＧＧＧＣＡＣＣＧＧＧＧＴＧＣＣＴＧＣＴＣＧＡＴＴＣＴＣＡＧＧＡＡＧＣＧＧＣＴＣＣＧＧＧＡＣＡＧＡＣＴＴＴＡＣＴＣＴＧＡＡＣＡＴＴＣＡＣＣＣＡＡＴＧＧＡＧＧＡＡＡＡＴＧＡＴＡＣＡＧＣＡＡＴＧＴＡＣＴＴＣＴＧＣＣＡＧＣＡＧＡＧＣＡＡＧＧＡＧＧＴＧＣＣＣＴＧＧＡＣＣＴＴＴＧＧＣＧＧＧＧＧＡＡＣＡＡＡＧＣＴＧＧＡＡＡＴＣＡＡＡ（配列番号：１０）。
本発明の具体的な実施例によれば、前記ポリヌクレオチドが配列番号：４に示すアミノ酸配列（Ｈ２Ｌ２のヌクレオチド配列）をコードする配列番号：１１に示すヌクレオチド配列またはその相補配列を有する。
ＧＡＴＡＴＴＧＴＧＣＴＧＡＣＴＣＡＧＡＧＣＣＣＴＧＣＴＴＣＣＣＴＧＧＣＣＧＴＧＴＣＴＣＣＡＧＧＡＣＡＧＣＧＡＧＣＴＡＣＣＡＴＣＡＣＡＴＧＣＡＧＡＧＣＡＴＣＴＧＡＧＡＧＴＧＴＧＧＡＣＡＡＣＴＡＣＧＧＡＡＴＴＡＧＴＴＴＣＡＴＧＡＡＴＴＧＧＴＴＴＣＡＧＣＡＧＡＡＧＣＣＣＧＧＣＣＡＧＣＣＣＣＣＴＡＡＡＣＴＧＣＴＧＡＴＣＴＡＴＧＣＣＧＣＴＡＧＣＡＡＣＡＡＧＧＧＣＡＣＣＧＧＧＧＴＧＣＣＴＧＣＴＣＧＡＴＴＣＴＣＡＧＧＡＡＧＣＧＧＣＴＣＣＧＧＧＡＣＡＧＡＣＴＴＴＡＣＴＣＴＧＡＡＣＡＴＴＡＡＣＣＣＡＡＴＧＧＡＧＧＡＡＡＡＴＧＡＴＡＣＡＧＣＡＡＴＧＴＡＣＴＴＣＴＧＣＣＡＧＣＡＧＡＧＣＡＡＧＧＡＧＧＴＧＣＣＣＴＧＧＡＣＣＴＴＴＧＧＣＧＧＧＧＧＡＡＣＡＡＡＧＣＴＧＧＡＡＡＴＣＡＡＡ（配列番号：１１）。
本発明の具体的な実施例によれば、前記ポリヌクレオチドが配列番号：６に示すアミノ酸配列（Ｈ３Ｌ３のヌクレオチド配列）をコードする配列番号：１２に示すヌクレオチド配列またはその相補配列を有する。
ＧＡＣＡＴＣＧＴＣＣＴＧＡＣＴＣＡＧＡＧＣＣＣＴＧＣＴＴＣＣＣＴＧＧＣＣＧＴＧＡＧＣＣＣＡＧＧＣＣＡＧＣＧＡＧＣＡＡＣＣＡＴＣＡＣＡＴＧＣＡＧＡＧＣＣＴＣＡＧＡＧＡＧＣＧＴＧＧＡＣＡＡＣＴＡＣＧＧＣＡＴＴＡＧＣＴＴＣＡＴＧＡＡＴＴＧＧＴＡＴＣＡＧＣＡＧＡＡＧＣＣＣＧＧＧＣＡＧＣＣＴＣＣＣＡＡＧＣＴＧＣＴＧＡＴＣＴＡＣＧＣＣＧＣＴＴＣＣＡＡＣＡＡＧＧＣＣＡＣＴＧＧＧＧＴＧＣＣＴＧＣＴＣＧＡＴＴＣＴＣＣＧＧＣＴＣＴＧＧＧＡＧＴＧＧＡＡＣＡＧＡＣＴＴＴＡＣＴＣＴＧＡＡＣＡＴＴＡＡＴＣＣＡＡＴＧＧＡＡＧＣＴＡＡＴＧＡＴＡＣＡＧＣＡＧＴＧＴＡＴＴＴＣＴＧＣＣＡＧＣＡＧＡＧＣＡＡＧＧＡＧＧＴＣＣＣＡＴＧＧＡＣＣＴＴＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＡＣＣＡＡＧＣＴＧＧＡＧＡＴＣＡＡＧ（配列番号：１２）。
発明者が、本発明の実施例によれば、本発明のポリヌクレオチドを介して、ＰＤ−１を特異的に認識する抗体またはその抗原結合断片を合成することができる。ＰＤ−１を特異的に認識する抗体またはその抗原結合断片の前記特徴及びメリットについて、前記ポリヌクレオチドにも適用できるため、ここで、詳細な説明は省略する。
本発明の第３の側面において、本発明が発現ベクターを提供する。前記発現ベクターが前記ポリヌクレオチドを含む。
本発明の具体的な実施例によれば、前記発現ベクターは、
宿主細胞における前記ポリヌクレオチドの発現を制御するように、前記ポリヌクレオチドと操作可能に連結する制御要素を更に含む。
本発明の具体的な例示によれば、前記宿主細胞は、哺乳動物細胞でも良い。前記哺乳動物細胞は、ヒト腎上皮細胞系細胞でも良い。
本発明の具体的な例示によれば、前記ヒト腎上皮細胞系細胞は、２９３Ｔ細胞でも良い。
本発明の具体的な実施例によれば、前記制御要素は、
プロモーター、エンハンサー、及びターミネーターから選択される少なくとも１つを含み、
任意的に、前記プロモーターは、ＣＭＶプロモーターであり、前記エンハンサーは、初期ＣＭＶエンハンサーであり、前記ターミネーターは、ＳＶ ｐｏｌｙＡターミネーターである。
本発明の第４の側面によれば、本発明は、組み換え細胞を提供する。前記組み換え細胞は、前記発現ベクターを含む。
本発明の第５の側面において、本発明は、前記抗体またはその抗原結合断片の製造方法を提供する。本発明の実施例によれば、前記組み換え細胞を培養するステップを含む。
発明者が、本発明の方法を介して、前記組み換え細胞を培養することにより、本発明の実施例によるＰＤ−１を特異的に認識する抗体またはその抗原結合断片を合成できることを見出す。ＰＤ−１を特異的に認識する抗体またはその抗原結合断片の前記特徴及びメリットについて、前記方法にも適用できるため、ここで、詳細な説明は省略する。
本発明の第６の側面において、本発明は、前記ポリヌクレオチド、発現ベクター、または組み換え細胞の抗体またはその抗原結合断片の製造における使用を提供する。前記抗体とＰＤ−１とが特異的に結合する。これにより、発明者が、前記ポリヌクレオチド、発現ベクター、または組み換え細胞を利用することにより、ＰＤ−１と特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片を製造できることを見出す。従って、得られた抗体またはその抗原結合断片によりＰＤ−１とその受容体の結合を阻害できるため、ＰＤ−１受容体（例えば、ＳＨＰ１／２）に関するシグナル経路を阻害でき、腫瘍の成長を有効に抑制できる。
本発明の第７の側面において、本発明は、ハイブリドーマを提供する。それが中国典型培養物保蔵センターに寄託されていた（ＣＣＴＣＣ）。
発明者が、本発明のハイブリドーマを利用することにより、本発明の実施例におけるＰＤ−１を特異的に認識する抗体またはその抗原結合断片を合成できることを見出す。ＰＤ−１を特異的に認識する抗体またはその抗原結合断片の前記特徴及びメリットについて、前記ハイブリドーマにも適用できるため、ここで、詳細な説明は省略する。
本発明の第８の側面において、本発明は、前記ハイブリドーマのモノクローナル抗体の製造における使用を提供する。
発明者が、本発明のハイブリドーマを利用することにより、本発明の実施例によるＰＤ−１を特異的に認識する抗体またはその抗原結合断片を合成できることを見出す。ＰＤ−１を特異的に認識する抗体またはその抗原結合断片の前記特徴及びメリットについて、前記使用にも適用できるため、ここで、詳細な説明は省略する。
本発明の第９の側面において、本発明は、前記抗体またはその抗原結合断片、前記ポリヌクレオチド、発現ベクター、組み換え細胞または前記ハイブリドーマの医薬の製造における使用を提供する。前記医薬が、Ｔ細胞の活性化と増殖を促進し、サイトカインの発現と分泌を調節し、抗腫瘍細胞を刺激してより強い免疫応答を生成することに用いられる。
本発明の第１０の側面において、本発明は、医薬組成物を提供する。本発明の実施例によれば、前記医薬組成物は、前記抗体またはその抗原結合断片、前記ポリヌクレオチド、前記発現ベクター、前記組み換え細胞または前記ハイブリドーマを含む。
本発明の第１１の側面において、本発明は、ＰＤ−１と結合できる医薬の検出方法を提供する。
本発明の実施例によれば、前記方法は、
検出対象である医薬が存在する場合、前記抗体またはその抗原結合断片と抗原を接触させ、かつ前記抗体またはその抗原結合断片と前記抗原との第１の結合量を決定して、前記抗原は、ＰＤ−１またはその断片であるステップ、及び
検出対象である医薬が存在しない場合、前記抗体またはその抗原結合断片と抗原を接触させ、かつ前記抗体またはその抗原結合断片と前記抗原との第２の結合量を決定して、前記抗原は、ＰＤ−１またはその断片であるステップを含み、
ただし、前記第２の結合量が前記第１の結合量より多いことは、前記検出対象である医薬がＰＤ−１と結合できる合図である。
前記方法により、ＰＤ−１と結合できる検出対象である医薬を選別できる。
本発明の第１２の側面において、本発明は、混合薬を提供する。
本発明の実施例によれば、前記混合薬は、
（１）前記抗体またはその抗原結合断片、前記ポリヌクレオチド、前記発現ベクター、前記組み換え細胞または前記ハイブリドーマ、及び
（２）（１）と異なる免疫強化剤、を含む。
本発明の実施例によれば、前記（１）と異なる免疫強化剤は、抗ＣＴＬＡ−４抗体、抗ＣＤ４０抗体、ブデソニド（Ｂｕｄｅｓｏｎｉｄｅ）、サリチル酸塩から選択される少なくとも１つを含み、任意的に、前記サリチル酸塩は、スルファサラジン（ｓｕｌｆａｓａｌａｚｉｎｅ）、オルサラジン（ｏｌｓａｌａｚｉｎｅ）、バルサラジド（ｂａｌｓａｌａｚｉｄｅ）及びメサラジン（ｍｅｓａｌａｍｉｎｅ）から選択される少なくとも１つを含む。
ＰＤ−１とＣＴＬＡ−４との併用による阻害と、腫瘍の標準治療（例えば、化学療法）と同時に利用されることがある。臨床試験に基づいて、抗ＰＤ−１抗体と抗ＣＴＬＡ−４抗体との併用により、化学療法剤の用量を低下しても同じ効果を達成できる。従来文献によると、抗ＰＤ−１抗体と抗ＣＴＬＡ−４抗体、及びダカルバジン（ドセタキセル、抗がん薬に属する）またはインターロイキン−２（ＩＬ−２）とを併用することにより悪性黒色腫を治療することが提案する。多種類の化学療法薬における細胞毒素は、細胞死を誘導し、腫瘍細胞によって発現される抗原のレベルを増加させる。一方、抗ＰＤ−１抗体と抗ＣＴＬＡ−４抗体を併用すると、放射線療法、手術、ホルモン療法などの相乗効果を増加させることができる。上記のいずれも体内の抗原のソースを増加するためである。血管増殖を阻害することにより、腫瘍細胞の増殖をさらに阻害させるため、血管新生阻害剤も抗ＰＤ−１抗体および抗ＣＴＬＡ−４抗体と併用できる。これにより、体内の抗原発現の増加に寄与することがある。
本発明の付加的な特徴及びメリットは、以下の説明において一部が述べられ、一部が以下の説明においてさらに明瞭になり、又は本発明の実践を介して把握できる。
本発明の付加的な特徴及びメリットは、下記の図面を参考しながら実施例を説明することにより、明瞭かつ理解しやすくなる。
本発明の１つの実施例によれば、Ｈ１Ｌ１、Ｈ２Ｌ２、Ｈ３Ｌ３のＰＤ−１との結合のＥＬＩＳＡ結果図である。 本発明の１つの実施例によれば、Ｈ１Ｌ１、Ｈ２Ｌ２、Ｈ３Ｌ３がＰＤ−１とＰｄＬ１との結合を抑制する競合ＥＬＩＳＡ結果図である。 本発明の１つの実施例によれば、Ｈ２Ｌ２がＰＤ−１とＰｄＬ２との結合を抑制する競合ＥＬＩＳＡ結果図である。 本発明の１つの実施例によれば、Ｈ１Ｌ１の運動特性パラメータ検出結果を示す図である。 本発明の１つの実施例によれば、Ｈ２Ｌ２の運動特性パラメータ検出結果を示す図である。 本発明の１つの実施例によれば、Ｈ３Ｌ３の運動特性パラメータ検出結果を示す図である。 本発明の１つの実施例によれば、抗体Ｈ１Ｌ１、Ｈ２Ｌ２、Ｈ３Ｌ３が、ＰＤ−１タンパク質の活性化を阻害することにより、Ｔ細胞を刺激してＩＬ−２とＩＦＮｇａｍｍａの分泌レベルを示す図。 本発明の１つの実施例によれば、それぞれ抗体Ｈ１Ｌ１、Ｈ２Ｌ２、Ｈ３Ｌ３のＢＢ００７細胞との結合の蛍光を示す図。 本発明の１つの実施例によれば、それぞれ抗体Ｈ１Ｌ１、Ｈ２Ｌ２、Ｈ３Ｌ３のＢＢ００７細胞との結合後の蛍光強度を示す図。
以下、本発明の実施形態を詳細に説明する。以下の実施形態は、例示的なものであり、本発明を解釈するのみに用いられ、本発明を限定するものと理解されてはならない。また、明確に記載されていない場合、下記実施例に利用された試薬は、いずれも一般的な市販品に属することや、本発明または既知の方法で合成できるものであり、明確に記載されていない反応条件は、当業者にとって容易に取得できるものである。
実施例１ ＰＤ−１ ４Ｇ１０ハイブリドーマ細胞株の確立
分子生物学の方法に基づいて、下記のアミノ酸配列を有する融合タンパク質ＰＤ−１−ｍＩｇＧＦｃを調製する。
ＭＱＩＰＱＡＰＷＰＶＶＷＡＶＬＱＬＧＷＲＰＧＷＦＬＤＳＰＤＲＰＷＮＰＰＴＦＳＰＡＬＬＶＶＴＥＧＤＮＡＴＦＴＣＳＦＳＮＴＳＥＳＦＶＬＮＷＹＲＭＳＰＳＮＱＴＤＫＬＡＡＦＰＥＤＲＳＱＰＧＱＤＣＲＦＲＶＴＱＬＰＮＧＲＤＦＨＭＳＶＶＲＡＲＲＮＤＳＧＴＹＬＣＧＡＩＳＬＡＰＫＡＱＩＫＥＳＬＲＡＥＬＲＶＴＥＲＲＡＥＶＰＴＡＨＰＳＰＳＰＲＰＡＧＱＦＱＴＬＶＳＰＲＰＳＥＴＶＴＣＮＶＡＨＰＡＳＳＴＫＶＤＫＫＩＶＰＲＤＣＧＣＫＰＣＩＣＴＶＰＥＶＳＳＶＦＩＦＰＰＫＰＫＤＶＬＴＩＴＬＴＰＫＶＴＣＶＶＶＤＩＳＫＤＤＰＥＶＱＦＳＷＦＶＤＤＶＥＶＨＴＡＱＴＱＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＳＶＳＥＬＰＩＭＨＱＤＷＬＮＧＫＥＦＫＣＲＶＮＳＡＡＦＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＲＰＫＡＰＱＶＹＴＩＰＰＰＫＥＱＭＡＫＤＫＶＳＬＴＣＭＩＴＤＦＦＰＥＤＩＴＶＥＷＱＷＮＧＱＰＡＥＮＹＫＮＴＱＰＩＭＮＴＮＧＳＹＦＶＹＳＫＬＮＶＱＫＳＮＷＥＡＧＮＴＦＴＣＳＶＬＨＥＧＬＨＮＨＨＴＥＫＳＬＳＨＳＰＧＫ（配列番号：１３）。
１． マウス免疫及び細胞融合
フロイントアジュバントにより予め乳化された抗原（前記方法により調製されたＰＤ−１−ｍＩｇＧＦｃ融合タンパク質）でＢＡＬＢ／Ｃマウスを免疫する。ＢＡＬＢ／Ｃマウスが免疫応答を生成した後、その脾細胞を採取し、マウス骨髄腫細胞と融合させてハイブリドーマを得、９６ウェルプレートで前記ハイブリドーマを培養する。
２． 間接ＥＬＩＳＡ
各ハイブリドーマ細胞株細胞が分泌する抗体について、抗原であるＰＤ−１−ｈＦｃによりコーティングされ、１％ＢＳＡを含むＰＢＳ緩衝液でＥＬＩＳＡプレートをブロックして、コーティングされたＥＬＩＳＡプレートを利用する間接ＥＬＩＳＡ法で、ＰＤ−１と特異的に結合する新たな抗体を分泌するハイブリドーマ細胞を選別する。
具体的なステップは、以下のようである。
１）抗原のコーティング
４℃で、１μｇ／ｍｌであるＰＤ−１−ｈＦｃ抗原（５０μｌ／ウェル）を一晩コーティングするステップ。
２）ブロッキング
３７℃、１％ ＢＳＡ（ＰＢＳで希釈する）で２時間ブロックして、１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含む１×ＰＢＳＴで３回洗浄して、乾燥するように軽く叩くステップ。
３）一次抗体
１μｇ／ｍｌから１：３で希釈して、７つの濃度勾配の抗体溶液を得て、対照組は、ＰＢＳであり、それぞれ３７℃で１時間インキュベートするステップ。
４）二次抗体
ＰＢＳＴで３回洗浄して、乾燥するように軽く叩き、１：５０００で希釈したＨＲＰ標識ヤギ抗マウスｌｇＧ（Ｈ＋Ｌ）を各ウェルに５０μｌずつ入れ、３７℃で１時間インキュベートするステップ。
５）顕色
ＰＢＳＴで３回洗浄して、乾燥するように軽く叩き、ＴＭＢ顕色剤を各ウェルに５０μｌずつ入れ、室温で５〜１０分反応するステップ。
６）顕色完了
５０μｌ／ウェルで２Ｍ Ｈ２ＳＯ４溶液を入れ、顕色反応を完了するステップ。
７）読取り
マイクロプレートリーダーにより、吸光度４５０ｎｍで各ウェルの吸光値を検出するステップ。
３． 競合ＥＬＩＳＡ
間接ＥＬＩＳＡにより選別されたハイブリドーマ細胞を、競合ＥＬＩＳＡ法でＰＤ−Ｌ１と競合してＰＤ−１と結合するモノクローナル抗体を分泌できるハイブリドーマ細胞を選別する。
具体的なステップは、以下のようである。
１）抗原のコーティング
９６ウェルＥＬＩＳＡプレートに、４℃で０．５μｇ／ｍｌであるＰＤ−１−ｍＩｇＧＦｃ抗原（５０μｌ／ウェル）を一晩コーティングするステップ。
２）ブロッキング
ＰＢＳＴでプレートを３回洗浄して、乾燥するように軽く叩き、３７℃、１％ ＢＳＡ（ＰＢＳで希釈する）で２時間ブロックして、１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含む１×ＰＢＳＴで３回洗浄するステップ。
３）一次抗体
３μｇ／ｍｌから１：３で希釈して、７つの濃度勾配の抗体溶液を得て、対照組は、ＰＢＳであり、それぞれ室温で１０分インキュベートするステップ。
４）リガンド
２μｇ／ｍｌのＰＤＬ１−ｈＩｇＧ１Ｆｃ溶液を各ウェルに５０μｌずつを入れ、３７℃で１時間インキュベートするステップ。
５）二次抗体
ＰＢＳＴで３回洗浄して、乾燥するように軽く叩き、１：５０００で希釈した二次抗体であるＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ−（Ｈ＋Ｌ）を各ウェルに５０μｌずつ入れ、３７℃で１時間インキュベートするステップ。
６）顕色
ＰＢＳＴで３回洗浄して、乾燥するように軽く叩き、ＴＭＢ顕色剤を各ウェルに５０μｌずつ入れ、室温で５〜１０分反応するステップ。
７）顕色完了
５０μｌ／ウェルで２Ｍ Ｈ２ＳＯ４溶液を入れ、顕色反応を完了するステップ。
８）読取り
マイクロプレートリーダーにより、吸光度４５０ｎｍで各ウェルの吸光値を検出するステップ。
検出結果に基づいて、ＰＤ−１ １８Ａ１０ハイブリドーマ細胞株を選別して、それが分泌するモノクローナル抗体は、１８Ａ１０と名付ける。
４．サブクローニングにより安定な細胞株を取得する
選別された細胞株１８Ａ１０をサブクローニングすることにより、ＰＤ−Ｌ１と競合してＰＤ−１と特異的に結合する抗体を分泌するモノクローナル安定細胞株を選別する。
具体的に、サブクローニング対象の細胞をカウントして、生存細胞数に基づいて、１５％ウシ胎児血清を含むＩＭＤＭ培地により希釈され、９６ウェルプレートに接種して培養する。理論上の細胞密度は、１細胞／ウェルである。細胞がモノクローナル細胞集塊に成長した後、ＥＬＩＳＡ法で選別を行い、サブクローニング・選別することを何回繰り返して、安定的なモノクローナル細胞株１８Ａ１０を得た。
５． １８Ａ１０抗体の製造
安定的な細胞株１８Ａ１０を得た後、１０％ＩｇＧを含むウシ胎児血清で安定的な細胞株１８Ａ１０を培養する。７〜１０日培養した後、細胞培養上清を収集・精製して、１８Ａ１０抗体を得た。
実施例２ ＫＦ００７ハイブリドーマ細胞株ｃＤＮＡ配列の取得
１．細胞／細菌トータルＲＮＡ抽出キットの取扱書（Ｔｉａｎｇｅｎ、製番ＤＰ４３０）に従って、１８Ａ１０ハイブリドーマ細胞株からｍＲＮＡを抽出する。
２．Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩＩ Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ＲＴ−ＰＣＲキットの取扱書に従って、一本鎖を合成して、ＰＣＲ増幅を行う。
３．ｐＥＡＳＹ−Ｔ１ クローニングキット（Ｔｉａｎｇｅｎ、製番ＣＴ１０１）の取扱書に従って、ＴＡクローニングを行う。
４．Ｍ１３ユニバーサルプライマーを利用してＰＣＲ法によって検出して、陽性クローンを選んでシーケンシングする。
５．シーケンシング結果をアライメントして、正確なｃＤＮＡ配列を取得する。
実施例３ 抗体１８Ａ１０ヒト化
ヒト化抗体を構成するため、マウス１８Ａ１０抗体の可変領域アミノ酸配列と、ヒトの可変領域基因配列とアライメントして、マウスアミノ酸配列の一部を選択的に変異させ、ヒト化アミノ酸配列を得ることにより、３つのヒト化抗体を取得する。ヒト化の程度に基づいて、それぞれＨ１Ｌ１、Ｈ２Ｌ２及びＨ３Ｌ３と名付ける。
ヒト化抗体Ｈ１Ｌ１の重鎖可変領域配列は、
ＥＶＱＬＶＱＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＫＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＧＭＳＷＶＲＱＴＰＥＫＧＬＤＷＶＡＴＩＳＧＧＧＲＤＴＹＹＰＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＮＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＬＹＹＣＡＲＱＫＧＥＡＷＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号：１）である。
ヒト化抗体Ｈ１Ｌ１の軽鎖可変領域アミノ酸配列は、
ＤＩＶＬＴＱＳＰＡＳＬＡＶＳＰＧＱＲＡＴＩＴＣＲＡＳＥＳＶＤＮＹＧＩＳＦＭＮＷＦＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＡＡＳＮＫＧＴＧＶＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＮＩＨＰＭＥＥＮＤＴＡＭＹＦＣＱＱＳＫＥＶＰＷＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号：２）である。
ヒト化抗体Ｈ２Ｌ２の重鎖可変領域配列は、
ＥＶＱＬＶＱＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＫＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＧＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＤＷＶＡＴＩＳＧＧＧＲＤＴＹＹＰＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＮＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＬＹＹＣＡＲＱＫＧＥＡＷＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号：３）である。
ヒト化抗体Ｈ２Ｌ２の軽鎖可変領域アミノ酸配列は、
ＤＩＶＬＴＱＳＰＡＳＬＡＶＳＰＧＱＲＡＴＩＴＣＲＡＳＥＳＶＤＮＹＧＩＳＦＭＮＷＦＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＡＡＳＮＫＧＴＧＶＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＮＩＮＰＭＥＥＮＤＴＡＭＹＦＣＱＱＳＫＥＶＰＷＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号：４）である。
ヒト化抗体Ｈ３Ｌ３の重鎖可変領域配列は、
ＥＶＱＬＶＱＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＫＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＧＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＤＷＶＡＴＩＳＧＧＧＲＤＴＹＹＰＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＱＫＧＥＡＷＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号：５）である。
ヒト化抗体Ｈ３Ｌ３の軽鎖可変領域アミノ酸配列は、
ＤＩＶＬＴＱＳＰＡＳＬＡＶＳＰＧＱＲＡＴＩＴＣＲＡＳＥＳＶＤＮＹＧＩＳＦＭＮＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＡＡＳＮＫＡＴＧＶＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＮＩＮＰＭＥＡＮＤＴＡＶＹＦＣＱＱＳＫＥＶＰＷＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号：６）である。
実施例４ ヒト化抗体Ｈ１Ｌ１、Ｈ２Ｌ２及びＨ３Ｌ３のタンパク発現
遺伝子合成手段でヒト化抗体Ｈ１Ｌ１、Ｈ２Ｌ２、Ｈ３Ｌ３をコードするヌクレオチド配列を合成して、発現ベクターに取り込む。発現ベクターのＤＮＡを抽出し、哺乳動物細胞である２９３細胞にトランスフェクトする。トランスフェクション後、抗体が哺乳動物細胞内に発現され、細胞外に分泌された。プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーカラムで、発現された抗体を精製して、ヒト化抗体Ｈ１Ｌ２、Ｈ２Ｌ２、Ｈ３Ｌ３タンパクを得た。
実施例５ １８Ａ１０組み換えヒト化抗体のＥＬＩＳＡ実験
１８Ａ１０ ＤＮＡ配列を取得した後、組み換え手段によりヒト化させ、ヒト化抗体を製造して、対比実験を行う。前記実験について、ＥＬＩＳＡ結合実験と競合ＥＬＩＳＡ実験を含むが、これらに限定されるものではない。
１． １８Ａ１０ Ｈ１Ｌ１、１８Ａ１０ Ｈ２Ｌ２、１８Ａ１０ Ｈ３Ｌ３ ＥＬＩＳＡ結合実験
具体的なステップは、以下のようである。
１）抗原のコーティング
４℃で０．５μｇ／ｍｌであるＰＤ−１−ｍＦｃ抗原（５０μｌ／ウェル）を一晩コーティングするステップ。
２）ブロッキング
３７℃、１％ ＢＳＡ（ＰＢＳで希釈する）で２時間ブロックして、１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含む１×ＰＢＳＴで３回洗浄して、乾燥するように軽く叩くステップ。
３）一次抗体
１μｇ／ｍｌから１：３で希釈して、７つの濃度勾配の抗体溶液を得て、対照組は、ＰＢＳであり、それぞれ３７℃で１時間インキュベートするステップ。
４）二次抗体
ＰＢＳＴで３回洗浄して、乾燥するように軽く叩き、１：５０００で希釈した二次抗体であるＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ−（Ｈ＋Ｌ）を各ウェルに５０μｌずつ入れ、３７℃で１時間インキュベートするステップ。
５）顕色
ＰＢＳＴで３回洗浄して、乾燥するように軽く叩き、ＴＭＢ顕色剤を各ウェルに５０μｌずつ入れ、室温で５〜１０分反応するステップ。
６）顕色完了
５０μｌ／ウェルで２Ｍ Ｈ２ＳＯ４溶液を入れ、顕色反応を完了するステップ。
７）読取り
マイクロプレートリーダーにより、吸光度４５０ｎｍで各ウェルの吸光値を検出するステップ。
結果を図１に示すように、Ｈ１Ｌ１、Ｈ２Ｌ２及びＨ３Ｌ３のＰＤ−１に対するＥＣ５０値は、それぞれ０．１５６ｎＭ、０．１１１ｎＭ及び０．１４４ｎＭである。
図１に示すように、前記３つの抗体Ｈ１Ｌ１、Ｈ２Ｌ２及びＨ３Ｌ３が、ＰＤ−１に対して強い親和性を有する。
２． １８Ａ１０ Ｈ１Ｌ１、１８Ａ１０ Ｈ２Ｌ２、及び１８Ａ１０ Ｈ３Ｌ３とＰＤＬ１競合ＥＬＩＳＡ実験
具体的なステップは、以下のようである。
１）抗原のコーティング
９６ウェルＥＬＩＳＡプレートに、４℃で０．５μｇ／ｍｌであるＰＤ−１−ｍＩｇＧＦｃ抗原（５０μｌ／ウェル）を一晩コーティングするステップ。
２）ブロッキング
ＰＢＳＴでプレートを３回洗浄して、乾燥するように軽く叩き、３７℃、１％ ＢＳＡ（ＰＢＳで希釈する）で２時間ブロックして、１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含む１×ＰＢＳＴで３回洗浄するステップ。
３）一次抗体
３μｇ／ｍｌから１：３で希釈して、７つの濃度勾配の抗体溶液を得て、対照組は、ＰＢＳであり、それぞれ室温で１０分インキュベートするステップ。
４）リガンド
２μｇ／ｍｌのＰＤＬ１−ｍＩｇＧ２ａＦｃ溶液を各ウェルに５０μｌずつを入れ、３７℃で１時間インキュベートするステップ。
５）二次抗体
ＰＢＳＴで３回洗浄して、乾燥するように軽く叩き、１：５０００で希釈した二次抗体であるＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ−（Ｈ＋Ｌ）を各ウェルに５０μｌずつ入れ、３７℃で１時間インキュベートするステップ。
６）顕色
ＰＢＳＴで３回洗浄して、乾燥するように軽く叩き、ＴＭＢ顕色剤を各ウェルに５０μｌずつ入れ、室温で５〜１０分反応するステップ。
７）顕色完了
５０μｌ／ウェルで２Ｍ Ｈ２ＳＯ４溶液を入れ、顕色反応を完了するステップ。
８）読取り
マイクロプレートリーダーにより、吸光度４５０ｎｍで各ウェルの吸光値を検出するステップ。
結果を図２に示すように、Ｈ１Ｌ１、Ｈ２Ｌ２及びＨ３Ｌ３が、ＰｄＬ１と競合してＰＤ−１と結合するＥＣ５０値は、それぞれ０．９９２ｎＭ、０．８３８ｎＭ及び１．１９４ｎＭである。
図２に示すように、前記３つの抗体Ｈ１Ｌ１、Ｈ２Ｌ２及びＨ３Ｌ３が、ＰｄＬ１とＰＤ−１との結合を有効に阻害できる。
３． １８Ａ１０ Ｈ２Ｌ２及びＰＤＬ２の競合ＥＬＩＳＡ実験
具体的なステップは、以下のようである。
１）抗原のコーティング
９６ウェルプレートに、４℃で１．０μｇ／ｍｌであるＰＤ−１−ｈＩｇＧＦｃ抗原（５０μｌ／ウェル）を一晩コーティングするステップ。
２）ブロッキング
ＰＢＳＴで３回洗浄して、乾燥するように軽く叩き、３７℃、１％ ＢＳＡ（ＰＢＳで希釈する）で２時間ブロックして、１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含む１×ＰＢＳＴで４回洗浄するステップ。
３）一次抗体
２０μｇ／ｍｌから１：３で希釈して、７つの濃度勾配の抗体溶液を得て、対照組は、ＰＢＳであり、それぞれ室温で１０分インキュベートするステップ。
４）リガンド
１．０μｇ／ｍｌのＰＤＬ２−ｈｉｓｔａｇ溶液を各ウェルに５０μｌずつを入れ、３７℃で１時間インキュベートするステップ。
５）二次抗体
ＰＢＳＴで５回洗浄して、乾燥するように軽く叩き、１：７５０で希釈した二次抗体であるＨＲＰ標識抗ｈｉｓｔａｇマウスモノクローナル抗体を各ウェルに５０μｌずつ入れ、３７℃で１時間インキュベートするステップ。
６）顕色
ＰＢＳＴで６回洗浄して、乾燥するように軽く叩き、ＴＭＢ顕色剤を各ウェルに５０μｌずつ入れ、室温で３０分反応するステップ。
７）顕色完了
５０μｌ／ウェルで２Ｍ Ｈ２ＳＯ４溶液を入れ、顕色反応を完了するステップ。
８）読取り
マイクロプレートリーダーにより、吸光度４５０ｎｍで各ウェルの吸光値を検出するステップ。
図３に示すように、前記３つの抗体Ｈ２Ｌ２が、ＰｄＬ１とＰＤ−１との結合を有効に阻害できることが分かる。
実施例６
Ｆｏｒｔｅｂｉｏ分子間相互作用解析装置によりＫＦ００７Ｈ１Ｌ１、Ｈ２Ｌ２、Ｈ３Ｌ３の運動特性パラメータを検出する。
ビオチン標識の抗原ＰＤ−１をＳＡセンサーの表面に固定され、ＰＢＳＴと平衡した後、抗体Ｈ１Ｌ１と結合して、Ｈ１Ｌ１：ＰＢＳＴ＝１：３で希釈し（濃度は、２００、６６．６７、２２．２２、７．４１、２．４７、０．８２、０．２７、０ｎＭ）、ＰＢＳＴで解離させる。Ｈ２Ｌ２とＨ３Ｌ３の検出方法は、Ｈ１Ｌ１と同一である。それぞれＨ１Ｌ１、Ｈ２Ｌ２、Ｈ３Ｌ３の運動特性パラメータを表４に示し、検出結果を図４〜６に示す。
実施例７ 抗体Ｈ１Ｌ１、Ｈ２Ｌ２及びＨ３Ｌ３がＴ細胞を刺激してＩＬ−２とＩＦＮｇａｍｍａを分泌することに対する分析
混合リンパ球反応（ＭＬＲ）実験で、抗体Ｈ１Ｌ１、Ｈ２Ｌ２とＨ３Ｌ３がＴリンパ球を刺激してＩＬ−２とＩＦＮｇａｍｍａの分泌能力を検出する。ＭＬＲ実験は、異なるヒトＴ細胞（ＴＣ）とヒト樹状細胞（ＤＣ）とを混合して、ＤＣ細胞の抗原提供能力によりＴ細胞を刺激してＩＬ−２とＩＦＮｇａｍｍａを分泌する。まず、サイトカインＧＭ−ＣＳＦとＩＬ−４で血液における単球を樹状細胞に分化させ、ＴＮＦａで未熟なＤＣ細胞を成熟させる。その後、成熟ＤＣ細胞と同種異系のＴＣ細胞と混合して５日培養した後、細胞上清におけるＩＬ−２とＩＦＮｇａｍｍａの分泌レベルを検出する。
９６ウェルプレートに、ＴＣとＤＣを混合して、ウェルごとに１×１０５ＴＣ細胞と１×１０４ＤＣ細胞を入れ、３つの抗体の濃度（１ｎＭ、１０ｎＭと１００ｎＭ）で、５日培養した後、ＩＬ−２アッセイキットで上清におけるＩＬ−２の含量を検出し、ＩＦＮｇａｍｍａアッセイキットでＩＦＮｇａｍｍａの含量を検出する。
図７に、抗体Ｈ１Ｌ１、Ｈ２Ｌ２及びＨ３Ｌ３がＴ細胞を刺激してＩＬ−２とＩＦＮｇａｍｍａを分泌するレベルを示す。図７に示すように、抗体Ｈ１Ｌ１、Ｈ２Ｌ２及びＨ３Ｌ３がＴ細胞を刺激してＩＬ−２とＩＦＮｇａｍｍａを有効に分泌し、かつ用量依存的な関係を呈する。
実施例８ 抗体Ｈ１Ｌ１、Ｈ２Ｌ２及びＨ３Ｌ３とＰＤ−１との結合のＥＣ５０に対する分析
フローサイトメトリーにより抗体Ｈ１Ｌ１、Ｈ２Ｌ２及びＨ３Ｌ３が、ＰＤ−１を安定的に発現する細胞（ＢＢ００７細胞と名付ける）の表面抗原の結合活性を検出する。通常なトリプシン消化法によりＢＢ００７細胞を取得して、ＰＢＳで１回洗浄して、複数なチューブに分けられ、チューブごとに２×１０５個細胞を有する。ＰＢＳ（１％ＢＳＡ）でそれぞれ濃度２０ｎＭ、１０ｎＭ、５ｎＭ、１ｎＭ、０．１ｎＭ、０ｎＭのＨ１Ｌ１、Ｈ２Ｌ２及びＨ３Ｌ３の抗体希釈液を調製して、各濃度の総体積は、１００μｌであり、氷上で細胞を１時間インキュベートする、ＰＢＳで１回洗浄して、各チューブに１００μｌ ＦＩＴＣ−Ｇｏａｔ−Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ（１：５００）を入れ、氷上で１時間インキュベートして、その後、各チューブに３００μｌ ＰＢＳを入れ、フローサイトメーターでＦＩＴＣチャンネルを利用して蛍光シグナルを検出する。
それぞれＨ１Ｌ１、Ｈ２Ｌ２、Ｈ３Ｌ３抗体とＢＢ００７細胞との結合を図７に示す。図８に示すように、Ｈ１Ｌ１、Ｈ２Ｌ２及びＨ３Ｌ３抗体が、ＢＢ００７細胞表面のターゲットタンパク質であるＰＤ−１と有効に結合でき、かつその結合効率が、用量依存的な関係を呈することが分かる。
結合後のＨ１Ｌ１、Ｈ２Ｌ２、Ｈ３Ｌ３抗体に対して蛍光定量分析を行い、曲線模擬によりＨ１Ｌ１、Ｈ２Ｌ２、Ｈ３Ｌ３のＥＣ５０（結合効率を示す）は、それぞれ３．３８ｎＭ、１．５９ｎＭ、１．６８ｎＭ（図９）である。
本願の明細書の説明において、「１つの実施例」、「いくつかの実施例」、「例示」、「具体的な例示」または「いくつかの例示」などの用語は、該当実施例または例示を結合しながら説明した具体的な特徴、構成、材料または特性が本願の少なくとも１つの実施例または例示に含まれることを意味する。本明細書において、前記用語の概要な表現は、同一の実施例または例示を対象とする必要がない。かつ、説明した具体的な特徴、構成、材料または特性が任意の１つまたは複数の実施例または例示に適当な手段で結合されることができる。また、互いに矛盾しない場合、当業者が本明細書に記載の異なる実施例または例示及び異なる実施例または例示における特徴を結合することや組み合わせることができる。
本発明の実施例は、上記内容に開示・説明されているが、上記実施例は、例示として挙げられ、それに限定されるものではない、当業者が本発明の範囲で、様々な変化、修正、取り替え及び変形を行うことができる。
本発明の具体的な実施例によれば、前記ポリヌクレオチドが、配列番号：１に示すアミノ酸配列（即ち、Ｈ１Ｌ１の重鎖可変領域のアミノ酸配列）をコードする配列番号：７に示すヌクレオチド配列またはその相補配列を有する。
ＧＡＡＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＣＡＧＡＧＣＧＧＡＧＧＧＧＧＡＣＴＧＧＴＧＣＡＧＣＣＣＧＧＣＧＧＧＴＣＴＣＴＧＡＡＧＣＴＧＡＧＴＴＧＣＧＣＣＧＣＴＴＣＡＧＧＡＴＴＣＡＣＴＴＴＴＡＧＣＴＣＣＴＡＣＧＧＣＡＴＧＴＣＣＴＧＧＧＴＧＣＧＡＣＡＧＡＣＣＣＣＣＧＡＧＡＡＡＧＧＧＣＴＧＧＡＣＴＧＧＧＴＣＧＣＴＡＣＣＡＴＣＴＣＴＧＧＡＧＧＣＧＧＧＡＧＡＧＡＣＡＣＡＴＡＣＴＡＴＣＣＴＧＡＴＡＧＴＧＴＣＡＡＧＧＧＣＣＧＧＴＴＣＡＣＡＡＴＴＡＧＣＡＧＡＧＡＣＡＡＣＴＣＣＡＡＡＡＡＣＡＡＴＣＴＧＴＡＴＣＴＧＣＡＧＡＴＧＡＡＴＡＧＣＣＴＧＡＧＧＧＣＡＧＡＡＧＡＴＡＣＣＧＣＣＣＴＧＴＡＣＴＡＴＴＧＴＧＣＣＣＧＣＣＡＧＡＡＡＧＧＡＧＡＧＧＣＴＴＧＧＴＴＴＧＣＡＴＡＣＴＧＧＧＧＡＣＡＧＧＧＧＡＣＡＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＡＧＣＡＧＣ（配列番号：７）。
本発明の具体的な実施例によれば、前記ポリヌクレオチドが配列番号：３に示すアミノ酸配列（即ち、Ｈ２Ｌ２の重鎖可変領域のアミノ酸配列）をコードする配列番号：８に示すヌクレオチド配列またはその相補配列を有する。
ＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＣＡＧＴＣＴＧＧＣＧＧＣＧＧＡＣＴＧＧＴＧＣＡＧＣＣＣＧＧＣＧＧＧＴＣＡＣＴＧＡＡＧＣＴＧＡＧＣＴＧＣＧＣＣＧＣＴＴＣＣＧＧＣＴＴＣＡＣＣＴＴＴＡＧＣＴＣＣＴＡＣＧＧＡＡＴＧＴＣＣＴＧＧＧＴＧＣＧＡＣＡＧＧＣＡＣＣＣＧＧＧＡＡＧＧＧＧＣＴＧＧＡＣＴＧＧＧＴＣＧＣＴＡＣＴＡＴＣＴＣＡＧＧＡＧＧＣＧＧＧＡＧＡＧＡＣＡＣＣＴＡＣＴＡＴＣＣＴＧＡＴＡＧＣＧＴＣＡＡＧＧＧＣＣＧＧＴＴＣＡＣＡＡＴＴＡＧＣＣＧＧＧＡＣＡＡＣＡＧＣＡＡＧＡＡＣＡＡＴＣＴＧＴＡＣＣＴＧＣＡＧＡＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＡＧＧＧＣＴＧＡＧＧＡＴＡＣＴＧＣＡＣＴＧＴＡＣＴＡＴＴＧＴＧＣＣＣＧＣＣＡＧＡＡＧＧＧＣＧＡＡＧＣＡＴＧＧＴＴＴＧＣＣＴＡＴＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＡＡＣＣＣＴＧＧＴＧＡＣＡＧＴＣＴＣＴＡＧＴ（配列番号：８）。
本発明の具体的な実施例によれば、前記ポリヌクレオチドが配列番号：５に示すアミノ酸配列（即ち、Ｈ３Ｌ３の重鎖可変領域のアミノ酸配列）をコードする配列番号：９に示すヌクレオチド配列またはその相補配列を有する。
ＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＣＡＧＡＧＴＧＧＡＧＧＣＧＧＧＣＴＧＧＴＧＣＡＧＣＣＣＧＧＣＧＧＧＴＣＡＣＴＧＡＡＧＣＴＧＡＧＣＴＧＣＧＣＣＧＣＴＴＣＣＧＧＣＴＴＣＡＣＣＴＴＴＡＧＣＴＣＣＴＡＣＧＧＡＡＴＧＴＣＣＴＧＧＧＴＧＣＧＡＣＡＧＧＣＡＣＣＣＧＧＧＡＡＧＧＧＧＣＴＧＧＡＣＴＧＧＧＴＣＧＣＴＡＣＴＡＴＣＴＣＡＧＧＡＧＧＣＧＧＧＡＧＡＧＡＣＡＣＣＴＡＣＴＡＴＣＣＴＧＡＴＡＧＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＣＧＧＴＴＣＡＣＡＡＴＴＡＧＣＣＧＧＧＡＣＡＡＣＡＧＣＡＡＧＡＡＣＡＣＴＣＴＧＴＡＣＣＴＧＣＡＧＡＴＧＡＡＣＴＣＴＣＴＧＡＧＧＧＣＴＧＡＧＧＡＴＡＣＡＧＣＡＧＴＣＴＡＣＴＡＴＴＧＴＧＣＣＣＧＣＣＡＧＡＡＧＧＧＣＧＡＡＧＣＡＴＧＧＴＴＴＧＣＣＴＡＴＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＡＡＣＣＣＴＧＧＴＧＡＣＡＧＴＣＴＣＴＡＧＴ（配列番号：９）。
本発明の具体的な実施例によれば、前記ポリヌクレオチドが配列番号：２に示すアミノ酸配列（即ち、Ｈ１Ｌ１の軽鎖可変領域のアミノ酸配列）をコードする配列番号：１０に示すヌクレオチド配列またはその相補配列を有する。
ＧＡＴＡＴＴＧＴＧＣＴＧＡＣＴＣＡＧＡＧＣＣＣＴＧＣＴＴＣＣＣＴＧＧＣＣＧＴＧＴＣＴＣＣＡＧＧＡＣＡＧＣＧＡＧＣＴＡＣＣＡＴＣＡＣＡＴＧＣＡＧＡＧＣＡＴＣＴＧＡＧＡＧＴＧＴＧＧＡＣＡＡＣＴＡＣＧＧＡＡＴＴＡＧＴＴＴＣＡＴＧＡＡＴＴＧＧＴＴＴＣＡＧＣＡＧＡＡＧＣＣＣＧＧＣＣＡＧＣＣＣＣＣＴＡＡＡＣＴＧＣＴＧＡＴＣＴＡＴＧＣＣＧＣＴＡＧＣＡＡＣＡＡＧＧＧＣＡＣＣＧＧＧＧＴＧＣＣＴＧＣＴＣＧＡＴＴＣＴＣＡＧＧＡＡＧＣＧＧＣＴＣＣＧＧＧＡＣＡＧＡＣＴＴＴＡＣＴＣＴＧＡＡＣＡＴＴＣＡＣＣＣＡＡＴＧＧＡＧＧＡＡＡＡＴＧＡＴＡＣＡＧＣＡＡＴＧＴＡＣＴＴＣＴＧＣＣＡＧＣＡＧＡＧＣＡＡＧＧＡＧＧＴＧＣＣＣＴＧＧＡＣＣＴＴＴＧＧＣＧＧＧＧＧＡＡＣＡＡＡＧＣＴＧＧＡＡＡＴＣＡＡＡ（配列番号：１０）。
本発明の具体的な実施例によれば、前記ポリヌクレオチドが配列番号：４に示すアミノ酸配列（即ち、Ｈ２Ｌ２の軽鎖可変領域のアミノ酸配列）をコードする配列番号：１１に示すヌクレオチド配列またはその相補配列を有する。
ＧＡＴＡＴＴＧＴＧＣＴＧＡＣＴＣＡＧＡＧＣＣＣＴＧＣＴＴＣＣＣＴＧＧＣＣＧＴＧＴＣＴＣＣＡＧＧＡＣＡＧＣＧＡＧＣＴＡＣＣＡＴＣＡＣＡＴＧＣＡＧＡＧＣＡＴＣＴＧＡＧＡＧＴＧＴＧＧＡＣＡＡＣＴＡＣＧＧＡＡＴＴＡＧＴＴＴＣＡＴＧＡＡＴＴＧＧＴＴＴＣＡＧＣＡＧＡＡＧＣＣＣＧＧＣＣＡＧＣＣＣＣＣＴＡＡＡＣＴＧＣＴＧＡＴＣＴＡＴＧＣＣＧＣＴＡＧＣＡＡＣＡＡＧＧＧＣＡＣＣＧＧＧＧＴＧＣＣＴＧＣＴＣＧＡＴＴＣＴＣＡＧＧＡＡＧＣＧＧＣＴＣＣＧＧＧＡＣＡＧＡＣＴＴＴＡＣＴＣＴＧＡＡＣＡＴＴＡＡＣＣＣＡＡＴＧＧＡＧＧＡＡＡＡＴＧＡＴＡＣＡＧＣＡＡＴＧＴＡＣＴＴＣＴＧＣＣＡＧＣＡＧＡＧＣＡＡＧＧＡＧＧＴＧＣＣＣＴＧＧＡＣＣＴＴＴＧＧＣＧＧＧＧＧＡＡＣＡＡＡＧＣＴＧＧＡＡＡＴＣＡＡＡ（配列番号：１１）。
本発明の具体的な実施例によれば、前記ポリヌクレオチドが配列番号：６に示すアミノ酸配列（即ち、Ｈ３Ｌ３の軽鎖可変領域のアミノ酸配列）をコードする配列番号：１２に示すヌクレオチド配列またはその相補配列を有する。
ＧＡＣＡＴＣＧＴＣＣＴＧＡＣＴＣＡＧＡＧＣＣＣＴＧＣＴＴＣＣＣＴＧＧＣＣＧＴＧＡＧＣＣＣＡＧＧＣＣＡＧＣＧＡＧＣＡＡＣＣＡＴＣＡＣＡＴＧＣＡＧＡＧＣＣＴＣＡＧＡＧＡＧＣＧＴＧＧＡＣＡＡＣＴＡＣＧＧＣＡＴＴＡＧＣＴＴＣＡＴＧＡＡＴＴＧＧＴＡＴＣＡＧＣＡＧＡＡＧＣＣＣＧＧＧＣＡＧＣＣＴＣＣＣＡＡＧＣＴＧＣＴＧＡＴＣＴＡＣＧＣＣＧＣＴＴＣＣＡＡＣＡＡＧＧＣＣＡＣＴＧＧＧＧＴＧＣＣＴＧＣＴＣＧＡＴＴＣＴＣＣＧＧＣＴＣＴＧＧＧＡＧＴＧＧＡＡＣＡＧＡＣＴＴＴＡＣＴＣＴＧＡＡＣＡＴＴＡＡＴＣＣＡＡＴＧＧＡＡＧＣＴＡＡＴＧＡＴＡＣＡＧＣＡＧＴＧＴＡＴＴＴＣＴＧＣＣＡＧＣＡＧＡＧＣＡＡＧＧＡＧＧＴＣＣＣＡＴＧＧＡＣＣＴＴＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＡＣＣＡＡＧＣＴＧＧＡＧＡＴＣＡＡＧ（配列番号：１２）。
具体的なステップは、以下のようである。
１）抗原のコーティング
４℃で、ＥＬＩＳＡプレートに１μｇ／ｍｌであるＰＤ−１−ｈＦｃ抗原（５０μｌ／ウェル）を一晩コーティングするステップ。
２）ブロッキング
３７℃、１％ ＢＳＡ（ＰＢＳで希釈する）で２時間ブロックして、１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含む１×ＰＢＳＴで３回洗浄して、乾燥するように軽く叩くステップ。
３）一次抗体のインキュベート
１μｇ／ｍｌから１：３で希釈して、７つの濃度勾配の抗体溶液を得て、対照組は、ＰＢＳであり、それぞれ３７℃で１時間インキュベートするステップ。
４）二次抗体のインキュベート
ＰＢＳＴで３回洗浄して、乾燥するように軽く叩き、１：５０００で希釈したＨＲＰ標識ヤギ抗マウスｌｇＧ（Ｈ＋Ｌ）を各ウェルに５０μｌずつ入れ、３７℃で１時間インキュベートするステップ。
５）顕色
ＰＢＳＴで３回洗浄して、乾燥するように軽く叩き、ＴＭＢ顕色剤を各ウェルに５０μｌずつ入れ、室温で５〜１０分反応するステップ。
６）顕色完了
５０μｌ／ウェルで２Ｍ Ｈ２ＳＯ４溶液を入れ、顕色反応を完了するステップ。
７）読取り
マイクロプレートリーダーにより、吸光度４５０ｎｍで各ウェルの吸光値を検出するステップ。
具体的なステップは、以下のようである。
１）抗原のコーティング
９６ウェルＥＬＩＳＡプレートに、４℃で０．５μｇ／ｍｌであるＰＤ−１−ｍＩｇＧＦｃ抗原（５０μｌ／ウェル）を一晩コーティングするステップ。
２）ブロッキング
ＰＢＳＴでプレートを３回洗浄して、乾燥するように軽く叩き、３７℃、１％ ＢＳＡ（ＰＢＳで希釈する）で２時間ブロックして、１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含む１×ＰＢＳＴで３回洗浄するステップ。
３）一次抗体のインキュベート
３μｇ／ｍｌから１：３で希釈して、７つの濃度勾配の抗体溶液を得て、対照組は、ＰＢＳであり、それぞれ室温で１０分インキュベートするステップ。
４）リガンド
２μｇ／ｍｌのＰＤＬ１−ｈＩｇＧ１Ｆｃ溶液を各ウェルに５０μｌずつを入れ、３７℃で１時間インキュベートするステップ。
５）二次抗体のインキュベート
ＰＢＳＴで３回洗浄して、乾燥するように軽く叩き、１：５０００で希釈した二次抗体であるＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ−（Ｈ＋Ｌ）を各ウェルに５０μｌずつ入れ、３７℃で１時間インキュベートするステップ。
６）顕色
ＰＢＳＴで３回洗浄して、乾燥するように軽く叩き、ＴＭＢ顕色剤を各ウェルに５０μｌずつ入れ、室温で５〜１０分反応するステップ。
７）顕色完了
５０μｌ／ウェルで２Ｍ Ｈ２ＳＯ４溶液を入れ、顕色反応を完了するステップ。
８）読取り
マイクロプレートリーダーにより、吸光度４５０ｎｍで各ウェルの吸光値を検出するステップ。
検出結果に基づいて、ＰＤ−１ １８Ａ１０ハイブリドーマ細胞株を選別して、それが分泌するモノクローナル抗体は、１８Ａ１０と名付ける。
実施例２ ハイブリドーマ細胞株ｃＤＮＡ配列の取得
１．細胞／細菌トータルＲＮＡ抽出キットの取扱書（Ｔｉａｎｇｅｎ、製番ＤＰ４３０）に従って、１８Ａ１０ハイブリドーマ細胞株からｍＲＮＡを抽出する。
２．Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩＩ Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ＲＴ−ＰＣＲキットの取扱書に従って、一本鎖を合成して、ＰＣＲ増幅を行う。
３．ｐＥＡＳＹ−Ｔ１ クローニングキット（Ｔｉａｎｇｅｎ、製番ＣＴ１０１）の取扱書に従って、ＴＡクローニングを行う。
４．Ｍ１３ユニバーサルプライマーを利用してＰＣＲ法によって検出して、陽性クローンを選んでシーケンシングする。
５．シーケンシング結果をアライメントして、正確なｃＤＮＡ配列を取得する。
１． １８Ａ１０ Ｈ１Ｌ１、１８Ａ１０ Ｈ２Ｌ２、１８Ａ１０ Ｈ３Ｌ３ ＥＬＩＳＡ結合実験
具体的なステップは、以下のようである。
１）抗原のコーティング
４℃で０．５μｇ／ｍｌであるＰＤ−１−ｍＦｃ抗原（５０μｌ／ウェル）を一晩コーティングするステップ。
２）ブロッキング
３７℃、１％ ＢＳＡ（ＰＢＳで希釈する）で２時間ブロックして、１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含む１×ＰＢＳＴで３回洗浄して、乾燥するように軽く叩くステップ。
３）一次抗体のインキュベート
１μｇ／ｍｌから１：３で希釈して、７つの濃度勾配の抗体溶液を得て、対照組は、ＰＢＳであり、それぞれ３７℃で１時間インキュベートするステップ。
４）二次抗体のインキュベート
ＰＢＳＴで３回洗浄して、乾燥するように軽く叩き、１：５０００で希釈した二次抗体であるＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ−（Ｈ＋Ｌ）を各ウェルに５０μｌずつ入れ、３７℃で１時間インキュベートするステップ。
５）顕色
ＰＢＳＴで３回洗浄して、乾燥するように軽く叩き、ＴＭＢ顕色剤を各ウェルに５０μｌずつ入れ、室温で５〜１０分反応するステップ。
６）顕色完了
５０μｌ／ウェルで２Ｍ Ｈ２ＳＯ４溶液を入れ、顕色反応を完了するステップ。
７）読取り
マイクロプレートリーダーにより、吸光度４５０ｎｍで各ウェルの吸光値を検出するステップ。
結果を図１に示すように、Ｈ１Ｌ１、Ｈ２Ｌ２及びＨ３Ｌ３のＰＤ−１に対するＥＣ５０値は、それぞれ０．１５６ｎＭ、０．１１１ｎＭ及び０．１４４ｎＭである。
図１に示すように、前記３つの抗体Ｈ１Ｌ１、Ｈ２Ｌ２及びＨ３Ｌ３が、ＰＤ−１に対して強い親和性を有する。
２． １８Ａ１０ Ｈ１Ｌ１、１８Ａ１０ Ｈ２Ｌ２、及び１８Ａ１０ Ｈ３Ｌ３とＰＤＬ１競合ＥＬＩＳＡ実験
具体的なステップは、以下のようである。
１）抗原のコーティング
９６ウェルＥＬＩＳＡプレートに、４℃で０．５μｇ／ｍｌであるＰＤ−１−ｍＩｇＧＦｃ抗原（５０μｌ／ウェル）を一晩コーティングするステップ。
２）ブロッキング
ＰＢＳＴでプレートを３回洗浄して、乾燥するように軽く叩き、３７℃、１％ ＢＳＡ（ＰＢＳで希釈する）で２時間ブロックして、１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含む１×ＰＢＳＴで３回洗浄するステップ。
３）一次抗体のインキュベート
３μｇ／ｍｌから１：３で希釈して、７つの濃度勾配の抗体溶液を得て、対照組は、ＰＢＳであり、それぞれ室温で１０分インキュベートするステップ。
４）リガンド
２μｇ／ｍｌのＰＤＬ１−ｍＩｇＧ２ａＦｃ溶液を各ウェルに５０μｌずつを入れ、３７℃で１時間インキュベートするステップ。
５）二次抗体のインキュベート
ＰＢＳＴで３回洗浄して、乾燥するように軽く叩き、１：５０００で希釈した二次抗体であるＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ−（Ｈ＋Ｌ）を各ウェルに５０μｌずつ入れ、３７℃で１時間インキュベートするステップ。
６）顕色
ＰＢＳＴで３回洗浄して、乾燥するように軽く叩き、ＴＭＢ顕色剤を各ウェルに５０μｌずつ入れ、室温で５〜１０分反応するステップ。
７）顕色完了
５０μｌ／ウェルで２Ｍ Ｈ２ＳＯ４溶液を入れ、顕色反応を完了するステップ。
８）読取り
マイクロプレートリーダーにより、吸光度４５０ｎｍで各ウェルの吸光値を検出するステップ。
結果を図２に示すように、Ｈ１Ｌ１、Ｈ２Ｌ２及びＨ３Ｌ３が、ＰｄＬ１と競合してＰＤ−１と結合するＥＣ５０値は、それぞれ０．９９２ｎＭ、０．８３８ｎＭ及び１．１９４ｎＭである。
図２に示すように、前記３つの抗体Ｈ１Ｌ１、Ｈ２Ｌ２及びＨ３Ｌ３が、ＰｄＬ１とＰＤ−１との結合を有効に阻害できる。
３． １８Ａ１０ Ｈ２Ｌ２及びＰＤＬ２の競合ＥＬＩＳＡ実験
具体的なステップは、以下のようである。
１）抗原のコーティング
９６ウェルプレートに、４℃で１．０μｇ／ｍｌであるＰＤ−１−ｈＩｇＧＦｃ抗原（５０μｌ／ウェル）を一晩コーティングするステップ。
２）ブロッキング
ＰＢＳＴで３回洗浄して、乾燥するように軽く叩き、３７℃、１％ ＢＳＡ（ＰＢＳで希釈する）で２時間ブロックして、１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含む１×ＰＢＳＴで４回洗浄するステップ。
３）一次抗体のインキュベート
２０μｇ／ｍｌから１：３で希釈して、７つの濃度勾配の抗体溶液を得て、対照組は、ＰＢＳであり、それぞれ室温で１０分インキュベートするステップ。
４）リガンド
１．０μｇ／ｍｌのＰＤＬ２−ｈｉｓｔａｇ溶液を各ウェルに５０μｌずつを入れ、３７℃で１時間インキュベートするステップ。
５）二次抗体のインキュベート
ＰＢＳＴで５回洗浄して、乾燥するように軽く叩き、１：７５０で希釈した二次抗体であるＨＲＰ標識抗ｈｉｓｔａｇマウスモノクローナル抗体を各ウェルに５０μｌずつ入れ、３７℃で１時間インキュベートするステップ。
６）顕色
ＰＢＳＴで６回洗浄して、乾燥するように軽く叩き、ＴＭＢ顕色剤を各ウェルに５０μｌずつ入れ、室温で３０分反応するステップ。
７）顕色完了
５０μｌ／ウェルで２Ｍ Ｈ２ＳＯ４溶液を入れ、顕色反応を完了するステップ。
８）読取り
マイクロプレートリーダーにより、吸光度４５０ｎｍで各ウェルの吸光値を検出するステップ。
図３に示すように、前記抗体Ｈ２Ｌ２が、ＰｄＬ１とＰＤ−１との結合を有効に阻害できることが分かる。
実施例６
Ｆｏｒｔｅｂｉｏ分子間相互作用解析装置によりＨ１Ｌ１、Ｈ２Ｌ２、Ｈ３Ｌ３の運動特性パラメータを検出する。
ビオチン標識の抗原ＰＤ−１をＳＡセンサーの表面に固定され、ＰＢＳＴと平衡した後、抗体Ｈ１Ｌ１と結合して、Ｈ１Ｌ１：ＰＢＳＴ＝１：３で希釈し（濃度は、２００、６６．６７、２２．２２、７．４１、２．４７、０．８２、０．２７、０ｎＭ）、ＰＢＳＴで解離させる。Ｈ２Ｌ２とＨ３Ｌ３の検出方法は、Ｈ１Ｌ１と同一である。それぞれＨ１Ｌ１、Ｈ２Ｌ２、Ｈ３Ｌ３の運動特性パラメータを表４に示し、検出結果を図４〜６に示す。
それぞれＨ１Ｌ１、Ｈ２Ｌ２、Ｈ３Ｌ３抗体とＢＢ００７細胞との結合を表５に示す。図８に示すように、Ｈ１Ｌ１、Ｈ２Ｌ２及びＨ３Ｌ３抗体が、ＢＢ００７細胞表面のターゲットタンパク質であるＰＤ−１と有効に結合でき、かつその結合効率が、用量依存的な関係を呈することが分かる。

Claims (23)

  1. 抗ＰＤ−１のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片であって、
    （１）配列番号：１に示すアミノ酸配列、
    （２）配列番号：３に示すアミノ酸配列、
    （３）配列番号：５に示すアミノ酸配列、及び
    （４）（１）〜（３）と比べて、少なくとも１つの保守的アミノ酸突然変異を有するアミノ酸配列、
    から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む、
    ことを特徴とするモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
  2. 前記抗ＰＤ−１のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片は、
    （５）配列番号：２に示すアミノ酸配列、
    （６）配列番号：４に示すアミノ酸配列、
    （７）配列番号：６に示すアミノ酸配列、及び
    （８）（５）〜（７）と比べて、少なくとも１つの保守的アミノ酸突然変異を有するアミノ酸配列、
    から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を更に含む、
    ことを特徴とする請求項１に記載の抗体またはその抗原結合断片。
  3. 前記抗ＰＤ−１のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片は、
    配列番号：１に示すアミノ酸配列を有する重鎖可変領域及び配列番号：２に示すアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、
    配列番号：３に示すアミノ酸配列を有する重鎖可変領域及び配列番号：４に示すアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、及び
    配列番号：５に示すアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と配列番号：６に示すアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、
    から選択される１つを含む、
    ことを特徴とする請求項１または２に記載の抗体またはその抗原結合断片。
  4. 前記抗体は、モノクローナル抗体である、
    ことを特徴とする請求項１に記載の抗体またはその抗原結合断片。
  5. 前記抗ＰＤ−１のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片が、
    ＰＤ−１と特異的、効率的に結合でき、かつＴ細胞の活性化と増殖を促進し、サイトカインの発現と分泌を調節し、または抗腫瘍細胞を刺激してより強い免疫応答を生成することに用いられる、
    ことを特徴とする請求項１に記載の抗体またはその抗原結合断片。
  6. 単離ポリヌクレオチドであって、
    請求項１〜５のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片をコードする、
    ことを特徴とする単離ポリヌクレオチド。
  7. 前記ポリヌクレオチドは、
    配列番号：７に示すヌクレオチド配列またはその相補配列、
    配列番号：８に示すヌクレオチド配列またはその相補配列、
    配列番号：９に示すヌクレオチド配列またはその相補配列、
    配列番号：１０に示すヌクレオチド配列またはその相補配列、
    配列番号：１１に示すヌクレオチド配列またはその相補配列、及び
    配列番号：１２に示すヌクレオチド配列またはその相補配列、
    から選択される少なくとも１つを含む、
    ことを特徴とする請求項６に記載のポリヌクレオチド。
  8. 発現ベクターであって、
    請求項６または７に記載のポリヌクレオチドを含む、
    ことを特徴とする発現ベクター。
  9. 前記発現ベクターは、
    宿主細胞における前記ポリヌクレオチドの発現を制御するように、前記ポリヌクレオチドと操作可能に連結する制御要素を更に含む、
    ことを特徴とする請求項８に記載の発現ベクター。
  10. 前記宿主細胞は、哺乳動物細胞である、
    ことを特徴とする請求項９に記載の発現ベクター。
  11. 前記哺乳動物細胞は、ヒト腎上皮細胞系細胞である、
    ことを特徴とする請求項１０に記載の発現ベクター。
  12. 前記ヒト腎上皮細胞系細胞は、２９３Ｔ細胞である、
    ことを特徴とする請求項１１に記載の発現ベクター。
  13. 前記制御要素は、
    プロモーター、エンハンサー、及びターミネーターから選択される少なくとも１つを含み、
    任意的に、前記プロモーターは、ＣＭＶプロモーターであり、前記エンハンサーは、初期ＣＭＶエンハンサーであり、前記ターミネーターは、ＳＶ ｐｏｌｙＡターミネーターである、
    ことを特徴とする請求項９に記載の発現ベクター。
  14. 組み換え細胞であって、
    請求項８〜１３のいずれかに記載の発現ベクターを含む、
    ことを特徴とする組み換え細胞。
  15. 請求項１〜５のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片の製造方法であって、
    請求項１４に記載の組み換え細胞を培養するステップを含む、
    ことを特徴とする抗体またはその抗原結合断片の製造方法。
  16. 請求項６または７に記載のポリヌクレオチド、請求項８〜１３のいずれかに記載の発現ベクター、または請求項１４に記載の組み換え細胞の抗体またはその抗原結合断片の製造における使用であって、
    前記抗体がＰＤ−１と特異的に結合する、
    ことを特徴とする使用。
  17. ハイブリドーマであって、
    中国典型培養物保蔵センター（ＣＣＴＣＣ）に寄託され、寄託番号は、Ｃ２０１６６７であり、寄託日付は、２０１６年４月１日である、
    ことを特徴とするハイブリドーマ。
  18. 請求項１７に記載のハイブリドーマのモノクローナル抗体の製造における使用。
  19. 請求項１〜５のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片、請求項６または７に記載のポリヌクレオチド、請求項８〜１３のいずれかに記載の発現ベクター、請求項１４に記載の組み換え細胞または請求項１７に記載のハイブリドーマの医薬の製造における使用であって、
    前記医薬が、Ｔ細胞の活性化と増殖を促進し、サイトカインの発現と分泌を調節し、または抗腫瘍細胞を刺激してより強い免疫応答を生成することに用いられる、
    ことを特徴とする使用。
  20. 医薬組成物であって、
    請求項１〜５のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片、
    請求項６または７に記載のポリヌクレオチド、
    請求項８〜１３のいずれかに記載の発現ベクター、
    請求項１４に記載の組み換え細胞、または
    請求項１７に記載のハイブリドーマを含む、
    ことを特徴とする医薬組成物。
  21. ＰＤ−１と結合できる医薬の検出方法であって、
    前記方法は、
    検出対象である医薬が存在する場合、請求項１〜５のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片と抗原を接触させ、かつ前記抗体またはその抗原結合断片と前記抗原との第１の結合量を決定して、前記抗原は、ＰＤ−１またはその断片であるステップ、及び
    検出対象である医薬が存在しない場合、請求項１〜５のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片と抗原を接触させ、かつ前記抗体またはその抗原結合断片と前記抗原との第２の結合量を決定して、前記抗原は、ＰＤ−１またはその断片であるステップを含み、
    ただし、前記第２の結合量が前記第１の結合量より多いことは、前記検出対象である医薬がＰＤ−１と結合できる合図である、
    ことを特徴とする検出方法。
  22. 混合薬であって、
    （１）請求項１〜５のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片、請求項６または７に記載のポリヌクレオチド、請求項８〜１３のいずれかに記載の発現ベクター、請求項１４に記載の組み換え細胞、または請求項１７に記載のハイブリドーマと、
    （２）（１）と異なる免疫強化剤と、を含む、
    ことを特徴とする混合薬。
  23. 前記（１）と異なる免疫強化剤は、
    抗ＣＴＬＡ−４抗体、抗ＣＤ４０抗体、ブデソニド及びサリチル酸塩からなる群から選択される少なくとも１つを含み、
    任意的に、前記サリチル酸塩は、スルファサラジン、オルサラジン、バルサラジド及びメサラジンから選択される少なくとも１つを含む、
    ことを特徴とする請求項１６に記載の混合薬。
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