ES2906650T3 - Anticuerpo monoclonal anti-PD-1 - Google Patents
Anticuerpo monoclonal anti-PD-1 Download PDFInfo
- Publication number
- ES2906650T3 ES2906650T3 ES16896573T ES16896573T ES2906650T3 ES 2906650 T3 ES2906650 T3 ES 2906650T3 ES 16896573 T ES16896573 T ES 16896573T ES 16896573 T ES16896573 T ES 16896573T ES 2906650 T3 ES2906650 T3 ES 2906650T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- antigen
- antibody
- binding fragment
- seq
- binding
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 72
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 72
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 72
- 101100519207 Mus musculus Pdcd1 gene Proteins 0.000 claims abstract description 63
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 44
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 27
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 44
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 25
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 25
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 25
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 16
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 16
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 15
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 14
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 14
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 claims description 8
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 claims description 7
- 108010021064 CTLA-4 Antigen Proteins 0.000 claims description 6
- 102000008203 CTLA-4 Antigen Human genes 0.000 claims description 6
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 5
- 230000028327 secretion Effects 0.000 claims description 5
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 claims description 4
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 claims description 4
- 230000004913 activation Effects 0.000 claims description 4
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 claims description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 4
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 4
- YGSDEFSMJLZEOE-UHFFFAOYSA-M salicylate Chemical compound OC1=CC=CC=C1C([O-])=O YGSDEFSMJLZEOE-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 4
- 229960001860 salicylate Drugs 0.000 claims description 4
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 claims description 3
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 claims description 3
- VOVIALXJUBGFJZ-KWVAZRHASA-N Budesonide Chemical compound C1CC2=CC(=O)C=C[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1C[C@H]3OC(CCC)O[C@@]3(C(=O)CO)[C@@]1(C)C[C@@H]2O VOVIALXJUBGFJZ-KWVAZRHASA-N 0.000 claims description 2
- UETNIIAIRMUTSM-UHFFFAOYSA-N Jacareubin Natural products CC1(C)OC2=CC3Oc4c(O)c(O)ccc4C(=O)C3C(=C2C=C1)O UETNIIAIRMUTSM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229960004168 balsalazide Drugs 0.000 claims description 2
- IPOKCKJONYRRHP-FMQUCBEESA-N balsalazide Chemical compound C1=CC(C(=O)NCCC(=O)O)=CC=C1\N=N\C1=CC=C(O)C(C(O)=O)=C1 IPOKCKJONYRRHP-FMQUCBEESA-N 0.000 claims description 2
- 229960004436 budesonide Drugs 0.000 claims description 2
- KBOPZPXVLCULAV-UHFFFAOYSA-N mesalamine Chemical compound NC1=CC=C(O)C(C(O)=O)=C1 KBOPZPXVLCULAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229960004963 mesalazine Drugs 0.000 claims description 2
- 229960004110 olsalazine Drugs 0.000 claims description 2
- QQBDLJCYGRGAKP-FOCLMDBBSA-N olsalazine Chemical compound C1=C(O)C(C(=O)O)=CC(\N=N\C=2C=C(C(O)=CC=2)C(O)=O)=C1 QQBDLJCYGRGAKP-FOCLMDBBSA-N 0.000 claims description 2
- 229960001940 sulfasalazine Drugs 0.000 claims description 2
- NCEXYHBECQHGNR-QZQOTICOSA-N sulfasalazine Chemical compound C1=C(O)C(C(=O)O)=CC(\N=N\C=2C=CC(=CC=2)S(=O)(=O)NC=2N=CC=CC=2)=C1 NCEXYHBECQHGNR-QZQOTICOSA-N 0.000 claims description 2
- NCEXYHBECQHGNR-UHFFFAOYSA-N sulfasalazine Natural products C1=C(O)C(C(=O)O)=CC(N=NC=2C=CC(=CC=2)S(=O)(=O)NC=2N=CC=CC=2)=C1 NCEXYHBECQHGNR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 45
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 24
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 23
- UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L di(octadecanoyloxy)lead Chemical compound [Pb+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 21
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 20
- 238000011161 development Methods 0.000 description 15
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 11
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 11
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 10
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 10
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 10
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 10
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 10
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 7
- 102100024216 Programmed cell death 1 ligand 1 Human genes 0.000 description 6
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 6
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 6
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 6
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 5
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 5
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 5
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 5
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 5
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 5
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 5
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 5
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 5
- 108091008875 B cell receptors Proteins 0.000 description 4
- 229940045513 CTLA4 antagonist Drugs 0.000 description 4
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 4
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 4
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 4
- 102100024213 Programmed cell death 1 ligand 2 Human genes 0.000 description 4
- 102100040678 Programmed cell death protein 1 Human genes 0.000 description 4
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 4
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 4
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 4
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 108010074708 B7-H1 Antigen Proteins 0.000 description 3
- 101100463133 Caenorhabditis elegans pdl-1 gene Proteins 0.000 description 3
- 101000611936 Homo sapiens Programmed cell death protein 1 Proteins 0.000 description 3
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 3
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 3
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 238000007799 mixed lymphocyte reaction assay Methods 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 3
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 101001117317 Homo sapiens Programmed cell death 1 ligand 1 Proteins 0.000 description 2
- 101001117312 Homo sapiens Programmed cell death 1 ligand 2 Proteins 0.000 description 2
- 101000914514 Homo sapiens T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Proteins 0.000 description 2
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- 101100407308 Mus musculus Pdcd1lg2 gene Proteins 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- 108700030875 Programmed Cell Death 1 Ligand 2 Proteins 0.000 description 2
- 101710089372 Programmed cell death protein 1 Proteins 0.000 description 2
- 230000006044 T cell activation Effects 0.000 description 2
- 230000006052 T cell proliferation Effects 0.000 description 2
- 102100027213 T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Human genes 0.000 description 2
- 102100021657 Tyrosine-protein phosphatase non-receptor type 6 Human genes 0.000 description 2
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 2
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 description 2
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 229940044683 chemotherapy drug Drugs 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 2
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 2
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 2
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 2
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine Chemical compound CC1=C(N)C(C)=CC(C=2C=C(C)C(N)=C(C)C=2)=C1 UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UZOVYGYOLBIAJR-UHFFFAOYSA-N 4-isocyanato-4'-methyldiphenylmethane Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1CC1=CC=C(N=C=O)C=C1 UZOVYGYOLBIAJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100022524 Alpha-1-antichymotrypsin Human genes 0.000 description 1
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 1
- 101000678026 Homo sapiens Alpha-1-antichymotrypsin Proteins 0.000 description 1
- 101000617285 Homo sapiens Tyrosine-protein phosphatase non-receptor type 6 Proteins 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- ZDZOTLJHXYCWBA-VCVYQWHSSA-N N-debenzoyl-N-(tert-butoxycarbonyl)-10-deacetyltaxol Chemical compound O([C@H]1[C@H]2[C@@](C([C@H](O)C3=C(C)[C@@H](OC(=O)[C@H](O)[C@@H](NC(=O)OC(C)(C)C)C=4C=CC=CC=4)C[C@]1(O)C3(C)C)=O)(C)[C@@H](O)C[C@H]1OC[C@]12OC(=O)C)C(=O)C1=CC=CC=C1 ZDZOTLJHXYCWBA-VCVYQWHSSA-N 0.000 description 1
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 101710094000 Programmed cell death 1 ligand 1 Proteins 0.000 description 1
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 1
- 108700012920 TNF Proteins 0.000 description 1
- 206010052779 Transplant rejections Diseases 0.000 description 1
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 1
- 102100033019 Tyrosine-protein phosphatase non-receptor type 11 Human genes 0.000 description 1
- 101710116241 Tyrosine-protein phosphatase non-receptor type 11 Proteins 0.000 description 1
- 101710128901 Tyrosine-protein phosphatase non-receptor type 6 Proteins 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000007815 allergy Effects 0.000 description 1
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 1
- 239000004037 angiogenesis inhibitor Substances 0.000 description 1
- 229940121369 angiogenesis inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 1
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 1
- 229940041181 antineoplastic drug Drugs 0.000 description 1
- 238000013357 binding ELISA Methods 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000011220 combination immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 229960003668 docetaxel Drugs 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 239000000890 drug combination Substances 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 238000011067 equilibration Methods 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000001794 hormone therapy Methods 0.000 description 1
- 102000048362 human PDCD1 Human genes 0.000 description 1
- 230000003463 hyperproliferative effect Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 229940127121 immunoconjugate Drugs 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 description 1
- 210000003370 receptor cell Anatomy 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 238000011440 reduced-dose chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 230000002463 transducing effect Effects 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 108091005703 transmembrane proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000035160 transmembrane proteins Human genes 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000004565 tumor cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 1
- 125000001493 tyrosinyl group Chemical group [H]OC1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
- C07K16/2818—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against CD28 or CD152
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
- A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
- C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/74—Inducing cell proliferation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
- C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
Un anticuerpo contra la muerte programada-1 (PD-1) o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3 y una región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4.
Description
DESCRIPCIÓN
Anticuerpo monoclonal anti-PD-1
CAMPO
La presente divulgación se refiere al campo de la biomedicina, más concretamente a un anticuerpo monoclonal contra PD-1.
ANTECEDENTES
Factor de muerte programada 1 (PD-1) (también conocido como CD279, Gene ID: PDCD1, número de acceso del banco de genes: NP_005009), como miembro inhibidor de la superfamilia de inmunoglobulinas con homología a CD28, es un receptor de superficie celular crítico en la regulación del equilibrio entre las señales estimuladoras e inhibidoras en el sistema inmunitario, así como en el mantenimiento de la tolerancia periférica. El PD-1 es una proteína transmembrana monomérica de tipo I, que consiste en un dominio extracelular similar a una región variable de inmunoglobulina y un dominio citoplásmico con un motivo de inhibición basado en tirosina inmunorreceptora (ITIM) y un motivo de cambio basado en tirosina inmunorreceptora (ITSM). La expresión de PD-1 es inducible en las células T, las células B, las células asesinas naturales (NK) y los monocitos, por ejemplo tras la activación de los linfocitos a través de la transducción de señales del receptor de células T (TCR) o del receptor de células B (BCR). PD-1 tiene dos ligandos conocidos, es decir, PD-L1 (como, B7-H1, CD274) y PD-L2 (como, B7-DC, CD273), que son miembros de la familia B7 expresados en la superficie celular. Al ligar un ligando, PD-1 recluta fosfatasas (como SHP-1 y SHP-2) a su motivo de tirosina intracelular, que posteriormente desfosforila moléculas efectoras activadas a través de la transducción de señales de TCR o BCR. Por lo tanto, PD-1 es capaz de transducir señales inhibitorias en las células T y en las células B sólo cuando se une al TCR o al BCR al mismo tiempo.
El documento WO2011/110621 divulga PD-1 un anticuerpo agonista humanizado que se une a PD-1 humano que comprende una cadena pesada y una cadena ligera en la que el dominio variable de la cadena pesada comprende la secuencia dada en la SEQ ID n O : 1 para la CDR-H1, la secuencia que Figura en la SEQ ID n O: 2 para la CDR-H2 y la secuencia indicada en la SEQ ID NO: 3 para la CDR-H3 y el dominio variable de la cadena ligera comprende la secuencia indicada en la SEQ ID NO : 4 para la CDR-L1, la secuencia que Figura en la SEQ ID NO: 5 para la CDR-L2 y la secuencia indicada en la SEQ Id NO : 7 para CDR-L3. La divulgación también se extiende a los usos terapéuticos de las moléculas de anticuerpos, composiciones y procedimientos para producir dichas moléculas de anticuerpos.
El documento WO2006/121168 proporciona anticuerpos monoclonales aislados, particularmente anticuerpos monoclonales humanos, que se unen específicamente a PD-1 con alta afinidad. También se proporcionan moléculas de ácido nucleico que codifican los anticuerpos de la invención, vectores de expresión, células huésped y procedimientos para expresar los anticuerpos de la invención. También se proporcionan inmunoconjugados, moléculas biespecíficas y composiciones farmacéuticas que comprenden los anticuerpos de la invención. La invención también proporciona procedimientos para detectar PD-1, así como procedimientos para tratar diversas enfermedades, incluyendo el cáncer y las enfermedades infecciosas, utilizando anticuerpos anti-PD-1. La presente invención proporciona además procedimientos para utilizar una inmunoterapia combinada, como la combinación de anticuerpos anti-CTLA-4 y anti-PD-1, para tratar enfermedades hiperproliferativas, como el cáncer. La invención también proporciona procedimientos para alterar los acontecimientos adversos relacionados con el tratamiento con dichos anticuerpos de forma individual.
El documento WO2004/056875 proporciona anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno que pueden actuar como agonistas y/o antagonistas de PD-1 (Muerte Programada 1), modulando así las respuestas inmunitarias en general, y las mediadas por TcR y CD28, en particular. Las composiciones y procedimientos divulgados pueden utilizarse, por ejemplo, en el tratamiento de enfermedades autoinmunes, trastornos inflamatorios, alergias, rechazo de trasplantes, cáncer y otros trastornos del sistema inmunitario.
Sin embargo, todavía existe la necesidad de mejorar el anticuerpo que reconoce específicamente a PD-1.
SUMARIO
Las realizaciones de la presente divulgación pretenden resolver al menos uno de los problemas existentes en la técnica relacionada, al menos en cierta medida, o al menos proporcionar una alternativa comercial útil. Para ello, la presente divulgación proporciona en las realizaciones un anticuerpo monoclonal contra la muerte programada-1 (PD-1).
En un aspecto, la presente divulgación proporciona en sus realizaciones un anticuerpo monoclonal contra PD-1 o un fragmento de unión a antígeno del mismo. En algunas realizaciones no cubiertas por la invención reivindicada, el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo incluye una región variable de cadena pesada que tiene al menos una de las secuencias de aminoácidos consistentes en: (1) la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1, (2) la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3, (3) la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 5, y (4) una secuencia de aminoácidos que tiene una o más mutaciones de aminoácidos conservadoras en comparación con (1) a (3) .
En algunas realizaciones no cubiertas por la invención reivindicada, el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo incluye además una región variable de cadena ligera que tiene al menos una de las secuencias de aminoácidos consistentes en: (5) la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, (6) la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4, (7) la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 6, y (8) una secuencia de aminoácidos que tiene una o más mutaciones de aminoácidos conservadoras en comparación con (5) a (7).
En una realización no cubierta por la invención reivindicada, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo incluye una región variable de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 (EVQLVQSGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFSSYGMSWVRQTPEKGLDWVATISGGGRDT YYPDSVKGRFTISRDNSKNNLYLQMNSLRAEDTALYYCARQKGEAWFAYWGQGTLVT VSS), y una región variable de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 (DIVLTQSPASLAVSPGQRATITCRASESVDNYGISFMNWFQQKPGQPPKLLIYAASNKGT GVPARFSGSGSGTDFTLNIHPMEENDTAMYFCQQSKEVPWTFGGGTKLEIK).
En otra realización, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo incluye una región variable de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3 (EVQLVQSGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFSSYGMSWVRQAPGKGLDWV ATISGGGRD TYYPDSVKGRFTISRDNSKNNLYLQMNSLRAEDTALYYCARQKGEAWFAYWGQGTLV TVSS), y una región variable de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4 (DIVLTQSPASLAVSPGQRATITCRASESVDNYGISFMNWFQQKPGQPPKLLIYAASNKGT GVPARFSGSGSGTDFTLNINPMEENDTAMYFCQQSKEVPWTFGGGTKLEIK).
En otra realización no cubierta por la invención reivindicada, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo incluye una región variable de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 5 (EVQLVQSGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFSSYGMSWVRQAPGKGLDWVATISGGGRD TYYPDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARQKGEAWFAYWGQGTLV TVSS), y una región variable de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 6 (DIVLTQSPASLAVSPGQRATITCRASESVDNYGISFMNWYQQKPGQPPKLLIYAASNKAT GVPARFSGSGSGTDFTLNINPMEANDTAVYFCQQSKEVPWTFGGGTKLEIK).
En algunas realizaciones, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo es un anticuerpo monoclonal. En algunas realizaciones, el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo se une específicamente a PD-1 de manera eficiente, así como es capaz de promover la activación y la proliferación de células T, regular la expresión y la secreción de citoquinas o estimular las células antitumorales para generar una respuesta inmunitaria más fuerte. Los presentes inventores han encontrado sorprendentemente que el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo en las realizaciones de la presente divulgación es capaz de reconocer específicamente PD-1, así como de promover la activación y proliferación de células T, regular la expresión y secreción de citoquinas o estimular las células antitumorales para generar una respuesta inmunitaria más fuerte.
En otro aspecto, la presente divulgación en realizaciones proporciona un polinucleótido aislado. En algunas realizaciones, el polinucleótido codifica el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo descrito en lo anterior.
En algunas realizaciones, el polinucleótido descrito en lo anterior incluye al menos una de las secuencias de nucleótidos siguientes.
En una realización específica no cubierta por la invención reivindicada, el polinucleótido incluye la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 7 o una secuencia complementaria de la misma, en la que la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 7 codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 (es decir, un aminoácido de la región variable de la cadena pesada del anticuerpo H1L1)
GAAGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGAGGGGGACTGGTGCAGCCCGGCGGGTCTCTG
AAGCTGAGTTGCGCCGCTTCAGGATTCACTTTTAGCTCCTACGGCATGTCCTGGGTGC
GACAGACCCCCGAGAAAGGGCTGGACTGGGTCGCTACCATCTCTGGAGGCGGGAGA
GACACATACTATCCTGATAGTGTCAAGGGCCGGTTCACAATTAGCAGAGACAACTCC
AAAAACAATCTGTATCTGCAGATGAATAGCCTGAGGGCAGAAGATACCGCCCTGTA
CTATTGTGCCCGCCAGAAAGGAGAGGCTTGGTTTGCATACTGGGGACAGGGGACACT
GGTCACCGTCAGCAGC (SEQ ID NO: 7)
En otra realización específica, el polinucleótido incluye la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 8 o una secuencia complementaria de la misma, en la que la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 8 codifica la secuencia
de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3 (es decir, un aminoácido de la región variable de la cadena pesada del anticuerpo H2L2)
GAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGCGGCGGACTGGTGCAGCCCGGCGGGTCACTG
AAGCTGAGCTGCGCCGCTTCCGGCTTCACCTTTAGCTCCTACGGAATGTCCTGGGTGC
GACAGGCACCCGGGAAGGGGCTGGACTGGGTCGCTACTATCTCAGGAGGCGGGAGA
GACACCTACTATCCTGATAGCGTCAAGGGCCGGTTCACAATTAGCCGGGACAACAGC
AAGAACAATCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGGGCTGAGGATACTGCACTGTA
CTATTGTGCCCGCCAGAAGGGCGAAGCATGGTTTGCCTATTGGGGCCAGGGAACCCT
GGTGACAGTCTCTAGT (SEQ ID NO: 8)
En todavía otra realización específica no cubierta por la invención reivindicada, el polinucleótido incluye la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 9 o una secuencia complementaria de la misma, en la que la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 9 codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 5 (es decir, un aminoácido de la región variable de la cadena pesada del anticuerpo H3L3)
GAGGTGCAGCTGGTGCAGAGTGGAGGCGGGCTGGTGCAGCCCGGCGGGTCACTG
AAGCTGAGCTGCGCCGCTTCCGGCTTCACCTTTAGCTCCTACGGAATGTCCTGGGTGC
GACAGGCACCCGGGAAGGGGCTGGACTGGGTCGCTACTATCTCAGGAGGCGGGAGA
GACACCTACTATCCTGATAGCGTGAAGGGCCGGTTCACAATTAGCCGGGACAACAGC
AAGAACACTCTGTACCTGCAGATGAACTCTCTGAGGGCTGAGGATACAGCAGTCTAC
TATTGTGCCCGCCAGAAGGGCGAAGCATGGTTTGCCTATTGGGGCCAGGGAACCCTG
GTGACAGTCTCTAGT (SEQ ID NO: 9)
En una realización específica adicional no cubierta por la invención reivindicada, el polinucleótido incluye la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 10 o una secuencia complementaria de la misma, en la que la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 10 codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 (es decir, un aminoácido de la región variable de la cadena ligera del anticuerpo H1L1)
GATATTGTGCTGACTCAGAGCCCTGCTTCCCTGGCCGTGTCTCCAGGACAGCGAG
CT ACC AT C AC ATGC AGAGC ATCTGAG AGTGTGGAC AACT ACGGAATT AGTTTCATG A
ATTGGTTTCAGCAGAAGCCCGGCCAGCCCCCTAAACTGCTGATCTATGCCGCTAGCA
ACAAGGGCACCGGGGTGCCTGCTCGATTCTCAGGAAGCGGCTCCGGGACAGACTTTA
CTCTGAACATTCACCCAATGGAGGAAAATGATACAGCAATGTACTTCTGCCAGCAGA
GCAAGGAGGTGCCCTGGACCTTTGGCGGGGGAACAAAGCTGGAAATCAAA (SEQ ID
NO: 10)
En una realización específica adicional, el polinucleótido incluye la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 11 o una secuencia complementaria de la misma, en la que la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 11 codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4 (es decir, un aminoácido de la región variable de la cadena ligera del anticuerpo H2L2)
GATATTGTGCTGACTCAGAGCCCTGCTTCCCTGGCCGTGTCTCCAGGACAGCGAG
CTACCATCACATGCAGAGCATCTGAGAGTGTGGACAACTACGGAATTAGTTTCATGA
ATTGGTTTCAGCAGAAGCCCGGCCAGCCCCCTAAACTGCTGATCTATGCCGCTAGCA
ACAAGGGCACCGGGGTGCCTGCTCGATTCTCAGGAAGCGGCTCCGGGACAGACTTTA
CTCTGAACATTAACCCAATGGAGGAAAATGATACAGCAATGTACTTCTGCCAGCAGA
GCAAGGAGGTGCCCTGGACCTTTGGCGGGGGAACAAAGCTGGAAATCAAA (SEQ ID
NO: 11)
En una realización específica adicional no cubierta por la invención reivindicada, el polinucleótido incluye la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 12 o una secuencia complementaria de la misma, en la que la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 12 codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 6 (es decir, un aminoácido de la región variable de la cadena ligera del anticuerpo H3L3)
GACATCGTCCTGACTCAGAGCCCTGCTTCCCTGGCCGTGAGCCCAGGCCAGCGA
GCAACCATCACATGCAGAGCCTCAGAGAGCGTGGACAACTACGGCATTAGCTTCATG
AATTGGTATCAGCAGAAGCCCGGGCAGCCTCCCAAGCTGCTGATCTACGCCGCTTCC
AACAAGGCCACTGGGGTGCCTGCTCGATTCTCCGGCTCTGGGAGTGGAACAGACTTT
ACTCTGAACATTAATCC AATGGAAGCTAATGAT ACAGC AGTGT ATTTCTGCCAGCAG
AGCAAGGAGGTCCCATGGACCTTCGGCGGCGGCACCAAGCTGGAGATCAAG (SEQ ID
NO: 12)
Los presentes inventores han encontrado que es posible sintetizar el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo que reconoce específicamente PD-1 en las realizaciones de la presente divulgación utilizando el polinucleótido de acuerdo con las realizaciones de la presente divulgación. Las características y ventajas de dicho anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se unen específicamente a PD-1 descritas en lo anterior también son adecuadas para el polinucleótido, que no se describirá en detalle.
En todavía otro aspecto, la presente divulgación en realizaciones proporciona un vector de expresión, incluyendo el polinucleótido descrito en lo anterior.
En una realización específica, el vector de expresión incluye además: un elemento de control, operablemente conectado al polinucleótido y configurado para controlar la expresión del polinucleótido en una célula huésped. En una realización específica, la célula huésped puede ser una célula de mamífero, además la célula de mamífero puede ser una célula de línea celular epitelial renal humana.
En una realización específica, la línea celular epitelial renal humana es de células 293T.
En una realización específica, el elemento de control incluye al menos uno de los siguientes: un promotor, un potenciadory un terminador, opcionalmente, el promotores un promotor de citomegalovirus (CMV), el potenciador es un potenciador temprano de CMV, y el terminador es un terminador SV polyA.
En una realización específica, el elemento de control incluye un promotor de citomegalovirus, un potenciador temprano de CMV y un terminador SV polyA.
En todavía otro aspecto, la presente divulgación en realizaciones proporciona una célula recombinante, incluyendo el vector de expresión descrito en lo anterior.
En aún otro aspecto, la presente divulgación en realizaciones proporciona un procedimiento para preparar el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo descrito en lo anterior, incluyendo el cultivo de la célula recombinante descrita en lo anterior.
Los presentes inventores han encontrado que es posible sintetizar eficazmente el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo que reconoce específicamente a PD-1 en las realizaciones de la presente divulgación cultivando la célula recombinante descrita en lo anterior de acuerdo con el presente procedimiento. Las características y ventajas de dicho anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se unen específicamente a PD-1 descritas en lo anterior también son adecuadas para el procedimiento, que no se describirá en detalle.
En aún otro aspecto, la presente divulgación en realizaciones proporciona el uso del polinucleótido, el vector de expresión o la célula recombinante descrita en lo anterior en la preparación de un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo, en el que el anticuerpo se une específicamente a PD-1. Así, los presentes inventores han encontrado que es posible preparar y adquirir de forma eficiente el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo capaz de unirse específicamente a PD-1 utilizando el polinucleótido, el vector de expresión o la célula recombinante descritos en lo anterior. Además, con el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo preparado, es posible bloquear la unión de PD-1 al receptor del mismo de forma eficaz, bloqueando así las vías de
señalización correspondientes de los receptores de PD-1 (como SHP1/2), inhibiendo así el crecimiento del tumor de forma eficaz.
En aún otro aspecto, la presente divulgación proporciona un hibridoma, depositado en el Centro de China para la Colección de Cultivos Tipo (CCTCC).
Los presentes inventores han encontrado que es posible sintetizar eficazmente el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo que reconoce específicamente a PD-1 en las realizaciones de la presente divulgación utilizando el hibridoma de acuerdo con las realizaciones de la presente divulgación. Las características y ventajas de dicho anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se ha descrito anteriormente también son adecuadas para el hibridoma, que no se describirá en detalle.
En aún otro aspecto, la presente divulgación en realizaciones proporciona el uso del hibridoma descrito en lo anterior en la preparación de un anticuerpo monoclonal.
Los presentes inventores han encontrado que es posible sintetizar eficazmente el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo que reconoce específicamente a PD-1 en las realizaciones de la presente divulgación utilizando el hibridoma de acuerdo con las realizaciones de la presente divulgación. Las características y ventajas de dicho anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se unen específicamente a PD-1 descritas en lo anterior también son adecuadas para el uso, que no se describirá en detalle.
En aún otro aspecto, la presente divulgación en realizaciones proporciona el uso del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo, así como el polinucleótido, el vector de expresión, la célula recombinante o el hibridoma descrito en lo anterior en la preparación de un medicamento para promover la activación y proliferación de células T, regular la expresión y secreción de citoquinas, o estimular las células antitumorales para generar una respuesta inmune más fuerte.
En aún otro aspecto, la presente divulgación proporciona una composición farmacéutica. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica incluye el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo, el polinucleótido, el vector de expresión, la célula recombinante o el hibridoma descritos en lo anterior.
En aún otro aspecto, la presente divulgación en realizaciones proporciona un procedimiento para identificar un medicamento capaz de unirse a PD-1. En algunas realizaciones, el procedimiento incluye:
poner en contacto el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo descrito en lo anterior con un antígeno en presencia de un candidato, y determinar una primera cantidad de unión del anticuerpo o del fragmento de unión a antígeno del mismo al antígeno, donde el antígeno es PD-1 o un fragmento del mismo; y
poner en contacto el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo descrito en lo anterior con un antígeno en ausencia del candidato, y determinar una segunda cantidad de unión del anticuerpo o del fragmento de unión a antígeno del mismo al antígeno, donde el antígeno es PD-1 o un fragmento del mismo,
donde la segunda cantidad de unión mayor que la primera cantidad de unión es una indicación de que el candidato es capaz de unirse a PD-1.
Por lo tanto, es posible cribar el candidato que se une a PD-1 de acuerdo con el presente procedimiento.
En aún otro aspecto, la presente divulgación en realizaciones proporciona una combinación de fármacos. En algunas realizaciones, la combinación de fármacos incluye:
(1) el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo, el polinucleótido, el vector de expresión, la célula recombinante o el hibridoma descritos en lo anterior; y
(2) un agente potenciador de la inmunidad diferente de (1).
En algunas realizaciones, el agente potenciador de la inmunidad diferente de (1) incluye al menos uno seleccionado del grupo que consiste en: un anticuerpo contra el antígeno 4 de linfocitos T citotóxicos (CTLA-4), un anticuerpo anti-CD40, budesonida y un salicilato, opcionalmente el salicilato incluye al menos uno de sulfasalazina, olsalazina, balsalazida y mesalamina.
El bloqueo tanto de PD-1 como de CTLA-4 se aplica normalmente en combinación con la terapia tumoral estándar (por ejemplo, quimioterapia). Los ensayos clínicos han demostrado que se puede conseguir la misma eficacia con un fármaco quimioterapéutico con una dosis reducida cuando se utiliza en combinación con el anticuerpo anti-PD-1 y el anticuerpo anti-CTLA-4. En la literatura se informa de que la descarbazina (Docetaxel, un fármaco anticanceroso) o la interleucina-2 (IL-2) en combinación con el anticuerpo anti-PD-1 y el anticuerpo anti-CTLA-4 son útiles en el tratamiento del melanoma. Por un lado, el fármaco quimioterapéutico induce la muerte celular, lo que a su vez aumenta el nivel de antígenos expresados por las células tumorales. Por otro lado, el bloqueo combinado de PD-1 y CTLA-4 potencia el efecto sinérgico entre la radioterapia, la cirugía, la terapia hormonal y similares, cada una de las cuales amplía las
fuentes de los antígenos en el cuerpo. Además, los inhibidores de la angiogénesis también pueden utilizarse en combinación con el anticuerpo anti-PD-1 y el anticuerpo anti-CTLA-4 para inhibir la proliferación vascular, con lo que se inhibe aún más el crecimiento de las células tumorales, a lo que también puede contribuir el aumento de la expresión del antígeno en el organismo.
Los aspectos y ventajas adicionales de la presente divulgación se expondrán en parte en la siguiente descripción, parte de la cual se hará evidente a partir de la descripción o se entenderá a partir de la práctica de la presente divulgación.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
Los aspectos y ventajas anteriores y/o adicionales de la presente divulgación se harán evidentes y se entenderán fácilmente a partir de la descripción de los ejemplos en combinación con las siguientes figuras, en las que:
La Figura 1 es un gráfico que muestra los resultados de ELISA de los anticuerpos H1L1, H2L2 y H3L3 que se unen a PD-1 de acuerdo con una realización de la presente divulgación.
La Figura 2 es un gráfico que muestra los resultados del ELISA competitivo de los anticuerpos H1L1, H2L2 y H3L3 que compiten con PdL1 en la unión de PD-1 de acuerdo con una realización de la presente divulgación. La Figura 3 es un gráfico que muestra los resultados del ELISA competitivo del anticuerpo H2L2 que compite con PdL2 en la unión de PD-1 de acuerdo con una realización de la presente divulgación.
La Figura 4 es un gráfico que muestra los parámetros característicos dinámicos del anticuerpo H1L1 de acuerdo con una realización de la presente divulgación.
La Figura 5 es un gráfico que muestra los parámetros característicos dinámicos del anticuerpo H2L2 de acuerdo con una realización de la presente divulgación.
La Figura 6 es un gráfico que muestra los parámetros característicos dinámicos del anticuerpo H3L3 de acuerdo con una realización de la presente divulgación.
La Figura 7 es un gráfico que muestra los contenidos de IL-2 e IFN gamma secretados por las células T bajo la estimulación de los anticuerpos H1L1, H2L2 y H3L3 mediante el bloqueo de la activación de la proteína PD-1 de acuerdo con una realización de la presente divulgación.
La Figura 8 es un gráfico que muestra la fluorescencia de los anticuerpos H1L1, H2L2 y H3L3 que se unen a las células BB007 de acuerdo con una realización de la presente divulgación.
La Figura 9 es un gráfico que muestra las intensidades de fluorescencia de los anticuerpos H1L1, H2L2 y H3L3 que se unen a las células BB007 de acuerdo con una realización de la presente divulgación.
DESCRIPCIÓN DETALLADA
Los ejemplos de la presente divulgación se describen en detalle a continuación. Cabe señalar que dichos ejemplos son explicativos y tienen por objeto explicar la presente divulgación y no deben interpretarse como una limitación de la misma. Si no se especifica explícitamente, los reactivos utilizados en los siguientes ejemplos están disponibles en el mercado o pueden sintetizarse de acuerdo con la descripción de la presente divulgación o con técnicas o condiciones conocidas. Las condiciones de reacción no enumeradas están fácilmente disponibles para los expertos en la materia.
Ejemplo 1 Establecimiento de la línea celular de hibridoma PD-1 4G10
La proteína de fusión PD-1-mIgGFc que tiene la siguiente secuencia de aminoácidos se preparó de acuerdo con procedimientos biológicos
MQIPQAPWPVVWAVLQLGWRPGWFLDSPDRPWNPPTFSPALLVVTEGDNA
TFTCSFSNTSESFVLNWYRMSPSNQTDKLAAFPEDRSQPGQDCRFRVTQLPNGRDFHMS
VVRARRNDSGTYLCGAISLAPKAQIKESLRAELRVTERRAEVPTAHPSPSPRPAGQFQTL
VSPRPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLT
PKVTCVVVDISKDDPEYQFSWFVDDYEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLN
GKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPED
ITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMNTNGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLH
NHHTEKSLSHSPGK (SEQ ID NO: 13).
Paso 1 Inmunización de ratones y fusión de células
Los ratones BALB/C fueron inmunizados con el antígeno (es decir, la proteína de fusión PD-1-mIgGFc preparada como se ha indicado anteriormente) que fue emulsionado con adyuvante de Freund por adelantado. Tras la inducción de respuestas inmunitarias en los ratones BALB/C, se recolectaron esplenocitos y se fusionaron con células de mieloma murino, obteniéndose así células de hibridoma, que se cultivaron posteriormente en una placa de 96 pocillos de forma individual.
Paso 2 ELISA indirecto
Las células de hibridoma que secretan nuevos anticuerpos individuales capaces de unirse específicamente al PD-1 se cribaron mediante ELISA indirecto con una placa de ELISA recubierta con antígeno (PD-1-hFc) y bloqueada con BSA al 15 en el tampón PBS.
Específicamente, el ELISA indirecto se llevó a cabo como sigue.
Paso 2.1 Recubrimiento de antígeno
Se recubrió una placa ELISA con el antígeno PD-1-hFc en una concentración de 1 ^g/ml (50 ^l por pocillo) mediante incubación a 4 °C durante la noche.
Paso 2.2 Bloqueo
La placa de ELISA recubierta con el antígeno PD-1-hFc se bloqueó con BSA al 15 en el tampón PBS a 37 °C durante 2 horas, y se lavó con tampón 1*PBST que contenía Tween-20 al 15 durante tres veces, y se secó suavemente. Paso 2.3 Incubación con el anticuerpo primario
El anticuerpo, secretado por células de hibridoma individuales, se diluyó de 1 ^g/ml en serie de 1:3, obteniéndose 7 soluciones de anticuerpo en gradiente. Las 7 soluciones de anticuerpos del gradiente y el control PBS en blanco se añadieron respectivamente a la placa ELISA bloqueada para incubar a 37 °C durante 1 hora.
Paso 2.4 Incubación con el anticuerpo secundario
Después de lavar la placa de ELISA con el tampón PBST tres veces y secarla suavemente, se añadió IgG-HRP de cabra anti-ratón (H+l) como anticuerpo secundario en dilución 1:5000 (5o ^l por pocillo) para incubarlo a 37 °C durante 1 hora.
Paso 2.5 Desarrollo
Después de lavar la placa de ELISA con el tampón PBST tres veces y secarla suavemente, se añadió 3,3',5,5'-Tetrametilbencidina (TMB) como revelador en 50 ^l por pocillo para incubarla a temperatura ambiente durante 5 a 10 minutos.
Paso 2.6 Terminación del desarrollo
Se añadió una solución de H2SO42M en 50 ^l por pocillo para terminar el desarrollo.
Paso 2.7 Lectura
La absorbancia de la solución en cada pocillo se midió con el lector de microplacas bajo una longitud de onda de 450 nm.
Paso 3 ELISA competitivo
Mediante el ELISA indirecto, esas células de hibridoma seleccionadas se cribaron además mediante el ELISA competitivo para detectar las que secretan anticuerpos monoclonales que se unen competitivamente a PD-1 en presencia de PD-L1.
Específicamente, el ELISA competitivo se llevó a cabo como sigue.
Paso 3.1 Recubrimiento de antígeno
Se recubrió una placa ELISA de 96 pocilios con el antígeno PD-1-mIgGFc en una concentración de 0,5 |jg/ml (50 |jl por pocillo) mediante incubación a 4 °C durante la noche.
Paso 3.2 Bloqueo
Después de lavarla con el tampón PBST durante tres veces y secarla suavemente, la placa ELISA de 96 pocillos se bloqueó con BSA al 15 en el tampón PBS a 37 °C durante 2 horas, y se lavó con el tampón 1*PBST que contenía Tween-20 al 15 durante tres veces.
Paso 3.3 Incubación con el anticuerpo primario
El anticuerpo, secretado por las células de hibridoma seleccionadas, se diluyó a partir de 3 jg/m l en series de 1:3, obteniéndose 7 soluciones de anticuerpo en gradiente. Las 7 soluciones de anticuerpos del gradiente y el control de PBS en blanco (50 jl por pocillo) se añadieron respectivamente en la placa ELISA de 96 pocillos bloqueada para incubar a temperatura ambiente durante 10 minutos.
Paso 3.4 Incubación con el ligando
Se añadieron 2 jg/m l de solución de PDL1-hIgG1Fc en 50 j l por pocillo para incubar a 37 °C durante 1 hora.
Paso 3.5 Incubación con el anticuerpo secundario
Después de lavar la placa de ELISA de 96 pocillos con el tampón PBST tres veces y secarla suavemente, se añadió IgG-HRP de cabra anti-ratón (H+L) como anticuerpo secundario en dilución 1:5000 (50 j l por pocillo) para incubarlo a 37 °C durante 1 hora.
Paso 3.6 Desarrollo
Después de lavar la placa ELISA de 96 pocillos con el tampón PBST durante tres veces y secarla suavemente de nuevo, se añadió TMB como revelador en 50 j l por pocillo para incubarlo a temperatura ambiente durante 5 a 10 minutos.
Paso 3.7 Terminación del desarrollo
Se añadió una solución de H2SO42M en 50 j l por pocillo para terminar el desarrollo.
Paso 3.8 Lectura
La absorbancia de la solución en cada pocillo se midió con el lector de microplacas bajo una longitud de onda de 450 nm.
La línea celular de hibridoma PD-1 18A10 se seleccionó como la línea celular de hibridoma deseada de acuerdo con los resultados, y el anticuerpo monoclonal de la misma se denomina anticuerpo 18A10.
Paso 4 Subclonación para la obtención de una línea celular estable
Para la línea celular de hibridoma PD-1 18A10 obtenida, se requiere la subclonación para obtener una línea celular de hibridoma estable que secrete anticuerpos monoclonales que se unan competitivamente a PD-1 en presencia de PD-L1.
Específicamente, se contó la célula de hibridoma PD-1 18A10 que se iba a subclonar, y luego se diluyó con medio de Dubecco modificado de Iscove (medio IMDM) que contenía 15 5 de suero bovino fetal dependiendo del número de células viables para su siembra e incubación en una placa de 96 pocillos, a con una densidad celular teóricamente de siembra de una célula por pocillo. Después de crecer en un grupo de células monoclonales, estas células fueron examinadas también por el procedimiento ELISA, seguido de varias repeticiones de subclonación y cribado, obteniendo así la línea celular estable de hibridoma PD-1 18A10.
Paso 5 Producción del anticuerpo 18A10
La línea celular estable de hibridoma PD-1 18A10 se cultivó con suero bovino fetal que contenía un 105 de IgG durante 7 a 10 días, seguido de la recolección del sobrenadante celular y la purificación para obtener el anticuerpo 18A10.
Ejemplo 2 Adquisición de la secuencia de ADNc de la línea celular de hibridoma 18A10
1. el ARNm de la línea celular de hibridoma 18A10 se extrajo de acuerdo con las instrucciones del kit RNAprep pure Cell/Bacteria para la extracción de ARN total (Tiangen, Cat. N° DP430).
2. La primera cadena de ADNc se sintetizó de acuerdo con las instrucciones del kit de síntesis de primera cadena SuperScript® III para RT-PCR de Invitrogen, seguido de la amplificación por PCR.
3. Los productos amplificados por PCR se sometieron a clonación TA de acuerdo con las instrucciones del kit de clonación pEASY-T1 (Transgen, CT101).
4. Los productos clonados por TA se identificaron mediante amplificación por PCR con cebadores universales M13, seguida de la selección de clones positivos para su secuenciación.
5. Mediante la alineación, se obtuvieron las secuencias exactas de ADNc a partir de los resultados de la secuenciación.
Ejemplo 3 Diseño del anticuerpo humanizado 18A10
Para construir un anticuerpo humanizado, se compararon las secuencias de la región variable de la cadena pesada y la región variable de la cadena ligera del anticuerpo murino 18A10 con las secuencias de la línea germinal del anticuerpo disponibles en las bases de datos públicas del NCBI. Se diseñaron tres anticuerpos humanizados mediante la mutación selectiva de una parte de las secuencias de aminoácidos del anticuerpo murino 18A10 por las correspondientes secuencias de aminoácidos humanos, denominadas H1L1, H2L2 y H3L3, respectivamente, de acuerdo con la diferencia de grado de humanización.
La región variable de la cadena pesada del anticuerpo humanizado H1L1 tiene una secuencia de
EVQLVQSGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFSSYGMSWVRQTPEKGLDWVATISGGG
RDT Y YPD S VKGRFTISRDN SKNNL YLQMNSLRAEDT AL Y Y C ARQKGE A WF A Y W GQGT
LVTVSS (SEQ ID NO: 1).
La región variable de la cadena ligera del anticuerpo humanizado H1L1 tiene una secuencia de
DIVLTQSPASLAVSPGQRATITCRASESVDNYGISFMNWFQQKPGQPPKLLIYAASN
KGTGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPMEENDTAMYFCQQSKEVPWTFGGGTKLEIK (SEQ
ID NO: 2).
La región variable de la cadena pesada del anticuerpo humanizado H2L2 tiene una secuencia de
EVQLVQSGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFSSYGMSWVRQAPGKGLDWVATISGGG
RDTYYPDSVKGRFTISRDNSKNNLYLQMNSLRAEDTALYYCARQKGEAWFAYWGQGT
LVTVSS (SEQ ID NO: 3).
La región variable de la cadena ligera del anticuerpo humanizado H2L2 tiene una secuencia de
DIVLTQSPASLAVSPGQRATITCRASESVDNYGISFMNWFQQKPGQPPKLLIYAASN
KGTGVPARFSGSGSGTDFTLNINPMEENDTAMYFCQQSKEVPWTFGGGTKLEIK (SEQ
ID NO: 4).
La región variable de la cadena pesada del anticuerpo humanizado H3L3 tiene una secuencia de
EVQLVQSGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFSSYGMSWVRQAPGKGLDWVATISGGG
RDTYYPDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARQKGEAWFAYWGQGT
LVTVSS (SEQ ID NO: 5).
La región variable de la cadena ligera del anticuerpo humanizado H3L3 tiene una secuencia de
DIVLTQSPASLAVSPGQRATITCRASESVDNYGISFMNWYQQKPGQPPKLLIYAASN
KATGVPARFSGSGSGTDFTLNINPMEANDTAVYFCQQSKEVPWTFGGGTKLEIK (SEQ
ID NO: 6).
Ejemplo 4 Expresión de anticuerpos humanizados H1L1, H2L2 y H3L3
Las secuencias de ácido nucleico que codifican los anticuerpos humanizados H1L1, H2L2, H3L3 se sintetizaron mediante el Procedimiento de Síntesis de Genes, y cada una se incorporó a un vector de expresión . Se extrajeron los ADN de los vectores de expresión individuales y se transfectaron en células 293 de mamífero. Tras la transfección, el anticuerpo se expresaba en el interior de la célula y se secretaba fuera de ella. Tras la purificación en la columna de cromatografía de afinidad de proteína A, se obtuvieron los anticuerpos humanizados H1L1, H2L2 y H3L3.
Ejemplo 5 Experimentos ELISA de anticuerpos recombinantes humanizados 18A10
Los anticuerpos humanizados, generados tras la adquisición de la secuencia de ADN de la línea celular de hibridoma 18A10 y el diseño de la humanización mediante la técnica de recombinación, se ensayaron mediante una serie de experimentos de comparación, que incluían, pero no se limitan a, el experimento de unión ELISA y el experimento ELISA competitivo.
1. Experimentos de unión ELISA de los anticuerpos 18A10 H1L1, 18A10 H2L2 y 18A10 H3L3 Específicamente, los experimentos de unión de ELISA se realizaron de la siguiente manera.
Paso 5.1.1 Recubrimiento de antígeno
Se recubrió una placa ELISA con el antígeno PD-1-mFc en una concentración de 0,5 pg/ml (50 pl por pocillo) mediante incubación a 4 °C durante la noche.
Paso 5.1.2 Bloqueo
La placa de ELISA recubierta con el antígeno PD-1-mFc se bloqueó con BSA al 15 en el tampón PBS a 37 °C durante 2 horas, y se lavó con tampón 1*PBST que contenía Tween-20 al 15 durante tres veces, y se secó suavemente. Paso 5.1.3 Incubación con el anticuerpo primario
Los anticuerpos 18A10 H1L1, 18A10 H2L2 y 18A10 H3L3 se diluyeron cada uno de 1 pg/ml en serie de 1:3, obteniéndose 7 soluciones de anticuerpos en gradiente para cada anticuerpo. Las 7 soluciones de anticuerpos en gradiente para cada anticuerpo y el control PBS en blanco se añadieron respectivamente a la placa ELISA bloqueada para incubar a 37 °C durante 1 hora.
Paso 5.1.4 Incubación con el anticuerpo secundario
Después de lavar la placa de ELISA con el tampón PBST tres veces y secarla suavemente, se añadió IgG-HRP de cabra anti-ratón (H+L) como anticuerpo secundario en dilución 1:5000 (5o pl por pocillo) para incubarlo a 37 °C durante 1 hora.
Paso 5.1.5 Desarrollo
Después de lavar la placa de ELISA con el tampón PBST tres veces y secarla suavemente, se añadió TMB como revelador en 50 pl por pocillo para incubarlo a temperatura ambiente durante 5 a 10 minutos.
Paso 5.1.6 Terminación del desarrollo
Se añadió una solución de H2SO42M en 50 pl por pocillo para terminar el desarrollo.
Paso 5.1.7 Lectura
La absorbancia de la solución en cada pocillo se midió con el lector de microplacas bajo una longitud de onda de 450 nm.
Los resultados se muestran en la Figura 1, donde los valores EC50 de los anticuerpos H1L1, H2L2 y H3L3 contra PD-1 son 0,156 nM, 0,111 nM y 0,144 nM, respectivamente.
Se puede ver en la Figura 1 que los anticuerpos H1L1, H2L2 y H3L3 tienen cada uno una fuerte afinidad por PD-1.
Tabla 1
continuación
2 Experimentos ELISA competitivos de los anticuerpos 18A10 H1L1,18A10 H2L2 y 18A10 H3L3 con PDL1 Específicamente, los experimentos de ELISA competitivo se llevaron a cabo como sigue.
Paso 5.2.1 Recubrimiento de antígeno
Se recubrió una placa ELISA de 96 pocilios con el antígeno PD-1-mIgGFc en una concentración de 0,5 jg/m l (50 |jl por pocillo) mediante incubación a 4 °C durante la noche.
Paso 5.2.2 Bloqueo
Después de lavarla con el tampón PBST durante tres veces y secarla suavemente, la placa ELISA de 96 pocillos se bloqueó con BSA al 15 en el tampón PBS a 37 °C durante 2 horas, y se lavó con tampón 1*PBST que contenía Tween-20 al 15 durante tres veces.
Paso 5.2.3 Incubación con el anticuerpo primario
Los anticuerpos 18A10 H1L1, 18A10 H2L2 y 18A10 H3L3 se diluyeron cada uno de 3 jg/m l en serie de 1:3, obteniéndose 7 soluciones de anticuerpos en gradiente para cada anticuerpo. Las 7 soluciones de anticuerpos en gradiente para cada anticuerpo y el control de PBS en blanco (50 j l por pocillo) se añadieron respectivamente a la placa ELISA de 96 pocillos bloqueada para incubar a temperatura ambiente durante 10 minutos.
Paso 5.2.4 Incubación con el ligando
Se añadieron 0,3 jg/m l de solución de PDL1-mIgG2aFc en 50 j l por pocillo para incubar a 37 °C durante 1 hora. Paso 5.2.5 Incubación con el anticuerpo secundario
Después de lavar la placa de ELISA de 96 pocillos con el tampón PBST tres veces y secarla suavemente, se añadió IgG-HRP de cabra anti-ratón (H+L) como anticuerpo secundario en dilución 1:5000 (50 j l por pocillo) para incubarlo a 37 °C durante 1 hora.
Paso 5.2.6 Desarrollo
Después de lavar la placa ELISA de 96 pocillos con el tampón PBST durante tres veces y secarla suavemente de nuevo, se añadió TMB como revelador en 50 j l por pocillo para incubarlo a temperatura ambiente durante 5 a 10 minutos.
Paso 5.2.7 Terminación del desarrollo
Se añadió una solución de H2SO42M en 50 j l por pocillo para terminar el desarrollo.
Paso 5.2.8 Lectura
La absorbancia de la solución en cada pocillo se midió con el lector de microplacas bajo una longitud de onda de 450 nm.
Los resultados se muestran en la Figura 2, donde los valores EC50 de los anticuerpos H1L1, H2L2 y H3L3 cuando compiten con PdL1 en la unión de PD-1 son 0,992 nM, 0,838 nM y 1,194 nM respectivamente.
Se puede observar en la Figura 2 que los anticuerpos H1L1, H2L2 y H3L3 son capaces de inhibir cada uno de ellos la unión de Pd-1 a PdL1 de forma eficaz.
Tabla 2
continuación
3 Experimento ELISA competitivo del anticuerpo 18A10 H2L2 con PDL2
Específicamente, el experimento de ELISA competitivo se realizó como sigue.
Paso 5.3.1 Recubrimiento de antígeno
Se recubrió una placa ELISA de 96 pocilios con el antígeno PD-1-hIgGFc en una concentración de 1 jg/m l (100 |jl por pocilio) mediante incubación a 4 °C durante la noche.
Paso 5.3.2 Bloqueo
Después de lavarla con el tampón PBST durante tres veces y secarla suavemente, la placa ELISA de 96 pocillos se bloqueó con BSA al 15 en el tampón PBS a 37 °C durante 2 horas, y se lavó con tampón 1*PBST que contenía Tween-20 al 15 durante cuatro veces.
Paso 5.3.3 Incubación con el anticuerpo primario
El anticuerpo 18A10 H2L2 se diluyó a partir de 20 jg/m l en series de 1:3, obteniéndose 7 soluciones de anticuerpos en gradiente. Las 7 soluciones de anticuerpos del gradiente y el control de PBS en blanco (50 j l por pocillo) se añadieron respectivamente a la placa ELISA de 96 pocillos bloqueada para su incubación a temperatura ambiente durante 10 minutos.
Paso 5.3.4 Incubación con el ligando
Se añadió 1,0 jg/m l de solución de etiqueta PDL2-his en 50 j l por pocillo para incubar a 37 °C durante 1 hora. Paso 5.3.5 Incubación con el anticuerpo secundario
Después de lavar la placa ELISA de 96 pocillos con el tampón PBST durante cinco veces y secarla suavemente, se añadió el anticuerpo monoclonal de ratón anti-his tag conjugado con HRP como anticuerpo secundario en una dilución de 1:750 (50 j l por pocillo) para incubarlo a 37 °C durante 1 hora.
Paso 5.3.6 Desarrollo
Después de lavar la placa de ELISA de 96 pocillos con el tampón PBST durante seis veces y secarla suavemente de nuevo, se añadió TMB como revelador en 100 j l por pocillo para incubarlo a temperatura ambiente durante 30 minutos.
Paso 5.3.7 Terminación del desarrollo
Se añadió una solución de H2SO42M en 50 j l por pocillo para terminar el desarrollo.
Paso 5.3.8 Lectura
La absorbancia de la solución en cada pocillo se midió con el lector de microplacas bajo una longitud de onda de 450 nm.
Los resultados se muestran en la Figura 3, de la que se desprende que el anticuerpo H2L2 es capaz de inhibir la unión de PD-1 a PdL2 de forma efectiva.
Tabla 3
Ejemplo 6
Los parámetros cinéticos característicos de los anticuerpos 18A10 H1L1, H2L2 y H3L3 se determinaron utilizando el instrumento de interacción de moléculas Fortebio.
El antígeno PD-1 marcado con biotina se inmovilizó en la superficie del sensor SA. Tras el equilibrio con el tampón PBST, el anticuerpo H1L1, diluido en serie 1:3 con PBST (200 nM, 66,67 nM, 22,22 nM, 7,41 nM, 2,47 nM, 0,82 nM, 0,27 nM y 0 nM), se aplicó al sensor SA para su unión al antígeno PD-1 marcado con biotina, tras lo cual se aplicó PBST al sensor SA para su disociación. Los ensayos para H2L2 y H3L3 son los mismos que para H1L1. Los resultados de los parámetros cinéticos característicos de los anticuerpos H1L1, H2L2 y H3L3 se muestran en la Tabla 4, Figura 4, Figura 5 y Figura 6.
Tabla 4
Ejemplo 7 Ensayos de IL-2 e IFN gamma secretados por células T bajo estimulación de anticuerpos H1L1, H2L2y H3L3
Los linfocitos T fueron ensayados para la secreción de IL-2 e IFN gamma bajo estimulación de anticuerpos H1L1, H2L2 y H3L3 por la reacción de linfocitos mixtos (MLR). Para la MLR, se mezclaron células T (TC) y células dendríticas (DC) de diferentes fuentes humanas, de forma que las células T secretan IL-2 e IFN gamma bajo la función de presentación de antígenos de las células DC. En concreto, los monocitos de la sangre se diferencian en células DC inmaduras bajo la inducción de las citocinas GM-CSF e IL-4, tras lo cual las células DC inmaduras fueron inducidas a la maduración mediante la estimulación del factor de necrosis tumoral alfa (TNFa). Posteriormente, las células DC maduradas y las células TC alogénicas se mezclan y se cultivan durante 5 días, tras lo cual se determina la IL-2 y el IFN gamma secretados en el sobrenadante celular.
En este ejemplo, las células TC (1*105 por pocillo) y las células DC maduras (1*104 por pocillo) se mezclaron en una placa de 96 pocillos, y luego se cultivaron en presencia de anticuerpos individuales en tres concentraciones (es decir, 1 nM, 10 nM y 100 nM) durante 5 días, después de lo cual se detectó la cantidad de IL-2 en el sobrenadante celular con un kit de ensayo de IL-2, y la cantidad de IFN gamma en el sobrenadante celular se detectó con un kit de ensayo de IFN gamma.
La Figura 7 muestra los contenidos de IL-2 e IFN gamma secretados por las células T bajo la estimulación de los anticuerpos H1L1, H2L2 y H3L3 respectivamente, de lo que se desprende que los anticuerpos H1L1, H2L2 y H3L3 son capaces de estimular a las células T para que secreten IL-2 e iFn gamma de una manera eficaz y dependiente de la dosis.
Ejemplo 8 Ensayo de la EC50 de los anticuerpos H1L1, H2L2 y H3L3 que se unen a PD-1
Las eficiencias de unión de los anticuerpos H1L1, H2L2 y H3L3 al antígeno PD-1 expresado de forma estable en la superficie de las células (denominadas células BB007) se determinaron mediante citometría de flujo. Las células
Claims (11)
1. Un anticuerpo contra la muerte programada-i (PD-1) o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3 y una región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4.
2. El anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo es capaz de promover la activación y la proliferación de células T, regular la expresión y la secreción de citoquinas o estimular las células antitumorales.
3. Un polinucleótido aislado, que codifica el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con la reivindicación 1 o 2.
4. El polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 3, que comprende
la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 8 y la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 11 .
5. Un vector de expresión, que comprende el polinucleótido de la reivindicación 3 o 4, y un elemento de control, operablemente conectado al polinucleótido y configurado para controlar la expresión del polinucleótido en una célula huésped.
6. El vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 5, en el que la célula huésped es una célula de mamífero, preferentemente una célula de línea celular epitelial renal humana, y más preferentemente una célula 293T.
7. El vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 5 o 6, en el que el elemento de control comprende al menos uno de:
un promotor, un potenciadory un terminador; en el que
el promotor es preferentemente un promotor de citomegalovirus (CMV), el potenciador es preferentemente un potenciador temprano de CMV, y el terminador es preferentemente un terminador SV polyA.
8. Una célula recombinante, que comprende el vector de expresión de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7.
9. Una composición farmacéutica, que comprende: el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, el polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 3 o 4, el vector de expresión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, o la célula recombinante de acuerdo con la reivindicación 8.
10. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 9, que comprende además un agente potenciador de la inmunidad, en la que
el agente potenciador de la inmunidad se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo contra el antígeno 4 de los linfocitos T citotóxicos (CTLA-4), un anticuerpo anti-CD40, budesonida y un salicilato, y
el salicilato se selecciona del grupo que consiste en sulfasalazina, olsalazina, balsalazida y mesalamina.
11. Un procedimiento para identificar un medicamento capaz de unirse a la muerte programada-1 (PD-1), que comprende:
poner en contacto el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con la reivindicación 1 o 2 con un antígeno en presencia de un candidato, y determinar una primera cantidad de unión del anticuerpo o del fragmento de unión a antígeno del mismo al antígeno, en el que el antígeno es PD-1 o un fragmento del mismo; y
poner en contacto el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con la reivindicación 1 o 2 con un antígeno en ausencia del candidato, y determinar una segunda cantidad de unión del anticuerpo o del fragmento de unión a antígeno del mismo al antígeno, en el que el antígeno es PD-1 o un fragmento del mismo, en el que la segunda cantidad de unión mayor que la primera cantidad de unión es una indicación de que el candidato tiene la capacidad de unirse a PD-1.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201610207741.6A CN107286242B (zh) | 2016-04-01 | 2016-04-01 | 抗pd-1的单克隆抗体 |
| PCT/CN2016/103814 WO2017166804A1 (zh) | 2016-04-01 | 2016-10-28 | 抗pd-1的单克隆抗体 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2906650T3 true ES2906650T3 (es) | 2022-04-19 |
Family
ID=59963387
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES16896573T Active ES2906650T3 (es) | 2016-04-01 | 2016-10-28 | Anticuerpo monoclonal anti-PD-1 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US11104734B2 (es) |
| EP (1) | EP3441086B1 (es) |
| JP (2) | JP6857232B2 (es) |
| CN (1) | CN107286242B (es) |
| DK (1) | DK3441086T3 (es) |
| ES (1) | ES2906650T3 (es) |
| WO (1) | WO2017166804A1 (es) |
Families Citing this family (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| MX2018000621A (es) | 2015-07-13 | 2018-05-11 | Cytomx Therapeutics Inc | Anticuerpos anti-pd-1, anticuerpos anti-pd-1 activables, y metodos de uso de los mismos. |
| CN107286242B (zh) * | 2016-04-01 | 2019-03-22 | 中山康方生物医药有限公司 | 抗pd-1的单克隆抗体 |
| WO2019109357A1 (zh) * | 2017-12-08 | 2019-06-13 | 杭州翰思生物医药有限公司 | 抗pd-1/cd47的双特异性抗体及其应用 |
| CN108314734B (zh) * | 2018-01-31 | 2021-11-05 | 中国药科大学 | 抗pd-1单克隆抗体及其应用 |
| JP2021523158A (ja) | 2018-05-07 | 2021-09-02 | ゲンマブ エー／エス | 抗ｐｄ−１抗体と抗組織因子抗体−薬物コンジュゲートとの組み合わせを用いるがんの治療方法 |
| WO2021006199A1 (ja) | 2019-07-05 | 2021-01-14 | 小野薬品工業株式会社 | Ｐｄ－１／ｃｄ３二重特異性タンパク質による血液がん治療 |
| US20220332825A1 (en) | 2019-08-08 | 2022-10-20 | Ono Pharmaceutical Co., Ltd. | Bispecific protein |
| KR20220070201A (ko) * | 2019-09-30 | 2022-05-30 | 쓰촨 케룬-바이오테크 바이오파마수티컬 컴퍼니 리미티드 | 항-pd-1 항체 및 이의 용도 |
| IL302836A (en) | 2020-11-17 | 2023-07-01 | Seagen Inc | Methods for treating cancer with a combination of tocatinib and an anti-PD-1/anti-PD-L1 antibody |
| IL309831A (en) | 2021-07-13 | 2024-02-01 | BioNTech SE | Multispecific binding agents against CD40 and CD137 in combined cancer therapy |
| IL311771A (en) | 2021-10-06 | 2024-05-01 | BioNTech SE | Multispecific binding agents against PD-L1 and CD137 in combination |
| WO2023083439A1 (en) | 2021-11-09 | 2023-05-19 | BioNTech SE | Tlr7 agonist and combinations for cancer treatment |
| WO2023086989A1 (en) * | 2021-11-12 | 2023-05-19 | Adrx, Inc. | Transthyretin (ttr) monomer binding antibodies |
| WO2023218046A1 (en) | 2022-05-12 | 2023-11-16 | Genmab A/S | Binding agents capable of binding to cd27 in combination therapy |
Family Cites Families (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ATE514713T1 (de) * | 2002-12-23 | 2011-07-15 | Wyeth Llc | Antikörper gegen pd-1 und ihre verwendung |
| DK2439273T3 (da) * | 2005-05-09 | 2019-06-03 | Ono Pharmaceutical Co | Humane monoklonale antistoffer til programmeret død-1(pd-1) og fremgangsmåder til behandling af cancer ved anvendelse af anti-pd-1- antistoffer alene eller i kombination med andre immunterapeutika |
| TW201134488A (en) * | 2010-03-11 | 2011-10-16 | Ucb Pharma Sa | PD-1 antibodies |
| WO2014055648A1 (en) * | 2012-10-02 | 2014-04-10 | Bristol-Myers Squibb Company | Combination of anti-kir antibodies and anti-pd-1 antibodies to treat cancer |
| CN103242448B (zh) * | 2013-05-27 | 2015-01-14 | 郑州大学 | 一种全人源化抗pd-1单克隆抗体及其制备方法和应用 |
| RU2711141C2 (ru) * | 2014-07-22 | 2020-01-15 | СиБи ТЕРЕПЬЮТИКС, ИНК. | Антитела против pd-1 |
| CN105061597B (zh) * | 2015-06-09 | 2016-04-27 | 北京东方百泰生物科技有限公司 | 一种抗pd-1的单克隆抗体及其获得方法 |
| CN105175544B (zh) * | 2015-10-20 | 2021-04-09 | 安徽瀚海博兴生物技术有限公司 | 一种抗pd-1人源化单克隆抗体及其应用 |
| CN105238762A (zh) * | 2015-10-26 | 2016-01-13 | 无锡傲锐东源生物科技有限公司 | 抗pd-1蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞及其产生的抗pd-1单克隆抗体和应用 |
| CN107286242B (zh) * | 2016-04-01 | 2019-03-22 | 中山康方生物医药有限公司 | 抗pd-1的单克隆抗体 |
-
2016
- 2016-04-01 CN CN201610207741.6A patent/CN107286242B/zh active Active
- 2016-10-28 EP EP16896573.9A patent/EP3441086B1/en active Active
- 2016-10-28 ES ES16896573T patent/ES2906650T3/es active Active
- 2016-10-28 JP JP2019502126A patent/JP6857232B2/ja active Active
- 2016-10-28 DK DK16896573.9T patent/DK3441086T3/da active
- 2016-10-28 WO PCT/CN2016/103814 patent/WO2017166804A1/zh active Application Filing
-
2018
- 2018-09-28 US US16/146,925 patent/US11104734B2/en active Active
-
2020
- 2020-12-25 JP JP2020215952A patent/JP7121792B2/ja active Active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP7121792B2 (ja) | 2022-08-18 |
| WO2017166804A1 (zh) | 2017-10-05 |
| CN107286242A (zh) | 2017-10-24 |
| US20190040138A1 (en) | 2019-02-07 |
| JP6857232B2 (ja) | 2021-04-14 |
| JP2021058204A (ja) | 2021-04-15 |
| EP3441086A1 (en) | 2019-02-13 |
| EP3441086B1 (en) | 2021-12-15 |
| US11104734B2 (en) | 2021-08-31 |
| CN107286242B (zh) | 2019-03-22 |
| JP2019519247A (ja) | 2019-07-11 |
| EP3441086A4 (en) | 2019-11-13 |
| DK3441086T3 (da) | 2022-01-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2906650T3 (es) | Anticuerpo monoclonal anti-PD-1 | |
| CN111526888B (zh) | 抗tigit抗体及其作为治疗和诊断的用途 | |
| CN109476732B (zh) | 三特异性和/或三价结合蛋白 | |
| JP2020519289A (ja) | ＴＧＦ−β受容体含有融合タンパク質およびそれらの医薬的用途 | |
| JP2021526012A (ja) | Ｃｔｌａ−４を標的とする抗体、その調製方法および使用 | |
| JP7022067B2 (ja) | Ｆｏｘｐ３由来のペプチドに特異的なｔ細胞受容体様抗体 | |
| JP2019523636A (ja) | ＣＤ４０Ｌ−Ｆｃ融合ポリペプチドおよびその使用方法 | |
| CA3132078A1 (en) | Bifunctional fusion protein and pharmaceutical use thereof | |
| KR20200092976A (ko) | 항-cd137 항체 및 이의 용도 | |
| CN110637031A (zh) | 程序性死亡蛋白1(pd-1)的重组抗体及其用途 | |
| JP2023546508A (ja) | 抗ｔｉｇｉｔ抗体、その医薬組成物及び用途 | |
| JP6961090B2 (ja) | 抗ｐｄ−１／ｃｄ４７二重特異性抗体及びその適用 | |
| WO2023046113A1 (zh) | 一种抗人pd-l1人源化抗体或其抗原结合片段及其应用 | |
| US20230104769A1 (en) | Recombinant anti-human pd-1 antibody and application thereof | |
| JP2021534750A (ja) | 新規ながん免疫療法抗体組成物 | |
| CN115785269B (zh) | 抗pd-l1的抗体及其应用 | |
| US20240034790A1 (en) | Antibody specific for cd47 and uses thereof | |
| CA3238571A1 (en) | Bispecific antibody against tigit and pd-l1, and pharmaceutical composition thereof and use thereof | |
| CA3231649A1 (en) | Multispecific binding moieties comprising pd-1 and tgf-brii binding domains | |
| CN115894700A (zh) | 同时靶向PD-L1和FasL的双特异性抗体、药物组合物及其应用 |