JP2019518759A - オリゴヌクレオチドの精製のための疎水性相互作用クロマトグラフィー - Google Patents
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Abstract
【選択図】なし
Description
本出願は、米国特許法第119条(e)の下で、2016年6月14日に出願された米国仮特許出願第62/349,970号及び2017年5月1日に出願された米国仮特許出願第62/492,402号に基づく出願日の利益を主張するものであり、各出願の全内容は参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、ASCII形式で電子提出された配列表を含み、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。2017年6月12日に作成された上記ASCIIコピーは、123429−00120_SL.txtという名称であり、839バイトのサイズである。
a)混合物に塩を添加するステップと、
b)疎水性吸着剤の容量の約32〜約78%の動的負荷容量において、希釈された混合物を疎水性吸着剤に接触させるステップと、
c)疎水性吸着剤を塩水溶液で洗浄するステップと、
d)標的オリゴヌクレオチドを溶離液で溶離するステップと、
e)標的オリゴヌクレオチドを含む溶出液を収集するステップと
を含み、生成物関連不純物が少なくとも1つのN−1不純物を含み、これにより生成物関連不純物から標的オリゴヌクレオチドが分離される、方法である。
a)混合物に塩を添加するステップと、
b)疎水性吸着剤の容量の約40〜約100%の動的負荷容量において、希釈された混合物を疎水性吸着剤に接触させるステップと、
c)疎水性吸着剤を塩水溶液で洗浄するステップと、
d)標的オリゴヌクレオチドを溶離液で溶離するステップと、
e)標的オリゴヌクレオチドを含む溶出液を収集するステップと
を含み、生成物関連不純物が少なくとも1つのP=O不純物を含み、これにより生成物関連不純物から標的オリゴヌクレオチドが分離される、方法である。
TCACTTTCATAATGCTGG(配列番号1)
の配列(5’から3’)を有するホスホロチオエートオリゴヌクレオチドであり、ここで、オリゴヌクレオチドの各ヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート結合であり、オリゴヌクレオチドの各ヌクレオシドは、2’−メトキシエチル(MOE)ヌクレオシドであり、各シトシンは、5’−メチルシトシンである。配列番号1はBIIB058としても知られ、WO2007/002390、WO2010/148249、及びUS8,980,853に記載されており、各々の教示は参照により本明細書に組み込まれる。
CAGGATACATTTCTACAGCT(配列番号2)
の配列(5’から3’)を有する5−10−5 MOEギャップマーであり、ここで、ヌクレオシド1〜5及び16〜20の各々は、2’−O−メトキシエチルリボース修飾ヌクレオシドであり、ヌクレオシド6〜15の各々は、2’−デオキシヌクレオシドであり、ヌクレオシド2〜3、4〜5、16〜17、及び18〜19の間のヌクレオシド間結合は、ホスホジエステル結合であり、ヌクレオシド1〜2、3〜4、5〜6、6〜7、7〜8、8〜9、9〜10、10〜11、11〜12、12〜13、13〜14、14〜15、15〜16、17〜18、及び19〜20の間のヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート結合であり、各シトシンは、5’−メチルシトシンである。配列番号2は、次の化学表記:mCes Aeo Ges Geo Aes Tds Ads mCds Ads Tds Tds Tds mCds Tds Ads mCeo Aes Geo mCes Teによって記述され、ここで、
Aは、アデニンであり、
mCは、5’−メチルシトシンであり、
Gは、グアニンであり、
Tは、チミンであり、
eは、2’−O−メトキシエチルリボース修飾糖であり、
dは、2’−デオキシリボース糖であり、
sは、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合であり、
oは、ホスホジエステルヌクレオシド間結合である。
物質:
カラム:6.84mL Phenyl Sepharose Fast Flow高置換
床高:20cm
生成物希釈緩衝液:850mM硫酸アンモニウム、50mMトリス、pH8.5
平衡化緩衝液:800mM硫酸アンモニウム、50mMトリス、pH8.5
粗生成物負荷:765mM硫酸アンモニウム、50mMトリス、pH8.5
洗浄緩衝液:440mM硫酸アンモニウム、50mMトリス、pH8.5
溶出緩衝液:40mM硫酸アンモニウム、50mMトリス、pH8.5
ストリップ:脱イオン水
定置洗浄:1N水酸化ナトリウム
保存:0.1N水酸化ナトリウム
UVモニタ:295nm
−試料の調製:試料(配列番号2)を希釈緩衝液で10倍に希釈した(最終的な硫酸アンモニウム濃度は765mMである)。
−サイクル法:200cm/時間で4カラム体積(CV)の800mM硫酸アンモニウム、50mMトリス(pH8.5)によりカラムを平衡化した。次の3つの異なる動的負荷容量において、200cm/時間の速度で試料を負荷した:
ラン1:8.8%の動的負荷容量で負荷。
ラン2:47%の動的負荷容量で負荷。
ラン3:100%の動的負荷容量で負荷。
100cm/時間で7CVの440mM硫酸アンモニウム、50mMトリス(pH8.5)を用い、カラムを洗浄した。200cm/時間で6CVの40mM硫酸アンモニウム、50mMトリス(pH8.5)を用い、カラム溶出を行った。200cm/時間で2CVの脱イオン水を用い、カラムのストリッピングを行った。200cm/時間で3CVの1N水酸化ナトリウムによりカラムを清浄にし、200cm/時間で3CVの0.1N水酸化ナトリウム中に保存した。
n−1不純物及びP=O不純物の相対除去量を、それぞれ、以下の表1及び2に提供する。
実験計画法(DesignExpert(商標)v9)ソフトウェアを使用し、P=O生成物関連不純物の除去に対する動的負荷容量の影響の評価を完了した。統計的設計法の種類は、中心複合であった。研究の種類は、応答曲面法であった。床高20cm及び動的結合容量45mg/mLのPhenyl Sepharoseカラムを用い、50ランを行った。洗浄緩衝液は440mM硫酸アンモニウムであり、溶出緩衝液は40mM硫酸アンモニウムであった。それぞれ7カラム体積及び6カラム体積の洗浄緩衝液及び溶出緩衝液を使用した。実施例1において上記したものと同じ条件を使用し、配列番号2をオリゴヌクレオチドとして使用した。
N−1生成物関連不純物の除去に対する動的負荷容量の影響の評価を図2に示す。図2には5ランがプロットされており、これらは、45mg/mLの疎水性吸着剤の9、24、47、69、及び100%の負荷容量に対応する。N−1の低減率は、粗生物中のN−1の出発レベルから計算した。この分析により、負荷比がN−1の低減において重要な唯一の因子であると結論された。したがって、この統計分析によれば、他の変数は、N−1の低減に対して重要でない。
カラム:6.84mL Phenyl Sepharose Fast Flow高置換(Ge Healthcare Life Sciences、P/C:17−0973−05)
床高:20cm
生成物希釈緩衝液:850mM硫酸アンモニウム、50mMトリス、pH8.5
平衡化緩衝液:800mM硫酸アンモニウム、50mMトリス、pH8.5
粗生成物負荷:765mM硫酸アンモニウム、50mMトリス、pH8.5
洗浄緩衝液:440mM硫酸アンモニウム、50mMトリス、pH8.5
400mM硫酸アンモニウム、50mMトリス、pH8.5
溶出緩衝液:40mM硫酸アンモニウム、50mMトリス、pH8.5
10mM硫酸アンモニウム、50mMトリス、pH8.5
ストリップ:脱イオン水
定置洗浄:1N水酸化ナトリウム
保存:0.1N水酸化ナトリウム
UVモニタ:295nm
−試料の調製:試料(配列番号2)を希釈緩衝液で10倍に希釈した(最終的な硫酸アンモニウム濃度は765mMである)。
−サイクル法:200cm/時間で4カラム体積(CV)の800mM硫酸アンモニウム、50mMトリス(pH8.5)によりカラムを平衡化した。表3に示した5つの異なる負荷比において、200cm/時間の速度で試料を負荷した。
物質:
カラム:81mL、Phenyl Sepharose Fast Flow高置換を充填
床高:15cm、ベッド直径:2.6cm
生成物希釈緩衝液:575mM硫酸アンモニウム、50mMトリス、pH8.5
平衡化緩衝液:500mM硫酸アンモニウム、50mMトリス、pH8.5
粗生成物負荷:500mM硫酸アンモニウム、50mMトリス、pH8.5
洗浄緩衝液:250mM硫酸アンモニウム、50mMトリス、pH8.5
溶出緩衝液:10mM硫酸アンモニウム、50mMトリス、pH8.5
ストリップ:水
定置洗浄:1N水酸化ナトリウム
保存:0.1N水酸化ナトリウム
UVモニタ:295nm
−試料の調製:粗試料(配列番号1)を生成物希釈緩衝液で7.7倍に希釈した(最終的な硫酸アンモニウム濃度は500mMである)。
−クロマトグラフィーカラム法:150cm/時間で5カラム体積(CV)の500mM硫酸アンモニウム、50mMトリス(pH8.5)によりカラムを平衡化した。希釈した粗試料を、47%(26.5mg生成物/mL樹脂)の動的負荷容量において150cm/時間の流速で負荷した。
粗生物中の量に対する脱塩基不純物、CNEt不純物、及びN+1不純物の相対除去量を、それぞれ、以下の表4、5、及び6に提供する。
Claims (33)
- 標的オリゴヌクレオチド及び生成物関連不純物を含有する混合物から前記標的オリゴヌクレオチドを分離するための方法であって、
a)前記混合物に塩を添加するステップと、
b)疎水性吸着剤の容量の約32〜約78%の動的負荷容量において、希釈された前記混合物を前記疎水性吸着剤に接触させるステップと、
c)前記疎水性吸着剤を塩水溶液で洗浄するステップと、
d)前記標的オリゴヌクレオチドを溶離液で溶離するステップと、
e)前記標的オリゴヌクレオチドを含む溶出液を収集するステップと
を含み、前記生成物関連不純物が少なくとも1つのn−1不純物を含み、これにより前記生成物関連不純物から前記標的オリゴヌクレオチドが分離される、前記方法。 - 標的のチオール化オリゴヌクレオチド及び生成物関連不純物を含有する混合物から前記標的オリゴヌクレオチドを分離するための方法であって、
a)前記混合物に塩を添加するステップと、
b)疎水性吸着剤の容量の約40〜約100%の動的負荷容量において、希釈された前記混合物を前記疎水性吸着剤に接触させるステップと、
c)前記疎水性吸着剤を塩水溶液で洗浄するステップと、
d)前記標的オリゴヌクレオチドを溶離液で溶離するステップと、
e)前記標的オリゴヌクレオチドを含む溶出液を収集するステップと
を含み、前記生成物関連不純物が少なくとも1つのP=O不純物を含み、これにより前記生成物関連不純物から前記標的オリゴヌクレオチドが分離される、前記方法。 - 前記塩が前記混合物に塩水溶液として添加されるか、または前記塩が前記混合物に直接溶解される、請求項1または2に記載の方法。
- 前記洗浄ステップの流速が負荷流速よりも遅い、先行請求項のいずれか1項に記載の方法。
- 前記溶離液が、水、塩水溶液、エチレングリコール、もしくはプロピレングリコール、またはそれらの混合物から選択される、先行請求項のいずれか1項に記載の方法。
- 前記溶出液の収集が、前記生成物の溶出ピークの最初の1〜25%を含まないように遅延される、先行請求項のいずれか1項に記載の方法。
- 前記溶出液の収集が、前記生成物の溶出ピークの最初の10〜25%を含まないように遅延される、先行請求項のいずれか1項に記載の方法。
- 前記溶出液の収集が、前記生成物の溶出ピークの最初の5〜10%を含まないように遅延される、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
- 前記溶出液の収集が、前記生成物の溶出ピークの最後の1〜25%を含まない、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
- 前記溶出液の収集が、前記生成物の溶出ピークの最後の5〜10%を含まない、請求項9に記載の方法。
- 前記溶出液の収集が、前記生成物の溶出ピークの最後の10〜25%を含まない、請求項9に記載の方法。
- 前記疎水性吸着剤が少なくとも15cmの床高で充填される、先行請求項のいずれかに記載の方法。
- 前記塩が、NH4 +、K+、またはNa+のうちのいずれかのカチオン、及びF−、[SO4]−2、[HPO4]−2、酢酸イオン、もしくはCl−からなるいずれかのアニオン、またはそれらの組み合わせを含む、先行請求項のいずれか1項に記載の方法。
- 前記塩が硫酸アンモニウムである、先行請求項のいずれか1項に記載の方法。
- 前記疎水性吸着剤が、フェニル、ブチル、またはヘキシルを含む、先行請求項のいずれか1項に記載の方法。
- 前記標的オリゴヌクレオチドが15〜25個のヌクレオチドを含む、先行請求項のいずれか1項に記載の方法。
- 前記標的オリゴヌクレオチドが、アデニン、グアニン、チミン(5−メチルウラシル)、シトシン、ヒポキサンチン、キサンチン、7−メチルグアニン、5,6−ジヒドロウラシル、5−メチルシトシン、7−デアザプリン、及び5−ヒドロキシメチルシトシンからなる群から独立して選択される核酸塩基を含む、先行請求項のいずれか1項に記載の方法。
- 前記標的オリゴヌクレオチドが、アデニン、グアニン、チミン(5−メチルウラシル)、及び5−メチルシトシンからなる群から独立して選択される核酸塩基を含む、先行請求項のいずれか1項に記載の方法。
- 前記標的オリゴヌクレオチドが、任意選択で置換されている糖を含むか、2つの非ジェミナル環原子が架橋して二環式核酸(BNA)を形成しているか、または、前記糖の環酸素原子が、S、N(R)、もしくはC(R1)(R)2(式中、RはHまたはC1〜C12アルキルである)、及びこれらの組み合わせに置き換えられている、先行請求項のいずれか1項に記載の方法。
- 前記糖が、2’位において、O[(CH2)nO]mCH3、O(CH2)nNH2、O(CH2)nCH3、O(CH2)nONH2、OCH2C(=O)N(H)CH3、及びO(CH2)nON[CH2)nCH3]2(式中、n及びmは独立して、1〜約10である)で置換されている、請求項19に記載の方法。
- 前記糖が、2’においてO(CH2)2OCH3で置換されている、請求項19に記載の方法。
- 前記標的オリゴヌクレオチドが、RNAのみ、DNAのみ、またはRNA及びDNAの組み合わせを含む、先行請求項のいずれか1項に記載の方法。
- 前記標的オリゴヌクレオチドがギャップマーである、先行請求項のいずれか1項に記載の方法。
- 前記標的オリゴヌクレオチドが、ホスホジエステル(P=O)、ホスホロチオエート(P=S)、またはそれらの組み合わせを含む、先行請求項のいずれか1項に記載の方法。
- 前記標的オリゴヌクレオチドの配列が(配列番号1)である、先行請求項のいずれか1項に記載の方法。
- 前記標的オリゴヌクレオチドの配列が(配列番号2)である、先行請求項のいずれか1項に記載の方法。
- 前記標的オリゴヌクレオチドが、4,4’−ジメトキシトリチル(DMT)を含む、先行請求項のいずれか1項に記載の方法。
- 前記標的オリゴヌクレオチドが、4,4’−ジメトキシトリチル(DMT)を含まない、請求項1〜27のいずれか1項に記載の方法。
- 前記生成物関連不純物が、少なくとも1つのP=O不純物を更に含む、請求項1に記載の方法。
- 前記生成物関連不純物が、少なくとも1つのn−1不純物を更に含む、請求項2に記載の方法。
- 前記生成物関連不純物が、少なくとも1つの脱塩基不純物を更に含む、請求項1〜30のいずれか1項に記載の方法。
- 前記生成物関連不純物が、少なくとも1つのCNEt不純物を更に含む、請求項1〜31のいずれか1項に記載の方法。
- 前記生成物関連不純物が、少なくとも1つのN+1不純物を更に含む、請求項1〜32のいずれか1項に記載の方法。
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