JP2019516369A - 液体試料中の成分の磁気抽出のための方法及びシステム - Google Patents
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Abstract
Description
− 試料を磁性粒子と混合する段階;
− 液体をピペットすることを目的とした先端を含むチューブ状のピペットコーン内へと、ウェルから混合物を吸引する段階;
− ピペットコーンの内壁上に、
○「捕捉」ゾーンと呼ばれる、ピペットコーンの先端上の前記コーンの所定のゾーンに磁性粒子を引付及び保持することができる第1の磁界を、ピペットコーンに適用することにより;及び、
○ウェル内へ、ピペットコーンに含有される混合物を吸引及び排出する少なくとも一のサイクルを適用することにより;
磁性粒子を捕捉する段階;
− ピペットコーンの内壁上に捕捉された粒子を、
○ピペットコーンに含有される混合物を排出することにより;及び
○洗浄溶液を含有するウェルから、ピペットコーン内へ洗浄溶液を吸引及び排出する少なくとも一のサイクルを適用することにより;
洗浄する少なくとも一の段階;
− 第1の磁界に関してピペットコーンの相対運動を行うことにより、ピペットコーンの内壁上の磁性粒子を、捕捉ゾーンからピペットコーンの先端へ移動させる段階;並びに
− ピペットコーンの先端に移動した前記磁性粒子を、溶液を含有する回収ウェルへ移送する段階
を含む方法である。
− ピペットコーンの先端を回収ウェル中に置くこと;及び
− ピペットコーンの先端に含有される磁性粒子を回収ウェル中に移動させるように、回収ウェルの底部から第2の磁界を適用すること
を含む。
− 第1の頻度でサイクルを適用する第1の段階;
− その後の、第1の頻度より低い第2の頻度でサイクルを適用する第2の段階
を含む。
− 磁界を失活させること;
− 洗浄溶液を含有するウェルから、ピペットコーン内へ洗浄溶液を吸引及び排出する少なくとも一のサイクルを適用することによって、捕捉された粒子を放出すること;
−
○ピペットコーンに第1の磁界を適用することによって、及び
○洗浄溶液を含有するウェル内へ、ピペットコーンに含有される混合物を吸引及び排出する少なくとも一のサイクルを適用することによって、
ピペットコーンの内壁上に捕捉する第2の段階を適用すること
により、ピペットコーンの内壁上に捕捉された粒子を洗浄する少なくとも一の段階を含む。
− 前記ピペットコーン内へと、洗浄溶液を吸引すること;
− その後、磁性粒子に適用される第1の磁界を、ピペットコーンの内壁上に前記粒子を捕捉するために、調節すること;
− その後、ピペットコーン洗浄液体を排出すること
により、ピペットコーンの内壁上に捕捉された粒子を洗浄する少なくとも一の段階を含む。
− ピペットコーンを前記コーンの縦軸と平行に動かし、第1の磁界を一定に保つこと;及び/又は
− 捕捉された粒子の前に互いに離間した磁石を通過させること
により行われる。
− 基部;
− ウェル支持体を取り外し可能に収容できる、基部に作製された凹部;
− 有利には液体をピペットすることを目的とする先端を含む少なくとも一のチューブ状ピペットコーンを備えたピペットを取り外し可能に挿入することができる、基部の凹部に開口している第1のハウジングを含むピペット支持体であって、ピペットコーンの軸に平行な方向において基部に対して並進運動可能であり、各ピペットコーンの先端がウェル支持体のウェルに挿入される第1の位置と、前記先端が前記ウェルの外側にある少なくとも一の第2の位置の間で運動可能である、ピペット支持体;
− 磁化部分を取り外し可能に収容できる第2のハウジングであって、ピペット支持体が第1の位置にあるときにピペットコーンの先端上の位置でピペットコーンのそれぞれに対向し、ピペット支持体が第2の位置にあるときにピペットコーンの先端に対向する、第2のハウジング
を含むピペットホルダーでもある。
− 基部は少なくとも一の回転できる歯車を備え;
− 且つ、ピペット支持体は、歯車の回転中にピペット支持体を基部に対して並進運動させるために、歯車と係合するラックを備える。
− 液体をピペットすることを目的とする先端を含む少なくとも一のチューブ状ピペットコーンと、各ピペットコーンに吸引及び排出のための回路とを備えるピペット;
− 少なくとも一のウェル支持体;
− 以下:
○基部;
○各ウェル支持体を取り外し可能に受領できる、基部に作製された凹部;
○有利にはピペットが取り外し可能に挿入される、基部の凹部に開口している第1のハウジングを含むピペット支持体であって、ピペットコーンの軸に平行な方向において基部に対して並進運動可能であり、各ピペットコーンの先端がウェル支持体のウェルに挿入される第1の位置と、前記先端が前記ウェルの外側にある少なくとも一の第2の位置の間で運動可能である、ピペット支持体;
○ピペット支持体が第1の位置にあるときにピペットコーンの先端上の位置でピペットコーンのそれぞれに対向し、ピペット支持体が第2の位置にあるときにピペットコーンの先端に対向する、第2のハウジング
を備えるピペットホルダー;及び
− 第2のハウジングに取り外し可能に挿入された磁化部分
を含むシステムでもある。
− マイクロプレート18aの第1の列の各ウェルが、シリカ粒子を含む溶解試料(以下「溶解試料」と称する)で満たされ、第1の列の各ウェル中の総容積は、5mlのディープウェルマイクロプレートの使用及び電子ピペットにより取り扱われる容積のため、好ましくは1.5ml超であるように;
− マイクロプレート18aの第2の列の各ウェル66が1250μlの洗浄バッファー(例えばbioMerieuxのbMx参照番号280131の「NucliSENS easyMAG Extraction Buffer No.2」)で満たされるように;
− マイクロプレート18aの第3の列の各ウェル66が1250μlの洗浄バッファー(例えばbioMerieuxのbMx参照番号280131の「NucliSENS easyMAG Extraction Buffer No.2」)で満たされるように;
− 磁性ラック18bに挿入される各PCR溶出チューブ69が100μlの容積のバッファー(例えばbioMerieuxの参照番号280132の「NucliSENS easyMAG Extraction Buffer No.3」)で満たされるように、
5mlのウェル62を有するマイクロプレート18aと、磁性ラック18bの0.2mlのPCR溶出チューブ69を満たすことにより、108で継続する。
− プレート18aの導入を可能にするように、電子ピペット12をそのコーン20の列とともに、ピペットホルダー14のハウジング38に上昇した位置で配置し;且つ
− プレート18aを、コーン20に合わせて溶解試料を含むウェルの第1列を有する基部34のハウジング56に配置する。
1.例えば、先述の方法における、ピペットコーン中で磁性粒子を捕捉する第1の工程;
2.洗浄バッファー(例えばbioMerieuxの参照番号280130の「NucliSENS easyMAG Extraction Buffer No.1」)で満たされたマイクロプレートの異なる列における、その後の第1の洗浄工程、及び好ましくは少なくとも一の第2の洗浄工程。各洗浄操作は、ピペットコーン上に捕捉された粒子を有する洗浄バッファーの吸引/排出のサイクルを含み、少なくとも15秒、好ましくは25秒から35秒の間、例えば30秒、且つ好ましくは1分未満続く;
3.洗浄バッファー(例えばbioMerieuxの参照番号bMx280131の「NucliSENS easyMAGExtraction Buffer No.2」)で満たされたマイクロプレート18aの第3の列における少なくとも一の第3の洗浄工程。この第3の洗浄工程中、粒子を再懸濁するために、磁石を除去することにより粒子は放出され、懸濁液中に粒子を有するバッファーは、マイクロプレート18aの対応するウェルで吸引/排出される。好ましくは先述のようにペレット上をメニスカスが通過する段階を含む第3の洗浄工程は、数分間、特に5分間続く;
4.例えば先述のようにピペットコーン中で粒子を捕捉する第2の工程;
5.任意選択的には、第4の洗浄工程、粒子は洗浄バッファー(例えばbioMerieuxの参照番号bMx280131の「NucliSENS easyMAGExtraction Buffer No.2」)で満たされたマイクロプレート18aの第3の列で捕捉される;
6.粒子ペレットの先端への移動の工程と、その後の、チューブ(例えば溶出バッファー、例えば先述のようなbioMerieuxの参照番号280132の「NucliSENS easyMAG Extraction Buffer No.3」を含むもの)への移送の工程
を含む。
− 抽出バッファーNo.1は、シリカのシラノール基と核酸のリン酸基との間に架橋を作成することにより、シリカ上の核酸の捕捉を促進するバッファーである。それには、例えば、グアニジンチオシアネート、つまり、R.Boom等による文献「Rapid and simple method for purification of nucleic acids.」Journal of Clinical Microbiology. 1989;3 495-503に記載されるカオトロピック剤が含まれる。
− 第1及び第2の洗浄操作は、残留マトリックス又は微生物デブリを除去することを可能にする。
− 第3及び第4の洗浄操作は、GuSCNの痕跡と磁性粒子によって捕捉されたDNA/RNAで通常続いて行われるPCR型増幅の阻害剤の痕跡を除去することを可能する。
− PCRコーンに含まれる溶出バッファーは、洗浄バッファーの痕跡を除去することと、溶出工程に最低な条件下にすることを可能にする。
1.
a.ピペットコーン中10分間の吸引/排出により撹拌して;
b.「Hyglos Streptavidin」磁性粒子(50μl)を添加し、吸引/排出により15分間撹拌して(細菌−ビオチン化ファージタンパク質複合体は磁性粒子と結合する);
c.磁性粒子を収集する段階のための磁石をコーンに置き;
d.磁性粒子捕捉サイクルを起動して;
2mlの試料をビオチン化ファージタンパク質溶液(最終濃度2μg/ml)と接触させることによる特異的な捕捉工程:
2.TST(Tris Saline Tween)洗浄溶液を含有するウェル中5回の吸引/排出サイクルで洗浄する工程;
3.ビーズビーティング処理に供された5マイクロリットルチューブに磁性粒子を収集する工程であって、ここで、5マイクロリットルの最終溶液はq−PCRに供される、工程
からなる。
− 行われる様々な上述の工程を可能にする、プログラム可能な電子ピペットと支持体との組み合わせからなる自動システムを使用して行われる磁性粒子の捕捉/洗浄/溶出の工程;
− 1から8の数の試料が使用される電子ピペットの構成に応じて処理されること;
− 試料が半自動システムを有する上記で規定された文脈で平行して処理されること;
− 必要に応じて、2のシステムが組み合わされ、処理される試料の数を増加させること;
− 溶出工程が様々なタイプのチューブで行われること:核酸捕捉に関与する(例えばNucliSENS(著作権)化学)ときには磁性シリカ粒子を回収するための0.2mlのPCRチューブ、又は病原体(磁性免疫濃縮)の回収のために使用された磁性粒子の回収の場合はビーズビーティングチューブ。この目的のため、システムは、磁性粒子上の病原体の捕捉/濃縮の工程と、セラミック/ガラスビーズ(例えばCapLyse(著作権)型)による、そのin situ溶解の工程とを可能にする、
を可能にする。
Claims (31)
- 液体形態の生物学的試料に含有される、磁性粒子と結合することができる成分を抽出するための方法であって、
− 試料を磁性粒子と混合する段階(106);
− 液体をピペットすることを目的とした先端(21)を含むチューブ状のピペットコーン(20)内へと、ウェルから混合物を吸引する段階(110);
− 以下:
○「捕捉」ゾーンと呼ばれる、ピペットコーン(20)の先端上の前記コーンの所定のゾーンに磁性粒子を引付及び保持することができる第1の磁界(16)を、ピペットコーン(20)に適用すること;及び
○ウェル(62)内へと、ピペットコーン(20)に含有される混合物を吸引及び排出する少なくとも一のサイクルを適用すること
により、ピペットコーン(20)の内壁上に磁性粒子を捕捉する段階(112);
− 以下:
○ピペットコーン(20)に含有される混合物を排出すること;及び
○洗浄溶液を含有するウェル(62)から、ピペットコーン(20)内へと、洗浄溶液を吸引及び排出する少なくとも一のサイクルを適用すること
により、ピペットコーン(20)の内壁上に捕捉された粒子を洗浄する少なくとも一の段階(114、116):
− 第1の磁界(16)に関してピペットコーン(20)の相対運動を行うことにより、ピペットコーン(20)の内壁上の磁性粒子を、捕捉ゾーンからピペットコーン(20)の先端(21)へ移動させる段階(118);
− ピペットコーン(20)の先端(21)に移動した前記磁性粒子を、溶液を含有する回収ウェル(69)へ移送する段階(120)
を含む方法。 - 第1の磁界(16)の運動が、ピペットコーン(20)を前記コーン(20)の縦軸(X)に平行に動かし、第1の磁界(16)を一定に保つことからなり、ピペットコーンの縦軸(X)が、ピペットコーン(20)の運動中に第1の磁界(16)から等しい距離にとどまる、請求項1に記載の方法。
- 移送段階(120)が、
− ピペットコーン(20)の先端(21)を回収ウェル(69)中に置くこと;及び
− ピペットコーン(20)の先端(21)に含有される磁性粒子を回収ウェル(69)中に移動させるように、回収ウェル(69)の底部から第2の磁界(68)を適用すること
を含む、請求項1又は2に記載の方法。 - 第2の磁界(68)が、部分的に又は完全にピペットコーンの先端の下に配置された磁石によって生成される、請求項3に記載の方法。
- ピペットコーンに適用される第1の磁界が、第2の磁界の適用中に失活される、請求項3又は4に記載の方法。
- 移送段階(120)が、第1の磁界(16)の失活と、その後にピペットコーンの先端(21)内へと、回収ウェル(69)の溶液を吸引及び排出するサイクルの適用を含み、前記適用が、
− 第1の頻度でサイクルを適用する第1の段階;
− その後の、第1の頻度より低い第2の頻度でサイクルを適用する第2の段階
を含む、請求項3から5のいずれか一項に記載の方法。 - 捕捉段階(112)の前に、ピペットコーンに含有される混合物を、ピペットコーン内へと前記混合物を吸引及び排出する少なくとも一のサイクルを適用することにより、撹拌する段階を含む、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。
- 移送段階(120)の前に、
a.磁界を失活させること;
b.洗浄溶液を含有するウェルから、ピペットコーン内へと、洗浄溶液を吸引及び排出する少なくとも一のサイクルを適用することによって、捕捉された粒子を放出すること;
c.
○ピペットコーンに第1の磁界を適用することにより、及び
○洗浄溶液を含有するウェル内へと、ピペットコーンに含有される混合物を吸引及び排出する少なくとも一のサイクルを適用することにより
ピペットコーンの内壁上に捕捉する第2の段階を適用すること;
により、ピペットコーンの内壁上に捕捉された粒子を洗浄する少なくとも一の段階を含む、請求項1から7のいずれか一項に記載の方法。 - 捕捉された粒子の放出が、ピペットコーン中に捕捉された粒子のペレット上で前記溶液のメニスカスの上下運動を行うような方法でサイクルを適用する段階を含み、前記メニスカスの上下運動が、ピペットコーンの全長よりも短いコーンの一部上で行われる、請求項8に記載の方法。
- 捕捉された粒子の放出が、コーン洗浄溶液を完全に吸引及び排出するようにサイクルを適用する第2の段階を含む、請求項9に記載の方法。
- 第2の段階のサイクルの適用頻度が、第1の段階のサイクルの適用頻度よりも低い、請求項10に記載の方法。
- 捕捉された粒子の放出の前に、少なくとも二つの洗浄段階が、二つの異なる洗浄溶液において行われる、請求項8から11のいずれか一項に記載の方法。
- 生物学的試料に含有される成分が核酸である、請求項8から12のいずれか一項に記載の方法。
- 生物学的試料に含有される成分が微生物であり、単一の捕捉段階と単一の洗浄段階とを含む、請求項1から7のいずれか一項に記載の方法。
- 試料と磁性粒子との混合物が、1ミリリットル超、好ましくは2ミリリットル以上の容積を有し、回収ウェルの容積が、200マイクロリットル未満、好ましくは100マイクロリットル以下である、請求項14に記載の方法。
- 移送段階(120)の前に、
− ピペットコーン内に洗浄溶液を吸引すること;
− その後、磁性粒子に適用される第1の磁界を、ピペットコーンの内壁上に前記粒子を捕捉するために、調節すること;
− その後、ピペットコーン洗浄液体を排出すること
により、ピペットコーンの内壁上に捕捉された粒子を洗浄する少なくとも一の段階を含む、請求項1から15のいずれか一項に記載の方法。 - 第1の磁界の調節が、
− ピペットコーンを前記コーンの縦軸と平行に動かし、第1の磁界を一定に保つこと;及び/又は、
− 捕捉された粒子の前に互いに離間した磁石を通過させること
により行われる、請求項16に記載の方法。 - ピペットコーンの容積が、回収ウェルの容積の少なくとも10倍である、請求項1から17のいずれか一項に記載の方法。
- 混合物の体積が、ピペットコーンの容積の少なくとも3倍である、請求項1から18のいずれか一項に記載の方法。
- 成分が、核酸、微生物、タンパク質及びペプチドにより形成される群に属する、請求項1から19のいずれか一項に記載の方法。
- − 基部(34);
− ウェル支持体(18a、18b)を取り外し可能に収容できる、基部(34)に作製された凹部(56);
− 液体をピペットすることを目的とする先端(21)を含む少なくとも一のチューブ状ピペットコーン(20)を備えたピペット(12)を挿入することができる第1のハウジング(38)を含むピペット支持体(36)であって、ピペットコーン(20)の軸(X)に平行な方向において基部(34)に対して並進運動可能であり、各ピペットコーンの先端(21)がウェル支持体(18a、18b)のウェル(62、69)に挿入される第1の位置と、前記先端(21)が前記ウェル(62、69)の外側にある少なくとも一の第2の位置の間で運動可能である、ピペット支持体;
− 磁化部分(16)を取り外し可能に収容できる第2のハウジング(78)であって、ピペット支持体(36)が第1の位置にあるときにピペットコーン(20)の先端上の位置でピペットコーンのそれぞれに対向し、ピペット支持体(36)が第2の位置にあるときにピペットコーン(20)の先端に対向する、第2のハウジング
を備えるピペットホルダー(14)。 - 第1のハウジング(38)が、第1のハウジング(38)へのピペット(12)の前側の挿入及び第1のハウジングからのピペット(12)の前側の除去のための開口部を備える、請求項21に記載のピペットホルダー。
- 第2のハウジング(78)が基部(36)中に作製されている、請求項21又は22に記載のピペットホルダー。
- ピペット支持体(36)が第2の位置にあるときに、ピペットコーン(20)の先端(21)上の位置で各ピペットコーンを対向させるために、磁化部分(16)が取り外し可能に挿入されうるピペット支持体(36)中の第3のハウジングを備える、請求項21から23のいずれか一項に記載のピペットホルダー。
- 第2及び第3のハウジングが連通し、ピペット支持体が、第3のハウジング中に磁化部分を取り外し可能に維持することが可能な手段を含む、請求項24に記載のピペットホルダー。
- − 基部(34)が少なくとも一の回転できる歯車を備え;且つ
− ピペット支持体(36)が、歯車(42)の回転中にピペット支持体を基部(34)に対して並進運動させるために、歯車と係合するラック(40)を備える、
請求項21から25のいずれか一項に記載のピペットホルダー。 - 少なくとも第1の位置にピペット支持体(82)をロック及びアンロックするための装置を備える、請求項26に記載のピペットホルダー。
- 歯車を回すために歯車にしっかりと結合され、且つ、別のピペットホルダーの歯車にしっかりと結合されたハンドル(50)に取り外し可能に設置できる少なくとも一のハンドル(50)を含む、請求項26及び27に記載のピペットホルダー。
- 液体形態の生物学的試料に含有される、磁性粒子と結合することができる成分を抽出するためのシステムであって、
− 液体をピペットすることを目的とする先端(21)を含む少なくとも一のチューブ状ピペットコーン(20)と、各ピペットコーン(20)に吸引及び排出のための回路とを備えるピペット(12);
− 少なくとも一のウェル支持体(18a、18b);
− 以下:
○基部(34);
○各ウェル支持体を取り外し可能に収容できる、基部(34)に作製された凹部(56);
○ピペット(12)が挿入される、基部(34)の凹部(56)に開口している第1のハウジング(38)を含むピペット支持体(36)であって、ピペットコーン(12)の軸(X)に平行な方向において基部(34)に対して並進運動可能であり、各ピペットコーン(36)の先端(21)がウェル支持体(18a、18b)のウェル(62、69)に挿入される第1の位置と、前記先端(21)が前記ウェル(62、69)の外側にある少なくとも一の第2の位置の間で運動可能である、ピペット支持体;
○ピペット支持体が第1の位置にあるときにピペットコーン(20)の先端(21)上の位置でピペットコーンのそれぞれに対向し、ピペット支持体が第2の位置にあるときにピペットコーンの先端に対向する、第2のハウジング(78)
を備えるピペットホルダー(14);及び
− 第2のハウジング(78)に取り外し可能に挿入された磁化部分(16)
を含むシステム。 - ピペットホルダーが請求項21から28に記載のものである、請求項29に記載のシステム。
- ウェル(69)を受領するための凹部(66)が作製される部分(64)と、前記部分(64)に作製される凹部(66)のそれぞれに対向する少なくとも一の磁石(68)とを含むウェル支持体(18b)。
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