JP2019510503A - キメラ抗原受容体t細胞組成物 - Google Patents
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Abstract
本発明は、がん、感染性疾患、自己免疫疾患、炎症性疾患、および免疫不全症が挙げられるが、これらに限定されない、多くの状態の治療、予防、または緩和のための養子免疫エフェクター細胞療法のための改善された組成物を提供する。より具体的には、本発明は、改善されたキメラ抗原受容体(CAR)T細胞組成物、ならびにその作製方法および使用方法に関する。特定の実施形態において企図される免疫エフェクター細胞は、1つ以上のT細胞受容体遺伝子座におけるキメラ抗原受容体(CAR)および正確な破壊または修飾を含み、TCR発現およびシグナル伝達の破壊をもたらす。
Description
関連出願の相互参照
本出願は、米国特許法第119条(e)の下で、2016年4月14日出願の米国仮出願第62/322,547号、2016年4月7日出願の米国仮出願第62/319,703号の利益を主張するものであり、これらの出願の各々は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
本出願は、米国特許法第119条(e)の下で、2016年4月14日出願の米国仮出願第62/322,547号、2016年4月7日出願の米国仮出願第62/319,703号の利益を主張するものであり、これらの出願の各々は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
配列表に関する記載
本出願に関連する配列表は、紙コピーの代わりにテキスト形式で提供され、本明細書において参照により本明細書に組み込まれる。配列表を含むテキストファイルの名称はBLBD_067_02WO_ST25.txtである。テキストファイルは61KBであり、2017年4月7日に作成され、本明細書の出願と同時に、EFS−Webを介して電子的に提出される。
本出願に関連する配列表は、紙コピーの代わりにテキスト形式で提供され、本明細書において参照により本明細書に組み込まれる。配列表を含むテキストファイルの名称はBLBD_067_02WO_ST25.txtである。テキストファイルは61KBであり、2017年4月7日に作成され、本明細書の出願と同時に、EFS−Webを介して電子的に提出される。
本発明は、養子細胞療法のための改善された免疫エフェクター細胞組成物に関する。より具体的には、本発明は、改善されたキメラ抗原受容体(CAR)T細胞組成物、ならびにその作製方法および使用方法に関する。
関連技術の説明
がんの世界的負担は、1975〜2000年に2倍になった。がんは、世界中で罹患率および死亡率の2番目に多い原因であり、2012年には、約1410万の新しい症例および820万のがん関連死亡を伴う。最も一般的ながんは、乳癌、肺、および気管支癌、前立腺癌、結腸および直腸癌、膀胱癌、皮膚の黒色腫、非ホジキンリンパ腫、甲状腺癌、腎臓および腎盂癌、子宮内膜癌、白血病、および膵臓癌である。新たながん症例の数は、今後20年以内に、2200万まで上昇すると予想される。
がんの世界的負担は、1975〜2000年に2倍になった。がんは、世界中で罹患率および死亡率の2番目に多い原因であり、2012年には、約1410万の新しい症例および820万のがん関連死亡を伴う。最も一般的ながんは、乳癌、肺、および気管支癌、前立腺癌、結腸および直腸癌、膀胱癌、皮膚の黒色腫、非ホジキンリンパ腫、甲状腺癌、腎臓および腎盂癌、子宮内膜癌、白血病、および膵臓癌である。新たながん症例の数は、今後20年以内に、2200万まで上昇すると予想される。
T細胞の単離、改変、拡張、および再注入に基づいた養子細胞免疫療法戦略は、初期段階臨床治験において検討および試験されている。特に、キメラ抗原受容体を発現するT細胞(CAR T細胞)に基づいた戦略は、それらの選択的認識および強力なエフェクター機構によるがん免疫療法のための最適なエフェクター細胞に急速になる。
しかしながら、現在の治療は、成功の混合した速度を示し、小人数の患者のみが長期寛解を形成し、CAR T細胞系免疫療法にとっていまだに実現されていない可能性を示す。
本発明は、概して、一部分において、改善された免疫エフェクター細胞組成物、およびそれを製造する方法に関する。特定の実施形態において企図される免疫エフェクター細胞は、1つ以上のT細胞受容体遺伝子座におけるキメラ抗原受容体(CAR)および正確な破壊または修飾を含み、TCR発現およびシグナル伝達の破壊をもたらす。驚くべきことには、本発明者らは、1つ以上の改変されたT細胞受容体アルファ(TCRα)対立遺伝子を含むCAR T細胞が、増加した量の細胞傷害性サイトカインを分泌し、改変されたTCRα対立遺伝子を欠いているCAR T細胞よりも治療上有効であることを発見している。
様々な実施形態において、1つ以上の改変されたT細胞受容体アルファ(TCRα)対立遺伝子を含むキメラ抗原受容体(CAR)T細胞が、提供され、CAR T細胞は、標的抗原に結合したとき、1つ以上の改変されたTCRα対立遺伝子を欠いている標的抗原に結合したCAR T細胞と比較して、増加した量の炎症性サイトカインを分泌する。
特定の実施形態において、CARは、BCMA、CD19、CSPG4、PSCA、ROR1、およびTAG72からなる群から選択される標的抗原に結合する細胞外ドメインを含む。
ある特定の実施形態において、CARは、T細胞受容体のアルファ鎖またはベータ鎖、CD3δ、CD3ε、CD3γ、CD3ζ、CD4、CD5、CD8α、CD9、CD16、CD22、CD27、CD28、CD33、CD37、CD45、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD152、CD154、およびPD−1からなる群から選択されるポリペプチドから単離された膜貫通ドメインを含む。
特定の実施形態において、CARは、TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、CARD11、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CD54(ICAM)、CD83、CD134(OX40)、CD137(4−1BB)、CD278(ICOS)、DAP10、LAT、NKD2C、SLP76、TRIM、およびZAP70からなる群から選択されるポリペプチドから単離された1つ以上の細胞内共刺激シグナル伝達ドメインを含む。
さらなる実施形態において、CARは、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD22、CD79a、CD79b、およびCD66dからなる群から選択されるポリペプチドから単離されたシグナル伝達ドメインを含む。
いくつかの実施形態において、CARは、CD8αのヒンジ領域、PD1のヒンジ領域、およびCD152のヒンジ領域からなる群から選択されるヒンジ領域ポリペプチドを含む。
ある特定の実施形態において、CARは、1つ以上のリンカーポリペプチドを含む。
特定の実施形態において、CARは、IgG1、IgG4、またはIgDのCH2およびCH3領域を含むスペーサー領域ポリペプチドを含む。
さらなる実施形態において、CARは、IgG1重鎖シグナルポリペプチド、CD8αシグナルポリペプチド、およびヒトGM−CSF受容体アルファシグナルポリペプチドからなる群から選択されるシグナルペプチドを含む。
特定の実施形態において、1つ以上の改変されたTCRα対立遺伝子は、非機能性であるか、または実質的に減少した機能を有する。
さらなる実施形態において、CAR T細胞は、CARをコードする核酸を含む1つ以上のプロウイルス組み込み体を含む。
ある特定の実施形態において、CAR T細胞は、CARをコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含むポリヌクレオチドを含み、ポリヌクレオチドは、相同組換え修復によって1つ以上のTCRα対立遺伝子に挿入されている。
さらなる実施形態において、1つ以上の炎症性サイトカインは、IFNγ、IL−4、IL−10、TNFα、IL−8、IL−5、IL−6、GM−CSF、およびMIP−1αからなる群から選択される。
様々な実施形態において、1つ以上の改変されたTCRα対立遺伝子、および標的抗原に結合するCARをコードする核酸を含むCAR T細胞が、提供され、CAR T細胞は、標的抗原を発現する標的細胞と接触するときに、1つ以上の改変されたTCRα対立遺伝子を欠いている標的抗原に結合したCAR T細胞と比較して、増加した量の1つ以上の炎症性サイトカインを分泌する。
様々な実施形態において、1つ以上の改変されたTCRα対立遺伝子、および標的抗原に結合するCARをコードする核酸を含む1つ以上のプロウイルス組み込み体を含むCAR T細胞が、提供され、CAR T細胞は、標的抗原に結合したとき、1つ以上の改変されたTCRα対立遺伝子を欠いている標的抗原に結合したCAR T細胞と比較して、増加した量の1つ以上の炎症性サイトカインを分泌する。
様々な実施形態において、1つ以上の改変されたTCRα対立遺伝子を含むCAR T細胞が、提供され、標的抗原に結合するCARをコードする核酸を含むドナー修復テンプレートが、相同組換え修復によって1つ以上のTCRα対立遺伝子に挿入され、CAR T細胞は、標的抗原に結合したとき、1つ以上の改変されたTCRα対立遺伝子を欠いている標的抗原に結合したCAR T細胞と比較して、増加した量の1つ以上の炎症性サイトカインを分泌する。
ある特定の実施形態において、核酸は、CARをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたRNAポリメラーゼIIプロモーターをさらに含む。
いくつかの実施形態において、RNAポリメラーゼIIプロモーターは、短いEF1αプロモーター、長いEF1αプロモーター、ヒトROSA26遺伝子座、ユビキチンC(UBC)プロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼ−1(PGK)プロモーター、サイトメガロウイルスエンハンサー/ニワトリβ−アクチン(CAG)プロモーター、β−アクチンプロモーター、および骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサー、負の制御領域欠失、dl587revプライマー結合部位置換(MND)プロモーターからなる群から選択される。
特定の実施形態において、CARは、BCMA、CD19、CSPG4、PSCA、ROR1、およびTAG72からなる群から選択される抗原に結合する細胞外ドメインを含む。
いくつかの実施形態において、CARは、膜貫通ドメインおよび1つ以上の細胞内シグナル伝達ドメインをさらに含む。
さらなる実施形態において、CARは、膜貫通ドメイン、共刺激ドメイン、および一次シグナル伝達ドメインを含む。
特定の実施形態において、CARは、シグナルペプチド、1つ以上のリンカーペプチド、および1つ以上のヒンジペプチド、ならびに任意に、1つ以上のスペーサーペプチドをさらに含む。
さらなる実施形態において、CARは、抗BCMA scFv、CD8α膜貫通ドメイン、CD137共刺激ドメイン、およびCD3ζ一次シグナル伝達ドメインを含む。
ある特定の実施形態において、CARは、抗CD19scFv、CD8α膜貫通ドメイン、CD137共刺激ドメイン、およびCD3ζ一次シグナル伝達ドメインを含む。
いくつかの実施形態において、CARは、抗CSPG4scFv、CD8α膜貫通ドメイン、CD137共刺激ドメイン、およびCD3ζ一次シグナル伝達ドメインを含む。
特定の実施形態において、CARは、抗ROR1scFv、CD8α膜貫通ドメイン、CD137共刺激ドメイン、およびCD3ζ一次シグナル伝達ドメインを含む。
さらなる実施形態において、CARは、抗PSCA scFv、CD8α膜貫通ドメイン、CD137共刺激ドメイン、およびCD3ζ一次シグナル伝達ドメインを含む。
特定の実施形態において、CARは、抗TAG72scFv、CD8α膜貫通ドメイン、CD137共刺激ドメイン、およびCD3ζ一次シグナル伝達ドメインを含む。
さらなる実施形態において、1つ以上の炎症性サイトカインは、IFNγ、IL−4、IL−10、TNFα、IL−8、IL−5、IL−6、GM−CSF、およびMIP−1αからなる群から選択される。
様々な実施形態において、本明細書において企図されるCAR T細胞を含む、組成物が、提供される。
様々な実施形態において、本明細書において企図されるCAR T細胞、および生理学的に許容される賦形剤を含む、組成物が、提供される。
様々な実施形態において、CAR T細胞を作製する方法が、提供され、本方法は、TCRα対立遺伝子における標的部位で二本鎖切断を操作することであって、切断は、非相同末端連結(NHEJ)によって修復され、それによって改変されたTCRα対立遺伝子を生成する、操作することと、CARをコードするウイルスベクターをT細胞に形質導入することと、を含み、CAR T細胞は、標的抗原に結合したとき、改変されたTCRα対立遺伝子を欠いている標的抗原に結合したCAR T細胞と比較して、増加した量の1つ以上の炎症性サイトカインを分泌する。
ある特定の実施形態において、改変されたTCRα対立遺伝子は、非機能性であるか、または実質的に減少した機能を有する。
特定の実施形態において、ウイルスベクターは、レトロウイルスベクターである。
いくつかの実施形態において、レトロウイルスベクターは、レンチウイルスベクターである。
様々な実施形態において、CAR T細胞を作製する方法が、提供され、本方法は、TCRα対立遺伝子における標的部位で二本鎖切断を操作することと、CARをコードする核酸に作動可能に連結されたRNAポリメラーゼIIプロモーターを含むドナー修復テンプレートを含むウイルスベクターをT細胞に形質導入することと、を含み、ドナー修復テンプレートは、二本鎖切断(DSB)の部位で相同組換え修復によってTCRα対立遺伝子に組み込まれ、CAR T細胞は、標的抗原に結合したとき、改変されたTCRα対立遺伝子を欠いている標的抗原に結合したCAR T細胞と比較して、増加した量の1つ以上の炎症性サイトカインを分泌する。
ある特定の実施形態において、ドナー修復テンプレートは、DSBのTCRα配列5´に相同な5´相同アーム、およびDSBのTCRα配列3´に相同な3´相同アームを含む。
さらなる実施形態において、ウイルスベクターは、組換えアデノ随伴ウイルスベクター(rAAV)またはレトロウイルスである。
特定の実施形態において、rAAVは、AAV2からの1つ以上のITRを有する。
特定の実施形態において、rAAVは、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、およびAAV10からなる群から選択される血清型を有する。
さらなる実施形態において、レトロウイルスは、レンチウイルスである。
いくつかの実施形態において、レンチウイルスは、インテグラーゼ欠損レンチウイルスである。
特定の実施形態において、二本鎖切断は、操作されたヌクレアーゼで生成される。
ある特定の実施形態において、操作されたヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼ、メガTAL、TALEN、ZFN、またはCRISPR/Casヌクレアーゼからなる群から選択される。
ある特定の実施形態において、メガヌクレアーゼは、I−OnuI LHEから操作される。
いくつかの実施形態において、操作されたヌクレアーゼは、TALE DNA結合ドメインおよび操作されたメガヌクレアーゼを含むメガTALである。
さらなる実施形態において、二本鎖切断は、操作されたエンドヌクレアーゼおよび末端プロセシング酵素によって生じる。
特定の実施形態において、操作されたエンドヌクレアーゼをコードするmRNA、および末端プロセシング酵素をコードするmRNAは、T細胞に導入されて、二本鎖切断を生じさせる。
さらなる実施形態において、操作されたエンドヌクレアーゼをコードするmRNA、ウイルス自己切断ペプチド、および末端プロセシング酵素は、T細胞に導入されて、二本鎖切断を生じさせる。
特定の実施形態において、操作されたエンドヌクレアーゼをコードするmRNA、IRES要素、および末端プロセシング酵素は、T細胞に導入されて、二本鎖切断を生じさせる。
さらなる実施形態において、末端プロセシング酵素またはその生物学的に活性な断片に融合された操作されたエンドヌクレアーゼをコードするmRNAは、T細胞に導入されて、二本鎖切断を生じさせる。
ある特定の実施形態において、末端プロセシング酵素は、5´−3´エキソヌクレアーゼ、5´−3´アルカリ性エキソヌクレアーゼ、3´−5´エキソヌクレアーゼ、5´フラップエンドヌクレアーゼ、ヘリカーゼ、またはテンプレート依存性DNAポリメラーゼ活性を示す。
特定の実施形態において、末端プロセシング酵素は、Trex2またはその生物学的に活性な断片を含む。
いくつかの実施形態において、1つ以上の炎症性サイトカインは、IFNγ、IL−4、IL−10、TNFα、IL−8、IL−5、IL−6、GM−CSF、およびMIP−1αからなる群から選択される。
様々な実施形態において、対象におけるがんを治療する方法が、提供され、本方法は、対象に、CAR T細胞または本明細書において企図される組成物を投与することを含む。
さらなる実施形態において、腫瘍を排除するために対象に投与される改変されたTCRα対立遺伝子を含むCAR T細胞の治療上有効量は、腫瘍を排除するために対象に投与される改変されたTCRαを欠いているCAR T細胞の治療上有効量より少ない。
さらなる実施形態において、がんは、固形がんである。
ある特定の実施形態において、がんは、液性がんである。
特定の実施形態において、液性がんは、急性リンパ球性白血病(ALL)、急性骨髄性白血病(AML)、骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性、赤白血病、有毛細胞白血病(HCL)、慢性リンパ球性白血病(CLL)、および慢性骨髄性白血病(CML)、慢性骨髄単球性白血病(CMML)、および真性赤血球増加症、ホジキンリンパ腫、結節性リンパ球優位型ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、小リンパ球性リンパ腫(SLL)、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、免疫芽球性大細胞型リンパ腫、前駆Bリンパ芽球性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、菌状息肉腫、菌状息肉腫、未分化大細胞リンパ腫、セザリー症候群、前駆Tリンパ芽球性リンパ腫、多発性骨髄腫、顕性多発性骨髄腫、くすぶり多発性骨髄腫、形質細胞白血病、非分泌性骨髄腫、IgD骨髄腫、骨硬化性骨髄腫、骨の孤立性形質細胞腫、および髄外性形質細胞腫からなる群から選択される血液学的悪性腫瘍である。
さらなる実施形態において、血液学的悪性腫瘍は、多発性骨髄腫である。
ある特定の実施形態において、血液学的悪性腫瘍は、CLLである。
様々な実施形態において、治療を必要とする対象におけるB細胞関連状態を治療する方法が、提供され、本方法は、対象に、治療上有効量のCAR T細胞または対象に、治療上有効量の本明細書において企図される組成物を投与することを含む。
特定の実施形態において、B細胞関連状態は、多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、不確定な悪性度のB細胞増殖、リンパ腫様肉芽腫症、移植後リンパ増殖性障害、免疫調節性障害、関節リウマチ、重症筋無力症、特発性血小板減少性紫斑病、抗リン脂質抗体症候群、シャーガス病、グレーブス病、ウェゲナー肉芽腫症、結節性多発動脈炎、シェーグレン症候群、尋常性天疱瘡、強皮症、多発性硬化症、抗リン脂質抗体症候群、ANCA関連血管炎、グッドパスチャー病、川崎病、自己免疫性溶血性貧血、および急速進行性糸球体腎炎、重鎖病、原発性もしくは免疫細胞関連アミロイドーシス、または意義不明の単クローン性免疫グロブリン血症である。
ある特定の実施形態において、B細胞関連状態は、B細胞悪性腫瘍である。
特定の実施形態において、B細胞関連状態は、形質細胞悪性腫瘍である。
いくつかの実施形態において、B細胞関連状態は、自己免疫疾患である。
様々な実施形態において、CAR T細胞の有効性を増大させる方法が、提供され、本方法は、TCRα対立遺伝子における標的部位で二本鎖切断(DSB)を形成する操作されたヌクレアーゼを導入して、TCRα対立遺伝子を改変させることによって、CAR T細胞表面上のTCRαシグナル伝達成分の利用能を低減させることを含む。
さらなる実施形態において、CAR T細胞は、CARをコードする1つ以上のプロウイルス組み込み体を含み、DSBは、非相同末端連結(NHEJ)によって修復される。
さらなる実施形態において、CAR T細胞は、DSBで相同組換え修復によってTCRα対立遺伝子に組み込まれるCARをコードする核酸に作動可能に連結されたRNAポリメラーゼIIプロモーターを含む。
いくつかの実施形態において、操作されたヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼ、メガTAL、TALEN、ZFN、またはCRISPR/Casヌクレアーゼからなる群から選択される。
特定の実施形態において、メガヌクレアーゼは、I−OnuI LHEから操作される。
さらなる実施形態において、操作されたヌクレアーゼは、TALE DNA結合ドメインおよび操作されたメガヌクレアーゼを含むメガTALである。
ある特定の実施形態において、二本鎖切断は、操作されたエンドヌクレアーゼおよび末端プロセシング酵素によって生じる。
特定の実施形態において、操作されたエンドヌクレアーゼをコードするmRNA、および末端プロセシング酵素をコードするmRNAは、T細胞に導入されて、二本鎖切断を生じさせる。
いくつかの実施形態において、操作されたエンドヌクレアーゼをコードするmRNA、ウイルス自己切断ペプチド、および末端プロセシング酵素は、T細胞に導入されて、二本鎖切断を生じさせる。
ある特定の実施形態において、操作されたエンドヌクレアーゼをコードするmRNA、IRES要素、および末端プロセシング酵素は、T細胞に導入されて、二本鎖切断を生じさせる。
特定の実施形態において、末端プロセシング酵素またはその生物学的に活性な断片に融合された操作されたエンドヌクレアーゼをコードするmRNAは、T細胞に導入されて、二本鎖切断を生じさせる。さらなる実施形態において、末端プロセシング酵素は、5´−3´エキソヌクレアーゼ、5´−3´アルカリ性エキソヌクレアーゼ、3´−5´エキソヌクレアーゼ、5´フラップエンドヌクレアーゼ、ヘリカーゼ、またはテンプレート依存性DNAポリメラーゼ活性を示す。
さらなる実施形態において、末端プロセシング酵素は、Trex2またはその生物学的に活性な断片を含む。
特定の実施形態において、標的抗原に結合したCAR T細胞は、改変されたTCRα対立遺伝子を欠いている標的抗原に結合したCAR T細胞と比較して増加した量の、IFNγ、IL−4、IL−10、TNFα、IL−8、IL−5、IL−6、GM−CSF、およびMIP−1αからなる群から選択される1つ以上の炎症性サイトカインを分泌する。
配列識別子の簡単な説明
配列番号1は、I−OnuIのポリヌクレオチド配列を示す。
配列番号2は、配列番号1によってコードされるポリペプチド配列を示す。
配列番号3および4は、ゲノム編集のためのTCRα標的部位の例示的な例を示す。
配列番号5〜7は、操作されたI−OnuIバリアントのポリペプチド配列を示す。
配列番号8は、抗CD19 CARのポリペプチド配列を示す。
配列番号9は、プラスミド、pBW1021のポリヌクレオチド配列を示す。
配列番号10は、TCRα I−OnuIのメガTAL標的部位を示す。
配列番号11は、TCRα I−OnuIのメガTALの例示的な例のポリペプチド配列を示す。
配列番号12は、抗BCMA CARの例示的な例のポリペプチド配列を示す。
配列番号13は、プラスミド、pBW400のポリヌクレオチド配列を示す。
配列番号14〜24は、様々なリンカーのアミノ酸配列を示す。
配列番号25〜49は、プロテアーゼ切断部位および自己切断型ポリペプチド切断部位のアミノ酸配列を示す。
配列番号1は、I−OnuIのポリヌクレオチド配列を示す。
配列番号2は、配列番号1によってコードされるポリペプチド配列を示す。
配列番号3および4は、ゲノム編集のためのTCRα標的部位の例示的な例を示す。
配列番号5〜7は、操作されたI−OnuIバリアントのポリペプチド配列を示す。
配列番号8は、抗CD19 CARのポリペプチド配列を示す。
配列番号9は、プラスミド、pBW1021のポリヌクレオチド配列を示す。
配列番号10は、TCRα I−OnuIのメガTAL標的部位を示す。
配列番号11は、TCRα I−OnuIのメガTALの例示的な例のポリペプチド配列を示す。
配列番号12は、抗BCMA CARの例示的な例のポリペプチド配列を示す。
配列番号13は、プラスミド、pBW400のポリヌクレオチド配列を示す。
配列番号14〜24は、様々なリンカーのアミノ酸配列を示す。
配列番号25〜49は、プロテアーゼ切断部位および自己切断型ポリペプチド切断部位のアミノ酸配列を示す。
A.概要
本発明は、概して、一部分において、改善された免疫エフェクター細胞組成物、およびそれを製造する方法に関する。特定の実施形態において企図される免疫エフェクター細胞は、1つ以上のT細胞受容体遺伝子座におけるキメラ抗原受容体(CAR)および正確な破壊または修飾を含み、TCR発現およびシグナル伝達の破壊をもたらす。驚くべきことには、本発明者らは、本明細書において企図される方法によって製造される1つ以上の改変されたTCRα対立遺伝子を含むゲノム編集されたCAR T細胞が、増大した治療有効性、例えば、炎症性サイトカイン、例えば、腫瘍細胞に対してCAR T細胞の細胞溶解活性を増大させる、IFNγ、TNFα、IL−2、および細胞毒素を含む他の分子、例えば、パーフォリン、グランザイムA、グランザイムBの抗原依存性分泌の増加に染まっていることが発見している。
本発明は、概して、一部分において、改善された免疫エフェクター細胞組成物、およびそれを製造する方法に関する。特定の実施形態において企図される免疫エフェクター細胞は、1つ以上のT細胞受容体遺伝子座におけるキメラ抗原受容体(CAR)および正確な破壊または修飾を含み、TCR発現およびシグナル伝達の破壊をもたらす。驚くべきことには、本発明者らは、本明細書において企図される方法によって製造される1つ以上の改変されたTCRα対立遺伝子を含むゲノム編集されたCAR T細胞が、増大した治療有効性、例えば、炎症性サイトカイン、例えば、腫瘍細胞に対してCAR T細胞の細胞溶解活性を増大させる、IFNγ、TNFα、IL−2、および細胞毒素を含む他の分子、例えば、パーフォリン、グランザイムA、グランザイムBの抗原依存性分泌の増加に染まっていることが発見している。
様々な実施形態において、CAR T細胞は、T細胞受容体アルファ(TCRα)遺伝子の1つ以上の対立遺伝子の改変を含む。特定の実施形態において、1つ以上のTCRα対立遺伝子の改変は、TCRα対立遺伝子(複数可)の発現を除去するか、または実質的に除去し、TCRα対立遺伝子(複数可)の発現を低下するか、および/またはTCRα対立遺伝子(複数可)の1つ以上の機能を損なう、実質的に損なう、もしくは除去するか、またはTCRα対立遺伝子(複数可)が機能しない。特定の実施形態において、TCRα機能としては、細胞表面へのCD3の動員、抗原のMHC依存性認識および結合、TCRαβシグナル伝達の活性化が挙げられるが、これらに限定されない。
様々な実施形態において、DNA切断が、細胞のTCRα遺伝子において生じ、切断されたゲノム配列の末端のNHEJは、正常なTCRの発現、機能喪失型もしくは機能獲得型TCRの発現を有する細胞、または好ましくは機能的なTCRの発現を欠いている、例えば、細胞表面にCD3を動員する能力を欠いている細胞をもたらし、TCRαβシグナル伝達を活性化し、MHC−抗原複合体を認識し、結合し得る。1つの好ましい実施形態において、修復は、操作されたエンドヌクレアーゼおよび末端プロセシング酵素、例えば、3´−5´エキソヌクレアーゼ(Trex2)またはその生物学的に活性な断片を用いることによってNHEJおよび機能喪失型に偏っている。
様々な他の実施形態において、切断されたTCRαゲノム配列の修復のためのドナーテンプレートが、提供され、TCRα対立遺伝子が、DNA切断部位における相同組換えによってテンプレートの配列で修復される。好ましい実施形態において、修復テンプレートは、CARをコードするポリヌクレオチド配列を含む。
したがって、本明細書において企図される方法および組成物は、既存の養子細胞療法と比較して量子改善を表す。
別段の指示が具体的にない限り、特定の実施形態の実践には、当該技術分野の技能の範囲内である化学、生化学、有機化学、分子生物学、微生物学、組換えDNA技術、遺伝学、免疫学、および細胞生物学の従来法が用いられ、これらの多くは、例証の目的で以下に記載される。このような技法は文献に完全に説明されている。例えば、Sambrook,et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(3rd Edition,2001)、Sambrook,et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(2nd Edition,1989)、Maniatis et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(1982)、Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley and Sons、2008年7月更新)、Short Protocols in Molecular Biology:A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology,Greene Pub.Associates and Wiley−Interscience、Glover,DNA Cloning:A Practical Approach,vol.I&II(IRL Press,Oxford,1985)、Anand,Techniques for the Analysis of Complex Genomes,(Academic Press,New York,1992)、Transcription and Translation(B.Hames & S.Higgins,Eds.,1984)、Perbal,A Practical Guide to Molecular Cloning(1984)、Harlow and Lane,Antibodies,(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1998)Current Protocols in Immunology Q.E.Coligan,A.M.Kruisbeek,D.H.Margulies,E.M.Shevach and W.Strober,eds.,1991)、Annual Review of Immunology、ならびにAdvances in Immunologyなどの学術誌中の研究論文を参照されたい。
B.定義
別様に定義されない限り、本明細書において使用される技術用語および科学用語は全て、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。特定の実施形態の実践および試験には、本明細書に記載されるものと同様または同等の任意の方法および材料が使用され得るが、好ましい実施形態の組成物、方法、および材料を本明細書に記載する。本開示において、以下の用語は、以下の定義の通りである。
別様に定義されない限り、本明細書において使用される技術用語および科学用語は全て、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。特定の実施形態の実践および試験には、本明細書に記載されるものと同様または同等の任意の方法および材料が使用され得るが、好ましい実施形態の組成物、方法、および材料を本明細書に記載する。本開示において、以下の用語は、以下の定義の通りである。
「a」、「an」、および「the」という冠詞は、本明細書において、その冠詞の文法上の目的語の1つ、または1つより多く(すなわち、少なくとも1つ、または1つ以上)を指すように使用される。例として、「あるエレメント(an element)」は1つの要素または1つ以上の要素を意味する。
代替物(例えば、「または(or)」)の使用は、代替物のうちの1つ、両方、またはそれらの任意の組み合わせのいずれかを意味するよう理解されるものとする。
「および/または」という用語は、代替物のうちの1つまたは両方のいずれかを意味するよう理解されるものとする。
本明細書で使用される場合、「約」または「およそ」という用語は、基準の分量、レベル、値、数、頻度、割合、寸法、サイズ、量、重量、または長さに対して15%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、または1%ほど異なる分量、レベル、値、数、頻度、割合、寸法、サイズ、量、重量、または長さを指す。一実施形態において、「約」または「およそ」という用語は、基準の分量、レベル、値、数、頻度、割合、寸法、サイズ、量、重量、または長さについて±15%、±10%、±9%、±8%、±7%、±6%、±5%、±4%、±3%、±2%、または±1%の範囲の分量、レベル、値、数、頻度、割合、寸法、サイズ、量、重量、または長さを指す。
一実施形態において、例えば、1〜5、約1〜5、または約1〜約5の範囲は、範囲によって包含される各数値を指す。例えば、非例示的かつ単に例示的な実施形態において、「1〜5」の範囲は、1、2、3、4、5、もしくは1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、もしくは5.0、または1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、もしくは5.0の語句と同等である。
本明細書全体を通して、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、「含む(comprise)」、「含む(comprises)」、および「含んでいる(comprising)」という言葉は、記載されるステップもしくは要素またはステップもしくは要素の一群の包含を暗示するが、いかなる他のステップもしくは要素またはステップもしくは要素の一群の除外を暗示するものではないと理解される。「からなる」とは、「からなる」という表現に続くもの全てを含み、それらに限定されることを意味する。したがって、「からなる」という表現は、列記される要素が必要または必須であり、他の要素が存在し得ないことを示す。「から本質的になる」とは、句の後に列記される任意の要素を含み、列記された要素の開示において指定された活性または作用に干渉しない、または寄与しない他の要素に限定されることを意味する。よって、「から本質的になる」という句は、列記される要素が必要であるか、または必須であるが、列記された要素の活性または作用に物質的に影響を及ぼす他の要素が存在しないことを示す。
本明細書全体を通して、「一実施形態」、「ある実施形態」、「特定の実施形態」、「関連する実施形態」、「ある特定の実施形態」、「付加的な実施形態」、もしくは「さらなる実施形態」、またはそれらの組み合わせへの言及は、その実施形態に関連して記載される特定の特徴、構造、または特性が、少なくとも1つの実施形態に含まれることを意味する。したがって、本明細書全体を通して様々な箇所での前述の句の出現は、必ずしも全てが同じ実施形態に対して言及されない。更に、特定の特徴、構造、または特性は、1つ以上の実施形態において、任意の好適な様式で組み合わされてよい。一実施形態の特徴の積極的な記載が特定の実施形態における特徴を除外する根拠とならないことも理解する。
「免疫エフェクター細胞」とは、1つ以上のエフェクター機能(例えば、細胞傷害性細胞殺滅活性、サイトカインの分泌、ADCCおよび/またはCDCの誘導)を有する免疫系の任意の細胞である。特定の実施形態において企図される例示的な免疫エフェクター細胞は、Tリンパ球、特に細胞傷害性T細胞(CTL;CD8+T細胞)、TIL、およびヘルパーT細胞(HTL;CD4+T細胞)である。一実施形態において、免疫エフェクター細胞は、ナチュラルキラー(NK)細胞を含む。一実施形態において、免疫エフェクター細胞は、ナチュラルキラーT(NKT)細胞を含む。好ましい実施形態において、免疫エフェクター細胞は、CAR T細胞である。
「T細胞」または「Tリンパ球」という用語は、当該技術分野において認識されており、胸腺細胞、ナイーブTリンパ球、未成熟Tリンパ球、成熟Tリンパ球、休止Tリンパ球、または活性化Tリンパ球を含むよう意図される。T細胞は、Tヘルパー(Th)細胞、例えば、Tヘルパー1(Th1)またはTヘルパー2(Th2)細胞であり得る。T細胞は、ヘルパーT細胞(HTL;CD4+T細胞)CD4+T細胞、細胞傷害性T細胞(CTL;CD8+T細胞)、腫瘍浸潤細胞傷害性T細胞(TIL;CD8+T細胞)、CD4+CD8+T細胞、CD4−CD8−T細胞、またはT細胞の任意の他のサブセットであってもよい。一実施形態において、T細胞は、NKT細胞である。特定の実施形態で使用するのに好適な他の例示的なT細胞集団は、ナイーブT細胞およびメモリーT細胞を含む。好ましい実施形態において、T細胞は、CARを発現するように改変される。
「強力なT細胞」および「若いT細胞」は、特定の実施形態において互換的に使用され、T細胞が増殖および分化の同時減少が可能であるT細胞表現型を指す。特定の実施形態において、若いT細胞は、「ナイーブT細胞」の表現型を有する。特定の実施形態において、若いT細胞は、生物学的マーカー:CD62L、CCR7、CD28、CD27、CD122、CD127、CD197、およびCD38のうちの1つ以上または全てを含む。一実施形態において、若いT細胞は、生物学的マーカー:CD62L、CD127、CD197、およびCD38のうちの1つ以上または全てを含む。一実施形態において、若いT細胞は、CD57、CD244、CD160、PD−1、CTLA4、TIM3、およびLAG3の発現を欠いている。
本明細書で使用される場合、「増殖」という用語は、細胞の対称または非対称***のいずれかにおける細胞***の増加を指す。特定の実施形態において、「増殖」は、T細胞の対称または非対称***を指す。「増殖の増加」は、処理されていない試料中の細胞と比較して、処理された試料中の細胞の数が増加している場合に起こる。
本明細書で使用される場合、「分化」という用語は、細胞の効力もしくは増殖を減少させるまたは細胞をより発生的に制限された状態へと移動させる方法を指す。特定の実施形態において、分化したT細胞は、免疫エフェクター細胞機能を獲得する。
本明細書で使用される場合、「T細胞製造」または「T細胞を製造する方法または同等の用語は、T細胞の治療用組成物を産生するプロセスを指し、この製造方法は、次のステップ:採取、刺激、活性化、ゲノム編集、および拡張のうちの1つ以上または全てを含むことができる。
「エクスビボ」という用語は、一般に、生物体の外側で行われる行為、例えば、天然の条件の変更が最小であることが好ましい、生物体の外側の人工的な環境において生組織内または生組織上で行われる実験または測定などを指す。特定の実施形態において、「エクスビボ」手順は、生物体から取得し、通常は滅菌条件下で、一般には数時間または最大約24時間であるが、状況に応じて最大48または72時間を含む時間にわたって実験装置内で培養または調節した生細胞または組織を伴う。ある特定の実施形態において、そのような組織または細胞を収集し、凍結させ、エクスビボにおける処理のために後で解凍することができる。生細胞または組織を使用して数日よりも長く続く組織培養実験または手順は、一般には「インビトロ」と見なされるが、ある特定の実施形態において、この用語は、エクスビボと互換的に使用することができる。
「インビボ」という用語は、一般に、生物体の内側で行われる行為、例えば、細胞の自己再生および細胞の増殖または増大などを指す。一実施形態において、「インビボにおける増大」という用語は、細胞集団の数をインビボにおいて増加させる能力を指す。一実施形態において、細胞は、インビボで操作または改変される。
「刺激」という用語は、TCR/CD3複合体を介したシグナル変換が挙げられるが、これらに限定されない、シグナル変換事象が媒介される、刺激分子(例えば、TCR/CD3複合体)とその同族リガンドの結合によって誘導される一次応答を指す。
「刺激分子」は、同族刺激性リガンドと特異的に結合するT細胞上の分子を指す。
「刺激性リガンド」は、本明細書で使用される場合、抗原提示細胞(例えば、aAPC、樹状細胞、B細胞など)上に存在する場合、T細胞上の同族結合パートナー(本明細書において、「刺激分子」と称される)と特異的に結合し、それにより、これらに限定されないが、活性化、免疫応答の開始、増殖などを含めた、T細胞による一次応答を媒介することができるリガンドを意味する。刺激性リガンドとしては、CD3リガンド、例えば、抗CD3抗体ならびにCD2リガンド、例えば、抗CD2抗体およびペプチド、例えば、CMV、HPV、EBVペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。
「活性化」という用語は、検出可能な細胞増殖を誘導するように十分に刺激されたT細胞の状態を指す。特定の実施形態において、活性化は、誘導性サイトカイン産生、および検出可能なエフェクター機能にも関連し得る。「活性化T細胞」という用語は、とりわけ、増殖しているT細胞を指す。TCR単独を通じて生成されるシグナルは、T細胞の完全な活性化には不十分であり、1つ以上の二次または共刺激シグナルも必要である。したがって、T細胞の活性化は、TCR/CD3複合体を通じた一次刺激シグナルおよび1つ以上の二次共刺激シグナルを含む。共刺激は、CD3/TCR複合体を通じた、またはCD2を通じた刺激などの一次活性化シグナルを受けたT細胞による増殖および/またはサイトカイン産生によって証明することができる。
「共刺激シグナル」とは、TCR/CD3ライゲーションなどの一次シグナルと組み合わさって、T細胞増殖、サイトカイン産生、および/または特定の分子(例えばCD28)の上方制御もしくは下方制御を導くシグナルを指す。
「共刺激リガンド」は、共刺激分子に結合する分子を指す。共刺激リガンドは、可溶性であり得るか、または表面上に提示され得る。「共刺激分子」は、共刺激リガンド(例えば、抗CD28抗体)と特異的に結合するT細胞上の同族結合パートナーを指す。
「自家性」とは、本明細書で使用される場合、ドナーおよびレシピエントは、同じ対象である細胞を指す。
「同種」とは、本明細書で使用される場合、ドナーおよびレシピエント種は、同じであるが、細胞は遺伝的に異なる細胞を指す。
「同系」とは、本明細書で使用される場合、ドナーおよびレシピエント種は、同じであるが、ドナーおよびレシピエントは、異なる個人であり、ドナー細胞およびレシピエント細胞は、遺伝的に同一である細胞を指す。
「異種」は、本明細書で使用される場合、ドナーおよびレシピエント種が異なる種の細胞を指す。
本明細書で使用される場合、「個体」および「対象」という用語は、多くの場合、互換的に使用され、遺伝子療法ベクター、細胞ベースの治療薬、および本明細書において他の箇所に企図される方法を用いて治療され得る、がん、または他の免疫障害の症状を示す任意の動物を指す。好適な対象(例えば、患者)は、実験動物(マウス、ラット、ウサギ、またはモルモットなど)、農場動物、および家畜動物、またはペット(ネコまたはイヌ)を含む。非ヒト霊長類、および好ましくはヒト患者が含まれる。典型的な対象には、がんまたは他の免疫障害を有するか、それと診断されたことがあるか、またはそのリスクがあるか、もしくはそれを有しているヒト患者が含まれる。
本明細書で使用される場合、「患者」という用語は、本明細書において他の箇所に開示される組成物および方法を用いて治療され得るがんまたは他の免疫障害と診断されたことのある対象を指す。
本明細書で使用される「治療(treatment)」または「治療すること(treating)」には、疾患または病態の症状もしくは病理に対する、あらゆる有益な作用または望ましい効果を含み、治療される疾患または状態、例えば、がん、自己免疫疾患、免疫障害などのうちの1つ以上の測定可能なマーカーの最小の低減さえも含み得る。治療は、任意に、疾患もしくは状態の進行の遅延のいずれかを伴ってもよい。「治療」は、疾患もしくは状態、またはその関連症状の完全な根絶、あるいは治癒を必ずしも示さない。
本明細書で使用される場合、「予防する(prevent)」および「予防される(prevented)」、「予防すること(preventing)」などの同様の用語は、疾患もしくは状態、例えば、がん、自己免疫疾患、免疫障害などの発生または再発の可能性を予防、阻害、または低減するための手法を示す。疾患もしくは状態の開始または再発を遅延する、あるいは疾患もしくは状態の症状の発生または再発を遅延することも指す。本明細書で使用される場合、「予防(prevention)」および類似する用語も、疾患もしくは状態の開始または再発前の疾患もしくは状態の強度、作用、症状、および/または負荷を減少させることも含む。
本明細書で使用される場合、「の少なくとも1つの症状を寛解させる」という語句は、対象が治療を受けている疾患または状態、例えば、がん、感染性疾患、自己免疫疾患、炎症性疾患、および免疫不全のうちの1つ以上の症状を減少させることを指す。特定の実施形態において、治療される疾患または状態はがんであり、寛解される1つ以上の症状としては、脱力感、疲労、息切れ、易挫傷性および易出血性、頻繁な感染症、リンパ節腫大、腹部の膨張または(腹部器官の肥大による)痛み、骨痛または関節痛、骨折、計画外の体重減少、食欲不振、寝汗、持続的微熱、および(腎機能不全による)排尿減少が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「量」という用語は、臨床結果を含む、有益なもしくは所望の予防または治療結果を達成するのに十分な、ゲノム編集されたCAR T細胞の「有効な量」または「有効量」を指す。
「予防有効量」は、所望の予防的結果を達成するのに有効なゲノム編集されたCAR T細胞の量を指す。必ずしもそうではないが、典型的には、予防的用量は疾患の発生前または初期段階で対象に使用されるため、予防有効量は、治療有効量よりも少ない。
ゲノム編集されたCAR T細胞の「治療上有効量」は、個体の疾患状態、年齢、性別、および体重、ならびに個体において所望の応答を誘発するゲノム編集されたCAR T細胞の能力などの要因によって異なり得る。治療上有効量は、治療的に有益な作用がウイルスまたは形質導入された治療用細胞の任意の毒性または有害な作用を上回るものでもある。「治療上有効量」という用語は、対象(例えば、患者)を治療するのに有効な量を含む。治療量が示される場合、投与される特定の実施形態において企図される組成物の正確な量は、医師が、本明細書を考慮して、ならびに患者(対象)の年齢、体重、腫瘍サイズ、感染または転移の程度、および状態における個々の差を考慮して、決定することができる。
「免疫障害」は、免疫系からの応答を排除する疾患を指す。特定の実施形態において、「免疫障害」という用語は、がん、自己免疫疾患、または免疫不全を指す。一実施形態において、免疫障害は、感染性疾患を包含する。
本明細書で使用される場合、「がん」という用語は、一般に、異常な細胞が制御されずに***し、近くの組織に浸潤し得る、疾患または状態のクラスに関する。
本明細書で使用される場合、「悪性」という用語は、腫瘍細胞の群が、制御されていない成長(すなわち、正常な限界を超えた***)、浸潤(すなわち、近接組織への侵入およびその破壊)、ならびに転移(すなわち、リンパ液または血液を介した、体内の他の場所への拡散)のうちの1つ以上を示すがんを指す。
本明細書で使用される場合、「転移する」という用語は、身体の1つの部分から別の部分へとがんが拡散することを指す。拡散した細胞により形成された腫瘍は「転移性腫瘍」または「転移」と呼ばれる。転移性腫瘍は、元々(原発)の腫瘍の細胞と同様の細胞を含む。
本明細書で使用される場合、「良性」または「非悪性」という用語は、大きく成長し得るが、身体の他の部分に拡散しない腫瘍を指す。良性腫瘍は、自己限定的であり、通常は浸潤または転移しない。
「がん細胞」は、がん性腫瘍または組織の個々の細胞を指す。「腫瘍」または「腫瘍細胞」とは、概して、良性、前悪性、または悪性であり得る細胞の異常増殖により形成された腫脹または病変を指す。ほとんどのがんは腫瘍を形成するが、いくつか、例えば白血病は、必ずしも腫瘍を形成しない。腫瘍を形成するがんに関しては、がん(細胞)および腫瘍(細胞)という用語は互換的に使用される。個体における腫瘍の量は、腫瘍の数、体積、または重量として測定され得る「腫瘍負荷」である。
「自己免疫疾患」とは、体が、自身の組織のいくつかの成分に対する免疫原性(すなわち、免疫系)応答を生じる疾患を指す。言い換えれば、免疫系は、体内のある組織または系を「自己」と認識する能力を失い、あたかもそれを外来であるかのように標的とし、攻撃する。自己免疫疾患は、主に1つの器官が影響を受けるもの(例えば、溶血性貧血および抗免疫甲状腺炎)と、自己免疫疾患プロセスが多くの組織を通じて拡散するもの(例えば、全身性エリテマトーデスに分類することができる。例えば、多発性硬化症は、脳および脊髄の神経線維を囲む鞘を攻撃するT細胞によって引き起こされると考えられている。これにより、協調喪失、衰弱、および霧視が生じる。自己免疫疾患は、当該技術分野で既知であり、例えば、橋本甲状腺炎、グレーブス病、ループス、多発性硬化症、リウマチ性関節炎、溶血性貧血、抗免疫甲状腺炎、全身性エリテマトーデス、セリアック病、クローン病、大腸炎、糖尿病、強皮症、乾癬などが挙げられる。
「免疫不全」とは、疾患によってまたは化学物質の投与によって免疫系が損なわれた患者の状態を意味する。この状態により、当該系が、外来物質に対する防御に必要な血液細胞の数および型が欠損したものになる。免疫不全状態または疾患は、当該技術分野で既知であり、それらとしては、例えば、AIDS(後天性免疫不全症候群)、SCID(重症複合型免疫不全症)、選択的IgA欠損症、分類不能型免疫不全症、X連鎖無ガンマグロブリン血症、慢性肉芽腫性疾患、高IgM症候群、および糖尿病が挙げられる。
「感染性疾患」とは、人から人へまたは生物体から生物体へ伝染する可能性があり、微生物またはウイルス性因子によって引き起こされる疾患(例えば、風邪)を指す。感染性疾患は、当該技術分野で既知であり、それらとしては、例えば、肝炎、性行為感染症(例えば、クラミジア、淋病)、結核、HIV/AIDS、ジフテリア、B型肝炎、C型肝炎、コレラ、およびインフルエンザが挙げられる。
「増強する」もしくは「促進する」、または「増加する」もしくは「増幅する」もしくは「強化する」とは、概して、本明細書において企図される組成物、例えば、1つ以上の改変されたTCRα対立遺伝子を含むゲノム編集されたCAR T細胞が、同じまたは実質的に同じCARを発現するCAR T細胞によって引き起こされる応答と比較して、より大きな応答(すなわち、生理学的応答)をもたらすか、誘発するか、または引き起こす能力を指すが、TCRα対立遺伝子は、改変されていない(対照組成物)。測定可能な応答は、炎症性サイトカイン放出の増加、例えば、とりわけ、当該技術分野で理解および本明細書における説明から明らかである他の測定可能な応答の中でもとりわけ、IFNγ、細胞溶解活性の増加、またはCAR発現の増加を含み得る。「増加した」または「増強された」量は、典型的には「統計的に有意な」量であり、ビヒクルまたは対照組成物によりもたらされる応答の1.1倍、1.2倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍、またはそれ以上(例えば、500、1000倍)(その間および1を超える全ての整数ならびに小数点、例えば、1.5、1.6、1.7、1.8などを含む)の増加を含み得る。
「減少する(decrease)」または「低減する(lower)」または「減る(lessen)」または「低下する(reduce)」または「軽減する(abate)」または「除去する(ablate)」または「阻害する(inhibit)」または「抑制する(dampen)」とは、一般に、本明細書において企図される組成物の、ビヒクルまたは対照分子/組成物のいずれかによって引き起こされる応答と比較してより小さな応答(すなわち、生理学的応答)をもたらすか、誘発するか、または引き起こす能力を指す。測定可能な応答は、内因性TCR発現または機能の減少を含み得る。「減少した(decrease)」または「低下した(reduced)」量とは、典型的には、「統計的に有意な」量であり、ビヒクルまたは対照組成物によって生じる応答(参照応答)の1.1倍、1.2倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍、またはそれ以上(例えば、500、1000倍)(その間および1を超える全ての整数ならびに小数点、例えば、1.5、1.6、1.7、1.8などを含む)の減少を含み得る。
「維持する」、または「保存する」、または「維持」、または「変化しない」、または「実質的に変化しない」、または「実質的に減少しない」とは、概して、本明細書において企図される組成物が、細胞において、ビヒクル、対照分子/組成物のいずれかによって引き起こされる応答、または特定の細胞系列における応答と比較した場合に実質的に同様もしくは比較可能な生理学的応答(すなわち、下流作用)をもたらすか、誘発するか、または引き起こす能力を指す。比較可能な応答は、参照応答と大幅に異ならないか、または測定可能な差がないものである。
本明細書で使用される「特異的結合親和性」、または「特異的に結合する」、または「特異的に結合している」、または「特異的結合」、または「特異的に標的化する」という用語は、バックグラウンド結合よりも高い結合親和性である分子から別のものに結合することを説明する。結合ドメインは、例えば、約105M−1以上の親和性またはKa(すなわち、1/Mの単位を有する特定の結合相互作用の平衡結合定数)を有する標的分子に結合するまたはそれと関連する場合、標的分子に「特異的に結合する」。ある特定の実施形態において、結合ドメインは、約106M−1、107M−1、108M−1、109M−1、1010M−1、1011M−1、1012M−1、または1013M−1以上のKaを有する標的物に結合する。「高親和性」結合ドメインは、少なくとも107M−1、少なくとも108M−1、少なくとも109M−1、少なくとも1010M−1、少なくとも1011M−1、少なくとも1012M−1、少なくとも1013M−1、またはそれ以上のKaを有する結合ドメインを指す。
あるいは、親和性は、Mの単位を有する特定の結合相互作用(例えば、10−5M〜10−13M、またはそれ以下)の平衡解離定数(Kd)として定義され得る。特定の実施形態において企図される結合ドメインポリペプチドの親和性は、従来の技術を使用して、例えば、競合ELISA(酵素結合免疫吸着検定法)によって、または結合会合(binding association)、もしくは標識リガンドを使用した置換アッセイによって、あるいは、Biacore,Inc.(Piscataway,NJ)から入手可能であるBiacore T100などの表面プラズモン共鳴デバイス、またはそれぞれCorningおよびPerkin Elmerから入手可能なEPICシステムもしくはEnSpireなどの光学バイオセンサ技術を使用して、容易に決定することができる(例えば、Scatchard et al.(1949)Ann.N.Y.Acad.Sci.51:660、および米国特許第5,283,173号、同第5,468,614号、またはその均等物も参照されたい)。
一実施形態において、特異的結合の親和性は、バックグラウンド結合より約2倍高いか、バックグラウンド結合より約5倍高いか、バックグラウンド結合より約10倍高いか、バックグラウンド結合より約20倍高いか、バックグラウンド結合より約50倍高いか、バックグラウンド結合より約100倍高いか、またはバックグラウンド結合より約1000倍以上高い。
「抗原(Ag)」とは、動物において抗体の産生またはT細胞応答を刺激することのできる化合物、組成物、または物質、例えば、脂質、炭水化物、多糖、糖タンパク質、ペプチド、または核酸を指し、動物に注射または吸収される組成物(例えば、腫瘍特異的タンパク質を含むものなど)を含む。抗原は、開示される抗原などの異種抗原により誘発されたものを含む、特定の体液性または細胞性免疫の産物と反応する。「標的抗原」または「標的抗原または対象」は、本明細書において企図される操作された抗原受容体の結合ドメインが結合するように設計される、抗原である。一実施形態において、抗原は、クラスI MHC−ペプチド複合体またはクラスII MHC−ペプチド複合体などのMHC−ペプチド複合体である。
「エピトープ」または「抗原決定基」は、結合剤が結合する抗原の領域を指す。
本明細書で使用される場合、「単離されたポリヌクレオチド」は、天然に存在する状態でそれに隣接する配列から精製されたポリヌクレオチド、例えば、ある断片に通常隣接する配列から取り除かれたDNA断片を指す。「単離されたポリヌクレオチド」は、相補的DNA(cDNA)、組換えDNA、または実際に存在せず、人の手によって作製された他のポリヌクレオチドも指す。
本明細書で使用される、「単離されたタンパク質」、「単離されたペプチド」、または「単離されたポリペプチド」などは、細胞環境から、および細胞の他の成分との会合から、ペプチドまたはポリペプチド分子のインビトロでの合成、単離、および/または精製を指し、すなわち、それは、インビボの物質と著しく会合していない。
「単離された細胞」とは、天然に存在しない細胞、例えば、インビボの組織または器官から得られた、および細胞外マトリックスが実質的に含まない、実際に存在しないT細胞、改変されたT細胞、操作されたT細胞などを指す。
「組換え」とは、非相同末端連結(NHEJ)および相同組換えによるドナー捕捉を含むが、これらに限定されない、2つのポリヌクレオチド間の遺伝子情報の交換プロセスを指す。本開示の目的のために、「相同組換え(HR)」は、例えば、相同組換え修復(HDR)機構を介して細胞において二本鎖切断の修復中に起こるそのような交換の特殊の形態を指す。このプロセスには、ヌクレオチド配列相同性を必要とし、「標的」分子(すなわち、二本鎖切断を受けた分子)を修復するためのテンプレートとして「ドナー」分子を用い、かつそれは、ドナーから標的への遺伝情報の移動をもたらすために、「非交差遺伝子変換」または「ショートトラクト遺伝子変換(short tract gene conversion)」として、様々な名称で公知である。いずれかの特定の理論によって拘束されることを望むものではないが、そのような移動は、切断された標的とドナーとの間に形成されるヘテロ二重鎖DNAのミスマッチ修正、および/または、標的の一部になる遺伝情報の再合成にドナーが使用される「合成依存的鎖アニーリング」、および/または関連のプロセスを含み得る。そのような特殊なHRは、ドナーポリヌクレオチドの配列の一部または全てが標的ポリヌクレオチドに組み込まれるような、標的分子の配列の変更をもたらす場合が多い。
「切断」とは、DNA分子の共有結合骨格の破壊を指す。切断は、リン酸ジエステル結合の酵素的または化学的加水分解が挙げられるが、これらに限定されない、種々の方法によって開始することができる。一本鎖切断および二本鎖切断の両方とも可能である。二本鎖切断は、2つの異なる一本鎖切断事象の結果として生じ得る。DNA切断は、平滑末端または付着末端のいずれかの産生をもたらし得る。ある特定の実施形態において、本明細書において企図されるポリペプチドは、標的化二本鎖DNA切断のために用いられる。
「標的部位」または「標的配列」は、結合および/または切断が存在するのに十分な条件という条件で、結合分子が結合するおよび/または切断するであろう核酸の一部を定義する染色体または染色体外核酸配列である。
「外因性」分子は、1つ以上の遺伝子的、生化学的、または他の方法によって、通常細胞に存在しないが、細胞に導入される分子である。例示的な外因性分子としては、有機小分子、タンパク質、核酸、炭水化物、脂質、糖タンパク質、リポタンパク質、多糖、上記の分子の任意の修飾誘導体、または上記の分子のうちの1つ以上を含む任意の複合体が挙げられるが、これらに限定されない。細胞への外因性分子の導入のための方法は、当業者に既知であり、脂質媒介移動(すなわち、中性および陽イオン性脂質を含むリポソーム)、電気穿孔、直接注入、細胞融合、微粒子銃、生体高分子ナノ粒子、リン酸カルシウム共沈、DEAEデキストラン媒介移動、およびウイルスベクター媒介移動を含むが、これらに限定されない。
「内因性」分子は、通常、特定の環境条件下の特定の発達段階で、特定の細胞に存在する分子である。例えば、内因性核酸は、染色体、ミトコンドリアのゲノム、他の細胞小器官、または天然に存在するエピソーム核酸を含むことができる。さらなる内因性分子は、タンパク質、例えば、内因性TCRを含むことができる。
「遺伝子」とは、このような調節配列がコードおよび/または転写配列に隣接するかどうかに関わらず、遺伝子産物をコードするDNA領域、ならびに遺伝子産物の産生を調節する全てのDNA領域を指す。遺伝子としては、プロモーター配列、ターミネータ、リボソーム結合部位および内部リボソーム侵入部位などの翻訳調節配列、エンハンサー、サイレンサー、インスレーター、境界要素、複製開始点、マトリックス付着部位、および遺伝子座制御領域が挙げられるが、これらに限定されない。
「遺伝子発現」とは、遺伝子に含まれる情報の遺伝子産物への変換を指す。遺伝子産物は、遺伝子の直接転写産物(例えば、mRNA、tRNA、rRNA、アンチセンスRNA、リボザイム、構造RNA、または任意の他の種類のRNA)、またはmRNAの翻訳により産生されたタンパク質であり得る。遺伝子産物はまた、キャップ形成、ポリアデニル化、メチル化、および編集などのプロセスにより修飾されたRNA、および例えば、メチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化、ADPリボシル化、ミリスチル化、およびグリコシル化により修飾されたタンパク質も含む。
本明細書で使用される場合、「ゲノム編集」という用語は、遺伝子の発現を回復、補正、および/または修正する、細胞のゲノムにおける標的部位で遺伝子材料の置換、欠失、および/または導入を指す。特定の実施形態において企図されるゲノム編集は、任意に、ドナー修復テンプレートの存在下で、細胞のゲノムにおける標的部位でDNA病変を生成するために、1つ以上の操作されたヌクレアーゼを細胞に導入することを含む。
本明細書で使用される場合、「遺伝子操作された」または「遺伝子改変された」という用語は、細胞内の全遺伝子材料にDNAまたはRNAの形態における追加の遺伝子材料の染色体または染色体外の添加を指す。遺伝子改変は、細胞のゲノムにおける特定の部位に標的化され得るか、または非標的化され得る。一実施形態において、遺伝子改変は、部位特異的である。一実施形態において、遺伝子改変は、部位特異的ではない。
C.ゲノム編集されたCAR T細胞
特定の実施形態において企図される方法によって製造されるゲノム編集された細胞は、改善されたCAR T細胞組成物を含む。一実施形態において、CAR T細胞は、1つ以上の改変されたTCRα対立遺伝子を含む。驚くべきことには、本発明者らは、本明細書において企図される方法によって製造される1つ以上の改変されたTCRα対立遺伝子を含むゲノム編集されたCAR T細胞が、増大した治療有効性、例えば、炎症性サイトカイン、例えば、腫瘍細胞に対してCAR T細胞の細胞溶解活性を増大させる、IFNγ、TNFα、IL−2、および細胞毒素を含む他の分子、例えば、パーフォリン、グランザイムA、グランザイムBの抗原依存性分泌の増加に染まっていることが発見している。いずれの特定の理論によって拘束されるものではないが、増大したCAR T細胞有効性が、一部分において、CARのためのアクセサリーシグナル伝達成分を解放するTCR αβ受容体発現の低下、サイトカイン分泌の増加、および持続性シグナル伝達の低減によるものであることが企図される。
特定の実施形態において企図される方法によって製造されるゲノム編集された細胞は、改善されたCAR T細胞組成物を含む。一実施形態において、CAR T細胞は、1つ以上の改変されたTCRα対立遺伝子を含む。驚くべきことには、本発明者らは、本明細書において企図される方法によって製造される1つ以上の改変されたTCRα対立遺伝子を含むゲノム編集されたCAR T細胞が、増大した治療有効性、例えば、炎症性サイトカイン、例えば、腫瘍細胞に対してCAR T細胞の細胞溶解活性を増大させる、IFNγ、TNFα、IL−2、および細胞毒素を含む他の分子、例えば、パーフォリン、グランザイムA、グランザイムBの抗原依存性分泌の増加に染まっていることが発見している。いずれの特定の理論によって拘束されるものではないが、増大したCAR T細胞有効性が、一部分において、CARのためのアクセサリーシグナル伝達成分を解放するTCR αβ受容体発現の低下、サイトカイン分泌の増加、および持続性シグナル伝達の低減によるものであることが企図される。
様々な実施形態において、ゲノム編集されたCAR T細胞は、本明細書において企図される遺伝子編集する組成物および方法によって改変された1つ以上のTCRα対立遺伝子を含む。
一実施形態において、ゲノム編集されたCAR T細胞は、1つ以上の改変されたTCRα対立遺伝子、およびCARをコードする核酸を含む。
一実施形態において、ゲノム編集されたCAR T細胞は、1つ以上の改変されたTCRα対立遺伝子、およびCARをコードする核酸を含む1つ以上のプロウイルス組み込み体を含む。一実施形態において、プロウイルス組み込み体は、レトロウイルスまたはレンチウイルス系プロウイルス組み込み体である。
一実施形態において、ゲノム編集されたCAR T細胞は、1つ以上の改変されたTCRα対立遺伝子を含み、1つ以上のTCRα対立遺伝子は、相同組換え修復によって、CARをコードする核酸を含むドナー修復テンプレートを1つ以上のTCRα対立遺伝子に挿入することによって改変されている。
特定の実施形態において、1つ以上の改変されたTCRα対立遺伝子を含むCAR T細胞を作製する方法は、T細胞の集団を活性化し、T細胞の集団を刺激して、増殖することと、操作されたヌクレアーゼをT細胞の集団に導入して、TCRα対立遺伝子で二本鎖切断を生じることと、キメラ抗原受容体(CAR)をコードする核酸を、T細胞に導入することと、を含む。
ある特定の実施形態において、1つ以上の改変されたTCRα対立遺伝子を含むCAR T細胞を作製する方法は、T細胞集団を活性化し、T細胞集団を刺激して、増殖することと、CARをコードするウイルスベクターをT細胞に形質導入することと、を含む。操作されたヌクレアーゼの発現は、NHEJによって優先的に修復されるTCRα対立遺伝子における標的部位で二本鎖切断を形成する。一実施形態において、操作されたエンドヌクレアーゼは、3´末端プロセシング酵素、例えば、Trex2などの3´−5´エキソヌクレアーゼを有する細胞に導入されて、NHEJによって二本鎖切断を修復するために偏向を増加させる。一実施形態において、T細胞は、レトロウイルスベクター、例えば、CARをコードする、ガンマレトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターで形質導入する。一実施形態において、T細胞は、CARをコードするレンチウイルスベクターで形質導入する。
いくつかの実施形態において、1つ以上の改変されたTCRα対立遺伝子を含むCAR T細胞を作製する方法は、T細胞集団を活性化し、T細胞集団を刺激して、増殖することと、CARをコードする核酸を含むドナー修復テンプレートを含むウイルスベクターをT細胞に形質導入することと、を含み、操作されたヌクレアーゼの発現は、TCRα対立遺伝子における標的部位で二本鎖切断を形成し、ドナー修復テンプレートは、二本鎖切断(DSB)の部位で相同組換え修復(HDR)によってTCRα対立遺伝子に組み込まれる。一実施形態において、ドナーテンプレートは、CARをコードする核酸に作動可能に連結されたRNApol IIプロモーターをさらに含む。
特定の実施形態において企図されるゲノム編集されたCAR T細胞は、自家性/自律性(「自己」)であっても、非自家性(「非自己」、例えば、同種、同系、または異種)であってもよい。本明細書で使用される場合、「自家」は、同じ対象からの細胞を指す。本明細書で使用される場合、「同種」は、比較する際に細胞と遺伝的に異なる同じ種の細胞を指す。本明細書で使用される場合、「同系」は、比較する際に細胞と遺伝的に同一である異なる対象の細胞を指す。本明細書で使用される場合、「異種」は、比較する際に細胞と異なる種の細胞を指す。好ましい実施形態において、T細胞は、哺乳類対象から得られる。より好ましい実施形態において、T細胞は、霊長類対象から得られる。最も好ましい実施形態において、T細胞は、ヒト対象から得られる。
T細胞は、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺問題、感染部位からの組織、腹水、胸水、脾臓組織、および腫瘍を含むが、これらに限定されない、いくつかの供給源から得ることができる。ある特定の実施形態において、T細胞は、当業者に既知の任意の数の技術、例えば沈降、例えば、FICOLL(商標)分離などを使用して、対象から収集された血液単位から得ることができる。
他の実施形態において、単離または精製されたT細胞集団が、使用される。いくつかの実施形態において、PBMCの単離後、細胞傷害性Tリンパ球とヘルパーTリンパ球との両方が、活性化、増幅、および/または遺伝子改変の前または後に、ナイーブT細胞、メモリーT細胞、およびエフェクターT細胞の亜集団に分別され得る。
マーカー:CD3、CD4、CD8、CD28、CD45RA、CD45RO、CD62、CD127、およびHLA−DRのうちの1つ以上を発現するT細胞の特定のサブ集団は、正または負の選択技法により更に単離され得る。一実施形態において、CD62L、CCR7、CD28、CD27、CD122、CD127、CD197、またはCD38もしくはCD62L、CD127、CD197、およびCD38からなる群から選択されるマーカーのうちの1つ以上を発現するT細胞の特定のサブ集団は、正または負の選択技法により更に単離され得る。様々な実施形態において、製造されたT細胞組成物は、マーカー:CD57、CD244、CD160、PD−1、CTLA4、TIM3、およびLAG3のうちの1つ以上を発現しない、または実質的に発現しない。
一実施形態において、単離または精製されたT細胞集団は、CD3+、CD4+、CD8+、またはこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない、マーカーのうちの1つ以上発現する。
ある特定の実施形態において、T細胞は、ゲノム編集する前に、個体から単離され、まず、活性化し、刺激して、インビトロで増殖する。
T細胞組成物の十分な治療用量を達成するために、T細胞は、多くの場合、1つ以上の刺激、活性化、および/または拡大させる。T細胞は、一般的に、例えば、米国特許第6,352,694号、同第6,534,055号、同第6,905,680号、同第6,692,964号、同第5,858,358号、同第6,887,466号、同第6,905,681号、同第7,144,575号、同第7,067,318号、同第7,172,869号、同第7,232,566号、同第7,175,843号、同第5,883,223号、同第6,905,874号、同第6,797,514号、および同第6,867,041号(それらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)に記載される方法を使用して、活性化および増幅させ得る。特定の実施形態において、T細胞を、活性化し、T細胞へのゲノム編集組成物の導入前に、約1日〜約4日間、約1〜約3日間、約1〜約2日間、約2〜約3日間、約2〜約4日間、約3〜約4日間、または約1日間、約2日間、約3日間、または約4日間増幅させる。
特定の実施形態において、T細胞は、活性化し、T細胞へのゲノム編集組成物の導入前に、約6時間、約12時間、約18時間、または約24時間増幅させる。
一実施形態において、T細胞は、ゲノム編集組成物がT細胞に導入されると同時に活性化する。
一実施形態において、共刺激リガンドが、T細胞上の同族の共刺激分子に特異的に結合する抗原提示細胞(例えば、aAPC、樹状細胞、B細胞など)で提示され、それにより、例えばTCR/CD3複合体の結合によりもたらされる一次シグナルに加えて、所望のT細胞応答を媒介するシグナルが提供される。好適な共刺激リガンドとしては、CD7、B7−1(CD80)、B7−2(CD86)、4−1BBL、OX40L、誘導性共刺激リガンド(ICOS−L)、細胞間接着分子(ICAM)、CD30L、CD40、CD70、CD83、HLA−G、MICA、MICB、リンフォトキシンベータ受容体、ILT3、ILT4、Tollリガンド受容体に結合する作動薬または抗体、およびB7−H3と特異的に結合するリガンドが挙げられるが、これらに限定されない。
特定の実施形態において、共刺激リガンドは、CD27、CD28、4−IBB、OX40、CD30、CD40、ICOS、リンパ球機能関連抗原1(LFA−1)、CD7、LIGHT、NKG2C、B7−H3、およびCD83と特異的に結合するリガンドを含むが、これらに限定されない、T細胞上に存在する共刺激分子に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片を含む。
好適な共刺激リガンドは、標的抗原をさらに含み、これは、可溶形態で提供されても、またはゲノム編集されたT細胞で発現する操作された抗原受容体に結合するAPCもしくはaAPCで発現してもよい。
様々な実施形態において、ゲノム編集されたCAR T細胞を生成する方法は、T細胞を含む細胞の集団を活性化させること、およびT細胞の集団を増幅させることを含む。T細胞活性化は、T細胞TCR/CD3複合体によって、一次刺激シグナルを提供すること、およびアクセサリー分子、例えばCD28によって二次共刺激シグナルを提供することによって達成され得る。
TCR/CD3複合体は、好適なCD3結合剤、例えばCD3リガンドまたは抗CD3モノクローナル抗体とT細胞を接触させることによって刺激され得る。CD3抗体の例示的な例としては、OKT3、G19−4、BC3、および64.1が挙げられるが、これらに限定されない。
TCR/CD3複合体によって提供される一次刺激シグナルに加えて、T細胞応答の誘導は、第2の共刺激シグナルを必要とする。特定の実施形態において、CD28結合剤は、共刺激シグナルを提供するために使用され得る。CD28結合剤の例示的な例としては、天然のCD28リガンド、例えば、CD28の天然リガンド(例えば、B7−1(CD80)およびB7−2(CD86)などのタンパク質のB7ファミリーのメンバー;CD28を架橋することができる抗CD28モノクローナル抗体またはその断片、例えば、モノクローナル抗体9.3、B−T3、XR−CD28、KOLT−2、15E8、248.23.2、およびEX5.3D10が挙げられるが、これらに限定されない。
一実施形態において、一次刺激シグナルを提供する分子、例えば、TCR/CD3複合体によって刺激を提供する分子、および共刺激分子は、同じ表面に結合する。
ある特定の実施形態において、刺激シグナルおよび共刺激シグナルを提供する結合剤は、細胞の表面上に局在化される。これは、細胞表面上でのその発現に好適な形態における結合剤をコードする核酸を細胞にトランスフェクトもしくは形質導入することによって、あるいは結合剤を細胞表面に結合させることによって達成することができる。
別の実施形態において、一次刺激シグナルを提供する分子、例えば、TCR/CD3複合体によって刺激を提供する分子、および共刺激分子は、抗原提示細胞で提示される。
一実施形態において、一次刺激シグナルを提供する分子、例えば、TCR/CD3複合体によって刺激を提供する分子、および共刺激分子は、別々の表面上に提供される。
ある特定の実施形態において、刺激シグナルおよび共刺激シグナルを提供する結合剤のうちの1つは、可溶性であり(溶液で提供され)、他の薬剤(複数可)は、1つ以上の表面上に提供される。
特定の実施形態において、刺激シグナルおよび共刺激シグナルを提供する結合剤は、両方とも可溶形態で提供される(溶液で提供される)。
様々な実施形態において、本明細書において企図されるゲノム編集されたCAR T細胞を作製するための方法は、抗CD3抗体および抗CD28抗体でT細胞を活性化させることを含む。
一実施形態において、本明細書において企図される方法によって活性化されたT細胞の増幅は、T細胞を含む細胞の集団を、数時間(約3時間)から約7日間〜約28日間、またはそれらの間の任意の時間単位の整数値にわたって培養することをさらに含む。別の実施形態において、T細胞組成物は、14日間培養され得る。特定の実施形態において、T細胞は、約21日間培養される。別の実施形態において、T細胞組成物は、約2〜3日間培養される。T細胞の培養時間が60日以上になり得るように、数サイクルの刺激/活性化/増幅が望ましい場合もある。
特定の実施形態において、T細胞培養に適切な条件としては、適切な培地(例えば、最小必須培地またはRPMI Media 1640もしくはX−vivo 15(Lonza))、ならびに、血清(例えば、ウシ胎仔血清またはヒト血清)、インターロイキン−2(IL−2)、インスリン、IFN−γ、IL−4、IL−7、IL−21、GM−CSF、IL−10、IL−12、IL−15、TGFβ、およびTNF−α、または当業者に既知の細胞の増殖に好適な任意の他の添加剤を含むが、これらに限定されない、増殖および生存能に必要な1つ以上の要素が挙げられる。
細胞培養培地のさらなる例証となる例としては、アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、およびビタミンが添加され、血清不含であるか、あるいは適切な量の血清(もしくは血漿)または定義されたホルモン一式、ならびに/またはT細胞の増殖および増幅に十分な量のサイトカイン(複数可)が補充された、RPMI 1640、Clicks、AIM−V、DMEM、MEM、a−MEM、F−12、X−Vivo 15、およびX−Vivo 20、Optimizerが挙げられるが、これらに限定されない。
抗生物質、例えば、ペニシリンおよびストレプトマイシンは、実験用培養物にのみ含まれ、対象に注入される細胞の培養物には含まれない。標的細胞は、増殖の支持に必要な条件下、例えば、適切な温度(例えば、37℃)および雰囲気(例えば、空気+5%CO2)に維持される。
特定の実施形態において、PBMCまたは単離されたT細胞は、IL−2、IL−7、および/またはIL−15などの適切なサイトカインを含む培養培地において、概してビーズまたは他の表面に結合した抗CD3抗体および抗CD28抗体などの刺激剤および共刺激剤と接触させられる。
他の実施形態において、種々の共刺激分子およびサイトカインの安定した発現および分泌を指向するようにK562、U937、721.221、T2、およびC1R細胞を操作することにより作製された人工APC(aAPC)。特定の実施形態において、K32またはU32 aAPCは、AAPC細胞表面上に1つ以上の抗体ベースの刺激分子の表示を指向するために使用される。T細胞集団は、CD137L(4−1BBL)、CD134L(OX40L)、および/またはCD80もしくはCD86を含むが、これらに限定されない、様々な共刺激分子を発現するaAPCにより増幅され得る。最後に、aAPCは、遺伝子改変T細胞を増幅し、CD8 T細胞上のCD28発現を維持するために、効率的なプラットホームを提供する。WO03/057171およびUS2003/0147869に提供されるaAPCは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
様々な実施形態において、改変されたTCRα対立遺伝子を含むCAR T細胞を生成する方法は、本明細書において企図される1つ以上の操作されたヌクレアーゼをT細胞の集団に導入して、TCRα対立遺伝子で二本鎖切断を生じることを含む。
一実施形態において、本明細書において企図される1つ以上のヌクレアーゼは、活性化および刺激前に、T細胞に導入される。
別の実施形態において、本明細書において企図される1つ以上のヌクレアーゼは、T細胞が刺激されるのとほぼ同時にT細胞に導入される。
好ましい実施形態において、本明細書において企図される1つ以上のヌクレアーゼは、T細胞の活性化および刺激後、例えば、約1、2、3、または4日後に、T細胞に導入される。特定の実施形態において、T細胞に導入されたヌクレアーゼとしては、エンドヌクレアーゼ、例えば、メガヌクレアーゼ、メガTAL、TALEN、ZFN、またはCRISPR/Casヌクレアーゼ、ならびに任意に、末端プロセシングヌクレアーゼまたはその生物学的に活性な断片、例えば、5´−3´エキソヌクレアーゼ、5´−3´アルカリ性エキソヌクレアーゼ、3´−5´エキソヌクレアーゼ(例えば、Trex2)、5´フラップエンドヌクレアーゼ、ヘリカーゼ、またはテンプレート依存性DNAポリメラーゼ活性が挙げられるが、これらに限定されない。エンドヌクレアーゼおよび末端プロセシングヌクレアーゼは、融合タンパク質として発現され得、ポリシストロニックmRNAから発現され得るか、または独立して、1つ以上のmRNAまたは発現カセットから発現され得る。
特定の実施形態において、1つ以上のヌクレアーゼは、ベクターを用いてT細胞に導入される。他の実施形態において、1つ以上のヌクレアーゼは、好ましくは、mRNAとしてT細胞に導入される。ヌクレアーゼは、マイクロインジェクション、トランスフェクション、リポフェクション、熱ショック、電気穿孔、形質導入、遺伝子銃、マイクロインジェクション、DEAEデキストラン媒介移動などに導入され得る。
特定の実施形態において企図されるゲノム編集された方法は、NHEJを介して優先的に修復される標的部位でDSBを形成するために、本明細書において企図される1つ以上の操作されたヌクレアーゼを、活性化および刺激されたT細胞の集団に導入することと、続いて、T細胞の集団に、CARをコードするベクターを形質導入することと、を含む。
特定の実施形態において企図されるゲノム編集された方法は、標的部位でDSBを形成するために、本明細書において企図される1つ以上の操作されたヌクレアーゼを、活性化および刺激されたT細胞の集団に導入することと、続いて、1つ以上のドナー修復テンプレートを、相同組換えによってDSB部位で細胞のゲノムに組み込まれるであろうT細胞の集団に導入することと、を含む。
特定の実施形態において、CARをコードするポリヌクレオチドを含む1つ以上のドナーテンプレートは、T細胞の集団に導入される。ドナーテンプレートは、マイクロインジェクション、トランスフェクション、リポフェクション、熱ショック、電気穿孔、形質導入、遺伝子銃、マイクロインジェクション、DEAE−デキストラン媒介移動などに導入され得る。
好ましい実施形態において、1つ以上のヌクレアーゼは、mRNA電気穿孔によってT細胞に導入され、1つ以上のドナー修復テンプレートは、ウイルス形質導入によってT細胞に導入される。
別の好ましい実施形態において、1つ以上のヌクレアーゼは、mRNA電気穿孔によってT細胞に導入され、1つ以上のドナー修復テンプレートは、AAV形質導入によってT細胞に導入される。AAVベクターは、AAV2からのITR、およびAAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、またはAAV10のうちのいずれか1つからの血清型を含み得る。好ましい実施形態において、AAVベクターは、AAV2からのITR、およびAAV6からの血清型を含み得る。
特定の実施形態において、ドナー修復テンプレートは、1つ以上の相同アームを含む。本明細書で使用される場合、「相同アーム」という用語は、標的部位でヌクレアーゼによって導入されるDNA切断に隣接するDNA配列と同一する、またはほぼ同一であるドナーテンプレート中の核酸配列を指す。一実施形態において、ドナーテンプレートは、DNA切断部位の5´のDNA配列と同一する、またはほぼ同一である核酸を含む5´相同アームを含む。一実施形態において、ドナーテンプレートは、DNA部位の3´のDNA配列と同一する、またはほぼ同一である核酸を含む3´相同アームを含む。好ましい実施形態において、ドナーテンプレートは、5´相同アームと3´相同アームとを含む。
特定の実施形態において企図される相同アームの好適な長さの例示的な例は、独立して、選択され得、相同アームの全ての介在長さを含む、約100bp、約200bp、約300bp、約400bp、約500bp、約600bp、約700bp、約800bp、約900bp、約1000bp、約1100bp、約1200bp、約1300bp、約1400bp、約1500bp、約1600bp、約1700bp、約1800bp、約1900bp、約2000bp、約2100bp、約2200bp、約2300bp、約2400bp、約2500bp、約2600bp、約2700bp、約2800bp、約2900bp、または約3000bp、もしくはそれ以上の相同アームが挙げられ得るが、これらに限定されない。
好適な相同アームの長さのさらなる例示的な例としては、相同アームの全ての介在長さを含む、約100bp〜約3000bp、約200bp〜約3000bp、約300bp〜約3000bp、約400bp〜約3000bp、約500bp〜約3000bp、約500bp〜約2500bp、約500bp〜約2000bp、約750bp〜約2000bp、約750bp〜約1500bp、または約1000bp〜約1500bpが挙げられるが、これらに限定されない。
特定の実施形態において、5´および3´相同アームの長さは、独立して、約500bp〜約1500bpから切断される。一実施形態において、5´相同アームは、約1500bpであり、3´相同アームは、約1000bpである。一実施形態において、5´相同アームは、約600bpであり、3´相同アームは、約600bpである。
ドナー修復テンプレートは、本明細書において他の箇所に企図される、プロモーターおよび/またはエンハンサー、非翻訳領域(UTR)、コザック配列、ポリアデニル化シグナル、付加的な制限酵素部位、多重クローニング部位、内部リボソーム侵入部位(IRES)、リコンビナーゼ認識部位(例えば、LoxP、FRT、およびAtt部位)、終止コドン、転写終結シグナル、および自己切断型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、エピトープタグなどを1つ以上のポリヌクレオチドをさらに含み得る。
様々な実施形態において、ドナー修復テンプレートは、5´相同アーム、RNAポリメラーゼIIプロモーター、CAR、および3´相同アームを含む。
別の好ましい実施形態において、1つ以上のヌクレアーゼは、mRNA電気穿孔によってT細胞に導入され、1つ以上のドナー修復テンプレートは、レンチウイルス形質導入によってT細胞に導入される。レンチウイルスベクター骨格は、HIV−1、HIV−2、ビスナ・マエディウイルス(VMV)ウイルス、ヤギ関節炎脳炎ウイルス(CAEV)、ウマ感染性貧血ウイルス(EIAV)、ネコ免疫不全ウイルス(FIV)、ウシ免疫不全ウイルス(BIV)、またはサル免疫不全ウイルス(SIV)に由来し得る。レンチウイルスベクターは、組み込みコンピテントまたはインテグリーゼ欠損レンチウイルスベクター(IDLV)であり得る。一実施形態において、HIV系ベクター骨格(すなわち、HIVシス作用配列要素)を含むIDLVベクターが、好ましい。
1つ以上のドナー修復テンプレートは、1つ以上の操作されたヌクレアーゼが細胞に導入される前、それと同時に、またはその後に送達され得る。ある特定の実施形態において、1つ以上のドナー修復テンプレートは、1つ以上の操作されたヌクレアーゼと同時に送達される。他の実施形態において、1つ以上のドナー修復テンプレートは、1つ以上の操作されたヌクレアーゼの前に、例えば、1つ以上の操作されたヌクレアーゼの約1分〜約30分、約1分〜約60分、約1分〜約90分、約1時間〜約24時間前に、または1つ以上の操作されたヌクレアーゼの24時間以上前が挙げられるが、これらに限定されない、1つ以上のドナー修復テンプレートの数秒〜数時間前に送達される。ある特定の実施形態において、1つ以上のドナー修復テンプレートは、ヌクレアーゼの後、好ましくは、約1、2、3、4、5、6、7、もしくは8時間以内に、より好ましくは、約1、2、3、もしくは4時間以内に、またより好ましくは、約4時間以内に送達される。
1つ以上のドナー修復テンプレートは、1つ以上の操作されたヌクレアーゼと同じ送達システムを用いて送達され得る。非限定的な例として、同時に送達したとき、ドナー修復テンプレートおよび操作されたヌクレアーゼは、同じベクター、例えば、IDLVレンチウイルスベクターまたはAAVベクター(例えば、AAV6)によってコードされ得る。特定の好ましい実施形態において、操作されたヌクレアーゼ(複数可)は、mRNA電気穿孔によって送達され、ドナー修復テンプレートは、AAVベクターによる形質導入によって送達される。
特定の実施形態において、1つ以上の改変されたTCRα対立遺伝子を用いてCAR T細胞を生成する方法は、IL−2、IL−7、および/もしくはIL−15などの適切なサイトカイン、ならびに/またはPI3K細胞シグナル伝達経路を調節する1つ以上の薬剤を含む細胞培地中で、細胞を、刺激剤および共刺激剤、例えば、可溶性抗CD3抗体および抗CD28抗体、またはビーズもしくは他の表面に結合した抗体と接触させることを含む。
本明細書で使用される場合、「PI3K阻害剤」という用語は、PI3Kに結合し、その少なくとも1つの活性を阻害する核酸、ペプチド、化合物、または有機小分子を指す。PI3Kタンパク質は、クラス1のPI3K、クラス2のPI3K、およびクラス3のPI3Kの3つのクラスに分けることができる。クラス1のPI3Kは、4つのp110触媒サブ単位(p110α、p110β、p110δ、およびp110γ)のうちの1つ、ならびに調節サブ単位の2つのファミリーのうちの1つからなるヘテロ二量体として存在する。特定の実施形態において、PI3K阻害剤は、クラス1のPI3K阻害剤を標的化する。一実施形態において、PI3K阻害剤は、クラス1のPI3K阻害剤の1つ以上のアイソフォームに選択性(すなわち、p110α、p110β、p110δ、およびp110γ、またはp110α、p110β、p110δ、およびp110γのうちの1つ以上に対する選択性)を示すであろう。別の態様では、PI3K阻害剤はアイソフォーム選択性を提示せず、「汎PI3K阻害剤」とみなされるであろう。一実施形態において、PI3K阻害剤は、PI3K触媒ドメインとの結合に関してATPと競合するであろう。
特定の実施形態で使用するのに好適なPI3K阻害剤の例示的な例としては、BKM120(クラス1のPI3K阻害剤、Novartis)、XL147(クラス1のPI3K阻害剤、Exelixis)、(汎PI3K阻害剤、GlaxoSmithKline)、およびPX−866(クラス1のPI3K阻害剤;p110α、p110β、およびp110γアイソフォーム、Oncothyreon)が挙げられるが、これらに限定されない。
選択的PI3K阻害剤の他の例示的な例としては、BYL719、GSK2636771、TGX−221、AS25242、CAL−101、ZSTK474、およびIPI−145が挙げられるが、これらに限定されない。
汎PI3K阻害剤のさらに例示的な例としては、BEZ235、LY294002、GSK1059615、TG100713、およびGDC−0941が挙げられるが、これらに限定されない。
好ましい実施形態において、PI3K阻害剤は、ZSTK474である。
D.ヌクレアーゼ
特定の実施形態において企図される免疫エフェクター細胞組成物は、1つ以上のTCRα対立遺伝子を標的化する操作されたヌクレアーゼで達成されたゲノム編集によって生成される。
特定の実施形態において企図される免疫エフェクター細胞組成物は、1つ以上のTCRα対立遺伝子を標的化する操作されたヌクレアーゼで達成されたゲノム編集によって生成される。
様々な実施形態において、CAR T細胞は、T細胞受容体アルファ(TCRα)遺伝子において標的DNA配列を結合し、切断するように設計される、操作されたヌクレアーゼを用いて編集される。特定の実施形態において企図される操作されたヌクレアーゼは、ポリヌクレオチドテンプレート、例えば、ドナー修復テンプレートの不在下で、非相同末端連結(NHEJ)によって修復され、続いて、CARをコードするウイルスで形質導入され得るか、または相同組換え修復(HDR)、すなわち、CARをコードするドナー修復テンプレートの存在下で相同組換えによって修復され得る、標的ポリヌクレオチド配列中の二本鎖切断を導入するために使用することができる。ある特定の実施形態において企図される操作されたヌクレアーゼはまた、ドナー修復テンプレートの存在下で、細胞の塩基除去修復(BER)機構または相同組換えを用いて修復され得る一本鎖DNA切断を生じさせる、ニッカーゼとして操作され得る。NHEJは、遺伝子機能を妨害する小挿入および欠失の形成を頻繁にもたらす変異性プロセスである。相同組換えは、修復のためのテンプレートとして相同DNAを必要とし、標的部位を隣接する領域に相同性を持っている配列によっていずれかの側上に隣接された、標的部位で所望の配列を含有するドナーDNAの導入によって特定された無限の様々な修正をもたらすように活用され得る。
「操作されたヌクレアーゼ」とは、1つ以上のDNA結合ドメインおよび1つ以上のDNA切断ドメインを含むヌクレアーゼを指し、このヌクレアーゼは、DNA切断標的配列に隣接したDNA結合標的配列に結合するように設計および/または改変されている。操作されたヌクレアーゼは、天然に存在するヌクレアーゼまたは事前に操作されたヌクレアーゼから設計および/または改変され得る。特定の実施形態において企図される操作されたヌクレアーゼは、1つ以上のさらなる機能ドメイン、例えば、5´−3´エキソヌクレアーゼ、5´−3´アルカリ性エキソヌクレアーゼ、3´−5´エキソヌクレアーゼ(例えば、Trex2)、5´フラップエンドヌクレアーゼ、ヘリカーゼ、またはテンプレート依存性DNAポリメラーゼ活性を示す末端プロセシング酵素の末端プロセシング酵素ドメインをさらに含み得る。特定の実施形態において、操作されたHEは、5´−3´エキソヌクレアーゼ、5´−3´アルカリ性エキソヌクレアーゼ、3´−5´エキソヌクレアーゼ(例えば、Trex2)、5´フラップエンドヌクレアーゼ、ヘリカーゼ、またはテンプレート依存性DNAポリメラーゼ活性を示す末端プロセシング酵素を有するT細胞に導入される。HEおよび3´プロセシング酵素は、別々に、例えば、異なるベクターまたは別々のmRNAで、または一緒に、例えば、融合タンパク質として、またはウイルス自己切断ペプチドもしくはIRES要素によって分離されたポリシストロニック構築物において導入され得る。
標的配列に結合および切断するように操作され得るヌクレアーゼの例示的な例としては、ホーミングエンドヌクレアーゼ(メガヌクレアーゼ)、メガTAL、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ(ZFN)、およびクラスタ化調節的スペース間短パリンドローム反復(CRISPR)/Casヌクレアーゼシステムが挙げられるが、これらに限定されない。
特定の実施形態において、本明細書において企図されるヌクレアーゼは、1つ以上の異種DNA結合および切断ドメイン(例えば、ZFN、TALEN、メガTAL)を含む(Boissel et al.,2014、Christian et al.,2010)。他の実施形態において、天然に存在するヌクレアーゼのDNA結合ドメインは、選択された標的部位(例えば、同族体結合部位とは異なる部位に結合するように操作されているメガヌクレアーゼ)に結合するように改変され得る。例えば、メガヌクレアーゼは、それらの同族体結合部位とは異なる標的部位に結合するように設計されている(Boissel et al.,2014)。特定の実施形態において、ヌクレアーゼは、標的部位(例えば、CRISPR/Cas)にヌクレアーゼを標的化するように核酸配列を必要とする。
様々な実施形態において、ホーミングエンドヌクレアーゼまたはメガヌクレアーゼは、TCRα遺伝子座における一本鎖ニックまたは二本鎖切断(DSB)に結合し、導入するように操作されている。「ホーミングエンドヌクレアーゼ」および「メガヌクレアーゼ」は、同義に使用され、12〜45個の塩基対切断部位を認識し、一般に、配列および構造モチーフに基づいた5つのファミリー:LAGLIDADG、GIY−YIG、HNH、His−Cys box、およびPD−(D/E)XKに分類される、天然に存在するヌクレアーゼまたは操作されたメガヌクレアーゼを指す。
操作されたHEは、実際に存在せず、組換えDNA技術またはランダム変異誘発によって得ることができる。操作されたHEは、天然に存在するHEまたは事前に操作されたHEにおいて、1つ以上のアミノ酸改変を行う、例えば、1つ以上のアミノ酸を変異、置換、添加、または欠失することによって得られ得る。特定の実施形態において、操作されたHEは、DNA認識界面への1つ以上のアミノ酸改変を含む。
「DNA認識界面」とは、核酸標的塩基と相互作用するHEアミノ酸残基、ならびに隣接するような残基を指す。各HEにおいて、DNA認識界面は、側鎖−側鎖接触および側鎖−DNA接触の広範なネットワークを含み、その大部分は、必然的に特定の核酸標的配列を認識するのに特有である。それ故に、特定の核酸配列に対応するDNA認識界面のアミノ酸配列は、著しく変化し、任意の天然または操作されたHEの特徴である。非限定的な例として、特定の実施形態において企図される操作されたHEは、天然HE(または事前に操作されたHE)のDNA認識界面中に局在する1つ以上のアミノ酸残基を変異させた、HEバリアントのライブラリーを構築することによって得られ得る。ライブラリーは、切断アッセイを用いて、各予想TCRα遺伝子座標的部位に対する標的切断活性についてスクリーニングされ得る(例えば、Jarjour et al.,2009.Nuc.Acids Res.37(20):6871−6880を参照されたい)。
LAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼ(LHE)は、メガヌクレアーゼの最も良く研究されたファミリーであり、主に、古細菌ならびに緑藻類および菌類におけるオルガネラDNAにおいてコードされ、最高全体のDNA認識特異性を示す。LHEは、1タンパク質鎖当たり1つまたは2つのLAGLIDADG触媒モチーフを含み、それぞれ、ホモ二量体または一本鎖モノマーとして機能する。LAGLIDADGタンパク質の構造研究は、高度に保存されたコア構造を特定し(Stoddard 2005)、αββαββα折り畳みによって特徴とし、LAGLIDADGモチーフがこの折り畳みの第1のらせんに属する。LHEの高度に効率的かつ特定の切断は、新規の高度に特異的なエンドヌクレアーゼを得るためにタンパク質の骨組みを表す。しかしながら、非天然または非標準的な標的部位に結合および切断するために操作されたLHEは、適切なLHE骨組みの選択、標的遺伝子座の検査、推定上の標的部位の選択、およびLHEの広範囲な改変を、標的部位における塩基対位置の最大3分の2で、そのDNA接触点および切断特異性を改変するために必要とする。
操作されたLHEが設計され得るLHEの例示的な例としては、I−AabMI、I−AaeMI、I−AniI、I−ApaMI、I−CapIII、I−CapIV、I−CkaMI、I−CpaMI、I−CpaMII、I−CpaMIII、I−CpaMIV、I−CpaMV、I−CpaV、I−CraMI、I−EjeMI、I−GpeMI、I−GpiI、I−GzeMI、I−GzeMII、I−GzeMIII、I−HjeMI、I−LtrII、I−LtrI、I−LtrWI、I−MpeMI、I−MveMI、I−NcrII、I−Ncrl、I−NcrMI、I−OheMI、I−OnuI、I−OsoMI、I−OsoMII、I−OsoMIII、I−OsoMIV、I−PanMI、I−PanMII、I−PanMIII、I−PnoMI、I−ScuMI、I−SmaMI、I−SscMI、およびI−Vdi141Iが挙げられるが、これらに限定されない。
一実施形態において、操作されたLHEは、I−CpaMI、I−HjeMI、I−OnuI、I−PanMI、およびSmaMIからなる群から選択される。
一実施形態において、操作されたLHEは、I−OnuIである。例えば、配列番号1および2を参照されたい。
一実施形態において、ヒトTCRα遺伝子を標的化する操作されたI−OnuI LHEは、天然I−OnuIから生成された。好ましい実施形態において、ヒトTCRα遺伝子を標的化する操作されたI−OnuI LHEは、事前に操作されたI−OnuIから生成された。一実施形態において、操作されたI−OnuI LHEは、配列番号3に記載されるヒトTCRα遺伝子標的部位に対して生成された。一実施形態において、操作されたI−OnuI LHEは、配列番号4に記載されるヒトTCRα遺伝子標的部位に対して生成された。
特定の実施形態において、操作されたI−OnuI LHEは、DNA認識界面への1つ以上のアミノ酸置換を含む。特定の実施形態において、I−OnuI LHEは、I−OnuIのDNA認識界面(Taekuchi et al.2011.Proc Natl Acad Sci U.S.A.2011 Aug 9;108(32):13077−13082)、または配列番号5、6、もしくは7に記載のI−OnuIの操作されたバリアント、またはそのさらに操作されたバリアントと少なくとも70%、少なくとも71%、少なくとも72%、少なくとも73%、少なくとも74%、少なくとも75%、少なくとも76%、少なくとも77%、少なくとも78%、少なくとも79%、少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の配列同一性を含む。
一実施形態において、I−OnuI LHEは、I−OnuIのDNA認識界面(Taekuchi et al.2011.Proc Natl Acad Sci U.S.A.2011 Aug 9;108(32):13077−13082)、または配列番号5、6、もしくは7に記載のI−OnuIの操作されたバリアント、またはそのさらに操作されたバリアントと少なくとも70%、より好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%,より好ましくは少なくとも95%、より好ましくは少なくとも97%、より好ましくは少なくとも99%の配列同一性を含む。
特定の実施形態において、操作されたI−OnuI LHEは、DNA認識界面において、特に、I−OnuIの位置24〜50、68〜82、180〜203、および223〜240から位置しているサブドメイン(配列番号2)、または配列番号5、6、もしくは7に記載のI−OnuIの操作されたバリアント、またはそのさらに操作されたバリアントにおいて1つ以上のアミノ酸置換または改変を含む。
一実施形態において、操作されたI−OnuI LHEは、I−OnuI配列全体内に他の場所に位置しているさらなる位置で1つ以上のアミノ酸置換または改変を含む。置換および/または改変され得る残基としては、核酸標的に接触するか、または直接もしくは水分子を介して核酸骨格もしくはヌクレオチド塩基と相互作用するアミノ酸が挙げられるが、これに限定されない。1つの非限定的な例において、本明細書において企図される操作されたI−OnuI LHEは、I−OnuIの位置:19、24、26、28、30、32、34、35、36、37、38、40、42、44、46、48、68、70、72、75、76 77、78、80、82、168、180、182、184、186、188、189、190、191、192、193、195、197、199、201、203、223、225、227、229、231、232、234、236、238、240からなる位置群から選択される少なくとも1つの位置(配列番号2)、または配列番号5、6、もしくは7に記載のI−OnuIの操作されたバリアント、またはそのさらに操作されたバリアントにおいて1つ以上の置換および/または改変、好ましくは少なくとも5、好ましくは少なくとも10、好ましくは少なくとも15、より好ましくは少なくとも20、さらにより好ましくは少なくとも25を含む。
特定の実施形態において、本明細書において企図される操作されたI−OnuI LHEは、L26I、R28D、N32R、K34N、S35E、V37N、G38R、S40R,E42S、G44R、V68K、A70T、N75R、S78M、K80R、L138M、S159P、E178D、C180Y、F182G、I186K、S188V、S190G、K191N、L192A、G193K、Q195Y、Q197G、V199R、T203S、K207R、Y223S、K225W、およびD236Eからなる群から選択される1つ以上のアミノ酸置換および/または改変を含む。
一実施形態において、I−OnuI LHEは、配列番号5、6、もしくは7に記載のアミノ酸配列、またはそのさらに操作されたバリアントを有する。
様々な例示的な実施形態は、TCRα遺伝子座の標的領域に結合し、切断するメガTALヌクレアーゼを企図する。「メガTAL」とは、操作されたTALE DNA結合ドメインおよび操作されたメガヌクレアーゼを含む操作されたヌクレアーゼを指し、ならびに任意に、1つ以上のリンカーおよび/またはさらなる機能ドメイン、例えば、5´−3´エキソヌクレアーゼ、5´−3´アルカリ性エキソヌクレアーゼ、3´−5´エキソヌクレアーゼ(例えば、Trex2)、5´フラップエンドヌクレアーゼ、ヘリカーゼ、またはテンプレート依存性DNAポリメラーゼ活性を示す末端プロセシング酵素の末端プロセシング酵素ドメインを含む。特定の実施形態において、メガTALは、5´−3´エキソヌクレアーゼ、5´−3´アルカリ性エキソヌクレアーゼ、3´−5´エキソヌクレアーゼ(例えば、Trex2)、5´フラップエンドヌクレアーゼ、ヘリカーゼ、またはテンプレート依存性DNAポリメラーゼ活性を示す末端プロセシング酵素を有するT細胞に導入され得る。メガTALおよび3´プロセシング酵素は、別々に、例えば、異なるベクターまたは別々のmRNAで、または一緒に、例えば、融合タンパク質として、またはウイルス自己切断ペプチドもしくはIRES要素によって分離されたポリシストロニック構築物において導入され得る。
「TALE DNA結合ドメイン」は、植物転写活性化因子を模倣し、植物トランスクリプトームを操作する、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEエフェクターまたはTALエフェクター)のDNA結合部分である(例えば、Kay et al.,2007.Science 318:648−651を参照されたい)。特定の実施形態において企図されるTALE DNA結合ドメインは、初めから、または天然に存在するTALE、例えば、Xanthomonas campestris pv.vesicatoria、Xanthomonas gardneri、Xanthomonas translucens、Xanthomonas axonopodis、Xanthomonas perforans、Xanthomonas alfalfa、Xanthomonas citri、Xanthomonas euvesicatoria、およびXanthomonas oryzaeからのAvrBs3、ならびにRalstonia solanacearumからのbrg11およびhpx17で操作される。DNA結合ドメインを誘発および設計するためのTALEタンパク質の例示的な例は、米国特許第9,017,967号およびその中に言及される参照文献において開示され、これらのすべてが、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
特定の実施形態において、メガTALは、TALE DNA結合ドメインのその対応する標的DNA配列への結合に関与する1つ以上の反復単位を含むTALE DNA結合ドメインを含む。単一の「反復単位」(「反復」とも称される)は、典型的には、33〜35アミノ酸長である。各TALE DNA結合ドメイン反復単位は、典型的には、反復の12位および/または13位で反復可変二残基(RVD)を作製する1または2つのDNA結合残基を含む。12位および13位でHD配列がシトシン(C)への結合をもたらし、NGは、Tに結合し、NIはAに結合し、NNは、GまたはAに結合し、NGは、Tに結合するように、これらのTALE DNA結合ドメインのDNA認識のための天然(正準)コードが決定されている。ある特定の実施形態において、非正準(非定型)RVDが、企図される。
特定の実施形態において企図される特定のメガTALで用いるのに好適な非正準RVDの例示的な例としては、グアニン(G)の認識のためのHH、KH、NH、NK、NQ、RH、RN、SS、NN、SN、KN;アデニン(A)の認識のためのNI、KI、RI、HI、SI;チミン(T)の認識のためのNG、HG、KG、RG;シトシン(C)の認識のためのRD、SD、HD、ND、KD、YG;AまたはGの認識のためのNV、HN;およびAまたはTまたはGまたはCの認識のためのH*、HA、KA、N*、NA、NC、NS、RA、S*が挙げられるが、これらに限定されず、式中、(*)は、13位でアミノ酸が不在することを意味する。特定の実施形態において企図される特定のメガTALで用いるのに好適なRVDのさらなる例示的な例は、米国特許第8,614,092号に開示されるものをさらに含み、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
特定の実施形態において、本明細書において企図されるメガTALは、3〜30反復単位を含むTALE DNA結合ドメインを含む。ある特定の実施形態において、メガTALは、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、または30のTALE DNA結合ドメイン反復単位を含む。好ましい実施形態において、本明細書において企図されるメガTALは、5〜13反復単位、より好ましくは7〜12反復単位、より好ましくは9〜11反復単位、およびより好ましくは9、10、または11反復単位を含むTALE DNA結合ドメインを含む。
特定の実施形態において、本明細書において企図されるメガTALは、3〜30反復単位、および一連のTALE反復単位のC末端で位置している20アミノ酸を含むさらなる単一の切断型TALE反復単位、すなわち、さらなるC末端半TALE DNA結合ドメイン反復単位を含むTALE DNA結合ドメインを含む(本明細書において他の箇所に開示されるCキャップのアミノ酸−20〜−1、以下に参照)。それ故に、特定の実施形態において、本明細書において企図されるメガTALは、3.5〜30.5反復単位を含むTALE DNA結合ドメインを含む。ある特定の実施形態において、メガTALは、3.5、4.5、5.5、6.5、7.5、8.5、9.5、10.5、11.5、12.5、13.5、14.5、15.5、16.5、17.5、18.5、19.5、20.5、21.5、22.5、23.5、24.5、25.5、26.5、27.5、28.5、29.5、または30.5のTALE DNA結合ドメイン反復単位を含む。好ましい実施形態において、本明細書において企図されるメガTALは、5.5〜13.5の反復単位、より好ましくは、7.5〜12.5の反復単位、より好ましくは、9.5〜11.5の反復単位、およびより好ましくは9.5、10.5、または11.5の反復単位を含むTALE DNA結合ドメインを含む。
特定の実施形態において、メガTALは、「N末端ドメイン(NTD)」ポリペプチド、1つ以上のTALE繰り返しドメイン/単位、「C末端ドメイン(CTD)」ポリペプチド、および操作されたメガヌクレアーゼを含む。
本明細書で使用される場合、「N末端ドメイン(NTD)」ポリペプチドという用語は、天然に存在するTALE DNA結合ドメインのN末端部分または断片に隣接する配列を指す。NTD配列は、存在する場合、TALE DNA結合ドメイン反復単位が、DNAに結合する能力を保持する限り、任意の長さからのものであり得る。特定の実施形態において、NTDポリペプチドは、TALE DNA結合ドメインに対して少なくとも120〜少なくとも140もしくはそれ以上のアミノ酸のN末端を含む(0は、ほとんどのN末端反復単位のアミノ酸1である)。特定の実施形態において、NTD ポリペプチドは、TALE DNA結合ドメインに対して少なくとも約120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、または少なくとも140のアミノ酸のN末端を含む。一実施形態において、本明細書において企図されるメガTALは、Xanthomonas TALEタンパク質の少なくとも約アミノ酸+1〜+122から少なくとも約+1〜+137のNTDポリペプチドを含む(0は、ほとんどのN末端反復単位のアミノ酸1である)。特定の実施形態において、NTDポリペプチドは、Xanthomonas TALEタンパク質のTALE DNA結合ドメインに対して少なくとも約122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、または137のアミノ酸のN末端を含む。一実施形態において、本明細書において企図されるメガTALは、Ralstonia TALEタンパク質の少なくともアミノ酸+1〜+121のNTDポリペプチドを含む(0は、ほとんどのN末端反復単位のアミノ酸1である)。特定の実施形態において、NTD ポリペプチドは、Ralstonia TALEタンパク質のTALE DNA結合ドメインに対して少なくとも約121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、または137のアミノ酸のN末端を含む。
本明細書で使用される場合、「C末端ドメイン(CTD)」ポリペプチドという用語は、天然に存在するTALE DNA結合ドメインのC末端部分または断片に隣接する配列を指す。CTDは、存在する場合、TALE DNA結合ドメイン反復単位が、DNAに結合する能力を保持する限り、任意の長さからのものであり得る。特定の実施形態において、CTDポリペプチドは、TALE DNA結合ドメインの最後の完全反復への少なくとも20〜少なくとも85またはそれ以上のアミノ酸のC末端を含む(初めの20のアミノ酸は、最後のC末端完全反復単位に対して半反復単位のC末端である)。特定の実施形態において、CTDポリペプチドは、TALE DNA結合ドメインの最後の完全反復に対して少なくとも約20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、443、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、または少なくとも85のアミノ酸のC末端を含む。一実施形態において、本明細書において企図されるメガTALは、Xanthomonas TALEタンパク質のうちの少なくとも約−20〜−1のアミノ酸のCTDポリペプチドを含む(−20は、最後のC末端完全反復単位に対してアミノ酸1の半反復単位のC末端である)。特定の実施形態において、CTDポリペプチドは、Xanthomonas TALEタンパク質のTALE DNA結合ドメインの最後の完全反復に対して少なくとも約20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、または1のアミノ酸のC末端を含む。一実施形態において、本明細書において企図されるメガTALは、Ralstonia TALEタンパク質のうちの少なくとも約−20〜−1のアミノ酸のCTDポリペプチドを含む(−20は、最後のC末端完全反復単位に対してアミノ酸1の半反復単位のC末端である)。特定の実施形態において、CTDポリペプチドは、Ralstonia TALEタンパク質のTALE DNA結合ドメインの最後の完全反復に対して少なくとも約20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、または1のアミノ酸のC末端を含む。
特定の実施形態において、本明細書において企図されるメガTALは、標的配列に結合するように操作されたTALE DNA結合ドメイン、標的配列に結合し、切断するように操作されたメガヌクレアーゼ、ならびに任意に、任意に、本明細書において他の箇所に企図される1つ以上のリンカーポリペプチドで互いに結合される、NTDおよび/またはCTDポリペプチドを含む、融合ポリペプチドを含む。いずれかの特定の理論によって拘束されることを望むものではないが、TALE DNA結合ドメインを含むメガTAL、ならびに任意に、NTDおよび/またはCTDポリペプチドが、操作されたメガヌクレアーゼにさらに融合されるリンカーポリペプチドに融合されることが企図される。それ故に、TALE DNA結合ドメインは、メガヌクレアーゼのDNA結合ドメインによって結合した標的配列から離れて約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、または15ヌクレオチド以内であるDNA標的配列に結合する。このように、本明細書において企図されるメガTALは、ゲノム編集の特異性および効率を増加させる。
特定の実施形態において、本明細書において企図されるメガTALは、1つ以上のTALE DNA結合反復単位、ならびにI−AabMI、I−AaeMI、I−AniI、I−ApaMI、I−CapIII、I−CapIV、I−CkaMI、I−CpaMI、I−CpaMII、I−CpaMIII、I−CpaMIV、I−CpaMV、I−CpaV、I−CraMI、I−EjeMI、I−GpeMI、I−GpiI、I−GzeMI、I−GzeMII、I−GzeMIII、I−HjeMI、I−LtrII、I−LtrI、I−LtrWI、I−MpeMI、I−MveMI、I−NcrII、I−Ncrl、I−NcrMI、I−OheMI、I−OnuI、I−OsoMI、I−OsoMII、I−OsoMIII、I−OsoMIV、I−PanMI、I−PanMII、I−PanMIII、I−PnoMI、I−ScuMI、I−SmaMI、I−SscMI、およびI−Vdi141I、または好ましくはI−CpaMI、I−HjeMI、I−OnuI、I−PanMI、およびSmaMI、またはより好ましくはI−OnuIからなる群から選択される操作されたLHEを含む。
特定の実施形態において、本明細書において企図されるメガTALは、1つ以上のTALE DNA結合反復単位のNTD、CTD、ならびにI−AabMI、I−AaeMI、I−AniI、I−ApaMI、I−CapIII、I−CapIV、I−CkaMI、I−CpaMI、I−CpaMII、I−CpaMIII、I−CpaMIV、I−CpaMV、I−CpaV、I−CraMI、I−EjeMI、I−GpeMI、I−GpiI、I−GzeMI、I−GzeMII、I−GzeMIII、I−HjeMI、I−LtrII、I−LtrI、I−LtrWI、I−MpeMI、I−MveMI、I−NcrII、I−Ncrl、I−NcrMI、I−OheMI、I−OnuI、I−OsoMI、I−OsoMII、I−OsoMIII、I−OsoMIV、I−PanMI、I−PanMII、I−PanMIII、I−PnoMI、I−ScuMI、I−SmaMI、I−SscMI、およびI−Vdi141I、または好ましくは、I−CpaMI、I−HjeMI、I−OnuI、I−PanMI、およびSmaMI、またはより好ましくは、I−OnuIからなる群から選択される操作されたLHEを含む。
特定の実施形態において、本明細書において企図されるメガTALは、約9.5〜約11.5のTALE DNA結合反復単位のNTD、ならびにI−AabMI、I−AaeMI、I−AniI、I−ApaMI、I−CapIII、I−CapIV、I−CkaMI、I−CpaMI、I−CpaMII、I−CpaMIII、I−CpaMIV、I−CpaMV、I−CpaV、I−CraMI、I−EjeMI、I−GpeMI、I−GpiI、I−GzeMI、I−GzeMII、I−GzeMIII、I−HjeMI、I−LtrII、I−LtrI、I−LtrWI、I−MpeMI、I−MveMI、I−NcrII、I−Ncrl、I−NcrMI、I−OheMI、I−OnuI、I−OsoMI、I−OsoMII、I−OsoMIII、I−OsoMIV、I−PanMI、I−PanMII、I−PanMIII、I−PnoMI、I−ScuMI、I−SmaMI、I−SscMI、およびI−Vdi141I、または好ましくは、I−CpaMI、I−HjeMI、I−OnuI、I−PanMI、およびSmaMI、またはより好ましくは、I−OnuIからなる群から選択される操作されたI−OnuI LHEを含む。
特定の実施形態において、本明細書において企図されるメガTALは、約122アミノ酸〜137アミノ酸、約9.5、約10.5、または約11.5の結合反復単位のNTD、約20アミノ酸〜約85アミノ酸のCTD、ならびにI−AabMI、I−AaeMI、I−AniI、I−ApaMI、I−CapIII、I−CapIV、I−CkaMI、I−CpaMI、I−CpaMII、I−CpaMIII、I−CpaMIV、I−CpaMV、I−CpaV、I−CraMI、I−EjeMI、I−GpeMI、I−GpiI、I−GzeMI、I−GzeMII、I−GzeMIII、I−HjeMI、I−LtrII、I−LtrI、I−LtrWI、I−MpeMI、I−MveMI、I−NcrII、I−Ncrl、I−NcrMI、I−OheMI、I−OnuI、I−OsoMI、I−OsoMII、I−OsoMIII、I−OsoMIV、I−PanMI、I−PanMII、I−PanMIII、I−PnoMI、I−ScuMI、I−SmaMI、I−SscMI、およびI−Vdi141I、または好ましくは、I−CpaMI、I−HjeMI、I−OnuI、I−PanMI、およびSmaMI、またはより好ましくは、I−OnuIからなる群から選択される操作されたI−OnuI LHEを含む。
特定の実施形態において、TCRα遺伝子座の標的領域に結合し、切断するTALENが、企図される。「TALEN」とは、本明細書において他の箇所に企図される操作されたTALE DNA結合ドメインおよびエンドヌクレアーゼドメイン(またはそのエンドヌクレアーゼ半ドメイン)を含む操作されたヌクレアーゼを指し、ならびに任意に、1つ以上のリンカーおよび/またはさらなる機能ドメイン、例えば、5´−3´エキソヌクレアーゼ、5´−3´アルカリ性エキソヌクレアーゼ、3´−5´エキソヌクレアーゼ(例えば、Trex2)、5´フラップエンドヌクレアーゼ、ヘリカーゼ、またはテンプレート依存性DNAポリメラーゼ活性を示す末端プロセシング酵素の末端プロセシング酵素ドメインを含む。特定の実施形態において、TALENは、5´−3´エキソヌクレアーゼ、5´−3´アルカリ性エキソヌクレアーゼ、3´−5´エキソヌクレアーゼ(例えば、Trex2)、5´フラップエンドヌクレアーゼ、ヘリカーゼ、またはテンプレート依存性DNAポリメラーゼ活性を示す末端プロセシング酵素を有するT細胞に導入され得る。TALENおよび3´プロセシング酵素は、別々に、例えば、異なるベクターまたは別々のmRNAで、または一緒に、例えば、融合タンパク質として、またはウイルス自己切断ペプチドもしくはIRES要素によって分離されたポリシストロニック構築物において導入され得る。
一実施形態において、標的二本鎖切断は、2つのTALENを用いて達成され、それぞれ、触媒活性の切断ドメインを再構成するために使用され得るエンドヌクレアーゼ半ドメインを含む。別の実施形態において、標的二本鎖切断は、TALE DNA結合ドメインおよび2つのエンドヌクレアーゼ半ドメインを含む単一のポリペプチドを用いて達成される。
特定の実施形態において企図されるTALENは、NTD、約3〜30の反復単位、例えば、約3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、または30の反復単位を含むTALE DNA結合ドメイン、およびエンドヌクレアーゼドメインまたは半ドメインを含む。
特定の実施形態において企図されるTALENは、NTD、約3.5〜30.5の反復単位、例えば、約3.5、4.5、5.5、6.5、7.5、8.5、9.5、10.5、11.5、12.5、13.5、14.5、15.5、16.5、17.5、18.5、19.5、20.5、21.5、22.5、23.5、24.5、25.5、26.5、27.5、28.5、29.5、または30.5の反復単位を含むTALE DNA結合ドメイン、CTD、およびエンドヌクレアーゼドメインまたは半ドメインを含む。
特定の実施形態において企図されるTALENは、本明細書において他の箇所に開示される約121アミノ酸〜約137アミノ酸のNTD、約9.5〜約11.5の反復単位(すなわち、約9.5、約10.5、または約11.5の反復単位)を含むTALE DNA結合ドメイン、約20アミノ酸〜約85アミノ酸のCTD、およびエンドヌクレアーゼドメインまたは半ドメインを含む。
特定の実施形態において、TALENは、一種制限エンドヌクレアーゼのエンドヌクレアーゼドメインを含む。制限エンドヌクレアーゼ(制限酵素)は、多数の種において存在し、(認識部位で)DNAとの配列特異的結合、ならびに結合部位またはその近くでDNAの切断を可能にする。ある特定の制限酵素(例えば、IIS型)は、認識部位から除去された部位でDNAを切断し、分離可能な結合およびエンドヌクレアーゼドメインを有する。一実施形態において、TALENは、少なくとも1つのIIS型制限酵素からのエンドヌクレアーゼドメイン(またはエンドヌクレアーゼ半ドメイン)、および本明細書において他の箇所に企図される1つ以上のTALE DNA結合ドメインを含む。
特定の実施形態において企図されるTALENで用いるのに好適なIIS型制限エンドヌクレアーゼドメインの例示的な例は、「rebase.neb.com/cgi−bin/sublist?S」で開示される少なくとも1633のIIS型制限エンドヌクレアーゼのエンドヌクレアーゼドメインを含む。
特定の実施形態において企図されるTALENで用いるのに好適なIIS型制限エンドヌクレアーゼドメインのさらなる例示的な例は、Aar I、Ace III、Aci I、Alo I、Alw26 I、Bae I、Bbr7 I、Bbv I、Bbv II、BbvC I、Bcc I、Bce83 I、BceA I、Bcef I、Bcg I、BciV I、Bfi I、Bin I、Bmg I、Bpu10 I、BsaX I、Bsb I、BscA I、BscG I、BseR I、BseY I、Bsi I、Bsm I、BsmA I、BsmF I、Bsp24 I、BspG I、BspM I、BspNC I、Bsr I、BsrB I、BsrD I、BstF5 I、Btr I、Bts I、Cdi I、CjeP I、Drd II、EarI、Eci I、Eco31 I、Eco57 I、Eco57M I、Esp3 I、Fau I、Fin I、Fok I、Gdi II、Gsu I、Hga I、Hin4 II、Hph I、Ksp632 I、Mbo II、Mly I、Mme I、Mnl I、Pfl1108、I Ple I、Ppi I Psr I、RleA I、Sap I、SfaN I、Sim I、SspD5 I、Sth132 I、Sts I、TspDT I、TspGW I、Tth111 II、UbaP I、Bsa I、およびBsmB Iからなる群から選択されるエンドヌクレアーゼのものを含む。
一実施形態において、本明細書において企図されるTALENは、Fok IのIIS型制限エンドヌクレアーゼのエンドヌクレアーゼドメインを含む。
一実施形態において、本明細書において企図されるTALENは、切断特異性を増強するために少なくとも1つのIIS型制限エンドヌクレアーゼからのTALE DNA結合ドメインおよびエンドヌクレアーゼ半ドメインを含み、任意に、エンドヌクレアーゼ半ドメインは、ホモ二量体化を最小限にするかまたは防止する1つ以上のアミノ酸置換または改変を含む。
特定の実施形態において企図される特定の実施形態で用いるのに好適な切断半ドメインの例示的な例は、米国特許公開第20050064474号、同第20060188987号、同第20080131962号、同第20090311787号、同第20090305346号、同第20110014616号、および同第20110201055号を含み、これらのそれぞれは、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
特定の実施形態において、TCRα遺伝子座の標的領域に結合し、切断する亜鉛フィンガーヌクレアーゼ(ZFN)が、企図される。「ZFN」は、1つ以上の亜鉛フィンガーDNA結合ドメインおよびエンドヌクレアーゼドメイン(またはそのエンドヌクレアーゼ半ドメイン)を含む操作されたヌクレアーゼを指し、ならびに任意に、1つ以上のリンカーおよび/またはさらなる機能ドメイン、例えば、5´−3´エキソヌクレアーゼ、5´−3´アルカリ性エキソヌクレアーゼ、3´−5´エキソヌクレアーゼ(例えば、Trex2)、5´フラップエンドヌクレアーゼ、ヘリカーゼ、またはテンプレート依存性DNAポリメラーゼ活性を示す末端プロセシング酵素の末端プロセシング酵素ドメインを含む。
特定の実施形態において、ZFNは、5´−3´エキソヌクレアーゼ、5´−3´アルカリ性エキソヌクレアーゼ、3´−5´エキソヌクレアーゼ(例えば、Trex2)、5´フラップエンドヌクレアーゼ、ヘリカーゼ、またはテンプレート依存性DNAポリメラーゼ活性を示す末端プロセシング酵素を有するT細胞に導入され得る。ZFNおよび3´プロセシング酵素は、別々に、例えば、異なるベクターまたは別々のmRNAで、または一緒に、例えば、融合タンパク質として、またはウイルス自己切断ペプチドもしくはIRES要素によって分離されたポリシストロニック構築物において導入され得る。
一実施形態において、標的二本鎖切断は、2つのZFNを用いて達成され、それぞれ、触媒活性の切断ドメインを再構成するために使用され得るエンドヌクレアーゼ半ドメインを含む。別の実施形態において、1つ以上の亜鉛フィンガーDNA結合ドメインおよび2つのエンドヌクレアーゼ半ドメインを含む単一のポリペプチドを用いて達成される。
一実施形態において、ZNFは、本明細書において他の箇所に企図されるTALE DNA結合ドメイン、亜鉛フィンガーDNA結合ドメイン、および本明細書において他の箇所に企図されるエンドヌクレアーゼドメイン(またはエンドヌクレアーゼ半ドメイン)を含む。
一実施形態において、ZNFは、亜鉛フィンガーDNA結合ドメイン、および本明細書において他の箇所に企図されるメガヌクレアーゼを含む。
特定の実施形態において、ZFNは、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、または8つもしくはそれ以上の亜鉛フィンガーモチーフおよびエンドヌクレアーゼドメイン(またはエンドヌクレアーゼ半ドメイン)を有する亜鉛フィンガーDNA結合ドメインを含む。典型的には、単一の亜鉛フィンガーモチーフは、約30アミノ酸長である。亜鉛フィンガーモチーフは、正準C2H2亜鉛フィンガーならびに非正準亜鉛フィンガー、例えば、C3H亜鉛フィンガーおよびC4亜鉛フィンガーなどの両方を含む。
亜鉛フィンガー結合ドメインは、任意のDNA配列に結合するように操作され得る。所与の3bpのDNA標的配列に対する候補亜鉛フィンガーDNA結合ドメインが特定されており、対応する複合DNA標的配列を標的化されるマルチフィンガーペプチド中に複数のドメインを連結するためのモジュール組み立て戦略が、考案されている。当該技術分野で既知の他の好適な方法はまた、亜鉛フィンガーDNA結合ドメインをコードする核酸を設計および構築するために使用することができ、例えば、ファージディスプレイ、ランダム変異誘発、コンビナトリアルライブラリー、コンピュータ/合理的設計、親和性選択、PCR、cDNAまたはゲノムライブラリーからのクローニング、合成的構築などである(例えば、米国特許第5,786,538号、Wu et al.,PNAS 92:344−348(1995)、Jamieson et al.,Biochemistry 33:5689−5695(1994)、Rebar&Pabo,Science 263:671−673(1994)、Choo&Klug,PNAS 91:11163−11167(1994)、Choo&Klug,PNAS 91:11168−11172(1994)、Desjarlais&Berg,PNAS 90:2256−2260(1993)、Desjarlais&Berg,PNAS 89:7345−7349(1992)、Pomerantz et al.,Science 267:93−96(1995)、Pomerantz et al.,PNAS 92:9752−9756(1995)、Liu et al.,PNAS 94:5525−5530(1997)、Griesman&Pabo,Science 275:657−661(1997)、Desjarlais&Berg,PNAS 91:11−99−11103(1994)を参照されたい)。
個々の亜鉛フィンガーモチーフは、3つまたは4つのヌクレオチド配列に結合する。亜鉛フィンガー結合ドメインが操作されて、結合する配列(例えば、標的配列)の長さは、操作された亜鉛フィンガー結合ドメインにおける多くの亜鉛フィンガーモチーフを決定するであろう。例えば、亜鉛フィンガーモチーフが重複するサブ部位に結合しないZFNについては、6ヌクレオチドの標的配列が、2フィンガー結合ドメインによって結合され、9ヌクレオチドの標的配列が、3フィンガー結合ドメインなどによって結合される。特定の実施形態において、標的部位における個々の亜鉛フィンガーモチーフのためのDNA結合部位は、連続している必要はないが、マルチフィンガー結合ドメイン中の亜鉛フィンガーモチーフ間のリンカー配列の長さおよび性質に応じて、1つまたはいくつかのヌクレオチドによって分離され得る。
特定の実施形態において、本明細書において企図されるZNFは、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、または8つもしくはそれ以上の亜鉛フィンガーモチーフを含む亜鉛フィンガーDNA結合ドメイン、ならびに少なくとも1つのIIS型制限酵素および本明細書において他の箇所に企図される1つ以上のTALE DNA結合ドメインからのエンドヌクレアーゼドメインまたは半ドメインを含む。
特定の実施形態において、本明細書において企図されるZNFは、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、または8つもしくはそれ以上の亜鉛フィンガーモチーフを含む亜鉛フィンガーDNA結合ドメイン、ならびに、Aar I、Ace III、Aci I、Alo I、Alw26 I、Bae I、Bbr7 I、Bbv I、Bbv II、BbvC I、Bcc I、Bce83 I、BceA I、Bcef I、Bcg I、BciV I、Bfi I、Bin I、Bmg I、Bpu10 I、BsaX I、Bsb I、BscA I、BscG I、BseR I、BseY I、Bsi I、Bsm I、BsmA I、BsmF I、Bsp24 I、BspG I、BspM I、BspNC I、Bsr I、BsrB I、BsrD I、BstF5 I、Btr I、Bts I、Cdi I、CjeP I、Drd II、EarI、Eci I、Eco31 I、Eco57 I、Eco57M I、Esp3 I、Fau I、Fin I、Fok I、Gdi II、Gsu I、Hga I、Hin4 II、Hph I、Ksp632 I、Mbo II、Mly I、Mme I、Mnl I、Pfl1108、I Ple I、Ppi I Psr I、RleA I、Sap I、SfaN I、Sim I、SspD5 I、Sth132 I、Sts I、TspDT I、TspGW I、Tth111 II、UbaP I、Bsa I、およびBsmB Iからなる群から選択される少なくとも1つのIIS型制限酵素からのエンドヌクレアーゼドメインまたは半ドメインを含む。
特定の実施形態において、本明細書において企図されるZNFは、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、または8つもしくはそれ以上の亜鉛フィンガーモチーフを含む亜鉛フィンガーDNA結合ドメイン、ならびにFok IのIIS型制限エンドヌクレアーゼからのエンドヌクレアーゼドメインまたは半ドメインを含む。
一実施形態において、本明細書において企図されるZFNは、切断特異性を増強するために少なくとも1つのIIS型制限エンドヌクレアーゼからの亜鉛フィンガーDNA結合ドメインおよびエンドヌクレアーゼ半ドメインを含み、任意に、エンドヌクレアーゼ半ドメインは、ホモ二量体化を最小限にするかまたは防止する1つ以上のアミノ酸置換または改変を含む。
様々な実施形態において、CRISPR(クラスタ化調節的スペース間短パリンドローム反復)/Cas(CRISPR関連)ヌクレアーゼシステムは、1つ以上のTCRα遺伝子座における一本鎖ニックまたは二本鎖切断(DSB)に結合し、導入するように操作される。CRISPR/Casヌクレアーゼシステムは、哺乳動物のゲノム操作のために使用することができる細菌システムに基づいた最近操作されたヌクレアーゼシステムである。例えば、Jinek et al.(2012)Science 337:816−821、Cong et al.(2013)Science 339:819−823、Mali et al.(2013)Science 339:823−826、Qi et al.(2013)Cell152:1173−1183、Jinek et al.(2013),eLife2:e00471、David Segal(2013)eLife 2:e00563、Ran et al.(2013)Nature Protocols 8(11):2281−2308、Zetsche et al.(2015)Cell 163(3):759−771を参照されたく、これらのそれぞれは、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
一実施形態において、CRISPR/Casヌクレアーゼシステムは、Casヌクレアーゼ、ならびにCasヌクレアーゼを標的部位に動員する1つ以上のRNA、例えば、トランス活性化cRNA(tracrRNA)およびCRISPR RNA(crRNA)、または単一のガイドRNA(sgRNA)を含む。crRNAおよびtracrRNAは、本明細書において「単一のガイドRNA」または「sgRNA」と称される1つのポリヌクレオチド配列に操作され得る。
一実施形態において、Casヌクレアーゼは、二本鎖DNAエンドヌクレアーゼもしくはニッカーゼもしくは触媒的に死滅したCasとして操作され、TCRα遺伝子座内に位置しているプロトスペーサー標的配列の部位特異的なDNA認識および部位特異的な切断のためのcrRNAおよびtracrRNA、またはsgRNAで標的複合体を形成する。プロトスペーサーモチーフは、Cas/RNA複合体を動員する役割を果たす、短プロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)に隣接する。Casポリペプチドは、Casポリペプチドに特異的なPAMモチーフを認識する。したがって、CRISPR/Casシステムは、特定のCasポリペプチドに特異的な特定の3´PAM配列によって隣接された二本鎖ポリヌクレオチド配列のいずれかまたは両方の鎖を標的化し、切断するために使用することができる。PAMは、バイオインフォマティクスを用いてまたは実験的なアプローチを用いて特定され得る。Esvelt et al.,2013,Nature Methods.10(11):1116−1121であり、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
一実施形態において、Casヌクレアーゼは、1つ以上の異種DNA結合ドメイン、例えば、TALE DNA結合ドメインまたは亜鉛フィンガーDNA結合ドメインを含む。TALEまたは亜鉛フィンガーDNA結合ドメインへのCasヌクレアーゼの融合は、DNA切断効率および特異性を増加させる。特定の実施形態において、Casヌクレアーゼは、任意に、1つ以上のリンカーおよび/またはさらなる機能ドメイン、例えば、5´−3´エキソヌクレアーゼ、5´−3´アルカリ性エキソヌクレアーゼ、3´−5´エキソヌクレアーゼ(例えば、Trex2)、5´フラップエンドヌクレアーゼ、ヘリカーゼ、またはテンプレート依存性DNAポリメラーゼ活性を示す末端プロセシング酵素の末端プロセシング酵素ドメインを含む。特定の実施形態において、Casヌクレアーゼは、5´−3´エキソヌクレアーゼ、5´−3´アルカリ性エキソヌクレアーゼ、3´−5´エキソヌクレアーゼ(例えば、Trex2)、5´フラップエンドヌクレアーゼ、ヘリカーゼ、またはテンプレート依存性DNAポリメラーゼ活性を示す末端プロセシング酵素を有するT細胞に導入され得る。Casヌクレアーゼおよび3´プロセシング酵素は、別々に、例えば、異なるベクターまたは別々のmRNAで、または一緒に、例えば、融合タンパク質として、またはウイルス自己切断ペプチドもしくはIRES要素によって分離されたポリシストロニック構築物において導入され得る。
様々な実施形態において、Casヌクレアーゼは、Cas9またはCpf1である。
特定の実施形態において企図される特定の実施形態で用いるのに好適なCas9ポリペプチドの例示的な例としては、Enterococcus faecium、Enterococcus italicus、Listeria innocua、Listeria monocytogenes、Listeria seeligeri、Listeria ivanovii、Streptococcus agalactiae、Streptococcus anginosus、Streptococcus bovis、Streptococcus dysgalactiae、Streptococcus equinus、Streptococcus gallolyticus、Streptococcus macacae、Streptococcus mutans、Streptococcus pseudoporcinus、Streptococcus pyogenes、Streptococcus thermophilus、Streptococcus gordonii、Streptococcus infantarius、Streptococcus macedonicus、Streptococcus mitis、Streptococcus pasteurianus、Streptococcus suis、Streptococcus vestibularis、Streptococcus sanguinis、Streptococcus downei、Neisseria bacilliformis、Neisseria cinerea、Neisseria flavescens、Neisseria lactamica、Neisseria meningitidis、Neisseria subflava、Lactobacillus brevis、Lactobacillus buchneri、Lactobacillus casei、Lactobacillus paracasei、Lactobacillus fermentum、Lactobacillus gasseri、Lactobacillus jensenii、Lactobacillus johnsonii、Lactobacillus rhamnosus、Lactobacillus ruminis、Lactobacillus salivarius、Lactobacillus sanfranciscensis、Corynebacterium accolens、Corynebacterium diphtheriae、Corynebacterium matruchotii、Campylobacter jejuni、Clostridium perfringens、Treponema vincentii、Treponema phagedenis、およびTreponema denticolaが挙げられるが、これらに限定されない、細菌種から得られ得る。
特定の実施形態において企図される特定の実施形態で用いるのに好適なCpf1ポリペプチドの例示的な例は、とりわけ、Francisella spp.、Acidaminococcus spp.、Prevotella spp.、Lachnospiraceae spp.が挙げられるが、これらに限定されない、細菌種から得られ得る。
Cas9オルトログの保存領域には、中央HNHエンドヌクレアーゼドメインおよび分割RuvC/RNase Hドメインが含まれる。Cpf1ドメインは、RuvC/RNase Hドメインを有するが、認識できるHNHドメインを有しない。HNHおよびRuvC様ドメインは、それぞれ、二本鎖DNA標的配列の1つの鎖を切断するのに関与する。Cas9ヌクレアーゼポリペプチドのHNHドメインは、tracrRNA:crRNAまたはsgRNAに相補的なDNA鎖を切断する。Cas9ヌクレアーゼのRuvC様ドメインは、tracrRNA:crRNAまたはsgRNAに相補的なDNA鎖を切断する。Cpf1は、Cpf1のそれぞれのRuvC様ドメインが、標的部位の相補的または非相補的鎖を切断する二量体として作用すると予測される。特定の実施形態において、バリアントドメインのヌクレアーゼ活性を減少または排除するHNHまたはRuvC様エンドヌクレアーゼドメインにおける1つ以上のアミノ酸付加、欠失、変異、または置換を含む、Cas9ヌクレアーゼバリアント(例えば、Cas9ニッカーゼ)が、企図される。
ドメインにおけるヌクレアーゼ活性を減少または排除するCas9 HNH変異の例示的な例としては、S.pyogenes(D10A)、S.thermophilis(D9A)、T.denticola(D13A)、およびN.meningitidis(D16A)が挙げられるが、これらに限定されない。
ドメインにおけるヌクレアーゼ活性を減少または排除するCas9 RuvC様ドメインの例示的な例としては、S.pyogenes(D839A、H840A、またはN863A)、S.thermophilis(D598A、H599A、またはN622A)、T.denticola(D878A、H879A、またはN902A)、およびN.meningitidis(D587A、H588A、またはN611A)が挙げられるが、これらに限定されない。
E.キメラ抗原受容体(CAR)
特定の実施形態において、1つ以上の改変されたTCRα対立遺伝子を含むT細胞は、1つ以上のキメラ抗原受容体(CAR)を発現するように操作される。
特定の実施形態において、1つ以上の改変されたTCRα対立遺伝子を含むT細胞は、1つ以上のキメラ抗原受容体(CAR)を発現するように操作される。
一実施形態において、T細胞は、1つ以上のTCRα対立遺伝子におけるDSBを導入することによって、続いて、CARをコードするベクターをT細胞に形質導入することによって操作される。
一実施形態において、T細胞は、CARをコードするドナー修復テンプレートの存在下で、1つ以上のTCRα対立遺伝子におけるDSBを導入することによって操作される。特定の実施形態において、CARは、単一のTCRα対立遺伝子においてDSBで挿入される。
一実施形態において、本明細書において企図される操作されたT細胞は、TCRα対立遺伝子で挿入されないCARを含む。
様々な実施形態において、ゲノム編集されたT細胞は、腫瘍細胞に対して細胞傷害性を再指向させるCARを発現する。CARは、特定の抗腫瘍細胞免疫活性を呈するキメラタンパク質を生成するために、標的抗原(例えば、腫瘍抗原)に対する抗体ベースの特異性をT細胞受容体活性化細胞内ドメインと組み合わせる分子である。本明細書で使用される場合、「キメラ」という用語は、異なる起源からの異なるタンパク質またはDNAの一部で構成されることを説明する。
様々な実施形態において、CARは、特定の標的抗原に結合する細胞外ドメイン(結合ドメインまたは抗原特異的結合ドメインとも称される)、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを含む。CARの主な特性は、免疫エフェクター細胞の特異性を再指向させ、それにより、モノクローナル抗体、可溶性リガンド、または細胞特異的共受容体の細胞特異的標的化能力を利用して、主要組織適合性(MHC)依存様式で標的抗原発現細胞の細胞死を媒介することのできる分子の増殖、サイトカイン産生、食作用、または産生を誘発するそれらの能力である。
特定の実施形態において、CARは、腫瘍細胞上に発現する、標的ポリペプチド、例えば、標的抗原に特異的に結合する細胞外結合ドメインを含む。本明細書で使用される場合、「結合ドメイン」、「細胞外ドメイン」、「細胞外結合ドメイン」、「抗原結合ドメイン」、「抗原特異的結合ドメイン」、および「細胞外抗原特異的結合ドメイン」は、同義に使用され、目的とする標的抗原に特異的に結合する能力を有するCARを提供する。結合ドメインは、生物学的分子(例えば、細胞表面受容体もしくは腫瘍タンパク質、脂質、多糖、または他の細胞表面標的分子、またはその成分)に特異的に認識および結合する能力を有する、任意のタンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、またはペプチドを含み得る。結合ドメインは、目的とする生物学的分子のために任意の天然に存在する、合成、半合成、または組換え産生された結合パートナーを含む。
特定の実施形態において、細胞外結合ドメインは、抗体またはその抗原結合断片を含む。
「抗体」は、免疫細胞により認識されるものなど、抗原決定基を含有するペプチド、脂質、多糖、または核酸など、標的抗原のエピトープを特異的に認識し、それに結合する、少なくとも軽鎖または重鎖免疫グロブリン可変領域を含むポリペプチドである結合剤を指す。抗体は、抗原結合断片、例えば、ラクダIg(ラクダ科抗体もしくはそのVHH断片)、Ig NAR、Fab断片、Fab’断片、F(ab)’2断片、F(ab)’3断片、Fv、一本鎖Fv抗体(「scFv」)、bis−scFv、(scFv)2、ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ジスルフィド安定化Fvタンパク質(「dsFv」)、および単一ドメイン抗体(sdAb、ナノボディ)、またはその他の抗体断片を含む。本用語はまた、キメラ抗体(例えば、ヒト化マウス抗体)、ヘテロ結合抗体(二重特異性抗体など)、およびそれらの抗原結合断片などの遺伝子操作された形態も含む。Pierce Catalog and Handbook,1994−1995(Pierce Chemical Co.,Rockford,IL)、Kuby,J.,Immunology,3rd Ed.,W.H.Freeman&Co.,New York,1997も参照されたい。
ある好ましい実施形態において、結合ドメインは、scFvである。
別の好ましい実施形態において、結合ドメインは、ラクダ科抗体である。
特定の実施形態において、CARは、アルファ葉酸受容体、5T4、αvβ6インテグリン、BCMA、B7−H3、B7−H6、CAIX、CD16、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD70、CD79a、CD79b、CD123、CD138、CD171、CEA、CSPG4、EGFR、EGFRファミリーからなる群から選択される抗原に結合する細胞外ドメインを含み、ErbB2(HER2)、EGFRvIII、EGP2、EGP40、EPCAM、EphA2、EpCAM、FAP、胎児AchR、FRα、GD2、GD3、グリピカン−3(GPC3)、HLA−A1+MAGE1、HLA−A2+MAGE1、HLA−A3+MAGE1、HLA−A1+NY−ESO−1、HLA−A2+NY−ESO−1、HLA−A3+NY−ESO−1、IL−11Rα、IL−13Rα2、ラムダ、Lewis−Y、カッパ、メソテリン、Muc1、Muc16、NCAM、NKG2Dリガンド、NY−ESO−1、PRAME、PSCA、PSMA、ROR1、SSX、サバイビン、TAG72、TEM、VEGFR2、およびWT−1を含む。
特定の実施形態において、CARは、BCMA、CD19、CSPG4、PSCA、ROR1、およびTAG72からなる群から選択される抗原に結合する細胞外ドメインを含む。
特定の実施形態において、CARは、細胞外結合ドメイン、例えば、抗原に結合する抗体またはその抗原結合断片を含み、抗原は、クラスI MHC−ペプチド複合体またはクラスII MHC−ペプチド複合体などのMHC−ペプチド複合体である。
ある特定の実施形態において、CARは、様々なドメイン間のリンカー残基を含む。「可変領域リンカー配列」は、得られるポリペプチドが、同じ軽鎖および重鎖の可変領域を含む抗体と同じ標的分子に対して特異的結合親和性を保持するように、重鎖可変領域を軽鎖可変領域に接続し、2つのサブ結合ドメインの相互作用と適合性のあるスペーサー機能を提供するアミノ酸配列である。特定の実施形態において、リンカーは、1つ以上の重鎖もしくは軽鎖の可変ドメイン、ヒンジドメイン、膜貫通ドメイン、共刺激ドメイン、および/または一次シグナル伝達ドメインを分離する。特定の実施形態において、CARは、1つ、2つ、3つ、4つ、または5つもしくはそれ以上のリンカーを含む。特定の実施形態において、リンカーの長さは、約1〜約25個のアミノ酸、約5〜約20個のアミノ酸、もしくは約10〜約20個のアミノ酸、または任意の介在長さのアミノ酸である。いくつかの実施形態において、リンカーは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25個またはそれ以上のアミノ酸長である。
特定の実施形態において、CARの結合ドメインには、1つ以上の「スペーサードメイン」が続き、これは、適切な細胞/細胞接触、抗原結合、および活性化が可能となるように抗原結合ドメインをエフェクター細胞の表面から離して移動させる領域を指す(Patel et al.,Gene Therapy,1999;6:412−419)。スペーサードメインは、天然、合成、半合成、または組換えの起源のいずれに由来してもよい。ある特定の実施形態において、スペーサードメインは、1つ以上の重鎖定常領域、例えば、CH2およびCH3を含むがこれらに限定されない、免疫グロブリンの一部である。スペーサードメインは、天然に存在する免疫グロブリンヒンジ領域または変更された免疫グロブリンヒンジ領域のアミノ酸配列を含み得る。
一実施形態において、スペーサードメインは、IgG1、IgG4、またはIgDのCH2およびCH3を含む。
一実施形態において、CARの結合ドメインは、1つ以上の「ヒンジドメイン」に連結し、これは、適切な細胞/細胞接触、抗原結合、および活性化が可能となるように、抗原結合ドメインをエフェクター細胞の表面から離して位置付ける機能を果たす。CARは一般に、結合ドメインと膜貫通ドメイン(TM)との間に1つ以上のヒンジドメインを含む。ヒンジドメインは、天然、合成、半合成、または組換え源のいずれかに由来し得る。ヒンジドメインは、天然に生じる免疫グロブリンヒンジ領域または変更された免疫グロブリンヒンジ領域のアミノ酸配列を含み得る。
本明細書に記載のCARで用いるのに好適な例示的なヒンジドメインとしては、CD8αおよびCD4などの1型膜タンパク質の細胞外領域に由来するヒンジ領域が挙げられ、これは、これらの分子の野生型ヒンジ領域であってもよいし、変更されていてもよい。別の実施形態において、ヒンジドメインは、CD8αヒンジ領域を含む。
一実施形態において、ヒンジは、PD−1ヒンジまたはCD152ヒンジである。
「膜貫通ドメイン」は、細胞外結合部分と細胞内シグナル伝達ドメインとを融合させ、CARを免疫エフェクター細胞の形質膜に固着させる、CARの一部分である。TMドメインは、天然、合成、半合成、または組換え源のいずれかに由来し得る。
例示的なTMドメインは、T細胞受容体のアルファまたはベータ鎖、CD3δ、CD3ε、CD3γ、CD3ζ、CD4、CD5、CD8α、CD9、CD16、CD22、CD27、CD28、CD33、CD37、CD45、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD152、CD154、およびPD−1に由来し得る(すなわち、これらの少なくとも膜貫通領域(複数可)を含む。
一実施形態において、CARは、CD8αに由来するTMドメインを含む。別の実施形態において、本明細書において企図されるCARは、CD8αに由来するTMドメイン、およびCARのTMドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインを連結する、好ましくは長さが1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10個の間のアミノ酸の短いオリゴ−またはポリペプチドリンカーを含む。グリシン−セリンリンカーは、特に好適なリンカーを提供する。
特定の実施形態において、CARは、細胞内シグナル伝達ドメインを含む。「細胞内シグナル伝達ドメイン」とは、標的抗原に対する効果的なCAR結合のメッセージを、免疫エフェクター細胞の内部に形質導入して、エフェクター細胞機能、例えば、活性化、サイトカイン産生、増殖、およびCAR結合標的細胞に対する細胞傷害因子の放出を含む細胞傷害活性、または細胞外CARドメインに対する抗原結合により誘発される他の細胞応答を誘発することに関与する、CARの部分を指す。
したがって、「細胞内シグナル伝達ドメイン」という用語は、エフェクター機能シグナルを形質導入し、細胞に特殊機能を行わせる、タンパク質の一部分を指す。通常、細胞内シグナル伝達ドメイン全体が採用され得るが、多くの場合、ドメイン全体を使用する必要はない。細胞内シグナル伝達ドメインの切り詰められた部分が使用される程度において、このような切り詰められた部分は、エフェクター機能シグナルを伝達する限り、ドメイン全体の代わりに使用され得る。細胞内シグナル伝達ドメインという用語は、エフェクター機能シグナルの伝達に十分な細胞内シグナル伝達ドメインの任意の切り詰められた部分を含むことを意味する。
TCRによって生成されたシグナル単独ではT細胞の完全な活性化に不十分であり、二次的または共刺激性のシグナルも必要であることが知られている。したがって、T細胞活性化は、2つの異なるクラスの細胞内シグナル伝達ドメイン、すなわち、TCR(例えば、TCR/CD3複合体)によって抗原依存性一次活性化を開始する一次シグナル伝達ドメインと、抗原依存様式で作用して二次的または共刺激性のシグナルを提供する共刺激シグナル伝達ドメインとによって媒介されると言うことができる。好ましい実施形態において、CARは、1つ以上の「共刺激シグナル伝達ドメイン」および「一次シグナル伝達ドメイン」を含む細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
一次シグナル伝達ドメインは、刺激方法または阻害方法のいずれかでTCR複合体の一次活性化を調節する。刺激様式で作用する一次シグナル伝達ドメインは、免疫受容体チロシンベース活性化モチーフまたはITAMとして知られる、シグナル伝達モチーフを含有し得る。
特定の実施形態において企図されるCARで用いるのに好適な一次シグナル伝達ドメインを含むITAMの例示的な例としては、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD22、CD79a、CD79b、およびCD66dに由来するものが挙げられる。特定の好ましい実施形態において、CARは、CD3ζ一次シグナル伝達ドメインおよび1つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインを含む。細胞内一次シグナル伝達ドメインおよび共刺激シグナル伝達ドメインは、膜貫通ドメインのカルボキシル末端に、任意の順序でタンデムに連結していてよい。
特定の実施形態において、CARは、CAR受容体を発現するT細胞の有効性および増幅を増強するために、1つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインを含む。本明細書で使用される場合、「共刺激シグナル伝達ドメイン」または「共刺激ドメイン」という用語は、共刺激分子の細胞内シグナル伝達ドメインを指す。
特定の実施形態において企図されるCARで用いるのに好適なそのような共刺激分子の例示的な例としては、TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、CARD11、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CD54(ICAM)、CD83、CD134(OX40)、CD137(4−1BB)、CD278(ICOS)、DAP10、LAT、NKD2C、SLP76、TRIM、およびZAP70が挙げられる。一実施形態において、CARは、CD28、CD137、およびCD134、およびCD3ζ一次シグナル伝達ドメインからなる群から選択される1つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインを含む。
様々な実施形態において、CARは、BCMA、CD19、CSPG4、PSCA、ROR1、およびTAG72からなる群から選択される抗原に結合する細胞外ドメイン;CD4、CD8α、CD154、およびPD−1からなる群から選択されるポリペプチドから単離された膜貫通ドメイン;CD28、CD134、およびCD137からなる群から選択されるポリペプチドから単離される1つ以上の細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン;ならびにFcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD22、CD79a、CD79b、およびCD66dからなる群から選択されるポリペプチドから単離されたシグナル伝達ドメインを含む。
F.ポリペプチド
CAR、ガヌクレアーゼ、メガTAL、TALEN、ZFN、およびCasヌクレアーゼ、融合ポリペプチド、およびポリペプチドを発現するベクターが挙げられるが、これらに限定されない、様々なポリペプチドが、本明細書において企図される。
CAR、ガヌクレアーゼ、メガTAL、TALEN、ZFN、およびCasヌクレアーゼ、融合ポリペプチド、およびポリペプチドを発現するベクターが挙げられるが、これらに限定されない、様々なポリペプチドが、本明細書において企図される。
「ポリペプチド」、「ポリペプチド断片」、「ペプチド」、および「タンパク質」は、別段の規定がない限り、従来の意味に従って、すなわち、アミノ酸の配列として同義に使用される。一実施形態において、「ポリペプチド」は、融合ポリペプチドおよび他のバリアントを含む。ポリペプチドは、様々な周知の組換えおよび/または合成技法のいずれかを使用して調製され得る。ポリペプチドは特定の長さに限定されず、例えば、それらは、全長タンパク質配列、全長タンパク質の断片、または融合タンパク質を含み得、かつ、ポリペプチドの翻訳後修飾、例えばグリコシル化、アセチル化、リン酸化など、ならびに天然に存在するおよび天然に存在しない両方の、当該技術分野で既知の他の修飾を含み得る。
本明細書で使用される「単離されたペプチド」または「単離されたポリペプチド」などは、細胞環境から、また細胞の他の成分との会合から、ペプチドもしくはポリペプチド分子をインビトロで単離および/または精製することを指す(すなわち、それは、インビボの物質と著しく会合していない)。
特定の実施形態において企図されるポリペプチドの例示的な例としては、メガヌクレアーゼ、メガTAL、TALEN、ZFN、Casヌクレアーゼ、末端プロセシングヌクレアーゼ、治療ポリペプチド、および融合ポリペプチド、およびそのバリアントが挙げられるが、これらに限定されない。
ポリペプチドバリアントには、生物学的に活性な「ポリペプチド断片」を含む。本明細書で使用される場合、「生物学的に活性な断片」または「最小限の生物学的に活性な断片」とは、天然に存在するポリペプチド活性の少なくとも100%、少なくとも90%、少なくとも80%、少なくとも70%、少なくとも60%、少なくとも50%、少なくとも40%、少なくとも30%、少なくとも20%、少なくとも10%、または少なくとも5%保持するポリペプチド断片を指す。ポリペプチド断片は、ポリペプチドを指し、これは、天然に存在するもしくは組換え産生されたポリペプチドのアミノ末端欠失、カルボキシル末端欠失、および/もしくは内部欠失、または置換を有する、単量体または多量体であり得る。ある特定の実施形態において、ポリペプチド断片は、少なくとも5〜約1700アミノ酸長のアミノ酸鎖を含み得る。ある特定の実施形態において、断片が、少なくとも5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700またはそれ以上のアミノ酸長である。
ポリペプチド断片の例示的な例としては、DNA結合ドメイン、ヌクレアーゼドメイン、抗体断片、細胞外リガンド結合ドメイン、シグナル伝達ドメイン、膜貫通ドメイン、多量体化ドメインが挙げられる。
ポリペプチドには、「ポリペプチドバリアント」が挙げられる。ポリペプチドバリアントは、1つ以上の置換、欠失、付加、および/または挿入において天然に存在するポリペプチドと異なり得る。そのようなバリアントは、天然に存在し得るか、または、例えば、上記のポリペプチド配列のうちの1つ以上を改変することによって合成的に生成され得る。例えば、特定の実施形態において、ポリペプチドに、1つ以上の置換、欠失、付加、および/または挿入によって、ポリペプチドの生物学的特性を改善させることが望ましい場合がある。特定の実施形態において、ポリペプチドは、典型的にはバリアントが参照配列の少なくとも1つの生物学的活性を維持する場合、本明細書において企図される参照配列のいずれかに対して少なくとも約65%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%,85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
上記のように、ポリペプチドは、アミノ酸置換、欠失、短縮化、および挿入を含む、様々な方法で変更され得る。このような操作方法は、当該技術分野で一般に既知である。例えば、参照ポリペプチドのアミノ酸配列バリアントは、DNAにおける突然変異により調製され得る。突然変異誘発およびヌクレオチド配列の変更方法は、当該技術分野で周知である。例えば、Kunkel(1985,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.82:488−492)、Kunkel et al.,(1987,Methods in Enzymol,154:367−382)、米国特許第4,873,192号、Watson,J.D.et al.,(Molecular Biology of the Gene,Fourth Edition,Benjamin/Cummings,Menlo Park,Calif.,1987)、およびこれらの文献中に引用される参考文献を参照されたい。目的とするタンパク質の生物活性に影響しない適切なアミノ酸置換に関する指針は、Dayhoff et al.,(1978)Atlas of Protein Sequence and Structure(Natl.Biomed.Res.Found.,Washington,D.C.)のモデルに見出すことができる。
ある特定の実施形態において、バリアントは、1つ以上の保存的置換を含むであろう。「保存置換」とは、ペプチド化学分野における当業者がポリペプチドの二次構造および疎水性親水性(hydropathic nature)が実質的に変化しないことを予想するように、アミノ酸が類似する性質を有する別のアミノ酸に置換されるものである。改変が、特定の実施形態において企図されるポリヌクレオチドおよびポリペプチドの構造において行われつつ、望ましい特性を有するバリアントまたは誘導体のポリペプチドをコードする機能分子も得ることができる。同等の、またはさらには改善されたバリアントポリペプチドを作り出すために、ポリペプチドのアミノ酸配列を変更することが所望される場合、当業者は、例として、例えば表1によるコードDNA配列のコドンのうちの1つ以上を変化させることができる。
生物学的活性を消失することなく置換、挿入、または欠失させることのできるアミノ酸残基がどれかを決定する指針は、当該技術分野で周知のコンピュータプログラム、例えばDNASTAR、DNA Strider、Geneious、Mac Vector、またはVector NTIソフトウェアなどを使用して見出すことができる。好ましくは、本明細書に開示されるタンパク質バリアントのアミノ酸変化は、保存的アミノ酸変化、すなわち、同様に荷電したまたは非荷電のアミノ酸の置換である。保存的アミノ酸変化は、それらの側鎖において関連するアミノ酸のファミリーのうちの1つの置換を伴う。天然に生じるアミノ酸は、一般に、酸性(アスパラギン酸、グルタミン酸)、塩基性(リジン、アルギニン、ヒスチジン)、非極性(アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン)、および非荷電の極性(グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシン)アミノ酸の4つのファミリーに分類される。フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンは、時折、芳香族アミノ酸として一緒に分類される。ペプチドまたはタンパク質において、アミノ酸の好適な保存的置換は、本技術分野における当業者に既知であり、一般に、得られる分子の生物学的活性を変更することなく作製され得る。当業者は、全般に、ポリペプチドの非必須領域における単一のアミノ酸置換が実質的に生物学的活性を変更しないことを認識している(例えば、Watson et al.Molecular Biology of the Gene,4th Edition,1987,The Benjamin/Cummings Pub.Co.,p.224を参照されたい)。
ポリペプチドバリアントは、グリコシル化形態、他の分子との凝集接合体、および無関係の化学部分との共有結合接合体(例えば、PEG化分子)をさらに含む。共有結合バリアントは、当該技術分野で既知であるように、アミノ酸鎖内またはN末端もしくはC末端の残基に見出される基に官能基を連結することによって調製することができる。バリアントには、対立遺伝子バリアント、種バリアント、およびムテインも含まれる。タンパク質の機能活性に影響を及ぼさない領域の短縮化または欠失もバリアントである。
一実施形態において、2つ以上のポリペプチドの発現が所望される場合、それらをコードするポリヌクレオチド配列は、本明細書において他の箇所に開示されるように、およびIRES配列によって分離され得る。
特定の実施形態において企図されるポリペプチドは、融合ポリペプチドを含む。特定の実施形態において、融合ポリペプチド、および融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが提供される。融合ポリペプチドおよび融合タンパク質とは、少なくとも2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、またはそれ以上のポリペプチドセグメントを有するポリペプチドを指す。
別の実施形態において、2つ以上のポリペプチドが、本明細書において他の箇所に開示されるように、1つ以上の自己切断型ポリペプチド配列を含む融合タンパク質として発現し得る。
一実施形態において、本明細書において企図される融合タンパク質は、1つ以上のDNA結合ドメインおよび1つ以上のヌクレアーゼ、ならびに1つ以上のリンカーおよび/または自己切断型ポリペプチドを含む。
一実施形態において、本明細書において企図される融合タンパク質は、1つ以上の細胞外ドメイン、細胞外リガンド結合ドメイン、または抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、およびまたは1つ以上の細胞内シグナル伝達ドメイン、ならびに任意に、1つ以上の多量体化ドメインを含む。
特定の実施形態において企図される融合タンパク質である、ポリペプチドの例示的な例としては、少なくともおよそを有するポリペプチドが含まれ、メガTAL、TALEN、ZFN、Casヌクレアーゼ、末端プロセシングヌクレアーゼ、CAR、および他のポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。
融合ポリペプチドは、典型的には、C末端とN末端で連結しているが、それらは、C末端とC末端、N末端とN末端、またはN末端とC末端で連結していてもよい。特定の実施形態において、融合タンパク質のポリペプチドは、任意の順序であり得る。融合ポリペプチドまたは融合タンパク質はまた、融合ポリペプチドの所望の活性が保存される限り、保存的に改変されたバリアント、多形性バリアント、対立遺伝子、変異体、サブ配列、および種間相同体も含み得る。融合ポリペプチドは、化学合成方法もしくは2つの部分間の化学連結により産生され得るか、または他の標準的な技法を使用して一般的に調製され得る。融合ポリペプチドを含む連結されたDNA配列は、本明細書において他の箇所に開示されているように、好適な転写または翻訳の制御エレメントに作動可能に連結される。
融合ポリペプチドは、任意に、ポリペプチド内で1つ以上のポリペプチドまたはドメインを連結させるために使用することができるリンカーを含み得る。ペプチドリンカー配列は、各ポリペプチドが、ポリペプチドドメインがそれらの所望の機能を発揮できるように、その適切な二次および三次構造の折り畳みを確実にするのに十分な距離によって任意の2つ以上のポリペプチド構成成分を分離するために用いられ得る。そのようなペプチドリンカー配列は、当該技術分野で標準的な技術を用いて融合ポリペプチドに組み込まれる。好適なペプチドリンカー配列は、要因:(1)それらが可撓性伸長立体配座を取ることができること、(2)それらが第1および第2のポリペプチド上の機能性エピトープと相互作用できる二次構造を取れないこと、および(3)ポリペプチド機能性エピトープと反応するかもしれない疎水性または荷電残基の欠失、に基づいて選択され得る。好ましいペプチドリンカー配列は、Gly、Asn、およびSer残基を含有する。ThrおよびAlaなどの他の中性に近いアミノ酸もまた、このリンカー配列中で使用され得る。リンカーとして有用に用いられ得るアミノ酸配列は、Maratea et al.,Gene 40:39−46,1985、Murphy et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83:8258−8262,1986、米国特許第4,935,233号および米国特許第4,751,180号に開示されているものを含む。リンカー配列は、特定の融合ポリペプチドセグメントが、機能ドメインを分離し、立体干渉を防止するために使用することができる不要なN末端アミノ酸領域を含有するときには、必要とされない。好ましいリンカーは、典型的には、組換え融合タンパク質の一部として合成される可撓性アミノ酸配列である。リンカーポリペプチドは、1〜200アミノ酸の長さ、1〜100アミノ酸の長さ、または1〜50アミノ酸の長さであり得、その間の全ての整数値を含む。
例示的なリンカーとしては、次のアミノ酸配列:グリシンポリマー(G)n;グリシン−セリンポリマー(G1−5S1−5)n(式中、nは、少なくとも1、2、3、4、または5である);グリシン−アラニンポリマー;アラニン−セリンポリマー;GGG(配列番号14);DGGGS(配列番号15);TGEKP(配列番号16)(例えば、Liu et al.,PNAS 5525−5530(1997)を参照されたい);GGRR(配列番号17)(Pomerantz et al.1995、上記参照);(GGGGS)n(配列番号18)(Kim et al.,PNAS 93,1156−1160(1996.);EGKSSGSGSESKVD(配列番号19)(Chaudhary et al.,1990,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.87:1066−1070);KESGSVSSEQLAQFRSLD(配列番号20)(Bird et al.,1988,Science 242:423−426)、GGRRGGGS(配列番号21);LRQRDGERP(配列番号22);LRQKDGGGSERP(配列番号23);LRQKD(GGGS)2ERP(配列番号24)が挙げられるが、これらに限定されない。代替的に、柔軟なリンカーは、DNA結合部位およびペプチド自体の両方をモデル化することができるコンピュータプログラムを使用して(Desjarlais&Berg,PNAS 90:2256−2260(1993),PNAS 91:11099−11103(1994)、またはファージディスプレイ法により、合理的に設計され得る。
融合ポリペプチドは、本明細書に記載されるポリペプチドドメインの各々の間または内因性オープンリーディングフレームとドナー修復テンプレートによってコードされるポリペプチドとの間にポリペプチド切断シグナルをさらに含んでもよい。加えて、ポリペプチド切断部位は、任意のリンカーペプチド配列に入れることができる。例示的なポリペプチド切断シグナルとしては、プロテアーゼ切断部位、ヌクレアーゼ切断部位(例えば、稀な制限酵素認識部位、自己切断型リボザイム認識部位)、および自己切断型ウイルスオリゴペプチドなどのポリペプチド切断認識部位が挙げられる(deFelipe and Ryan,2004.Traffic,5(8);616−26を参照されたい)。
好適なプロテアーゼ切断部位および自己切断型ペプチドは当業者に既知である(例えば、Ryan et al.,1997.J.Gener.Virol.78,699−722、Scymczak et al.(2004)Nature Biotech.5,589−594を参照されたい)。例示的なプロテアーゼ切断部位は、ポティウイルスNIaプロテアーゼ(例えば、タバコエッチウイルスプロテアーゼ)、ポティウイルスHCプロテアーゼ、ポティウイルスP1(P35)プロテアーゼ、ビオウイルスNIaプロテアーゼ、ビオウイルスRNA−2コードプロテアーゼ、アフトウイルスLプロテアーゼ、エンテロウイルス2Aプロテアーゼ、ライノウイルス2Aプロテアーゼ、ピコルナ3Cプロテアーゼ、コモウイルス24Kプロテアーゼ、ネポウイルス24Kプロテアーゼ、RTSV(イネツングロ球状ウイルス)3C様プロテアーゼ、PYVF(パースニップ黄斑ウイルス)3C様プロテアーゼ、ヘパリン、トロンビン、因子Xa、およびエンテロキナーゼを含むが、これらに限定されない。その高い切断厳密性により、TEV(タバコエッチウイルス)プロテアーゼ切断部位、例えば、EXXYXQ(G/S)(配列番号25)、例えば、ENLYFQG(配列番号26)およびENLYFQS(配列番号27)(式中、Xは、任意のアミノ酸を表す)(TEVによる切断はQとGとの間またはQとSとの間で生じる)が一実施形態において好ましい。
ある特定の実施形態において、自己切断型ポリペプチド部位は、2Aもしくは2A様の部位、配列、またはドメインを含む(Donnelly et al.,2001.J.Gen.Virol.82:1027−1041)。特定の実施形態において、ウイルス2Aペプチドは、アフトウイルス2Aペプチド、ポティウイルス2Aペプチド、またはカルジオウイルス2Aペプチドである。
一実施形態において、ウイルス2Aペプチドは、***ウイルス(FMDV)2Aペプチド、ウマ鼻炎Aウイルス(ERAV)2Aペプチド、Thosea asignaウイルス(TaV)2Aペプチド、ブタテッショウウイルス−1(PTV−1)2Aペプチド、Theilovirus2Aペプチド、および脳心筋炎ウイルス2Aペプチドからなる群から選択される。
2A部位の例示的な例を、表2に提供する。
G.ポリヌクレオチド
特定の実施形態において、本明細書において企図されるポリペプチドまたは融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが提供される。本明細書で使用される場合、「ポリヌクレオチド」または「核酸」という用語は、デオキシリボ核酸(DNA)、リボ核酸(RNA)、およびDNA/RNAハイブリッドを指す。ポリヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖であり得る。ポリヌクレオチドとしては、プレ−メッセンジャーRNA(pre−mRNA)、メッセンジャーRNA(mRNA)、RNA、短い干渉RNA(siRNA)、短いヘアピンRNA(shRNA)、マイクロRNA(miRNA)、リボザイム、合成RNA、ゲノムRNA(gRNA)、プラス鎖RNA(RNA(+))、マイナス鎖RNA(RNA(−))、tracrRNA、crRNA、単一ガイドRNA(sgRNA)、合成RNA、ゲノムDNA(gDNA)、PCR増幅DNA、相補DNA(cDNA)、合成DNA、または組換えDNAが挙げられるが、これらに限定されない。
特定の実施形態において、本明細書において企図されるポリペプチドまたは融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが提供される。本明細書で使用される場合、「ポリヌクレオチド」または「核酸」という用語は、デオキシリボ核酸(DNA)、リボ核酸(RNA)、およびDNA/RNAハイブリッドを指す。ポリヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖であり得る。ポリヌクレオチドとしては、プレ−メッセンジャーRNA(pre−mRNA)、メッセンジャーRNA(mRNA)、RNA、短い干渉RNA(siRNA)、短いヘアピンRNA(shRNA)、マイクロRNA(miRNA)、リボザイム、合成RNA、ゲノムRNA(gRNA)、プラス鎖RNA(RNA(+))、マイナス鎖RNA(RNA(−))、tracrRNA、crRNA、単一ガイドRNA(sgRNA)、合成RNA、ゲノムDNA(gDNA)、PCR増幅DNA、相補DNA(cDNA)、合成DNA、または組換えDNAが挙げられるが、これらに限定されない。
ポリヌクレオチドとは、リボヌクレオチドもしくはデオキシリボヌクレオチドまたはヌクレオチドのいずれかの型の修飾型、少なくとも5、少なくとも10、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも25、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも100、少なくとも200、少なくとも300、少なくとも400、少なくとも500、少なくとも1000、少なくとも5000、少なくとも10000、または少なくとも15000もしくはそれ以上のヌクレオチドの長さ、ならびに全ての中間の長さのヌクレオチドの多量体型を指す。この文脈において、「中間の長さ」が、引用された値の間の任意の長さ、例えば、6、7、8、9など、101、102,、103など、151、152、153など、201、202、203などを意味することは、容易に理解されるであろう。特定の実施形態において、ポリヌクレオチドまたはバリアントは、参照配列のいずれかに対して少なくともまたは約50%、55%、60%、65%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の配列同一性を有する。
様々な例示的な実施形態において、本明細書において企図されるポリヌクレオチドとしては、メガヌクレアーゼ、メガTAL、TALEN、ZFN、Casヌクレアーゼ、末端プロセシングヌクレアーゼ、CAR、治療ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ならびに発現ベクター、ウイルスベクター、および運搬プラスミドを含むポリヌクレオチドが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「ポリヌクレオチドバリアント」および「バリアント」などの用語は、参照ポリヌクレオチド配列と実質的な配列同一性を示すポリヌクレオチド、または下文に定義されるストリンジェントな条件下で参照配列とハイブリダイズするポリヌクレオチドを指す。これらの用語はまた、少なくとも1つのヌクレオチドの付加、欠失、置換、または修飾によって、参照ポリヌクレオチドと区別されるポリヌクレオチドも包含する。したがって、「ポリヌクレオチドバリアント」および「バリアント」という用語は、1つ以上のヌクレオチドが付加もしくは欠失されたか、または異なるヌクレオチドで修飾されているか、または置き換えられたポリヌクレオチドを含む。この点において、変異、付加、欠失、および置換を含むある特定の変更は、参照ポリヌクレオチドに対して行われ得、それにより変更されたポリヌクレオチドは参照ポリヌクレオチドの生物学的機能または活性を保持することは十分に理解されている。
一実施形態において、ポリヌクレオチドは、ストリンジェントな条件下で標的核酸配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む。「ストリンジェントな条件」下でハイブリダイズすることは、ヌクレオチド配列が互いに少なくとも60%同一性が、ハイブリダイズされたままであるハイブリダイゼーションプロトコルを説明する。一般に、ストリンジェントな条件は、定義されたイオン強度およびpHの特定の配列に対して熱溶解点(Tm)よりも約5℃低くなるように選択される。Tmは、温度(定義されたイオン強度、pH、および核酸濃度下で)であり、標的配列に相補的なプローブの50%は、平衡状態で標的配列にハイブリダイズする。標的配列は、一般に、過剰に存在するため、Tmでは、平衡状態でプローブの50%が占有されている。
本明細書で使用される「配列同一性」または例えば「に対して50%同一の配列」を含む記述は、配列が比較枠にわたってヌクレオチド単位基準またはアミノ酸単位基準で同一である程度を指す。よって、「配列同一性の割合」は、比較枠にわたって2つの最適にアライメントされた配列を比較すること、同一の核酸塩基(例えば、A、T、C、G、I)または同一のアミノ酸残基(例えば、Ala、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gln、Cys、およびMet)が両方の配列で生じる位置数を決定して対応位置数を得ること、比較枠の総位置数(すなわち、枠のサイズ)で対応位置数を除すること、およびその結果を100で乗じて配列同一性の割合を得ることにより計算され得る。典型的には、ポリペプチドバリアントが参照ポリペプチドの少なくとも1つの生物学的活性を維持する、本明細書に記載される参照配列のいずれかに対して少なくとも約50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の配列同一性を有するヌクレオチドおよびポリペプチドが含まれる。
2つ以上のポリヌクレオチドまたはポリペプチド間の配列関係を説明するために使用される用語は、「参照配列」、「比較枠」、「配列同一性」、「配列同一性の割合」、および「実質的な同一性」を含む。「参照配列」は、ヌクレオチドおよびアミノ酸残基を含めて、長さが少なくとも12だが、頻繁に15〜18、多くの場合、少なくとも25の単量体単位である。2つのポリヌクレオチドは、各々、(1)2つのポリヌクレオチド間で類似する配列(すなわち、完全なポリヌクレオチド配列の一部のみ)および(2)2つのポリヌクレオチド間で多様である配列を含み得るため、2つ(以上)のポリヌクレオチド間の配列比較は、典型的には、「比較枠」にわたって2つのポリヌクレオチドの配列を比較して、配列類似性の局所的な領域を特定および比較することにより行われる。「比較枠」は、2つの配列が最適にアライメントされた後に、ある配列が同じ数の隣接位置の参照配列と比較される、少なくとも6つの隣接位置、一般的には約50〜約100、より一般的には約100〜約150の概念的セグメントを指す。比較枠は、2つの配列の最適なアライメントの参照配列(付加または欠失を含まない)と比較したとき、約20%以下の付加または欠失(すなわち、ギャップ)を含み得る。比較枠をアライメントするための配列の最適なアライメントは、コンピュータ化されたアルゴリズムの実装(Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0のGAP、BESTFIT、FASTA、およびTFASTA、Genetics Computer Group,575 Science Drive Madison,WI,USA)により、または調査および選択された様々な方法のいずれかによって生成された最良のアライメント(すなわち、比較枠にわたって最高率の相同性をもたらす)により実施され得る。例えば、Altschul et al.,1997,Nucl.Acids Res.25:3389によって開示されるBLASTファミリーのプログラムも参照することができる。配列分析の詳細な説明は、Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons Inc.,1994−1998,Chapter 15のユニット19.3に見出すことができる。
本明細書で使用される場合、「単離されたポリヌクレオチド」は、天然に存在する状態でそれに隣接する配列から精製されたポリヌクレオチド、例えば、ある断片に通常隣接する配列から取り除かれたDNA断片を指す。特定の実施形態において、「単離されたポリヌクレオチド」は、相補的DNA(cDNA)、組換えポリヌクレオチド、合成ポリヌクレオチド、または実際に存在せず、人の手によって作製された他のポリヌクレオチドも指す。
ポリヌクレオチドの配向を説明する用語は、5´(通常、遊離リン酸基を有するポリヌクレオチドの末端)および3´(通常、遊離ヒドロキシル(OH)基を有するポリヌクレオチドの末端)を含む。ポリヌクレオチド配列は、5´から3´配向または3´から5´配向で注釈が付けられ得る。DNAおよびmRNAについては、5´から3´の鎖は、その配列がプレメッセンジャー(premRNA)の配列と同一であるため[DNAのチミン(T)の代わりにRNAのウラシル(U)を除く]、「センス」鎖、「プラス」鎖、または「コード」鎖と呼ばれる。DNAおよびmRNAについては、RNAポリメラーゼにより転写された鎖である相補3´から5´鎖は、「テンプレート」鎖、「アンチセンス」鎖、「マイナス」鎖、または「非コード」鎖と呼ばれる。本明細書で使用される場合、「逆配向」という用語は、3´から5´配向で書かれた5´から3´配列、または5´から3´配向で書かれた3´から5´配列を指す。
「相補的」および「相補性」という用語は、塩基対合規則によって関係が表されるポリヌクレオチド(すなわち、ヌクレオチドの配列)を指す。例えば、DNA配列5´A G T C A T G 3´の相補鎖は、3´T C A G T A C 5´である。後者の配列は、左側に5´端、そして右側に3´端の5´C A T G A C T 3´の逆相補として書かれることが多い。その逆相補体と等しい配列は、パリンドローム配列と言われる。相補性は「部分的」であり、核酸の塩基のうちのいくつかのみが塩基対合規則に従い一致する。または、核酸間で「完全な」もしくは「全」相補性が存在し得る。
本明細書で使用される「核酸カセット」という用語は、1つ以上のRNAを発現することのできるベクター内の遺伝子配列を指す。一実施形態において、核酸カセットは、目的となる1つ以上のポリヌクレオチド(複数可)を含有する。別の実施形態において、核酸カセットは、目的となる1つ以上のポリヌクレオチド(複数可)に作動可能に連結された1つ以上の発現制御配列を含有する。ベクターは、1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、または10個もしくはそれ以上の核酸カセットを含み得る。このカセットは、単一単位として、他のポリヌクレオチド配列、例えば、プラスミドまたはウイルスベクターから除去されるか、またはそれに挿入され得る。
ポリヌクレオチドは、目的となるポリヌクレオチド(複数可)を含む。本明細書で使用される場合、「目的となるポリヌクレオチド」という用語は、ポリペプチドもしくは融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたは本明細書において企図される阻害性ポリヌクレオチドの転写のためのテンプレートとして機能するポリヌクレオチドを指す。
さらに、本明細書において企図されるように、遺伝コードの縮重の結果として、ポリペプチドまたはそのバリアントの断片をコードし得る多くのヌクレオチド配列が存在することは、当業者には理解されよう。これらのポリヌクレオチドのいくつかは、任意の未変性遺伝子のヌクレオチド配列に対して最小の相同性を有する。とはいえ、コドン利用の差により異なるポリヌクレオチド、例えば、ヒトおよび/または霊長類のコドン選択のために最適化されるポリヌクレオチドは、特定の実施形態において特に企図される。一実施形態において、特定の単立遺伝子配列を含むポリヌクレオチドが提供される。対立遺伝子は、ヌクレオチドの欠失、付加、および/または置換などの1つ以上の変異の結果として変更されている内在性ポリヌクレオチド配列である。
ある特定の実施形態において、目的となるポリヌクレオチドは、CARをコードするドナー修復テンプレートを含む。
ある特定の実施形態において、目的となるポリヌクレオチドは、crRNA、tracrRNA、単一ガイドRNA(sgRNA)、siRNA、miRNA、shRNA、リボザイム、または別の阻害性RNAが挙げられるが、これらに限定されない、阻害性ポリヌクレオチドを含む。
本明細書で使用される場合、「siRNA」または「短い干渉RNA」という用語は、動物における配列特異的転写後遺伝子サイレンシング、翻訳阻害、転写阻害、またはエピジェネティックRNAiのプロセスを媒介する短いポリヌクレオチド配列を指す(Zamore et al.,2000,Cell,101,25−33、Fire et al.,1998,Nature,391,806、Hamilton et al.,1999,Science,286,950−951、Lin et al.,1999,Nature,402,128−129、Sharp,1999,Genes & Dev.,13,139−141、およびStrauss,1999,Science,286,886)。
本明細書で使用される場合、「miRNA」または「マイクロRNA」という用語は、20〜22ヌクレオチド、典型的には、pre−miRNAとして知られる、約70ヌクレオチドホールドバックRNA前駆体構造から切り取られた、小さい非コードRNAを指す。miRNAは、miRNAと標的との間の相補性の程度により、2つの方法のうちの1つでそれらの標的を負に調節する。
本明細書で使用される場合、「shRNA」または「短いヘアピンRNA」という用語は、単一の自己相補的RNA鎖によって形成される二本鎖構造を指す。
本明細書で使用される場合、「リボザイム」という用語は、標的mRNAの部位特異的切断が可能な触媒的に活性なRNA分子を指す。
一実施形態において、ドナー修復テンプレートは、阻害性RNAを含み、本明細書において他の箇所に記載されるように、例えば、強力な構成的pol III、例えば、ヒトまたはマウスU6 snRNAプロモーター、ヒトおよびマウスH1 RNAプロモーター、またはヒトtRNA−valプロモーター、または強力な構成的pol IIプロモーターなどの1つ以上の調節配列を含む。
特定の実施形態において企図されるポリヌクレオチドは、コード配列自体の長さにかかわらず、本明細書において他の箇所に開示されるか、または当該技術分野で既知の、プロモーターおよび/またはエンハンサー、非翻訳領域(UTR)、コザック配列、ポリアデニル化シグナル、付加的な制限酵素部位、多重クローニング部位、内部リボソーム侵入部位(IRES)、リコンビナーゼ認識部位(例えば、LoxP、FRT、およびAtt部位)、終止コドン、転写終結シグナル、および自己切断型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、エピトープタグなどの他のDNA配列と組み合わされてもよく、その結果、それらの全体的な長さが大幅に変動してもよい。したがって、ほぼ全ての長さのポリヌクレオチド断片を採用することができ、合計の長さは、好ましくは、調製の容易さおよび意図される組換えDNAプロトコルの使用により制限されることが特定の実施形態において企図される。
ポリヌクレオチドは、当該技術分野で既知であり、利用可能である十分に確立された種々の技術のいずれを使用して、調製、操作、発現、および/または送達され得る。所望のポリペプチドを発現するために、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が適切なベクターに挿入され得る。
ベクターの例示的な例としては、プラスミド、自己複製配列、および転位因子、例えば、Sleeping Beauty、PiggyBacが挙げられるが、これらに限定されない。
ベクターのさらなる例示的な例としては、プラスミド、ファージミド、コスミド、人工染色体、例えば、酵母人工染色体(YAC)、細菌人工染色体(BAC)、またはP1誘導人工染色体(PAC)など、バクテリオファージ、例えば、ラムダファージまたはM13ファージ、および動物ウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。
ベクターとして有用なウイルスの例示的な例としては、レトロウイルス(レンチウイルスを含む)、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス(例えば、単純ヘルペスウイルス)、ポックスウイルス、バキュロウイルス、パピローマウイルス、およびパポバウイルス(例えば、SV40)が挙げられるが、これらに限定されない。
発現ベクターの例示的な例としては、哺乳動物細胞における発現のためのpClneoベクター(Promega)、哺乳動物細胞におけるレンチウイルス媒介性遺伝子移入および発現のためのpLenti4/V5−DEST(商標)、pLenti6/V5−DEST(商標)、およびpLenti6.2/V5−GW/lacZ(Invitrogen)が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、本明細書に開示されるポリペプチドのコード配列が、哺乳動物細胞におけるポリペプチドの発現のために、このような発現ベクターに連結され得る。
特定の実施形態において、ベクターは、エピソームベクター、または染色体外に維持されるベクターである。本明細書で使用される場合、「エピソーム」という用語は、宿主の染色体DNA内に組み込むことなしに、および宿主細胞の***により徐々に失われることなく複製することができるベクターを指し、該ベクターは染色体外またはエピソームで複製することも意味する。ベクターは、アルファ、ベータ、もしくはガンマヘルペスウイルス、アデノウイルス、SV40、ウシパピローマウイルス、または酵母からのDNA複製起源、または「ori」をコードする配列を保有するように操作される。典型的には、宿主細胞は、複製を活性化するウイルス複製トランス活性化因子タンパク質を含む。アルファヘルペスウイルスは、比較的短い生殖周期、可変宿主範囲を有し、感染細胞を効率的に破壊し、主に感覚神経節において潜伏感染を確立する。アルファヘルペスウイルスの例示的な例としては、HSV 1、HSV 2、およびVZVが挙げられる。ベータヘルペスウイルスは、長い生殖周期および制限された宿主範囲を有する。感染細胞は、多くの場合、増大する。潜在性は、血液、腎臓、分泌腺、および他の組織の白血球に維持され得る。ベータヘルペスウイルスの例示的な例としては、CMV、HHV−6、およびHHV−7が挙げられる。ガンマ−ヘルペスウイルスは、Tリンパ球またはBリンパ球のいずれかに対して特異的であり、潜在性は、多くの場合、リンパ組織において示されている。ガンマヘルペスウイルスの例示的な例としては、EBVおよびHHV−8が挙げられる。
発現ベクター内に存在する「発現制御配列」、「制御エレメント」、または「調節配列」は、宿主細胞タンパク質と相互作用して転写および翻訳を行う、ベクター複製起点の非翻訳領域、選択カセット、プロモーター、エンハンサー、翻訳開始シグナル(シャイン・ダルガーノ配列またはコザック配列)イントロン、ポリアデニル化配列、5’および3’非翻訳領域である。このようなエレメントは、それらの強度および特異性が異なり得る。用いられるベクター系および宿主に応じて、遍在性プロモーターおよび誘導性プロモーターを含む任意の数の好適な転写および翻訳エレメントを使用することができる。
特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、発現ベクターおよびウイルスベクターを含むが、これらに限定されず、プロモーターおよび/またはエンハンサーなどの外因性、内因性、もしくは異種の制御配列を含む。「内因性」制御配列は、ゲノム内の所与の遺伝子と自然に連結しているものである。「外因性制御配列」は、その遺伝子の転写が連結されたエンハンサー/プロモーターにより指向されるように、遺伝子操作の手段(すなわち、分子生物学的技法)により遺伝子と並立に配置されるものである。「異種制御配列」は、遺伝子操作されている細胞とは異なる種に由来する外因性配列である。
本明細書で使用される「プロモーター」という用語は、RNAポリメラーゼが結合するポリヌクレオチド(DNAまたはRNA)の認識部位を指す。RNAポリメラーゼは、プロモーターに作動可能に連結されたポリヌクレオチドを開始および転写する。特定の実施形態において、哺乳動物細胞において作動可能なプロモーターは、転写が開始される部位からおよそ25〜30塩基上流に位置するAT豊富領域、および/またはNが任意のヌクレオチドであり得るCNCAAT領域の、転写の開始から70〜80塩基上流に見られる別の配列を含む。
「エンハンサー」という用語は、転写を増強することができ、いくつかの事例では別の制御配列に対するそれらの配向に関係なく機能することができる配列を含むDNAのセグメントを指す。エンハンサーは、プロモーターおよび/もしくは他のエンハンサー要素と協同的または追加的に機能することができる。「プロモーター/エンハンサー」という用語は、プロモーターおよびエンハンサー両方の機能を提供することができる配列を含有するDNAのセグメントを指す。
「作動可能に連結される」という用語は、説明されている成分がそれらの意図される様式で機能することを可能にする関係にある並立を指す。一実施形態において、本用語は、発現制御配列が第2の配列に対応する核酸の転写を指向する、核酸発現制御配列(プロモーターおよび/またはエンハンサーなど)と第2のポリヌクレオチド配列、例えば、目的となるポリヌクレオチドとの間の機能的連結を指す。
本明細書で使用される場合、「構成的発現制御配列」という用語は、作動可能に連結された配列の転写を構成的もしくは連続的に可能にするプロモーター、エンハンサー、またはプロモーター/エンハンサーを指す。構成的発現制御配列は、それぞれ、多種多様な細胞および組織型における発現を可能にする「遍在性」プロモーター、エンハンサー、もしくはプロモーター/エンハンサー、または限定された様々な細胞および組織型における発現を可能にする「細胞特異的」、「細胞型特異的」、「細胞系列特異的」、もしくは「組織特異的」プロモーター、エンハンサー、またはプロモーター/エンハンサーであり得る。
特定の実施形態で使用するのに好適な例証となる遍在性発現制御配列としては、サイトメガロウイルス(CMV)最初期プロモーター、ウイルス性サルウイルス40(SV40)(例えば、初期または後期)、モロニーマウス白血病ウイルス(MoMLV)LTRプロモーター、ラウス肉腫ウイルス(RSV)LTR、単純ヘルペスウイルス(HSV)(チミジンキナーゼ)プロモーター、ワクシニアウイルス由来のH5、P7.5、およびP11プロモーター、伸長因子1アルファ(EF1a)プロモーター、初期増殖応答1(EGR1)、フェリチンH(FerH)、フェリチンL(FerL)、グリセルアルデヒド3リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH)、真核細胞翻訳開始因子4A1(EIF4A1)、熱ショック70kDaタンパク質5(HSPA5)、熱ショックタンパク質90kDaベータメンバー1(HSP90B1)、熱ショックタンパク質70kDa(HSP70)、β−キネシン(β−KIN)、ヒトROSA 26遺伝子座(Irions et al.、Nature Biotechnology 25,1477−1482(2007))、ユビキチンCプロモーター(UBC)、ホスホグリセリン酸キナーゼ−1(PGK)プロモーター、サイトメガロウイルスエンハンサー/ニワトリβ−アクチン(CAG)プロモーター、β−アクチンプロモーター、および骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサー、負の制御領域欠失、dl587revプライマー結合部位置換(MND)プロモーター(Challita et al.、J Virol.69(2):748−55(1995))が挙げられるが、これらに限定されない。
特定の実施形態において、所望のポリヌクレオチド配列の細胞型特異的、系統特異的、または組織特異的な発現を達成するために(例えば、細胞型、細胞系統、もしくは組織のサブセットのみまたは発達の特定の段階の間ポリペプチドをコードする特定の核酸を発現するために)、細胞、細胞型、細胞系統、または組織特異的発現制御配列を使用することが望ましくあり得る。
本明細書で使用される場合、「条件付き発現」は、誘導性発現、抑制性発現、特定の生理学的状態、生物学的状態、または疾患状態を有する細胞または組織における発現などを含むが、これらに限定されない、あらゆる種類の条件付き発現を指し得る。この定義は、細胞型または組織特異的発現を除外することを意図しない。ある特定の実施形態は、目的となるポリヌクレオチドの条件付き発現を提供し、例えば、ポリヌクレオチドを発現させる、または目的となるポリヌクレオチドによりコードされるポリヌクレオチドの発現を増加もしくは減少させる処理または条件に、細胞、組織、生物などを供することによって、発現が制御される。
誘導性プロモーター/系の例示的な例としては、グルココルチコイドもしくはエストロゲン受容体をコードする遺伝子のプロモーターなどのステロイド誘導性プロモーター(対応するホルモンでの処理によって誘導可能)、メタロチオニン(metallothionine)プロモーター(様々な重金属での処理によって誘導可能)、MX−1プロモーター(インターフェロンによって誘導可能)、「GeneSwitch」ミフェプリストン調節可能な系(Sirin et al.,2003,Gene,323:67)、クミン酸誘導性遺伝子スイッチ(WO2002/088346)、テトラサイクリン依存性調節系などが挙げられるが、これらに限定されない。
条件付き発現は、部位特異的DNAリコンビナーゼを使用することによって達成することもできる。ある特定の実施形態によると、ポリヌクレオチドは、部位特異的リコンビナーゼにより媒介される組換えのための少なくとも1つ(典型的には2つ)の部位(複数可)を含む。本明細書で使用される場合、「リコンビナーゼ」または「部位特異的リコンビナーゼ」という用語は、野生型タンパク質であり得る1つ以上の組換え部位(例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、10またはそれ以上)を伴う組換え反応に関与する、切除性(excisive)もしくは組み込み(integrative)のタンパク質、酵素、補助因子、または関連するタンパク質(Landy,Current Opinion in Biotechnology 3:699−707(1993)を参照されたい)、またはそれらの変異体、誘導体(例えば、組換えタンパク質配列またはその断片を含む融合タンパク質)、断片、およびバリアントを含む。特定の実施形態で使用するのに好適なリコンビナーゼの例示的な例としては、Cre、Int、IHF、Xis、Flp、Fis、Hin、Gin、ΦC31、Cin、Tn3リゾルバーゼ、TndX、XerC、XerD、TnpX、Hjc、Gin、SpCCE1、およびParAが挙げられるが、これらに限定されない。
ポリヌクレオチドは、多様な部位特異的リコンビナーゼのいずれかに対して1つ以上の組換え部位を含み得る。部位特異的リコンビナーゼのための標的部位は、ベクター、例えば、レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターの組み込みに必要とされる任意の部位(複数可)に加えてであることを理解されたい。本明細書で使用される場合、「組換え配列」、「組換え部位」、または「部位特異的組換え部位」という用語は、リコンビナーゼが認識および結合する特定の核酸配列を指す。
例えば、Creリコンビナーゼの組換え部位の1つはloxPであり、これは、8塩基対コア配列に隣接する2つの13塩基対逆方向反復(リコンビナーゼ結合部位として機能する)を含む34塩基対配列である(Sauer,B.,Current Opinion in Biotechnology 5:521−527(1994)の図1を参照されたい)。他の例示的なloxP部位は、lox511(Hoess et al.,1996;Bethke and Sauer,1997)、lox5171(Lee and Saito,1998)、lox2272(Lee and Saito,1998)、m2(Langer et al.,2002)、lox71(Albert et al.,1995)、およびlox66(Albert et al.,1995)を含むが、これらに限定されない。
FLPリコンビナーゼの好適な認識部位としては、FRT(McLeod,et al.,1996)、F1、F2、F3(Schlake and Bode,1994)、F4、F5(Schlake and Bode,1994)、FRT(LE)(Senecoff et al.,1988)、FRT(RE)(Senecoff et al.,1988)が挙げられるが、これらに限定されない。
認識配列の他の例は、リコンビナーゼ酵素λインテグラーゼ、例えば、phi−c31により認識される、attB、attP、attL、およびattR配列である。φC31 SSRは、異型部位attB(長さが34bp)とattP(長さが39bp)との間の組換えのみを媒介する(Groth et al.,2000)。それぞれ、細菌およびファージゲノム上のファージインテグラーゼの結合部位に名前が由来するattBおよびattPは両方とも、φC31ホモ二量体により結合される可能性がある不完全な逆方向反復を含入する(Groth et al.,2000)。産生部位であるattLおよびattRは、φC31媒介組換えを進めるために(Belteki et al.,2003)、効果的に不活性であり、反応を不可逆にする。挿入を触媒するために、attB保有DNAが、attP部位をゲノムattB部位に挿入するよりも容易にゲノムattP部位内に容易に挿入されることが分かった(Thyagarajan et al.,2001;Belteki et al.,2003)。よって、典型的な戦略は、相同組換えにより、attP保有「ドッキング部位」を、定義された座位に位置付け、次に、挿入のためにこれをattB保有入来配列と組み合わせる。
一実施形態において、本明細書において企図されるポリヌクレオチドは、一対のリコンビナーゼ認識部位によって隣接される修復テンプレートポリヌクレオチドを含む。特定の実施形態において、修復テンプレートポリヌクレオチドは、LoxP部位、FRT部位、またはatt部位によって隣接される。
特定の実施形態において、本明細書において企図されるポリヌクレオチドは、1つ以上のポリペプチドをコードする目的となる1つ以上のポリヌクレオチドを含む。特定の実施形態において、複数のポリペプチドの各々の効率的な翻訳を達成するために、ポリヌクレオチド配列は、1つ以上のIRES配列または自己切断型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列によって分離され得る。
本明細書で使用される場合、「内部リボソーム侵入部位」または「IRES」は、シストロン(タンパク質コード領域)のATGなどの開始コドンへの直接的な内部リボソーム侵入を促進し、それによって遺伝子のキャップ非依存性翻訳をもたらすエレメントを指す。例えば、Jackson et al.,1990.Trends Biochem Sci 15(12):477−83)およびJackson and Kaminski.1995.RNA 1(10):985−1000を参照されたい。当業者によって一般に用いられるIRESの例は、米国特許第6,692,736号に記載されるものを含む。当該技術分野で既知の「IRES」のさらなる例としては、ピコルナウイルスから得られるIRES(Jackson et al.,1990)、ならびにウイルスまたは細胞mRNA源から得られるIRES、例えば、免疫グロブリン重鎖結合タンパク質(BiP)、血管内皮成長因子(VEGF)(Huez et al.1998.Mol.Cell.Biol.18(11):6178−6190)、線維芽細胞成長因子2(FGF−2)、およびインスリン様成長因子(IGFII)、翻訳開始因子eIF4G、ならびに酵母転写因子TFIIDおよびHAP4、Novagenから市販されている脳心筋炎ウイルス(encephelomycarditis virus)(EMCV)(Duke et al.,1992.J.Virol 66(3):1602−9)およびVEGF IRES(Huez et al.,1998.Mol Cell Biol 18(11):6178−90)が挙げられるが、これらに限定されない。IRESはまた、Picornaviridae、Dicistroviridae、およびFlaviviridae種のウイルスゲノム、ならびにHCV、Friendマウス白血病ウイルス(FrMLV)、およびMoloneyマウス白血病ウイルス(MoMLV)においても報告されている。
一実施形態において、本明細書において企図されるポリヌクレオチドに使用されるIRESは、EMCV IRESである。
特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、コンセンサスコザック配列を含む。本明細書で使用される場合、「コザック配列」という用語は、リボソームの小さいサブ単位へのmRNAの初期結合を大幅に容易にし、翻訳を増加させる、短いヌクレオチド配列を指す。コンセンサスコザック配列は、(GCC)RCCATGG(配列番号50)であり、式中、Rは、プリン(AまたはG)である(Kozak,1986.Cell.44(2):283−92、およびKozak,1987.Nucleic Acids Res.15(20):8125−48)。
効率的な終止および異種核酸転写物のポリアデニル化を指向するエレメントは、異種遺伝子の発現を増加させる。転写終止シグナルは一般に、ポリアデニル化シグナルの下流に見られる。特定の実施形態において、ベクターは、発現されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのポリアデニル化配列3’を含む。本明細書で使用される場合、「ポリA部位」または「ポリA配列」という用語は、RNAポリメラーゼIIによる新生RNA転写の終止およびポリアデニル化の両方を指向するDNA配列を示す。ポリアデニル化配列は、コード配列の3’端へのポリA尾部の付加により、mRNAの安定性を促進し、よって、転写効率の増加に寄与し得る。ポリA尾部を欠く転写物は不安定であり、迅速に分解されるため、組換え転写物の効率的なポリアデニル化が望ましい。ベクターにおいて使用され得るポリAシグナルの例示的な例としては、理想的なポリA配列(例えば、AATAAA、ATTAAA、AGTAAA)、ウシ成長ホルモンポリA配列(BGHpA)、ウサギβ−グロビンポリA配列(rβgpA)、または当該技術分野で既知の別の好適な異種もしくは内因性ポリA配列が挙げられる。
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを保有する細胞は、直接的な毒性および/または未制御の増殖のリスクを低減させるために、誘導性自殺遺伝子を含む自殺遺伝子を用いる。特定の実施形態において、自殺遺伝子は、ポリヌクレオチドを保有する宿主または細胞に対して免疫原性ではない。使用され得る自殺遺伝子のある特定の例は、カスパーゼ−9もしくはカスパーゼ−8、またはシトシンデアミナーゼである。カスパーゼ−9は、二量体化の特定の化学誘導物資(CID)を使用して活性化され得る。
ある特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、本明細書において企図される遺伝子改変された細胞に、インビボで負の選択を受けやすくさせる遺伝子セグメントを含む。「負の選択」とは、個々のインビボ条件の変化の結果として排除され得る注入された細胞を指す。負の選択可能な表現型は、投与された薬剤、例えば、化合物に対して感受性を付与する遺伝子の挿入により生じ得る。負の選択可能な遺伝子は当該技術分野で既知であり、ガンシクロビル感受性を付与する単純ヘルペスウイルスI型チミジンキナーゼ(HSV−I TK)遺伝子、細胞性ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ(HPRT)遺伝子、細胞性アデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(APRT)遺伝子、および細菌性シトシンデアミナーゼが含まれるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態において、遺伝子改変細胞は、インビトロでの負の選択可能な表現型の細胞の選択を可能にする正のマーカーを更に含むポリヌクレオチドを含む。正の選択可能なマーカーは、宿主細胞に導入されると、その遺伝子を有する細胞の正の選択を可能にする優性表現型を発現する遺伝子であり得る。この種類の遺伝子は当該技術分野で既知であり、ハイグロマイシンBに対する耐性を付与するハイグロマイシンBホスホトランスフェラーゼ遺伝子(hph)、抗生物質G418に対する耐性をコードするTn5からのアミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ遺伝子(neoまたはaph)、ジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)遺伝子、アデノシンデアミナーゼ遺伝子(ADA)、および多剤耐性(MDR)遺伝子が含まれるが、これらに限定されない。
一実施形態において、正の選択可能なマーカーおよび負の選択可能エレメントは、負の選択可能エレメントの損失が正の選択可能なマーカーの損失も必然的に伴うように連結されている。特定の実施形態において、正の選択可能なマーカーおよび負の選択可能なマーカーは、一方の損失が他方の損失に義務的につながるように融合されている。上述される所望の正負両方の選択の特徴を付与するポリペプチドを発現産物としてもたらす融合ポリヌクレオチドの例は、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼチミジンキナーゼ融合遺伝子(HyTK)である。この遺伝子の発現は、インビトロでの正の選択のためのハイグロマイシンB耐性、およびインビボでの負の選択のためのガンシクロビル感受性を付与するポリペプチドをもたらす。優性の正の選択可能なマーカーと負の選択可能なマーカーとの融合に由来する二機能性選択可能な融合遺伝子の使用を説明する、S.D.LuptonによるPCT US91/08442およびPCT/US94/05601の刊行物も参照されたい。
好ましい正の選択可能なマーカーは、hph、nco、およびgptからなる群から選択される遺伝子に由来し、好ましい負の選択可能なマーカーは、シトシンデアミナーゼ、HSV−I TK、VZV TK、HPRT、APRT、およびgptからなる群から選択される遺伝子に由来する。特定の実施形態において企図される例示的な二機能性選択可能融合遺伝子としては、正の選択可能なマーカーは、hphまたはneoに由来し、負の選択可能なマーカーは、シトシンデアミナーゼもしくはTK遺伝子、または選択可能マーカーに由来する。
特定の実施形態において、1つ以上のメガヌクレアーゼ、メガTAL、TALEN、ZFN、Casヌクレアーゼ、末端プロセシングヌクレアーゼ、CAR、治療ポリペプチド、および融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、非ウイルス方法およびウイルス方法の両方によって、免疫エフェクター細胞、例えば、T細胞に導入され得る。特定の実施形態において、ヌクレアーゼをコードする1つ以上のポリヌクレオチドおよび/またはドナー修復テンプレートの送達は、同じ方法もしくは異なる方法によって、および/または同じベクターもしくは異なるベクターによって提供され得る。
「ベクター」という用語は、本明細書において、別の核酸分子を移入または輸送することのできる核酸分子を指すように使用される。移入された核酸は概して、ベクター核酸分子に連結、例えば、挿入される。ベクターは、細胞における自律複製を指向する配列を含んでもよいし、宿主細胞DNAへの組み込みを可能にするのに十分な配列を含んでもよい。特定の実施形態において、非ウイルスベクターは、本明細書において企図される1つ以上のポリヌクレオチドをT細胞に送達するために使用される。
非ウイルスベクターの例示的な例としては、プラスミド(例えば、DNAプラスミドまたはRNAプラスミド)、トランスポゾン、コスミド、細菌人工染色体、およびウイルスベクターが挙げられるが、これらに限定されない。
特定の実施形態において企図されるポリヌクレオチドの非ウイルス送達の例示的な方法としては、電気穿孔、ソノポレーション、リポフェクション、マイクロインジェクション、微粒子銃、ビロソーム、リポソーム、免疫リポソーム、ナノ粒子、ポリカチオン、または脂質:核酸抱合体、裸DNA、人工ビリオン、DEAEデキストラン介在転移、遺伝子銃、および熱ショックが挙げられるが、これらに限定されない。
特定の実施形態において企図される特定の実施形態で用いるのに好適なポリヌクレオチド送達システムの例示的な例としては、Amaxa Biosystems、Maxcyte,Inc.、BTX Molecular Delivery Systems、およびCopernicus Therapeutics Inc.によって提供されるものが挙げられるが、これらに限定されない。リポフェクション試薬は、市販されている(例えば、Transfectam(商標)およびLipofectin(商標))。ポリヌクレオチドの効率的な受容体認識のために好適なカチオン性および中性脂質は、文献に記載されている。例えば、Liu et al.(2003)Gene Therapy.10:180−187、およびBalazs et al.(2011)Journal of Drug Delivery.2011:1−12を参照されたい。抗体標的バクテリア由来の生命体ではない(non−living)ナノ細胞ベースの送達もまた、特定の実施形態において企図される。
特定の実施形態において企図されるポリヌクレオチドを含むウイルスベクターは、個々の患者に、典型的には、以下に記載されるように、全身投与(例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、もしくは頭蓋内注入)または局所適用による投与によってインビボで送達され得る。あるいは、ベクターは、個々の患者から外植される細胞(例えば、動員末梢血、リンパ球、骨髄穿刺液、組織生検など)または万能ドナー造血幹細胞などのエクスビボで細胞に送達され、続いて、細胞の患者に再移植され得る。
一実施形態において、操作されたヌクレアーゼおよび/またはドナー修復テンプレートを含むウイルスベクターは、インビボで細胞の形質導入のために生物に直接投与される。あるいは、裸DNAが、投与され得る。投与は、注射、注入、局所適用、および電気穿孔が挙げられるが、これらに限定されない、血液または組織細胞との最終接触に分子を導入するために通常使用される経路のうちのいずれかによるものである。かかる核酸を投与する好適な方法が利用可能であり、当業者に周知であり、1つを超える経路が、特定の組成物を投与するために使用することができるが、特定の経路は、多くの場合、別の経路よりもより即時かつより効果的な反応を提供することができる。
特定の実施形態において企図される特定の実施形態で用いるのに好適なウイルスベクターシステムの例示的な例としては、アデノ随伴ウイルス(AAV)、レトロウイルス、単純ヘルペス、アデノウイルス、遺伝子導入のためのワクシニアウイルスベクターが挙げられるが、これらに限定されない。
様々な実施形態において、操作されたヌクレアーゼをコードする1つ以上のポリヌクレオチドおよび/またはドナー修復テンプレートは、1つ以上のポリヌクレオチドを含む、組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)で細胞を形質導入ことによって、免疫エフェクター細胞、例えば、T細胞に導入される。
AAVは、主なエピソームである小規模(約26nm)の複製欠損である。非エンベロープウイルス。AAVは、***細胞および非***細胞の両方を感染させることができ、そのゲノムを宿主細胞のゲノムに組み込み得る。組換えAAV(rAAV)は、典型的には、最小で、トランス遺伝子およびその調節配列、ならびに5´および3´AAV逆方向末端反復(ITR)からなる。ITR配列は、約145bpの長さである。特定の実施形態において、rAAVは、ITR、およびAAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、またはAAV10から単離されるカプシド配列を含む。
いくつかの実施形態において、ITR配列が、1つのAAV血清型から単離され、カプシド配列が、異なるAAV血清型から単離される、キメラrAAVが使用される。例えば、AAV2に由来するITR配列およびAAV6に由来するカプシド配列を有するrAAVは、AAV2/AAV6と称される。特定の実施形態において、rAAVベクターは、AAV2からのITR、およびAAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、またはAAV10のうちのいずれか1つからのカプシドタンパク質を含み得る。好ましい実施形態において、rAAVは、AAV2に由来するITR配列と、AAV6に由来するカプシド配列とを含む。
いくつかの実施形態において、操作および選択方法は、目的となる細胞を形質導入する可能性が高いAAVカプシドに適用され得る。
rAAVベクターの構築、その生成、および精製は、例えば、米国特許第9,169,494号、同第9,169,492号、同第9,012,224号、同第8,889,641号、同第8,809,058号、および同第8,784,799号に開示されており、これらのそれぞれは、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
様々な実施形態において、CAR、操作されたヌクレアーゼをコードする1つ以上のポリヌクレオチド、またはドナー修復テンプレートは、細胞を、レトロウイルス、例えば、1つ以上のポリヌクレオチドを含むレンチウイルスで形質導入することによって、免疫エフェクター細胞、例えば、T細胞に導入される。
本明細書で使用される場合、「レトロウイルス」という用語は、そのゲノムRNAを直鎖状二本鎖DNAのコピーに逆転写し、その後そのゲノムDNAを宿主ゲノムに共有結合的に組み込むRNAウイルスを指す。特定の実施形態において使用するのに好適な例示的なレトロウイルスとしては、モロニーマウス白血病ウイルス(M−MuLV)、モロニーマウス肉腫ウイルス(MoMSV)、ハーベイマウス肉腫ウイルス(HaMuSV)、マウス乳癌ウイルス(MuMTV)、テナガザル白血病ウイルス(GaLV)、ネコ白血病ウイルス(FLV)、スプーマウイルス、フレンドマウス白血病ウイルス、マウス幹細胞ウイルス(MSCV)、およびラウス肉腫ウイルス(RSV))、ならびにレンチウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「レンチウイルス」という用語は、複合レトロウイルスの群(または族)を指す。例示的なレンチウイルスとしては、HIV(ヒト免疫不全ウイルス;HIV1型およびHIV2型を含む)、ビスナ・マエディウイルス(VMV)ウイルス、ヤギ関節炎脳炎ウイルス(CAEV)、ウマ感染性貧血ウイルス(EIAV)、ネコ免疫不全ウイルス(FIV)、ウシ免疫不全ウイルス(BIV)、ならびにサル免疫不全ウイルス(SIV)が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態において、HIVベースのベクター骨格(すなわち、HIVシス作動性配列要素)が好ましい。
様々な実施形態において、本明細書において企図されるレンチウイルスベクターは、1つ以上のLTR、ならびにアクセサリーエレメント:cPPT/FLAP、プサイ(Ψ)パッケージングシグナル、輸出エレメント、ポリ(A)配列のうちの1つ以上または全てを含み、任意に、本明細書において他の箇所に論じられるように、WPREまたはHPRE、絶縁体エレメント、選択可能なメーカー、および細胞自殺遺伝子を含み得る。
特定の実施形態において、本明細書において企図されるレンチウイルスベクターは、組み込みまたは非組み込みまたは組み込み欠損レンチウイルスであり得る。本明細書で使用される場合、「組み込み欠損レンチウイルス」という用語は、ウイルスゲノムを宿主細胞のゲノム内に組み込む能力を欠くインテグラーゼを有するレンチウイルスを指す。組み込み能力のないウイルスベクターは、特許出願WO2006/010834に記載されており、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
インテグラーゼ活性を減少させるのに好適なHIV−1遺伝子における例示的な変異としては、H12N、H12C、H16C、H16V、S81R、D41A、K42A、H51A、Q53C、D55V、D64E、D64V、E69A、K71A、E85A、E87A、D116N、D1161、D116A、N120G、N1201、N120E、E152G、E152A、D35E、K156E、K156A、E157A、K159E、K159A、K160A、R166A、D167A、E170A、H171A、K173A、K186Q、K186T、K188T、E198A、R199c、R199T、R199A、D202A、K211A、Q214L、Q216L、Q221L、W235F、W235E、K236S、K236A、K246A、G247W、D253A、R262A、R263A、およびK264Hが挙げられるが、これらに限定されない。
「長い末端反復(LTR)」という用語は、それらの天然の配列関係において、直接反復であり、U3、R、およびU5領域を含有するレトロウイルスDNAの末端に位置する塩基対のドメインを指す。
本明細書で使用される場合、「FLAPエレメント」または「cPPT/FLAP」という用語は、レトロウイルス、例えばHIV−1またはHIV−2のセントラルポリプリントラクトおよび中央終止配列(cPPTおよびCTS)が配列に含まれる核酸を指す。好適なFLAPエレメントは、米国特許第6,682,907号およびZennou,et al.,2000,Cell,101:173に記載されている。
本明細書で使用される場合、「パッケージングシグナル」または「パッケージング配列」という用語は、ウイルスRNAをウイルスカプシドまたは粒子内に挿入するために必要なレトロウイルスゲノム内に位置するプサイ(Ψ)配列を指し、例えば、Clever et al.,1995.J.of Virology,Vol.69,No.4;pp.2101−2109を参照されたい。
「輸出エレメント」という用語は、細胞の核から細胞質へのRNA転写物の輸送を調節するシス作用性転写後調節エレメントを指す。RNA輸出エレメントの例としては、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)rev応答エレメント(RRE)(例えば、Cullen et al.,1991.J.Virol.65:1053、およびCullen et al.,1991.Cell 58:423を参照されたい)、およびB型肝炎ウイルス転写後調節エレメント(HPRE)が挙げられるが、これらに限定されない。
特定の実施形態において、ウイルスベクターにおける異種配列の発現は、転写後調節エレメント、効率的なポリアデニル化部位、および任意に、転写終止シグナルをベクター内に組み込むことにより増加する。例えば、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント(WPRE;Zufferey et al.,1999,J.Virol.,73:2886)、B型肝炎ウイルスに存在する転写後調節エレメント(HPRE)(Huang et al.,Mol.Cell.Biol.,5:3864)、および同類のもの(Liu et al.,1995,Genes Dev.,9:1766)など、種々の転写後調節エレメントが、タンパク質における異種核酸の発現を増加させることができる。
レンチウイルスベクターは、好ましくは、LTRを改変する結果としていくつかの安全性の強化をもたらす。「自己不活性化型」(SIN)ベクターとは、U3領域として知られている右(3´)LTRエンハンサープロモーター領域が1回目のウイルス複製以降のウイルス転写を防止するように(例えば欠失または置換によって)改変されている、複製欠損ベクターを指す。5´LTRのU3領域を異種プロモーターに置き換えてウイルス粒子の産生中のウイルスゲノムの転写を推進することによって、さらなる安全性の強化がもたらされる。使用され得る異種プロモーターの例としては、例えば、ウイルス性サルウイルス40(SV40)(例えば、初期または後期)、サイトメガロウイルス(CMV)(例えば、最初期)、モロニーマウス白血病ウイルス(MoMLV)、ラウス肉腫ウイルス(RSV)、および単純ヘルペスウイルス(HSV)(チミジンキナーゼ)プロモーターが挙げられる。
本明細書で使用される「シュードタイプ」または「シュードタイピング」という用語は、ウイルスエンベロープタンパク質が好ましい特性を保有する別のウイルスのもので置換されたウイルスを指す。例えば、HIVは、HIVエンベロープタンパク質(env遺伝子によってコードされる)が通常ウイルスをCD4+提示細胞に標的指向するため、HIVがより広範囲の細胞を感染させることを可能にする、水疱性口内炎ウイルスGタンパク質(VSV−G)エンベロープタンパク質でシュードタイピングされ得る。
ある特定の実施形態において、レンチウイルスベクターは、既知の方法に従って生成される。例えば、Kutner et al.,BMC Biotechnol.2009;9:10.doi:10.1186/1472−6750−9−10、Kutner et al.Nat.Protoc.2009;4(4):495−505.doi:10.1038/nprot.2009.22を参照されたい。
本明細書において企図されるある特定の具体的な実施形態によると、ウイルスベクター骨格配列の大部分または全てが、レンチウイルス、例えばHIV−1に由来する。しかしながら、レトロウイルスおよび/もしくはレンチウイルス配列の多くの異なる供給源を使用することまたは組み合わせることができ、ある特定のレンチウイルス配列における多くの置換および変更が、移入ベクターが本明細書に記載される機能を行う能力を損なうことなく適用され得ることを理解されたい。さらに、種々のレンチウイルスベクターが当該技術分野で既知であり、Naldini et al.,(1996a、1996b、および1998)、Zufferey et al.,(1997)、Dull et al.,1998、米国特許第6,013,516号および同第5,994,136号を参照されたく、それらの多くが、本明細書において企図されるウイルスベクターまたは移入プラスミドを産生するように適合され得る。
様々な実施形態において、CAR、操作されたヌクレアーゼをコードする1つ以上のポリヌクレオチド、またはドナー修復テンプレートは、免疫エフェクター細胞を、1つ以上のポリヌクレオチドを含むアデノウイルスで形質導入することによって、免疫エフェクター細胞に導入される。
アデノウイルス系ベクターは、多くの細胞型において非常に高い形質導入効率が可能であり、細胞***を必要としない。このようなベクターを用いて、高力価および高レベルの発現が得られている。このベクターは、相対的に簡単な系で大量に産生され得る。ほとんどのアデノウイルスベクターは、トランス遺伝子を、Ad E1a、E1b、および/またはE3遺伝子に置き換え、その後、複製欠損ベクターが、トランスで欠失遺伝子機能を供給するヒト293細胞中で増殖されるように、操作される。Adベクターは、非***中の分化細胞、例えば肝臓、腎臓、および筋肉中に見出されるものを含む多数の型の組織をインビボで形質導入し得る。従来のAdベクターは、大きな輸送能力を有する。
複製欠損である現行のアデノウイルスベクターの生成および伝播は、Ad5 DNA断片によってヒト胎児腎臓細胞から形質転換された293と指定された特有のヘルパー細胞株を利用し得、E1タンパク質を構造的に発現する(Graham et al.,1977)。E3領域がアデノウイルスゲノムに不必要である(Jones & Shenk,1978)ため、293細胞の支援を受ける現行のアデノウイルスベクターは、E1領域、D3領域のいずれか、または両方の領域に外来DNAを保持する(Graham & Prevec,1991)。アデノウイルスベクターは、真核生物遺伝子の発現(Levrero et al.,1991、Gomez−Foix et al.,1992)およびワクチン開発(Grunhaus & Horwitz,1992、Graham & Prevec,1992)で使用されている。組み換えアデノウイルスを異なる組織に投与する研究には、気管点滴注入(Rosenfeld et al.,1991、Rosenfeld et al.,1992)、筋肉注射(Ragot et al.,1993)、末梢静脈内注射(Herz & Gerard,1993)、および脳への定位接種(stereotactic inoculation)(Le Gal La Salle et al.,1993)が含まれる。臨床試験中のAdベクターの使用の一例は、筋肉内注射による抗腫瘍免疫化に対するポリヌクレオチド療法を含んだ(Sterman et al.,Hum.Gene Ther.7:1083−9(1998))。
様々な実施形態において、CAR、操作されたヌクレアーゼをコードする1つ以上のポリヌクレオチド、またはドナー修復テンプレートは、免疫エフェクター細胞を、1つ以上のポリヌクレオチドを含む単純ヘルペス、例えば、HSV−1、HSV−2で形質導入することによって、免疫エフェクター細胞に導入される。
成熟HSVビリオンは、152kbである直鎖二本鎖DNA分子からなるウイルスゲノムを有する包まれた二十面体カプシドからなる。一実施形態において、HSV系ウイルスベクターは、1つ以上の必須または非必須HSV遺伝子に欠けている。一実施形態において、HSV系ウイルスベクターは、複製欠損である。最も複製欠損であるHSVベクターは、複製を妨げるために、1つ以上の最初期、初期、または後期HSV遺伝子を除去するための欠失を含む。例えば、HSVベクターは、ICP4、ICP22、ICP27、ICP47、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される最初期遺伝子を欠損し得る。HSVベクターの利点は、長期のDNA発現、および25kbまでの外因性DNAインサートを収容するその大型ウイルスDNAゲノムをもたらすことができる、潜伏段階へ入る能力である。HSV系ベクターは、例えば、米国特許第5,837,532号、同第5,846,782号、および同第5,804,413号、ならびに国際特許出願WO91/02788、WO96/04394、WO98/15637、およびWO99/06583に記載されており、これらのそれぞれは、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
H.組成物および製剤
特定の実施形態において企図される組成物は、本明細書において企図されるように、1つ以上のポリペプチド、ポリヌクレオチド、それらを含むベクター、および免疫エフェクター細胞組成物を含み得る。組成物は、薬学的組成物を含むが、これに限定されない。「薬学的組成物」は、単独で、または1つ以上の他の治療様式と組み合わせてのいずれかで、細胞または動物に投与するための、薬学的に許容される、または生理学的に許容される溶液に製剤化された組成物を指す。また、所望される場合、組成物が、例えばサイトカイン、成長因子、ホルモン、小分子、化学療法薬、プロドラッグ、薬物、抗体、または他の様々な薬学的活性剤といった他の薬剤と組み合わせて投与されてもよいことは理解されよう。本組成物に同様に含まれ得る他の構成成分に実質的に制限はないが、但し、追加の薬剤が、本組成物が意図される療法を送達する能力に悪影響を及ぼさないものとする。
特定の実施形態において企図される組成物は、本明細書において企図されるように、1つ以上のポリペプチド、ポリヌクレオチド、それらを含むベクター、および免疫エフェクター細胞組成物を含み得る。組成物は、薬学的組成物を含むが、これに限定されない。「薬学的組成物」は、単独で、または1つ以上の他の治療様式と組み合わせてのいずれかで、細胞または動物に投与するための、薬学的に許容される、または生理学的に許容される溶液に製剤化された組成物を指す。また、所望される場合、組成物が、例えばサイトカイン、成長因子、ホルモン、小分子、化学療法薬、プロドラッグ、薬物、抗体、または他の様々な薬学的活性剤といった他の薬剤と組み合わせて投与されてもよいことは理解されよう。本組成物に同様に含まれ得る他の構成成分に実質的に制限はないが、但し、追加の薬剤が、本組成物が意図される療法を送達する能力に悪影響を及ぼさないものとする。
「薬学的に許容される」という表現は、本明細書において、健全な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激作用、アレルギー反応、または他の問題もしくは合併症を伴わずにヒトおよび動物の組織と接触させて使用するのに好適な、妥当な利益/リスク比に見合った化合物、材料、組成物、および/または剤形を指すために用いられる。
本明細書で使用される「薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤」としては、ヒトまたは飼育動物に使用するのに許容可能なものとして米国食品医薬品局によって承認されている任意のアジュバント、担体、賦形剤、滑剤、甘味剤、希釈剤、防腐剤、染料/着色剤、風味増強剤、界面活性剤、湿潤剤、分散剤、懸濁化剤、安定剤、等張剤、溶媒、界面活性剤、または乳化剤が挙げられるが、これらに限定されない。例示的な薬学的に許容される担体としては、ラクトース、グルコース、およびスクロースなどの糖類;コーンスターチおよびジャガイモデンプンなどのデンプン類;カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、および酢酸セルロースなどのセルロースおよびその誘導体;トラガカント;モルト;ゼラチン;タルク;ココアバター、ワックス、動物脂および植物脂、パラフィン、シリコーン、ベントナイト、ケイ酸、酸化亜鉛;落花生油、綿実油、紅花油、胡麻油、オリーブ油、コーン油、および大豆油などの油類;プロピレングリコールなどのグリコール;グリセリン、ソルビトール、マンニトール、およびポリエチレングリコールなどのポリオール類;オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチルなどのエステル;寒天;水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムなどの緩衝剤;アルギン酸;発熱性物質除去水;等張食塩水;リンゲル溶液;エチルアルコール;リン酸緩衝溶液、ならびに薬学的製剤において採用される任意の他の適合性物質が挙げられるが、これらに限定されない。
特定の実施形態において、組成物は、本明細書において企図される方法によって製造される、ある量のゲノム編集されたCAR T細胞を含む。好ましい実施形態において、薬学的組成物は、1つ以上の改変されたおよび/または非機能性TCRα対立遺伝子を含み、1つ以上のCARを発現する、CAR T細胞を含む。
特定の実施形態において企図される方法によって製造されるCAR T細胞を含む薬学的組成物が、約102〜約1010個の細胞/kg体重、約105〜約109個の細胞/kg体重、約105〜約108個の細胞/kg体重、約105〜約107個の細胞/kg体重、約107〜約109個の細胞/kg体重、または約107〜約108個の細胞/kg体重の投与量(これらの範囲内の全ての整数値を含む)で投与され得ると概説することができる。細胞数は、その中に含まれる細胞の型のように、組成物が意図される最終用途に依存する。本明細書に提供される使用において、細胞は一般に、1リットル以下の容量であり、500mL以下、更には250mLまたは100mL以下であり得る。したがって、所望の細胞の密度は、典型的には、約106個の細胞/mL超であり、概して約107個の細胞/mL超、概して約108個の細胞/mL以上である。臨床的に関連する免疫細胞数は、累積的に約105、106、107、108、109、1010、1011、または1012個の細胞と等しいかまたはそれを超える複数回の注入に分配され得る。
いくつかの実施形態において、特に、注入された細胞の全てが特定の標的抗原に再指向されるため、106/キログラム(患者当たり106−1011)の範囲内の低い細胞数が投与され得る。CARを発現するように改変されたT細胞は、これらの範囲内の投薬量で複数回投与され得る。細胞は、療法を受ける患者に対して同種、同系、異種、または自家であり得る。所望される場合、治療は、免疫応答の誘導を増強するために、注入されたT細胞の生着および機能を増強するために、本明細書に記載されるマイトジェン(例えばPHA)またはリンホカイン、サイトカイン、および/もしくはケモカイン(例えば、IFN−γ、IL−2、IL−7、IL−15、IL−12、TNF−アルファ、IL−18、およびTNF−ベータ、GM−CSF、IL−4、IL−13、Flt3−L、RANTES、MIP1αなど)の投与を含んでもよい。
概して、本明細書に記載されるように活性化および増幅された細胞を含む組成物は、免疫不全の個体において生じる疾患の治療および防止に用いられ得る。具体的には、本明細書において企図される方法によって製造される改変されたT細胞を含む組成物は、がんの治療に使用される。特定の実施形態において企図されるゲノム編集されたCAR T細胞は、単独で、あるいは担体、希釈剤、賦形剤、および/またはIL−2、IL−7、および/もしくはIL−15、または他のサイトカインもしくは細胞集団などの他の構成成分と組み合わせて薬学的組成物としてのいずれかで投与され得る。特定の実施形態において、本明細書において企図される薬学的組成物は、1つ以上の薬学的または生理学的に許容される担体、希釈剤、もしくは賦形剤と組み合わせた、ある量の1つ以上の改変されたTCRα対立遺伝子を含むCAR T細胞を含む。
特定の実施形態において企図されるゲノム編集されたCAR T細胞を含む薬学的組成物は、中性緩衝食塩水、リン酸緩衝食塩水などの緩衝液;グルコース、マンノース、スクロース、またはデキストラン、マンニトールなどの炭水化物;タンパク質;ポリペプチドまたはグリシンなどのアミノ酸;抗酸化剤;EDTAまたはグルタチオンなどのキレート剤;アジュバント(例えば、水酸化アルミニウム);および防腐剤を更に含み得る。特定の実施形態において企図される組成物は、好ましくは、非経口投与、例えば、血管内(静脈内または動脈内)、腹腔内、または筋肉内投与用に製剤化される。
液体薬学的組成物は、それらが溶液であるか、懸濁液であるか、または他の同様の形態であるかにかかわらず、注射用水、食塩水溶液、好ましくは生理食塩水、リンゲル液、等張食塩水などの無菌希釈剤、溶媒もしくは懸濁媒として機能し得る合成モノグリセリドもしくはジグリセリドなどの固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、または他の溶媒;ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗菌剤;アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤;エチレンジアミン四酢酸などのキレート剤;アセテート、シトレート、またはホスフェートなどの緩衝液、および塩化ナトリウムまたはデキストロースなどの等張性を調整するための薬剤のうちの1つ以上を含み得る。非経口調製物は、アンプル、使い捨てシリンジ、またはガラスもしくはプラスチックで作製された多用量バイアルに封入され得る。注射可能な薬学的組成物は、好ましくは減菌である。
一実施形態において、ゲノム編集されたCAR T細胞組成物は、薬学的に許容される細胞培養培地において製剤化される。そのような組成物は、ヒト対象への投与に好適である。特定の実施形態において、薬学的に許容される細胞培養培地は、血清不含培地である。
血清不含培地は、簡素かつより明確に定義された組成、低い程度の混入物、感染因子源の可能性の排除、およびコストの低下を含め、血清含有培地に比べていくつかの利点を有する。様々な実施形態において、血清不含培地は動物質不含であり、任意選択によりタンパク質不含であってもよい。任意選択により、培地は生物薬剤学的に許容される組換えタンパク質を含んでもよい。「動物質不含」培地とは、成分が非動物源に由来する培地を指す。動物質不含培地では、組換えタンパク質が天然の動物タンパク質に取って代わり、栄養素は合成源、植物源、または微生物源から得られる。対照的に、「タンパク質不含」培地は、タンパク質を実質的に含まないものと定義される。
特定の組成物に使用される血清不含培地の例証となる例としては、QBSF−60(Quality Biological,Inc.)、StemPro−34(Life Technologies)、およびX−VIVO10が挙げられるが、これらに限定されない。
好ましい一実施形態において、本明細書において企図されるゲノム編集されたCAR T細胞を含む組成物は、PlasmaLyte Aを含む溶液において製剤化される。
別の好ましい実施形態において、本明細書において企図されるゲノム編集されたCAR T細胞を含む組成物は、凍結保存培地を含む溶液において製剤化される。例えば、凍結保存剤を含む凍結保存培地を使用して、解凍後の高い細胞生存成績を維持することができる。特定の組成物に使用される凍結保存培地の例示的な例としては、CryoStor CS10、CryoStor CS5、およびCryoStor CS2が挙げられるが、これらに限定されない。
より好ましい実施形態において、本明細書において企図されるゲノム編集されたCAR T細胞を含む組成物は、PlasmaLyte A対CryoStor CS10を50:50で含む溶液において製剤化される。
特定の実施形態において、本明細書において企図される組成物は、単独で、または1つ以上の治療薬と組み合わせて、有効量の増幅されたゲノム編集されたCAR T細胞組成物を含む。したがって、CAR T細胞組成物は、単独で投与されても、または他の公知のがん治療、例えば放射線療法、化学療法、移植、免疫療法、ホルモン療法、光線力学的療法などと組み合わせて投与されてもよい。本組成物は、抗生物質と組み合わせても投与され得る。このような治療薬は、特定の癌など、本明細書に記載される特定の疾患状態の標準的な治療として、当該技術分野において認められていてよい。特定の実施形態において企図される例示的な治療剤としては、サイトカイン、成長因子、ステロイド、NSAID、DMARD、抗炎症薬、化学療法薬、放射線療法薬、治療用抗体、または他の活性剤および補助剤が挙げられる。
ある特定の実施形態において、本明細書において企図されるCAR T細胞を含む組成物は、任意の数の化学療法剤と併せて投与されてもよい。化学療法剤の例示的な例としては、チオテパおよびシクロホスファミド(CYTOXAN(商標))などのアルキル化剤;ブスルファン、インプロスルファン、およびピポスルファンなどのスルホン酸アルキル;ベンゾドパ、カルボコン、メツレドパ、およびウレドパなどのアジリジン;アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド、およびトリメチローロメラミンを含むエチレンイミンならびにメチルアメラミン;クロラムブシル、クロルナファジン、クロロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩、メルファラン、ノベンビチン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロフォスファミド、ウラシルマスタードなどのナイトロジェンマスタード;カルムスチン、クロロゾトシン、ホテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチンなどのニトロソウレア;アクラシロマイシン、アクチノマイシン、オースラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カリケアマイシン、カラビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、6−ジアゾ−5−オキソ−L−ノルロイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、ピューロマイシン、クエラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシンなどの抗生物質;メトトレキサートおよび5−フルオロウラシル(5−FU)などの代謝拮抗剤;デノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサートなどの葉酸類似体;フルダラビン、6−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンなどのプリン類似体;アンシタビン、アザシチジン、6−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジン、5−FUなどのピリミジン類似体;カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトンなどのアンドロゲン;アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンなどの抗副腎剤;フロリン酸などの葉酸補充剤;アセグラトン;アルドホスファミドグリコシド;アミノレブリン酸;アムサクリン;ベストラブシル;ビサントレン;エダトラキサート;デホファミン;デメコルシン;ジアジコン;エフォルミチン;酢酸エリプチニウム;エトグルシド;硝酸ガリウム;ヒドロキシウレア;レンチナン;ロニダミン;ミトグアゾン;ミトキサントロン;モピダモール;ニトラクリン;ペントスタチン;フェナメット;ピラルビシン;ポドフィリン酸;2−エチルヒドラジド;プロカルバジン;PSK(登録商標);ラゾキサン;シゾフィラン;スピロゲルマニウム;テヌアゾン酸;トリアジコン;2,2’,2’’−トリクロロトリエチルアミン;ウレタン;ビンデシン;ダカルバジン;マンノムスチン;ミトブロニトール;ミトラクトール;ピポブロマン;ガシトシン;アラビノシド(「Ara−C」);シクロホスファミド;チオテパ;タキソイド、例えば、パクリタキセル(TAXOL(登録商標))およびドセタキセル(TAXOTERE(登録商標));クロランブシル;ゲムシタビン;6−チオグアニン;メルカプトプリン;メトトレキサート;シスプラチンおよびカルボプラチンなどの白金類似体;ビンブラスチン;白金;エトポシド(VP−16);イホスファミド;マイトマイシンC;ミトキサントロン;ビンクリスチン;ビノレルビン;ナベルビン;ノバントロン;テニポシド;ダウノマイシン;アミノプテリン;ゼローダ;イバンドロナート;CPT−11;トポイソメラーゼ阻害剤RFS2000;ジフルオロメチルオミチン(DMFO);Targretin(商標)(ベキサロテン)、Panretin(商標)(アリトレチノイン)などのレチノイン酸誘導体;ONTAK(商標)(デニロイキンジフチトクス);エスペラミシン;カペシタビン;ならびに上記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸、または誘導体が挙げられる。この定義には、腫瘍に対するホルモン作用を調節または阻害するように作用する抗ホルモン剤、例えばタモキシフェン、ラロキシフェン、アロマターゼ阻害4(5)−イミダゾール、4−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、LY117018、オナプリストン、およびトレミフェン(Fareston)を含む抗エストロゲン薬など;ならびにフルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、リュープロリド、およびゴセレリンなどの抗アンドロゲン薬;ならびに上記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸、または誘導体も含まれる。
種々の他の治療剤が、本明細書において企図される組成物と併せて使用され得る。一実施形態において、CAR T細胞を含む組成物は、抗炎症剤と共に投与される。抗炎症剤または薬物は、ステロイドおよびグルココルチコイド(ベタメタゾン、ブデソニド、デキサメタゾン、酢酸ヒドロコルチゾン、ヒドロコルチゾン、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾロン、プレドニゾン、トリアムシノロンを含む)、非ステロイド系抗炎症剤(NSAIDS)(アスピリン、イブプロフェン、ナプロキセン、メトトレキサート、スルファサラジン、レフルノミド、抗TNF薬物、シクロホスファミド、およびミコフェノレートを含む)を含むが、これらに限定されない。
他の例示的なNSAIDは、イブプロフェン、ナプロキセン、ナプロキセンナトリウム、VIOXX(登録商標)(ロフェコキシブ)およびCELEBREX(登録商標)(セレコキシブ)などのCox−2阻害剤、ならびにシアリレート(sialylate)からなる群から選択される。例示的な鎮痛薬は、アセトアミノフェン、オキシコドン、プロポルキシフェン(proporxyphene)塩酸塩のトラマドールからなる群から選択される。例示的なグルココルチコイドは、コルチゾン、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾロン、またはプレドニゾンからなる群から選択される。例示的な生体応答修飾物質としては、細胞表面マーカー(例えば、CD4、CD5など)に対して指向される分子、TNF拮抗薬(例えば、エタネルセプト(ENBREL(登録商標))、アダリムマブ(HUMIRA(登録商標))、およびインフリキシマブ(REMICADE(登録商標))などのサイトカイン阻害剤、ケモカイン阻害剤、ならびに接着分子阻害剤が挙げられる。生物学的応答修飾物質は、モノクローナル抗体ならびに分子の組換え形態を含む。例示的なDMARDとしては、アザチオプリン、シクロホスファミド、シクロスポリン、メトトレキサート、ペニシリラミン、レフルノミド、スルファサラジン、ヒドロキシクロロキン、金(経口(オーラノフィン)および筋肉内)、およびミノサイクリンが挙げられる。
特定の実施形態において企図されるゲノム編集されたT細胞との組み合わせに好適な治療用抗体の例示的な例としては、アバゴボマブ、アデカツムマブ、アフツズマブ、アレムツズマブ、アルツモマブ、アマツキシマブ、アナツモマブ、アルシツモマブ、バビツキシマブ、ベクツモマブ、ベバシズマブ、ビバツズマブ、ブリナツモマブ、ブレンツキシマブ、カンツズマブ、カツマキソマブ、セツキシマブ、シタツズマブ、シクスツムマブ、クリバツズマブ、コナツムマブ、ダラツムマブ、ドロジツマブ、デュリゴツマブ、デュシジツマブ、デツモマブ、ダセツズマブ、ダロツズマブ、エクロメキシマブ、エロツズマブ、エンシツキシマブ、エルツマキソマブ、エタラシズマブ、ファリエツズマブ、フィクラツズマブ、フィギツムマブ、フランボツマブ、フツキシマブ、ガニツマブ、ゲムツズマブ、ギレンツキシマブ、グレムバツムマブ、イブリツモマブ、イゴボマブ、イムガツズマブ、インダツキシマブ、イノツズマブ、インテツムマブ、イピリムマブ、イラツムマブ、ラベツズマブ、レクサツムマブ、リンツズマブ、ロルボツズマブ、ルカツムマブ、マパツムマブ、マツズマブ、ミラツズマブ、ミンレツモマブ、ミツモマブ、モキセツモマブ、ナルナツマブ、ナプツモマブ、ネシツムマブ、ニモツズマブ、ノフェツモマブ、オカラツズマブ、オファツムマブ、オララツマブ、オナルツズマブ、オポルツズマブ、オレゴボマブ、パニツムマブ、パルサツズマブ、パトリツマブ、ペムツモマブ、ペルツズマブ、ピンツモマブ、プリツムマブ、ラコツモマブ、ラドレツマブ、リロツムマブ、リツキシマブ、ロバツムマブ、サツモマブ、シブロツズマブ、シルツキシマブ、シムツズマブ、ソリトマブ、タカツズマブ、タプリツモマブ、テナツモマブ、テプロツムマブ、ティガツズマブ、トシツモマブ、トラスツズマブ、ツコツズマブ、ウブリツキシマブ、ベルツズマブ、ボルセツズマブ、ボツムマブ、ザルツムマブ、、CC49、および3E8が挙げられるが、これらに限定されない。
ある特定の実施形態において、本明細書において企図される組成物は、サイトカインと併せて投与される。本明細書で使用される場合、「サイトカイン」とは、細胞間の介在物質として別の細胞に作用する1つの細胞集団によって放出されるタンパク質の一般的な用語を意味する。そのようなサイトカインの例は、リンホカイン、モノカイン、ケモカイン、および従来のポリペプチドホルモンである。サイトカインの中には、ヒト成長ホルモン、N−メチオニルヒト成長ホルモン、およびウシ成長ホルモンなどの成長ホルモン;副甲状腺ホルモン;チロキシン;インスリン;プロインスリン;リラキシン;プロリラキシン;卵胞刺激ホルモン(FSH)、甲状腺刺激ホルモン(TSH)、および黄体ホルモン(LH)などの糖タンパク質ホルモン;肝臓成長因子;線維芽細胞成長因子;プロラクチン;胎盤性ラクトゲン;腫瘍壊死因子−アルファおよび−ベータ;ミュラー管抑制物質;マウスゴナドトロピン関連ペプチド;インヒビン;アクチビン;血管内皮成長因子;インテグリン;トロンボポエチン(TPO);NGF−ベータなどの神経成長因子;血小板成長因子;TGF−アルファおよびTGF−ベータなどの形質転換成長因子(TGF);インスリン様成長因子IおよびII;エリスロポエチン(EPO);骨誘導因子;インターフェロン−アルファ、ベータ、および−ガンマなどのインターフェロン;マクロファージ−CSF(M−CSF)などのコロニー刺激因子(CSF);顆粒球−マクロファージ−CSF(GM−CSF);ならびに顆粒球−CSF(G−CSF);IL−1、IL−1アルファ、IL−2、IL−3、IL−4、IL−5、IL−6、IL−7、IL−8、IL−9、IL−10、IL−11、IL−12、IL−15などのインターロイキン(IL)、TNF−アルファまたはTNF−ベータなどの腫瘍壊死因子;ならびにLIFおよびキットリガンド(KL)を含む他のポリペプチド因子が含まれる。本明細書で使用される場合、サイトカインという用語は、天然源または組換え細胞培養物からのタンパク質、および天然配列サイトカインの生物学的に活性な等価物を含む。
I.標的細胞
特定の実施形態において、標的細胞、例えば、腫瘍またはがん細胞に再指向されたゲノム編集されたCAR T細胞が、細胞上に標的抗原に結合する結合ドメインを有することが企図される。
特定の実施形態において、標的細胞、例えば、腫瘍またはがん細胞に再指向されたゲノム編集されたCAR T細胞が、細胞上に標的抗原に結合する結合ドメインを有することが企図される。
一実施形態において、標的細胞は、他の正常な(所望の)細胞の表面上には実質的に見出されない抗原、例えば標的抗原を発現する。
一実施形態において、標的細胞は、骨の細胞(bone cell)、骨細胞(osteocyte)、骨芽細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、軟骨芽細胞、筋肉細胞、骨格筋細胞、筋芽細胞、筋細胞、平滑筋細胞、膀胱細胞、骨髄細胞、中枢神経系(CNS)細胞、末梢神経系(PNS)細胞、グリア細胞、アストロサイト細胞、ニューロン、色素細胞、上皮細胞、皮膚細胞、内皮細胞、血管内皮細胞、***細胞、結腸細胞、食道細胞、胃腸管細胞、胃細胞、結腸細胞、頭部細胞、頸部細胞、歯肉細胞、舌細胞、腎細胞、肝細胞、肺細胞、鼻咽頭細胞、卵巣細胞、濾胞細胞、子宮頸部細胞、膣細胞、子宮細胞、膵細胞、膵実質細胞、膵管細胞、膵島細胞、前立腺細胞、陰茎細胞、生殖腺細胞、睾丸細胞、造血細胞、リンパ球系細胞、または骨髄系細胞である。
一実施形態において、標的細胞は、固形がん細胞である。
特定の実施形態において企図される組成物および方法によって標的化され得る細胞の例示的な例としては、次の固形がん:副腎癌、副腎皮質癌、肛門癌、虫垂癌、星状細胞腫、非定型奇形腫/ラブドイド腫瘍、基底細胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脳/CNS癌、乳癌、気管支腫瘍、心臓腫瘍、子宮頸癌、胆管細胞癌、軟骨肉腫、脊索腫、結腸癌、結腸直腸癌、頭蓋咽頭腫、乳管内上皮内癌(DCIS)子宮内膜癌、上衣腫、食道癌、感覚神経芽腫、ユーイング肉腫、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、眼癌、卵管癌、線維組織腫(fibrous histiosarcoma)、線維肉腫、胆嚢癌、胃癌、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍(GIST)、胚細胞腫瘍、神経膠腫、神経膠芽腫、頭頸部癌、血管芽腫、肝細胞癌、下咽頭癌、眼球内黒色腫、カポジ肉腫、腎癌、喉頭癌、平滑筋肉腫、***癌、脂肪肉腫、肝臓癌、肺癌、非小細胞肺癌、肺カルチノイド腫瘍、悪性中皮腫、髄様癌、髄芽腫、髄膜腫(menangioma)、黒色腫、メルケル細胞癌、正中管癌(midline tract carcinoma)、口癌、粘液肉腫、骨髄異形成症候群、骨髄増殖性腫瘍、鼻腔および副鼻腔癌、上咽頭癌、神経芽細胞腫、乏突起神経膠腫、口頭癌、口腔癌、中咽頭癌、骨肉腫、卵巣癌、膵癌、膵島細胞腫瘍、乳頭癌、傍神経節腫、副甲状腺癌、陰茎癌、咽頭癌、褐色細胞腫、松果体腫、下垂体腫瘍、胸膜肺芽腫、原発性腹膜癌、前立腺癌、直腸癌、網膜芽細胞腫、腎細胞癌、腎盂腎および尿管癌、横紋筋肉腫、唾液腺癌、皮脂腺癌、皮膚癌、軟部組織肉腫、扁平上皮癌、小細胞肺癌、小腸癌、胃の癌、汗腺癌、滑膜腫、精巣癌、咽喉癌、胸腺癌、甲状腺癌、尿道癌、子宮癌、子宮肉腫、膣癌、血管癌、外陰癌、ならびにウィルムス腫瘍のものが挙げられるが、これらに限定されない。
一実施形態において、標的細胞は、液性がんまたは血液癌細胞である。
多発性骨髄腫の例示的な例としては、白血病、リンパ腫、および多発性骨髄腫が挙げられるが、これらに限定されない。
特定の実施形態において企図される組成物および方法によって標的化され得る細胞の例示的な例としては、次の白血病:急性リンパ球性白血病(ALL)、急性骨髄性白血病(AML)、骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性、赤白血病、有毛細胞白血病(HCL)、慢性リンパ球性白血病(CLL)、および慢性骨髄性白血病(CML)、慢性骨髄単球性白血病(CMML)、ならびに真性赤血球増加症のものが挙げられるが、これらに限定されない。
特定の実施形態において企図される組成物および方法によって標的化され得る細胞の例示的な例としては、次のリンパ腫:ホジキンリンパ腫、結節性リンパ球優位型ホジキンリンパ腫、ならびにB細胞非ホジキンリンパ腫:バーキットリンパ腫、小リンパ球性リンパ腫(SLL)、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、免疫芽球性大細胞型リンパ腫、前駆Bリンパ芽球性リンパ腫、およびマントル細胞リンパ腫;およびT細胞非ホジキンリンパ腫:菌状息肉症、未分化大細胞リンパ腫、セザリー症候群、および前駆Tリンパ芽球性リンパ腫を含むがそれに限定されない非ホジキンリンパ腫のものが挙げられるが、これらに限定されない。
特定の実施形態において企図される組成物および方法によって標的化され得る細胞の例示的な例としては、次の多発性骨髄腫:顕性多発性骨髄腫、くすぶり型多発性骨髄腫、形質細胞性白血病、非分泌型骨髄腫、IgD骨髄腫、骨硬化性骨髄腫、孤立性骨形質細胞腫、および髄外性形質細胞腫のものが挙げられるが、これらに限定されない。
別の特定の実施形態において、標的細胞は、がん患者の細胞などのがん細胞である。
一実施形態において、標的細胞は、細胞、例えば、CMV、HPV、およびEBVが挙げられるが、これらに限定されない、ウイルスによって感染されるがん細胞である。
一実施形態において、標的抗原は、アルファ葉酸受容体、5T4、αvβ6インテグリン、BCMA、B7−H3、B7−H6、CAIX、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD70、CD79a、CD79b、CD123、CD138、CD171、CEA、CSPG4、EGFR、EGFRファミリー、例えば、ErbB2(HER2)、EGFRvIII、EGP2、EGP40、EPCAM、EphA2、EpCAM、FAP、胎児AchR、FRα、GD2、GD3、グリピカン−3(GPC3)、HLA−A1+MAGE1、HLA−A2+MAGE1、HLA−A3+MAGE1、HLA−A1+NY−ESO−1、HLA−A2+NY−ESO−1、HLA−A3+NY−ESO−1、IL−11Rα、IL−13Rα2、ラムダ、Lewis−Y、カッパ、メソテリン、Muc1、Muc16、NCAM、NKG2Dリガンド、NY−ESO−1、PRAME、PSCA、PSMA、ROR1、SSX、サバイビン、TAG72、TEM、VEGFR2、およびWT−1のエピトープである。
J.治療方法
本明細書において企図される組成物および方法によって製造されるゲノム編集されたCAR T細胞は、がん、感染性疾患、自己免疫疾患、炎症性疾患、および免疫不全症が挙げられるが、これらに限定されない、様々な状態の治療で用いるための改善された養子細胞療法を提供する。特定の実施形態において、一次T細胞の特異性は、本明細書において企図されるCARで一次T細胞を遺伝子改変することにより、腫瘍またはがん細胞に再指向される。一実施形態において、ゲノム編集されたCAR T細胞は、それを必要とするレシピエントに注入される。注入された細胞は、受容者の腫瘍細胞を殺滅することができる。
本明細書において企図される組成物および方法によって製造されるゲノム編集されたCAR T細胞は、がん、感染性疾患、自己免疫疾患、炎症性疾患、および免疫不全症が挙げられるが、これらに限定されない、様々な状態の治療で用いるための改善された養子細胞療法を提供する。特定の実施形態において、一次T細胞の特異性は、本明細書において企図されるCARで一次T細胞を遺伝子改変することにより、腫瘍またはがん細胞に再指向される。一実施形態において、ゲノム編集されたCAR T細胞は、それを必要とするレシピエントに注入される。注入された細胞は、受容者の腫瘍細胞を殺滅することができる。
特定の実施形態において、本明細書において企図されるゲノム編集されたCAR T細胞は、固形腫瘍またはがんの治療で使用される。
特定の実施形態において、本明細書において企図されるゲノム編集されたCAR T細胞は、副腎癌、副腎皮質癌、肛門癌、虫垂癌、星状細胞腫、非定型奇形腫/ラブドイド腫瘍、基底細胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脳/CNS癌、乳癌、気管支腫瘍、心臓腫瘍、子宮頸癌、胆管細胞癌、軟骨肉腫、脊索腫、結腸癌、結腸直腸癌、頭蓋咽頭腫、乳管内上皮内癌(DCIS)子宮内膜癌、上衣腫、食道癌、感覚神経芽腫、ユーイング肉腫、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、眼癌、卵管癌、線維組織腫(fibrous histiosarcoma)、線維肉腫、胆嚢癌、胃癌、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍(GIST)、胚細胞腫瘍、神経膠腫、神経膠芽腫、頭頸部癌、血管芽腫、肝細胞癌、下咽頭癌、眼球内黒色腫、カポジ肉腫、腎癌、喉頭癌、平滑筋肉腫、***癌、脂肪肉腫、肝臓癌、肺癌、非小細胞肺癌、肺カルチノイド腫瘍、悪性中皮腫、髄様癌、髄芽腫、髄膜腫(menangioma)、黒色腫、メルケル細胞癌、正中管癌(midline tract carcinoma)、口癌、粘液肉腫、骨髄異形成症候群、骨髄増殖性腫瘍、鼻腔および副鼻腔癌、上咽頭癌、神経芽細胞腫、乏突起神経膠腫、口頭癌、口腔癌、中咽頭癌、骨肉腫、卵巣癌、膵癌、膵島細胞腫瘍、乳頭癌、傍神経節腫、副甲状腺癌、陰茎癌、咽頭癌、褐色細胞腫、松果体腫、下垂体腫瘍、胸膜肺芽腫、原発性腹膜癌、前立腺癌、直腸癌、網膜芽細胞腫、腎細胞癌、腎盂腎および尿管癌、横紋筋肉腫、唾液腺癌、皮脂腺癌、皮膚癌、軟部組織肉腫、扁平上皮癌、小細胞肺癌、小腸癌、胃の癌、汗腺癌、滑膜腫、精巣癌、咽喉癌、胸腺癌、甲状腺癌、尿道癌、子宮癌、子宮肉腫、膣癌、血管癌、外陰癌、ならびにウィルムス腫瘍のものが挙げられるが、これらに限定されない、固形腫瘍またはがんの治療で使用される。
特定の実施形態において、本明細書において企図されるゲノム編集されたCAR T細胞は、肝臓癌、膵臓癌、肺癌、乳癌、膀胱癌、脳癌、骨癌、甲状腺癌、腎臓癌、または皮膚癌が挙げられるが、これらに限定されない、固形腫瘍またはがんの治療で使用される。
特定の実施形態において、本明細書において企図されるゲノム編集されたCAR T細胞は、膵臓、膀胱、および肺が挙げられるが、これらに限定されない、様々ながんの治療で使用される。
特定の実施形態において、本明細書において企図されるゲノム編集されたCAR T細胞は、液性がんまたは血液癌の治療で使用される。
特定の実施形態において、本明細書において企図されるゲノム編集されたCAR T細胞は、白血病、リンパ腫、および多発性骨髄腫が挙げられるが、これらに限定されない、B細胞悪性腫瘍の治療で使用される。
特定の実施形態において、本明細書において企図されるゲノム編集されたCAR T細胞は、以下の白血病、リンパ腫、および多発性骨髄腫:急性リンパ球性白血病(ALL)、急性骨髄性白血病(AML)、骨髄芽球性,前骨髄球性、骨髄単球性、単球性、赤白血病、有毛細胞白血病(HCL)、慢性リンパ球性白血病(CLL)、および慢性骨髄性白血病(CML)、慢性骨髄単球性白血病(CMML)、および真性赤血球増加症、ホジキンリンパ腫、結節性リンパ球優位型ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、小リンパ球性リンパ腫(SLL)、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、免疫芽球性大細胞型リンパ腫、前駆Bリンパ芽球性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、菌状息肉腫、未分化大細胞リンパ腫、セザリー症候群、前駆Tリンパ芽球性リンパ腫、多発性骨髄腫、顕性多発性骨髄腫、くすぶり多発性骨髄腫、形質細胞白血病、非分泌性骨髄腫、IgD骨髄腫、骨硬化性骨髄腫、骨の孤立性形質細胞腫、ならびに髄外性形質細胞腫が挙げられるが、これらに限定されない、液性がんの治療において使用される。
特定の実施形態において、治療上有効量の、本明細書において企図されるゲノム編集されたT細胞またはそれを含む組成物を、それを必要とする患者に、単独でまたは1つ以上の治療剤と組み合わせて投与することを含む方法が、提供される。ある特定の実施形態において、これらの細胞は、がんを発症するリスクがある患者の治療で使用される。したがって、特定の実施形態は、治療上有効量の本明細書において企図されるゲノム編集されたT細胞を、それを必要とする患者に投与することを含む、がんの少なくとも1つの症状の治療または予防または寛解を含む。
一実施形態において、がんの治療を必要とする対象におけるがんを治療する方法は、有効量、例えば、治療上有効量の本明細書において企図されるゲノム編集されたCAR T細胞を含む組成物を投与することを含む。適切な投薬量は臨床試験によって決定され得るが、投与の量および頻度は、患者の状態、ならびに患者の疾患の種類および重症度などの要因によって決定される。
一実施形態において、対象に投与される組成物中のT細胞の量は、少なくとも0.1×105個の細胞、少なくとも0.5×105個の細胞、少なくとも1×105個の細胞、少なくとも5×105個の細胞、少なくとも1×106個の細胞、少なくとも0.5×107個の細胞、少なくとも1×107個の細胞、少なくとも0.5×108個の細胞、少なくとも1×108個の細胞、少なくとも0.5×109個の細胞、少なくとも1×109個の細胞、少なくとも2×109個の細胞、少なくとも3×109個の細胞、少なくとも4×109個の細胞、少なくとも5×109個の細胞、または少なくとも1×1010個の細胞である。
特定の実施形態において、約1×107個のT細胞〜約1×109個のT細胞、約2×107個のT細胞〜約0.9×109個のT細胞、約3×107個のT細胞〜約0.8×109個のT細胞、約4×107個のT細胞〜約0.7×109個のT細胞、約5×107個のT細胞〜約0.6×109個のT細胞、または約5×107個のT細胞〜約0.5×109個のT細胞が対象に投与される。
一実施形態において、対象に投与される組成物中のT細胞の量は、少なくとも0.1×104個の細胞/kg体重、少なくとも0.5×104個の細胞/kg体重、少なくとも1×104個の細胞/kg体重、少なくとも5×104個の細胞/kg体重、少なくとも1×105個の細胞/kg体重、少なくとも0.5×106個の細胞/kg体重、少なくとも1×106個の細胞/kg体重、少なくとも0.5×107個の細胞/kg体重、少なくとも1×107個の細胞/kg体重、少なくとも0.5×108個の細胞/kg体重、少なくとも1×108個の細胞/kg体重、少なくとも2×108個の細胞/kg体重、少なくとも3×108個の細胞/kg体重、少なくとも4×108個の細胞/kg体重、少なくとも5×108個の細胞/kg体重、または少なくとも1×109個の細胞/kg体重である。
特定の実施形態において、約1×106個のT細胞/kg体重〜約1×108個のT細胞/kg体重、約2×106個のT細胞/kg体重〜約0.9×108個のT細胞/kg体重、約3×106個のT細胞/kg体重〜約0.8×108個のT細胞/kg体重、約4×106個のT細胞/kg体重〜約0.7×108個のT細胞/kg体重、約5×106個のT細胞/kg体重〜約0.6×108個のT細胞/kg体重、または約5×106個のT細胞/kg体重〜約0.5×108個のT細胞/kg体重が対象に投与される。
所望の療法をもたらすために、特定の実施形態において企図される組成物の複数回投与が必要とされる場合があることは、当業者であれば認識するであろう。例えば、組成物は、1週間、2週間、3週間、1ヶ月、2ヶ月、3ヶ月、4ヶ月、5ヶ月、6ヶ月、1年、2年、5年、10年、またはそれ以上にわたって、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10回もしくはそれ以上投与され得る。
ある特定の実施形態において、活性化されたT細胞を対象に投与し、次いで再採血し(またはアフェレーシスを行い)、そこからT細胞を活性化させ、これらの活性化および増幅したT細胞を患者に再注入することが望ましい場合がある。このプロセスは、数週間毎に複数回行われ得る。ある特定の実施形態において、T細胞は、10cc〜400ccの採血から活性化され得る。ある特定の実施形態において、T細胞は、20cc、30cc、40cc、50cc、60cc、70cc、80cc、90cc、100cc、150cc、200cc、250cc、300cc、350cc、または400ccもしくはそれ以上の採血から活性化される。理論に束縛されるものではないが、この複数回採血/複数回再注入プロトコルの使用は、ある特定のT細胞集団を選出することに役立ち得る。
特定の実施形態において企図される組成物の投与は、エアロゾル吸入、注射、摂取、輸血、留置、または移植を含む、任意の簡便な様式で行われ得る。好ましい実施形態において、組成物は、非経口投与される。本明細書で使用される場合、「非経口投与」および「非経口投与される」という語句は、腸内および局所投与以外、通常、注射による投与モードを指し、血管内、静脈内、筋肉内、動脈内、くも膜下腔内、嚢内、眼窩内、腫瘍内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、嚢下、くも膜下、脊髄内、ならびに胸骨内注射および注入を含むが、これらに限定されない。一実施形態において、本明細書において企図される組成物は、腫瘍、リンパ節、または感染部位への直接注射により対象に投与される。
一実施形態において、それを必要とする対象は、対象のがんに対する細胞免疫応答を増加させるために有効量の組成物を投与される。免疫応答は、感染細胞、調節性T細胞、およびヘルパーT細胞応答を死滅させることができる細胞傷害性T細胞により媒介される細胞免疫応答を含み得る。B細胞を活性化することができるヘルパーT細胞によって主に媒介され、よって抗体産生につながる体液性免疫応答も誘発され得る。組成物により誘導される免疫応答の種類を分析するには種々の技術を使用することができ、これらは、当該技術分野において、例えば、Current Protocols in Immunology,Edited by:John E.Coligan,Ada M.Kruisbeek,David H.Margulies,Ethan M.Shevach,Warren Strober(2001)John Wiley&Sons,NY,N.Y.に詳しく記載されている。
一実施形態において、がんと診断された対象を治療する方法は、対象から免疫エフェクター細胞を取り出すことと、前記免疫エフェクター細胞のゲノムを編集し、ゲノム編集された免疫エフェクター細胞の集団を生成することと、CARをコードする核酸を細胞に導入することと、ゲノム編集された免疫エフェクター細胞の集団を同じ対象に投与することと、を含む。好ましい実施形態において、免疫エフェクター細胞は、T細胞を含む。
特定の実施形態において企図される細胞組成物を投与するための方法は、エクスビボのゲノム編集された免疫エフェクター細胞の再導入、または対象に導入されると成熟免疫エフェクター細胞に分化する免疫エフェクター細胞のゲノム編集された前駆細胞の再導入をもたらすのに有効な任意の方法を含む。1つの方法は、末梢血T細胞をゲノム編集することと、CARをコードする核酸をエクスビボで細胞に形質導入することと、形質導入細胞を対象に戻すことと、を含む。
本明細書に引用される公開文献、特許出願、および交付済み特許は全て、個々の公開文献、特許出願、または交付済み特許それぞれが参照により組み込まれるよう明確かつ個別に示されているかのように、参照により本明細書に組み込まれる。
前述の実施形態は、理解を明確にするために図示および例によりいくらか詳細に記載されているが、本明細書において企図される教示の観点から、添付の特許請求の範囲の趣旨または範囲から逸脱することなく、ある特定の変更および改変がそれに対して行われ得ることは、当業者には容易に明らかであろう。以下の実施例は、限定ではなく、単なる例示として提供されるものである。当業者であれば、変更または改変しても本質的に同様の結果を得ることができる必須ではない種々のパラメータを容易に認識するであろう。
実施例1
破壊されたTCRα 対立遺伝子を有する抗BCMA CAR T細胞
培養方法
凍結保存された末梢血単核細胞(PBMC)を、Ficoll勾配を用いて2人の異なる健常なドナーから単離し、解凍し、抗体を刺激する抗CD3および抗CD28 T細胞を有する培地に入れた。抗体刺激から24時間後、細胞を、抗BCMA scFv、4−1BB共刺激ドメイン、およびCD3ζシグナル伝達ドメインを含む第二世代のキメラ抗原受容体(CAR)をコードするレンチウイルスを用いて10のMOIで形質導入した。抗体刺激から72時間後、100×106個の形質導入した細胞(大規模)または5×106個の形質導入した細胞(小規模)を、TCRα遺伝子座を標的とするメガTALをコードする50μg/mLのインビトロ転写mRNAを有するMaxcyte電気穿孔デバイスを使用して電気穿孔した。電気穿孔直後の培養液中に細胞を戻して、30℃で24時間インキュベートし、37℃のインキュベーターに戻し、IL−2を含有する新鮮な培地で合計10日間培養した。10日目に、細胞を、今後の分析のために凍結保存した。
破壊されたTCRα 対立遺伝子を有する抗BCMA CAR T細胞
培養方法
凍結保存された末梢血単核細胞(PBMC)を、Ficoll勾配を用いて2人の異なる健常なドナーから単離し、解凍し、抗体を刺激する抗CD3および抗CD28 T細胞を有する培地に入れた。抗体刺激から24時間後、細胞を、抗BCMA scFv、4−1BB共刺激ドメイン、およびCD3ζシグナル伝達ドメインを含む第二世代のキメラ抗原受容体(CAR)をコードするレンチウイルスを用いて10のMOIで形質導入した。抗体刺激から72時間後、100×106個の形質導入した細胞(大規模)または5×106個の形質導入した細胞(小規模)を、TCRα遺伝子座を標的とするメガTALをコードする50μg/mLのインビトロ転写mRNAを有するMaxcyte電気穿孔デバイスを使用して電気穿孔した。電気穿孔直後の培養液中に細胞を戻して、30℃で24時間インキュベートし、37℃のインキュベーターに戻し、IL−2を含有する新鮮な培地で合計10日間培養した。10日目に、細胞を、今後の分析のために凍結保存した。
ベクターコピー数分析
組み込まれたレンチウイルス粒子の数をq−PCRによって決定し、ベクターコピー数(VCN)として提示した。VCNを、市販のgDNA単離キットを用いて細胞からゲノムDNAを単離することと、組み込まれたプロウイルスのPsi/Gag領域のためのtaqManプローブで定量的PCRアッセイを行うことと、プラスミドベースの陽性対照で生成された標準曲線を用いて、Psi/Gagシグナルを、内因性RNAsePコピー数と比較することによって決定した。VCNは、標準培養プロセスを用いて培養された抗BCMA CAR T細胞(EPなし)、電気穿孔したが、mRNAを受けない細胞(EPのみ)、およびTCRα遺伝子を標的化するメガTALをコードするmRNAで電気穿孔した細胞(TCRα KO)における各ドナーに対して同様であった。図1。
組み込まれたレンチウイルス粒子の数をq−PCRによって決定し、ベクターコピー数(VCN)として提示した。VCNを、市販のgDNA単離キットを用いて細胞からゲノムDNAを単離することと、組み込まれたプロウイルスのPsi/Gag領域のためのtaqManプローブで定量的PCRアッセイを行うことと、プラスミドベースの陽性対照で生成された標準曲線を用いて、Psi/Gagシグナルを、内因性RNAsePコピー数と比較することによって決定した。VCNは、標準培養プロセスを用いて培養された抗BCMA CAR T細胞(EPなし)、電気穿孔したが、mRNAを受けない細胞(EPのみ)、およびTCRα遺伝子を標的化するメガTALをコードするmRNAで電気穿孔した細胞(TCRα KO)における各ドナーに対して同様であった。図1。
細胞増殖
生存細胞計数は、細胞の増殖における電気穿孔プロトコルの影響を決定することを除いては、Nexcelom計数デバイスおよびトリパンブルーを用いた10日間の培養プロセス中、両ドナーに対して行われた。単独で電気穿孔を行った細胞(EPのみ)またはTCRα メガTAL mRNAで電気穿孔を行った細胞(TCRα KO)、および30℃で一晩インキュベートした細胞は、標準プロセスを用いて培養した細胞と比較して遅延増殖を示したが、PBMC培養開始後の5日〜10日間同様の成長速度を再開した。図2。
生存細胞計数は、細胞の増殖における電気穿孔プロトコルの影響を決定することを除いては、Nexcelom計数デバイスおよびトリパンブルーを用いた10日間の培養プロセス中、両ドナーに対して行われた。単独で電気穿孔を行った細胞(EPのみ)またはTCRα メガTAL mRNAで電気穿孔を行った細胞(TCRα KO)、および30℃で一晩インキュベートした細胞は、標準プロセスを用いて培養した細胞と比較して遅延増殖を示したが、PBMC培養開始後の5日〜10日間同様の成長速度を再開した。図2。
抗BCMA CAR発現およびTCRα標的有効性(CD3陰性細胞)
抗BCMA CAR発現、およびフローサイトメトリー分析を介してTCRα破壊の有効性は、10日目に決定された。CAR発現は、PEフルオロフォアに対して共役されたBCMA抗原を有する細胞を染色することによって決定された。抗BCMA CAR発現は、電気穿孔群および非電気穿孔群の中で同様であった。図3、最右の象限。メガTAL媒介TCRα破壊は、CD3表面染色によって決定された。検出可能なCD3発現は、細胞表面へのTCRα鎖輸送を必要とし、TCRα破壊の遺伝子分析とよく相関していることがこれまでに示されている。データは、CD3が、大規模でメガTAL mRNAで電気穿孔された約50%のT細胞、小規模で約60%の細胞の表面から除去されることを示す。図3、最下の象限。TCRα破壊は、CAR陽性細胞とCAR陰性細胞との間で同様であった。図3、左隅の象限(CAR陰性)を右隅の象限(CAR陽性)と比較する。図4は、図3に示されるFACSデータのグラフ表示を示す。
抗BCMA CAR発現、およびフローサイトメトリー分析を介してTCRα破壊の有効性は、10日目に決定された。CAR発現は、PEフルオロフォアに対して共役されたBCMA抗原を有する細胞を染色することによって決定された。抗BCMA CAR発現は、電気穿孔群および非電気穿孔群の中で同様であった。図3、最右の象限。メガTAL媒介TCRα破壊は、CD3表面染色によって決定された。検出可能なCD3発現は、細胞表面へのTCRα鎖輸送を必要とし、TCRα破壊の遺伝子分析とよく相関していることがこれまでに示されている。データは、CD3が、大規模でメガTAL mRNAで電気穿孔された約50%のT細胞、小規模で約60%の細胞の表面から除去されることを示す。図3、最下の象限。TCRα破壊は、CAR陽性細胞とCAR陰性細胞との間で同様であった。図3、左隅の象限(CAR陰性)を右隅の象限(CAR陽性)と比較する。図4は、図3に示されるFACSデータのグラフ表示を示す。
抗原依存性細胞傷害性放出
BCMA陽性細胞株およびBCMA陰性細胞株に対して破壊されたTCRα対立遺伝子(TCRα KO)を有する抗BCMA CAR T細胞の生物学的活性を、インターフェロン−ガンマ(IFNγ)放出アッセイを用いて評価した。5×104個のT細胞は、上述のように、標準プロセス(EPなし)、EPのみ、およびTCRα KOを用いて増幅し、BCMA陽性細胞株およびBCMA陰性細胞株を1:1の比で、37℃で24時間共培養した。培養培地上清を収集し、標準発光アッセイを、異なる細胞型から相対的サイトカイン生成を評価するために行った。TCRα KO細胞は、抗原依存性様式において、より高いレベルの主な免疫刺激サイトカインIFNγを分泌した。図5A。
BCMA陽性細胞株およびBCMA陰性細胞株に対して破壊されたTCRα対立遺伝子(TCRα KO)を有する抗BCMA CAR T細胞の生物学的活性を、インターフェロン−ガンマ(IFNγ)放出アッセイを用いて評価した。5×104個のT細胞は、上述のように、標準プロセス(EPなし)、EPのみ、およびTCRα KOを用いて増幅し、BCMA陽性細胞株およびBCMA陰性細胞株を1:1の比で、37℃で24時間共培養した。培養培地上清を収集し、標準発光アッセイを、異なる細胞型から相対的サイトカイン生成を評価するために行った。TCRα KO細胞は、抗原依存性様式において、より高いレベルの主な免疫刺激サイトカインIFNγを分泌した。図5A。
BCMA陽性細胞株およびBCMA陰性細胞株に対して破壊されたTCRα対立遺伝子(TCRα KO+/−Trex2)を有する抗BCMA CAR T細胞の生物学的活性を、サイトカイン放出アッセイを用いて評価した。5×104個のT細胞は、標準プロセス(EPなし)、TCRα KO、またはTrex2で生成したTCRα KOを用いて増幅した。抗BCMA CAR T細胞を、T細胞、またはBCMA陽性細胞株およびBCMA陰性細胞株を1:1の比で、37℃で24時間共培養した。培養培地上清を収集し、標準発光アッセイを、異なる細胞型から相対的IL−4、IL−10、TNFα、IL−8、IL−5、IL−6、GM−CSF、およびMIP−1α生成を評価するために行った。全ての抗BCMA CAR T細胞は、抗原依存性様式においてサイトカインを生成した。図5B。
TCRα KO細胞のインビボ有効性
上述の標準プロセス(EPなし)、EPのみ、およびTCRα KOの処理を用いて製造された抗BCMA CAR T細胞は、Daudi腫瘍異種移植片モデルを使用してインビボ有効性について試験した。ルシフェラーゼを構成的に発現する2×106個のDaudi細胞を、NSGマウスに注射し、Xenogen IVIS撮像装置によって評価されるように、ルシフェラーゼシグナルが、約1×107p/sec/cm2/sr(腫瘍細胞注射後の約11日)に達するまで、移植し、成長させた。この時、マウスを、10×106、5×106、または2.5×106個の抗BCMA CAR T細胞(1群当たりn=5)で注射した。腫瘍の成長に続いて、ルシフェラーゼのXenogen造影を介して週2回マウスを連続造影した。27日で、全ての用量にわたってTCRα KO細胞は、標準プロセスを用いて培養された抗BCMA CAR T細胞、およびmRNAを用いずに電気穿孔したものをしのいだ。図6A。
上述の標準プロセス(EPなし)、EPのみ、およびTCRα KOの処理を用いて製造された抗BCMA CAR T細胞は、Daudi腫瘍異種移植片モデルを使用してインビボ有効性について試験した。ルシフェラーゼを構成的に発現する2×106個のDaudi細胞を、NSGマウスに注射し、Xenogen IVIS撮像装置によって評価されるように、ルシフェラーゼシグナルが、約1×107p/sec/cm2/sr(腫瘍細胞注射後の約11日)に達するまで、移植し、成長させた。この時、マウスを、10×106、5×106、または2.5×106個の抗BCMA CAR T細胞(1群当たりn=5)で注射した。腫瘍の成長に続いて、ルシフェラーゼのXenogen造影を介して週2回マウスを連続造影した。27日で、全ての用量にわたってTCRα KO細胞は、標準プロセスを用いて培養された抗BCMA CAR T細胞、およびmRNAを用いずに電気穿孔したものをしのいだ。図6A。
TCRα KO細胞は、継続して、43日で他の抗BCMA CAR T細胞をしのぐ。図6B。
実施例2
TCRα破壊は、抗CD19 CAR T細胞からサイトカイン放出を増強する
抗CD19 CARをコードするレンチウイルスで形質導入したT細胞における抗原依存性サイトカイン生成は、TCRα遺伝子座に組み込まれた抗CD19 CARを含有するゲノム編集されたT細胞における抗原依存性サイトカイン生成と比較した。
TCRα破壊は、抗CD19 CAR T細胞からサイトカイン放出を増強する
抗CD19 CARをコードするレンチウイルスで形質導入したT細胞における抗原依存性サイトカイン生成は、TCRα遺伝子座に組み込まれた抗CD19 CARを含有するゲノム編集されたT細胞における抗原依存性サイトカイン生成と比較した。
レンチウイルス抗CD19 CAR
ヒトPBMC(1×106個の細胞/mL)を、可溶性抗CD3および抗CD28抗体(50ng/mL)で0日目に活性化した。24時間のインキュベーション後、1×106個の細胞を、抗CD19 CARレンチウイルス(LV−T細胞;pBB146、配列番号8)で形質導入した。レンチウイルスベクターは、CD8α由来のシグナルペプチド、抗CD19 scFv、CD8α由来のヒンジ領域、および膜貫通ドメイン、細胞内4−1BB共刺激ドメイン、およびCD3ζシグナル伝達ドメインを含むCARに作動可能に連結されたMNDプロモーターを含むCAR発現カセットを含有した。レンチウイルスを、確立されたプロトコルを用いて調製した。例えば、Kutner et al.,BMC Biotechnol.2009;9:10.doi:10.1186/1472−6750−9−10、Kutner et al.Nat.Protoc.2009;4(4):495−505.doi:10.1038/nprot.2009.22を参照されたい。
ヒトPBMC(1×106個の細胞/mL)を、可溶性抗CD3および抗CD28抗体(50ng/mL)で0日目に活性化した。24時間のインキュベーション後、1×106個の細胞を、抗CD19 CARレンチウイルス(LV−T細胞;pBB146、配列番号8)で形質導入した。レンチウイルスベクターは、CD8α由来のシグナルペプチド、抗CD19 scFv、CD8α由来のヒンジ領域、および膜貫通ドメイン、細胞内4−1BB共刺激ドメイン、およびCD3ζシグナル伝達ドメインを含むCARに作動可能に連結されたMNDプロモーターを含むCAR発現カセットを含有した。レンチウイルスを、確立されたプロトコルを用いて調製した。例えば、Kutner et al.,BMC Biotechnol.2009;9:10.doi:10.1186/1472−6750−9−10、Kutner et al.Nat.Protoc.2009;4(4):495−505.doi:10.1038/nprot.2009.22を参照されたい。
TCRα遺伝子座に組み込まれた抗CD19 CAR
抗CD19 CARを含有するアデノ随伴ウイルス(AAV)プラスミドを、設計し、構築し、検証した(pBW1021、配列番号9)。ドナー修復テンプレートは、CD8α由来のシグナルペプチド、抗CD19 scFv、CD8α由来のヒンジ領域、および膜貫通ドメイン、細胞内4−1BB共刺激ドメイン、およびCD3ζシグナル伝達ドメインを含むCARに作動可能に連結されたMNDプロモーターを含むCAR発現カセットを含有した。ドナー修復テンプレートの5´および3´相同領域は、それぞれ、約650bpであった。
抗CD19 CARを含有するアデノ随伴ウイルス(AAV)プラスミドを、設計し、構築し、検証した(pBW1021、配列番号9)。ドナー修復テンプレートは、CD8α由来のシグナルペプチド、抗CD19 scFv、CD8α由来のヒンジ領域、および膜貫通ドメイン、細胞内4−1BB共刺激ドメイン、およびCD3ζシグナル伝達ドメインを含むCARに作動可能に連結されたMNDプロモーターを含むCAR発現カセットを含有した。ドナー修復テンプレートの5´および3´相同領域は、それぞれ、約650bpであった。
組換えAAV(rAAV)を、複製、カプシド、およびアデノウイルスヘルパーエレメントに必要性をもたらす1つ以上のプラスミドでHEK 293T細胞を一時的に同時遺伝子導入することによって調製した。rAAVは、イオジキサノール系勾配における超遠心分離を使用して同時遺伝子導入したHEK 293T細胞培地から精製した。
ヒトPBMC(1×106個の細胞/mL)を、可溶性抗CD3および抗CD28抗体(50ng/mL)で0日目に活性化した。活性化後の3日目に、細胞を、緩衝液のみ(UTD対照)またはTCRαを標的化するメガTALポリペプチドをコードするmRNA(配列番号11)で電気穿孔した。電気穿孔した細胞を、30℃で1時間インキュベートし、抗CD19 CARドナー修復テンプレートをコードするrAAVで形質導入して、TCRα遺伝子座で相同組換え(HR−T細胞)を推進した。ゲノム編集された細胞を、30℃で24時間インキュベートし、次いで、回収し、IL−2を含有する培地で、37℃で5日間培養した。
抗CD19 CAR発現およびTCRα標的有効性(CD3陰性細胞)
活性化後の10日目に、抗CD19 CAR T細胞を、CD3および抗CD19 CAR表面発現を検出するために、フローサイトメトリーによって分析した。レンチウイルス形質導入は、72%のCD3+抗CD19−CAR+T細胞を生成したが、28〜40%のHR−T細胞は、CD3−抗CD19 CAR+であった。図7。
活性化後の10日目に、抗CD19 CAR T細胞を、CD3および抗CD19 CAR表面発現を検出するために、フローサイトメトリーによって分析した。レンチウイルス形質導入は、72%のCD3+抗CD19−CAR+T細胞を生成したが、28〜40%のHR−T細胞は、CD3−抗CD19 CAR+であった。図7。
抗原依存性細胞傷害性
LV−TおよびHR−T細胞の細胞傷害性可能性を、エフェクター対標的物(E:T)の比を1:1で24時間、T細胞を、CD19+のNalm−6(GFP)とK562(BFP)標的細胞の混合物を50:50で同時インキュベートすることによって分析した。T細胞の共培養後、Nalm−6対K562に比は、T細胞傷害性の直接読み出しである。CD19の特異的細胞傷害性の同様のレベルは、LV−TおよびHR−T細胞の両方の共培養において観察された。図8A。
LV−TおよびHR−T細胞の細胞傷害性可能性を、エフェクター対標的物(E:T)の比を1:1で24時間、T細胞を、CD19+のNalm−6(GFP)とK562(BFP)標的細胞の混合物を50:50で同時インキュベートすることによって分析した。T細胞の共培養後、Nalm−6対K562に比は、T細胞傷害性の直接読み出しである。CD19の特異的細胞傷害性の同様のレベルは、LV−TおよびHR−T細胞の両方の共培養において観察された。図8A。
抗原依存性細胞傷害性放出
抗原依存性サイトカイン放出を、LV−T細胞またはHR−T細胞を、CD19+Nalm−6細胞と、E:T比を1:1で24時間共培養することによって分析した。培養上清を収集し、IFNγ放出をサイトメトリービーズアレイ(CBA)(BD biosciences)を用いて分析した。HR−T細胞は、LV−T細胞と比較して、増加した量のIFNγを放出した。図8B。
抗原依存性サイトカイン放出を、LV−T細胞またはHR−T細胞を、CD19+Nalm−6細胞と、E:T比を1:1で24時間共培養することによって分析した。培養上清を収集し、IFNγ放出をサイトメトリービーズアレイ(CBA)(BD biosciences)を用いて分析した。HR−T細胞は、LV−T細胞と比較して、増加した量のIFNγを放出した。図8B。
実施例3
TCRα破壊は、抗CD19 CAR T細胞からサイトカイン放出を増強する
抗CD19 CARをコードするレンチウイルスで形質導入したT細胞における抗原依存性サイトカイン生成は、TCRα遺伝子座に組み込まれた抗CD19 CARを含有するゲノム編集されたT細胞における抗原依存性サイトカイン生成と比較した。
TCRα破壊は、抗CD19 CAR T細胞からサイトカイン放出を増強する
抗CD19 CARをコードするレンチウイルスで形質導入したT細胞における抗原依存性サイトカイン生成は、TCRα遺伝子座に組み込まれた抗CD19 CARを含有するゲノム編集されたT細胞における抗原依存性サイトカイン生成と比較した。
レンチウイルス抗CD19 CAR
ヒトPBMC(1×106個の細胞/mL)を、可溶性抗CD3および抗CD28抗体(50ng/mL)で0日目に活性化した。24時間のインキュベーション後、1×106個の細胞を、抗CD19 CARレンチウイルス(LV−T細胞;pBB146、配列番号8)で形質導入した。レンチウイルスベクターは、CD8α由来のシグナルペプチド、抗CD19 scFv、CD8α由来のヒンジ領域、および膜貫通ドメイン、細胞内4−1BB共刺激ドメイン、およびCD3ζシグナル伝達ドメインを含むCARに作動可能に連結されたMNDプロモーターを含むCAR発現カセットを含有した。レンチウイルスを、確立されたプロトコルを用いて調製した。例えば、Kutner et al.,BMC Biotechnol.2009;9:10.doi:10.1186/1472−6750−9−10、Kutner et al.Nat.Protoc.2009;4(4):495−505.doi:10.1038/nprot.2009.22を参照されたい。
ヒトPBMC(1×106個の細胞/mL)を、可溶性抗CD3および抗CD28抗体(50ng/mL)で0日目に活性化した。24時間のインキュベーション後、1×106個の細胞を、抗CD19 CARレンチウイルス(LV−T細胞;pBB146、配列番号8)で形質導入した。レンチウイルスベクターは、CD8α由来のシグナルペプチド、抗CD19 scFv、CD8α由来のヒンジ領域、および膜貫通ドメイン、細胞内4−1BB共刺激ドメイン、およびCD3ζシグナル伝達ドメインを含むCARに作動可能に連結されたMNDプロモーターを含むCAR発現カセットを含有した。レンチウイルスを、確立されたプロトコルを用いて調製した。例えば、Kutner et al.,BMC Biotechnol.2009;9:10.doi:10.1186/1472−6750−9−10、Kutner et al.Nat.Protoc.2009;4(4):495−505.doi:10.1038/nprot.2009.22を参照されたい。
TCRα遺伝子座に組み込まれた抗CD19 CAR
抗CD19 CARを含有するアデノ随伴ウイルス(AAV)プラスミドを、設計し、構築し、検証した(pBW400、配列番号13)。ドナー修復テンプレートは、CD8α由来のシグナルペプチド、抗CD19 scFv、CD8α由来のヒンジ領域、および膜貫通ドメイン、細胞内4−1BB共刺激ドメイン、およびCD3ζシグナル伝達ドメイン、およびウッドチャック転写後調節領域(WPRE)を含むCARに作動可能に連結されたMNDプロモーターを含むCAR発現カセットを含有した。ドナー修復テンプレートの5´および3´相同領域は、それぞれ、約650bpであった。
抗CD19 CARを含有するアデノ随伴ウイルス(AAV)プラスミドを、設計し、構築し、検証した(pBW400、配列番号13)。ドナー修復テンプレートは、CD8α由来のシグナルペプチド、抗CD19 scFv、CD8α由来のヒンジ領域、および膜貫通ドメイン、細胞内4−1BB共刺激ドメイン、およびCD3ζシグナル伝達ドメイン、およびウッドチャック転写後調節領域(WPRE)を含むCARに作動可能に連結されたMNDプロモーターを含むCAR発現カセットを含有した。ドナー修復テンプレートの5´および3´相同領域は、それぞれ、約650bpであった。
組換えAAV(rAAV)を、複製、カプシド、およびアデノウイルスヘルパーエレメントに必要性をもたらす1つ以上のプラスミドでHEK 293T細胞を一時的に同時遺伝子導入することによって調製した。rAAVは、イオジキサノール系勾配における超遠心分離を使用して同時遺伝子導入したHEK 293T細胞培地から精製した。
ヒトPBMC(1×106個の細胞/mL)を、可溶性抗CD3および抗CD28抗体(50ng/mL)で0日目に活性化した。活性化後の3日目に、細胞を、緩衝液のみ(UTD対照)またはTCRαを標的化するメガTALポリペプチドをコードするmRNA(配列番号11)で電気穿孔した。電気穿孔した細胞を、30℃で1時間インキュベートし、抗CD19 CARドナー修復テンプレートをコードするrAAVで形質導入して、TCRα遺伝子座で相同組換え(HR−T細胞)を推進した。ゲノム編集された細胞を、30℃で24時間インキュベートし、次いで、回収し、IL−2を含有する培地で、37℃で5日間培養した。
抗CD19 CAR発現およびTCRα標的有効性(CD3陰性細胞)
活性化後の10日目に、抗CD19 CAR T細胞を、CD3および抗CD19 CAR表面発現を検出するために、フローサイトメトリーによって分析した。レンチウイルス形質導入は、85%のCD3+抗CD19−CAR+T細胞を生成したが、49%のHR−T細胞は、CD3−抗CD19 CAR+であった。図9。
活性化後の10日目に、抗CD19 CAR T細胞を、CD3および抗CD19 CAR表面発現を検出するために、フローサイトメトリーによって分析した。レンチウイルス形質導入は、85%のCD3+抗CD19−CAR+T細胞を生成したが、49%のHR−T細胞は、CD3−抗CD19 CAR+であった。図9。
抗原依存性細胞傷害性
LV−TおよびHR−T細胞の細胞傷害性可能性を、エフェクター対標的物(E:T)の比を1:1で24時間、T細胞を、CD19+のNalm−6(GFP)とK562(BFP)標的細胞の混合物を50:50で同時インキュベートすることによって分析した。T細胞の共培養後、Nalm−6対K562に比は、T細胞傷害性の直接読み出しである。CD19の特異的細胞傷害性の同様のレベルは、LV−TおよびHR−T細胞の両方の共培養において観察された。図10A。
LV−TおよびHR−T細胞の細胞傷害性可能性を、エフェクター対標的物(E:T)の比を1:1で24時間、T細胞を、CD19+のNalm−6(GFP)とK562(BFP)標的細胞の混合物を50:50で同時インキュベートすることによって分析した。T細胞の共培養後、Nalm−6対K562に比は、T細胞傷害性の直接読み出しである。CD19の特異的細胞傷害性の同様のレベルは、LV−TおよびHR−T細胞の両方の共培養において観察された。図10A。
抗原依存性細胞傷害性放出
抗原依存性サイトカイン放出を、LV−T細胞またはHR−T細胞を、CD19+Nalm−6細胞と、E:T比を1:1で24時間共培養することによって分析した。培養上清を収集し、IFNγ、IL−2、IL−4、およびTNFα放出をサイトメトリービーズアレイ(CBA)(BD biosciences)を用いて分析した。HR−T細胞は、LV−T細胞と比較して、増加した量のサイトカインを放出した。図10B。
抗原依存性サイトカイン放出を、LV−T細胞またはHR−T細胞を、CD19+Nalm−6細胞と、E:T比を1:1で24時間共培養することによって分析した。培養上清を収集し、IFNγ、IL−2、IL−4、およびTNFα放出をサイトメトリービーズアレイ(CBA)(BD biosciences)を用いて分析した。HR−T細胞は、LV−T細胞と比較して、増加した量のサイトカインを放出した。図10B。
実施例4
TCRα遺伝子座への抗CD19 CARトランス遺伝子の相同組換えは、T細胞枯渇マーカーの低減された発現と関連している
抗CD19 CARをコードするレンチウイルスで形質導入したT細胞におけるT細胞枯渇は、TCRα遺伝子座に組み込まれた抗CD19 CARを含有するゲノム編集されたT細胞におけるT細胞枯渇と比較した。
TCRα遺伝子座への抗CD19 CARトランス遺伝子の相同組換えは、T細胞枯渇マーカーの低減された発現と関連している
抗CD19 CARをコードするレンチウイルスで形質導入したT細胞におけるT細胞枯渇は、TCRα遺伝子座に組み込まれた抗CD19 CARを含有するゲノム編集されたT細胞におけるT細胞枯渇と比較した。
プロモーターを含有するアデノ随伴ウイルス(AAV)プラスミド、抗CD19 CARをコードするトランス遺伝子、およびポリアデニル化シグナルを、設計し、構築し、検証した。組換えAAV(rAAV)を、複製、カプシド、およびアデノウイルスヘルパーエレメントに必要性をもたらす1つ以上のプラスミドでHEK 293T細胞を一時的に同時遺伝子導入することによって調製した。rAAVは、イオジキサノール系勾配における超遠心分離を使用して同時遺伝子導入したHEK 293T細胞培地から精製した。
レンチウイルスベクターは、CD8α由来のシグナルペプチド、抗CD19 scFv、CD8α由来のヒンジ領域、および膜貫通ドメイン、細胞内4−1BB共刺激ドメイン、およびCD3ζシグナル伝達ドメインを含むCARに作動可能に連結されたMNDプロモーターを含むCAR発現カセットを含有した。レンチウイルスを、確立されたプロトコルを用いて調製した。例えば、Kutner et al.,BMC Biotechnol.2009;9:10.doi:10.1186/1472−6750−9−10、Kutner et al.Nat.Protoc.2009;4(4):495−505.doi:10.1038/nprot.2009.22を参照されたい。
一次ヒトT細胞を、実施例1に記載されるように、CD3およびCD28で活性化した。活性化した一次ヒトT細胞を、インビトロで転写されたメガTAL mRNAで電気穿孔し、抗CD19 CARトランス遺伝子(HR−CAR T細胞)をコードするrAAV標的化ベクターで形質導入したか、または活性化した一次ヒトT細胞を、抗CD19 CARをコードするレンチウイルスで形質導入した(LV−CAR T細胞)。
LV−TおよびHR−T細胞を、エフェクター(E)細胞対標的(T)細胞の比を1:1で、CD19を発現するNalm−6細胞で共培養した。T細胞枯渇マーカー発現(PD−L1、PD−1、およびTim−3)を、24時間および72時間の共培養で測定した。24時間で、HR−CAR T細胞は、LV−CAR T細胞と比較してPD−1およびPD−L1の上方調節の低減を示した。図11A。72時間で、HR−CAR T細胞は、LV−CAR T細胞と比較してPD−1およびTim−3の上方調節の低減を示した。図11B。
概して、続く特許請求の範囲において、使用される用語は、本明細書および特許請求の範囲に開示される特定の実施形態に特許請求の範囲を限定するものと解釈されるべきではなく、可能性のある全ての実施形態を、かかる特許請求の範囲が権利を有する同等物の全範囲と共に含むものと解釈されるべきである。したがって、特許請求の範囲は、開示により制限されない。
Claims (80)
- 1つ以上の改変されたT細胞受容体アルファ(TCRα)対立遺伝子を含むキメラ抗原受容体(CAR)T細胞であって、前記CAR T細胞が、標的抗原に結合したとき、1つ以上の改変されたTCRα対立遺伝子を欠いている前記標的抗原に結合したCAR T細胞と比較して、増加した量の炎症性サイトカインを分泌する、CAR T細胞。
- 前記CARが、BCMA、CD19、CSPG4、PSCA、ROR1、およびTAG72からなる群から選択される標的抗原に結合する細胞外ドメインを含む、請求項1に記載のCAR T細胞。
- 前記CARは、前記T細胞受容体のアルファ鎖またはベータ鎖、CD3δ、CD3ε、CD3γ、CD3ζ、CD4、CD5、CD8α、CD9、CD16、CD22、CD27、CD28、CD33、CD37、CD45、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD152、CD154、およびPD−1からなる群から選択されるポリペプチドから単離された膜貫通ドメインを含む、請求項1または請求項2に記載のCAR T細胞。
- 前記CARが、TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、CARD11、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CD54(ICAM)、CD83、CD134(OX40)、CD137(4−1BB)、CD278(ICOS)、DAP10、LAT、NKD2C、SLP76、TRIM、およびZAP70からなる群から選択されるポリペプチドから単離された1つ以上の細胞内共刺激シグナル伝達ドメインを含む、請求項1〜3のいずれか1項に記載のCAR T細胞。
- 前記CARが、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD22、CD79a、CD79b、およびCD66dからなる群から選択されるポリペプチドから単離されたシグナル伝達ドメインを含む、請求項1〜4のいずれか1項に記載のCAR T細胞。
- 前記CARが、CD8αのヒンジ領域、PD1のヒンジ領域、およびCD152のヒンジ領域からなる群から選択されるヒンジ領域ポリペプチドを含む、請求項1〜5のいずれか1項に記載のCAR T細胞。
- 前記CARが、1つ以上のリンカーポリペプチドを含む、請求項1〜6のいずれか1項に記載のCAR T細胞。
- 前記CARが、IgG1、IgG4、またはIgDのCH2およびCH3領域を含むスペーサー領域ポリペプチドを含む、請求項1〜7のいずれか1項に記載のCAR T細胞。
- 前記CARが、IgG1重鎖シグナルポリペプチド、CD8αシグナルポリペプチド、およびヒトGM−CSF受容体アルファシグナルポリペプチドからなる群から選択されるシグナルペプチドを含む、請求項1〜8のいずれか1項に記載のCAR T細胞。
- 前記1つ以上の改変されたTCRα対立遺伝子が、非機能性であるか、または実質的に減少した機能を有する、請求項1〜9のいずれか1項に記載のCAR T細胞。
- 前記CAR T細胞が、前記CARをコードする核酸を含む1つ以上のプロウイルス組み込み体を含む、請求項1〜10のいずれか1項に記載のCAR T細胞。
- 前記CAR T細胞が、前記CARをコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含むポリヌクレオチドを含み、前記ポリヌクレオチドが、相同組換え修復によって前記1つ以上のTCRα対立遺伝子に挿入されている、請求項1〜10のいずれか1項に記載のCAR T細胞。
- 前記1つ以上の炎症性サイトカインが、IFNγ、IL−4、IL−10、TNFα、IL−8、IL−5、IL−6、GM−CSF、およびMIP−1αからなる群から選択される、請求項1〜12のいずれか1項に記載のCAR T細胞。
- CAR T細胞であって、
a)1つ以上の改変されたTCRα対立遺伝子と、
b)標的抗原に結合するCARをコードする核酸と、を含み、
前記CAR T細胞が、前記標的抗原を発現する標的細胞と接触したとき、1つ以上の改変されたTCRα対立遺伝子を欠いている前記標的抗原に結合したCAR T細胞と比較して、増加した量の1つ以上の炎症性サイトカインを分泌する、CAR T細胞。 - CAR T細胞であって、
a)1つ以上の改変されたTCRα対立遺伝子と、
b)標的抗原に結合するCARをコードする核酸を含む1つ以上のプロウイルス組み込み体と、を含み、
前記CAR T細胞が、標的抗原に結合したとき、1つ以上の改変されたTCRα対立遺伝子を欠いている前記標的抗原に結合したCAR T細胞と比較して、増加した量の1つ以上の炎症性サイトカインを分泌する、CAR T細胞。 - 1つ以上の改変されたTCRα対立遺伝子を含むCAR T細胞であって、標的抗原に結合するCARをコードする核酸を含むドナー修復テンプレートが、相同組換え修復によって前記1つ以上のTCRα対立遺伝子に挿入され、前記CAR T細胞が、標的抗原に結合したとき、1つ以上の改変されたTCRα対立遺伝子を欠いている前記標的抗原に結合したCAR T細胞と比較して、増加した量の1つ以上の炎症性サイトカインを分泌する、CAR T細胞。
- 前記核酸が、前記CARをコードする前記ポリヌクレオチドに作動可能に連結されたRNAポリメラーゼIIプロモーターをさらに含む、請求項14〜16のいずれか1項に記載のCAR T細胞。
- 前記RNAポリメラーゼIIプロモーターが、短いEF1αプロモーター、長いEF1αプロモーター、ヒトROSA 26遺伝子座、ユビキチンC(UBC)プロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼ−1(PGK)プロモーター、サイトメガロウイルスエンハンサー/ニワトリβ−アクチン(CAG)プロモーター、β−アクチンプロモーター、および骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサー、負の制御領域欠失、dl587revプライマー結合部位置換(MND)プロモーターからなる群から選択される、請求項17に記載のCAR T細胞。
- 前記CARが、BCMA、CD19、CSPG4、PSCA、ROR1、およびTAG72からなる群から選択される抗原に結合する細胞外ドメインを含む、請求項14〜18のいずれか1項に記載のCAR T細胞。
- 前記CARが、膜貫通ドメインおよび1つ以上の細胞内シグナル伝達ドメインをさらに含む、請求項14〜19のいずれか1項に記載のCAR T細胞。
- 前記CARが、膜貫通ドメイン、共刺激ドメイン、および一次シグナル伝達ドメインを含む、請求項14〜20のいずれか1項に記載のCAR T細胞。
- 前記CARが、シグナルペプチド、1つ以上のリンカーペプチド、および1つ以上のヒンジペプチド、ならびに任意に、1つ以上のスペーサーペプチドをさらに含む、請求項14〜21のいずれか1項に記載のCAR T細胞。
- 前記CARが、抗BCMA scFv、CD8α膜貫通ドメイン、CD137共刺激ドメイン、およびCD3ζ一次シグナル伝達ドメインを含む、請求項14〜21のいずれか1項に記載のCAR T細胞。
- 前記CARが、抗CD19 scFv、CD8α膜貫通ドメイン、CD137共刺激ドメイン、およびCD3ζ一次シグナル伝達ドメインを含む、請求項14〜21のいずれか1項に記載のCAR T細胞。
- 前記CARが、抗CSPG4 scFv、CD8α膜貫通ドメイン、CD137共刺激ドメイン、およびCD3ζ一次シグナル伝達ドメインを含む、請求項14〜21のいずれか1項に記載のCAR T細胞。
- 前記CARが、抗ROR1 scFv、CD8α膜貫通ドメイン、CD137共刺激ドメイン、およびCD3ζ一次シグナル伝達ドメインを含む、請求項14〜21のいずれか1項に記載のCAR T細胞。
- 前記CARが、抗PSCA scFv、CD8α膜貫通ドメイン、CD137共刺激ドメイン、およびCD3ζ一次シグナル伝達ドメインを含む、請求項14〜21のいずれか1項に記載のCAR T細胞。
- 前記CARが、抗TAG72 scFv、CD8α膜貫通ドメイン、CD137共刺激ドメイン、およびCD3ζ一次シグナル伝達ドメインを含む、請求項14〜21のいずれか1項に記載のCAR T細胞。
- 前記1つ以上の炎症性サイトカインが、IFNγ、IL−4、IL−10、TNFα、IL−8、IL−5、IL−6、GM−CSF、およびMIP−1αからなる群から選択される、請求項14〜28のいずれか1項に記載のCAR T細胞。
- 請求項1〜29のいずれか1項に記載のCAR T細胞を含む、組成物。
- 請求項1〜29のいずれか1項に記載のCAR T細胞と、生理学的に許容される賦形剤と、を含む、組成物。
- CAR T細胞を作製する方法であって、
a)TCRα対立遺伝子における標的部位で二本鎖切断を操作することであって、前記切断が、非相同末端連結(NHEJ)によって修復され、それによって、改変されたTCRα対立遺伝子を生成する、操作することと、
b)CARをコードするウイルスベクターを前記T細胞に形質導入することと、を含み、
前記CAR T細胞が、標的抗原に結合したとき、改変されたTCRα対立遺伝子を欠いている前記標的抗原に結合したCAR T細胞と比較して、増加した量の1つ以上の炎症性サイトカインを分泌する、方法。 - 前記改変されたTCRα対立遺伝子が、非機能性であるか、または実質的に減少した機能を有する、請求項32に記載の方法。
- 前記ウイルスベクターが、レトロウイルスベクターである、請求項32または請求項33に記載の方法。
- 前記レトロウイルスベクターが、レンチウイルスベクターである、請求項34に記載の方法。
- CAR T細胞を作製する方法であって、
a)TCRα対立遺伝子における標的部位で二本鎖切断を操作することと、
b)前記T細胞に、CARをコードする核酸に作動可能に連結されたRNAポリメラーゼIIプロモーターを含むドナー修復テンプレートを含むウイルスベクターを形質導入することと、を含み、
前記ドナー修復テンプレートが、前記二本鎖切断(DSB)の前記部位で相同組換え修復によって前記TCRα対立遺伝子に組み込まれ、
前記CAR T細胞が、標的抗原に結合したとき、改変されたTCRα対立遺伝子を欠いている前記標的抗原に結合したCAR T細胞と比較して、増加した量の1つ以上の炎症性サイトカインを分泌する、方法。 - 前記ドナー修復テンプレートが、前記DSBの5´のTCRα配列に相同な5´相同アームと、前記DSBの3´のTCRα配列に相同な3´相同アームとを含む、請求項36に記載の方法。
- 前記ウイルスベクターが、組換えアデノ随伴ウイルスベクター(rAAV)またはレトロウイルスである、請求項36または37に記載の方法。
- 前記rAAVが、AAV2からの1つ以上のITRを有する、請求項38に記載の方法。
- 前記rAAVが、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、およびAAV10からなる群から選択される血清型を有する、請求項38または請求項39に記載の方法。
- 前記レトロウイルスが、レンチウイルスである、請求項38に記載の方法。
- 前記レンチウイルスが、インテグラーゼ欠損レンチウイルスである、請求項41に記載の方法。
- 前記二本鎖切断が、操作されたヌクレアーゼで生成される、請求項32〜42のいずれか1項に記載の方法。
- 前記操作されたヌクレアーゼが、メガヌクレアーゼ、メガTAL、TALEN、ZFN、またはCRISPR/Casヌクレアーゼからなる群から選択される、請求項42に記載の方法。
- 前記メガヌクレアーゼが、I−OnuI LHEから操作される、請求項43または請求項44に記載の方法。
- 前記操作されたヌクレアーゼが、TALE DNA結合ドメインおよび操作されたメガヌクレアーゼを含むメガTALである、請求項43または請求項44に記載の方法。
- 前記二本鎖切断が、操作されたエンドヌクレアーゼおよび末端プロセシング酵素によって生じる、請求項32〜46のいずれか1項に記載の方法。
- 前記操作されたエンドヌクレアーゼをコードするmRNAおよび前記末端プロセシング酵素をコードするmRNAが、前記T細胞に導入されて、前記二本鎖切断を生じさせる、請求項47に記載の方法。
- 前記操作されたエンドヌクレアーゼをコードするmRNA、ウイルス自己切断ペプチド、および末端プロセシング酵素が、前記T細胞に導入されて、前記二本鎖切断を生じさせる、請求項47に記載の方法。
- 前記操作されたエンドヌクレアーゼをコードするmRNA、IRES要素、および末端プロセシング酵素が、前記T細胞に導入されて、前記二本鎖切断を生じさせる、請求項47に記載の方法。
- 末端プロセシング酵素またはその生物学的に活性な断片に融合された前記操作されたエンドヌクレアーゼをコードするmRNAが、前記T細胞に導入されて、前記二本鎖切断を生じさせる、請求項47に記載の方法。
- 前記末端プロセシング酵素が、5´−3´エキソヌクレアーゼ、5´−3´アルカリ性エキソヌクレアーゼ、3´−5´エキソヌクレアーゼ、5´フラップエンドヌクレアーゼ、ヘリカーゼ、またはテンプレート依存性DNAポリメラーゼ活性を示す、請求項47〜51のいずれか1項に記載の方法。
- 前記末端プロセシング酵素が、Trex2またはその生物学的に活性な断片を含む、請求項47〜52のいずれか1項に記載の方法。
- 前記1つ以上の炎症性サイトカインが、IFNγ、IL−4、IL−10、TNFα、IL−8、IL−5、IL−6、GM−CSF、およびMIP−1αからなる群から選択される、請求項32〜53のいずれか1項に記載の方法。
- 対象におけるがんを治療する方法であって、前記対象に、請求項1〜29のいずれか1項に記載のCAR T細胞、または請求項30もしくは請求項31に記載の組成物を投与することを含む、方法。
- 腫瘍を排除するために前記対象に投与される改変されたTCRα対立遺伝子を含むCAR T細胞の治療上有効量が、前記腫瘍を排除するために前記対象に投与される改変されたTCRαを欠いているCAR T細胞の治療上有効量より少ない、請求項55に記載の方法。
- 前記がんが、固形がんである、請求項55または請求項56に記載の方法。
- 前記がんが、液性がんである、請求項55または請求項56に記載の方法。
- 前記液性がんが、急性リンパ球性白血病(ALL)、急性骨髄性白血病(AML)、骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性、赤白血病、有毛細胞白血病(HCL)、慢性リンパ球性白血病(CLL)、および慢性骨髄性白血病(CML)、慢性骨髄単球性白血病(CMML)、および真性赤血球増加症、ホジキンリンパ腫、結節性リンパ球優位型ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、小リンパ球性リンパ腫(SLL)、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、免疫芽球性大細胞型リンパ腫、前駆Bリンパ芽球性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、菌状息肉腫、菌状息肉腫、未分化大細胞リンパ腫、セザリー症候群、前駆Tリンパ芽球性リンパ腫、多発性骨髄腫、顕性多発性骨髄腫、くすぶり多発性骨髄腫、形質細胞白血病、非分泌性骨髄腫、IgD骨髄腫、骨硬化性骨髄腫、骨の孤立性形質細胞腫、ならびに髄外性形質細胞腫からなる群から選択される血液学的悪性腫瘍である、請求項58に記載の方法。
- 前記血液学的悪性腫瘍が、多発性骨髄腫である、請求項56に記載の方法。
- 前記血液学的悪性腫瘍が、CLLである、請求項56に記載の方法。
- 治療を必要とする対象におけるB細胞関連状態を治療する方法であって、前記対象に、治療上有効量の請求項1〜29のいずれか1項に記載のCAR T細胞、または前記対象に、治療上有効量の請求項30もしくは請求項31に記載の組成物を投与することを含む、方法。
- 前記B細胞関連状態が、多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、不確定な悪性度のB細胞増殖、リンパ腫様肉芽腫症、移植後リンパ増殖性障害、免疫調節性障害、関節リウマチ、重症筋無力症、特発性血小板減少性紫斑病、抗リン脂質抗体症候群、シャーガス病、グレーブス病、ウェゲナー肉芽腫症、結節性多発動脈炎、シェーグレン症候群、尋常性天疱瘡、強皮症、多発性硬化症、抗リン脂質抗体症候群、ANCA関連血管炎、グッドパスチャー病、川崎病、自己免疫性溶血性貧血、および急速進行性糸球体腎炎、重鎖病、原発性もしくは免疫細胞関連アミロイドーシス、または意義不明の単クローン性ガンマグロブリン血症である、請求項62に記載の方法。
- 前記B細胞関連状態が、B細胞悪性腫瘍である、請求項63に記載の方法。
- 前記B細胞関連状態が、形質細胞悪性腫瘍である、請求項63に記載の方法。
- 前記B細胞関連状態が、自己免疫疾患である、請求項63に記載の方法。
- CAR T細胞の有効性を増大させる方法であって、TCRα対立遺伝子における標的部位で二本鎖切断(DSB)を形成する操作されたヌクレアーゼを導入して、前記TCRα対立遺伝子を改変させることによって、前記CAR T細胞表面上のTCRαシグナル伝達成分の利用能を低減させることを含む、方法。
- 前記CAR T細胞が、前記CARをコードする1つ以上のプロウイルス組み込み体を含み、前記DSBが、非相同末端連結(NHEJ)によって修復される、請求項67に記載の方法。
- 前記CAR T細胞が、前記DSBで相同組換え修復により前記TCRα対立遺伝子に組み込まれるCARをコードする核酸に作動可能に連結されたRNAポリメラーゼIIプロモーターを含む、請求項67に記載の方法。
- 前記操作されたヌクレアーゼが、メガヌクレアーゼ、メガTAL、TALEN、ZFN、またはCRISPR/Casヌクレアーゼからなる群から選択される、請求項67〜69のいずれか1項に記載の方法。
- 前記メガヌクレアーゼが、I−OnuI LHEから操作される、請求項70に記載の方法。
- 前記操作されたヌクレアーゼが、TALE DNA結合ドメインおよび操作されたメガヌクレアーゼを含むメガTALである、請求項70に記載の方法。
- 前記二本鎖切断が、操作されたエンドヌクレアーゼおよび末端プロセシング酵素によって生じる、請求項67〜69のいずれか1項に記載の方法。
- 前記操作されたエンドヌクレアーゼをコードするmRNA、および前記末端プロセシング酵素をコードするmRNAが、前記T細胞に導入されて、前記二本鎖切断を生じさせる、請求項73に記載の方法。
- 前記操作されたエンドヌクレアーゼをコードするmRNA、ウイルス自己切断ペプチド、および末端プロセシング酵素が、前記T細胞に導入されて、前記二本鎖切断を生じさせる、請求項73に記載の方法。
- 前記操作されたエンドヌクレアーゼをコードするmRNA、IRES要素、および末端プロセシング酵素が、前記T細胞に導入されて、前記二本鎖切断を生じさせる、請求項73に記載の方法。
- 末端プロセシング酵素またはその生物学的に活性な断片に融合された前記操作されたエンドヌクレアーゼをコードするmRNAが、前記T細胞に導入されて、前記二本鎖切断を生じさせる、請求項73に記載の方法。
- 前記末端プロセシング酵素が、5´−3´エキソヌクレアーゼ、5´−3´アルカリ性エキソヌクレアーゼ、3´−5´エキソヌクレアーゼ、5´フラップエンドヌクレアーゼ、ヘリカーゼ、またはテンプレート依存性DNAポリメラーゼ活性を示す、請求項74〜77のいずれか1項に記載の方法。
- 前記末端プロセシング酵素が、Trex2またはその生物学的に活性な断片を含む、請求項74〜78のいずれか1項に記載の方法。
- 標的抗原に結合した前記CAR T細胞が、改変されたTCRα対立遺伝子を欠いている前記標的抗原に結合したCAR T細胞と比較して増加した量の、IFNγ、IL−4、IL−10、TNFα、IL−8、IL−5、IL−6、GM−CSF、およびMIP−1αからなる群から選択される1つ以上の炎症性サイトカインを分泌する、請求項67〜78のいずれか1項に記載の方法。
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