CN109777782A - 一种通用型car-t细胞及其制备方法和用途 - Google Patents
一种通用型car-t细胞及其制备方法和用途 Download PDFInfo
- Publication number
- CN109777782A CN109777782A CN201910116481.5A CN201910116481A CN109777782A CN 109777782 A CN109777782 A CN 109777782A CN 201910116481 A CN201910116481 A CN 201910116481A CN 109777782 A CN109777782 A CN 109777782A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cell
- sequence
- car
- seq
- universal car
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title abstract description 9
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 26
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 claims abstract description 25
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 claims abstract description 16
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 claims abstract description 16
- 101150058049 car gene Proteins 0.000 claims abstract description 13
- 238000010354 CRISPR gene editing Methods 0.000 claims abstract description 11
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 88
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 69
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 31
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 claims description 25
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 21
- 108091027544 Subgenomic mRNA Proteins 0.000 claims description 15
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 claims description 14
- 108091081062 Repeated sequence (DNA) Proteins 0.000 claims description 11
- 210000004907 gland Anatomy 0.000 claims description 9
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 9
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 9
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims description 8
- 238000005215 recombination Methods 0.000 claims description 8
- 230000005611 electricity Effects 0.000 claims description 7
- 230000008685 targeting Effects 0.000 claims description 7
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 6
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 6
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 6
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 6
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 6
- 230000006798 recombination Effects 0.000 claims description 6
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 claims description 5
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims description 5
- 101150038500 cas9 gene Proteins 0.000 claims description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 4
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 claims description 4
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 4
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 claims description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 3
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 claims description 3
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 claims description 2
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 claims description 2
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 claims description 2
- 208000030961 allergic reaction Diseases 0.000 claims description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 2
- 239000008024 pharmaceutical diluent Substances 0.000 claims description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 2
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 claims description 2
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 claims description 2
- 238000012795 verification Methods 0.000 claims description 2
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 claims 1
- 206010025135 lupus erythematosus Diseases 0.000 claims 1
- 230000007096 poisonous effect Effects 0.000 claims 1
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 abstract description 27
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 abstract description 13
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 abstract description 10
- 238000001802 infusion Methods 0.000 abstract description 6
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 abstract description 5
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 abstract description 4
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 abstract description 3
- 206010050685 Cytokine storm Diseases 0.000 abstract description 2
- 206010052015 cytokine release syndrome Diseases 0.000 abstract description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 39
- 108010019670 Chimeric Antigen Receptors Proteins 0.000 description 33
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 21
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 16
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 11
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 8
- 241000972680 Adeno-associated virus - 6 Species 0.000 description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 7
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 7
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 7
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 6
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 6
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 6
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 5
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 5
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 5
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 5
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 5
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 5
- 102100024222 B-lymphocyte antigen CD19 Human genes 0.000 description 4
- 101000980825 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD19 Proteins 0.000 description 4
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 4
- 230000006044 T cell activation Effects 0.000 description 4
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 4
- 230000007541 cellular toxicity Effects 0.000 description 4
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 230000006870 function Effects 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 231100000820 toxicity test Toxicity 0.000 description 4
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 4
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 4
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 4
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 description 3
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 3
- 238000001994 activation Methods 0.000 description 3
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 3
- 238000013461 design Methods 0.000 description 3
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 3
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 3
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 3
- 208000024908 graft versus host disease Diseases 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 3
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 3
- 239000002574 poison Substances 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 3
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 2
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 2
- -1 IFN-r Proteins 0.000 description 2
- 108010002586 Interleukin-7 Proteins 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 2
- 102000017578 LAG3 Human genes 0.000 description 2
- 101150030213 Lag3 gene Proteins 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- 238000010459 TALEN Methods 0.000 description 2
- 108010043645 Transcription Activator-Like Effector Nucleases Proteins 0.000 description 2
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 2
- 102100040247 Tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 230000030741 antigen processing and presentation Effects 0.000 description 2
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 2
- 229940041181 antineoplastic drug Drugs 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 2
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- MURGITYSBWUQTI-UHFFFAOYSA-N fluorescin Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1C1C2=CC=C(O)C=C2OC2=CC(O)=CC=C21 MURGITYSBWUQTI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 238000012858 packaging process Methods 0.000 description 2
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 238000010008 shearing Methods 0.000 description 2
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 230000005909 tumor killing Effects 0.000 description 2
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 2
- 102100023990 60S ribosomal protein L17 Human genes 0.000 description 1
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 1
- 206010000830 Acute leukaemia Diseases 0.000 description 1
- 108010083359 Antigen Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000006306 Antigen Receptors Human genes 0.000 description 1
- 208000004736 B-Cell Leukemia Diseases 0.000 description 1
- 108010001857 Cell Surface Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000000844 Cell Surface Receptors Human genes 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 208000009329 Graft vs Host Disease Diseases 0.000 description 1
- 102100034458 Hepatitis A virus cellular receptor 2 Human genes 0.000 description 1
- 101710083479 Hepatitis A virus cellular receptor 2 homolog Proteins 0.000 description 1
- 101000914514 Homo sapiens T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Proteins 0.000 description 1
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 1
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 206010054949 Metaplasia Diseases 0.000 description 1
- 101100180399 Mus musculus Izumo1r gene Proteins 0.000 description 1
- 208000015914 Non-Hodgkin lymphomas Diseases 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 239000012124 Opti-MEM Substances 0.000 description 1
- 101710089372 Programmed cell death protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000004389 Ribonucleoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010081734 Ribonucleoproteins Proteins 0.000 description 1
- 229940126547 T-cell immunoglobulin mucin-3 Drugs 0.000 description 1
- 102100027213 T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Human genes 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 230000000961 alloantigen Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 208000016361 genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000036449 good health Effects 0.000 description 1
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 210000005096 hematological system Anatomy 0.000 description 1
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 1
- 208000005252 hepatitis A Diseases 0.000 description 1
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 239000003999 initiator Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 239000011229 interlayer Substances 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 230000002045 lasting effect Effects 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000015689 metaplastic ossification Effects 0.000 description 1
- 239000011325 microbead Substances 0.000 description 1
- 239000007758 minimum essential medium Substances 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 230000002688 persistence Effects 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 238000004064 recycling Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000012827 research and development Methods 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001502 supplementing effect Effects 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 208000006379 syphilis Diseases 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 238000012384 transportation and delivery Methods 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000008827 tuberculosis Diseases 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 1
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
- A61K39/4643—Vertebrate antigens
- A61K39/4644—Cancer antigens
- A61K39/464402—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- A61K39/464411—Immunoglobulin superfamily
- A61K39/464412—CD19 or B4
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
- A61K39/4611—T-cells, e.g. tumor infiltrating lymphocytes [TIL], lymphokine-activated killer cells [LAK] or regulatory T cells [Treg]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/463—Cellular immunotherapy characterised by recombinant expression
- A61K39/4631—Chimeric Antigen Receptors [CAR]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/463—Cellular immunotherapy characterised by recombinant expression
- A61K39/4632—T-cell receptors [TCR]; antibody T-cell receptor constructs
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/08—Antiallergic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
- C12N15/864—Parvoviral vectors, e.g. parvovirus, densovirus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
- C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
- A61K2239/27—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterized by targeting or presenting multiple antigens
- A61K2239/30—Mixture of cells
Abstract
本发明公开了一种使CAR的表达受控于内源性启动子的生理性通用型CAR‑T细胞及其制备方法和用途。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除TCR恒定区基因,同时使用AAV介导的基因同源重组技术在TCR恒定区精准***CAR基因。从而获得受内源性启动子调控的CAR表达,将CAR的表达水平控制在正常生理范围内的通用型CAR‑T。这种CAR‑T的特点可异体输注,CAR的表达处于生理水平且均匀一致,没有显著的细胞因子风暴,更安全。本发明还涉及所述CAR‑T细胞的在抗肿瘤方面的应用。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药领域,具体地涉及通用型CAR-T细胞及其制备方法和用途。
背景技术
CAR-T是利用能够与特定抗原结合的抗体片段来识别肿瘤细胞表面的抗原的经过改造的T细胞。近年来,CD19抗原特异性CAR-T细胞用于治疗B细胞白血病和淋巴瘤临床试验中,显示出极高的反应率及持续的疾病缓解效果。嵌合抗原受体(CAR)赋予T细胞HLA非依赖的方式识别肿瘤抗原的能力,这使得经过CAR改造的T细胞相对于天然T细胞表面受体TCR能够识别更广泛的目标。近年来,CAR-T技术在急性白血病和非霍奇金淋巴瘤的治疗上有着显著的疗效,被认为是最有前景的肿瘤治疗方式之一。
CAR-T治疗的原理如下:通过基因工程修饰,使体外分离收集的癌症患者的T细胞表达识别单一肿瘤抗原的嵌合抗原受体(CAR),并在体外大量扩增CAR-T细胞后将其输回癌症患者体内进行细胞免疫治疗。CAR作为一种基因表达的嵌合蛋白包含与T细胞信号传导结构域连接的、抗体的抗原结合结构域(如:单链抗体scFv)。CAR-T细胞过继性免疫的显著优势在于:细胞免疫治疗更具精确性。CAR-T细胞过继免疫治疗***应用基因修饰病人自体的T细胞,利用抗原抗体结合原理规避了依赖MHC限制的抗原呈递,从而具有精确的靶向性。同时克服了肿瘤细胞可能通过下调MHC分子表达以降低抗原呈递的免疫逃逸。
目前CAR-T疗法的研发主要集中在CAR的构建,通过多方面的修饰以增强CAR-T细胞的靶向性,免疫杀伤性、效用持久性及安全性。尽管CAR的构建已取得了诸多显著进展,然而,基于传统的CAR-T细胞过继性免疫治疗***始终存在以下明显缺陷:(1)只能自体输注。目前CAR-T治疗血液***疾病虽然能够取得很好的疗效,但是只能自体输注,即从患者体内抽取T细胞,进行基因修饰后扩增,然后再回输给患者。因此这种治疗方式不能像药物一样广泛应用。有的患者由于无法获得足够数量的T细胞而无法进行CAR-T回输,丧失了治疗的可能性。(2)制备繁琐:每一套靶向某单一肿瘤相关抗原的CAR-T***均需要单独构建,并通过实验检测其安全性、靶向性和有效性,应用于临床的评价周期较长,耗时费力,经济性较差。(3)在CAR-T细胞过继免疫治疗过程中,对CAR-T细胞在体内的靶向能力、生物代谢情况缺乏有效的评价和监控手段,因而常导致治疗过度或治疗无效。
现在绝大多数的CAR-T临床实验都是使用的自体型CAR-T,但是病人自身的T细胞通常都存在质量与数量的缺陷;且自体型CAR-T的生产成本更加昂贵,大约为通用型CAR-T的五倍;自体型CAR-T需要私人定制,而通用型CAR-T能够做到现货供应(off-the-sheff),节约时间。然而异体型T细胞上的抗原受体TCR可能会识别接受者体内的异体抗原,从而引发移植物抗宿主病(GVHD);此外,异体T细胞上的HLA表达也会迅速地引起宿主免疫细胞排斥反应。因此使用ZFNs,TALENs以及CRISPR/Cas9等基因编辑工具,敲除异体T细胞上的TCR,MHC以及相关信号通路基因,从而防止异体型CAR-T的宿主排斥反应,是实现通用型CAR-T的关键一步。
CRISPR/Cas9是现在应用最广泛,研究最深入的基因编辑工具。与TALENs和ZFNs相比,CRISRP/Cas9的精确性更高,能降低脱靶效应带来的副作用;设计简单,更利于规模化生产。虽然Novartis和Juno早在2015年就开始与CRISPR相关公司合作开发下一代CAR-T产品,但是现在还没有更多进展更新被报道。采用CRISPR/Cas9编辑T细胞基因组是相当困难的,CRISPR/Cas9的delievry方法主要包括慢病毒,腺病毒,AAV等病毒载体递送,使用质粒或者核糖核蛋白RNP电转,或者是使用编码Cas9的mRNA与sgRNA共电转。虽然使用质粒DNA核转能够编辑T细胞基因,但是DNA核转对于T细胞的毒性非常大,不利于T细胞编辑的大规模应用。
在CAR蛋白在T细胞表面表达的过程中,需要借助病毒载体,通过DNA合成技术合成能够在细胞中表达CAR蛋白的DNA序列;然后通过分子克隆技术将CAR的DNA序列装进质粒载体的更长的环状DNA中。质粒载体把装在多克隆位点的基因或DNA序列在细胞中表达成蛋白质。质粒载体DNA是经过人工改造的,包含其他的DNA组件比如表达抗生素的基因序列、启动子序列、多克隆位点(multiple cloning site,MCS)等等,并且,其可以和其他一些经过基因工程改造的辅助质粒(helper plasmid)一起在工程细胞(比如293T细胞)中自动组装成有感染(infection)能力的慢病毒。这样的慢病毒就具有在细胞中表达CAR蛋白的作用。将这样的慢病毒加入培养T细胞的培养基中,其就能够感染T细胞,即进入T细胞,然后利用T细胞内的元素来表达CAR蛋白,这些CAR蛋白表达之后就锚定在T细胞的表面。目前通常采用病毒介导的基因表达技术,比如慢病毒(lentivirus)、逆转录病毒(retrovirus)、腺病毒(adenovirus)、腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)等。
然而,这些病毒技术都有一定的不足,例如主要就在于慢病毒和逆转录病毒进入细胞之后,就会随机地***(insertion)到基因组中,而腺病毒也会有一定的概率***到基因组中,都可能会破坏细胞中的基因,从而导致细胞异常,甚至可能会让细胞转变成肿瘤细胞,进而引发肿瘤。因此,采用这些病毒技术来制备CART进行细胞免疫治疗会有引发肿瘤的风险。
发明内容
本发明针对上述缺陷,利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对来自健康志愿者(donor)的T细胞进行基因编辑,使用重组腺相关病毒载体将CAR基因同源重组到TCR恒定区基因,获得受内源性启动子调控的生理性通用型CAR-T。
具体的,本发明涉及一种通用型CAR-T细胞,所述T细胞的TCR恒定区基因同源重组一段编码CAR基因的序列。具体的,所述同源重组是通过重组腺相关病毒载体实现的,所述同源重组是T细胞的TCR恒定区基因的外显子前。
另一方面,本发明还涉及一种制备通用型CAR-T细胞的方法,所述方法包括如下步骤:1)在T细胞中引入sgRNA分子和Cas9分子敲除TCR基因;2)在所述T细胞中引入包含CAR分子的重组腺相关病毒载体;其中,步骤2)在步骤1)之后2小时内进行,并且所述sgRNA分子包含TCR恒定区域外显子上下游各250bp的靶区域互补的靶向结构域。
所述方法在步骤1)之前还包括分离和/或激活健康志愿者(或供者)的T细胞的步骤;优选地,所述方法在步骤2)之后还包括对通用型CAR-T细胞进行分选的步骤;更优选地,分选之后再对所得的通用型CAR-T细胞进行有效性验证。
26.其中,所述腺相关病毒载体包含如下操作性连接的序列元件:5’末端反向重复序列(5’ITR)、3’末端反向重复序列(3’ITR)及编码CAR基因的序列。
优选的,所述腺相关病毒载体还可进一步包含如下操作性连接的序列元件:SA序列、2A序列、PolyA序列、5’和3’HA序列和5’、3’末端反向重复序列。
所述的5’基因组同源(5’HA)序列包含SEQ ID NO:1所示的序列;
所述的SA序列包含SEQ ID NO:2所示的序列;
所述的2A序列包含SEQ ID NO:3所示的序列;
所述的CD19CAR(4-1BB)序列包含SEQ ID NO:4所示的序列;
所述的PolyA序列包含SEQ ID NO:5所示的序列;
所述的3’基因组同源(3’HA)序列包含SEQ ID NO:6所示的序列;
所述的5’末端反向重复序列包含SEQ ID NO:7所示的序列;
所述的3’末端反向重复序列包含SEQ ID NO:8所示的序列;
进一步的,所述重组腺相关病毒载体包含与SEQ ID NO:9所示的序列具有至少约70%、至少约80%、至少约90%序列同一性或更多的序列同一性的核苷酸序列。
本发明还涉及所述的重组腺相关病毒载体的制备方法,所述方法包括以下步骤:提供前述病毒载体的包装细胞系;和从所述包装细胞系的上清液中回收重组AAV病毒。
本发明还涉及一种重组腺相关病毒,所述病毒由前述任意的重组腺相关病毒载体包装获得。
另一方面,本发明还涉及一种用于表达CAR基因的方法,所述方法包括提供包括编码前述任意的重组腺相关病毒(AAV)的核苷酸序列;和将所述重组AAV转染T细胞,所述重组AAV在T细胞中原位整合到TCR区域,在内源性启动子的调控下表达所述CAR基因。
另一方面,本发明还涉及前述任意的重组腺相关病毒载体、重组腺相关病毒在制备CAR-T细胞或抗肿瘤药物中的应用。
另一方面,本发明还涉及前述一种重组腺相关病毒载体的CAR-T细胞制备方法,该方法包括如下步骤:
第一步,构建前述任意的重组腺相关病毒载体;
第二步,病毒包装;
第三步,T细胞分离及激活、CRISPR/cas9基因编辑,AAV介导的基因同源重组(共刺激结构域基因转导)、T细胞扩增;
前述任意的重组腺相关病毒载体是通过基因工程手段,将其表达于癌症患者或健康人外周血中分离收集的T细胞以获得CAR-T细胞。
因此,本发明还涉及由上述方法制备获得的CAR-T细胞。
本发明还涉及一种试剂盒,所述试剂盒中包含前述任意的重组腺相关病毒载体、重组腺相关病毒,或所述CAR-T细胞。
本发明还涉及所述CAR-T细胞或所述试剂盒在制备抗肿瘤药物中的应用。
另一方面,本发明还涉及通用型CAR-T细胞,所述T细胞的TCR恒定区基因同源重组一段编码CAR基因的序列,在同源重组之前,所述T细胞事先经CRISPR/cas9***敲除TCR基因。
具体的,所述敲除TCR基因是通过将T细胞、Cas9蛋白与sgRNA混合进行电转实现的。
其中,所述sgRNA来源于TCR恒定区域外显子上下游各250bp。sgRNA包含与SEQ IDNO:13所示的序列具有至少约70%、至少约80%、至少约90%序列同一性或更多的序列同一性的核苷酸序列。
具体的,其中所述细胞来源于健康志愿者(或供者)。
具体的,所述CAR包含顺序连接的信号肽、胞外结合区、任选的铰链区、跨膜区和胞内信号区。
此外,本发明还涉及一种组合物或试剂盒,其包含前述任意的通用型CAR-T细胞;优选地,所述组合物或试剂盒还包含可药用的稀释剂、赋形剂或载体。
本发明还涉及通用型CAR-T细胞用于制备***或感染性疾病的药物或试剂盒的用途。所述恶性肿瘤或感染性疾病包括:血液***肿瘤、实体瘤、异体移植所引起的免疫排斥反应以及自身免疫性疾病如过敏反应或者***性红斑狼疮。
总的来说,本发明的有益效果在于:
1、本发明所述的获得的结构改进的AAV载体制备的无致病性;
2、发明所述的通用型T细胞和通用型CAR-T细胞可以通过同种异体回输的方式应用于恶性肿瘤或感染性疾病的治疗,极大地降低了治疗成本;
3、制备获得的CAR整合在TCR恒定区外显子之前,并且受到内源性启动子的调控,保证了CAR的表达是受生理调控的,且表达均一。由于这种生理性及均一性,CAR不会出现过度的表达,且CAR的表达水平与原来TCR的表达水平一致,各CAR-T细胞之间的个体差异性小;
4、安全性更高,由于CAR的表达是在生理范围内的,当CAR-T细胞激活后,释放的细胞因子也在生理范围内,不会出现过度的释放,从而避免细胞因子风暴的产生。
5、不存在引发肿瘤的风险,利用基因编辑技术,将CAR通过同源重组的方式精确的整合到指定的TCR恒定区基因上,而非随机整合到T细胞的基因组上,因此不会出现引发肿瘤的风险。
附图说明
图1-图3为三个质粒结构示意图,依次为:AAV6-TCR-CD19CAR(4-1BB)(实验载体),AAV6-TCR-GFP(阴性对照),LV-EF-1a-CD19CAT(4-1BB)-mCherry(阳性对照);
图4:基因编辑的AAV6-TCR-CD19CAR(4-1BB)质粒结构图;
图5:经基因编辑后两个不同个体的T细胞TCR敲除流式检测结果;
图6:AAV6介导的CD19CAR(4-1BB)同源重组的流式检测结果;
图7:AAV6-TCR-CD19CAR-T的肿瘤杀伤能力流式细胞检测结果;
图8:不同时间点细胞因子浓度的检测及对比结果,其中,柱形图中每天从左到右的柱的数值分别代表Kmix、LV、AAV、LV+Kmix、AAV+Kmix;
图9:CAR-T细胞的衰竭标志物的流式检测及对比结果,折线图中位于上方的折线为LV CD19 CAR-T+Kmix,位于下方的折线为AAV CD19 CAR-T+Kmix;;
图10a、b:CAR-T抗肿瘤体内实验结果,其中图10b为生存曲线,慢病毒转导的LVCAR-T与AAV转导的AAV-TCR-CAR-T均显著延长小鼠的生存期,两组效果无显著差异。
具体实施方式
本发明人经过深入的研究,鉴于自体CAR-T免疫疗法的高成本,治疗效果个体差异大,安全性低,有引发肿瘤的风险等问题,本申请利用基因编辑技术,结合基因重组技术,从表达CAR基因的载体入手,对AAV载体的结构进行了改进,从而实现CAR的基因片段定点精确整合,确保了CAR基因的持续稳定表达,避免了引发肿瘤的风险。同时还将CAR的表达至于内源性启动子的控制之下,使得CAR的表达受正常生理调控,显著减少治疗副作用,获得了一种生理性的通用型CAR-T。
术语
如本文所用,所述的“操作性连接”或“可操作性相连”是指两个或多个核酸区域或核酸序列的功能性的空间排列。
所述的“元件”是指一些对于蛋白的表达有用的一系列功能性的核酸序列,本发明中,所述的“元件”被***地构建以形成一种表达构建体。所述的“元件”的序列可以是本发明中所提供的那些,也包括它们的变体,只要这些变体基本上保留了所述“元件”的功能,其通过***或删除一些碱基(如1-50bp;较佳地1-30bp,更佳地1-20bp,更佳地1-10bp),或进行随机或定点突变等来获得。
质粒
腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)载体是利用天然存在的腺相关病毒某些特性经过基因工程改造后产生的一种可供人工转基因的载体。腺相关病毒(Adeno-associated virus,AAV)是一种不能自我复制的病毒,具有较低的免疫原性。目前有约10种血清型AAV,不同血清型的AAV能够选择性地靶向不同组织。但是AAV病毒载体装载容量有限,不超过5.0kb。
根据上述所提供的元件的信息,进行了适当的变化且仍然保留其原有功能的上述元件的变异体也包括在本发明中。例如,在严格条件下与本发明限定的序列杂交且具有相同功能的序列变异体。
本发明的各元件所指向的基因的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法,可根据本发明所公开的有关核苷酸序列,尤其是开放阅读框序列来设计引物,并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板,扩增而得有关序列。
所述的载体中上述元件的上游以及下游的位置,还可包括限制性的酶切位点,这样有利于各元件的有机连接。
本领域的技术人员熟知的方法能用于构建本发明所需的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。此外,表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因,以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状。
包含上述的适当多核苷酸序列以及适当启动子或者控制序列的载体,可以用于进行病毒的包装。
本发明还提供了包含有所述表达CAR的重组腺相关病毒载体或由该载体包装而成的病毒的试剂盒。其它常用于进行病毒包装、转染、注射等的试剂也可被包含在所述的试剂盒中,以方便本领域技术人员使用。此外,所述试剂盒中还可包含有指导本领域技术人员操作的使用说明书。
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著,分子克隆实验指南,第三版,科学出版社,2002中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1质粒的构建
1、本实施例构建的质粒包括
LV-EF-1a-CD19CAR(4-1BB)-mCherry(阳性对照,结构示意图见图3)
AAV6-TCR-CD19CAR(4-1BB)(实验载体,结构示意图见图1、4)
AAV6-TCR-GFP(阴性对照,结构示意图见图2)
2、质粒构建及病毒包装过程
2.1 LV-EF-1a-CD19CAT(4-1BB)-mCherry质粒构建
序列为SEQ ID NO:10所示。
获得LV-EF-1a-CD19CAR(4-1BB)-mCherry质粒
先在ApE或Snapgene软件上构建该质粒图谱。
质粒的功能区域:LTR-EF-1a-CD19CAT(4-1BB)-mCherry-LTR进行基因合成。
将该段序列克隆入慢病毒载体质粒。
质粒转化、涂板、挑克隆、提取质粒(小提),测序确认无误,再次提取质粒(大提,去内毒素),质粒待包病毒使用。
2.2 AAV6-TCR-CD19CAR(4-1BB)质粒构建
先在ApE或Snapgene软件上构建该质粒的图谱。
质粒功能区域的结构:ITR-5’HA-SA-2A-CD19CAR(4-1BB)-polyA-3’HA-ITR
序列为SEQ ID NO:11所示。
首先合成基因片段:5’HA-SA-2A-CD19CAR(4-1BB)-polyA-3’HA
将上述基因片段克隆入AAV6病毒载体质粒
质粒转化、涂板、挑克隆、提取质粒(小提),测序确认无误,再次提取质粒(大提,去内毒素),质粒待包病毒使用。
2.3 AAV6-TCR-GFP质粒构建
先在ApE或Snapgene软件上构建该质粒的图谱。
质粒功能区域的结构为:ITR-5’HA-SA-2A-GFP-polyA-3’HA-ITR
序列为SEQ ID NO:12所示。
按照Infusion原理,设计GFP引物,PCR获得GFP片段。
以上述2.2质粒为模板,按照Infusion原理,设计引物,PCR获得AAV6载体。
Infusion连接,质粒转化、涂板、挑克隆、提取质粒(小提),测序确认无误,再次提取质粒(大提,去内毒素),质粒待包病毒使用。
实施例2病毒包装过程
2.1 LV包装
准备DMEM+10%FBS培养基+抗生素
复苏293T细胞,传代培养,判断细胞状态良好
包毒前一日,分6个10cm培养皿,各seed 2.5M细胞,24h后达到70%汇聚即可包毒。
包毒质粒包括:pSLQ5367,pCMV-dR8.91,pMD2-G,TransIT-Virus Reagent,Opti MEM.
具体配比依照表1中的10-cm盘。
表1 DNA转染的条件配比
2.2.AAV6病毒包装
以T75flask为例,前一天下午传代,细胞数量9M-10M
试剂名称 试剂数量
载体质粒 7.5ul(1.0ug/ul)
包装质粒 7.5ul(1.0ug/ul)
辅助质粒 7.5ul(1.0ug/ul)
OptiMEM 1.5ml
TanslT-VirusGen:45ul
4.AAV病毒收毒:病毒颗粒同时存在于包装细胞和培养上清中。
5.AAV病毒浓缩与纯化。
实施例3 T细胞分选
一、T细胞分选
1、获得健康捐献者的血液样品(至少50mL)。经过如下疾病的检测(不仅局限于这些检测),合格的患者。包括:甲肝,乙肝,丙肝,艾滋病,梅毒抗体,结核,遗传性疾病等。
2、获得外周血单个核细胞(PBMC)
1)将Ficoll-PaqueTM PLUS(#07957)混合均匀后置于空管中;
2)用PBS+2%FBS稀释血液样品(2X);
3)将步骤2)中的血液样品置于步骤1)溶液的上层,尽量减少血液与Ficoll-PaqueTM PLUS的混合,室温下400g离心30分钟后自然降速;
4)移弃步骤3)离心后的上层血浆,取血浆与Ficoll-PaqueTM PLUS液交界层即为外周血单个核细胞(其中,离心后管中分为四层,从上到下依次为血浆、外周血单个核细胞、Ficoll-PaqueTM PLUS液、红细胞与粒细胞层)。
5)用PBS+2%FBS清洗外周血单个核细胞,待用。
3、获得T细胞(T memory stem cells,Tmsc)
使用Miltenyi的Pan T cell isolation Kit human获得总T细胞。此试剂盒为阴选试剂盒。二、T细胞培养
1)T细胞培养基(IL-2):OpTmizerTMCTSTMT-cell Expansion SFM+5%CTSTM ImmuneCell SR+1%Penicillin-Streptomycin 100X Solution+1%L-glutamine+IL-2 200IU/mL。
2)T细胞培养基(IL-7/15):OpTmizerTMCTSTMT-cell Expansion SFM+5%CTSTMImmune Cell SR+1%Penicillin-Streptomycin 100X Solution+1%L-glutamine+IL-710ng/ml+IL-1510ng/mL。
起始细胞浓度为1M/mL,在Flask里培养基液面高度不高于1cm。
三、T细胞激活
1)T细胞激活使用:Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28磁珠
2)洗磁珠用Beads Wash Buffer:PBS+1%BSA+2mMEDTA,pH=7.4。
3)按等量1:1比例将T细胞与磁珠混合。
4)T25Flask或6孔板里培养。
四、T细胞扩增
T细胞激活48-72小时后,去除Beads,进行基因转导。之后更换T细胞培养基(IL-7/15)将激活的T细胞以1M/mL为起始细胞密度,进行细胞培养,每2天补充培养基并添加适量细胞因子。
实施例4 T细胞的CAR基因转导
实施例3中的T细胞激活48-72小时以后,AAV6病毒介导的CAR基因同源重组,原位***剪切位点进行基因修饰,即刻转导,AAV6病毒MOI:2.5×10e5-10e6。
1、TCR基因敲除
1.1采用CRISPR/cas9***
1.2电转体系:
T细胞:3M
cas9蛋白10ug(2ul)
sgRNA 2.5ug(5ul)
总体积:Buffer T 100μL
电转条件:1600V,10ms,3pulses
其中,所述的sgRNA序列如下:
CTGGATATCTGTGGGACAAGAGG(SEQ ID NO:13)
1.3 CAR基因转导
AAV6病毒介导的CAR基因同源重组,原位***剪切位点。电转后即刻转导,AAV6MOI:2.5×10e5-10e6。
1.4 TCR-/CAR+T细胞的分选
4天后,采用Miltenyi的CD3 Biotin Microbeads分选TCR阴性的T细胞。
结果如图5,T细胞分别来自两个不同个体。流式细胞仪检测TCR,CD3的表达情况。两个不同个体的T细胞TCR敲除率分别为87.2%和68.6%。
图6所示:T细胞分别来自两个不同个体。流式细胞仪检测CAR的表达情况,分别为69.1%和67.5%。与慢病毒转导的CAR-T相比,本CAR-T细胞CAR的表达更为均一。
实施例5 CAR-T细胞的功能,表型的检测
1.细胞毒性的检测
K562-CD19+/K562-CD19-细胞共培养,起始细胞数量各5×10e4,其中CD19+细胞表达mCherry荧光蛋白
再与CAR-T细胞共培养,E/T比例8:1,4:1,2:1,1:1,0.5:1,0:1
各设三个复孔
NegativeCtrl:8:1,4:1,2:1,1:1,0.5:1,0:1
PositiveCtrl:8:1,4:1,2:1,1:1,0.5:1,0:1
Test 1:8:1,4:1,2:1,1:1,0.5:1,0:1
Test 2:8:1,4:1,2:1,1:1,0.5:1,0:1
Blank k562-CD19+:0:1,
Blank k562-CD19-:0:1,
Test1+CD19-:8:1,4:1
Test2+CD19-:8:1,4:1
所有4:1组均设6个复孔,1用来检测细胞表型:12,24,48h;2检测CAR的表达情况
96孔板培养
48小时后流式细胞仪检测K562-CD19+细胞的mCherry荧光
计算公式为:
100%×(1-(%CD19pos/%CD19neg at notedE:T)/(%CD19pos/CD19neg at 0:1E:T))by flow cytometry
结果如图7所示,AAV6-TCR-CD19CAR-T的肿瘤杀伤能力与CAR-T细胞与靶细胞的比值成正比,CAR-T细胞:肿瘤细胞=4:1或8:1时效果最明显。
细胞毒性试验,不同时间点取20ul培养液上清,测细胞因子:IL-2,IFN-r,TNF-a
结果如图8所示,流式细胞因子检测细胞毒性试验不同时间点,细胞培养基中细胞因子的浓度。AAV6-TCR-CD19CAR-T的三个主要细胞因子IL-2,IFN-r,TNF-a的浓度显著降低。
3.T细胞衰竭的检测
细胞毒性试验开始后,不同时间点检测T细胞衰竭的标志物:PD-1,TIM-3,LAG-3
结果如图9所示,细胞毒性试验开始后检测T细胞的衰竭标志物:PD-1,LAG-3,TIM-3。AAV-TCR-CD19CAR-T细胞的衰竭标志物表达量显著低于对照组。
4.小鼠肿瘤模型的建立及AAV-TCR-CAR-T细胞的体内功能检测
体内实验表明(图10a/b):本发明所制备的AAV-TCR-CAR-T表现出等效的抗肿瘤活性,能够有效地控制小鼠体内肿瘤的生长。小鼠的生存期显著延长。
本发明虽然以较佳实施例公开如上,但并不是用来限定权利要求,任何本领域技术人员在不脱离本发明构思的前提下,都可以做出若干可能的变动和修改,因此本发明的保护范围应当以本发明权利要求所界定的范围准。
序列表
<110> 北京门罗生物科技有限公司
<120> 一种通用型CAR-T细胞及其制备方法和用途
<130> 申请日
<160> 13
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 560
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
acgcaggtgt tctgatttat agttcaaaac ctctatcaat gagagagcaa tctcctggta 60
atgtgataga tttcccaact taatgccaac ataccataaa cctcccattc tgctaatgcc 120
cagcctaagt tggggagacc actccagatt ccaagatgta cagtttgctt tgctgggcct 180
ttttcccatg cctgccttta ctctgccaga gttatattgc tggggttttg aagaagatcc 240
tattaaataa aagaataagc agtattatta agtagccctg catttcaggt ttccttgagt 300
ggcaggccag gcctggccgt gaacgttcac tgaaatcatg gcctcttggc caagattgat 360
agcttgtgcc tgtccctgag tcccagtcca tcacgagcag ctggtttcta agatgctatt 420
tcccgtataa agcatgagac cgtgacttgc cagccccaca gagccccgcc cttgtccatc 480
actggcatct ggactccagc ctgggttggg gcaaagaggg aaatgagatc atgtcctaac 540
cctgatcctc ttgtcccaca 560
<210> 2
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ctagggacag cgatcgggta catcgatcgc aggcgcaatc ttcgcatttc ttttttccag 60
<210> 3
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gctactaact tcagcctgct gaagcaggct ggagacgtgg aggagaaccc tggacct 57
<210> 4
<211> 1524
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gccttaccag tgaccgcctt gctcctgccg ctggccttgc tgctccacgc cgccaggccg 60
gagcagaaac ttatcagtga ggaggacctg gacatccaga tgacacagac tacatcctcc 120
ctgtctgcct ctctgggaga cagagtcacc atcagttgca gggcaagtca ggacattagt 180
aaatatttaa attggtatca gcagaaacca gatggaactg ttaaactcct gatctaccat 240
acatcaagat tacactcagg agtcccatca aggttcagtg gcagtgggtc tggaacagat 300
tattctctca ccattagcaa cctggagcaa gaagatattg ccacttactt ttgccaacag 360
ggtaatacgc ttccgtacac gttcggaggg gggaccaagc tggagatcac aggtggcggt 420
ggctcgggcg gtggtgggtc gggtggcggc ggatctgagg tgaaactgca ggagtcagga 480
cctggcctgg tggcgccctc acagagcctg tccgtcacat gcactgtctc aggggtctca 540
ttacccgact atggtgtaag ctggattcgc cagcctccac gaaagggtct ggagtggctg 600
ggagtaatat ggggtagtga aaccacatac tataattcag ctctcaaatc cagactgacc 660
atcatcaagg acaactccaa gagccaagtt ttcttaaaaa tgaacagtct gcaaactgat 720
gacacagcca tttactactg tgccaaacat tattactacg gtggtagcta tgctatggac 780
tactggggcc aaggaacctc agtcaccgtc tcctcagcgg ccgcattcgt gccggtcttc 840
ctgccagcga agcccaccac gacgccagcg ccgcgaccac caacaccggc gcccaccatc 900
gcgtcgcagc ccctgtccct gcgcccagag gcgtgccggc cagcggcggg gggcgcagtg 960
cacacgaggg ggctggactt cgcctgtgat atctacatct gggcgccctt ggccgggact 1020
tgtggggtcc ttctcctgtc actggttatc accctttact gcaaacgggg cagaaagaaa 1080
ctcctgtata tattcaaaca accatttatg agaccagtac aaactactca agaggaagat 1140
ggctgtagct gccgatttcc agaagaagaa gaaggaggat gtgaactgag agtgaagttc 1200
agcaggagcg cagacgcccc cgcgtacaag cagggccaga accagctcta taacgagctc 1260
aatctaggac gaagagagga gtacgatgtt ttggacaaga gacgtggccg ggaccctgag 1320
atggggggaa agccgagaag gaagaaccct caggaaggcc tgtacaatga actgcagaaa 1380
gataagatgg cggaggccta cagtgagatt gggatgaaag gcgagcgccg gaggggcaag 1440
gggcacgatg gcctttacca gggtctcagt acagccacca aggacaccta cgacgccctt 1500
cacatgcagg ccctgccccc tcgc 1524
<210> 5
<211> 225
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
ctgtgccttc tagttgccag ccatctgttg tttgcccctc ccccgtgcct tccttgaccc 60
tggaaggtgc cactcccact gtcctttcct aataaaatga ggaaattgca tcgcattgtc 120
tgagtaggtg tcattctatt ctggggggtg gggtggggca ggacagcaag ggggaggatt 180
gggaagacaa tagcaggcat gctggggatg cggtgggctc tatgg 225
<210> 6
<211> 560
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
gatatccaga accctgaccc tgccgtgtac cagctgagag actctaaatc cagtgacaag 60
tctgtctgcc tattcaccga ttttgattct caaacaaatg tgtcacaaag taaggattct 120
gatgtgtata tcacagacaa aactgtgcta gacatgaggt ctatggactt caagagcaac 180
agtgctgtgg cctggagcaa caaatctgac tttgcatgtg caaacgcctt caacaacagc 240
attattccag aagacacctt cttccccagc ccaggtaagg gcagctttgg tgccttcgca 300
ggctgtttcc ttgcttcagg aatggccagg ttctgcccag agctctggtc aatgatgtct 360
aaaactcctc tgattggtgg tctcggcctt atccattgcc accaaaaccc tctttttact 420
aagaaacagt gagccttgtt ctggcagtcc agagaatgac acgggaaaaa agcagatgaa 480
gagaaggtgg caggagaggg cacgtggccc agcctcagtc tctccaactg agttcctgcc 540
tgcctgcctt tgctcagact 560
<210> 7
<211> 130
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60
ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa ctccatcact 120
aggggttcct 130
<210> 8
<211> 141
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60
ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc 120
gagcgcgcag ctgcctgcag g 141
<210> 9
<211> 3315
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60
ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa ctccatcact 120
aggggttcct gcggccgcac gcgtacgcag gtgttctgat ttatagttca aaacctctat 180
caatgagaga gcaatctcct ggtaatgtga tagatttccc aacttaatgc caacatacca 240
taaacctccc attctgctaa tgcccagcct aagttgggga gaccactcca gattccaaga 300
tgtacagttt gctttgctgg gcctttttcc catgcctgcc tttactctgc cagagttata 360
ttgctggggt tttgaagaag atcctattaa ataaaagaat aagcagtatt attaagtagc 420
cctgcatttc aggtttcctt gagtggcagg ccaggcctgg ccgtgaacgt tcactgaaat 480
catggcctct tggccaagat tgatagcttg tgcctgtccc tgagtcccag tccatcacga 540
gcagctggtt tctaagatgc tatttcccgt ataaagcatg agaccgtgac ttgccagccc 600
cacagagccc cgcccttgtc catcactggc atctggactc cagcctgggt tggggcaaag 660
agggaaatga gatcatgtcc taaccctgat cctcttgtcc cacactaggg acagcgatcg 720
ggtacatcga tcgcaggcgc aatcttcgca tttctttttt ccagacgcta ctaacttcag 780
cctgctgaag caggctggag acgtggagga gaaccctgga cctgccttac cagtgaccgc 840
cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg ccggagcaga aacttatcag 900
tgaggaggac ctggacatcc agatgacaca gactacatcc tccctgtctg cctctctggg 960
agacagagtc accatcagtt gcagggcaag tcaggacatt agtaaatatt taaattggta 1020
tcagcagaaa ccagatggaa ctgttaaact cctgatctac catacatcaa gattacactc 1080
aggagtccca tcaaggttca gtggcagtgg gtctggaaca gattattctc tcaccattag 1140
caacctggag caagaagata ttgccactta cttttgccaa cagggtaata cgcttccgta 1200
cacgttcgga ggggggacca agctggagat cacaggtggc ggtggctcgg gcggtggtgg 1260
gtcgggtggc ggcggatctg aggtgaaact gcaggagtca ggacctggcc tggtggcgcc 1320
ctcacagagc ctgtccgtca catgcactgt ctcaggggtc tcattacccg actatggtgt 1380
aagctggatt cgccagcctc cacgaaaggg tctggagtgg ctgggagtaa tatggggtag 1440
tgaaaccaca tactataatt cagctctcaa atccagactg accatcatca aggacaactc 1500
caagagccaa gttttcttaa aaatgaacag tctgcaaact gatgacacag ccatttacta 1560
ctgtgccaaa cattattact acggtggtag ctatgctatg gactactggg gccaaggaac 1620
ctcagtcacc gtctcctcag cggccgcatt cgtgccggtc ttcctgccag cgaagcccac 1680
cacgacgcca gcgccgcgac caccaacacc ggcgcccacc atcgcgtcgc agcccctgtc 1740
cctgcgccca gaggcgtgcc ggccagcggc ggggggcgca gtgcacacga gggggctgga 1800
cttcgcctgt gatatctaca tctgggcgcc cttggccggg acttgtgggg tccttctcct 1860
gtcactggtt atcacccttt actgcaaacg gggcagaaag aaactcctgt atatattcaa 1920
acaaccattt atgagaccag tacaaactac tcaagaggaa gatggctgta gctgccgatt 1980
tccagaagaa gaagaaggag gatgtgaact gagagtgaag ttcagcagga gcgcagacgc 2040
ccccgcgtac aagcagggcc agaaccagct ctataacgag ctcaatctag gacgaagaga 2100
ggagtacgat gttttggaca agagacgtgg ccgggaccct gagatggggg gaaagccgag 2160
aaggaagaac cctcaggaag gcctgtacaa tgaactgcag aaagataaga tggcggaggc 2220
ctacagtgag attgggatga aaggcgagcg ccggaggggc aaggggcacg atggccttta 2280
ccagggtctc agtacagcca ccaaggacac ctacgacgcc cttcacatgc aggccctgcc 2340
ccctcgctga ctgtgccttc tagttgccag ccatctgttg tttgcccctc ccccgtgcct 2400
tccttgaccc tggaaggtgc cactcccact gtcctttcct aataaaatga ggaaattgca 2460
tcgcattgtc tgagtaggtg tcattctatt ctggggggtg gggtggggca ggacagcaag 2520
ggggaggatt gggaagacaa tagcaggcat gctggggatg cggtgggctc tatgggatat 2580
ccagaaccct gaccctgccg tgtaccagct gagagactct aaatccagtg acaagtctgt 2640
ctgcctattc accgattttg attctcaaac aaatgtgtca caaagtaagg attctgatgt 2700
gtatatcaca gacaaaactg tgctagacat gaggtctatg gacttcaaga gcaacagtgc 2760
tgtggcctgg agcaacaaat ctgactttgc atgtgcaaac gccttcaaca acagcattat 2820
tccagaagac accttcttcc ccagcccagg taagggcagc tttggtgcct tcgcaggctg 2880
tttccttgct tcaggaatgg ccaggttctg cccagagctc tggtcaatga tgtctaaaac 2940
tcctctgatt ggtggtctcg gccttatcca ttgccaccaa aaccctcttt ttactaagaa 3000
acagtgagcc ttgttctggc agtccagaga atgacacggg aaaaaagcag atgaagagaa 3060
ggtggcagga gagggcacgt ggcccagcct cagtctctcc aactgagttc ctgcctgcct 3120
gcctttgctc agactctgat tttgtaggta accacgtgcg gaccgagcgg ccgcaggaac 3180
ccctagtgat ggagttggcc actccctctc tgcgcgctcg ctcgctcact gaggccgggc 3240
gaccaaaggt cgcccgacgc ccgggctttg cccgggcggc ctcagtgagc gagcgagcgc 3300
gcagctgcct gcagg 3315
<210> 10
<211> 12298
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
gggtctctct ggttagacca gatctgagcc tgggagctct ctggctaact agggaaccca 60
ctgcttaagc ctcaataaag cttgccttga gtgcttcaag tagtgtgtgc ccgtctgttg 120
tgtgactctg gtaactagag atccctcaga cccttttagt cagtgtggaa aatctctagc 180
agcatctaga attaattccg tgtattctat agtgtcacct aaatcgtatg tgtatgatac 240
ataaggttat gtattaattg tagccgcgtt ctaacgacaa tatgtacaag cctaattgtg 300
tagcatctgg cttactgaag cagaccctat catctctctc gtaaactgcc gtcagagtcg 360
gtttggttgg acgaaccttc tgagtttctg gtaacgccgt cccgcacccg gaaatggtca 420
gcgaaccaat cagcagggtc atcgctagcc agatcctcta cgccggacgc atcgtggccg 480
gcatcaccgg cgccacaggt gcggttgctg gcgcctatat cgccgacatc accgatgggg 540
aagatcgggc tcgccacttc gggctcatga gcgcttgttt cggcgtgggt atggtggcag 600
gccccgtggc cgggggactg ttgggcgcca tctccttgca tgcaccattc cttgcggcgg 660
cggtgctcaa cggcctcaac ctactactgg gctgcttcct aatgcaggag tcgcataagg 720
gagagcgtcg aatggtgcac tctcagtaca atctgctctg atgccgcata gttaagccag 780
ccccgacacc cgccaacacc cgctgacgcg ccctgacggg cttgtctgct cccggcatcc 840
gcttacagac aagctgtgac cgtctccggg agctgcatgt gtcagaggtt ttcaccgtca 900
tcaccgaaac gcgcgagacg aaagggcctc gtgatacgcc tatttttata ggttaatgtc 960
atgataataa tggtttctta gacgtcaggt ggcacttttc ggggaaatgt gcgcggaacc 1020
cctatttgtt tatttttcta aatacattca aatatgtatc cgctcatgag acaataaccc 1080
tgataaatgc ttcaataata ttgaaaaagg aagagtatga gtattcaaca tttccgtgtc 1140
gcccttattc ccttttttgc ggcattttgc cttcctgttt ttgctcaccc agaaacgctg 1200
gtgaaagtaa aagatgctga agatcagttg ggtgcacgag tgggttacat cgaactggat 1260
ctcaacagcg gtaagatcct tgagagtttt cgccccgaag aacgttttcc aatgatgagc 1320
acttttaaag ttctgctatg tggcgcggta ttatcccgta ttgacgccgg gcaagagcaa 1380
ctcggtcgcc gcatacacta ttctcagaat gacttggttg agtactcacc agtcacagaa 1440
aagcatctta cggatggcat gacagtaaga gaattatgca gtgctgccat aaccatgagt 1500
gataacactg cggccaactt acttctgaca acgatcggag gaccgaagga gctaaccgct 1560
tttttgcaca acatggggga tcatgtaact cgccttgatc gttgggaacc ggagctgaat 1620
gaagccatac caaacgacga gcgtgacacc acgatgcctg tagcaatggc aacaacgttg 1680
cgcaaactat taactggcga actacttact ctagcttccc ggcaacaatt aatagactgg 1740
atggaggcgg ataaagttgc aggaccactt ctgcgctcgg cccttccggc tggctggttt 1800
attgctgata aatctggagc cggtgagcgt gggtctcgcg gtatcattgc agcactgggg 1860
ccagatggta agccctcccg tatcgtagtt atctacacga cggggagtca ggcaactatg 1920
gatgaacgaa atagacagat cgctgagata ggtgcctcac tgattaagca ttggtaactg 1980
tcagaccaag tttactcata tatactttag attgatttaa aacttcattt ttaatttaaa 2040
aggatctagg tgaagatcct ttttgataat ctcatgacca aaatccctta acgtgagttt 2100
tcgttccact gagcgtcaga ccccgtagaa aagatcaaag gatcttcttg agatcctttt 2160
tttctgcgcg taatctgctg cttgcaaaca aaaaaaccac cgctaccagc ggtggtttgt 2220
ttgccggatc aagagctacc aactcttttt ccgaaggtaa ctggcttcag cagagcgcag 2280
ataccaaata ctgtctttct agtgtagccg tagttaggcc accacttcaa gaactctgta 2340
gcaccgccta catacctcgc tctgctaatc ctgttaccag tggctgctgc cagtggcgat 2400
aagtcgtgtc ttaccgggtt ggactcaaga cgatagttac cggataaggc gcagcggtcg 2460
ggctgaacgg ggggttcgtg cacacagccc agcttggagc gaacgaccta caccgaactg 2520
agatacctac agcgtgagct atgagaaagc gccacgcttc ccgaagggag aaaggcggac 2580
aggtatccgg taagcggcag ggtcggaaca ggagagcgca cgagggagct tccaggggga 2640
aacgcctggt atctttatag tcctgtcggg tttcgccacc tctgacttga gcgtcgattt 2700
ttgtgatgct cgtcaggggg gcggagccta tggaaaaacg ccagcaacgc ggccttttta 2760
cggttcctgg ccttttgctg gccttttgct cacatgttct ttcctgcgtt atcccctgat 2820
tctgtggata accgtattac cgcctttgag tgagctgata ccgctcgccg cagccgaacg 2880
accgagcgca gcgagtcagt gagcgaggaa gcggaagagc gcccaatacg caaaccgcct 2940
ctccccgcgc gttggccgat tcattaatgc agctgtggaa tgtgtgtcag ttagggtgtg 3000
gaaagtcccc aggctcccca gcaggcagaa gtatgcaaag catgcatctc aattagtcag 3060
caaccaggtg tggaaagtcc ccaggctccc cagcaggcag aagtatgcaa agcatgcatc 3120
tcaattagtc agcaaccata gtcccgcccc taactccgcc catcccgccc ctaactccgc 3180
ccagttccgc ccattctccg ccccatggct gactaatttt ttttatttat gcagaggccg 3240
aggccgcctc ggcctctgag ctattccaga agtagtgagg aggctttttt ggaggcctag 3300
gcttttgcaa aaagcttgga cacaagacag gcttgcgaga tatgtttgag aataccactt 3360
tatcccgcgt cagggagagg cagtgcgtaa aaagacgcgg actcatgtga aatactggtt 3420
tttagtgcgc cagatctcta taatctcgcg caacctattt tcccctcgaa cactttttaa 3480
gccgtagata aacaggctgg gacacttcac atgagcgaaa aatacatcgt cacctgggac 3540
atgttgcaga tccatgcacg taaactcgca agccgactga tgccttctga acaatggaaa 3600
ggcattattg ccgtaagccg tggcggtctg taccgggtgc gttactggcg cgtgaactgg 3660
gtattcgtca tgtcgatacc gtttgtattt ccagctacga tcacgacaac cagcgcgagc 3720
ttaaagtgct gaaacgcgca gaaggcgatg gcgaaggctt catcgttatt gatgacctgg 3780
tggataccgg tggtactgcg gttgcgattc gtgaaatgta tccaaaagcg cactttgtca 3840
ccatcttcgc aaaaccggct ggtcgtccgc tggttgatga ctatgttgtt gatatcccgc 3900
aagatacctg gattgaacag ccgtgggata tgggcgtcgt attcgtcccg ccaatctccg 3960
gtcgctaatc ttttcaacgc ctggcactgc cgggcgttgt tctttttaac ttcaggcggg 4020
ttacaatagt ttccagtaag tattctggag gctgcatcca tgacacaggc aaacctgagc 4080
gaaaccctgt tcaaaccccg ctttaaacat cctgaaacct cgacgctagt ccgccgcttt 4140
aatcacggcg cacaaccgcc tgtgcagtcg gcccttgatg gtaaaaccat ccctcactgg 4200
tatcgcatga ttaaccgtct gatgtggatc tggcgcggca ttgacccacg cgaaatcctc 4260
gacgtccagg cacgtattgt gatgagcgat gccgaacgta ccgacgatga tttatacgat 4320
acggtgattg gctaccgtgg cggcaactgg atttatgagt gggccccgga tctttgtgaa 4380
ggaaccttac ttctgtggtg tgacataatt ggacaaacta cctacagaga tttaaagctc 4440
taaggtaaat ataaaatttt taagtgtata atgtgttaaa ctactgattc taattgtttg 4500
tgtattttag attccaacct atggaactga tgaatgggag cagtggtgga atgcctttaa 4560
tgaggaaaac ctgttttgct cagaagaaat gccatctagt gatgatgagg ctactgctga 4620
ctctcaacat tctactcctc caaaaaagaa gagaaaggta gaagacccca aggactttcc 4680
ttcagaattg ctaagttttt tgagtcatgc tgtgtttagt aatagaactc ttgcttgctt 4740
tgctatttac accacaaagg aaaaagctgc actgctatac aagaaaatta tggaaaaata 4800
ttctgtaacc tttataagta ggcataacag ttataatcat aacatactgt tttttcttac 4860
tccacacagg catagagtgt ctgctattaa taactatgct caaaaattgt gtacctttag 4920
ctttttaatt tgtaaagggg ttaataagga atatttgatg tatagtgcct tgactagaga 4980
tcataatcag ccataccaca tttgtagagg ttttacttgc tttaaaaaac ctcccacacc 5040
tccccctgaa cctgaaacat aaaatgaatg caattgttgt tgttaacttg tttattgcag 5100
cttataatgg ttacaaataa agcaatagca tcacaaattt cacaaataaa gcattttttt 5160
cactgcattc tagttgtggt ttgtccaaac tcatcaatgt atcttatcat gtctggatca 5220
actggataac tcaagctaac caaaatcatc ccaaacttcc caccccatac cctattacca 5280
ctgccaatta cctagtggtt tcatttactc taaacctgtg attcctctga attattttca 5340
ttttaaagaa attgtatttg ttaaatatgt actacaaact tagtagttgg aagggctaat 5400
tcactcccaa agaagacaag atatccttga tctgtggatc taccacacac aaggctactt 5460
ccctgattag cagaactaca caccagggcc aggggtcaga tatccactga cctttggatg 5520
gtgctacaag ctagtaccag ttgagccaga taaggtagaa gaggccaata aaggagagaa 5580
caccagcttg ttacaccctg tgagcctgca tgggatggat gacccggaga gagaagtgtt 5640
agagtggagg tttgacagcc gcctagcatt tcatcacgtg gcccgagagc tgcatccgga 5700
gtacttcaag aactgctgat atcgagcttg ctacaaggga ctttccgctg gggactttcc 5760
agggaggcgt ggcctgggcg ggactgggga gtggcgagcc ctcagatcct gcatataagc 5820
agctgctttt tgcctgtact gggtctctct ggttagacca gatctgagcc tgggagctct 5880
ctggctaact agggaaccca ctgcttaagc ctcaataaag cttgccttga gtgcttcaag 5940
tagtgtgtgc ccgtctgttg tgtgactctg gtaactagag atccctcaga cccttttagt 6000
cagtgtggaa aatctctagc agtggcgccc gaacagggac ttgaaagcga aagggaaacc 6060
agaggagctc tctcgacgca ggactcggct tgctgaagcg cgcacggcaa gaggcgaggg 6120
gcggcgactg gtgagtacgc caaaaatttt gactagcgga ggctagaagg agagagatgg 6180
gtgcgagagc gtcagtatta agcgggggag aattagatcg cgatgggaaa aaattcggtt 6240
aaggccaggg ggaaagaaaa aatataaatt aaaacatata gtatgggcaa gcagggagct 6300
agaacgattc gcagttaatc ctggcctgtt agaaacatca gaaggctgta gacaaatact 6360
gggacagcta caaccatccc ttcagacagg atcagaagaa cttagatcat tatataatac 6420
agtagcaacc ctctattgtg tgcatcaaag gatagagata aaagacacca aggaagcttt 6480
agacaagata gaggaagagc aaaacaaaag taagaccacc gcacagcaag cggccggccg 6540
ctgatcttca gacctggagg aggagatatg agggacaatt ggagaagtga attatataaa 6600
tataaagtag taaaaattga accattagga gtagcaccca ccaaggcaaa gagaagagtg 6660
gtgcagagag aaaaaagagc agtgggaata ggagctttgt tccttgggtt cttgggagca 6720
gcaggaagca ctatgggcgc agcgtcaatg acgctgacgg tacaggccag acaattattg 6780
tctggtatag tgcagcagca gaacaatttg ctgagggcta ttgaggcgca acagcatctg 6840
ttgcaactca cagtctgggg catcaagcag ctccaggcaa gaatcctggc tgtgaaagat 6900
acctaaagga tcaacagctc ctggggattt ggggttgctc tggaaaactc atttgcacca 6960
ctgctgtgcc ttggaatgct agttggagta ataaatctct ggaacagatt tggaatcaca 7020
cgacctggat ggagtgggac agagaaatta acaattacac aagcttaata cactccttaa 7080
ttgaagaatc gcaaaaccag caagaaaaga atgaacaaga attattggaa ttagataaat 7140
gggcaagttt gtggaattgg tttaacataa caaattggct gtggtatata aaattattca 7200
taatgatagt aggaggcttg gtaggtttaa gaatagtttt tgctgtactt tctatagtga 7260
atagagttag gcagggatat tcaccattat cgtttcagac ccacctccca accccgaggg 7320
gacccgacag gcccgaagga atagaagaag aaggtggaga gagagacaga gacagatcca 7380
ttcgattagt gaacggatct cgacggtatc gccaaatggc agtattcatc cacaatttta 7440
aaagaaaagg ggggattggg gggtacagtg caggggaaag aatagtagac ataatagcaa 7500
cagacataca aactaaagaa ttacaaaaac aaattacaaa aattcaaaat tttcgggttt 7560
attacaggga cagcagagat ccagtttatc gataagcttt gcaaagatgg ataaagtttt 7620
aaacagagag gaatctttgc agctaatgga ccttctaggt cttgaaagga gtgggaattg 7680
gctccggtgc ccgtcagtgg gcagagcgca catcgcccac agtccccgag aagttggggg 7740
gaggggtcgg caattgaacc ggtgcctaga gaaggtggcg cggggtaaac tgggaaagtg 7800
atgtcgtgta ctggctccgc ctttttcccg agggtggggg agaaccgtat ataagtgcag 7860
tagtcgccgt gaacgttctt tttcgcaacg ggtttgccgc cagaacacag gtaagtgccg 7920
tgtgtggttc ccgcgggcct ggcctcttta cgggttatgg cccttgcgtg ccttgaatta 7980
cttccacctg gctgcagtac gtgattcttg atcccgagct tcgggttgga agtgggtggg 8040
agagttcgag gccttgcgct taaggagccc cttcgcctcg tgcttgagtt gaggcctggc 8100
ctgggcgctg gggccgccgc gtgcgaatct ggtggcacct tcgcgcctgt ctcgctgctt 8160
tcgataagtc tctagccatt taaaattttt gatgacctgc tgcgacgctt tttttctggc 8220
aagatagtct tgtaaatgcg ggccaagatc tgcacactgg tatttcggtt tttggggccg 8280
cgggcggcga cggggcccgt gcgtcccagc gcacatgttc ggcgaggcgg ggcctgcgag 8340
cgcggccacc gagaatcgga cgggggtagt ctcaagctgg ccggcctgct ctggtgcctg 8400
gcctcgcgcc gccgtgtatc gccccgccct gggcggcaag gctggcccgg tcggcaccag 8460
ttgcgtgagc ggaaagatgg ccgcttcccg gccctgctgc agggagctca aaatggagga 8520
cgcggcgctc gggagagcgg gcgggtgagt cacccacaca aaggaaaagg gcctttccgt 8580
cctcagccgt cgcttcatgt gactccacgg agtaccgggc gccgtccagg cacctcgatt 8640
agttctcgag cttttggagt acgtcgtctt taggttgggg ggaggggttt tatgcgatgg 8700
agtttcccca cactgagtgg gtggagactg aagttaggcc agcttggcac ttgatgtaat 8760
tctccttgga atttgccctt tttgagtttg gatcttggtt cattctcaag cctcagacag 8820
tggttcaaag tttttttctt ccatttcagg tgtcgtgagg taccgcctag gacgcgtgga 8880
tccgccacca tggccttacc agtgaccgcc ttgctcctgc cgctggcctt gctgctccac 8940
gccgccaggc cggagcagaa acttatcagt gaggaggacc tggacatcca gatgacacag 9000
actacatcct ccctgtctgc ctctctggga gacagagtca ccatcagttg cagggcaagt 9060
caggacatta gtaaatattt aaattggtat cagcagaaac cagatggaac tgttaaactc 9120
ctgatctacc atacatcaag attacactca ggagtcccat caaggttcag tggcagtggg 9180
tctggaacag attattctct caccattagc aacctggagc aagaagatat tgccacttac 9240
ttttgccaac agggtaatac gcttccgtac acgttcggag gggggaccaa gctggagatc 9300
acaggtggcg gtggctcggg cggtggtggg tcgggtggcg gcggatctga ggtgaaactg 9360
caggagtcag gacctggcct ggtggcgccc tcacagagcc tgtccgtcac atgcactgtc 9420
tcaggggtct cattacccga ctatggtgta agctggattc gccagcctcc acgaaagggt 9480
ctggagtggc tgggagtaat atggggtagt gaaaccacat actataattc agctctcaaa 9540
tccagactga ccatcatcaa ggacaactcc aagagccaag ttttcttaaa aatgaacagt 9600
ctgcaaactg atgacacagc catttactac tgtgccaaac attattacta cggtggtagc 9660
tatgctatgg actactgggg ccaaggaacc tcagtcaccg tctcctcagc ggccgcattc 9720
gtgccggtct tcctgccagc gaagcccacc acgacgccag cgccgcgacc accaacaccg 9780
gcgcccacca tcgcgtcgca gcccctgtcc ctgcgcccag aggcgtgccg gccagcggcg 9840
gggggcgcag tgcacacgag ggggctggac ttcgcctgtg atatctacat ctgggcgccc 9900
ttggccggga cttgtggggt ccttctcctg tcactggtta tcacccttta ctgcaaacgg 9960
ggcagaaaga aactcctgta tatattcaaa caaccattta tgagaccagt acaaactact 10020
caagaggaag atggctgtag ctgccgattt ccagaagaag aagaaggagg atgtgaactg 10080
agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtaca agcagggcca gaaccagctc 10140
tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 10200
cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 10260
gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 10320
cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 10380
tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgctgag acgaatgccg agataccgtc 10440
ggatatcgaa ttcccacggg gttggggttg cgccttttcc aaggcagccc tgggtttgcg 10500
cagggacgcg gctgctctgg gcgtggttcc gggaaacgca gcggcgccga ccctgggtct 10560
cgcacattct tcacgtccgt tcgcagcgtc acccggatct tcgccgctac ccttgtgggc 10620
cccccggcga cgcttcctgc tccgccccta agtcgggaag gttccttgcg gttcgcggcg 10680
tgccggacgt gacaaacgga agccgcacgt ctcactagta ccctcgcaga cggacagcgc 10740
cagggagcaa tggcagcgcg ccgaccgcga tgggctgtgg ccaatagcgg ctgctcagcg 10800
gggcgcgccg agagcagcgg ccgggaaggg gcggtgcggg aggcggggtg tggggcggta 10860
gtgtgggccc tgttcctgcc cgcgcggtgt tccgcattct gcaagcctcc ggagcgcacg 10920
tcggcagtcg gctccctcgt tgaccgaatc accgacctct ctccccaggg ggatccaccg 10980
gtcgccacca tggtgagcaa gggcgaggag gataacatgg ccatcatcaa ggagttcatg 11040
cgcttcaagg tgcacatgga gggctccgtg aacggccacg agttcgagat cgagggcgag 11100
ggcgagggcc gcccctacga gggcacccag accgccaagc tgaaggtgac caagggtggc 11160
cccctgccct tcgcctggga catcctgtcc cctcagttca tgtacggctc caaggcctac 11220
gtgaagcacc ccgccgacat ccccgactac ttgaagctgt ccttccccga gggcttcaag 11280
tgggagcgcg tgatgaactt cgaggacggc ggcgtggtga ccgtgaccca ggactcctcc 11340
ctgcaggacg gcgagttcat ctacaaggtg aagctgcgcg gcaccaactt cccctccgac 11400
ggccccgtaa tgcagaagaa gaccatgggc tgggaggcct cctccgagcg gatgtacccc 11460
gaggacggcg ccctgaaggg cgagatcaag cagaggctga agctgaagga cggcggccac 11520
tacgacgctg aggtcaagac cacctacaag gccaagaagc ccgtgcagct gcccggcgcc 11580
tacaacgtca acatcaagtt ggacatcacc tcccacaacg aggactacac catcgtggaa 11640
cagtacgaac gcgccgaggg ccgccactcc accggcggca tggacgagct gtacaagtaa 11700
agcgtcgaca atcaacctct ggattacaaa atttgtgaaa gattgactgg tattcttaac 11760
tatgttgctc cttttacgct atgtggatac gctgctttaa tgcctttgta tcatgctatt 11820
gcttcccgta tggctttcat tttctcctcc ttgtataaat cctggttgct gtctctttat 11880
gaggagttgt ggcccgttgt caggcaacgt ggcgtggtgt gcactgtgtt tgctgacgca 11940
acccccactg gttggggcat tgccaccacc tgtcagctcc tttccgggac tttcgctttc 12000
cccctcccta ttgccacggc ggaactcatc gccgcctgcc ttgcccgctg ctggacaggg 12060
gctcggctgt tgggcactga caattccgtg gtgttgtcgg ggaagctgac gtcctttcca 12120
tggctgctcg cctgtgttgc cacctggatt ctgcgcggga cgtccttctg ctacgtccct 12180
tcggccctca atccagcgga ccttccttcc cgcggcctgc tgccggctct gcggcctctt 12240
ccgcgtcttc gccttcgccc tcagacgagt cggatctccc tttgggccgc ctccccgc 12298
<210> 11
<211> 5200
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60
ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa ctccatcact 120
aggggttcct gcggccgcac gcgttcaagg ccttatatcg agtaaacggt agtgctgggg 180
cttagacgca ggtgttctga tttatagttc aaaacctcta tcaatgagag agcaatctcc 240
tggtaatgtg atagatttcc caacttaatg ccaacatacc ataaacctcc cattctgcta 300
atgcccagcc taagttgggg agaccactcc agattccaag atgtacagtt tgctttgctg 360
ggcctttttc ccatgcctgc ctttactctg ccagagttat attgctgggg ttttgaagaa 420
gatcctatta aataaaagaa taagcagtat tattaagtag ccctgcattt caggtttcct 480
tgagtggcag gccaggcctg gccgtgaacg ttcactgaaa tcatggcctc ttggccaaga 540
ttgatagctt gtgcctgtcc ctgagtccca gtccatcacg agcagctggt ttctaagatg 600
ctatttcccg tataaagcat gagaccgtga cttgccagcc ccacagagcc ccgcccttgt 660
ccatcactgg catctggact ccagcctggg ttggggcaaa gagggaaatg agatcatgtc 720
ctaaccctga tcctcttgtc ccacactagg gacagcgatc gggtacatcg atcgcaggcg 780
caatcttcgc atttcttttt tccagacgct actaacttca gcctgctgaa gcaggctgga 840
gacgtggagg agaaccctgg acctgtgagc aagggcgagg agctgttcac cggggtggtg 900
cccatcctgg tcgagctgga cggcgacgta aacggccaca agttcagcgt gtccggcgag 960
ggcgagggcg atgccaccta cggcaagctg accctgaagt tcatctgcac caccggcaag 1020
ctgcccgtgc cctggcccac cctcgtgacc accctgacct acggcgtgca gtgcttcagc 1080
cgctaccccg accacatgaa gcagcacgac ttcttcaagt ccgccatgcc cgaaggctac 1140
gtccaggagc gcaccatctt cttcaaggac gacggcaact acaagacccg cgccgaggtg 1200
aagttcgagg gcgacaccct ggtgaaccgc atcgagctga agggcatcga cttcaaggag 1260
gacggcaaca tcctggggca caagctggag tacaactaca acagccacaa cgtctatatc 1320
atggccgaca agcagaagaa cggcatcaag gtgaacttca agatccgcca caacatcgag 1380
gacggcagcg tgcagctcgc cgaccactac cagcagaaca cccccatcgg cgacggcccc 1440
gtgctgctgc ccgacaacca ctacctgagc acccagtccg ccctgagcaa agaccccaac 1500
gagaagcgcg atcacatggt cctgctggag ttcgtgaccg ccgccgggat cactctcggc 1560
atggacgagc tgtacaagta ctcagatctc gagctcaagt agctgtgcct tctagttgcc 1620
agccatctgt tgtttgcccc tcccccgtgc cttccttgac cctggaaggt gccactccca 1680
ctgtcctttc ctaataaaat gaggaaattg catcgcattg tctgagtagg tgtcattcta 1740
ttctgggggg tggggtgggg caggacagca agggggagga ttgggaagac aatagcaggc 1800
atgctgggga tgcggtgggc tctatgggat atccagaacc ctgaccctgc cgtgtaccag 1860
ctgagagact ctaaatccag tgacaagtct gtctgcctat tcaccgattt tgattctcaa 1920
acaaatgtgt cacaaagtaa ggattctgat gtgtatatca cagacaaaac tgtgctagac 1980
atgaggtcta tggacttcaa gagcaacagt gctgtggcct ggagcaacaa atctgacttt 2040
gcatgtgcaa acgccttcaa caacagcatt attccagaag acaccttctt ccccagccca 2100
ggtaagggca gctttggtgc cttcgcaggc tgtttccttg cttcaggaat ggccaggttc 2160
tgcccagagc tctggtcaat gatgtctaaa actcctctga ttggtggtct cggccttatc 2220
cattgccacc aaaaccctct ttttactaag aaacagtgag ccttgttctg gcagtccaga 2280
gaatgacacg ggaaaaaagc agatgaagag aaggtggcag gagagggcac gtggcccagc 2340
ctcagtctct ccaactgagt tcctgcctgc ctgcctttgc tcagactgtt tgccccttac 2400
tgctcttcta ggcctcattc taactgattt tgtaggtaac cacgtgcgga ccgagcggcc 2460
gcaggaaccc ctagtgatgg agttggccac tccctctctg cgcgctcgct cgctcactga 2520
ggccgggcga ccaaaggtcg cccgacgccc gggctttgcc cgggcggcct cagtgagcga 2580
gcgagcgcgc agctgcctgc aggggcgcct gatgcggtat tttctcctta cgcatctgtg 2640
cggtatttca caccgcatac gtcaaagcaa ccatagtacg cgccctgtag cggcgcatta 2700
agcgcggcgg gtgtggtggt tacgcgcagc gtgaccgcta cacttgccag cgccctagcg 2760
cccgctcctt tcgctttctt cccttccttt ctcgccacgt tcgccggctt tccccgtcaa 2820
gctctaaatc gggggctccc tttagggttc cgatttagtg ctttacggca cctcgacccc 2880
aaaaaacttg atttgggtga tggttcacgt agtgggccat cgccctgata gacggttttt 2940
cgccctttga cgttggagtc cacgttcttt aatagtggac tcttgttcca aactggaaca 3000
acactcaacc ctatctcggg ctattctttt gatttataag ggattttgcc gatttcggcc 3060
tattggttaa aaaatgagct gatttaacaa aaatttaacg cgaattttaa caaaatatta 3120
acgtttacaa ttttatggtg cactctcagt acaatctgct ctgatgccgc atagttaagc 3180
cagccccgac acccgccaac acccgctgac gcgccctgac gggcttgtct gctcccggca 3240
tccgcttaca gacaagctgt gaccgtctcc gggagctgca tgtgtcagag gttttcaccg 3300
tcatcaccga aacgcgcgag acgaaagggc ctcgtgatac gcctattttt ataggttaat 3360
gtcatgataa taatggtttc ttagacgtca ggtggcactt ttcggggaaa tgtgcgcgga 3420
acccctattt gtttattttt ctaaatacat tcaaatatgt atccgctcat gagacaataa 3480
ccctgataaa tgcttcaata atattgaaaa aggaagagta tgagtattca acatttccgt 3540
gtcgccctta ttcccttttt tgcggcattt tgccttcctg tttttgctca cccagaaacg 3600
ctggtgaaag taaaagatgc tgaagatcag ttgggtgcac gagtgggtta catcgaactg 3660
gatctcaaca gcggtaagat ccttgagagt tttcgccccg aagaacgttt tccaatgatg 3720
agcactttta aagttctgct atgtggcgcg gtattatccc gtattgacgc cgggcaagag 3780
caactcggtc gccgcataca ctattctcag aatgacttgg ttgagtactc accagtcaca 3840
gaaaagcatc ttacggatgg catgacagta agagaattat gcagtgctgc cataaccatg 3900
agtgataaca ctgcggccaa cttacttctg acaacgatcg gaggaccgaa ggagctaacc 3960
gcttttttgc acaacatggg ggatcatgta actcgccttg atcgttggga accggagctg 4020
aatgaagcca taccaaacga cgagcgtgac accacgatgc ctgtagcaat ggcaacaacg 4080
ttgcgcaaac tattaactgg cgaactactt actctagctt cccggcaaca attaatagac 4140
tggatggagg cggataaagt tgcaggacca cttctgcgct cggcccttcc ggctggctgg 4200
tttattgctg ataaatctgg agccggtgag cgtgggtctc gcggtatcat tgcagcactg 4260
gggccagatg gtaagccctc ccgtatcgta gttatctaca cgacggggag tcaggcaact 4320
atggatgaac gaaatagaca gatcgctgag ataggtgcct cactgattaa gcattggtaa 4380
ctgtcagacc aagtttactc atatatactt tagattgatt taaaacttca tttttaattt 4440
aaaaggatct aggtgaagat cctttttgat aatctcatga ccaaaatccc ttaacgtgag 4500
ttttcgttcc actgagcgtc agaccccgta gaaaagatca aaggatcttc ttgagatcct 4560
ttttttctgc gcgtaatctg ctgcttgcaa acaaaaaaac caccgctacc agcggtggtt 4620
tgtttgccgg atcaagagct accaactctt tttccgaagg taactggctt cagcagagcg 4680
cagataccaa atactgtcct tctagtgtag ccgtagttag gccaccactt caagaactct 4740
gtagcaccgc ctacatacct cgctctgcta atcctgttac cagtggctgc tgccagtggc 4800
gataagtcgt gtcttaccgg gttggactca agacgatagt taccggataa ggcgcagcgg 4860
tcgggctgaa cggggggttc gtgcacacag cccagcttgg agcgaacgac ctacaccgaa 4920
ctgagatacc tacagcgtga gctatgagaa agcgccacgc ttcccgaagg gagaaaggcg 4980
gacaggtatc cggtaagcgg cagggtcgga acaggagagc gcacgaggga gcttccaggg 5040
ggaaacgcct ggtatcttta tagtcctgtc gggtttcgcc acctctgact tgagcgtcga 5100
tttttgtgat gctcgtcagg ggggcggagc ctatggaaaa acgccagcaa cgcggccttt 5160
ttacggttcc tggccttttg ctggcctttt gctcacatgt 5200
<210> 12
<211> 2603
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60
ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa ctccatcact 120
aggggttcct gcggccgcac gcgttcaagg ccttatatcg agtaaacggt agtgctgggg 180
cttagacgca ggtgttctga tttatagttc aaaacctcta tcaatgagag agcaatctcc 240
tggtaatgtg atagatttcc caacttaatg ccaacatacc ataaacctcc cattctgcta 300
atgcccagcc taagttgggg agaccactcc agattccaag atgtacagtt tgctttgctg 360
ggcctttttc ccatgcctgc ctttactctg ccagagttat attgctgggg ttttgaagaa 420
gatcctatta aataaaagaa taagcagtat tattaagtag ccctgcattt caggtttcct 480
tgagtggcag gccaggcctg gccgtgaacg ttcactgaaa tcatggcctc ttggccaaga 540
ttgatagctt gtgcctgtcc ctgagtccca gtccatcacg agcagctggt ttctaagatg 600
ctatttcccg tataaagcat gagaccgtga cttgccagcc ccacagagcc ccgcccttgt 660
ccatcactgg catctggact ccagcctggg ttggggcaaa gagggaaatg agatcatgtc 720
ctaaccctga tcctcttgtc ccacactagg gacagcgatc gggtacatcg atcgcaggcg 780
caatcttcgc atttcttttt tccagacgct actaacttca gcctgctgaa gcaggctgga 840
gacgtggagg agaaccctgg acctgtgagc aagggcgagg agctgttcac cggggtggtg 900
cccatcctgg tcgagctgga cggcgacgta aacggccaca agttcagcgt gtccggcgag 960
ggcgagggcg atgccaccta cggcaagctg accctgaagt tcatctgcac caccggcaag 1020
ctgcccgtgc cctggcccac cctcgtgacc accctgacct acggcgtgca gtgcttcagc 1080
cgctaccccg accacatgaa gcagcacgac ttcttcaagt ccgccatgcc cgaaggctac 1140
gtccaggagc gcaccatctt cttcaaggac gacggcaact acaagacccg cgccgaggtg 1200
aagttcgagg gcgacaccct ggtgaaccgc atcgagctga agggcatcga cttcaaggag 1260
gacggcaaca tcctggggca caagctggag tacaactaca acagccacaa cgtctatatc 1320
atggccgaca agcagaagaa cggcatcaag gtgaacttca agatccgcca caacatcgag 1380
gacggcagcg tgcagctcgc cgaccactac cagcagaaca cccccatcgg cgacggcccc 1440
gtgctgctgc ccgacaacca ctacctgagc acccagtccg ccctgagcaa agaccccaac 1500
gagaagcgcg atcacatggt cctgctggag ttcgtgaccg ccgccgggat cactctcggc 1560
atggacgagc tgtacaagta ctcagatctc gagctcaagt agctgtgcct tctagttgcc 1620
agccatctgt tgtttgcccc tcccccgtgc cttccttgac cctggaaggt gccactccca 1680
ctgtcctttc ctaataaaat gaggaaattg catcgcattg tctgagtagg tgtcattcta 1740
ttctgggggg tggggtgggg caggacagca agggggagga ttgggaagac aatagcaggc 1800
atgctgggga tgcggtgggc tctatgggat atccagaacc ctgaccctgc cgtgtaccag 1860
ctgagagact ctaaatccag tgacaagtct gtctgcctat tcaccgattt tgattctcaa 1920
acaaatgtgt cacaaagtaa ggattctgat gtgtatatca cagacaaaac tgtgctagac 1980
atgaggtcta tggacttcaa gagcaacagt gctgtggcct ggagcaacaa atctgacttt 2040
gcatgtgcaa acgccttcaa caacagcatt attccagaag acaccttctt ccccagccca 2100
ggtaagggca gctttggtgc cttcgcaggc tgtttccttg cttcaggaat ggccaggttc 2160
tgcccagagc tctggtcaat gatgtctaaa actcctctga ttggtggtct cggccttatc 2220
cattgccacc aaaaccctct ttttactaag aaacagtgag ccttgttctg gcagtccaga 2280
gaatgacacg ggaaaaaagc agatgaagag aaggtggcag gagagggcac gtggcccagc 2340
ctcagtctct ccaactgagt tcctgcctgc ctgcctttgc tcagactgtt tgccccttac 2400
tgctcttcta ggcctcattc taactgattt tgtaggtaac cacgtgcgga ccgagcggcc 2460
gcaggaaccc ctagtgatgg agttggccac tccctctctg cgcgctcgct cgctcactga 2520
ggccgggcga ccaaaggtcg cccgacgccc gggctttgcc cgggcggcct cagtgagcga 2580
gcgagcgcgc agctgcctgc agg 2603
<210> 13
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
ctggatatct gtgggacaag agg 23
Claims (25)
1.一种通用型CAR-T细胞,其特征在于,所述T细胞的TCR恒定区基因敲除,并在敲除的原位同源重组一段编码CAR基因的序列。
2.如权利要求1所述通用型CAR-T细胞,其特征在于,所述同源重组是通过重组腺相关病毒载体实现的。
3.如权利要求2所述通用型CAR-T细胞,其特征在于,所述同源重组发生在T细胞的TCR恒定区基因的外显子前。
4.如权利要求2或3所述通用型CAR-T细胞,其特征在于,所述腺相关病毒载体包含如下操作性连接的序列元件:5’末端反向重复序列(5’ITR)、3’末端反向重复序列(3’ITR)及编码CAR基因的序列。
5.如前述任意一项权利要求所述通用型CAR-T细胞,其特征在于,所述腺相关病毒载体进一步包含如下操作性连接的序列元件:SA序列、2A序列、PolyA序列、5’HA序列、3’HA和5’、3’末端反向重复序列。
6.如前述任意一项权利要求所述通用型CAR-T细胞,其特征在于,所述腺相关病毒载体中所述的CD19CAR(4-1BB)序列包含SEQ ID NO:4所示的序列。
7.如前述任意一项权利要求所述通用型CAR-T细胞,其特征在于,所述腺相关病毒载体中所述的5’基因组同源序列(5’HA)包含SEQ ID NO:1所示的序列;所述的SA序列包含SEQID NO:2所示的序列;所述的2A序列包含SEQ ID NO:3所示的序列;;所述的PolyA序列包含SEQ ID NO:5所示的序列;所述的3’基因组同源序列(3’HA)包含SEQ ID NO:6所示的序列;所述的5’末端反向重复序列包含SEQ ID NO:7所示的序列;3’末端反向重复序列包含SEQID NO:8所示的序列。
8.如前述任意一项权利要求所述通用型CAR-T细胞,其特征在于,所述重组腺相关病毒载体包含与SEQ ID NO:9所示的序列具有至少约70%、至少约80%、至少约90%序列同一性或更多的序列同一性的核苷酸序列。
9.如前述任意一项权利要求所述通用型CAR-T细胞,其特征在于,在同源重组之前,所述T细胞事先经CRISPR/cas9***敲除TCR基因。
10.如前述任意一项权利要求所述通用型CAR-T细胞,其特征在于,所述敲除TCR基因是通过将T细胞、Cas9蛋白与sgRNA混合进行电转实现的。
11.如前述任意一项权利要求所述通用型CAR-T细胞,其特征在于,所述sgRNA来源于TCR恒定区域外显子上下游各250bp。
12.如前述任意一项权利要求所述通用型CAR-T细胞,其特征在于,所述sgRNA包含与SEQ ID NO:13所示的序列具有至少约70%、至少约80%、至少约90%序列同一性或更多的序列同一性的核苷酸序列。
13.如前述任意一项权利要求所述通用型CAR-T细胞,其特征在于,其中所述细胞来源于健康志愿者。
14.如前述任意一项权利要求所述通用型CAR-T细胞,其特征在于,其中所述CAR包含顺序连接的信号肽、胞外结合区、任选的铰链区、跨膜区和胞内信号区。
15.一种制备通用型CAR-T细胞的方法,所述方法包括如下步骤:
1)在T细胞中引入sgRNA分子和Cas9蛋白敲除TCR基因;
2)在所述T细胞中引入包含CAR分子的重组腺相关病毒载体;
其中,步骤2)在步骤1)之后2小时内进行,并且所述sgRNA分子包含TCR恒定区域外显子上下游各250bp的靶区域互补的靶向结构域。
16.如权利要求15所述制备通用型CAR-T细胞的方法,其特征在于,所述腺相关病毒载体包含如下操作性连接的序列元件:5’基因组同源序列(5’HA)、3’基因组同源序列(3’HA)以及编码CAR基因的序列。
17.如权利要求15或16所述制备通用型CAR-T细胞的方法,其特征在于,所述腺相关病毒载体进一步包含如下操作性连接的序列元件:SA序列、2A序列、PolyA序列、5’和3’HA序列和5’、3’反向重复序列。
18.如权利要求17所述制备通用型CAR-T细胞的方法,其特征在于,所述腺相关病毒载体中所述的5’基因组同源(5’HA)序列包含SEQ ID NO:1所示的序列;所述的SA序列包含SEQID NO:2所示的序列;所述的2A序列包含SEQ ID NO:3所示的序列;所述的CD19CAR(4-1BB)序列包含SEQ ID NO:4所示的序列;所述的PolyA序列包含SEQ ID NO:5所示的序列;所述的3’基因组同源(3’HA)序列包含SEQ ID NO:6所示的序列和/或所述的5’末端反向重复序列包含SEQ ID NO:7所示的序列;3’末端反向重复序列包含SEQ ID NO:8所示的序列。
19.如权利要求15或16所述制备通用型CAR-T细胞的方法,其特征在于,所述重组腺相关病毒载体包含与SEQ ID NO:9所示的序列具有至少约70%、至少约80%、至少约90%序列同一性或更多的序列同一性的核苷酸序列。
20.如前述任意一项权利要求所述制备通用型CAR-T细胞的方法,其特征在于,所述方法在步骤1)之前还包括分离和/或激活健康志愿者的T细胞的步骤;优选地,所述方法在步骤2)之后还包括对通用型CAR-T细胞进行分选的步骤;更优选地,分选之后再对所得的通用型CAR-T细胞进行有效性验证。
21.如前述任意一项权利要求所述制备通用型CAR-T细胞的方法,其特征在于,所述sgRNA包含与SEQ ID NO:13所示的序列具有至少约70%、至少约80%、至少约90%序列同一性或更多的序列同一性的核苷酸序列。
22.如前述任意一项权利要求所述制备通用型CAR-T细胞的方法,其特征在于,所述敲除TCR基因是通过将T细胞、Cas9蛋白与sgRNA混合进行电转实现的。
23.一种组合物或试剂盒,其包含权利要求1-14中任一项的通用型CAR-T细胞;优选地,所述组合物或试剂盒还包含可药用的稀释剂、赋形剂或载体。
24.权利要求1-14中任一项的通用型CAR-T细胞用于制备***或感染性疾病的药物或试剂盒的用途。
25.如权利要求24所述的用途,其特征在于,所述恶性肿瘤或感染性疾病包括:血液***肿瘤、实体瘤、异体移植所引起的免疫排斥反应以及自身免疫性疾病如过敏反应或者***性红斑狼疮。
Priority Applications (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201910116481.5A CN109777782A (zh) | 2019-02-15 | 2019-02-15 | 一种通用型car-t细胞及其制备方法和用途 |
PCT/CN2019/075716 WO2020164166A1 (zh) | 2019-02-15 | 2019-02-21 | 一种通用型car-t细胞及其制备方法和用途 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201910116481.5A CN109777782A (zh) | 2019-02-15 | 2019-02-15 | 一种通用型car-t细胞及其制备方法和用途 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN109777782A true CN109777782A (zh) | 2019-05-21 |
Family
ID=66504454
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201910116481.5A Pending CN109777782A (zh) | 2019-02-15 | 2019-02-15 | 一种通用型car-t细胞及其制备方法和用途 |
Country Status (2)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN109777782A (zh) |
WO (1) | WO2020164166A1 (zh) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2022052877A1 (zh) * | 2020-09-10 | 2022-03-17 | 上海邦耀生物科技有限公司 | 对细胞中的靶位点进行基因编辑的方法 |
CN114616239A (zh) * | 2019-10-17 | 2022-06-10 | 北京门罗生物科技有限公司 | 嵌合抗原受体和其中表达有嵌合抗原受体的t细胞 |
Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN107365798A (zh) * | 2017-07-13 | 2017-11-21 | 山东省齐鲁细胞治疗工程技术有限公司 | 一种携带iCasp9***基因的CD19‑CAR‑T细胞及其应用 |
CN108277205A (zh) * | 2016-12-30 | 2018-07-13 | 四川大学 | 表达cxcr4的嵌合抗原受体修饰的淋巴细胞及制备方法和用途 |
CN108379597A (zh) * | 2018-03-15 | 2018-08-10 | 上海市第人民医院 | 一种基因载体及其用于治疗视网膜神经节细胞变性的基因治疗药物 |
CN108472314A (zh) * | 2015-07-31 | 2018-08-31 | 明尼苏达大学董事会 | 修饰的细胞和治疗方法 |
CN108753807A (zh) * | 2018-07-02 | 2018-11-06 | 宜明细胞生物科技有限公司 | 一种重组嵌合抗原受体基因及其应用 |
CN109055428A (zh) * | 2018-09-19 | 2018-12-21 | 上海市第人民医院 | 一种重组腺相关病毒载体及其制备方法与应用 |
Family Cites Families (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2018510160A (ja) * | 2015-03-20 | 2018-04-12 | ブルーバード バイオ, インコーポレイテッド | ベクター製剤 |
SG11201804373VA (en) * | 2015-12-04 | 2018-06-28 | Novartis Ag | Compositions and methods for immunooncology |
CN109415687A (zh) * | 2016-04-07 | 2019-03-01 | 蓝鸟生物公司 | 嵌合抗原受体t细胞组合物 |
CN107354156B (zh) * | 2017-07-19 | 2021-02-09 | 广州医科大学附属第五医院 | 一种敲除野生型T细胞TCR beta链的gRNA及方法 |
-
2019
- 2019-02-15 CN CN201910116481.5A patent/CN109777782A/zh active Pending
- 2019-02-21 WO PCT/CN2019/075716 patent/WO2020164166A1/zh active Application Filing
Patent Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN108472314A (zh) * | 2015-07-31 | 2018-08-31 | 明尼苏达大学董事会 | 修饰的细胞和治疗方法 |
CN108277205A (zh) * | 2016-12-30 | 2018-07-13 | 四川大学 | 表达cxcr4的嵌合抗原受体修饰的淋巴细胞及制备方法和用途 |
CN107365798A (zh) * | 2017-07-13 | 2017-11-21 | 山东省齐鲁细胞治疗工程技术有限公司 | 一种携带iCasp9***基因的CD19‑CAR‑T细胞及其应用 |
CN108379597A (zh) * | 2018-03-15 | 2018-08-10 | 上海市第人民医院 | 一种基因载体及其用于治疗视网膜神经节细胞变性的基因治疗药物 |
CN108753807A (zh) * | 2018-07-02 | 2018-11-06 | 宜明细胞生物科技有限公司 | 一种重组嵌合抗原受体基因及其应用 |
CN109055428A (zh) * | 2018-09-19 | 2018-12-21 | 上海市第人民医院 | 一种重组腺相关病毒载体及其制备方法与应用 |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
JUSTIN EYQUEM等: "Targeting a CAR to the TRAC locus with CRISPR/Cas9 enhances tumour rejection", 《NATURE》 * |
MACLEOD等: "Integration of a CD19 CAR into the. TCR Alpha Chain Locus Streamlines Production of Allogeneic Gene-Edited CAR T Cells", 《MOLECULAR THERAPY》 * |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN114616239A (zh) * | 2019-10-17 | 2022-06-10 | 北京门罗生物科技有限公司 | 嵌合抗原受体和其中表达有嵌合抗原受体的t细胞 |
CN114616239B (zh) * | 2019-10-17 | 2023-08-11 | 北京门罗生物科技有限公司 | 嵌合抗原受体和其中表达有嵌合抗原受体的t细胞 |
WO2022052877A1 (zh) * | 2020-09-10 | 2022-03-17 | 上海邦耀生物科技有限公司 | 对细胞中的靶位点进行基因编辑的方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO2020164166A1 (zh) | 2020-08-20 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN109266682B (zh) | 一种神经细胞快速逆行跨突触标记的方法及应用 | |
KR102271675B1 (ko) | 헌팅톤병의 aav 치료 | |
JP6066909B2 (ja) | ペプチド癌抗原特異的t細胞のレセプター遺伝子 | |
CN101668853B (zh) | 癌抗原特异性t细胞受体基因、由该基因编码的肽及其使用 | |
AU2017240788A1 (en) | Chimeric receptors and methods of use thereof | |
KR20210030973A (ko) | 조작된 면역자극성 박테리아 균주 및 이의 용도 | |
KR20190062505A (ko) | Hpv-특이적 결합 분자 | |
KR20140093922A (ko) | Agr2 차단 항체 및 그의 용도 | |
KR20140060541A (ko) | 암을 치료하기 위한 rna 조작된 t 세포 | |
CN110099997A (zh) | 表达car和转录因子的细胞及其用途 | |
KR20160023649A (ko) | 심근증을 치료하기 위한 유전자―치료 벡터 | |
CN112088008A (zh) | 修饰细胞的扩增及其用途 | |
KR20180105709A (ko) | 중추 신경계의 암의 치료를 위한 조작된 t 세포의 투여 | |
TW202237826A (zh) | 基因編輯的自然殺手細胞 | |
KR20080113261A (ko) | 수용체 티로신 키나제 alk의 세포외 도메인에 결합하는 항체 | |
PT2005185E (pt) | Métodos para a identificação de alvos polipeptídicos | |
WO2018064626A1 (en) | Adaptive chimeric antigen receptor t-cell design | |
CN109777782A (zh) | 一种通用型car-t细胞及其制备方法和用途 | |
US20220220187A1 (en) | Chimeric receptor therapy | |
CN114901802A (zh) | 重组cdkl5蛋白、基因疗法和生产方法 | |
CN111848822B (zh) | Cd19和cd30双靶点嵌合抗原受体及其应用 | |
CN109825526A (zh) | 一种用于通用型car-t制备的重组腺相关病毒载体及其构建方法和应用 | |
CN112245578B (zh) | 一种covid-19病毒预防性疫苗及其制备方法 | |
CN115335396A (zh) | 靶向cd33的嵌合抗原受体 | |
CN109694878B (zh) | 一种基于原生质体的海带分子育种方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination |