JP2019509997A - 神経血管形成疾患または障害の治療標的としてのｆｆａ１（ｇｐｒ４０） - Google Patents

神経血管形成疾患または障害の治療標的としてのｆｆａ１（ｇｐｒ４０） Download PDF

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Abstract

本発明は、血管形成、あるいはより一般には眼の血管疾患、網膜変性症および／または腫瘍を特徴とするニューロンの疾患または障害の治療または予防のための治療標的としての遊離脂肪酸受容体１（ＦＦＡ１）の発見に関する方法および組成物を提供する。小分子および核酸剤を含む、既知のＦＦＡ１阻害剤の治療的および／または予防的使用および組成物が記載される。新規なＦＦＡ１阻害剤の同定のための方法も提供される。【選択図】図１−１

Description

関連出願
本願は、米国特許法第１１９条（ｅ）項の下、２０１６年２月１７日付で出願された米国特許仮出願第６２／２９６，２５２号に対する優先権の利益を主張する。この米国特許仮出願は参照によりその全文が本明細書に援用される。
連邦政府資金提供を受けた研究開発の記載
本発明は、ＮＩＨ ＥＹ０２４８６８、ＥＹ０１７０１７、ＥＹ０２２２７５、Ｐ０１ ＨＤ１８６５５；ボストン小児病院Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｆａｃｕｌｔｙ Ｃａｒｅｅｒ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ａｗａｒｄ、Ｂｒｉｇｈｔ Ｆｏｃｕｓ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、Ｍａｓｓ Ｌｉｏｎｓ Ｅｙｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｃ．ＮＩＨ ＥＹ０２４９６３の下で政府支援によってなされた。合衆国政府は本発明に一定の権利を有する。
黄斑の網膜血管新生は、高齢者の失明の主な原因である（Ｌｉｍ，Ｌ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ ３７９，１７２８−１７３８（２０１２））。光受容体は、身体の中でも最もエネルギーを消費する細胞であり（Ｗｏｎｇ−Ｒｉｌｅｙ，Ｍ．Ｔ．Ｔ．Ｅｙｅ Ｂｒａｉｎ ２，９９−１１６（２０１０），およびＯｋａｗａ，Ｈ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｂｉｏｌ １８，１９１７−１９２１（２００８））、黄斑は最も光受容体密度の高い領域である。
網膜血管腫状増殖（ＲＡＰ）の血管病変は、黄斑部毛細血管拡張症（ＭａｃＴｅｌ）（Ｙａｎｎｕｚｚｉ，Ｌ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．Ｒｅｔｉｎａ ３２ Ｓｕｐｐｌ １，４５０−４６０（２０１２））ならびに血管新生加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）の１５〜２０％（Ｂｏｔｔｏｎｉ，Ｆ．，ｅｔ ａｌ．Ａｒｃｈ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ １２３，１６４４−１６５０（２００５））に見出され、網膜の血管形成に関連する高いエネルギー需要に一致する。ＶＥＧＦは黄斑の疾患において血管新生に寄与するが、ＶＥＧＦ分泌を開始する要因はほとんど不明なままである。脂質異常症（Ｄｙｓｌｉｐｉｄｉｍｉａ）およびミトコンドリア機能障害（加齢に関連）は血管新生ＡＭＤの重要なリスク因子である（Ｆｅｅｈａｎ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．ＢＭＣ Ｍｅｄ Ｇｅｎｅｔ １２，８３（２０１１），Ｆｒｉｔｓｃｈｅ，Ｌ．Ｇ．，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ ４０，８９２−８９６（２００８）、およびＢａｒｏｔ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｅｙｅ Ｒｅｓ ３６，１０６９−１０７７（２０１１））。現在、ＡＭＤまたはＭａｃＴｅｌの治療法はない。そのため、ＡＭＤおよび／またはＭａｃＴｅｌを寛解および／または予防する治療学の同定が当分野で必要とされている。
Ｌｉｍ，Ｌ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ ３７９，１７２８−１７３８（２０１２） Ｗｏｎｇ−Ｒｉｌｅｙ，Ｍ．Ｔ．Ｔ．Ｅｙｅ Ｂｒａｉｎ ２，９９−１１６（２０１０） Ｏｋａｗａ，Ｈ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｂｉｏｌ １８，１９１７−１９２１（２００８） Ｙａｎｎｕｚｚｉ，Ｌ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．Ｒｅｔｉｎａ ３２ Ｓｕｐｐｌ １，４５０−４６０（２０１２） Ｂｏｔｔｏｎｉ，Ｆ．，ｅｔ ａｌ．Ａｒｃｈ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ １２３，１６４４−１６５０（２００５） Ｆｅｅｈａｎ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．ＢＭＣ Ｍｅｄ Ｇｅｎｅｔ １２，８３（２０１１） Ｆｒｉｔｓｃｈｅ，Ｌ．Ｇ．，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ ４０，８９２−８９６（２００８） Ｂａｒｏｔ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｅｙｅ Ｒｅｓ ３６，１０６９−１０７７（２０１１）
本発明は、少なくとも一部分、血管形成を特徴とする神経系細胞（例えば、網膜細胞）疾患および／または障害の治療標的としての遊離脂肪酸受容体１（ＦＦＡ１、Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＲ）４０依存性（ＧＰＲ４０）タンパク質としても公知の）の同定に基づく。血管形成を特徴とする眼（例えば、網膜）の疾患または障害の治療または予防のために、ＧＷ１１００、アンチセンスおよび／またはＲＮＡｉ剤などの既知アンタゴニストを含む１以上のアンタゴニストでＦＦＡ１を標的化することが特に検討される。本発明の特定の態様では、本明細書に記載されるＦＦＡ１の標的化が、加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）および未熟児網膜症（ＲＯＰ）などの眼の血管疾患に対して、ならびに網膜変性症および／または一般に腫瘍に対して治療効果を発揮することができることも明らかにされる。関連する態様では、ＦＦＡ１（ＧＰＲ４０）だけでなく、例えば、ＧＰＲ８４および／またはＧＰＲ１２０も同様に標的化することができ、同様の治療効果を有することも本明細書において明らかにされる。
ＦＦＡ１を阻害するさらなる化合物または薬剤をスクリーニングし、同定するための眼および／または網膜細胞の使用も検討される。理論に縛られることを望むものではないが、ＦＦＡ１の阻害は、網膜へのグルコース流入を増加させることによって治療効果を発揮すると思われる。
一態様では、本発明は、対象の神経系細胞における血管形成を治療または予防するための、かつ／あるいは対象において癌を治療または予防するための方法を提供し、該方法は、（ａ）神経系細胞の血管形成を有するかまたはその危険のある対象および／または癌を有するかまたは癌を発症する危険のある対象を同定すること；および（ｂ）ＦＦＡ１阻害剤を対象に投与することとを含み、それにより対象の神経系細胞における血管形成を治療または予防し、かつ／または対象において癌を治療または予防する。
一実施形態では、神経系細胞は網膜細胞、任意選択で視細胞である。
本発明のもう一つの態様は、対象において網膜血管腫状増殖（ＲＡＰ）の血管病変を治療または予防するための方法を提供し、該方法は、（ａ）ＲＡＰの血管病変を有するかまたはそれを発症する危険のある対象を同定することと；および（ｂ）ＦＦＡ１阻害剤を対象に投与することとを含み、それにより、対象においてＲＡＰの血管病変を治療または予防する。
ある種の実施形態では、対象は、黄斑部毛細血管拡張症（ＭａｃＴｅｌ）または血管新生加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）を有する。
一実施形態では、対象の細胞は、適切な対照対象の細胞と比較して、脂質の取り込みが損なわれる。
もう一つの実施形態では、対象は、脂質異常症またはミトコンドリア機能障害を有する。
さらなる実施形態では、ＦＦＡ１阻害剤は、小分子アンタゴニストまたはＲＮＡｉ剤である。
随意に、ＦＦＡ１アンタゴニストはＧＷ１１００である。
ある種の実施形態では、ＦＦＡ１阻害剤は対象の眼に投与される。随意に、ＦＦＡ１阻害剤は、硝子体内注射によって投与される。
もう一つの実施形態では、ＦＦＡ１阻害剤を投与することにより、対象の網膜細胞においてＧＬＵＴ１の発現が増加する。
本発明のさらなる態様は、網膜細胞においてグルコース取り込みを増加させる方法を提供し、該方法は、網膜細胞を入手し、網膜細胞をＦＦＡ１阻害剤と接触させ、それにより網膜細胞でのグルコース取り込みを増加させることを含む。
一実施形態では、網膜細胞は試験管内の網膜細胞である。
ある種の実施形態では、ＧＬＵＴ１発現は、ＦＦＡ１阻害剤と接触した網膜細胞において増加する。
本発明のもう一つの態様は、被検化合物をＦＦＡ１阻害剤であると同定するための方法を提供し、該方法は、網膜細胞と被検化合物を接触させることと；および網膜細胞でのグルコース取り込みを測定することとを含み、被検化合物の存在下で網膜細胞でのグルコース取り込みの増加が測定されれば、被検化合物をＦＦＡ１阻害剤であると同定する。
ある種の実施形態では、網膜細胞は、網膜細胞において脂肪酸の取り込みを抑制する超低密度リポタンパク質受容体（Ｖｌｄｌｒ）遺伝子の突然変異または欠失を有する。
一実施形態では、ＧＬＵＴ１発現は、被検化合物と接触した網膜細胞で増加する。
本発明のさらなる態様は、対象において眼の血管疾患、網膜変性症および／または癌を治療または予防するための方法を提供し、該方法は、（ａ）眼の血管疾患、網膜変性症および／または癌を有するかまたは発症する危険のある対象を同定することと；ならびに（ｂ）ＧＰＲ８４阻害剤を対象に投与することとを含み、それにより対象において眼の血管疾患、網膜変性症および／または癌を治療または予防する。
一実施形態では、ＧＰＲ８４阻害剤は、小分子アンタゴニストまたはＲＮＡｉ剤である。
もう一つの実施形態では、ＧＰＲ８４阻害剤はＧＬＰＧ１２０５である。
ある種の実施形態では、眼の血管疾患は、加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）または未熟児網膜症（ＲＯＰ）である。
本発明のもう一つの態様は、対象において眼の血管疾患、網膜変性症および／または癌を治療または予防するための方法を提供し、該方法は、（ａ）眼の血管疾患、網膜変性症および／または癌を有するかまたは発症する危険のある対象を同定することと；ならびに（ｂ）ＧＰＲ１２０阻害剤を対象に投与することとを含み、それにより対象において眼の血管疾患、網膜変性症および／または癌を治療または予防する。
ある種の実施形態では、ＧＰＲ１２０阻害剤は、小分子アンタゴニストまたはＲＮＡｉ剤である。
もう一つの実施形態では、ＧＰＲ１２０阻害剤は、４−メチル−Ｎ−９Ｈ−キサンテン−９−イル−ベンゼンスルホンアミドである。
定義
別に定義されない限り、本明細書において使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明の属する分野の当業者に一般に理解される意味を有する。以下の参考文献は、本発明で使用される用語の多くの一般的定義を当業者に提供する：Ｔｈｅ Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｗａｌｋｅｒ ｅｄ．，１９８８）；Ｔｈｅ Ｇｌｏｓｓａｒｙ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，５ｔｈ Ｅｄ．，Ｒ．Ｒｉｅｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ（１９９１）；およびＨａｌｅ＆Ｍａｒｈａｍ，Ｔｈｅ Ｈａｒｐｅｒ Ｃｏｌｌｉｎｓ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９１）。本明細書において使用される場合、以下の用語は、別段の指定のない限り、下にそれらについて記載される意味を有する。
別に具体的に述べられているかまたは文脈から明らかでない限り、本明細書において使用される場合、用語「約」は、当技術分野の通常の許容差の範囲内、例えば平均値の２標準偏差以内と理解される。約は、述べた値の１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％、または０．０１％以内と理解され得る。文脈から明らかでない限り、本明細書に記載される全ての数値は約という用語で修飾される。
「薬剤」は、あらゆる小さい化合物、抗体、核酸分子、またはペプチドもしくはそのフラグメントを意味する。「薬剤」には、本明細書下文に定義される「治療薬」が含まれる。
本明細書において使用される場合、「加齢黄斑変性」、または「ＡＭＤ」とは、網膜の中心付近の小さい部分であって鋭い中心視野に必要な眼の部分である黄斑の変質または故障を引き起こす眼の状態をさす。より具体的には、黄斑内の視細胞はゆっくりと死滅する、したがって進行性の視力喪失の主な原因となる。
「寛解させる」とは、疾患の発症または進行を低下させる、抑制する、減弱する、減らす、停止する、または安定化させることを意味する。
「アゴニスト」は、本明細書において使用する場合、タンパク質の生物学的機能を促進する分子である。そのためアゴニストは標的タンパク質に結合してその機能を引き出すことができる。しかし、タンパク質と結合しないアゴニストも想定される。アゴニストは、タンパク質の生物学的機能を直接的または間接的に強化することができる。ある特定の遺伝子の発現を増加させるアゴニストは、本発明の特定の実施形態の範囲内で想定される。適したアゴニストは当業者に明白である。本発明には、アゴニストが標的タンパク質の機能を直接に強化することは必要ではない。むしろ、最終的に標的化されたタンパク質の活性化を導く経路の上流の１以上のタンパク質機能を安定化させるかまたは強化するアゴニストも想定される。あるいは、アゴニストは、標的タンパク質の負の転写制御因子の機能を阻害することがあり、この際、転写制御因子は、最終的に標的タンパク質の転写を阻止する経路の上流で作用する。
「アンタゴニスト」とは、別の分子の活性または結合を、例えばアゴニストの１以上の結合部位と競合することによって妨害するが、活性のある応答を誘導しない分子をさし得る。
本明細書において使用する場合、癌は、以下の種類の癌、乳癌、胆道癌；膀胱癌；神経膠芽腫および髄芽細胞腫を含む脳癌；子宮頸癌；絨毛癌；結腸癌；子宮内膜癌；食道癌；胃癌；急性リンパ性および骨髄性白血病を含む血液腫瘍；Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病／リンパ腫；毛様細胞白血病；慢性骨髄性白血病、多発性骨髄腫；エイズ関連白血病および成人Ｔ細胞白血病リンパ腫；ボーエン病およびパジェット病を含む上皮内腫瘍；肝癌；肺癌；ホジキン病およびリンパ球性リンパ腫を含むリンパ腫；神経芽腫；扁平上皮癌を含む口腔癌；上皮細胞、間質細胞、生殖細胞および間葉系細胞から生じるものを含む卵巣癌；膵臓癌；前立腺癌；直腸癌；平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、脂肪肉腫、線維肉腫、および骨肉腫を含む肉腫；黒色腫、カポジ肉腫、基底細胞癌、および扁平上皮癌を含む皮膚癌；精上皮腫、非精上皮腫（奇形腫、絨毛癌）、間質腫瘍、および胚細胞腫瘍などの胚腫瘍を含む精巣癌；甲状腺腺癌および髄様癌（ｍｅｄｕｌｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）を含む甲状腺癌；ならびに腺癌およびウィルムス腫瘍を含む腎癌を含むことができる。その他の癌は当業者に公知であろう。
本開示において、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」および「有する（ｈａｖｉｎｇ）」などは、米国特許法においてこれらの語のものとされている意味を有し得、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」などを意味し得る；同様に、「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」または「本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ）」は米国特許法においてこれらの語のものとされている意味を有する。この用語はオープンエンドであり、列挙される内容の基本的または新規な特徴が、先行技術の実施形態を除いて列挙される内容よりも多く存在することで変化しない限り、列挙される内容よりも多くの存在が考慮に入れられる。
本明細書に記載される任意の組成物または方法は、本明細書に記載されるその他の組成物および方法のいずれか１以上と組み合わせることができる。
「脂質異常症」とは、異常な量の血中脂質を意味する。脂質異常症は、従来、脂質およびリポタンパク質の上昇パターンによって分類された。より実際的な系は、脂質異常症を原発性または続発性と大別し、それらをコレステロールだけの増加（純粋または単独高コレステロール血症）、ＴＧだけの増加（純粋または単独高トリグリセリド血症）、またはコレステロールとＴＧの両方の増加（混合または複合型高脂血症）によって特徴づける。
「有効量」とは、非処置患者と比較して疾患の症状を寛解させるために必要な薬剤の量を意味する。疾患の治療的処置のために本発明を実行するために使用する１または複数の活性薬剤の有効量は、投与様式、対象の年齢、体重、および全体的な健康に応じて変化する。究極的には、主治医または獣医が適切な量および投与計画を決定することになる。そのような量は、「有効」量と呼ばれる。
「遊離脂肪酸受容体１」または「Ｆｆａ１」は、ＧＰＲ４０、クラスＡ Ｇタンパク質共役型受容体とも呼ばれ、Ｆｆａｒ１遺伝子（ＮＭ＿００５３０３．２ ｍＲＮＡ；ＮＰ＿００５２９４．１ タンパク質）にコードされる。ＦＦＡ１は、中鎖から長鎖脂肪酸によって天然に活性化される。
「阻害核酸」とは、哺乳類細胞に投与すると標的遺伝子の発現の（例えば、１０％、２５％、５０％、７５％の、または９０〜１００％さえの）低下をもたらす、二本鎖ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはアンチセンスＲＮＡ、またはその部分、あるいはその模倣物を意味する。キトサン組成物は、ポリヌクレオチド、例えば阻害核酸分子などの送達に有用であり、病原体感染および関連疾患の治療または予防に有用である。一般に、核酸阻害剤は、標的核酸分子、またはそのオーソログの少なくとも一部を含むか、あるいは標的核酸分子の相補鎖の少なくとも一部を含む。例えば、阻害核酸分子は、本明細書中に描写される核酸のいずれかまたは全ての少なくとも一部を含む。
用語「黄斑」とは、網膜内の小さい領域をさす。黄斑は中心視野を担う網膜の一部であり、ものをはっきり見せる。網膜のほんの小さい部分ではあるが、黄斑は網膜の残りの部分よりも細部に対する感度が高い。多くの高齢者が身体の自然の老化過程の一部として黄斑変性症を発症する。黄斑変性症の症状には、ぼやけ、暗領域または中心視野の歪み、または中心視野の永久喪失さえ含まれる。それは通常、側視力または周辺視力に影響を及ぼさない。
用語「ミトコンドリア病」とは、細胞のミトコンドリアが細胞または臓器機能に十分なエネルギーを産生することができない場合に起こる慢性遺伝性障害をさす。ミトコンドリア病には、ミトコンドリア筋症、真性糖尿病、レーベル遺伝性視神経症、リー症候群、神経障害、運動失調、網膜色素変性症および眼瞼下垂（ＮＡＲＰ）、赤色ぼろ線維・ミオクローヌスてんかん症候群（ＭＥＲＲＦ）およびミトコンドリア筋症・脳筋症・乳酸アシドーシス・脳卒中様発作症候群（ＭＥＬＡＳ）をはじめとする多くの形態がある。
本明細書において使用される場合、「薬剤を入手する」で用いられる「入手する」には、薬剤を合成する、購入する、または別の場合には獲得することが含まれる。
別に具体的に述べられているかまたは文脈から明らかでない限り、本明細書において使用される場合、用語「または」は、包括的であると理解される。別に具体的に述べられているかまたは文脈から明らかでない限り、本明細書において使用される場合、用語「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は単数または複数であると理解される。
「視細胞」とは、網膜におけるニューロンの束を意味する。視細胞は光エネルギー単位（光子）を捕捉し、中枢神経系の電気シグナルとして事象を記録する。次に、情報を処理し構築する網膜のニューロンの中間層にシグナルが伝えられた後、視神経線維に沿って脳に情報が伝達される。
「ＰＰＡＲα」とは、ＰＰＡＲＡ遺伝子にコードされる核タンパク質であるペルオキシソーム増殖因子活性化受容体αを意味する。ＰＰＡＲαは、肝臓での脂質代謝の転写因子および制御因子である。ＰＰＡＲαは主にリガンド結合によって活性化され、例えば、高脂血症を治療するために使用されるフィブラート系薬物、およびペルオキシソーム増殖因子と総称される殺虫剤、除草剤、可塑剤、および有機溶媒の多様な集合を含む。
本明細書において使用される場合、用語「防ぐ」、「防ぐこと」、「予防」、「予防的処置」などは、障害または状態を有していないがそれを発症する危険があるか発症しやすい対象において障害または状態を発症する可能性を減らすことをさす。
「基準」とは、標準または対照、例えば、標準条件または対照条件を意味する。
本明細書に記載される範囲は、範囲内の全ての値の簡潔表現であると理解される。例えば、１〜５０の範囲は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０からなる群の任意の数、数の組合せ、または下位範囲を含むと理解される。
「減少させる」とは、少なくとも１０％、２５％、５０％、７５％、または１００％のマイナスの変更を意味する。
「ｓｉＲＮＡ」とは、二重鎖ＲＮＡを意味する。最適には、ｓｉＲＮＡは、１８、１９、２０、２１、２２、２３または２４ヌクレオチド長であり、その３’末端に２塩基のオーバーハングを有する。これらのｄｓＲＮＡは、個々の細胞または動物の全体に導入することができる；例えば、それらは血流を経由して全身に導入されてよい。そのようなｓｉＲＮＡは、ｍＲＮＡレベルまたはプロモーター活性を下方制御するために使用される。
本明細書において使用される場合、用語「ｓｈＲＮＡ」（低分子ヘアピン型ＲＮＡ）とは、ｓｉＲＮＡの一部がヘアピン構造（ｓｈＲＮＡ）の一部であるＲＮＡ二本鎖をさす。二本鎖部分に加えて、ヘアピン構造は、二本鎖を形成する２つの配列の間に位置するループ部分を含み得る。このループは長さが様々であり得る。一部の実施形態では、ループは５、６、７、８、９、１０、１１、１２または１３ヌクレオチド長である。ヘアピン構造は、３’または５’オーバーハング部分も含むことができる。一部の態様では、オーバーハングは０、１、２、３、４または５ヌクレオチド長の３’または５’オーバーハングである。特定の態様では、ベクター中のヌクレオチド配列は、低分子ヘアピン型ＲＮＡの発現のための鋳型として働き、センス領域、ループ領域およびアンチセンス領域を含む。発現に続いて、センス領域およびアンチセンス領域が二本鎖を形成する。ｓｈＲＮＡを形成するこの二本鎖が、例えばＦｆａｒ１ ｍＲＮＡとハイブリダイズし、ＦＦＡ１の発現を低下させ、新血管形成を誘導する。
「対象」とは、限定されるものではないが、ヒトまたは非ヒト哺乳動物、例えばウシ、ウマ、イヌ、ヒツジ、またはネコなどを含む哺乳動物を意味する。
「治療上有効な量」は、臨床結果を含む有益または望ましい結果をもたらすために十分な量である。有効量は、１回以上の投与で投与することができる。
本明細書において使用される場合、用語「治療する」、「治療すること」、「治療」などは、それに関連する障害および／または症状（例えば、ＡＭＤ、ＭａｃＴｅｌまたはその他の眼の血管形成関連疾患もしくは障害、あるいは一般に腫瘍）を低下させるかまたは寛解させることをさす。排除されないが、障害または状態を治療することが、障害、状態またはそれに関連する症状が完全に除去されることを必要とするものでないことは当然理解される。
用語「腫瘍」、「固形腫瘍」、「原発腫瘍」、および「続発性腫瘍」とは、神経細胞起源の癌腫、肉腫、腺腫、および癌、造血細胞に起源をもたない事実上あらゆる種類の癌をさし、特に：癌腫、肉腫、腺腫、肝細胞癌、肝細胞癌、肝芽腫、横紋筋肉腫、食道癌、甲状腺癌、ガングリオブラストーマ（ｇａｎｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ）、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、滑膜腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、ラブドセリオサルコーマ（ｒｈａｂｄｏｔｈｅｌｉｏｓａｒｃｏｍａ）、結腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、腎細胞癌、血腫、胆管癌、黒色腫、絨毛癌、精上皮腫、胎生期癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽細胞腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、網膜芽細胞腫、多発性骨髄腫、直腸癌、甲状腺癌、頭頸部癌、脳癌、末梢神経系の癌、中枢神経系の癌、神経芽腫、子宮内膜の癌、ならびに上記の全ての転移に関する。
本明細書に記載される任意の組成物または方法は、本明細書に記載されるその他の組成物および方法のいずれか１以上と組み合わせることができる。
本発明のその他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲から当業者に明らかである。
網膜のエネルギー欠乏がＶｌｄｌｒ−／−の血管病変に関連することを示す概略図である。光受容体は、適切な栄養分がそれらのエネルギー需要を満たす場合に、高い代謝速度を有し、ＨＩＦは分解され、ＶＥＧＦは産生されない。解糖のための基質が少ないことと脂肪酸のβ酸化は、分解のためにＨＩＦ１αにタグを付けるプロピルヒドロキシラーゼ（ＰＨＤ）の補因子である、クレブス回路の代謝物質αケトグルタル酸の産生を低下させることがある。ＨＩＦ１αの安定化は、光受容体においてＶＥＧＦ発現を引き起こし、病的新生血管病変の発生を刺激することができる。 深部血管叢（ＤＶＰ）に起源をもち、外網状層を破り（Ｐ１２）、Ｐ１６で光受容体外節（ｏｓ）に向かって伸びるＶｌｄｌｒ−／−網膜の病的血管を示す画像を示す図である；スケール：２００μｍ。ｎ＝５網膜。 網膜のエネルギー需要を増加させるために、通常の１２時間の明／暗サイクル（Ｃｔｌ：対照、ｎ＝２８）と比較した、暗所で育てたＶｌｄｌｒ−／−仔（ｎ＝１０網膜）の画像および棒グラフを示す図である。スケール：１ｍｍ（左）、０．５ｍｍ（その他）。白色の点は血管病変を標識する。（Ｐ＝０．００３１）。 網膜の走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）画像の三次元再構成によって定量されるミトコンドリアの量を示す画像を示す図である；光受容体内のミトコンドリア（偽着色）；ｎ＝２３受容体。スケール：５μｍ。Ｐ＜０．０００１。 網膜のＡＴＰレベルが同腹仔対照ＷＴ（ｎ＝４）と比較してＶｌｄｌｒ−／−網膜（ｎ＝６）において大幅に低下したことを示す棒グラフを示す図である；両側スチューデントｔ検定、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。Ｐ＝０．００２６。結果は平均値±ＳＥＭとして表す。
ＦＡ酸化阻害剤、エトモキシル（４０μＭ）の存在下または不在下で長鎖脂肪酸（ＦＡ）パルミチン酸を供給した野生型（ＷＴ）網膜の酸素消費速度（ＯＣＲ）を示すグラフを示す図である；ｎ＝６〜８網膜。 ＦＡ酸化阻害剤、エトモキシル（４０μＭ）の存在下または不在下で長鎖脂肪酸（ＦＡ）パルミチン酸または対照（Ｃｔｌ：ウシ血清アルブミンまたはＢＳＡ）を供給したＷＴ網膜の最大ＯＣＲを示す棒グラフを示す図である；ｎ＝６〜８網膜。 ＷＴおよびＶｌｄｌｒ−／−マウスにおける循環血漿パルミチン酸レベルを示す棒グラフを示す図である。Ｎ＝７ ＷＴ、１３ Ｖｌｄｌｒ−／−マウス血漿試料；（ｎ＝ＷＴ：７、Ｖｌｄｌｒ−／−：１３網膜 Ｐ＜０．０００１）。 ＬＣ／ＭＳ／ＭＳで測定したＦＡβ酸化レベルの代謝物質の整列を示すヒートマップを示す図である；ｎ＝３動物網膜。 ＬＣ／ＭＳ／ＭＳで測定した総アシルカルニチンおよび遊離カルニチンレベル（Ｐ＝０．００１４）を示す棒グラフを示す図である；ｎ＝３動物網膜。 無傷の網膜のＣｐｔ１ａ ｍＲＮＡ（左：Ｐ＝０．００５２）ｑＲＴ−ＰＣＲによるレーザー・キャプチャー・マクロダイセクション（ＬＣＭ）網膜層を示す棒グラフを示す図である。ＯＮＬ：外核層；ＩＮＬ：内核層（光受容体）およびＧＣＬ：神経節細胞層；ｎ＝３動物網膜。 網膜のγ放射能計数により確認される、１８Ｆ−ＦＤＧマイクロＰＥＴ／ＣＴスキャンにより、Ｖｌｄｌｒ−／−網膜でのグルコース取り込みの低下が明らかになったことを示す画像および棒グラフを示す図である；スケール；４ｍｍ、ｎ＝２２ＷＴ、１２Ｖｌｄｌｒ−／−網膜；Ｐ＝０．０１１６。 ＬＣＭおよびｑＲＴ−ＰＣＲ（ｎ＝３網膜）による、Ｇｌｕｔ１ ｍＲＮＡ（無傷の網膜での発現、左、ｎ＝９ＷＴ；１２Ｖｌｄｌｒ−／−網膜；Ｐ＝０．０１１９）および網膜の層（右）を示す棒グラフを示す図である（両側スチューデントｔ検定（図２Ｃ〜２Ｆおよび図２Ｇ〜２Ｉ）およびチューキー事後分析を含む一元配置分散分析（図２Ｂ、２Ｆ、および２Ｈ）；＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。 無傷のＷＴ網膜およびＶｌｄｌｒ−／−網膜のＧｌｕｔ１タンパク質発現を示す棒グラフおよびブロットを示す図である；ｎ＝６網膜 Ｐ＝０．０３；結果は平均値±ＳＥＭとして表示される両側スチューデントｔ検定（図２Ｃ〜２Ｆおよび図２Ｇ〜２Ｉ）およびチューキー事後分析を含む一元配置分散分析（図２Ｂ、２Ｆ、および２Ｈ）；＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
ＦＦＡ１が網膜のグルコース取り込みおよびＲＡＰを調節することを示す概略図を示す図である。Ｖｌｄｌｒ−／−網膜での脂質取り込みの低下は、脂質センサーＦＦＡ１のアゴニストである細胞外中鎖／長鎖ＦＡを増加させた。これはＧｌｕｔ１発現の低下に関連していた。 ＷＴおよびＶｌｄｌｒ−／−の無傷の網膜におけるＦＡを感知するＧＰＣＲの発現を示す棒グラフを示す図である。 ＬＣＭ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）による網膜の層におけるＦｆａｒ分布を示す棒グラフを示す図である。ＯＮＬ：外核層；ＩＮＬ：内核層、ＧＣＬ：神経節細胞層；ｎ＝３動物網膜；ＦＦＡ１アゴニストＧＷ９５０８。 グルコース取り込み（３Ｈ−２−ＤＧトレーサー）を示す棒グラフを示す図である（ｎ＝Ｃｔｌ：５〜８ｃｔｌ、ＧＷ：９〜１６ ＧＷ処理網膜）。 Ｆｆａ１アゴニストＧＷ９５０８アゴニストＧｌｕｔ１タンパク質発現を示す棒グラフおよびブロットを示す図である（ｎ＝１２網膜；Ｐ＜０．０００１）。 ＷＴおよびＶｌｄｌｒ−／−マウスでのＰ１６のＲＡＰ様病的血管病変の数を示す画像および棒グラフを示す図である。 グルコース取り込みを再び確立したＶｌｄｌｒ−／−マウス（Ｖｌｄｌｒ−／−／Ｆｆａｒ１−／−）におけるＦｆａｒ１の欠失を示す画像を示す図である（１８Ｆ−ＦＤＧ；ｎ＝４網膜；スケール：４ｍｍ、ＧＷ：ｎ＝１１ 溶媒対照：ｎ＝７、Ｐ＝０．０００２））。 Ｖｌｄｌｒ−／−マウスでのＦｆａｒ１欠失（Ｖｌｄｌｒ−／−／Ｆｆａｒ１−／−）がＧｌｕｔ１タンパク質発現をＷＴレベルに対して増加させたことを示す棒グラフおよびブロットを示す図である（ｎ＝ＷＴ：１０、その他９網膜）。 Ｖｌｄｌｒ−／−マウスでのＦｆａｒ１欠失（Ｖｌｄｌｒ−／−／Ｆｆａｒ１−／−）が、同腹仔Ｖｌｄｌｒ−／−／Ｆｆａｒ１＋／＋マウスと比較した、ＷＴ（病変なし）およびＶｌｄｌｒ−／−マウスのＲＡＰ様病的血管病変の数を減少させたことを示す画像および棒グラフを示す図である（Ｐ１６；ｎ＝１０網膜；Ｐ＝０．０１５３）。両側スチューデントｔ検定（図３Ｅ、３Ｆ、および３Ｉ）ならびにダネット（図３Ｂ、３Ｃ、３Ｇ、および３Ｈ）またはチューキー（図３Ｄ）の事後比較を含む一元配置分散分析；＊Ｐ≦０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。結果は平均値±ＳＥＭとして表す。
燃料の欠乏したＶｌｄｌｒ−／−網膜が、より少ないαケトグルタル酸およびより多くのＶｅｇｆを生成したことを示す概略図を示す図である。グルコースおよびＦＡ取り込みの二重の不足がＶｌｄｌｒ−／−網膜のアセチル−ｃｏＡを還元させた（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ；ｎ＝ＷＴ：１１、Ｖｌｄｌｒ−／−：１５動物網膜）。 ピルビン酸およびＦＡ取り込みの二重の不足がＶｌｄｌｒ−／−網膜のアセチル−ｃｏＡを還元させたことを示す棒グラフを示す図である（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ；ｎ＝ＷＴ：１５、Ｖｌｄｌｒ−／−：１２動物網膜；Ｐ＝０．００３２）。 グルコースおよびＦＡ取り込みの二重の不足がＶｌｄｌｒ−／−網膜のアセチル−ｃｏＡを還元させたことを示す棒グラフを示す図である（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ；ｎ＝ＷＴ：１１、Ｖｌｄｌｒ−／−：１５動物網膜；Ｐ＝０．００６９）；アセチルカルニチンを測定することにより推定。 Ｖｌｄｌｒ−／−網膜におけるＴＣＡ（クレブス）回路中間体α−ＫＧを示す棒グラフを示す図である（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ；ｎ＝ＷＴ：１１、Ｖｌｄｌｒ−／−：１５動物網膜；Ｐ＝０．００１６）。酸素（Ｏ２）とともに、α−ＫＧは、プロリンの水酸化（ヒドロキシプロリン）による分解のためにＨＩＦ１αをタグ付けするプロピル−ヒドロキシラーゼデヒドロゲナーゼ（ＰＨＤ）の必須の活性化補助因子である。 ＬＣ／ＭＳ／ＭＳで測定したＷＴおよびＶｌｄｌｒ−／−網膜中のヒドロキシプロリン残基のレベルを示す棒グラフを示す図である；ｎ＝ＷＴ：１５、Ｖｌｄｌｒ−／−：１２動物網膜；Ｐ＝０．０００４）。 ＷＴ、Ｖｌｄｌｒ−／−およびＶｌｄｌｒ−／−／Ｆｆａｒ１−／−網膜核抽出のＨｉｆ１α安定化を示すブロットおよび棒グラフを示す図である。フィブリラリン（Ｆｂｌ）を、核ローディングコントロールとして使用した（ｎ＝３（全ての群））。 Ｖｌｄｌｒ−／−光受容体層におけるＨｉｆ１α網膜発現を示す画像を示す図である。（ＯＮＬ；Ｐ１２網膜フラットマウント）スケール：１００μｍ；左：拡大焦点；中央および右パネル：３Ｄ共焦点ＩＨＣ、ｎ＝３）。 Ｖｅｇｆａも分泌されたことを示す棒グラフを示す図である（Ｐ１６、ＥＬＩＳＡ、ｎ＝６網膜；ｎ＝３網膜）。 Ｖｅｇｆａも分泌されたことおよび３次元共焦点ＩＨＣを示す画像を示す図である。ｎ＝３網膜；スケール１００μｍ；左拡大焦点；中央および右パネル３次元共焦点ＩＨＣ。 網膜血管腫状増殖（ＲＡＰ、ｎ＝３）かまたは脈絡膜血管新生（ＣＮＶ、ｎ＝７）のＡＭＤをもつヒト対象が、ＥＬＩＳＡで病的新生血管のない対照対象（黄斑円孔；ｎ＝８）と比較して高いＶＥＧＦＡ硝子体レベルを有することを示す棒グラフを示す図である。両側スチューデントｔ検定（図４Ｃおよび４Ｄ）、マン・ホイットニー検定（図４Ｂおよび４Ｅ）、および事後ダネット（Ｄｕｎｅｔｔ’ｓ）（図４Ｆおよび４Ｇ）またはチューキーの多重比較（図４Ｈ）を含む一元配置分散分析；＊Ｐ≦０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。結果は平均値±ＳＥＭとして表す。
光受容体選択性のＶｌｄｌｒの枯渇がＲＡＰ様病変を生成することを示す棒グラフを示す図である。ＷＴ（ｎ＝４）、異種接合（ｈｅｔ）Ｖｌｄｌｒ＋／−（ｎ＝５）およびＶｌｄｌｒ−／−マウス（ｎ＝５網膜；ｑＲＴ−ＰＣＲ）における網膜Ｖｌｄｌｒ発現；ｎｓ：有意差なし。 光受容体においてＶｌｄｌｒを局所的にノックダウンするために使用したＶｌｄｌｒ＋／−（Ｈｅｔ）マウスのトリグリセリドを示す棒グラフを示す図である。ｎ＝ＷＴ：７ Ｖｌｄｌｒ＋／−：８血漿。 光受容体においてＶｌｄｌｒを局所的にノックダウンするために使用したＶｌｄｌｒ＋／−（Ｈｅｔ）マウスのパルミチン酸血漿レベルを示す棒グラフを示す図である。ｎ＝ＷＴ：７ Ｖｌｄｌｒ＋／−：８血漿。 光受容体特異的ｈＲＫプロモーターを含むＡＡＶ２ウイルスベクターをクローニングして、蛍光ｅＧＦＰおよびＶｌｄｌｒに対する異なるｓｈＲＮＡを含めるようにしたことを示す画像を示す図である（Ｃａｈｉｌｌ，Ｇ．Ｆ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ２８２，６６８−６７５（１９７０），Ｗｏｎｇ−Ｒｉｌｅｙ，Ｍ．Ｔ．Ｔ．Ｅｙｅ Ｂｒａｉｎ ２，９９−１１６（２０１０）、およびＮｉｕ，Ｙ．−Ｇ．＆Ｅｖａｎｓ，Ｒ．Ｄ．Ｊ Ｌｉｐｉｄｓ ２０１１，１８９８７６（２０１１）。 網膜下ベクター注射（Ｐ１）および網膜収集（Ｐ１２、１６、２６）のタイミングを示す画像を示す図である。 ウイルスベクターの網膜の分布を示す画像を示す図である。 光受容体（ＯＮＬ）におけるウイルスベクターの網膜の分布を示す画像を示す図である。ＯＳ：外節、ＩＳ：内節、ＯＮＬ：外核層、ＩＮＬ：内核層、ＧＣＬ：神経節細胞層；ｎ＝５網膜。 Ｖｌｄｌｒ＋／−マウスにおける３種の異なるｓｈＲＮＡによる網膜Ｖｌｄｌｒ抑制を示す棒グラフを示す図である（ｑＲＴ−ＰＣＲ；ｎ＝ｓｈＣｔｌ：８、ｓｈＲＮＡ−１：１２、ｓｈＲＮＡ−２：４、ｓｈＲＮＡ−３：８網膜）。 Ｖｌｄｌｒ＋／−マウス光受容体においてＶｌｄｌｒを選択的に枯渇させた場合の一部のＲＡＰ様病変の発達を示す画像を示す図である。ＤＶＰ：深部血管叢、ＲＰＥ：網膜色素上皮。ｎ＝５網膜。両側スチューデントｔ検定（図５Ｂおよび５Ｃ）およびダネットの事後比較を含む一元配置分散分析（図５Ａおよび５Ｈ）；＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
脂肪酸およびグルコースがマウス網膜に燃料を供給することを示す概略図を示す図である。図６Ａは、収束してアセチル−ｃｏＡを生成する脂質およびグルコース代謝の大要を概略図で表す。アセチル−ｃｏＡはクレブス（またはＴＣＡ）回路および電子移動鎖（ＥＴＣ）に燃料を供給してＡＴＰを生成する；ｎｓ：有意差なし。 エトモキシル（４０μＭ）の存在下（ｎ＝８）または不在下（ｎ＝６網膜）でパルミチン酸とともにインキュベートした生体外網膜の酸素消費速度（ＯＣＲ）を示すグラフを示す図である。 エトモキシル（４０μＭ）の存在下（ｎ＝８）または不在下（ｎ＝６網膜）でパルミチン酸とともにインキュベートした生体外網膜の最大ＯＣＲを示す棒グラフを示す図である；Ｐ＝０．００２７。 グルコース（１２ｍＭ）とともにインキュベートし、解糖およびグルコース酸化を阻害するために２−デオキシグルコース（２−ＤＧ；１００ｍＭ）で処理したかまたは処理しなかった、生体外網膜のＯＣＲを示すグラフを示す図である；ｎ＝８網膜。 グルコース（１２ｍＭ）とともにインキュベートし、解糖およびグルコース酸化を阻害するために２−デオキシグルコース（２−ＤＧ；１００ｍＭ）で処理したかまたは処理しなかった、生体外網膜の最大ＯＣＲを示す棒グラフを示す図である。ｎ＝８網膜；Ｐ＝０．００１９。 グルコース（ｎ＝８）またはパルミチン酸（ｎ＝６網膜）の、そのそれぞれの阻害剤と比較した最大酸化能を示す棒グラフを示す図である。 グルコースを含む培地中でインキュベートした（１２ｍＭ、６時間）生体外網膜によるグルコース取り込みおよび分泌された乳酸塩を示す棒グラフを示す図である；解糖は、１６のグルコースの大部分を利用することによるものであり、グルコース分子あたり２の乳酸塩を生成する；ｎ＝４網膜。 パルミチン酸が最大ＯＣＲを野生型（ＷＴ；ｎ＝Ｃｔｌ：１５、パルミチン酸：１４網膜）で増加させたが、Ｖｌｄｌｒ−／−網膜では増加させなかった（ｎ＝Ｃｔｌ：１０、パルミチン酸：１３網膜；Ｐ＝０．００３５）ことを示す棒グラフを示す図である；両側マン・ホイットニー（図６Ｂ、６Ｃ、および６Ｆ）またはスチューデントｔ検定（図６Ｄ、６Ｅ、および６Ｈ）；＊＊Ｐ＜０．０１。
Ｖｌｄｌｒ−／−マウスにおける不十分な脂質取り込みを示す画像および棒グラフを示す図である。Ｖｌｄｌｒは、レーザー・キャプチャー・マクロダイセクション（ＬＣＭおよびｑＲＴ−ＰＣＲ）により光受容体（外核層；ＯＮＬ）で高度に発現する。ＧＣＬ：神経節細胞層、ＩＮＬ：内核層、ＲＰＥ：網膜色素上皮。ｎ＝３網膜。 ＷＴマウスの光受容体内節（ＩＳ）の蛍光色素標識した長鎖ＦＡ（Ｂｏｄｉｐｙ Ｃ−１６）が、これらの脂質を経管栄養法で補給したＶｌｄｌｒ−／−マウスと比較して増加したことを示す画像を示す図である。また、脂質取り込みの低下に関連する血清脂質の増加からのＶｌｄｌｒ−／−マウスの明白に濁った血清も言及される（隅）；ｎ＝３網膜。 ＷＴ網膜（ｎ＝１６）と比較した、Ｖｌｄｌｒ−／−（ｎ＝１２）でのブロモパルミチン酸−１４Ｃの網膜取り込みの低下を示す棒グラフを示す図である。 トリグリセリドの増加に関連する、ＷＴ網膜（ｎ＝１６）と比較したＶｌｄｌｒ−／−（ｎ＝１２）でのブロモパルミチン酸−１４Ｃの網膜取り込みの低下を示す棒グラフを示す図である。 ＷＴ網膜（ｎ＝１６）と比較した、Ｖｌｄｌｒ−／−（ｎ＝１２）でのブロモパルミチン酸−１４Ｃの網膜取り込みの低下、ＦＡ血漿レベル（赤色：パルミチン酸、Ｃ１６）を示す画像および棒グラフを示す図である；ｎ＝ＷＴ：７、Ｖｌｄｌｒ−／−；１３血漿試料；両側マン・ホイットニー（図７Ｅ）またはスチューデントｔ検定（図７Ｃ−７Ｅ）およびチューキーの事後比較を含む一元配置分散分析（図７Ａ）；＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
Ｖｌｄｌｒ−／−マウスにおけるＰＰＡＲα（ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体α）の役割を示す棒グラフを示す図である。ＦＡのβ酸化を制御するＰＰＡＲαは、Ｖｌｄｌｒ−／−網膜で抑制された（ｎ＝３、Ｐ＝０．００７９）。 ＦＡのβ酸化を制御するＰＰＡＲαが、Ｖｌｄｌｒ−／−網膜で主に光受容体において抑制されたことを示す棒グラフを示す図である（ＯＮＬ、ｎ＝３動物）。 ＰＰＡＲαアゴニストＷＹ１６４６３が血管病変の数を低下させたことを示す画像および棒グラフを示す図である。Ｃｔｌ：ｎ＝１０、ＷＹ：ｎ＝１２網膜；Ｐ＝０．０４２９。両側スチューデントｔ検定（図８Ａおよび８Ｃ）およびチューキーの事後比較を含む一元配置分散分析（図８Ｂ）；＊Ｐ＜０．０５、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
光受容体による外因性および内因性脂質のＦＡの酸化を示すグラフを示す図である。エトモキシル（４０μＭ）の存在下または不在下で、ＢＳＡと複合化したパルミチン酸とともに、またはＢＳＡのみ（対照）とともにインキュベートした光受容体（６６１Ｗ）の試験管内酸素消費速度（ＯＣＲ）；ｎ＝５〜６網膜。 エトモキシル（４０μＭ）の存在下または不在下で、ＢＳＡと複合化したパルミチン酸とともに、またはＢＳＡのみ（対照）とともにインキュベートした光受容体（６６１Ｗ）の最大酸化能を示す棒グラフを示す図である；ｎ＝５〜６網膜。 パルミチン酸の存在下または不在下、かつＰＰＡＲαアゴニスト（ＧＷ９５７８、１００ｎＭ、４８時間）で処理したかまたは処理していない光受容体（６６１Ｗ）のＯＣＲを示すグラフを示す図である；ｎ＝４〜６網膜。 パルミチン酸の存在下または不在下、かつＰＰＡＲαアゴニスト（ＧＷ９５７８、１００ｎＭ、４８時間）で処理したかまたは処理していない光受容体（６６１Ｗ）の最大酸化能を示す棒グラフを示す図である；ｎ＝４〜６網膜。 パルミチン酸の存在下または不在下、かつＰＰＡＲαアゴニスト（ＧＷ９５７８、１００ｎＭ、４８時間）で処理したかまたは処理していない光受容体（６６１Ｗ）の細胞外酸性化速度（ＥＣＡＲ）を示すグラフを示す図である；ｎ＝４〜６網膜。 パルミチン酸の存在下または不在下、かつＰＰＡＲαアゴニスト（ＧＷ９５７８、１００ｎＭ、４８時間）で処理したかまたは処理していない光受容体（６６１Ｗ）の細胞外酸性化速度（ＥＣＡＲ）を示す棒グラフを示す図である；ｎ＝４〜６網膜。同等の酸性化速度によって示唆されるように、ＰＰＡＲαアゴニストは、解糖にあまり影響を及ぼさずにＦＡのβ酸化を誘導した。チューキーの事後比較を含む一元配置分散分析（図９Ａ〜９Ｄ）およびダンの多重比較を含むクラスカル・ウォリス検定（図９Ｅおよび９Ｆ）；ｎｓ：有意差なし、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
グルコース代謝がＶｌｄｌｒ−／−網膜で抑制されたことを示す画像を示す図である。炭水化物代謝が、ＷＴとＶｌｄｌｒ−／−網膜を比較する遺伝子アレイで最も制御された分子経路であった。Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙパスウェイ解析、ｎ＝３動物（同腹仔）。 解糖の最後の一方向ステップに関連する、ピルビン酸キナーゼ（Ｐｋｍ２）が、遺伝子アレイで高度に制御されたことを示す棒グラフを示す図である。Ｐｋｍ２の抑制は、Ｖｌｄｌｒ−／−網膜でｑＲＴ−ＰＣＲによって確認された。ｎ＝ＷＴ：６、Ｖｌｄｌｒ−／−：５網膜；Ｐ＝０．０２１５。 Ｇｌｕｔ３および４タンパク質発現が、ＷＴ（ｎ＝４）とＶｌｄｌｒ−／−（ｎ＝３）網膜で有意差がなかったことを示す棒グラフおよびブロットを示す図である；両側スチューデントｔ検定；＊Ｐ＜０．０５。
Ｇｌｕｔ１がＦＦＡ１によって制御されることを示す棒グラフを示す図である。ＦＦＡ１アゴニストＧＷ９５０８（ＧＷ）は、ＷＴ Ｐ＝０．０１４２およびＶｌｄｌｒ−／− Ｐ＝０．０２８４においてＧｌｕｔ１発現を低下させる；網膜；ｎ＝１１〜１６網膜。 グルコース取り込み（１８Ｆ−ＦＤＧ）を示す棒グラフを示す図である；Ｖｌｄｌｒ−／−マウスでのＦｆａｒ１欠失は、網膜のグルコース取り込みおよびＧｌｕｔ１発現を再び確立した ｎ＝ｂ：６〜１７、ｃ：３〜９網膜。 ＷＴ、Ｖｌｄｌｒ−／−、Ｖｌｄｌｒ−／−／Ｆｆａｒ１−／−、およびＦｆａｒ１−／−網膜におけるＧｌｕｔ１ ｍＲＮＡ発現を示す棒グラフを示す図である。Ｖｌｄｌｒ−／−マウスでのＦｆａｒ１欠失は、網膜のグルコース取り込みおよびＧｌｕｔ１発現を再び確立した ｎ＝ｂ：６〜１７、ｃ：３〜９網膜。 Ｆｆａｒ１のノックダウン（試験管内）を示す棒グラフを示す図である（ｓｉＲＮＡを使用；Ｐ＝０．００２５）。 ｓｉＲＮＡを使用するＦｆａｒ１のノックダウンが視細胞（６６１Ｗ）でのＧＷ９５０８によるＧｌｕｔ１抑制を妨げたことを示す棒グラフを示す図である；ｎ＝３実験。 ＭＥＫ／ＥＲＫシグナル伝達の抑制（ＰＤ：ＰＤ９８０５９、２０μＭ；Ｐ＝０．００５６）は６６１Ｗ光受容体でＦＦＡ１媒介性のＧｌｕｔ１抑制を妨げたが、ＪＮＫシグナル伝達（ＳＰ：ＳＰ６００１２５、５０μＭ、Ｐ＝０．０１２１）を妨げないことを示す棒グラフを示す図である；ｎ＝３〜７。両側スチューデントｔ検定（図１１Ａ、１１Ｄ、および１１Ｆ）またはマン・ホイットニー（図１１Ｆ）、およびダネットの事後比較（図１１Ｂおよび１１Ｃ）またはボンフェローニの事後比較（図１１Ｅ）を含む一元配置分散分析；＊Ｐ≦０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。結果は平均値±ＳＥＭとして表す。
ＦＦＡ１アゴニストが網膜血管腫増殖を増加させたことを示す画像を示す図である。ＦＦＡ１は、Ｃ＞６の脂肪酸によって活性化される（Ｂｒｉｓｃｏｅ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ２７８：１１３０３−１１３１１）。Ｃ８〜１０のＭＣＴ（中鎖トリグリセリド；ｎ＝１０網膜）を与えられたマウスは、血管病変の数を対照と比較して２倍超に増加させた（通常の生理食塩水；ｎ＝１５網膜；Ｐ＝０．００１１）。 ＭＣＴを与えたマウスは、Ｖｌｄｌｒ−／−網膜においてＧｌｕｔ１発現を抑制したことを示す棒グラフを示す図である；ｎ＝６網膜；Ｐ＝０．０２３１。 選択的ＦＦＡ１アゴニストＴＡＫ−８７５がＲＡＰ様病変の数を有意に増加させたことを示す画像および棒グラフを示す図である；Ｃｔｌ：ｎ＝９、ＴＡＫ：ｎ＝８網膜；Ｐ＝０．００３５；スケール：１ｍｍ。結果は平均値±ＳＥＭとして表す。両側スチューデントｔ検定；＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。
ＦＦＡ１が光受容体においてＨｉｆαを安定化させ、Ｖｅｇｆａ分泌を促進することを示すブロットおよび棒グラフを示す図である。生体内ＦＦＡ１アゴニストＧＷ９５０８（ＧＷ）はＷＴ網膜でＨｉｆαを安定化させた；ｎ＝６実験；Ｐ＝０．００４４。 ＦＦＡ１アゴニストＧＷ９５０８（ＧＷ）がＶｌｄｌｒ−／−網膜においてＨｉｆαを安定化させたことを示すブロットおよび棒グラフを示す図である；ｎ＝６実験；Ｐ＝０．０４１１。 ＧＷ９５０８で処理したかまたはグルコース飢餓状態の光受容体（６６１Ｗ）でのグルコース取り込みの低下が、安定化されたＨｉｆαに関連していたことを示すブロットおよび棒グラフを示す図である；ｎ＝３実験；Ｐ＝０．０００６。 ＧＷ９５０８で処理したかまたはグルコース飢餓状態の光受容体（６６１Ｗ）でのグルコース取り込みの低下が、Ｖｅｇｆａ発現の増加に関連していたことを示す棒グラフを示す図である；ｎ＝３実験。 ＧＷ９５０８で処理したかまたはグルコース飢餓状態の光受容体（６６１Ｗ）でのグルコース取り込みの低下が、分泌に関連していたことを示す棒グラフを示す図である（ＥＬＩＳＡ）；ｎ＝３実験；Ｐ＝０．００１３。両側スチューデントｔ検定（図１３Ａ、１３Ｃおよび１３Ｅ）またはマン・ホイットニー検定（図１３Ｂ）およびボンフェローニ事後比較を含む二元配置分散分析（図１３Ｄ）； ＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。結果は平均値±ＳＥＭとして表す。
マクロファージが成熟（早期未成熟以外の）ＲＡＰ様病変を囲むことを示す棒グラフを示す図である。マクロファージのマーカー（ＣＤ６８）は、Ｖｌｄｌｒ−／−ＲＡＰ様病変発生の初期段階（Ｐ１２）で増加せず、より多くの血管病変を有する、暗所で育てた仔でさえも増加しなかった；ｎ＝７〜１３網膜。 炎症性サイトカイン（ＴＮＦα）が、Ｖｌｄｌｒ−／−ＲＡＰ様病変発生の初期段階（Ｐ１２）で増加せず、より多くの血管病変を有する、暗所で育てた仔でさえも増加しなかったことを示す棒グラフを示す図である；ｎ＝７〜１３網膜。 マクロファージ／ミクログリア細胞（ＩｂＡ１、緑色）を示す画像を示す図である。 これらの病変の共焦点断面によって確認されるように、マクロファージ／ミクログリア細胞が成熟血管レジオン（ｌｅｇｉｏｎｓ）を囲んでいることを示す画像を示す図である；ｎ＝５網膜。 これらの病変の共焦点断面によって確認されるように、マクロファージ／ミクログリア細胞が、深部血管叢（ＤＶＰ）に近い新生のＲＡＰ様血管を囲まなかったことを示す画像を示す図である。ｎ＝５網膜。ＯＮＬ：外核層。スケールバー：図１４Ｅ、２０μｍ。ダンの多重比較を含むクラスカル・ウォリス検定；＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。
本発明は、少なくとも一部分、網膜はエネルギーのために脂肪酸（ＦＡ）β酸化を用い、そして特に脂質センサーであるＦＦＡ１は、ＦＡが利用可能な場合にグルコース取り込みを抑えるという発見に基づく。ＦＦＡ１のそのような役割の発見は、少なくとも一部分、血管形成を特徴とする神経系細胞（例えば、網膜細胞）の疾患または障害が、治療有効量／予防有効量のＦＦＡ１阻害剤を対象および／またはモデル系に投与することによって対象および／またはモデル系で効果的に治療または予防されることができることを示す。随意に、加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）および未熟児網膜症（ＲＯＰ）などの眼の血管疾患の治療、ならびに網膜変性症および／または腫瘍の治療も、通常、本発明の阻害剤に検討される。関連する態様では、ＦＦＡ１（ＧＰＲ４０）だけでなく、例えば、ＧＰＲ８４および／またはＧＰＲ１２０も標的化して同様の治療効果を得ることができる。小分子化合物および阻害核酸を含む既知ＦＦＡ１阻害剤の使用は、明白に検討される。例えば、例えば化合物ライブラリーと接触させた網膜細胞（随意にＶｌｄｌｒ欠失を含む）のグルコース取り込みの試験管内モニタリングによる、新しいＦＦＡ１阻害剤を同定するための方法も検討される。
本発明のさらなる態様および実施形態は下に説明される。
作用機構
理論に縛られることを望むものではないが、本発明は以下の方法で機能すると考えられる。代謝速度の高い組織は、グルコースだけでなく脂質もエネルギーに使用している場合が多く、栄養豊富時および欠乏時に生存に有利となる（Ｃａｈｉｌｌ，Ｇ．Ｆ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ２８２，６６８−６７５（１９７０））。現在の定説は、高いエネルギーを消費する光受容体はグルコースに依存していることを示唆する（Ｗｏｎｇ−Ｒｉｌｅｙ，Ｍ．Ｔ．Ｔ．Ｅｙｅ Ｂｒａｉｎ ２，９９−１１６（２０１０））。代謝速度の高い組織で発現する超低密度リポタンパク質受容体（ＶＬＤＬＲ）は、トリグリセリド由来のＦＡの取り込みを促進する（Ｎｉｕ，Ｙ．−Ｇ．＆Ｅｖａｎｓ，Ｒ．Ｄ．Ｊ Ｌｉｐｉｄｓ ２０１１，１８９８７６（２０１１））。Ｖｌｄｌｒは光受容体に存在する（Ｄｏｒｒｅｌｌ，Ｍ．Ｉ．，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １１９，６１１−６２３（２００９））。Ｖｌｄｌｒ−／−網膜では、ＦＦＡ１は、ＦＡ取り込みが低いにもかかわらず高い循環脂質レベルを感知し（Ｇｏｕｄｒｉａａｎ，Ｊ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｌｉｐｉｄ ｒｅｓｅａｒｃｈ ４５，１４７５−１４８１（２００４））、グルコース輸送体Ｇｌｕｔ１を抑制する。この光受容体へのグルコース流入の低下は、脂質／グルコースの二重の燃料不足およびクレブス回路の中間体α−ケトグルタル酸（ＫＧ）の低下をもたらす。α−ＫＧレベルの低下は、低酸素誘導因子１α（Ｈｉｆ１α）の安定化および飢餓Ｖｌｄｌｒ−／−光受容体による血管内皮細胞増殖因子（Ｖｅｇｆａ）の分泌を促進し、新生血管に燃料を供給させる。Ｖｌｄｌｒ−／−網膜において通常無血管の光受容体に侵入するこれらの異常な血管は、血管新生加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）のサブセットである網膜血管腫状増殖（ＲＡＰ）によく似ており（Ｂｏｔｔｏｎｉ，Ｆ．，ｅｔ ａｌ．Ａｒｃｈ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ １２３，１６４４−１６５０（２００５））、ヒトでの高い硝子体ＶＥＧＦレベルに関連している。そのため、調節不全の脂質およびグルコースの光受容体エネルギー代謝は、血管新生ＡＭＤおよびその他の網膜疾患の駆動力となり得る。
網膜血管新生（ＲＡＰ）は、黄斑部毛細血管拡張症（ＭａｃＴｅｌ）において（Ｙａｎｎｕｚｚｉ，Ｌ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．Ｒｅｔｉｎａ ３２ Ｓｕｐｐｌ １，４５０−４６０（２０１２））、ならびに黄斑新生血管の加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）の１５〜２０％において見られ（Ｂｏｔｔｏｎｉ，Ｆ．，ｅｔ ａｌ．Ａｒｃｈ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ １２３，１６４４−１６５０（２００５））、高齢者の失明の主原因である（Ｌｉｍ，Ｌ．Ｓ．，Ｌａｎｃｅｔ ３７９，１７２８−１７３８（２０１２））。黄斑で最も高密度な光受容体は、最も多くエネルギーを消費し、ミトコンドリアが豊富な細胞の中にあり（Ｗｏｎｇ−Ｒｉｌｅｙ，Ｅｙｅ Ｂｒａｉｎ ２，９９−１１６（２０１０）、およびＯｋａｗａ，Ｃｕｒｒ Ｂｉｏｌ １８，１９１７−１９２１（２００８））、黄斑の血管新生を引き起こす高いエネルギー需要に一致する。ＶＥＧＦは網膜の血管新生に寄与するが、黄斑の疾患においてＶＥＧＦ分泌を開始させる因子はほとんど不明のままである。異常を起こした光受容体ミトコンドリアのエネルギー代謝は、燃料供給を増加させようとして通常無血管の光受容体で異常な血管形成を推進すると仮定され、血管新生ＡＭＤの重要なリスク因子である脂質異常症およびミトコンドリア機能障害（加齢に関連）に一致した（Ｌｉｍ，Ｌ．Ｓ．，Ｌａｎｃｅｔ ３７９，１７２８−１７３８（２０１２）。
網膜のニューロンは、燃料をグルコースに頼ると考えられている（Ｗｏｎｇ−Ｒｉｌｅｙ，Ｅｙｅ Ｂｒａｉｎ ２，９９−１１６（２０１０）、およびＣｏｈｅｎ，Ｌ．Ｈ．＆Ｎｏｅｌｌ，Ｗ．Ｋ．Ｊ Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ ５，２５３−２７６（１９６０））。グルコースは代謝されて（解糖により）ピルビン酸となり、サイトゾルで乳酸塩に変換されるかまたはミトコンドリアでアセチル−ＣｏＡに酸化されるかのいずれかの後、クレブス回路に入ってＡＴＰを生成する。光受容体において、主なグルコース輸送体はＧＬＵＴ１である（Ｍａｎｔｙｃｈ，Ｇ．Ｊ．，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３３，６００−６０７（１９９３）、およびＧｏｓｐｅ，Ｓ．Ｍ．，Ｊ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ １２３，３６３９−３６４４（２０１０））。臨床的に、ＧＬＵＴ１欠乏症は乳幼児けいれんおよび発育遅延を引き起こし（Ｋｌｅｐｐｅｒ，Ｊ．Ｅｐｉｌｅｐｓｉａ ４９ Ｓｕｐｐｌ ８，４６−４９（２００８））、脳におけるグルコース代謝の重要性を強調する。しかし、ＧＬＵＴ１欠乏個体は、通常の視力を有し、おそらく脂質β酸化による代わりの網膜エネルギー基質が存在することを示唆する。
脂質β酸化は、代謝速度の高い心筋および骨格筋において一般的であり、そこでは豊富なＶＬＤＬＲが脂肪酸（ＦＡ）取り込みを促進する（Ｌｏｐａｓｃｈｕｋ，Ｇ．Ｄ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｒｅｖ ９０，２０７−２５８（２０１０））。ＶＬＤＬＲはカイロミクロンに結合し、リポタンパク質リパーゼによるトリグリセリド（ＴＧ）からの長鎖ＦＡの切断を可能にする（Ｇｏｕｄｒｉａａｎ，Ｊ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ ４５，１４７５−１４８１（２００４））（Ｇｏｕｄｒｉａａｎ，Ｊ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｌｉｐｉｄ ｒｅｓｅａｒｃｈ ４５，１４７５−１４８１（２００４））。ＶＬＤＬＲは、内皮細胞を越えた活性リポタンパク質リパーゼの経細胞輸送を促進して（Ｏｂｕｎｉｋｅ，Ｊ．Ｃ．，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７６，８９３４−８９４１（２００１））遊離ＦＡを組織に送達し、Ｖｌｄｌｒ欠失は、心臓において脂質取り込みおよびＦＡのβ酸化を抑制する（Ｎｉｕ，Ｙ．−Ｇ．＆Ｅｖａｎｓ，Ｒ．Ｄ．Ｊ Ｌｉｐｉｄｓ ２０１１，１８９８７６（２０１１））。Ｖｌｄｌｒが豊富で脂質の豊富な光受容体で同様の機構が仮定された。脂質β酸化酵素は眼で発現する（Ｔｙｎｉ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｅｄｉａｔｒ Ｒｅｓ ５６，７４４−７５０（２００４））。臨床的に、ＶＬＤＬＲ欠失は黄斑症を引き起こし（Ｓａｒａｃ，Ｏ．，ｅｔ ａｌ．，Ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ Ｇｅｎｅｔ ３３，２４９−２５２（２０１２））、Ｖｌｄｌｒ−／−マウスはＲＡＰ様網膜血管病変を発症する（図１Ａ）（Ｄｏｒｒｅｌｌ，Ｍ．Ｉ．，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １１９，６１１−６２３（２００９））。Ｖｌｄｌｒ−／−マウスにより、脂質は光受容体に燃料を供給し、燃料の欠乏は新生血管を促進するという仮説の調査が可能である。
加齢黄斑変性（ＡＭＤ）
ＡＭＤは一般的な癌疾患であり、５０歳以上の人の失明の主な原因である。ＡＭＤは、網膜の中心付近の小さい部分であって鋭い中心視野に必要な眼の部分である黄斑への損傷を引き起こし、この中心視野により我々は真っ直ぐ前にある対象物を見ることができる。一部の人々において、ＡＭＤは長期間失明が起こらないほどゆっくり進行する。その他の人々では、疾患は速く進行し、片目または両目の視力を失うこともある。ＡＭＤが進行するにつれて、視野の中心に近い領域がぼやけることが一般的な症状である。時間とともに、ぼやけた領域がさらに大きくなるか、または中心視野に空白部分ができることがある。対象物はまた前にそうであったほど鮮やかに見えない可能性がある。
ＡＭＤ自体は、見る能力のない全盲をもたらすものではない。しかし、ＡＭＤにおいて中心視野を失うことにより、簡単な日常の活動、例えば顔を見る、運転する、読む、書く、あるいは細かい作業、例えば料理または家中の修理などをする能力などが妨害され得る。
脂質異常症
脂質異常症は、血液中の脂質の量が異常であることを特徴とする。先進国では、大部分の脂質異常症は、高脂血症であり、食事およびライフスタイルに起因する場合が多い。脂質異常症は、従来、脂質およびリポタンパク質の上昇パターンによって分類された。より実際的な系は、脂質異常症を原発性または続発性と大別し、それらをコレステロールだけの増加（純粋または単独高コレステロール血症）、ＴＧだけの増加（純粋または単独高トリグリセリド血症）、またはコレステロールとＴＧの両方の増加（混合または複合型高脂血症）によって特徴づける。
脂質異常症は通常症状を引き起こさないが、冠動脈疾患（ＣＡＤ）、脳卒中、および末梢動脈疾患をはじめとする症候性血管疾患を導く可能性がある。高レベルのＴＧ（＞１０００ｍｇ／ｄＬ［＞１１．３ｍｍｏｌ／Ｌ］）は、急性膵炎を引き起こし得る。高レベルのＬＤＬは、角膜輪、ならびにアキレス腱、肘と膝の腱、および中手指節関節の至る所で腱黄色腫を引き起こし得る。
ミトコンドリア病（加齢性）
ミトコンドリア病は、細胞のミトコンドリアが細胞または臓器機能に十分なエネルギーを産生することができない場合に起こる慢性遺伝性障害である。発生率は、米国で約１：４０００個体である。ミトコンドリア病には、ミトコンドリア筋症、真性糖尿病、レーベル遺伝性視神経症、リー症候群、神経障害、運動失調、網膜色素変性症および眼瞼下垂（ＮＡＲＰ）、赤色ぼろ線維・ミオクローヌスてんかん症候群（ＭＥＲＲＦ）およびミトコンドリア筋症・脳筋症・乳酸アシドーシス・脳卒中様発作症候群（ＭＥＬＡＳ）をはじめとする多くの形態がある。
ミトコンドリアの疾患は、脳、心臓、肝臓、骨格筋、腎臓および内分泌系および呼吸器系の細胞に最も大きい損傷を引き起こすと思われる。どの細胞が罹患するかによって、症状には、運動制御の喪失、筋力低下および疼痛、胃腸障害および嚥下障害、成長不良、心疾患、肝疾患、糖尿病、呼吸器系合併症、発作、視覚／聴覚問題、乳酸アシドーシス、発育遅延および感染に対する感受性が含まれることがある。
黄斑
黄斑は、鋭い中心視野をもたらす数百万個の光感知細胞で構成されている。黄斑は網膜の最も感受性の高い部分であり、眼底に位置する。網膜は光を電気シグナルに変えた後、これらの電気シグナルを視神経を通って脳に送り、そこで電気シグナルは我々の理解する画像に翻訳される。黄斑が損傷を受けている場合、視野の中心はぼんやり、歪んで、または暗く見えることがある。
ＭａｃＴｅｌ（黄斑部毛細血管拡張症）
黄斑部毛細血管拡張症は、黄斑が影響を受ける疾患であり、中心視野の喪失を引き起こす。黄斑は、網膜の小さい領域（眼底の内側を覆う光感受性組織）であり、中心視野を担って細部をよりはっきり見せる。黄斑部毛細血管拡張症は、黄斑の中心である中心窩の周囲の細い血管に問題がある場合に発症する。黄斑部毛細血管拡張症には２つの種類（１型および２型）があり、各々は異なる形で血管に影響を及ぼす。黄斑部毛細血管拡張症は、網膜の血管疾患、あるいは糖尿病または高血圧症などの全身疾患の結果として起こることがあるが、多くの例では、臨床所見で既知の原因が明らかになることはない。
黄斑部毛細血管拡張症の重篤な合併症の一つは、網膜下の異常血管の発生である。これは脈絡膜血管新生と呼ばれ、血管内皮細胞増殖因子阻害剤（抗ＶＥＧＦ）と呼ばれる薬物の注射を必要とすることがある。抗ＶＥＧＦ薬物療法は、網膜下で異常血管を増殖させる眼内の特定の化学物質を標的にする。その化学物質は血管内皮細胞増殖因子、またはＶＥＧＦと呼ばれる。ＶＥＧＦを薬物注射によって遮断することにより、異常血管の増殖を減らし、それらの漏出を遅くし、網膜の腫脹を減らすのを助け、一部の例では、視力を改善することができる。
１型黄斑部毛細血管拡張症
１型黄斑部毛細血管拡張症では、血管は拡張して小さい動脈瘤を形成し、腫脹を引き起こし、黄斑細胞を損傷する。この疾患は大抵片目に起こり、そのことが１型と２型を区別する。
２型黄斑部毛細血管拡張症
黄斑部毛細血管拡張症の最も一般的な形は２型黄斑部毛細血管拡張症であり、そこでは中心窩の周囲の小血管が漏れるか、拡張する（広くなる）か、またはその両方となる。それは原因不明の両側性疾患であり、その特徴的な変化は黄斑部の毛細血管網および神経感覚の萎縮である。一部の例では、新しい血管が網膜の下に生じ、それらも破裂または漏出し得る。血管から漏出している液体は黄斑を腫脹または肥厚させ（黄斑浮腫と呼ばれる状態）、それは中心視野に影響を及ぼす。また、瘢痕組織も黄斑および中心窩の上に時々生じ、細部視力の喪失を引き起こす。２型は両眼に影響を及ぼすが、必ずしも同じ重症度ではない。
ＲＡＰ（網膜血管腫状増殖）
ＲＡＰは、神経感覚網膜内で起こり、毛細血管増殖、網膜内血管新生の形成、および網膜間吻合（ａｎａｓｔａｍｏｓｅｓ）で始まる血管プロセスを説明する。ＲＡＰ病変は、文献で自然歴が乏しいと特徴づけられてきたが、リファレンスグループが何かは不明である。また、これらの記載が視力結果をさすのか解剖結果をさすのか、または両方をさすのかどうかも不明である。ＲＡＰ病変について報告している文献の中で繰り返される別のテーマは、これらの病変が治療にあまり反応しないこと、および失明を減少させ、病変を制御するのに有益であることが示された明確な治療法が示されていないことである。これにより、直接レーザー光凝固術、経瞳孔温熱療法、病変の外科的除去、網膜フィーダー血管の外科的切除、硝子体内のトリアムシノロン（ｔｒｉａｍｉｎｃｏｌｏｎｅ）、眼周囲の酢酸アネコルタブを含むまたは含まないフルオレセインまたはインドシアニングリーン（ＩＣＧ）染料でガイドされる光線力学療法（ＰＤＴ）、ペガプタニブナトリウム（ＥｙｅＴｅｃｈ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ）、ラニビズマブ（Ｌｕｃｅｎｔｉｓ、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ Ｉｎｃ，Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、またはベバシズマブ（Ａｖａｓｔｉｎ、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ Ｉｎｃ，Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いる抗血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）レジメン、あるいは様々な上記の組合せを含む、あらゆるＡＭＤ関連ＣＮＶ病変に使用されてきた治療法に似ている治療法のリストによって、これらの病変の多様な治療様式の使用がもたらされた。
未熟児網膜症（ＲＯＰ）
未熟児網膜症（ＲＯＰ）は、失明の可能性のある眼疾患であり、妊娠３１週以前に産まれた（正産期は妊娠３８〜４２週）体重が約２・３／４ポンド（１２５０グラム）以下の早産児に主に影響を及ぼす。出生時に小さい乳児ほど、その乳児がＲＯＰとなる可能性は高い。この障害（通常、両目に発症する）は、幼児期の失明の最も一般的な原因の一つであり、一生の視覚障害および失明につながり得る。ＲＯＰが最初に診断されたのは１９４２年であった。
新生児医療の進歩によって、より小さく、より早産の乳児が救われている。これらの乳児はＲＯＰの危険性が非常に高い。全ての未熟な乳児がＲＯＰを発症するものではない。およそ３９０万人の乳児が毎年米国で産まれている；このうち、約２８，０００人が２・３／４ポンド以下の重さである。これらの乳児の約１４，０００〜１６，０００人が何らかの程度のＲＯＰに罹患している。ＲＯＰのより軽い症例では、この疾患は好転し、永久損傷が残らない。ＲＯＰをもつ全ての乳児の約９０パーセントが軽度の分類に入り、治療を必要としない。しかし、より重篤な疾患をもつ乳児は、視覚障害または失明にさえなることがあり得る。約１，１００〜１，５００人の乳児が毎年、医学的処置を必要とするほど重篤なＲＯＰを発症する。米国で毎年約４００〜６００人の乳児がＲＯＰによって法律上盲目となる。
ＲＯＰは５つのステージに分類され、軽度（ステージＩ）から重度（ステージＶ）に及ぶ：
ステージＩ−軽度の異常な血管成長。ステージＩを発症する多くの小児は治療せずに改善し、最終的に正常な視力となる。疾患はさらに進行せず、自力で回復する。
ステージＩＩ−中程度の異常な血管成長。ステージＩＩを発症する多くの小児は治療せずに改善し、最終的に正常な視力となる。疾患はさらに進行せず、自力で回復する。
ステージＩＩＩ−重度の異常な血管成長。異常血管は、網膜の表面に沿った正常な成長パターンをたどる代わりに、眼の中心に向かって成長する。ステージＩＩＩを発症する一部の小児は治療せずに改善し、最終的に正常な視力となる。しかし、乳児がある程度のステージＩＩＩであり、「ｐｌｕｓ ｄｉｓｅａｓｅ」を発症する場合、治療が検討される。「Ｐｌｕｓ ｄｉｓｅａｓｅ」は、網膜の血管が拡張し捻れることを意味し、疾患の悪化を示す。この時点で治療するとかなりの可能性で網膜剥離を予防することができる。
ステージＩＶ−部分網膜剥離。出血する異常な血管によって生じた瘢痕からの牽引が網膜を眼球壁から引き離す。
ステージＶ−全網膜剥離および疾患の末期。眼がこのステージで放っておかれている場合、乳児は重度の視覚障害、さらに失明さえする可能性がある。
ＲＯＰを発症する大部分の乳児はステージＩまたはＩＩである。しかし、少数の乳児でＲＯＰは時には非常に急速に悪化する。未治療のＲＯＰは、視覚を損なう恐れがある。
ＲＯＰをもつ乳児は、以降の人生で特定の眼の問題、例えば網膜剥離、近視（近眼）、斜視（寄り目）、弱視（レイジーアイ）、および緑内障などを発症する危険がより高いと考えられる。多くの例で、これらの眼の問題は治療または制御することができる。
ＲＯＰは、異常血管が成長し、眼底を覆う組織である網膜の至る所に広がる時に起こる。これらの異常血管は脆いので、漏れて網膜に傷痕を残し、網膜を定位置から引き離す可能性がある。これが網膜剥離を引き起こす。網膜剥離は、ＲＯＰにおいて視力障害および失明の主な原因である。
いくつかの複雑な要因がＲＯＰの発症の一因であり得る。眼は妊娠約１６週で発達し始め、その時、網膜の血管は眼底の視神経を形成し始める。血管は発達中の網膜の端部に向かって徐々に成長し、酸素および栄養分を供給する。妊娠の最後の１２週の間に、眼は急速に発達する。乳児が正期に産まれる場合、網膜の血管成長はほぼ完了している（網膜は通常出生後数週から１カ月に発達を終える）。しかし、これらの血管が網膜の端部に到達する前に、乳児が未熟児で産まれる場合、正常な血管の成長が止まることがある。網膜の端部−末梢−は、十分な酸素および栄養分を得られないことがある。
網膜の末梢はその後、栄養分を求めて網膜のその他の領域にシグナルを送ると考えられる。結果として、新しい異常な血管が成長し始める。これらの新しい血管は脆弱であるので、出血し、網膜の瘢痕となり得る。これらの瘢痕が収縮すると、瘢痕が網膜を引っ張り、網膜を眼底から剥離させる。
今まで、ＲＯＰの最も有効な証明済みの治療は、レーザー療法または寒冷療法である。レーザー療法は、正常な血管のない網膜の末梢を「焼き払う」。寒冷療法では、医師は、網膜の末梢に重なる眼表面上の点に短時間触れるために氷点下温度を生成する機器を使用する。レーザー療法と寒冷療法の両方が網膜の末梢領域を破壊し、血管の異常な成長を遅くするかまたは逆転させる。残念ながら、これらの治療法は一部の側方視野も破壊する。これは、我々の視界の最も重要な部分−我々が読書、裁縫、および運転などの「真っ直ぐ前の」活動に必要な、鋭い中心視野、を救うために行われる。
レーザー療法も寒冷療法も、進行ＲＯＰをもつ乳児、特に「ｐｌｕｓ ｄｉｓｅａｓｅ」のあるステージＩＩＩの乳児にのみ実施される。両方の治療法は眼の侵襲的手術と考えられ、医師は各々の長期の副作用を知らない。
ＲＯＰの後期には、他の治療法の選択肢としては、以下が挙げられる：
・強膜バックル。これは、シリコーンバンドを眼の周囲に置き、それを締めることを含む。これにより硝子体ゲルが瘢痕組織に引き寄せられないようにし、網膜を平らにして眼球壁上に戻すことができる。眼は成長し続けているので、強膜バックルを設置した乳児は、数カ月または数年後にバンドを取り外す必要がある；そうしないとこの乳児は近視になる。強膜バックルは通常、ステージＩＶまたはＶの乳児に行われる。
・硝子体切除術。硝子体除去術は、硝子体を除去し、それを生理食塩水溶液で置き換えることを含む。硝子体を除去した後、網膜の瘢痕組織を剥がすかまたは切除することができ、網膜を緩め、眼壁に対して後方に押し付けることができる。硝子体切除術は、ステージＶでしか行われない。
ＲＯＰ治療は失明の確率を減らすが、それは常に失明を阻止するとは限らない。全ての乳児がＲＯＰ治療に応答するわけではないので、疾患が悪化することもある。ＲＯＰの治療が効かない場合、網膜剥離が起こることがある。多くの場合、網膜の一部だけが剥離する（ステージＩＶ）。部分的な剥離は同じ状態のままであることもあり、治療せずに治ることもあるので、これが起こるとさらなる治療が必要でなくなる場合がある。しかし、一部の例では、網膜剥離のさらなる進行（ステージＶ）を阻止しようとする治療を医者が勧めることがある。網膜の中心または網膜全体が剥離すると、中心視野が脅かされるので、網膜を再び付着させるための手術が勧められることがある。
ＦＦＡ１（ＧＰＲ４０とも呼ばれる）
「遊離脂肪酸受容体１」または「ＦＦＡ１」は、ＧＰＲ４０、クラスＡ Ｇタンパク質共役型受容体とも呼ばれ、Ｆｆａｒ１遺伝子にコードされる。ＦＦＡ１は、中鎖から長鎖脂肪酸によって活性化される。ＧＰＣＲは、生理機能の多様性に重要な細胞内シグナル伝達経路を活性化することによって多様な分子に応答する７つの推定膜貫通ドメインを有することを特徴とする膜タンパク質である。ＦＦＡ１は、オーファン受容体（すなわち既知リガンドのない受容体）としてヒトゲノムＤＮＡ断片から最初に同定された。ＦＦＡ１は膵臓β細胞およびインスリン分泌細胞株で高度に発現する。ＦＦＡ１活性化は、細胞内シグナル伝達タンパク質のＧｑファミリーの調節およびカルシウムレベルの上昇の同時誘導に関連付けられる。脂肪酸がＦＦＡ１のリガンドとして機能すること、および脂肪酸がＦＦＡ１を通してインスリン分泌を調節することは認識されている。Ｇタンパク質共役型受容体の調節（例えば、選択的アゴニスト刺激）により、ホスホリパーゼＣが活性化され、イノシトール１，４，５−トリホスフェートおよびジアシルグリセロールが産生され、および細胞内カルシウムのレベルが増加し、これはカスパーゼ依存性アポトーシス経路を活性化する（Ｔｓｕｊｉｈａｔａ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｅｘｐ Ｔｈｅｒ ３３９：２２８−２３７（２０１１）；およびＢｒｉｓｃｏｅ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｂｉｏ Ｃｈｅｍ ２７８，１１３０３−１１３１１（２００３））。ＧＰＲ４０アゴニスト（例えば、選択的アゴニスト刺激による）は、特定の癌細胞（例えば、神経冠組織に由来する癌）の増殖を阻害するか、またはアポトーシスを誘導するために使用されてきた。さらに、ＧＰＲ４０アゴニストは、特定の癌および癌細胞株に細胞毒性効果をもたらすことが報告されている。ＧＰＲ４０のアゴニスト刺激（例えば、ω−３脂肪酸経由）は、阻害し、癌の治療および／または予防に有用なシグナル伝達経路を活性化する。
ＧＰＣＲは７つの膜貫通ドメインを有する膜タンパク質であり、多様な分子に応答することができ、それによって細胞内シグナル伝達経路を活性化することができ、多様な生理機能の達成に重要である。ＦＦＡ１は、パルミチン酸、オレイン酸、ステアリン酸、リノール酸、およびリノレン酸、ならびに同類のものなどの血漿中の大部分の一般脂肪酸と結合する能力のある、細胞表面で同定される最初の脂肪酸受容体であった。ＦＦＡ１は、いくつかの組織依存性の役割を果たす、栄養分を感知する受容体と考えられることができ、その役割は全体的なグルコース利用および／または脂肪代謝に影響を及ぼすことがある。例えば、長鎖ＦＦＡは、ＦＦＡ１の活性化を通して膵臓の１３細胞でＧＳＩＳを増幅する。一連のＦＦＡ１アゴニストが、一部の特許出願、例えば国際公開第２００５０８７７１０号、国際公開第２００５０５１８９０号、および国際公開第２００４１０６２７６号などによって開示されている。
その他のＧＰＣＲ
本発明の組成物、製剤および方法による標的化に検討されるその他のＧＰＣＲとしては、ＧＰＲ１２０、ＧＰＲ４４（プロスタグランジンＤ２受容体２（ＤＰ２）とも呼ばれる）、ＧＰＲ４２、ＧＰＲ８４、およびヒト等価物が挙げられる。例えば、ＧＰＲ１２０は、ω３脂肪酸の抗炎症作用およびインスリン抵抗性改善作用を媒介することが示されており、ＧＰＲ１２０の欠乏は、脂肪代謝の低下の原因であり、それによって肥満症をもたらす。例となるＧＰＲ１２０阻害剤としては、４−メチル−Ｎ−９Ｈ−キサンテン−９−イル−ベンゼンスルホンアミドを挙げることができる。
別の例では、ＧＰＲ８４は、炭素鎖長がＣ９〜Ｃ１４の中鎖ＦＦＡの受容体である。その発現は、炎症において高度に誘導可能であり、好中球でのその発現は、ＬＰＳ刺激によって増加させ、ＧＭ−ＣＳＦ刺激によって減少させることができる。ＧＰＲ８４は、ＬＰＳによって単球（ｏｎｏｃｙｔｅｓ）／マクロファージで誘導された短鎖および長鎖の飽和および不飽和ＦＦＡによって活性化されない。その上、単球／マクロファージでのＧＰＲ８４の活性化は、ＬＰＳに刺激されたＩＬ−１２ ｐ４０産生を濃度依存的様式で増幅させることがある。例となるＧＰＲ８４阻害剤はＧＬＰＧ１２０５である。
糖尿病性網膜症
糖尿病性網膜症は、網膜の血管に影響を及ぼし、糖尿病をもつ人々の中で失明の最も一般的な原因であり、労働年齢の成人の中で視覚障害および失明の主な原因でもある糖尿病性眼疾患を説明する。糖尿病由来の慢性的高血糖は、網膜の血管の損傷に関連し、それによって糖尿病性網膜症となる。これは水晶体の湾曲を変え、かすみ目の症状を生じる。水晶体の腫脹の結果として遠視力がぼやけることは、ひとたび血糖値がコントロールされれば治まる。糖尿病をもつ患者における血糖値のより良いコントロールも、糖尿病性網膜症の発症および進行を遅くする。糖尿病性網膜症の症状には、対象の視野に点または浮遊物が見えること、かすみ目、対象の視野の中央に暗いかまたは空の点があること、および夜に目が見えにくいことが含まれ得る。糖尿病性網膜症は、４つのステージを経て進行し得る：
Ｉ．軽度の非増殖性網膜症：網膜血管の腫脹の小さな領域が、毛細血管瘤と呼ばれる小さい膨隆をその壁から突出させることが起こり得る。
ＩＩ．中程度の非増殖性網膜症：疾患の進行により血管腫脹および歪みを引き起こし、そのために血管の血液を輸送する能力に影響が及ぶ。
ＩＩＩ．重度の非増殖性網膜症：より多くの血管が遮断され、網膜の領域への血液供給を奪う。
ＩＶ．増殖性糖尿病性網膜症：網膜によって分泌される増殖因子が新しい血管の成長を誘発する疾患の進行期。新しい血管は網膜の内面に沿って、さらに眼を満たす流体の中に成長する。新しい血管の脆弱性により、新しい血管は漏れやすく、出血しやすい。瘢痕組織は網膜剥離（網膜を下にある組織から引きはがすこと）を引き起こし得る。網膜剥離は永久的な失明を引き起こし得る。
脂肪酸受容体ＧＰＲ４０は、２型糖尿病の治療のための潜在的な治療標的として注目されてきた。当分野は、ＧＰＲ４０の活性化が糖耐性を改善し、それが次に２型糖尿病の治療（例えば、アゴニストＴＡＫ−８７５）に有益となるという考えを支持する。しかし、文献はＧＰＲ４０の抑制が２型糖尿病を治療するために有益であるかどうかに関して不明なままである。小分子アンタゴニスト（ＤＣ２６０１２６）は、β細胞の過負荷を減らすことによって膵臓β細胞機能不全から保護することが実証された。
ＦＦＡ１阻害剤
ＦＦＡ１の阻害剤が、本発明の方法および組成物での使用について検討される。そのような阻害剤には、小分子と核酸阻害因子の両方が含まれる。ＦＦＡ１の小分子阻害剤には、以下が含まれる。
ＧＷ−１１００（エチル４−［５−［（２−エトキシピリミジン−５−イル）メチル］−２−［（４−フルオロフェニル）メチルスルファニル］−４−オキソピリミジン−１−イル］ベンゾエート）は、以下の構造を有するＦＦＡ１の既知阻害剤である。
ＤＣ２６０１２６（Ｎ−（４−ブチルフェニル）−４−フルオロ−ベンゼンスルホンアミド）は、ＧＰＲ４０の小分子アンタゴニストと同定されたもう一つの化合物であり（Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．ＰＬＯＳ ＤＯＩ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００６６７４４）、以下の構造を有する。

その他の当該技術分野で承認されている、ＦＦＡ１、およびＧＰＣＲ阻害剤としては、より一般には、例えば、百日咳毒素が挙げられる。
上記のＦＦＡ１阻害剤化合物は単なる例である。それは、当該技術分野で承認されているあらゆるＦＦＡ１阻害剤が本発明の方法および組成物で使用されることが検討されているためである。
神経変性
神経変性は、ニューロンの構造および機能の進行性の喪失を特徴とし、ニューロンの死滅も含まれる。筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病、アルツハイマー病、およびハンチントン病をはじめとする多くの神経変性疾患は、神経変性プロセスの結果として起こる。そのような疾患は不治であり、結果的にニューロン細胞の進行性の変性および／または死をもたらす。神経変性疾患のごく一部（５％未満）だけが遺伝子突然変異によって起こり、残りは脳での有毒タンパク質の蓄積とミトコンドリア機能の喪失によって起こり、それによって神経毒性分子のレベルが増加する。研究が進歩するにつれて、これらの疾患を細胞下レベルで互いに関連付ける多くの類似点が現れる。異なる神経変性疾患間には、非定型タンパク質アセンブリと誘導された細胞死を含む、多くの類似点がある。神経変性は、分子から全身に及ぶ多くの異なるレベルの神経回路に見出すことができる。神経変性疾患の最大のリスク因子は加齢である。ミトコンドリアＤＮＡ突然変異と酸化ストレスの両方が加齢の一因となる。これらの疾患の多くが遅発性であり、各疾患の根本要因は、年齢とともに神経の機能が徐々に失われることである。現在、神経変性を治癒するために利用可能な治療法はない。疾患の各々に関して、薬物療法は症状を軽減し、患者の生活の質を改善するのに役立つことができるだけである。
癌
本発明は、癌の治療のための方法をさらに提供することができ、より具体的には、悪性細胞の代謝を変えるために使用することができる。癌は、身体のシステムの正常機能に干渉する細胞の制御できない増殖とも呼ぶことができる。その本来の位置から移動して重要な臓器に播種する癌は、罹患した臓器の機能悪化によって対象の死を引き起こし得る。癌腫は、上皮細胞に生じる悪性の癌であり、それには腺癌および扁平上皮癌が含まれる。肉腫は、結合組織または支持組織の癌であり、それには骨肉腫、軟骨肉腫および消化管間質腫瘍が含まれる。造血性癌、例えば白血病などは、対象において正常な造血区画に勝つことができ、それによって造血不全を（貧血、血小板減少症および好中球減少症の形で）引き起こし、究極的には死をもたらす。当業者は、癌を肉腫、癌腫または造血性癌に分類することができる。
本明細書において使用する場合、癌には、以下の種類の癌、乳癌、胆道癌；膀胱癌；神経膠芽腫および髄芽細胞腫を含む脳癌；子宮頸癌；絨毛癌；結腸癌；子宮内膜癌；食道癌；胃癌；急性リンパ性および骨髄性白血病を含む血液腫瘍；Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病／リンパ腫；毛様細胞白血病；慢性（ｃｈｒｏｍｉｃ）骨髄性白血病、多発性骨髄腫；エイズ関連白血病および成人Ｔ細胞白血病リンパ腫；ボーエン病およびパジェット病を含む上皮内腫瘍；肝癌；肺癌；ホジキン病およびリンパ球性リンパ腫を含むリンパ腫；神経芽腫；扁平上皮癌を含む口腔癌；上皮細胞、間質細胞、生殖細胞および間葉系細胞から生じるものを含む卵巣癌；膵臓癌；前立腺癌；直腸癌；平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、脂肪肉腫、線維肉腫、および骨肉腫を含む肉腫；黒色腫、カポジ肉腫、基底細胞癌、および扁平上皮癌を含む皮膚癌；精上皮腫、非精上皮腫（奇形腫、絨毛癌）、間質腫瘍、および胚細胞腫瘍などの胚腫瘍を含む精巣癌；甲状腺腺癌およびメデュラーカルシノーマ（ｍｅｄｕｌｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）を含む甲状腺癌；ならびに腺癌およびウィルムス腫瘍を含む腎癌が含まれる。その他の癌は当業者に公知であろう。
阻害核酸
本発明のｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡまたはその他の阻害核酸も、生体内で組換えウイルスベクターから細胞内に、または血管新生の領域の近傍に発現させることができる。本発明の組換えウイルスベクターは、本発明のｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡまたはその他の阻害核酸をコードする配列、およびｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡまたはその他の阻害核酸配列を発現させるために適した任意のプロモーターを含む。適したプロモーターとしては、例えば、Ｕ６またはＨ１ ＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター配列およびサイトメガロウイルスプロモーターが挙げられる。その他の適したプロモーターの選択は、当技術分野の技術の範囲内である。また、本発明の組換えウイルスベクターは、特定の組織における、または特定の細胞内環境におけるｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡまたはその他の阻害核酸の発現のための誘導性または調節可能プロモーターも含むことができる。本発明のｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡまたはその他の阻害核酸を生体内で細胞に送達するための組換えウイルスベクターの使用は、下文でより詳細に考察される。
本発明のｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡまたはその他の阻害核酸は、組換えウイルスベクターから、２つの別々の相補ＲＮＡ分子として、または２つのコンプリメンタリー（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔａｒｙ）領域をもつ単一のＲＮＡ分子として発現することができる。
本明細書において使用される場合、用語「ベクター」とは、それに連結されているもう一つの核酸を輸送する能力のある核酸分子をさす。ベクターの一つの種類が「プラスミド」であり、これは追加のＤＮＡセグメントをその中に連結することのできる環状の二本鎖ＤＮＡループをさす。別の種類のベクターは、追加のＤＮＡセグメントをウイルスゲノムに連結することのできるウイルスベクターである。ある特定のベクターは、それらが導入されている宿主細胞において自己複製する能力がある（例えば、細菌複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳類ベクター）。その他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳類ベクター）は、宿主細胞への導入時に、宿主細胞のゲノムに組み込まれ、それによって宿主ゲノムとともに複製される。さらに、ある特定のベクター（発現ベクター）は、それらが作動可能に連結されている遺伝子の発現を指示する能力がある。
概して、本発明において有用なベクターとしては、限定されるものではないが、本発明による核酸の挿入または組み込みによって操作されたプラスミド、ファージミド、ウイルス、ウイルス源もしくは細菌源に由来するその他の媒体が挙げられる。ウイルスベクターは例となるベクターの種類であり、それには、限定されるものではないが、以下のウイルス由来の核酸配列が含まれる：レトロウイルス、例えばモロニーネズミ白血病ウイルス、ハーベイネズミ肉腫ウイルス、ネズミ***腫瘍ウイルス、およびラウス肉腫ウイルスなど；アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス；ＳＶ４０型ウイルス；ポリオーマウイルス；エプスタイン・バーウイルス；パピローマウイルス；ヘルペスウイルス；ワクシニアウイルス；ポリオウイルス；ならびにレトロウイルスなどのＲＮＡウイルス。命名されていないが当技術分野で公知のその他のベクターを容易に使用することができる。
ある特定のウイルスベクターは、非必須遺伝子が目的の遺伝子で置き換えられている非細胞変性真核生物ウイルスに基づく。非細胞変性ウイルスには、レトロウイルス（例えば、レンチウイルス）が含まれ、その生活環はゲノムウイルスＲＮＡのＤＮＡへの逆転写とそれに続く宿主細胞ＤＮＡへのプロウイルスの組み込みを伴う。レトロウイルスは、ヒト遺伝子治療試験に認可されている。最も有用なレトロウイルスは、複製欠損（すなわち、所望のタンパク質の合成を指示する能力があるが、感染粒子を産生する能力はない）レトロウイルスである。そのような遺伝子改変レトロウイルス発現ベクターは、生体内での遺伝子の高効率形質導入に一般用途を有する。複製欠損レトロウイルスを作製するための標準プロトコール（プラスミドへの外来性遺伝物質の組み込み、プラスミドによるパッケージング細胞株のトランスフェクション、パッケージング細胞株による組換えレトロウイルスの産生、組織培養培地からのウイルス粒子の回収、およびウイルス粒子による標的細胞の感染のステップを含む）は、Ｍｕｒｒｙ，“Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，”ｖｏｌ．７，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｃｈｉｆｆｏｎ，Ｎ．Ｊ．，１９９１に記載されている。
本発明の核酸剤の送達に有用な特定のウイルスは、アデノウイルスおよびアデノ随伴（ＡＡＶ）ウイルスであり、これは遺伝子療法でのヒト使用が既に認可されている二本鎖ＤＮＡウイルスである。実際に１２の異なるＡＡＶ血清型（ＡＡＶ１〜１２）が知られていて、各々は異なる組織指向性をもつ（Ｗｕ Ｚ，Ａｓｏｋａｎ Ａ，Ｓａｍｕｌｓｋｉ Ｒ Ｊ：Ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｓｅｒｏｔｙｐｅｓ：ｖｅｃｔｏｒ ｔｏｏｌｋｉｔ ｆｏｒ ｈｕｍａｎ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １４：３１６−３２７，２００６）。組換えＡＡＶは、依存性パルボウイルスＡＡＶ２に由来する（Ｃｈｏｉ Ｖ Ｗ，Ｓａｍｕｌｓｋｉ Ｒ Ｊ，ＭｃＣａｒｔｙ Ｄ Ｍ：Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ＤＮＡ ｈａｉｒｐｉｎ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｎ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７９：６８０１−６８０７，２００５）。アデノ随伴ウイルス１型〜１２型は、複製欠損となるように操作されることができ、広範囲の細胞型および種を感染させる能力がある（Ｗｕ Ｚ，Ａｓｏｋａｎ Ａ，Ｓａｍｕｌｓｋｉ Ｒ Ｊ：Ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｓｅｒｏｔｙｐｅｓ：ｖｅｃｔｏｒ ｔｏｏｌｋｉｔ ｆｏｒ ｈｕｍａｎ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １４：３１６−３２７，２００６）。それはさらに、熱および脂質溶媒安定性；造血細胞を含む多様な系譜の細胞での高い形質導入頻度；ならびに重複感染抑制がないので、複数の系列の形質導入が可能である、などの利点を有する。報告によれば、アデノ随伴ウイルスは、ヒト細胞のＤＮＡに部位特異的な様式で組み込むことができ、それによってレトロウイルス感染に特有の挿入変異の可能性および挿入された遺伝子発現の変異性を最小にすることができる。その上、野生型アデノ随伴ウイルス感染は、組織培養において選択圧の不在下で１００回超の継代の間追跡されており、これはアデノ随伴ウイルスのゲノム組み込みが比較的安定な事象であることを意味する。アデノ随伴ウイルスはまた、染色体外でも機能することができ、大部部の組換えアデノウイルスは染色体外である。網膜の保護された環境において、ＡＡＶベクターは、高レベルの導入遺伝子発現を網膜色素性上皮（ＲＰＥ）、光受容体、または神経節細胞で一回の処置の後に長期間維持することが可能である。各細胞型は、ＡＡＶ血清型、プロモーター、および眼内注射の部位の適切な組合せを選択することによって特異的に標的化することができる（Ｄｉｎｃｕｌｅｓｃｕ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２００５ Ｊｕｎ；１６（６）：６４９−６３およびＬｅｂｈｅｒｚ，Ｃ．，Ｍａｇｕｉｒｅ，Ａ．，Ｔａｎｇ，Ｗ．，Ｂｅｎｎｅｔｔ，Ｊ．＆Ｗｉｌｓｏｎ，Ｊ．Ｍ．Ｎｏｖｅｌ ＡＡＶ ｓｅｒｏｔｙｐｅｓ ｆｏｒ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｏｃｕｌａｒ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ．Ｊ Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ １０，３７５−８２（２００８））。一実施形態では、ＡＡＶ血清型８が特に適している。
発現させるｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡまたはその他の１または複数の阻害核酸分子のコード配列を受け取る能力のあるいかなるウイルスベクターも、例えばアデノウイルス（ＡＶ）；アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）；レトロウイルス（例えば、レンチウイルス（ＬＶ）、ラブドウイルス、ネズミ白血病ウイルス）；疱疹ウイルス、および同類のものに由来するベクターを使用することができる。ウイルスベクターの指向性は、他のウイルス由来の外被タンパク質またはその他の表面抗原でベクターをシュードタイプすることによって変更することもできる。例えば、本発明のＡＡＶベクターは、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、狂犬病、エボラ、モコラ、および同類のもの由来の表面タンパク質でシュードタイプすることができる。
本発明での使用に適した組換えウイルスベクターの選択、ｓｉＲＮＡを発現させるための核酸配列をベクターに挿入するための方法、およびウイルスベクターを目的の細胞に送達する方法は、当技術分野の技術の範囲内である。例えば、その全開示内容が参照により本明細書に組み込まれる、Ｄｏｒｎｂｕｒｇ Ｒ（１９９５），Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐ．２：３０１−３１０；Ｅｇｌｉｔｉｓ Ｍ Ａ（１９９８），Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：６０８−６１４；Ｍｉｌｌｅｒ Ａ Ｄ（１９９０），Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐ．１：５−１４；およびＡｎｄｅｒｓｏｎ Ｗ Ｆ（１９９８），Ｎａｔｕｒｅ ３９２：２５−３０を参照されたい。
随意に、ＡＶおよびＡＡＶ由来のウイルスベクターが用いられる。ある種の実施形態では、本発明のｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡまたはその他の阻害核酸は、例えばＵ６またはＨ１ ＲＮＡプロモーターのいずれかを含む組換えＡＡＶベクター、あるいはサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターから、２つの別々の相補的な一本鎖ＲＮＡ分子として発現する。
本発明のｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡまたはその他の阻害核酸を発現させるために適したＡＶベクター、組換えＡＶベクターを構築するための方法、およびベクターを標的細胞に送達するための方法は、Ｘｉａ Ｈ ｅｔ ａｌ．（２００２），Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２０：１００６−１０１０に記載されている。
本発明のｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡまたはその他の阻害核酸を発現させるために適したＡＡＶベクター、組換えＡＡＶベクターを構築するための方法、およびベクターを標的細胞に送達するための方法は、Ｓａｍｕｌｓｋｉ Ｒ ｅｔ ａｌ．（１９８７）、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６１：３０９６−３１０１；Ｆｉｓｈｅｒ Ｋ Ｊ ｅｔ ａｌ．（１９９６），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７０：５２０−５３２；Ｓａｍｕｌｓｋｉ Ｒ ｅｔ ａｌ．（１９８９），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：３８２２−３８２６；米国特許第５，２５２，４７９号；５，１３９，９４１号；国際特許出願公開第９４／１３７８８号；および国際特許出願公開第９３／２４６４１号に記載されており、その全開示内容は参照により本明細書に組み込まれる。
生体内での核酸の非ウイルス投与は、多様な方法によって達成されている。これらには、リポフェクチン／リポソーム融合Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ８４，ｐｐ７４１３−７４１７（１９９３）、アデノウイルス増強を伴うまたは伴わないポリリジン縮合Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ３，ｐｐ１４７−１５４（１９９２）、および細胞への核酸のトランスフェリン輸送受容体送達Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ８７，ｐｐ３４１０−３４１４（１９９０）が挙げられる。ポリアクリル酸からなる特異的組成物の使用が国際公開第９４／２４９８３号に開示されている。裸のＤＮＡは、国際公開第９０／１１０９２号に開示されるように投与された。
ある種の実施形態では、本発明の核酸を標的細胞に導入するためにリポソームおよび／またはナノ粒子の使用が検討される。
リポソームは、リン脂質から形成され、リン脂質は水性媒体中に分散され、自発的に多重膜同心二層小胞（多重膜小胞（ＭＬＶ）とも呼ばれる）を形成する。ＭＬＶは通常２５ｎｍ〜４μｍの直径を有する。ＭＬＶを超音波処置すると、中心部に水溶液を含有する、直径が２００〜５００Åの範囲の小型単層小胞（ＳＵＶ）が形成される。
リポソーム媒介性トランスフェクションで遭遇する困難および危険を制限するように設計された合成陽イオン性脂質を用いて核酸の生体内トランスフェクションのためのリポソームを調製することができる。陽イオン性脂質を使用すると、負に帯電した核酸の封入を促進でき、負に帯電した細胞膜との融合も促進できる（Ｆｅｌｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８９）。
あるいは、生体内で細胞膜を横切って核酸を送達する最も簡単で最も安全な方法の一つは、高濃度遊離もしくは裸のポリヌクレオチド（一般にｍＲＮＡまたはＤＮＡ）を直接適用することを伴うことがある。「裸のＤＮＡ（またはＲＮＡ）」とは、これまでに他の化学部分と複合化されていないＤＮＡ（ＲＮＡ）分子を意味する。動物細胞による裸のＤＮＡの取り込みは、賦形剤および核酸と同時に細胞を投与することによって増加することがある。そのような賦形剤は、細胞膜を横切るＤＮＡの浸透を、したがって治療薬の細胞送達を強化するかまたは増加させる試薬である。様々な賦形剤、例えば界面活性剤、例えばＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、ドデシル硫酸ナトリウム、Ｔｗｅｅｎ２０、およびＴｗｅｅｎ８０からなる群から選択される界面活性剤；細菌毒素、例としてストレプトリジンＯ、コレラ毒素、および大腸菌の組換え修飾された不安定毒素；ならびに多糖類、例えばグルコース、スクロース、フルクトース、またはマルトースなど、例として、細胞膜付近の浸透圧を混乱させることによって作用するものが当技術分野で記載されている。遊離ポリヌクレオチドの送達を強化するその他の方法、例えば細胞外ヌクレアーゼと細胞内ヌクレアーゼの両方による内側または外側からの核酸分解切断によるポリヌクレオチド不活性化の遮断が記載されている。
ある種の実施形態では、本発明の核酸は、異種調節領域、例えば、異種プロモーターの制御下にある。このプロモーターは、通常、活性なプロモーターであり得、またはある特定の実施形態では、例えば、眼および／または光受容体特異的プロモーター、例えば３つのバージョンのヒト赤錐体オプシンプロモーター（ＰＲＯ．５、３ＬＣＲ−ＰＲＯ．５およびＰＲ２．１）、ヒト青錐体オプシンプロモーターＨＢ５６９（Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２００８ Ｊｕｌ；１５（１４）：１０４９−５５．Ｅｐｕｂ ２００８ Ｍａｒ １３．，Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｔｏ ｃｏｎｅｓ ｗｉｔｈ ｈｕｍａｎ ｃｏｎｅ ｏｐｓｉｎ ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ ｉｎ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＡＡＶ．Ｋｏｍａｒｏｍｙ Ａ Ｍ，Ａｌｅｘａｎｄｅｒ Ｊ Ｊ，Ｃｏｏｐｅｒ Ａ Ｅ，Ｃｈｉｏｄｏ Ｖ Ａ，Ｇｌｕｓｈａｋｏｖａ Ｌ Ｇ，Ａｃｌａｎｄ Ｇ Ｍ，Ｈａｕｓｗｉｒｔｈ Ｗ Ｗ，Ａｇｕｉｒｒｅ Ｇ Ｄ）など；３つの光受容体特異的プロモーター（光受容体間レチノイド結合タンパク質−ＩＲＰＢ１７８３；グアニル酸シクラーゼ活性化タンパク質１−ＧＣＡＰ２９２；ロドプシン−ｍＯＰ５００）‘（Ｍｏｌ Ｖｉｓ．２００７ Ｏｃｔ １８；１３：２００１−１１．Ｔａｒｇｅｔｅｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｗｏ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｎｅｕｒａｌ ｒｅｔｉｎａ ｕｓｉｎｇ ｓｅｌｆ−ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｎｇ，ｉｎｓｕｌａｔｅｄ ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ ｃａｒｒｙｉｎｇ ｔｗｏ ｉｎｔｅｒｎａｌ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ．Ｓｅｍｐｌｅ−Ｒｏｗｌａｎｄ Ｓ Ｌ，Ｅｃｃｌｅｓ Ｋ Ｓ，Ｈｕｍｂｅｒｓｔｏｎｅ Ｅ Ｊ．）ヒトロドプシンキナーゼ（ＲＫ）プロモーター（Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ．２００７ Ｓｅｐ；４８（９）：３９５４−６１．ＡＡＶ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ ｒｏｄ ａｎｄ ｃｏｎｅ ｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｗｉｔｈ ａ ｈｕｍａｎ ｒｈｏｄｏｐｓｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ．Ｋｈａｎｉ Ｓ Ｃ，Ｐａｗｌｙｋ Ｂ Ｓ，Ｂｕｌｇａｋｏｖ Ｏ Ｖ，Ｋａｓｐｅｒｅｋ Ｅ，Ｙｏｕｎｇ Ｊ Ｅ，Ａｄａｍｉａｎ Ｍ，Ｓｕｎ Ｘ，Ｓｍｉｔｈ Ａ Ｊ，Ａｌｉ Ｒ Ｒ，Ｌｉ Ｔ．）；錐体トランスデューシンのαサブユニットまたは錐体光受容体調節エレメント１（ＣＰＲＥ−１）のプロモーター、ＴａｌｐｈａＣプロモーター中の新規な２０−ｂｐエンハンサーエレメント（Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２００８ Ａｐｒ １８；２８３（１６）：１０８８１−９１．Ｅｐｕｂ ２００８ Ｆｅｂ １３．Ａ ｎｏｖｅｌ，ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｉｌｙ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｅｎｈａｎｃｅｒ ｏｆ ｃｏｎｅ ｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｓｍｙｔｈ Ｖ Ａ，Ｄｉ Ｌｏｒｅｎｚｏ Ｄ，Ｋｅｎｎｅｄｙ Ｂ Ｎ．）、オーファン核内受容体Ｎｒ２ｅ３のプロモーター；ヒト網膜グアニル酸シクラーゼ１（ｒｅｔＧＣ１）のプロモーター、および錐体転写因子ＴｒΒ２［（ＰｅｎｇおよびＣｈｅｎ，２００５；Ｏｈ ｅｔ ａｌ．，２００７）ホスホジエステラーゼ、ＰＤＥ６Ｂのβサブユニットのプロモーター（Ｍａｌｉ ｅｔ ａｌ．，２００７）であり得る。プロモーターは、ヒトロドプシン（ｈＲＨＯ）、ヒト赤オプシン（ｈＲＯ）、ヒト緑オプシンおよびマウス錐体アレスチン−３（ｍＣＡＲ）からなる遺伝子の群から随意に選択することもできる。ある特定の実施形態では、マウス錐体アレスチン−３（ｍＣＡＲ）が使用され得る。
本発明の核酸を、随意に光受容体と接触するように投与する適した方法、すなわち侵襲的および非侵襲的方法は、当技術分野で周知である。２以上の経路を用いて核酸を投与することもできるが、ある特定の経路は、他の経路よりも即時的でより有効な反応を提供することができる。したがって、記載される投与経路は、単なる例であり、決して制限的ではない。したがって、この方法は、所望の効果を達成するために、本発明の核酸を動物、随意にヒトに投与する様式に依存しない。そうであるから、いかなる投与経路も、本発明の核酸が適切な宿主細胞（例えば、眼細胞、例えば、ＦＦＡ１抑制による血管形成を治療または予防する際に関与する網膜および／または網膜に関連する細胞）を標的にする限り適切である。本発明の核酸は、適切に処方され、注射、目薬、軟膏、インプラントなどの形で投与されることができる。本発明の核酸は、例えば、全身に、局所に、結膜下に、眼内に、眼球後方に、眼周囲に、網膜下に、または脈絡膜上に適用することができる。特定の例では、標的化された眼細胞（例えば、網膜細胞および／または網膜関連細胞）を本発明の核酸に確実に十分に曝露するために、複数回適用を行い、複数の経路（例えば、網膜下および硝子体内）を用いることが適切であり得る。本発明の核酸の複数回適用も、望ましい効果を達成するために必要とされ得る。
特定の例に応じて、本発明の核酸を患者に非侵襲的に投与することが望ましいであろう。例えば、複数の手術が行われて、患者が麻酔に対して低い耐性を示す場合、またはその他の眼関連障害が存在する場合、本発明による核酸の局所投与が最も適切であることがある。局所製剤は、当業者に周知である。そのような製剤は、本発明の状況において眼への適用に適している。パッチ、角膜シールド（例えば、米国特許第５，１８５，１５２号参照）、および点眼液（例えば、米国特許第５，７１０，１８２号参照）および軟膏、例えば、点眼薬の使用も、当分野の技術の範囲内である。また、本発明の核酸は、無針注射装置、例えばＢｉｏｊｅｃｔ社より入手可能なＢｉｏｊｅｃｔｏｒ ２０００ Ｎｅｅｄｌｅ−Ｆｒｅｅ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ Ｓｙｓｔｅｍ＠を用いて非侵襲的に投与することもできる。
本発明の核酸は、核酸の制御もしくは持続放出を可能にする装置、例えば眼スポンジ（ｏｃｕｌａｒ ｓｐｏｎｇｅ）、網目構造、機械的リザーバー、または機械的インプラントなどの中または上に随意に存在することができる。インプラント（例えば、米国特許第５，４４３，５０５号、４，８５３，２２４号および４，９９７，６５２号参照）、装置（例えば、米国特許第５，５５４，１８７号、４，８６３，４５７号、５，０９８，４４３号および５，７２５，４９３号参照）、例えば埋め込み可能な装置、例えば、機械的リザーバー、眼内装置または眼内導管を備える眼球外装置、あるいはポリマー組成物からなるインプラントまたは装置は、本発明による核酸の眼投与に特に有用である。また、本発明による核酸は、例えば、ゼラチン、コンドロイチン硫酸、ポリリン酸エステル、例えばビス−２−ヒドロキシエチル−テレフタラート（ＢＨＥＴ）など、またはポリ乳酸グリコール酸を含む、持続放出製剤の形態で投与されることもできる（例えば、米国特許第５，３７８，４７５号参照）。
あるいは、本発明による核酸は、侵襲的手技、例えば硝子体内注射または随意に硝子体切除後の網膜下注射などを用いて投与することができる。網膜下注射は、眼の異なる区画、すなわち前眼房に投与することができる。眼内注射が好ましいが、注射組成物は、筋肉内、静脈内、そして腹腔内に投与することもできる。注射組成物の製薬上許容される担体は、当業者に周知である（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｙ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｃｏ．，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａ．，Ｂａｎｋｅｒ ａｎｄ Ｃｈａｌｍｅｒｓ，ｅｄｓ．，ｐａｇｅｓ ２３８−２５０（１９８２），およびＡＳＨＰ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｎ Ｉｎｊｅｃｔａｂｌｅ Ｄｒｕｇｓ，Ｔｏｉｓｓｅｌ，４１ｈ ｅｄ．，．ｐａｇｅｓ ６２２−６３０（１９８６）参照）。本発明による核酸は、生体内で微粒子銃、すなわち遺伝子銃によって投与することもできる。随意に、本発明の核酸は、眼の特定の領域に送達するための眼科用機器によって投与される。専門化された眼科用機器を使用することにより、隣接する眼組織への損傷を最小限に抑える一方で、核酸の正確な投与を確実にすることができる。また、本発明の核酸を眼の特定の領域に送達することは、非罹患細胞の本発明の核酸への曝露を制限し、それによって副作用の危険性が減少する。例となる眼科用機器は、鉗子と網膜下ニードルまたは鋭いベントカニューレの組合せである。あるいは、本発明の核酸を直接に、硝子体、房水、１または複数の毛様体組織もしくは細胞および／または外眼筋の中にエレクトロポレーションまたはイオン導入手段によって注射してもよい。
本発明に従って、動物、特にヒトに投与される本発明の核酸の用量は、その動物において妥当な時間枠で望ましい応答をもたらすために十分であるべきである。当業者であれば、投薬量は、年齢、種、問題の病理、および状態または病状を含む多様な要因に依存することを理解するであろう。また、投薬量は、発現させようとする、かつ／または活性のある核酸、ならびに神経系細胞（例えば、網膜細胞）疾患または障害に罹患しようとしているかまたは実際に罹患した眼組織の量にも依存する。また、用量の大きさは、投与の経路、タイミング、および頻度、ならびに本発明による特定の核酸の投与に付随する恐れのある有害な副作用および望ましい生理学的効果の存在、性質、および程度によって決定される。様々な状態または病状、特に、慢性的な状態または病状が、複数の投与を伴う長期の治療を必要とし得ることは、当業者に理解されるであろう。
本発明の核酸は、医薬組成物中で投与されることができ、これは製薬上許容される担体と本発明の１または複数の核酸を含む。任意の適した製薬上許容される担体は、本発明の状況の範囲内で使用することができ、そのような担体は当技術分野で周知である。担体の選択は、一つには、組成物を投与する特定の部位および組成物を投与するために用いる特定の方法によって決定される。
適した製剤には、抗酸化剤、バッファー、制菌剤、および意図するレシピエントの血液または眼内液と製剤を等張にする溶質を含み得る水溶液および非水溶液、等張性滅菌溶液、ならびに、沈殿防止剤、可溶化剤、増粘剤、安定剤、および防腐剤を含み得る水性および非水性滅菌懸濁液が含まれる。製剤は、単位用量または複数用量の密封容器、例えばアンプルおよびバイアルなどに提示することができ、滅菌液担体、例えば水を使用直前に添加することだけを必要とする、フリーズドライ（凍結乾燥）状態で貯蔵することができる。即時溶液および懸濁液は、以前に記載された種類の滅菌粉末、顆粒、および錠剤から調製することができる。随意に、製薬上許容される担体は、緩衝生理食塩溶液である。ある種の実施形態では、本発明の方法で使用する本発明の核酸は、本発明の核酸を投与前の損傷から保護するために処方された医薬組成物で投与される。例えば、医薬組成物は、本発明の核酸の損失を減らすために、本発明の核酸を調製、貯蔵、または投与するために使用される装置、例えばガラス器具、シリンジ、またはニードルなどの上で処方されることができる。医薬組成物は、本発明の核酸の光感受性および／または温度感受性を低下させるように処方されることができる。この目的のため、医薬組成物は、製薬上許容される液体担体、例えば、上記の液体担体など、およびポリソルベート８０、Ｌ−アルギニン、ポリビニルピロリドン、トレハロース、およびそれらの組合せからなる群から選択される安定化剤を随意に含む。そのような医薬組成物の使用は、核酸の有効期間を延長し、投与を容易にし、本発明の方法の効率を高める。この点で、医薬組成物は、形質導入効率を強化するために処方されることもできる。
その上、核酸がその他の治療もしくは生物活性薬剤を含む組成物中に存在することができることを当業者は理解するであろう。例えば、特定の適応の治療に有用な治療的要因が存在し得る。例えば、失明を治療する場合、ヒアルロニダーゼを組成物に添加して、眼の硝子体中の血液および血液タンパク質の分解をもたらすことができる。本発明による核酸の生体内投与に関連する腫脹および炎症ならびに眼の苦痛を低減するために、炎症を制御する因子、例えばイブプロフェンまたはステロイドなどを組成物の一部にすることができる。核酸自体に対する免疫応答を低下させるために免疫系抑制剤を組み合わせて投与することができる。同様に、ビタミンおよびミネラル、抗酸化剤、および微量栄養素を同時投与することができる。遺伝子導入手順に関連する感染およびその他の障害のリスクを低減するために、抗生物質、すなわち殺菌剤および殺真菌剤が存在することもあり得る。
本発明はまた、本発明による単離核酸を含む医薬組成物に関する。
本発明はまた、治療を必要とする患者に治療上有効な量の本発明による単離核酸を投与することを含む、神経系細胞（例えば、網膜細胞）疾患または障害を治療するための方法に関する。
所与標的配列を含有するｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡまたはその他の阻害核酸が標的ｍＲＮＡのＲＮＡｉ媒介性分解を引き起こす能力は、細胞のＲＮＡまたはタンパク質のレベルを測定するための標準技法を用いて評価することができる。例えば、本発明のｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡまたはその他の阻害核酸を培養細胞に送達することができ、標的ｍＲＮＡのレベルをノーザンブロットまたはドットブロット法によって、または定量的ＲＴ−ＰＣＲによって測定することができる。あるいは、例えば、対象の培養細胞および／または細胞中のＦＦＡ１タンパク質のレベルは、ＥＬＩＳＡまたはウエスタンブロットによって測定することができる。
所与標的配列を含有するｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡまたはその他の阻害核酸による標的ｍＲＮＡのＲＮＡｉ媒介性分解は、網膜の血管形成の動物モデル、例えば本明細書に記載されるマウスモデルなどで評価することもできる。例えば、本発明のｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡまたはその他の阻害核酸の投与の前後に、マウスにおける血管形成／血管新生の領域を測定することができる。ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡまたはその他の阻害核酸の投与によるそのようなマウスにおける血管形成／血管新生の領域の減少は、標的ｍＲＮＡ（例えば、Ｆｆａｒ１）のダウンレギュレーションを示す。
医薬組成物
本発明のもう一つの態様は、本発明の化合物の医薬組成物に関する。本発明の医薬組成物は、一般に本発明の化合物および製薬上許容される担体を含む。本明細書で使用する場合、「製薬上許容される担体」には、ありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌薬および抗真菌薬、等張剤および吸収遅延剤、ならびに生理学的に適合性である同類のものが含まれる。担体の種類は、意図する投与経路に基づいて選択することができる。様々な実施形態では、担体は、静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、局所、経皮または経口投与に適している。製薬上許容される担体には、滅菌水溶液または分散体および滅菌注射溶液または分散液の即時調製のための滅菌粉末が含まれる。薬学的活性物質のためのそのような媒体および薬剤の使用は当技術分野で周知である。任意の従来の媒体または薬剤も活性化合物と適合しない場合を除いて、本発明の医薬組成物中でのその使用が検討される。補助活性化合物も組成物に組み込むことができる。
治療組成物は、一般に無菌であり、製造および保存の条件下で安定していなければならない。組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、リポソーム、または高い薬物濃度に適したその他の規則構造として処方されることができる。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール、および同類のもの）、ならびにその適した混合物を含有する溶媒または分散媒であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散体の場合には必要な粒度を維持することによって、さらに界面活性剤の使用によって維持することができる。多くの場合、等張剤、例えば、糖、ポリアルコール、例えばマンニトール、ソルビトール、または塩化ナトリウムなどを組成物に含めることが好ましい。注射組成物の長期の吸収は、吸収を遅らせる薬剤、例えば、モノステアリン酸塩およびゼラチンを組成物に含めることによってもたらすことができる。さらに、時限放出製剤中、例えば緩徐放出ポリマーを含む組成物中、または本明細書に記載される脂肪パッド中の化合物を投与することができる。活性化合物は、化合物を急速放出から保護する担体、例えばインプラントを含む制御放出製剤およびマイクロカプセル化送達系などとともに調製することができる。生分解性、生体適合性ポリマー、例えばエチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルソエステル、ポリ乳酸およびポリ乳酸・ポリグリコール酸共重合体（ＰＬＧ）を使用することができる。そのような製剤の調製のための多くの方法が一般に当業者に公知である。
滅菌注射溶液は、必要量の活性化合物を必要に応じて上に列挙した一つの成分または複数の成分の組合せとともに適切な溶媒に組み込み、その後濾過滅菌することによって調製することができる。一般に、分散体は、塩基性分散媒と、上に列挙した中から必要な他の成分を含有する滅菌溶媒に活性化合物を組み込むことによって調製される。滅菌注射溶液の調製用の滅菌粉末の例では、ある特定の調製方法は、真空乾燥および凍結乾燥であり、それは以前に滅菌濾過したその溶液から有効成分の粉末と任意のさらなる望ましい成分を生じる。
投与経路に応じて、化合物は、酵素、酸およびその他の薬剤を不活化させ得る自然条件の作用から化合物を保護する材料でコーティングされてよい。例えば、化合物は、酵素阻害剤とともに同時投与される適切な担体または希釈液中で、あるいはリポソームなどの適切な担体中で対象に投与されることができる。製薬上許容される希釈液としては、生理食塩水および緩衝水溶液が挙げられる。酵素阻害剤としては、膵臓トリプシン阻害剤、ジイソプロピルフルオロ−リン酸塩（ＤＥＰ）およびトラジロールが挙げられる。リポソームとしては、水中油中水型エマルションならびに従来のリポソーム（Ｓｔｒｅｊａｎ，ｅｔ ａｌ．，（１９８４）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ ７：２７）が挙げられる。分散体は、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、およびそれらの混合物中で、そして油中で調製することもできる。通常の貯蔵および使用条件下で、これらの調製物は、微生物の増殖を防ぐために防腐剤を含むことがある。
組成物中の活性薬剤（すなわちＦＦＡ１阻害剤）は、好ましくは組成物中に治療上有効な量で処方される。「治療上有効な量」とは、所望の治療結果を達成し、それによって特定の病状の治療経過に影響を及ぼすための、投薬量および必要な期間で有効な量をさす。活性薬剤の治療上有効な量は、個体の病状、年齢、性別、および体重、ならびに個体において望ましい応答を誘発する薬剤の能力などの要因によって変動することがある。投与計画を調節して最適な治療応答を得ることができる。また、治療上有効な量は、薬剤の有毒もしくは有害作用を治療上有益な効果が上回る量でもある。もう一つの実施形態では、活性薬剤は、組成物中に予防有効量で処方される。「予防有効量」とは、望ましい予防結果を達成するための、投薬量および必要な期間で有効な量をさす。一般に、予防用量は疾患の前または早期段階の対象に使用するため、予防有効量は、治療上有効な量よりも少なくなる。
活性化合物の組成物中の量は、個体の病状、年齢、性別、および体重などの要因によって変動することがある。投与計画を調節して最適な治療応答を得ることができる。例えば、１回のボーラス投与を行ってもよいし、数回の分割用量を経時的に投与してもよいし、または治療状況の緊急要件に示されるように用量を比例的に減少または増加させてもよい。投与をしやすくし、投薬量を均一にするために、非経口組成物を投薬単位形で処方することは特に有利である。本明細書において投薬単位形とは、治療する哺乳類対象の単位投薬量として適した、物理的に別個の単位をさす；各単位は、必要とされる製薬担体に関連して望ましい治療効果を生じるように計算された所定量の活性化合物を含有する。本発明の投薬単位形の規格は、（ａ）活性化合物の特有の特徴および達成されるべき特定の治療効果、ならびに（ｂ）個体において感受性を治療するための、そのような活性化合物を配合する技術分野に固有の制限に規定され、これらに直接依存する。
本発明の化合物（例えば、ＦＦＡ１阻害剤）の例となる投薬量としては、例えば、約０．０００１％〜５％、約０．０００１％〜１％、約０．０００１％〜０．１％、約０．００１％〜０．１％、約０．００５％〜０．１％、約０．０１％〜０．１％、約０．０１％〜０．０５％および約０．０５％〜０．１％が挙げられる。
本発明の１または複数の化合物は、１または複数の化合物のバイオアベイラビリティの持続時間を延長し、１または複数の化合物の作用の持続時間を増加させ、化合物の放出時間枠を少なくとも３時間、少なくとも６時間、少なくとも１２時間、少なくとも２４時間、少なくとも４８時間、少なくとも７２時間、少なくとも４日、少なくとも５日、少なくとも６日、少なくとも７日、少なくとも２週、少なくとも３週、および少なくとも１カ月からなる群から選択される量だけ増加させるが、脂肪パッド送達系の不在下における１または複数の化合物の放出時間枠を超えて少なくともいくらかの量だけ増加させる方法で投与することができる。随意に、前述の効果のいずれかまたは全部の持続時間は、少なくとも３０分、少なくとも１時間、少なくとも２時間、少なくとも３時間、少なくとも６時間、少なくとも１２時間、少なくとも２４時間、少なくとも４８時間、少なくとも７２時間、少なくとも４日、少なくとも５日、少なくとも６日、少なくとも７日、少なくとも２週、少なくとも３週または少なくとも１カ月延長することができる。
本発明の化合物は、化合物がその中の唯一の活性薬剤である医薬組成物に処方することができる。あるいは、医薬組成物は、さらなる活性薬剤を含むことができる。例えば、本発明の２以上の化合物を組み合わせて使用してよい。さらに、本発明の化合物は、癌への調節作用を有する１以上のその他の薬剤と併用することができる。
キット
本発明は、本発明の組成物を含むキットを含み、それは随意に化合物（例えば、ＦＦＡ１阻害剤）、および取扱説明書も含む。
本発明は、限定と解釈されるべきでない以下の実施例によってさらに説明される。本願を通して引用された全ての参考文献、特許、および公開された特許出願の内容、ならびに図は、参照により本明細書に組み込まれる。
実施例
実施例１：材料および方法
動物
ＮＩＨの実験動物の管理と使用に関する指針、視覚と眼科学研究協会会議（Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｉｎ Ｖｉｓｉｏｎ ａｎｄ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ：ＡＲＶＯ）の眼科と視覚研究における動物の使用に関する声明を遵守した全ての研究は、ボストン小児病院の動物実験委員会で承認された。Ｖｌｄｌｒノックアウトマウス（Ｖｌｄｌｒ−／−；ジャクソン研究所ストック：００２５２９）を野生型Ｃ５７Ｂｌ／６マウスと交雑させて、同腹仔対照実験のための異型接合繁殖動物を得た。Ｖｌｄｌｒ−／−マウスはまた、Ｆｆａｒ１ノックアウトマウス（Ｆｆａｒ１−／−）１と交雑させて、究極的にＶｌｄｌｒ−／−／Ｆｆａｒ１−／＋異型接合繁殖動物およびダブルノックアウトマウス（Ｖｌｄｌｒ−／−／Ｆｆａｒ１−／−）を得た。出生後（Ｐ）１６日に体重が５グラム未満または７グラム超の仔は排除した（Ｓｔａｈｌ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ １７７，２７１５−２７２３（２０１０））。同腹仔Ｖｌｄｌｒ−／−の仔を、Ｐ８からＰ１５までＷＹ１６４３６３（５０ｍｇ／ｋｇ１日１回、腹腔内；Ｓｉｇｍａ）、ＧＷ９５０８（１４μＭ、１日１回腹腔内；Ｃａｙｍａｎ）、ＴＡＫ−８７５（１５ｍｇ／ｋｇ １日２回、経管栄養；Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ）、中鎖脂肪酸トリグリセリド油（ＭＣＴ、２０μＬ、１日１回経管栄養；Ｎｅｓｔｌｅ）または対応する溶媒で処置し、Ｐ１６で犠牲にして網膜の血管病変を定量化した。両性のマウス仔を使用した。
血管病変の定量化
網膜外側の血管病変、網膜血管腫状増殖（ＲＡＰ）の暗示または黄斑部毛細血管拡張症（ＭａｃＴｅｌ）を定量化するために、キシラジンおよびケタミンの混合物でマウスを安楽死させ、眼球を摘出し、４％パラホルムアルデヒド中で室温で１時間固定した。網膜を解剖し、全ての硝子体血管を注意深く除去し、ＰＢＳ中１ｍＭ ＣａＣｌ２中の蛍光標識したイソレクチンＢ４（レクチン）（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４−Ｉ２１４１３、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）で室温で一晩染色した。レクチンで染色した網膜をＳｕｐｅｒｆｒｏｓｔ／Ｐｌｕｓ顕微鏡スライド（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上に光受容体側を上にしてホールマウントし、ＳｌｏｗＦａｄｅ Ａｎｔｉｆａｄｅ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に包埋した。網膜の病変を定量化するために、ホールマウントした各網膜の２０枚の画像をＺｅｉｓｓ ＡｘｉｏＯｂｓｅｒｖｅｒ．Ｚ１顕微鏡で１０倍の倍率で得、ＡｘｉｏＶｉｓｉｏｎ ４．６．３．０ソフトウェアを使用して融合させて一つの画像を形成した。血管病変数は、酸素誘導網膜症モデルで血管新生を測定するために使用される方法（ＳＷＩＦＴ＿ＮＶ）（Ｓｔａｈｌ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ １２，２９７−３０１（２００９）の適合である、ＳＷＩＦＴ＿ＭＡＣＴＥＬ法を用いて分析した。
ＳＷＩＦＴ＿ＭＡＣＴＥＬ
ＩｍａｇｅＪプラットフォーム（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、ｈｔｔｐ：／／ｉｍａｇｅｊ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｊ／）で動作するように開発された一組のマクロを作成した。要するに、ＳＷＩＦＴ＿ＭＡＣＴＥＬは、レクチン染色網膜ホールマウントから赤色のチャネルを分離し、画像を４象限に分割し、バックグラウンド蛍光を除去して、血管新生（ＮＶ）構造を正常な血管のバックグラウンド蛍光に対してはっきりと際立たせる。特定の象限の蛍光閾値を増加または低下させるためのスライドバーを使用して、ＳＷＩＦＴ＿ＭＡＣＴＥＬのユーザーは、ＮＶ構造を目立たせるが正常な血管は目立たせない閾値を各象限に指定する。適切な閾値を設定した後、細胞残屑または過蛍光の網膜端部のようなアーチファクトは、手作業で除去し、定量化から除外することができる。次に、ＳＷＩＦＴ＿ＭＡＣＴＥＬは、選択された強度閾値の上にあり、１００画素の最小サイズを有する対象の一部である画像中の全ての画素を分析する。オブジェクトサイズにこのカットオフを設定することにより、血管の分岐点のような小さいアーチファクトは自動的に除去される。４象限全てを測定した後、ＳＷＩＦＴ＿ＭＡＣＴＥＬは、全ての４つのＮＶ象限から複合材料を生成し、総ＮＶ画素数を計算する。ＳＷＩＦＴ＿ＮＶ法の結果は、確立された手測定プロトコールの結果とよく相関することが見出され（Ｒ２＝０．９３７２）、強い個体内（Ｒ２＝０．９３７６）および個体間（Ｒ２＝０．９４２４）再現性を示す（Ｓｔａｈｌ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ １２，２９７−３０１（２００９））。ｎは定量化した眼の数である。
走査電子顕微鏡および三次元網膜の再構築
２０１０年にＤｅｅｒｉｎｃｋらによって確立されたプロトコールの適合版を用いて、組織をシリアル・ブロック・フェイス走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）用に処理した（Ｔ．Ｄｅｅｒｉｎｃｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ ａｎｄ Ｍｉｃｒｏａｎａｌｙｓｉｓ １６，ｎｏ．Ｓ２（２０１０））。全眼を分離し、カルノフスキー固定液で固定した。角膜および水晶体を取り出し、組織をタンニン酸中で一晩さらに固定した。次に、重金属浸潤（Ｈｅａｖｙ ｍｅｔａｌ ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）を行った；組織をカコジル酸緩衝液中１．５％フェロシアン化カリウム、０．５％四酸化オスミウム中でインキュベートし、それに続いてチオカルボヒドラジド処理し、１％オスミウムインキュベーションへの２回目の曝露を行った。ウォルトンのアスパラギン酸鉛曝露を実施しなかったので、それらを１％酢酸ウラニルインキュベーションによって仕上げ、続いて脱水によって酸化プロピレンとし、Ｄｕｒｃｕｐａｎ ＡＣＭ樹脂に包埋した。組織を連続的に切片化し、Ｚｅｉｓｓ Ｓｉｇｍａ可変圧力電界放出型走査電子顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）に取り付けたＧａｔａｎ ３ＶＩＥＷ シリアル・ブロック・フェイス・イメージング・システム（Ｇａｔａｎ，Ａｂｉｎｇｄｏｎ，ＵＫ）を用いて画像化した。データを収集し、Ａｍｉｒａ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＦＥＩ，Ｏｒｅｇｏｎ，ＵＳＡ）で使用して３Ｄ画像を再構築した。同じソフトウェアを用いて、光受容体ミトコンドリアの量をＷＴマウス、Ｖｌｄｌｒ−／−マウスの病変の周囲、およびＶｌｄｌｒ−／−マウスの病変から離れた場所について推定した。
ＡＴＰ測定
キットを取扱説明書によって（ｐｅｒ）使用してＡＴＰを測定した（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ａ２２０６６）。手短に言えば、標準的な反応溶液を次の成分から作製した：ｄＨ２Ｏ、２０Ｘ反応緩衝液、ＤＴＴ（０．１Ｍ）、Ｄ−ルシフェリン（１０ｍＭ）、ホタルルシフェラーゼ原液（５ｍｇ／ｍＬ）。低濃度ＡＴＰ標準液をＡＴＰ溶液（５ｍＭ）をｄＨ２Ｏに希釈することによって調製した。標準的な反応溶液のバックグラウンド発光を一連の希釈ＡＴＰ標準液の発光読み値から引くことによって検量線を生成した。ＡＴＰを含有する試料について発光測定を行い、実験試料中のＡＴＰの量を検量線から計算した。
酸素消費速度および細胞外酸性化速度
全ての酸素消費速度は、Ｓｅａｈｏｒｓｅ ＸＦｅ９６ Ｆｌｕｘ Ａｎａｌｙｚｅｒ（登録商標）を用いて測定した。全網膜を分離し、１ｍｍパンチ生検を９６ウェルプレートに負荷した。網膜パンチをアッセイ媒体（１２ｍＭグルコース、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳおよび２６ｍＭ ＮａＨＣＯ３を添加したＤＭＥＭ５０３０媒体）中でインキュベートして、酸素消費速度（ＯＣＲ）および細胞外酸性化速度（ＥＣＡＲ）を測定した。光受容体（６６１Ｗ）細胞を、測定の１時間前にそれらのアッセイ媒体（ＤＭＥＭ５０３０、１２ｍＭグルコース、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ）中でインキュベートした。脂肪酸酸化速度は、分析の前に組織または細胞をエトモキシル（４０μＭ；Ｓｉｇｍａ）で４０分処理した後、ＢＳＡ（対照）またはＢＳＡ／パルミチン酸複合体（Ｓｅａｈｏｒｓｅ）を提供することによって決定した。グルコース酸化速度は、データ獲得中の２−デオキシグルコース（２−ＤＧ、１００ｍＭ；Ｓｉｇｍａ）または媒体対照の注射後に測定した。最大脂肪酸またはグルコース酸化能を決定するために、非ミトコンドリア呼吸（２μＭロテノンおよび２μＭアンチマイシンＡの注射後の速度）を０．５μＭカルボニルシアニド−ｐトリフルオロメトキシフェニルヒドラゾン（ＦＣＣＰ）の注射後の酸素消費速度から引いた。
グルコースおよび乳酸塩測定
全網膜および光受容体（６６１Ｗ）を、アッセイ媒体（ＤＭＥＭ ５０３０、１２ｍＭグルコース、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ）中で、それぞれ６時間および４８時間インキュベートした。媒体を回収し、短時間回転させ（１３ｇ）、細胞残屑を除去し、Ｙｅｌｌｏｗ Ｓｐｒｉｎｇｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（ＹＳＩ）２９５０を用いて測定したグルコースおよび乳酸塩レベルを、組織または細胞に曝露しなかった対照媒体と比較した。グルコースの乳酸塩への変換（解糖速度）を決定するため、乳酸塩産生量をグルコース取り込み量で除算した。
網膜の脂質取り込み
網膜の長鎖脂肪酸取り込みを、０．１ｍｇの４，４−ジフルオロ−５，７−ジメチル−４−ボラ−３ａ、４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−ヘキサデカン酸（ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ Ｃ１６；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）を経管栄養で投与した野生型およびＶｌｄｌｒ−／−マウスについて比較した。マウスを２時間後に安楽死させ、眼球を摘出し、ＯＣＴに包埋し、蛍光顕微鏡による即時イメージングのために凍結切片化した（１０μｍ）。網膜のＦＡ取り込みは、Ｐ９からＰ１２まで１日２回注射した（腹腔内；０．５ｕＣｉ／用量）１４Ｃ標識２−ブロモパルミチン酸トレーサーを用いて定量化した；投与した全放射能をマウス体重に対して正規化した。次に、網膜を解剖し、Ｕｌｔｉｍａ Ｇｏｌｄ ｌｉｑｕｉｄシンチレーションカクテル（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）中で均質化し、Ｔｒｉ−Ｃａｒｂ ２９００ＴＲ機器（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いてβ計数し（１４Ｃ ＤＰＭ）、バックグラウンドシンチレーションについて補正した。
血漿トリグリセリド（ＴＧ）および脂肪酸（ＦＡ）分析
血漿を、ＷＴおよびＶｌｄｌｒ−／−マウスから全血の遠心分離（２０００ｇ×２０分；４℃）によってＥＤＴＡコートチューブに単離した。ＲＡＮＤＯＸ ＴＲＩＧＳキット（ＴＲ２１０）を取扱説明書によって（ｐｅｒ）使用してＴＧを測定した。全血漿中のＦＡを前に記載したようにアッセイした（Ｓｐａｈｉｓ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎｓ Ｌｅｕｋｏｔ Ｅｓｓｅｎｔ Ｆａｔｔｙ Ａｃｉｄｓ ９９，２５−３４（２０１５））。手短に言えば、各試料を直接エステル交換に供した後、Ａｇｉｌｅｎｔ ＧＣ ＡｕｔｏＳａｍｐｌｅｒシステム（７８９０Ａ）を用いてガスクロマトグラフに注入した。ＦＡを既知標準物質の予測される保持時間との比較によって同定した後、ＯｐｅｎＬＡＢ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓｕｉｔｅ（Ａｇｉｌｅｎｔ）で分析した。
β酸化代謝物質の定量化
アシルカルニチン代謝物質を、氷冷メタノールを用いてＷＴおよびＶｌｄｌｒ−／−（Ｐ１２）の急速冷凍網膜から抽出した。試料を超音波処理し、遠心分離し、上清を窒素蒸発用の新鮮なチューブに移した。乾燥したら、移動相（ＡＣＮ：Ｈ２Ｏ ８０：２０、ギ酸０．０５％）で再構成する前にブタノール分解（ｂｕｔａｎｏｌｙｓｉｓ）を実施した（ブタノール−ＨＣｌ、５５℃２０分間）。試料を液体クロマトグラフィーとそれに続くタンデム質量分光測光法（ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｙ）により分析した（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ、Ａｌｌｉａｎｃｅ ２７９５ ＬＣおよびＱｕａｔｔｒｏ ｍｉｃｒｏ，Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐ）。データを正のエレクトロスプレーイオン化で記録し、Ｎｅｏｌｙｎｘ（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐ）で分析した。
網膜のグルコース取り込み
ポジトロン断層撮影（ＰＥＴ）画像診断をＷＴ、Ｖｌｄｌｒ−／−、Ｖｌｄｌｒ−／−／Ｆｆａｒ１−／−およびＦｆａｒ１−／−マウスで実施し（Ｐ１６；Ｆｏｃｕｓ１２０高解像度、Ｓｉｅｍｅｎｓ）、続いてマイクロＣＡＴイメージング（ＭｉｃｒｏＣＡＴ ＩＩスキャナ、Ｓｉｅｍｅｎｓ）を実施した。フッ素−１８フルオロデオキシグルコース（１８Ｆ−ＦＤＧ）を腹腔内注射（ｉ．ｐ．）により投与して無毒の放射能レベルを得た（３．７および３７ＭＢｑ；または０．１〜１．０ｍＣｉ）。実際に投与した活性は、注射の前後のシリンジ中の活性を測定する投与量較正器を使用して求めた。画像は、放射性トレーサー取り込みを確実にするために注射６０分後に獲得した。マウスをイメージングの前に６時間絶食させ、暗所で維持し、手順の持続時間の間ノーズコーンを通してイソフルラン（２〜４％）の吸入によって麻酔した。動物は、最初に頭を画像化され（腹臥位）、適切な体温を維持するために温熱パッドの上に置かれた。イメージングが終了すると、マウスを安楽死させ、網膜を正確な１８Ｆ−ＦＤＧ網膜の活性（γカウンターによる定量化）のために解剖し、減衰について補正した。ＷＴおよびＶｌｄｌｒ−／−マウスの仔はまた、微量の３Ｈ−２−デオキシグルコース（毎日０．５μＣｉ、腹腔内）を注射され、ＧＷ９５０８または溶媒（毎日１４μＭ、腹腔内）を５日間（Ｐ７〜Ｐ１２）で処置された。網膜を回収し、シンチレーションカクテル（Ｅｃｏｌｉｔｅ＋、ＭＰバイオメディカルズ）で均質化し、ＬＳ６５００ Ｍｕｌｔｉｐｕｒｐｏｓｅ Ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ Ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｂｅｃｋｍａｎ）を用いてベータカウントを測定した。
レーザー・キャプチャー・マクロダイセクション
眼球摘出直後に眼をＯＣＴに包埋し、急速冷凍した。眼をＲＮアーゼフリー条件下で１０μｍの切片に凍結切片化し、ＲＮアーゼフリーのポリエチレンナフタレートスライドガラスに収集した（１１５０５１８９、Ｌｅｉｃａ）。切片をレクチン（１ｍＭ ＣａＣｌ２中１：５０）で染色し、７０％、９０％および１００％エタノール洗浄で脱水した。網膜の血管および層をＬｅｉｃａ ＬＭＤ ６０００システム（Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ）で顕微解剖し、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｃｒｏキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ）のＲＮＡ安定化緩衝液に直接収集した。上記のＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてＲＮＡを顕微解剖した組織から抽出し、生成されたｃＤＮＡでリアルタイムＰＣＲを実施した。
逆転写および定量的リアルタイムＰＣＲ分析
細胞培養、全網膜またはレーザーキャプチャーした新生血管および層から得たＲＮＡ試料をＤＮアーゼＩ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ）で処理して混入しているゲノムＤＮＡを除去した。次に、ＤＮアーゼで処理したＲＮＡを、逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてｃＤＮＡに変換した。標的遺伝子および対照遺伝子、シクロフィリンＡのＰＣＲプライマーを、Ｐｒｉｍｅｒ ＢａｎｋおよびＮＣＢＩ Ｐｒｉｍｅｒ Ｂｌａｓｔソフトウェアを用いて設計した。ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７７００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ＳｙｓｔｅｍをＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒミックスキットとともに用いて遺伝子発現の定量分析を生成し、ΔｃＴ法を用いてシクロフィリンＡと比較した遺伝子発現を計算した。
プライマー配列
発現アレイ
ＷＴおよびＶｌｄｌｒ−／−網膜のＩｌｌｕｍｉｎａマウス遺伝子マイクロアレイ解析を生物学的に三通り実施した（Ｍｏｕｓｅ−ＷＧ６発現ＢｅａｄＣｈｉｐ、Ｉｌｌｕｍｉｎａ）。チップは、３４，０００の遺伝子を表す４５，０００のプローブセットを含む。マイクロアレイ研究は、ｃＤＮＡ合成から生データの正規化まで、ボストン小児病院の分子遺伝学コア施設（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｒｅ Ｆａｃｉｌｉｔｙ）によって実施した。手短に言えば、全ＲＮＡ（各１μｇ）を逆転写し、それに続いて１回の試験管内転写増幅を行ってビオチン標識ヌクレオチドを組み込み、その後ハイブリダイゼーションを行い、製造業者の説明書に従ってストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐａｔａｖｉｄｉｎ）−Ｃｙ３で染色した。チップをＩｌｌｕｍｉｎａ ＢｅａｄＡｒｒａｙ Ｒｅａｄｅｒで走査して、標識した標的で信号強度を測定した。品質管理、バックグラウンド分析およびランク・インバリアント・アルゴリズム（ｒａｎｋ ｉｎｖａｒｉａｎｔ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）による正規化のために、生データをマイクロアレイソフトウェア（Ｂｅａｄ Ｓｔｕｄｉｏ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎバージョン３．４．０）で解析した。正規化データは、Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙパスウェイ解析（Ｐ＝０．０５および０．１９のデルタ；Ｑｕｉａｇｅｎ）を用いて比較分子および細胞経路制御についてさらに解析した（Ｃａｌｖａｎｏ，Ｓ．Ｅ．，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ４３７，１０３２−１０３７（２００５））。
免疫組織化学
ホールマウント免疫組織化学のために、眼を摘出し、４％パラホルムアルデヒド中で室温で１時間固定した。網膜を分離し、蛍光標識したイソレクチンＢ４（ＣａＣｌ２ １ｍＭを含むＰＢＳ中のＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ−５９４、Ｉ２１４１３、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）を用いて網膜の脈管構造および病変を室温（ＲＴ）で一晩染色した。網膜を、５倍対物レンズとＺｅｉｓｓ ＡｘｉｏＯｂｓｅｒｖｅｒ．Ｚ１顕微鏡を用いて可視化し、ＡｘｉｏＶｉｓｉｏｎソフトウェア（バージョン４．６．３．０）で動作するＺｅｉｓｓ ＡｘｉｏＣａｍ ＭＲｍで画像化した。ホールマウントはまた、冷メタノール中で固定および透過処理し（−２０℃で２０分）、３％ウシ血清アルブミンおよび０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００でブロッキングし、血管（上記）を可視化するためにイソレクチンＢ４で染色し、かつ／またはＨＩＦ１α（ＴＢＳ中１：１００、ＮＢ００−１３４、Ｎｏｖｕｓ）、ＶＥＧＦ（１：１００、ＲＢ−２２２、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＩＢＡ−１（１：２００、ＣＰ２９０Ａ、Ｂｉｏｃａｒｅ Ｍｅｄｉｃａｌ ＵＫ）および青錐体オプシン（１：１００、ｓｃ−１４３６５、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）に対する一次抗体で４℃で一晩染色し、それに続いて二次抗体で染色した（室温で１時間；ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ １：１０００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。フラットマウント（および断面）を共焦点顕微鏡（Ｌｅｉｃａ ＴＣＳ ＳＰ２ ＡＯＢＳ）で画像化し、Ｖｏｌｏｃｉｔｙソフトウェア（Ｐｅｒｋ Ｅｌｍｅｒ）を用いてｚ−ｓｔａｃｋｓを三次元再構築した。
ウエスタンブロットおよびＥＬＩＳＡ
網膜試料を上記のように入手した。３つの異なる動物由来の網膜可溶化液（２０μｇ）または内皮細胞可溶化液（１０μｇ）をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに負荷し、ＰＶＤＦ膜にエレクトロブロットした。ブロッキングの後、膜をβ−アクチン（Ｓｉｇｍａ、Ａ１９７８）、Ｈｉｆ１α（Ｎｏｖｕｓ、ＮＢ１００−１３４）、およびＧｌｕｔ１（Ｎｏｖｕｓ、ＮＢ３００−６６６およびＡｂｃａｍ、Ａｂ６５２）に対する抗体とともに一晩インキュベートした（各々、１：１０００）。洗浄後、膜を１：１０，０００西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗ウサギまたは抗マウス二次抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ、ＮＡ９３１ＶおよびＮＡ９３４Ｖ）とともに室温で１時間インキュベートした。ＩｍａｇｅＪを用いてデンシメトリーを分析した。網膜のＶｅｇｆａ濃度は、ＥＬＩＳＡによって測定し（マニュアルに従う、ＭＭＶ００、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ブラッドフォード法を行って各試料の総細胞タンパク質含量を測定することによって正規化した。
代謝物質プロファイリング
迅速に解剖したＷＴおよびＶｌｄｌｒ−／−網膜の代謝物質（安楽死から１分未満の急速冷凍；生物学的反復１５〜１６）を、内部標準のイノシン−１５Ｎ４、チミン−ｄ４、およびグリココール酸−ｄ４（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｉｓｏｔｏｐｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を含有する８０％メタノール（８μＬ／ｍｇ組織）中で、ＴｉｓｓｕｅＬｙｓｅｒ ＩＩ（Ｑｉａｇｅｎ）ビーズミルを２０Ｈｚで４分間使用して均質化した。試料を遠心分離（９，０００ｇ、１０分、４℃）してデブリをペレット状にし、２つの液体クロマトグラフィータンデム質量分析（ＬＣ−ＭＳ）法を用いて上清を分析して、以前に記載されるように極性代謝物質を測定した（Ｊａｉｎ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３６，１０４０−１０４４（２０１２）、およびＴｏｗｎｓｅｎｄ，Ｍ．Ｋ．，ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ ５９，１６５７−１６６７（２０１３））。手短に言えば、負のイオン化モード多重反応モード（ＭＲＭ）データを、５５００ ＱＴＲＡＰトリプル四重極質量分析計（ＡＢ ＳＣＩＥＸ）に連結させたＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ）を使用して得た。上清を１５０×２．０ｍｍ Ｌｕｎａ ＮＨ２カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）に直接注入し、カラムは４００μＬ／分の流量で、初期条件の１０％移動相Ａ［水（ＶＷＲ）中２０ｍＭ酢酸アンモニウムおよび２０ｍＭ水酸化アンモニウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）］および９０％移動相Ｂ［７５：２５ｖ／ｖ アセトニトリル／メタノール（ＶＷＲ）中１０ｍＭ水酸化アンモニウム］、それに続いて移動相Ａ１００％まで１０分の直線勾配によって溶離した。イオンスプレー電圧は−４．５ｋＶであり、ソース温度は５００℃であった。正イオン化モードＭＲＭデータは、１１００シリーズポンプ（Ａｇｉｌｅｎｔ）およびＨＴＳ ＰＡＬ オートサンプラー（Ｌｅａｐ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に連結させた４０００ ＱＴＲＡＰトリプル四重極質量分析計（ＡＢ ＳＣＩＥＸ）を用いて得た。細胞抽出物（１０μＬ）を、安定同位体標識内部標準［０．２ｎｇ／μＬバリン−ｄ８、Ｉｓｏｔｅｃ；および０．２ｎｇ／μＬフェニルアラニン−ｄ８（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｉｓｏｔｏｐｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）］を含有する４０μＬの７４．９：２４．９：０．２（ｖ／ｖ／ｖ）アセトニトリル／メタノール／ギ酸を用いて希釈し、１５０×２．１ｍｍ Ａｔｌａｎｔｉｓ ＨＩＬＩＣカラム（Ｗａｔｅｒｓ）に注入した。カラムは、２５０μＬ／分の流量で、５％移動相Ａ（水中１０ｍＭギ酸アンモニウムおよび０．１％ギ酸）で１分間と、それに続いて４０％移動相Ｂ（０．１％ギ酸を含むアセトニトリル）まで１０分の直線勾配で均一濃度で溶離した。イオンスプレー電圧は４．５ｋＶであり、ソース温度は４５０℃であった。ＭｕｌｔｉＱｕａｎｔ ２．１（ＡＢ ＳＣＩＥＸ）を使用して自動ピーク統合について生データを処理し、代謝物質ピークを統合の質について手動でレビューし、既知の標準物質と比較して同一性を確認した。
光受容体（６６１Ｗ）細胞培養
錐体視細胞（ａｌ−Ｕｂａｉｄｉ，Ｍ．Ｒ．，Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １１９，１６８１−１６８７（１９９２）、およびＴａｎ，Ｅ．，ｅｔ ａｌ．Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ ４５，７６４−７６８（２００４））（６６１Ｗ；Ａｌ−Ｕｂａｉｄｉ博士より）は、ヒドロコルチゾン（２０μｇ／５００ｍＬ、Ｈ−２２７０、Ｓｉｇｍａ）、プロゲステロン（２０μｇ／５００ｍＬ、Ｐ−８７８３、Ｓｉｇｍａ）、プトレシン（０．０１６ｇ／５００ｍＬ、Ｐ−７５０５、Ｓｉｇｍａ）およびβ−メルカプトエタノール（２０μＬ／５００ｍＬ、Ｍ−６２５０、Ｓｉｇｍａ）を添加したＦＢＳ１０％を含むＤＭＥＭ中の加湿雰囲気下５％ＣＯ２、３７℃で単層として培養した。等しい数の６６１Ｗ細胞（０．３×１０６）を６ウェルディッシュに蒔き、８０％コンフルエンスまで培養した。細胞をＰＢＳで２回洗浄し、４時間飢餓（ＦＢＳを含まない上記培地）させた後、ＧＷ９５０８（１４μＭ、Ｃａｙｍａｎ）または溶媒で刺激した。次に、光受容体をＨｉｆ１αタンパク質発現のために処置後８時間収集した（ウエスタンブロット参照）；一方、それらの培地をＥＬＩＳＡによるＶｅｇｆａ定量化のために（マニュアルに従う、ＭＭＶ００、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）１２時間で回収した。Ｖｅｇｆａ濃度は、ブラッドフォード法を行って各ウェルの総細胞タンパク質含量を測定することによって、ウェルあたりの細胞数について正規化した。
ＡＡＶ２−ＲＫｓｈＶｌｄｌｒベクターおよびＡＡＶ２ウイルスの調製
マウスＶｌｄｌｒに対する３つの独立したｓｈＲＮＡを、公開されたアルゴリズム（Ｐａｒｋ，Ｙ．Ｋ．，ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｒｅｓｅａｒｃｈ ３６，Ｗ９７−１０３（２００８））を用いて設計した。ｍｉＲ−３０マイクロＲＮＡ、ｍｉＲ−３０ループおよびセンスおよびアンチセンスを含むＶｌｄｌｒ ｓｈＲＮＡを含む鋳型オリゴヌクレオチドを合成した（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。ＤＮＡ断片を増幅させ、精製し、消化させ、修飾ＣＡＧ−ＧＦＰ−ｍｉＲ３０ベクター（ボストン小児病院のＺｈｉｑｉａｎｇ Ｌｉｎ博士およびＷｉｌｌｉａｍ Ｔ．Ｐｕ博士提供）に以前の報告に従って挿入し（Ｇｒｉｅｇｅｒ，Ｊ．Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ １，１４１２−１４２８（２００６））、ＣＡＧプロモーターを、ｐＡＡＶＲＫ−ＧＦＰ（Ｃｏｎｎｉｅ Ｃｅｐｋｏ博士およびＴｉａｎｓｅｎ Ｌｉ博士提供）からクローン化されたロドプシンキナーゼ（ＲＫ）プロモーター（Ｋｈａｎｉ，Ｓ．Ｃ．，ｅｔ ａｌ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ＆ｖｉｓｕａｌ ｓｃｉｅｎｃｅ ４８，３９５４−３９６１（２００７））に置き換えた。Ｖｌｄｌｒノックダウン効率を仔の網膜で試験した。組換えＡＡＶ２ベクターを以前に記載されるように作製した（Ｖａｎｄｅｎｂｅｒｇｈｅ，Ｌ．Ｈ．，ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍａｎ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ２１，１２５１−１２５７（２０１０））。手短に言えば、ＡＡＶベクター、ｒｅｐ／ｃａｐパッケージングプラスミド、およびアデノウイルスヘルパープラスミドを、ポリエチレンイミンと混合し、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ＣＲＬ−１１２６８、ＡＴＣＣ）にトランスフェクトした。トランスフェクションの７２時間後、細胞を回収し、細胞ペレットをウイルス緩衝液に再懸濁し、その後３サイクルの凍結融解を行い、均質化した。細胞デブリを５，０００ｇで２０分間ペレット化し、上清をイオジキサノール勾配に流した。回収したＡＡＶベクターを、Ａｍｉｃｏｎ １００Ｋカラム（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用してＰＢＳで３回洗浄した。リアルタイムＰＣＲを用いて組換えＡＡＶのゲノム力価を求めた。このプロトコールは、対照ＡＡＶ２−ｓｈＣｏｎｔｒｏｌを調製するためにも使用した。ウイルスを様々な濃度に希釈して感染を試験し、およそ２×１０１２ｇｃ／ｍＬの濃度を実験に使用した。マウスＶｌｄｌｒ ｓｉＲＮＡの配列は次の通りである：ｓｈＶｌｄｌｒ ＃１（５’−３’）、ＧＧＡ ＡＡＧ ＴＴＣ ＡＡＧ ＴＧＣ ＡＧＡ ＡＧＣ Ｇ；ｓｈＶｌｄｌｒ ＃２（５’−３’）、ＧＧＡ ＡＴＧ ＣＣＡ ＴＡＴ ＣＡＡ ＣＧＡ ＡＴＧ Ｃ；ｓｈＶｌｄｌｒ ＃３（５’−３’）、ＧＧＧ ＡＴＣ ＴＧＣ ＡＧＴ ＣＡＡ ＡＴＴ ＴＧＴ Ａ；スクランブルｓｈＲＮＡ対照（５’−３’）、ＧＡＴ ＴＴＡ ＡＧＡ ＣＡＡ ＧＣＧ ＴＡＴ ＡＡＣ Ａ。
ヒト試料および硝子体切除術
本研究は、ヘルシンキ宣言の主義に従い、ヒト臨床プロトコールおよびインフォームドコンセントの承認をメゾヌーヴ・ロズモン（Ｍａｉｓｏｎｎｅｕｖｅ−Ｒｏｓｅｍｏｎｔ）病院（ＨＭＲ）倫理委員会から得た（Ｒｅｆ．ＣＥＲ：１００５９）。全ての患者は以前にＡＭＤと診断され、追跡され、手術は１名の網膜硝子体外科医によって実施された（Ｆ．Ａ．Ｒ．）。硝子体試料は生検直後にドライアイスの上で凍結され、貯蔵された（−８０℃）。ＶＥＧＦＡ ＥＬＩＳＡを製造業者の説明書に従って実施した（ＤＶＥ００、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）。
統計解析
スチューデントｔ検定を使用し、ダネット、ボンフェローニまたはチューキー事後分析を含む分散分析（表１参照）を使用して、異なる群を比較した；ｐ＜０．０５を統計上異なるとみなした。ダゴスティーノ−ピアソンまたはコルモゴロフ−スミルノフ（ＫＳ）正規性検定を用いて正規分布を確認した。非ガウス分布をもつデータは、マン・ホイットニー検定を用いて解析した（ノンパラメトリック、２群）。動物は無作為化しなかったが、定量化は可能な場合には盲検化した。全ての実験は少なくとも３回繰り返した。平均から２よりも大きい標準偏差値を外れ値とみなし、排除した。試料サイズを推定して、「Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｕｓｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌｓ ｉｎ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ」（２００３）に従って、８０％（１−β）および０．０５のαのパワーで２０％の差を検出した。結果は平均値±ＳＥＭとして表す。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
統計解析の説明
各図パネルのｎ、分散差、統計検定およびＰ値の詳細な説明（表１）：
実施例２：ＲＡＰ様病変の数と網膜のエネルギー需要の相関
ＲＡＰ様病変の数は、光受容体エネルギー需要と関係していた。杆体視細胞は、「暗電流」として公知の光子に誘導される脱分極に必要な電気化学勾配を維持するために、明所よりも３〜４倍多く暗所でエネルギーを消費する（Ｏｋａｗａ，Ｈ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｂｉｏｌ １８，１９１７−１９２１（２００８））。逆に、膜ターンオーバーおよび視覚サイクル活性は暗所で低下する（Ｏｋａｗａ，Ｈ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｂｉｏｌ １８，１９１７−１９２１（２００８））。暗所で育てたＶｌｄｌｒ−／−マウスは、通常の明／暗サイクルで育てたマウスよりも１．５倍多くの血管病変を発症し（図１Ｂ）、エネルギー代謝が新生血管疾患に影響を及ぼすことを示す。光受容体は、視神経から末梢の方向へ外向きに成熟することが記載されている。エネルギー消費は光受容体が成熟するにつれて増加し（Ｐ１２−１６）、Ｐ１６でより成熟した中心網膜はより多くのＲＡＰ様病変を有していた（Ｗｏｎｇ−Ｒｉｌｅｙ，Ｍ．Ｔ．Ｔ．Ｅｙｅ Ｂｒａｉｎ ２，９９−１１６（２０１０）、およびＴｒｉｃｋ，Ｇ．Ｌ．＆Ｂｅｒｋｏｗｉｔｚ，Ｂ．Ａ．Ｐｒｏｇ Ｒｅｔｉｎ Ｅｙｅ Ｒｅｓ ２４，２５９−２７４（２００５））。
Ｖｌｄｌｒの減少が、特に光受容体において病理学的血管を動作させるのに十分であったかどうかを判定するために、残っているＶｌｄｌｒを、正常な循環脂肪酸レベルを有するＶｌｄｌｒ＋／−マウスの光受容体で（ＡＡＶ２−ｈＲＫを用いて）選択的にノックダウンした（Ｆｕｒｕｋａｗａ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ９１，５３１−５４１（１９９７））（図５Ａ−５Ｉ）。エネルギー欠乏に一致して、Ｖｌｄｌｒ−／−光受容体は腫脹したミトコンドリアを示した（三次元走査電子顕微鏡および図１Ｄ；ビデオ−示さず）。そのような結果をビデオ（データは示さず）でさらに確認し、それはＷＴおよびＶｌｄｌｒ−／−光受容体ミトコンドリアを比較し、ＷＴまたはＶｌｄｌｒ−／−光受容体の偽着色したミトコンドリアは走査電子顕微鏡の三次元再構築によって可視化された。Ｖｌｄｌｒ−／−マウスでは、血管病変も検出された。さらに、Ｖｌｄｌｒ−／−網膜はＡＴＰ貯蔵が低く（図１Ｅ）、それはＶｌｄｌｒ−／−マウスでのエネルギー欠損を裏付けた。
実施例３：脂肪酸はグルコースに加えて網膜エネルギー産生に寄与し、Ｖｌｄｌｒ−／−網膜でも欠乏している可能性があった。
血管新生を育てるエネルギー欠損の病因を調査するために、ＦＡおよびグルコースのＷＴ網膜のエネルギー産生への寄与（図６Ａ）を調査した。長鎖ＦＡパルミチン酸は、網膜外植片でミトコンドリアβ酸化に燃料を供給し、酸素消費速度（ＯＣＲ）を倍増させる。エトモキシルに誘導される、ミトコンドリアへのＦＡ輸送の抑制は、ミトコンドリア呼吸を抑止し、ＦＡのβ酸化が網膜のエネルギー代謝に寄与することを裏付ける（図２Ａ〜２Ｂ、および６Ａ〜６Ｃ）。
グルコース酸化の寄与はさらに調査され、網膜のグルコースはまたＦＡと同程度に効率的にミトコンドリアによって酸化された（図６Ｄ〜６Ｆ）。しかし、Ｗａｒｂｕｒｇ、ＣｏｈｅｎおよびＷｉｎｋｌｅｒによって報告されるように（Ｃｏｈｅｎ，Ｌ．Ｈ．＆Ｎｏｅｌｌ，Ｗ．Ｋ．Ｊ Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ ５，２５３−２７６（１９６０）、およびＷｉｎｋｌｅｒ， Ｂ．Ｓ．Ｊ Ｇｅｎ Ｐｈｙｓｉｏｌ ７７，６６７−６９２（１９８１））、大多数のグルコース（８７％）は、酸化的リン酸化よりもむしろ解糖によって乳酸塩に変換された（図６Ｇ）。ＷＴ網膜とは異なり、Ｖｌｄｌｒ−／−網膜（ＦＡ取り込みが限定される）は、パルミチン酸に曝露した際にミトコンドリア呼吸を増加させなかった（図６Ｈ）。ＦＡは、グルコースに加えて、網膜のエネルギー産生に寄与し、そしてＶｌｄｌｒ−／−網膜でも欠乏していることがある。
脂肪酸取り込みの定量化
網膜の脂質エネルギー代謝におけるＶｌｄｌｒの果たし得る役割を考えて、網膜のＦＡ取り込みを定量化した。報告されたＶｌｄｌｒは、網膜の光受容体で高度に発現した（図７Ａ）（Ｈｕ，Ｗ．，ｅｔ ａｌ Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ ４９，４０７−４１５（２００８））。網膜の中／長鎖ＦＡ取り込みは、Ｖｌｄｌｒ−／−網膜で低下した。血清の濁度は、より高い循環脂質レベルを反映した（図７Ｂおよび７Ｃ）。トリグリセリドおよび中／長鎖ＦＡ血漿レベル（特にパルミチン酸）はＶｌｄｌｒ−／−マウスで上昇した（図６Ｃ、および図７Ｄおよび７Ｅ）。重要なことに、アセチル−ＣｏＡを生成するミトコンドリアでの脂質のＦＡβ酸化のプロセスは抑制された（図６Ｄ）。Ｖｌｄｌｒ−／−網膜では、総アシルカルニチンおよび遊離カルニチンレベルが低下した（図６Ｅ）。サイトゾルのＦＡレベルが低いことは、主にＶｌｄｌｒ−／−光受容体において、ペルオキシソーム増殖性活性化受容体（ＰＰＡＲα）発現の低下に関連していた（Ｌｅｆｅｂｖｒｅ，Ｐ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １１６，５７１−５８０（２００６））（図８Ａおよび８Ｂ）。ＰＰＡＲαは、ＦＡのβ酸化のいくつかのステップの重要な制御因子であり（Ｌｅｆｅｂｖｒｅ，Ｐ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １１６，５７１−５８０（２００６））；それにはＦＡのミトコンドリアへの内部移行を媒介するＣｐｔ１ａが含まれる（図６Ｂ）。Ｃｐｔ１ａはＷＴで豊富であったが、Ｖｌｄｌｒ−／−光受容体では抑制された（図２Ｆ）。ＦＡのβ酸化を強化するために使用した選択的ＰＰＡＲαアゴニスト（ＷＹ１６４６３）（Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｍ．Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｇ Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ ５３，１２４−１４４（２０１４））は、Ｖｌｄｌｒ−／−網膜でＲＡＰ様病変を低下させた（図８Ｃ）。光受容体（６６１Ｗ）細胞に、パルミチン酸を単独でまたはＰＰＡＲαアゴニスト（ＧＷ９５７８）とともに与えると、ＦＡのβ酸化によりミトコンドリア呼吸がさらに増加したが、アンカップリングによるものではなく、エトモキシルが呼吸の増加を抑止したためであった（図９Ａ〜９Ｄ）。解糖からの乳酸の産生を反映する細胞外酸性化率は、検出できるほどの影響をＰＰＡＲαアゴニストから受けなかった（図９Ｅおよび９Ｆ）。新生血管眼疾患の代謝シグナル伝達におけるＰＰＡＲαの役割のさらなる調査が保証される。全体的に、これらの知見は、脂質がエネルギー基質網膜であることを示し、グルコースが光受容体の唯一の燃料であるという現在の定説に異議を唱える。
グルコース取り込みの代償的な急増は、Ｖｌｄｌｒ−／−網膜のＦＡ欠乏を緩和すると予測された。驚くことに、網膜のグルコース取り込み（１８Ｆ−ＦＤＧ）をポジトロン放出断層撮影（ＰＥＴ）によって評価すると、網膜の１８Ｆ−ＦＤＧカウントは、主要な網膜グルコース輸送体Ｇｌｕｔ１のＧＬＵＴ１発現のように（図２Ｈおよび２Ｉ）、特にＶｌｄｌｒ−／−光受容体において（図２Ｈ）、ＷＴと比較して減少した（図２Ｇおよび得られたビデオデータは、ＦＦＡ１がＶｌｄｌｒ−／−網膜でグルコース取り込みを指示したことを示す。ここでは１８Ｆ−ＦＤＧマイクロＰＥＴ／ＣＴスキャンによってＷＴ、Ｖｌｄｌｒ−／−、Ｖｌｄｌｒ−／−／Ｆｆａｒ１−／−およびＦｆａｒ１−／−マウスでのグルコース取り込みを同時に比較した（データは示さず））。したがって、糖代謝が、Ｖｌｄｌｒ−／−とＷＴ網膜を比較する遺伝子マイクロアレイで最も著しく制御された経路である（図１０Ａ）。解糖の重大な酵素であるピルビン酸キナーゼ（Ｐｋｍ２）の抑制をこのアレイによって同定し、ｑＲＴ−ＰＣＲによって確認した（図１０Ｂ）。Ｇｌｕｔ３および４は制御されなかった（図１０Ｃ）。したがって、Ｖｌｄｌｒ−／−網膜は、脂質とグルコースの両方の取り込みが不十分であり（図２Ａ〜２Ｉ）、全身のエネルギー不足に一致する（図１Ａ〜１Ｅ）。
実施例４：Ｇタンパク質共役型膜受容体を感知する脂肪酸のスクリーニング
Ｖｌｄｌｒ−／−血清中の脂質の存在量は、グルコース取り込みを減らし、網膜への燃料供給を制御するのを助ける脂質センサーによる信号と仮定した（図３Ａ）。網膜でＧタンパク質共役型膜受容体（ＧＰＣＲ）を感知する既知ＦＡをスクリーニングした。ＦＦＡ１はＷＴで最も豊富に発現するＦＡ受容体であり、Ｖｌｄｌｒ−／−網膜、特に光受容体でさらに増加した（図３Ｂおよび３Ｃ）。ＦＦＡ１は最初に膵臓で発見され（Ｉｔｏｈ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ４２２，１７３−１７６（２００３））、グルコース輸送およびインスリン分泌（β島細胞）を管理する（Ｋｅｂｅｄｅ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ ５７，２４３２−２４３７（２００８）、およびＡｌｑｕｉｅｒ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ ５８，２６０７−２６１５（２００９））。高い膵ＦＦＡ１発現は、主要な膵島グルコース輸送体である、Ｇｌｕｔ２の発現を抑制した（Ｓｔｅｎｅｂｅｒｇ，Ｐ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ １，２４５−２５８（２００５））。Ｆｆａｒ１はまた、脳にも局在し、脳でのその機能は十分に確立されていない（Ｈｏｎｏｒｅ，Ｊ．−Ｃ．，ｅｔ ａｌ．Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ Ｖａｓｃ Ｂｉｏｌ ３３，９５４−９６１（２０１３））、および（Ｂｒｉｓｃｏｅ，Ｃ．Ｐ．，ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７８，１１３０３−１１３１１（２００３））。ＷＴおよびＶｌｄｌｒ−／−網膜において、Ｇｌｕｔ１の発現（Ｇｏｓｐｅ，Ｓ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ １２３，３６３９−３６４４（２０１０））および網膜のグルコース取り込みを抑制したＦＦＡ１アゴニスト（ＧＷ９５０８）を同定した（図３Ｄおよび図１１Ａ）。重要なことに、ＦＦＡ１アゴニスト（ＧＷ９５０８）による処置は、対照と比較してＶｌｄｌｒ−／−網膜のＲＡＰ様病変の数を２倍以上にした（図３Ｆ）。ＦＦＡ１は、６個よりも多くの炭素を含む脂質と結合する（Ｂｒｉｓｃｏｅ，Ｃ．Ｐ．，ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７８，１１３０３−１１３１１（２００３））。ＦＦＡ１脂質アゴニスト中鎖脂肪酸トリグリセリド（ＭＣＴ；８〜１０炭素）（Ｂｒｉｓｃｏｅ，Ｃ．Ｐ．，ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７８，１１３０３−１１３１１ （２００３））または第２のＦＦＡ１選択的アゴニストＴＡＫ−８７５（Ｎａｉｋ，Ｈ．，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ５２，１００７−１０１６（２０１２））で処置したＶｌｄｌｒ−／−マウスは、対照と比較してＧｌｕｔ１抑制を増やし、より多くのＲＡＰ様病変を増加させた（図１２Ａ〜１２Ｃ）。Ｆｆａｒ１の欠失したＶｌｄｌｒ−／−マウスは、ＷＴおよびＦｆａｒ１−／−のレベルに対して網膜のグルコース取り込み（図３Ｇおよび上記のビデオデータ（データは示さず））およびＧｌｕｔ１発現を増加させ（図３Ｈ、および図１１Ｂ〜１１Ｃ）、ＲＡＰ様病変はＶｌｄｌｒ−／−／Ｆｆａｒ１−／−マウスでより少なかった（図３Ｉ）。Ｆｆａｒ１の試験管内ノックダウンまたはＭＥＫ／ＥＲＫ阻害剤（ＰＤ９８０５９）による細胞の処置は、光受容体のＧＷ９５０８によるＧｌｕｔ１抑制を防いだ（６６１Ｗ；図１１Ｄ〜１１Ｆ）。そのため、Ｆｆａｒ１は、ミトコンドリア代謝を循環する基質供給と結びつける、栄養センサーの機能を果たすことができる。
実施例５：脂質／グルコース燃料が網膜で不十分であると、通常無血管の光受容体層で異常な血管形成が引き起こされ得る
二重のグルコースおよび脂質の燃料基質の欠乏に見舞われた光受容体は、エネルギー恒常性を回復しようとして血管の供給を増加させる信号を送ることが仮定された（図４Ａ）。低酸素は血管形成の主な推進因子（ｄｒｉｖｅｒ）であると想定されたが、組織への不適切な栄養利用可能性も血管成長を制御し得る。ピルビン酸レベルの低下、低下したグルコース取り込みおよび解糖からクレブス（ＴＣＡ）回路に流れ込む代謝中間体（図４Ｂ）およびさらに低下したＦＡ取り込みおよびβ酸化からのより少ないアセチルカルニチン（図４Ｃ）は、必須中間体、例えばα−ケトグルタル酸などの産生の減少に関連すると同定した（α−ＫＧはそれよりも少ない、図４Ｄ）。
酸素とともに、α−ＫＧは、プロリンの水酸化による分解のためにＨＩＦ１αをタグ付けするプロピル−ヒドロキシラーゼデヒドロゲナーゼ（ＰＨＤ）の必要な活性化補助因子である（Ｋａｅｌｉｎ，Ｗ．Ｇ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ Ｓｙｍｐ Ｑｕａｎｔ Ｂｉｏｌ ７６，３３５−３４５（２０１１））。より少ないヒドロキシプロリンがＶｌｄｌｒ−／−網膜で検出され、ＰＨＤ活性の低下と一致した（図４Ｅ）。実際に、ＦＦＡ１アゴニストＧＷ９５０８による網膜のグルコース取り込みの減少および光受容体（６６１Ｗ）のグルコース飢餓は、Ｈｉｆ１α安定化（図１３Ａ〜１３Ｃ）およびＶｅｇｆａ分泌（図１３Ｄおよび１３Ｅ）に関連していた。生体内で、Ｖｌｄｌｒ−／−光受容体（図４Ｇ）でのＨｉｆ１α安定化（図４Ｆ）は、Ｖｅｇｆａ産生に関連していた（図４Ｈおよび４Ｉ）。Ｖｌｄｌｒ−／−網膜でのＦｆａｒ１の欠失は、ＨＩＦα安定化およびＶｅｇｆａ分泌を抑制し（図４Ｆおよび４Ｈ）、それにより血管病変がより少なくなった（図３Ｉ）。以前の結果に一致して（Ｈｕａ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ＆ｖｉｓｕａｌ ｓｃｉｅｎｃｅ ５２，２８０９−２８１６（２０１１））、光受容体でＶｅｇｆａを分泌するように操作したマウスは、Ｖｌｄｌｒ−／−マウスに匹敵する網膜血管腫状増殖を生じ（Ｏｈｎｏ−Ｍａｔｓｕｉ，Ｋ．，ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｐａｔｈｏｌｏｇｙ １６０，７１１−７１９（２００２））；光受容体由来のＶｅｇｆａは、そのためＲＡＰ様病変を促進するのに十分であった。重要なことに、潜在的に血管病変の一因となる、エネルギー危機に関連する酸化ストレスも、Ｈｉｆ１αを直接に安定化させ、Ｖｌｄｌｒ−／−光受容体におけるＶｅｇｆａ分泌を促進する可能性が高い（Ｄｏｒｒｅｌｌ，Ｍ．Ｉ．，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １１９，６１１−６２３（２００９），Ｃｈｅｎ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．Ｍｉｃｒｏｖａｓｃ Ｒｅｓ ７８，１１９−１２７（２００９），およびＺｈｏｕ，Ｘ．，ｅｔ ａｌ．，ＰｌｏＳ Ｏｎｅ ６，ｅ１６７３３（２０１１））。しかし、ＡＭＤの病因に関係づけられることの多いマクロファージは、新生のＲＡＰ様病変の発症に、ただ成熟した血管病変を取り囲んでいるだけで関連していなかった（図１４Ａ〜１４Ｄ）。ヒト疾患に対するこれらの知見を翻訳すると、対照と比較してより高い硝子体ＶＥＧＦレベルがＡＭＤ／ＲＡＰヒト対象で検出された（黄斑円孔；図４Ｊ）。これらの知見は、脂質／グルコース燃料が網膜で不十分であると、一つにはクレブス回路代謝物質α−ＫＧの減少によって、通常無血管の光受容体層で異常な血管形成が引き起こされ得ることを示した。
網膜において、脂質とグルコースの両方を燃料として使用する能力は、高燃料を必要とするかまたは燃料の欠乏している期間に有益であり得る。絶食は、ＦＡをβ酸化する能力のある高エネルギー消費器官、例えば心臓、およびおそらく網膜などによって使用される脂肪組織からＦＡを解放する（図２Ａ〜２Ｆ、図６Ａ〜６Ｃ、および図９Ａ〜９Ｄ）。実際に、ＦＡのβ酸化障害は、以前に網膜症に関連しているとして同定された（Ｆｌｅｔｃｈｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ １０６，１８−２４（２０１２））。脂質を燃料として使用する組織は、飢餓の間はグルコース取り込みを抑える（Ｍａｎｔｙｃｈ，Ｇ．Ｊ ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３３，６００−６０７（１９９３）、およびＦｅｒｒａｎｎｉｎｉ，Ｅ．，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ ７２，１７３７−１７４７（１９８３））。栄養利用可能性を感知し、燃料取り込みを適応させる能力は、代謝効率を改善することができ得る。
Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）は、アミノ酸、グルコースおよび脂質の公知の膜センサーである（Ｗａｕｓｏｎ，Ｅ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ ２７，１１８８−１１９７（２０１３））。ここで、ＦＦＡ１は、ＦＡ利用可能性の代謝センサーであることが示され、それは網膜へのグルコース流入を制御する（図３Ａ〜３Ｉ）。光受容体でグルコース流入がＦＦＡ１によって（おそらく循環脂質に次いで）長期間抑制されたことが、ＡＭＤまたはＭａｃＴｅｌの加齢性ミトコンドリア機能障害の一因となった可能性がある。２型糖尿病の治療に考えられるＦＦＡ１アゴニストの網膜への作用は、特にＡＭＤのリスクの高まる高齢の個体において注意深くモニターされるべきである。
要約
ミトコンドリア代謝は、その他の疾患、例えば癌などで病的血管形成の一因になり得る。増殖のための構成要素を提供するために、腫瘍はワールブルク効果による効率的なＡＴＰ産生を犠牲にして血管形成を促進する（Ｗａｒｂｕｒｇ，Ｏ．Ｓｃｉｅｎｃｅ １２３，３０９−３１４（１９５６））。ミトコンドリアの酸化的リン酸化を抑制する際に、腫瘍細胞は、より少ないα−ＫＧを生成することがある（Ｚｈａｏ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２４，２６１−２６５（２００９））（または競合代謝物質を蓄積させる）（Ｋａｅｌｉｎ，Ｗ．Ｇ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ Ｓｙｍｐ Ｑｕａｎｔ Ｂｉｏｌ ７６，３３５−３４５（２０１１））。これは、続いて起こるＨＩＦ１α安定化によってプロリル−ヒドロキシラーゼデヒドロゲナーゼ（ＰＨＤ）を阻害し、成長に必要な腫瘍血管形成を引き起こす。この知見は、エネルギー需要を血管供給と適合させる、血管形成の推進因子としてのミトコンドリアの燃料飢餓の重要性を示す。ミトコンドリアの機能が年齢とともに低下するにつれて、このプロセスは、加齢性網膜疾患において病的血管形成の一因となり得る。
要約すれば、脂質取り込みおよび脂質β酸化は、Ｖｌｄｌｒ−／−網膜で削減される。循環ＦＡの増加は、網膜のグルコース取り込みの減少およびクレブス（Ｋｒｅｂ）回路中間体α−ＫＧの減少に関連している、ＦＦＡ１を活性化することができる。Ｈｉｆαは安定化し、ＶｅｇｆａがＶｌｄｌｒ−／−光受容体によって分泌され、病的ＲＡＰ様新生血管を生じる。本研究は、網膜の生理学および血管新生ＡＭＤ／ＲＡＰに寄与する３つの重要な新規な機構を明らかにした：
（１）脂質β酸化は網膜のエネルギー源である、
（２）ＦＦＡ１は、網膜のグルコース流入を制御してミトコンドリア代謝と利用可能な燃料基質を適合させる循環脂質の重要な栄養センサーである、および
（３）栄養の欠乏は、網膜の病的血管形成の推進因子である。
これらの経路は、新しい治療法の発見に重要であり得る。
実施例６：神経系細胞（例えば、網膜細胞）疾患または障害を治療するためのＦＦＡ１阻害剤の使用
この例では、血管形成を特徴とする、神経系細胞（例えば、網膜細胞）疾患または障害を有するかまたは発症する危険のある対象（例えば、ＲＡＰの血管病変を有するかまたはその危険のある対象、例えば、ＭａｃＴｅｌおよび／またはＡＭＤを有するかまたはその危険のある対象）は、ＦＦＡ１阻害剤を含む医薬組成物を投与される。血管形成を特徴とする、神経系細胞（例えば、網膜細胞）疾患または障害の予防および／または改善は、ＦＦＡ１阻害剤を対象に投与する前と後にモニターされる。ＦＦＡ１阻害剤（例えば、ＲＮＡｉおよび／または小分子）は、対象に（例えば、対象への眼内注射によって）全身投与または局所投与される。対象におけるＦＦＡ１阻害剤の予防および／または治療効力はそれによって同定される。
実施例７：新規ＦＦＡ１阻害剤の同定
この例では、視細胞（例えば、６６１Ｗ細胞）を試験管内で、随意にアレイ形式で増殖させる。細胞（随意に超低密度リポタンパク質受容体（Ｖｌｄｌｒ）遺伝子の突然変異または欠失を有する）を被検化合物のライブラリーと接触させ、細胞のグルコース取り込みをモニターする。グルコース取り込みの著しい増加に再現性良く影響を及ぼす被検化合物が、それによってＦＦＡ１の候補新規阻害剤として同定される。
新規ＦＦＡ１阻害剤の同定に検討されるアッセイとしては、放射性熱量測定アッセイ、ならびにグルコース取り込みを測定する非放射性熱量測定アッセイが挙げられる。これらのアッセイは、ハイスループット分析用に随意に最適化される。例えば、非放射性アッセイには、比色分析グルコース取り込みアッセイキット（例えば、Ａｂｃａｍ製品番号ａｂ１３６９５５）が含まれる。その上、グルコース取り込み細胞に基づくアッセイキット（Ｃａｙｍａｎ ｃｈｅｍｉｃａｌ品目番号６００４７０）を使用して、蛍光デオキシグルコース類似体を用いてグルコース取り込みを測定する。さらに別の例では、ＦＦＡ１阻害剤は、グルコース輸送体、Ｇｌｕｔ１の細胞表面提示によって同定される（例えば、ＥＬＩＳＡに基づくアッセイおよび／または遺伝子発現アッセイ）。
実施例８：神経変性を治療するためのＦＦＡ１阻害剤の使用
この例では、神経変性（ニューロンの機能の喪失を特徴とし、ニューロンの死滅も含む）を有するかまたは発症する危険のある対象にＦＦＡ１阻害剤を含む医薬組成物が投与される。神経変性の予防および／または改善は、ＦＦＡ１阻害剤を対象に投与する前と後にモニターされる。対象におけるＦＦＡ１阻害剤の予防および／または治療効力はそれによって同定される。
実施例９：癌を治療するためのＦＦＡ１阻害剤の使用
この例では、癌を有するかまたは発症する危険のある対象にＦＦＡ１阻害剤を含む医薬組成物が投与される。癌の予防および／または改善は、ＦＦＡ１阻害剤を対象に投与する前と後にモニターされる。対象におけるＦＦＡ１阻害剤の予防および／または治療効力はそれによって同定される。一部の例では、阻害剤は、悪性細胞の代謝を変更し、それによって対象を治療する。
等価物
当業者は、日常的な実験しか使用しなくても、本明細書に記載される本発明の特定の実施形態の多くの等価物を理解するか、または確かめることができるであろう。そのような等価物は以下の特許請求の範囲に包含されることが意図される。

Claims (25)

  1. 対象の神経系細胞における血管形成を治療または予防するための、かつ／あるいは対象において癌を治療または予防するための方法であって、前記方法が：
    （ａ）神経系細胞の血管形成を有するかまたはその危険のある対象および／または癌を有するかまたは癌を発症する危険のある対象を同定することと；
    （ｂ）ＦＦＡ１阻害剤を前記対象に投与することとを含み、
    それにより前記対象の前記神経系細胞における血管形成を治療または予防し、かつ／または前記対象において癌を治療または予防する、方法。
  2. 前記神経系細胞が網膜細胞、任意選択で視細胞である、請求項１に記載の方法。
  3. 対象において網膜血管腫状増殖（ＲＡＰ）の血管病変を治療または予防するための方法であって、前記方法が：
    （ａ）ＲＡＰの血管病変を有するかまたはそれを発症する危険のある対象を同定することと；
    （ｂ）ＦＦＡ１阻害剤を前記対象に投与することとを含み、
    それにより前記対象においてＲＡＰの血管病変を治療または予防する方法。
  4. 前記対象が、黄斑部毛細血管拡張症（ＭａｃＴｅｌ）または血管新生加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）を有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 前記対象の前記細胞が、適切な対照対象の細胞と比較して、脂質の取り込みが損なわれる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 前記対象が脂質異常症またはミトコンドリア機能障害を有する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 前記ＦＦＡ１阻害剤が小分子アンタゴニストまたはＲＮＡｉ剤である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 前記ＦＦＡ１アンタゴニストがＧＷ１１００である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
  9. 前記ＦＦＡ１阻害剤が前記対象の眼に投与される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
  10. 前記ＦＦＡ１阻害剤が硝子体内注射によって投与される、請求項９に記載の方法。
  11. 前記ＦＦＡ１阻害剤を投与することにより、前記対象の網膜細胞においてＧＬＵＴ１の発現が増加する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
  12. 網膜細胞においてグルコース取り込みを増加させる方法であって、前記方法が、網膜細胞を入手し、前記網膜細胞をＦＦＡ１阻害剤と接触させ、それにより前記網膜細胞でのグルコース取り込みを増加させることを含む、方法。
  13. 前記網膜細胞が試験管内の網膜細胞である、請求項１２に記載の方法。
  14. 前記ＦＦＡ１阻害剤と接触した前記網膜細胞でＧＬＵＴ１発現が増加する、請求項１２に記載の方法。
  15. 被検化合物をＦＦＡ１阻害剤であると同定するための方法であって、前記方法が網膜細胞と被検化合物を接触させることと；および前記網膜細胞でのグルコース取り込みを測定することとを含み、前記被検化合物の存在下で前記網膜細胞でのグルコース取り込みの増加が測定されれば、前記被検化合物をＦＦＡ１阻害剤であると同定する、方法。
  16. 前記網膜細胞が、前記網膜細胞において脂肪酸の取り込みを抑制する超低密度リポタンパク質受容体（Ｖｌｄｌｒ）遺伝子の突然変異または欠失を有する、請求項１５に記載の方法。
  17. 前記被検化合物と接触した前記網膜細胞でＧＬＵＴ１発現が増加する、請求項１５に記載の方法。
  18. 対象において前記眼の血管疾患、網膜変性症および／または癌を治療または予防するための方法であって、前記方法が：
    （ａ）前記眼の血管疾患、網膜変性症および／または癌を有するかまたは発症する危険のある対象を同定することと；
    （ｂ）ＧＰＲ８４阻害剤を前記対象に投与することとを含み、
    それにより前記対象において前記眼の前記血管疾患、網膜変性症および／または癌を治療または予防する、方法。
  19. 前記ＧＰＲ８４阻害剤が小分子アンタゴニストまたはＲＮＡｉ剤である、請求項１８に記載の方法。
  20. 前記ＧＰＲ８４阻害剤がＧＬＰＧ１２０５である、請求項１８に記載の方法。
  21. 前記眼の前記血管疾患が、加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）または未熟児網膜症（ＲＯＰ）である、請求項１８に記載の方法。
  22. 対象において前記眼の血管疾患、網膜変性症および／または癌を治療または予防するための方法であって、前記方法が：
    （ａ）前記眼の血管疾患、網膜変性症および／または癌を有するかまたは発症する危険のある対象を同定することと；
    （ｂ）ＧＰＲ１２０阻害剤を前記対象に投与することとを含み、
    それにより前記対象において前記眼の前記血管疾患、網膜変性症および／または癌を治療または予防する、方法。
  23. 前記ＧＰＲ１２０阻害剤が小分子アンタゴニストまたはＲＮＡｉ剤である、請求項２２に記載の方法。
  24. 前記ＧＰＲ１２０阻害剤が４−メチル−Ｎ−９Ｈ−キサンテン−９−イル−ベンゼンスルホンアミドである、請求項２２に記載の方法。
  25. 前記眼の前記血管疾患が、加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）または未熟児網膜症（ＲＯＰ）である、請求項２２に記載の方法。
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