JP2019509023A - Ror2抗体組成物及び関連する方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、ヒトROR2を特異的に認識する抗体、抗体フラグメント又は抗原結合フラグメント、並びに関連抗体薬物複合体(ADC)及びキメラ抗原受容体(CAR)を提供する。また、様々な診断及び治療用途でこうした抗体を使用する方法も本発明に提供される。
Description
関連出願の相互参照
本出願は、米国仮特許出願第62/280,834号明細書(2016年1月20日出願)に対する優先権の利益を主張する。優先出願の全開示内容は、全体として、及びあらゆる目的のために、参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、米国仮特許出願第62/280,834号明細書(2016年1月20日出願)に対する優先権の利益を主張する。優先出願の全開示内容は、全体として、及びあらゆる目的のために、参照により本明細書に組み込まれる。
癌は、主な死亡原因の1つである。これは、細胞の不死化を招く遺伝子変化、例えば、染色体転位、腫瘍抑制遺伝子、転写因子若しくは増殖因子受容体の突然変異などに起因する、正常細胞の悪性形質転換によって引き起こされる疾患の1クラスである。不死化が、過剰増殖と組み合わされると、不死化細胞は、転移を伴う、若しくは伴わない(固形腫瘍の場合)腫瘍、又は白血病及びリンパ腫(血液の癌)を発生する。アポトーシス、又はプログラム細胞死の欠損は、癌を引き起こす細胞の悪性形質転換にさらに寄与し得る。
受容体チロシンキナーゼオーファン受容体−1及び−2(ROR1及びROR2)から構成される膜結合性受容体チロシンキナーゼのファミリーは、特定の癌に特に関連するものとして記載されている(Rebagay et al.(2012)Front Oncol.2(34))が、少なくともROR1の場合、ごくわずかな例外を除いて、正常組織上の発現にはほとんど存在しない(Balakrishnan et al.(2016)Clin Cancer Res.doi:10.1158/1078−0432)。ROR発現が、腫瘍発生と機能的に関連しているか否かは依然として不明のままである。しかし、RORファミリーメンバーの極めて腫瘍選択的な発現のために、これらは、標的癌療法にとって適切な標的を代表するものである。重要なことには、ROR2は、神経芽細胞腫、肉腫、腎細胞癌、乳癌、胃癌、前立腺癌、黒色腫、扁平上皮癌、多発性骨髄腫及びその他の癌において腫瘍細胞表面上に発現される。
正常生理学では、ROR2は、胚発生中の骨及び軟骨成長の様々な状況の原因となる。誕生後、ROR2の発現は下方制御されるため、ROR2は、通常、成体組織において検出できないか、又は非常に低いレベルで発現される。ROR2の弱い発現は、胃及び胸腺組織に報告されているに過ぎない(Morioka et al.,Cancer Sci.100:1227−1233,2009)。ROR2は、以前からROR2特異的抗体の開発のための標的として認識されている(国際公開第2013103637号パンプレット)。しかし、文献に記載される既知の配列を有するhROR2標的に対する抗体はない。
従って、ROR2発現癌の抗体による標的療法の開発の基礎として用いることができる高品質の抗ROR2結合抗体のニーズがある。さらには、例えば、ウエスタンブロッティング及び/又は免疫組織化学(IHC)などの、ROR2関連疾患状態におけるROR2発現を検出するための追加的診断ツールに対するニーズも存在する。本発明は、これらの、及び他のニーズに取り組むことに関する。
一態様では、本発明は、ヒト受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体2(hROR2)の細胞外ドメインに特異的に結合し、且つ、哺乳動物細胞に発現されるヒトROR2(hROR2)細胞外ドメインをベイトとして用いて、非免疫ウサギの高度に多様なファージディスプレイライブラリーから選択された、ウサギ抗体の新規の高親和性結合ドメインを提供する。ウサギ抗体の可変領域は、組換えタンパク質として、また、哺乳動物宿主細胞の表面に過剰発現されるhROR2の結合に基づいて、hROR2のECDに対する結合についてスクリーニングすることにより、選択されている。この戦略によって、高品質及び好都合な機能的特性の新規のhROR2抗体が同定されている。さらに、本発明は、ヒトIgC1抗体の定常領域ドメインに融合されたウサギ可変ドメインのキメラ完全長抗体を提供する。
本発明の第2の態様では、超強力アントラサイクリン毒素を含むキメラウサギ−ヒト抗ヒトROR2(hROR2)抗体に基づく部位特異的結合抗体薬物複合体(ADC)が本発明によって提供される。部位特異的結合は、国際公開第2014140317号パンフレットに実質的に開示されているように、ソルターゼ酵素を用いた酵素結合によって達成される。インビトロで高い効力を有する抗hROR2 ADCをもたらす超強力アントラサイクリン毒素は、国際公開第2016102679号パンフレット(本明細書に参照により組み込まれる)に開示されている。
最後に、本発明は、インビトロで高い効果を示す前記抗hROR2結合ドメインを使用して、キメラ抗原受容体(CAR)及びこれらのCARで作製されたT細胞、すなわち、いわゆるCAR−T細胞を提供する。
従って、本発明は、以下:(i)配列番号1と配列番13;(ii)配列番号2と配列番号14;(iii)配列番号3と配列番号15;(iv)配列番号4と配列番号16;(v)配列番号5と配列番号17;(vi)配列番号6と配列番号18;(vii)配列番号7と配列番号19;(vii)配列番号8と配列番号20;(ix)配列番号9と配列番号21;(x)配列番号10と配列番号22;(xi)配列番号11と配列番号23;若しくは(xii)配列番号12と配列番24にそれぞれ示される、免疫グロブリン重鎖可変領域配列と免疫グロブリン軽鎖可変領域配列とを含むhROR2特異的抗体のものと同じhROR2に対する結合特異性を有する、抗hROR2抗体、抗体ベースの結合タンパク質、その抗体フラグメント(抗原結合フラグメント)、抗体薬物複合体(ADC)、又はCARに関する。
本発明は、さらに、一方又は両方が、以下:(i)配列番号1と配列番13;(ii)配列番号2と配列番号14;(iii)配列番号3と配列番号15;(iv)配列番号4と配列番号16;(v)配列番号5と配列番号17;(vi)配列番号6と配列番号18;(vii)配列番号7と配列番号19;(viii)配列番号8と配列番号20;(ix)配列番号9と配列番号21;(x)配列番号10と配列番号22;(xi)配列番号11と配列番号23;若しくは(xii)配列番号12と配列番24にそれぞれ示される、重鎖可変領域配列又は軽鎖可変領域配列に対して、少なくとも90%、若しくは少なくとも95%、又は95%超で、且つ100%未満同一である、重鎖可変領域配列又は軽鎖可変領域配列を含む、抗hROR2抗体、抗体ベースの結合タンパク質、その抗体フラグメント、抗体薬物複合体(ADC)、又はCARに関する。
本発明は、さらに、一方又は両方が、以下:(i)配列番号1と配列番13;(ii)配列番号2と配列番号14;(iii)配列番号3と配列番号15;(iv)配列番号4と配列番号16;(v)配列番号5と配列番号17;(vi)配列番号6と配列番号18;(vii)配列番号7と配列番号19;(viii)配列番号8と配列番号20;(ix)配列番号9と配列番号21;(x)配列番号10と配列番号22;(xi)配列番号11と配列番号23;若しくは(xii)配列番号12と配列番24にそれぞれ示される、重鎖可変領域配列及び軽鎖可変領域配列と同一である、重鎖可変領域配列又は軽鎖可変領域配列を含む、抗hROR2抗体、抗体ベースの結合タンパク質、その抗体フラグメント、抗体薬物複合体(ADC)、又はCARに関する。
本発明は、さらに、以下:(i)配列番号25〜27と配列番号61〜63、(ii)配列番号28〜30と配列番号64〜66、(iii)配列番号31〜33と配列番号67〜69、(iv)配列番号34〜36と配列番号70〜72、(v)配列番号37〜39と配列番号73〜75、(vi)配列番号40〜42と配列番号76〜78、(vii)配列番号43〜45と配列番号79〜81、(viii)配列番号46〜48と配列番号82〜84、(ix)配列番号49〜51と配列番号85〜87、(x)配列番号52〜54と配列番号88〜90、(xi)配列番号55〜57と配列番号91〜93、若しくは(xii)配列番号58〜60と配列番号94〜96に対して、それぞれ少なくとも90%、若しくは少なくとも95%、又は95%超で、且つ100%未満同一である、免疫グロブリン重鎖CDR配列と免疫グロブリン軽鎖CDR配列とを含む、抗hROR2抗体、抗体ベースの結合タンパク質、その抗体フラグメント、抗体薬物複合体(ADC)、又はCARに関する。
本発明は、さらに、以下:(i)配列番号25〜27と配列番号61〜63、(ii)配列番号28〜30と配列番号64〜66、(iii)配列番号31〜33と配列番号67〜69、(iv)配列番号34〜36と配列番号70〜72、(v)配列番号37〜39と配列番号73〜75、(vi)配列番号40〜42と配列番号76〜78、(vii)配列番号43〜45と配列番号79〜81、(viii)配列番号46〜48と配列番号82〜84、(ix)配列番号49〜51と配列番号85〜87、(x)配列番号52〜54と配列番号88〜90、(xi)配列番号55〜57と配列番号91〜93、若しくは(xii)配列番号58〜60と配列番号94〜96とそれぞれ同一である、重鎖CDR1〜3配列と軽鎖CDR1〜3配列とを含む、本発明の抗hROR2抗体、抗体ベースの結合タンパク質、その抗体フラグメント、抗体薬物複合体(ADC)、又はCARに関する。
本発明は、さらに、以下:(i)配列番号1と配列番13;(ii)配列番号2と配列番号14;(iii)配列番号3と配列番号15;(iv)配列番号4と配列番号16;(v)配列番号5と配列番号17;(vi)配列番号6と配列番号18;(vii)配列番号7と配列番号19;(viii)配列番号8と配列番号20;(ix)配列番号9と配列番号21;(x)配列番号10と配列番号22;(xi)配列番号11と配列番号23;若しくは(xii)配列番号12と配列番24にそれぞれ示される、重鎖可変領域配列と軽鎖可変領域配列とを含む、本発明の抗hROR2抗体、抗体ベースの結合タンパク質、その抗体フラグメント、抗体薬物複合体(ADC)、又はCARに関する。
本発明は、さらに、配列番号25〜60からなる群から選択される少なくとも1つの重鎖CDR配列を含む、本発明の抗hROR2抗体、抗体ベースの結合タンパク質、その抗体フラグメント、抗体薬物複合体(ADC)、又はCARに関する。これらの分子の一部は、配列番号61〜96からなる群から選択される軽鎖CDR配列をさらに含む。
本発明は、さらに、以下:配列番号25〜27、配列番号28〜30、配列番号31〜33、配列番号34〜36、配列番号37〜39、配列番号40〜42、配列番号43〜45、配列番号46〜48、配列番号49〜51、配列番号52〜54、配列番号55〜57、若しくは配列番号58〜60とそれぞれ同一である、重鎖CDR1、CDR2、及びCDR3配列を含む、抗hROR2抗体、抗体ベースの結合タンパク質、その抗体フラグメント、抗体薬物複合体(ADC)、又はCARに関する。
本発明は、さらに、配列番号61〜96からなる群から選択される少なくとも1つの軽鎖CDR配列を含む、本発明の抗hROR2抗体、抗体ベースの結合タンパク質、その抗体フラグメント、抗体薬物複合体(ADC)、又はCARに関する。これらの分子の一部は、配列番号25〜60からなる群から選択される重鎖CDR配列をさらに含む。
本発明は、さらに、以下:配列番号61〜63、配列番号64〜66、配列番号67〜69、配列番号70〜72、配列番号73〜75、配列番号76〜78、配列番号79〜81、配列番号82〜84、配列番号85〜87、配列番号88〜90、配列番号91〜93、若しくは配列番号94〜96とそれぞれ同一である、軽鎖CDR1、CDR2、及びCDR3配列を含む、抗hROR2抗体、抗体ベースの結合タンパク質、その抗体フラグメント、抗体薬物複合体(ADC)、又はCARに関する。
本発明は、さらに、以下:(i)配列番号25〜27と配列番号61〜63、(ii)配列番号28〜30と配列番号64〜66、(iii)配列番号31〜33と配列番号67〜69、(iv)配列番号34〜36と配列番号70〜72、(v)配列番号37〜39と配列番号73〜75、(vi)配列番号40〜42と配列番号76〜78、(vii)配列番号43〜45と配列番号79〜81、(viii)配列番号46〜48と配列番号82〜84、(ix)配列番号49〜51と配列番号85〜87、(x)配列番号52〜54と配列番号88〜90、(xi)配列番号55〜57と配列番号91〜93、若しくは(xii)配列番号58〜60と配列番号94〜96にそれぞれ示される重鎖CDR1、CDR2、及びCDR3配列と軽鎖CDR1、CDR2、及びCDR3配列とを含む、抗hROR2抗体、抗体ベースの結合タンパク質、その抗体フラグメント、抗体薬物複合体(ADC)、又はCARに関する。
様々な実施形態では、本発明の抗hROR2抗体、抗体ベースの結合タンパク質、その抗体フラグメントは、以下:IgA1、IgA2、IgD、IgE、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4若しくはIgMアイソタイプ、又はそれらのF(ab)2、Fv、scFv、IgGACH2、F(ab’)2、scFv2CH3、Fab、VL、VH、scFv4、scFv3、scFv2、dsFv、Fv、scFv−Fc、(scFv)2フラグメント、又は非枯渇IgG、ダイアボディ、若しくは二価抗体のいずれかであってよい。一部の実施形態では、抗hROR2抗体又は抗体ベースの結合タンパク質は、天然に存在するIgG1、IgG2、IgG3、IgG4アイソタイプ、又は合成IgGからなる群から選択されるIgGである。一部の他の実施形態では、抗hROR2抗体フラグメントは、Fab、scFv、又はdsFvである。一部の実施形態では、抗hROR2抗体、抗体ベースの結合タンパク質、その抗体フラグメントは、合成分子と結合している。これらの実施形態の一部では、抗hROR2抗体、抗体ベースの結合タンパク質、その抗体フラグメントは、膜貫通領域及び細胞内T細胞受容体(TCR)シグナル伝達ドメインと結合して、キメラ抗原受容体(CAR)を形成する。
本発明は、さらに、hROR2特異的細胞の殺傷をもたらす毒素ペイロードと一緒に、本発明のhROR2特異的抗体、抗体ベースの結合タンパク質又はその抗体フラグメントを含む抗体薬物複合体(ADC)に関する。前記ADCにおいて、毒素ペイロードは、マレイミド官能基を有する古典的な化学リンカー、又はリシン若しくはシステインアミノ酸側鎖との結合を媒介することができる当技術分野で公知の他の化学物質を使用し、リシン若しくはシステインアミノ酸側鎖を介して、抗体、抗体ベースの結合タンパク質又は抗体フラグメントと非部位特異的に結合することができる。前記ADCでは、低分子量ペイロードは、例えば、二官能価リンカー、ホルミル−グリシン形成酵素修飾抗体上でピクテ・スペングラー(Pictet−Spengler)化学を可能にするリンカー、グリカン−再モデル化抗体、又は細菌トランスグルタミナーゼ若しくはソルターゼ酵素のように、当技術分野で公知の化学、化学−酵素、若しくは酵素結合のいずれかによって、部位特異的に結合することもできる。
関連する一態様では、本発明は、治療に有効な量の本発明の抗hROR2抗体、抗体ベースの結合タンパク質、その抗体フラグメント、抗体薬物複合体(ADC)と、薬学的に許容される担体とを含有する医薬組成物を提供する。また、本明細書に開示する抗体、抗体ベースの結合タンパク質、その抗体フラグメント若しくは抗体薬物複合体(ADC)の少なくとも1つを含む医薬組成物又はキットも本発明に提供される。さらに、本明細書に開示する抗hROR2抗体、抗体ベースの結合タンパク質、その抗体フラグメント、抗体薬物複合体(ADC)、又はCARの免疫グロブリン重鎖若しくは免疫グロブリン軽鎖の可変領域をコードする、単離された若しくは実質的に精製されたポリヌクレオチド、並びにそのようなポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターも本発明に提供される。
別の態様では、本発明は、対象においてhROR2を発現する細胞を殺傷するか、又はその増殖を阻害する方法を提供する。これらの方法は、本明細書に開示する治療有効量の抗hROR2抗体、抗体ベースの結合タンパク質、その抗体フラグメント、抗体薬物複合体(ADC)、又はCARを、治療が必要な対象に投与するステップを含む。これにより、対象においてhROR2を発現する細胞を殺傷するか、又はその増殖を阻害することが可能になる。様々な実施形態では、hROR2を発現する細胞は、腫瘍細胞である。関連する態様では、本発明は、対象において、hROR2の発現増大に関連する疾患又は状態を治療する方法を提供する。これらの方法は、治療有効量の本発明の抗hROR2抗体、抗体ベースの結合タンパク質、その抗体フラグメント、抗体薬物複合体(ADC)、又はCARを、hROR2の発現増大に関連する疾患又は状態に罹患した対象に投与するステップを含む。これにより、対象において、疾患又は状態の治療が可能になる。これらの治療法の一部は、対象の癌の治療に関する。本発明の方法による治療に適した癌として、例えば、神経芽細胞腫、骨肉腫、腎細胞癌、乳癌、胃癌、前立腺癌、黒色腫、扁平上皮癌及び多発性骨髄腫が挙げられる。様々な実施形態では、投与される抗hROR2抗体、抗体ベースの結合タンパク質、その抗体フラグメント、又はそれらに基づく抗体薬物複合体(ADC)若しくはCARは、F(ab)2、Fv、scFv、IgGACH2、F(ab’)2、scFv2CH3、Fab、VL、VH、scFv4、scFv3、scFv2、dsFv、Fv、(scFv)2、又は合成IgGである。一部の方法では、投与される抗hROR2抗体、抗体ベースの結合タンパク質又はその抗体フラグメントは、合成分子と結合している。これらの実施形態の一部では、投与される抗hROR2抗体、抗体ベースの結合タンパク質、その抗体フラグメントは、膜貫通領域及び細胞内T細胞受容体(TCR)シグナル伝達ドメインに結合されて、キメラ抗原受容体(CAR)を形成する。一部の実施形態では、キメラ抗原受容体(CAR)は、対象に投与しようとするT細胞上に存在する。一部の他の実施形態では、抗体は、細胞傷害剤、放射性同位体、又はリポソームに結合することができる。
別の態様では、本発明は、対象におけるROR2レベルの変化を検出する方法を提供する。この方法は、以下:(a)対象から生体サンプルを取得するステップ;(b)サンプルを、本明細書に開示する抗hROR2抗体、抗体ベースの結合タンパク質、その抗体フラグメントと接触させるステップ;(c)生体サンプル中のROR2のレベルを決定するステップ;並びに(d)生体サンプル中のROR2のレベルとROR2のコントロールレベルを比較するステップを含む。これにより、生体サンプル中のROR2レベルが、ROR2のコントロールレベルに対して変化しているか否かを決定することができる。これらの方法では、コントロールレベルに対して、対象のROR2レベルの増加は、対象におけるROR2の発現増大に関連する疾患又は状態を示す。例えば、ROR2の発現増大の検出は、対象における神経芽細胞腫、骨肉腫、腎細胞癌、乳癌、胃癌、前立腺癌、黒色腫、扁平上皮癌、又は多発性骨髄腫の存在を示し得る。
また別の態様では、本発明は、対象においてROR2発現腫瘍を検出する方法を提供する。これらの方法は、(a)ROR2発現腫瘍を有する、有することが疑われる、若しくは、それを発生するリスクがある対象に、本発明の抗hROR2抗体、抗体ベースの結合タンパク質、その抗体フラグメントを投与するステップ;及び(b)変化した結合標識密度若しくは濃度の領域について対象をイメージするステップを含み、ここで、密度若しくは濃度は、(i)近傍組織中のバックグラウンド又は(ii)対象の同じ領域中で以前検出された密度若しくは濃度と比較される。変化した結合標識密度若しくは濃度の領域の存在は、対象におけるROR2発現腫瘍の存在の指標である。
本明細書の残りの部分及び請求項を参照にすることにより、本発明の性質及び利点はさらに理解されるであろう。
1.概説
受容体チロシンキナーゼオーファン受容体−1及び−2、ROR1及びROR2は、全体的な構造設計及びいくつかの機能的類似性に基づき、新たな受容体チロシンキナーゼファミリーを定義するただ2つのファミリーメンバーである。ROR1及びROR2タンパク質のいずれも、免疫グロブリンドメイン、システインリッチフリズルド(frizzled)ドメイン及びクリングル(Kringle)ドメインから構成される細胞外ドメイン(ECD)を有するI型1回膜貫通型受容体である。これらの3つの細胞外ドメインに、キナーゼドメインを含むタンパク質の細胞内部分にECDを結合する膜貫通ドメインが続く(Rabagay et al.(2012)Frontiers Oncol.2:1−8)。
受容体チロシンキナーゼオーファン受容体−1及び−2、ROR1及びROR2は、全体的な構造設計及びいくつかの機能的類似性に基づき、新たな受容体チロシンキナーゼファミリーを定義するただ2つのファミリーメンバーである。ROR1及びROR2タンパク質のいずれも、免疫グロブリンドメイン、システインリッチフリズルド(frizzled)ドメイン及びクリングル(Kringle)ドメインから構成される細胞外ドメイン(ECD)を有するI型1回膜貫通型受容体である。これらの3つの細胞外ドメインに、キナーゼドメインを含むタンパク質の細胞内部分にECDを結合する膜貫通ドメインが続く(Rabagay et al.(2012)Frontiers Oncol.2:1−8)。
ヒトROR1及びROR2タンパク質は、互いに58%相同であるが、RORタンパク質の各々は、種の間で高度に保存されている。これは、ヒトROR2特異的モノクローナル抗体の作製にとって課題を呈し、そうした抗体はごくわずかしか知られておらず、抗ROR2抗体の配列は文献に記載されていない。
抗hROR2抗体を作製するために、本発明者らは、ファージにより展示された極めて高複雑度のナイーブウサギ抗体Fabライブラリーを作製し、hROR2の哺乳動物細胞発現ECD及び細胞表面発現ヒトROR2に対する結合物質のライブラリーを選択することにより、ネイティブヒトROR2タンパク質と反応性で、最も機能性且つ多様な抗体クローンを選択した。
この戦略を選んだのは、得ようとする抗体レパトアが、依然として天然のウサギBリンパ球に由来し、従って、免疫系の予め選択された抗体重鎖及び軽鎖について選択されるためである。しかし、ネイティブ組換え及び細胞発現ヒトROR2を含む適用スクリーニング戦略によって、特定のROR2陽性癌のように、ROR2発現と関連するヒトの疾患の治療法に特に有用である、高い機能性品質を有するhROR2特異的抗体が同定されることが期待された。
選んだ戦略の結果、多様なCDR1、2及び3配列(図1)を有し、且つヒトROR2に対しては高い結合選択性を有するが、その最も関連する「姉妹分子」であるヒトROR1については結合選択性を示さない(図2及び3)いくつかの新たなウサギ高親和性抗ヒトROR2抗体が同定された。hROR2特異的抗体の一部は、hROR2標的に対して高い親和性(一桁のnM親和性)を示した(図10)。本発明は、本発明者らによる大きなナイーブキメラ/ヒトFabライブラリーの作製及びヒトROR2に対する結合物質の選択に一部が基づくものである。本明細書に詳述するように、本発明者らによっていくつかのモノクローナルキメラウサギ/ヒトFab抗体(mAb)が得られた(図1を参照)。これらのmAbは全て、ELISAにより分析される通り、精製済ヒトROR2に、また、フローサイトメトリーにより分析される通り、細胞表面ヒトROR2に結合する。ROR2の最も近縁であり、ROR2と58%のアミノ酸配列同一性を有するROR1に結合するものはなかった。加えて、mAbの親和性及びそれらのエピトープ(これらは異なる)の位置が決定されている。さらに、いくつかのmAb(抗体クローンXBR2−401、XBR2−416、XBR2−433、ERR2−302、ERR2−308、ERR2−317、XBR2−327、及びXBR2−TOP72)も、キメラウサギ/ヒトIgG1フォーマットに変換し、哺乳動物細胞において発現させた後、プロテインAアフィニティクロマトグラフィーにより精製した。これらのIgG1抗体の結合活性も決定した。
これに加えて、数個のmAbが、C末端ソルターゼ認識タグを有するキメラウサギ/ヒトIgG1として発現され、これによって、国際公開第2014140317号パンフレットに実質的に記載されているように、ソルターゼ酵素媒介抗体結合技術(SMAC−technology(商標))による抗体C末端へのペイロードの部位特異的結合が可能になる。これらの抗hROR2抗体は、国際公開第2016102679号パンフレット(本明細書に参照により組み込まれる)に実質的に開示されているように、抗体薬物複合体(ADC)を作製するために、非常に強力なアントラサイクリンベースのPNU−159682毒素誘導体、Gly5−EDA−PNUに部位特異的に結合された(図13)。これらのADCは、機能的にインビトロで評価され、全て、ヒトROR2を異所性発現するマウス乳癌細胞を効果的に殺傷することが明らかにされた。
ROR2ターゲティングmAbの治療有用性をさらに調べるために、これまでに記載されている方法(Hudecek,M.,Lupo−Stanghellini,M.T.,Kosasih,P.L.,Sommermeyer,D.,Jensen,M.C.,Rader,C.,and Riddell,S.R.(2013)Receptor affinity and extracellular domain modifications affect tumor recognition by ROR1−specific chimeric antigen receptor T cells.Clin.Cancer Res.19,3153−3164)を用いて、XBR2−401をベースとするCAR−T細胞を作製した。手短には、エクスビボで拡大した正常ドナーCD8+CD62L+T細胞に、レンチウイルスにより、scFvフォーマット中にXBR2−401を含有するEF1αプロモータ駆動の発現カセット、続いて短い若しくは長いスペーサ、ヒトCD28の膜貫通ドメイン、4−1BBのシグナル伝達ドメイン、CD3ζのシグナル伝達ドメイン、並びに切断型リガンド結合及びチロシンキナーゼドメインを含むT2A分断膜貫通EGFRフラグメントを形質導入した。EGFR+形質導入T細胞のFACS単離によって、>90%のCAR−T細胞における頑健な抗ROR2認識が明らかにされた。短い及び長いスペーサを有するROR2ターゲティングXBR2−401 CAR−Tの活性を乳癌細胞株T47D(ROR2+ROR1−)及びMDA−MB−231(ROR2−ROR1+)に対して試験した。XBR2−401は、ROR2のKrドメイン内の膜近傍エピトープに結合することから、本発明者らは、XBR2−401 CAR−T細胞が、短いスペーサよりも長いスペーサで、活性であると仮定した。これは、ROR2+ROR1−標的細胞の存在下、増殖、IFN−γ及びIL−2分泌、並びに細胞傷害性に関して確認された(図16)。
これらの試験に従って、本発明は、hROR2を特異的に認識するモノクローナル抗体、並びに関連抗体をベースとする結合タンパク質及びその抗体フラグメント(抗原結合フラグメント)を提供する。本発明は、また、本明細書に記載するhROR2抗体から得られる抗体薬物複合体(ADC)及びキメラ抗原受容体(CAR)も提供する。さらに、ROR2発現の異常若しくは増大に関連する疾患及び状態、例えば、癌の治療及び診断用途において、これらの抗体薬剤及び関連組成物を使用する方法も本発明に提供される。
II.定義
別に定義しない限り、本明細書で使用される全ての技術及び科学用語は、本発明が関連する技術分野の通常の技術者により一般に理解されているものと同じ意味を有する。下記の参照文献は、本発明で使用される用語の多くの一般的な定義を当業者に提供する:Academic Press Dictionary of Science and Technology,Morris(Ed.),Academic Press(1st ed., 1992); Oxford Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology,Smith et al.(Eds.),Oxford University Press(revised ed.,2000);Encyclopaedic Dictionary of Chemistry,Kumar(Ed.),Anmol Publications Pvt.Ltd.(2002);Dictionary of Microbiology and Molecular Biology,Singleton et al.(Eds.),John Wiley & Sons (3rd ed.,2002);Dictionary of Chemistry,Hunt(Ed.),Routledge(1st ed.,1999);Dictionary of Pharmaceutical Medicine,Nahler (Ed.),Springer−Verlag Telos(1994);Dictionary of Organic Chemistry,Kumar and Anandand(Eds.),Anmol Publications Pvt.Ltd.(2002);及びa Dictionary of Biology(Oxford Paperback Reference),Martin and Hine(Eds.),Oxford University Press(4th ed.,2000)。これに加えて、本発明の実施に際して読者を補助するために、以下の定義が提供される。
別に定義しない限り、本明細書で使用される全ての技術及び科学用語は、本発明が関連する技術分野の通常の技術者により一般に理解されているものと同じ意味を有する。下記の参照文献は、本発明で使用される用語の多くの一般的な定義を当業者に提供する:Academic Press Dictionary of Science and Technology,Morris(Ed.),Academic Press(1st ed., 1992); Oxford Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology,Smith et al.(Eds.),Oxford University Press(revised ed.,2000);Encyclopaedic Dictionary of Chemistry,Kumar(Ed.),Anmol Publications Pvt.Ltd.(2002);Dictionary of Microbiology and Molecular Biology,Singleton et al.(Eds.),John Wiley & Sons (3rd ed.,2002);Dictionary of Chemistry,Hunt(Ed.),Routledge(1st ed.,1999);Dictionary of Pharmaceutical Medicine,Nahler (Ed.),Springer−Verlag Telos(1994);Dictionary of Organic Chemistry,Kumar and Anandand(Eds.),Anmol Publications Pvt.Ltd.(2002);及びa Dictionary of Biology(Oxford Paperback Reference),Martin and Hine(Eds.),Oxford University Press(4th ed.,2000)。これに加えて、本発明の実施に際して読者を補助するために、以下の定義が提供される。
用語「抗体」は、同義語として「免疫グロブリン」(Ig)とも呼ばれ、又は「抗原結合フラグメント」は、所与の抗原、エピトープ若しくは複数のエピトープに対する強力な一価、二価若しくは多価結合を示すポリペプチド鎖を指す。別に注記されていない限り、本発明で使用される抗体又は抗原結合フラグメントは、任意の脊椎動物種に由来する配列を有することができる。これらは、例えば、ハイブリドーマ技術、リボソームディスプレイ、ファージディスプレイ、遺伝子シャッフリングライブラリー、半合成若しくは完全な合成ライブラリー又はこれらの組み合わせなどの任意の好適な技術を用いて作製することができる。別に注記されていない限り、本発明で使用される「抗原」という用語は、インタクトな抗体、抗原結合ポリペプチドフラグメント及び以下に記載されるか、又は当技術分野で公知の他のデザイナー抗体(例えば、Serafini,J Nucl.Med.34:533−6,1993を参照)を含む。
インタクトな「抗体」は、典型的に、ジスルフィド結合により互いに結合された少なくとも2つの重(H)鎖(約50〜70kD)と2つの軽(L)鎖(約25kD)とを含む。認識されている抗体鎖コード免疫グロブリン遺伝子としては、κ、λ、α、γ、Δ、ε、及びμ定常領域遺伝子、並びに多種多様な免疫グロブリン可変領域遺伝子がある。軽鎖は、κ又はλのいずれかとして分類される。重鎖は、γ、μ、α、Δ、又はεとして分類され、これらは、それぞれ、免疫グロブリンクラス、IgG、IgM、IgA、IgD及びIgEを定義する。
抗体の各重鎖は、重鎖可変領域(VH)と重鎖定常領域から成る。大部分のIgGアイソタイプ(サブクラス)の重鎖定常領域は、3つのドメイン、CH1、CH2及びCH3から成り、IgM又はIgEなどの一部のIgGアイソタイプは、第4の定常領域ドメイン、CH4を含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域(VL)と軽鎖定常領域から成る。軽鎖定常領域は、1つのドメイン、CLから成る。重鎖及び軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含有する。抗体の定常領域は、免疫グロブリンと、免疫系の様々な細胞及び古典的補体系の第1成分(Clq)などの宿主組織又は因子との結合を媒介し得る。
抗体のVH及びVL領域は、相補性決定領域(CDR)とも呼ばれる超可変性の領域にさらに細分することができ、これらの領域の間には、より保存されたフレームワーク領域(FR)が点在している。各VH及びVLは、3つのCDRと4つのFRとから構成され、次の順:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4で、アミノ末端からカルボキシ末端まで配置されている。CDRとFR領域の配置及び番号付け方法は、例えば、Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,米国保健福祉省(U.S. Department of Health and Human Services)、米国政府印刷局(U.S.Government Printing Office)(1987及び1991)により定義されている。
本明細書で使用される「抗体ベースの結合タンパク質」は、他の非免疫グロブリン、又は非抗体由来成分に関して、少なくとも1つの抗体由来VH、VL、又はCH免疫グロブリンドメインを含有する任意のタンパク質を表し得る。こうした抗体ベースのタンパク質として、限定されないが、(i)免疫グロブリンCHドメインの全部若しくは一部を有する受容体又は受容体成分を含む、結合タンパク質のFc−融合タンパク質、(ii)VH及び/若しくはVLドメインが、別の分子スカフォールドに連結されている結合タンパク質、又は(iii)免疫グロブリンVH、及び/若しくはVL、並びに/又はCHドメインが、天然に存在する抗体若しくは抗体フラグメントに通常見いだされない様式で組み合わされている、及び/又はアセンブルされている分子が挙げられる(抗原結合フラグメント)。
「結合親和性」は、一般に、平衡会合又は解離定数(それぞれ、KA又はKD)に関して表現され、これらは、解離及び会合速度定数(それぞれ、koff及びkon)の反比となる。従って、速度定数の比が同じままである限り、同等の親和性は、異なる速度定数と一致し得る。抗体の結合親和性は、通常、抗体の一価フラグメント(例えば、Fabフラグメント)のKDとして表され、一桁のナノモル範囲以下の(サブナノモル又はピコモル)KD値は、非常に高く、治療及び診断的に重要であるとみなされる。
本明細書で使用される用語「結合特異性」は、抗体と抗原(又はエピトープ若しくはその抗原決定基)、受容体とリガンド、酵素と基質の結合のような、ある分子の別の分子に対する選択的親和性を指す。従って、ある実体の特定の抗原決定基(例えば、ROR1又はROR2の特定のエピトープ)に結合する全てのモノクローナル抗体は、その実体に対する同じ結合特異性を有するとみなされる。
用語「抗体薬物複合体」、又は「ADC」は、治療活性物質又は活性医薬成分(API)を抗体の結合標的にターゲティングして、薬理作用を発揮することができるように、治療活性物質又は活性医薬成分(API)が共有結合されている抗体を指す。治療活性物質又は活性医薬成分は、ADCによりターゲティングされる細胞、好ましくは悪性若しくは癌細胞の殺傷をもたらすことができる細胞毒素であってよい。治療活性物質、活性医薬成分又は細胞毒素の共有結合は、ペイロードをリシン若しくはシステイン残基に結合する標準的化学リンカーを用いて非部位特異的様式で実施してもよいし、あるいは、好ましくは、結合部位、並びに作製しようとするADCの薬物対抗体比(DAR)の十分な制御を可能にする部位特異的様式で実施する。
用語「保存的に修飾された変異体」は、アミノ酸及び核酸配列の両方に適用される。特定の核酸配列に関して、保存的に修飾された変異体は、同一若しくはほぼ同一のアミノ酸配列をコードする核酸、又は、核酸が、アミノ酸配列をコードしない場合には、ほぼ同一の配列を指す。遺伝子コードの縮重のために、多数の機能的に同一の核酸が、いずれか所与のタンパク質をコードする。例えば、コドンGCA、GCC、GCG及びGCUは全て、アミノ酸アラニンをコードする。従って、コドンによりアラニンが指定される全ての位置で、コドンは、コードされたポリペプチドを改変することなく、対応する記載のコドンのいずれかに改変することができる。こうした核酸変異は、保存的修飾変異の1種である「サイレント変異」である。ポリペプチドをコードする本明細書に記載の全ての核酸配列も核酸のあらゆる可能なサイレント変異を表している。当業者は、機能的に同一の分子を取得するために、核酸中の各コドン(通常、メチオニンの唯一のコドンであるAUG、及び通常、トリプトファンの唯一のコドンであるTGGを除く)を修飾することができることは認識されよう。従って、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレント変異は、記載される配列の各々に内在している。
ポリペプチド配列の場合、「保存的修飾変異体」は、保存的アミノ酸置換、すなわち、電荷が類似した側鎖を有する他のアミノ酸残基で置換されたアミノ酸残基を有する変異体を指す。電荷が類似した側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野で定義されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖(例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン)、酸性側鎖(例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸)、非荷電極性側鎖(例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン)、非極性側鎖(例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン)、β分岐側鎖(例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン)及び芳香族側鎖(例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)を有するアミノ酸を含む。
用語「接触(させること)」は、その通常の意味を有し、2つ以上の物質(例えば、ポリペプチド若しくはファージ)を合わせる、物質と細胞を合わせる、又は異なる細胞の2つの集団を合わせることを指す。接触は、例えば、試験管若しくは増殖培地中で、抗体と細胞を混合する、又は抗体の集団を細胞の集団と混合するなど、インビトロで実施することができる。接触はまた、例えば、細胞における2つのポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドの同時発現により、細胞内で、又は細胞溶解物中で、2つのポリペプチドを接触させるなど、細胞内又はインサイチュで実施することもできる。さらに、接触は、例えば、薬剤を標的細胞に送達するために、対象に薬剤を投与することにより、対象においてインビボで実施することもできる。
用語「同一」又は「同一性」パーセントは、2つ以上の核酸又はポリペプチド配列に関して、同じである2つ以上の配列若しくはサブ配列を指す。2つの配列は、2つの配列が、比較窓にわたり、あるいは、下記の配列比較アルゴリズムの1つを用いて、又は手動アラインメント及び視覚検査により測定される指定領域にわたって、最大一致について比較したとき、明示されたパーセンテージの同じ(すなわち、明示された領域にわたって、又は明示されていない場合、配列全体にわたって、60%同一、任意選択で65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、若しくは99%同一の)アミノ酸残基若しくはヌクレオチドを有していれば、「実質的に同一である」。任意選択で、同一性は、長さが少なくとも約50ヌクレオチド(若しくは10アミノ酸)の領域にわたって、又は好ましくは長さが100〜500又は1000ヌクレオチド以上(若しくは20、50、200以上のアミノ酸)の領域にわたって存在する。
比較のための配列のアラインメント方法は、当技術分野で公知である。比較のための配列の最適なアラインメントは、例えば、スミス−ウォーターマンの局所相同性アルゴリズム(Smith and Waterman,Adv.Appl.Math.2:482c,1970)により;ニードルマン−ウンシュの相同性アライメントアルゴリズム(Needleman and Wunsch,J.Mol.Biol.48:443,1970)により;ピアーソン−リップマンの類似性検索方法(Pearson and Lipman,Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA85:2444,1988)により;これらのアルゴリズムのコンピュータ化実装(GAP,BESTFIT,FASTA,and TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package,Genetics Computer Group,Madison,WI)により;又は手動アラインメント及び視覚検査(例えば、Brent et al.,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,Inc.(ringbou ed., 2003)を参照)によって実施することができる。配列同一性及び配列類似性の割合を決定するのに好適なアルゴリズムの2つの例は、BLAST及びBLAST 2.0アルゴリズムであり、これらは、Altschul et al.,Nuc.Acids Res.25:3389−3402,1977;及びAltschul et al.,J Mol.Biol.215:403−410,1990にそれぞれ記載されている。
用語「対象」は、ヒト及び非ヒト動物(特に、非ヒト哺乳動物)を指す。用語「対象」は、本明細書において、例えば、治療及び診断方法に関して、ヒト又は動物である対象を指す。動物である対象として、限定されないが、神経芽細胞腫、骨肉腫、腎細胞癌、乳癌、胃癌、前立腺癌、黒色腫、扁平上皮癌、多発性骨髄腫及びその他の癌などのROR2発現増大に関連する状態又は障害の哺乳動物モデルなどの動物モデルが挙げられる。非ヒト対象の他の具体的な例として、例えば、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ネコ、イヌ、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、サルが挙げられる。
人工T細胞受容体(キメラT細胞受容体、キメラ免疫受容体、キメラ抗原受容体(CAR)若しくはTボディとしても知られる)は、免疫エフェクター細胞に任意の特異性をグラフトする、改変受容体である。典型的には、これらの受容体を用いて、モノクローナル抗体の特異性をT細胞にグラフトし;それらのコード配列の転移が、レトロウイルス若しくはレンチウイルスベクター又はトランスポゾンによって促進される。CAR操作T細胞(また、CAR−T細胞と略される)は、その細胞外認識単位が、抗体由来の認識ドメインから成り、その細胞内領域が、1つ又は複数のリンパ球刺激部分に由来するキメラ受容体を備える、遺伝子改変T細胞である。プロトタイプCARの構造は、モジュラー型であり、様々な機能性ドメインを収容し、これによって、T細胞の特異性の選択及び制御された活性化を可能にするように設計されている。好ましい抗体由来の認識単位は、モノクローナル抗体の重鎖及び軽鎖可変領域の特異性及び結合残基を兼ね備える単鎖可変フラグメント(scFv)である。最も一般的なリンパ球活性化部分は、T細胞トリガー(例えば、CD3ζ)部分とタンデムのT細胞共刺激(例えば、CD28)ドメインを含む。エフェクターリンパ球(例えば、T細胞及びナチュラルキラー細胞)にこうしたキメラ受容体を付与することによって、改変細胞は、非HLA限定様式で、予定された特異性により、任意の所望される標的抗原に向け直される。レトロウイルス若しくはレンチウイルスベクター又はトランスポゾンを用いて、所与の患者の末梢リンパ球からのT細胞に、CAR構築物をエクスビボで導入する。得られたCAR改変T細胞を注入により患者に戻した後、それらは、移動し、その標的部位に到達し、その標的細胞若しくは組織と相互作用した後、活性化を受けて、予定のエフェクター機能を実施する。CARアプローチの治療標的としては、癌及びHIV感染細胞、又は自己免疫エフェクター細胞が挙げられる。
本明細書で使用される用語「治療する」、「治療する(こと)」、「治療」、及び「治療に有効な」は、必ずしも100%又は完全な治療を意味しない。そうではなく、当業者により、潜在的な利益又は治療効果を有するものとして認識される様々な程度の治療がある。これに関して、本発明の方法は、任意の量の任意のレベルの治療を提供し得る。さらには、本発明の方法により提供される治療は、治療対象の疾患の1つ又は複数の状態若しくは症状の治療を含むことができる。
「ベクター」は、プラスミド、ファージ若しくはコスミドなどのレプリコンであり、それに、別のポリヌクレオチドセグメントが結合して、結合したセグメントの複製をもたらし得る。1つ又は複数のポリペプチドをコードする遺伝子の発現を指令することができるベクターは、「発現ベクター」と呼ばれる。
III.ROR2及び関連誘導体化合物に特異的に結合する、抗体、抗体ベースの結合タンパク質、その抗体フラグメント、抗体薬物複合体(ADC)、又はCAR
一態様では、本発明は、本明細書に例示する抗ROR2抗体と同じ結合特異性で、ヒトROR2に特異的に結合する、新規の抗体、抗体ベースの結合タンパク質、その抗体フラグメント(「抗原結合フラグメント」とも呼ばれる)、ADC又はCARに提供する(図1)。本発明の抗体は、同種抗原であるROR2に結合する能力を保持するインタクトな抗体の抗原結合部分を含有する、インタクトな抗体(例えば、本明細書に例示するIgG1抗体)、抗体フラグメント(例えば、本明細書に例示するFab抗体)、抗体ベースの結合タンパク質、その抗体フラグメント、ADC又はCARを含む。こうした抗体フラグメントの例としては、以下のものが挙げられる:(i)Fabフラグメント、VL、VH、CL及びCH1ドメインから構成される一価フラグメント;(ii)F(ab’)2フラグメント、ヒンジ領域でのジスルフィド架橋により連結された2つのFabフラグメントを含む二価フラグメント;(iii)VH及びCH1ドメインから構成されるFdフラグメント;(iv)インタクトな抗体の単一アームのVL及びVHドメインから構成されるFvフラグメント;(v)構造的に保存されたフレームワーク領域の間で操作された鎖間ジスルフィド結合を有するジスルフィド安定化Fvs(dsFvs);(vi)VH又はVLドメインから構成される単一ドメイン抗体(dAb)(例えば、Ward et al. Nature 341:544−546,1989を参照);並びに(vii)直鎖ペプチド又は環状ペプチドなどの単離された相補性決定領域(CDR)。抗体ベースの結合タンパク質の例は、抗体の結合ドメインが、他のポリペプチド若しくはポリペプチドドメイン、例えば、別の分子スカフォールド、Fc−領域、他のポリペプチド若しくは抗体の他の機能若しくは結合ドメインと組み合わされて、追加結合特性を有する分子、例えば、二重若しくは多重特異性タンパク質又は抗体をもたらすポリペプチドである。こうしたポリペプチドは、天然に存在する抗体若しくは抗体フラグメントには通常見いだされない結合又は機能ドメインの配列を形成することができる。
一態様では、本発明は、本明細書に例示する抗ROR2抗体と同じ結合特異性で、ヒトROR2に特異的に結合する、新規の抗体、抗体ベースの結合タンパク質、その抗体フラグメント(「抗原結合フラグメント」とも呼ばれる)、ADC又はCARに提供する(図1)。本発明の抗体は、同種抗原であるROR2に結合する能力を保持するインタクトな抗体の抗原結合部分を含有する、インタクトな抗体(例えば、本明細書に例示するIgG1抗体)、抗体フラグメント(例えば、本明細書に例示するFab抗体)、抗体ベースの結合タンパク質、その抗体フラグメント、ADC又はCARを含む。こうした抗体フラグメントの例としては、以下のものが挙げられる:(i)Fabフラグメント、VL、VH、CL及びCH1ドメインから構成される一価フラグメント;(ii)F(ab’)2フラグメント、ヒンジ領域でのジスルフィド架橋により連結された2つのFabフラグメントを含む二価フラグメント;(iii)VH及びCH1ドメインから構成されるFdフラグメント;(iv)インタクトな抗体の単一アームのVL及びVHドメインから構成されるFvフラグメント;(v)構造的に保存されたフレームワーク領域の間で操作された鎖間ジスルフィド結合を有するジスルフィド安定化Fvs(dsFvs);(vi)VH又はVLドメインから構成される単一ドメイン抗体(dAb)(例えば、Ward et al. Nature 341:544−546,1989を参照);並びに(vii)直鎖ペプチド又は環状ペプチドなどの単離された相補性決定領域(CDR)。抗体ベースの結合タンパク質の例は、抗体の結合ドメインが、他のポリペプチド若しくはポリペプチドドメイン、例えば、別の分子スカフォールド、Fc−領域、他のポリペプチド若しくは抗体の他の機能若しくは結合ドメインと組み合わされて、追加結合特性を有する分子、例えば、二重若しくは多重特異性タンパク質又は抗体をもたらすポリペプチドである。こうしたポリペプチドは、天然に存在する抗体若しくは抗体フラグメントには通常見いだされない結合又は機能ドメインの配列を形成することができる。
本発明の抗体は、単鎖抗体のような抗体フラグメントも包含する。用語「単鎖抗体」は、ポリペプチド結合中に、一般にスペーサペプチドを介して連結された、VH及びVLドメインを含むポリペプチドを指し、これは、アミノ末端及び/又はカルボキシル末端に追加ドメイン若しくはアミノ酸配列を含んでもよい。例えば、単鎖抗体は、コードポリヌクレオチドへの連結のためのテザーセグメントを含んでもよい。一例として、単鎖可変領域フラグメント(scFv)は、単鎖抗体である。個別の遺伝子によりコードされるFvフラグメントのVL及びVHドメインと比較して、scFvは、合成リンカーを介して(例えば、組換え方法により)連結された2つのドメインを有する。これにより、VL及びVH領域が対合して、一価分子を形成する単一タンパク質鎖としてこれらを作製することが可能になる。
本発明の抗体はまた、ラクダ科(camelid)スカフォールドを有する、単一ドメイン抗原結合単位も包含する。ラクダ科の動物には、ラクダ、ラマ、及びアルパカが含まれる。ラクダ科は、軽鎖が欠失した機能抗体を産生する。重鎖可変(VH)ドメインは、自律的にフォールドし、抗原結合単位として独立に機能する。その結合表面は、古典的抗原結合分子(Fab)又は単鎖可変フラグメント(scFv)の6つのCDRと比較して、3つのCDRしか含まない。ラクダ科抗体は、一般的抗体の結合親和性と同等の結合親和性を獲得することができる。
本明細書に記載される様々な抗体、抗体ベースの結合タンパク質、及びその抗体フラグメントは、インタクトな抗体の酵素若しくは化学的修飾により生成するか、又は組換えDNA方法を用いて新たに合成することもでき、あるいは、ファージディスプレイライブラリーを用いて同定することもできる。これらの抗体、抗体ベースの結合タンパク質、及びその抗体フラグメントを作製する方法は全て、当技術分野で公知である。例えば、単鎖抗体は、ファージディスプレイライブラリー又はリボソームディスプレイライブラリー、遺伝子シャッフルライブラリー(例えば、McCafferty et al.,Nature 348:552−554,1990;及び米国特許第4,946,778号明細書)を用いて同定することができる。特に、scFv抗体は、例えば、以下:Bird et al.,Science 242:423−426,1988;及びHuston et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879−5883,1988に記載される方法を用いて取得することができる。Fv抗体フラグメントは、Skerra and Plueckthun,Science 240:1038−41,1988に記載されているように作製することができる。ジスルフィド安定化Fvフラグメント(dsFv)は、Reiter et al.,Int.J.Cancer 67:113−23,1996に記載されている方法を用いて作製することができる。同様に、単一ドメイン抗体(dAb)は、例えば、Ward et al.,Nature 341:544−546,1989;及びCai and Garen,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:6280−85,1996に記載されている多様な方法を用いて生成することができる。ラクダ科単一ドメイン抗体は、当技術分野で公知の方法、例えば、Dumoulin et al.,Nat.Struct.Biol.11:500−515,2002;Ghahroudi et al.,FEBS Letters 414:521−526,1997;及びBond et al.,J.Mol.Biol.332:643−55,2003に記載の方法を用いて生成することができる。他のタイプの抗原結合フラグメント(例えば、Fab、F(ab’)2又はFdフラグメント)も、日常的に実施されている免疫学方法を用いて容易に生成することができる。例えば、Harlow & Lane,Using Antibodies,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York,1998を参照されたい。
一部の実施形態では、本発明の抗体、抗体フラグメント、抗体ベースの結合タンパク質、ADC又はCARは、図1に示される抗体と実質的に同一である、それらの重鎖CDR1、CDR2及びCDR3配列と、それらの軽鎖CDR1、CDR2及びCDR3配列とを有する。例示した抗体の軽鎖及び重鎖CDR配列を全て図面に表示する。これらの実施形態の一部では、抗体、抗体フラグメント、抗体ベースの結合タンパク質、ADC又はCARは、以下を有する:(1)配列番号25〜27とそれぞれ実質的に同一の重鎖CDR1〜3配列;及び配列番号61〜63とそれぞれ実質的に同一の軽鎖CDR1〜3配列;(2)配列番号28〜30とそれぞれ実質的に同一の重鎖CDR1〜3配列;及び配列番号64〜66とそれぞれ実質的に同一の軽鎖CDR1〜3配列;(3)配列番号31〜33とそれぞれ実質的に同一の重鎖CDR1〜3配列;及び配列番号67〜69とそれぞれ実質的に同一の軽鎖CDR1〜3配列;(4)配列番号34〜36とそれぞれ実質的に同一の重鎖CDR1〜3配列;及び配列番号70〜72とそれぞれ実質的に同一の軽鎖CDR1〜3配列;(5)配列番号37〜39とそれぞれ実質的に同一の重鎖CDR1〜3配列;及び配列番号73〜75とそれぞれ実質的に同一の軽鎖CDR1〜3配列;(6)配列番号40〜42とそれぞれ実質的に同一の重鎖CDR1〜3配列;及び配列番号76〜78とそれぞれ実質的に同一の軽鎖CDR1〜3配列;(7)配列番号43〜45とそれぞれ実質的に同一の重鎖CDR1〜3配列;及び配列番号79〜81とそれぞれ実質的に同一の軽鎖CDR1〜3配列;(8)配列番号46〜48とそれぞれ実質的に同一の重鎖CDR1〜3配列;及び配列番号82〜84とそれぞれ実質的に同一の軽鎖CDR1〜3配列;(9)配列番号49〜51とそれぞれ実質的に同一の重鎖CDR1〜3配列;及び配列番号85〜87とそれぞれ実質的に同一の軽鎖CDR1〜3配列;(10)配列番号52〜54とそれぞれ実質的に同一の重鎖CDR1〜3配列;及び配列番号88〜90とそれぞれ実質的に同一の軽鎖CDR1〜3配列;(11)配列番号55〜57とそれぞれ実質的に同一の重鎖CDR1〜3配列;及び配列番号91〜93とそれぞれ実質的に同一の軽鎖CDR1〜3配列;又は(12)配列番号58〜60とそれぞれ実質的に同一の重鎖CDR1〜3配列;及び配列番号94〜96とそれぞれ実質的に同一の軽鎖CDR1〜3配列。
一部の実施形態では、本発明の抗体、抗体フラグメント、抗体ベースの結合タンパク質、ADC又はCARは、以下に示される配列とそれぞれ同一である重鎖CDR1〜CDR3配列と軽鎖CDR1〜CDR配列を含む:(1)配列番号25〜27と配列番号61〜63(抗体XBR2−401)、(2)配列番号28〜30と配列番号64〜66(抗体XBR2−416)、(3)配列番号31〜33と配列番号67〜69(抗体XBR2−433)、(4)配列番号34〜36と配列番号70〜72(抗体XBR2−327)、(5)配列番号37〜39と配列番号73〜75(抗体XBR2−TOP9)、(6)配列番号40〜42と配列番号76〜78(抗体XBR2−TOP72)、(7)配列番号43〜45と配列番号79〜81(抗体ERR2−302)、(8)配列番号46〜48と配列番号82〜84(抗体ERR2−308)、(9)配列番号49〜51と配列番号85〜87(抗体ERR2−316)、(10)配列番号52〜54と配列番号88〜90(抗体ERR2−317)、(11)配列番号55〜57と配列番号91〜93(抗体ERR2−TOP2)、又は(12)配列番号58〜60と配列番号94〜96(抗体ERR2−TOP35)。
他の実施形態では、ヒトROR2と特異的に結合する本発明の抗体、抗体フラグメント、抗体ベースの結合タンパク質、ADC又はCARは、以下を含む:(a)配列番号13〜24のいずれか1つと実質的に同一の配列を有する軽鎖可変ドメイン、(b)配列番号1〜12のいずれか1つと実質的に同一の配列を有する重鎖可変ドメイン、又は(c)(a)の軽鎖と(b)の重鎖の両方。一部の実施形態では、本発明の抗体、抗体フラグメント、抗体ベースの結合タンパク質、ADC又はCARは、(a)の軽鎖と(b)の重鎖の両方を含む。一部の実施形態では、本発明の抗体、抗体フラグメント、抗体ベースの結合タンパク質、ADC又はCARは、以下を含む:(a)配列番号13〜24のいずれか1つに対して少なくとも90%の同一性を有する軽鎖可変ドメイン、(b)配列番号1〜12のいずれか1つに対して少なくとも90%の同一性を有する重鎖可変ドメイン、又は(c)(a)の軽鎖と(b)の重鎖の両方。一部の実施形態では、同一性の割合は、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、又は少なくとも99%、あるいは100%であってよい。一部の実施形態では、軽鎖可変ドメインは、配列番号13〜24のいずれか1つに対して少なくとも95%の同一性を有する。一部の実施形態では、軽鎖可変ドメインは、配列番号13〜24のいずれか1つに対して100%の同一性を有する。一部の実施形態では、本発明の抗体、抗体フラグメント、抗体ベースの結合タンパク質、ADC又はCARは、配列番号1〜12のいずれか1つに対して少なくとも90%の同一性を有する重鎖可変ドメインを含む。他の実施形態では、同一性の割合は、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、又は少なくとも99%、あるいは100%であってよい。一部の実施形態では、重鎖可変ドメインは、配列番号1〜12のいずれか1つに対して少なくとも95%の同一性を有する。一部の実施形態では、重鎖可変ドメインは、配列番号1〜12のいずれか1つに対して100%の同一性を有する。
一部の実施形態では、本発明の抗体、抗体フラグメント、抗体ベースの結合タンパク質、ADC又はCARは、本明細書に例示するものなどのいずれか好適な軽鎖と組み合わせて、本明細書に記載するいずれかの重鎖(例えば、図1に示す重鎖)を含み得る。同様に、抗体は、本明細書に例示するものなどのいずれか好適な重鎖と組み合わせて、前述した軽鎖(例えば、図1に示す軽鎖)のいずれかを含み得る。例えば、好ましい実施形態では、本発明の抗体、抗体フラグメント、抗体ベースの結合タンパク質、ADC又はCARは、配列番号13に対して少なくとも90%の同一性を有する軽鎖と、配列番号1に対して少なくとも90%の同一性を有する重鎖、又は配列番号14に対して少なくとも90%の同一性を有する軽鎖と、配列番号2に対して少なくとも90%の同一性を有する重鎖、又は配列番号15に対して少なくとも90%の同一性を有する軽鎖と、配列番号3に対して少なくとも90%の同一性を有する重鎖を含む。一部の実施形態では、本発明の抗体、抗体フラグメント、抗体ベースの結合タンパク質、ADC又はCARは、以下にそれぞれ示す軽鎖配列と重鎖配列を含み得る:(1)配列番号13と配列番号1、(2)配列番号14と配列番号2、又は(3)配列番号15と配列番号3。様々な実施形態において、ペプチド配列の同一性(%)は、例えば、100×[(同一の位置)/min(TGA,TGB)](式中、TGA及びTGBは、TGA及びTGBを最小にするアラインメント中のペプチド配列A及びBにおける残基の数と、内部ギャップ位置の数の総和である)として算出できる。例えば、Russell et al,J.Mol.Biol.,244:332−350(1994)を参照されたい。
本発明の抗体、抗体フラグメント、抗体ベースの結合タンパク質、ADC又はCARは、ヒトROR2の細胞外ドメインを特異的に認識するか、若しくはこれと特異的に結合する完全長抗体又は抗体フラグメントをはじめとする、いずれの抗体であってもよい。例えば、抗体、抗体フラグメント又は抗体ベースの結合タンパク質は、ポリクローナル、モノクローナル、組換え、キメラ、又はヒト化抗体であってよい。さらに、抗体は、限定されないが、IgA、IgD、IgE、IgG、又はIgMなどのいずれのアイソタイプのものであってもよい。このように、例えば、抗体は、IgA1若しくはIgA2などのいずれのIgA、又はIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、若しくは合成IgGなどのいずれのIgAであってもよい。抗体は、ヒトROR2の細胞外ドメインに対する特異性を有するいずれかの抗体フラグメント又は抗体ベースの結合タンパク質、例えば、F(ab)2、Fv、scFv、IgGACH2、F(ab’)2、scFv2CH3、Fab、VL、VH、scFv4、scFv3、scFv2、dsFv、Fv、scFv−Fc、(scFv)2、ダイアボディ、または二価抗体であってもよい。抗体は、限定されないが、非枯渇IgG抗体、CAR、又は抗体の他のFc若しくはFab変異体であってもよい。
前述した重鎖に加えて、本発明の抗体、抗体ベースの結合タンパク質又はその抗体フラグメントは、連続的なナイーブ鎖シャッフリングを用いて、Fabライブラリーから選択した軽鎖をさらに含み得る。同様に、前述した軽鎖に加えて、本発明の抗体は、連続的なナイーブ鎖シャッフリングを用いて、Fabライブラリーから選択した重鎖をさらに含み得る。
一部の実施形態では、本発明は、本明細書に例示する抗ROR2抗体の保存的修飾変異体である、抗体、抗体ベースの結合タンパク質又はその抗体フラグメントを提供する。典型的に、これらの変異体の可変領域は、1又は複数のアミノ酸残基における保存的置換を除いて、これらの例示した配列の1つと同一のアミノ酸配列を有する。一部の実施形態では、本発明の抗体、抗体フラグメント、抗体ベースの結合タンパク質、ADC又はCARは、ヒトROR2に特異的に結合し、且つ、配列番号25〜96からなる群から選択される1配列を有する少なくとも1つのCDRを含む。本発明はまた、前述のCDR配列又は実質的に同一のCDR配列の1つ又は複数の変異体を含む、ROR2に対する特異性を有する単離された抗体、抗体フラグメント、抗体ベースの結合タンパク質、ADC又はCARも提供する。これらの抗体における変異型CDR配列は、配列番号25〜96からなる群から選択される1配列に1、2、若しくは3つの置換、挿入、欠失、又はそれらの組合せを含み得る。例えば、組換えキメラ若しくはヒト化抗体(又はそのフラグメント)は、前述したCDR配列の1、2、3、4、5、若しくは6つを含み得る。しかしながら、一部の実施形態では、組換えキメラ若しくはヒト化抗体(又はそのフラグメント)は、例えば、配列番号61〜63、配列番号64〜66、若しくは配列番号67〜69に示される軽鎖CDR;及び配列番号25〜27、配列番28〜30、若しくは配列番号31〜33に示される重鎖CDRなど、同じ軽鎖又は重鎖の3つCDR配列を含む。一部の実施形態では、組換えキメラ若しくはヒト化抗体(又はそのフラグメント)は、例えば、(a)配列番号61〜63と配列番号25〜27;(b)配列番号64〜66と配列番号28〜30;又は(c)配列番号67〜69と配列番号31〜33など、同じ抗体の6つのCDR配列を含む。
一部の実施形態では、本発明は、約10μM以下、5μM以下、2μM以下、1μM以下、500nM以下、400nM以下、300nM以下、又は200nM以下のROR2に対する結合活性を有する抗体、抗体ベースの結合タンパク質又はその抗体フラグメントを提供する。一部の実施形態では、抗体、抗体ベースの結合タンパク質又はその抗体フラグメントは、約100nM以下、約75nM以下、約50nM以下、約25nM以下、約10nM以下、又は約5nM以下の結合活性で、ROR2に結合する。一部の実施形態では、抗体、抗体ベースの結合タンパク質又はその抗体フラグメントは、約1nM以下、約800pM以下、約700pM以下、約600pM以下、約500pM以下、約400pM以下、約300pM以下、約200pM以下、又は約100pM以下の結合活性で、ROR2に結合する。結合活性は、ELISA、バイオレイヤー干渉法、又は表面プラズモン共鳴などの当技術分野で公知の技術を用いて測定することができる。
本発明の抗体、抗体ベースの結合タンパク質又はその抗体フラグメントは、いずれか好適な技術により、例えば、いずれか好適な真核又は非真核生物発現系を用いて、生成することができる。特定の実施形態では、哺乳動物発現系を用いて、抗体、抗体ベースの結合タンパク質又はその抗体フラグメントを生成する。本発明の抗体又は抗原結合フラグメントを生成するいくつかの具体的な技術を本明細書に例示する。一部の実施形態では、本発明の抗体又は抗原結合フラグメントは、細菌発現系などの好適な非真核生物発現系を用いて生成することができる。細菌発現系を用いて、F(ab)2、Fv、scFv、IgGACH2、F(ab’)2、scFv2CH3、Fab、VL、VH、scFv4、scFv3、scFv2、dsFv、Fv、scFv−Fc、(scFv)2、及びダイアボディなどのフラグメントを生成することができる。こうしたフラグメントを生成するためにDNAコード配列を改変する技術は、当技術分野において公知である。
本発明の抗体、抗体ベースの結合タンパク質又はその抗体フラグメントは、いずれか好適なタイプの結合を用いて、合成分子に結合させることができる。組換え操作及び組み込みセレノシステイン(例えば、2014年12月23日に発行された米国特許第8,916,159号明細書に記載されているような)を用いて、合成分子に結合させることができる。他の結合方法は、ネイティブ若しくは操作リシン側鎖アミン又はシステイン側鎖チオールとの共有結合を含み得る。例えば、Wu et al.,Nat.Biotechnol,23:1 137−1 146(2005)を参照されたい。
好ましい実施形態では、合成分子と結合した本発明の抗体、抗体ベースの結合タンパク質又はその抗体フラグメント(毒素である合成分子との抗体薬物複合体の場合、「ADC」と呼ばれる)は、部位特異的ソルターゼ酵素媒介抗体結合を用いて取得される。国際公開第2014140317号パンフレットに開示されているように、ソルターゼ(ソルターゼトランスペプチダーゼとも呼ばれる)は、特定のペプチドモチーフ(「ソルターゼ認識タグ」又は「ソルターゼタグ」と呼ばれる)を認識して、切断することにより、表面タンパク質を修飾する一群の原核生物酵素を形成する。通常、所与のソルターゼ酵素は、1つ又は複数のソルターゼ認識タグを認識する。ソルターゼ酵素は、天然に存在するものであってもよいし、又は遺伝子操作に付したものであってもよい(Dorr et al.,PNAS 2014;111,13343−8)。
好ましい実施形態では、複合体は、以下:(a)1つ又は複数のソルターゼ認識タグを担持する本明細書に記載の抗体、抗体ベースの結合タンパク質又はその抗体フラグメントと、(b)グリシン若しくはオリゴグリシンタグ、Gly(n)を担持する1つ又は複数の合成分子の部位特異的ソルターゼ酵素媒介結合によって得られる。好ましくは、ソルターゼ認識タグを抗体の少なくとも1つのサブドメインのC末端に融合又は結合させる。前記ソルターゼ認識タグは、以下:LPXSG(配列番号137)、LPXAG(配列番号138)、LPXTG(配列番号139)、LAXTG(配列番号140)、及びNPQTG(配列番号141)からなる群から選択するのが好ましく、ここで、Xは、任意のアミノ酸残基である。好ましくは、オリゴグリシンタグ、Gly(n)は、長さ1〜21グリシン残基を有し、長さ3〜5アミノ酸を有するのが好ましい(すなわち、Gly(3)、Gly(4)、又はGly(5))。
合成分子は、腫瘍をターゲティングするものなどの任意の分子であってよい。一部の実施形態では、抗体と結合させる合成分子は、タンパク質(例えば、抗体)又はRNA若しくはDNAアプタマーである。一実施形態では、合成分子と結合した本発明の抗体、抗体ベースの結合タンパク質又はその抗体フラグメントは、一般式A−(L−P)nを有し、式中、Aは、本明細書に記載の抗体、抗体ベースの結合タンパク質又はその抗体フラグメントであり、Lは、1つ又は複数のリンカーであり、Pは、標識及び細胞傷害性若しくは細胞静止剤からなる群から選択される1つ又は複数のペイロードであり、ここで、nは、≧1〜≦10の範囲の整数である。この実施形態では、リンカーは、好ましくは、以下:オリゴペプチドリンカー(開裂可能及び開裂不可能なオリゴペプチドリンカーを含む)、ヒドラジンリンカー、チオ尿素、自壊的(self−immolative)リンカー、スクシンイミジルトランス−4−(マレイミジルメチル)シクロヘキサン−1−カルボキシレート(SMCC)リンカー、マレイミドリンカー、ジスルフィドリンカー、チオエーテルリンカー、及び/又はマレイミドリンカーからなる群から選択される少なくとも1つを含むか、又はそれから構成される。
当業者は、別のリンカーも好適となり得ることを理解されよう。こうしたリンカーは、開裂不可能であってもよいし、又はpH、酸化還元電位若しくは特定の細胞内酵素により開裂可能であってもよい。開裂可能なオリゴペプチドリンカーとしては、プロテアーゼ−又はマトリックスメタロプロテアーゼ−開裂可能リンカーがある。リンカーが、上記の組み合わせを含んでもよいことは理解されよう。例えば、リンカーは、バリン−シトルリンPABリンカーであってもよい。好ましい実施形態では、リンカーは、ペンタペプチドモチーフ:LPXSG(配列番号137)、LPXAG(配列番号138)、LPXTG(配列番号139)、LAXTG(配列番号140)、及びNPQTG(配列番号141)を含む配列を有するオリゴペプチド(Xは、任意のアミノ酸である)、続いてオリゴ−グリシン区間、Gly(n)(nは、≧1〜≦21の整数である)を含む。好ましい実施形態では、リンカーは、抗体、抗体ベースの結合タンパク質又はその抗体フラグメントの少なくとも1つのサブドメインのC末端に結合される。
様々な実施形態では、抗体と結合させる好適な合成分子(「ペイロード」)としては、例えば、細胞傷害性薬剤、細胞静止剤、又は血管新生阻害剤、放射性同位体、及びリポソームが挙げられる。細胞傷害性薬剤は、植物、真菌、又は細菌分子であってよい。一部の実施形態では、本発明の抗体と結合させる細胞傷害性薬剤は、低分子量毒素(MW<2’000ダルトン、好ましくは、MW<1’000ダルトン)、ペプチド毒素、又はタンパク質毒素である。これらの毒素の多くの具体的な例が当技術分野で公知である。例えば、Dyba et al.,Curr.Pharm.Des.10:2311−34,2004;Kuyucak et al.,Future Med.Chem.6:1645−58,2014;Beraud et al.,Inflamm.Allergy Drug Targets.10:322−42,2011;及びMiddlebrook et al.,Microbiol.Rev.48:199−221,1984を参照されたい。一部の実施形態では、治療薬を抗体と結合させる。例えば、治療薬は、メイタンシノイド(例えば、メイタンシノール若しくはDM1メイタンシノイド)、タキサン、カリケアミシン、セマドチン、モノメチルラウリスタチン(例えば、モノメチルラウリスタチンE若しくはモノメチルラウリスタチンF)、ピロロベンゾジアゼピン(PBD)又は、好ましくは、アントラサイクリン、より好ましくは極めて強力なアントラサイクリンPNU−159682の誘導体であってよい。極めて強力なアントラサイクリンPNU−159682の特に好ましい誘導体は、国際公開第2016102679号パンフレット(参照により本明細書に組み込まれる)に開示されている。治療薬はまた、ビンクリスチン及びプレドニゾンを含んでもよい。様々な実施形態では、本発明で使用することができる治療薬は、抗代謝物質(例えば、メトトレキサートなどの抗葉酸剤、5−フルオロウラシルなどのフルオロピリミジン、システインアラビノシド、又はプリン若しくはアデノシンのアナログ);挿入剤(例えば、ドキソルビシン、ネモルビシン、又は好ましくはPNU−159682の誘導体などのアントラサイクリン)、ダウノマイシン、エピラビシン、イダルビシン、ミトマイシン−C、ダクチノマイシン、若しくはミトラマイシン、又はピロロベンゾジアゼピンなどの他の挿入剤;カリケアミシン、チアンシマイシン、及びその他のエンジインなどのDNA反応剤;白金誘導体(例えば、シスプラチン若しくはカルボプラチン);アルキル化剤(例えば、ナイトロジェンマスタード、メルファラン、クロラムブシル、ブスルファン、シクロホスファミド、イホスファミドニトロウレア若しくはチオテパ);α−アマニチンなどのRNAポリメラーゼ阻害剤;有糸***阻害剤(例えば、ビンクリスチンなどのビンカアルカロイド、又はパクリタキセル若しくはドセタキセルなどのタキソイド);トポイソメラーゼ阻害剤(例えば、エトポシド、テニポシド、アムサクリン、トポテカン);細胞周期阻害剤(例えば、フラボピリドール);又は微小管剤(例えば、エポチロン、チューブリシン、プレ−チューブリシン、ジスコデルモリドアナログ、若しくはエリュテロビンアナログ)であってよい。治療薬は、ボルテゾミブ、アムサクリン、エトポシド、リン酸エトポシド、テニポシド、若しくはドキソルビシンなどのプロテアソーム阻害剤又はトポイソメラーゼ阻害剤であってよい。治療用放射性同位体としては、ヨウ素(131I)、イットリウム(90Y)、ルテチウム(177Lu)、アクチニウム(225Ac)、プラセオジム、アスタチン(At)、レニウム(Re),ビスマス(Bi若しくはBi)、及びロジウム(Rh)が挙げられる。血管新生阻害剤としては、リモミド、ベバクジマブ、アンギオスタチン、及びラゾキサンが挙げられる。
好ましい実施形態では、合成毒素分子は、Quintieri et al.(2005)に記載されているようなPNU−159682及びその誘導体(以下の式(i)を参照)、メイタンシン、モノメチルアウリスタチンMMAE、及びモノメチルアウリスタチンMMAFから選択される。好ましい実施形態では、リンカーと、その波線(wavy line)で連結する毒素は、国際公開第2016102679号パンフレット(参照により本明細書に組み込まれる)に記載されているような式(i)のものである:
合成分子が、式(i)のものである実施形態では、アミノ結合を形成するために、リンカーは、1つのアミノ基が、式(i)の波線に直接連結されるように、形態NH2−(CH2)m−NH2(m≧1且つ≦11、好ましくはm=2)のアルキルジアミノ基を含むのが好ましい。第2のアミノ基がオリゴペプチドリンカーに連結しているのがさらに好ましい。第2アミノ基は、オリゴペプチドリンカーと連結されるのがさらに好ましく、このリンカーは、より好ましくは、オリゴグリシンGly(n)であり、ここで、nは、≧1且つ≦21である。最も好ましいペイロードを図13(B)に示す。
一部の実施形態では、合成分子は、任意の抗体、抗体ベースの結合タンパク質、又は抗体フラグメントに結合させることができる。一部の実施形態では、合成分子は、標識である。標識は、診断用途で有用となり得、例えば、造影剤を含み得る。造影剤は、ヨウ素(131I若しくは125I)、インジウム(111In)、テクネチウム(99Tc)、リン(32P)、炭素(14C)、トリチウム(3H)などの放射性同位体標識、その他の放射性同位体標識(例えば、放射性イオン)、又は上に挙げた治療用放射性同位体の1つなどの治療用放射性同位体標識であってよい。加えて、造影剤は、X線不透過物質、磁気共鳴イメージング(MRI)剤、超音波イメージング剤、及び動物の身体をイメージングする装置による検出に好適ないずれか他の造影剤を含み得る。さらに、合成分子は、蛍光標識、生物活性酵素標識、発光性標識、又は発色団標識であってもよい。
一部の実施形態では、合成分子は、Bendas,BioDrugs,15:215−224,2001に記載されているように、リポソームであってよい。こうした実施形態では、抗体は、コロイド粒子、例えば、リポソームに結合させて、疾患細胞への薬剤の制御送達に用いることができる。リポソーム、例えば、免疫リポソームと結合した抗体を作製する場合、化学療法薬などの薬剤又はその他の薬物を、標的細胞への送達のためにリポソームに封入することができる。一部の実施形態では、本発明の抗体、抗体ベースの結合タンパク質又はその抗体フラグメントは、ROR2以外に、1つ又は複数の抗原に対する特異性を有してもよい。例えば、本発明の抗体は、ROR2と別の腫瘍抗原、例えば、神経芽細胞腫、腎細胞癌、乳癌、胃癌、前立腺癌、結腸癌(例えば、結腸腺癌)、又は乳癌(例えば、乳腺癌)に関連する抗原に対する特異性を有するように、操作する(例えば、二価ダイアボディ、又は結合したFab二量体若しくは三量体として)ことができる。抗体は、ROR2と、細胞傷害性エフェクター細胞の活性化又はターゲティングを促進する抗原とを有するように、操作することができる。
ROR2ターゲティングmAbの治療有用性をさらに調べるために、mAbに基づくキメラ抗原受容体(CAR)及びCAR−T細胞を作製した。典型的には、本発明のキメラ抗原受容体は、膜貫通領域及び細胞内T細胞受容体(TCR)シグナル伝達ドメインと融合した、本明細書に記載のhROR2抗体又は抗体フラグメントを含有する。これまでに記載されている方法(Hudecek,M.,Lupo−Stanghellini,M.T.,Kosasih,P.L.,Sommermeyer,D.,Jensen,M.C.,Rader,C.,and Riddell,S.R.(2013)Receptor affinity and extracellular domain modifications affect tumor recognition by ROR1−specific chimeric antigen receptor T cells.Clin.Cancer Res.19,3153−3164)を用いて、XBR2−401をベースとするCAR−T細胞を作製した。手短には、エクスビボで拡大した正常ドナーCD8+CD62L+T細胞に、レンチウイルスにより、scFvフォーマットのXBR2−401を含有するEF1αプロモータ駆動の発現カセット、続いて短い若しくは長いスペーサ、ヒトCD28の膜貫通ドメイン、4−1BBのシグナル伝達ドメイン、CD3ζのシグナル伝達ドメイン、並びに切断型リガンド結合及びチロシンキナーゼドメインを含むT2A分断膜貫通EGFRフラグメントを形質導入した。EGFR+形質導入T細胞のFACS単離によって、>90%のCAR−T細胞における頑健な抗ROR2認識が明らかにされた。乳癌細胞株T47D(ROR2+ROR1−)及びMDA−MB−231(ROR2−ROR1+)に対する、短い及び長いスペーサを有するROR2ターゲティングXBR2−401 CAR−Tの活性。XBR2−401は、ROR2のKrドメイン内の膜近傍エピトープに結合することから、XBR2−401 CAR−T細胞は、短いスペーサよりも長いスペーサの方が、活性である可能性がある。これは、ROR2+ROR1−標的細胞の存在下で、増殖、IFN−γ及びIL−2分泌、並びに細胞傷害性に関して確認された(図16)。
IV.ROR2抗体を生成するためのポリヌクレオチド、ベクター及び宿主細胞
本発明は、本明細書に記載の抗体、抗体ベースの結合タンパク質又はその抗体フラグメントのセグメント若しくはドメインを含むポリペプチドをコードする配列と同一又は相補的である、実質的に精製されたポリヌクレオチド(DNA若しくはRNA)を提供する。一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、図1に示す重鎖又は軽鎖ドメイン配列をコードする。例示として、抗体XBR2−401、XBR2−416及びXBR2−433の重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメイン配列をコードする1対のポリヌクレオチドが、配列番号129及び132、配列番号130及び133、並びに配列番号131及び134にそれぞれ示される。本発明のポリヌクレオチドの一部は、配列番号129、130、若しくは131に示されるヌクレオチド配列及び/又は配列番号132、133、若しくは134に示される軽鎖可変領域配列を含む。本発明のいくつかの他のポリヌクレオチドは、配列番号129〜134から選択される配列と実質的に(例えば、少なくとも65、80%、95%、又は99%)同一のヌクレオチド配列を含む。適切な発明ベクターから発現されると、これらのポリヌクレオチドによりコードされたポリペプチドは、ROR2抗原結合能力を呈示することができる。
本発明は、本明細書に記載の抗体、抗体ベースの結合タンパク質又はその抗体フラグメントのセグメント若しくはドメインを含むポリペプチドをコードする配列と同一又は相補的である、実質的に精製されたポリヌクレオチド(DNA若しくはRNA)を提供する。一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、図1に示す重鎖又は軽鎖ドメイン配列をコードする。例示として、抗体XBR2−401、XBR2−416及びXBR2−433の重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメイン配列をコードする1対のポリヌクレオチドが、配列番号129及び132、配列番号130及び133、並びに配列番号131及び134にそれぞれ示される。本発明のポリヌクレオチドの一部は、配列番号129、130、若しくは131に示されるヌクレオチド配列及び/又は配列番号132、133、若しくは134に示される軽鎖可変領域配列を含む。本発明のいくつかの他のポリヌクレオチドは、配列番号129〜134から選択される配列と実質的に(例えば、少なくとも65、80%、95%、又は99%)同一のヌクレオチド配列を含む。適切な発明ベクターから発現されると、これらのポリヌクレオチドによりコードされたポリペプチドは、ROR2抗原結合能力を呈示することができる。
さらに、本発明には、本明細書に記載の抗体の重鎖若しくは軽鎖からの少なくとも1つのCDR領域、通常、3つのCDR領域全てをコードするポリヌクレオチドも提供される。いくつかの他のポリヌクレオチドは、例示した抗体の重鎖及び/又は軽鎖の可変領域配列の全部若しくは実質的に全部をコードする。例えば、これらのポリヌクレオチドの一部は、配列番号1〜12のいずれか1つに示される重鎖可変領域のアミノ酸配列、及び/又は配列番号13〜24のいずれか1つに示される軽鎖可変領域のアミノ酸配列をコードする。コードの縮重のために、様々な核酸配列が、免疫グロブリンアミノ酸配列の各々をコードすることになる。
本発明のポリヌクレオチドは、例示した抗体の可変領域配列だけをコードすることができる。これらはまた、抗体の可変領域及び定常領域の両方をコードすることもできる。本発明のポリヌクレオチド配列の一部は、配列番号1〜12のいずれか1つに示される成熟重鎖可変領域配列と実質的に(例えば、少なくとも80%、90%、95%若しくは99%)同一の成熟重鎖可変領域配列をコードする。本発明のポリヌクレオチド配列の一部は、配列番号13〜24のいずれか1つに示される成熟軽鎖可変領域配列と実質的に同一の成熟軽鎖可変領域配列をコードする。ポリヌクレオチド配列の一部は、例示した抗体のうちの1抗体の重鎖及び軽鎖両方の可変領域を含むポリペプチドをコードする。一部の他のポリヌクレオチドは、例示した抗体のうちの1抗体の重鎖又は軽鎖の可変領域とそれぞれ実質的に同一である2つのポリペプチドセグメントをコードする。
ポリヌクレオチド配列は、デノボ固相DNA合成により、又は例示した機能抗体をコードする既存の配列(例えば、以下の実施例に記載する配列)のPCR突然変異によって、生成することができる。核酸の直接の化学合成は、Narang et al.,Meth.Enzymol.68:90,1979のホスホトリエステル法;Brown et al.,Meth.Enzymol.68:109,1979のホスホジエステル法;Beaucage et al.,Tetra.Lett.,22:1859,1981のジエチルホスホロアミダイト法;及び米国特許第4,458,066号明細書に記載の固体支持体法などの当技術分野で公知の方法によって達成することができる。PCRによるポリヌクレオチド配列への突然変異の導入は、例えば、下記の文献に記載されているように実施することができる:PCR Technology:Principles and Applications for DNA Amplification,H.A.Erlich(Ed.),Freeman Press,NY,NY,1992;PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications,Innis et al.(Ed.),Academic Press,San Diego,CA,1990;Mattila et al.,Nucleic Acids Res.19:967,1991;及びEckert et al.,PCR Methods and Applications 1:17,1991。
さらに、本明細書に記載の機能抗体を生成するための発現ベクター及び宿主細胞も本発明に提供される。抗体を発現するためのプラスミド及びトランスポゾンベースのベクターの具体的な例は、以下の実施例に記載されている。機能抗体鎖又は結合フラグメントをコードするポリヌクレオチドを発現するために、様々な他の発現ベクターを使用することもできる。ウイルスベース及び非ウイルス発現ベクターを用いて、哺乳動物宿主細胞において抗体を生成することができる。非ウイルスベクター及び系としては、プラスミド、典型的にはタンパク質若しくはRNAを発現するための発現カセットを備えるエピソーマルベクター、ヒト人工染色体が挙げられる(例えば、Harrington et al.,Nat.Genet.15:345,1997を参照)が挙げられる。例えば、哺乳動物(例えば、ヒト)細胞における抗体ポリヌクレオチド及びポリペプチドの発現に有用な非ウイルスベクターには、pCEP4、pREP4、pThioHis A,B&C、pcDNA3.1/His、pEBVHis A,B&C(Invitrogen,San Diego,CA)、MPSVベクター、並びに他のタンパク質を発現するための当技術分野において知られている多数の他のベクターがある。他の有用な非ウイルスベクターは、Sleeping Beauty、PiggyBack及びその他のトランスポゾン系によって動員することができる発現カセットを含む。有用なウイルスベクターとしては、レンチウイルス(lentiviruses)又はその他のレトロウイルス(retroviruses)、アデノウイルス(adenoviruses)、アデノ関連ウイルス(adeno−associated viruses)、ヘルペスウイルス(herpes viruses)をベースとするベクター、SV40、パピローマウイルス(papilloma virus)、HBP エプスタイン・バーウイルス(Epstein Barr virus)、ワクシニアウイルス(vaccinia virus)ベクター及びセムリキ森林熱ウイルス(Semliki Forest virus)(SFV)をベースとするベクターが挙げられる。Brent et al.,前掲;Smith,Annu.Rev.Microbiol.49:807,1995;及びRosenfeld et al.,Cell 68:143,1992を参照されたい。
発現ベクターの選択は、ベクターを発現させることが意図される宿主細胞に左右される。典型的には、発現ベクターは、機能抗体鎖又はフラグメントをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されているプロモータ及び他の調節配列(例えば、エンハンサー)を含む。一部の実施形態では、誘導性プロモータを使用して、誘導条件下を除き、挿入配列の発現を阻止する。誘導性プロモータとしては、例えば、アラビノース、lacZ、メタロチオネインプロモータ又はヒートショックプロモータが挙げられる。その発現産物が宿主細胞による耐容性が優れたコード配列について集団を偏らせることなく、形質転換生物の培養物を非誘導条件下で拡大することができる。プロモータに加えて、機能抗体鎖又はフラグメントの効率的な発現のために他の調節エレメントが必要となる、又は望ましい場合もある。これらのエレメントは、典型的に、ATG開始コドン及び隣接リボソーム結合部位(コザック共通配列)又はその他の配列を含む。さらに、発現の効率は、使用する細胞系に適したエンハンサーの含有によって増強される(例えば、Scharf et al.,Results Probl.Cell Differ.20:125,1994;及びBittner et al.,Meth.Enzymol.,153:516,1987を参照)。例えば、哺乳動物宿主細胞での発現を増大するために、SV40エンハンサー又はCMVエンハンサーを使用することができる。
発現ベクターはまた、挿入された機能抗体配列によってコードされるポリペプチドを含む融合タンパク質を形成するための分泌シグナル配列位置も賦与し得る。大抵の場合、挿入された機能抗体配列は、ベクターへの導入の前に、シグナル配列に連結される。また、機能抗体軽鎖及び重鎖可変ドメインをコードする配列を受けるために用いられるベクターも、それらの定常領域若しくは部分をコードすることがある。こうしたベクターは、定常領域を有する融合タンパク質と同様に、可変領域の発現を可能にし、これにより、インタクトな抗体又はそのフラグメントの生成をもたらす。典型的に、こうした定常領域は、ヒト型であり、好ましくはヒトIgG1抗体のものである。
機能抗体鎖を含有し、これを発現させる宿主細胞は、原核又は真核細胞のいずれであってもよい。一部の好ましい実施形態では、哺乳動物宿主細胞を用いて、本発明の抗体ポリペプチドを発現すると共に、これを生成する。例えば、宿主細胞は、内在性免疫グロブリン遺伝子を発現するハイブリドーマ細胞株又は外性発現ベクターを含有する哺乳動物細胞株のいずれであってもよい。これらは、任意の正常な可死又は正常若しくは異常な不死動物細胞若しくはヒト細胞を含む。本明細書に例示する細胞株以外に、インタクトな免疫グロブリンを分泌することができるいくつかの他の好適な宿主細胞株も当技術分野で知られている。こうした細胞株として、例えば、CHO細胞株、各種HEK293細胞株、各種Cos細胞株、HeLa細胞、骨髄腫細胞株、形質転換B細胞及びハイブリドーマが挙げられる。ポリペプチドを発現するための哺乳動物組織細胞培養物の使用は、例えば、Winnacker,From Genes to Clones,VCH Publishers,N.Y.,N.Y.,1987に概要が論じられている。哺乳動物宿主細胞のための発現ベクターは、複製起点、プロモータ、及びエンハンサーなどの発現制御配列、並びにリボソーム結合部位、RNAスプライス部位、ポリアデニル化部位、及び転写終結配列などの必要なプロセシング情報部位を含み得る。これらの発現ベクターは、通常、哺乳動物遺伝子由来又は哺乳動物ウイルス由来のプロモータを含有する。好適なプロモータは、構成性、細胞型特異的、発生期特異的、及び/又はモジュレート可能若しくは調節可能なものであってよい。有用なプロモータとして、限定されないが、本明細書に例示するEF1α及びヒトUbCプロモータ、メタロチオネインプロモータ、構成性アデノウイルス後期プロモータ、デキサメタゾン誘導性MMTVプロモータ、SV40プロモータ、MRP pol IIIプロモータ、構成性MPSVプロモータ、テトラサイクリン誘導性CMVプロモータ(ヒト最初期CMVプロモータなど)、構成性CMVプロモータ、及び当技術分野で公知のプロモータ−エンハンサー複合体が挙げられる。
目的のポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを導入する方法は、細胞宿主の種類によって変わる。例えば、原核細胞の場合には、一般に塩化ナトリウム形質転換が使用されるが、他の細胞宿主の場合には、リン酸ナトリウム処理又はエレクトロポレーションが用いられ得る(概要については、Brent et al.,前掲を参照)。他の方法としては、例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム処理、リポソーム媒介形質転換、注射及びマイクロインジェクション、弾道法、ビロソーム、イムノリポソーム、ポリカチオン:核酸複合体、ネイキッドDNA、人工ビリオン、ヘルペスウイルス構造タンパク質VP22との融合(Elliot and O’Hare,Cell 88:223,1997)、薬剤によるDNAの取り込み強化、並びにエクスビボ形質導入が挙げられる。組換えタンパク質の長期、高収率生成のためには、多くの場合、安定した発現が望ましい。例えば、ウイルス複製起点又は内在性発現エレメント及び選択マーカ遺伝子を含有する本発明の発現ベクターを用いて、抗体鎖又は結合断片を安定して発現する細胞株を調製することができる。ベクターの導入後、選択培地に移す前に、細胞を濃縮培地中で1〜2日間増殖させてもよい。選択マーカの目的は、選択に対する耐性を付与することであり、その存在によって、選択培地中で導入配列を好適に発現する細胞の増殖が可能になる。耐性の、安定にトランスフェクトされた細胞は、細胞型に適した組織培養技術を用いて増殖することができる。
本発明は、さらに、本発明の抗体、抗体ベースの結合タンパク質又はその抗体フラグメントを生成するように組換えにより操作された真核又は非真核細胞(例えば、Tリンパ球)も提供する。真核又は非真核細胞は、本発明の抗体を生成するための発現系として使用することができる。一部の実施形態では、本発明は、本発明のROR2特異的抗体を組換えにより発現するように操作されたROR2標的免疫細胞を提供する。例えば、本発明は、本発明の抗体(例えば、scFv、scFv−Fc、若しくは(scFv)2)を発現するように操作されたT細胞を提供し、これは、下記ドメイン:スペーサ又はヒンジ領域(例えば、CD28配列若しくはIgG4ヒンジ−Fc配列)、膜貫通領域(例えば、膜貫通規定ドメイン)、及び細胞内T細胞受容体(TCR)シグナル伝達ドメインの1つ又は複数を含む合成分子と連結しており、これによって、キメラ抗原受容体(CAR)又はTボディを形成する。CAR(又はTボディ)内に含有させることができる細胞内TCRシグナル伝達ドメインとして、限定されないが、CD3ζ、FcR−γ、及びSyk−PTシグナル伝達ドメイン並びにCD28、4−1BB、及びCD134同時シグナル伝達ドメインが挙げられる。CAR(又はTボディ)を発現するT細胞を構築するための方法は、当技術分野で公知である。例えば、Marcu−Malina et al.,Expert Opinion on Biological Therapy,Vol.9,No.5(2009年4月16日にインターネットで公開)を参照されたい。
V.治療及び診断用途
一部の実施形態では、本発明は、本明細書に記載する抗体、抗体ベースの結合タンパク質若しくはその抗体フラグメント、若しくは抗体薬物複合体(ADC)又はキメラ抗原受容体(CAR)含有の操作細胞と細胞を接触させることにより、ROR2を発現する細胞(ROR2細胞)を阻害する方法を提供する。抗体、抗体ベースの結合タンパク質又はその抗体フラグメントは、ネイキッド(非結合)分子であっても、又は合成分子、例えば、細胞傷害剤、細胞静止剤、又は血管新生阻害剤、放射性同位体、あるいはリポソームに結合した抗体分子であってもよい。この方法を用いて、インビトロで又は対象において(すなわち、インビボで)ROR2細胞を阻害することができる。接触させるROR2細胞は、例えば、ROR2のレベル増大に関連する障害の細胞培養物又は動物モデルに存在するものであってよい。この方法は、例えば、特定のROR2細胞型の抗体の阻害活性を測定及び/又はランク付け(別の抗体に対して)する上で有用である。ROR2細胞の阻害は、ROR2細胞の活性若しくは増殖を阻止又は低減することを含む。阻害はまた、ROR2細胞の殺傷も含み得る。この方法は、特定の作用機構に何ら拘束又は制限されるものではないが、阻害活性は、ROR2媒介性シグナル伝達を阻止することにより、又はROR2関連受容体のシグナル伝達を阻止することによって、媒介することができる。阻害活性はまた、ROR2細胞を攻撃する免疫系エフェクターの動員により、例えば、抗体依存性細胞傷害(ADCC)又は補体系の成分を活性化することによって、媒介することもできる。
一部の実施形態では、本発明は、本明細書に記載する抗体、抗体ベースの結合タンパク質若しくはその抗体フラグメント、若しくは抗体薬物複合体(ADC)又はキメラ抗原受容体(CAR)含有の操作細胞と細胞を接触させることにより、ROR2を発現する細胞(ROR2細胞)を阻害する方法を提供する。抗体、抗体ベースの結合タンパク質又はその抗体フラグメントは、ネイキッド(非結合)分子であっても、又は合成分子、例えば、細胞傷害剤、細胞静止剤、又は血管新生阻害剤、放射性同位体、あるいはリポソームに結合した抗体分子であってもよい。この方法を用いて、インビトロで又は対象において(すなわち、インビボで)ROR2細胞を阻害することができる。接触させるROR2細胞は、例えば、ROR2のレベル増大に関連する障害の細胞培養物又は動物モデルに存在するものであってよい。この方法は、例えば、特定のROR2細胞型の抗体の阻害活性を測定及び/又はランク付け(別の抗体に対して)する上で有用である。ROR2細胞の阻害は、ROR2細胞の活性若しくは増殖を阻止又は低減することを含む。阻害はまた、ROR2細胞の殺傷も含み得る。この方法は、特定の作用機構に何ら拘束又は制限されるものではないが、阻害活性は、ROR2媒介性シグナル伝達を阻止することにより、又はROR2関連受容体のシグナル伝達を阻止することによって、媒介することができる。阻害活性はまた、ROR2細胞を攻撃する免疫系エフェクターの動員により、例えば、抗体依存性細胞傷害(ADCC)又は補体系の成分を活性化することによって、媒介することもできる。
一部の関連する実施形態では、本発明は、ROR2のレベル増大に関連する障害を有する、有することが疑われる、又はそうした障害を発生するリスクがある対象を治療する方法を提供する。一般に、本方法は、治療有効量の本発明の単離された抗体、抗体ベースの結合タンパク質、その抗体フラグメント、ADC又はCARを含む医薬組成物を対象に投与するステップを含む。抗体は、本明細書に記載するいずれの抗ROR2抗体であってもよい。従って、抗体は、キメラ、ヒト化、合成、F(ab)2、Fv、scFv、IgGACH2、F(ab’)2、scFv2CH3、Fab、VL、VH、scFv4、scFv3、scFv2、dsFv、Fv、又は(scFv)2であってよい。一部の実施形態では、本方法は、IgG、scFv、dsFv、F(ab’)2、ダイアボディ、又は二価抗体を投与するステップを含む。投与される抗体又は抗原結合フラグメントは、前述した合成分子、例えば、細胞傷害剤、細胞静止剤、若しくは血管新生阻害剤、治療用放射性同位体、又はリボソームと結合させることができる。例示的な細胞傷害剤は、緑膿菌外毒素(Pseudomonas exotoxin)A(PE38)である。治療することができる障害としては、神経芽細胞腫、骨肉腫、腎細胞癌、乳癌、胃癌、前立腺癌、黒色腫、扁平上皮癌、多発性骨髄腫、及びROR2発現の増大に関連するその他の障害が挙げられる。
一部の実施形態では、本発明は、遺伝子操作された本明細書に記載のT細胞の養子移入によって、ROR2の発現に関連する障害を有する、有することが疑われる、又はそうした障害を発生するリスクがある対象を治療する方法を提供し、ここで、T細胞は、ROR2と選択的に結合するキメラ抗原受容体(CAR)として本発明の抗体又は抗原結合フラグメントを発現する。組換え技術を用いて、治療しようとする対象からのいずれか好適なT細胞、例えば、セントラルメモリT細胞にCARコード遺伝子材料を導入することができる。遺伝子材料を担持するT細胞を拡大することができる(例えば、サイトカインの存在下で)。遺伝子操作されたT細胞は、典型的に、注入によって、患者に移入する。その後、移入された本発明のT細胞は、対象においてROR2発現細胞に対する免疫応答を高めることができる。養子移入法を用いて、例えば、神経芽細胞腫、骨肉腫、腎細胞癌、乳癌、胃癌、前立腺癌、黒色腫、扁平上皮癌、多発性骨髄腫、及びその他の癌を含む、ROR2に関連する癌のいずれかを有するか、又は有することが疑われる対象を治療することができる。
一部の実施形態では、前述の治療方法は、さらに、ROR2のレベル増大に関連する障害を治療するための第2の治療薬を同時投与するステップも含み得る。例えば、治療しようとする障害が、ROR2を発現する癌を含むとき、本方法は、癌を治療するのに好適な、細胞傷害剤、細胞静止剤、若しくは血管新生阻害剤、又は免疫刺激剤(例えば、免疫チェックポイント阻害抗体、例えば、限定されないが、PD1、PDL1、CTLA4、OX40、TIM3、GITR、LAG3などに結合するもの)の同時投与をさらに含み得る。癌が、B細胞悪性疾患である場合、本方法は、例えば、リツキシマブ、アレムツズマブ、オファツムマブ、オクレリズマブ、又はCHOP化学療法薬レジメンの同時投与をさらに含み得る。
一部の他の実施形態では、本発明は、FACS、免疫組織化学(IHC)又はウエスタンブロッティングのいずれかにより、例えばコントロールに比べて、変化したレベルのROR2(例えば、細胞表面ROR2)を生体サンプル中で検出する方法を提供する。一般に、本方法は、本発明の抗体、抗体ベースの結合タンパク質、その抗体フラグメントと生体サンプルを接触させるステップと、サンプル中で材料(例えば、細胞)に選択的に結合する抗体の量を決定することにより、生体サンプル中のROR2のレベルを決定するステップを含む。生体サンプルは、細胞培養物又は試験対象由来のものでよく、例えば、ROR2のレベル増大に関連する疾患又は状態を有する、有することが疑われる、又はそうした疾患又は状態を発生するリスクがある対象からの血漿若しくは組織サンプルであってよい。コントロールレベルは、1つ又は複数のコントロール培養物若しくは疾患のない対象からの対応するサンプル中の同じ抗体を用いて検出されたROR2レベルと一致するのが望ましい。本発明の抗体を用いてROR2レベルを決定する方法は、イムノ−(ウエスタン)ブロッティング、酵素連結イムノソルベントアッセイ(ELISA)、免疫組織化学(IHC)及びフローサイトメトリー、例えば、蛍光活性化セルソーティング(FACS)分析などの任意の免疫アッセイを含み得る。
検出方法を用いて、ROR2増大に関連する障害の存在をスクリーニングすることができる。本方法は、スクリーニングを必要とする試験対象、例えば、ROR2増大に関連する障害を有する、有することが疑われる、又はそうした障害を発生するリスクがある対象から、サンプルを取得するステップを含む。本発明の抗体、抗体ベースの結合タンパク質、その抗体フラグメントを用いて、サンプル中のROR2のレベル(例えば、量又は濃度)を測定し、サンプル中のレベルをROR2のコントロールレベルと比較する。コントロールレベルは、例えば、ROR2増大に関連する障害のない1又は好ましくは複数のコントロールグループ対象からのサンプル中の平均レベル(例えば、量又は濃度)を表す。あるいは、コントロールレベルは、試験対象が、ROR2増大に関連する状態がなかった、又はそれを呈示していなかったときなど、以前の1又は複数の時点に、試験対象から採取された1つ又は複数のサンプル中のROR2のレベル若しくは平均レベルと一致してもよい。コントロールレベルに比べて、生体サンプル中の有意に高いROR2のレベルは、対象におけるROR2増大に関連する障害を示している。細胞表面ROR2発現が主に胚形成に限定されるヒトなどの対象の場合、ROR2のコントロールレベルは、ゼロ又は無であってよい。このように、本発明が提供する検出方法の一部の実施形態では、生体サンプル中のROR2のどんな有意且つ検出可能な量も、対象におけるROR1増大に関連する障害を示す可能性がある。
さらに、検出方法を用いて、ROR2増大に関連する障害の進行をモニターすることができる。本方法は、スクリーニングを必要とする対象、例えば、ROR2増大に関連する障害を有すると診断されたか、又は有することが疑われる対象からサンプルを取得するステップを含む。本発明の抗体、抗体ベースの結合タンパク質、その抗体フラグメントを用いて、サンプル中のROR2のレベルを測定し、サンプル中のレベルを、以前の1又は複数の時点で試験対象から採取された1つ又は複数のサンプル中のROR2のレベル若しくは平均レベルに一致するコントロールレベルと比較する。コントロールに比べて、有意に増大又は低下したROR2のレベルは、対象の障害が、それぞれ、悪化又は改善していることを示している。前述の検出方法を用いて、例えば、神経芽細胞腫、骨肉腫、腎細胞癌、乳癌、胃癌、前立腺癌、黒色腫、扁平上皮癌、多発性骨髄腫、及びその他の癌を含む障害の存在をスクリーニングする、又はその進行をモニターすることができる。
一部の実施形態では、本発明は、変化したレベルのROR2について対象をスクリーニングする方法を提供する。一般に、本方法は、標識(例えば、造影剤)と結合した本発明の抗体、抗体ベースの結合タンパク質、その抗体フラグメントを対象に投与するステップ、標識を検出するのに好適な様式で対象をイメージングするステップ、及び対象における1領域が、近傍の組織中の標識のバックグラウンドレベルと比較して、変化した密度若しくは濃度の標識を有するか否かを決定するステップを含む。あるいは、本方法は、対象の同じ領域中で以前検出された標識の密度若しくは濃度と比較して、領域中の標識の密度若しくは濃度に変化があるか否を決定するステップを含む。対象をイメージングする方法は、抗体に結合した標識を検出する上で適した、X線イメージング、X線コンピュータ断層(CT)イメージング(例えば、CT血管造影(CTA)イメージング)、磁気共鳴(MR)イメージング、磁気共鳴血管造影(MRA)、核医学、超音波(US)イメージング、最適イメージング、エラストグラフィ、赤外線イメージング、マイクロ波イメージングなどを含み得る。好ましい実施形態では、対象は、例えば、神経芽細胞腫、骨肉腫、腎細胞癌、乳癌、胃癌、前立腺癌、黒色腫、扁平上皮癌、多発性骨髄腫、及びその他の癌などのROR2発現腫瘍を有する、有することが疑われる、又はそれを発生するリスクがあり、本方法を用いて、腫瘍の存在をスクリーニング又は検出する。別の実施形態では、本方法を用いて、時間経過による、例えば、治療期間中のROR2発現腫瘍サイズ又は密度をモニターすることができる。
VI.医薬組成物及び併用
別の態様では、本発明は、本明細書に記載の抗体、抗体フラグメント、抗体ベースの結合タンパク質、又はADCと、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物を提供する。医薬組成物は、本明細書に記載の抗体又は関連化合物のいずれかから調製することができる。例示的な組成物として、1つ又は複数の配列番号13(軽鎖)及び/又は配列番号1(重鎖)を有するキメラ抗体、配列番号14(軽鎖)及び/又は配列番号2(重鎖)を有するキメラ抗体、並びに配列番号15(軽鎖)及び/又は配列番号3(重鎖)を有するキメラ抗体が挙げられる。本発明の医薬組成物に好適な他の抗体、抗体フラグメント、抗体ベースの結合タンパク質、又はADCとしては、配列番号16〜24に示される軽鎖及び/又は配列番号4〜12に示される重鎖を有するものが挙げられる。本発明の他の例示的な組成物は、配列番号25〜96からなる群から選択される1、2、3、4、5、若しくは6つのCDRを有するヒト化抗体を含有することができる。しかし、一部の実施形態では、抗体は、図1に示される同じ例示軽鎖又は重鎖の3つのCDR配列を含む。これらは、以下:(i)配列番号25〜27と配列番号61〜63(抗体XBR2−401)、(ii)配列番号28〜30と配列番号64〜66(抗体XBR2−416)、(iii)配列番号31〜33と配列番号67〜69(抗体XBR2−433)、(iv)配列番号34〜36と配列番号70〜72(抗体XBR2−327)、(v)配列番号37〜39と配列番号73〜75(抗体XBR2−TOP9)、(vi)配列番号40〜42と配列番号76〜78(抗体XBR2−TOP72)、(vii)配列番号43〜45と配列番号79〜81(抗体ERR2−302)、(viii)配列番号46〜48と配列番号82〜84(抗体ERR2−308)、(ix)配列番号49〜51と配列番号85〜87(抗体ERR2−316)、(x)配列番号52〜54と配列番号88〜90(抗体ERR2−317)、(xi)配列番号55〜57と配列番号91〜93(抗体ERR2−TOP2)、及び(xii)配列番号58〜60と配列番号94〜96(抗体ERR2−TOP35)にそれぞれ示される重鎖CDR1、CDR2及びCDR3配列と、軽鎖CDR1、CDR2及びCDR3配列とを含む。一部の実施形態では、医薬組成物は、図1に例示される同じ抗体の6つのCDR配列、例えば、(a)配列番号25〜27と配列番号61〜63(抗体XBR2−401);(b)配列番号28〜30と配列番号64〜66(抗体XBR2−416);又は(c)配列番号31〜33と配列番号67〜69(抗体XBR2−433)を有する抗体を含む。また別の例示的な医薬組成物は、dsFvフラグメントを含み、これは、必要に応じて、また当業者には理解されるように、アミノ酸配列に1つ又は複数の修飾を含んでもよい。
別の態様では、本発明は、本明細書に記載の抗体、抗体フラグメント、抗体ベースの結合タンパク質、又はADCと、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物を提供する。医薬組成物は、本明細書に記載の抗体又は関連化合物のいずれかから調製することができる。例示的な組成物として、1つ又は複数の配列番号13(軽鎖)及び/又は配列番号1(重鎖)を有するキメラ抗体、配列番号14(軽鎖)及び/又は配列番号2(重鎖)を有するキメラ抗体、並びに配列番号15(軽鎖)及び/又は配列番号3(重鎖)を有するキメラ抗体が挙げられる。本発明の医薬組成物に好適な他の抗体、抗体フラグメント、抗体ベースの結合タンパク質、又はADCとしては、配列番号16〜24に示される軽鎖及び/又は配列番号4〜12に示される重鎖を有するものが挙げられる。本発明の他の例示的な組成物は、配列番号25〜96からなる群から選択される1、2、3、4、5、若しくは6つのCDRを有するヒト化抗体を含有することができる。しかし、一部の実施形態では、抗体は、図1に示される同じ例示軽鎖又は重鎖の3つのCDR配列を含む。これらは、以下:(i)配列番号25〜27と配列番号61〜63(抗体XBR2−401)、(ii)配列番号28〜30と配列番号64〜66(抗体XBR2−416)、(iii)配列番号31〜33と配列番号67〜69(抗体XBR2−433)、(iv)配列番号34〜36と配列番号70〜72(抗体XBR2−327)、(v)配列番号37〜39と配列番号73〜75(抗体XBR2−TOP9)、(vi)配列番号40〜42と配列番号76〜78(抗体XBR2−TOP72)、(vii)配列番号43〜45と配列番号79〜81(抗体ERR2−302)、(viii)配列番号46〜48と配列番号82〜84(抗体ERR2−308)、(ix)配列番号49〜51と配列番号85〜87(抗体ERR2−316)、(x)配列番号52〜54と配列番号88〜90(抗体ERR2−317)、(xi)配列番号55〜57と配列番号91〜93(抗体ERR2−TOP2)、及び(xii)配列番号58〜60と配列番号94〜96(抗体ERR2−TOP35)にそれぞれ示される重鎖CDR1、CDR2及びCDR3配列と、軽鎖CDR1、CDR2及びCDR3配列とを含む。一部の実施形態では、医薬組成物は、図1に例示される同じ抗体の6つのCDR配列、例えば、(a)配列番号25〜27と配列番号61〜63(抗体XBR2−401);(b)配列番号28〜30と配列番号64〜66(抗体XBR2−416);又は(c)配列番号31〜33と配列番号67〜69(抗体XBR2−433)を有する抗体を含む。また別の例示的な医薬組成物は、dsFvフラグメントを含み、これは、必要に応じて、また当業者には理解されるように、アミノ酸配列に1つ又は複数の修飾を含んでもよい。
一部の実施形態では、本発明の組成物は、抗体、抗体フラグメント、抗体ベースの結合タンパク質又はADCのための担体、望ましくは薬学的に許容される担体を含む。薬学的に許容される担体は、任意の好適な薬学的に許容される担体であってよい。これは、ヒト若しくは動物患者への投与に適した1種又は複数種の適合性固体若しくは液体充填材、希釈剤、他の賦形剤、又は封入物質(例えば、生理学的に許容される担体又は薬理学的に許容される担体)であってよい。用語「担体」は、活性成分の使用、例えば、対象への活性成分の投与を容易にするために活性成分と併用される有機若しくは無機成分(天然若しくは合成)を意味する。薬学的に許容される担体は、所望の薬効を実質的に損なわないように、1種若しくは複数種の活性成分、例えば、ハイブリッド分子と混合することができ、また、組成物中に2種以上の薬学的に許容される担体が存在する場合には、互いに混合することができる。薬学的に許容される材料は、典型的に、吐気、めまい、発疹、若しくは急性胃蠕動などの有意な望ましくない生理学的作用を生じることなく、対象、例えば、患者への投与を可能にする。例えば、治療目的のためにヒト患者に投与される場合、薬学的に許容される担体を含む組成物は免疫原性ではないことが望ましい。
本発明の医薬組成物は、さらに、例えば、塩の形態の酢酸、塩の形態のクエン酸、塩の形態のホウ酸、及び塩の形態のリン酸などの好適な緩衝剤を含有することができる。組成物は、さらに、塩化ベンザルコニウム、クロロブタノール、パラベン、及びチメロサールなどの好適な防腐剤を任意選択的に含有することもできる。本発明の医薬組成物は、単位剤形で提供することができ、また、いずれか好適な方法で調製することができ、その多くは、製剤分野で公知である。こうした方法は、本発明の抗体を、1若しくは複数の補助成分を構成する担体と会合させるステップを含む。一般に、組成物は、活性剤を液体担体、微粉化した固体担体、又はその両方と均一且つ入念に会合させた後、必要であれば、生成物を造形することにより調製される。
非経口投与に好適な組成物は、本発明の組成物の滅菌水性調製物を含むのが好都合であり、これは、好ましくはレシピエントの血液と等張性である。この水性調製物は、好適な分散又は湿潤剤及び懸濁剤を用いて、公知の方法に従い製剤化することができる。滅菌注射調製物はまた、非毒性の非経口的に許容される希釈剤若しくは溶媒中の滅菌注射液若しくは懸濁液、例えば、1,3−ブタンジオール中の溶液であってよい。使用することができる許容されるビヒクル及び溶媒として、水、リンガー溶液、及び等張性塩化ナトリウム溶液がある。さらに、溶媒又は懸濁媒として、滅菌、不揮発性油が一般に使用される。この目的のために、いずれの無刺激の不揮発性油を使用してもよく、例えば、合成モノ−若しくはジ−グリセリドがある。加えて、オレイン酸などの脂肪酸を注射液の調製に使用することもできる。経口、皮下、静脈内、筋肉内などの投与に好適な担体製剤は、Remington’s Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Co.,Easton,PAに見いだすことができる。
本発明の医薬組成物の調製及びそれらの様々な投与経路は、当技術分野で公知の方法に従って実施することができる。例えば、Remington:The Science and Practice of Pharmacy,Mack Publishing Co.,20th ed.,2000;及びSustained and Controlled Release Drug Delivery Systems,J.R.Robinson,ed.,Marcel Dekker,Inc., New York,1978を参照されたい。本発明に関して有用な送達系は、本発明の組成物の送達が、治療しようとする部位の感作を引き起こす前に、並びにそれを引き起こすのに十分な時間で、実施されるように、定時放出、遅延放出、及び持続的放出を含む。本発明の組成物は、他の治療薬又は療法と一緒に使用することができる。このような系は、本発明の組成物の反復投与を回避して、対象及び医師に対する便宜を高めることができ、しかも、本発明の組成物にとって特に好適となり得る。
多くのタイプの放出送達系が入手可能であり、当業者には周知である。好適な送達系としては、ポリ(ラクチド−グリコシド)、コポリオキサレート、ポリカプロラクトン、ポリエステルアミド、ポリオルトエステル、ポリヒドロキシ酪酸、及びポリ無水物が挙げられる。薬物を含有する前述のポリマーのマイクロカプセルは、例えば、米国特許第5,075,109号明細書に記載されている。送達系はまた、コレステロール、コレステロールエステルなどのステロール、脂肪酸又はモノ−ジ−及びトリグリセリドなどの中性脂肪を含む脂質である非ポリマー系;ハイドロゲル放出系;シラスティック系;ペプチドベース系;ワックスコーティング;通常の結合剤及び賦形剤を用いた圧縮錠剤;部分的に融合したインプラントなどを含んでもよい。具体的な例として、限定されないが、以下のものが挙げられる:(a)活性組成物が、米国特許第4,452,775号明細書、同第4,667,014号明細書、同第4,748,034号明細書、及び同第5,239,660号明細書に記載されるものなどのマトリックス内の形態で含有されるエロージョン系、並びに(b)米国特許第3,832,253号明細書及び同第3,854,480号明細書に記載されているようなポリマーから制御された速度で活性成分が透過する分散系。さらに、ポンプを用いたハードウエア送達系を使用することができ、そのいくつかは、移植のために改変されている。
本発明はまた、本発明の方法を実施する上で好適なキットも提供する。典型的には、キットは、本発明の治療及び診断方法を実施するために必要な2種以上の構成要素を含む。キット構成要素としては、限定されないが、本発明の1種又は複数種の抗体、抗体ベースの結合タンパク質、その抗体フラグメント、若しくはADC、適切な試薬、及び/又は装置が挙げられる。一部の実施形態では、キットは、本発明の抗体、抗体ベースの結合タンパク質、その抗体フラグメント、及びROR2を検出する上で好適な免疫アッセイバッファー(例えば、ELISA、フローサイトメトリー、磁気選別、又はFACSによる)を含み得る。キットは、さらに、1若しくは複数のマイクロタイタープレート、標準、アッセイ希釈剤、洗浄バッファー、接着プレートカバー、磁気ビーズ、磁石、及び/又はキットを使用する本発明の方法を実施するための指示書を含んでもよい。キットスキャンは、基質(例えば、マルチウェルプレート若しくはチップ)に結合した本発明の抗体、抗体ベースの結合タンパク質、その抗体フラグメントを含み、これは、好適にパッケージングされ、ROR2を検出する上で有用である。一部の実施形態では、キットは、蛍光標識、生体活性酵素標識、発光性標識、若しくは発色団標識などの標識に結合した本発明の抗体、抗体ベースの結合タンパク質、その抗体フラグメントを含む。キットは、さらに、結合した抗体、抗体ベースの結合タンパク質、その抗体フラグメント、例えば、酵素の基質を視覚化するための試薬も含み得る。一部の実施形態では、キットは、造影剤に結合した本発明の抗体又は抗原結合フラグメント、並びに任意選択で、対象における抗体、抗体ベースの結合タンパク質、その抗体フラグメントをイメージングする上で有用な1つ又は複数の試薬又は装置の構成要素を含む。
一般に、キット内の本発明の抗体、抗体ベースの結合タンパク質、その抗体フラグメント又はADCは、例えば、バイアル、ポーチ、アンプル、及び/又は治療若しくは検出方法に適した任意の容器内に好適にパッケージされる。キット構成要素は、濃縮物(凍結乾燥組成物を含む)として提供することができ、これは、使用前にさらに希釈してもよいし、又は使用濃度で提供することができる。インビボでの本発明の抗体の使用のために、所望の量及び濃度の構成要素を有する滅菌容器内に単一用量を供給してもよい。
本発明をさらに説明するために以下に実施例を記載するが、本発明の範囲を制限しない。本発明の他の変形は、当業者には容易に理解され、それらは、添付の特許請求の範囲に含まれる。
実施例1.ヒトROR2特異的モノクローナル抗体の作製
細胞株:ATCCからのMDA−MB−231及びT47Dを、10%(v/v)熱不活性化FBS(Thermo Scientific;Logan,UT)、100U/mLペニシリン、及び100μg/mLストレプトマイシン(Invitrogen)で補充したDMEM(Invitrogen;Carlsbad,CA)中で培養した。マウスB前駆細胞63−12(Shinkai et al.,Cell 68,855−867,1992)、並びにhROR1又はhROR2を異所性発現する63−12細胞を、10%(v/v)熱不活性化FBS(Thermo Scientific)、0.1%(v/v)β−ME、100U/mLペニシリン、及び100μg/mLストレプトマイシン(Invitrogen)で補充したIMEM(Invitrogen)中で培養した。HEK 293F細胞は、Invitrogenから購入し、1%(v/v)熱不活性化FBS(Thermo Scientific)、100U/mLペニシリン、及び100μg/mLストレプトマイシン(Invitrogen)で補充したFreeStyle Medium中に維持した。
細胞株:ATCCからのMDA−MB−231及びT47Dを、10%(v/v)熱不活性化FBS(Thermo Scientific;Logan,UT)、100U/mLペニシリン、及び100μg/mLストレプトマイシン(Invitrogen)で補充したDMEM(Invitrogen;Carlsbad,CA)中で培養した。マウスB前駆細胞63−12(Shinkai et al.,Cell 68,855−867,1992)、並びにhROR1又はhROR2を異所性発現する63−12細胞を、10%(v/v)熱不活性化FBS(Thermo Scientific)、0.1%(v/v)β−ME、100U/mLペニシリン、及び100μg/mLストレプトマイシン(Invitrogen)で補充したIMEM(Invitrogen)中で培養した。HEK 293F細胞は、Invitrogenから購入し、1%(v/v)熱不活性化FBS(Thermo Scientific)、100U/mLペニシリン、及び100μg/mLストレプトマイシン(Invitrogen)で補充したFreeStyle Medium中に維持した。
完全長hROR2哺乳動物発現ベクターのクローニング:合成した、又は配列確認した市販のベクターから得られたフランキング制限部位を有するモジュラー部分から転移可能なベクターバックボーン(pPB−Puro)をアセンブルしたが、これらについては、国際公開第2014013026A1号パンフレットに詳しく記載されている。これらの元の転移可能なベクターバックボーンは、元のベクター中のプロマイシン耐性遺伝子のIRES駆動発現を個別のホスホグリセリン酸キナーゼプロモータ(PGK)駆動発現と交換することによって修飾した。これは、IRES配列を、多回クローニング部位の3’側に位置するSV40−pA配列で置換した後、プロマイシン耐性遺伝子の5’側にPGKプロモータ配列を導入することによって実施した。フランキング制限部位(5’NotI/3’BstBI)を用いた全遺伝子合成(Genscript,Piscataway)によって完全長ROR2オープンリーディングフレームを合成し、次に、これらを、それぞれの制限酵素を用いて転移可能なベクターの多回クローニング部位にクローニングした。
EMT−6マウス乳癌細胞株におけるhROR2の異所性発現のための細胞株の操作:マウスEMT−6乳癌細胞(バーゼル大学病院(University Hospital of Basel,Switzerland)、Prof.Dr.med.Alfred Zippeliusからの親切な寄贈品)を、完全DMEM(10%(v/v)ウシ胎児血清(FCS)を含むL−グルタミン、100IU/mLのPen−Strep−Fungizone及び2mMのL−グルタミン(全て、Bioconcept,Allschwil,Switzerland)を含むダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)高グルコース(4.5g/l))において、37℃及び5%CO2で培養した。細胞は、下記の通り、転位によってヒトROR2を過剰発現するように操作した:細胞を遠心分離(6分、1200rpm、4℃)し、RPMI−1640培地中に再懸濁させた(5×106細胞/mL)。次に、13.3μgの転移性ベクターpPB−PGK−Puro−ROR2(完全長ヒトROR2(NP_004551.2)及びプロマイシン耐性遺伝子の同時発現を指令する)と、6.6μgのトランスポザーゼ含有ベクターpCDNA3.1_hy_mPBを含有する400μLのRPMIに、400μLの上記細胞懸濁物を添加した。DNA/EMT−6細胞混合物をエレクトロポレーションキュベット(0.4cm−ギャップ、165−2088,BioRad,Cressier,Switzerland)に移し、300V及び950μFのキャパシタンスエクステンダーを備えたBiorad Gene Pulser IIを用いて、エレクトロポレーションした。次に、細胞を室温で5〜10分間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を1200rpmで6分間遠心分離し、1回洗浄してから、完全DMEM中に再懸濁させた後、5%CO2雰囲気下、37℃にて、加湿インキュベータ内でのインキュベーションに付した。エレクトロポレーションから1日後、3μg/mLのプロマイシン(Sigma−Aldrich,P8833)を添加することによって、ヒトROR2を安定に発現する細胞プールを選択した。
選択したEMT−6−ROR2細胞上でのROR2発現をフローサイトメトリーにより確認した。手短には、トリプシン処理後、106個の細胞をFACSチューブ内で遠心分離し;得られたペレットをバッファー(2%(v/v)FCSを含むPBS)中に再懸濁させた。次に、細胞をXBR2−401(mAb003);30分、4℃、最終濃度2μg/mL)と一緒にインキュベートした後、遠心分離及び洗浄した。続いて、細胞を前述のように再懸濁させ、1:250希釈率で、抗ヒトIgG抗体(Fcγ特異的)PE(eBioscience,Vienna,Austria,12−4998−82)と一緒に暗所で(30分、4℃)インキュベートし、バッファーで1回洗浄してから、FACSソーティングまで氷上で維持した。
FACS Aria IIを用いて、ウェル当たり200μLの完全DMEMを含有する96ウェル平底プレート中に細胞をシングルセルソーティングした。このプレートを37℃でインキュベートし、クローンを6ウェルプレートに拡大した後、分析用のFACSCalibur計器(BD Biosciences)及びFlowJo分析ソフトウエア(Tree Star,Ashland,OR)を用いて、上に概説したフローサイトメトリーによるROR2発現の分析を行った。
図15Cは、抗ROR2抗体XBR2−401(mAb003)を用いて検出された、クローン14(高ROR2発現)及びWT(ROR2陰性)EMT−6のFACS分析データを示す。
図15Cは、抗ROR2抗体XBR2−401(mAb003)を用いて検出された、クローン14(高ROR2発現)及びWT(ROR2陰性)EMT−6のFACS分析データを示す。
実施例2.高複雑度ウサギFabライブラリーの作製及びスクリーニング用の試薬
組換えヒトROR2タンパク質hFc−hROR2−T245の構築、発現、精製、及びビオチン化:Thermo ScientificからのヒトROR2 cDNA(クローンID:40/46553)をテンプレートとして使用した。ROR2は、アミノ酸245位に一塩基多型(SNP)を有する。クローニングの一環として、クローン40/46553の245位の比較的稀なアラニンを、より一般的なトレオニンに変異させた。手短には、ROR2の細胞外ドメイン(ECD)のN末端及びC末端部分をコードする2つのcDNAフラグメントを、(i)プライマーhROR2ECD_F(gcctaagcttgtctccgggtgccgaagtggaggttctggatccgaacg)(配列番号97)及びhROR2_A245T_R(gctcacgcggcttgggtgtccgggagcgcgcgtcgc)(配列番号98)並びに(ii)プライマーhROR2_A245T_F(gcgacgcgcgctcccggacacccaagccgcgtgagc)(配列番号99)及びhROR2ECD_R(agctctcgagtcaccccatcttgctgctgtctcggggactacacgagg)(配列番号100)でPCR増幅した。続いて、フランキングプライマーhROR2ECD_F及びhROR2ECD_Rを用いたオーバーラップ伸長PCRにより、全ROR2 ECD(アミノ酸55〜394)をアセンブルしてから、HindIII/XhoIを介したpCEP4−hFc(Hofer et al.,2008)にクローニングした。得られたpCEP4−hFc−hROR2の構築物を、293フェクチン(Invitrogen)及び製造者のプロトコルに詳述される条件を用いて、HEK293F細胞(Invitrogen)に一過性にトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞をFreeStyle無タンパク質培地(Invitrogen)中で培養し、hFc−hROR2融合タンパク質を上清からプロテインAアフィニティクロマトグラフィーにより精製した。精製したhFc−hROR2を、Biotin−Tag Micro Biotinylationキット(Sigma−Aldrich)を用いてビオチン化した。手短には、50μLの0.1Mリン酸ナトリウムバッファー(pH7.2)中300μgのhFc−hROR2を1μLの5mg/mLビオチンアミドヘキサン酸3−スルホ−N−ヒドロキシスクシニドエステルと一緒に、穏やかに攪拌しながら、室温で30分間インキュベートした。キットにより供給されるMicroSpin G−50カラムを用いて、ビオチン化hFc−hROR2を単離した。
組換えヒトROR2タンパク質hFc−hROR2−T245の構築、発現、精製、及びビオチン化:Thermo ScientificからのヒトROR2 cDNA(クローンID:40/46553)をテンプレートとして使用した。ROR2は、アミノ酸245位に一塩基多型(SNP)を有する。クローニングの一環として、クローン40/46553の245位の比較的稀なアラニンを、より一般的なトレオニンに変異させた。手短には、ROR2の細胞外ドメイン(ECD)のN末端及びC末端部分をコードする2つのcDNAフラグメントを、(i)プライマーhROR2ECD_F(gcctaagcttgtctccgggtgccgaagtggaggttctggatccgaacg)(配列番号97)及びhROR2_A245T_R(gctcacgcggcttgggtgtccgggagcgcgcgtcgc)(配列番号98)並びに(ii)プライマーhROR2_A245T_F(gcgacgcgcgctcccggacacccaagccgcgtgagc)(配列番号99)及びhROR2ECD_R(agctctcgagtcaccccatcttgctgctgtctcggggactacacgagg)(配列番号100)でPCR増幅した。続いて、フランキングプライマーhROR2ECD_F及びhROR2ECD_Rを用いたオーバーラップ伸長PCRにより、全ROR2 ECD(アミノ酸55〜394)をアセンブルしてから、HindIII/XhoIを介したpCEP4−hFc(Hofer et al.,2008)にクローニングした。得られたpCEP4−hFc−hROR2の構築物を、293フェクチン(Invitrogen)及び製造者のプロトコルに詳述される条件を用いて、HEK293F細胞(Invitrogen)に一過性にトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞をFreeStyle無タンパク質培地(Invitrogen)中で培養し、hFc−hROR2融合タンパク質を上清からプロテインAアフィニティクロマトグラフィーにより精製した。精製したhFc−hROR2を、Biotin−Tag Micro Biotinylationキット(Sigma−Aldrich)を用いてビオチン化した。手短には、50μLの0.1Mリン酸ナトリウムバッファー(pH7.2)中300μgのhFc−hROR2を1μLの5mg/mLビオチンアミドヘキサン酸3−スルホ−N−ヒドロキシスクシニドエステルと一緒に、穏やかに攪拌しながら、室温で30分間インキュベートした。キットにより供給されるMicroSpin G−50カラムを用いて、ビオチン化hFc−hROR2を単離した。
組換えヒトROR1(hROR1−His)及びヒトROR2(hROR2−His)タンパク質の構築、発現、及び精製:hROR1−Hisは、テンプレートとしてpCEP4−hFc−hROR1(Yang et al.,2011)を用い、プライマーSP−hROR1_F(5’gctgggtaccggcgcgccaccatggactggacttggagaatcctgtttctcgtagctgctgcaactggagcacactccgcccggggcgccgccgcccag3’)(配列番号101)及びhROR1−His_R(5’ cggcctcgagtcagtgatggtgatggtggtgctccatcttgttcttctcctt 3’)(配列番号102)でPCR増幅し、hROR2−Hisは、テンプレートとしてpCEP4−hFc−hROR2を用い、プライマーSP−hROR2_F(gctgggtaccggcgcgccaccatggactggacttggagaatcctgtttctcgtagctgctgcaactggagcacactccgaagtggaggttctggatccg)(配列番号103)及びhROR2−His_R(cggcctcgagtcagtgatggtgatggtggtgccccatcttgctgctgtctcg)(配列番号104)でPCR増幅した。KpnI/XhoIを介して個別にpCE4(Invitrogen)にクローニングした後、これらの構築物を、293フェクチン(Invitrogen)を用いてHEK293F細胞(Invitrogen)に一過性にトランスフェクトし、記載されている(Kwong and Rader,2009)通りに、1−mL HisTrapカラム(GE Healthcare)を用いたImmobilized Metal Ion Affinity Chromatographyにより、対応する組換えタンパク質産物を精製した。精製したhROR1−His及びhROR2−Hisの品質及び量をSDS−PAGE及びA280吸光度によりそれぞれ分析した。
ナイーブキメラウサギ/ヒトFabライブラリーの作製及び選択:ウサギの取り扱いは全て、Pocono Rabbit Farm & Laboratory(Canadensis,PA)又はR&R Research(Stanwood,WA)の家畜担当職員により実施された。計9匹のウサギ(月齢3〜4ヵ月)を使用した。これらのウサギの5匹は、ニュージーランドホワイト(New Zealand White)(NZW)系統であり、そのうち3匹は、Pocono Rabbit Farm & Laboratory(Canadensis,PA)から取得し、2匹は、R&R Research(Stanwood,WA)から取得した。4匹のb9野生型ウサギは、米国立アレルギー・感染症研究所(National Institute of Allergy and Infectious Diseases)(NIAID)(McCartney−Francis et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U S A 81:1794−1798,1984;及びPopkov et al.,J.Mol.Biol.325:325−335,2003で開発され、特性決定された純種を起源とする個別のR&R Researchから得られた。各ウサギからの脾臓及び骨髄を収集し、確立されたプロトコル(Rader,Methods Mol Biol 525:101−128,xiv, 2009を用いて、全RNA作製並びにウサギVκ、Vλ、及びVHコード配列のRT−PCR増幅のために処理した。ウサギ(rb)Vκ/ヒト(hu)Cκ/rbVH及びrbVλ/huCλ/rbVHセグメントは、それぞれ、3フラグメントオーバーラップ発現PCRに基づく1融合ステップでアセンブルした。b9ウサギに由来するVLも、NZWウサギ由来のVHを用いてアセンブルしたことに留意されたい。FabコードフラグメントをSfiIで消化し、SfiI処理ファージディスプレイベクターpC3C(Hofer et al.,J Immunol Meth 318:75−87,2007)と16℃で24時間連結した。続いて、30回の個別のエレクトロポレーション(各々、50μlのエレクトロコンピテントセル中0.5μgのDNAを用いる)により、15μgの精製pC3C−rbVκ/hCκ/rbVH連結産物を大腸菌(E.coli)株SR320(トロント大学(University of Toronto, Toronto,Ontario,Canada)Dr.Sachdev S.Sidhuからの親切な寄贈品)に形質転換し、ライブラリーκについて7.5×109個の独立した形質転換体を取得した。ライブラリーλの場合、同じ手順を用いて、4.8×109個の独立した形質転換体が得られた。VCSM13ヘルパーファージ(Stratagene;La Jolla,CA)を用いて、ファージミドライブラリーをファージライブラリーに変換し、−80℃で保存した。XL1−Blue(Stratagene)又はER2738(Lucigen)を用いて、ファージライブラリーκ及びライブラリーλを再度増幅し、同様に混合した後、ビオチン化hFc−hROR2に対する4ラウンドのパニングに付した。パニングの間、5μg/mLの抗原をストレプトアビジンコート磁気ビーズ(Dynabeads MyOne Streptavidin C1;Invitrogen)と一緒に37℃で30分間プレインキュベートした後、1mg/mLの非特異的ポリクローナルヒトIgG(Thermo Scientific)の存在下で、ファージライブラリーからの結合物質を捕捉した。第3ラウンドのパニングから、空のビーズを用いたインキュベーションにより、インプットファージをネガティブディプリーションした後、抗原負荷ビーズに対する選択に付した。選択の後、IPTG誘導細菌クローンの上清をELISA及びフローサイトメトリーにより分析した。AluIを用いたDNA指紋法により反復クローンを同定し、ユニークなクローンのVL及びVH配列をDNAシーケンシングにより決定した(図1)。
実施例3.キメラウサギ/ヒトFab及び完全長IgG1抗体の発現及び精製
キメラウサギ/ヒトFab及びIgG1の構築、発現及び精製:キメラウサギ/ヒトFabフォーマットのMAb:XBR2−401、XBR2−416、及びXBR2−433は、大腸菌(E.coli)発現プラスミドpC3C−Hisにクローニングして、発現させた後、記載されているように(Kwong and Rader,2009)精製した。キメラウサギ/ヒトIgG1フォーマットのmAb:XBR2−401、XBR2−416、及びXBR2−433の発現のために、以前記載されているベクターPIGG−R11を使用した(Yang et al.,2011)。発現に使用した様々なプライマー配列を表1に示す。Fab:XBR2−401、XBR2−416、及びXBR2−433のVHコード配列を、プライマー4−1_VH_F及び4−1_VH_R、4−16_VH_F及び4−16_VH_R、並びに4−33_VH_F及び4−33_VH_Rをそれぞれ用いてPCR増幅した後、ApaI/SacIを介してPIGG−R11にクローニングした。次に、Fab4−1、4−16、及び4−33の軽鎖コード配列を、それぞれ、プライマー4−1_κ_F、4−16_κ_F、及び4−33_λ_Fを、LEAD−Bと組み合わせて用いて、PCR増幅した後、HindIII/XbaIを介して、対応する重鎖コード配列を有するPIGG−R11にクローニングした。Fab XBR2−401のVHコード配列のFR4の内部ApaI部位は、プライマー4−1_VH_Rにおけるサイレント突然変異によって除去されたことに留意されたい。さらに、XBR2−416、及びXBR2−433について、大腸菌(E.coli)株XL1−Blueにおける選択の間に抑制されていたTAG停止コドンは、プライマー4−16_VH_F及び4−33_VH_Fを用いて、XBR2−416、及びXBR2−433両方のネイティブVHの第1アミノ酸をコードするCAG(グルタミン)に変更した(図1)。得られたPIGG−XBR2−401、PIGG−XBR2−416、及びPIGG−XBR2−433プラスミドは、293フェクチン(Invitrogen)を用いて、HEK293F細胞(Invitrogen)に一過性にトランスフェクトし、記載されているように(Yang et al.,2011;Yang and Rader,2012)、1mL組換えProtein A HiTrapカラム(GE Healthcare,Piscataway,NJ)を用いて、対応するタンパク質産物を精製した。精製したIgG1の品質及び量をSDS−PAGE及びA280吸光度によりそれぞれ分析した。
キメラウサギ/ヒトFab及びIgG1の構築、発現及び精製:キメラウサギ/ヒトFabフォーマットのMAb:XBR2−401、XBR2−416、及びXBR2−433は、大腸菌(E.coli)発現プラスミドpC3C−Hisにクローニングして、発現させた後、記載されているように(Kwong and Rader,2009)精製した。キメラウサギ/ヒトIgG1フォーマットのmAb:XBR2−401、XBR2−416、及びXBR2−433の発現のために、以前記載されているベクターPIGG−R11を使用した(Yang et al.,2011)。発現に使用した様々なプライマー配列を表1に示す。Fab:XBR2−401、XBR2−416、及びXBR2−433のVHコード配列を、プライマー4−1_VH_F及び4−1_VH_R、4−16_VH_F及び4−16_VH_R、並びに4−33_VH_F及び4−33_VH_Rをそれぞれ用いてPCR増幅した後、ApaI/SacIを介してPIGG−R11にクローニングした。次に、Fab4−1、4−16、及び4−33の軽鎖コード配列を、それぞれ、プライマー4−1_κ_F、4−16_κ_F、及び4−33_λ_Fを、LEAD−Bと組み合わせて用いて、PCR増幅した後、HindIII/XbaIを介して、対応する重鎖コード配列を有するPIGG−R11にクローニングした。Fab XBR2−401のVHコード配列のFR4の内部ApaI部位は、プライマー4−1_VH_Rにおけるサイレント突然変異によって除去されたことに留意されたい。さらに、XBR2−416、及びXBR2−433について、大腸菌(E.coli)株XL1−Blueにおける選択の間に抑制されていたTAG停止コドンは、プライマー4−16_VH_F及び4−33_VH_Fを用いて、XBR2−416、及びXBR2−433両方のネイティブVHの第1アミノ酸をコードするCAG(グルタミン)に変更した(図1)。得られたPIGG−XBR2−401、PIGG−XBR2−416、及びPIGG−XBR2−433プラスミドは、293フェクチン(Invitrogen)を用いて、HEK293F細胞(Invitrogen)に一過性にトランスフェクトし、記載されているように(Yang et al.,2011;Yang and Rader,2012)、1mL組換えProtein A HiTrapカラム(GE Healthcare,Piscataway,NJ)を用いて、対応するタンパク質産物を精製した。精製したIgG1の品質及び量をSDS−PAGE及びA280吸光度によりそれぞれ分析した。
キメラウサギ/ヒトFabフォーマット中の他の全てのmAbを大腸菌(E.coli)発現プラスミドpET11aにクローニングして、発現させ、記載されているように(Kwong and Rader,2009)精製した。キメラウサギ/ヒトIgG1フォーマットのmAb:ERR2−302、ERR2−308、ERR2−317、XBR2−327及びXBR2−TOP72の発現のために、pCEP4(Invitrogen)を用いて、重鎖及び軽鎖を個別にクローニングした。重鎖の場合、重鎖シグナルペプチドコード配列を含むgBlock、ERR2−302のVH及びヒトIgG1のCH1(1〜49)をIDT(San Jose,CA)により合成し、プライマーKpnI/AscI−シグナル及びCH1−内部/オーバーラップ−Rを用いて増幅して、プライマーCH1−内部/オーバーラップ−F及びHC−CH3−R−XhoIを用いてPIGGから増幅されたCH1(50〜88)−CH2−CH3と、プライマーKpnI/AscI−シグナル及びHC−CH3−R−XhoIを用いたオーバーラップ伸長PCRにより融合した後、AscI/XhoIによりpCEP4にクローニングした。gBLOCKを合成したとき、NheI部位は、同義突然変異によってAla12のCH1に導入されたことに留意されたい。この構築物は、AscI/NheIを用いてVHを置換することにより、他のmAb重鎖をクローニングするためのベクターとして役立ち:ERR2−308、ERR2−317、XBR2−327及びXBR2−TOP72のVHを、フォワードプライマーERR2−308 HC−F、ERR2−317 HC−F、XBR2−327 HC−F及びERR2−308 HC−F並びにリバースプライマーVH−CH1−R−EheIで個別に増幅した後、伸長PCRにより、プライマーKpnI/AscI−シグナル及びVH−CH1−R−EheIを含むシグナルペプチドを付加した。次に、AscI/NheIにより、各VHをベクターに挿入した。軽鎖のクローニングのために、ERR2−302及びXBR2−TOP72のλ軽鎖は、プライマーLC−R−Xholと個別に組み合わせたプライマーERR2−302 LC−F及びXBR2−TOP72 LC−Fで増幅し、ERR2−308、ERR2−317及びXBR2−327のκ鎖は、プライマーKC−R−XhoIとそれぞれ個別に組み合わせたプライマーERR2−308 KC−F、ERR2−317 KC−F、及びERR2−317 KC−Fで増幅した。次に、フォワードプライマーKpnI/AscI−シグナル及びリバースプライマーLC−R−XhoI又はKC−R−XhoIを用いた伸長PCRにより、シグナルペプチドを付加した。続いて、各軽鎖PCR産物をAscI/XhoIによりpCEP4にクローニングした。各IgGについて重鎖又は軽鎖を含む、得られた構築物は、293フェクチン(Invitrogen)を用いてHEK293F細胞(Invitrogen)に一過性に同時トランスフェクトし、記載されているように(Yang et al.,2011;Yang and Rader,2012)、1mL組換えProtein A HiTrapカラム(GE Healthcare,Piscataway,NJ)を用いて、対応する組換えタンパク質産物を精製した。精製したIgG1の品質及び量をSDS−PAGE及びA280吸光度によりそれぞれ分析した。
実施例4.抗体結合活性の試験
ELISA:ROR2抗体の結合特性をELISAにより調べた。コーティングのために、96ウェルCostar3690プレート(Corning,Corning,NY)の各ウェルを25μLのコーティングバッファー(0.1M Na2CO3、0.1M NaHCO3、pH9.6)中100ngの抗原と一緒に37℃で1時間インキュベートした。150μLの3%(w/v)BSA/TBSで、37℃にて1時間遮断してから、100ng/50μLのFabを添加し、37℃で2時間インキュベートした後、150μLのPBSで10回洗浄し、1%(w/v)BSA/TBS中のセイヨウワサビペルオキシダーゼ(HRP)(R&D Systems,Minneapolis,MN)に結合させたマウス抗HisタグmAbの1:1000希釈物50μLと一緒に37℃で1時間インキュベートした。PBSによる洗浄を繰り返してから、基質として2,2’−アジノ−ビス(3−エチルベンズチアゾリン)−6−スルホン酸(Roche)を用いて、製造者の指示に従い、比色検出を実施した。図2Aに示すように、SpectraMax M5マイクロプレートリーダ(Molecular Devices;Sunnyvale,CA)及びSoftMax Proソフトウエア(Molecular Devices)を用いて、吸光度を405nmで測定した。
ELISA:ROR2抗体の結合特性をELISAにより調べた。コーティングのために、96ウェルCostar3690プレート(Corning,Corning,NY)の各ウェルを25μLのコーティングバッファー(0.1M Na2CO3、0.1M NaHCO3、pH9.6)中100ngの抗原と一緒に37℃で1時間インキュベートした。150μLの3%(w/v)BSA/TBSで、37℃にて1時間遮断してから、100ng/50μLのFabを添加し、37℃で2時間インキュベートした後、150μLのPBSで10回洗浄し、1%(w/v)BSA/TBS中のセイヨウワサビペルオキシダーゼ(HRP)(R&D Systems,Minneapolis,MN)に結合させたマウス抗HisタグmAbの1:1000希釈物50μLと一緒に37℃で1時間インキュベートした。PBSによる洗浄を繰り返してから、基質として2,2’−アジノ−ビス(3−エチルベンズチアゾリン)−6−スルホン酸(Roche)を用いて、製造者の指示に従い、比色検出を実施した。図2Aに示すように、SpectraMax M5マイクロプレートリーダ(Molecular Devices;Sunnyvale,CA)及びSoftMax Proソフトウエア(Molecular Devices)を用いて、吸光度を405nmで測定した。
フローサイトメトリー:抗体の抗原結合特性は、フローサイトメトリー分析によっても調べた。具体的には、標準的なフローサイトメトリー方法を用いて、細胞を染色した。手短には、精製済の抗ROR2Fabの場合、0.1〜1×106個の細胞を氷上の1μg/100μLのFabで1時間かけて染色した。氷冷フローサイトメトリーバッファー(1%(v/v)BSA、0.1%アジ化ナトリウム及び1mM EDTAを含有するPBS)で2回洗浄した後、氷上の100μLフローサイトメトリーバッファー中のAlexa Fluor 488(Qiagen)と結合したマウス抗HisタグmAbの1:1000希釈物と一緒に、30分かけて細胞をインキュベートした。精製済の抗ROR2IgG1の場合、0.1〜1×106個の細胞を100ng/100μLのIgGと一緒に氷上で1時間インキュベートした。氷冷フローサイトメトリーバッファーで2回洗浄した後、氷上の100μLフローサイトメトリーバッファー中のAPC(Jackson ImmunoResearch)と結合したヤギ抗ヒトIgG、Fcγ pAbの1:500希釈物で、30分かけて細胞を染色した。最後に、分析から死滅細胞を排除するために、4’,6−ジアミジノ−2−フェニルインドール(DAPI)を最終濃度100ng/mLまで添加した。FACSCalibur計器(BD Biosciences)及びFlowJo分析ソフトウエア(Tree Star,Ashland,OR)を用いて、細胞を分析した。試験の結果を図2B、図4〜8、及び図11に示す。
単離した抗体の交差反応性及びエピトープマッピングを調べるために、別の試験を実施した。これらの試験では、145にThr(hROR2−T245)(55〜394)を有するヒトROR2及びより低頻度のSNP hROR2−A245(55〜394)を有するヒトROR2、並びにマウスROR2(34〜403)の細胞外ドメインを、HAタグ(YPYDVPDYAS)と、膜貫通ドメイン(アミノ酸533〜553)を含むPDGFRBセグメント(アミノ酸513〜561)が続く(G4S)3リンカーに個別に融合させ、HEK293F細胞上に安定して展示させた(図3)。次に、hROR2−T245、hROR2−A245、及びmROR2に対するキメラウサギ/ヒトFabフォーマット中の全てのmAbの交差反応性を、これらの細胞を用いたフローサイトメトリーにより試験した(図4)。同様に、hROR2−T245の3つの細胞外ドメインの様々な組成物、Ig(アミノ酸55〜145)、Fr(169〜303)、Ki(316〜394)Ig+Fr(55〜303)、Fr+Ki(169〜394)も、HEK293細胞上に個別に安定して展示させた(図3)。これらのROR2ドメイン展示細胞株を使用し、フローサイトメトリーにより、キメラウサギ/ヒトIgGを用いて、mAb:XBR2−401(図5)、XBR2−433(図6)、及びXBR2−416(図7)のエピトープを決定した。手短には、0.1〜1×106個の細胞を精製済(1μg/mL)のキメラウサギ/ヒトIgGと一緒に、氷上で1時間インキュベートした。氷冷フローサイトメトリーバッファー(1%(v/v)BSA、0.1%アジ化ナトリウム及び1mM EDTAを含有するPBS)で2回洗浄した後、100μlのフローサイトメトリーバッファー中のAPC(Jackson ImmunoResearch)と結合したヤギ抗ヒトIgG、Fcγ pAbの1:500希釈物と一緒に氷上で30分間細胞をインキュベートした。氷冷フローサイトメトリーバッファーで2回洗浄した後、100μlのフローサイトメトリーバッファー中のビオチン化ラット抗HAmAb 3F10(Roche)の1:500希釈物と一緒に氷上で1時間細胞をインキュベートし、前回と同様に洗浄した後、2μg/mLのPE結合ストレプトアビジン(BD Bioscience)により氷上で30分間染色した。分析から死滅細胞を排除するために、DAPIを最終濃度100ng/mLまで添加した。他のmAbのエピトープは全て、前述したものと同じ手順のフローサイトメトリーにより、キメラウサギ/ヒトFabを用いて決定した。FACSCalibur計器(BD Biosciences)及びFlowJo分析ソフトウエア(Tree Star,Ashland,OR)を用いて、細胞を分析した。
表面プラズモン共鳴:さらに、hFc−hROR2に対する全Fabの親和性を測定するために表面プラズモン共鳴試験を実施し、Biacore試薬及びソフトウエアを用いたBiacore X100計器(GE Healthcare,Piscataway,NJ)でエピトープマッピング試験を実施した。Human Antibody Capture Kit(GE Healthcare,Piscataway,NJ)の指示に従い、抗ヒトIgG(Fc)抗体をCM5センサーチップ上に固定化した。次に、hFc−hROR2融合タンパク質を特定の密度(図9及び図10Bに示す)で捕捉した。各センサーチップは、即座のバックグラウンド除去のために空のフローセルを含んだ。全結合アッセイは、1×HBS−EP+泳動バッファー(10mM HEPES、150mM NaCl、3mM EDTA(pH7.4)、及び0.05%(v/v)Surfactant P20)及び流量30mL/分を用いた。親和性測定のために、全てのFabを5つの異なる濃度(希釈係数は2)で注射し、そのうちの1つは2回反復して試験した(各Fabの最も高い濃度を図10Bに示す)。センサーチップは、結合能力を一切喪失することなく、Human Antibody Capture Kitから3M MgCl2を用いて再生した。会合(kon)及び解離(koff)速度定数の計算は、1:1ラングミュア(Langmuir)結合モデルに基づいて行った。平衡解離定数(KD)をkoff/konから算出した。エピトープマッピング試験のために、図9に示す順で、各Fabを1×HBS−EP+泳動バッファー中に、500nMの単独で、又は混合物として調製し、注射した。
ウエスタンブロッティング:変性ROR2ポリペプチドに対する、単離された抗体の結合活性を調べるために、ウエスタンブロッティングアッセイを実施した。1×サンプルバッファー(1%β−メルカプトエタノールを含有)により、細胞又はタンパク質を溶解させ、NuPAGE Novex4−12%Bis−Trisゲル(Invitrogen)上での泳動の前に煮沸した。膜転写及び5%ミルクによる遮断の後、2μg/mLのキメラウサギ/ヒトIgG1 XBR2−401を塗布して、変性タンパク質を検出し、続いて、HRPに結合した1/1000抗ヒトFcとのインキュベーションの後、ECL Prime Western Blotting Detection Reagent(GE Healthcare)を用いて展開させた。図12に示すように、結果から、抗体が、実際に変性hROR2を認識することがわかる。
実施例5.精製、組換えツインストレップタグ付き(twin strep−tagged)ヒト、マウス及びカニクイザルROR2の発現
ツインストレップタグ付きヒト、マウス及びカニクイザルROR2−細胞外ドメインを次のように生成した:ヒトROR2(NP_004551.2)、マウスROR2(NP_038874.3)及びカニクイザルROR2(XP_005582291.1)の細胞外ドメインをコードするヌクレオチド配列を各々、シグナル配列(MNFGLRLIFLVLTLKGVQC)とN末端に融合させ、ツインストレップタグ(SAWSHPQFEKGGGSGGGSGGSAWSHPQFEKG)をコードする配列とC末端に融合させた。全遺伝子合成(GenScript,Piscataway,USA)により、フランキングする5’NotI及び3’HindIII部位を有する全ヌクレオチド配列を生成し、哺乳動物発現ベクターpCB14中にアセンブルして、DNAシーケンシングにより確認した。このベクター、すなわち、エピソーム哺乳動物発現ベクターpCEP4(Invitrogen)の誘導体は、EBV複製起点を担持し、染色体外複製を可能にするためにEBV核抗原(EBNA−1)をコードし、元のヒグロマイシンB耐性遺伝子の代わりに、プロマイシン選択マーカを含有する。
ツインストレップタグ付きヒト、マウス及びカニクイザルROR2−細胞外ドメインを次のように生成した:ヒトROR2(NP_004551.2)、マウスROR2(NP_038874.3)及びカニクイザルROR2(XP_005582291.1)の細胞外ドメインをコードするヌクレオチド配列を各々、シグナル配列(MNFGLRLIFLVLTLKGVQC)とN末端に融合させ、ツインストレップタグ(SAWSHPQFEKGGGSGGGSGGSAWSHPQFEKG)をコードする配列とC末端に融合させた。全遺伝子合成(GenScript,Piscataway,USA)により、フランキングする5’NotI及び3’HindIII部位を有する全ヌクレオチド配列を生成し、哺乳動物発現ベクターpCB14中にアセンブルして、DNAシーケンシングにより確認した。このベクター、すなわち、エピソーム哺乳動物発現ベクターpCEP4(Invitrogen)の誘導体は、EBV複製起点を担持し、染色体外複製を可能にするためにEBV核抗原(EBNA−1)をコードし、元のヒグロマイシンB耐性遺伝子の代わりに、プロマイシン選択マーカを含有する。
組換えヒトツインストレップタグ付きROR2(NP_004551.2)、マウスツインストレップタグ付きROR2(NP_038874.3)、及びカニクイザルツインストレップタグ付きROR2(XP_005582291.1)を下記のプロトコルに従って発現させ、実験室内で精製した:TwinStrepタグでC末端がタグ付けされ、ROR2細胞外ドメイン(ECD)の発現を指令するEBNA発現ベクターpCB14b−ROR2−ECD−TwinStrep(ヒトROR2)、pCB14g−マウスROR2−ECD−TwinStrep(マウスROR2)又はpCB14b−カニクイザルROR2−ECD−TwinStrep(カニクイザルROR2)を、PLUS(商標)Reagent(Thermo Fisher Scientific,15388100)と共にLipofectamine(登録商標)LTXを用いて、HEK293Tにトランスフェクトした。1日のインキュベーション(37℃、5%CO2、増殖培地:10%(v/v)ウシ胎児血清(FCS)を含むL−グルタミン、100IU/mLのPen−Strep−Fungizone及び2mM L−グルタミン(全て、Bioconcept)を含有するダルベッコ改変イーグル培地(Dulbecco’s Modified Eagle Medium)(DMEM)High Glucose(4.5g/l))の後、細胞を選択条件(2μg/mLのプロマイシン(Sigma−Aldrich、2mg/mLのP8833−25mgストック))下で拡大した。細胞を分割して、さらに拡大し(37℃、5%CO2);一旦密集に達したら、組織培養皿を20μg/mLのポリ−L−リシン(Sigma−Aldrich、P1524)で、37℃にて2時間コーティングし、PBSで2回洗浄した。次に、細胞をトリプシン処理し、PBSで洗浄した後、ポリ−L−リシンコーティングプレート上に1:3に分割した。再度、密集に達した後、細胞をPBSで洗浄してから、1μg/mLのプロマイシン(Sigma−Aldrich、P8833)、100IU/mLのPen−Strep−Fungizone(Bioconcept、4−02F00−H)、161μg/mLのN−アセチル−L−システイン(Sigma−Aldrich、A8199)及び10μg/mLのL−グルタチオン還元型(Sigma−Aldrich、G6529)で補充した生成培地(DMEM/F−12,Gibco/Thermo Fisher Scientific,31330−03)を用いて培地の取替えを行った。上清を隔週で回収し、濾過する(0.22μm)ことにより細胞を除去して、精製まで4℃で保存した。精製のために、濾過した上清をStreptactin(登録商標)Superflow(登録商標)高容量カートリッジ(IBA,Goettingen,Germany,2−1238−001)カラムにロードし;AEKTA pure(GE Healthcare)で、製造者のプロトコルに従い、精製及び溶離を実施した。SDS−PAGEにより、タンパク質純度及び完全性について画分を分析した。タンパク質含有画分を混合し、Amicon濾過ユニット(Millipore,Schaffhausen,Switzerland)を用いて、PBS中≧1:100の希釈率に達するまでバッファー交換に付した後、ローリテンションフィルタ(0.20μm,Carl Roth,Karlsruhe,Germany,PA49.1)を用いて滅菌濾過した。
実施例6.精製、組換え抗ヒトROR2及びアイソタイプコントロール抗体の発現
発現ベクター:リーダ配列としてMNFGLRLIFLVLTLKGVQCを用いた全遺伝子合成(GenScript)によって抗体可変領域コード領域を生成し、発現ベクターpCB14において、ヒトIgH−γ及びIgL−κ(ERR2−308、ERR2−316、ERR2−317、XBR2−327、Huluc63)又はIgL−λ(ERR2−302、ERR2−Top35)定常領域とアセンブルした。
発現ベクター:リーダ配列としてMNFGLRLIFLVLTLKGVQCを用いた全遺伝子合成(GenScript)によって抗体可変領域コード領域を生成し、発現ベクターpCB14において、ヒトIgH−γ及びIgL−κ(ERR2−308、ERR2−316、ERR2−317、XBR2−327、Huluc63)又はIgL−λ(ERR2−302、ERR2−Top35)定常領域とアセンブルした。
完全長重鎖及び軽鎖の各々をコードする発現ベクターは、独自の哺乳動物発現ベクター(スイス国)にアセンブルした。当技術分野で公知の方法により、抗体をCHO細胞に一過性に発現させ、組換え抗体を、当技術分野で公知のように、標準プロテインA精製によりCHO細胞上清から精製した。手短には、CHO細胞上清を遠心分離により回収し、滅菌濾過(0.2μm)した後、以下に記載するように、AmphereプロテインAカラム(JSR Life Sciences)を用いたFPLCによるアフィニティクロマトグラフィーを実施した。
実験室内発現及び精製:PLUS(商標)Reagent(Thermo Fisher Scientific,Reinach,Switzerland,15388100)と共にLipofectamine(登録商標)LTX Reagentを用いて、pCB14ベースの発現ベクターをHEK293T細胞にトランスフェクトした。1日のインキュベーション(37℃、5%CO2、増殖培地:10%(v/v)ウシ胎児血清(FCS)を含むL−グルタミン、100IU/mLのPen−Strep−Fungizone及び2mM L−グルタミン(全て、Bioconcept,Allschwil,Switzerland)を含有するダルベッコ改変イーグル培地(Dulbecco’s Modified Eagle Medium)(DMEM)High Glucose(4.5g/l))の後、細胞を選択条件(2μg/mLのプロマイシン(Sigma−Aldrich,Buchs SG,Switzerland、2mg/mLのP8833−25mgストック))下で拡大した。細胞を分割し、さらに拡大した(37℃、5%CO2);一旦密集に達したら、組織培養皿を20μg/mLのポリ−L−リシン(Sigma−Aldrich、P1524)で、37℃にて2時間コーティングし、PBSで2回洗浄した。次に、細胞をトリプシン処理し、ポリ−L−リシンでコーティングしたプレート上に1:3に分割した。再度、密集に達した後、細胞をPBSで洗浄してから、1μg/mLのプロマイシン(Sigma、P8833)、100IU/mLのPen−Strep−Fungizone(Bioconcept)、161μg/mLのN−アセチル−L−システイン(Sigma−Aldrich、A8199)及び10μg/mLのL−グルタチオン還元型(Sigma−Aldrich、G6529)で補充した生成培地(DMEM/F−12,Gibco/Thermo Fisher Scientific,31330−03)への培地の取替えを行った。上清を隔週で回収し、濾過する(0.22μm)ことにより細胞を除去して、精製まで4℃で保存した。
精製のために、濾過した上清をPBS平衡Protein A HiTrapカラム(GE Healthcare,Frankfurt am Main,Germany,17−0405−01)又はJSR Amsphere(商標)Protein Aカラム(JSR Life Sciences,Leuven,Belgium,JWT203CE)にロードし、PBSで洗浄し;AEKTA pure(GE Healthcare)で、0.1Mグリシン(pH2.5)を用いて、溶離を実施した。1M Tris−HClバッファー(pH8.0)で画分を直ちに中和してから、SDS−PAGEにより、タンパク質純度及び完全性について分析した。タンパク質含有画分を混合し、Amicon濾過ユニット(Millipore,Schaffhausen,Switzerland,UFC901008)を用いて、表2に列記するバッファー中で1:100の希釈率に達するまでバッファー交換に付した後、ローリテンションフィルタ(0.20μm,Carl Roth,Karlsruhe,Germany,PA49.1)を用いて滅菌濾過した。
表2は、後の実施例で使用する抗体を、それらの最終濃度及びバッファーと共に列記する。
Huluc63は、非関連コントロール抗体に相当し;重鎖及び軽鎖を以下に記載する。
実施例7.マウス及びカニクイザルROR2に対する抗ヒトROR2抗体の交差反応性
96ウェルプレートの各ウェルを、0.1M重炭酸塩コーティングバッファー(pH9.6)中2μg/mLのツインストレップタグ付きヒト、マウス又はカニクイザルROR2(実施例4から)50μLでコーティングした後、4℃で12時間インキュベートした。別の96ウェルプレートも、抗ヒトFc(Jackson ImmunoResearch,109−006−008)を用いた以外は、同様に調製した。37℃にて、150μLの3%(w/v)ウシ血清アルブミン(BSA)/TBSで1時間遮断してから、下記の抗体を0.5μg/mLの濃度で各プレートのウェルに添加し、1%(w/v)BSA/TBSで連続的に希釈(希釈係数4)した後、37℃で1時間のインキュベーションに付した:ERR2−302(mAb004)、ERR2−308(mAb037)、ERR2−316(mAb0005)、ERR2−317(mAb006)、XBR2−327(mAb007)、ERR2−Top35(mab130)、及びXBR2−401(mab003)。0.05%Tween 20を含むPBSで洗浄した後、HRPに結合したF(ab’)2抗ヒトFCγ(Jackson Immunoresearch,109−036−008)を1:10,000の希釈率で、ウェル当たり50μl添加し、37℃で1時間インキュベートした後、Spark 10Mプレートリーダ(Tecan)を用いた検出に付した。Graphpad Prism Software(Graphpad Software,La Jolla,CA,U.S.A.)を用いて、抗体濃度(ng/mL)に対するOD490nmの曲線を当てはめた。Prism Softwareの組み込み「ログ(阻害剤)対応答−可変傾き(4つのパラメータ)」IC50決定関数を用いて決定したIC50値を、ヒト及びマウスROR2については表3に、またヒト及びカニクイザルROR2については表4に報告する。図14に示すように、抗ヒトROR2抗体ERR2−302及びERR2−Top35は、ヒトROR2(パネルA、C)及びマウスROR2(パネルB)に結合し;残りは、マウスROR2と交差反応性ではない。しかしながら、本発明の抗ヒトROR2抗体の全てが、カニクイザルROR2と交差反応性である(パネルD)。
96ウェルプレートの各ウェルを、0.1M重炭酸塩コーティングバッファー(pH9.6)中2μg/mLのツインストレップタグ付きヒト、マウス又はカニクイザルROR2(実施例4から)50μLでコーティングした後、4℃で12時間インキュベートした。別の96ウェルプレートも、抗ヒトFc(Jackson ImmunoResearch,109−006−008)を用いた以外は、同様に調製した。37℃にて、150μLの3%(w/v)ウシ血清アルブミン(BSA)/TBSで1時間遮断してから、下記の抗体を0.5μg/mLの濃度で各プレートのウェルに添加し、1%(w/v)BSA/TBSで連続的に希釈(希釈係数4)した後、37℃で1時間のインキュベーションに付した:ERR2−302(mAb004)、ERR2−308(mAb037)、ERR2−316(mAb0005)、ERR2−317(mAb006)、XBR2−327(mAb007)、ERR2−Top35(mab130)、及びXBR2−401(mab003)。0.05%Tween 20を含むPBSで洗浄した後、HRPに結合したF(ab’)2抗ヒトFCγ(Jackson Immunoresearch,109−036−008)を1:10,000の希釈率で、ウェル当たり50μl添加し、37℃で1時間インキュベートした後、Spark 10Mプレートリーダ(Tecan)を用いた検出に付した。Graphpad Prism Software(Graphpad Software,La Jolla,CA,U.S.A.)を用いて、抗体濃度(ng/mL)に対するOD490nmの曲線を当てはめた。Prism Softwareの組み込み「ログ(阻害剤)対応答−可変傾き(4つのパラメータ)」IC50決定関数を用いて決定したIC50値を、ヒト及びマウスROR2については表3に、またヒト及びカニクイザルROR2については表4に報告する。図14に示すように、抗ヒトROR2抗体ERR2−302及びERR2−Top35は、ヒトROR2(パネルA、C)及びマウスROR2(パネルB)に結合し;残りは、マウスROR2と交差反応性ではない。しかしながら、本発明の抗ヒトROR2抗体の全てが、カニクイザルROR2と交差反応性である(パネルD)。
実施例8.ヒト及びカニクイザルROR2に対する抗ヒトROR2抗体の結合親和性
ヒトROR2及びカニクイザルROR2に対する抗ROR2抗体の親和性の測定のための表面プラズモン共鳴をBiacore T200計器(GE Healthcare)で実施した。ヤギαヒトFcγ特異的IgG(Jackson ImmunoResearch,109−005−098)をCM5センサーチップ(GE Healthcare,BR−1005−30)上に共有結合によって固定化した。親和性の測定のために、精製済抗ヒトROR2抗体を使用した。全てのケースで、抗ROR2抗体を1×HBS−EP+泳動バッファー(10mM HEPES、150mM NaCl、3mM EDTA(pH7.4)、及び0.05%(v/v)Tween P20)で、7.5μg/mlまで希釈し、流量10μl/分で60秒捕捉した。ヒトROR2−TwinStrep又はカニクイザルROR2−TwinStrepを、200nM〜12.5nMの2倍連続希釈物を用いて、泳動バッファー中に希釈した。会合及び解離を流量30μl/分でそれぞれ120秒及び200秒間測定した。会合(kon)及び解離(koff)速度定数の計算は、1:1ラングミュア(Langmuir)結合モデルに基づいて行った。平衡解離定数(Kd)は、koff/konから算出した。値を表5に報告する。
ヒトROR2及びカニクイザルROR2に対する抗ROR2抗体の親和性の測定のための表面プラズモン共鳴をBiacore T200計器(GE Healthcare)で実施した。ヤギαヒトFcγ特異的IgG(Jackson ImmunoResearch,109−005−098)をCM5センサーチップ(GE Healthcare,BR−1005−30)上に共有結合によって固定化した。親和性の測定のために、精製済抗ヒトROR2抗体を使用した。全てのケースで、抗ROR2抗体を1×HBS−EP+泳動バッファー(10mM HEPES、150mM NaCl、3mM EDTA(pH7.4)、及び0.05%(v/v)Tween P20)で、7.5μg/mlまで希釈し、流量10μl/分で60秒捕捉した。ヒトROR2−TwinStrep又はカニクイザルROR2−TwinStrepを、200nM〜12.5nMの2倍連続希釈物を用いて、泳動バッファー中に希釈した。会合及び解離を流量30μl/分でそれぞれ120秒及び200秒間測定した。会合(kon)及び解離(koff)速度定数の計算は、1:1ラングミュア(Langmuir)結合モデルに基づいて行った。平衡解離定数(Kd)は、koff/konから算出した。値を表5に報告する。
実施例9.SMAC技術を用いた部位特異的結合ADCの作製
ソルターゼA酵素。黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)由来の組換え及びアフィニティ精製ソルターゼA酵素は、国際公開第2014140317A1号パンフレットに開示されているように、大腸菌(E.coli)から生成した。
ソルターゼA酵素。黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)由来の組換え及びアフィニティ精製ソルターゼA酵素は、国際公開第2014140317A1号パンフレットに開示されているように、大腸菌(E.coli)から生成した。
グリシン修飾毒素の作製。ペンタグリシン修飾PNU−159682誘導体を含むSMAC−technology(商標)結合ADCを作製するために、国際公開第2016102697号パンフレットに開示されているように、Gly5−EDA−PNU(図13B)を製造した。質量分析法及びHPLCによって、ペンタグリシン修飾PNU毒素のアイデンティティ及び純度を確認した。Gly5−修飾毒素は、HPLCクロマトグラムにおける単一ピークによって決定される通り、>95%の純度を示した。
ソルターゼ媒介性抗体結合。列記した結合バッファー中のグリシン修飾毒素[200μM]及び3μMソルターゼAと一緒に、LPETGタグ付きmAb[10μM]を25℃で3.5時間インキュベートすることによって、前述の毒素を表3に従い抗ROR2抗体に結合させた。これを、rProtein A GraviTrapカラム(BioRad)に通過させることによって、反応を停止した。5カラム体積の溶出バッファー(0.1MグリシンpH2.5、50nM NaCl)で、結合したコンジュゲートを溶離し、1カラム体積画分を、酸を中和するために25%v/v 1M HEPES pH8を含有するチューブに収集した。タンパク質含有画分をプールし、ZebaSpin脱塩カラムを用いて表7の製剤化バッファー中で製剤化した。
ADC解析学。Polymer Labs PLRP 2.1mm×5cm、0.05〜0.1%のTFA/H2Oと0.04〜0.1%のTFA/CH3CNとの間の25分の線形勾配を用いた1mL/分/80℃の5μmカラムランで実施した逆相クロマトグラフィーにより、DARを評価した。まず、pH8.0のDTTとの37℃、15分間のインキュベーションによりサンプルを還元した。逆相クロマトグラフィーにより決定されるDARを以下の表6にまとめる。
実施例10.野生型EMT−6及びROR2過剰発現EMT−6乳癌細胞に対する抗ROR2抗体ベースのADCのインビトロ細胞傷害性アッセイ
表5の抗ROR2 ADCの細胞傷害性を、野生型(WT)EMT−6及びヒトROR2を過剰発現するように操作されたEMT−6細胞(実施例1から)を用いて調べた。アイソタイプコントロールとして、Huluc−G5−PNU(adc101)を含んだ。
表5の抗ROR2 ADCの細胞傷害性を、野生型(WT)EMT−6及びヒトROR2を過剰発現するように操作されたEMT−6細胞(実施例1から)を用いて調べた。アイソタイプコントロールとして、Huluc−G5−PNU(adc101)を含んだ。
このために、ウェル当たり9.75×103個のWT EMT−6及びhROR2過剰発現EMT−6細胞を、10体積%のFCS、100IU/mLのPen−Strep−Fungizone及び2mM L−グルタミンで補充した75μLのDMEMを含む96ウェルプレート上に平板培養し(水を含有するエッジウェルを除く)、37℃にて、7.5%CO2雰囲気下の加湿したインキュベータ内で増殖させた。1日のインキュベーションの後、増殖培地中3.5倍連続希釈物を25μLの量でそれぞれのウェルに、各ADCを添加した(これにより、20μg/mL〜0.88ng/mlの最終ADC濃度が得られた)。さらに4日後、プレートをインキュベータから取り出し、室温に平衡させた。約30分後、各ウェルから50μLを取り出し、50μLのCellTiter−Glo(登録商標)2.0 Luminescent Solution(Promega,G9243)を各ウェルに添加した。750rpmで5分間のプレートの振盪に続いて、振盪なしで20分のインキュベーションの後、Tecan iControlプレートリーダで発光を測定した。Graphpad Prism Softwareを用いて、ADC濃度(ng/mL)に対する発光の曲線を当てはめた。Prism Softwareの組み込み「ログ(阻害剤)対応答−可変傾き(4つのパラメータ)」IC50決定関数を用いて決定したIC50値を表7に報告する。
図15は、表7のADCを用いたWT及びhROR2過剰発現EMT6細胞に対するインビトロ細胞殺傷アッセイの用量−応答曲線を示す。上の表及び図15によれば、本発明のADCは、ROR2発現状態に依存的な特異的殺傷を達成する。
実施例11.XBR2−401に基づく抗hROR2 CARを発現するCAR−T細胞の機能性評価
以前記載されている方法(Hudecek,M.,Lupo−Stanghellini,M.T.,Kosasih,P.L.,Sommermeyer,D.,Jensen,M.C.,Rader,C.,and Riddell,S.R.(2013)Receptor affinity and extracellular domain modifications affect tumor recognition by ROR1−specific chimeric antigen receptor T cells. Clin.Cancer Res.19,3153−3164)を用いて、XBR2−401ベースのCAR−T細胞を操作した。エクスビボ拡大一次ヒトCD8+CD62L+T細胞に、レンチウイルスにより、CD3ζ及び4−1BBシグナル伝達ドメイン、並びに短い若しくは長いスペーサを含有するXBR2−401 CARを形質導入した。形質導入したT細胞をFACSによりtEGFRを介して精製し、機能性アッセイの前日にそれらの表現型を評価した。CD8+純度は、97%〜99%の間で変動し、tEGFR発現は、95%〜99%の間で変動した。ROR2陽性又はROR2陰性ヒト乳癌細胞との72時間の同時培養後、CFSE染色CD8+CD62L+細胞をフローサイトメトリーにより分析したところ、XBR2−401の標的依存性増殖が判明した(図16;上のパネル)。ROR2陽性及びROR2陰性細胞との11時間の同時培養後、ルシフェラーゼを用いた細胞傷害性アッセイにより、選択的細胞傷害性を測定した(図16;下のパネル)。
以前記載されている方法(Hudecek,M.,Lupo−Stanghellini,M.T.,Kosasih,P.L.,Sommermeyer,D.,Jensen,M.C.,Rader,C.,and Riddell,S.R.(2013)Receptor affinity and extracellular domain modifications affect tumor recognition by ROR1−specific chimeric antigen receptor T cells. Clin.Cancer Res.19,3153−3164)を用いて、XBR2−401ベースのCAR−T細胞を操作した。エクスビボ拡大一次ヒトCD8+CD62L+T細胞に、レンチウイルスにより、CD3ζ及び4−1BBシグナル伝達ドメイン、並びに短い若しくは長いスペーサを含有するXBR2−401 CARを形質導入した。形質導入したT細胞をFACSによりtEGFRを介して精製し、機能性アッセイの前日にそれらの表現型を評価した。CD8+純度は、97%〜99%の間で変動し、tEGFR発現は、95%〜99%の間で変動した。ROR2陽性又はROR2陰性ヒト乳癌細胞との72時間の同時培養後、CFSE染色CD8+CD62L+細胞をフローサイトメトリーにより分析したところ、XBR2−401の標的依存性増殖が判明した(図16;上のパネル)。ROR2陽性及びROR2陰性細胞との11時間の同時培養後、ルシフェラーゼを用いた細胞傷害性アッセイにより、選択的細胞傷害性を測定した(図16;下のパネル)。
実施例12.XBR2−401の特異性分析
図18は、Retrogenix Cell Microarray Platformの概略を示す。一次スクリーン:ROR2をターゲティングする精製済キメラウサギ/ヒトIgG1 XBR2−401と、ROR1をターゲティングする精製済キメラウサギ/ヒトIgG1 XBR1−402を各々濃度2μg/mLまでプールした。4,336のヒト血漿膜タンパク質を個別に発現する固定HEK293細胞/スライドに対する結合について、プールをスクリーニングした(13スライドセット;n=2スライド/スライドセット)。トランスフェクション効率は全て、最小閾値を超えた。AlexaFluor647抗ヒトIgG Fc検出抗体を使用した。ImageQuantで蛍光(AlexaFluor647及びZsGreen1)を分析することによって、一次ヒット(重複スポット)を同定した。全ヒットをコードするベクターをシーケンシングすることにより、それらの正しいアイデンティティを確認した。確認スクリーン:全ヒットをコードするベクター、並びにコントロールベクターを新しいスライドに2回反復してスポットし、これらを用いて、前回と同様に、ヒトHEK293細胞をリバーストランスフェクトした。トランスフェクション効率は全て、最小閾値を超えた。同一の固定スライドを2つの試験抗体(XBR2−401及びXBR1−402)の各々で個別に処理し、さらにポジティブ及びネガティブコントロール(n=2スライド/処理)でも処理した。スライドを前述と同様に分析した(図18)。
図18は、Retrogenix Cell Microarray Platformの概略を示す。一次スクリーン:ROR2をターゲティングする精製済キメラウサギ/ヒトIgG1 XBR2−401と、ROR1をターゲティングする精製済キメラウサギ/ヒトIgG1 XBR1−402を各々濃度2μg/mLまでプールした。4,336のヒト血漿膜タンパク質を個別に発現する固定HEK293細胞/スライドに対する結合について、プールをスクリーニングした(13スライドセット;n=2スライド/スライドセット)。トランスフェクション効率は全て、最小閾値を超えた。AlexaFluor647抗ヒトIgG Fc検出抗体を使用した。ImageQuantで蛍光(AlexaFluor647及びZsGreen1)を分析することによって、一次ヒット(重複スポット)を同定した。全ヒットをコードするベクターをシーケンシングすることにより、それらの正しいアイデンティティを確認した。確認スクリーン:全ヒットをコードするベクター、並びにコントロールベクターを新しいスライドに2回反復してスポットし、これらを用いて、前回と同様に、ヒトHEK293細胞をリバーストランスフェクトした。トランスフェクション効率は全て、最小閾値を超えた。同一の固定スライドを2つの試験抗体(XBR2−401及びXBR1−402)の各々で個別に処理し、さらにポジティブ及びネガティブコントロール(n=2スライド/処理)でも処理した。スライドを前述と同様に分析した(図18)。
本明細書で引用する一部の追加文献を以下に挙げる。
Hofer,T.,W.Tangkeangsirisin,M.G.Kennedy,R.G.Mage,S.J.Raiker,K.Venkatesh,H.Lee,R.J.Giger,andC.Rader.2007.Chimeric rabbit/human Fab and IgG specific for members of the Nogo−66 receptor family selected for species cross−reactivity with an improved phage display vector.J Immunol Meth 318:75−87.
Hofer,T.,J.D.Thomas,T.R.Burke,Jr.,and C.Rader.2008.An engineered selenocysteine defines a unique class of antibody derivatives.Proc Natl Acad Sci U S a 105:12451−12456.
Kwong,K.Y.,S.Baskar,H.Zhang,C.L.Mackall,and C.Rader.2008.Generation,affinity maturation,and characterization of a human anti−human NKG2D monoclonal antibody with dual antagonistic and agonistic activity.J Mol Biol 384:1143−1156.
Kwong,K.Y.,and C.Rader.2009.E.coli expression and purification of Fab antibody fragments.Curr Protoc Protein Sci Chapter 6:Unit 6 10.
McCartney−Francis,N.,R.M.Skurla,Jr.,R.G.Mage,and K.E.Bernstein.1984.Kappa−chain allotypes and isotypes in the rabbit:cDNA sequences of clones encoding b9 suggest an evolutionary pathway and possible role of the interdomain disulfide bond in quantitative allotype expression.Proc Natl Acad Sci U S a 81:1794−1798.
Popkov,M.,R.G.Mage,C.b. Alexander,S.Thundivalappil,C.F.Barbas,3rd,and C.Rader.2003.Rabbit immune repertoires as sources for therapeutic monoclonal antibodies:the impact of kappa allotype−correlated variation in cysteine content on antibody libraries selected by phage display.J Mol Biol 325:325−335.
Rader,C.2009.Generation and selection of rabbit antibody libraries by phage display.Methods Mol Biol 525:101−128,xiv.
Yang,J.,S.Baskar,K.Y.Kwong,M.G.Kennedy,a.Wiestner,and C.Rader.2011.Therapeutic potential and challenges of targeting receptor tyrosine kinase ROR1 with monoclonal antibodies in b−cell malignancies. PloS One 6:e21018.
Yang,J.,and C. Rader.2012.Cloning,expression, and purification of monoclonal antibodies in scFv−Fc format.Methods Mol Biol 901:209−232.
Hofer,T.,W.Tangkeangsirisin,M.G.Kennedy,R.G.Mage,S.J.Raiker,K.Venkatesh,H.Lee,R.J.Giger,andC.Rader.2007.Chimeric rabbit/human Fab and IgG specific for members of the Nogo−66 receptor family selected for species cross−reactivity with an improved phage display vector.J Immunol Meth 318:75−87.
Hofer,T.,J.D.Thomas,T.R.Burke,Jr.,and C.Rader.2008.An engineered selenocysteine defines a unique class of antibody derivatives.Proc Natl Acad Sci U S a 105:12451−12456.
Kwong,K.Y.,S.Baskar,H.Zhang,C.L.Mackall,and C.Rader.2008.Generation,affinity maturation,and characterization of a human anti−human NKG2D monoclonal antibody with dual antagonistic and agonistic activity.J Mol Biol 384:1143−1156.
Kwong,K.Y.,and C.Rader.2009.E.coli expression and purification of Fab antibody fragments.Curr Protoc Protein Sci Chapter 6:Unit 6 10.
McCartney−Francis,N.,R.M.Skurla,Jr.,R.G.Mage,and K.E.Bernstein.1984.Kappa−chain allotypes and isotypes in the rabbit:cDNA sequences of clones encoding b9 suggest an evolutionary pathway and possible role of the interdomain disulfide bond in quantitative allotype expression.Proc Natl Acad Sci U S a 81:1794−1798.
Popkov,M.,R.G.Mage,C.b. Alexander,S.Thundivalappil,C.F.Barbas,3rd,and C.Rader.2003.Rabbit immune repertoires as sources for therapeutic monoclonal antibodies:the impact of kappa allotype−correlated variation in cysteine content on antibody libraries selected by phage display.J Mol Biol 325:325−335.
Rader,C.2009.Generation and selection of rabbit antibody libraries by phage display.Methods Mol Biol 525:101−128,xiv.
Yang,J.,S.Baskar,K.Y.Kwong,M.G.Kennedy,a.Wiestner,and C.Rader.2011.Therapeutic potential and challenges of targeting receptor tyrosine kinase ROR1 with monoclonal antibodies in b−cell malignancies. PloS One 6:e21018.
Yang,J.,and C. Rader.2012.Cloning,expression, and purification of monoclonal antibodies in scFv−Fc format.Methods Mol Biol 901:209−232.
本明細書に記載するいくつかの追加ヌクレオチド配列を以下に挙げる。
配列番号129
5’−CAGTCAGTGAAGGAGTCCGAGGGAGG
TCTCTTCAAGCCAACGGATACCCTGACACTCACCTGCACAGTCTCTGGATTCTCCCTCAGTAGCTATGGAGTGACCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAGCGGGCTGGAATGGATCGGATACATTAATACTGCTGGTAACACATACTACGCGAGCTGGGCGAAAAGCCGGTCCACCATCACCAGGAACACCAACGAGAACACGGTGACTCTGAAAATGACCAGTCTGACAGCCGCGGACACGGCCACCTATTTCTGTGCGAGAGATTGGACATCCCTTAACATCTGGGGACCAGGGACCCTCGTCACCGTCTCTTCA−3’
配列番号130
5’−CAGGAGCAGCTGGAGGAGTCCGGGGGTCGCCTGGTCACGCCTGGGACACCCCTGACACTCACCTGCACAGTCTCTGGATTCTCCCTCAGTAGCTACTGGATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAATGGATCGGGACCATTACGCCTGGTGGTAACACGGACTACGCGACCTGGGCGAAAGCCCGATTCACCGTCTCCAAAACCTCGACCACGGTGGATCTAAAAATCACCAGTCCGACAACCGAGGACACGGCCACCTATTTCTGTGCCAGAGGGATAGGTGGTGCTGCTGACTTGTGGGGGCCAGGCACCCTGGTCACCATCTCCTCA−3’
配列番号131
5’−CAGTCAGTGAAGGAGTCCGAGGGAGGTCTCTTCAAGCCAACGGATAGCCTGACACTCACCTGCACAGTCTCTGGATTCTCCCTCAGTACCTATGGAGTGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAACGGGCTGGAATGGATCGGGGCCATTGGTAGTAGTGGTAGCGCAAACTACGCGAGCTGGGCGAAAGACCGATCCACCATCACCAGAAACACCAACCTGAACACGGTGACTCTGAAAATGACCAGTCTGACAGCCGCGGACACGGCCACCTATTTCTGTGCGAGAGATGGTTACTATAGTAGTGGCTGGGGTCCCTACTTTAACATCTGGGGGCCAGGCACCCTGGTCACCATCTCCTCA−3’
配列番号132
5’−GACCCTATGCTGACCCAGACTCCATCCTCCACGTCTACCGCTGTGGGAGACACAGTCACCATCAAGTGCCAGGCTAGTCAGAGCATTAGTAGTGACTTATCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGCAGCGTCCCAAGCTCCTGATCTACCAGGCATCCACTCTGGCATCTGGGGTCCCATCGCGGTTCAAAGGCAGTGGATATGGGACAGAGTACACTCTCACCATCAGCGGCGTGCAGCGTGAGGATGCTGCCATCTACTACTGTCTAGGTGGTTATGCTGATGCTTCTTATCGAACTGCTTTCGGCGGAGGAACCAAGCTGGAGATCAAA−3’
配列番号133
5’−CAAGTGCTGACCCAGACTCCATCCTCCACGTCTGCCGCTGTGGGAGGCACAGTCACCATCAAGTGCCAGGCCAGTCAGAGCATTAGTAGTAGCGACTTATCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGCAGCCTCCCAAGCTCCTGATCTATGCTACATCCTATCTGGCATCTGGAGTCCCATCGCGGTTCAAAGGCAGTGGATCTGGGACAGAGTACACTCTCACCATCAGCGGCGTGCAGCGTGAGGATGCTGCCACCTACTACTGTCTAGGTGGTTATCCTAATACTTCTTACCGGTCTGCTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAA−3’
配列番号134
5’−TCCTTCGTGCTGACTCAGCCAGCCTCAGTGCAGGTGAACTTGGGACAGACGGTCTCCCTCACATGCACTGCAGATACACTGAGCAGAAGTTATGCTTCCTGGTACCAGCAGAAGCCAGGCCAGGCCCCTGTGCTGCTCATCTACAGGGATACCAGTCGGCCCTCAGGGGTCCCTGACCGCTTCTCTGGCTCCAGCTCAGGGAACACGGCCACCCTGACCATCAGTGGGGCCCAGGCTGGGGACGAGGCTGACTACTATTGTGCTACAAGCGGTGGCAGTGGCAGCAACCCTCAGTATGTGTTCGGCGGAGGGACCCAGCTGACCGTCACAGGC−3’
配列番号129
5’−CAGTCAGTGAAGGAGTCCGAGGGAGG
TCTCTTCAAGCCAACGGATACCCTGACACTCACCTGCACAGTCTCTGGATTCTCCCTCAGTAGCTATGGAGTGACCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAGCGGGCTGGAATGGATCGGATACATTAATACTGCTGGTAACACATACTACGCGAGCTGGGCGAAAAGCCGGTCCACCATCACCAGGAACACCAACGAGAACACGGTGACTCTGAAAATGACCAGTCTGACAGCCGCGGACACGGCCACCTATTTCTGTGCGAGAGATTGGACATCCCTTAACATCTGGGGACCAGGGACCCTCGTCACCGTCTCTTCA−3’
配列番号130
5’−CAGGAGCAGCTGGAGGAGTCCGGGGGTCGCCTGGTCACGCCTGGGACACCCCTGACACTCACCTGCACAGTCTCTGGATTCTCCCTCAGTAGCTACTGGATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAATGGATCGGGACCATTACGCCTGGTGGTAACACGGACTACGCGACCTGGGCGAAAGCCCGATTCACCGTCTCCAAAACCTCGACCACGGTGGATCTAAAAATCACCAGTCCGACAACCGAGGACACGGCCACCTATTTCTGTGCCAGAGGGATAGGTGGTGCTGCTGACTTGTGGGGGCCAGGCACCCTGGTCACCATCTCCTCA−3’
配列番号131
5’−CAGTCAGTGAAGGAGTCCGAGGGAGGTCTCTTCAAGCCAACGGATAGCCTGACACTCACCTGCACAGTCTCTGGATTCTCCCTCAGTACCTATGGAGTGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAACGGGCTGGAATGGATCGGGGCCATTGGTAGTAGTGGTAGCGCAAACTACGCGAGCTGGGCGAAAGACCGATCCACCATCACCAGAAACACCAACCTGAACACGGTGACTCTGAAAATGACCAGTCTGACAGCCGCGGACACGGCCACCTATTTCTGTGCGAGAGATGGTTACTATAGTAGTGGCTGGGGTCCCTACTTTAACATCTGGGGGCCAGGCACCCTGGTCACCATCTCCTCA−3’
配列番号132
5’−GACCCTATGCTGACCCAGACTCCATCCTCCACGTCTACCGCTGTGGGAGACACAGTCACCATCAAGTGCCAGGCTAGTCAGAGCATTAGTAGTGACTTATCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGCAGCGTCCCAAGCTCCTGATCTACCAGGCATCCACTCTGGCATCTGGGGTCCCATCGCGGTTCAAAGGCAGTGGATATGGGACAGAGTACACTCTCACCATCAGCGGCGTGCAGCGTGAGGATGCTGCCATCTACTACTGTCTAGGTGGTTATGCTGATGCTTCTTATCGAACTGCTTTCGGCGGAGGAACCAAGCTGGAGATCAAA−3’
配列番号133
5’−CAAGTGCTGACCCAGACTCCATCCTCCACGTCTGCCGCTGTGGGAGGCACAGTCACCATCAAGTGCCAGGCCAGTCAGAGCATTAGTAGTAGCGACTTATCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGCAGCCTCCCAAGCTCCTGATCTATGCTACATCCTATCTGGCATCTGGAGTCCCATCGCGGTTCAAAGGCAGTGGATCTGGGACAGAGTACACTCTCACCATCAGCGGCGTGCAGCGTGAGGATGCTGCCACCTACTACTGTCTAGGTGGTTATCCTAATACTTCTTACCGGTCTGCTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAA−3’
配列番号134
5’−TCCTTCGTGCTGACTCAGCCAGCCTCAGTGCAGGTGAACTTGGGACAGACGGTCTCCCTCACATGCACTGCAGATACACTGAGCAGAAGTTATGCTTCCTGGTACCAGCAGAAGCCAGGCCAGGCCCCTGTGCTGCTCATCTACAGGGATACCAGTCGGCCCTCAGGGGTCCCTGACCGCTTCTCTGGCTCCAGCTCAGGGAACACGGCCACCCTGACCATCAGTGGGGCCCAGGCTGGGGACGAGGCTGACTACTATTGTGCTACAAGCGGTGGCAGTGGCAGCAACCCTCAGTATGTGTTCGGCGGAGGGACCCAGCTGACCGTCACAGGC−3’
以上において本発明を明瞭な理解のために例示及び実施例によってある程度詳しく説明してきたが、当業者には、本発明の教示に照らして、添付の請求項の精神又は範囲を逸脱することなく、本発明にいくつかの変更及び修正が加えられ得ることは容易に理解されよう。
本明細書で引用した刊行物、データベース、GenBank配列、特許、及び特許出願の全ては、その各々が、あたかも明示的且つ個別に、参照により組み込まれていると示されているのと同様に、参照により本明細書に組み込まれる。
Claims (42)
- ヒト受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体2(ROR2)の細胞外ドメインと特異的に対し、第2抗体のものと同じ結合特異性で結合する、抗体、抗体ベースの結合タンパク質又はその抗体フラグメントであって、前記第2抗体が、(i)配列番号1と配列番13;(ii)配列番号2と配列番号14;(iii)配列番号3と配列番号15;(iv)配列番号4と配列番号16;(v)配列番号5と配列番号17;(vi)配列番号6と配列番号18;(vii)配列番号7と配列番号19;(viii)配列番号8と配列番号20;(ix)配列番号9と配列番号21;(x)配列番号10と配列番号22;(xi)配列番号11と配列番号23;若しくは(xii)配列番号12と配列番24にそれぞれ示される、重鎖可変領域配列と軽鎖可変領域配列とを含む、抗体、抗体ベースの結合タンパク質又はその抗体フラグメント。
- 重鎖可変領域配列と軽鎖可変領域配列とを含み、その一方又は両方が、(i)配列番号1と配列番13;(ii)配列番号2と配列番号14;(iii)配列番号3と配列番号15;(iv)配列番号4と配列番号16;(v)配列番号5と配列番号17;(vi)配列番号6と配列番号18;(vii)配列番号7と配列番号19;(viii)配列番号8と配列番号20;(ix)配列番号9と配列番号21;(x)配列番号10と配列番号22;(xi)配列番号11と配列番号23;若しくは(xii)配列番号12と配列番24にそれぞれ示される重鎖可変領域配列及び軽鎖可変領域配列に対して、少なくとも90%又は少なくとも95%同一である、請求項1に記載の抗体、抗体ベースの結合タンパク質又はその抗体フラグメント。
- 重鎖可変領域配列と軽鎖可変領域配列とを含み、その一方又は両方が、(i)配列番号1と配列番13;(ii)配列番号2と配列番号14;(iii)配列番号3と配列番号15;(iv)配列番号4と配列番号16;(v)配列番号5と配列番号17;(vi)配列番号6と配列番号18;(vii)配列番号7と配列番号19;(viii)配列番号8と配列番号20;(ix)配列番号9と配列番号21;(x)配列番号10と配列番号22;(xi)配列番号11と配列番号23;若しくは(xii)配列番号12と配列番24にそれぞれ示される重鎖可変領域配列及び軽鎖可変領域配列と同一である、重鎖可変領域配列と軽鎖可変領域配列とを含む、請求項1に記載の抗体、抗体ベースの結合タンパク質又はその抗体フラグメント。
- (i)配列番号1と配列番13;(ii)配列番号2と配列番号14;(iii)配列番号3と配列番号15;(iv)配列番号4と配列番号16;(v)配列番号5と配列番号17;(vi)配列番号6と配列番号18;(vii)配列番号7と配列番号19;(viii)配列番号8と配列番号20;(ix)配列番号9と配列番号21;(x)配列番号10と配列番号22;(xi)配列番号11と配列番号23;若しくは(xii)配列番号12と配列番24にそれぞれ示される重鎖可変領域配列と免疫グロブリン軽鎖可変領域配列とを含む、請求項1に記載の抗体、抗体ベースの結合タンパク質又はその抗体フラグメント。
- (i)配列番号25〜27と配列番号61〜63、(ii)配列番号28〜30と配列番号64〜66、(iii)配列番号31〜33と配列番号67〜69、(iv)配列番号34〜36と配列番号70〜72、(v)配列番号37〜39と配列番号73〜75、(vi)配列番号40〜42と配列番号76〜78、(vii)配列番号43〜45と配列番号79〜81、(viii)配列番号46〜48と配列番号82〜84、(ix)配列番号49〜51と配列番号85〜87、(x)配列番号52〜54と配列番号88〜90、(xi)配列番号55〜57と配列番号91〜93、若しくは(xii)配列番号58〜60と配列番号94〜96に対して、それぞれ少なくとも90%又は少なくとも95%同一である、重鎖CDR1〜3配列と軽鎖CDR1〜3配列とを含む、請求項1に記載の抗体、抗体ベースの結合タンパク質又はその抗体フラグメント。
- 配列番号25〜60からなる群から選択される重鎖CDR配列を含む、請求項1に記載の抗体、抗体ベースの結合タンパク質又はその抗体フラグメント。
- 配列番号61〜96からなる群から選択される軽鎖CDR配列をさらに含む、請求項6に記載の抗体、抗体ベースの結合タンパク質又はその抗体フラグメント。
- 重鎖CDR1、CDR2及びCDR3配列を含み、それらは配列番号25〜27、配列番号28〜30、配列番号31〜33、配列番号34〜36、配列番号37〜39、配列番号40〜42、配列番号43〜45、配列番号46〜48、配列番号49〜51、配列番号52〜54、配列番号55〜57、若しくは配列番号58〜60とそれぞれ同一である、請求項6に記載の抗体、抗体ベースの結合タンパク質又はその抗体フラグメント。
- (i)配列番号25〜27と配列番号61〜63、(ii)配列番号28〜30と配列番号64〜66、(iii)配列番号31〜33と配列番号67〜69、(iv)配列番号34〜36と配列番号70〜72、(v)配列番号37〜39と配列番号73〜75、(vi)配列番号40〜42と配列番号76〜78、(vii)配列番号43〜45と配列番号79〜81、(vii)配列番号46〜48と配列番号82〜84、(ix)配列番号49〜51と配列番号85〜87、(x)配列番号52〜54と配列番号88〜90、(xi)配列番号55〜57と配列番号91〜93、若しくは(xii)配列番号58〜60と配列番号94〜96にそれぞれ示される重鎖CDR1、CDR2、及びCDR3配列と軽鎖CDR1、CDR2、及びCDR3配列とを含む、請求項8に記載の抗体、抗体ベースの結合タンパク質又はその抗体フラグメント。
- 配列番号61〜96からなる群から選択される軽鎖CDR配列を含む、請求項1に記載の抗体、抗体ベースの結合タンパク質又はその抗体フラグメント。
- 配列番号25〜60からなる群から選択される重鎖CDR配列をさらに含む、請求項10に記載の抗体、抗体ベースの結合タンパク質又はその抗体フラグメント。
- 軽鎖CDR1、CDR2及びCDR3配列を含み、それらは配列番号61〜63、配列番号64〜66、配列番号67〜69、配列番号70〜72、配列番号73〜75、配列番号76〜78、配列番号79〜81、配列番号82〜84、配列番号85〜87、配列番号88〜90、配列番号91〜93、若しくは配列番号94〜96とそれぞれ同一である、請求項10に記載の抗体、抗体ベースの結合タンパク質又はその抗体フラグメント。
- 前記抗体又は抗体フラグメントが、キメラであるか、又はヒト化されている、請求項1に記載の抗体、抗体ベースの結合タンパク質又はその抗体フラグメント。
- 前記抗体又は抗体フラグメントが、IgA1、IgA2、IgD、IgE、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、合成IgG、IgM、F(ab)2、Fv、scFv、IgGACH2、F(ab’)2、scFv2CH3、Fab、VL、VH、scFv4、scFv3、scFv2、dsFv、Fv、scFv−Fc、(scFv)2、非枯渇IgG、ダイアボディ、若しくは二価抗体である、請求項1に記載の抗体、抗体ベースの結合タンパク質又はその抗体フラグメント。
- 合成分子と結合している、請求項1に記載の抗体、抗体ベースの結合タンパク質又はその抗体フラグメント。
- 前記合成分子が、細胞傷害剤、標識、治療用放射性同位体、又はリポソームである、請求項15に記載の抗体、抗体ベースの結合タンパク質又はその抗体フラグメント。
- 前記細胞傷害剤が、低分子量毒素、又はペプチド毒素、又はタンパク質毒素から選択される、請求項16に記載の抗体又は抗原結合フラグメント。
- 請求項1に記載の抗体又はその抗体フラグメントと少なくとも1種の細胞傷害剤とを含む、抗体薬物複合体(ADC)。
- 前記細胞傷害剤が、低分子量毒素、ペプチド毒素、又はタンパク質毒素である、請求項18に記載の抗体薬物複合体。
- 前記抗体又はその抗体フラグメントが、ソルターゼ酵素媒介抗体結合(SMAC)を介して細胞傷害剤と結合している、請求項18に記載の抗体薬物複合体。
- 前記細胞傷害剤が、アントラサイクリン(PNU)毒素誘導体Gly(n)−EDA−PNUであり、ここで、nは、1〜21の任意の数である、請求項20に記載の抗体薬物複合体。
- 前記抗体又はその抗体フラグメントが、キメラであるか、又はヒト化されている、請求項18に記載の抗体薬物複合体。
- 前記抗体又はその抗体フラグメントが、以下:(1)配列番号25〜27と配列番号61〜63、(2)配列番号43〜45と配列番号79〜81、(3)配列番号46〜48と配列番号82〜84、(4)配列番号52〜54と配列番号88〜90、(5)配列番号34〜36と配列番号70〜72、若しくは(6)配列番号58〜60と配列番号94〜96にそれぞれ示される重鎖CDR1、CDR2、及びCDR3配列と軽鎖CDR1、CDR2、及びCDR3配列とを含む、請求項18に記載の抗体薬物複合体。
- 前記抗体又はその抗体フラグメントが、以下:(1)配列番号1と配列番13;(2)配列番号7と配列番号19;(3)配列番号8と配列番号20;(4)配列番号10と配列番号22;(5)配列番号4と配列番号16;若しくは(6)配列番号12と配列番号24にそれぞれ示される、重鎖可変領域配列と軽鎖可変領域配列とを含む、請求項18に記載の抗体薬物複合体。
- 膜貫通領域及び細胞内T細胞受容体(TCR)シグナル伝達ドメインと融合した請求項1に記載の抗体又は抗体フラグメントを含む、キメラ抗原受容体(CAR)。
- 前記抗体又はその抗体フラグメントが、キメラであるか、又はヒト化されている、請求項25に記載のキメラ抗原受容体。
- 前記抗体又はその抗体フラグメントが、配列番号25〜27及び配列番号61〜63にそれぞれ示される重鎖CDR1、CDR2、及びCDR3配列と軽鎖CDR1、CDR2、及びCDR3配列とを含む、請求項25に記載のキメラ抗原受容体。
- 前記抗体又はその抗体フラグメントが、配列番号1及び配列番号13にそれぞれ示される重鎖可変領域配列と軽鎖可変領域配列とを含む、請求項25に記載のキメラ抗原受容体。
- (1)治療有効量の(a)請求項1に記載の抗体、抗体ベースの結合タンパク質若しくはその抗体フラグメント又は(b)請求項18に記載の抗体薬物複合体(ADC)と、(2)薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
- (1)請求項1に記載の抗体若しくは抗原結合フラグメント又は(2)請求項18に記載の抗体薬物複合体(ADC)を含む、キット。
- 請求項1に記載の抗体、抗体ベースの結合タンパク質若しくはその抗体フラグメントの重鎖又は軽鎖の可変領域をコードするポリヌクレオチド。
- 請求項31に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
- 対象においてROR2を発現する細胞を殺傷するか、又はその増殖を阻害する方法であって、請求項29に記載の医薬組成物を、それが必要な対象に投与し、これにより、前記対象においてROR2を発現する前記細胞を殺傷するか、又はその増殖を阻害するステップを含む、方法。
- 前記細胞が、腫瘍細胞である、請求項33に記載の方法。
- 前記医薬組成物が、(1)請求項1に記載の抗体、抗体ベースの結合タンパク質若しくはその抗体フラグメントと、(2)細胞傷害剤とを含む抗体薬物複合体(ADC)を含む、請求項33に記載の方法。
- 前記細胞傷害剤が、低分子量毒素、ペプチド毒素、又はタンパク質毒素である、請求項35に記載の方法。
- 対象においてROR2の発現増大に関連する疾患又は状態を治療する方法であって、請求項29に記載の医薬組成物を、ROR2の発現増大に関連する疾患又は状態を有する対象に投与し、これにより、前記対象においてROR2の発現増大に関連する前記疾患又は状態を治療するステップを含む方法。
- 前記疾患又は状態が、癌である、請求項37に記載の方法。
- 前記疾患又は状態が、神経芽細胞腫、骨肉腫、腎細胞癌、乳癌、胃癌、前立腺癌、黒色腫、扁平上皮癌、又は多発性骨髄腫である、請求項37に記載の方法。
- 前記医薬組成物が、(1)請求項1に記載の抗体又はその抗体フラグメントと、(2)細胞傷害剤とを含む抗体薬物複合体(ADC)を含む、請求項37に記載の方法。
- 前記細胞傷害剤が、低分子量毒素、ペプチド毒素、又はタンパク質毒素である、請求項40に記載の方法。
- 前記抗体又は抗体フラグメントが、膜貫通領域及び細胞内T細胞受容体(TCR)シグナル伝達ドメインと融合して、キメラ抗原受容体(CAR)を形成する、請求項37に記載の方法。
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