JP2019507579A - デュシェンヌ型筋ジストロフィーの処置のための材料および方法 - Google Patents

デュシェンヌ型筋ジストロフィーの処置のための材料および方法 Download PDF

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Abstract

本出願は、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）を伴う患者を、ｅｘ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの両方で処置するための材料および方法を提示する。加えて、本出願は、細胞内のジストロフィン遺伝子を、ゲノム編集により編集するための材料および方法を提示する。本開示は、ＤＭＤの遺伝子基盤に取り組む手法を提示する。単回というわずかな回数の処置により、ジストロフィンのリーディングフレームを修復し、ジストロフィンタンパク質の活性を修復しうる恒久的変化を、ゲノムに対して創出する、ゲノム操作ツールを使用することにより、結果として得られる療法は、疾患を引き起こす、根底的な遺伝子の欠損を矯正しうる。

Description

技術分野
本出願は、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）を伴う患者を、ｅｘ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの両方で処置するための材料および方法を提示する。加えて、本出願は、細胞内のジストロフィン遺伝子を、ゲノム編集により編集するための材料および方法を提示する。
関連出願
本出願は、２０１５年１０月２８日に出願された米国仮出願番号第６２／２４７，４８４号および２０１６年４月１８日に出願された米国仮出願番号第６２／３２４，０６４号の利益を主張しており、これら仮出願の両方は、それらの全体が参考として本明細書中に援用される。
参照による配列表の組込み
本出願は、コンピュータで読取り可能な形態（ファイル名：160101PCT sequence listing _ST25：２８６，９２８，８９６バイト；ＡＳＣＩＩテキストファイル；２０１６年１０月２８日に作成された）の配列表であって、参照によりその全体において本明細書に組み込まれ、本開示の一部を形成する配列表を含む。
背景
デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）とは、男児の生児出生４，０００例中約１例において生じる、重度のＸ連鎖劣性神経筋障害である。患者は一般に、４歳までに診断され、１０歳までに車椅子に束縛される。大半の患者は、心不全および／または呼吸器不全のために、２５歳を超えては生きない。既存の処置は、最良でも、緩和的なものである。ＤＭＤのための最も一般的な処置は、筋力の喪失を緩徐化させるのに使用されるステロイドである。しかし、大半のＤＭＤ患者は、年少期にステロイドの施薬を始めるため、処置は、思春期を遅延させ、さらに、患者の生活の質の低下にも寄与する。
ＤＭＤは、ジストロフィン遺伝子（Ｘ染色体：３１，１１７，２２８〜３３，３４４，６０９（Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ：ＧＲＣｈ３８／ｈｇ３８））内の突然変異により引き起こされる。２．２メガ塩基の長さにわたるゲノム領域を伴うジストロフィンは、２番目に大きなヒト遺伝子である。ジストロフィン遺伝子は、７９のエクソンを含有し、これが、１１，０００塩基対のｍＲＮＡへとプロセシングされ、これが、４２７ｋＤａのタンパク質へと翻訳される。機能的に、ジストロフィンは、アクチンフィラメントと、筋線維内の細胞外マトリックスとの間のリンカーとして作用する。ジストロフィンのＮ末端は、アクチン結合性ドメインであるが、Ｃ末端は、筋線維を、細胞外マトリックスへとアンカリングする膜貫通スキャフォールドと相互作用する。筋収縮時に、ジストロフィンは、筋組織が、機械的な力に抗することを可能とする構造的支持をもたらす。ＤＭＤは、ジストロフィン遺伝子内の多種多様な突然変異であって、早期終止コドンをもたらし、したがって、切断型ジストロフィンタンパク質をもたらす突然変異により引き起こされる。切断型ジストロフィンタンパク質は、Ｃ末端を含有せず、したがって、筋収縮の応力に抗するのに必要な構造的支持をもたらすことができない。結果として、筋線維は、引き離され筋消耗に至る。
ベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）は、ＤＭＤと比較して、筋ジストロフィーのそれほど重度ではない形態である。ＢＭＤもまた、ジストロフィン遺伝子内の突然変異により引き起こされるが、ＢＭＤにおける突然変異は、ジストロフィンのリーディングフレームを維持する。ＢＭＤジストロフィンタンパク質は、内部欠失を含有するが、Ｎ末端およびＣ末端の両方の部分は保持する。したがって、ＢＭＤにおけるジストロフィンタンパク質は、野生型タンパク質より短いが、アクチンフィラメントと、細胞外マトリックスとのリンカーとして、なお機能しうる。実際、内部欠失のサイズに応じて、ＢＭＤ患者は、軽微な症状を示すに過ぎない場合がある。結果として、大半の研究上の取組みは、重度のＤＭＤ表現型を、それほど重度ではないＢＭＤ表現型へと転換することに焦点を当てている。
ゲノム操作とは、生物の遺伝子情報（ゲノム）の、ターゲティングされた特異的修飾のための戦略および技法を指す。ゲノム操作は、特に、ヒトの健康；有害な突然変異を保有する遺伝子の矯正の領域における、広範にわたる可能な適用であって、例えば、遺伝子の機能を探索する適用のために、極めて活発な研究領域である。遺伝子組み換えなど、遺伝子を、生細胞へと挿入するのに開発された初期の技術は、しばしば、新たな配列の、ゲノムへの挿入のランダムな性格により限定されていた。新たな遺伝子は通例、盲動的に配置され、他の遺伝子の機能を不活化させることもあり、撹乱することもあり、または重度の望ましくない効果を引き起こすことさえあった。さらに、新たな配列が、２つの異なる細胞内の同じ場所に挿入される保証がなかったので、これらの技術は一般に、いかなる程度の再現性ももたらさなかった。ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、ＨＥ、およびＭｅｇａＴＡＬなど、より最近のゲノム操作戦略は、ＤＮＡの特異的領域の修飾を可能とし、これにより、矯正または挿入の正確さを、初期の技術と比較して増大させ、ある程度の再現性を提供している。これにも拘らず、このような最近のゲノム操作戦略は、限界を有する。
複数の研究は、ゲノム操作が、ＤＭＤを処置するための魅力的な戦略であることを示唆する。最初期の手法の１つは、４ｋｂ未満であり、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターへとパッケージングしうるミニジストロフィン遺伝子を操作することを含んでいた。これは、マウスモデル（Wang, B.、J. Li、およびX. Xiao、Proc Natl Acad Sci U S A、２０００年、９７巻（２５号）：１３７１４〜９頁）（Watchko, J.ら、Hum Gene Ther、２００２年、１３巻（１２号）：１４５１〜６０頁）およびイヌモデル（Wang, Z.ら、Mol Ther、２０１２年、２０巻（８号）：１５０１〜７頁）において、実験的に調べられた遺伝子置換療法であり、フェーズＩの臨床試験は、非自己の合成エピトープに対する免疫応答と関連する問題が存在することを示唆した（Mendell, J.R.ら、N Engl J Med、２０１０年、３６３巻（１５号）：１４２９〜３７頁）。
より最近になって、ＤＭＤ患者の細胞内のリーディングフレームを修復するのに、オリゴ媒介型エクソンスキッピングが使用された。この戦略では、短鎖オリゴが、ｐｒｅ−ｍＲＮＡ内に見出されるスプライシングシグナルを遮断し、単一エクソンのスキッピングを容易とする。単一エクソンのスキッピングは、転写機構が、早期終止コドンを迂回し、インタクトのＮおよびＣ末端を伴うタンパク質を作製することを可能とする。フェーズＩ／ＩＩ臨床試験は、アンチセンスオリゴの毎週の注射が、エクソンスキッピングおよびジストロフィン陽性線維を誘導することを示している（Cirak, S.ら、Lancet、２０１１年、３７８巻（９７９１号）：５９５〜６０５頁）。しかし、この種の処置の主要な限界は、薬物が、ゲノムローカスではなく、ｐｒｅ−ｍＲＮＡをターゲティングするため、患者の生涯にわたる反復投与を要求することである。進行中のフェーズＩＩ／ＩＩＩ臨床試験は、持続的発現のための、ＡＡＶを介するエクソンスキッピングオリゴの送達、ならびにマルチエクソンスキッピング戦略を容易にするための、複数のアンチセンスオリゴの送達について査定している。
ＤＭＤへの取組みを試みる、世界中の研究者および医療従事者による努力にも拘らず、かつ、ゲノム操作法の将来性にも拘らず、最も有病率が高く、かつ、消耗性の遺伝性障害である、ＤＭＤのための安全かつ有効な処置を開発する火急の必要が依然として残っている。
Wang, B.、J. Li、およびX. Xiao、Proc Natl Acad Sci U S A、２０００年、９７巻（２５号）：１３７１４〜９頁 Watchko, J.ら、Hum Gene Ther、２００２年、１３巻（１２号）：１４５１〜６０頁 Wang, Z.ら、Mol Ther、２０１２年、２０巻（８号）：１５０１〜７頁 Mendell, J.R.ら、N Engl J Med、２０１０年、３６３巻（１５号）：１４２９〜３７頁 Cirak, S.ら、Lancet、２０１１年、３７８巻（９７９１号）：５９５〜６０５頁
要旨
本開示は、ＤＭＤの遺伝子基盤に取り組む手法を提示する。単回というわずかな回数の処置により、ジストロフィンのリーディングフレームを修復し、ジストロフィンタンパク質の活性を修復しうる恒久的変化を、ゲノムに対して創出する、ゲノム操作ツールを使用することにより、結果として得られる療法は、疾患を引き起こす、根底的な遺伝子の欠損を矯正しうる。
本明細書では、ゲノム編集により、ジストロフィン遺伝子内の、１もしくは複数のエクソン、または異常なイントロンのスプライスアクセプターもしくはドナー部位を欠失させるか、挿入するか、または置きかえ（欠失させ、かつ、挿入し）、ジストロフィンのリーディングフレームを修復し、ジストロフィンタンパク質の活性を修復することにより、ゲノムに対して、恒久的変化を創出するための、ｅｘ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの細胞法であって、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）を処置するのに使用しうる、細胞のｅｘ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ方法が提示される。本明細書ではまた、このような方法を実施するための、構成要素、キット、および組成物も提示される。また、このような方法により作製される細胞も提示される。
本明細書では、ヒト細胞内のジストロフィン遺伝子を、ゲノム編集により編集するための方法であって、ヒト細胞へと、１または複数のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼを導入して、ジストロフィン遺伝子内またはその近傍に、１または複数の一本鎖切断（ＳＳＢ）または二本鎖切断（ＤＳＢ）であって、ジストロフィン遺伝子内またはその近傍に、１もしくは複数のエクソン、または異常なイントロンのスプライスアクセプターもしくはドナー部位の恒久的な欠失、挿入、または置きかえをもたらし、ジストロフィンのリーディングフレームの修復、およびジストロフィンタンパク質の活性の修復をもたらすＳＳＢまたはＤＳＢを生じさせるステップを含む方法が提示される。ヒト細胞は、筋細胞または筋前駆細胞でありうる。
本明細書ではまた、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）を伴う患者（例えば、ヒト）を処置するためのｅｘ ｖｉｖｏ方法であって、ｉ）ＤＭＤ患者特異的な誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を創出するステップと；ｉｉ）ｉＰＳＣのジストロフィン遺伝子内またはその近傍で編集するステップと；ｉｉｉ）ゲノム編集されたｉＰＳＣを、Ｐａｘ７＋筋始原細胞へと分化させるステップと；ｉｖ）Ｐａｘ７＋筋始原細胞を、患者へと植え込むステップとを含むｅｘ ｖｉｖｏ方法も提示される。
患者特異的誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を創出するステップは、ａ）体細胞を、患者から単離することと；ｂ）多能性関連遺伝子のセットを、体細胞へと導入して、体細胞が多能性幹細胞となるように誘導することとを含みうる。体細胞は、線維芽細胞でありうる。多能性関連遺伝子のセットは、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、Ｌｉｎ２８、ＮＡＮＯＧ、およびｃＭＹＣからなる群から選択される遺伝子のうちの１または複数である。
ｉＰＳＣのジストロフィン遺伝子内またはその近傍で編集するステップは、ｉＰＳＣへと、１または複数のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼを導入することであって、ジストロフィン遺伝子内またはその近傍に、１または複数の一本鎖切断（ＳＳＢ）または二本鎖切断（ＤＳＢ）であって、ジストロフィン遺伝子内またはその近傍に、１もしくは複数のエクソン、または異常なイントロンのスプライスアクセプターもしくはドナー部位の恒久的な欠失、挿入、または置きかえをもたらし、ジストロフィンのリーディングフレームの修復、およびジストロフィンタンパク質の活性の修復をもたらすＳＳＢまたはＤＳＢを生じさせることを含みうる。
ゲノム編集されたｉＰＳＣを、Ｐａｘ７＋筋始原細胞へと分化させるステップは、ゲノム編集されたｉＰＳＣを、低分子薬物を含む特異的培地処方物と接触させること；トランス遺伝子の過剰発現；または血清枯渇を含みうる。
Ｐａｘ７＋筋始原細胞を、患者へと植え込むステップは、所望の筋肉への局所注射により、Ｐａｘ７＋筋始原細胞を、患者へと植え込むことを含みうる。
本明細書ではまた、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）を伴う患者（例えば、ヒト）を処置するためのｉｎ ｖｉｖｏ方法であって、患者の細胞内のジストロフィン遺伝子を編集するステップを含むｉｎ ｖｉｖｏ方法も提示される。細胞は、筋細胞または筋前駆細胞でありうる。
患者の細胞内のジストロフィンを編集するステップは、患者の細胞へと、１または複数のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼを導入することであって、ジストロフィン遺伝子内またはその近傍に、１または複数の一本鎖切断（ＳＳＢ）または二本鎖切断（ＤＳＢ）であって、ジストロフィン遺伝子内またはその近傍に、１もしくは複数のエクソン、または異常なイントロンのスプライスアクセプターもしくはドナー部位の恒久的な欠失、挿入、または置きかえをもたらし、ジストロフィンのリーディングフレームの修復、およびジストロフィンタンパク質の活性の修復をもたらすＳＳＢまたはＤＳＢを生じさせることを含みうる。
１または複数のＤＮＡエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（また、Ｃｓｎ１およびＣｓｘ１２としても公知である）、Ｃａｓ１００、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、またはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼ；これらの相同体、これらの天然に存在する分子の組換え体、これらのコドン最適化体、これらの修飾形、および前出のうちのいずれかの組合せでありうる。
方法は、細胞へと、１または複数のＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする、１または複数のポリヌクレオチドを導入するステップを含みうる。方法は、細胞へと、１または複数のＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする、１または複数のリボ核酸（ＲＮＡ）を導入するステップを含みうる。１もしくは複数のポリヌクレオチド、または１もしくは複数のＲＮＡは、１もしくは複数の修飾ポリヌクレオチド、または１もしくは複数の修飾ＲＮＡでありうる。１または複数のＤＮＡエンドヌクレアーゼは、１または複数のタンパク質またはポリペプチドでありうる。
方法は、細胞へと、１または複数のガイドリボ核酸（ｇＲＮＡ）を導入するステップをさらに含みうる。１または複数のｇＲＮＡは、単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である。１もしくは複数のｇＲＮＡ、または１もしくは複数のｓｇＲＮＡは、１もしくは複数の修飾ｇＲＮＡ、または１もしくは複数の修飾ｓｇＲＮＡである。１または複数のＤＮＡエンドヌクレアーゼは、１もしくは複数のｇＲＮＡ、または１もしくは複数のｓｇＲＮＡとあらかじめ複合体化させることができる。
方法は、細胞へと、野生型ジストロフィンの遺伝子またはｃＤＮＡの少なくとも一部分を含むポリヌクレオチドドナー鋳型を導入するステップをさらに含みうる。野生型ジストロフィンの遺伝子またはｃＤＮＡの少なくとも一部分は、エクソン１、エクソン２、エクソン３、エクソン４、エクソン５、エクソン６、エクソン７、エクソン８、エクソン９、エクソン１０、エクソン１１、エクソン１２、エクソン１３、エクソン１４、エクソン１５、エクソン１６、エクソン１７、エクソン１８、エクソン１９、エクソン２０、エクソン２１、エクソン２２、エクソン２３、エクソン２４、エクソン２５、エクソン２６、エクソン２７、エクソン２８、エクソン２９、エクソン３０、エクソン３１、エクソン３２、エクソン３３、エクソン３４、エクソン３５、エクソン３６、エクソン３７、エクソン３８、エクソン３９、エクソン４０、エクソン４１、エクソン４２、エクソン４３、エクソン４４、エクソン４５、エクソン４６、エクソン４７、エクソン４８、エクソン４９、エクソン５０、エクソン５１、エクソン５２、エクソン５３、エクソン５４、エクソン５５、エクソン５６、エクソン５７、エクソン５８、エクソン５９、エクソン６０、エクソン６１、エクソン６２、エクソン６３、エクソン６４、エクソン６５、エクソン６６、エクソン６７、エクソン６８、エクソン６９、エクソン７０、エクソン７１、エクソン７２、エクソン７３、エクソン７４、エクソン７５、エクソン７６、エクソン７７、エクソン７８、エクソン７９、イントロン領域、合成イントロン領域、断片、これらの組合せ、またはジストロフィン遺伝子もしくはｃＤＮＡ全体の少なくとも一部を含みうる。野生型ジストロフィンの遺伝子またはｃＤＮＡの少なくとも一部分は、エクソン１、エクソン２、エクソン３、エクソン４、エクソン５、エクソン６、エクソン７、エクソン８、エクソン９、エクソン１０、エクソン１１、エクソン１２、エクソン１３、エクソン１４、エクソン１５、エクソン１６、エクソン１７、エクソン１８、エクソン１９、エクソン２０、エクソン２１、エクソン２２、エクソン２３、エクソン２４、エクソン２５、エクソン２６、エクソン２７、エクソン２８、エクソン２９、エクソン３０、エクソン３１、エクソン３２、エクソン３３、エクソン３４、エクソン３５、エクソン３６、エクソン３７、エクソン３８、エクソン３９、エクソン４０、エクソン４１、エクソン４２、エクソン４３、エクソン４４、エクソン４５、エクソン４６、エクソン４７、エクソン４８、エクソン４９、エクソン５０、エクソン５１、エクソン５２、エクソン５３、エクソン５４、エクソン５５、エクソン５６、エクソン５７、エクソン５８、エクソン５９、エクソン６０、エクソン６１、エクソン６２、エクソン６３、エクソン６４、エクソン６５、エクソン６６、エクソン６７、エクソン６８、エクソン６９、エクソン７０、エクソン７１、エクソン７２、エクソン７３、エクソン７４、エクソン７５、エクソン７６、エクソン７７、エクソン７８、エクソン７９、イントロン領域、合成イントロン領域、断片、これらの組合せ、またはジストロフィン遺伝子もしくはｃＤＮＡ全体を含みうる。ドナー鋳型は、一本鎖または二本鎖ポリヌクレオチドでありうる。
方法は、細胞へと、１または複数のガイドリボ核酸（ｇＲＮＡ）を導入するステップをさらに含みうる。１または複数のＤＮＡエンドヌクレアーゼは、５’ローカスにおける第１のＳＳＢまたはＤＳＢによる切断、および３’ローカスにおける第２のＳＳＢまたはＤＳＢによる切断である１対の一本鎖切断（ＳＳＢ）または二本鎖切断（ＤＳＢ）であって、ジストロフィン遺伝子内またはその近傍の５’ローカスと３’ローカスとの間に、１もしくは複数のエクソン、または異常なイントロンのスプライスアクセプターもしくはドナー部位の恒久的な欠失または置きかえをもたらし、ジストロフィンのリーディングフレームの修復、およびジストロフィンタンパク質の活性の修復をもたらすＳＳＢまたはＤＳＢを生じさせる１または複数のＣａｓ９またはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼでありうる。１つのｇＲＮＡは、１対のＳＳＢまたはＤＳＢを創出しうる。１つのｇＲＮＡは、５’ローカス、３’ローカス、または５’ローカスと３’ローカスとの間のセグメントと相補的であるスペーサー配列を含みうる。第１のｇＲＮＡは、５’ローカスのセグメントと相補的であるスペーサー配列を含むことが可能であり、第２のｇＲＮＡは、３’ローカスのセグメントと相補的であるスペーサー配列を含みうる。
１または複数のｇＲＮＡは、１または複数の単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）でありうる。１もしくは複数のｇＲＮＡ、または１もしくは複数のｓｇＲＮＡは、１もしくは複数の修飾ｇＲＮＡ、または１もしくは複数の修飾ｓｇＲＮＡでありうる。１または複数のＤＮＡエンドヌクレアーゼは、１もしくは複数のｇＲＮＡ、または１もしくは複数のｓｇＲＮＡとあらかじめ複合体化させることができる。
５’ローカスと３’ローカスとの間には、染色体ＤＮＡの欠失が存在しうる。
欠失は、単一エクソンの欠失でありうる。単一エクソンの欠失は、エクソン２、エクソン８、エクソン４３、エクソン４４、エクソン４５、エクソン４６、エクソン５０、エクソン５１、エクソン５２、またはエクソン５３の欠失でありうる。５’ローカスは、エクソン２、エクソン８、エクソン４３、エクソン４４、エクソン４５、エクソン４６、エクソン５０、エクソン５１、エクソン５２、およびエクソン５３からなる群から選択される単一エクソンの５’境界部に対して近位でありうる。３’ローカスは、エクソン２、エクソン８、エクソン４３、エクソン４４、エクソン４５、エクソン４６、エクソン５０、エクソン５１、エクソン５２、およびエクソン５３からなる群から選択される単一エクソンの３’境界部に対して近位でありうる。５’ローカスは、エクソン２、エクソン８、エクソン４３、エクソン４４、エクソン４５、エクソン４６、エクソン５０、エクソン５１、エクソン５２、およびエクソン５３からなる群から選択される単一エクソンの５’境界部に対して近位であることが可能であり、３’ローカスは、これらの３’境界部に対して近位でありうる。エクソンの境界部に対する近位は、隣接イントロンの周囲のスプライスドナーおよびアクセプターを含みうる。
欠失は、マルチエクソンの欠失でありうる。マルチエクソンの欠失は、エクソン４５〜５３またはエクソン４５〜５５の欠失でありうる。５’ローカスは、エクソン４５〜５３およびエクソン４５〜５５からなる群から選択される複数のエクソンの５’境界部に対して近位でありうる。３’ローカスは、エクソン４５〜５３およびエクソン４５〜５５からなる群から選択される複数のエクソンの３’境界部に対して近位でありうる。５’ローカスは、エクソン４５〜５３およびエクソン４５〜５５からなる群から選択される複数のエクソンの５’境界部に対して近位であることが可能であり、３’ローカスは、これらの３’境界部に対して近位でありうる。エクソンの境界部に対する近位は、隣接イントロンの周囲のスプライスドナーおよびアクセプターを含みうる。
５’ローカスと３’ローカスとの間には、染色体ＤＮＡの置きかえが存在しうる。置きかえは、単一エクソンの置きかえでありうる。単一エクソンの置きかえは、エクソン２、エクソン８、エクソン４３、エクソン４４、エクソン４５、エクソン４６、エクソン５０、エクソン５１、エクソン５２、エクソン５３、またはエクソン７０の置きかえでありうる。５’ローカスは、エクソン２、エクソン８、エクソン４３、エクソン４４、エクソン４５、エクソン４６、エクソン５０、エクソン５１、エクソン５２、エクソン５３、またはエクソン７０からなる群から選択される単一エクソンの５’境界部に対して近位でありうる。３’ローカスは、エクソン２、エクソン８、エクソン４３、エクソン４４、エクソン４５、エクソン４６、エクソン５０、エクソン５１、エクソン５２、エクソン５３、またはエクソン７０からなる群から選択される単一エクソンの３’境界部に対して近位でありうる。５’ローカスは、エクソン２、エクソン８、エクソン４３、エクソン４４、エクソン４５、エクソン４６、エクソン５０、エクソン５１、エクソン５２、エクソン５３、またはエクソン７０からなる群から選択される単一エクソンの５’境界部に対して近位であることが可能であり、３’ローカスは、これらの３’境界部に対して近位でありうる。エクソンの境界部に対する近位は、隣接イントロンまたは隣接エクソンの周囲のスプライスドナーおよびアクセプターを含みうる。
置きかえは、マルチエクソンの置きかえでありうる。マルチエクソンの置きかえは、エクソン４５〜５３またはエクソン４５〜５５の置きかえでありうる。５’ローカスは、エクソン４５〜５３またはエクソン４５〜５５からなる群から選択される複数のエクソンの５’境界部に対して近位でありうる。３’ローカスは、エクソン４５〜５３またはエクソン４５〜５５からなる群から選択される複数のエクソンの３’境界部に対して近位でありうる。５’ローカスは、エクソン４５〜５３またはエクソン４５〜５５からなる群から選択される複数のエクソンの５’境界部に対して近位であることが可能であり、３’ローカスは、これらの３’境界部に対して近位でありうる。エクソンの境界部に対する近位は、隣接イントロンまたは隣接エクソンの周囲のスプライスドナーおよびアクセプターを含みうる。
方法は、細胞へと、野生型ジストロフィンの遺伝子またはｃＤＮＡの少なくとも一部分を含むポリヌクレオチドドナー鋳型を導入するステップをさらに含むことが可能であり、置きかえは、相同性により導かれる修復（ＨＤＲ）によるものである。
野生型ジストロフィンの遺伝子またはｃＤＮＡの少なくとも一部分は、エクソン１、エクソン２、エクソン３、エクソン４、エクソン５、エクソン６、エクソン７、エクソン８、エクソン９、エクソン１０、エクソン１１、エクソン１２、エクソン１３、エクソン１４、エクソン１５、エクソン１６、エクソン１７、エクソン１８、エクソン１９、エクソン２０、エクソン２１、エクソン２２、エクソン２３、エクソン２４、エクソン２５、エクソン２６、エクソン２７、エクソン２８、エクソン２９、エクソン３０、エクソン３１、エクソン３２、エクソン３３、エクソン３４、エクソン３５、エクソン３６、エクソン３７、エクソン３８、エクソン３９、エクソン４０、エクソン４１、エクソン４２、エクソン４３、エクソン４４、エクソン４５、エクソン４６、エクソン４７、エクソン４８、エクソン４９、エクソン５０、エクソン５１、エクソン５２、エクソン５３、エクソン５４、エクソン５５、エクソン５６、エクソン５７、エクソン５８、エクソン５９、エクソン６０、エクソン６１、エクソン６２、エクソン６３、エクソン６４、エクソン６５、エクソン６６、エクソン６７、エクソン６８、エクソン６９、エクソン７０、エクソン７１、エクソン７２、エクソン７３、エクソン７４、エクソン７５、エクソン７６、エクソン７７、エクソン７８、エクソン７９、イントロン領域、合成イントロン領域、断片、これらの組合せ、またはジストロフィン遺伝子もしくはｃＤＮＡ全体の少なくとも一部を含みうる。野生型ジストロフィンの遺伝子またはｃＤＮＡの少なくとも一部分は、エクソン１、エクソン２、エクソン３、エクソン４、エクソン５、エクソン６、エクソン７、エクソン８、エクソン９、エクソン１０、エクソン１１、エクソン１２、エクソン１３、エクソン１４、エクソン１５、エクソン１６、エクソン１７、エクソン１８、エクソン１９、エクソン２０、エクソン２１、エクソン２２、エクソン２３、エクソン２４、エクソン２５、エクソン２６、エクソン２７、エクソン２８、エクソン２９、エクソン３０、エクソン３１、エクソン３２、エクソン３３、エクソン３４、エクソン３５、エクソン３６、エクソン３７、エクソン３８、エクソン３９、エクソン４０、エクソン４１、エクソン４２、エクソン４３、エクソン４４、エクソン４５、エクソン４６、エクソン４７、エクソン４８、エクソン４９、エクソン５０、エクソン５１、エクソン５２、エクソン５３、エクソン５４、エクソン５５、エクソン５６、エクソン５７、エクソン５８、エクソン５９、エクソン６０、エクソン６１、エクソン６２、エクソン６３、エクソン６４、エクソン６５、エクソン６６、エクソン６７、エクソン６８、エクソン６９、エクソン７０、エクソン７１、エクソン７２、エクソン７３、エクソン７４、エクソン７５、エクソン７６、エクソン７７、エクソン７８、エクソン７９、イントロン領域、合成イントロン領域、断片、これらの組合せ、またはジストロフィン遺伝子もしくはｃＤＮＡ全体を含みうる。
方法は、細胞へと、１つのガイドリボ核酸（ｇＲＮＡ）と、野生型ジストロフィンの遺伝子の少なくとも一部分を含むポリヌクレオチドドナー鋳型とを導入するステップをさらに含みうる。１または複数のＤＮＡエンドヌクレアーゼは、ジストロフィン遺伝子内またはその近傍のローカスに、ポリヌクレオチドドナー鋳型に由来する新たな配列の、ローカスにおける染色体ＤＮＡへの挿入を容易とする１つの一本鎖切断（ＳＳＢ）または二本鎖切断（ＤＳＢ）であって、ジストロフィン遺伝子内またはその近傍に、１もしくは複数のエクソン、または異常なイントロンのスプライスアクセプターもしくはドナー部位の恒久的な挿入または矯正をもたらし、ジストロフィンのリーディングフレームの修復、およびジストロフィンタンパク質の活性の修復をもたらすＳＳＢまたはＤＳＢを生じさせる１または複数のＣａｓ９またはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼでありうる。ｇＲＮＡは、ローカスのセグメントと相補的であるスペーサー配列を含みうる。
方法は、細胞へと、１または複数のガイドリボ核酸（ｇＲＮＡ）と、野生型ジストロフィンの遺伝子の少なくとも一部分を含むポリヌクレオチドドナー鋳型とを導入するステップをさらに含みうる。１または複数のＤＮＡエンドヌクレアーゼは、ジストロフィン遺伝子内またはその近傍に、ポリヌクレオチドドナー鋳型に由来する新たな配列の、５’ローカスと３’ローカスとの間における染色体ＤＮＡへの挿入を容易とする、５’ローカスにおける第１の切断、および３’ローカスにおける第２の切断である１対の一本鎖切断（ＳＳＢ）または二本鎖切断（ＤＳＢ）であって、ジストロフィン遺伝子内またはその近傍の５’ローカスと３’ローカスとの間に、１もしくは複数のエクソン、または異常なイントロンのスプライスアクセプターもしくはドナー部位の恒久的な挿入または矯正をもたらし、ジストロフィンのリーディングフレームの修復、およびジストロフィンタンパク質の活性の修復をもたらすＳＳＢまたはＤＳＢを生じさせる１または複数のＣａｓ９またはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼでありうる。
１つのｇＲＮＡは、１対のＳＳＢまたはＤＳＢを創出しうる。１つのｇＲＮＡは、５’ローカス、３’ローカス、または５’ローカスと３’ローカスとの間のセグメントと相補的であるスペーサー配列を含みうる。第１のｇＲＮＡは、５’ローカスのセグメントと相補的であるスペーサー配列を含むことが可能であり、第２のｇＲＮＡは、３’ローカスのセグメントと相補的であるスペーサー配列を含みうる。
１または複数のｇＲＮＡは、１または複数の単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）でありうる。１もしくは複数のｇＲＮＡ、または１もしくは複数のｓｇＲＮＡは、１もしくは複数の修飾ｇＲＮＡ、または１もしくは複数の修飾ｓｇＲＮＡでありうる。１または複数のＤＮＡエンドヌクレアーゼは、１もしくは複数のｇＲＮＡ、または１もしくは複数のｓｇＲＮＡとあらかじめ複合体化させることができる。
５’ローカスと３’ローカスとの間には、挿入が存在しうる。
挿入は、単一エクソンの挿入でありうる。単一エクソンの挿入は、エクソン２、エクソン８、エクソン４３、エクソン４４、エクソン４５、エクソン４６、エクソン５０、エクソン５１、エクソン５２、エクソン５３、またはエクソン７０の挿入でありうる。５’ローカスまたは３’ローカスは、エクソン２、エクソン８、エクソン４３、エクソン４４、エクソン４５、エクソン４６、エクソン５０、エクソン５１、エクソン５２、エクソン５３、およびエクソン７０からなる群から選択される単一エクソンの境界部に対して近位でありうる。エクソンの境界部に対する近位は、隣接イントロンまたは隣接エクソンの周囲のスプライスドナーおよびアクセプターを含みうる。
挿入は、マルチエクソンの挿入でありうる。マルチエクソンの挿入は、エクソン４５〜５３またはエクソン４５〜５５の挿入でありうる。５’ローカスまたは３’ローカスは、エクソン４５〜５３またはエクソン４５〜５５からなる群から選択される複数のエクソンの境界部に対して近位でありうる。エクソンの境界部に対する近位は、隣接イントロンの周囲のスプライスドナーおよびアクセプターを含みうる。
野生型ジストロフィンの遺伝子またはｃＤＮＡの少なくとも一部分は、エクソン１、エクソン２、エクソン３、エクソン４、エクソン５、エクソン６、エクソン７、エクソン８、エクソン９、エクソン１０、エクソン１１、エクソン１２、エクソン１３、エクソン１４、エクソン１５、エクソン１６、エクソン１７、エクソン１８、エクソン１９、エクソン２０、エクソン２１、エクソン２２、エクソン２３、エクソン２４、エクソン２５、エクソン２６、エクソン２７、エクソン２８、エクソン２９、エクソン３０、エクソン３１、エクソン３２、エクソン３３、エクソン３４、エクソン３５、エクソン３６、エクソン３７、エクソン３８、エクソン３９、エクソン４０、エクソン４１、エクソン４２、エクソン４３、エクソン４４、エクソン４５、エクソン４６、エクソン４７、エクソン４８、エクソン４９、エクソン５０、エクソン５１、エクソン５２、エクソン５３、エクソン５４、エクソン５５、エクソン５６、エクソン５７、エクソン５８、エクソン５９、エクソン６０、エクソン６１、エクソン６２、エクソン６３、エクソン６４、エクソン６５、エクソン６６、エクソン６７、エクソン６８、エクソン６９、エクソン７０、エクソン７１、エクソン７２、エクソン７３、エクソン７４、エクソン７５、エクソン７６、エクソン７７、エクソン７８、エクソン７９、イントロン領域、合成イントロン領域、断片、これらの組合せ、またはジストロフィン遺伝子もしくはｃＤＮＡ全体の少なくとも一部を含みうる。野生型ジストロフィンの遺伝子またはｃＤＮＡの少なくとも一部分は、エクソン１、エクソン２、エクソン３、エクソン４、エクソン５、エクソン６、エクソン７、エクソン８、エクソン９、エクソン１０、エクソン１１、エクソン１２、エクソン１３、エクソン１４、エクソン１５、エクソン１６、エクソン１７、エクソン１８、エクソン１９、エクソン２０、エクソン２１、エクソン２２、エクソン２３、エクソン２４、エクソン２５、エクソン２６、エクソン２７、エクソン２８、エクソン２９、エクソン３０、エクソン３１、エクソン３２、エクソン３３、エクソン３４、エクソン３５、エクソン３６、エクソン３７、エクソン３８、エクソン３９、エクソン４０、エクソン４１、エクソン４２、エクソン４３、エクソン４４、エクソン４５、エクソン４６、エクソン４７、エクソン４８、エクソン４９、エクソン５０、エクソン５１、エクソン５２、エクソン５３、エクソン５４、エクソン５５、エクソン５６、エクソン５７、エクソン５８、エクソン５９、エクソン６０、エクソン６１、エクソン６２、エクソン６３、エクソン６４、エクソン６５、エクソン６６、エクソン６７、エクソン６８、エクソン６９、エクソン７０、エクソン７１、エクソン７２、エクソン７３、エクソン７４、エクソン７５、エクソン７６、エクソン７７、エクソン７８、エクソン７９、イントロン領域、合成イントロン領域、断片、これらの組合せ、またはジストロフィン遺伝子もしくはｃＤＮＡ全体を含みうる。
挿入または矯正は、相同性により導かれる修復（ＨＤＲ）によるものでありうる。
ドナー鋳型は、一本鎖または二本鎖ポリヌクレオチドでありうる。
Ｃａｓ９またはＣｐｆ１の、ｍＲＮＡ、ｇＲＮＡ、およびドナー鋳型を、各々別個の脂質ナノ粒子へと製剤化することもでき、全てを脂質ナノ粒子へと共製剤化することもできる。
Ｃａｓ９またはＣｐｆ１のｍＲＮＡを、脂質ナノ粒子へと製剤化することができ、ｇＲＮＡおよびドナー鋳型の両方は、細胞へと、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターにより送達することができる。
Ｃａｓ９またはＣｐｆ１のｍＲＮＡは、脂質ナノ粒子へと製剤化することができ、ｇＲＮＡは、細胞へと、電気穿孔により送達することができ、ドナー鋳型は、細胞へと、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターにより送達することができる。
ジストロフィン遺伝子は、Ｘ染色体：３１，１１７，２２８〜３３，３４４，６０９（Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ：ＧＲＣｈ３８／ｈｇ３８）に位置しうる。
本明細書ではまた、ＤＭＤを伴う患者に由来する細胞内のジストロフィン遺伝子を編集するための、１または複数のガイドリボ核酸（ｇＲＮＡ）も提示される。１または複数のｇＲＮＡおよび／またはｓｇＲＮＡは、配列表の配列番号１〜１，４１０，４７２内の核酸配列からなる群から選択されるスペーサー配列を含みうる。１または複数のｇＲＮＡは、１または複数の単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）でありうる。１もしくは複数のｇＲＮＡ、または１もしくは複数のｓｇＲＮＡは、１もしくは複数の修飾ｇＲＮＡ、または１もしくは複数の修飾ｓｇＲＮＡでありうる。
本明細書では、ジストロフィン遺伝子内の、１もしくは複数のエクソン、または異常なイントロンのスプライスアクセプターもしくはドナー部位を恒久的に欠失させるかまたは矯正し、ジストロフィンのリーディングフレームを修復し、ジストロフィンタンパク質の活性を修復するように、先行する方法により改変された細胞が提示される。本明細書では、先行する方法により改変された細胞の、ＤＭＤ患者への投与により、ＤＭＤを改善するための方法がさらに提示される。
本明細書で記載される発明は、本概要でまとめられた例に限定されないことが理解される。本明細書では、多様な他の態様についても、記載および例示する。
本明細書で開示し、説明するＤＭＤの処置のための材料および方法の様々な態様は、付属の図面を参照して、より良く理解することができる。
図１Ａは、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼについてのコドン最適化遺伝子を含むプラスミド（ＣＴｘ−１）である。また、ＣＴｘ−１プラスミドは、ｇＲＮＡスキャフォールド配列を含み、これは配列表の配列番号１〜４６７，０３０で列挙される配列からの２０ｂｐスペーサー配列、または配列表の配列番号１，４１０，４３０〜１，４１０，４７２で列挙される配列からの１９ｂｐスペーサー配列を含む。
図１Ｂは、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼについての異なるコドン最適化遺伝子を含むプラスミド（ＣＴｘ−２）である。また、ＣＴｘ−２プラスミドは、ｇＲＮＡスキャフォールド配列を含み、これは配列表の配列番号１〜４６７，０３０で列挙される配列からの２０ｂｐスペーサー配列、または配列表の配列番号１，４１０，４３０〜１，４１０，４７２で列挙される配列からの１９ｂｐスペーサー配列を含む。
図１Ｃは、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼについてのまた別の異なるコドン最適化遺伝子を含むプラスミド（ＣＴｘ−３）である。また、ＣＴｘ−３プラスミドは、ｇＲＮＡスキャフォールド配列を含み、これは配列表の配列番号１〜４６７，０３０で列挙される配列からの２０ｂｐスペーサー配列、または配列表の配列番号１，４１０，４３０〜１，４１０，４７２で列挙される配列からの１９ｂｐスペーサー配列を含む。
図２Ａは、タイプＩＩ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の図解である。
図２Ｂは、タイプＩＩ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の図解である。
図３Ａは、ジストロフィン遺伝子のエクソン４５、５１、および５３をターゲティングする、ＨＥＫ２９３ＴにおけるＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ ｇＲＮＡの切断効率を説明する。
図３Ｂは、ジストロフィン遺伝子のエクソン５５および７０をターゲティングする、ＨＥＫ２９３ＴにおけるＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ ｇＲＮＡの切断効率を説明する。
図４Ａは、ジストロフィン遺伝子のエクソン４３、４４、４５、４６、５０、５１、５２、５３、および５５のスプライスアクセプターをターゲティングする、ＨＥＫ２９３ＴにおけるＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ ｇＲＮＡの切断効率を説明する。
図４Ｂは、ジストロフィン遺伝子のエクソン４３、４４、４５、４６、５０、５１、５２、５３、および５５のスプライスアクセプターをターゲティングする、ＨＥＫ２９３ＴにおけるＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ、およびＳ．ａｕｒｅｕｓ ｇＲＮＡの切断効率を説明する。
図４Ｃは、ジストロフィン遺伝子のエクソン４３、４４、４５、４６、５０、５１、５２、５３、および５５のスプライスアクセプターをターゲティングする、ＨＥＫ２９３ＴにおけるＣｐｆ１ ｇＲＮＡの切断効率を説明する。
図５Ａ〜Ｂは、ジストロフィン遺伝子のエクソン５１、４５、５３、４４、４６、５２、５０、４３、および５５をターゲティングする、ＨＥＫ２９３ＴにおけるＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ ｇＲＮＡの切断効率およびスプライスアクセプターノックアウト効率を説明する。 図５Ａ〜Ｂは、ジストロフィン遺伝子のエクソン５１、４５、５３、４４、４６、５２、５０、４３、および５５をターゲティングする、ＨＥＫ２９３ＴにおけるＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ ｇＲＮＡの切断効率およびスプライスアクセプターノックアウト効率を説明する。
図６は、ジストロフィン遺伝子のエクソン５１、４５、５３、４４、４６、５２、５０、４３、および５５をターゲティングする、ＨＥＫ２９３ＴにおけるＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ（ＮＭ）、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ（ＳＴ）、およびＳ．ａｕｒｅｕｓ（ＳＡ）ｇＲＮＡの切断効率およびスプライスアクセプターノックアウト効率を説明する。
図７Ａは、ｇＲＮＡがジストロフィン遺伝子のエクソン５２を囲む領域をターゲティングする、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ ｇＲＮＡの切断効率を説明する。
図７Ｂは、ｇＲＮＡがジストロフィン遺伝子のエクソン４４、４５、および５４を囲む領域をターゲティングする、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ ｇＲＮＡの切断効率を説明する。
図８Ａは、ｇＲＮＡがジストロフィン遺伝子のエクソン５２を囲む領域をターゲティングする、ｉＰＳＣにおけるＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ ｇＲＮＡの切断効率を説明する。
図８Ｂは、ｇＲＮＡがジストロフィン遺伝子のエクソン４４、４５、および５４を囲む領域をターゲティングする、ｉＰＳＣにおけるＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ ｇＲＮＡの切断効率を説明する。
図９は、ｇＲＮＡがジストロフィン遺伝子のエクソン４４、４５、５２、および５４を囲む領域をターゲティングする、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞およびｉＰＳＣにおけるＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ ｇＲＮＡの切断効率の比較を説明する。
図１０Ａ、図１０Ｂ、および図１０Ｃは、クローン欠失事象のクローン解析を説明する。 図１０Ａ、図１０Ｂ、および図１０Ｃは、クローン欠失事象のクローン解析を説明する。
図１１Ａおよび図１１Ｂは、Δ５２クローンのサンガーシークエンシングを説明する。
図１２Ａ〜Ｅは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ：ｉｎ−ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ）ｇＲＮＡスクリーニングにより選択したｇＲＮＡの切断効率を説明する。 図１２Ａ〜Ｅは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ：ｉｎ−ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ）ｇＲＮＡスクリーニングにより選択したｇＲＮＡの切断効率を説明する。 図１２Ａ〜Ｅは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ：ｉｎ−ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ）ｇＲＮＡスクリーニングにより選択したｇＲＮＡの切断効率を説明する。 図１２Ａ〜Ｅは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ：ｉｎ−ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ）ｇＲＮＡスクリーニングにより選択したｇＲＮＡの切断効率を説明する。 図１２Ａ〜Ｅは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ：ｉｎ−ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ）ｇＲＮＡスクリーニングにより選択したｇＲＮＡの切断効率を説明する。
図１３Ａは、ジストロフィン遺伝子のエクソン４５〜５５間の相同性指向修復（ＨＤＲ）を説明する。
図１３Ｂは、ジストロフィン遺伝子のエクソン４５〜５５ローカス(遺伝子座)でのＨＤＲのＰＣＲ確認を示す。
図１４Ａは、３プライマーＰＣＲアッセイを示す。
図１４Ｂは、３プライマーＰＣＲアッセイからの結果を示す。
図１４Ｃは、３プライマーＰＣＲアッセイから発生したデータを説明する。
図１５は、所望のΔ４５〜５５欠失を有する５つのクローンを説明する。
図１６Ａ〜Ｂは、所望のΔ４５〜５５欠失を有する５つのクローンのＳＳＥＡ−４染色およびＴＲＡ−１６０染色結果を説明する。
図１７は、全ての５つの編集済みクローンについての内部欠失ジストロフィンタンパク質の発現を示す。
図１８は、分化したクローン５６のミオシン重鎖染色を示す。
図１９Ａ〜１９ＶＶは、ラージスケールのレンチウイルススクリーニングの結果を説明する。 図１９Ａ〜１９ＶＶは、ラージスケールのレンチウイルススクリーニングの結果を説明する。 図１９Ａ〜１９ＶＶは、ラージスケールのレンチウイルススクリーニングの結果を説明する。 図１９Ａ〜１９ＶＶは、ラージスケールのレンチウイルススクリーニングの結果を説明する。 図１９Ａ〜１９ＶＶは、ラージスケールのレンチウイルススクリーニングの結果を説明する。 図１９Ａ〜１９ＶＶは、ラージスケールのレンチウイルススクリーニングの結果を説明する。 図１９Ａ〜１９ＶＶは、ラージスケールのレンチウイルススクリーニングの結果を説明する。 図１９Ａ〜１９ＶＶは、ラージスケールのレンチウイルススクリーニングの結果を説明する。 図１９Ａ〜１９ＶＶは、ラージスケールのレンチウイルススクリーニングの結果を説明する。 図１９Ａ〜１９ＶＶは、ラージスケールのレンチウイルススクリーニングの結果を説明する。 図１９Ａ〜１９ＶＶは、ラージスケールのレンチウイルススクリーニングの結果を説明する。 図１９Ａ〜１９ＶＶは、ラージスケールのレンチウイルススクリーニングの結果を説明する。 図１９Ａ〜１９ＶＶは、ラージスケールのレンチウイルススクリーニングの結果を説明する。 図１９Ａ〜１９ＶＶは、ラージスケールのレンチウイルススクリーニングの結果を説明する。 図１９Ａ〜１９ＶＶは、ラージスケールのレンチウイルススクリーニングの結果を説明する。 図１９Ａ〜１９ＶＶは、ラージスケールのレンチウイルススクリーニングの結果を説明する。 図１９Ａ〜１９ＶＶは、ラージスケールのレンチウイルススクリーニングの結果を説明する。 図１９Ａ〜１９ＶＶは、ラージスケールのレンチウイルススクリーニングの結果を説明する。 図１９Ａ〜１９ＶＶは、ラージスケールのレンチウイルススクリーニングの結果を説明する。 図１９Ａ〜１９ＶＶは、ラージスケールのレンチウイルススクリーニングの結果を説明する。 図１９Ａ〜１９ＶＶは、ラージスケールのレンチウイルススクリーニングの結果を説明する。 図１９Ａ〜１９ＶＶは、ラージスケールのレンチウイルススクリーニングの結果を説明する。 図１９Ａ〜１９ＶＶは、ラージスケールのレンチウイルススクリーニングの結果を説明する。 図１９Ａ〜１９ＶＶは、ラージスケールのレンチウイルススクリーニングの結果を説明する。 図１９Ａ〜１９ＶＶは、ラージスケールのレンチウイルススクリーニングの結果を説明する。 図１９Ａ〜１９ＶＶは、ラージスケールのレンチウイルススクリーニングの結果を説明する。 図１９Ａ〜１９ＶＶは、ラージスケールのレンチウイルススクリーニングの結果を説明する。 図１９Ａ〜１９ＶＶは、ラージスケールのレンチウイルススクリーニングの結果を説明する。 図１９Ａ〜１９ＶＶは、ラージスケールのレンチウイルススクリーニングの結果を説明する。 図１９Ａ〜１９ＶＶは、ラージスケールのレンチウイルススクリーニングの結果を説明する。 図１９Ａ〜１９ＶＶは、ラージスケールのレンチウイルススクリーニングの結果を説明する。 図１９Ａ〜１９ＶＶは、ラージスケールのレンチウイルススクリーニングの結果を説明する。 図１９Ａ〜１９ＶＶは、ラージスケールのレンチウイルススクリーニングの結果を説明する。 図１９Ａ〜１９ＶＶは、ラージスケールのレンチウイルススクリーニングの結果を説明する。 図１９Ａ〜１９ＶＶは、ラージスケールのレンチウイルススクリーニングの結果を説明する。 図１９Ａ〜１９ＶＶは、ラージスケールのレンチウイルススクリーニングの結果を説明する。 図１９Ａ〜１９ＶＶは、ラージスケールのレンチウイルススクリーニングの結果を説明する。 図１９Ａ〜１９ＶＶは、ラージスケールのレンチウイルススクリーニングの結果を説明する。 図１９Ａ〜１９ＶＶは、ラージスケールのレンチウイルススクリーニングの結果を説明する。 図１９Ａ〜１９ＶＶは、ラージスケールのレンチウイルススクリーニングの結果を説明する。 図１９Ａ〜１９ＶＶは、ラージスケールのレンチウイルススクリーニングの結果を説明する。 図１９Ａ〜１９ＶＶは、ラージスケールのレンチウイルススクリーニングの結果を説明する。 図１９Ａ〜１９ＶＶは、ラージスケールのレンチウイルススクリーニングの結果を説明する。 図１９Ａ〜１９ＶＶは、ラージスケールのレンチウイルススクリーニングの結果を説明する。 図１９Ａ〜１９ＶＶは、ラージスケールのレンチウイルススクリーニングの結果を説明する。 図１９Ａ〜１９ＶＶは、ラージスケールのレンチウイルススクリーニングの結果を説明する。 図１９Ａ〜１９ＶＶは、ラージスケールのレンチウイルススクリーニングの結果を説明する。 図１９Ａ〜１９ＶＶは、ラージスケールのレンチウイルススクリーニングの結果を説明する。
配列表の簡単な説明
配列番号１〜４６７，０３０は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼでジストロフィン遺伝子をターゲティングするためのｇＲＮＡ ２０ｂｐスペーサー配列のリストである。
配列番号４６７，０３１〜５２８，１９６は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼでジストロフィン遺伝子をターゲティングするためのｇＲＮＡ ２０ｂｐスペーサー配列のリストである。
配列番号５２８，１９７〜５５３，１９８は、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼでジストロフィン遺伝子をターゲティングするためのｇＲＮＡ ２４ｂｐスペーサー配列のリストである。
配列番号５５３，１９９〜５６３，９１１は、Ｔ．ｄｅｎｔｉｃｏｌａ Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼでジストロフィン遺伝子をターゲティングするためのｇＲＮＡ ２４ｂｐスペーサー配列のリストである。
配列番号５６３，９１２〜６２７，８５４は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼでジストロフィン遺伝子をターゲティングするためのｇＲＮＡ ２４ｂｐスペーサー配列のリストである。
配列番号６２７，８５５〜１，４１０，３９９は、Ａｃｉｄｏｍｉｎｏｃｃｏｃｃｕｓ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ、およびＦｒａｎｃｉｓｃｅｌｌａ Ｎｏｖｉｃｉｄａ Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼでジストロフィン遺伝子をターゲティングするためのｇＲＮＡ ２０〜２４ｂｐスペーサー配列のリストである。
配列番号１，４１０，４００〜１，４１０，４０２は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼでジストロフィン遺伝子をターゲティングするためのｇＲＮＡ ２４ｂｐスペーサー配列のリストである。
配列番号１，４１０，４０３〜１，４１０，４２９は、Ａｃｉｄｏｍｉｎｏｃｃｏｃｃｕｓ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ、およびＦｒａｎｃｉｓｃｅｌｌａ Ｎｏｖｉｃｉｄａ Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼでジストロフィン遺伝子をターゲティングするためのｇＲＮＡ ２３ｂｐスペーサー配列のリストである。
配列番号１，４１０，４３０〜１，４１０，４７２は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼでジストロフィン遺伝子をターゲティングするためのｇＲＮＡ １９ｂｐスペーサー配列のリストである。
詳細な説明
デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）
ＤＭＤは、ジストロフィン遺伝子（Ｘ染色体：３１，１１７，２２８〜３３，３４４，６０９（Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ：ＧＲＣｈ３８／ｈｇ３８））内の突然変異により引き起こされる。２．２メガ塩基の長さにわたるゲノム領域を伴うジストロフィンは、２番目に大きなヒト遺伝子である。ジストロフィン遺伝子は、７９のエクソンを含有し、これが、１１，０００塩基対のｍＲＮＡへとプロセシングされ、これが、４２７ｋＤａのタンパク質へと翻訳される。機能的に、ジストロフィンは、アクチンフィラメントと、筋線維内の細胞外マトリックスとの間のリンカーとして作用する。ジストロフィンのＮ末端は、アクチン結合性ドメインであるが、Ｃ末端は、筋線維を、細胞外マトリックスへとアンカリングする膜貫通スキャフォールドと相互作用する。筋収縮時に、ジストロフィンは、筋組織が、機械的な力に抗することを可能とする、構造的支持をもたらす。ＤＭＤは、ジストロフィン遺伝子内の多種多様な突然変異であって、早期終止コドンをもたらし、したがって、切断型ジストロフィンタンパク質をもたらす突然変異により引き起こされる。切断型ジストロフィンタンパク質は、Ｃ末端を含有せず、したがって、筋収縮の応力に抗するのに必要な構造的支持をもたらすことができない。結果として、筋線維は、引き離され、筋消耗をもたらす。
治療法
本明細書では、ゲノム操作ツールを使用して、ジストロフィンのリーディングフレームを修復し、ジストロフィンタンパク質の活性を修復しうる恒久的変化を、ゲノムに対して創出するための、細胞のｅｘ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ方法が提示される。このような方法は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ヌクレアーゼなどのエンドヌクレアーゼを使用して、ジストロフィン遺伝子の、ゲノムローカス内のエクソンを、恒久的に欠失させる（切り出す）か、挿入するか、または置きかえる（欠失させ、かつ、挿入する）（すなわち、コーディングおよび／またはスプライシング配列内の突然変異）。このようにして、本発明は、単回というわずかな回数の処置で（エクソンスキッピングオリゴを、患者の生涯にわたり送達するのではなく）、エクソンスキッピングにより作製される産物を模倣し、かつ／またはリーディングフレームを修復する。前臨床研究は、亜鉛フィンガー、ＴＡＬＥ、およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベースのヌクレアーゼを使用して、ターゲティングされた変化を、ゲノムへと施すことにより、ジストロフィンのＣ末端の発現に関して実施した。一例では、ＤＭＤを伴う患者のうちの６０％を超える患者を処置すると推定される、大きなゲノム領域の欠失を行った。
本明細書では、ＤＭＤを伴う患者を処置するための方法が提示される。このような方法の例は、ｅｘ ｖｉｖｏにおける細胞ベースの療法である。例えば、ＤＭＤ患者特異的なｉＰＳ細胞株を創出する。次いで、本明細書で記載される材料および方法を使用して、これらのｉＰＳ細胞の染色体ＤＮＡを矯正する。次に、矯正されたｉＰＳＣを、Ｐａｘ７＋筋始原細胞へと分化させる。最後に、始原細胞を、患者へと植え込む。このｅｘ ｖｉｖｏ方法には、多くの利点が存在する。
ｅｘ ｖｉｖｏにおける細胞療法の１つの利点は、投与前において、治療剤についての包括的な解析を行う能力である。全てのヌクレアーゼベースの治療剤は、あるレベルのオフ標的作用を及ぼす。ｅｘ ｖｉｖｏにおける遺伝子矯正の実施は、植込みの前に、矯正された細胞集団を完全に特徴付けることを可能とする。本開示の態様は、矯正された細胞の全ゲノムをシークエンシングして、オフ標的切断が、存在する場合、患者に対する最小限の危険性と関連するゲノム位置にあることを確保することを含む。さらに、細胞のクローン集団を、植込みの前に単離することができる。
ｅｘ ｖｉｖｏにおける細胞療法の別の利点は、他の初代細胞供給源と比較した、ｉＰＳＣ内の遺伝子矯正に関する。ｉＰＳＣは、多産であり、細胞ベースの療法に要求される多数の細胞を得ることを容易とする。さらに、ｉＰＳＣは、クローン単離を実施するために理想的な細胞型である。これは、生存率を低下させる危険を犯さずに、正確なゲノム矯正のためのスクリーニングを可能とする。これに対し、初代筋芽細胞など、他の潜在的な細胞型は、少数の継代だけにわたり生存可能であり、クローン的に拡大することが困難である。また、患者特異的ＤＭＤ筋芽細胞は、ジストロフィンタンパク質の欠如のために、不健全でもありうる。他方、患者由来のＤＭＤ ｉＰＳＣは、この分化状態では、ジストロフィンを発現しないので、罹患表現型を提示しない。したがって、ＤＭＤ ｉＰＳＣの操作は、はるかに容易であり、所望の遺伝子矯正を施すのに必要とされる時間の量を短縮しうる。
ｅｘ ｖｉｖｏにおける細胞療法のさらなる利点は、筋芽細胞と対比した、筋原性Ｐａｘ７＋始原細胞の植込みに関する。Ｐａｘ７＋細胞は、筋原性サテライト細胞として許容されている。Ｐａｘ７＋始原細胞は、多核化筋線維の周縁部に存在する単核細胞である。損傷に応答して、始原細胞は、***し、既存の線維と融合する。これに対し、筋芽細胞は、植込み時に、筋線維と直接融合し、ｉｎ ｖｉｖｏにおける増殖能は最小限である。したがって、筋芽細胞が、反復的な損傷後における治癒の一助となりえないのに対し、Ｐａｘ７＋始原細胞は、リザーバーとして機能し、患者の生涯にわたり、筋肉を治癒させる一助となりうる。
このような方法の別の例は、ｉｎ ｖｉｖｏベースの療法である。この方法では、本明細書で記載される材料および方法を使用して、患者における細胞の染色体ＤＮＡを矯正する。
ｉｎ ｖｉｖｏにおける遺伝子治療の利点は、治療剤の作製および投与の容易さである。同じ治療的カクテルが、ＤＭＤ患者集団のサブセット（ｎ＞１）に到達する潜在的可能性を有しうる。これに対し、提起される、ｅｘ ｖｉｖｏにおける細胞療法は、各患者（ｎ＝１）のために、カスタムメイドの治療剤を開発することを要求する。ｅｘ ｖｉｖｏにおける細胞療法の開発には時間が要求されるが、ある特定の進行ＤＭＤ患者にはその時間はないことがある。
本明細書ではまた、ゲノム編集により、ヒト細胞内のジストロフィン遺伝子を編集するための細胞方法も提示される。例えば、細胞を、患者または動物から単離する。次いで、本明細書で記載される材料および方法を使用して、細胞の染色体ＤＮＡを矯正する。
コーディングおよびスプライシング配列内の突然変異に加えて、いくつかの種類のゲノム標的部位が存在しうる。
転写および翻訳の調節には、細胞内のタンパク質またはヌクレオチドと相互作用する、いくつかの異なるクラスの部位が関与する。転写因子または他のタンパク質のＤＮＡ結合性部位は、部位の役割について研究するのに突然変異または欠失のためにターゲティングされうることが多いが、それらはまた、遺伝子発現を変化させるのにターゲティングすることもできる。部位は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）または相同性により導かれる修復（ＨＤＲ）による直接的ゲノム編集を介して付加されうる。ゲノムシークエンシング、ＲＮＡ発現、および転写因子の結合についてのゲノムワイドの研究の使用の増大は、部位が、どのようにして、発生的または一時的な遺伝子調節をもたらすのかを同定する能力を増大させている。これらの制御系は直接的なものでありうるか、または複数のエンハンサーに由来する活性の統合を要求しうる広範な協同的調節を伴いうる。転写因子は、６〜１２ｂｐ長の縮重ＤＮＡ配列に結合することが典型的である。個々の部位によりもたらされる低レベルの特異性は、結合および機能的な結果に、複雑な相互作用および規則が関与することを示唆する。縮重性が小さな結合性部位は、調節のより簡便手段をもたらしうる。ゲノム内で類似する配列が少なく、オフ標的切断の潜在的可能性が小さい、より長い配列を指定するように、人工転写因子をデザインすることができる。遺伝子の調節または発現の変化を可能とするように、これらの種類の結合性部位のうちのいずれかを、突然変異させるか、欠失させるか、または創出することさえできる（Canver, M.C.ら、Nature（２０１５年））。
これらの特色を有する、遺伝子調節的領域の別のクラスは、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）結合性部位である。ｍｉＲＮＡとは、転写後遺伝子調節において鍵となる役割を果たすノンコーディングＲＮＡである。ｍｉＲＮＡは、全ての哺乳動物タンパク質コード遺伝子のうちの３０％の発現を調節しうる。さらなる低分子非コードＲＮＡを加えた、二本鎖ＲＮＡによる、特異的かつ強力な遺伝子サイレンシング（ＲＮＡｉ）が発見された（Canver, M.C.ら、Nature（２０１５年））。遺伝子サイレンシングに重要な非コードＲＮＡの最大のクラスは、ｍｉＲＮＡである。哺乳動物では、ｍｉＲＮＡはまず、個別の転写単位、タンパク質イントロンの一部、または他の転写物でありうる、長いＲＮＡ転写物として転写される。長い転写物は、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ（ｐｒｉｍａｒｙ ｍｉＲＮＡ）と呼ばれ、塩基対合の不完全なヘアピン構造を含む。これらのｐｒｉ−ｍｉＲＮＡは、Ｄｒｏｓｈａを伴う、核内のタンパク質複合体である、Ｍｉｃｒｏｐｒｏｃｅｓｓｓｏｒにより、１または複数の短いｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ（ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｍｉＲＮＡ）へと切断されうる。
ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡは、移出される、２ヌクレオチドの３’突出を伴う約７０ヌクレオチドの長さの短いステムループであり、１９〜２５ヌクレオチドの成熟ｍｉＲＮＡ：ｍｉＲＮＡ＊二重鎖になる。塩基対合安定性の小さなｍｉＲＮＡ鎖（ガイド鎖）は、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）へとロードされうる。パッセンジャーガイド鎖（＊でマークされる）は、機能的でありうるが、通例分解される。成熟ｍｉＲＮＡは、ＲＩＳＣを、標的ｍＲＮＡ内の部分的に相補的な配列モチーフであって、３’非翻訳領域（ＵＴＲ）内に主に見出される相補的配列モチーフへとテザリングし、転写後遺伝子サイレンシングを誘導する（Bartel, D.P.、Cell、１３６巻、２１５〜２３３頁（２００９年）；Saj, A.およびLai, E.C.、Curr Opin Genet Dev、２１巻、５０４〜５１０頁（２０１１年））。
ｍｉＲＮＡは、発生、分化、細胞周期、および増殖の制御、ならびに哺乳動物および他の多細胞の生物の事実上全ての生物学的経路において重要でありうる。ｍｉＲＮＡはまた、細胞周期の制御、アポトーシス、および幹細胞分化、造血、低酸素状態、筋発生、神経発生、インスリン分泌、コレステロール代謝、老化、ウイルスの複製、および免疫応答にも関与しうる。
単一のｍｉＲＮＡが、数百の異なるｍＲＮＡ転写物をターゲティングしうる一方で、個々の転写物は、多くの異なるｍｉＲＮＡによりターゲティングされうる。最新版のｍｉＲＢａｓｅ（ｖ．２１）では、２８６４５を超えるマイクロＲＮＡが、注釈されている。一部のｍｉＲＮＡは、複数のローカスによりコードされる場合があり、それらの一部は、タンデムに共転写されたクラスターから発現しうる。特色は、複数の経路およびフィードバック制御を伴う、複雑な調節ネットワークを可能とする。ｍｉＲＮＡは、これらのフィードバックおよび調節回路の不可欠な部分である可能性があり、タンパク質の産生を限界内に保つことにより、遺伝子発現を調節する一助となりうる（Herranz, H.およびCohen, S.M.、Gene Dev、２４巻、１３３９〜１３４４頁（２０１０年）；Posadas, D.M.およびCarthew, R.W.、Curr Opin Genet Dev、２７巻、１〜６頁（２０１４年））。
ｍｉＲＮＡはまた、異常なｍｉＲＮＡ発現と関連する多数のヒト疾患においても重要でありうる。この関連は、ｍｉＲＮＡ調節経路の重要性を裏書きする。最近のｍｉＲＮＡ欠失研究は、ｍｉＲＮＡを、免疫応答の調節と連関させている（Stern-Ginossar, N.ら、Science、３１７巻、３７６〜３８１頁（２００７年））。
ｍｉＲＮＡはまた、がんとも強力な連関を有し、異なる種類のがんにおいて役割を果たしうる。ｍｉＲＮＡは、いくつかの腫瘍において、下方調節されることが見出されている。ｍｉＲＮＡは、細胞周期の制御およびＤＮＡの損傷への応答など、鍵となるがん関連経路の調節において重要な場合があり、したがって、診断において使用することができ、臨床においてターゲティングすることができる。マイクロＲＮＡは、全てのマイクロＲＮＡを枯渇させる実験が、腫瘍血管新生を抑制するように、血管新生の平衡を精密に調節しうる（Chen, S.ら、Genes Dev、２８巻、１０５４〜１０６７頁（２０１４年））。
タンパク質コーディング遺伝子について示されている通り、ｍｉＲＮＡ遺伝子はまた、がんと共に生じる後成的（ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ）変化下にも置かれうる。多くのｍｉＲＮＡローカスは、ＤＮＡのメチル化によるそれらの調節の機会を増大させるＣｐＧアイランドと関連しうる（Weber, B.、Stresemann, C.、Brueckner, B.、およびLyko, F.、Cell Cycle、６巻、１００１〜１００５頁（２００７年））。研究の大半は、クロマチンリモデリング薬による処理を使用して、ｍｉＲＮＡの後成的サイレンシングを明らかにしている。
ＲＮＡサイレンシングにおけるそれらの役割に加えて、ｍｉＲＮＡはまた、翻訳も活性化させうる（Posadas, D.M.およびCarthew, R.W.、Curr Opin Genet Dev、２７巻、１〜６頁（２０１４年））。これらの部位のノックアウトが、標的遺伝子の発現の低下をもたらしうるのに対し、これらの部位の導入は、発現を増大させうる。
個々のｍｉＲＮＡは、結合特異性に重要でありうる、シード配列（２〜８塩基のマイクロＲＮＡ）を突然変異させることにより、最も効果的にノックアウトすることができる。この領域内の切断、続いてＮＨＥＪによる誤修復は、標的部位への結合を遮断することにより、ｍｉＲＮＡの機能を効果的に消失させうる。ｍｉＲＮＡはまた、回文配列に隣接する特殊なループ領域の特異的ターゲティングによっても阻害しうるであろう。触媒的に不活性なＣａｓ９はまた、ｓｈＲＮＡの発現を阻害するのにのにも使用することができる（Zhao, Y.ら、Sci Rep、４巻、３９４３頁（２０１４年））。ｍｉＲＮＡのターゲティングに加えて、結合部位もまた、ターゲティングされ、突然変異させて、ｍｉＲＮＡによるサイレンシングを防止することができる。
ヒト細胞
本明細書で記載および例示される通りに、ＤＭＤを改善するために、遺伝子編集のための主要な標的は、ヒト細胞である。例えば、ｅｘ ｖｉｖｏ方法では、ヒト細胞は、記載される技法を使用して改変された後に、Ｐａｘ７＋筋始原細胞をもたらしうる体細胞でありうる。例えば、ｉｎ ｖｉｖｏ方法では、ヒト細胞は、筋細胞または筋前駆細胞でありうる。
それを必要とする患者に由来し、したがって、既に患者と完全にマッチしている自家細胞内で遺伝子編集を実施することにより、患者へと安全に再導入することが可能であり、患者の疾患と関連する、１または複数の臨床状態の改善において有効でありうる細胞集団を効果的にもたらす細胞を作出することが可能である。
始原細胞（本明細書ではまた、幹細胞とも称する）は、増殖およびより多くの始原細胞をもたらすことのいずれもが可能であり、分化細胞または分化可能な娘細胞をもたらしうる、多数の母細胞を発生させる能力を有する。娘細胞自体が、増殖し、その後、１または複数の成熟細胞型へと分化する一方で、また、親の発生的潜在能を伴う１または複数の細胞も保持する後代をもたらすように、誘導することができる。次いで、「幹細胞」という用語は、特定の状況下では、より特化したまたは分化した表現型へと分化する能力または潜在的能力を伴い、ある特定の状況下では、実質的に分化せずに、増殖する能力を保持する細胞を指す。一態様では、始原細胞または幹細胞という用語は、それらの子孫細胞（後代）が分化により、例えば、胚細胞および組織の、進行する多様化においてそうであるように、完全に個別の性格を獲得することにより、しばしば、異なる方向に特化する汎用母細胞を指す。細胞の分化とは、典型的に、多くの細胞***を介して生じる、複雑な過程である。分化細胞は、複能性細胞に由来することが可能であり、複能性細胞はそれ自体、複能性細胞に由来するなどである。これらの複能性細胞の各々は、幹細胞であると考えられるが、各々がもたらしうる細胞型の範囲は、大幅に変動しうる。一部の分化細胞もまた、発生的潜在能が大きな細胞をもたらす能力を有する。このような能力は、天然の場合もあり、多様な因子による処理時に、人工的に誘導される場合もある。多くの生物学的事例では、幹細胞はまた、１つを超える別個の細胞型の後代をもたらしうるため、「複能性」でもありうるが、これは、「幹細胞性」であるために必要ではない。
自己再生は、幹細胞の別の重要な側面でありうる。理論的に、自己再生は、２つの主要な機構のうちのいずれかにより生じうる。幹細胞は、一方の娘細胞が、幹細胞状態を保持し、他方の娘細胞が、何らかの別個の他の特異的機能および表現型を発現して、非対称的に***する場合がある。代替的に、集団内の幹細胞の一部が、２つの幹細胞へと、対称的に***することが可能であり、これにより、全体としての集団内に一部の幹細胞を維持するのに対し、集団内の他の細胞は、分化した後代だけをもたらす。一般に、「始原細胞」は、より始原性である（すなわち、発生経路または進行に沿って、完全な分化細胞より早期の段階にある）、細胞の表現型を有する。始原細胞はまた、顕著な、または極めて高度な、増殖潜在能も有する。始原細胞は、細胞が発生および分化する、発生の経路および環境に応じて、複数の別個の分化細胞型をもたらす場合もあり、単一の分化細胞型をもたらす場合もある。
細胞の個体発生の文脈では、「分化した」または「〜を分化させること」という形容詞は、相対的な用語である。「分化細胞」とは、比較する細胞より、発生経路をさらに下に進んだ細胞である。したがって、幹細胞は、分化系統限定前駆細胞（筋細胞の始原細胞など）へと分化することが可能であり、これは、経路をさらに下った、他の種類の前駆細胞（筋細胞の前駆細胞など）へと分化することが可能であり、次いで、筋細胞など、最終段階の分化細胞へと分化し、ある特定の組織型において、特徴的な役割を果たし、さらに増殖する能力を保持する場合もあり、保持しない場合もある。
誘導多能性幹細胞
一部の例では、本明細書で記載される、遺伝子操作されたヒト細胞は、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）でありうる。ｉＰＳＣを使用する利点は、細胞を、始原細胞が投与される同じ対象から導出しうることである。すなわち、体細胞は、対象から得、誘導多能性幹細胞へと再プログラム化し、次いで、対象へと投与するように、始原細胞へと再分化させることができる（例えば、自家細胞）。始原細胞は、自家供給源から本質的に導出されるため、別の対象または対象群に由来する細胞の使用と比較して、生着拒絶またはアレルギー応答の危険性を低減することができる。加えて、ｉＰＳＣの使用は、胚供給源から得られた細胞に対する必要も無化する。したがって、一態様では、開示される方法で使用される幹細胞は、胚性幹細胞ではない。
分化は、生理学的文脈では、一般に、不可逆的であるが、体細胞を、ｉＰＳＣへと再プログラム化するためのいくつかの方法が最近開発されている。当業者には、例示的な方法が公知であり、本明細書の下記で略述する。
「〜を再プログラム化すること」という用語は、分化細胞（例えば、体細胞）の分化状態を変更するまたは逆行させ工程を指す。言い換えると、再プログラム化することとは、細胞の分化を、より未分化なまたはより始原的な細胞型へと戻すように駆動する工程を指す。多くの初代細胞を培養することは、完全な分化特徴の、何らかの喪失をもたらしうることに留意されたい。したがって、分化細胞という用語に含まれるこのような細胞を単に培養するだけで、これらの細胞が、非分化細胞（例えば、未分化細胞）または多能性細胞となるわけではない。分化細胞から多能性への移行は、培養物中で分化的性格の部分的な喪失をもたらす刺激を越えた、再プログラム化刺激を要求する。再プログラム化細胞はまた、培養物中では一般に、回数の限定された***能だけを有する初代親細胞と比べて、増殖可能性の喪失を伴わない、拡大継代能の特徴も有する。
再プログラム化されるべき細胞は、再プログラム化する前に、部分分化している場合もあり、最終分化している場合もある。再プログラム化は、分化細胞（例えば、体細胞）の分化状態の、多能性状態または複能性状態への完全な逆行を包含する。再プログラム化は、分化細胞（例えば、体細胞）の分化状態の、未分化細胞（例えば、胚様細胞）への完全なまたは部分的な逆行を包含しうる。再プログラム化は、細胞による特定の遺伝子であって、その発現が、再プログラム化にさらに寄与する遺伝子の発現をもたらしうる。本明細書で記載されるある特定の例では、分化細胞（例えば、体細胞）の再プログラム化は、分化細胞に、未分化状態を取らせうる（例えば、分化細胞を、未分化細胞としうる）。結果として得られる細胞を、「再プログラム化細胞」または「誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣまたはｉＰＳ細胞）」と称する。
再プログラム化は、細胞の分化の間に生じる遺伝パターンであって、核酸修飾（例えば、メチル化）、クロマチン凝縮、後成的変化、ゲノムインプリンティングなどの遺伝性パターンの少なくとも一部の変更、例えば、逆行を伴いうる。再プログラム化は、既に多能性である細胞の、既存の未分化状態を単に維持すること、または既に複能性細胞（例えば、筋原性幹細胞）である細胞の、既存の完全未満の分化状態を維持することとは別個である。再プログラム化はまた、既に多能性または複能性である細胞の自己再生または増殖の促進とも別個であるが、一部の例では、本明細書で記載される組成物および方法はまた、このような目的でも有用でありうる。
当技術分野では、体細胞から多能性幹細胞を作出するのに使用しうる多くの方法が公知である。体細胞を、多能性表現型へと再プログラム化する、任意のこのような方法が、本明細書で記載される方法における使用に適切であろう。
転写因子の規定された組合せを使用して、多能性細胞を作出するための再プログラム化法については記載されている。Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、およびｃ−Ｍｙｃの直接的な形質導入により、マウス体細胞を、発生の潜在能を拡大した、ＥＳ細胞様細胞へと転換することができる（例えば、TakahashiおよびYamanaka、Cell、１２６巻（４号）：６６３〜７６頁（２００６年）を参照されたい）。ｉＰＳＣは、多能性関連の転写回路およびエピジェネティックランドスケープの大半を修復するので、ＥＳ細胞に似ている。加えて、マウスｉＰＳＣは、多能性についての全ての標準的アッセイ：具体的には、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける、三胚葉の細胞型への分化、奇形腫の形成、キメラへの寄与、生殖細胞系列伝達［例えば、MaheraliおよびHochedlinger、Cell Stem Cell、３巻（６号）：５９５〜６０５頁（２００８年）を参照されたい］、および四倍体補完法を満たす。
ヒトｉＰＳＣは、同様の形質導入法を使用して得ることができ、転写因子のトリオである、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、およびＮＡＮＯＧは、多能性を統御する転写因子のコアセットとして確立されている（例えば、BudniatzkyおよびGepstein、Stem Cell Transl Med.、３巻（４号）：４４８〜５７頁（２０１４年）；Barrettら、Stem Cell Trans Med、３巻：１〜６頁、ｓｃｔｍ．２０１４−０１２１（２０１４年）；Focosiら、Blood Cancer Journal、４巻：ｅ２１１頁（２０１４年）；ならびにこれらにおいて引用されている参考文献を参照されたい）。ｉＰＳＣの作製は、従来通りにウイルスベクターを使用して、幹細胞関連遺伝子をコードする核酸配列を、成体の体細胞へと導入することにより達成することができる。
ｉＰＳＣは、最終分化した体細胞から作出または導出しうるほか、成体幹細胞または体細胞性幹細胞から作出または導出することもできる。すなわち、非多能性始原細胞を、再プログラム化することにより、多能性または複能性とすることができる。このような場合、最終分化細胞を再プログラム化するのに要求されるほど多くの再プログラム化因子を含むことが必要ではない場合がある。さらに、再プログラム化は、再プログラム化因子の非ウイルス的導入により誘導することができ、例えば、タンパク質自体を導入することにより、または再プログラム化因子をコードする核酸を導入することにより、または翻訳時に再プログラム化因子をもたらすメッセンジャーＲＮＡを導入することにより誘導することができる（例えば、Warrenら、Cell Stem Cell、７巻（５号）：６１８〜３０頁（２０１０年）を参照されたい）。再プログラム化は、例えば、Ｏｃｔ−４（Ｏｃｔ−３／４またはＰｏｕｆ５１としてもまた公知）、Ｓｏｘ１、Ｓｏｘ２、Ｓｏｘ３、Ｓｏｘ１５、Ｓｏｘ１８、ＮＡＮＯＧ、Ｋｌｆ１、Ｋｌｆ２、Ｋｌｆ４、Ｋｌｆ５、ＮＲ５Ａ２、ｃ−Ｍｙｃ、１−Ｍｙｃ、ｎ−Ｍｙｃ、Ｒｅｍ２、Ｔｅｒｔ、およびＬＩＮ２８を含む幹細胞関連遺伝子をコードする核酸の組合せを導入することにより達成することができる。本明細書で記載される方法および組成物を使用する再プログラム化は、Ｏｃｔ−３／４、Ｓｏｘファミリーのメンバー、Ｋｌｆファミリーのメンバー、およびＭｙｃファミリーのメンバーのうちの１または複数を、体細胞へと導入することをさらに含みうる。本明細書で記載される方法および組成物は、Ｏｃｔ−４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、ｃ−ＭＹＣ、およびＫｌｆ４のそれぞれのうちの１もしくは複数を、再プログラム化のために導入することをさらに含みうる。上記で言及した通り、再プログラム化のために使用される正確な方法は、本明細書で記載される方法および組成物にとって、必ずしも不可欠なわけではない。しかし、再プログラム化細胞から分化させた細胞を、例えば、ヒト治療において使用するべき場合、一態様では、再プログラム化は、ゲノムを変更する方法により行うわけではない。したがって、このような例では、再プログラム化は、例えば、ウイルスまたはプラスミドベクターを使用せずに達成することができる。
出発細胞集団から導出される再プログラム化の効率（すなわち、再プログラム化細胞の数）は、Shiら、Cell-Stem Cell、２巻：５２５〜５２８頁（２００８年）；Huangfuら、Nature Biotechnology、２６巻（７号）：７９５〜７９７頁（２００８年）；およびMarsonら、Cell-Stem Cell、３巻：１３２〜１３５頁（２００８年）により示される通り、多様な薬剤、例えば、低分子の添加により増強することができる。したがって、誘導多能性幹細胞作製の効率または速度を増強する薬剤または薬剤の組合せを、患者特異的または疾患特異的ｉＰＳＣの作製において使用することができる。再プログラム化効率を増強する薬剤の一部の非限定的な例は、とりわけ、可溶性Ｗｎｔ、Ｗｎｔ馴化培地、ＢＩＸ−０１２９４（Ｇ９ａヒストンメチルトランスフェラーゼ）、ＰＤ０３２５９０１（ＭＥＫ阻害剤）、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤、バルプロ酸、５’−アザシチジン、デキサメタゾン、スベロイルアニリドヒドロキサム酸（ＳＡＨＡ）、ビタミンＣ、およびトリコスタチン（ＴＳＡ）を含む。
再プログラム化増強剤の他の非限定的な例は、スベロイルアニリドヒドロキサム酸（ＳＡＨＡ（例えば、ＭＫ０６８３、ボリノスタット）および他のヒドロキサム酸）、ＢＭＬ−２１０、Ｄｅｐｕｄｅｃｉｎ（例えば、（−）−Ｄｅｐｕｄｅｃｉｎ）、ＨＣトキシン、Ｎｕｌｌｓｃｒｉｐｔ（４−（１，３−ジオキソ−１Ｈ，３Ｈ−ベンゾ［デ］イソキノリン−２−イル）−Ｎ−ヒドロキシブタンアミド）、フェニルブチレート（例えば、フェニル酪酸ナトリウムおよびバルプロ酸（ＶＰＡ）および他の短鎖脂肪酸）、Ｓｃｒｉｐｔａｉｄ、スラミンナトリウム、トリコスタチンＡ（ＴＳＡ）、ＡＰＨＡ化合物８、Ａｐｉｃｉｄｉｎ、酪酸ナトリウム、酪酸ピバロイルオキシメチル（Ｐｉｖａｎｅｘ、ＡＮ−９）、Ｔｒａｐｏｘｉｎ Ｂ、クラミドシン、デプシペプチド（ＦＲ９０１２２８またはＦＫ２２８としてもまた公知である）、ベンズアミド（例えば、ＣＩ−９９４（例えば、Ｎ−アセチルジナリン）およびＭＳ−２７−２７５）、ＭＧＣＤ０１０３、ＮＶＰ−ＬＡＱ−８２４、ＣＢＨＡ（ｍ−カルボキシ桂皮酸ビスヒドロキサム酸）、ＪＮＪ１６２４１１９９、Ｔｕｂａｃｉｎ、Ａ−１６１９０６、プロキサミド、オキサムフラチン、３−Ｃｌ−ＵＣＨＡ（例えば、６−（３−クロロフェニルウレイド）カプロンヒドロキサム酸）、ＡＯＥ（２−アミノ−８−オキソ−９，１０−エポキシデカン酸）、ＣＨＡＰ３１、およびＣＨＡＰ５０を含む。他の再プログラム化増強剤は、例えば、ＨＤＡＣのドミナントネガティブ形態（例えば、触媒不活性形態）、ｓｉＲＮＡによるＨＤＡＣ阻害剤、およびＨＤＡＣに特異的に結合する抗体を含む。このような阻害剤は、例えば、ＢＩＯＭＯＬ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｆｕｋａｓａｗａ、Ｍｅｒｃｋ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｎｏｖａｒｔｉｓ、Ｇｌｏｕｃｅｓｔｅｒ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｔｉｔａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、ＭｅｔｈｙｌＧｅｎｅ、およびＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから入手可能である。
本明細書で記載される方法による使用のための多能性幹細胞の誘導を確認するために、単離されたクローンを、幹細胞マーカーの発現について調べることができる。体細胞から導出された細胞内のこのような発現により、細胞を、誘導多能性幹細胞として同定する。幹細胞マーカーは、ＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４、ＣＤ９、Ｎａｎｏｇ、Ｆｂｘｌ５、Ｅｃａｔｌ、Ｅｓｇｌ、Ｅｒａｓ、Ｇｄｆ３、Ｆｇｆ４、Ｃｒｉｐｔｏ、Ｄａｘｌ、Ｚｐｆ２９６、Ｓｌｃ２ａ３、Ｒｅｘｌ、Ｕｔｆｌ、およびＮａｔｌを含む非限定的な群から選択することができる。１つの場合には、例えば、Ｏｃｔ４またはＮａｎｏｇを発現しる細胞は、多能性であると同定される。このようなマーカーの発現を検出するための方法は、例えば、ＲＴ−ＰＣＲ、およびウェスタンブロットまたはフローサイトメトリー解析など、コードされたポリペプチドの存在を検出する免疫学的方法を含みうる。検出は、ＲＴ−ＰＣＲを伴いうるだけでなく、タンパク質マーカーの検出も含みうる。細胞内マーカーは、ＲＴ−ＰＣＲ、または免疫細胞化学などのタンパク質検出法を介して、最もよく同定しうるが、細胞表面マーカーは、例えば、免疫細胞化学によりたやすく同定される。
単離された細胞の多能性幹細胞性は、ｉＰＳＣが、三胚葉の各々の細胞へと分化する能力について査定する試験により確認することができる。一例として述べると、ヌードマウスにおける奇形腫形成を使用して、単離されたクローンの多能性について査定することができる。細胞を、ヌードマウスへと導入し、細胞から生じる腫瘍に対して、組織学および／または免疫組織化学を実施することができる。三胚葉全てに由来する細胞を含む腫瘍の増殖は、例えば、細胞が多能性幹細胞であることをさらに指し示す。
ＤＭＤ患者特異的なｉＰＳＣの創出
本開示のｅｘ ｖｉｖｏ方法の１つのステップは、ＤＭＤ患者特異的な１つのｉＰＳ細胞、ＤＭＤ患者特異的な複数のｉＰＳ細胞、またはＤＭＤ患者特異的なｉＰＳ細胞株を創出することを伴いうる。TakahashiおよびYamanaka、２００６年；Takahashi、Tanabeら、２００７年において記載されている通り、当技術分野では、患者特異的ｉＰＳ細胞を創出するための、多くの方法が確立されている。加えて、多能性細胞の、筋系統への分化は、国際特許出願公開第ＷＯ２０１３／０３０２４３号および同第ＷＯ２０１２／１０１１１４号において記載されている通り、Ａｎａｇｅｎｅｓｉｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓにより開発された技術により達することができる。例えば、創出するステップは、ａ）皮膚細胞または線維芽細胞などの体細胞を、患者から単離することと；ｂ）細胞を、多能性幹細胞となるように誘導するために、多能性関連遺伝子のセットを、体細胞へと導入することとを含みうる。多能性関連遺伝子のセットは、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、Ｌｉｎ２８、ＮＡＮＯＧ、およびｃＭＹＣからなる群から選択される遺伝子のうちの１または複数でありうる。
ゲノム編集
ゲノム編集とは一般に、ゲノムのヌクレオチド配列を、好ましくは、精密なまたは所定の方式で修飾する工程を指す。本明細書で記載されるゲノム編集法の例は、部位特異的ヌクレアーゼを使用して、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を、ゲノム内の正確な標的位置で切断し、これにより、一本鎖または二本鎖ＤＮＡ切断を、ゲノム内の特定の位置において創出する方法を含む。このような切断は、最近、Coxら、Nature Medicine、２１巻（２号）、１２１〜３１頁（２０１５年）において総説された通り、相同性により導かれる修復（ＨＤＲ）および非相同末端結合（ＮＨＥＪ）など、天然の内因性細胞過程により修復することが可能であり、規則的に修復されている。ＮＨＥＪは、二本鎖切断から生じるＤＮＡ末端を直接接合させるが、場合によって、ヌクレオチド配列の喪失または付加であって、遺伝子発現を破壊する場合もあり、増強する場合もある、喪失または付加を伴う。ＨＤＲは、相同配列またはドナー配列を、規定されたＤＮＡ配列を切断点に挿入するための鋳型として利用する。相同配列は、姉妹染色分体など、内因性ゲノム内に存在しうる。代替的に、ドナーは、ヌクレアーゼにより切断されるローカスとの相同性が大きな領域を有するが、切断された標的ローカスへと組み込まれうる欠失を含む、さらなる配列または配列変化も含有しうる、プラスミド、一本鎖オリゴヌクレオチド、二本鎖オリゴヌクレオチド、二重鎖オリゴヌクレオチド、またはウイルスなどの外因性核酸でありうる。第３の修復機構は、「代替的ＮＨＥＪ」ともまた称する、マイクロ相同性媒介型末端結合（ＭＭＥＪ）であって、切断部位において、小規模の欠失および挿入が生じうるという点で、遺伝子結果がＮＨＥＪと同様である、ＭＭＥＪでありうる。ＭＭＥＪは、より好適な、ＤＮＡ末端の接合による修復結果を駆動するように、ＤＮＡ切断部位を挟む、少数の塩基対による相同配列を使用することができ、最近の報告は、この工程の分子機構についてさらに解明している（例えば、ChoおよびGreenberg、Nature、５１８巻、１７４〜７６頁（２０１５年）；Kentら、Nature Structural and Molecular Biology、Ａｄｖ．Ｏｎｌｉｎｅ ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｓｍｂ．２９６１（２０１５年）；Mateos-Gomezら、Nature、５１８巻、２５４〜５７頁（２０１５年）；Ceccaldiら、Nature、５２８巻、２５８〜６２頁（２０１５年）を参照されたい）。一部の場合には、ＤＮＡ切断部位における潜在的なマイクロ相同性についての解析に基づき、可能性が高い修復結果を予測することが可能でありうる。
これらのゲノム編集機構の各々を使用して、所望のゲノムの変更を創出することができる。ゲノム編集工程内のステップは、意図される突然変異部位の近傍にまで近接した、標的ローカス内で、１つのＤＮＡ切断、または２つのＤＮＡ切断であって、二本鎖切断または２つの一本鎖切断としての２つのＤＮＡ切断を創出することでありうる。これは、本明細書で記載および例示される通り、部位特異的ポリペプチドの使用を介して達成することができる。
ＤＮＡエンドヌクレアーゼなどの部位特異的ポリペプチドは、二本鎖切断または一本鎖切断を、核酸内、例えば、ゲノムＤＮＡ内に導入しうる。二本鎖切断は、細胞の内因性ＤＮＡ修復経路（例えば、相同性依存型修復あるいは非相同末端結合または代替的非相同末端結合（Ａ−ＮＨＥＪ）もしくはマイクロ相同性媒介型末端結合）を刺激しうる。ＮＨＥＪは、相同鋳型を必要とせずに、切断された標的核酸を修復しうる。これは、場合によって、標的核酸内の切断部位において、小規模の欠失または挿入（インデル）をもたらす可能性があり、遺伝子発現の破壊または変更をもたらしうる。ＨＤＲは、相同な修復鋳型またはドナーが利用可能である場合に生じうる。相同なドナー鋳型は、標的核酸切断部位を挟む配列と相同でありうる配列を含みうる。姉妹染色分体は、細胞により、修復鋳型として使用されうる。しかし、ゲノム編集の目的では、修復鋳型は、プラスミド、二重鎖オリゴヌクレオチド、一本鎖オリゴヌクレオチド、二本鎖オリゴヌクレオチド、またはウイルス核酸などの外因性核酸として供給することができる。さらなるまたは変更された核酸配列もまた、標的ローカスへと組み込まれるように、外因性ドナー鋳型と共に、さらなる核酸配列（トランス遺伝子など）または修飾（単一または複数の塩基変化または欠失など）を、相同性のフランキング領域の間に導入することができる。ＭＭＥＪは、切断部位において、小規模の欠失および挿入が生じうるという点で、ＮＨＥＪと同様な遺伝子結果をもたらしうる。ＭＭＥＪは、好適な、末端接合によるＤＮＡ修復結果を駆動するように、切断部位を挟む、少数の塩基対の相同配列を使用しうる。一部の場合には、ヌクレアーゼ標的領域内の潜在的なマイクロ相同性についての解析に基づき、可能性が高い修復結果を予測することが可能でありうる。
したがって、場合によって、相同組換えを使用して、外因性ポリヌクレオチド配列を、標的核酸切断部位へと挿入することができる。本明細書では、外因性ポリヌクレオチド配列を、ドナーポリヌクレオチド（またはドナーもしくはドナー配列もしくはポリヌクレオチドドナー鋳型）と称する。ドナーポリヌクレオチド、ドナーポリヌクレオチドの一部、ドナーポリヌクレオチドのコピー、またはドナーポリヌクレオチドのコピーの一部を、標的核酸切断部位へと挿入することができる。ドナーポリヌクレオチドは、外因性ポリヌクレオチド配列、すなわち、標的核酸切断部位において、天然には存在しない配列でありうる。
ＮＨＥＪおよび／またはＨＤＲによる標的ＤＮＡの修飾は、例えば、突然変異、欠失、変更、組込み、遺伝子の矯正、遺伝子の置きかえ、遺伝子のタグ付け、トランス遺伝子の挿入、ヌクレオチドの欠失、遺伝子の破壊、転座、および／または遺伝子の突然変異をもたらしうる。ゲノムＤＮＡを欠失させ、非天然核酸を、ゲノムＤＮＡへと組み込む工程は、ゲノム編集の例である。
ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ系
ＣＲＩＳＰＲ（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ）ゲノムローカスは、多くの原核生物（例えば、細菌および古細菌）のゲノム内で見出すことができる。原核生物では、ＣＲＩＳＰＲローカスは、原核生物を、ウイルスおよびファージなど、外来の侵入者に対して防御する一助となる、ある種の免疫系として機能する産物をコードする。ＣＲＩＳＰＲローカスの機能の３つの段階：新たな配列の、ＣＲＩＳＰＲローカスへの組込み、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）の発現、および外来の侵入者核酸のサイレンシングが存在する。５種類のＣＲＩＳＰＲ系（例えば、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、Ｕ型、およびＶ型）が同定されている。
ＣＲＩＳＰＲローカスは、「リピート」と称する、いくつかの短い反復配列を含む。発現すると、リピートは、二次構造（例えば、ヘアピン）を形成する場合もあり、かつ／または非構造化一本鎖配列を構成する場合もある。リピートは通例、クラスターで生じ、種間で顕著に異なることが多い。リピートは、「スペーサー」と称する固有の介在配列で規則的に隔てられる結果として、リピート−スペーサー−リピートローカスアーキテクチャーをもたらす。スペーサーは、既知の外来インベーダー配列と同一であるか、またはこれと高度な相同性を有する。スペーサー−リピート単位は、スペーサー−リピート単位の成熟形態へとプロセシングされる、ｃｒｉｓｐｒＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）をコードする。ｃｒＲＮＡは、標的核酸のターゲティングに関与する、「シード」またはスペーサー配列（原核生物における天然に存在する形態では、スペーサー配列は、外来のインベーダー核酸をターゲティングする）を含む。スペーサー配列は、ｃｒＲＮＡの５’または３’末端に位置する。
ＣＲＩＳＰＲローカスはまた、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）遺伝子をコードするポリヌクレオチド配列も含む。Ｃａｓ遺伝子は、原核生物におけるｃｒＲＮＡ機能の生合成および干渉段階に関与するエンドヌクレアーゼをコードする。一部のＣａｓ遺伝子は、相同な二次および／または三次構造を含む。
ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系
天然のＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系におけるｃｒＲＮＡの生合成は、ｔｒａｃｒＲＮＡ（ｔｒａｎｓ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ）を要求する。ｔｒａｃｒＲＮＡは、内因性ＲＮアーゼＩＩＩにより修飾され、次いで、ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡアレイ内のｃｒＲＮＡリピートとハイブリダイズすることができる。内因性ＲＮアーゼＩＩＩを動員して、ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡを切断することができる。切断されたｃｒＲＮＡを、エクソリボヌクレアーゼによるトリミング（例えば、５’トリミング）にかけて、成熟ｃｒＲＮＡ形態をもたらすことができる。ｔｒａｃｒＲＮＡを、さらに、ｃｒＲＮＡとハイブリダイズさせたままにすることができ、ｔｒａｃｒＲＮＡおよびｃｒＲＮＡは、部位特異的ポリペプチド（例えば、Ｃａｓ９）と会合する。ｃｒＲＮＡ−ｔｒａｃｒＲＮＡ−Ｃａｓ９複合体のｃｒＲＮＡは、複合体を、ｃｒＲＮＡがハイブリダイズしうる標的核酸へとガイドしうる。ｃｒＲＮＡの、標的核酸とのハイブリダイゼーションは、Ｃａｓ９を、ターゲティングされた核酸切断のために活性化させうる。ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系内の標的核酸を、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）と称する。天然では、ＰＡＭは、部位特異的ポリペプチド（例えば、Ｃａｓ９）の、標的核酸への結合を容易とするのに不可欠である。ＩＩ型系（また、ＮｍｅｎｉまたはＣＡＳＳ４とも称する）は、ＩＩ−Ａ型（ＣＡＳＳ４）およびＩＩ−Ｂ（ＣＡＳＳ４ａ）へとさらに細分することができる。Jinekら、Science、３３７巻（６０９６号）：８１６〜８２１頁（２０１２年）は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系が、ＲＮＡによりプログラム可能なゲノム編集に有用であることを示し、国際特許出願公開第ＷＯ２０１３／１７６７７２号は、部位特異的遺伝子編集のための、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ系の多数の例および適用を提示する。
Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ系
Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ系は、ＩＩ型系との、いくつかの重要な差違を有する。例えば、Ｃｐｆ１は、ＩＩ型系とは対照的に、ｔｒａｃｒＲＮＡを欠く、単一のＲＮＡによりガイドされるエンドヌクレアーゼである。実際、Ｃｐｆ１関連ＣＲＩＳＰＲアレイは、ｔｒａｃｒＲＮＡをさらにトランス活性化させる要件なしに、成熟ｃｒＲＮＡへとプロセシングされうる。Ｖ型ＣＲＩＳＰＲアレイは、各成熟ｃｒＲＮＡが、１９ヌクレオチドのダイレクトリピートで始まり、２３〜２５ヌクレオチドのスペーサー配列を後続させる、４２〜４４ヌクレオチドの長さの短い成熟ｃｒＲＮＡへとプロセシングされうる。これに対し、ＩＩ型系における成熟ｃｒＲＮＡは、２０〜２４ヌクレオチドのスペーサー配列で始まり、約２２ヌクレオチドのダイレクトリピートを後続させうる。また、Ｃｐｆ１は、Ｃｐｆ１−ｃｒＲＮＡ複合体が、短いＴリッチＰＡＭを先行させる標的ＤＮＡを効率的に切断するように、Ｔリッチプロトスペーサー隣接モチーフを利用するが、これは、ＩＩ型系についての標的ＤＮＡが、ＧリッチＰＡＭを後続させるのと対照的である。したがって、Ｖ型系が、ＰＡＭから遠い点で切断するのに対し、ＩＩ型系は、ＰＡＭと隣接する点で切断する。加えて、ＩＩ型系とは対照的に、Ｃｐｆ１は、４または５ヌクレオチドの５’突出を伴う、ずれた位置でのＤＮＡの二本鎖切断を介してＤＮＡを切断する。ＩＩ型系は、平滑末端型二本鎖切断を介して切断する。ＩＩ型系と同様に、Ｃｐｆ１は、予測されるＲｕｖＣ様エンドヌクレアーゼドメインを含有するが、第２のＨＮＨエンドヌクレアーゼドメインを欠き、これは、ＩＩ型系と対照的である。
Ｃａｓ遺伝子／ポリペプチドおよびプロトスペーサー隣接モチーフ
例示的なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓポリペプチドは、Fonfaraら、Nucleic Acids Research、４２巻：２５７７〜２５９０頁（２０１４年）の図１におけるＣａｓ９ポリペプチドを含む。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子を名乗る系は、Ｃａｓ遺伝子が発見されて以来、広範にわたり書き換えられている。Fonfara、前出の図５は、多様な種に由来するＣａｓ９ポリペプチドのＰＡＭ配列を提示する。
部位特異的ポリペプチド
部位特異的ポリペプチドは、ＤＮＡを切断するためにゲノム編集において使用されるヌクレアーゼである。部位特異的ポリペプチドは、細胞または患者へと、１または複数のポリペプチドとして投与することもでき、ポリペプチドをコードする１または複数のｍＲＮＡとして投与することもできる。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１系の文脈では、部位特異的ポリペプチドは、ガイドＲＮＡに結合することが可能であり、ガイドＲＮＡは、ポリペプチドが導かれる標的ＤＮＡ内の部位を指定する。本明細書で開示されるＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１系では、部位特異的ポリペプチドは、ＤＮＡエンドヌクレアーゼなどのエンドヌクレアーゼでありうる。
部位特異的ポリペプチドは、複数の核酸切断（すなわち、ヌクレアーゼ）ドメインを含みうる。２つまたはこれを超える核酸切断ドメインは、リンカーを介して、併せて連結することができる。例えば、リンカーは、可撓性リンカーを含みうる。リンカーは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、またはこれを超えるアミノ酸の長さを含みうる。
天然に存在する野生型のＣａｓ９酵素は、２つのヌクレアーゼドメインである、ＨＮＨヌクレアーゼドメインおよびＲｕｖＣドメインを含む。本明細書において、「Ｃａｓ９」とは、天然に存在するＣａｓ９および組換えＣａｓ９の両方を指す。本明細書で想定されるＣａｓ９酵素は、ＨＮＨもしくはＨＮＨ様ヌクレアーゼドメイン、および／またはＲｕｖＣもしくはＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインを含みうる。
ＨＮＨまたはＨＮＨ様ドメインは、ＭｃｒＡ様フォールドを含む。ＨＮＨまたはＨＮＨ様ドメインは、２つのアンチパラレルのβ鎖およびα螺旋を含む。ＨＮＨまたはＨＮＨ様ドメインは、金属結合性部位（例えば、二価カチオン結合性部位）を含む。ＨＮＨまたはＨＮＨ様ドメインは、標的核酸（例えば、ｃｒＲＮＡによりターゲティングされる鎖の相補鎖）の１つの鎖を切断しうる。
ＲｕｖＣまたはＲｕｖＣ様ドメインは、ＲＮアーゼＨまたはＲＮアーゼＨ様フォールドを含む。ＲｕｖＣ／ＲＮアーゼＨドメインは、ＲＮＡおよびＤＮＡの両方に対する作用を含む核酸ベースの機能の多様なセットに関与する。ＲＮアーゼＨドメインは、複数のα螺旋により取り囲まれた、５つのβ鎖を含む。ＲｕｖＣ／ＲＮアーゼＨまたはＲｕｖＣ／ＲＮアーゼＨ様ドメインは、金属結合性部位（例えば、二価カチオン結合性部位）を含む。ＲｕｖＣ／ＲＮアーゼＨまたはＲｕｖＣ／ＲＮアーゼＨ様ドメインは、標的核酸（例えば、二本鎖標的ＤＮＡの非相補鎖）の１つの鎖を切断しうる。
部位特異的ポリペプチドは、二本鎖切断または一本鎖切断を、核酸内、例えば、ゲノムＤＮＡ内に導入しうる。二本鎖切断は、細胞の内因性ＤＮＡ修復経路（例えば、相同性依存型修復（ＨＤＲ）あるいは非相同末端結合（ＮＨＥＪ）または代替的非相同末端結合（Ａ−ＮＨＥＪ）もしくはマイクロ相同性媒介型末端結合（ＭＭＥＪ））を刺激しうる。ＮＨＥＪは、相同鋳型を必要とせずに、切断された標的核酸を修復しうる。これは、場合によって、標的核酸内の切断部位において、小規模の欠失または挿入（インデル）をもたらす可能性があり、遺伝子発現の破壊または変更をもたらしうる。ＨＤＲは、相同な修復鋳型またはドナーが利用可能である場合に生じうる。相同なドナー鋳型は、標的核酸切断部位を挟む配列と相同である配列を含みうる。姉妹染色分体は、細胞により、修復鋳型として使用されうる。しかし、ゲノム編集の目的では、修復鋳型は、プラスミド、二重鎖オリゴヌクレオチド、一本鎖オリゴヌクレオチドまたはウイルス核酸などの外因性核酸として供給することができる。さらなるまたは変更された核酸配列もまた、標的ローカスへと組み込まれるように、外因性ドナー鋳型と共に、さらなる核酸配列（トランス遺伝子など）または修飾（単一または複数の塩基変化または欠失など）を、相同性のフランキング領域の間に導入することができる。ＭＭＥＪは、切断部位において、小規模の欠失および挿入が生じうるという点で、ＮＨＥＪと同様な遺伝子結果をもたらしうる。ＭＭＥＪは、好適な、末端接合によるＤＮＡ修復結果を駆動するように、切断部位を挟む、少数の塩基対による相同配列を使用しうる。一部の場合には、ヌクレアーゼ標的領域内の潜在的なマイクロ相同性についての解析に基づき、可能性が高い修復結果を予測することが可能でありうる。
したがって、場合によって、相同組換えを使用して、外因性ポリヌクレオチド配列を、標的核酸切断部位へと挿入することができる。本明細書では、外因性ポリヌクレオチド配列を、ドナーポリヌクレオチド（またはドナーもしくはドナー配列）と称する。ドナーポリヌクレオチド、ドナーポリヌクレオチドの一部分、ドナーポリヌクレオチドのコピー、またはドナーポリヌクレオチドのコピーの一部を、標的核酸切断部位へと挿入することができる。ドナーポリヌクレオチドは、外因性ポリヌクレオチド配列、すなわち、標的核酸切断部位において、天然には存在しない配列でありうる。
ＮＨＥＪおよび／またはＨＤＲによる標的ＤＮＡの修飾は、例えば、突然変異、欠失、変更、組込み、遺伝子の矯正、遺伝子の置きかえ、遺伝子のタグ付け、トランス遺伝子の挿入、ヌクレオチドの欠失、遺伝子の破壊、転座、および／または遺伝子の突然変異をもたらしうる。ゲノムＤＮＡを欠失させ、非天然核酸を、ゲノムＤＮＡへと組み込む工程は、ゲノム編集の例である。
部位特異的ポリペプチドは、例示的な、野生型の部位特異的ポリペプチド［例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓに由来するＣａｓ９；ＵＳ２０１４／００６８７９７における配列番号８；またはSapranauskasら、Nucleic Acids Res、３９巻（２１号）：９２７５〜９２８２頁（２０１１年）］、および多様な他の部位特異的ポリペプチドに対する、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含みうる。
部位特異的ポリペプチドは、１０連続アミノ酸にわたり、野生型の部位特異的ポリペプチド（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓに由来するＣａｓ９、前出）に対する、少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９５、９７、９９、または１００％の同一性を含む。部位特異的ポリペプチドは、１０連続アミノ酸にわたり、野生型の部位特異的ポリペプチド（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓに由来するＣａｓ９、前出）に対する、最大で７０、７５、８０、８５、９０、９５、９７、９９、または１００％の同一性を含みうる。部位特異的ポリペプチドは、部位特異的ポリペプチドのＨＮＨヌクレアーゼドメイン内の１０連続アミノ酸にわたり、野生型の部位特異的ポリペプチド（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓに由来するＣａｓ９、前出）に対する、少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９５、９７、９９、または１００％の同一性を含みうる。部位特異的ポリペプチドは、部位特異的ポリペプチドのＨＮＨヌクレアーゼドメイン内の１０連続アミノ酸にわたり、野生型の部位特異的ポリペプチド（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓに由来するＣａｓ９、前出）に対する、最大で７０、７５、８０、８５、９０、９５、９７、９９、または１００％の同一性を含みうる。部位特異的ポリペプチドは、部位特異的ポリペプチドのＲｕｖＣヌクレアーゼドメイン内の１０連続アミノ酸にわたり、野生型の部位特異的ポリペプチド（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓに由来するＣａｓ９、前出）に対する、少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９５、９７、９９、または１００％の同一性を含みうる。部位特異的ポリペプチドは、部位特異的ポリペプチドのＲｕｖＣヌクレアーゼドメイン内の１０連続アミノ酸にわたり、野生型の部位特異的ポリペプチド（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓに由来するＣａｓ９、前出）に対する、最大で７０、７５、８０、８５、９０、９５、９７、９９、または１００％の同一性を含む。
部位特異的ポリペプチドは、例示的な野生型の部位特異的ポリペプチドの修飾形態を含みうる。例示的な野生型の部位特異的ポリペプチドの修飾形態は、部位特異的ポリペプチドの核酸切断活性を低減する突然変異を含みうる。例示的な野生型の部位特異的ポリペプチドの修飾形態は、例示的な野生型の部位特異的ポリペプチド（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓに由来するＣａｓ９、前出）の核酸切断活性のうちの、９０％未満、８０％未満、７０％未満、６０％未満、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満、または１％未満を有しうる。部位特異的ポリペプチドの修飾形態は、実質的な核酸切断活性を有さない場合がある。部位特異的ポリペプチドが、実質的な核酸切断活性を有さない修飾形態である場合、本明細書では、「酵素的に不活性」と称する。
部位特異的ポリペプチドの修飾形態は、それが、標的核酸上の一本鎖切断（ＳＳＢ）を誘導しうる（例えば、二本鎖標的核酸の糖−リン酸骨格のうちの１つだけを切断することにより）ように、突然変異を含みうる。突然変異は、野生型の部位特異的ポリペプチド（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓに由来するＣａｓ９、前出）の複数の核酸切断ドメインのうちの１または複数における核酸切断活性のうちの、９０％未満、８０％未満、７０％未満、６０％未満、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満、または１％未満をもたらしうる。突然変異は、標的核酸の相補鎖を切断する能力は保持するが、標的核酸の非相補鎖を切断するその能力は低減する、複数の核酸切断ドメインのうちの１または複数をもたらしうる。突然変異は、標的核酸の非相補鎖を切断する能力は保持するが、標的核酸の相補鎖を切断するその能力は低減する、複数の核酸切断ドメインのうちの１または複数をもたらしうる。例えば、例示的な野生型Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９ポリペプチド内の残基、例えば、Ａｓｐ１０、Ｈｉｓ８４０、Ａｓｎ８５４、およびＡｓｎ８５６を突然変異させて、複数の核酸切断ドメイン（例えば、ヌクレアーゼドメイン）のうちの１または複数を不活化する。突然変異させるべき残基は、例示的な野生型Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９ポリペプチド内の残基Ａｓｐ１０、Ｈｉｓ８４０、Ａｓｎ８５４、およびＡｓｎ８５６（例えば、配列および／または構造アライメントにより決定される）に対応しうる。突然変異の非限定的な例は、Ｄ１０Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、またはＮ８５６Ａを含む。当業者は、アラニン置換以外の突然変異が適しうることを認識しうる。
Ｄ１０Ａ突然変異を、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、またはＮ８５６Ａ突然変異のうちの１または複数と組み合わせて、ＤＮＡ切断活性を実質的に欠く部位特異的ポリペプチドを作製することができる。Ｈ８４０Ａ突然変異を、Ｄ１０Ａ、Ｎ８５４Ａ、またはＮ８５６Ａ突然変異のうちの１または複数と組み合わせて、ＤＮＡ切断活性を実質的に欠く部位特異的ポリペプチドを作製することができる。Ｎ８５４Ａ突然変異を、Ｈ８４０Ａ、Ｄ１０Ａ、またはＮ８５６Ａ突然変異のうちの１または複数と組み合わせて、ＤＮＡ切断活性を実質的に欠く部位特異的ポリペプチドを作製することができる。Ｎ８５６Ａ突然変異を、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、またはＤ１０Ａ突然変異のうちの１または複数と組み合わせて、ＤＮＡ切断活性を実質的に欠く部位特異的ポリペプチドを作製することができる。１つの実質的に不活性なヌクレアーゼドメインを含む部位特異的ポリペプチドを、「ニッカーゼ」と称する。
ＲＮＡにガイドされるエンドヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９のニッカーゼ変異体を使用して、ＣＲＩＳＰＲにより媒介されるゲノム編集の特異性を増大させることができる。野生型のＣａｓ９は、標的配列（内因性のゲノムローカスなど）内の、指定された約２０ヌクレオチドの配列とハイブリダイズするようにデザインされた、単一のガイドＲＮＡによりガイドされることが典型的である。しかし、ガイドＲＮＡと標的ローカスとのいくつかのミスマッチが許容される可能性があり、標的部位内で要求される相同性の長さを、例えば、最小で１３ｎｔの相同性まで効果的に低減し、これにより、標的ゲノム内の他の場所で、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９複合体による、結合および二本鎖核酸切断（オフ標的切断としてもまた公知である）の潜在的可能性の上昇をもたらす。Ｃａｓ９のニッカーゼ変異体は各々、１つの鎖だけを切断するため、二本鎖切断を創出するためには、１対のニッカーゼが、近接して、かつ、標的核酸の逆鎖上で結合し、これにより、二本鎖切断の同等物である、１対のニックを創出することが必要である。これは、２つの別個のガイドＲＮＡ（各ニッカーゼにつき１つずつ）が、近接して、かつ、標的核酸の逆鎖上で結合しなければならないことを要求する。この要件は本質的に、二本鎖切断が生じるために必要とされる、最小の相同性の長さを二倍にし、これにより、２つのガイドＲＮＡ部位（存在する場合）が、二本鎖切断の形成を可能とするのに十分な程度に、互いと近接する可能性が低い場合に、二本鎖切断イベントが、ゲノム内の別の場所で生じる可能性を低減する。当技術分野で記載される通り、ニッカーゼはまた、ＨＤＲを、ＮＨＥＪと対比して促進するのにも使用することができる。ＨＤＲを使用して、所望の変化を効果的に媒介する特異的ドナー配列の使用を介して、選択された変化を、ゲノム内の標的部位へと導入することができる。遺伝子編集における使用のための、多様なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系についての記載は、例えば、国際特許出願公開第ＷＯ２０１３／１７６７７２号；およびNature Biotechnology、３２巻、３４７〜３５５頁（２０１４年）；ならびにこれらにおいて引用されている参考文献において見出すことができる。
想定される突然変異は、置換、付加、および欠失、またはこれらの任意の組合せを含みうる。突然変異は、突然変異させるアミノ酸を、アラニンへと転換する。突然変異は、突然変異させるアミノ酸を、別のアミノ酸（例えば、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、プロリン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、ヒスチジン、リシン、またはアルギニン）へと転換する。突然変異は、突然変異させるアミノ酸を、天然のアミノ酸（例えば、セレノメチオニン）へと転換する。突然変異は、突然変異させるアミノ酸を、アミノ酸模倣体（例えば、リン酸化模倣体）へと転換する。突然変異は、保存的突然変異でありうる。例えば、突然変異は、突然変異させるアミノ酸を、サイズ、形状、電荷、極性、コンフォメーションが相似するアミノ酸、および／または突然変異させるアミノ酸のロタマー（例えば、システイン／セリン突然変異、リシン／アスパラギン突然変異、ヒスチジン／フェニルアラニン突然変異）へと転換しうる。突然変異は、リーディングフレームのシフトおよび／または早期終止コドンの創出を引き起こしうる。突然変異は、遺伝子の調節的領域、または１もしくは複数の遺伝子の発現に影響を及ぼすローカスへの変化を引き起こしうる。
部位特異的ポリペプチド（例えば、変異体の、突然変異させた、酵素的に不活性の、および／または条件的に酵素的に不活性の部位特異的ポリペプチド）は、核酸をターゲティングしうる。部位特異的ポリペプチド（例えば、変異体の、突然変異させた、酵素的に不活性の、および／または条件的に酵素的に不活性のエンドリボヌクレアーゼ）は、ＤＮＡをターゲティングしうる。部位特異的ポリペプチド（例えば、変異体の、突然変異させた、酵素的に不活性の、および／または条件的に酵素的に不活性のエンドリボヌクレアーゼ）は、ＲＮＡをターゲティングしうる。
部位特異的ポリペプチドは、１または複数の非天然配列（例えば、部位特異的ポリペプチドは、融合タンパク質である）を含みうる。
部位特異的ポリペプチドは、細菌（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）に由来するＣａｓ９、核酸結合性ドメイン、および２つの核酸切断ドメイン（すなわち、ＨＮＨドメインおよびＲｕｖＣドメイン）に対して、少なくとも１５％のアミノ酸同一性を含むアミノ酸配列を含みうる。
部位特異的ポリペプチドは、細菌（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）に由来するＣａｓ９、および２つの核酸切断ドメイン（すなわち、ＨＮＨドメインおよびＲｕｖＣドメイン）に対して、少なくとも１５％のアミノ酸同一性を含むアミノ酸配列を含みうる。
部位特異的ポリペプチドは、細菌（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）に由来するＣａｓ９、および２つの核酸切断ドメインに対して、少なくとも１５％のアミノ酸同一性を含むアミノ酸配列を含むことが可能であり、この場合、核酸切断ドメインの一方または両方は、細菌（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）に由来するＣａｓ９に由来するヌクレアーゼドメインに対する、少なくとも５０％のアミノ酸同一性を含む。
部位特異的ポリペプチドは、細菌（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）に由来するＣａｓ９、２つの核酸切断ドメイン（すなわち、ＨＮＨドメインおよびＲｕｖＣドメイン）、および部位特異的ポリペプチドを、非天然配列へと連結する、非天然配列（例えば、核局在化シグナル）またはリンカーに対して、少なくとも１５％のアミノ酸同一性を含むアミノ酸配列を含みうる。
部位特異的ポリペプチドは、細菌（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）に由来するＣａｓ９、２つの核酸切断ドメイン（すなわち、ＨＮＨドメインおよびＲｕｖＣドメイン）に対して、少なくとも１５％のアミノ酸同一性を含むアミノ酸配列を含むことが可能であり、この場合、部位特異的ポリペプチドは、核酸切断ドメインの一方または両方における突然変異であって、ヌクレアーゼドメインの切断活性を、少なくとも５０％低減する突然変異を含む。
部位特異的ポリペプチドは、細菌（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）に由来するＣａｓ９、および２つの核酸切断ドメイン（すなわち、ＨＮＨドメインおよびＲｕｖＣドメイン）に対して、少なくとも１５％のアミノ酸同一性を含むアミノ酸配列を含むことが可能であり、この場合、ヌクレアーゼドメインのうちの１つは、アスパラギン酸１０の突然変異を含み、かつ／またはヌクレアーゼドメインのうちの１つは、ヒスチジン８４０の突然変異を含むことが可能であり、突然変異は、ヌクレアーゼドメインの切断活性を、少なくとも５０％低減する。
１または複数の部位特異的ポリペプチド、例えば、ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、ゲノム内の特異的ローカスにおいて、１つの二本鎖切断を併せて生じさせる２つのニッカーゼ、またはゲノム内の特異的ローカスにおいて、２つの二本鎖切断を併せて生じさせるかまたは引き起こす４つのニッカーゼを含みうる。代替的に、１つの部位特異的ポリペプチド、例えば、ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、ゲノム内の特異的ローカスにおいて、１つの二本鎖切断を生じさせうるかまたは引き起こしうる。
ゲノムターゲティング核酸
本開示は、会合させたポリペプチド（例えば、部位特異的ポリペプチド）の活性を、標的核酸内の特異的標的配列へと導きうるゲノムターゲティング核酸を提示する。ゲノムターゲティング核酸は、ＲＮＡでありうる。本明細書では、ゲノムターゲティングＲＮＡを、「ガイドＲＮＡ」または「ｇＲＮＡ」と称する。ガイドＲＮＡは、少なくとも目的の標的核酸配列とハイブリダイズするスペーサー配列と、ＣＲＩＳＰＲリピート配列とを含みうる。ＩＩ型系では、ｇＲＮＡはまた、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列と呼ばれる第２のＲＮＡも含む。ＩＩ型ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）では、ＣＲＩＳＰＲリピート配列と、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列とは、互いとハイブリダイズして、二重鎖を形成する。Ｖ型ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）では、ｃｒＲＮＡが二重鎖を形成する。いずれの系でも、ガイドＲＮＡと、部位特異的ポリペプチドとが、複合体を形成するように、二重鎖は、部位特異的ポリペプチドに結合しうる。ゲノムターゲティング核酸は、部位特異的ポリペプチドとのその会合により、複合体に、標的特異性をもたらしうる。したがって、ゲノムターゲティング核酸は、部位特異的ポリペプチドの活性を導きうる。
例示的なガイドＲＮＡは、配列表内のスペーサー配列であって、ジストロフィン遺伝子内またはその近傍にあるそれらの標的配列のゲノム位置、および関連する、Ｃａｓ９により切断される部位と共に示されるスペーサー配列を含み、ここで、ゲノム位置は、ＧＲＣｈ３８／ｈｇ３８ヒトゲノムアセンブリーに基づく。
各ガイドＲＮＡは、ジストロフィン遺伝子内またはその近傍にある、そのゲノムの標的配列と相補的なスペーサー配列を含むようにデザインすることができる。例えば、配列表内のスペーサー配列の各々を、単鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）（例えば、ＲＮＡキメラ）またはｃｒＲＮＡ（対応するｔｒａｃｒＲＮＡと共に）へとまとめることができる。Jinekら、Science、３３７巻、８１６〜８２１頁（２０１２年）；およびDeltchevaら、Nature、４７１巻、６０２〜６０７頁（２０１１年）を参照されたい。
ゲノムターゲティング核酸は、二重分子ガイドＲＮＡでありうる。ゲノムターゲティング核酸は、単一分子ガイドＲＮＡでありうる。
二重分子ガイドＲＮＡは、ＲＮＡの２つの鎖を含みうる。第１の鎖は、５’〜３’方向に、任意選択のスペーサー伸長配列、スペーサー配列、および最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列を含む。第２の鎖は、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列（最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列と相補的）、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列、および任意選択のｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列を含みうる。
ＩＩ型系内の単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）は、５’〜３’方向に、任意選択のスペーサー伸長配列、スペーサー配列、最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列、単一分子ガイドリンカー、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列、および任意選択のｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列を含みうる。任意選択のｔｒａｃｒＲＮＡ伸長は、ガイドＲＮＡの、さらなる機能性（例えば、安定性）に寄与するエレメントを含みうる。単一分子ガイドリンカーは、最小ＣＲＩＳＰＲリピートと、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列とを連結して、ヘアピン構造を形成しうる。任意選択のｔｒａｃｒＲＮＡ伸長は、１または複数のヘアピンを含みうる。
Ｖ型系内の単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）は、５’〜３’方向に、最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列およびスペーサー配列を含みうる。
例示を目的として述べると、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ／Ｃｐｆ１系において使用されるガイドＲＮＡ、または他のより低分子のＲＮＡは、下記で例示され、当技術分野で記載される通り、化学的手段によりたやすく合成することができる。化学合成手順が、持続的に拡大しつつある一方で、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ；ＰＡＧＥなど、ゲルの使用を回避する）などの手順による、このようなＲＮＡの精製は、ポリヌクレオチド長が、１００ほどのヌクレオチドを優に超えて増大するにつれて、難しくなる傾向がある。より長いＲＮＡを作出するために使用される１つの手法は、併せてライゲーションされる、２つまたはこれを超える分子を作製することである。Ｃａｓ９またはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼをコードするＲＮＡなど、はるかに長いＲＮＡは、酵素により、よりたやすく作出される。多様な種類のＲＮＡ修飾、例えば、当技術分野で記載される、安定性を増強し、自然免疫応答の可能性もしくは程度を低減し、かつ／または他の属性を増強する修飾は、ＲＮＡの化学合成および／または酵素による作出中に導入することもでき、これらの後で導入することもできる。
スペーサー伸長配列
ゲノムターゲティング核酸についての一部の例では、スペーサー伸長配列は、活性を修飾することも可能であり、安定性をもたらすことも可能であり、かつ／またはゲノムターゲティング核酸を修飾するための位置をもたらすこともできる。スペーサー伸長配列は、オンまたはオフ標的活性または特異性を修飾しうる。一部の例では、スペーサー伸長配列を提供することができる。スペーサー伸長配列は、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２０、２４０、２６０、２８０、３００、３２０、３４０、３６０、３８０、４００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、もしくは７０００、またはこれを超えるヌクレオチドを超える長さを有しうる。スペーサー伸長配列は、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２０、２４０、２６０、２８０、３００、３２０、３４０、３６０、３８０、４００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、またはこれを超えるヌクレオチド未満の長さを有しうる。スペーサー伸長配列は、１０ヌクレオチド未満の長さでありうる。スペーサー伸長配列は、１０〜３０ヌクレオチドの間の長さでありうる。スペーサー伸長配列は、３０〜７０ヌクレオチドの間の長さでありうる。
スペーサー伸長配列は、別の部分（例えば、安定性制御配列、エンドリボヌクレアーゼ結合配列、リボザイム）を含みうる。この部分は、核酸ターゲティング核酸の安定性を低下させる場合もあり、増大させる場合もある。この部分は、転写ターミネーターセグメント（すなわち、転写終結配列）でありうる。この部分は、真核細胞内で機能しうる。この部分は、原核細胞内で機能しうる。この部分は、真核細胞内および原核細胞内の両方で機能しうる。適切な部分の非限定的な例は、５’キャップ（例えば、７−メチルグアニル酸キャップ（ｍ７Ｇ））、リボスイッチ配列（例えば、安定性の調節ならびに／またはタンパク質およびタンパク質複合体のアクセシビリティの調節を可能とする）、ｄｓＲＮＡ二重鎖（すなわち、ヘアピン）を形成する配列、ＲＮＡを、細胞内の場所（例えば、核、ミトコンドリア、クロロプラストなど）へとターゲティングする配列、トラッキングをもたらす修飾もしくは配列（例えば、蛍光分子への直接のコンジュゲーション、蛍光の検出を容易とする部分へのコンジュゲーション、蛍光の検出を可能とする配列など）、および／またはタンパク質の結合部位をもたらす修飾もしくは配列（例えば、転写活性化因子、転写抑制因子、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、ＤＮＡデメチラーゼ、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、ヒストンデアセチラーゼなどを含む、ＤＮＡに対して作用するタンパク質）を含む。
スペーサー配列
スペーサー配列は、目的の標的核酸内の配列とハイブリダイズする。ゲノムターゲティング核酸のスペーサーは、ハイブリダイゼーション（すなわち、塩基対合）を介して、配列特異的に、標的核酸と相互作用しうる。スペーサーのヌクレオチド配列は、目的の標的核酸の配列に応じて変動しうる。
本明細書のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系では、スペーサー配列は、系内で使用されるＣａｓ９酵素のＰＡＭの５’側に位置する標的核酸とハイブリダイズするようにデザインすることができる。スペーサーは、標的配列に完全にマッチする場合もあり、ミスマッチを有する場合もある。各Ｃａｓ９酵素は、それが標的ＤＮＡ内で認識する、特定のＰＡＭ配列を有する。例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓは、標的核酸内で、配列５’−ＮＲＧ−３’［配列中、Ｒは、ＡまたはＧを含み、Ｎは、任意のヌクレオチドであり、Ｎは、スペーサー配列によりターゲティングされる標的核酸配列のすぐ３’側にある］を含むＰＡＭを認識する。
標的核酸配列は、２０ヌクレオチドを含みうる。標的核酸は、２０未満のヌクレオチドを含みうる。標的核酸は、２０を超えるヌクレオチドを含みうる。標的核酸は、少なくとも５、１０、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、またはこれを超えるヌクレオチドを含みうる。一部の例では、標的核酸は、最大で５、１０、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、またはこれを超えるヌクレオチドを含む。標的核酸配列は、ＰＡＭの最初のヌクレオチドのすぐ５’側の２０塩基を含みうる。例えば、５’−ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＲＧ−３’（配列番号１，４１０，４７３）を含む配列では、標的核酸は、複数のＮに対応する配列［配列中、Ｎは、任意のヌクレオチドであり、下線を付したＮＲＧ配列は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓのＰＡＭである］を含みうる。
標的核酸とハイブリダイズするスペーサー配列は、少なくとも約６ヌクレオチド（ｎｔ）の長さを有しうる。スペーサー配列は、少なくとも約６ｎｔ、少なくとも約１０ｎｔ、少なくとも約１５ｎｔ、少なくとも約１８ｎｔ、少なくとも約１９ｎｔ、少なくとも約２０ｎｔ、少なくとも約２５ｎｔ、少なくとも約３０ｎｔ、少なくとも約３５ｎｔ、または少なくとも約４０ｎｔ、約６ｎｔ〜約８０ｎｔ、約６ｎｔ〜約５０ｎｔ、約６ｎｔ〜約４５ｎｔ、約６ｎｔ〜約４０ｎｔ、約６ｎｔ〜約３５ｎｔ、約６ｎｔ〜約３０ｎｔ、約６ｎｔ〜約２５ｎｔ、約６ｎｔ〜約２０ｎｔ、約６ｎｔ〜約１９ｎｔ、約１０ｎｔ〜約５０ｎｔ、約１０ｎｔ〜約４５ｎｔ、約１０ｎｔ〜約４０ｎｔ、約１０ｎｔ〜約３５ｎｔ、約１０ｎｔ〜約３０ｎｔ、約１０ｎｔ〜約２５ｎｔ、約１０ｎｔ〜約２０ｎｔ、約１０ｎｔ〜約１９ｎｔ、約１９ｎｔ〜約２５ｎｔ、約１９ｎｔ〜約３０ｎｔ、約１９ｎｔ〜約３５ｎｔ、約１９ｎｔ〜約４０ｎｔ、約１９ｎｔ〜約４５ｎｔ、約１９ｎｔ〜約５０ｎｔ、約１９ｎｔ〜約６０ｎｔ、約２０ｎｔ〜約２５ｎｔ、約２０ｎｔ〜約３０ｎｔ、約２０ｎｔ〜約３５ｎｔ、約２０ｎｔ〜約４０ｎｔ、約２０ｎｔ〜約４５ｎｔ、約２０ｎｔ〜約５０ｎｔ、または約２０ｎｔ〜約６０ｎｔでありうる。一部の例では、スペーサー配列は、２０ヌクレオチドを含みうる。スペーサー配列は、１９ヌクレオチドを含みうる。
一部の例では、スペーサー配列と標的核酸との相補性パーセントは、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％である。一部の例では、スペーサー配列と標的核酸との相補性パーセントは、最大で約３０％、最大で約４０％、最大で約５０％、最大で約６０％、最大で約６５％、最大で約７０％、最大で約７５％、最大で約８０％、最大で約８５％、最大で約９０％、最大で約９５％、最大で約９７％、最大で約９８％、最大で約９９％、または１００％である。一部の例では、スペーサー配列と標的核酸との相補性パーセントは、標的核酸の相補鎖の標的配列のうちの、最も５’側の６つの連続ヌクレオチドにわたり、１００％である。スペーサー配列と標的核酸との相補性パーセントは、約２０連続ヌクレオチドにわたり、少なくとも６０％でありうる。スペーサー配列および標的核酸の長さは、１〜６ヌクレオチド異なる場合があるが、これは、１または複数のバルジ（ｂｕｌｇｅ）と考えることができる。
スペーサー配列は、コンピュータプログラムを使用して、デザインすることもでき、選び出すこともできる。コンピュータプログラムは、予測溶融温度、二次構造形成、予測アニーリング温度、配列同一性、ゲノムコンテキスト、クロマチンアクセシビリティ、％ＧＣ、ゲノム発生頻度（例えば、同一であるかまたは類似するが、ミスマッチ、挿入、または欠失の結果として、１または複数のスポットで変動する配列）、メチル化状態、ＳＮＰの存在などの変数を使用しうる。
最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列
最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列は、基準ＣＲＩＳＰＲリピート配列（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓに由来するｃｒＲＮＡ）に対する、少なくとも約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または１００％の配列同一性を伴う配列である。
最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列は、細胞内の最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列とハイブリダイズしうるヌクレオチドを含みうる。最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列と最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列とは、二重鎖、すなわち、塩基対合した二本鎖構造を形成しうる。一体となって、最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列および最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、部位特異的ポリペプチドに結合しうる。最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列の少なくとも一部は、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列とハイブリダイズしうる。最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列の少なくとも一部は、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列に対する、少なくとも約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または１００％の相補性を含みうる。最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列の少なくとも一部は、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列に対する、最大で約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または１００％の相補性を含みうる。
最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列は、約７ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチドの長さを有しうる。例えば、最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列の長さは、約７ヌクレオチド（ｎｔ）〜約５０ｎｔ、約７ｎｔ〜約４０ｎｔ、約７ｎｔ〜約３０ｎｔ、約７ｎｔ〜約２５ｎｔ、約７ｎｔ〜約２０ｎｔ、約７ｎｔ〜約１５ｎｔ、約８ｎｔ〜約４０ｎｔ、約８ｎｔ〜約３０ｎｔ、約８ｎｔ〜約２５ｎｔ、約８ｎｔ〜約２０ｎｔ、約８ｎｔ〜約１５ｎｔ、約１５ｎｔ〜約１００ｎｔ、約１５ｎｔ〜約８０ｎｔ、約１５ｎｔ〜約５０ｎｔ、約１５ｎｔ〜約４０ｎｔ、約１５ｎｔ〜約３０ｎｔ、または約１５ｎｔ〜約２５ｎｔである。一部の例では、最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列は、約９ヌクレオチドの長さである。最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列は、約１２ヌクレオチドの長さでありうる。
最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列は、少なくとも６、７、または８連続ヌクレオチドの連なりにわたり、基準最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓに由来する野生型ｃｒＲＮＡ）に対して、少なくとも約６０％同一でありうる。例えば、最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列は、少なくとも６、７、または８連続ヌクレオチドの連なりにわたり、基準最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列に対して、少なくとも約６５％同一、少なくとも約７０％同一、少なくとも約７５％同一、少なくとも約８０％同一、少なくとも約８５％同一、少なくとも約９０％同一、少なくとも約９５％同一、少なくとも約９８％同一、少なくとも約９９％同一、または１００％同一である。
最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列
最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、基準ｔｒａｃｒＲＮＡ配列（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓに由来する野生型ｔｒａｃｒＲＮＡ）に対する、少なくとも約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または１００％の配列同一性を伴う配列でありうる。
最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、細胞内の最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列とハイブリダイズするヌクレオチドを含みうる。最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列と最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列とは、二重鎖、すなわち、塩基対合した二本鎖構造を形成する。一体となって、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列および最小ＣＲＩＳＰＲリピートは、部位特異的ポリペプチドに結合する。最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列の少なくとも一部は、最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列とハイブリダイズしうる。最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列と、少なくとも約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または１００％相補的でありうる。
最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、約７ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチドの長さを有しうる。例えば、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、約７ヌクレオチド（ｎｔ）〜約５０ｎｔ、約７ｎｔ〜約４０ｎｔ、約７ｎｔ〜約３０ｎｔ、約７ｎｔ〜約２５ｎｔ、約７ｎｔ〜約２０ｎｔ、約７ｎｔ〜約１５ｎｔ、約８ｎｔ〜約４０ｎｔ、約８ｎｔ〜約３０ｎｔ、約８ｎｔ〜約２５ｎｔ、約８ｎｔ〜約２０ｎｔ、約８ｎｔ〜約１５ｎｔ、約１５ｎｔ〜約１００ｎｔ、約１５ｎｔ〜約８０ｎｔ、約１５ｎｔ〜約５０ｎｔ、約１５ｎｔ〜約４０ｎｔ、約１５ｎｔ〜約３０ｎｔ、または約１５ｎｔ〜約２５ｎｔ長でありうる。最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、約９ヌクレオチドの長さでありうる。最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、約１２ヌクレオチドでありうる。最小ｔｒａｃｒＲＮＡは、Jinekら、前出において記載されている、ｔｒａｃｒＲＮＡのｎｔ２３〜４８からなりうる。
最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、少なくとも６、７、または８連続ヌクレオチドの連なりにわたり、基準最小ｔｒａｃｒＲＮＡ（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓに由来する野生型、ｔｒａｃｒＲＮＡ）配列に対して、少なくとも約６０％同一でありうる。例えば、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、少なくとも６、７、または８連続ヌクレオチドの連なりにわたり、基準最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列に対して、少なくとも約６５％同一、約７０％同一、約７５％同一、約８０％同一、約８５％同一、約９０％同一、約９５％同一、約９８％同一、約９９％同一、または１００％同一でありうる。
最小ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡと、最小ｔｒａｃｒＲＮＡとの二重鎖は、二重螺旋を含みうる。最小ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡと、最小ｔｒａｃｒＲＮＡとの二重鎖は、少なくとも約１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、もしくは１０、またはこれを超えるヌクレオチドを含みうる。最小ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡと、最小ｔｒａｃｒＲＮＡとの二重鎖は、最大で約１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、もしくは１０、またはこれを超えるヌクレオチドを含みうる。
二重鎖は、ミスマッチを含みうる（すなわち、二重鎖の２つの鎖は、１００％相補的ではない）。二重鎖は、少なくとも約１つ、２つ、３つ、４つ、もしくは５つ、またはこれを超えるミスマッチを含みうる。二重鎖は、最大で約１つ、２つ、３つ、４つ、もしくは５つ、またはこれを超えるミスマッチを含みうる。二重鎖は、２つ以下のミスマッチを含みうる。
バルジ（ｂｕｌｇｅ）
場合によって、最小ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡと、最小ｔｒａｃｒＲＮＡとの二重鎖内には、「バルジ」が存在しうる。バルジとは、二重鎖内のヌクレオチドの非対合領域である。バルジは、二重鎖の、部位特異的ポリペプチドへの結合に寄与しうる。バルジは、二重鎖の一方の側に、非対合の５’−ＸＸＸＹ−３’［配列中、Ｘは、任意のプリンであり、Ｙは、逆鎖上のヌクレオチドと、揺らぎ対を形成しうるヌクレオチドを含む］を含むことが可能であり、二重鎖の他の側に、非対合ヌクレオチド領域を含みうる。二重鎖の２つの側における非対合ヌクレオチドの数は、異なりうる。
一例では、バルジは、バルジの最小ＣＲＩＳＰＲリピート鎖上に、非対合プリン（例えば、アデニン）を含みうる。一部の例では、バルジは、バルジの最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列鎖の非対合５’−ＡＡＧＹ−３’［配列中、Ｙは、最小ＣＲＩＳＰＲリピート鎖上のヌクレオチドと、揺らぎ対合を形成しうる、ヌクレオチドを含む］を含みうる。
二重鎖の、最小ＣＲＩＳＰＲリピート側のバルジは、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、もしくは５つ、またはこれを超える非対合ヌクレオチドを含みうる。二重鎖の、最小ＣＲＩＳＰＲリピート側のバルジは、最大で１つ、２つ、３つ、４つ、もしくは５つ、またはこれを超える非対合ヌクレオチドを含みうる。二重鎖の、最小ＣＲＩＳＰＲリピート側のバルジは、１つの非対合ヌクレオチドを含みうる。
二重鎖の、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列側のバルジは、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、もしくは１０、またはこれを超える非対合ヌクレオチドを含みうる。二重鎖の、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列側のバルジは、最大で１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、もしくは１０、またはこれを超える非対合ヌクレオチドを含みうる。二重鎖の、第２の側のバルジ（例えば、二重鎖の、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列側）は、４つの非対合ヌクレオチドを含みうる。
バルジは、少なくとも１つの揺らぎ対合を含みうる。一部の例では、バルジは、最大で１つの揺らぎ対合を含む。一部の例では、バルジは、少なくとも１つのプリンヌクレオチドを含みうる。バルジは、少なくとも３つのプリンヌクレオチドを含みうる。バルジ配列は、少なくとも５つのプリンヌクレオチドを含みうる。バルジ配列は、少なくとも１つのグアニンヌクレオチドを含みうる。バルジ配列は、少なくとも１つのアデニンヌクレオチドを含みうる。
ヘアピン
多様な例では、１または複数のヘアピンは、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列内の最小ｔｒａｃｒＲＮＡに対して３’側に位置しうる。
ヘアピンは、最小ＣＲＩＳＰＲリピートと最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列との二重鎖内の、最後の対合ヌクレオチドの３’側の、少なくとも約１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１５、もしくは２０、またはこれを超えるヌクレオチドから始まりうる。ヘアピンは、最小ＣＲＩＳＰＲリピートと最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列との二重鎖内の、最後の対合ヌクレオチドの３’側の、最大で約１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、もしくは１０、またはこれを超えるヌクレオチドから始まりうる。
ヘアピンは、少なくとも約１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１５、もしくは２０、またはこれを超える連続ヌクレオチドを含みうる。ヘアピンは、最大で約１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１５、またはこれを超える連続ヌクレオチドを含みうる。
ヘアピンは、ＣＣジヌクレオチド（すなわち、２つの連続シトシンヌクレオチド）を含みうる。
ヘアピンは、二重鎖ヌクレオチド（例えば、ヘアピン内で一体にハイブリダイズしたヌクレオチド）を含みうる。例えば、ヘアピンは、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列のヘアピン二重鎖内の、ＧＧジヌクレオチドへとハイブリダイズしたＣＣジヌクレオチドを含みうる。
ヘアピンのうちの１または複数は、部位特異的ポリペプチドの、ガイドＲＮＡと相互作用する領域と相互作用しうる。
ある例では、２つまたはこれを超えるヘアピンが存在し、他の例では、３つまたはこれを超えるヘアピンが存在する。
３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列
３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、基準ｔｒａｃｒＲＮＡ配列（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓに由来するｔｒａｃｒＲＮＡ）に対する、少なくとも約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または１００％の配列同一性を伴う配列を含みうる。
３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、約６ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチドの長さを有しうる。例えば、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、約６ヌクレオチド（ｎｔ）〜約５０ｎｔ、約６ｎｔ〜約４０ｎｔ、約６ｎｔ〜約３０ｎｔ、約６ｎｔ〜約２５ｎｔ、約６ｎｔ〜約２０ｎｔ、約６ｎｔ〜約１５ｎｔ、約８ｎｔ〜約４０ｎｔ、約８ｎｔ〜約３０ｎｔ、約８ｎｔ〜約２５ｎｔ、約８ｎｔ〜約２０ｎｔ、約８ｎｔ〜約１５ｎｔ、約１５ｎｔ〜約１００ｎｔ、約１５ｎｔ〜約８０ｎｔ、約１５ｎｔ〜約５０ｎｔ、約１５ｎｔ〜約４０ｎｔ、約１５ｎｔ〜約３０ｎｔ、または約１５ｎｔ〜約２５ｎｔの長さを有しうる。３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、約１４ヌクレオチドの長さを有しうる。
３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、少なくとも６、７、または８連続ヌクレオチドの連なり（ｓｔｒｅｔｃｈ）にわたり、基準３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓに由来する野生型３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列）に対して、少なくとも約６０％同一でありうる。例えば、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、少なくとも６、７、または８連続ヌクレオチドの連なりにわたり、基準３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓに由来する野生型３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列）に対して、少なくとも約６０％同一、約６５％同一、約７０％同一、約７５％同一、約８０％同一、約８５％同一、約９０％同一、約９５％同一、約９８％同一、約９９％同一、または１００％同一でありうる。
３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、１つを超える二重鎖領域（例えば、ヘアピン領域、ハイブリダイズ領域）を含みうる。３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、２つの二重鎖領域を含みうる。
３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、ステムループ構造を含みうる。３’ｔｒａｃｒＲＮＡ内のステムループ構造は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、もしくは２０、またはこれを超えるヌクレオチドを含みうる。３’ｔｒａｃｒＲＮＡ内のステムループ構造は、最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０、またはこれを超えるヌクレオチドを含みうる。ステムループ構造は、機能的部分を含みうる。例えば、ステムループ構造は、アプタマー、リボザイム、タンパク質と相互作用するヘアピン、ＣＲＩＳＰＲアレイ、イントロン、またはエクソンを含みうる。ステムループ構造は、少なくとも約１、２、３、４、もしくは５、またはこれを超える機能的部分を含みうる。ステムループ構造は、最大で約１、２、３、４、もしくは５、またはこれを超える機能的部分を含みうる。
３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列内のヘアピンは、Ｐドメインを含みうる。一部の例では、Ｐドメインは、ヘアピン内の二本鎖領域を含みうる。
ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列
ｔｒａｃｒＲＮＡが、単一分子ガイドの文脈にある場合であれ、二重分子ガイドの文脈にある場合であれ、ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列をもたらすことができる。ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列は、約１ヌクレオチド〜約４００ヌクレオチドの長さを有しうる。ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列は、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２０、２４０、２６０、２８０、３００、３２０、３４０、３６０、３８０、または４００ヌクレオチドを超える長さを有しうる。ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列は、約２０〜約５０００またはこれを超えるヌクレオチドの長さを有しうる。ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列は、１０００ヌクレオチドを超える長さを有しうる。ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列は、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２０、２４０、２６０、２８０、３００、３２０、３４０、３６０、３８０、４００、またはこれを超えるヌクレオチド未満の長さを有しうる。ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列は、１０００ヌクレオチド未満の長さを有しうる。ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列は、１０ヌクレオチド未満の長さを含みうる。ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列は、１０〜３０ヌクレオチドの長さでありうる。ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列は、３０〜７０ヌクレオチドの長さでありうる。
ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列は、機能的部分（例えば、安定性制御配列、リボザイム、エンドリボヌクレアーゼ結合配列）を含みうる。機能的部分は、転写ターミネーターセグメント（すなわち、転写終結配列）を含みうる。機能的部分は、約１０ヌクレオチド（ｎｔ）〜約１００ヌクレオチド、約１０ｎｔ〜約２０ｎｔ、約２０ｎｔ〜約３０ｎｔ、約３０ｎｔ〜約４０ｎｔ、約４０ｎｔ〜約５０ｎｔ、約５０ｎｔ〜約６０ｎｔ、約６０ｎｔ〜約７０ｎｔ、約７０ｎｔ〜約８０ｎｔ、約８０ｎｔ〜約９０ｎｔ、または約９０ｎｔ〜約１００ｎｔ、約１５ｎｔ〜約８０ｎｔ、約１５ｎｔ〜約５０ｎｔ、約１５ｎｔ〜約４０ｎｔ、約１５ｎｔ〜約３０ｎｔ、または約１５ｎｔ〜約２５ｎｔの全長を有しうる。機能的部分は、真核細胞内で機能しうる。機能的部分は、原核細胞内で機能しうる。機能的部分は、真核細胞内および原核細胞内の両方で機能しうる。
適切なｔｒａｃｒＲＮＡ伸長の機能的部分の非限定的な例は、３’ポリアデニル化テール、リボスイッチ配列（例えば、安定性の調節ならびに／またはタンパク質およびタンパク質複合体によるアクセシビリティの調節を可能とする）、ｄｓＲＮＡ二重鎖（すなわち、ヘアピン）を形成する配列、ＲＮＡを細胞内の場所（例えば、核、ミトコンドリア、クロロプラストなど）へとターゲティングする配列、トラッキングをもたらす修飾もしくは配列（例えば、蛍光分子への直接のコンジュゲーション、蛍光の検出を容易とする部分へのコンジュゲーション、蛍光の検出を可能とする配列など）、および／またはタンパク質の結合性部位をもたらす修飾もしくは配列（例えば、転写活性化因子、転写抑制因子、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、ＤＮＡデメチラーゼ、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、ヒストンデアセチラーゼなどを含む、ＤＮＡに対して作用するタンパク質）を含む。ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列は、プライマー結合性部位または分子インデックス（例えば、バーコード配列）を含みうる。ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列は、１または複数のアフィニティータグを含みうる。
単一分子ガイドリンカー配列
単一分子ガイド核酸のリンカー配列は、約３ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチドの長さを有しうる。Jinekら、前出では、例えば、単純な４ヌクレオチドの「テトラループ」（−ＧＡＡＡ−）が使用された（Science、３３７巻（６０９６号）：８１６〜８２１頁（２０１２年））。例示的なリンカーは、約３ヌクレオチド（ｎｔ）〜約９０ｎｔ、約３ｎｔ〜約８０ｎｔ、約３ｎｔ〜約７０ｎｔ、約３ｎｔ〜約６０ｎｔ、約３ｎｔ〜約５０ｎｔ、約３ｎｔ〜約４０ｎｔ、約３ｎｔ〜約３０ｎｔ、約３ｎｔ〜約２０ｎｔ、約３ｎｔ〜約１０ｎｔの長さを有する。例えば、リンカーは、約３ｎｔ〜約５ｎｔ、約５ｎｔ〜約１０ｎｔ、約１０ｎｔ〜約１５ｎｔ、約１５ｎｔ〜約２０ｎｔ、約２０ｎｔ〜約２５ｎｔ、約２５ｎｔ〜約３０ｎｔ、約３０ｎｔ〜約３５ｎｔ、約３５ｎｔ〜約４０ｎｔ、約４０ｎｔ〜約５０ｎｔ、約５０ｎｔ〜約６０ｎｔ、約６０ｎｔ〜約７０ｎｔ、約７０ｎｔ〜約８０ｎｔ、約８０ｎｔ〜約９０ｎｔ、または約９０ｎｔ〜約１００ｎｔの長さを有しうる。単一分子ガイド核酸のリンカーは、４〜４０ヌクレオチドの間でありうる。リンカーは、少なくとも約１００、５００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、５５００、６０００、６５００、もしくは７０００、またはこれを超えるヌクレオチドでありうる。リンカーは、最大で約１００、５００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、５５００、６０００、６５００、もしくは７０００、またはこれを超えるヌクレオチドでありうる。
リンカーは、様々な配列のうちのいずれも含みうるが、一部の例では、リンカーは、ガイドＲＮＡの他の部分と相同的である広範な領域であって、ガイドの他の機能的な領域に干渉する可能性のある分子内結合を引き起こしうる領域を有する配列を含まない。Jinekら、前出では、単純な４ヌクレオチドの配列である、−ＧＡＡＡ−が使用された（Science、３３７巻（６０９６号）：８１６〜８２１頁（２０１２年））が、より長い配列を含む、多数の他の配列も同様に、使用することができる。
リンカー配列は、機能的部分を含みうる。例えば、リンカー配列は、アプタマー、リボザイム、タンパク質と相互作用するヘアピン、タンパク質結合性部位、ＣＲＩＳＰＲアレイ、イントロン、またはエクソンを含む、１または複数の特色を含みうる。リンカー配列は、少なくとも約１、２、３、４、もしくは５、またはこれを超える機能的部分を含みうる。一部の例では、リンカー配列は、最大で約１、２、３、４、もしくは５、またはこれを超える機能的部分を含みうる。
１もしくは複数のエクソン、または異常なイントロンのスプライスアクセプターもしくはドナー部位の欠失（切出し）、挿入、または置きかえ（欠失および挿入）により、細胞を矯正するゲノム操作戦略
本開示のｅｘ ｖｉｖｏ方法のステップは、ゲノム操作を使用して、ＤＭＤ患者特異的なｉＰＳ細胞のゲノムを編集／矯正することを伴う。同様に、本開示のｉｎ ｖｉｖｏ方法のステップは、ゲノム操作を使用して、ＤＭＤ患者における筋細胞のゲノムを編集／矯正することを伴う。同様に、本開示の細胞方法におけるステップは、ゲノム操作により、ヒト細胞内のジストロフィン遺伝子を編集／矯正することを伴う。
ＤＭＤ患者は、ジストロフィン遺伝子内の広範にわたる突然変異を呈する。したがって、異なる患者は一般に、異なる矯正戦略を要求するであろう。任意のＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼを本開示の方法で使用することができ、各ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼは、疾患特異的な場合もあり、疾患特異的でない場合もある、それ自体と関連するＰＡＭを有する。例えば、ジストロフィン遺伝子を、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓに由来するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼでターゲティングするためのｇＲＮＡスペーサー配列は、配列表の配列番号１〜４６７，０３０および１，４１０，４３０〜１，４１０，４７２において同定されている。ジストロフィン遺伝子を、Ｓ．ａｕｒｅｕｓに由来するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼでターゲティングするためのｇＲＮＡスペーサー配列は、配列表の配列番号４６７，０３１〜５２８，１９６において同定されている。ジストロフィン遺伝子を、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓに由来するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼでターゲティングするためのｇＲＮＡスペーサー配列は、配列表の配列番号５２８，１９７〜５５３，１９８において同定されている。ジストロフィン遺伝子を、Ｔ．ｄｅｎｔｉｃｏｌａに由来するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼでターゲティングするためのｇＲＮＡスペーサー配列は、配列表の配列番号５５３，１９９〜５６３，９１１において同定されている。ジストロフィン遺伝子を、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓに由来するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼでターゲティングするためのｇＲＮＡスペーサー配列は、配列表の配列番号５６３，９１２〜６２７，８５４および１，４１０，４００〜１，４１０，４０２において同定されている。ジストロフィン遺伝子を、Ａｃｉｄｏｍｉｎｏｃｃｏｃｃｕｓ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ、およびＦｒａｎｃｉｓｃｅｌｌａ Ｎｏｖｉｃｉｄａに由来するＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼでターゲティングするためのｇＲＮＡスペーサー配列は、配列表の配列番号６２７，８５５〜１，４１０，３９９および１，４１０，４０３〜１，４１０，４２９において同定されている。
１つのゲノム操作戦略は、エクソンの欠失を伴う。特異的エクソンのターゲティングされた欠失は、単一の治療用カクテルで、患者の大規模なサブセットを処置するための、魅力的な戦略でありうる。ジストロフィンのリーディングフレームを修復することにより、単一エクソンの欠失が、患者のうちの最大で１３％を処置しうるのに対し、マルチエクソンの欠失は、患者のうちの最大で６２％を処置しうることが予測される。マルチエクソンの欠失は、より多数の患者に到達しうるが、より大きな欠失では、サイズの増大と共に、欠失効率が大幅に低下する。したがって、好ましい欠失は、４００〜３５０，０００塩基対（ｂｐ）のサイズの範囲でありうる。例えば、欠失は、４００〜１，０００；１，０００〜５，０００；５，０００〜１０，０００、１０，０００〜２５，０００；２５，０００〜５０，０００、５０，０００〜１００，０００；１００，０００〜２００，０００；または２００，０００〜３５０，０００塩基対のサイズの範囲でありうる。
既に言明した通り、ＤＭＤ遺伝子は、７９のエクソンを含有する。７９のエクソン、または異常なイントロンのスプライスアクセプターもしくはドナー部位のうちの、任意の１または複数は、ジストロフィンのリーディングフレームを修復するために、欠失させることができる。これらの方法は、これらは、患者の最大のサブセットに到達することが予測される領域であるので、エクソン２、８、４３、４４、４５、４６、５０、５１、５２、５３、７０、４５〜５３、または４５〜５５を欠失させるのに使用しうるｇＲＮＡ対を提供する（表１および２を参照されたい；表２に与えられる百分率は、文献により報告されている平均である）。
ＤＭＤ遺伝子の異なる領域は、欠失により修復することもでき、かつ／またはＨＤＲにより修復することもできる。目的のゲノム領域内で切断するｇＲＮＡの、ある特定の組合せを使用して、標的エクソン内の突然変異を矯正することができる。座標は、ＧＲｃｈ３８／ｈｇ３８ゲノムアセンブリー（表１）に基づく。
Figure 2019507579
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方法は、遺伝子を２回にわたり切断することにより、エクソン２を欠失させるｇＲＮＡ対であって、エクソン２の５’末端において切断する一方のｇＲＮＡと、エクソン２の３’末端において切断する他方のｇＲＮＡとによるｇＲＮＡ対を提供する。
方法は、遺伝子を２回にわたり切断することにより、エクソン８を欠失させるｇＲＮＡ対であって、エクソン８の５’末端において切断する一方のｇＲＮＡと、エクソン８の３’末端において切断する他方のｇＲＮＡとによるｇＲＮＡ対を提供する。
方法は、遺伝子を２回にわたり切断することにより、エクソン４３を欠失させるｇＲＮＡ対であって、エクソン４３の５’末端において切断する一方のｇＲＮＡと、エクソン４３の３’末端において切断する他方のｇＲＮＡとによるｇＲＮＡ対を提供する。
方法は、遺伝子を２回にわたり切断することにより、エクソン４４を欠失させるｇＲＮＡ対であって、エクソン４４の５’末端において切断する一方のｇＲＮＡと、エクソン４４の３’末端において切断する他方のｇＲＮＡとによるｇＲＮＡ対を提供する。
方法は、遺伝子を２回にわたり切断することにより、エクソン４５を欠失させるｇＲＮＡ対であって、エクソン４５の５’末端において切断する一方のｇＲＮＡと、エクソン４５の３’末端において切断する他方のｇＲＮＡとによるｇＲＮＡ対を提供する。
方法は、遺伝子を２回にわたり切断することにより、エクソン４６を欠失させるｇＲＮＡ対であって、エクソン４６の５’末端において切断する一方のｇＲＮＡと、エクソン４６の３’末端において切断する他方のｇＲＮＡとによるｇＲＮＡ対を提供する。
方法は、遺伝子を２回にわたり切断することにより、エクソン５０を欠失させるｇＲＮＡ対であって、エクソン５０の５’末端において切断する一方のｇＲＮＡと、エクソン５０の３’末端において切断する他方のｇＲＮＡとによるｇＲＮＡ対を提供する。
方法は、遺伝子を２回にわたり切断することにより、エクソン５１を欠失させるｇＲＮＡ対であって、エクソン５１の５’末端において切断する一方のｇＲＮＡと、エクソン５１の３’末端において切断する他方のｇＲＮＡとによるｇＲＮＡ対を提供する。
方法は、遺伝子を２回にわたり切断することにより、エクソン５２を欠失させるｇＲＮＡ対であって、エクソン５２の５’末端において切断する一方のｇＲＮＡと、エクソン５２の３’末端において切断する他方のｇＲＮＡとによるｇＲＮＡ対を提供する。
方法は、遺伝子を２回にわたり切断することにより、エクソン５３を欠失させるｇＲＮＡ対であって、エクソン５３の５’末端において切断する一方のｇＲＮＡと、エクソン５３の３’末端において切断する他方のｇＲＮＡとによるｇＲＮＡ対を提供する。
方法は、遺伝子を２回にわたり切断することにより、エクソン７０を欠失させるｇＲＮＡ対であって、エクソン７０の５’末端において切断する一方のｇＲＮＡと、エクソン７０の３’末端において切断する他方のｇＲＮＡとによるｇＲＮＡ対を提供する。
方法は、遺伝子を２回にわたり切断することにより、エクソン４５〜５３を欠失させるｇＲＮＡ対であって、エクソン４５の５’末端において切断する一方のｇＲＮＡと、エクソン５３の３’末端において切断する他方のｇＲＮＡとによるｇＲＮＡ対を提供する。
方法は、遺伝子を２回にわたり切断することにより、エクソン４５〜５５を欠失させるｇＲＮＡ対であって、エクソン４５の５’末端において切断する一方のｇＲＮＡと、エクソン５５の３’末端において切断する他方のｇＲＮＡとによるｇＲＮＡ対を提供する。
別のゲノム操作戦略は、１もしくは複数のエクソン、または異常なイントロンのスプライスアクセプターもしくはドナー部位への挿入またはこれらの置きかえであって、相同組換え（ＨＲ）としてもまた公知である、相同性により導かれる修復（ＨＤＲ）による挿入または置きかえを伴う。相同性により導かれる修復は、小規模な挿入／欠失または点突然変異に起因して、早期終止コドンを有する患者を処置するための１つの戦略である。ＤＭＤ表現型を、ＢＭＤ表現型へと転換する、大規模なゲノム欠失をもたらすのではなく、この戦略は、全リーディングフレームを修復し、罹患状態を完全に逆行させる。この戦略は、患者の早期終止の位置に基づく、よりカスタムメイドの手法を要求する。ジストロフィンエクソンの大半は、小型（＜３００ｂｐ）である。ＨＤＲ効率は、ドナー分子のサイズと反比例するので、これは有利である。また、ドナー鋳型が、サイズに制約されるアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）分子であって、ドナー鋳型送達の有効な手段であることが示されているＡＡＶ分子に適合することも予測される。
相同性により導かれる修復とは、二本鎖切断（ＤＳＢ）を修復するための細胞機構である。最も一般的な形態は、相同組換えである。ＨＤＲには、一本鎖アニーリングおよび代替的ＨＤＲを含む、さらなる経路が存在する。ゲノム操作ツールは、研究者が、ゲノムに対して、部位特異的修飾を創出するように、細胞の相同組換え経路を操作することを可能とする。細胞は、トランスに供給される合成のドナー分子を使用して、二本鎖切断を修復しうることが見出されている。したがって、特異的突然変異の近傍において二本鎖切断を導入し、適切なドナーを供給することにより、ゲノム内に、ターゲティングされた変化を施すことができる。特異的切断は、相同なドナー単独を供給される細胞１０６個中に１回の比率の１，０００倍を超えて、ＨＤＲ率を増大させる。特定のヌクレオチドにおける相同性により導かれる修復（ＨＤＲ）率は、切断部位までの距離の関数であるので、重複するかまたは最近傍の標的部位を選び出すことが重要である。ｉｎ ｓｉｔｕにおける矯正は、ゲノムの残余部分を撹乱せずにおくので、遺伝子編集は、遺伝子付加に対する利点をもたらす。
ＨＤＲによる編集のために供給されるドナーは、顕著に変動するが、小型または大型のフランキング相同性アームを伴う配列であって、ゲノムＤＮＡとのアニーリングを可能とする意図される配列を含有しうる。導入される遺伝子変化を挟む相同性領域は、３０ｂｐまたはこれより小型の場合もあり、マルチキロベースという大型のカセットの場合もあり、これらは、プロモーター、ｃＤＮＡなどを含有しうる。一本鎖オリゴヌクレオチドドナーおよび二本鎖オリゴヌクレオチドドナーのいずれも使用されている。これらのオリゴヌクレオチドは、１００ｎｔ未満〜２００ｎｔを超えるサイズの範囲でありうるが、より長いｓｓＤＮＡもまた、作出および使用しうる。ＰＣＲ単位複製配列、プラスミド、およびミニサークルを含む、二本鎖ドナーを使用することができる。一般に、ＡＡＶベクターは、ドナー鋳型の送達の極めて有効な手段でありうることが見出されているが、個々のドナーに対するパッケージング限界が＜５ｋｂである。ドナーの能動的転写が、ＨＤＲを３倍に増大させたことから、プロモーターを含むことが、転換を増大させうることが指し示される。逆に、ドナーのＣｐＧのメチル化は、遺伝子発現およびＨＤＲを減少させる。
Ｃａｓ９などの野生型エンドヌクレアーゼに加えて、一方のヌクレアーゼドメインまたは他方のヌクレアーゼドメインを不活化させる結果として、１つのＤＮＡ鎖だけの切断をもたらしうる、ニッカーゼ変異体が存在する。ＨＤＲは、個々のＣａｓニッカーゼにより導くこともでき、標的領域を挟むニッカーゼ対を使用して導くこともできる。ドナーは、一本鎖の場合もあり、ニック処理されている場合もあり、ｄｓＤＮＡの場合もある。
ドナーＤＮＡは、ヌクレアーゼと共に供給することもでき、様々な異なる方法、例えば、トランスフェクション、ナノ粒子、マイクロインジェクション、またはウイルスを介する形質導入により、独立に供給することもできる。ある範囲のテザリングの選択肢であって、ＨＤＲのためのドナーのアベイラビリティーを増大させる選択肢が提起されている。例は、ドナーの、ヌクレアーゼへの接合、近傍に結合するＤＮＡ結合性タンパク質への接合、またはＤＮＡ末端における結合もしくは修復に関与するタンパク質への接合を含む。
修復経路の選択は、細胞周期に影響を及ぼす培養条件など、いくつかの培養条件により導くこともでき、ＤＮＡ修復および関連タンパク質のターゲティングにより導くこともできる。例えば、ＨＤＲを増大させるために、ＫＵ７０、ＫＵ８０、またはＤＮＡリガーゼＩＶなど、鍵となるＮＨＥＪ分子を抑制することができる。
ドナーが存在しない場合、接合部において塩基対合をほとんどまたは全く伴わずにＤＮＡ末端を接合させる、いくつかの非相同性修復経路を使用して、ＤＮＡ切断に由来する末端または異なる切断に由来する末端を接合させることができる。カノニカルのＮＨＥＪに加えて、ａｌｔ−ＮＨＥＪなど、同様の修復機構が存在する。２つの切断が存在する場合、介在するセグメントを、欠失させることもでき、反転させることもできる。ＮＨＥＪ修復経路は、接合部において、挿入、欠失、または突然変異をもたらしうる。
ＮＨＥＪは、ヌクレアーゼによる切断の後において、１５ｋｂの誘導的遺伝子発現カセットを、ヒト細胞株内の規定されたローカスへと挿入するのに使用された（Maresca, M.、Lin, V.G.、Guo, N.、およびYang, Y.、Obligate ligation-gated recombination (ObLiGaRe): custom-designed nuclease-mediated targeted integration through nonhomologous end joining、Genome Res、２３巻、５３９〜５４６頁（２０１３年））。
ＮＨＥＪまたはＨＤＲによるゲノム編集に加えて、ＮＨＥＪ経路およびＨＲの両方を使用する、部位特異的遺伝子挿入が行われている。可能性として、イントロン／エクソン間境界部を含む、ある特定の状況では、組合せ法が適用可能でありうる。ＮＨＥＪが、イントロン内のライゲーションに有効であることがわかるのに対し、エラーフリーＨＤＲは、コーディング領域内でより良好に適しうる。
既に言明した通り、ＤＭＤ遺伝子は、７９のエクソンを含有する。７９のエクソンのうちの、任意の１または複数は、突然変異を矯正し、ジストロフィンのリーディングフレームを修復するために、正すことができる。データは、ジストロフィン遺伝子内の大半の早期終止コドンはエクソン７０にある傾向があることを示しているので、一部の方法は、ポリヌクレオチドドナー鋳型に由来する新たな配列の組込みであって、エクソン７０に配列を挿入するか、またはエクソン７０内の配列を置きかえる組込みを容易とするために使用しうる、１つのｇＲＮＡまたは１対のｇＲＮＡを提供する（Tuffery-Giraud, S.ら、Hum Mutat、２００９年、３０巻（６号）：９３４〜４５頁）（Flanigan, K.M.ら、Hum Mutat、２００９年、３０巻（１２号）：１６５７〜６６頁）。方法を、最大の数の患者に対して適用可能とするために、方法は、全エクソン７０を挿入するかまたは置きかえうるドナー鋳型を伴う。代替的に、方法は、ポリヌクレオチドドナー鋳型に由来する新たな配列の組込みであって、エクソン２、エクソン８、エクソン４３、エクソン４４、エクソン４５、エクソン４６、エクソン５０、エクソン５１、エクソン５２、エクソン５３、またはエクソン７０内に配列を挿入するか、またはこれらの中の配列を置きかえる組込みを容易とするために使用しうる、１つのｇＲＮＡまたは１対のｇＲＮＡを提供する。表１を参照されたい。
ＨＤＲ後において、ｐｒｅ−ｍＲＮＡが、適正にプロセシングされることを確保するために、周囲のスプライシングシグナルをインタクトに保つことが重要である。スプライシングドナーおよびアクセプターは一般に、隣接イントロンの１００塩基対以内にありうる。したがって、一部の例では、方法は、エクソンのイントロン接合部に照らして±約０〜３１００ｂｐを切断する、全てのｇＲＮＡをもたらしうる。
一部の方法は、遺伝子を２回にわたり切断することにより欠失をもたらすｇＲＮＡ対であって、エクソン２内の配列を置きかえるために、ポリヌクレオチドドナー鋳型に由来する新たな配列の組込みを容易とする、エクソン２の５’末端において切断する一方のｇＲＮＡと、エクソン２の３’末端において切断する他方のｇＲＮＡとによるｇＲＮＡ対を提供する。
代替的に、一部の方法は、先行する段落による１つのｇＲＮＡであって、エクソン２内の配列を置きかえるために、ポリヌクレオチドドナー鋳型に由来する新たな配列の挿入を容易とする、１つの二本鎖切断をもたらすｇＲＮＡを提供する。
方法の一部の例は、遺伝子を２回にわたり切断することにより欠失をもたらすｇＲＮＡ対であって、エクソン８内の配列を置きかえるために、ポリヌクレオチドドナー鋳型に由来する新たな配列の組込みを容易とする、エクソン８の５’末端において切断する一方のｇＲＮＡと、エクソン８の３’末端において切断する他方のｇＲＮＡとによるｇＲＮＡ対を提供する。
代替的に、一部の方法は、先行する段落による１つのｇＲＮＡであって、エクソン８内の配列を置きかえるために、ポリヌクレオチドドナー鋳型に由来する新たな配列の挿入を容易とする、１つの二本鎖切断をもたらすｇＲＮＡを提供する。
一部の方法は、遺伝子を２回にわたり切断することにより欠失をもたらすｇＲＮＡ対であって、エクソン４３内の配列を置きかえるために、ポリヌクレオチドドナー鋳型に由来する新たな配列の組込みを容易とする、エクソン４３の５’末端において切断する一方のｇＲＮＡと、エクソン４３の３’末端において切断する他方のｇＲＮＡとによるｇＲＮＡ対を提供する。
代替的に、一部の方法は、先行する段落による１つのｇＲＮＡであって、エクソン４３内の配列を置きかえるために、ポリヌクレオチドドナー鋳型に由来する新たな配列の挿入を容易とする、１つの二本鎖切断をもたらすｇＲＮＡを提供する。
一部の方法は、遺伝子を２回にわたり切断することにより欠失をもたらすｇＲＮＡ対であって、エクソン４４内の配列を置きかえるために、ポリヌクレオチドドナー鋳型に由来する新たな配列の組込みを容易とする、エクソン４４の５’末端において切断する一方のｇＲＮＡと、エクソン４４の３’末端において切断する他方のｇＲＮＡとによるｇＲＮＡ対を提供する。
代替的に、一部の方法は、先行する段落による１つのｇＲＮＡであって、エクソン４４内の配列を置きかえるために、ポリヌクレオチドドナー鋳型に由来する新たな配列の挿入を容易とする、１つの二本鎖切断をもたらすｇＲＮＡを提供する。
一部の方法は、遺伝子を２回にわたり切断することにより欠失をもたらすｇＲＮＡ対であって、エクソン４５内の配列を置きかえるために、ポリヌクレオチドドナー鋳型に由来する新たな配列の組込みを容易とする、エクソン４５の５’末端において切断する一方のｇＲＮＡと、エクソン４５の３’末端において切断する他方のｇＲＮＡとによるｇＲＮＡ対を提供する。
代替的に、一部の方法は、先行する段落による１つのｇＲＮＡであって、エクソン４５内の配列を置きかえるために、ポリヌクレオチドドナー鋳型に由来する新たな配列の挿入を容易とする、１つの二本鎖切断をもたらすｇＲＮＡを提供する。
一部の方法は、遺伝子を２回にわたり切断することにより欠失をもたらすｇＲＮＡ対であって、エクソン４６内の配列を置きかえるために、ポリヌクレオチドドナー鋳型に由来する新たな配列の組込みを容易とする、エクソン４６の５’末端において切断する一方のｇＲＮＡと、エクソン４６の３’末端において切断する他方のｇＲＮＡとによるｇＲＮＡ対を提供する。
代替的に、一部の方法は、先行する段落による１つのｇＲＮＡであって、エクソン４６内の配列を置きかえるために、ポリヌクレオチドドナー鋳型に由来する新たな配列の挿入を容易とする、１つの二本鎖切断をもたらすｇＲＮＡを提供する。
一部の方法は、遺伝子を２回にわたり切断することにより欠失をもたらすｇＲＮＡ対であって、エクソン５０内の配列を置きかえるために、ポリヌクレオチドドナー鋳型に由来する新たな配列の組込みを容易とする、エクソン５０の５’末端において切断する一方のｇＲＮＡと、エクソン５０の３’末端において切断する他方のｇＲＮＡとによるｇＲＮＡ対を提供する。
代替的に、一部の方法は、先行する段落による１つのｇＲＮＡであって、エクソン５０内の配列を置きかえるために、ポリヌクレオチドドナー鋳型に由来する新たな配列の挿入を容易とする、１つの二本鎖切断をもたらすｇＲＮＡを提供する。
一部の方法は、遺伝子を２回にわたり切断することにより欠失をもたらすｇＲＮＡ対であって、エクソン５１内の配列を置きかえるために、ポリヌクレオチドドナー鋳型に由来する新たな配列の組込みを容易とする、エクソン５１の５’末端において切断する一方のｇＲＮＡと、エクソン５１の３’末端において切断する他方のｇＲＮＡとによるｇＲＮＡ対を提供する。
代替的に、一部の方法は、先行する段落による１つのｇＲＮＡであって、エクソン５１内の配列を置きかえるために、ポリヌクレオチドドナー鋳型に由来する新たな配列の挿入を容易とする、１つの二本鎖切断をもたらすｇＲＮＡを提供する。
一部の方法は、遺伝子を２回にわたり切断することにより欠失をもたらすｇＲＮＡ対であって、エクソン５２内の配列を置きかえるために、ポリヌクレオチドドナー鋳型に由来する新たな配列の組込みを容易とする、エクソン５２の５’末端において切断する一方のｇＲＮＡと、エクソン５２の３’末端において切断する他方のｇＲＮＡとによるｇＲＮＡ対を提供する。
代替的に、一部の方法は、先行する段落による１つのｇＲＮＡであって、エクソン５２内の配列を置きかえるために、ポリヌクレオチドドナー鋳型に由来する新たな配列の挿入を容易とする、１つの二本鎖切断をもたらすｇＲＮＡを提供する。
一部の方法は、遺伝子を２回にわたり切断することにより欠失をもたらすｇＲＮＡ対であって、エクソン５３内の配列を置きかえるために、ポリヌクレオチドドナー鋳型に由来する新たな配列の組込みを容易とする、エクソン５３の５’末端において切断する一方のｇＲＮＡと、エクソン５３の３’末端において切断する他方のｇＲＮＡとによるｇＲＮＡ対を提供する。
代替的に、一部の方法は、先行する段落による１つのｇＲＮＡであって、エクソン５３内の配列を置きかえるために、ポリヌクレオチドドナー鋳型に由来する新たな配列の挿入を容易とする、１つの二本鎖切断をもたらすｇＲＮＡを提供する。
一部の方法は、遺伝子を２回にわたり切断することにより欠失をもたらすｇＲＮＡ対であって、エクソン７０内の配列を置きかえるために、ポリヌクレオチドドナー鋳型に由来する新たな配列の組込みを容易とする、エクソン７０の５’末端において切断する一方のｇＲＮＡと、エクソン７０の３’末端において切断する他方のｇＲＮＡとによるｇＲＮＡ対を提供する。
代替的に、一部の方法は、先行する段落による１つのｇＲＮＡであって、エクソン７０内の配列を置きかえるために、ポリヌクレオチドドナー鋳型に由来する新たな配列の挿入を容易とする、１つの二本鎖切断をもたらすｇＲＮＡを提供する。
相同性により導かれる修復による単一エクソンの組換えに加えて、本発明者らはまた、ＤＭＤ遺伝子内で見出される突然変異ホットスポットの、部分的なｃＤＮＡのノックインを実行するための方法についても記載する。例えば、エクソン４５〜５５を修復する処置は、患者のうちの最大で６２％を処置しうる。本明細書で記載される通りに、エクソン４５〜５５を欠失させるか、または置きかえるのではない、別の処置選択肢は、エクソン４５〜５５のゲノム領域全体（＞３５０，０００ｂｐにわたるイントロンを含む）を、約１８００ｂｐにわたる、エクソン４５〜５５のコーディング領域だけを含有するｃＤＮＡで置きかえる。置きかえは、相同性により導かれる修復法を使用して行うことができる。遺伝子間領域を除外することにより、エクソン４５〜５５のｃＤＮＡは（全ゲノム領域よりも）、相同性アームと共に、より容易に、本出願の「系の構成要素をコードする核酸」と題する節で記載される任意のドナーベクター中に含めることができる。この手法では、エクソン４５〜５５のゲノムの領域を除去する、２つのｇＲＮＡおよびＣａｓ９またはＣｐｆ１を、欠失させた領域を、所望のｃＤＮＡノックインで置きかえるドナー構築物と共に送達することができる。
ｃＤＮＡノックイン法を使用して、エクソンの任意のシリーズを置きかえることができる。
ｃＤＮＡノックイン配列は、合成のイントロン配列を含有するように最適化することができる。ＤＭＤローカスの適正な発現およびプロセシングを確保するように、天然のイントロンよりも小型の合成イントロンを、ドナー構築物内のエクソン間に付加することができる。
ジストロフィン遺伝子内の例示的な修飾は、特異的エクソンの上流または下流３ｋｂ未満、２ｋｂ未満、１ｋｂ未満、０．５ｋｂ未満の領域内など、上記で言及したジストロフィンローカス内またはこれらに対して近位における、欠失、挿入、または組換えを含む。ジストロフィン遺伝子内の突然変異の、比較的広範なバリエーションを踏まえると、上記で言及した欠失、挿入、または組換えの多数のバリエーション（限定なしに述べると、大型の欠失のほか、小型の欠失も含む）は、ジストロフィンのリーディングフレームの修復、およびジストロフィンタンパク質の活性の修復をもたらすと予測されることが察知されるであろう。
このような変異体は、問題となる特異的エクソンより５’および／もしくは３’方向において大規模となるか、またはいずれかの方向において小規模となる、欠失、挿入、または組換えを含みうる。したがって、特異的エクソンの欠失、挿入、または組換えに関する「近傍」または「近位」とは、所望の欠失、挿入、または置きかえの境界部（本明細書ではまた、端点とも称する）と関連するＳＳＢまたはＤＳＢローカスが、言及される基準ローカスから約３ｋｂ未満の領域内にありうることを意図する。ＳＳＢまたはＤＳＢローカスは、より近位の場合もあり、２ｋｂ以内、１ｋｂ以内、０．５ｋｂ以内、または０．１ｋｂ以内でありうる。小規模の欠失の場合、所望の端点は、基準ローカスにあるか、またはこれ「と隣接する」ことが可能であり、これにより、端点が、基準ローカスから１００ｂｐ以内、５０ｂｐ以内、２５ｂｐ以内、または約１０ｂｐ〜５ｂｐ未満でありうることを意図する。
ＤＭＤを伴う患者のための、エクソンスキッピングにより産生される産物を複製もしくは模倣すること、および／またはリーディングフレームを修復することの１つの利点は、それが、安全であり、かつ、ＤＭＤの改善と関連することが既に公知である点である。大型または小型の欠失／挿入／組換えを含む他の例は、ジストロフィンのリーディングフレームを修復する限りにおいて、同じ利益をもたらすことが予測されうる。したがって、本明細書で記載および例示される、欠失、挿入、および組換えの多くのバリエーションは、ＤＭＤを改善するために有効でありうることが予測されうる。
標的配列の選択
５’境界部および／または３’境界部の位置の、特定の基準ローカスと比べたシフトを使用して、本明細書でさらに記載および例示される、編集のために選択されるエンドヌクレアーゼ系に部分的に依存する、遺伝子編集の特定の適用を容易とするかまたは増強することができる。
このような標的配列選択の第１の非限定的例では、多くのエンドヌクレアーゼ系は、切断のための潜在的な標的部位の初期の選択を導きうる規則または基準であって、ＰＡＭ配列モチーフの要件、特に、ＩＩ型またはＶ型のＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼの場合における、ＤＮＡ切断部位に隣接する位置などの規則または基準を有する。
標的配列の選択または最適化についての別の非限定的例では、標的配列と遺伝子編集エンドヌクレアーゼとの特定の組合せについての「オフ標的」活性の頻度（すなわち、選択された標的配列以外の部位で、ＤＳＢが生じる頻度）を、オン標的活性の頻度と比べて評価することができる。場合によって、所望のローカスにおいて適正に編集された細胞は、他の細胞と比べて、選択的利点を有しうる。選択的利点についての、例示的であるが非限定的な例は、複製速度の増強、存続性、ある特定の条件に対する耐性、患者への導入後のｉｎ ｖｉｖｏにおける、生着成功率または存続率の増強などの属性、およびこのような細胞の維持または数もしくは生存率の増大と関連する他の属性の獲得を含む。他の場合には、所望のローカスで適正に編集された細胞を、適正に編集された細胞を同定するか、分取するか、または他の形で選択するのに使用される、１または複数のスクリーニング法により、正に選択することができる。選択的利点および指向選択法のいずれも、矯正と関連する表現型を利用しうる。場合によって、意図された細胞集団を選択または精製するのに使用される新たな表現型を創出する第２の修飾を創出するために、細胞を、２回またはこれを超える回数にわたり編集することができる。このような第２の修飾は、選択可能またはスクリーニング可能マーカーのための、第２のｇＲＮＡを付加することにより創出しうるであろう。場合によって、ｃＤＮＡを含有し、また、選択可能マーカーも含有するＤＮＡ断片を使用して、細胞を、所望のローカスにおいて、適正に編集することができる。
特定の場合に、いずれかの選択的利点が適用可能であるのであれ、いずれかの指向選択を適用するのであれ、適用の有効性を増強し、かつ／または所望の標的以外の部位における、所望されない変更の潜在的可能性を低減するために、標的配列の選択はまた、オフ標的頻度の考慮によっても導くことができる。本明細書および当技術分野で、さらに記載および例示される通り、オフ標的活性の発生は、標的部位と多様なオフ標的部位との間の類似性および相違性のほか、使用される特定のエンドヌクレアーゼも含む、いくつかの因子の影響を受ける可能性がある。オフ標的活性の予測の一助となる、バイオインフォマティクスツールが利用可能であり、このようなツールはまた、オフ標的活性の可能性が最も高い部位を同定し、次いで、これを、実験状況下で評価して、オフ標的の、オン標的活性に対する相対頻度について査定することができ、これにより、より高度な相対オン標的活性を有する配列の選択を可能とするのにも使用しうることが多い。本明細書では、このような技法の実例を提示するが、当技術分野では、他の例が公知である。
標的配列選択の別の態様は、相同組換えイベントに関する。相同性領域を共有する配列は、介在配列の欠失をもたらす、相同組換えイベントのための焦点として用いられうる。このような組換えイベントは、染色体および他のＤＮＡ配列の、通常の複製経過中に生じ、また、通常の細胞複製周期中に定期的に生じるが、多様なイベント（ＵＶ光およびＤＮＡ切断の他の誘導因子など）の発生により増強される場合もあり、ある特定の薬剤（多様な化学的誘導因子など）の存在により増強される場合もある、二本鎖切断（ＤＳＢ）の修復の場合など、ＤＮＡ配列が合成される他の時点においても生じる。多くのこのような誘導因子は、ＤＳＢを、ゲノム内で、無差別的に生じさせ、ＤＳＢは、通常の細胞内で、定期的に誘導および修復されうる。修復中に、元の配列は、完全な忠実度で再構築されうるが、場合によって、小規模の挿入または欠失（「インデル」と称する）が、ＤＳＢ部位に導入される。
ＤＳＢはまた、本明細書で記載されるエンドヌクレアーゼ系の場合のように、特定の位置において、特異的に誘導することもできるが、これを使用して、選択された染色***置において、導かれたかまたは優先的な遺伝子修飾イベントを引き起こすことができる。相同な配列が、ＤＮＡ修復（ならびに複製）において組換えを起こす傾向は、いくつかの状況において利用することができ、相同性により導かれる修復を使用して、「ドナー」ポリヌクレオチドの使用を介して供給される目的の配列を、所望の染色***置へと挿入する、ＣＲＩＳＰＲなど、遺伝子編集系の１つの適用のための基盤である。
「マイクロ相同性」の小領域であって、１０塩基対またはこれ未満という少数の塩基対を含みうる小領域でありうる、特定の配列の間の相同性の領域もまた、所望の欠失をもたらすのに使用することができる。例えば、単一のＤＳＢを、近傍の配列とのマイクロ相同性を呈する部位に導入することができる。このようなＤＳＢの修復の通常の経過中に、高頻度で生じる結果は、ＤＳＢおよび共時的な細胞の修復工程により容易とされる組換えの結果としての、介在配列の欠失である。
しかし、一部の状況では、相同性の領域内で、標的配列を選択することはまた、遺伝子融合（欠失が、コーディング領域内にある場合）を含む、はるかに大型の欠失ももたらしうるが、これは、特定の状況下を考慮して、所望される場合もあり、所望されない場合もある。
本明細書で提示される例は、ジストロフィンのリーディングフレームの修復をもたらす、破壊、欠失、または組換えを誘導するようにデザインされたＤＳＢを創出するための、多様な標的領域の選択、ならびにオン標的イベントと比べてオフ標的イベントを最小化するようにデザインされた、このような領域内の、特異的標的配列の選択をさらに例示する。
核酸の修飾
場合によって、細胞へと導入されたポリヌクレオチドは、例えば、活性、安定性、もしくは特異性を増強するか、送達を変更するか、宿主細胞内の自然免疫応答を低減するか、または本明細書でさらに記載され、当技術分野でも公知の他の増強のために、個別に、または組合せで使用されうる、１または複数の修飾を含みうる。
ある特定の例では、修飾ポリヌクレオチドを、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９／Ｃｐｆ１系で使用しうるが、この場合、ガイドＲＮＡ（単一分子ガイドまたは二重分子ガイド）、および／または細胞へと導入されるＣａｓもしくはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼをコードするＤＮＡもしくはＲＮＡは、下記で記載および例示される通りに修飾することができる。このような修飾ポリヌクレオチドを、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９／Ｃｐｆ１系で使用して、任意の１または複数のゲノムローカスを編集することができる。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９／Ｃｐｆ１系を、このような使用の非限定的例示を目的として使用して、単一分子ガイドの場合もあり、二重分子の場合もある、ガイドＲＮＡと、ＣａｓまたはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼとを含む、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９／Ｃｐｆ１ゲノム編集複合体の形成または安定性を増強するのに、ガイドＲＮＡの修飾を使用することができる。ガイドＲＮＡの修飾はまた、または代替的に、ゲノム編集複合体と、ゲノム内の標的配列との相互作用であって、例えば、オン標的活性を増強するのに使用されうる相互作用の開始、安定性、または反応速度を増強するのに使用することができる。ガイドＲＮＡの修飾はまた、または代替的に、特異性、例えば、オン標的部位におけるゲノム編集の、他の（オフ標的）部位における効果と比較した相対速度を増強するのに使用することができる。
修飾はまた、または代替的に、例えば、細胞内に存在するリボヌクレアーゼ（ＲＮアーゼ）による分解に対するその耐性を増大させ、これにより、細胞内のその半減期を延長することにより、ガイドＲＮＡの安定性を増大させるのに使用することができる。ガイドＲＮＡの半減期を延長する修飾は、エンドヌクレアーゼを発生させるために翻訳される必要があるＲＮＡを介して編集される細胞へと、ＣａｓまたはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼを導入する態様において、特に有用でありうる。エンドヌクレアーゼをコードするＲＮＡと同時に導入される、ガイドＲＮＡ半減期の延長を使用して、ガイドＲＮＡと、コードされるＣａｓまたはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼとが細胞内に共存する時間を延長しうるためである。
修飾はまた、または代替的に、細胞へと導入されたＲＮＡが、自然免疫応答を誘発する可能性または程度を減少させるのに使用することができる。低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を含むＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）の文脈では、十分に特徴付けられており、下記および当技術分野で記載されるこのような応答は、ＲＮＡの半減期の短縮および／またはサイトカインもしくは免疫応答と関連する他の因子の誘発と関連する傾向がある。
限定なしに述べると、ＲＮＡの安定性を増強する（細胞内に存在するＲＮアーゼによる分解に対するその耐性を増大させることなどにより）修飾、結果として得られる産物（すなわち、エンドヌクレアーゼ）の翻訳を増強する修飾、および／または細胞へと導入されたＲＮＡが、自然免疫応答を誘発する可能性もしくは程度を減少させる修飾を含む、１種または複数種の修飾もまた、細胞へと導入されるエンドヌクレアーゼをコードするＲＮＡへと施すことができる。
前出および他のものなどの修飾の組合せも同様に、使用することができる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９／Ｃｐｆ１の場合、例えば、１種または複数種の修飾を、ガイドＲＮＡ（上記で例示したガイドＲＮＡを含む）へと施すこともでき、かつ／または１種または複数種の修飾を、ＣａｓエンドヌクレアーゼをコードするＲＮＡ（上記で例示したＣａｓエンドヌクレアーゼをコードするＲＮＡを含む）へと施すこともできる。
例示を目的として述べると、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９／Ｃｐｆ１系で使用されるガイドＲＮＡ、または他の低分子ＲＮＡは、化学的手段によりたやすく合成することができ、下記で例示され、当技術分野で記載される通り、いくつかの修飾をたやすく組み込むことを可能とする。化学合成手順が、持続的に拡大しつつある一方で、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ；ＰＡＧＥなど、ゲルの使用を回避する）などの手順による、このようなＲＮＡの精製は、ポリヌクレオチド長が、１００ほどのヌクレオチドを優に超えて増大するにつれて、難しくなる傾向がある。より長い化学修飾ＲＮＡを作出するために使用しうる１つの手法は、併せてライゲーションされる、２つまたはこれを超える分子を作製することである。Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼをコードするＲＮＡなど、はるかに長いＲＮＡは、酵素により、よりたやすく作出される。酵素により作製されたＲＮＡにおける使用のために、少数種類の修飾が利用可能であるが、下記および当技術分野でさらに記載される通り、例えば、安定性を増強し、自然免疫応答の可能性もしくは程度を低減し、かつ／または他の属性を増強するのに使用しうる修飾がまだ存在し、新たな種類の修飾が、定期的に開発されている。
多様な種類の修飾、とりわけ、化学合成される低分子ＲＮＡと共に頻繁に使用される修飾についての例示を目的として述べると、修飾は、糖の２’位において修飾された、１または複数のヌクレオチド、一部の態様では、２’−Ｏ−アルキル、２’−Ｏ−アルキル−Ｏ−アルキル、または２’−フルオロで修飾されたヌクレオチドを含みうる。一部の態様では、ＲＮＡ修飾は、ピリミジンのリボース、非塩基性残基、またはＲＮＡの３’末端における逆塩基における、２’−フルオロ、２’−アミノ、または２’Ｏ−メチル修飾を含みうる。このような修飾は、規定の方式で、オリゴヌクレオチドへと組み込むことができ、これらのオリゴヌクレオチドは、所与の標的に対する２’−デオキシオリゴヌクレオチドよりＴｍが大きい（すなわち、標的への結合アフィニティーが大きい）ことが示されている。
いくつかのヌクレオチドおよびヌクレオシド修飾は、それらが組み込まれるオリゴヌクレオチドを、ヌクレアーゼ消化に対して、天然のオリゴヌクレオチドより耐性とすることが示されており、これらの修飾オリゴは、非修飾オリゴヌクレオチドより長時間にわたりインタクトのまま存続する。修飾オリゴヌクレオチドの具体例は、修飾骨格、例えば、ホスホロチオエート、ホスホトリエステル、メチルホスホネート、短鎖アルキルもしくはシクロアルキルによる糖間連結、または短鎖ヘテロ原子もしくは複素環による糖間連結を含む修飾オリゴヌクレオチドを含む。一部のオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート骨格を伴うオリゴヌクレオチド、およびヘテロ原子骨格、特に、ＣＨ２−ＮＨ−Ｏ−ＣＨ２、ＣＨ、〜Ｎ（ＣＨ３）〜Ｏ〜ＣＨ２（メチレン（メチルイミノ）またはＭＭＩ骨格として公知である）、ＣＨ２--Ｏ--Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２骨格、ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２、およびＯ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−ＣＨ２骨格［式中、天然のホスホジエステル骨格を、Ｏ−Ｐ−Ｏ−ＣＨとして表す］；アミド骨格［De Mesmaekerら、Ace. Chem. Res.、２８巻：３６６〜３７４頁（１９９５年）を参照されたい］；モルホリノ骨格構造（SummertonおよびWeller、米国特許第５，０３４，５０６号を参照されたい）；ペプチド核酸（ＰＮＡ）骨格（オリゴヌクレオチドのホスホジエステル骨格を、ポリアミド骨格で置きかえ、ヌクレオチドを、ポリアミド骨格のアザ窒素原子へと、直接的または間接的に結合させる；Nielsenら、Science、１９９１年、２５４巻、１４９７頁を参照されたい）を伴うオリゴヌクレオチドである。リン含有連結は、ホスホロチオエート、キラルのホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、３’アルキレンホスホネートおよびキラルのホスホネートを含む、メチルホスホネートおよび他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、３’−アミノホスホルアミデートおよびアミノアルキルホスホルアミデートを含むホスホルアミデート、チオノホスホルアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、およびボラノホスフェートであって、通常の３’−５’連結を有するこれら、２’−５’連結されたこれらの類似体、およびヌクレオシド単位の隣接する対が、５’−３’に対する３’−５’、または５’−２’に対する２’−５’で連結される逆極性を有するリン含有連結を含むがこれらに限定されない（米国特許第３，６８７，８０８号；同第４，４６９，８６３号；同第４，４７６，３０１号；同第５，０２３，２４３号；同第５，１７７，１９６号；同第５，１８８，８９７号；同第５，２６４，４２３号；同第５，２７６，０１９号；同第５，２７８，３０２号；同第５，２８６，７１７号；同第５，３２１，１３１号；同第５，３９９，６７６号；同第５，４０５，９３９号；同第５，４５３，４９６号；同第５，４５５，２３３号；同第５，４６６，６７７号；同第５，４７６，９２５号；同第５，５１９，１２６号；同第５，５３６，８２１号；同第５，５４１，３０６号；同第５，５５０，１１１号；同第５，５６３，２５３号；同第５，５７１，７９９号；同第５，５８７，３６１号；および同第５，６２５，０５０号を参照されたい）。
モルホリノベースのオリゴマー性化合物については、BraaschおよびDavid Corey、Biochemistry、４１巻（１４号）：４５０３〜４５１０頁（２００２年）；Genesis、３０巻、３号（２００１年）；Heasman、Dev. Biol.、２４３巻：２０９〜２１４頁（２００２年）；Naseviciusら、Nat. Genet.、２６巻：２１６〜２２０頁（２０００年）；Lacerraら、Proc. Natl. Acad. Sci.、９７巻：９５９１〜９５９６頁（２０００年）；および１９９１年７月２３日に公布された、米国特許第５，０３４，５０６号において記載されている。
シクロヘキセニル核酸オリゴヌクレオチド模倣体については、Wangら、J. Am. Chem. Soc.、１２２巻：８５９５〜８６０２頁（２０００年）において記載されている。
その中にリン原子を含まない修飾オリゴヌクレオチド骨格は、短鎖アルキルもしくはシクロアルキルによるヌクレオシド間連結、ヘテロ原子とアルキルもしくはシクロアルキルとの混合によるヌクレオシド間連結、または１もしくは複数の短鎖のヘテロ原子もしくは複素環によるヌクレオシド間連結により形成される骨格を有する。これらは、モルホリノ連結を有する骨格（ヌクレオシドの糖部分から部分的に形成される）；シロキサン骨格；スルフィド、スルホキシド、およびスルホン骨格；ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格；メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格；アルケン含有骨格；スルファメート骨格；メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ骨格；スルホネートおよびスルホンアミド骨格；アミド骨格；ならびにＮ、Ｏ、Ｓ、およびＣＨ２の構成要素部分の混合を有する他の骨格（それらの各々が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，０３４，５０６号；同第５，１６６，３１５号；同第５，１８５，４４４号；同第５，２１４，１３４号；同第５，２１６，１４１号；同第５，２３５，０３３号；同第５，２６４，５６２号；同第５，２６４，５６４号；同第５，４０５，９３８号；同第５，４３４，２５７号；同第５，４６６，６７７号；同第５，４７０，９６７号；同第５，４８９，６７７号；同第５，５４１，３０７号；同第５，５６１，２２５号；同第５，５９６，０８６号；同第５，６０２，２４０号；同第５，６１０，２８９号；同第５，６０２，２４０号；同第５，６０８，０４６号；同第５，６１０，２８９号；同第５，６１８，７０４号；同第５，６２３，０７０号；同第５，６６３，３１２号；同第５，６３３，３６０号；同第５，６７７，４３７号；および同第５，６７７，４３９号を参照されたい）を含む。
１または複数の置換糖部分、例えば、２’位における以下：ＯＨ、ＳＨ、ＳＣＨ３、Ｆ、ＯＣＮ、ＯＣＨ３ＯＣＨ３、ＯＣＨ３Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、またはＯ（ＣＨ２）ｎＣＨ３［式中、ｎは、１〜約１０である］；Ｃ１〜Ｃ１０の低級アルキル、アルコキシアルコキシ、置換低級アルキル、アルカリールまたはアラルキル；Ｃｌ；Ｂｒ；ＣＮ；ＣＦ３；ＯＣＦ３；Ｏ−、Ｓ−、またはＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ−、またはＮ−アルケニル；ＳＯＣＨ３；ＳＯ２ＣＨ３；ＯＮＯ２；ＮＯ２；Ｎ３；ＮＨ２；ヘテロシクロアルキル；ヘテロシクロアルカリール；アミノアルキルアミノ；ポリアルキルアミノ；置換シリル；ＲＮＡ切断基；レポーター基；挿入剤；オリゴヌクレオチドの薬物動態特性を改善するための基；またはオリゴヌクレオチドの薬力学特性を改善するための基；および同様の特性を有する他の置換基のうちの１つも含まれうる。一部の態様では、修飾は、２’−メトキシエトキシ（２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）としてもまた公知の、２’−０−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３）修飾（Martinら、HeIv. Chim. Acta、１９９５年、７８巻、４８６頁）を含む。他の修飾は、２’−メトキシ（２’−０−ＣＨ３）、２’−プロポキシ（２’−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３）、および２’−フルオロ（２’−Ｆ）を含む。同様の修飾を、オリゴヌクレオチド上の他の位置、特に、３’末端ヌクレオチド上の糖の３’位および５’末端ヌクレオチドの５’位においても施すことができる。オリゴヌクレオチドはまた、ペントフラノシル基の代わりに、シクロブチルなどの糖模倣体も有しうる。
一部の例では、糖およびヌクレオシド間連結の両方、すなわち、ヌクレオチド単位の骨格を、新規の基で置きかえることができる。塩基単位は、適切な核酸標的化合物とのハイブリダイゼーションのために維持することができる。１つのこのようなオリゴマー性化合物であるオリゴヌクレオチド模倣体であって、優れたハイブリダイゼーション特性を有することが示されているオリゴヌクレオチド模倣体を、ペプチド核酸（ＰＮＡ）と称する。ＰＮＡ化合物中では、オリゴヌクレオチドの糖骨格を、アミド含有骨格、例えば、アミノエチルグリシン骨格で置きかえることができる。ヌクレオ塩基は保持し、骨格のアミド部分のアザ窒素原子へと、直接的または間接的に結合させることができる。ＰＮＡ化合物の調製について教示する、代表的な米国特許は、米国特許第５，５３９，０８２号；同第５，７１４，３３１号；および同第５，７１９，２６２号を含むがこれらに限定されない。ＰＮＡ化合物についてのさらなる教示は、Nielsenら、Science、２５４巻：１４９７〜１５００頁（１９９１年）において見出すことができる。
ガイドＲＮＡはまた、加えてまたは代替的に、ヌクレオ塩基（当技術分野では単に「塩基」と称することが多い）の修飾または置換も含みうる。本明細書で使用される場合、「非修飾」または「天然」ヌクレオ塩基は、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、およびウラシル（Ｕ）を含む。修飾ヌクレオ塩基は、天然の核酸内で、低頻度で、または一過性に見出されるに過ぎないヌクレオ塩基、例えば、ヒポキサンチン、６−メチルアデニン、５−Ｍｅピリミジン、特に、５−メチルシトシン（また、５−メチル−２’デオキシシトシンとも称され、当技術分野では、５−Ｍｅ−Ｃと称されることが多い）、５−ヒドロキシメチルシトシン（ＨＭＣ）、グリコシルＨＭＣ、およびゲントビオシルＨＭＣ、ならびに合成のヌクレオ塩基、例えば、２−アミノアデニン、２−（メチルアミノ）アデニン、２−（イミダゾイルアルキル）アデニン、２−（アミノアルキル（alkly）アミノ）アデニンまたは他のヘテロ置換アルキルアデニン、２−チオウラシル、２−チオチミン、５−ブロモウラシル、５−ヒドロキシメチルウラシル、８−アザグアニン、７−デアザグアニン、Ｎ６（６−アミノヘキシル）アデニン、および２，６−ジアミノプリンを含む（Kornberg, A.、DNA Replication、W. H. Freeman & Co.、San Francisco、７５〜７７頁（１９８０年）；Gebeyehuら、Nucl. Acids Res.、１５巻：４５１３頁（１９９７年））。当技術分野で公知の「ユニバーサル」塩基、例えば、イノシンもまた、組み入れることができる。５−Ｍｅ−Ｃ置換は、核酸二重鎖の安定性を、０．６〜１．２℃だけ上昇させることが示されており（Sanghvi, Y. S.、Crooke, S. T.およびLebleu, B.編、Antisense Research and Applications、CRC Press、Boca Raton、１９９３年、２７６〜２７８頁）、塩基置換の態様である。
修飾ヌクレオ塩基は、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６−メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの２−プロピルおよび他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミン、および２−チオシトシン、５−ハロウラシルおよび５−ハロシトシン、５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシン、６−アゾウラシル、６−アゾシトシン、および６−アゾチミン、５−ウラシル（シュードウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシルアデニンおよび８−ヒドロキシルグアニンならびに他の８−置換アデニンおよび８−置換グアニン、５−ハロウラシルおよび５−ハロシトシン、特に、５−ブロモウラシルおよび５−ブロモシトシン、５−トリフルオロメチルウラシルおよび５−トリフルオロメチルシトシン、ならびに他の５−置換ウラシルおよび５−置換シトシン、７−メチルグアニン（quanine）および７−メチルアデニン、８−アザグアニンおよび８−アザアデニン、７−デアザグアニンおよび７−デアザアデニン、ならびに３−デアザグアニンおよび３−デアザアデニンなど、他の合成および天然ヌクレオ塩基を含みうる。
さらに、ヌクレオ塩基は、；米国特許第３，６８７，８０８号において開示されているヌクレオ塩基；「The Concise Encyclopedia of Polymer Science And Engineering」、８５８〜８５９頁、Kroschwitz, J.I.編、John Wiley & Sons、１９９０年において開示されているヌクレオ塩基；Englischら、「Angewandle Chemie, International Edition」、１９９１年、３０巻、６１３頁により開示されているヌクレオ塩基；およびSanghvi, Y. S.、１５章、「Antisense Research and Applications」、２８９〜３０２頁、Crooke, S.T.およびLebleu, B.編著、CRC Press、１９９３年により開示されているヌクレオ塩基を含みうる。これらのヌクレオ塩基のうちのいくつかは、本発明のオリゴマー性化合物の結合アフィニティーを増大させるために、特に有用である。これらは、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジン、ならびに２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシル、および５−プロピニルシトシンを含む、Ｎ−２、Ｎ−６、および０−６置換プリンを含む。５−メチルシトシン置換は、核酸二重鎖の安定性を、０．６〜１．２℃だけ上昇させることが示されており（Sanghvi, Y. S.、Crooke, S. T.およびLebleu, B.編、「Antisense Research and Applications」、CRC Press、Boca Raton、１９９３年、２７６〜２７８頁）、なおより特に、２’−Ｏ−メトキシエチル糖修飾と組み合わせた場合、塩基置換の態様である。修飾ヌクレオ塩基については、米国特許第３，６８７，８０８号のほか、同第４，８４５，２０５号；同第５，１３０，３０２号；同第５，１３４，０６６号；同第５，１７５，２７３号；同第５，３６７，０６６号；同第５，４３２，２７２号；同第５，４５７，１８７号；同第５，４５９，２５５号；同第５，４８４，９０８号；同第５，５０２，１７７号；同第５，５２５，７１１号；同第５，５５２，５４０号；同第５，５８７，４６９号；同第５，５９６，０９１号；同第５，６１４，６１７号；同第５，６８１，９４１号；同第５，７５０，６９２号；同第５，７６３，５８８号；同第５，８３０，６５３号；同第６，００５，０９６号；および米国特許出願公開第２００３／０１５８４０３号において記載されている。
したがって、「修飾された」という用語は、ガイドＲＮＡ、エンドヌクレアーゼ、またはガイドＲＮＡおよびエンドヌクレアーゼの両方へと組み込まれた、非天然の糖、リン酸、または塩基を指す。所与のオリゴヌクレオチド内の全ての位置が、一様に修飾される必要はなく、実際、前述の修飾のうちの１つを超える修飾は、単一のオリゴヌクレオチドに組み込むこともでき、オリゴヌクレオチド内の単一のヌクレオシドに組み込むこともできる。
ガイドＲＮＡおよび／またはエンドヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ（またはＤＮＡ）は、活性、細胞の分布、またはオリゴヌクレオチドの細胞による取込みを増強する、１または複数の部分またはコンジュゲートへと化学的に連結することができる。このような部分は、コレステロール部分などの脂質部分［Letsingerら、Proc. Natl. Acad.、Sci. USA、８６巻：６５５３〜６５５６頁（１９８９年）］；コール酸［Manoharanら、Bioorg. Med. Chem. Let.、４巻：１０５３〜１０６０頁（１９９４年）］；チオエーテル、例えば、ヘキシル−Ｓ−トリチルチオール［Manoharanら、Ann. N. Y. Acad. Sci.、６６０巻：３０６〜３０９頁（１９９２年）；およびManoharanら、Bioorg. Med. Chem. Let.、３巻：２７６５〜２７７０頁（１９９３年）］；チオコレステロール［Oberhauserら、Nucl. Acids Res.、２０巻：５３３〜５３８頁（１９９２年）］；脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオールもしくはウンデシル残基［Kabanovら、FEBS Lett.、２５９巻：３２７〜３３０頁（１９９０年）；およびSvinarchukら、Biochimie、７５巻：４９〜５４頁（１９９３年）］；リン脂質、例えば、ジ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロールもしくはトリエチルアンモニウム１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈ−ホスホネート［Manoharanら、Tetrahedron Lett.、３６巻：３６５１〜３６５４頁（１９９５年）；およびSheaら、Nucl. Acids Res.、１８巻：３７７７〜３７８３頁（１９９０年）］；ポリアミンもしくはポリエチレングリコール鎖［Mancharanら、Nucleosides & Nucleotides、１４巻：９６９〜９７３頁（１９９５年）］；アダマンタン酢酸［Manoharanら、Tetrahedron Lett.、３６巻：３６５１〜３６５４頁（１９９５年）］；パルミチル部分［（Mishraら、Biochim. Biophys. Acta、１２６４巻：２２９〜２３７頁（１９９５年）］；またはオクタデシルアミンもしくはヘキシルアミノ−カルボニル−ｔオキシコレステロール（hexylamino-carbonyl-t oxycholesterol）部分［Crookeら、J. Pharmacol. Exp. Ther.、２７７巻：９２３〜９３７頁（１９９６年）］を含むがこれらに限定されない。また、米国特許第４，８２８，９７９号；同第４，９４８，８８２号；同第５，２１８，１０５号；同第５，５２５，４６５号；同第５，５４１，３１３号；同第５，５４５，７３０号；同第５，５５２，５３８号；同第５，５７８，７１７号；同第５，５８０，７３１号；同第５，５８０，７３１号；同第５，５９１，５８４号；同第５，１０９，１２４号；同第５，１１８，８０２号；同第５，１３８，０４５号；同第５，４１４，０７７号；同第５，４８６，６０３号；同第５，５１２，４３９号；同第５，５７８，７１８号；同第５，６０８，０４６号；同第４，５８７，０４４号；同第４，６０５，７３５号；同第４，６６７，０２５号；同第４，７６２，７７９号；同第４，７８９，７３７号；同第４，８２４，９４１号；同第４，８３５，２６３号；同第４，８７６，３３５号；同第４，９０４，５８２号；同第４，９５８，０１３号；同第５，０８２，８３０号；同第５，１１２，９６３号；同第５，２１４，１３６号；同第５，０８２，８３０号；同第５，１１２，９６３号；同第５，２１４，１３６号；同第５，２４５，０２２号；同第５，２５４，４６９号；同第５，２５８，５０６号；同第５，２６２，５３６号；同第５，２７２，２５０号；同第５，２９２，８７３号；同第５，３１７，０９８号；同第５，３７１，２４１号；同第５，３９１，７２３号；同第５，４１６，２０３号；同第５，４５１，４６３号；同第５，５１０，４７５号；同第５，５１２，６６７号；同第５，５１４，７８５号；同第５，５６５，５５２号；同第５，５６７，８１０号；同第５，５７４，１４２号；同第５，５８５，４８１号；同第５，５８７，３７１号；同第５，５９５，７２６号；同第５，５９７，６９６号；同第５，５９９，９２３号；同第５，５９９，９２８号；および同第５，６８８，９４１号も参照されたい。
糖および他の部分を使用して、タンパク質と、カチオン性のポリソームおよびリポソームなど、ヌクレオチドを含む複合体とを、特定の部位へとターゲティングすることができる。例えば、肝細胞指向移入は、アシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰＲ）を媒介しうる（例えば、Huら、Protein Pept Lett.、２１巻（１０号）：１０２５〜３０頁（２０１４年）を参照されたい）。当技術分野で公知であり、定期的に開発されている他の系は、本場合において使用される生体分子および／またはその複合体を、目的の、特定の標的細胞へとターゲティングするのに使用することができる。
これらのターゲティング部分またはコンジュゲートは、一級または二級ヒドロキシル基などの官能基へと共有結合的に結合させたコンジュゲート基を含みうる。本発明のコンジュゲート基は、挿入剤、レポーター分子、ポリアミン、ポリアミド、ポリエチレングリコール、ポリエーテル、オリゴマーの薬力学特性を増強する基、およびオリゴマーの薬物動態特性を増強する基を含む。典型的なコンジュゲート基は、コレステロール、脂質、リン脂質、ビオチン、フェナジン、葉酸塩、フェナントリジン、アントラキノン、アクリジン、フルオレセイン、ローダミン、クマリン、および色素を含む。本開示の文脈における、薬力学特性を増強する基は、取込みを改善する基、分解に対する耐性を増強する基、および／または標的核酸との配列特異的ハイブリダイゼーションを強化する基を含む。本発明の文脈における、薬物動態特性を増強する基は、本発明の化合物の、取込み、分布、代謝、または排出を改善する基を含む。代表的なコンジュゲート基は、１９９２年１０月２３日に出願された、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９２／０９１９６号、および米国特許第６，２８７，８６０号において開示されている。コンジュゲート部分は、コレステロール部分などの脂質部分、コール酸、チオエーテル、例えば、ヘキシル−５−トリチルチオール、チオコレステロール、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオールまたはウンデシル残基、リン脂質、例えば、ジ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロールまたはトリエチルアンモニウム１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈ−ホスホネート、ポリアミン鎖もしくはポリエチレングリコール鎖、またはアダマンタン酢酸、パルミチル部分、またはオクタデシルアミンもしくはヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロール部分を含むがこれらに限定されない。例えば、米国特許第４，８２８，９７９号；同第４，９４８，８８２号；同第５，２１８，１０５号；同第５，５２５，４６５号；同第５，５４１，３１３号；同第５，５４５，７３０号；同第５，５５２，５３８号；同第５，５７８，７１７号；同第５，５８０，７３１号；同第５，５８０，７３１号；同第５，５９１，５８４号；同第５，１０９，１２４号；同第５，１１８，８０２号；同第５，１３８，０４５号；同第５，４１４，０７７号；同第５，４８６，６０３号；同第５，５１２，４３９号；同第５，５７８，７１８号；同第５，６０８，０４６号；同第４，５８７，０４４号；同第４，６０５，７３５号；同第４，６６７，０２５号；同第４，７６２，７７９号；同第４，７８９，７３７号；同第４，８２４，９４１号；同第４，８３５，２６３号；同第４，８７６，３３５号；同第４，９０４，５８２号；同第４，９５８，０１３号；同第５，０８２，８３０号；同第５，１１２，９６３号；同第５，２１４，１３６号；同第５，０８２，８３０号；同第５，１１２，９６３号；同第５，２１４，１３６号；同第５，２４５，０２２号；同第５，２５４，４６９号；同第５，２５８，５０６号；同第５，２６２，５３６号；同第５，２７２，２５０号；同第５，２９２，８７３号；同第５，３１７，０９８号；同第５，３７１，２４１号；同第５，３９１，７２３号；同第５，４１６，２０３号；同第５，４５１，４６３号；同第５，５１０，４７５号；同第５，５１２，６６７号；同第５，５１４，７８５号；同第５，５６５，５５２号；同第５，５６７，８１０号；同第５，５７４，１４２号；同第５，５８５，４８１号；同第５，５８７，３７１号；同第５，５９５，７２６号；同第５，５９７，６９６号；同第５，５９９，９２３号；同第５，５９９，９２８号；および同第５，６８８，９４１号を参照されたい。
化学合成にあまり適さず、酵素的合成により作製することが典型的な、長型のポリヌクレオチドもまた、多様な手段により修飾することができる。このような修飾は、例えば、ある特定のヌクレオチド類似体の導入、特定の配列または他の部分の、分子の５’または３’末端における組込み、および他の修飾を含みうる。例示を目的として述べると、Ｃａｓ９をコードするｍＲＮＡは、約４ｋｂの長さであり、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける転写により合成することができる。ｍＲＮＡへの修飾は、例えば、その翻訳または安定性を増大させる（細胞による分解に対するその耐性を増大させることなどによる）ように適用することもでき、ＲＮＡの、自然免疫応答を誘発する傾向であって、外因性ＲＮＡ、特に、Ｃａｓ９をコードするＲＮＡなど、長いＲＮＡの導入後において、細胞内で観察されることが多い傾向を低減するように適用することもできる。
当技術分野では、ポリＡテール、５’キャップ類似体（例えば、ＡＲＣＡ（Ａｎｔｉ−Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｃａｐ Ａｎａｌｏｇ）またはｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ（ｍＣＡＰ））、修飾５’または３’非翻訳領域（ＵＴＲ）、修飾塩基（シュードＵＴＰ、２−チオ−ＵＴＰ、５−メチルシチジン−５’−三リン酸（５−メチル−ＣＴＰ）またはＮ６−メチル−ＡＴＰなど）の使用、または５’末端リン酸を除去する、ホスファターゼによる処理など、多数のこのような修飾について記載されている。当技術分野では、これらの修飾および他の修飾が公知であり、ＲＮＡの新たな修飾が、定期的に開発されている。
例えば、ＴｒｉＬｉｎｋ Ｂｉｏｔｅｃｈ、ＡｘｏＬａｂｓ、Ｂｉｏ−Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｉｎｃ．、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ、および多くの他の供給元を含む、修飾ＲＮＡの多数の市販品の供給元が存在する。ＴｒｉＬｉｎｋにより記載されている通り、例えば、５−メチル−ＣＴＰを使用して、ヌクレアーゼの安定性の増大、翻訳の増大、または生得的免疫受容体の、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて転写されたＲＮＡとの相互作用の低減など、望ましい特徴を付与することができる。下記で言及される、KormannらおよびWarrenらによる刊行物において例示されている通り、５−メチルシチジン−５’−三リン酸（５−メチル−ＣＴＰ）、Ｎ６−メチル−ＡＴＰ、ならびにシュードＵＴＰおよび２−チオ−ＵＴＰはまた、培養物中およびｉｎ ｖｉｖｏにおける生得的免疫刺激を低減する一方で、翻訳を増強することも示されている。
ｉｎ ｖｉｖｏにおいて送達される化学修飾ｍＲＮＡを使用して、治療効果の改善を達成しうることが示されている（例えば、Kormannら、Nature Biotechnology、２９巻、１５４〜１５７頁（２０１１年）を参照されたい）。このような修飾を使用して、例えば、ＲＮＡ分子の安定性を増大させ、かつ／またはその免疫原性を低減することができる。シュードＵ、Ｎ６−メチル−Ａ、２−チオ−Ｕ、および５−メチル−Ｃなどの化学修飾を使用して、ウリジンおよびシチジン残基のうちの４分の１だけを、それぞれ、２−チオ−Ｕおよび５−メチル−Ｃで置換する結果として、マウスにおける、ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）により媒介されるｍＲＮＡの認識の顕著な低下がもたらされることが見出された。生得的免疫系の活性化を低減することにより、これらの修飾を使用して、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるｍＲＮＡの安定性および寿命を効果的に増大させることができる（例えば、Kormannら、前出を参照されたい）。
また、生得的抗ウイルス応答を迂回するようにデザインされた修飾を組み込む、合成のメッセンジャーＲＮＡの反復投与は、分化ヒト細胞を、多能性へと再プログラム化できることも示されている。例えば、Warrenら、Cell Stem Cell、７巻（５号）：６１８〜３０頁（２０１０年）を参照されたい。一次再プログラム化タンパク質として作用する、このような修飾ｍＲＮＡは、複数のヒト細胞型を再プログラム化する、効率的な手段でありうる。このような細胞を、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）と称し、５−メチル−ＣＴＰ、シュードＵＴＰ、およびＡＲＣＡ（Ａｎｔｉ−Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｃａｐ Ａｎａｌｏｇ）を組み込む、酵素的に合成されたＲＮＡであれば、細胞の抗ウイルス応答を効果的に逃避するのに使用されうることが見出された（例えば、Warrenら、前出を参照されたい）。
当技術分野で記載されるポリヌクレオチドの他の修飾は、例えば、ポリＡテールの使用、５’キャップ類似体（ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ（ｍＣＡＰ）など）の付加、５’もしくは３’非翻訳領域ＵＴＲの修飾、または５’末端リン酸を除去する、ホスファターゼによる処理（そして、新たな手法が定期的に開発されている）を含む。
本明細書における使用のための修飾ＲＮＡを作出するのに適用可能な、いくつかの組成物および技法が、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を含む、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）の修飾との関連で開発されている。ｓｉＲＮＡは、ｍＲＮＡ干渉を介する、遺伝子サイレンシングに対するそれらの効果は一般に、一過性であり、これは、反復投与を要求しうるため、ｉｎ ｖｉｖｏでは、特定の課題を提示する。加えて、ｓｉＲＮＡは、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）であり、哺乳動物細胞は、ウイルス感染の副産物であることが多い、ｄｓＲＮＡを検出および中和するように進化した免疫応答を有する。こうして、ｄｓＲＮＡに対する細胞応答を媒介しうる、ＰＫＲ（ｄｓＲＮＡ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｋｉｎａｓｅ）など、哺乳動物の酵素、および、潜在的に、レチノイン酸誘導性遺伝子Ｉ（ＲＩＧ−Ｉ）のほか、このような分子に応答してサイトカインの誘導を惹起しうる、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ３、ＴＬＲ７、およびＴＬＲ８など）が存在する（例えば、Angartら、Pharmaceuticals（Basel）、６巻（４号）：４４０〜４６８頁（２０１３年）；Kanastyら、Molecular Therapy、２０巻（３号）：５１３〜５２４頁（２０１２年）；Burnettら、Biotechnol J.、６巻（９号）：１１３０〜４６頁（２０１１年）；JudgeおよびMacLachlan、Hum Gene Ther、１９巻（２号）：１１１〜２４頁（２００８年）による総説；ならびにこれらにおいて引用されている参考文献を参照されたい）。
ＲＮＡの安定性を増強し、自然免疫応答を低減し、かつ／またはポリヌクレオチドの、ヒト細胞への導入であって、本明細書で記載される導入との関連で有用でありうる他の利益を達成するように、多種多様な修飾が、開発および適用されている（例えば、Whitehead KAら、Annual Review of Chemical and Biomolecular Engineering、２巻：７７〜９６頁（２０１１年）；GaglioneおよびMessere、Mini Rev Med Chem、１０巻（７号）：５７８〜９５頁（２０１０年）；Chernolovskayaら、Curr Opin Mol Ther.、１２巻（２号）：１５８〜６７頁（２０１０年）；Deleaveyら、Curr Protoc Nucleic Acids Chem、１６章：１６．３部（２００９年）；Behlke、Oligonucleotides、１８巻（４号）：３０５〜１９頁（２００８年）；Fuciniら、Nucleic Acid Ther、２２巻（３号）：２０５〜２１０頁（２０１２年）；Bremsenら、Front Genet、３巻：１５４頁（２０１２年）による総説を参照されたい）。
上記で言及した通り、それらの多くが、ｓｉＲＮＡの有効性を改善するようにデザインされた修飾に特化した、修飾ＲＮＡのいくつかの市販品の供給元が存在する。文献で報告されている多様な知見に基づき、様々な手法が提供されている。例えば、Dharmaconは、Kole、Nature Reviews Drug Discovery、１１巻：１２５〜１４０頁（２０１２年）により報告されている通り、非架橋酸素の、硫黄（ホスホロチオエート、ＰＳ）による置きかえが、ｓｉＲＮＡのヌクレアーゼ耐性を改善するのに使用されていることについて言及している。リボースの２’位の修飾は、ヌクレオチド間のリン酸結合のヌクレアーゼ耐性を改善する一方で、二重鎖の安定性（Ｔｍ）を増大させ、これはまた、免疫活性化からの保護をもたらすことも示されていることが報告されている。Soutschekら、Nature、４３２巻：１７３〜１７８頁（２００４年）により報告されている通り、中程度のＰＳ骨格の修飾の、小型の、十分に忍容される２’−置換（２’−Ｏ−メチル、２’−フルオロ、２’−ヒドロ）との組合せは、ｉｎ ｖｉｖｏにおける適用のための、高度に安定的なｓｉＲＮＡと関連しており、Volkov、Oligonucleotides、１９巻：１９１〜２０２頁（２００９年）により報告されている通り、２’−Ｏ−メチル修飾は、安定性の改善において有効であることが報告されている。自然免疫応答の誘導を減少させることとの関連で、特異的配列を、２’−Ｏ−メチル、２’−フルオロ、２’−ヒドロで修飾することは、ＴＬＲ７／ＴＬＲ８の相互作用を低減する一方で、一般に、サイレンシング活性を保存することが報告されている（例えば、Judgeら、Mol. Ther.、１３巻：４９４〜５０５頁（２００６年）；およびCekaiteら、J. Mol. Biol.、３６５巻：９０〜１０８頁（２００７年）を参照されたい）。２−チオウラシル、シュードウラシル、５−メチルシトシン、５−メチルウラシル、およびＮ６−メチルアデノシンなどのさらなる修飾もまた、ＴＬＲ３、ＴＬＲ７、およびＴＬＲ８により媒介される免疫作用を最小化することが示されている（例えば、Kariko, K.ら、Immunity、２３巻：１６５〜１７５頁（２００５年）を参照されたい）。
また、当技術分野で公知であり、市販されている、いくつかのコンジュゲートであって、例えば、コレステロール、トコフェロール、および葉酸、脂質、ペプチド、ポリマー、リンカー、およびアプタマーを含み、それらの送達および／または細胞による取込みを増強しうるコンジュゲートを、本明細書での使用のための、ＲＮＡなどのポリヌクレオチドへと適用することができる（例えば、Winkler、Ther. Deliv.、４巻：７９１〜８０９頁（２０１３年）による総説、およびこれにおいて引用されている参考文献を参照されたい）。
コドンの最適化
部位特異的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、当技術分野で標準的な方法に従い、目的の標的ＤＮＡを含有する細胞内の発現のために、コドンを最適化することができる。例えば、意図された標的核酸が、ヒト細胞内にある場合、Ｃａｓ９をコードする、コドンを最適化したヒトポリヌクレオチドを、Ｃａｓ９ポリペプチドを産生するための使用に想定する。
ゲノムターゲティング核酸と部位特異的ポリペプチドとの複合体
ゲノムターゲティング核酸は、部位特異的ポリペプチド（例えば、Ｃａｓ９など、核酸にガイドされるヌクレアーゼ）と相互作用し、これにより、複合体を形成する。ゲノムターゲティング核酸は、部位特異的ポリペプチドを、標的核酸へと導く。
ＲＮＰ
部位特異的ポリペプチドおよびゲノムターゲティング核酸は各々、細胞または患者へと、個別に投与することができる。他方、部位特異的ポリペプチドは、１もしくは複数のガイドＲＮＡ、またはｔｒａｃｒＲＮＡと併せた１もしくは複数のｃｒＲＮＡと、あらかじめ複合体化させることができる。次いで、あらかじめ複合体化させた材料を、細胞または患者へと投与することができる。このようなあらかじめ複合体化させた材料は、リボヌクレオタンパク質粒子（ＲＮＰ）として公知である。
系の構成要素をコードする核酸
本開示は、本開示のゲノムターゲティング核酸、本開示の部位特異的ポリペプチド、および／または本開示の方法の態様を実行するのに必要な、任意の核酸もしくはタンパク質性分子をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を提示する。
本開示のゲノムターゲティング核酸、本開示の部位特異的ポリペプチド、および／または本開示の方法の態様を実行するのに必要な、任意の核酸もしくはタンパク質性分子をコードする核酸は、ベクター（例えば、組換え発現ベクター）を含みうる。
「ベクター」という用語は、それを連結した別の核酸を輸送することが可能な核酸分子を指す。ベクターの１つの種類は、さらなる核酸セグメントをライゲーションしうる、環状の二本鎖ＤＮＡループを指す、「プラスミド」である。ベクターの別の種類は、さらなる核酸セグメントを、ウイルスゲノムへとライゲーションしうる、ウイルスベクターである。ある特定のベクターは、それらが導入される宿主細胞内の自己複製が可能である（例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクター、および哺乳動物のエピソームベクター）。他のベクター（例えば、哺乳動物の非エピソームベクター）は、宿主細胞への導入時に、宿主細胞のゲノムへと組み込まれ、これにより、宿主ゲノムと共に複製される。
一部の例では、ベクターは、それらが作動的に連結された核酸の発現を導くことが可能でありうる。本明細書では、このようなベクターを、「組換え発現ベクター」、またはより簡単に、「発現ベクター」と称するが、これらは、同等の機能を果たす。
「作動可能に連結された」という用語は、目的のヌクレオチド配列が、ヌクレオチド配列の発現を可能とする形で、調節配列へと連結されていることを意味する。「調節配列」という用語は、例えば、プロモーター、エンハンサー、および他の発現制御エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むことを意図する。当技術分野では、このような調節配列が周知であり、例えば、Goeddel、Gene Expression Technology、Methods in Enzymology、１８５巻、Academic Press、San Diego、CA（１９９０年）において記載されている。調節配列は、多くの種類の宿主細胞内のヌクレオチド配列の構成的発現を導く調節配列と、ある特定の宿主細胞内だけのヌクレオチド配列の発現を導く調節配列（例えば、組織特異的調節配列）とを含む。当業者は、発現ベクターのデザインが、標的細胞の選び出し、所望の発現レベルなどの因子に依存しうることを察知するであろう。
想定される発現ベクターは、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ＳＶ４０、単純ヘルペスウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、レトロウイルス（例えば、マウス白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルス、ならびにラウス肉腫ウイルス、ハーベイ肉腫ウイルス、トリ白血病ウイルス、レンチウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルス、および乳腺腫瘍ウイルスなどのレトロウイルスに由来するベクター）、および他の組換えベクターに基づくウイルスベクターを含むがこれらに限定されない。真核標的細胞のために想定される他のベクターは、ベクターである、ｐＸＴ１、ｐＳＧ５、ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、およびｐＳＶＬＳＶ４０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を含むがこれらに限定されない。真核標的細胞のために想定されるさらなるベクターは、図１Ａ〜１Ｃに記載されているベクターである、ｐＣＴｘ−１、ｐＣＴｘ−２、およびｐＣＴｘ−３を含むがこれらに限定されない。宿主細胞と適合性である限りにおいて、他のベクターを使用することができる。
一部の例では、ベクターは、１または複数の転写および／または翻訳制御エレメントを含みうる。利用される宿主／ベクター系に応じて、構成的および誘導的プロモーター、転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーターなどを含む、いくつかの適切な転写および翻訳制御エレメントのいずれかを、発現ベクター内で使用することができる。ベクターは、ウイルス配列またはＣＲＩＳＰＲ機構もしくは他のエレメントの構成要素を不活化させる、自己不活化ベクターでありうる。
適切な真核プロモーター（すなわち、真核細胞内で機能的なプロモーター）の非限定的な例は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）即初期、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）チミジンキナーゼ、初期および後期ＳＶ４０、レトロウイルスに由来するＬＴＲ（ｌｏｎｇ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ）、ヒト伸長因子１プロモーター（ＥＦ１）、ニワトリベータ−アクチンプロモーター（ＣＡＧ）へと融合させたサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサーを含むハイブリッド構築物、マウス幹細胞ウイルスプロモーター（ＭＳＣＶ）、ホスホグリセリン酸キナーゼ−１ローカスプロモーター（ＰＧＫ）、およびマウスメタロチオネインＩに由来するプロモーターを含む。
Ｃａｓエンドヌクレアーゼとの関連で使用されるガイドＲＮＡを含む低分子ＲＮＡを発現するためには、例えば、Ｕ６およびＨ１を含む、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターなどの多様なプロモーターが有利でありうる。当技術分野では、このようなプロモーターの使用を増強することについての記載、およびこのためのパラメータが公知であり、さらなる情報および手法が、定期的に記載されている（例えば、Ma, H.ら、Molecular Therapy - Nucleic Acids、３巻、ｅ１６１頁（２０１４年）、ｄｏｉ：１０．１０３８／ｍｔｎａ．２０１４．１２を参照されたい）。
発現ベクターはまた、翻訳開始のためのリボソーム結合性部位および転写ターミネーターも含有しうる。発現ベクターはまた、発現を増幅するのに適切な配列も含みうる。発現ベクターはまた、非天然タグ（例えば、ヒスチジンタグ、ヘマグルチニンタグ、緑色蛍光タンパク質など）をコードするヌクレオチド配列であって、部位特異的ポリペプチドへと融合させ、したがって、融合タンパク質をもたらすヌクレオチド配列も含みうる。
プロモーターは、誘導的プロモーター（例えば、熱ショックプロモーター、テトラサイクリン調節型プロモーター、ステロイド調節型プロモーター、金属調節型プロモーター、エストロゲン受容体調節型プロモーターなど）でありうる。プロモーターは、構成的プロモーター（例えば、ＣＭＶプロモーター、ＵＢＣプロモーター）でありうる。場合によって、プロモーターは、空間限定型および／または時間限定型プロモーター（例えば、組織特異的プロモーター、細胞型特異的プロモーターなど）でありうる。
本開示のゲノムターゲティング核酸および／または部位特異的ポリペプチドをコードする核酸は、細胞への送達のための送達媒体内またはその表面上にパッケージングすることができる。想定される送達媒体は、ナノスフェア、リポソーム、量子ドット、ナノ粒子、ポリエチレングリコール粒子、ハイドロゲル、およびミセルを含むがこれらに限定されない。様々なターゲティング部分を使用して、このような媒体の、所望される細胞型または場所との優先的な相互作用を増強することができる。
本開示の複合体、ポリペプチド、および核酸の、細胞への導入は、ウイルスまたはバクテリオファージ感染、トランスフェクション、コンジュゲーション、プロトプラスト融合、リポフェクション、電気穿孔、ヌクレオフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）媒介型トランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介型トランスフェクション、リポソーム媒介型トランスフェクション、遺伝子銃技術、リン酸カルシウム沈殿、直接的マイクロインジェクション、ナノ粒子媒介型核酸送達などにより行うことができる。
送達
ガイドＲＮＡポリヌクレオチド（ＲＮＡまたはＤＮＡ）および／またはエンドヌクレアーゼポリヌクレオチド（ＲＮＡまたはＤＮＡ）は、ウイルスにより送達することもでき、当技術分野で公知の非ウイルス性送達媒体により送達することもできる。代替的に、エンドヌクレアーゼポリペプチドを、電気穿孔または脂質ナノ粒子など、当技術分野で公知の非ウイルス性送達媒体により送達することができる。さらに代替的な態様では、ＤＮＡエンドヌクレアーゼを、１または複数のポリペプチド単独として送達することもでき、１もしくは複数のガイドＲＮＡ、またはｔｒａｃｒＲＮＡと併せた、１もしくは複数のｃｒＲＮＡとあらかじめ複合体化させた、１または複数のポリペプチドとして送達することもできる。
ポリヌクレオチドは、ナノ粒子、リポソーム、リボヌクレオタンパク質、正に帯電させたペプチド、低分子ＲＮＡコンジュゲート、アプタマー−ＲＮＡキメラ、およびＲＮＡ−融合タンパク質複合体を含むがこれらに限定されない、非ウイルス性送達媒体により送達することができる。一部の例示的な非ウイルス性送達媒体については、PeerおよびLieberman、Gene Therapy、１８巻：１１２７〜１１３３頁（２０１１年）（これは、他のポリヌクレオチドの送達にもまた有用な、ｓｉＲＮＡのための非ウイルス性送達媒体に焦点を当てている）において記載されている。
ガイドＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ、およびエンドヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡなどのポリヌクレオチドは、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）により、細胞または患者へと送達することができる。
ＬＮＰは、１０００ｎｍ、５００ｎｍ、２５０ｎｍ、２００ｎｍ、１５０ｎｍ、１００ｎｍ、７５ｎｍ、５０ｎｍ、または２５ｎｍ未満の直径を有する任意の粒子を指す。代替的に、ナノ粒子は、１〜１０００ｎｍ、１〜５００ｎｍ、１〜２５０ｎｍ、２５〜２００ｎｍ、２５〜１００ｎｍ、３５〜７５ｎｍ、または２５〜６０ｎｍのサイズの範囲でありうる。
ＬＮＰは、カチオン性脂質から作製することもでき、アニオン性脂質から作製することもでき、中性脂質から作製することもできる。融合性リン脂質であるＤＯＰＥまたは膜成分であるコレステロールなどの中性脂質を、トランスフェクション活性およびナノ粒子安定性を増強する「ヘルパー脂質」として、ＬＮＰ中に組み入れることができる。カチオン性脂質の限界は、低い安定性および急速なクリアランスに起因する低い効能ならびに炎症性または抗炎症性応答の発生を含む。
ＬＮＰはまた、疎水性脂質から構成される場合もあり、親水性脂質から構成される場合もあり、疎水性脂質および親水性脂質の両方から構成される場合もある。
当技術分野で公知の、任意の脂質または脂質の組合せを使用して、ＬＮＰを作製することができる。ＬＮＰを作製するのに使用される脂質の例は、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＳＰＡ、ＤＯＴＡＰ、ＤＭＲＩＥ、ＤＣ−コレステロール、ＤＯＴＡＰ−コレステロール、ＧＡＰ−ＤＭＯＲＩＥ−ＤＰｙＰＥ、およびＧＬ６７Ａ−ＤＯＰＥ−ＤＭＰＥ−ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。カチオン性脂質の例は、９８Ｎ１２−５、Ｃ１２−２００、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ（ＫＣ２）、ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ（ＭＣ３）、ＸＴＣ、ＭＤ１、および７Ｃ１である。中性脂質の例は、ＤＰＳＣ、ＤＰＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＯＰＥ、およびＳＭである。ＰＥＧで修飾された脂質の例は、ＰＥＧ−ＤＭＧ、ＰＥＧ−ＣｅｒＣ１４、およびＰＥＧ−ＣｅｒＣ２０である。
脂質を、任意の数のモル比で組み合わせて、ＬＮＰを作製することができる。加えて、ポリヌクレオチドを、脂質と、広範にわたるモル比で組み合わせて、ＬＮＰを作製することができる。
既に言明した通り、部位特異的ポリペプチドおよびゲノムターゲティング核酸の各々を、細胞または患者へと、個別に投与することができる。他方、部位特異的ポリペプチドは、１もしくは複数のガイドＲＮＡ、またはｔｒａｃｒＲＮＡと併せた１もしくは複数のｃｒＲＮＡと、あらかじめ複合体化させることができる。次いで、あらかじめ複合体化させた材料を、細胞または患者へと投与することができる。このようなあらかじめ複合体化させた材料は、リボヌクレオタンパク質粒子（ＲＮＰ）として公知である。
ＲＮＡは、ＲＮＡまたはＤＮＡとの特異的相互作用を形成することが可能である。この特性は、多くの生物学的工程で利用されているが、核酸に富む細胞内環境における、無差別的な相互作用の危険性とも隣り合わせである。この問題に対する１つの解決法は、ＲＮＡを、エンドヌクレアーゼと、あらかじめ複合体化させる、リボヌクレオタンパク質粒子（ＲＮＰ）の形成である。ＲＮＰの別の利益は、ＲＮＡの、分解からの保護である。
ＲＮＰ内のエンドヌクレアーゼは、修飾することもでき、非修飾とすることもできる。同様に、ｇＲＮＡ、ｃｒＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡ、またはｓｇＲＮＡは、修飾することもでき、非修飾とすることもできる。当技術分野では、多数の修飾が公知であり、使用することができる。
エンドヌクレアーゼと、ｓｇＲＮＡとは、１：１のモル比で組み合わせることができる。代替的に、エンドヌクレアーゼと、ｃｒＲＮＡと、ｔｒａｃｒＲＮＡとは一般に、１：１：１のモル比で組み合わせることができる。しかし、広範にわたるモル比を使用して、ＲＮＰを作製することができる。
組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを、送達のために使用することができる。当技術分野では、パッケージングされるＡＡＶゲノムであって、送達されるポリヌクレオチド、ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子、ならびにヘルパーウイルス機能を含むＡＡＶゲノムを、細胞へともたらすｒＡＡＶ粒子を作製する技法が標準的である。ｒＡＡＶの作製は典型的に、以下の構成要素：ｒＡＡＶゲノム、ｒＡＡＶゲノムとは別個の（すなわち、ｒＡＡＶゲノム内には存在しない）ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子、ならびにヘルパーウイルス機能が、単一の細胞（本明細書では、パッケージング細胞と描示する）内に存在することを要求する。ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子は、組換えウイルスを導出することができる、任意のＡＡＶ血清型に由来することが可能であり、ｒＡＡＶゲノムＩＴＲとは異なるＡＡＶ血清型であって、ＡＡＶ血清型である、ＡＡＶ−１、ＡＡＶ−２、ＡＡＶ−３、ＡＡＶ−４、ＡＡＶ−５、ＡＡＶ−６、ＡＡＶ−７、ＡＡＶ−８、ＡＡＶ−９、ＡＡＶ−１０、ＡＡＶ−１１、ＡＡＶ−１２、ＡＡＶ−１３、およびＡＡＶ ｒｈ．７４を含むがこれらに限定されないＡＡＶ血清型に由来しうる。偽型ｒＡＡＶの作製については、例えば、国際特許出願公開第ＷＯ０１／８３６９２号に開示されている。表３を参照されたい。
Figure 2019507579
パッケージング細胞を作出する方法は、ＡＡＶ粒子を作製するために必要な構成要素の全てを安定的に発現する細胞株を創出するステップを伴う。例えば、ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を欠くｒＡＡＶゲノム、ｒＡＡＶゲノムとは別個のＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子、ならびにネオマイシン耐性遺伝子などの選択可能マーカーを含むプラスミド（または複数のプラスミド）を、細胞のゲノムへと組み込む。ＡＡＶゲノムは、ＧＣテーリング（Samulskiら、１９８２年、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、７９巻：２０７７〜２０８１頁）、制限エンドヌクレアーゼ切断部位を含有する合成リンカーの付加（Laughlinら、１９８３年、Gene、２３巻：６５〜７３頁）などの手順により、または直接的平滑末端ライゲーション（SenapathyおよびCarter、１９８４年、J. Biol. Chem.、２５９巻：４６６１〜４６６６頁）により、細菌プラスミドへと導入されている。次いで、パッケージング細胞株に、アデノウイルスなどのヘルパーウイルスを感染させることができる。この方法の利点は、細胞が選択可能であり、ｒＡＡＶの大スケールの作製に適することである。適切な方法の他の例は、プラスミドではなく、アデノウイルスまたはバキュロウイルスを利用して、ｒＡＡＶゲノムならびに／またはｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を、パッケージング細胞へと導入する。
ｒＡＡＶ作製の一般原理については、例えば、Carter、１９９２年、Current Opinions in Biotechnology、１５３３〜５３９頁；およびMuzyczka、１９９２年、Curr. Topics in Microbial. and Immunol.、１５８巻：９７〜１２９頁において総説されている。多様な手法については、Ratschinら、Mol. Cell. Biol.、４巻：２０７２頁（１９８４年）；Hermonatら、Proc. Natl. Acad.、Sci. USA、８１巻：６４６６頁（１９８４年）；Tratschinら、Mol. Cell. Biol.、５巻：３２５１頁（１９８５年）；McLaughlinら、J. Virol.、６２巻：１９６３頁（１９８８年）；およびLebkowskiら、１９８８年、Mol. Cell. Biol.、７巻：３４９頁（１９８８年）において記載されている。Samulskiら（１９８９年、J. Virol.、６３巻：３８２２〜３８２８頁）；米国特許第５，１７３，４１４号；ＷＯ９５／１３３６５および対応する米国特許第５，６５８，７７６号；ＷＯ９５／１３３９２；ＷＯ９６／１７９４７；ＰＣＴ／ＵＳ９８／１８６００；ＷＯ９７／０９４４１（ＰＣＴ／ＵＳ９６／１４４２３）；ＷＯ９７／０８２９８（ＰＣＴ／ＵＳ９６／１３８７２）；ＷＯ９７／２１８２５（ＰＣＴ／ＵＳ９６／２０７７７）；ＷＯ９７／０６２４３（ＰＣＴ／ＦＲ９６／０１０６４）；ＷＯ９９／１１７６４；Perrinら（１９９５年）、Vaccine、１３巻：１２４４〜１２５０頁；Paulら（１９９３年）、Human Gene Therapy、４巻：６０９〜６１５頁；Clarkら（１９９６年）、Gene Therapy、３巻：１１２４〜１１３２頁；米国特許第５，７８６，２１１号；米国特許第５，８７１，９８２号；および米国特許第６，２５８，５９５号。
ＡＡＶベクターの血清型は、標的細胞型とマッチさせることができる。例えば、以下の例示的な細胞型にはとりわけ、表示のＡＡＶ血清型を形質導入することができる。表４を参照されたい。
Figure 2019507579
遺伝子改変細胞
「遺伝子改変細胞」という用語は、ゲノム編集（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用する）により導入される、少なくとも１つの遺伝子改変を含む細胞を指す。本明細書の、一部のｅｘ ｖｉｖｏ例では、遺伝子改変細胞は、遺伝子改変始原細胞でありうる。本明細書の、一部のｉｎ ｖｉｖｏ例では、遺伝子改変細胞は、遺伝子改変筋細胞または遺伝子改変筋前駆細胞でありうる。本明細書では、外因性ゲノムターゲティング核酸および／またはゲノムターゲティング核酸をコードする外因性核酸を含む遺伝子改変細胞が想定される。
「対照で処置された集団」という用語は、ゲノム編集の構成要素の付加を除き、同一な培地、ウイルスによる誘導、核酸配列、温度、コンフルエンシー、フラスコサイズ、ｐＨなどで処置された細胞の集団について記載する。当技術分野で公知の任意の方法、例えば、ジストロフィンタンパク質についてのウェスタンブロット解析、またはジストロフィンｍＲＮＡの定量化を使用して、ジストロフィンのリーディングフレームの修復を測定することができる。
「単離細胞」という用語は、それが元来見出される生物から取り出された細胞、またはこのような細胞の子孫を指す。任意選択で、細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、例えば、規定された条件下、または他の細胞の存在下で培養することができる。任意選択で、細胞は、後に、第２の生物へと導入することもでき、それが単離された生物（またはそれを子孫とする細胞）へと再導入することもできる。
細胞の単離集団に関する「単離集団」という用語は、混合細胞集団または異質細胞集団から、取り出され、分離された細胞集団を指す。場合によって、単離集団は、細胞がそこから単離されるかまたは濃縮された異質集団と比較して、実質的に純粋な細胞集団でありうる。場合によって、単離集団は、ヒト始原細胞の単離集団、例えば、ヒト始原細胞と、ヒト始原細胞がそこから導出された細胞とを含む異質細胞集団と比較して、実質的に純粋なヒト始原細胞の集団でありうる。
特定の細胞集団に関する、「実質的に増強された」という用語は、特定の種類の細胞の発生が、例えば、ＤＭＤを改善するための、このような細胞の所望のレベルに応じて、既存のまたは基準レベルと比べて、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも４００倍、少なくとも１０００倍、少なくとも５０００倍、少なくとも２００００倍、少なくとも１０００００倍、またはこれを超える倍数だけ増大する細胞集団を指す。
特定の細胞集団に関する「実質的に濃縮された」という用語は、全細胞集団を構成する細胞に照らして、少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、またはこれを超える細胞集団を指す。
特定の細胞集団に関する「実質的に純粋」という用語は、全細胞集団を構成する細胞に照らして、少なくとも約７５％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％純粋である細胞集団を指す。すなわち、始原細胞集団に関して、「実質的に純粋」または「本質的に精製された」という用語は、本明細書の用語により規定される始原細胞ではない細胞であって、約２０％、約１５％、約１０％、約９％、約８％、約７％、約６％、約５％、約４％、約３％、約２％、約１％、または１％未満より少数の細胞を含有する細胞集団を指す。
矯正ｉＰＳＣの、Ｐａｘ７＋筋始原細胞への分化
本開示のｅｘ ｖｉｖｏ方法の別のステップは、矯正ｉＰＳＣを、Ｐａｘ７＋筋始原細胞へと分化させることを伴う。分化させるステップは、当技術分野で公知の任意の方法に従い実施することができる。例えば、分化させるステップは、Chal、Oginumaら、２０１５年において示される通り、ゲノム編集されたｉＰＳＣを、低分子薬物を含む特異的培地処方物と接触させて、Ｐａｘ７＋筋始原細胞へと分化させることを含みうる。代替的に、ｉＰＳＣ、筋原性始原細胞、および他の系統の細胞は、Tapscott、Davisら、１９８８年；Langen、Scholsら、２００３年；Fujita、Endoら、２０１０年；Xu、Tabebordbarら、２０１３年；Shoji、Woltjenら、２０１５年の方法において示される通り、トランス遺伝子の過剰発現、血清枯渇、および／または低分子薬物を伴う、いくつかの確立された方法のうちの任意の１つを使用して、筋肉へと分化させることができる。
Ｐａｘ７＋筋始原細胞の、患者への植込み
本開示のｅｘ ｖｉｖｏ方法の別のステップは、Ｐａｘ７＋筋始原細胞を、患者へと植え込むことを伴う。この植え込むステップは、当技術分野で公知の任意の植込み法を使用して達することができる。例えば、遺伝子改変細胞を、患者の筋肉に直接注射することができる。
薬学的に許容される担体
本明細書で想定される、始原細胞を対象へと投与するｅｘ ｖｉｖｏ方法は、始原細胞を含む治療用組成物の使用を伴う。
治療用組成物は、細胞組成物と併せた、生理学的に忍容可能な担体と、任意選択で、本明細書で記載される、少なくとも１つのさらなる生体活性薬剤であって、その中に、有効成分として溶解または分散させた生体活性薬剤とを含有しうる。場合によって、治療用組成物は、治療目的で、哺乳動物またはヒト患者へと投与される場合、そうであることが所望されない限りにおいて、実質的に免疫原性ではない。
一般に、本明細書で記載される始原細胞は、薬学的に許容される担体を伴う懸濁液として投与することができる。当業者は、細胞組成物中で使用される、薬学的に許容される担体は、緩衝剤、化合物、低温保存剤、保存剤、または他の薬剤を、対象へと送達される細胞の生存率に実質的に干渉する量では含みえないことを認識しうる。細胞を含む製剤は、例えば、細胞膜の完全性の維持を可能とする浸透圧緩衝剤と、任意選択で、細胞生存率を維持するか、または投与時における生着を増強する栄養物質とを含みうる。このような処方物および懸濁液は、当業者に公知であり、かつ／または規定の実験を使用して、本明細書で記載される始原細胞を伴う使用に適合させることができる。
細胞組成物はまた、乳化手順が、細胞の生存率に有害な影響を及ぼさないことを条件として、乳化することもでき、リポソーム組成物として提示することもできる。細胞および任意の他の有効成分は、薬学的に許容され、有効成分に対して適合性であり、本明細書で記載される治療法における使用に適する量の賦形剤と混合することができる。
細胞組成物中に含まれるさらなる薬剤は、その中の成分の薬学的に許容される塩を含みうる。薬学的に許容される塩は、例えば、塩酸もしくはリン酸などの無機酸、または酢酸、酒石酸、マンデル酸などの有機酸により形成される酸付加塩（ポリペプチドの遊離アミノ基により形成される）を含む。遊離カルボキシル基により形成される塩はまた、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、または水酸化第二鉄などの無機塩基、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどの有機塩基に由来しうる。
当技術分野では、生理学的に忍容可能な担体が周知である。例示的な液体担体は、有効成分および水に加えて、材料を含有しないか、または、生理学的ｐＨ値のリン酸ナトリウム、生理学的生理食塩液、またはリン酸緩衝生理食塩液など、これらの両方などの緩衝剤を含有する滅菌水溶液である。なおさらに、水性担体は、１つを超える緩衝液塩のほか、塩化ナトリウムおよび塩化カリウムなどの塩、デキストロース、ポリエチレングリコール、および他の溶質を含有しうる。液体組成物はまた、水に加えた液相および水を除く液相も含有しうる。このようなさらなる液相の例は、グリセリン、綿実油などの植物油、および水−油エマルジョンである。特定の障害または状態の処置において有効な細胞組成物中で使用される活性化合物の量は、障害または状態の性格に依存する場合があり、標準的な臨床法により決定することができる。
投与および効能
所望の効果をもたらすような、損傷または修復部位など、所望の部位における、導入された細胞の、少なくとも部分的な局在化をもたらす方法または経路による、細胞、例えば、始原細胞の、対象への移入の文脈では、「〜を投与すること」、「〜を導入すること」、および「〜を植え込むこと」という用語は、互換的に使用される。細胞、例えば、始原細胞、またはそれらの分化した後代を、対象における所望の場所への送達をもたらす、任意の適切な経路により投与することができ、この場合、植え込まれた細胞または細胞の構成要素のうちの少なくとも一部は、依然として生存可能なままである。対象への投与後における細胞生存期間は、数時間、例えば、２４時間という短時間〜数日間〜数年間、またはさらに患者の生涯という長期間、すなわち、長期にわたる生着でありうる。例えば、本明細書で記載される一部の態様では、有効量の筋原性始原細胞を、腹腔内または静脈内経路などの全身投与経路を介して投与する。
本明細書では、「個体」、「対象」、「宿主」、および「患者」という用語が、互換的に使用され、診断、処置、または治療が所望される任意の対象を指す。一部の態様では、対象は、哺乳動物である。一部の態様では、対象は、ヒトである。
予防的に施される場合、本明細書で記載される始原細胞は、対象へと、ＤＭＤの任意の症状に先立ち、例えば、筋量減少の発生の前に投与することができる。したがって、筋始原細胞集団の予防的投与は、ＤＭＤを防止するように用いられうる。
治療的に施される場合、筋始原細胞は、ＤＭＤの症状または兆候の発症時（または発症後）に、例えば、筋量減少の発症時に施すことができる。
本明細書で記載される方法に従い投与される筋始原細胞集団は、１または複数のドナーから得られた、同種筋始原細胞を含みうる。「同種」とは、同じ種の１または複数の異なるドナーから得られた、筋始原細胞または筋始原細胞を含む生物学的試料であって、１または複数のローカスにおける遺伝子が同一ではない、筋始原細胞または筋始原細胞を含む生物学的試料を指す。例えば、対象へと投与される筋始原細胞集団は、１または複数の非類縁ドナー対象に由来する場合もあり、１または複数の同一でない同胞種に由来する場合もある。場合によって、遺伝子的に同一な動物、または一卵性双生児から得られた集団など、同系筋始原細胞集団も使用することができる。筋始原細胞は、自家細胞の場合もある、すなわち、筋始原細胞を、対象から得るか、または単離し、同じ対象へと投与する、すなわち、ドナーとレシピエントとは同じである。
「有効量」という用語は、ＤＭＤの、少なくとも１つまたは複数の徴候または症状を防止または緩和するのに必要とされる、始原細胞またはそれらの後代の集団の量を指し、所望の効果をもたらす、例えば、ＤＭＤを有する対象を処置するのに十分な、組成物の量に関する。したがって、「治療有効量」という用語は、ＤＭＤを有するか、またはその危険性がある対象など典型的な対象へと投与されると、特定の効果を促進するのに十分な、始原細胞または始原細胞を含む組成物の量を指す。有効量はまた、疾患の症状の発生を防止するかもしくは遅延させるか、疾患の症状の経過を変更する（例えば、疾患の症状の進行を緩徐化させることであるが、これに限定されない）か、または疾患の症状を逆行させるのに十分な量も含むであろう。任意の所与の場合について、適切な「有効量」とは、規定の実験を使用して、当業者により決定されうることが理解される。
本明細書で記載される多様な態様における使用のために、有効量の始原細胞は、始原細胞少なくとも１０２個、始原細胞少なくとも５×１０２個、始原細胞少なくとも１０３個、始原細胞少なくとも５×１０３個、始原細胞少なくとも１０４個、始原細胞少なくとも５×１０４個、始原細胞少なくとも１０５個、始原細胞少なくとも２×１０５個、始原細胞少なくとも３×１０５個、始原細胞少なくとも４×１０５個、始原細胞少なくとも５×１０５個、始原細胞少なくとも６×１０５個、始原細胞少なくとも７×１０５個、始原細胞少なくとも８×１０５個、始原細胞少なくとも９×１０５個、始原細胞少なくとも１×１０６個、始原細胞少なくとも２×１０６個、始原細胞少なくとも３×１０６個、始原細胞少なくとも４×１０６個、始原細胞少なくとも５×１０６個、始原細胞少なくとも６×１０６個、始原細胞少なくとも７×１０６個、始原細胞少なくとも８×１０６個、始原細胞少なくとも９×１０６個、またはこれらの倍数個を含む。始原細胞は、１または複数のドナーから導出することもでき、自家供給源から得ることもできる。本明細書で記載される一部の例では、始原細胞は、それを必要とする対象への投与の前に、培養物中で拡大することができる。
ＤＭＤを有する患者の細胞内で発現する機能的ジストロフィンのレベルを、わずかずつ、徐々に上昇させることは、疾患の１もしくは複数の症状を改善し、長期にわたる生存を増大させ、かつ／または他の処置と関連する副作用を低減するために有益でありうる。このような細胞の、ヒト患者への投与時には、機能的ジストロフィンレベルの上昇をもたらす、筋始原細胞の存在が有益である。場合によって、対象の有効な処置は、処置される対象における総ジストロフィンと比べて、少なくとも約３％、５％、または７％の機能的ジストロフィンをもたらす。一部の例では、機能的ジストロフィンは、総ジストロフィンのうちの、少なくとも約１０％であろう。一部の例では、機能的ジストロフィンは、総ジストロフィンのうちの、少なくとも約２０％〜３０％であろう。同様に、一部の状況では、正常化された細胞は、罹患細胞と比べて選択的利点を有するため、機能的ジストロフィンレベルを顕著に上昇させた細胞の、比較的限定的な亜集団の導入であってもなお、多様な患者において、有益でありうる。しかし、わずかなレベルの筋始原細胞であっても、機能的ジストロフィンレベルを上昇させた筋始原細胞は、患者におけるＤＭＤの１または複数の側面を改善するために有益でありうる。一部の例では、このような細胞を投与した患者における筋始原細胞のうちの約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、またはこれを超える筋始原細胞は、高レベルの機能的ジストロフィンを産生している。
「投与された」とは、所望の部位において、細胞組成物の少なくとも部分的な局在化をもたらす方法または経路による、始原細胞組成物の、対象への送達を指す。細胞組成物は、対象において有効な処置をもたらす、任意の適切な経路により、すなわち、対象における所望の位置への送達をもたらす投与であって、送達される組成物のうちの少なくとも一部、すなわち、細胞少なくとも１×１０４個を、所望の部位へと、ある期間にわたり送達する投与により投与することができる。投与方式は、注射、注入、点滴、または内服を含む。「注射」は、限定せずに述べると、静脈内、筋内、動脈内、髄腔内、心室内、関節包内、眼窩内、心内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内注、脳脊髄内、ならびに胸骨内（intrasternal）注射および注入を含む。一部の例では、経路は静脈内である。細胞を送達するためには、注射または注入による投与を行うことができる。
細胞は、全身投与される。「全身投与」、「全身投与された」、「末梢投与」、および「末梢投与された」という語句は、始原細胞の集団の、標的部位、組織、または臓器への直接投与以外の投与であって、代わりに、それが、対象の循環系に入り、したがって、代謝および他の同様の過程下に置かれるような投与を指す。
当業者は、ＤＭＤを処置するための組成物を含む処置の効能を決定しうる。しかし、ごく一例として述べると、機能的ジストロフィンのレベルの徴候または症状の任意の１つまたは全てが、有益な形で変更される（例えば、少なくとも１０％上昇する）か、または疾患の、他の臨床的に許容される症状もしくはマーカーが、改善されるかまたは軽快する場合に、処置は、「有効な処置」と考えられる。効能はまた、入院または医療的介入の必要により評価される、個体の非悪化（例えば、筋量の減少が軽減されるか、または疾患の進行が止まるか、もしくは少なくとも緩徐化する）により測定することもできる。これらの指標を測定する方法は、当業者に公知であり、かつ／または本明細書で記載されている。処置は、個体または動物（一部の非限定的な例は、ヒトまたは哺乳動物を含む）における、疾患の任意の処置を含み、（１）疾患の阻害、例えば、症状の進行を止めるか、もしくは緩徐化させること；または（２）疾患を和らげること、例えば、症状の減退を引き起こすこと；および（３）症状の発症の可能性を防止または低減することを含む。
本開示に従う処置は、個体における機能的ジストロフィンの量を増大させることにより、ＤＭＤと関連する１または複数の症状を軽快させうる。ＤＭＤと典型的に関連する初期の徴候は、例えば、歩行の遅延、腓筋の肥大（瘢痕組織に起因する）、および高頻度の転倒を含む。疾患が進行するにつれて、小児は、筋量の減少および疼痛に起因して、車椅子に束縛されるようになる。疾患は、心臓および／または呼吸器の合併症に起因して、致死性となる。
キット
本開示は、本明細書で記載される方法を実行するためのキットを提示する。キットは、ゲノムターゲティング核酸、ゲノムターゲティング核酸をコードするポリヌクレオチド、部位特異的ポリペプチド、部位特異的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および／または本明細書で記載される方法の態様を実行するのに必要な、任意の核酸もしくはタンパク質性分子のうちの１または複数、あるいはこれらの任意の組合せを含みうる。
キットは、（１）ゲノムターゲティング核酸をコードするヌクレオチド配列を含むベクターと、（２）部位特異的ポリペプチドまたは部位特異的ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むベクターと、（３）ベクターおよび／またはポリペプチドを修復および／または希釈するための試薬とを含みうる。
キットは、（１）（ｉ）ゲノムターゲティング核酸をコードするヌクレオチド配列、および（ｉｉ）部位特異的ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むベクターと、（２）ベクターを修復および／または希釈するための試薬とを含みうる。
キットのうちの一部では、キットは、単一分子ゲノムターゲティングガイド核酸を含みうる。上記のキットのうちのいずれかでは、キットは、二重分子ゲノムターゲティング核酸を含みうる。キットのうちのいずれかでは、キットは、２つまたはこれを超える、二重分子ガイドまたは単一分子ガイドを含みうる。キットは、核酸ターゲティング核酸をコードするベクターを含みうる。
キットのうちのいずれかでは、キットは、所望の遺伝子改変を生じさせるように挿入されるポリヌクレオチドをさらに含みうる。
キットの構成要素は、別個の容器内の場合もあり、単一の容器内で組み合わせる場合もある。
任意のキットは、１または複数のさらなる試薬をさらに含む場合があるが、この場合、このようなさらなる試薬は、緩衝液、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドを細胞へと導入するための緩衝液、洗浄緩衝液、対照試薬、対照ベクター、対照ＲＮＡポリヌクレオチド、ＤＮＡからのポリペプチドのｉｎ ｖｉｔｒｏにおける作製のための試薬、シークエンシングのためのアダプターなどから選択される。緩衝液は、安定化緩衝液、修復緩衝液、希釈緩衝液などでありうる。キットはまた、オン標的への結合もしくはエンドヌクレアーゼによるＤＮＡの切断を容易とするかもしくは増強するか、またはターゲティングの特異性を改善するのに使用しうる、１または複数の構成要素も含みうる。
上記で言及した構成要素に加えて、キットは、キットの構成要素を使用して、方法を実施するための指示書をさらに含みうる。方法を実施するための指示書は、適切な記録媒体上に記録することができる。例えば、指示書は、紙またはプラスチックなどの基板上に印刷することができる。指示書は、キット内に、パッケージ添付文書として存在する場合もあり、キットまたはその構成要素の容器（すなわち、パッケージングまたは部分パッケージングと関連する）の表示中に存在する場合などもある。指示書は、適切なコンピュータ読取り用保存媒体、例えば、ＣＤ−ＲＯＭ、ディスケット、フラッシュドライブなどに存在する電子保存データファイルとして存在しうる。一部の場合には、実際の指示書は、キット内に存在しないが、遠隔の供給源から、指示書を得る（例えば、インターネットを介して）ための手段を提供することができる。この場合の例は、指示書を閲覧することができ、かつ／または指示書をダウンロードしうるウェブアドレスを含むキットである。指示書と同様に、指示書を得るためのこの手段は、適切な基板上に記録することができる。
ガイドＲＮＡ製剤
本開示のガイドＲＮＡは、特定の投与方式および剤形に応じて、担体、溶媒、安定化剤、アジュバント、希釈剤など、薬学的に許容される賦形剤と共に製剤化することができる。ガイドＲＮＡ組成物は、製剤および投与経路に応じて、生理学的に適合性のｐＨを達成し、約３のｐＨ〜約１１のｐＨ、ｐＨ約３〜ｐＨ約７の範囲となるように製剤化することができる。場合によって、ｐＨは、ｐＨ約５．０〜ｐＨ約８の範囲に調整することができる。場合によって、組成物は、本明細書で記載される、治療有効量の少なくとも１つの化合物を、１または複数の薬学的に許容される賦形剤と併せて含みうる。任意選択で、組成物は、本明細書で記載される化合物の組合せを含む場合もあり、細菌の増殖の処理または防止において有用な、第２の有効成分（例えば、かつ、限定なしに述べると、抗菌剤または抗微生物剤）を含む場合もあり、本開示の試薬の組合せを含む場合もある。
適切な賦形剤は、例えば、タンパク質、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、重合アミノ酸、アミノ酸コポリマー、および不活性ウイルス粒子など、大型で、ゆっくりと代謝される高分子を含む担体分子を含む。他の例示的な賦形剤は、抗酸化剤（例えば、かつ、限定なしに述べると、アスコルビン酸）、キレート化剤（例えば、かつ、限定なしに述べると、ＥＤＴＡ）、炭水化物（例えば、かつ、限定なしに述べると、デキストリン、ヒドロキシアルキルセルロース、およびヒドロキシアルキルメチルセルロース）、ステアリン酸、液体（例えば、かつ、限定なしに述べると、油、水、生理食塩液、グリセロール、およびエタノール）、保湿剤または乳化剤、ｐＨ緩衝物質などを含みうる。
他の可能な治療法
遺伝子編集は、特異的配列をターゲティングするように操作されたヌクレアーゼを使用して行うことができる。現在のところ、ヌクレアーゼの４つ主要な種類：メガヌクレアーゼおよびそれらの誘導体、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ならびにＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ヌクレアーゼ系が存在する。特に、ＺＦＮおよびＴＡＬＥＮの特異性が、タンパク質−ＤＮＡ間相互作用を介するのに対し、ＲＮＡ−ＤＮＡ間相互作用は、主にＣａｓ９をガイドするので、ヌクレアーゼプラットフォームは、デザインの難易度、ターゲティングの密度、および作用方式にばらつきがある。Ｃａｓ９による切断はまた、異なるＣＲＩＳＰＲ系の間で異なる隣接モチーフである、ＰＡＭも要求する。Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓに由来するＣａｓ９は、ＮＧＧであるＰＡＭを使用して切断し、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓに由来するＣＲＩＳＰＲは、ＮＮＮＮＧＡＴＴ、ＮＮＮＮＮＧＴＴＴ、およびＮＮＮＮＧＣＴＴを含むＰＡＭを伴う部位において切断しうる。いくつかの他のＣａｓ９オーソログは、代替的なＰＡＭと隣接するプロトスペーサーをターゲティングする。
本開示の方法では、Ｃａｓ９などのＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼを使用することができる。しかし、治療のための標的部位など、本明細書で記載される教示は、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、ＨＥ、またはＭｅｇａＴＡＬなど、エンドヌクレアーゼの他の形態へと適用することもでき、ヌクレアーゼの組合せの使用へと適用することもできる。しかし、本開示の教示を、このようなエンドヌクレアーゼへと適用するためには、とりわけ、特異的標的部位へと導かれるタンパク質を操作することが必要となろう。
さらなる結合性ドメインをＣａｓ９タンパク質へと融合させて、特異性を増大させることができる。これらの構築物の標的部位は、同定されたｇＲＮＡ指定部位へとマップされるが、亜鉛フィンガードメインなどのための、さらなる結合モチーフを要求するであろう。Ｍｅｇａ−ＴＡＬの場合は、メガヌクレアーゼを、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合性ドメインへと融合させることができる。メガヌクレアーゼドメインは、特異性を増大させ、切断をもたらしうる。同様に、不活化Ｃａｓ９またはｄｅａｄ Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）は、切断ドメインへと融合させることができ、これは、ｓｇＲＮＡ／Ｃａｓ９標的部位と、融合させたＤＮＡ結合性ドメインのための隣接結合性部位とを要求する。これは、さらなる結合性部位がなければ、結合を減少させるように、触媒性の不活化に加えて、ｄＣａｓ９の何らかのタンパク質操作を要求する可能性が高い。
亜鉛フィンガーヌクレアーゼ
亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）とは、ＩＩ型エンドヌクレアーゼであるＦｏｋＩの触媒性ドメインへと連結された、操作亜鉛フィンガーＤＮＡ結合性ドメインから構成されるモジュラータンパク質である。ＦｏｋＩは、二量体としてだけ機能するため、１対のＺＦＮを、逆ＤＮＡ鎖上にあり、それらの間に正確な間隔を伴う、コグネイトの標的「半部位」配列に結合するように操作して、触媒的に活性のＦｏｋＩ二量体の形成を可能としなければならない。それ自体では配列特異性を有さないＦｏｋＩドメインが二量体化すると、ＺＦＮ半部位間で、ゲノム編集における開始ステップとして、ＤＮＡ二本鎖切断が作出される。
各ＺＦＮのＤＮＡ結合性ドメインは、夥多なＣｙｓ２−Ｈｉｓ２アーキテクチャーによる、３〜６つの亜鉛フィンガーであって、各フィンガーが、標的ＤＮＡ配列の１つの鎖のヌクレオチドのトリプレットを主に認識する亜鉛フィンガーから構成されることが典型的であるが、４番目のヌクレオチドとの交差相互作用もまた、重要でありうる。ＤＮＡとの鍵となる接触点を作る位置における、フィンガーのアミノ酸の変更は、所与のフィンガーの配列特異性を変更する。したがって、４フィンガーによる亜鉛フィンガータンパク質は、１２ｂｐの標的配列を選択的に認識するが、この場合、トリプレットの優先性は、可変的な程度で、隣接するフィンガーの影響を受けうるが、標的配列は、各フィンガーが寄与するトリプレット優先性の複合物である。ＺＦＮの重要な側面は、個々のフィンガーを修飾するだけで、ほぼ任意のゲノムアドレスへと、たやすく再ターゲティングしうるが、これを十分に行うには、かなりの熟練が要求されることである。ＺＦＮの大半の適用では、それぞれ、１２〜１８ｂｐずつを認識する、４〜６フィンガーのタンパク質が使用される。よって、１対のＺＦＮは、２４〜３６ｂｐの標的配列の組合せであって、半部位間の、典型的に５〜７ｂｐのスペーサーを含まない組合せを認識することが典型的であろう。結合性部位は、１５〜１７ｂｐを含む大型のスペーサーにより、さらに分離することができる。この長さの標的配列は、デザイン工程時に、リピートの配列または遺伝子の相同体を除外することを仮定すると、ヒトゲノム内で固有である可能性が高い。しかしながら、ＺＦＮタンパク質−ＤＮＡ間相互作用は、それらの特異性において絶対的ではないので、オフ標的結合および切断イベントが、２つのＺＦＮの間のヘテロ二量体、またはＺＦＮの一方もしくは他方によるホモ二量体として生じる。後者の可能性は、互いとだけ二量体化することが可能であり、それら自体では二量体化しえない、偏性ヘテロ二量体変異体としてもまた公知の、「プラス」および「マイナス」変異体を創出するように、ＦｏｋＩドメインの二量体化界面を操作することにより効果的に排されている。偏性ヘテロ二量体を強いることにより、ホモ二量体の形成が防止される。これは、ＺＦＮ、ならびにこれらのＦｏｋＩ変異体を採用する任意の他のヌクレアーゼの特異性を大いに増強している。
当技術分野では、様々なＺＦＮベースの系が記載されており、それらの改変は、定期的に報告され、多数の参考文献が、ＺＦＮのデザインを導くのに使用される規則およびパラメータについて記載している（例えば、Segalら、Proc Natl Acad Sci USA、９６巻（６号）：２７５８〜６３頁（１９９９年）；Dreier Bら、J Mol Biol.、３０３巻（４号）：４８９〜５０２頁（２０００年）；Liu Qら、J Biol Chem.、２７７巻（６号）：３８５０〜６頁（２００２年）；Dreierら、J Biol Chem、２８０巻（４２号）：３５５８８〜９７頁（２００５年）；およびDreierら、J Biol Chem.、２７６巻（３１号）：２９４６６〜７８頁（２００１年）を参照されたい）。
転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）
ＴＡＬＥＮとは、モジュラーヌクレアーゼの別のフォーマットであって、ＺＦＮと同様に、操作されたＤＮＡ結合性ドメインを、ＦｏｋＩヌクレアーゼドメインへと連結し、１対のＴＡＬＥＮが、タンデムに作動して、ターゲティングされたＤＮＡ切断を達成するフォーマットを表す。ＺＦＮとの主要な差違は、ＤＮＡ結合性ドメインおよび関連する標的ＤＮＡ配列認識特性の性格である。ＴＡＬＥＮのＤＮＡ結合性ドメインは、元来、植物の細菌性病原体であるＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｓｐ．において記載された、ＴＡＬＥタンパク質に由来する。ＴＡＬＥは、３３〜３５アミノ酸のリピートによるタンデムアレイであって、典型的には、最大で２０ｂｐの長さの標的ＤＮＡ配列であり、全標的配列の長さを最大で４０ｂｐとする、標的ＤＮＡ配列内の単一の塩基対を、各リピートが認識するタンデムアレイから構成される。各リピートのヌクレオチド特異性は、１２および１３位における、２つのアミノ酸だけを含む、ＲＶＤ（ｒｅｐｅａｔ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｉｒｅｓｉｄｕｅ）により決定される。塩基である、グアニン、アデニン、シトシン、およびチミンは主に、４つのＲＶＤ：それぞれ、Ａｓｎ−Ａｓｎ、Ａｓｎ−Ｉｌｅ、Ｈｉｓ−Ａｓｐ、およびＡｓｎ−Ｇｌｙにより認識される。これは、亜鉛フィンガーの場合より、はるかに単純な認識コードを構成し、したがって、ヌクレアーゼデザインのために、後者を上回る利点を表す。しかしながら、ＺＦＮと同様に、ＴＡＬＥＮのタンパク質−ＤＮＡ間相互作用は、それらの特異性において絶対的ではなく、ＴＡＬＥＮもまた、オフ標的活性を低減するように、ＦｏｋＩドメインの偏性ヘテロ二量体変異体の使用から利益を得ている。
それらの触媒機能を失活させた、ＦｏｋＩドメインのさらなる変異体も創出されている。ＴＡＬＥＮまたはＺＦＮ対の片方が、不活性のＦｏｋＩドメインを含有する場合は、標的部位において、ＤＳＢではなく、一本鎖ＤＮＡ切断（ニッキング）だけが生じるであろう。結果は、Ｃａｓ９切断ドメインのうちの一方を失活させた、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９／Ｃｐｆ１の「ニッカーゼ」突然変異体の使用と同等である。ＤＮＡニックを使用して、ＨＤＲによるゲノム編集を駆動しうるが、効率は、ＤＳＢによる場合より低下する。主要な利益は、オフ標的のニックは、ＮＨＥＪにより媒介される誤修復を受けやすいＤＳＢと異なり、迅速かつ正確に修復されることである。
当技術分野では、様々なＴＡＬＥＮベースの系が記載されており、それらの改変も、定期的に報告されている（例えば、Boch、Science、３２６巻（５９５９号）：１５０９〜１２頁（２００９年）；Makら、Science、３３５巻（６０６９号）：７１６〜９頁（２０１２年）；およびMoscouら、Science、３２６巻（５９５９号）：１５０１頁（２００９年）を参照されたい）。「ＧｏｌｄｅｎＧａｔｅ」プラットフォームまたはクローニングスキームに基づくＴＡＬＥＮの使用については、複数のグループにより記載されている（例えば、Cermakら、Nucleic Acids Res.、３９巻（１２号）：ｅ８２頁（２０１１年）；Liら、Nucleic Acids Res.、３９巻（１４号）：６３１５〜２５頁（２０１１年）；Weberら、PLoS One.、６巻（２号）：ｅ１６７６５頁（２０１１年）；Wangら、J Genet Genomics、４１巻（６号）：３３９〜４７頁、Epub、２０１４年５月１７日（２０１４年）；およびCermak Tら、Methods Mol Biol.、１２３９巻：１３３〜５９頁（２０１５年）を参照されたい）。
ホーミングエンドヌクレアーゼ
ホーミングエンドヌクレアーゼ（ＨＥ）とは、長い認識配列（１４〜４４塩基対）を有し、ＤＮＡを、高特異性で切断する（ゲノム内の固有の部位であることが多い）、配列特異的エンドヌクレアーゼである。ＨＥの、少なくとも６つの公知のファミリーであって、真核生物、原生生物、細菌、古細菌、シアノバクテリア、およびファージを含む、広範囲にわたる宿主に由来するＬＡＧＬＩＤＡＤＧ（配列番号１，４１０，４７４）、ＧＩＹ−ＹＩＧ、Ｈｉｓ−Ｃｉｓボックス、Ｈ−Ｎ−Ｈ、ＰＤ−（Ｄ／Ｅ）ｘＫ、およびＶｓｒ様を含む、それらの構造により分類されるファミリーが存在する。ＺＦＮおよびＴＡＬＥＮと同様に、ＨＥを使用して、ゲノム編集における最初のステップとして、標的ローカスにおけるＤＳＢを創出することができる。加えて、一部の天然および操作ＨＥは、ＤＮＡの単一の鎖だけを切断し、これにより、部位特異的ニッカーゼとして機能する。ＨＥの大型の標的配列およびそれらがもたらす特異性のために、ＨＥは、部位特異的ＤＳＢを創出するのに魅力的な候補物質となっている。
当技術分野では、様々なＨＥベースの系が記載されており、それらの改変は、定期的に報告されている（例えば、Steentoftら、Glycobiology、２４巻（８号）：６６３〜８０頁（２０１４年）；BelfortおよびBonocora、Methods Mol Biol.、１１２３巻：１〜２６頁（２０１４年）；HafezおよびHausner、Genome、５５巻（８号）：５５３〜６９頁（２０１２年）による総説；ならびにこれらにおいて引用されている参考文献を参照されたい）。
ＭｅｇａＴＡＬ／Ｔｅｖ−ｍＴＡＬＥＮ／ＭｅｇａＴｅｖ
ハイブリッド体のヌクレアーゼのさらなる例として、ＭｅｇａＴＡＬプラットフォームおよびＴｅｖ−ｍＴＡＬＥＮプラットフォームは、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合性ドメインと、触媒的に活性のＨＥとの融合体を使用し、微調整可能なＤＮＡ結合およびＴＡＬＥの特異性の両方、ならびにＨＥの切断配列特異性を利用する（例えば、Boisselら、NAR、４２巻：２５９１〜２６０１頁（２０１４年）；Kleinstiverら、G3、４巻：１１５５〜６５頁（２０１４年）；ならびにBoisselおよびScharenberg、Methods Mol. Biol.、１２３９巻：１７１〜９６頁（２０１５年）を参照されたい）。
さらなる変化形では、ＭｅｇａＴｅｖアーキテクチャーは、メガヌクレアーゼ（Ｍｅｇａ）の、ＧＩＹ−ＹＩＧホーミングエンドヌクレアーゼに由来するヌクレアーゼドメインである、Ｉ−ＴｅｖＩ（Ｔｅｖ）との融合体である。２つの活性部位は、ＤＮＡ基質で、約３０ｂｐ離れて位置し、非適合性の粘着末端を伴う２つのＤＳＢを発生させる（例えば、Wolfsら、NAR、４２巻、８８１６〜２９頁（２０１４年）を参照されたい）。既存のヌクレアーゼベースの手法の他の組合せが進化し、本明細書で記載される、ターゲティングされたゲノム修飾の達成において有用となることが予期される。
ｄＣａｓ９−ＦｏｋＩまたはｄＣｐｆ１−Ｆｏｋ１および他のヌクレアーゼ
上記で記載したヌクレアーゼプラットフォームの構造的特性と機能的特性とを組み合わせることにより、ゲノム編集のためのさらなる手法であって、固有の欠点のうちの一部を潜在的に克服しうる手法を提供する。例として述べると、ＣＲＩＳＰＲによるゲノム編集系は、単一のＣａｓ９エンドヌクレアーゼを使用して、ＤＳＢを創出することが典型的である。ターゲティングの特異性は、標的ＤＮＡ（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓに由来するＣａｓ９の場合、隣接するＮＡＧまたはＮＧＧであるＰＡＭ配列内のさらなる２塩基を加えた）とのワトソン−クリック型塩基対合を経るガイドＲＮＡ内の、２０または２４ヌクレオチドの配列により駆動される。このような配列は、ヒトゲノム内では、固有となるのに十分に長いが、ＲＮＡ／ＤＮＡ間相互作用の特異性は絶対的ではなく、場合によって、顕著な無差別性が、特に、標的配列の５’側において許容され、特異性を駆動する塩基の数を有効に低減する。これに対する１つの解決法は、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１の触媒性機能を完全に失活させる（ＲＮＡにガイドされるＤＮＡ結合機能だけを保持しながら）代わりに、ＦｏｋＩドメインを、失活させたＣａｓ９へと融合させることであった（例えば、Tsaiら、Nature Biotech、３２巻：５６９〜７６頁（２０１４年）；およびGuilingerら、Nature Biotech.、３２巻：５７７〜８２頁（２０１４年）を参照されたい）。ＦｏｋＩは、触媒的に活性となるには、二量体化しなければならないため、２つのガイドＲＮＡは、２つのＦｏｋＩ融合体を、近接してテザリングして、二量体を形成し、ＤＮＡを切断することが要求される。これは本質的に、標的部位の組合せにおける塩基の数を二倍化し、これにより、ＣＲＩＳＰＲベースの系によるターゲティングの厳密性を増大させる。
さらなる例として述べると、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合性ドメインの、Ｉ−ＴｅｖＩなど、触媒的に活性なＨＥへの融合は、オフ標的切断をさらに低減しうることを期待して、微調整可能なＤＮＡ結合およびＴＡＬＥの特異性の両方のほか、Ｉ−ＴｅｖＩの切断配列特異性も利用する。
本発明の方法および組成物
したがって、本開示は、特に、以下の非限定的な発明に関する。第１の方法である、方法１では、本開示は、ヒト細胞内のジストロフィン遺伝子を、ゲノム編集により編集するための方法であって、ヒト細胞へと、１または複数のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼを導入して、ジストロフィン遺伝子内またはその近傍に、１または複数の一本鎖切断（ＳＳＢ）または二本鎖切断（ＤＳＢ）であって、ジストロフィン遺伝子内またはその近傍に、１もしくは複数のエクソン、または異常なイントロンのスプライスアクセプターもしくはドナー部位の恒久的な欠失、挿入、または置きかえをもたらし、ジストロフィンのリーディングフレームの修復、およびジストロフィンタンパク質の活性の修復をもたらすＳＳＢまたはＤＳＢを生じさせるステップを含む方法を提示する。
別の方法である、方法２では、本開示は、方法１において提示される、ヒト細胞内のジストロフィン遺伝子を、ゲノム編集により編集するための方法であって、ヒト細胞が、筋細胞または筋前駆細胞である方法を提示する。
別の方法である、方法３では、本開示は、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）を伴う患者を処置するためのｅｘ ｖｉｖｏ方法であって、ｉ）ＤＭＤ患者特異的な誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を創出するステップと；ｉｉ）ｉＰＳＣのジストロフィン遺伝子内またはその近傍で編集するステップと；ｉｉｉ）ゲノム編集されたｉＰＳＣを、Ｐａｘ７＋筋始原細胞へと分化させるステップと；ｉｖ）Ｐａｘ７＋筋始原細胞を、患者へと植え込むステップとを含むｅｘ ｖｉｖｏ方法を提示する。
別の方法である、方法４では、本開示は、方法３において提示される、ＤＭＤを伴う患者を処置するためのｅｘ ｖｉｖｏ方法であって、創出するステップが、ａ）体細胞を、患者から単離することと；ｂ）多能性関連遺伝子のセットを、体細胞へと導入して、体細胞が多能性幹細胞となるように誘導することを含むｅｘ ｖｉｖｏ方法を提示する。
別の方法である、方法５では、本開示は、方法４において提示される、ＤＭＤを伴う患者を処置するためのｅｘ ｖｉｖｏ方法であって、体細胞が、線維芽細胞であるｅｘ ｖｉｖｏ方法を提示する。
別の方法である、方法６では、本開示は、方法４および５において提示される、ＤＭＤを伴う患者を処置するためのｅｘ ｖｉｖｏ方法であって、多能性関連遺伝子のセットが、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、Ｌｉｎ２８、ＮＡＮＯＧ、およびｃＭＹＣからなる群から選択される遺伝子のうちの１または複数である、ｅｘ ｖｉｖｏ方法を提示する。
別の方法である、方法７では、本開示は、方法３〜６のうちのいずれか１つにおいて提示される、ＤＭＤを伴う患者を処置するためのｅｘ ｖｉｖｏ方法であって、編集するステップが、ｉＰＳＣへと、１または複数のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼを導入して、ジストロフィン遺伝子内またはその近傍に、１または複数の一本鎖切断（ＳＳＢ）または二本鎖切断（ＤＳＢ）であって、ジストロフィン遺伝子内またはその近傍に、１もしくは複数のエクソン、または異常なイントロンのスプライスアクセプターもしくはドナー部位の恒久的な欠失、挿入、または置きかえをもたらし、ジストロフィンのリーディングフレームの修復、およびジストロフィンタンパク質の活性の修復をもたらすＳＳＢまたはＤＳＢを生じさせることを含む、ｅｘ ｖｉｖｏ方法を提示する。
別の方法である、方法８では、本開示は、方法３〜７のうちのいずれか１つにおいて提示される、ＤＭＤを伴う患者を処置するためのｅｘ ｖｉｖｏ方法であって、分化させるステップが、ゲノム編集されたｉＰＳＣを、Ｐａｘ７＋筋始原細胞へと分化させるように、以下：ゲノム編集されたｉＰＳＣを、低分子薬物を含む特異的培地処方物と接触させること；トランス遺伝子の過剰発現；または血清枯渇のうちの１または複数を含む、ｅｘ ｖｉｖｏ方法を提示する。
別の方法である、方法９では、本開示は、方法３〜８のうちのいずれか１つにおいて提示される、ＤＭＤを伴う患者を処置するためのｅｘ ｖｉｖｏ方法であって、植え込むステップが、所望の筋肉への局所注射により、Ｐａｘ７＋筋始原細胞を、患者へと植え込むことを含む、ｅｘ ｖｉｖｏ方法を提示する。
別の方法である、方法１０では、本開示は、ＤＭＤを伴う患者を処置するためのｉｎ ｖｉｖｏ方法であって、患者の細胞内のジストロフィン遺伝子を編集するステップを含むｉｎ ｖｉｖｏ方法を提示する。
別の方法である、方法１１では、本開示は、方法１０において提示される、ＤＭＤを伴う患者を処置するためのｉｎ ｖｉｖｏ方法であって、編集するステップが、患者の細胞へと、１または複数のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼを導入して、ジストロフィン遺伝子内またはその近傍に、１または複数の一本鎖切断（ＳＳＢ）または二本鎖切断（ＤＳＢ）であって、ジストロフィン遺伝子内またはその近傍に、１もしくは複数のエクソン、または異常なイントロンのスプライスアクセプター部位もしくはドナー部位の恒久的な欠失、挿入、または置きかえをもたらし、ジストロフィンのリーディングフレームの修復、およびジストロフィンタンパク質の活性の修復をもたらすＳＳＢまたはＤＳＢを生じさせることを含むｉｎ ｖｉｖｏ方法を提示する。
別の方法である、方法１２では、本開示は、方法１１において提示される、ＤＭＤを伴う患者を処置するためのｉｎ ｖｉｖｏ方法であって、細胞が、筋細胞または筋前駆細胞であるｉｎ ｖｉｖｏ方法を提示する。
別の方法である、方法１３では、本開示は、方法１、７、および１１のうちのいずれか１つにおいて提示される、ＤＭＤを伴う患者を処置するためのｉｎ ｖｉｖｏ方法であって、１または複数のＤＮＡエンドヌクレアーゼが、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（また、Ｃｓｎ１およびＣｓｘ１２としても公知である）、Ｃａｓ１００、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、またはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼ；これらの相同体、これらの天然に存在する分子の組換え体、これらのコドン最適化体、これらの修飾形、およびこれらの組合せであるｉｎ ｖｉｖｏ方法を提示する。
別の方法である、方法１４では、本開示は、細胞へと、１または複数のＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする、１または複数のポリヌクレオチドを導入するステップを含む、方法１３において提示される方法を提示する。
別の方法である、方法１５では、本開示は、細胞へと、１または複数のＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする、１または複数のリボ核酸（ＲＮＡ）を導入するステップを含む、方法１３において提示される方法を提示する。
別の方法である、方法１６では、本開示は、１もしくは複数のポリヌクレオチド、または１もしくは複数のＲＮＡが、１もしくは複数の修飾ポリヌクレオチド、または１もしくは複数の修飾ＲＮＡである、方法１４および１５において提示される方法を提示する。
別の方法である、方法１７では、本開示は、１または複数のＤＮＡエンドヌクレアーゼが、１または複数のタンパク質またはポリペプチドである、方法１３において提示される方法を提示する。
別の方法である、方法１８では、本開示は、細胞へと、１または複数のガイドリボ核酸（ｇＲＮＡ）を導入するステップをさらに含む、方法１〜１７のうちのいずれか１つにおいて提示される方法を提示する。
別の方法である、方法１９では、本開示は、１または複数のｇＲＮＡが、単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である、方法１８において提示される方法を提示する。
別の方法である、方法２０では、本開示は、１もしくは複数のｇＲＮＡ、または１もしくは複数のｓｇＲＮＡが、１もしくは複数の修飾ｇＲＮＡ、または１もしくは複数の修飾ｓｇＲＮＡである、方法１８および１９において提示される方法を提示する。
別の方法である、方法２１では、本開示は、１または複数のＤＮＡエンドヌクレアーゼを、１もしくは複数のｇＲＮＡ、または１もしくは複数のｓｇＲＮＡとあらかじめ複合体化させる、方法１８〜２０のうちのいずれか１つにおいて提示される方法を提示する。
別の方法である、方法２２では、本開示は、細胞へと、野生型ジストロフィンの遺伝子またはｃＤＮＡの少なくとも一部分を含む、ポリヌクレオチドドナー鋳型を導入するステップをさらに含む、方法１〜２１のうちのいずれか１つにおいて提示される方法を提示する。
別の方法である、方法２３では、本開示は、野生型ジストロフィンの遺伝子またはｃＤＮＡの少なくとも一部分が、エクソン１、エクソン２、エクソン３、エクソン４、エクソン５、エクソン６、エクソン７、エクソン８、エクソン９、エクソン１０、エクソン１１、エクソン１２、エクソン１３、エクソン１４、エクソン１５、エクソン１６、エクソン１７、エクソン１８、エクソン１９、エクソン２０、エクソン２１、エクソン２２、エクソン２３、エクソン２４、エクソン２５、エクソン２６、エクソン２７、エクソン２８、エクソン２９、エクソン３０、エクソン３１、エクソン３２、エクソン３３、エクソン３４、エクソン３５、エクソン３６、エクソン３７、エクソン３８、エクソン３９、エクソン４０、エクソン４１、エクソン４２、エクソン４３、エクソン４４、エクソン４５、エクソン４６、エクソン４７、エクソン４８、エクソン４９、エクソン５０、エクソン５１、エクソン５２、エクソン５３、エクソン５４、エクソン５５、エクソン５６、エクソン５７、エクソン５８、エクソン５９、エクソン６０、エクソン６１、エクソン６２、エクソン６３、エクソン６４、エクソン６５、エクソン６６、エクソン６７、エクソン６８、エクソン６９、エクソン７０、エクソン７１、エクソン７２、エクソン７３、エクソン７４、エクソン７５、エクソン７６、エクソン７７、エクソン７８、エクソン７９、イントロン領域、合成イントロン領域、断片、これらの組合せ、またはジストロフィン遺伝子もしくはｃＤＮＡ全体の少なくとも一部を含む、方法２２において提示される方法を提示する。
別の方法である、方法２４では、本開示は、野生型ジストロフィンの遺伝子またはｃＤＮＡの少なくとも一部分が、エクソン１、エクソン２、エクソン３、エクソン４、エクソン５、エクソン６、エクソン７、エクソン８、エクソン９、エクソン１０、エクソン１１、エクソン１２、エクソン１３、エクソン１４、エクソン１５、エクソン１６、エクソン１７、エクソン１８、エクソン１９、エクソン２０、エクソン２１、エクソン２２、エクソン２３、エクソン２４、エクソン２５、エクソン２６、エクソン２７、エクソン２８、エクソン２９、エクソン３０、エクソン３１、エクソン３２、エクソン３３、エクソン３４、エクソン３５、エクソン３６、エクソン３７、エクソン３８、エクソン３９、エクソン４０、エクソン４１、エクソン４２、エクソン４３、エクソン４４、エクソン４５、エクソン４６、エクソン４７、エクソン４８、エクソン４９、エクソン５０、エクソン５１、エクソン５２、エクソン５３、エクソン５４、エクソン５５、エクソン５６、エクソン５７、エクソン５８、エクソン５９、エクソン６０、エクソン６１、エクソン６２、エクソン６３、エクソン６４、エクソン６５、エクソン６６、エクソン６７、エクソン６８、エクソン６９、エクソン７０、エクソン７１、エクソン７２、エクソン７３、エクソン７４、エクソン７５、エクソン７６、エクソン７７、エクソン７８、エクソン７９、イントロン領域、合成イントロン領域、断片、これらの組合せ、またはジストロフィン遺伝子もしくはｃＤＮＡ全体を含む、方法２２において提示される方法を提示する。
別の方法である、方法２５では、本開示は、ドナー鋳型が、一本鎖または二本鎖ポリヌクレオチドである、方法２２〜２４のうちのいずれか１つにおいて提示される方法を提示する。
別の方法である、方法２６では、本開示は、細胞へと、１または複数のガイドリボ核酸（ｇＲＮＡ）を導入するステップをさらに含み、１または複数のＤＮＡエンドヌクレアーゼが、５’ローカスにおける第１のＳＳＢまたはＤＳＢによる切断、および３’ローカスにおける第２のＳＳＢまたはＤＳＢによる切断である１対の一本鎖切断（ＳＳＢ）または二本鎖切断（ＤＳＢ）であって、ジストロフィン遺伝子内またはその近傍の５’ローカスと３’ローカスとの間に、１もしくは複数のエクソン、または異常なイントロンのスプライスアクセプターもしくはドナー部位の恒久的な欠失または置きかえをもたらし、ジストロフィンのリーディングフレームの修復、およびジストロフィンタンパク質の活性の修復をもたらすＳＳＢまたはＤＳＢを生じさせる１または複数のＣａｓ９またはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼである、方法１、７、および１１のいずれか１つにおいて提示される方法を提示する。
別の方法である、方法２７では、本開示は、１つのｇＲＮＡが、１対のＳＳＢまたはＤＳＢを創出する、方法２６において提示される方法を提示する。
別の方法である、方法２８では、本開示は、１つのｇＲＮＡが、５’ローカス、３’ローカス、または５’ローカスと３’ローカスとの間のセグメントと相補的であるスペーサー配列を含む、方法２６において提示される方法を提示する。
別の方法である、方法２９では、本開示は、第１のｇＲＮＡおよび第２のｇＲＮＡを含み、第１のｇＲＮＡが、５’ローカスのセグメントと相補的であるスペーサー配列を含み、第２のｇＲＮＡが、３’ローカスのセグメントと相補的であるスペーサー配列を含む、方法２６において提示される方法を提示する。
別の方法である、方法３０では、本開示は、１または複数のｇＲＮＡが、１または複数の単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である、方法２６〜２９において提示される方法を提示する。
別の方法である、方法３１では、本開示は、１もしくは複数のｇＲＮＡ、または１もしくは複数のｓｇＲＮＡが、１もしくは複数の修飾ｇＲＮＡ、または１もしくは複数の修飾ｓｇＲＮＡである、方法２６〜３０において提示される方法を提示する。
別の方法である、方法３２では、本開示は、１または複数のＤＮＡエンドヌクレアーゼを、１もしくは複数のｇＲＮＡ、または１もしくは複数のｓｇＲＮＡとあらかじめ複合体化させる、方法２６〜３１のうちのいずれか１つにおいて提示される方法を提示する。
別の方法である、方法３３では、本開示は、５’ローカスと３’ローカスとの間に染色体ＤＮＡの欠失が存在する、方法２６〜３２のうちのいずれか１つにおいて提示される方法を提示する。
別の方法である、方法３４では、本開示は、欠失が、単一エクソンの欠失である、方法２６〜３３のうちのいずれか１つにおいて提示される方法を提示する。
別の方法である、方法３５では、本開示は、単一エクソンの欠失が、エクソン２、エクソン８、エクソン４３、エクソン４４、エクソン４５、エクソン４６、エクソン５０、エクソン５１、エクソン５２、またはエクソン５３の欠失である、方法３４において提示される方法を提示する。
別の方法である、方法３６では、本開示は、５’ローカスが、エクソン２、エクソン８、エクソン４３、エクソン４４、エクソン４５、エクソン４６、エクソン５０、エクソン５１、エクソン５２、およびエクソン５３からなる群から選択される単一エクソンの５’境界部に対して近位である、方法３４または３５において提示される方法を提示する。
別の方法である、方法３７では、本開示は、３’ローカスが、エクソン２、エクソン８、エクソン４３、エクソン４４、エクソン４５、エクソン４６、エクソン５０、エクソン５１、エクソン５２、およびエクソン５３からなる群から選択される単一エクソンの３’境界部に対して近位である、方法３４〜３６のうちのいずれか１つにおいて提示される方法を提示する。
別の方法である、方法３８では、本開示は、５’ローカスが、エクソン２、エクソン８、エクソン４３、エクソン４４、エクソン４５、エクソン４６、エクソン５０、エクソン５１、エクソン５２、およびエクソン５３からなる群から選択される単一エクソンの５’境界部に対して近位であり、３’ローカスが、これらの３’境界部に対して近位である、方法３４〜３７のうちのいずれか１つにおいて提示される方法を提示する。
別の方法である、方法３９では、本開示は、エクソンの境界部に対する近位が、隣接イントロンの周囲のスプライスドナーおよびアクセプターを含む、方法３６〜３８のうちのいずれか１つにおいて提示される方法を提示する。
別の方法である、方法４０では、本開示は、欠失が、マルチエクソンの欠失である、方法２６〜３３のうちのいずれか１つにおいて提示される方法を提示する。
別の方法である、方法４１では、本開示は、マルチエクソンの欠失が、エクソン４５〜５３またはエクソン４５〜５５の欠失である、方法４０において提示される方法を提示する。
別の方法である、方法４２では、本開示は、５’ローカスが、エクソン４５〜５３およびエクソン４５〜５５からなる群から選択される複数のエクソンの５’境界部に対して近位である、方法４０〜４１のうちのいずれか１つにおいて提示される方法を提示する。
別の方法である、方法４３では、本開示は、３’ローカスが、エクソン４５〜５３およびエクソン４５〜５５からなる群から選択される複数のエクソンの３’境界部に対して近位である、方法４０〜４２のうちのいずれか１つにおいて提示される方法を提示する。
別の方法である、方法４４では、本開示は、５’ローカスが、エクソン４５〜５３およびエクソン４５〜５５からなる群から選択される複数のエクソンの５’境界部に対して近位であり、３’ローカスが、これらの３’境界部に対して近位である、方法４０〜４３のうちのいずれか１つにおいて提示される方法を提示する。
別の方法である、方法４５では、本開示は、エクソンの境界部に対する近位が、隣接イントロンの周囲のスプライスドナーおよびアクセプターを含む、方法４２〜４４のうちのいずれか１つにおいて提示される方法を提示する。
別の方法である、方法４６では、本開示は、５’ローカスと３’ローカスとの間に染色体ＤＮＡの置きかえが存在する、方法２６〜３２のうちのいずれか１つにおいて提示される方法を提示する。
別の方法である、方法４７では、本開示は、置きかえが、単一エクソンの置きかえである、方法２６〜３２および４６のうちのいずれか１つにおいて提示される方法を提示する。
別の方法である、方法４８では、本開示は、単一エクソンの置きかえが、エクソン２、エクソン８、エクソン４３、エクソン４４、エクソン４５、エクソン４６、エクソン５０、エクソン５１、エクソン５２、エクソン５３、またはエクソン７０の置きかえである、方法２６〜３２および４６〜４７のうちのいずれか１つにおいて提示される方法を提示する。
別の方法である、方法４９では、本開示は、５’ローカスが、エクソン２、エクソン８、エクソン４３、エクソン４４、エクソン４５、エクソン４６、エクソン５０、エクソン５１、エクソン５２、エクソン５３、またはエクソン７０からなる群から選択される単一エクソンの５’境界部に対して近位である、方法４７〜４８のうちのいずれか１つにおいて提示される方法を提示する。
別の方法である、方法５０では、本開示は、３’ローカスが、エクソン２、エクソン８、エクソン４３、エクソン４４、エクソン４５、エクソン４６、エクソン５０、エクソン５１、エクソン５２、エクソン５３、またはエクソン７０からなる群から選択される単一エクソンの３’境界部に対して近位である、方法４７〜４９のうちのいずれか１つにおいて提示される方法を提示する。
別の方法である、方法５１では、本開示は、５’ローカスが、エクソン２、エクソン８、エクソン４３、エクソン４４、エクソン４５、エクソン４６、エクソン５０、エクソン５１、エクソン５２、エクソン５３、またはエクソン７０からなる群から選択される単一エクソンの５’境界部に対して近位であり、３’ローカスが、これらの３’境界部に対して近位である、方法４７〜５０のうちのいずれか１つにおいて提示される方法を提示する。
別の方法である、方法５２では、本開示は、エクソンの境界部に対する近位が、隣接イントロンまたは隣接エクソンの周囲のスプライスドナーおよびアクセプターを含む、方法４９〜５１のうちのいずれか１つにおいて提示される方法を提示する。
別の方法である、方法５３では、本開示は、置きかえが、マルチエクソンの置きかえである、方法２６〜３２または４６のうちのいずれか１つにおいて提示される方法を提示する。
別の方法である、方法５４では、本開示は、マルチエクソンの置きかえが、エクソン４５〜５３またはエクソン４５〜５５の置きかえである、方法５３において提示される方法を提示する。
別の方法である、方法５５では、本開示は、５’ローカスが、エクソン４５〜５３およびエクソン４５〜５５からなる群から選択される複数のエクソンの５’境界部に対して近位である、方法５３〜５４のうちのいずれか１つにおいて提示される方法を提示する。
別の方法である、方法５６では、本開示は、３’ローカスが、エクソン４５〜５３およびエクソン４５〜５５からなる群から選択される複数のエクソンの３’境界部に対して近位である、方法５３〜５５のうちのいずれか１つにおいて提示される方法を提示する。
別の方法である、方法５７では、本開示は、５’ローカスが、エクソン４５〜５３およびエクソン４５〜５５からなる群から選択される複数のエクソンの５’境界部に対して近位であり、３’ローカスが、これらの３’境界部に対して近位である、方法５３〜５６のうちのいずれか１つにおいて提示される方法を提示する。
別の方法である、方法５８では、本開示は、エクソンの境界部に対する近位が、隣接イントロンの周囲のスプライスドナーおよびアクセプターを含む、方法５５〜５７のうちのいずれか１つにおいて提示される方法を提示する。
別の方法である、方法５９では、本開示は、細胞へと、野生型ジストロフィンの遺伝子またはｃＤＮＡの少なくとも一部分を含むポリヌクレオチドドナー鋳型を導入するステップをさらに含み、置きかえが、相同性により導かれる修復（ＨＤＲ）によるものである、方法４６〜５８のうちのいずれか１つにおいて提示される方法を提示する。
別の方法である、方法６０では、本開示は、野生型ジストロフィンの遺伝子またはｃＤＮＡの少なくとも一部分が、エクソン１、エクソン２、エクソン３、エクソン４、エクソン５、エクソン６、エクソン７、エクソン８、エクソン９、エクソン１０、エクソン１１、エクソン１２、エクソン１３、エクソン１４、エクソン１５、エクソン１６、エクソン１７、エクソン１８、エクソン１９、エクソン２０、エクソン２１、エクソン２２、エクソン２３、エクソン２４、エクソン２５、エクソン２６、エクソン２７、エクソン２８、エクソン２９、エクソン３０、エクソン３１、エクソン３２、エクソン３３、エクソン３４、エクソン３５、エクソン３６、エクソン３７、エクソン３８、エクソン３９、エクソン４０、エクソン４１、エクソン４２、エクソン４３、エクソン４４、エクソン４５、エクソン４６、エクソン４７、エクソン４８、エクソン４９、エクソン５０、エクソン５１、エクソン５２、エクソン５３、エクソン５４、エクソン５５、エクソン５６、エクソン５７、エクソン５８、エクソン５９、エクソン６０、エクソン６１、エクソン６２、エクソン６３、エクソン６４、エクソン６５、エクソン６６、エクソン６７、エクソン６８、エクソン６９、エクソン７０、エクソン７１、エクソン７２、エクソン７３、エクソン７４、エクソン７５、エクソン７６、エクソン７７、エクソン７８、エクソン７９、イントロン領域、合成イントロン領域、断片、これらの組合せ、またはジストロフィン遺伝子もしくはｃＤＮＡ全体の少なくとも一部を含む、方法５９において提示される方法を提示する。
別の方法である、方法６１では、本開示は、野生型ジストロフィンの遺伝子またはｃＤＮＡの少なくとも一部分が、エクソン１、エクソン２、エクソン３、エクソン４、エクソン５、エクソン６、エクソン７、エクソン８、エクソン９、エクソン１０、エクソン１１、エクソン１２、エクソン１３、エクソン１４、エクソン１５、エクソン１６、エクソン１７、エクソン１８、エクソン１９、エクソン２０、エクソン２１、エクソン２２、エクソン２３、エクソン２４、エクソン２５、エクソン２６、エクソン２７、エクソン２８、エクソン２９、エクソン３０、エクソン３１、エクソン３２、エクソン３３、エクソン３４、エクソン３５、エクソン３６、エクソン３７、エクソン３８、エクソン３９、エクソン４０、エクソン４１、エクソン４２、エクソン４３、エクソン４４、エクソン４５、エクソン４６、エクソン４７、エクソン４８、エクソン４９、エクソン５０、エクソン５１、エクソン５２、エクソン５３、エクソン５４、エクソン５５、エクソン５６、エクソン５７、エクソン５８、エクソン５９、エクソン６０、エクソン６１、エクソン６２、エクソン６３、エクソン６４、エクソン６５、エクソン６６、エクソン６７、エクソン６８、エクソン６９、エクソン７０、エクソン７１、エクソン７２、エクソン７３、エクソン７４、エクソン７５、エクソン７６、エクソン７７、エクソン７８、エクソン７９、イントロン領域、合成イントロン領域、断片、これらの組合せ、またはジストロフィン遺伝子もしくはｃＤＮＡ全体を含む、方法５９において提示される方法を提示する。
別の方法である、方法６２では、本開示は、細胞へと、１つのガイドリボ核酸（ｇＲＮＡ）と、野生型ジストロフィンの遺伝子の少なくとも一部分を含むポリヌクレオチドドナー鋳型とを導入するステップをさらに含み、１または複数のＤＮＡエンドヌクレアーゼが、ジストロフィン遺伝子内またはその近傍のローカスに、ポリヌクレオチドドナー鋳型に由来する新たな配列の、ローカスにおける染色体ＤＮＡへの挿入を容易とする１つの一本鎖切断（ＳＳＢ）または二本鎖切断（ＤＳＢ）であって、ジストロフィン遺伝子内またはその近傍に、１もしくは複数のエクソン、または異常なイントロンのスプライスアクセプターもしくはドナー部位の恒久的な挿入または矯正をもたらし、ジストロフィンのリーディングフレームの修復、およびジストロフィンタンパク質の活性の修復をもたらすＳＳＢまたはＤＳＢを生じさせる１または複数のＣａｓ９またはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼであり、ｇＲＮＡが、ローカスのセグメントと相補的であるスペーサー配列を含む、方法１、７、または１１のうちのいずれか１つにおいて提示される方法を提示する。
別の方法である、方法６３では、本開示は、細胞へと、１または複数のガイドリボ核酸（ｇＲＮＡ）と、野生型ジストロフィンの遺伝子の少なくとも一部分を含むポリヌクレオチドドナー鋳型とを導入するステップをさらに含み、１または複数のＤＮＡエンドヌクレアーゼが、ジストロフィン遺伝子内またはその近傍に、ポリヌクレオチドドナー鋳型に由来する新たな配列の、５’ローカスと３’ローカスとの間における染色体ＤＮＡへの挿入を容易とする、５’ローカスにおける第１の切断、および３’ローカスにおける第２の切断である１対の一本鎖切断（ＳＳＢ）または二本鎖切断（ＤＳＢ）であって、ジストロフィン遺伝子内またはその近傍の５’ローカスと３’ローカスとの間に、１もしくは複数のエクソン、または異常なイントロンのスプライスアクセプターもしくはドナー部位の恒久的な挿入または矯正をもたらし、ジストロフィンのリーディングフレームの修復、およびジストロフィンタンパク質の活性の修復をもたらすＳＳＢまたはＤＳＢを生じさせる１または複数のＣａｓ９またはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼである、方法１、７、または１１のうちのいずれか１つにおいて提示される方法を提示する。
別の方法である、方法６４では、本開示は、１つのｇＲＮＡが、１対のＳＳＢまたはＤＳＢを創出する、方法６３において提示される方法を提示する。
別の方法である、方法６５では、本開示は、１つのｇＲＮＡが、５’ローカス、３’ローカス、または５’ローカスと３’ローカスとの間のセグメントと相補的であるスペーサー配列を含む、方法６３において提示される方法を提示する。
別の方法である、方法６６では、本開示は、第１のｇＲＮＡおよび第２のｇＲＮＡを含み、第１のｇＲＮＡが、５’ローカスのセグメントと相補的であるスペーサー配列を含み、第２のｇＲＮＡが、３’ローカスのセグメントと相補的であるスペーサー配列を含む、方法６３において提示される方法を提示する。
別の方法である、方法６７では、本開示は、１または複数のｇＲＮＡが、１または複数の単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である、方法６２または６３において提示される方法を提示する。
別の方法である、方法６８では、本開示は、１もしくは複数のｇＲＮＡ、または１もしくは複数のｓｇＲＮＡが、１もしくは複数の修飾ｇＲＮＡ、または１もしくは複数の修飾ｓｇＲＮＡである、方法６２〜６３または６７において提示される方法を提示する。
別の方法である、方法６９では、本開示は、１または複数のＤＮＡエンドヌクレアーゼを、１もしくは複数のｇＲＮＡ、または１もしくは複数のｓｇＲＮＡとあらかじめ複合体化させる、方法６２〜６３または６７〜６８のうちのいずれか１つにおいて提示される方法を提示する。
別の方法である、方法７０では、本開示は、挿入が、単一エクソンの挿入である、方法６２〜６９のうちのいずれか１つにおいて提示される方法を提示する。
別の方法である、方法７１では、本開示は、単一エクソンの挿入が、エクソン２、エクソン８、エクソン４３、エクソン４４、エクソン４５、エクソン４６、エクソン５０、エクソン５１、エクソン５２、エクソン５３またはエクソン７０の挿入である、方法７０において提示される方法を提示する。
別の方法である、方法７２では、本開示は、ローカス、５’ローカスまたは３’ローカスが、エクソン２、エクソン８、エクソン４３、エクソン４４、エクソン４５、エクソン４６、エクソン５０、エクソン５１、エクソン５２、エクソン５３およびエクソン７０からなる群から選択される単一エクソンの境界部に対して近位である、方法７０〜７１のうちのいずれか１つにおいて提示される方法を提示する。
別の方法である、方法７３では、本開示は、エクソンの境界部に対する近位が、隣接イントロンまたは隣接エクソンの周囲のスプライスドナーおよびアクセプターを含む、方法７２において提示される方法を提示する。
別の方法である、方法７４では、本開示は、挿入が、マルチエクソンの挿入である、方法６２〜６９のうちのいずれか１つにおいて提示される方法を提示する。
別の方法である、方法７５では、本開示は、マルチエクソンの挿入が、エクソン４５〜５３またはエクソン４５〜５５の挿入である、方法７４において提示される方法を提示する。
別の方法である、方法７６では、本開示は、ローカス、５’ローカスまたは３’ローカスが、エクソン４５〜５３またはエクソン４５〜５５からなる群から選択されるマルチエクソンの境界部に対して近位である、方法７４〜７５のうちのいずれか１つにおいて提示される方法を提示する。
別の方法である、方法７７では、本開示は、エクソンの境界部に対する近位が、隣接イントロンの周囲のスプライスドナーおよびアクセプターを含む、方法７６において提示される方法を提示する。
別の方法である、方法７８では、本開示は、野生型ジストロフィンの遺伝子またはｃＤＮＡの少なくとも一部分が、エクソン１、エクソン２、エクソン３、エクソン４、エクソン５、エクソン６、エクソン７、エクソン８、エクソン９、エクソン１０、エクソン１１、エクソン１２、エクソン１３、エクソン１４、エクソン１５、エクソン１６、エクソン１７、エクソン１８、エクソン１９、エクソン２０、エクソン２１、エクソン２２、エクソン２３、エクソン２４、エクソン２５、エクソン２６、エクソン２７、エクソン２８、エクソン２９、エクソン３０、エクソン３１、エクソン３２、エクソン３３、エクソン３４、エクソン３５、エクソン３６、エクソン３７、エクソン３８、エクソン３９、エクソン４０、エクソン４１、エクソン４２、エクソン４３、エクソン４４、エクソン４５、エクソン４６、エクソン４７、エクソン４８、エクソン４９、エクソン５０、エクソン５１、エクソン５２、エクソン５３、エクソン５４、エクソン５５、エクソン５６、エクソン５７、エクソン５８、エクソン５９、エクソン６０、エクソン６１、エクソン６２、エクソン６３、エクソン６４、エクソン６５、エクソン６６、エクソン６７、エクソン６８、エクソン６９、エクソン７０、エクソン７１、エクソン７２、エクソン７３、エクソン７４、エクソン７５、エクソン７６、エクソン７７、エクソン７８、エクソン７９、イントロン領域、合成イントロン領域、断片、これらの組合せ、またはジストロフィン遺伝子もしくはｃＤＮＡ全体の少なくとも一部を含む、方法６２または６３において提示される方法を提示する。
別の方法である、方法７９では、本開示は、野生型ジストロフィンの遺伝子またはｃＤＮＡの少なくとも一部分が、エクソン１、エクソン２、エクソン３、エクソン４、エクソン５、エクソン６、
エクソン７、エクソン８、エクソン９、エクソン１０、エクソン１１、エクソン１２、エクソン１３、エクソン１４、エクソン１５、エクソン１６、エクソン１７、エクソン１８、エクソン１９、エクソン２０、エクソン２１、エクソン２２、エクソン２３、エクソン２４、エクソン２５、エクソン２６、エクソン２７、エクソン２８、エクソン２９、エクソン３０、エクソン３１、エクソン３２、エクソン３３、エクソン３４、エクソン３５、エクソン３６、エクソン３７、エクソン３８、エクソン３９、エクソン４０、エクソン４１、エクソン４２、エクソン４３、エクソン４４、エクソン４５、エクソン４６、エクソン４７、エクソン４８、エクソン４９、エクソン５０、エクソン５１、エクソン５２、エクソン５３、エクソン５４、エクソン５５、エクソン５６、エクソン５７、エクソン５８、エクソン５９、エクソン６０、エクソン６１、エクソン６２、エクソン６３、エクソン６４、エクソン６５、エクソン６６、エクソン６７、エクソン６８、エクソン６９、エクソン７０、エクソン７１、エクソン７２、エクソン７３、エクソン７４、エクソン７５、エクソン７６、エクソン７７、エクソン７８、エクソン７９、イントロン領域、合成イントロン領域、断片、これらの組合せ、またはジストロフィン遺伝子もしくはｃＤＮＡ全体を含む、方法６２または６３において提示される方法を提示する。
別の方法である、方法８０では、本開示は、挿入が、相同性により導かれる修復（ＨＤＲ）によるものである、方法６２〜７９のうちのいずれか１つにおいて提示される方法を提示する。
別の方法である、方法８１では、本開示は、ドナー鋳型が、一本鎖または二本鎖ポリヌクレオチドである、方法６２〜８０のうちのいずれか１つにおいて提示される方法を提示する。
別の方法である、方法８２では、本開示は、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１の、ｍＲＮＡ、ｇＲＮＡ、およびドナー鋳型を、各々別個の脂質ナノ粒子へと製剤化するか、またはこれらの全てを、脂質ナノ粒子へと共製剤化する、方法２６〜８１のうちのいずれか１つにおいて提示される方法を提示する。
別の方法である、方法８３では、本開示は、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１のｍＲＮＡを、脂質ナノ粒子へと製剤化し、ｇＲＮＡおよびドナー鋳型の両方を、細胞へと、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターにより送達する、方法２６〜８１のうちのいずれか１つにおいて提示される方法を提示する。
別の方法である、方法８４では、本開示は、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１のｍＲＮＡを、脂質ナノ粒子へと製剤化し、ｇＲＮＡを、細胞へと、電気穿孔により送達し、ドナー鋳型を、細胞へと、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターにより送達する、方法２６〜８１のうちのいずれか１つにおいて提示される方法を提示する。
別の方法である、方法８５では、本開示は、ジストロフィン遺伝子が、Ｘ染色体：３１，１１７，２２８〜３３，３４４，６０９（Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ：ＧＲＣｈ３８／ｈｇ３８）に位置する、方法１〜８４のうちのいずれか１つにおいて提示される方法を提示する。
第１の組成物である、組成物１では、本開示は、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）を伴う患者に由来する細胞内のジストロフィン遺伝子を編集するための、１または複数のガイドリボ核酸（ｇＲＮＡ）であって、配列表の配列番号１〜１，４１０，４７２内の核酸配列からなる群から選択されるスペーサー配列を含む、１または複数のｇＲＮＡを提示する。
別の組成物である、組成物２では、本開示は、１または複数のｇＲＮＡが、１または複数の単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である、組成物１の１または複数のｇＲＮＡを提示する。
別の組成物である、組成物３では、本開示は、１もしくは複数のｇＲＮＡ、または１もしくは複数のｓｇＲＮＡが、１もしくは複数の修飾ｇＲＮＡ、または１もしくは複数の修飾ｓｇＲＮＡである、組成物１または２の１または複数のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを提示する。
定義
「〜を含むこと」または「〜を含む」という用語は、本発明に不可欠であるが、不可欠なものであれ、可欠なものであれ、未指定の要素の包含に対しても開かれた、組成物、方法、およびこれらのそれぞれの構成要素に言及して使用される。
「〜から本質的になる」という用語は、所与の態様に要求される要素を指す。用語は、本発明のその態様の、基本的かつ新規のまたは機能的な特徴に実質的に影響を及ぼさない、さらなる要素の存在を許容する。
「〜からなる」という用語は、態様についてのその記載において列挙されない任意の要素を除外して、本明細書で記載される組成物、方法、およびこれらのそれぞれの構成要素を指す。
単数形の「ある（ａ）」、「ある（ａｎ）」、および「その」は、文脈により、そうでないことが明確に指示されない限りにおいて、複数の指示対象を含む。
本明細書で列挙される任意の数値範囲は、数値精度が同じである（すなわち、指定された桁数と同じ桁数を有する）全ての部分範囲であって、列挙された範囲内に包含される部分範囲について記載する。例えば、「１．０〜１０．０」という列挙範囲は、本明細書の本文中で、「２．４〜７．６」という範囲が、明示的に列挙されていない場合であってもなお、例えば、「２．４〜７．６」など、列挙された最小値である１．０と、列挙された最大値である１０．０との間（およびこれらを含む）の、全ての部分範囲について記載する。したがって、本出願者は、本明細書で明示的に列挙される範囲内に包含される、同じ数値精度の、任意の部分範囲を、明示的に列挙するように、特許請求の範囲を含む本明細書を矯正する権利を留保する。任意のこのような部分範囲を明示的に列挙するように矯正することが、記載、記載の十分性、ならびに３５ Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１２（ａ）およびＥＰＣ １２３（２）条下の要件を含む、新規事項の要件に準拠するように、全てのこのような範囲は本明細書で固有に記載される。文脈により、明示的に指定またはそうでないことが要求されない限りにおいて、本明細書で記載される、全ての数値パラメータ（値、範囲、量、百分率などを表す数値パラメータ）はまた、「約」という語が、数の前に明示的に現れない場合であってもなお、「約」という語を前置しているかのように読むことができる。加えて、本明細書で記載される数値パラメータは、報告される有効桁数である、数値精度に照らして、通常の丸め法を適用することにより解釈されるものとする。また、本明細書で記載される数値パラメータは、必然的に、パラメータの数値を決定するのに使用される基礎的な測定法に特徴的な、固有のばらつきを有することも理解される。
本発明は、本発明の例示的で非限定的な態様を提供する以下の実施例を参照して、より完全に理解される。
本実施例は、ジストロフィンリーディングフレームを修復し、ジストロフィンタンパク質活性を修復する、ゲノムローカス（遺伝子座）からの問題のあるエクソンの恒久的な欠失または矯正をもたらす、ジストロフィン遺伝子（ＤＭＤ遺伝子）における、本明細書で集合的に「ゲノム改変」と呼ばれる、定義された治療的ゲノム欠失、挿入、または置きかえを創出するための例示的なゲノム編集技術としてのＣＲＩＳＰＲ系の使用を説明する。
ＤＭＤ遺伝子の様々な領域（ｒｅｇｉｏｎ）にわたる単鎖ｇＲＮＡを、切断効率について選択および試験した（表５）。ｇＲＮＡは、ＤＭＤ遺伝子における多数の目的の領域（ａｒｅａｓ）のエクソン、イントロン、およびスプライスアクセプターをターゲティングした。実施例において論議される全てのｇＲＮＡの命名規則は、＃（ｇＲＮＡに対応する）−ＮＮ（Ｃａｓタンパク質：ＳＰ−Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ、ＳＡ−Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、ＮＭ−Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ、ＳＴ−Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ、ＴＤ−Ｔ．ｄｅｎｔｉｃｏｌａ、Ｃｐｆ１）−ＮＮ＃＃（ＳＡ−スプライスアクセプター、Ｅ−エクソン、Ｉ−イントロン）である。
Figure 2019507579
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全ての試験したｇＲＮＡは、ＨＤＲ／矯正ベースの編集手法のために使用することができる。スプライスアクセプターをターゲティングする単鎖ｇＲＮＡは、エクソンスキッピングを誘導して、ＤＭＤ遺伝子のリーディングフレームを修復するために使用することができる。選択したｇＲＮＡ対を、リーディングフレームを修復するＤＭＤ遺伝子における欠失を作製するために使用することができる。選択したｇＲＮＡ対を、患者突然変異をシミュレートする欠失を作製するために使用することができ、モデルＤＭＤ突然変異株を発生させるために使用することができる。
様々なＣａｓオルソログを、切断について評価した。ＳＰ、ＮＭ、ＳＴ、ＳＡ、およびＣｐｆ１ ｇＲＮＡを、プラスミドにおいてＵ６プロモーターから発現させる、またはレンチウイルスにおいてＵ６プロモーターから発現させるＲＮＡとして送達した。対応するＣａｓタンパク質は、目的の細胞株にノックインして構成的に発現させるか、ｍＲＮＡとして送達するか、またはタンパク質として送達した。全ての上記に挙げた形式のｇＲＮＡの活性を、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、Ｋ５６２細胞、または人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）においてＴＩＤＥ解析または次世代シークエンシングを使用して評価した。
全体で、試験したほとんどのｇＲＮＡが切断を誘導したことが決定された。しかしながら、切断の量は、試験したＣａｓタンパク質に非常に依存していた。一般的に、ＳＰ Ｃａｓ９ ｇＲＮＡが最も高い切断レベルを誘導し、ＳＡ Ｃａｓ９ ｇＲＮＡは２番目に高い切断レベルを誘導することが分かった。一般的に、可能な最も高い切断効率を有するｇＲＮＡを治療適用に選択することは有益である。しかしながら、ｉＰＳＣベースの治療については、切断効率はそれほど重要ではない。ｉＰＳＣは、高増殖性であり、編集効率が１０％未満である場合でさえも、所望の編集を有する細胞のクローン集団を単離することを単純化する。
上記に説明する定義された治療改変の導入は、本明細書でさらに説明し、例示するように、ＤＭＤの改善の潜在的可能性のための新規治療戦略を代表する。
（実施例１）
ジストロフィン遺伝子のＣＲＩＳＰＲ／ＳＰＣａｓ９標的部位
ジストロフィン遺伝子の領域を標的部位についてスキャンした。各領域を、配列ＮＲＧを有するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）についてスキャンした。配列番号１〜４６７，０３０で示されるように、ＰＡＭに対応するｇＲＮＡ ２０ｂｐスペーサー配列を特定した。配列表の配列番号１，４１０，４３０〜１，４１０，４７２で示されるように、ＰＡＭに対応するｇＲＮＡ １９ｂｐスペーサー配列を特定した。
（実施例２）
ジストロフィン遺伝子のＣＲＩＳＰＲ／ＳＡＣａｓ９標的部位
ジストロフィン遺伝子の領域を標的部位についてスキャンした。各領域を、配列ＮＮＧＲＲＴを有するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）についてスキャンした。配列表の配列番号４６７，０３１〜５２８，１９６で示されるように、ＰＡＭに対応するｇＲＮＡ ２０ｂｐスペーサー配列を特定した。
（実施例３）
ジストロフィン遺伝子のＣＲＩＳＰＲ／ＳＴＣａｓ９標的部位
ジストロフィン遺伝子の領域を標的部位についてスキャンした。各領域を、配列ＮＮＡＧＡＡＷを有するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）についてスキャンした。配列表の配列番号５２８，１９７〜５５３，１９８で示されるように、ＰＡＭに対応するｇＲＮＡ ２４ｂｐスペーサー配列を特定した。
（実施例４）
ジストロフィン遺伝子のＣＲＩＳＰＲ／ＴＤＣａｓ９標的部位
ジストロフィン遺伝子の領域を標的部位についてスキャンした。各領域を、配列ＮＡＡＡＡＣを有するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）についてスキャンした。配列表の配列番号５５３，１９９〜５６３，９１１で示されるように、ＰＡＭに対応するｇＲＮＡ ２４ｂｐスペーサー配列を特定した。
（実施例５）
ジストロフィン遺伝子のＣＲＩＳＰＲ／ＮＭＣａｓ９標的部位
ジストロフィン遺伝子の領域を標的部位についてスキャンした。各領域を、配列ＮＮＮＮＧＨＴＴを有するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）についてスキャンした。配列表の配列番号５６３，９１２〜６２７，８５４および１，４１０，４００〜１，４１０，４０２で示されるように、ＰＡＭに対応するｇＲＮＡ ２４ｂｐスペーサー配列を特定した。
（実施例６）
ジストロフィン遺伝子のＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１標的部位
ジストロフィン遺伝子の領域を標的部位についてスキャンした。各領域を、配列ＹＴＮを有するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）についてスキャンした。配列表の配列番号６２７，８５５〜１，４１０，３９９および１，４１０，４０３〜１，４１０，４２９で示されるように、ＰＡＭに対応するｇＲＮＡ ２０〜２４ｂｐスペーサー配列を特定した。
（実施例７）
エクソン２をターゲティングする例示的なゲノム編集戦略
いくつかの方法は、遺伝子を２回切断することによりエクソン２を欠失させるｇＲＮＡ対を提供し、１つのｇＲＮＡはエクソン２の５’末端で切断し、他方のｇＲＮＡはエクソン２の３’末端で切断する。
（実施例８）
エクソン８をターゲティングする例示的なゲノム編集戦略
いくつかの方法は、遺伝子を２回切断することによりエクソン８を欠失させるｇＲＮＡ対を提供し、１つのｇＲＮＡはエクソン８の５’末端で切断し、他方のｇＲＮＡはエクソン８の３’末端で切断する。
（実施例９）
エクソン４３をターゲティングする例示的なゲノム編集戦略
いくつかの方法は、遺伝子を２回切断することによりエクソン４３を欠失させるｇＲＮＡ対を提供し、１つのｇＲＮＡはエクソン４３の５’末端で切断し、他方のｇＲＮＡはエクソン４３の３’末端で切断する。
（実施例１０）
エクソン４４をターゲティングする例示的なゲノム編集法
いくつかの方法は、遺伝子を２回切断することによりエクソン４４を欠失させるｇＲＮＡ対を提供し、１つのｇＲＮＡはエクソン４４の５’末端で切断し、他方のｇＲＮＡはエクソン４４の３’末端で切断する。
（実施例１１）
エクソン４５をターゲティングする例示的なゲノム編集戦略
いくつかの方法は、遺伝子を２回切断することによりエクソン４５を欠失させるｇＲＮＡ対を提供し、１つのｇＲＮＡはエクソン４５の５’末端で切断し、他方のｇＲＮＡはエクソン４５の３’末端で切断する。
（実施例１２）
エクソン４６をターゲティングする例示的なゲノム編集戦略
いくつかの方法は、遺伝子を２回切断することによりエクソン４６を欠失させるｇＲＮＡ対を提供し、１つのｇＲＮＡはエクソン４６の５’末端で切断し、他方のｇＲＮＡはエクソン４６の３’末端で切断する。
（実施例１３）
エクソン５０をターゲティングする例示的なゲノム編集戦略
いくつかの方法は、遺伝子を２回切断することによりエクソン５０を欠失させるｇＲＮＡ対を提供し、１つのｇＲＮＡはエクソン５０の５’末端で切断し、他方のｇＲＮＡはエクソン５０の３’末端で切断する。
（実施例１４）
エクソン５１をターゲティングする例示的なゲノム編集戦略
いくつかの方法は、遺伝子を２回切断することによりエクソン５１を欠失させるｇＲＮＡ対を提供し、１つのｇＲＮＡはエクソン５１の５’末端で切断し、他方のｇＲＮＡはエクソン５１の３’末端で切断する。
（実施例１５）
エクソン５２をターゲティングする例示的なゲノム編集戦略
いくつかの方法は、遺伝子を２回切断することによりエクソン５２を欠失させるｇＲＮＡ対を提供し、１つのｇＲＮＡはエクソン５２の５’末端で切断し、他方のｇＲＮＡはエクソン５２の３’末端で切断する。
（実施例１６）
エクソン５３をターゲティングする例示的なゲノム編集戦略
いくつかの方法は、遺伝子を２回切断することによりエクソン５３を欠失させるｇＲＮＡ対を提供し、１つのｇＲＮＡはエクソン５３の５’末端で切断し、他方のｇＲＮＡはエクソン５３の３’末端で切断する。
（実施例１７）
エクソン７０をターゲティングする例示的なゲノム編集戦略
いくつかの方法は、遺伝子を２回切断することによりエクソン７０を欠失させるｇＲＮＡ対を提供し、１つのｇＲＮＡはエクソン７０の５’末端で切断し、他方のｇＲＮＡはエクソン７０の３’末端で切断する。
（実施例１８）
エクソン４５〜５３をターゲティングする例示的なゲノム編集戦略
いくつかの方法は、遺伝子を２回切断することによりエクソン４５〜５３を欠失させるｇＲＮＡ対を提供し、１つのｇＲＮＡはエクソン４５の５’末端で切断し、他方のｇＲＮＡはエクソン５３の３’末端で切断する。
（実施例１９）
エクソン４５〜５５をターゲティングする例示的なゲノム編集戦略
いくつかの方法は、遺伝子を２回切断することによりエクソン４５〜５５を欠失させるｇＲＮＡ対を提供し、１つのｇＲＮＡはエクソン４５の５’末端で切断し、他方のｇＲＮＡはエクソン５５の３’末端で切断する。
（実施例２０）
ガイド鎖のバイオインフォマティクス解析
理論的結合および実験的に査定した活性の両方を含む多段階プロセスで、候補ガイドをスクリーニングおよび選択した。例示として、意図される染色***置以外の染色***置での効果の可能性を査定するために、以下により詳細に説明および例示するように、オフターゲット結合を査定するために使用可能な様々なバイオインフォマティクスツールの１つまたは複数を使用して、隣接するＰＡＭを有する、ジストロフィン遺伝子内またはその近傍の部位などの、特定のオンターゲット部位に適合する配列を有する候補ガイドを、同様の配列を有するオフターゲット部位で切断するそれらの潜在的可能性について査定することができる。その後、オフターゲット活性について比較的低い潜在的可能性を有することが予測される候補は、それらのオンターゲット活性、およびその後様々な部位でのオフターゲット活性を測定するために実験的に査定することができる。好ましいガイドは、選択した遺伝子座で所望の遺伝子編集レベルを達成するために十分に高いオンターゲット活性を有し、他の染色体遺伝子座では改変の可能性を低減させるために比較的低いオフターゲット活性を有する。オンターゲット対オフターゲット活性の比は多くの場合、ガイドの「特異性」と呼ばれる。
予測されるオフターゲット活性の最初のスクリーニングのために、最も可能性が高いオフターゲット部位を予測するために使用され得る、いくつかの公知かつ一般に利用可能なバイオインフォマティクスツールがあり、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ヌクレアーゼ系における標的部位への結合は相補的配列間のワトソン・クリック塩基対形成により駆動されるので、相違の程度（およびそれゆえオフターゲット結合の潜在的可能性の低減）は本質的に、標的部位に対する、潜在的可能性があるオフターゲット部位における、一次配列の差、ミスマッチおよびバルジ、すなわち、非相補的塩基に変えられた塩基、ならびに塩基の挿入または欠失に関連する。ＣＯＳＭＩＤ（ＣＲＩＳＰＲ Ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ Ｓｉｔｅｓ ｗｉｔｈ Ｍｉｓｍａｔｃｈｅｓ，Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ）（ウェブ上でｃｒｉｓｐｒ．ｂｍｅ．ｇａｔｅｃｈ．ｅｄｕにて使用可能）と呼ばれる例示的なバイオインフォマティクスツールは、かかる類似点を集計する。他のバイオインフォマティクスツールとして、ＧＵＩＤＯ、ａｕｔｏＣＯＳＭＩＤ、およびＣＣｔｏｐが挙げられるが、これらに限定されない。
オフターゲット切断を最小限にして、突然変異および染色体再編の有害効果を低減させるために、バイオインフォマティクスを使用した。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系についての研究は、特にＰＡＭ領域から遠位位置での、塩基対ミスマッチおよび／またはバルジを有するＤＮＡ配列へのガイド鎖の非特異的ハイブリダイゼーションに起因する高いオフターゲット活性の可能性を示唆した。それゆえ、塩基対ミスマッチに加えて、ＲＮＡガイド鎖とゲノム配列との間の挿入および／または欠失を有する、潜在的可能性があるオフターゲット部位を特定することができるバイオインフォマティクスツールを有することは重要である。バイオインフォマティクスベースのツール、ＣＯＳＭＩＤ（ＣＲＩＳＰＲ Ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ Ｓｉｔｅｓ ｗｉｔｈ Ｍｉｓｍａｔｃｈｅｓ，Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ）をそれゆえ、潜在的可能性があるＣＲＩＳＰＲオ３０Ｄ５ターゲット部位についてゲノムを検索するために使用した（ウェブ上でｃｒｉｓｐｒ．ｂｍｅ．ｇａｔｅｃｈ．ｅｄｕにて使用可能）。ＣＯＳＭＩＤ出力は、ミスマッチの数および位置に基づいて潜在的可能性があるオフターゲット部位のリストをランク付けし、標的部位のより情報に通じた選択を可能にし、より可能性があるオフターゲット切断を有する部位の使用を避ける。
ある領域におけるｇＲＮＡ標的化部位の見積もられたオンターゲット活性および／またはオフターゲット活性を比較検討する、追加のバイオインフォマティクスパイプラインを使用した。活性を予測するために使用することができる他の特徴として、問題の細胞種、ＤＮＡのアクセシビリティ、クロマチン状態、転写因子結合部位、転写因子結合データ、および他のＣＨＩＰ−ｓｅｑデータについての情報が挙げられる。ｇＲＮＡ対の相対的位置および方向、局所配列特徴、ならびにマイクロホモロジーなどの、編集効率を予測する追加の要素を比較検討する。
（実施例２１）
オンターゲット活性についての、細胞における好ましいガイドの試験
その後、最も低いオフターゲット活性を有すると予測されるｇＲＮＡを、一過性トランスフェクションにより、ヒト胎児腎臓由来上皮細胞、ＨＥＫ２９３Ｔにおけるオンターゲット活性について試験し、ＴＩＤＥまたは次世代シークエンシングを使用してインデル頻度について評価する。ＴＩＤＥは、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡ）により決定される標的遺伝子座のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９によるゲノム編集を迅速に査定するためのウェブツールである。２つの標準のキャピラリーシークエンシング反応からの定量的配列トレースデータに基づいて、ＴＩＤＥソフトウェアは、編集有効性を定量し、標的細胞プールのＤＮＡにおける挿入および欠失（インデル）の優勢なタイプを特定する。詳細な説明および例についてはBrinkmanら、Nucl. Acids Res.（２０１４年）を参照のこと。ハイスループットシークエンシングとしても公知の、次世代シークエンシング（ＮＧＳ：ｎｅｘｔ−ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（Ｓｏｌｅｘａ）シークエンシング、Ｒｏｃｈｅ ４５４シークエンシング、Ｉｏｎ ｔｏｒｒｅｎｔ：Ｐｒｏｔｏｎ／ＰＧＭシークエンシング、およびＳＯＬｉＤシークエンシングを含む、いくつかの異なる現代のシークエンシング技術を説明するために使用される包括的用語である。これらの最近の技術は、以前に使用されていたサンガーシークエンシングよりかなり迅速かつ安価に、ＤＮＡおよびＲＮＡをシークエンシングすることを可能にし、そのためゲノミクスおよび分子生物学の研究に革命を起こした。ＨＥＫ２９３ＴおよびｉＰＳＣの両方の細胞種はゆるいクロマチン構造を有することが公知なので、ＨＥＫ２９３Ｔは、ｉＰＳＣにおける遺伝子矯正についての優れたモデル系である。
クロマチンは、コイリングして、ヌクレオソームと呼ばれる個別の構造になることにより組織化されている。このコイリングは、転写機構へのゲノム材料のアクセシビリティに影響する。開放しているゲノム領域はユークロマチンと呼ばれ、きついコイリング領域はヘテロクロマチンと呼ばれる。幹細胞は一般的にゆるいクロマチンコンフォメーションを有し、細胞がより特殊化した細胞種に分化するにつれて、ゲノムのある特定の領域は閉鎖してヘテロクロマチンを形成することは、十分に受け入れられているパラダイムである（Sims, R. J.およびD. Reinberg（２００９年）、「Stem cells: Escaping fates with open states.」、Nature ４６０巻（７２５７号）：８０２〜８０３頁）。
（実施例２２）
関連するモデル細胞株における試験
ガイドＲＮＡの全てを個々に評価し、有効なｇＲＮＡを特定すると、ｇＲＮＡ対の全ての順列を、ジストロフィンリーディングフレームを修復すると予測され得るジストロフィン遺伝子のＤＮＡ配列を改変するそれらの能力について関連するモデル細胞株で試験する。患者試料で発見される改変と同様または同一の改変を有する筋芽細胞およびｉＰＳＣ細胞株を発生させた。これらの細胞を、適用可能である場合および適用可能であるとき、ｇＲＮＡおよびドナーＤＮＡ鋳型の様々な個々のおよび対の組合せで処理する。その後、試料を、当業者に公知の１つまたは複数の生物学的方法、例えばジストロフィンタンパク質のＣ末端を特異的に認識する（トランケートされたタンパク質はインタクトなＣ末端を含有しないことに留意されたい）酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を使用して、ジストロフィン発現の修復について評価することができる。その後、ジストロフィン発現を修復するｇＲＮＡ対は、ジストロフィンタンパク質の適切なサイズの発現を確認するためのウェスタンブロットなどの追加の生物学的技術によりさらに評価することができる。
（実施例２３）
ＨＤＲ遺伝子編集のための様々な手法の試験
オンターゲット活性およびオフターゲット活性の両方についてｇＲＮＡを試験した後、エクソン矯正およびノックイン戦略を、ＨＤＲ遺伝子編集について試験する。
エクソン矯正手法のために、ドナーＤＮＡ鋳型を、短い一本鎖オリゴヌクレオチド、短い二本鎖オリゴヌクレオチド（ＰＡＭ配列インタクト／ＰＡＭ配列突然変異）、長い一本鎖ＤＮＡ分子（ＰＡＭ配列インタクト／ＰＡＭ配列突然変異）、または長い二本鎖ＤＮＡ分子（ＰＡＭ配列インタクト／ＰＡＭ配列突然変異）として提供する。加えて、ドナーＤＮＡ鋳型をＡＡＶにより送達する。
ＤＮＡノックイン手法のために、Ｘｐ２１．２遺伝子座への相同性アームを有する一本鎖または二本鎖ＤＮＡは、ジストロフィン遺伝子の第１の標的エクソン（第１のコーディングエクソン）の４０ｎｔまたはそれよりも多く、ジストロフィン遺伝子の完全なコーディングＤＮＡ配列（ＣＤＳ：ｃｏｄｉｎｇ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）、およびジストロフィン遺伝子の３’ＵＴＲ、ならびに続くイントロンの少なくとも４０ｎｔを含み得る。Ｘｐ２１．２遺伝子座への相同性アームを有する一本鎖または二本鎖ＤＮＡは、ジストロフィン遺伝子の第１の標的エクソン（第１のコーディングエクソン）の８０ｎｔまたはそれよりも多く、ジストロフィン遺伝子の完全なコーディングＤＮＡ配列（ＣＤＳ）、およびジストロフィン遺伝子の３’ＵＴＲ、ならびに続くイントロンの少なくとも８０ｎｔを含み得る。Ｘｐ２１．２遺伝子座への相同性アームを有する一本鎖または二本鎖ＤＮＡは、ジストロフィン遺伝子の第１の標的エクソン（第１のコーディングエクソン）の１００ｎｔまたはそれよりも多く、ジストロフィン遺伝子の完全なコーディングＤＮＡ配列（ＣＤＳ）、およびジストロフィン遺伝子の３’ＵＴＲ、ならびに続くイントロンの少なくとも１００ｎｔを含み得る。Ｘｐ２１．２遺伝子座への相同性アームを有する一本鎖または二本鎖ＤＮＡは、ジストロフィン遺伝子の第１の標的エクソン（第１のコーディングエクソン）の１５０ｎｔまたはそれよりも多く、ジストロフィン遺伝子の完全なコーディングＤＮＡ配列（ＣＤＳ）、およびジストロフィン遺伝子の３’ＵＴＲ、ならびに続くイントロンの少なくとも１５０ｎｔを含み得る。Ｘｐ２１．２遺伝子座への相同性アームを有する一本鎖または二本鎖ＤＮＡは、ジストロフィン遺伝子の第１の標的エクソン（第１のコーディングエクソン）の３００ｎｔまたはそれよりも多く、ジストロフィン遺伝子の完全なコーディングＤＮＡ配列（ＣＤＳ）、およびジストロフィン遺伝子の３’ＵＴＲ、ならびに続くイントロンの少なくとも３００ｎｔを含み得る。Ｘｐ２１．２遺伝子座への相同性アームを有する一本鎖または二本鎖ＤＮＡは、ジストロフィン遺伝子の第１の標的エクソン（第１のコーディングエクソン）の４００ｎｔまたはそれよりも多く、ジストロフィン遺伝子の完全なＣＤＳ、およびジストロフィン遺伝子の３’ＵＴＲ、ならびに続くイントロンの少なくとも４００ｎｔを含み得る。あるいは、ＤＮＡ鋳型を、ＡＡＶにより送達する。
ｃＤＮＡノックイン手法のために、一本鎖または二本鎖ｃＤＮＡは、ジストロフィン遺伝子の単一のエクソン標的の４０ｎｔまたはそれよりも多くを含み得る。一本鎖または二本鎖ｃＤＮＡは、ジストロフィン遺伝子の単一のエクソン標的の８０ｎｔまたはそれよりも多くを含み得る。一本鎖または二本鎖ｃＤＮＡは、ジストロフィン遺伝子の単一のエクソン標的の１００ｎｔまたはそれよりも多くを含み得る。一本鎖または二本鎖ｃＤＮＡは、ジストロフィン遺伝子の単一のエクソン標的の１５０ｎｔまたはそれよりも多くを含み得る。一本鎖または二本鎖ｃＤＮＡは、ジストロフィン遺伝子の単一のエクソン標的の３００ｎｔまたはそれよりも多くを含み得る。一本鎖または二本鎖ｃＤＮＡは、ジストロフィン遺伝子の単一のエクソン標的の４００ｎｔまたはそれよりも多くを含み得る。あるいは、ＤＮＡ鋳型を、ＡＡＶにより送達する。
ｃＤＮＡノックイン手法のために、一本鎖または二本鎖ｃＤＮＡは、ジストロフィン遺伝子の多数のエクソン標的の４０ｎｔまたはそれよりも多くを含み得る。一本鎖または二本鎖ｃＤＮＡは、ジストロフィン遺伝子の多数のエクソン標的の８０ｎｔまたはそれよりも多くを含み得る。一本鎖または二本鎖ｃＤＮＡは、ジストロフィン遺伝子の多数のエクソン標的の１００ｎｔまたはそれよりも多くを含み得る。一本鎖または二本鎖ｃＤＮＡは、ジストロフィン遺伝子の多数のエクソン標的の１５０ｎｔまたはそれよりも多くを含み得る。一本鎖または二本鎖ｃＤＮＡは、ジストロフィン遺伝子の多数のエクソン標的の３００ｎｔまたはそれよりも多くを含み得る。一本鎖または二本鎖ｃＤＮＡは、ジストロフィン遺伝子の多数のエクソン標的の４００ｎｔまたはそれよりも多くを含み得る。あるいは、ＤＮＡ鋳型を、ＡＡＶにより送達する。
（実施例２４）
リードＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９／ＤＮＡドナーの組合せの再査定
ＨＤＲ遺伝子編集のための様々な戦略を試験した後、リードＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９／ＤＮＡドナーの組合せを、欠失の効率、組換え、およびオフターゲット特異性について治療的に関連する細胞において再査定する。Ｃａｓ９ ｍＲＮＡまたはＲＮＰは送達のための脂質ナノ粒子へと製剤化され、ｓｇＲＮＡはナノ粒子へと製剤化されるか、またはＡＡＮとして送達され、ドナーＤＮＡはナノ粒子へと製剤化されるか、またはＡＡＶとして送達される。
（実施例２５）
関連する動物モデルにおけるｉｎ ｖｉｖｏ試験
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９／ＤＮＡドナーの組合せを再査定した後、リード製剤を治療的に関連するマウスモデルにおいてｉｎ ｖｉｖｏで試験する。
ヒト細胞での培養は、上記に説明するように、ヒト標的およびバックグラウンドヒトゲノムについての直接的な試験を可能にする。
前臨床有効性および安全性評価は、治療的に関連するマウスモデルにおける改変マウスまたはヒト細胞の生着を通して観察することができる。改変細胞は、生着後数ヶ月で観察することができる。
（実施例２６）
ＤＭＤ遺伝子のエクソン４５、５１、５３、５５、および７０をターゲティングするＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ ｇＲＮＡの切断効率
ＤＭＤ遺伝子のエクソン４５、５１、５３、５５、および７０をターゲティングするＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ（ＳＰ）ｇＲＮＡを試験した（図３Ａ〜３Ｂ）。エクソン４５、５１、５３、５５、および７０の各々は、ＨＤＲ／矯正ベースの手法を使用して編集してもよい。
ＳＰ ｇＲＮＡを、ＳＰ Ｃａｓタンパク質を共発現するプラスミドにクローニングした。これらのプラスミドを、リポフェクタミン２０００を使用してＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。細胞をトランスフェクション４８時間後に回収し、ゲノムＤＮＡを単離し、切断効率を、ＴＩＤＥ解析を使用して評価した。データを３〜４つの反復を含有する１回の実験から集計した（Ｎ＝３〜４）。データを平均値およびＳＥＭとしてプロットした。
図３Ａ〜３Ｂからのデータは、ほとんどのｇＲＮＡがＨＥＫ２９３Ｔ細胞において５０％を超える効率で切断することを示す。
（実施例２７）
ＤＭＤ遺伝子のエクソン４３、４４、４５、４６、５０、５１、５２、５３、および５５のスプライスアクセプターをターゲティングするｇＲＮＡの切断効率
ＤＭＤを処置するための実行可能な選択肢は、ＤＭＤ遺伝子のリーディングフレームを修復するためにエクソンスキッピングを誘導することである。エクソンスキッピングを誘導するために、遺伝子編集手法は、内因性スプライシング機構により認識されるエクソンのすぐ上流のＡＧ配列を除去しなければならない。単鎖ｇＲＮＡが二重鎖切断を誘導した場合、細胞は切断を修復する。この時間の一部で、内因性修復機構は、誤りを生じ、切断部位に隣接する塩基を挿入または欠失させる。ＡＧ配列を突然変異させるｇＲＮＡは、スプライシング機構がもはやこの部位をスプライスアクセプター部位として認識することができず、隣接エクソンの次のスプライスアクセプターにスキップするので、この部位でエクソンスキッピングを誘導する可能性がある。
ＤＭＤ遺伝子のエクソン４３、４４、４５、４６、５０、５１、５２、５３、および５５のスプライスアクセプターをターゲティングするＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ（ＳＰ）、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ（ＳＡ）、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ（ＳＴ）、Ｎ．Ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ（ＮＭ）、およびＣｐｆ１ ｇＲＮＡを設計し、試験した（図４Ａ、４Ｂ、および４Ｃ）。
ＳＰ ｇＲＮＡを、ＤＭＤ遺伝子の９つのエクソンのスプライスアクセプターをターゲティングするように設計した。ｇＲＮＡをＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ）社からｓｐｌｉｔ ＲＮＡ ｇＲＮＡとして注文した。ｓｐｌｉｔ ｇＲＮＡを製造業者の教示によってｔｒａｃＲＮＡにアニーリングした。その後、アニーリングしたｓｐｌｉｔ ｇＲＮＡを、ＲＮＡｉＭａｘを使用して、ＳＰ Ｃａｓ９タンパク質細胞を安定に発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。細胞をトランスフェクション４８時間後に回収し、ゲノムＤＮＡを単離し、切断効率を、ＴＩＤＥ解析を使用して評価した（図４Ａ）。データを、各々３つの反復を含有する２回の独立した実験間で集計した（Ｎ＝２〜６）。データを平均値およびＳＥＭとしてプロットした。
ＮＭ、ＳＴ、およびＳＡ ｇＲＮＡを、９つのエクソンのスプライスアクセプターをターゲティングするように設計した。ｇＲＮＡを、対応するｇＲＮＡと共に目的のＣａｓタンパク質を共発現するプラスミドにクローニングした。プラスミドを、リポフェクタミン２０００を使用してＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。細胞をトランスフェクション４８時間後に回収し、ゲノムＤＮＡを単離し、切断効率を、ＴＩＤＥ解析を使用して評価した（図４Ｂ）。データを、各々３つの反復を含有する２〜４回の独立した実験間で集計した（Ｎ＝６〜１２）。データを平均値およびＳＥＭとしてプロットした。
Ｃｐｆ１ ｇＲＮＡを、ＤＭＤ遺伝子の９つのエクソンのスプライスアクセプターをターゲティングするように設計した。ｇＲＮＡを、ｇＲＮＡを発現するプラスミドにクローニングした。ＨＥＫ２９３Ｔに、リポフェクタミン２０００を使用して、目的のｇＲＮＡプラスミドおよびＣｐｆ１を発現する第２のプラスミドをコトランスフェクトした。細胞をトランスフェクション４８時間後に回収し、ゲノムＤＮＡを単離し、切断効率を、ＴＩＤＥ解析を使用して評価した（図４Ｃ）。データを、各々３つの反復を含有する２回の独立した実験間で集計した（Ｎ＝３〜６）。データを平均値およびＳＥＭとしてプロットした。
（実施例２８）
ＤＭＤ遺伝子のエクソン４３、４４、４５、４６、５０、５１、５２、５３、および５５をターゲティングするｇＲＮＡの切断効率およびスプライスアクセプターノックアウト効率
スプライスアクセプターをターゲティングするｇＲＮＡの多くは、所望のスプライス部位で効率的に切断する。ｇＲＮＡが有効に所望のＡＧ配列をノックアウトするかどうかを評価するために、切断部位の周囲のＰＣＲアンプリコンを次世代シークエンシングに供した。スプライスアクセプター部位が除去されたインデル百分率の読み取りを定量した（図５Ａ〜Ｂおよび図６）。非限定的に、読み取りの大きな割合でスプライスアクセプター部位を除去する８−ＳＡ−ＳＡ５５、３−ＳＰ−ＳＡ４５、３１−ＳＰ−ＳＡ５０、および４０−ＳＰ−ＳＡ５５を含む、いくつかの有望なｇＲＮＡを特定した。
Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ ｇＲＮＡを、ＤＭＤ遺伝子の９つのエクソンのスプライスアクセプターをターゲティングするように設計した。ｇＲＮＡを、ＩＤＴ社からｓｐｌｉｔ ＲＮＡ ｇＲＮＡとして注文した。ｓｐｌｉｔ ｇＲＮＡを、製造業者の教示によりｔｒａｃＲＮＡにアニーリングした。アニーリングしたｓｐｌｉｔ ｇＲＮＡを、ＲＮＡｉＭａｘを使用して、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９タンパク質細胞を安定に発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。細胞をトランスフェクション４８時間後に回収し、ゲノムＤＮＡを単離し、所望のスプライスアクセプターを囲む所望の１００〜２５０ｂｐ ＰＣＲアンプリコンを次世代シークエンシングに供した。データを、各々３つの反復を含有する２回の独立した実験間で集計した（Ｎ＝６）。平均を集団の平均として表した（図５Ａ〜Ｂ）。
Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ（ＮＭ）、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ（ＳＴ）、およびＳ．ａｕｒｅｕｓ（ＳＡ）ｇＲＮＡを、９つのエクソンのスプライスアクセプターをターゲティングするように設計した。ｇＲＮＡを、対応するｇＲＮＡと共に目的のＣａｓタンパク質を共発現するプラスミドにクローニングした。プラスミドを、リポフェクタミン２０００を使用してＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。細胞をトランスフェクション４８時間後に回収し、ゲノムＤＮＡを単離し、所望のスプライスアクセプターを囲む所望の１００〜２５０ｂｐ ＰＣＲアンプリコンを次世代シークエンシングに供した。データを、各々３つの反復を含有する２回の独立した実験間で集計した（Ｎ＝６）。平均を集団の平均として表した（図６）。
（実施例２９）
ＤＭＤ遺伝子のエクソン４４、４５、５２、および５４を囲む領域をターゲティングするｇＲＮＡの切断効率
編集手法を有効に評価するために、ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験のために患者の細胞株にアクセスすることは重要である。しかしながら、患者材料は、アクセス困難である場合があり、試料間で大きな患者毎の変動があり得る。それゆえ、一般的な患者突然変異を模倣するＤＭＤ突然変異細胞株を創出することは重要であった。これは、研究者が、編集効率の変動が患者特異的でないことを確実にするために同じバックグラウンドで修復戦略の有効性を試験することを可能にする。これに取り組むために、ＤＭＤ患者で発見される一般的な欠失（Δ５２、Δ４４、Δ４５、およびΔ５４）を創出するように対にされ得る、様々なｇＲＮＡを設計した。得られた細胞株は、ＨＤＲまたはエクソンスキッピング手法のいずれかを使用して矯正することができる。これらのｇＲＮＡは、モデル株の創出または目的の突然変異のＨＤＲベースの矯正のいずれかのために使用することができることに留意することが重要である。
領域（目的のエクソンの１００ｂｐ〜１ｋｂ上流および下流）を、ｇＲＮＡ設計ソフトウェアを使用してスクリーニングした。目的のエクソン（例えばＤＭＤ遺伝子のエクソン４４、４５、５２、および５４）の各側上で、最も少ない予測されるオフターゲット効果に基づく最も優れた６つのｇＲＮＡを選択した。これらのｇＲＮＡを、最初に切断効率についてＨＥＫ２９３Ｔで評価し（図７Ａ〜７Ｂ）、ｉＰＳＣで切断効率について確認した（図８Ａ〜８Ｂ）。
エクソン４４、４５、５２、および５４の周囲の単一のＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ ｇＲＮＡを選択した。ｇＲＮＡをＩＤＴ社からｓｐｌｉｔ ｇＲＮＡとして注文した。ｓｐｌｉｔ ｇＲＮＡを、製造業者の教示を使用してトレーサー配列にアニーリングした。
アニーリングしたｇＲＮＡを、ＲＮＡｉＭａｘを使用して、ＳＰ Ｃａｓ９タンパク質セルを安定に発現するＨＥＫ２９３Ｔにトランスフェクトした。細胞をトランスフェクション４８時間後に回収し、ゲノムＤＮＡを単離し、切断効率を、ＴＩＤＥ解析を使用して評価した（図７Ａ〜７Ｂ）。データを、各々３つの反復を含有する１回の実験から集計した（Ｎ＝１〜３）。データを平均値およびＳＥＭとしてプロットした。
また、アニーリングしたｇＲＮＡを、続いてＣａｓ９タンパク質と複合体形成させてリボヌクレオタンパク質複合体（ＲＮＰ：ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ）を形成した。ＲＮＡｉＭａｘを使用して、ＲＮＰをｉＰＳＣ（ＤｉＰＳ １０１６ＳｅｖＡ）にトランスフェクトした。細胞をトランスフェクション４８時間後に回収し、ゲノムＤＮＡを単離し、切断効率を、ＴＩＤＥ解析を使用して評価した（図８Ａ〜８Ｂ）。データを、３つの反復を含有する１回の実験から集計した（Ｎ＝１〜３）。データを平均値およびＳＥＭとしてプロットした。
エクソン４４、４５、５２、および５４の周囲の単一のＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ ｇＲＮＡを選択した。ｇＲＮＡをＩＤＴ社からｓｐｌｉｔ ｇＲＮＡとして注文した。ｓｐｌｉｔ ｇＲＮＡを、製造業者の教示を使用してトレーサー配列にアニーリングした。ｇＲＮＡを、ＲＮＡｉＭａｘを使用して、ＳＰ Ｃａｓ９タンパク質セルを安定に発現するＨＥＫ２９３Ｔにトランスフェクトした。また、同じｇＲＮＡを、Ｃａｓ９タンパク質と複合体形成させてリボヌクレオタンパク質複合体（ＲＮＰ）を形成した。ＲＮＡｉＭａｘを使用して、ＲＮＰをｉＰＳＣ（ＤｉＰＳ １０１６ＳｅｖＡ）にトランスフェクトした。細胞をトランスフェクション４８時間後に回収し、ゲノムＤＮＡを単離し、切断を、ＴＩＤＥ解析を使用して評価した。データを、多数の実験から集計した。平均値のみをプロットした。
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞およびｉＰＳＣにおける編集効率の間で高い相関があり、ピアソンの相関係数は全体で０．５１であった。そのため、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるスクリーニングは、本発明者らの目的の治療細胞株−ｉＰＳＣについての優れた代用物であると考えられた（図９）。
（実施例３０）
クローン欠失事象のクローン解析
ｉＰＳＣで２０％を超える切断効率を有するｇＲＮＡを、イントロン５５を除く目的の各イントロンで特定した。所望の欠失を生じる最も優れた切断効率を有する単一のｇＲＮＡを選択した。
２組のｇＲＮＡ対を、クローンΔ５２細胞株を創出するために使用した（１−ＳＰ−Ｉ５２＋２−ＳＰ−Ｉ５３および２−ＳＰ−Ｉ５２＋２−ＳＰ−Ｉ５３）。ＰＣＲ解析によりアクセスされるように、スクリーニングした２６１個の全クローンのうち、５７個は所望の欠失を有した（図１０Ａ、１０Ｃ）。
予測されるΔ５２欠失の存在を確認するために、目的の各クローンからのゲノムＤＮＡを回収した。欠失を挟むＰＣＲプライマーを設計した。欠失は小さかった（＜９００ｂｐ）ので、欠失を検出するために単一のプライマー対を使用することができた。これは、より小さな欠失バンド（約５００ｂｐ）または野生型（ＷＴ：ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ）バンド（約１０００ｂｐ）をもたらし得る。欠失（ｄｅｌ）または野生型（ＷＴ）生成物の代表的なゲルを、図１０Ａで示す。
欠失ＰＣＲ生成物をサンガーシークエンシングに供することにより、７つのクローンで欠失事象を確認した（７／７クローンは、予測された欠失事象を有し、小挿入および欠失を伴った）（図１１Ａ〜Ｂ）。７つのクローンからの欠失バンド（図８Ａで発生させたＰＣＲ）をゲル調製し、サンガーシークエンシングに供した。ｇＲＮＡ １−ＳＰ−Ｉ５２および２−ＳＰ−Ｉ５３を使用して創出した２つのクローンをシークエンシングし、予測される欠失生成物に整列させた（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９はｇＲＮＡの３’末端から３ＢＰを切断すると仮定して）（図１１Ａ）。ｇＲＮＡ ２−ＳＰ−Ｉ５２および２−ＳＰ−Ｉ５３を使用して創出した５つのクローンをシークエンシングし、予測される欠失生成物に整列させた（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９はｇＲＮＡの３’末端から３ＢＰを切断すると仮定して）（図１１Ｂ）。
同様に、２組のｇＲＮＡ対を、クローンΔ４４細胞株を創出するために使用した（２−ＳＰ−Ｉ４４＋３−ＳＰ−Ｉ４５および２−ＳＰ−Ｉ４４＋４−ＳＰ−Ｉ４５）。ＰＣＲ解析によりアクセスされるように、スクリーニングした２５６個の全クローンのうち、１６個は所望の欠失を有した（図１０Ｂ、１０Ｃ）。
予測されるΔ４４欠失の存在を確認するために、目的の各クローンからのゲノムＤＮＡを回収した。Δ４４ ｇＲＮＡは、Δ５２ ｇＲＮＡと比較してより大きな欠失を生成するので、欠失バンドまたはＷＴバンドのいずれかを検出するために、２組のＰＣＲプライマー対を設計した。予測される欠失バンドは約４００ｂｐであり、予測されるＷＴバンドは約５００ｂｐであった。欠失（ｄｅｌ）、野生型生成物（ＷＴ＋）、および野生型プライマーで増幅した陰性試料（ＷＴ−）の代表的なゲルを図１０Ｂに示す。
（実施例３１）
レンチウイルススクリーニング
エクソン５１スキッピングを誘導することができるｇＲＮＡ対の大きなスペクトルを特定するために、本発明者らは、ラージスケールレンチウイルススクリーニングを行った。イントロン５１およびイントロン５２ゲノム配列を、ｇＲＮＡ設計ソフトウェアを使用して解析に供した。得られたｇＲＮＡリストを、エクソン５１スプライスアクセプターに隣接する約３０００個の左ｇＲＮＡおよび３０００個の右ｇＲＮＡに狭めた。リストは、配列の固有性（ゲノム内のどこか他のところとの完全な適合を有しないｇＲＮＡのみをスクリーニングした）、および最小限の予測されるオフターゲットに基づいて狭めた。右ｇＲＮＡと対になった左ｇＲＮＡは、エクソン５１スキッピングを誘導するはずである。６０００個のｇＲＮＡを、Ｕ６プロモーターから目的の各ｇＲＮＡを発現し、ピューロマイシン耐性を与えるレンチウイルスベクターにクローニングした。Ｋ５６２細胞にＭＯＩ ２にてウイルスを形質導入し、ピューロマイシンで選択して、目的のｇＲＮＡを発現している細胞集団を得た。その後、これらの細胞にＣａｓ９ ｍＲＮＡを遺伝子導入して（ｎｕｃｌｅｏｆｅｔｅｄ）、一過性の切断期間を誘導した。７日後、これらの細胞をペレット化し、ゲノムＤＮＡを抽出した。ゲノムＤＮＡを、ハイブリッドキャプチャーを使用してエクソン５１の周囲の目的の領域について富化した。富化ＤＮＡを次世代シークエンシングに供した（図１９Ａ〜１９ＶＶ）。
（実施例３２）
ｉｎ ｖｉｔｒｏで転写される（ＩＶＴ）ｇＲＮＡスクリーニング
エクソン４５スキッピングを誘導することができるｇＲＮＡ対の大きなスペクトルを特定するために、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）ｇＲＮＡスクリーニングを行った。イントロン４５およびイントロン４６ゲノム配列を、ｇＲＮＡ設計ソフトウェアを使用して解析に供した。得られたｇＲＮＡリストを、配列の固有性（ゲノム内のどこか他のところとの完全な適合を有しないｇＲＮＡのみをスクリーニングした）、および最小限の予測されるオフターゲットに基づいて約１００個の左ｇＲＮＡおよび約１００個の右ｇＲＮＡのリストに狭めた。このｇＲＮＡの組をｉｎ ｖｉｔｒｏ転写し、メッセンジャーＭａｘを使用してＣａｓ９を安定に発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。細胞をトランスフェクション４８時間後に回収し、ゲノムＤＮＡを単離し、切断効率を、ＴＩＤＥ解析を使用して評価した（図１２Ａ〜Ｅ）。試験したｇＲＮＡの約１８％が５０％を超える切断効率を誘導したことが分かった。
（実施例３３）
ＤＭＤ遺伝子のエクソン４５〜５５間の部分的ｃＤＮＡノックイン
ＤＭＤ遺伝子を矯正するための別の手法は、部分的ｃＤＮＡノックインである。原理の証明として、ＤＭＤ遺伝子の領域エクソン４５〜５５を置きかえるための研究を行った（これは、ＤＭＤ患者の最大６２％を処置することができ得る）。エクソン４５〜５５のｃＤＮＡは、３．２ｋｂである。Ｔｒｉｌｉｎｋ社からの２固相合成ｇＲＮＡ［１つはエクソン４５（配列番号１４１０４４９）および２つ目はエクソン５５（配列番号１１４７３８）にある］を切断に使用した。２つのＴｒｉｌｉｎｋ社製ｇＲＮＡをＣａｓ９タンパク質と複合体形成させ、プラスミドドナーと共にｉＰＳＣに遺伝子導入した（ｎｕｃｌｅｏｆｅｔｅｄ）。プラスミドドナーは、エクソン４５〜５５部位への組み込みを誘導するために両側に１ｋｂホモロジーアームを伴う、ＧＦＰを構成的に発現する３．２ｋｂカセット（所望のｃＤＮＡノックインと同じサイズ）を有するように設計した。細胞を２３日間にわたり追跡した。全ての実験条件は、高効率で（６０％を超えて）遺伝子導入されたが、しかしながら、ドナーおよびｇＲＮＡを受容した細胞からのＧＦＰ発現のみが経時的に安定化し、ＨＤＲが細胞の約１６パーセントで起こったことを示した（図１３Ａ）。これらの試料からのゲノムＤＮＡを単離し、ドナー構築物の部位特異的統合について試験した。試料を、ＷＴ対立遺伝子または所望のノックイン対立遺伝子に特異的なプライマーで増幅した。予測されるように、ＷＴおよびノックイン対立遺伝子の両方を検出することができた（図１３Ｂ）。
（実施例３４）
内部欠失しているが、それでもなお機能的なジストロフィンタンパク質
概念の証明として、本発明者らが、ｉＰＳＣで編集し、編集した細胞のクローン集団を単離し、かつそれらの細胞を筋原性系列に分化させて、内部欠失しているが、それでもなお機能的なジストロフィンタンパク質を生成することができることを示した。
ＤＭＤ遺伝子を矯正するための１つの魅力的な方法は、Δ４５〜５５欠失を創出することである。この欠失は、ＤＭＤリーディングフレームを維持し、ＤＭＤ患者の約６２％でジストロフィン発現を修復することができる。所望のΔ４５〜５５欠失を創出するために、２つの公開されたＳＰ ｇＲＮＡ（ＣＲ６：配列番号１，４１０，４７５およびＣＲ３６：配列番号９１０３３）を、ＳＰ Ｃａｓ９ Ｔ２Ａ橙色蛍光タンパク質（ＯＦＰ：ｏｒａｎｇｅ ｆｌｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）もまた発現するプラスミドにクローニングした。
Figure 2019507579
これらの２つのプラスミドを、Ｍｉｒｕｓ ＬＴ１トランスフェクション試薬を使用して、ｉＰＳＣにコトランスフェクトした。２日後、ＯＦＰ発現により示されるＣａｓ９を発現している細胞を、蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ：ｆｌｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ）を使用して単離した。細胞を低密度で播種し、単一細胞クローンが皿に出現するまで７〜１０日間生育させた。これらのクローンを顕微鏡下で手作業にて採り、９６ウェルプレートに移した。細胞がコンフルエンスに達すると、試料を１：２で継代し、ゲノムＤＮＡを残りの細胞から単離した。
所望の欠失を有するクローンを特定するために、３プライマーＰＣＲアッセイを設計した（図１４Ａおよび１４Ｂ）。このアッセイは、同じＰＣＲ反応で野生型（ＷＴ）および欠失バンドの検出を可能にする。このアッセイを使用して、本発明者らは、編集事象を有する２６／１００クローンを特定した（図１４Ｃ）。
これらのクローンが所望のΔ４５〜５５欠失を有することをさらに確証するために、５つのクローンを、サンガーシークエンシングに供した。５つ全てが、所望の欠失事象を有することが確認された。１つのクローンは挿入を有し、１つは単一塩基対欠失を有した。他の３つのクローンは、完全な欠失事象を含有した（図１５）。
また、シークエンシングした全ての５つのクローンを、核型分析に供し、核型分析的に正常であることが分かった。さらに、全てのクローンは多能性を維持し、ＳＳＥＡ−４およびＴＲＡ−１６０の両方について９９％を超えて陽性染色された（図１６Ａ〜Ｂ）。
その後、公開されたChalらのプロトコール［Chalら（２０１５年）Differentiation of Pluripotent stem cells to muscle fiber to model Duchenne Muscular Dystrophy、Nature Biotechnology］を使用して、クローンのうちの４つを筋管（mytotubes）に分化させて、ジストロフィン発現を誘導した。ウェスタンブロットおよび免疫組織化学のために試料を回収した。全ての５つの編集済みクローンは、内部欠失ジストロフィンタンパク質の発現を誘導した（図１７）。これらのサイズを、ＷＴジストロフィンタンパク質またはΔ４５〜５５ジストロフィンタンパク質のいずれかを発現する対照ｃＤＮＡプラスミドをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞から単離したタンパク質と比較した。分化細胞は、ミオシン重鎖染色により示されるように、表現型として筋管を生成した。分化したクローン５６の代表的な画像を図１８に示す。
例示的な態様についての注釈
本開示は、本発明の様々な態様および／またはその潜在的可能性がある適用を例示する目的のために様々な特定の態様の説明を提供するが、変形および改変が当業者に想起されることが理解される。したがって、本明細書で説明する発明（単数）または発明（複数）は、少なくともそれらが請求されるのと同程度に広いものであり、本明細書で提供される特定の例示的な態様により、より狭く定義されるものではないと理解されるべきである。
本明細書で特定される任意の特許、刊行物、または他の開示材料は、別に示されない限り、組み込まれる材料が本明細書で明白に示される存在する説明、定義、記述、または他の開示材料と矛盾しない限り、その全体が本明細書に参照により組み込まれる。そのため、および必要な限り、本明細書で示される明らかな開示は、参照により組み込まれる任意の矛盾する材料に取って代わる。本明細書に参照により組み込まれると述べられているが、本明細書で示される存在する定義、記述、または他の開示材料と矛盾する任意の材料またはその部分は、その組み込まれる材料と存在する開示材料との間で矛盾が生じない限りにおいてのみ組み込まれる。出願人らは、本明細書に参照により組み込まれる、任意の主題またはその部分を明白に列挙するために、本明細書を訂正する権利を有する。

Claims (88)

  1. ヒト細胞内のジストロフィン遺伝子を、ゲノム編集により編集するための方法であって、前記ヒト細胞へと、１または複数のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼを導入するステップであって、前記ジストロフィン遺伝子内またはその近傍に、１または複数の一本鎖切断（ＳＳＢ）または二本鎖切断（ＤＳＢ）であって、前記ジストロフィン遺伝子内またはその近傍に、１もしくは複数のエクソン、または異常なイントロンのスプライスアクセプターもしくはドナー部位の恒久的な欠失、挿入、または置きかえをもたらし、ジストロフィンのリーディングフレームの修復、およびジストロフィンタンパク質の活性の修復をもたらすＳＳＢまたはＤＳＢを生じさせるステップを含む方法。
  2. 前記ヒト細胞が、筋細胞または筋前駆細胞である、請求項１に記載の方法。
  3. デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）を伴う患者を処置するためのｅｘ ｖｉｖｏ方法であって、
    ｉ）ＤＭＤ患者特異的な誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を創出するステップと；
    ｉｉ）前記ｉＰＳＣのジストロフィン遺伝子内またはその近傍で編集するステップと；
    ｉｉｉ）ゲノム編集されたｉＰＳＣを、Ｐａｘ７＋筋始原細胞へと分化させるステップと；
    ｉｖ）前記Ｐａｘ７＋筋始原細胞を、前記患者へと植え込むステップと
    を含むｅｘ ｖｉｖｏ方法。
  4. 前記創出するステップが、
    ａ）体細胞を、前記患者から単離することと；
    ｂ）多能性関連遺伝子のセットを、前記体細胞へと導入することであって、前記体細胞が多能性幹細胞となるように誘導することと
    を含む、請求項３に記載の方法。
  5. 前記体細胞が、線維芽細胞である、請求項４に記載の方法。
  6. 前記多能性関連遺伝子のセットが、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、Ｌｉｎ２８、ＮＡＮＯＧ、およびｃＭＹＣからなる群から選択される遺伝子のうちの１または複数である、請求項４に記載の方法。
  7. 前記編集するステップが、前記ｉＰＳＣへと、１または複数のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼを導入することであって、前記ジストロフィン遺伝子内またはその近傍に、１または複数の一本鎖切断（ＳＳＢ）または二本鎖切断（ＤＳＢ）であって、前記ジストロフィン遺伝子内またはその近傍に、１もしくは複数のエクソン、または異常なイントロンのスプライスアクセプターもしくはドナー部位の恒久的な欠失、挿入、または置きかえをもたらし、ジストロフィンのリーディングフレームの修復、およびジストロフィンタンパク質の活性の修復をもたらすＳＳＢまたはＤＳＢを生じさせることを含む、請求項３から６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 前記分化させるステップが、前記ゲノム編集されたｉＰＳＣを、Ｐａｘ７＋筋始原細胞へと分化させるように、以下：前記ゲノム編集されたｉＰＳＣを、低分子薬物を含む特異的培地処方物と接触させること；トランス遺伝子の過剰発現；または血清枯渇のうちの１または複数を含む、請求項３から７のいずれか一項に記載の方法。
  9. 前記植え込むステップが、所望の筋肉への局所注射により、前記Ｐａｘ７＋筋始原細胞を、前記患者へと植え込むことを含む、請求項３から８のいずれか一項に記載の方法。
  10. デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）を伴う患者を処置するためのｉｎ ｖｉｖｏ方法であって、前記患者の細胞内のジストロフィン遺伝子を編集するステップを含むｉｎ ｖｉｖｏ方法。
  11. 前記編集するステップが、前記患者の前記細胞へと、１または複数のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼを導入することであって、前記ジストロフィン遺伝子内またはその近傍に、１または複数の一本鎖切断（ＳＳＢ）または二本鎖切断（ＤＳＢ）であって、前記ジストロフィン遺伝子内またはその近傍に、１もしくは複数のエクソン、または異常なイントロンのスプライスアクセプターもしくはドナー部位の恒久的な欠失、挿入、または置きかえをもたらし、ジストロフィンのリーディングフレームの修復、およびジストロフィンタンパク質の活性の修復をもたらすＳＳＢまたはＤＳＢを生じさせることを含む、請求項１０に記載の方法。
  12. 前記細胞が、筋細胞または筋前駆細胞である、請求項１１に記載の方法。
  13. 前記１または複数のＤＮＡエンドヌクレアーゼが、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（また、Ｃｓｎ１およびＣｓｘ１２としても公知である）、Ｃａｓ１００、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、もしくはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼ；これらの相同体、これらの天然に存在する分子の組換え体、これらのコドン最適化体、またはこれらの修飾形、およびこれらの組合せである、請求項１、７、または１１のいずれか一項に記載の方法。
  14. 前記細胞へと、前記１または複数のＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする、１または複数のポリヌクレオチドを導入するステップを含む、請求項１３に記載の方法。
  15. 前記細胞へと、前記１または複数のＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする、１または複数のリボ核酸（ＲＮＡ）を導入するステップを含む、請求項１３に記載の方法。
  16. 前記１もしくは複数のポリヌクレオチド、または１もしくは複数のＲＮＡが、１もしくは複数の修飾ポリヌクレオチド、または１もしくは複数の修飾ＲＮＡである、請求項１４または１５に記載の方法。
  17. 前記１または複数のＤＮＡエンドヌクレアーゼが、１または複数のタンパク質またはポリペプチドである、請求項１３に記載の方法。
  18. 前記細胞へと、１または複数のガイドリボ核酸（ｇＲＮＡ）を導入するステップをさらに含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
  19. 前記１または複数のｇＲＮＡが、単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である、請求項１８に記載の方法。
  20. 前記１もしくは複数のｇＲＮＡ、または１もしくは複数のｓｇＲＮＡが、１もしくは複数の修飾ｇＲＮＡ、または１もしくは複数の修飾ｓｇＲＮＡである、請求項１８または１９に記載の方法。
  21. 前記１または複数のＤＮＡエンドヌクレアーゼを、１もしくは複数のｇＲＮＡ、または１もしくは複数のｓｇＲＮＡとあらかじめ複合体化させる、請求項１８から２０のいずれか一項に記載の方法。
  22. 前記細胞へと、野生型ジストロフィンの遺伝子またはｃＤＮＡの少なくとも一部分を含むポリヌクレオチドドナー鋳型を導入するステップをさらに含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
  23. 前記野生型ジストロフィンの遺伝子またはｃＤＮＡの前記少なくとも一部分が、エクソン１、エクソン２、エクソン３、エクソン４、エクソン５、エクソン６、エクソン７、エクソン８、エクソン９、エクソン１０、エクソン１１、エクソン１２、エクソン１３、エクソン１４、エクソン１５、エクソン１６、エクソン１７、エクソン１８、エクソン１９、エクソン２０、エクソン２１、エクソン２２、エクソン２３、エクソン２４、エクソン２５、エクソン２６、エクソン２７、エクソン２８、エクソン２９、エクソン３０、エクソン３１、エクソン３２、エクソン３３、エクソン３４、エクソン３５、エクソン３６、エクソン３７、エクソン３８、エクソン３９、エクソン４０、エクソン４１、エクソン４２、エクソン４３、エクソン４４、エクソン４５、エクソン４６、エクソン４７、エクソン４８、エクソン４９、エクソン５０、エクソン５１、エクソン５２、エクソン５３、エクソン５４、エクソン５５、エクソン５６、エクソン５７、エクソン５８、エクソン５９、エクソン６０、エクソン６１、エクソン６２、エクソン６３、エクソン６４、エクソン６５、エクソン６６、エクソン６７、エクソン６８、エクソン６９、エクソン７０、エクソン７１、エクソン７２、エクソン７３、エクソン７４、エクソン７５、エクソン７６、エクソン７７、エクソン７８、エクソン７９、イントロン領域、合成イントロン領域、断片、これらの組合せ、またはジストロフィン遺伝子もしくはｃＤＮＡ全体の少なくとも一部を含む、請求項２２に記載の方法。
  24. 前記野生型ジストロフィンの遺伝子またはｃＤＮＡの前記少なくとも一部分が、エクソン１、エクソン２、エクソン３、エクソン４、エクソン５、エクソン６、エクソン７、エクソン８、エクソン９、エクソン１０、エクソン１１、エクソン１２、エクソン１３、エクソン１４、エクソン１５、エクソン１６、エクソン１７、エクソン１８、エクソン１９、エクソン２０、エクソン２１、エクソン２２、エクソン２３、エクソン２４、エクソン２５、エクソン２６、エクソン２７、エクソン２８、エクソン２９、エクソン３０、エクソン３１、エクソン３２、エクソン３３、エクソン３４、エクソン３５、エクソン３６、エクソン３７、エクソン３８、エクソン３９、エクソン４０、エクソン４１、エクソン４２、エクソン４３、エクソン４４、エクソン４５、エクソン４６、エクソン４７、エクソン４８、エクソン４９、エクソン５０、エクソン５１、エクソン５２、エクソン５３、エクソン５４、エクソン５５、エクソン５６、エクソン５７、エクソン５８、エクソン５９、エクソン６０、エクソン６１、エクソン６２、エクソン６３、エクソン６４、エクソン６５、エクソン６６、エクソン６７、エクソン６８、エクソン６９、エクソン７０、エクソン７１、エクソン７２、エクソン７３、エクソン７４、エクソン７５、エクソン７６、エクソン７７、エクソン７８、エクソン７９、イントロン領域、合成イントロン領域、断片、これらの組合せ、またはジストロフィン遺伝子もしくはｃＤＮＡ全体を含む、請求項２２に記載の方法。
  25. 前記ドナー鋳型が、一本鎖または二本鎖ポリヌクレオチドである、請求項２２から２４のいずれか一項に記載の方法。
  26. 前記細胞へと、１または複数のガイドリボ核酸（ｇＲＮＡ）を導入するステップをさらに含み、前記１または複数のＤＮＡエンドヌクレアーゼが、５’ローカスにおける第１のＳＳＢまたはＤＳＢによる切断、および３’ローカスにおける第２のＳＳＢまたはＤＳＢによる切断である１対の一本鎖切断（ＳＳＢ）または二本鎖切断（ＤＳＢ）であって、前記ジストロフィン遺伝子内またはその近傍の前記５’ローカスと前記３’ローカスとの間に、１もしくは複数のエクソン、または異常なイントロンのスプライスアクセプターもしくはドナー部位の恒久的な欠失または置きかえをもたらし、前記ジストロフィンのリーディングフレームの修復、および前記ジストロフィンタンパク質の活性の修復をもたらすＳＳＢまたはＤＳＢを生じさせる１または複数のＣａｓ９またはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼである、請求項１、７、または１１のいずれか一項に記載の方法。
  27. １つのｇＲＮＡが、１対のＳＳＢまたはＤＳＢを創出する、請求項２６に記載の方法。
  28. １つのｇＲＮＡが、前記５’ローカス、前記３’ローカス、または前記５’ローカスと３’ローカスとの間のセグメントと相補的であるスペーサー配列を含む、請求項２６に記載の方法。
  29. 第１のｇＲＮＡおよび第２のｇＲＮＡを含み、前記第１のｇＲＮＡが、前記５’ローカスのセグメントと相補的であるスペーサー配列を含み、前記第２のｇＲＮＡが、前記３’ローカスのセグメントと相補的であるスペーサー配列を含む、請求項２６に記載の方法。
  30. 前記１または複数のｇＲＮＡが、１または複数の単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である、請求項２６から２９のいずれか一項に記載の方法。
  31. 前記１もしくは複数のｇＲＮＡ、または１もしくは複数のｓｇＲＮＡが、１もしくは複数の修飾ｇＲＮＡ、または１もしくは複数の修飾ｓｇＲＮＡである、請求項２６から３０のいずれか一項に記載の方法。
  32. 前記１または複数のＤＮＡエンドヌクレアーゼを、１もしくは複数のｇＲＮＡ、または１もしくは複数のｓｇＲＮＡとあらかじめ複合体化させる、請求項２６から３１のいずれか一項に記載の方法。
  33. 前記５’ローカスと前記３’ローカスとの間に染色体ＤＮＡの欠失が存在する、請求項２６から３２のいずれか一項に記載の方法。
  34. 前記欠失が、単一エクソンの欠失である、請求項２６から３３のいずれか一項に記載の方法。
  35. 前記単一エクソンの欠失が、エクソン２、エクソン８、エクソン４３、エクソン４４、エクソン４５、エクソン４６、エクソン５０、エクソン５１、エクソン５２、またはエクソン５３の欠失である、請求項３４に記載の方法。
  36. 前記５’ローカスが、エクソン２、エクソン８、エクソン４３、エクソン４４、エクソン４５、エクソン４６、エクソン５０、エクソン５１、エクソン５２、およびエクソン５３からなる群から選択される単一エクソンの５’境界部に対して近位である、請求項３４から３５のいずれか一項に記載の方法。
  37. 前記３’ローカスが、エクソン２、エクソン８、エクソン４３、エクソン４４、エクソン４５、エクソン４６、エクソン５０、エクソン５１、エクソン５２、およびエクソン５３からなる群から選択される単一エクソンの３’境界部に対して近位である、請求項３４から３６のいずれか一項に記載の方法。
  38. 前記５’ローカスが、エクソン２、エクソン８、エクソン４３、エクソン４４、エクソン４５、エクソン４６、エクソン５０、エクソン５１、エクソン５２、およびエクソン５３からなる群から選択される単一エクソンの５’境界部に対して近位であり、前記３’ローカスが、これらの前記３’境界部に対して近位である、請求項３４から３７のいずれか一項に記載の方法。
  39. 前記エクソンの前記境界部に対する近位が、隣接イントロンの周囲のスプライスドナーおよびアクセプターを含む、請求項３６から３８のいずれか一項に記載の方法。
  40. 前記欠失が、マルチエクソンの欠失である、請求項２６から３３のいずれか一項に記載の方法。
  41. 前記マルチエクソンの欠失が、エクソン４５〜５３またはエクソン４５〜５５の欠失である、請求項４０に記載の方法。
  42. 前記５’ローカスが、エクソン４５〜５３およびエクソン４５〜５５からなる群から選択される複数のエクソンの５’境界部に対して近位である、請求項４０から４１のいずれか一項に記載の方法。
  43. 前記３’ローカスが、エクソン４５〜５３およびエクソン４５〜５５からなる群から選択される複数のエクソンの３’境界部に対して近位である、請求項４０から４２のいずれか一項に記載の方法。
  44. 前記５’ローカスが、エクソン４５〜５３およびエクソン４５〜５５からなる群から選択される複数のエクソンの５’境界部に対して近位であり、３’ローカスが、これらの３’境界部に対して近位である、請求項４０から４３のいずれか一項に記載の方法。
  45. 前記エクソンの前記境界部に対する近位が、隣接イントロンの周囲のスプライスドナーおよびアクセプターを含む、請求項４２から４４のいずれか一項に記載の方法。
  46. 前記５’ローカスと前記３’ローカスとの間に染色体ＤＮＡの置きかえが存在する、請求項２６から３２のいずれか一項に記載の方法。
  47. 前記置きかえが、単一エクソンの置きかえである、請求項２６から３２または４６のいずれか一項に記載の方法。
  48. 前記単一エクソンの置きかえが、エクソン２、エクソン８、エクソン４３、エクソン４４、エクソン４５、エクソン４６、エクソン５０、エクソン５１、エクソン５２、エクソン５３、またはエクソン７０の置きかえである、請求項２６から３２または４６から４７のいずれか一項に記載の方法。
  49. 前記５’ローカスが、エクソン２、エクソン８、エクソン４３、エクソン４４、エクソン４５、エクソン４６、エクソン５０、エクソン５１、エクソン５２、エクソン５３、またはエクソン７０からなる群から選択される単一エクソンの５’境界部に対して近位である、請求項４７から４８のいずれか一項に記載の方法。
  50. 前記３’ローカスが、エクソン２、エクソン８、エクソン４３、エクソン４４、エクソン４５、エクソン４６、エクソン５０、エクソン５１、エクソン５２、エクソン５３、またはエクソン７０からなる群から選択される単一エクソンの３’境界部に対して近位である、請求項４７から４９のいずれか一項に記載の方法。
  51. 前記５’ローカスが、エクソン２、エクソン８、エクソン４３、エクソン４４、エクソン４５、エクソン４６、エクソン５０、エクソン５１、エクソン５２、エクソン５３、またはエクソン７０からなる群から選択される単一エクソンの５’境界部に対して近位であり、３’ローカスが、これらの３’境界部に対して近位である、請求項４７から５０のいずれか一項に記載の方法。
  52. 前記エクソンの前記境界部に対する近位が、隣接イントロンまたは隣接エクソンの周囲のスプライスドナーおよびアクセプターを含む、請求項４９から５１のいずれか一項に記載の方法。
  53. 前記置きかえが、マルチエクソンの置きかえである、請求項２６から３２または４６のいずれか一項に記載の方法。
  54. 前記マルチエクソンの置きかえが、エクソン４５〜５３またはエクソン４５〜５５の置きかえである、請求項５３に記載の方法。
  55. 前記５’ローカスが、エクソン４５〜５３およびエクソン４５〜５５からなる群から選択される複数のエクソンの５’境界部に対して近位である、請求項５３から５４のいずれか一項に記載の方法。
  56. 前記３’ローカスが、エクソン４５〜５３およびエクソン４５〜５５からなる群から選択される複数のエクソンの３’境界部に対して近位である、請求項５３から５５のいずれか一項に記載の方法。
  57. 前記５’ローカスが、エクソン４５〜５３およびエクソン４５〜５５からなる群から選択される複数のエクソンの５’境界部に対して近位であり、３’ローカスが、これらの３’境界部に対して近位である、請求項５３から５６のいずれか一項に記載の方法。
  58. 前記エクソンの前記境界部に対する近位が、隣接イントロンの周囲のスプライスドナーおよびアクセプターを含む、請求項５５から５７のいずれか一項に記載の方法。
  59. 前記細胞へと、野生型ジストロフィンの遺伝子またはｃＤＮＡの少なくとも一部分を含むポリヌクレオチドドナー鋳型を導入するステップをさらに含み、前記置きかえが、相同性により導かれる修復（ＨＤＲ）によるものである、請求項４６から５８のいずれか一項に記載の方法。
  60. 前記野生型ジストロフィンの遺伝子またはｃＤＮＡの前記少なくとも一部分が、エクソン１、エクソン２、エクソン３、エクソン４、エクソン５、エクソン６、エクソン７、エクソン８、エクソン９、エクソン１０、エクソン１１、エクソン１２、エクソン１３、エクソン１４、エクソン１５、エクソン１６、エクソン１７、エクソン１８、エクソン１９、エクソン２０、エクソン２１、エクソン２２、エクソン２３、エクソン２４、エクソン２５、エクソン２６、エクソン２７、エクソン２８、エクソン２９、エクソン３０、エクソン３１、エクソン３２、エクソン３３、エクソン３４、エクソン３５、エクソン３６、エクソン３７、エクソン３８、エクソン３９、エクソン４０、エクソン４１、エクソン４２、エクソン４３、エクソン４４、エクソン４５、エクソン４６、エクソン４７、エクソン４８、エクソン４９、エクソン５０、エクソン５１、エクソン５２、エクソン５３、エクソン５４、エクソン５５、エクソン５６、エクソン５７、エクソン５８、エクソン５９、エクソン６０、エクソン６１、エクソン６２、エクソン６３、エクソン６４、エクソン６５、エクソン６６、エクソン６７、エクソン６８、エクソン６９、エクソン７０、エクソン７１、エクソン７２、エクソン７３、エクソン７４、エクソン７５、エクソン７６、エクソン７７、エクソン７８、エクソン７９、イントロン領域、合成イントロン領域、断片、これらの組合せ、またはジストロフィン遺伝子もしくはｃＤＮＡ全体の少なくとも一部を含む、請求項５９に記載の方法。
  61. 前記野生型ジストロフィンの遺伝子またはｃＤＮＡの前記少なくとも一部分が、エクソン１、エクソン２、エクソン３、エクソン４、エクソン５、エクソン６、エクソン７、エクソン８、エクソン９、エクソン１０、エクソン１１、エクソン１２、エクソン１３、エクソン１４、エクソン１５、エクソン１６、エクソン１７、エクソン１８、エクソン１９、エクソン２０、エクソン２１、エクソン２２、エクソン２３、エクソン２４、エクソン２５、エクソン２６、エクソン２７、エクソン２８、エクソン２９、エクソン３０、エクソン３１、エクソン３２、エクソン３３、エクソン３４、エクソン３５、エクソン３６、エクソン３７、エクソン３８、エクソン３９、エクソン４０、エクソン４１、エクソン４２、エクソン４３、エクソン４４、エクソン４５、エクソン４６、エクソン４７、エクソン４８、エクソン４９、エクソン５０、エクソン５１、エクソン５２、エクソン５３、エクソン５４、エクソン５５、エクソン５６、エクソン５７、エクソン５８、エクソン５９、エクソン６０、エクソン６１、エクソン６２、エクソン６３、エクソン６４、エクソン６５、エクソン６６、エクソン６７、エクソン６８、エクソン６９、エクソン７０、エクソン７１、エクソン７２、エクソン７３、エクソン７４、エクソン７５、エクソン７６、エクソン７７、エクソン７８、エクソン７９、イントロン領域、合成イントロン領域、断片、これらの組合せ、またはジストロフィン遺伝子もしくはｃＤＮＡ全体を含む、請求項５９に記載の方法。
  62. 前記細胞へと、１つのガイドリボ核酸（ｇＲＮＡ）と、野生型ジストロフィンの遺伝子の少なくとも一部分を含むポリヌクレオチドドナー鋳型とを導入するステップをさらに含み、前記１または複数のＤＮＡエンドヌクレアーゼが、前記ジストロフィン遺伝子内またはその近傍のローカスに、前記ポリヌクレオチドドナー鋳型に由来する新たな配列の、前記ローカスにおける染色体ＤＮＡへの挿入を容易とする１つの一本鎖切断（ＳＳＢ）または二本鎖切断（ＤＳＢ）であって、前記ジストロフィン遺伝子内またはその近傍に、１もしくは複数のエクソン、または異常なイントロンのスプライスアクセプターもしくはドナー部位の恒久的な挿入または矯正をもたらし、前記ジストロフィンのリーディングフレームの修復、および前記ジストロフィンタンパク質の活性の修復をもたらすＳＳＢまたはＤＳＢを生じさせる１または複数のＣａｓ９またはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼであり、前記ｇＲＮＡが、前記ローカスのセグメントと相補的であるスペーサー配列を含む、請求項１、７、または１１のいずれか一項に記載の方法。
  63. 前記細胞へと、１または複数のガイドリボ核酸（ｇＲＮＡ）と、野生型ジストロフィンの遺伝子の少なくとも一部分を含むポリヌクレオチドドナー鋳型とを導入するステップをさらに含み、前記１または複数のＤＮＡエンドヌクレアーゼが、前記ジストロフィン遺伝子内またはその近傍に、前記ポリヌクレオチドドナー鋳型に由来する新たな配列の、５’ローカスと３’ローカスとの間における染色体ＤＮＡへの挿入を容易とする、前記５’ローカスにおける第１の切断、および前記３’ローカスにおける第２の切断である１対の一本鎖切断（ＳＳＢ）または二本鎖切断（ＤＳＢ）であって、前記ジストロフィン遺伝子内またはその近傍の前記５’ローカスと前記３’ローカスとの間に、１もしくは複数のエクソン、または異常なイントロンのスプライスアクセプターもしくはドナー部位の恒久的な挿入または矯正をもたらし、前記ジストロフィンのリーディングフレームの修復、および前記ジストロフィンタンパク質の活性の修復をもたらすＳＳＢまたはＤＳＢを生じさせる１または複数のＣａｓ９またはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼである、請求項１、７、または１１のいずれか一項に記載の方法。
  64. １つのｇＲＮＡが、１対のＳＳＢまたはＤＳＢを創出する、請求項６３に記載の方法。
  65. １つのｇＲＮＡが、前記５’ローカス、前記３’ローカス、または前記５’ローカスと前記３’ローカスとの間のセグメントと相補的であるスペーサー配列を含む、請求項６３に記載の方法。
  66. 第１のｇＲＮＡおよび第２のｇＲＮＡを含み、前記第１のｇＲＮＡが、前記５’ローカスのセグメントと相補的であるスペーサー配列を含み、前記第２のｇＲＮＡが、前記３’ローカスのセグメントと相補的であるスペーサー配列を含む、請求項６３に記載の方法。
  67. 前記１または複数のｇＲＮＡが、１または複数の単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である、請求項６２または６３に記載の方法。
  68. 前記１もしくは複数のｇＲＮＡ、または１もしくは複数のｓｇＲＮＡが、１もしくは複数の修飾ｇＲＮＡ、または１もしくは複数の修飾ｓｇＲＮＡである、請求項６２から６３または６７のいずれか一項に記載の方法。
  69. 前記１または複数のＤＮＡエンドヌクレアーゼを、１もしくは複数のｇＲＮＡ、または１もしくは複数のｓｇＲＮＡとあらかじめ複合体化させる、請求項６２から６３または６７から６８のいずれか一項に記載の方法。
  70. 前記挿入が、単一エクソンの挿入である、請求項６２から６９のいずれか一項に記載の方法。
  71. 前記単一エクソンの挿入が、エクソン２、エクソン８、エクソン４３、エクソン４４、エクソン４５、エクソン４６、エクソン５０、エクソン５１、エクソン５２、エクソン５３、またはエクソン７０の挿入である、請求項７０に記載の方法。
  72. 前記ローカス、５’ローカスまたは３’ローカスが、エクソン２、エクソン８、エクソン４３、エクソン４４、エクソン４５、エクソン４６、エクソン５０、エクソン５１、エクソン５２、エクソン５３、およびエクソン７０からなる群から選択される単一エクソンの境界部に対して近位である、請求項７０から７１のいずれか一項に記載の方法。
  73. 前記エクソンの前記境界部に対する近位が、隣接イントロンまたは隣接エクソンの周囲のスプライスドナーおよびアクセプターを含む、請求項７２に記載の方法。
  74. 前記挿入が、マルチエクソンの挿入である、請求項６２から６９のいずれか一項に記載の方法。
  75. 前記マルチエクソンの挿入が、エクソン４５〜５３またはエクソン４５〜５５の挿入である、請求項７４に記載の方法。
  76. 前記ローカス、５’ローカスまたは３’ローカスが、エクソン４５〜５３またはエクソン４５〜５５からなる群から選択されるマルチエクソンの境界部に対して近位である、請求項７４から７５のいずれか一項に記載の方法。
  77. 前記エクソンの前記境界部に対する近位が、隣接イントロンの周囲のスプライスドナーおよびアクセプターを含む、請求項７６に記載の方法。
  78. 前記野生型ジストロフィンの遺伝子またはｃＤＮＡの少なくとも一部分が、エクソン１、エクソン２、エクソン３、エクソン４、エクソン５、エクソン６、エクソン７、エクソン８、エクソン９、エクソン１０、エクソン１１、エクソン１２、エクソン１３、エクソン１４、エクソン１５、エクソン１６、エクソン１７、エクソン１８、エクソン１９、エクソン２０、エクソン２１、エクソン２２、エクソン２３、エクソン２４、エクソン２５、エクソン２６、エクソン２７、エクソン２８、エクソン２９、エクソン３０、エクソン３１、エクソン３２、エクソン３３、エクソン３４、エクソン３５、エクソン３６、エクソン３７、エクソン３８、エクソン３９、エクソン４０、エクソン４１、エクソン４２、エクソン４３、エクソン４４、エクソン４５、エクソン４６、エクソン４７、エクソン４８、エクソン４９、エクソン５０、エクソン５１、エクソン５２、エクソン５３、エクソン５４、エクソン５５、エクソン５６、エクソン５７、エクソン５８、エクソン５９、エクソン６０、エクソン６１、エクソン６２、エクソン６３、エクソン６４、エクソン６５、エクソン６６、エクソン６７、エクソン６８、エクソン６９、エクソン７０、エクソン７１、エクソン７２、エクソン７３、エクソン７４、エクソン７５、エクソン７６、エクソン７７、エクソン７８、エクソン７９、イントロン領域、合成イントロン領域、断片、これらの組合せ、またはジストロフィン遺伝子もしくはｃＤＮＡ全体の少なくとも一部を含む、請求項６２または６３に記載の方法。
  79. 前記野生型ジストロフィンの遺伝子またはｃＤＮＡの少なくとも一部分が、エクソン１、エクソン２、エクソン３、エクソン４、エクソン５、エクソン６、エクソン７、エクソン８、エクソン９、エクソン１０、エクソン１１、エクソン１２、エクソン１３、エクソン１４、エクソン１５、エクソン１６、エクソン１７、エクソン１８、エクソン１９、エクソン２０、エクソン２１、エクソン２２、エクソン２３、エクソン２４、エクソン２５、エクソン２６、エクソン２７、エクソン２８、エクソン２９、エクソン３０、エクソン３１、エクソン３２、エクソン３３、エクソン３４、エクソン３５、エクソン３６、エクソン３７、エクソン３８、エクソン３９、エクソン４０、エクソン４１、エクソン４２、エクソン４３、エクソン４４、エクソン４５、エクソン４６、エクソン４７、エクソン４８、エクソン４９、エクソン５０、エクソン５１、エクソン５２、エクソン５３、エクソン５４、エクソン５５、エクソン５６、エクソン５７、エクソン５８、エクソン５９、エクソン６０、エクソン６１、エクソン６２、エクソン６３、エクソン６４、エクソン６５、エクソン６６、エクソン６７、エクソン６８、エクソン６９、エクソン７０、エクソン７１、エクソン７２、エクソン７３、エクソン７４、エクソン７５、エクソン７６、エクソン７７、エクソン７８、エクソン７９、イントロン領域、合成イントロン領域、断片、これらの組合せ、またはジストロフィン遺伝子もしくはｃＤＮＡ全体を含む、請求項６２または６３に記載の方法。
  80. 前記挿入が、相同性により導かれる修復（ＨＤＲ）によるものである、請求項６２から７９のいずれか一項に記載の方法。
  81. 前記ドナー鋳型が、一本鎖または二本鎖ポリヌクレオチドである、請求項６２から８０のいずれか一項に記載の方法。
  82. 前記Ｃａｓ９またはＣｐｆ１の、ｍＲＮＡ、ｇＲＮＡ、およびドナー鋳型を、各々別個の脂質ナノ粒子へと製剤化するか、またはこれらの全てを、脂質ナノ粒子へと共製剤化する、請求項２６から８１のいずれか一項に記載の方法。
  83. 前記Ｃａｓ９またはＣｐｆ１のｍＲＮＡを、脂質ナノ粒子へと製剤化し、前記ｇＲＮＡおよびドナー鋳型の両方を、前記細胞へと、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターにより送達する、請求項２６から８１のいずれか一項に記載の方法。
  84. 前記Ｃａｓ９またはＣｐｆ１のｍＲＮＡを、脂質ナノ粒子へと製剤化し、前記ｇＲＮＡを、前記細胞へと、電気穿孔により送達し、ドナー鋳型を、前記細胞へと、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターにより送達する、請求項２６から８１のいずれか一項に記載の方法。
  85. 前記ジストロフィン遺伝子が、Ｘ染色体：３１，１１７，２２８〜３３，３４４，６０９（Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ：ＧＲＣｈ３８／ｈｇ３８）に位置する、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
  86. デュシェンヌ型筋ジストロフィーを伴う患者に由来する細胞内のジストロフィン遺伝子を編集するための、１または複数のガイドリボ核酸（ｇＲＮＡ）であって、配列表の配列番号１〜１，４１０，４７２内の核酸配列からなる群から選択されるスペーサー配列を含む、１または複数のｇＲＮＡ。
  87. １または複数の単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である、請求項８６に記載の、１または複数のｇＲＮＡ。
  88. 前記１もしくは複数のｇＲＮＡ、または１もしくは複数のｓｇＲＮＡが、１もしくは複数の修飾ｇＲＮＡ、または１もしくは複数の修飾ｓｇＲＮＡである、請求項８６または８７に記載の、１または複数のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡ。
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