CN108513546A - 用于治疗杜氏肌营养不良症的材料和方法 - Google Patents

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Abstract

本申请提供了用于离体和在体内治疗患有杜氏肌营养不良症(DMD)的患者的材料和方法。另外，本申请提供了通过基因组编辑来编辑细胞中的肌营养不良蛋白基因的材料和方法。

Description

用于治疗杜氏肌营养不良症的材料和方法
技术领域
本申请提供了用于离体和在体内治疗杜氏肌营养不良症(Duchenne MuscularDystrophy，DMD)患者的材料和方法。另外，本申请提供了通过基因组编辑来编辑细胞中的肌营养不良蛋白基因的材料和方法。
相关申请
本申请要求2015年10月28日递交的美国临时申请No.62/247,484和2016年4月18日递交的美国临时申请No.62/324,064的权益，这两个申请通过引用整体并入本文。
通过引用并入序列表
本申请包含计算机可读形式的序列表(文件名：160101PCT序列表_ST25：286,928,896字节-ASCII文本文件；2016年10月28日生成)，其通过引用整体并入本文并形成本公开的一部分。
背景
杜氏肌营养不良症(DMD)是一种严重的X连锁隐性神经肌肉障碍，约在4000名活的男新生儿中产生1例。患者通常在4岁之前被诊断出，并且在10岁之前就依赖于轮椅。大多数患者由于心脏和/或呼吸衰竭而不能活到25岁以上。现有的治疗充其量是姑息治疗。DMD的最常见治疗是类固醇，其用于减缓肌肉力量的丧失。然而，因为大多数DMD患者在生命早期开始接受类固醇，所以治疗延迟了***，并进一步促使患者的生活质量下降。
DMD由肌营养不良蛋白(dystrophin)基因(染色体X：31,117,228-33,344,609(基因组参***–GRCh38/hg38))中的突变引起。由于基因组区域长度超过2.2百万碱基，所以肌营养不良蛋白基因是第二大人类基因。肌营养不良蛋白基因含有79个外显子，这些外显子被加工成11000个碱基对的mRNA，所述mRNA被翻译成427kDa的蛋白质。在功能上，肌营养不良蛋白充当肌动蛋白微丝和肌纤维内的细胞外基质之间的接头。肌营养不良蛋白的N末端是肌动蛋白结合结构域，而C末端与跨膜支架相互作用，所述跨膜支架将肌纤维锚定到细胞外基质。在肌肉收缩时，肌营养不良蛋白提供结构支撑，从而允许肌肉组织承受机械力。DMD由肌营养不良蛋白基因内的多种突变引起，所述突变导致提前的终止密码子和因此截短的肌营养不良蛋白。截短的肌营养不良蛋白不含C末端，因此不能提供承受肌肉收缩应力所必需的结构支撑。因此，肌肉纤维自身撕裂，从而导致肌肉萎缩。
与DMD相比，贝克型肌营养不良症(Becker Muscular Dystrophy，BMD)是一种严重性更低的肌营养不良症形式。虽然BMD也是由肌营养不良蛋白基因内的突变引起的，但BMD突变维持了肌营养不良蛋白的读码框。BMD肌营养不良蛋白含有内部缺失，但还保留N末端部分和C末端部分二者。因此，BMD肌营养不良蛋白比野生型蛋白短，但仍可充当肌动蛋白微丝和细胞外基质之间的接头。事实上，根据内部缺失的大小，BMD患者可只有轻微的症状。因此，大多数研究工作集中于将严重的DMD表型转化为较不严重的BMD表型。
基因组工程是指用于对活生物体的遗传信息(基因组)进行靶向、特异性修饰的策略和技术。基因组工程是一个非常活跃的研究领域，因为它具有广泛的可能应用，特别是在人类健康领域；例如校正携带有害突变的基因，以探索基因的功能。为将基因***活细胞中而开发的早期技术(例如转基因)通常受限于新序列***基因组中的随机性。新基因通常被盲目地放置，并且可能会使其他基因的功能失活或受到干扰，或甚至造成严重的不良影响。此外，这些技术一般不提供任何程度的重复性，因为不能保证新序列会被***两个不同细胞中的相同位置。最近的基因组工程策略(例如ZFNs、TALENs、HEs和MegaTALs)使得能够修饰DNA的特定区域，从而与早期技术相比提高了校正或***的准确性，并提供了一定程度的重复性。尽管如此，这种最近的基因组工程策略也有局限性。
多项研究表明，基因组工程将是治疗DMD的有吸引力的策略。最早的方法之一涉及工程化小于4kb的小型肌营养不良蛋白基因，并且其可被包装到腺相关病毒(AAV)载体中。这是已经在小鼠(Wang,B.,J.Li和X.Xiao,Proc Natl Acad Sci U S A,2000.97(25):第13714-9页)(Watchko,J.等人,Hum Gene Ther,2002.13(12):第1451-60页)和狗模型(Wang,Z.等人,Mol Ther,2012.20(8):第1501-7页)中实验检测的置换基因疗法，并且I期临床试验表明：存在与对非自体合成表位的免疫应答相关的问题(Mendell,J.R.等人,NEngl J Med,2010.363(15):第1429-37页)。
最近，使用寡核苷酸介导的外显子跳读来重建DMD患者细胞中的读码框。在这种策略中，短的寡核苷酸阻断在前mRNA中发现的剪接信号并促使单个外显子的跳读。单个外显子的跳读允许转录机制绕过提前的终止密码子并产生具有完整N末端和C末端的蛋白质。I/II期临床试验显示：每周注射反义寡核苷酸诱导外显子跳读和肌营养不良蛋白阳性纤维(Cirak,S.等人,Lancet,2011.378(9791):第595-605页)。然而，这类治疗的主要限制是：其需要在患者的一生中重复给药，因为药物靶向前mRNA而不是基因组位点。正在进行的II/III期临床试验正在评估通过AAV递送外显子跳读寡核苷酸以实现持续表达，以及递送多种反义寡核苷酸以促使多外显子跳读策略。
尽管来自全世界的研究人员和医学专业人员一直努力尝试解决DMD，并且尽管基因组工程方法具有前景，但仍然迫切需要开发安全有效的对DMD的治疗，DMD是最普遍的致衰弱性遗传障碍之一。
概述
本公开给出了解决DMD遗传基础的方法。通过利用基因组工程工具使基因组产生永久性变化，利用少至一次的治疗，就能够重建(restore)肌营养不良蛋白的读码框并重建肌营养不良蛋白活性，所产生的疗法能够校正引起该疾病的根本基因缺陷。
本文提供了细胞、离体和体内方法，所述方法用于通过基因组编辑来缺失、***或置换(缺失和***)肌营养不良蛋白基因中的一个或更多个外显子或异常内含子剪接受体或供***点，从而使基因组产生永久性变化，并重建肌营养不良蛋白的读码框和重建肌营养不良蛋白的蛋白活性，其能够用于治疗杜氏肌营养不良症(DMD)。本文还提供了用于进行所述方法的组分、试剂盒和组合物。此外，本文提供了通过所述方法产生的细胞。
本文提供了通过基因组编辑来编辑人类细胞中的肌营养不良蛋白基因的方法，所述方法包括以下步骤：向所述人类细胞中引入一种或更多种脱氧核糖核酸(DNA)核酸内切酶以在所述肌营养不良蛋白基因内或附近产生一个或更多个单链断裂(SSB)或双链断裂(DSB)，这导致所述肌营养不良蛋白基因内或附近的一个或更多个外显子或异常内含子剪接受体或供***点的永久性缺失、***或置换，并导致所述肌营养不良蛋白的读码框重建和所述肌营养不良蛋白的蛋白活性重建。所述人类细胞可以是肌肉细胞或肌肉前体细胞。
本文还提供了用于治疗患有杜氏肌营养不良症(DMD)的患者的离体方法，所述方法包括以下步骤：i)产生DMD患者特异性诱导性多能干细胞(iPSC)；ii)在所述iPSC的肌营养不良蛋白基因内或附近编辑；iii)使基因组编辑的iPSC分化成Pax7+肌祖细胞；和iv)将所述Pax7+肌祖细胞植入所述患者体内。
产生患者特异性诱导性多能干细胞(iPSC)的步骤可以包括：a)从所述患者分离体细胞；和b)向所述体细胞内引入多能性相关基因的集合以诱导所述体细胞变成多能干细胞。所述体细胞可以是成纤维细胞。所述多能性相关基因的集合是一个或更多个选自OCT4、SOX2、KLF4、Lin28、NANOG和cMYC的基因。
在所述iPSC的肌营养不良蛋白基因内或附近编辑的步骤可以包括向所述iPSC中引入一种或更多种脱氧核糖核酸(DNA)核酸内切酶以在所述肌营养不良蛋白基因内或附近产生一个或更多个单链断裂(SSB)或双链断裂(DSB)，这导致所述肌营养不良蛋白基因内或附近的一个或更多个外显子或异常内含子剪接受体或供***点的永久性缺失、***或置换，并导致所述肌营养不良蛋白的读码框重建和所述肌营养不良蛋白的蛋白活性重建。
使基因组编辑的iPSC分化成Pax7+肌祖细胞的步骤可以包括使所述基因组编辑的iPSC与特定培养基制剂(specific media formulations)(包括小分子药物)接触；转基因过表达；或血清饥饿(serum withdrawal)。
将所述Pax7+肌祖细胞植入所述患者体内的步骤可包括通过局部注射到期望的肌肉中将所述Pax7+肌祖细胞植入所述患者体内。
本文还提供了用于治疗患有杜氏肌营养不良症(DMD)的患者(例如人)的体内方法，所述方法包括编辑所述患者的细胞中的肌营养不良蛋白基因的步骤。所述细胞可以是肌肉细胞或肌肉前体细胞。
编辑所述患者的细胞中的肌营养不良蛋白的步骤可包括向所述患者的细胞中引入一种或更多种脱氧核糖核酸(DNA)核酸内切酶以在所述肌营养不良蛋白基因内或附近产生一个或更多个单链断裂(SSB)或双链断裂(DSB)，这导致所述肌营养不良蛋白基因内或附近的一个或更多个外显子或异常内含子剪接受体或供***点的永久性缺失、***或置换，并导致所述肌营养不良蛋白的读码框重建和所述肌营养不良蛋白的蛋白活性重建。
所述一种或更多种DNA核酸内切酶可以是Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9(也称为Csn1和Csx12)、Cas100、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4或Cpf1核酸内切酶；其同源物，其天然存在分子的重组体，其密码子优化版本，其经修饰版本，以及任何前述的组合。
所述方法可包括：向所述细胞中引入编码所述一种或更多种DNA核酸内切酶的一种或更多种多核苷酸。所述方法可包括：向所述细胞中引入编码所述一种或更多种DNA核酸内切酶的一种或更多种核糖核酸(RNA)。所述一种或更多种多核苷酸或一种或更多种RNA可以是一种或更多种经修饰的多核苷酸或一种或更多种经修饰的RNA。所述一种或更多种DNA核酸内切酶可以是一种或更多种蛋白质或多肽。
所述方法可进一步包括：向所述细胞中引入一种或更多种向导核糖核酸(gRNA)。所述一种或更多种gRNA是单分子向导RNA(sgRNA)。所述一种或更多种gRNA或一种或更多种sgRNA是一种或更多种经修饰的gRNA或一种或更多种经修饰的sgRNA。所述一种或更多种DNA核酸内切酶可与一种或更多种gRNA或一种或更多种sgRNA预先复合。
所述方法可进一步包括：向所述细胞中引入包含野生型肌营养不良蛋白基因或cDNA的至少部分的多核苷酸供体模板。所述野生型肌营养不良蛋白基因或cDNA的至少部分可包括外显子1、外显子2、外显子3、外显子4、外显子5、外显子6、外显子7、外显子8、外显子9、外显子10、外显子11、外显子12、外显子13、外显子14、外显子15、外显子16、外显子17、外显子18、外显子19、外显子20、外显子21、外显子22、外显子23、外显子24、外显子25、外显子26、外显子27、外显子28、外显子29、外显子30、外显子31、外显子32、外显子33、外显子34、外显子35、外显子36、外显子37、外显子38、外显子39、外显子40、外显子41、外显子42、外显子43、外显子44、外显子45、外显子46、外显子47、外显子48、外显子49、外显子50、外显子51、外显子52、外显子53、外显子54、外显子55、外显子56、外显子57、外显子58、外显子59、外显子60、外显子61、外显子62、外显子63、外显子64、外显子65、外显子66、外显子67、外显子68、外显子69、外显子70、外显子71、外显子72、外显子73、外显子74、外显子75、外显子76、外显子77、外显子78、外显子79、内含子区域、合成的内含子区域、片段、其组合或整个肌营养不良蛋白基因或cDNA的至少部分。所述野生型肌营养不良蛋白基因或cDNA的至少部分可包括外显子1、外显子2、外显子3、外显子4、外显子5、外显子6、外显子7、外显子8、外显子9、外显子10、外显子11、外显子12、外显子13、外显子14、外显子15、外显子16、外显子17、外显子18、外显子19、外显子20、外显子21、外显子22、外显子23、外显子24、外显子25、外显子26、外显子27、外显子28、外显子29、外显子30、外显子31、外显子32、外显子33、外显子34、外显子35、外显子36、外显子37、外显子38、外显子39、外显子40、外显子41、外显子42、外显子43、外显子44、外显子45、外显子46、外显子47、外显子48、外显子49、外显子50、外显子51、外显子52、外显子53、外显子54、外显子55、外显子56、外显子57、外显子58、外显子59、外显子60、外显子61、外显子62、外显子63、外显子64、外显子65、外显子66、外显子67、外显子68、外显子69、外显子70、外显子71、外显子72、外显子73、外显子74、外显子75、外显子76、外显子77、外显子78、外显子79、内含子区域、合成的内含子区域、片段、其组合或整个肌营养不良蛋白基因或cDNA。所述供体模板可以是单链多核苷酸或双链多核苷酸。
所述方法可进一步包括：向所述细胞中引入一种或更多种向导核糖核酸(gRNA)。所述一种或更多种DNA核酸内切酶可以是一种或更多种Cas9或Cpf1核酸内切酶，其产生成对的单链断裂(SSB)或双链断裂(DSB)，第一个SSB或DSB断裂在5’基因座，第二个SSB或DSB断裂在3’基因座，这导致所述肌营养不良蛋白基因内或附近的5’基因座和3’基因座之间的一个或更多个外显子或异常内含子剪接受体或供***点的永久性缺失或置换，并导致所述肌营养不良蛋白的读码框重建和所述肌营养不良蛋白的蛋白活性重建。一种gRNA可以产生成对的SSB或DSB。一种gRNA可包含与5’基因座、3’基因座或5’基因座与3’基因座之间的区段互补的间隔子序列。第一gRNA可包含与5’基因座的区段互补的间隔子序列，第二gRNA可包含与3’基因座的区段互补的间隔子序列。
所述一种或更多种gRNA可以是一种或更多种单分子向导RNA(sgRNA)。所述一种或更多种gRNA或一种或更多种sgRNA可以是一种或更多种经修饰的gRNA或一种或更多种经修饰的sgRNA。所述一种或更多种DNA核酸内切酶可与一种或更多种gRNA或一种或更多种sgRNA预先复合。
5’基因座和3’基因座之间可存在染色体DNA的缺失。
所述缺失可以是单外显子缺失。所述单外显子缺失可以是外显子2、外显子8、外显子43、外显子44、外显子45、外显子46、外显子50、外显子51、外显子52或外显子53的缺失。所述5’基因座可以邻近选自外显子2、外显子8、外显子43、外显子44、外显子45、外显子46、外显子50、外显子51、外显子52和外显子53的单个外显子的5’边界。所述3’基因座可以邻近选自外显子2、外显子8、外显子43、外显子44、外显子45、外显子46、外显子50、外显子51、外显子52和外显子53的单个外显子的3’边界。所述5’基因座可以邻近选自外显子2、外显子8、外显子43、外显子44、外显子45、外显子46、外显子50、外显子51、外显子52和外显子53的单个外显子的5’边界且所述3’基因座可以邻近选自外显子2、外显子8、外显子43、外显子44、外显子45、外显子46、外显子50、外显子51、外显子52和外显子53的单个外显子的3’边界。邻近所述外显子的边界可以包括周围的相邻内含子的剪接供体和受体。
所述缺失可以是多外显子缺失。多外显子缺失可以是外显子45-53或外显子45-55的缺失。所述5’基因座可以邻近选自外显子45-53和外显子45-55的多外显子的5’边界。所述3’基因座可以邻近选自外显子45-53和外显子45-55的多外显子的3’边界。所述5’基因座可以邻近选自外显子45-53和外显子45-55的多外显子的5’边界且3’基因座可以邻近选自外显子45-53和外显子45-55的多外显子的3’边界。邻近所述外显子的边界可以包括周围的相邻内含子的剪接供体和受体。
所述5’基因座与所述3’基因座之间可以存在染色体DNA的置换。所述置换可以是单外显子置换。所述单外显子置换可以是外显子2、外显子8、外显子43、外显子44、外显子45、外显子46、外显子50、外显子51、外显子52、外显子53或外显子70的置换。所述5’基因座可以邻近选自外显子2、外显子8、外显子43、外显子44、外显子45、外显子46、外显子50、外显子51、外显子52、外显子53或外显子70的单个外显子的5’边界。所述3’基因座可以邻近选自外显子2、外显子8、外显子43、外显子44、外显子45、外显子46、外显子50、外显子51、外显子52、外显子53或外显子70的单个外显子的3’边界。所述5’基因座可以邻近选自外显子2、外显子8、外显子43、外显子44、外显子45、外显子46、外显子50、外显子51、外显子52、外显子53或外显子70的单个外显子的5’边界且所述3’基因座可以邻近选自外显子2、外显子8、外显子43、外显子44、外显子45、外显子46、外显子50、外显子51、外显子52、外显子53或外显子70的单个外显子的3’边界。邻近所述外显子的边界可以包括周围的相邻外显子或相邻内含子的剪接供体和受体。
所述置换可以是多外显子置换。所述多外显子置换可以是外显子45-53或外显子45-55的置换。所述5’基因座可以邻近选自外显子45-53或外显子45-55的多外显子的5’边界。所述3’基因座可以邻近选自外显子45-53或外显子45-55的多外显子的3’边界。所述5’基因座可以邻近选自外显子45-53或外显子45-55的多外显子的5’边界且所述3’基因座可以邻近选自外显子45-53或外显子45-55的多外显子的3’边界。邻近所述外显子的边界可以包括周围的相邻外显子或相邻内含子的剪接供体和受体。
所述方法可进一步包括：向所述细胞中引入包含野生型肌营养不良蛋白基因或cDNA的至少部分的多核苷酸供体模板，并且所述置换是通过同源定向修复(HDR)进行的。
所述野生型肌营养不良蛋白基因或cDNA的至少部分可包括外显子1、外显子2、外显子3、外显子4、外显子5、外显子6、外显子7、外显子8、外显子9、外显子10、外显子11、外显子12、外显子13、外显子14、外显子15、外显子16、外显子17、外显子18、外显子19、外显子20、外显子21、外显子22、外显子23、外显子24、外显子25、外显子26、外显子27、外显子28、外显子29、外显子30、外显子31、外显子32、外显子33、外显子34、外显子35、外显子36、外显子37、外显子38、外显子39、外显子40、外显子41、外显子42、外显子43、外显子44、外显子45、外显子46、外显子47、外显子48、外显子49、外显子50、外显子51、外显子52、外显子53、外显子54、外显子55、外显子56、外显子57、外显子58、外显子59、外显子60、外显子61、外显子62、外显子63、外显子64、外显子65、外显子66、外显子67、外显子68、外显子69、外显子70、外显子71、外显子72、外显子73、外显子74、外显子75、外显子76、外显子77、外显子78、外显子79、内含子区域、合成的内含子区域、片段、其组合或整个肌营养不良蛋白基因或cDNA的至少部分。所述野生型肌营养不良蛋白基因或cDNA的至少部分可包括外显子1、外显子2、外显子3、外显子4、外显子5、外显子6、外显子7、外显子8、外显子9、外显子10、外显子11、外显子12、外显子13、外显子14、外显子15、外显子16、外显子17、外显子18、外显子19、外显子20、外显子21、外显子22、外显子23、外显子24、外显子25、外显子26、外显子27、外显子28、外显子29、外显子30、外显子31、外显子32、外显子33、外显子34、外显子35、外显子36、外显子37、外显子38、外显子39、外显子40、外显子41、外显子42、外显子43、外显子44、外显子45、外显子46、外显子47、外显子48、外显子49、外显子50、外显子51、外显子52、外显子53、外显子54、外显子55、外显子56、外显子57、外显子58、外显子59、外显子60、外显子61、外显子62、外显子63、外显子64、外显子65、外显子66、外显子67、外显子68、外显子69、外显子70、外显子71、外显子72、外显子73、外显子74、外显子75、外显子76、外显子77、外显子78、外显子79、内含子区域、合成的内含子区域、片段、其组合或整个肌营养不良蛋白基因或cDNA。
所述方法可进一步包括：向所述细胞中引入一种向导核糖核酸(gRNA)和包含野生型肌营养不良蛋白基因的至少部分的多核苷酸供体模板。所述一种或更多种DNA核酸内切酶可以是一种或更多种Cas9或Cpf1核酸内切酶，其在所述肌营养不良蛋白基因内或附近的基因座处产生一个单链断裂(SSB)或双链断裂(DSB)，从而促使在染色体DNA的所述基因座处***来自所述多核苷酸供体模板的新序列，这导致所述肌营养不良蛋白基因内或附近的一个或更多个外显子或异常内含子剪接受体或供***点的永久性***或校正，并导致所述肌营养不良蛋白的读码框重建和所述肌营养不良蛋白的蛋白活性重建。所述gRNA可包含与所述基因座的区段互补的间隔子序列。
所述方法可进一步包括：向所述细胞中引入一种或更多种向导核糖核酸(gRNA)和包含野生型肌营养不良蛋白基因的至少部分的多核苷酸供体模板。所述一种或更多种DNA核酸内切酶可以是一种或更多种Cas9或Cpf1核酸内切酶，其在所述肌营养不良蛋白基因内或附近产生成对的单链断裂(SSB)或双链断裂(DSB)，第一个在5’基因座，第二个在3’基因座，从而促使在染色体DNA的5’基因座和3’基因座之间***来自所述多核苷酸供体模板的新序列，这导致所述肌营养不良蛋白基因内或附近的5’基因座和3’基因座之间的一个或更多个外显子或异常内含子剪接受体或供***点的永久性***或校正，并导致所述肌营养不良蛋白的读码框重建和所述肌营养不良蛋白的蛋白活性重建。
一种gRNA可以产生成对的SSB或DSB。一种gRNA可以包含与5’基因座、3’基因座或5’基因座与3’基因座之间的区段互补的间隔子序列。第一gRNA可包含与5’基因座的区段互补的间隔子序列，第二gRNA可包含与3’基因座的区段互补的间隔子序列。
所述一种或更多种gRNA可以是一种或更多种单分子向导RNA(sgRNA)。所述一种或更多种gRNA或一种或更多种sgRNA可以是一种或更多种经修饰的gRNA或一种或更多种经修饰的sgRNA。所述一种或更多种DNA核酸内切酶可以与一种或更多种gRNA或一种或更多种sgRNA预先复合。
5’基因座和3’基因座之间可以存在***。
所述***可以是单外显子***。单外显子***可以是外显子2、外显子8、外显子43、外显子44、外显子45、外显子46、外显子50、外显子51、外显子52、外显子53或外显子70的***。所述5’基因座或3’基因座可以邻近选自外显子2、外显子8、外显子43、外显子44、外显子45、外显子46、外显子50、外显子51、外显子52、外显子53和外显子70的单外显子的边界。邻近所述外显子的边界可以包括周围的相邻外显子或相邻内含子的剪接供体和受体。
所述***可以是多外显子***。所述多外显子***可以是外显子45-53或外显子45-55的***。5’基因座或3’基因座可以邻近选自外显子45-53或外显子45-55的多外显子的边界。邻近所述外显子的边界可以包括周围的相邻内含子的剪接供体和受体。
野生型肌营养不良蛋白基因或cDNA的至少部分可以包括外显子1、外显子2、外显子3、外显子4、外显子5、外显子6、外显子7、外显子8、外显子9、外显子10、外显子11、外显子12、外显子13、外显子14、外显子15、外显子16、外显子17、外显子18、外显子19、外显子20、外显子21、外显子22、外显子23、外显子24、外显子25、外显子26、外显子27、外显子28、外显子29、外显子30、外显子31、外显子32、外显子33、外显子34、外显子35、外显子36、外显子37、外显子38、外显子39、外显子40、外显子41、外显子42、外显子43、外显子44、外显子45、外显子46、外显子47、外显子48、外显子49、外显子50、外显子51、外显子52、外显子53、外显子54、外显子55、外显子56、外显子57、外显子58、外显子59、外显子60、外显子61、外显子62、外显子63、外显子64、外显子65、外显子66、外显子67、外显子68、外显子69、外显子70、外显子71、外显子72、外显子73、外显子74、外显子75、外显子76、外显子77、外显子78、外显子79、内含子区域、合成的内含子区域、片段、其组合或整个肌营养不良蛋白基因或cDNA的至少部分。所述野生型肌营养不良蛋白基因或cDNA的至少部分可以包括外显子1、外显子2、外显子3、外显子4、外显子5、外显子6、外显子7、外显子8、外显子9、外显子10、外显子11、外显子12、外显子13、外显子14、外显子15、外显子16、外显子17、外显子18、外显子19、外显子20、外显子21、外显子22、外显子23、外显子24、外显子25、外显子26、外显子27、外显子28、外显子29、外显子30、外显子31、外显子32、外显子33、外显子34、外显子35、外显子36、外显子37、外显子38、外显子39、外显子40、外显子41、外显子42、外显子43、外显子44、外显子45、外显子46、外显子47、外显子48、外显子49、外显子50、外显子51、外显子52、外显子53、外显子54、外显子55、外显子56、外显子57、外显子58、外显子59、外显子60、外显子61、外显子62、外显子63、外显子64、外显子65、外显子66、外显子67、外显子68、外显子69、外显子70、外显子71、外显子72、外显子73、外显子74、外显子75、外显子76、外显子77、外显子78、外显子79、内含子区域、合成的内含子区域、片段、其组合或整个肌营养不良蛋白基因或cDNA。
***或校正可以是通过同源定向修复(HDR)进行。
所述供体模板可以是单链多核苷酸或双链多核苷酸。
可以将所述Cas9或Cpf1 mRNA、gRNA和供体模板各自配制成单独的脂质纳米颗粒或全部共配制成脂质纳米颗粒。
可以将所述Cas9或Cpf1 mRNA配制成脂质纳米颗粒，可以通过腺相关病毒(AAV)载体将所述gRNA和供体模板二者递送至所述细胞。
可以将所述Cas9或Cpf1 mRNA配制成脂质纳米颗粒，可以通过电穿孔将所述gRNA递送至所述细胞，以及可以通过腺相关病毒(AAV)载体将所述供体模板递送至所述细胞。
所述肌营养不良蛋白基因可以位于染色体X：31,117,228-33,344,609(基因组参***-GRCh38/hg38)。
本文还提供了用于编辑来自患有DMD的患者的细胞中的肌营养不良蛋白基因的一种或更多种向导核糖核酸(gRNA)。所述一种或更多种gRNA和/或sgRNA可以包含选自以下的间隔子序列：序列表的SEQ ID NOs:1–1410472中的核酸序列。所述一种或更多种gRNA可以是一种或更多种单分子向导RNA(sgRNA)。所述一种或更多种gRNA或一种或更多种sgRNA可以是一种或更多种经修饰的gRNA或一种或更多种经修饰的sgRNA。
本文提供了这样的细胞，其已通过前述方法进行修饰以永久缺失或校正肌营养不良蛋白基因内的一个或更多个外显子或异常内含子剪接受体或供***点，并重建肌营养不良蛋白的读码框和重建肌营养不良蛋白的蛋白活性。本文还提供了通过向DMD患者施用已通过前述方法进行修饰的细胞来改善DMD的方法。
应该理解，本说明书中描述的发明不限于本概述中概括的实例。本文描述和例示了多种其他方面。
附图简介
参考附图可以更好地理解本说明书中公开和描述的用于治疗DMD的材料和方法的各个方面，附图中：
图1A是质粒(CTx-1)，其包含S.pyogenes Cas9核酸内切酶的密码子优化的基因。CTx-1质粒还包含gRNA支架序列，所述gRNA支架序列包括来自序列表的SEQ ID NO：1-467,030中列出的序列的20bp间隔子序列或来自序列表的SEQ ID NO：1,410,430-1,410,472中列出的序列的19bp间隔子序列；
图1B是质粒(CTx-2)，其包含S.pyogenes Cas9核酸内切酶的不同的密码子优化的基因。CTx-2质粒还包含gRNA支架序列，所述gRNA支架序列包括来自序列表的SEQ ID NO：1-467,030中列出的序列的20bp间隔子序列或来自序列表的SEQ ID NO：1,410,430-1,410,472中列出的序列的19bp间隔子序列；
图1C是质粒(CTx-3)，其包含S.pyogenes Cas9核酸内切酶的又一不同的密码子优化的基因。CTx-3质粒还包含gRNA支架序列，所述gRNA支架序列包括来自序列表的SEQ IDNO：1-467,030中列出的序列的20bp间隔子序列或来自序列表的SEQ ID NO：1,410,430-1,410,472中列出的序列的19bp间隔子序列。
图2A是II型CRISPR/Cas***的图示。
图2B是II型CRISPR/Cas***的图示。
图3A描述了HEK293T中靶向肌营养不良蛋白基因的外显子45、51和53的S.pyogenes gRNA的切割效率。
图3B描述了HEK293T中靶向肌营养不良蛋白基因的外显子55和70的S.pyogenesgRNA的切割效率。
图4A描述了HEK293T中靶向肌营养不良蛋白基因的外显子43、44、45、46、50、51、52、53和55的剪接受体的S.pyogenes gRNA的切割效率。
图4B描述了HEK293T中靶向肌营养不良蛋白基因的外显子43、44、45、46、50、51、52、53和55的剪接受体的N.meningitides、S.thermophiles和S.aureus gRNA的切割效率。
图4C描述了HEK293T中靶向肌营养不良蛋白基因的外显子43、44、45、46、50、51、52、53和55的剪接受体的Cpf1 gRNA的切割效率。
图5A-B描述了HEK293T中靶向肌营养不良蛋白基因的外显子51、45、53、44、46、52、50、43和55的S.pyogenes gRNA的切割效率和剪接受体敲除效率。
图6描述了HEK293T中靶向肌营养不良蛋白基因的外显子51、45、53、44、46、52、50、43和55的N.meningitides(NM)、S.thermophiles(ST)和S.aureus(SA)gRNA的切割效率和剪接受体敲除效率。
图7A描述了HEK293T细胞中S.pyogenes gRNA的切割效率，其中所述gRNA靶向肌营养不良蛋白基因的外显子52周围的区域。
图7B描述了HEK293T细胞中S.pyogenes gRNA的切割效率，其中所述gRNA靶向肌营养不良蛋白基因的外显子44、45和54周围的区域。
图8A描述了iPSC中S.pyogenes gRNA的切割效率，其中所述gRNA靶向肌营养不良蛋白基因的外显子52周围的区域。
图8B描述了iPSC中S.pyogenes gRNA的切割效率，其中所述gRNA靶向肌营养不良蛋白基因的外显子44、45和54周围的区域。
图9描述了HEK293T细胞和iPSC中S.pyogenes gRNA的切割效率比较，其中所述gRNA靶向肌营养不良蛋白基因的外显子44、45、52和54周围的区域。
图10A、图10B和图10C描述了克隆缺失事件的克隆分析。
图11A和图11B描述了Δ52克隆的sanger测序。
图12A-E描述了通过体外转录(IVT)gRNA筛选而选择的gRNA的切割效率。
图13A描述了肌营养不良蛋白基因的外显子45-55之间的同源定向修复(HDR)。
图13B示出了肌营养不良蛋白基因的外显子45-55基因座处的HDR的PCR确认。
图14A示出了三引物PCR检测。
图14B示出了三引物PCR检测的结果。
图14C描述了三引物PCR检测产生的数据。
图15描述了具有期望的Δ45-55缺失的5个克隆。
图16A-B描述了具有期望的Δ45-55缺失的5个克隆的SSEA-4染色和TRA-160染色结果。
图17示出了所有5个经编辑克隆的内部缺失的肌营养不良蛋白的表达。
图18示出了分化的克隆56的肌球蛋白重链染色。
图19A-19VV描述了大规模慢病毒筛选的结果。
序列表简介
SEQ ID NO：1-467,030是利用S.pyogenes Cas9核酸内切酶靶向肌营养不良蛋白基因的gRNA 20bp间隔子序列的列表。
SEQ ID NO：467,031-528,196是利用S.aureus Cas9核酸内切酶靶向肌营养不良蛋白基因的gRNA 20bp间隔子序列的列表。
SEQ ID NO：528,197-553,198是利用S.thermophilus Cas9核酸内切酶靶向肌营养不良蛋白基因的gRNA 24bp间隔子序列的列表。
SEQ ID NO：553,199-563,911是利用T.denticola Cas9核酸内切酶靶向肌营养不良蛋白基因的gRNA 24bp间隔子序列的列表。
SEQ ID NO：563,912-627,854是利用N.meningitides Cas9核酸内切酶靶向肌营养不良蛋白基因的gRNA 24bp间隔子序列的列表。
SEQ ID NO：627,855-1,410,399是利用Acidominoccoccus、Lachnospiraceae和Franciscella Novicida Cpf1核酸内切酶靶向肌营养不良蛋白基因的gRNA 20-24bp间隔子序列的列表。
SEQ ID NO：1,410,400-1,410,402是利用N.meningitides Cas9核酸内切酶靶向肌营养不良蛋白基因的gRNA 24bp间隔子序列的列表。
SEQ ID NO：1,410,403-1,410,429是利用Acidominoccoccus、Lachnospiraceae和Franciscella Novicida Cpf1核酸内切酶靶向肌营养不良蛋白基因的gRNA 23bp间隔子序列的列表。
SEQ ID NO：1,410,430-1,410,472是利用S.pyogenes Cas9核酸内切酶靶向肌营养不良蛋白基因的gRNA 19bp间隔子序列的列表。
详细说明
杜氏肌营养不良症(DMD)
DMD由肌营养不良蛋白基因(染色体X：31,117,228-33,344,609(基因组参***–GRCh38/hg38))中的突变引起。由于基因组区域长度超过2.2百万碱基，所以肌营养不良蛋白基因是第二大人类基因。肌营养不良蛋白基因含有79个外显子，这些外显子被加工成11000个碱基对的mRNA，所述mRNA被翻译成427kDa的蛋白质。在功能上，肌营养不良蛋白充当肌动蛋白微丝和肌纤维内的细胞外基质之间的接头。肌营养不良蛋白的N末端是肌动蛋白结合结构域，而C末端与跨膜支架相互作用，跨膜支架将肌纤维锚定到细胞外基质。在肌肉收缩时，肌营养不良蛋白提供结构支撑，从而允许肌肉组织承受机械力。DMD由肌营养不良蛋白基因内的多种突变引起，所述突变导致提前的终止密码子和因此截短的肌营养不良蛋白。截短的肌营养不良蛋白不含C末端，因此不能提供承受肌肉收缩应力所必需的结构支撑。因此，肌肉纤维自身撕裂，从而导致肌肉萎缩。
治疗方法
本文提供了利用基因组工程工具使基因组产生永久性变化的细胞、离体和体内方法，其能够重建肌营养不良蛋白的读码框并重建肌营养不良蛋白的蛋白活性。此类方法利用核酸内切酶(例如CRISPR/Cas9核酸酶)在肌营养不良蛋白基因的基因组基因座中永久缺失(切除)、***或置换(缺失和***)外显子(即，编码序列和/或剪接序列中的突变)。以这种方式，本发明模拟了外显子跳读所产生的产物，和/或利用少至一次的治疗重建读码框(而不是在患者的一生中递送外显子跳读寡核苷酸)。通过利用基于锌指、TALE和CRISPR/Cas9的核酸酶使基因组产生靶向变化，已经进行了关于肌营养不良蛋白C末端表达的临床前研究。在一个例子中，大的基因组区域被缺失，预计这能治疗超过60％的DMD患者。
本文提供了治疗DMD患者的方法。这种方法的一个例子是基于细胞的离体疗法。例如，产生DMD患者特异性iPS细胞系。然后，使用本文所述的材料和方法校正这些iPS细胞的染色体DNA。接下来，使校正的iPSC分化成Pax7+肌祖细胞。最后，将祖细胞植入患者体内。这种离体方法有许多优点。
离体细胞疗法方法的一个优点是能够在施用前对治疗剂进行综合分析。所有基于核酸酶的治疗剂都具有一定程度的脱靶效应。离体进行基因校正允许在植入前充分表征经校正的细胞群体。本公开的一些方面包括对经校正细胞的全基因组进行测序以确保脱靶切割(如果有的话)处于对患者风险最小的相关基因组位置中。此外，可以在植入前分离细胞的克隆群体。
离体细胞疗法的另一个优点涉及与其他原代细胞来源相比在iPSC中的基因校正。iPSC增殖力强(prolific)，从而使得容易获得基于细胞的治疗所需的大量细胞。此外，iPSC是进行克隆分离的理想细胞类型。这允许筛选正确的基因组校正，而不冒生存力降低的风险。相比之下，其他潜在的细胞类型(例如原代成肌细胞)仅存活几代且难以克隆扩增。此外，患者特异性DMD成肌细胞由于缺乏肌营养不良蛋白而不健康。另一方面，源自患者的DMDiPSC不会展示患病表型，因为它们在这种分化状态下不表达肌营养不良蛋白。因此，DMDiPSC的操作会容易得多，并且会缩短进行期望的基因校正所需的时间量。
离体细胞疗法的另一个优点涉及植入肌原性Pax7+祖细胞(与成肌细胞相对比)。Pax7+细胞被视为肌原性卫星细胞。Pax7+祖细胞是位于多核肌纤维周围的单核细胞。在损伤反应中，祖细胞***并与现有纤维融合。相比之下，成肌细胞在植入后直接与肌纤维融合并且在体内具有最低增殖能力。因此，反复损伤后成肌细胞无法帮助愈合，而Pax7+祖细胞可以充当储库(reservoir)并在患者一生中帮助愈合肌肉。
这种方法的另一个例子是基于体内的疗法。在该方法中，使用本文所述的材料和方法校正患者细胞的染色体DNA。
体内基因治疗的优点是易于进行治疗剂生产和施用。相同的治疗剂混合物有潜力影响DMD患者群体(n>1)的子集。相比之下，所提出的离体细胞疗法需要为每位患者(n＝1)开发定制治疗剂。离体细胞疗法开发需要时间，而某些晚期DMD患者可能没有时间。
本文还提供了通过基因组编辑来编辑人类细胞中的肌营养不良蛋白基因的细胞方法。例如，从患者或动物中分离细胞。然后，使用本文所述的材料和方法校正细胞的染色体DNA。
除了编码序列和剪接序列中的突变之外，还可以存在许多类型的基因组靶位点。
转录和翻译的调控涉及与细胞蛋白质或核苷酸相互作用的许多不同种类的位点。通常，转录因子或其他蛋白质的DNA结合位点可以作为突变或缺失的靶点，以研究该位点的作用，但它们也可以被靶向以改变基因表达。可通过非同源末端连接(NHEJ)或通过同源定向修复(HDR)的直接基因组编辑来添加位点。转录因子结合的全基因组研究、RNA表达和基因组测序的使用增加提高了我们确定这些位点如何导致发育或时序基因调控的能力。这些控制***可以是直接的，或可以涉及广泛的合作调控，这可能需要整合来自多个增强子的活性。转录因子通常结合6-12bp长的简并DNA序列。单个位点所提供的低水平特异性暗示结合和功能性结果涉及复杂的相互作用和规则。简并较少的结合位点可以提供较简单的调控手段。可以设计人工转录因子以指定在基因组中具有较少相似序列并具有较低的脱靶切割可能性的较长序列。这些类型的结合位点中的任何都可以被突变、缺失或者甚至创建以使基因调控或表达发生变化(Canver,M.C.等人,Nature(2015))。
具有这些特征的另一类基因调控区是微小RNA(miRNA)结合位点。miRNA是在转录后基因调控中起关键作用的非编码RNA。miRNA可以调控所有哺乳动物蛋白质编码基因的30％的表达。发现了通过双链RNA(RNAi)以及另外的小的非编码RNA的特异性且强效的基因沉默(Canver,M.C.等人,Nature(2015))。对于基因沉默而言重要的最大的一类非编码RNA是miRNA。在哺乳动物中，miRNA首先被转录为长RNA转录物，所述长RNA转录物可以是单独的转录单位、蛋白质内含子的部分或其他转录物。长转录物称为初级miRNA(pri-miRNA)，其包括不完全碱基配对的发夹结构。这些pri-miRNA可通过微处理器(Microprocessor)被切割成一个或更多个较短的前体miRNA(pre-miRNA)，所述微处理器是一种核内的蛋白质复合体，涉及Drosha。
Pre-miRNA是带有2个核苷酸的3'-悬挂序列的长度为～70个核苷酸的短茎环，其被输出为成熟的19-25个核苷酸的miRNA：miRNA*双链体。具有较低碱基配对稳定性的miRNA链(向导链)可被装载到RNA诱导的沉默复合体(RISC)上。乘客(passenger)向导链(用*标记)可以是有功能的，但通常降解。成熟的miRNA将RISC与主要在3'非翻译区(UTR)内发现的靶mRNA中的部分互补序列基序连在一起并诱导转录后基因沉默(Bartel,D.P.Cell 136,215-233(2009)；Saj,A.&Lai,E.C.Curr Opin Genet Dev 21,504-510(2011))。
miRNA在发育、分化、细胞周期和生长控制中以及哺乳动物和其他多细胞生物体中的几乎所有生物途径中都可以是重要的。miRNA还可以参与细胞周期控制、凋亡和干细胞分化、造血、缺氧、肌肉发育、神经发生、胰岛素分泌、胆固醇代谢、衰老、病毒复制和免疫应答。
一种miRNA可靶向数百种不同的mRNA转录物，而一种转录物可被许多不同的miRNA靶向。最新版本的miRBase(v.21)中注释了超过28645种微小RNA。一些miRNA可以由多个基因座编码，这些基因座中有一些可以从串联共转录簇表达。这些特征允许具有多种途径和反馈控制的复杂调控网络。miRNA可以是这些反馈和调控回路的构成部分，并且可以通过将蛋白质产生保持在一定限度内来帮助调控基因表达(Herranz,H.&Cohen,S.M.Genes Dev24,1339-1344(2010)；Posadas,D.M.&Carthew,R.W.Curr Opin Genet Dev 27,1-6(2014))。
miRNA在与异常miRNA表达相关联的大量人类疾病中也可以是重要的。这种关联强调了miRNA调控途径的重要性。最近的miRNA缺失研究已经将miRNA与免疫应答调控联系起来(Stern-Ginossar,N.等人,Science 317,376-381(2007))。
miRNA还与癌症有很强的联系，并且可以在不同类型的癌症中发挥作用。已发现miRNA在许多肿瘤中下调。miRNA可以在调控关键的癌症相关途径(例如细胞周期控制和DNA损伤应答)中起重要作用，因此可用于诊断并可用于临床靶向。微小RNA可精妙地调控血管生成的平衡，从而耗尽所有微小RNA的实验抑制肿瘤血管生成(Chen,S.等人,Genes Dev28,1054-1067(2014))。
如同已经对蛋白质编码基因所证实的那样，miRNA基因也可以经历伴随癌症发生的表观遗传变化。许多miRNA基因座可以与CpG岛相关联，这提高了它们被DNA甲基化调控的机会(Weber,B.,Stresemann,C.,Brueckner,B.&Lyko,F.Cell Cycle 6,1001-1005(2007))。大多数研究利用染色质重塑药物治疗来揭示表观遗传沉默的miRNA。
除了在RNA沉默中的作用之外，miRNA还可以激活翻译(Posadas,D.M.&Carthew,R.W.Curr Opin Genet Dev 27,1-6(2014))。敲除这些位点可以导致靶基因的表达降低，而引入这些位点可以提高表达。
通过使种子序列(微小RNA的碱基2-8)突变可以最有效地敲除单个miRNA，种子序列对于结合特异性可以是重要的。在这个区域进行切割，然后通过NHEJ错误修复，可以通过阻断与靶位点的结合有效地消除miRNA的功能。还可以通过特异性靶向与回文序列相邻的特定环区域来抑制miRNA。无催化活性的Cas9也可用于抑制shRNA表达(Zhao,Y.等人,SciRep 4,3943(2014))。除了靶向miRNA之外，结合位点也可以被靶向和突变以防止通过miRNA沉默。
人类细胞
为了改善DMD，如本文所述和说明的，基因编辑的主要靶标是人类细胞。例如，在离体方法中，人类细胞可以是体细胞，体细胞在使用所述技术修饰后可以产生Pax7+肌祖细胞。例如，在体内方法中，人类细胞可以是肌肉细胞或肌肉前体细胞。
通过在源自有需要的患者且因此已经与该患者完全匹配的自体细胞中进行基因编辑，可以产生能够被安全地重新引入患者体内的细胞，并有效地产生可以有效改善与患者疾病相关的一种或更多种临床病症的细胞群体。
祖细胞(在本文中也称为干细胞)既能够增殖又能够产生更多的祖细胞，这些祖细胞继而具有产生大量母细胞的能力，这些母细胞继而能够产生分化的或可分化的子细胞。子细胞自身可被诱导以增殖和产生随后分化成一种或更多种成熟细胞类型的子代，同时还保留具有亲代发育潜能的一种或更多种细胞。因此，术语“干细胞”是指这样的细胞，其具有在特定情况下分化成更专门化的或分化的表型的能力或潜能，并保留了在某些情况下增殖而基本上不分化的能力。在一个方面，术语祖细胞或干细胞是指广义的母细胞，其后代(子代)通过分化(例如通过获得完全个体特征，如在胚胎细胞和组织的渐进多样化中发生的)而专门化，通常在不同方向专门化。细胞分化是一个复杂的过程，其通常通过许多细胞***发生。分化的细胞可以源自多能细胞，所述多能细胞本身源自多能细胞，以此类推。虽然这些多能细胞中的每一种都可被视为干细胞，但每种细胞可以产生的细胞类型的范围可以差异很大。一些分化的细胞还具有产生具有较大发育潜能的细胞的能力。这种能力可以是天然的，或者可以通过用多种因素处理而人为诱导。在许多生物学实例中，干细胞也可以是“多能的”，因为它们可以产生多于一种不同细胞类型的后代，但这对于“干性(stem-ness)”而言不是必需的。
自我更新可以是干细胞的另一个重要方面。从理论上讲，自我更新可以通过两种主要机制中的任何一种发生。干细胞可以不对称***，其中一个子细胞保留干状态，另一个子细胞表达一些不同的其他特定功能和表型。或者，群体中的一些干细胞可以对称地***成两种，从而维持群体中一些干细胞作为一个整体，而群体中的其他细胞仅产生分化的子代。通常，“祖细胞”具有更原始的细胞表型(即，与完全分化的细胞比处于发育途径或进程中的较早步骤)。通常，祖细胞还具有显著的或非常高的增殖潜能。取决于发育途径以及细胞发育和分化的环境，祖细胞可产生多种不同的分化的细胞类型或一种分化的细胞类型。
在细胞个体发生的背景下，形容词“分化的”是一个相对术语。“分化的细胞”是这样的细胞，与被与之比较的细胞相比，其进展到了发育途径的更下游。因此，干细胞可以分化成谱系限制性前体细胞(例如肌肉细胞祖细胞)，所述谱系限制性前体细胞继而可以分化成所述途径更下游的其他类型的前体细胞(例如肌肉细胞前体)，然后分化成末期分化细胞，例如肌肉细胞，其在某种组织类型中起着特征性作用，并且可能保留或可能未保留进一步增殖的能力。
诱导性多能干细胞
在一些实例中，本文所述的基因工程人类细胞可以是诱导性多能干细胞(iPSC)。使用iPSC的一个优点是：细胞可以源自将要施用祖细胞的同一受试者。也就是说，可以从受试者获得体细胞，使其重编程为诱导性多能干细胞，然后再分化为将施用到受试者的祖细胞(例如，自体细胞)。因为祖细胞实质上源自自体来源，所以与使用来自另一受试者或受试者组的细胞相比，可以降低移植排斥或***反应的风险。另外，使用iPSC不需要从胚胎来源获得的细胞。因此，在一个方面，所公开的方法中使用的干细胞不是胚胎干细胞。
虽然在生理学环境中分化通常是不可逆的，但最近已经开发了几种方法以将体细胞重编程为iPSC。示例性方法是本领域技术人员已知的并且在下文中简要描述。
术语“重编程”是指改变或逆转分化细胞(例如体细胞)的分化状态的过程。换言之，重编程是指驱使细胞分化回转至更不分化或更原始类型的细胞的过程。应该指出的是，将许多原代细胞置于培养物中可导致完全分化特征在某种程度上丧失。因此，简单地培养术语分化的细胞中所涵盖的这类细胞不会使这些细胞成为未分化的细胞(例如未分化细胞)或多能细胞。分化的细胞向多能性的转变需要重编程刺激，所述重编程刺激超过培养物中导致分化特征部分丧失的刺激。与在培养物中一般只能***有限次的原代细胞亲本相比，重编程的细胞还具有能够长期传代而不丧失生长潜能的特征。
在重编程之前，待重编程的细胞可以是部分分化的或终末分化的。重编程包括分化细胞(例如体细胞)的分化状态完全逆转到多能(pluripotent)状态或专能(multipotent)状态。重编程可以包括分化细胞(例如体细胞)的分化状态完全或部分逆转到未分化细胞(例如胚胎样细胞)。重编程可导致细胞表达特定基因，其表达进一步促使重编程。在本文描述的某些实例中，分化细胞(例如体细胞)的重编程可导致分化细胞呈现未分化状态(例如，是未分化的细胞)。所得细胞被称为“重编程细胞”或“诱导性多能干细胞(iPSC或iPS细胞)”。
重编程可涉及改变(例如逆转)在细胞分化过程中发生的核酸修饰(例如甲基化)、染色质浓缩、表观遗传变化、基因组印记等可遗传模式中的至少一些。重编程不同于简单地维持已经是多能的细胞的现有未分化状态或维持已经是专能细胞(例如肌原性干细胞)的细胞的现有不完全分化状态。重编程也不同于促使已经多能或专能的细胞的自我更新或增殖，尽管在一些实例中，本文所述的组合物和方法也可用于此目的。
本领域已知可用于从体细胞产生多能干细胞的许多方法。将体细胞重编程为多能表型的任何此类方法均适用于本文所述的方法中。
已经描述了使用确定的转录因子组合来产生多能细胞的重编程方法。通过直接转导Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc，小鼠体细胞可被转化为具有扩展的发育潜能的ES细胞样细胞；参见例如Takahashi和Yamanaka,Cell126(4):663–76(2006)。iPSC类似于ES细胞，因为它们恢复了多潜能相关的转录回路和大部分表观遗传背景(landscape)。此外，小鼠iPSC满足多能性的所有标准试验：特别是，体外分化成三个胚层的细胞类型，畸胎瘤形成，促使嵌合体，种系传递[参见例如Maherali和Hochedlinger,Cell Stem Cell.3(6):595-605(2008)]和四倍体互补。
可以使用类似的转导方法获得人类iPSC，三个一组的转录因子OCT4、SOX2和NANOG已被确定为控制多能性的核心转录因子组；参见例如Budniatzky和Gepstein,Stem CellsTransl Med.3(4):448-57(2014)；Barrett等人,Stem Cells Trans Med 3:1-6sctm.2014-0121(2014)；Focosi等人,Blood Cancer Journal 4:e211(2014)；以及其中引用的参考文献。可以通过向成体体细胞中引入编码干细胞相关基因的核酸序列(过去使用病毒载体)来实现iPSC产生。
iPSC可以产生自或源自终末分化的体细胞，以及成体干细胞，或体干细胞。也就是说，可通过重编程使非多能祖细胞多能或专能。在这种情况下，可能没有必要包含重编程终末分化细胞所需的那么多的重编程因子。此外，可通过重编程因子的非病毒引入来诱导重编程，例如通过引入蛋白质本身，或通过引入编码重编程因子的核酸，或通过引入在翻译后产生重编程因子的信使RNA(参见例如，Warren等人,Cell Stem Cell,7(5):618-30(2010))。重编程可以通过引入编码干细胞相关基因的核酸的组合来实现，所述基因包括例如Oct-4(也称为Oct-3/4或Pouf51)、Sox1、Sox2、Sox3、Sox15、Sox18、NANOG、Klf1、Klf2、Klf4、Klf5、NR5A2、c-Myc、1-Myc、n-Myc、Rem2、Tert和LIN28。使用本文所述的方法和组合物重编程还可以包括向体细胞中引入Oct-3/4、Sox家族的成员、Klf家族的成员和Myc家族的成员中的一种或更多种。本文所述的方法和组合物还可以包括引入Oct-4、Sox2、Nanog、c-MYC和Klf4中的每一种的一种或更多种用于重编程。如上所述，用于重编程的确切方法对于本文所述的方法和组合物而言不一定是关键的。然而，在由重编程细胞分化的细胞将用于例如人类疗法中的情况下，在一个方面，重编程不由改变基因组的方法实现。因此，在这种实例中，可以例如不使用病毒或质粒载体实现重编程。
可以通过添加多种物质(agent)(例如小分子)来提高源自起始细胞群体的重编程的效率(即重编程细胞的数目)，如Shi等人,Cell-Stem Cell 2:525-528(2008)；Huangfu等人,Nature Biotechnology 26(7):795-797(2008)和Marson等人,Cell-Stem Cell 3:132-135(2008)所示。因此，产生患者特异性或疾病特异性iPSC时可以使用提高诱导性多能干细胞产生的效率或速率的物质或物质组合。提高重编程效率的物质的一些非限制性实例包括可溶性Wnt、Wnt条件培养基、BIX-01294(G9a组蛋白甲基转移酶)、PD0325901(MEK抑制剂)、DNA甲基转移酶抑制剂、组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂、丙戊酸、5'-氮胞苷、***、辛二酰苯胺异羟肟酸(SAHA)、维生素C和曲古抑菌素(TSA)等。
重编程增强剂的其它非限制性实例包括：辛二酰苯胺异羟肟酸(SAHA(例如MK0683、伏立诺他)和其他异羟肟酸)、BML-210、Depudecin(例如(-)-Depudecin)、HC毒素、Nullscript(4-(l,3-二氧代-lH,3H-苯并[de]异喹啉-2-基)-N-羟基丁酰胺)、苯基丁酸酯/盐(例如苯基丁酸钠)和丙戊酸((VP A))和其他短链脂肪酸)、Scriptaid、苏拉明钠、曲古抑菌素A(TSA)、APHA化合物8、Apicidin、丁酸钠、新戊酰氧基甲基丁酸酯(Pivanex，AN-9)、Trapoxin B、Chlamydocin、缩酚酸肽(Depsipeptide)(也称为FR901228或FK228)、苯酰胺(例如CI-994(例如N-乙酰基地那林)和MS-27-275)、MGCD0103、NVP-LAQ-824、CBHA(间羧基肉桂酸二异羟肟酸(m-carboxycinnaminic acid bishydroxamic acid))、JNJ16241199、Tubacin、A-161906、proxamide、oxamflatin、3-Cl-UCHA(例如6-(3-氯苯基脲基)己酸异羟肟酸)、AOE(2-氨基-8-氧代-9,10-环氧基癸酸)、CHAP31和CHAP 50。另一些重编程增强剂包括例如，HDAC的显性阴性形式(例如催化失活形式)、HDAC的siRNA抑制剂和特异性结合HDAC的抗体。这种抑制剂可从例如IOMOL International、Fukasawa、Merck Biosciences、Novartis、Gloucester Pharmaceuticals、Titan Pharmaceuticals、MethylGene和SigmaAldrich获得。
为了证实与本文所述的方法一起使用的多能干细胞的诱导，可以检测分离的克隆的干细胞标志物的表达。源自体细胞的细胞中的这种表达将细胞鉴定为诱导性多能干细胞。干细胞标志物可以选自非限制性组，包括SSEA3、SSEA4、CD9、Nanog、Fbxl5、Ecatl、Esgl、Eras、Gdf3、Fgf4、Cripto、Daxl、Zpf296、Slc2a3、Rexl、Utfl和Natl。例如，在一种情况下，表达Oct4或Nanog的细胞被鉴定为多能的。用于检测这种标志物表达的方法可以包括例如RT-PCR和检测所编码多肽的存在的免疫学方法，如Western印迹或流式细胞术分析。检测不仅可以涉及RT-PCR，还可以包括蛋白标志物的检测。通过RT-PCR或蛋白质检测方法(如免疫细胞化学)可以最佳地鉴定细胞内标志物，而细胞表面标志物容易例如通过免疫细胞化学鉴定。
分离细胞的多能干细胞特征可以通过评估iPSC分化成三个胚层中的每一个的细胞的能力的试验来证实。作为一个例子，可以使用裸鼠中的畸胎瘤形成来评估分离克隆的多能性特征。可以将细胞引入裸鼠中并且可以对由所述细胞产生的肿瘤进行组织学和/或免疫组织化学。例如，包含来自所有三个胚层的细胞的肿瘤的生长进一步指示该细胞是多能干细胞。
产生DMD患者特异性iPSC
本公开的离体方法的一个步骤可涉及产生一个或多个DMD患者特异性iPS细胞或DMD患者特异性iPS细胞系。本领域中存在许多用于产生患者特异性iPS细胞的已确立的方法，如Takahashi和Yamanaka2006；Takahashi,Tanabe等人2007中所述。此外，通过由Anagenesis Biotechnologies开发的技术可以实现多能细胞向肌肉谱系的分化，如国际专利申请公开号WO2013/030243和WO2012/101114中所述。例如，产生步骤可以包括：a)从患者分离体细胞，例如皮肤细胞或成纤维细胞；和b)向所述体细胞中引入多能性相关基因的集合以诱导细胞变成多能干细胞。所述多能性相关基因的集合可以是选自OCT4、SOX2、KLF4、Lin28、NANOG和cMYC的基因中一个或更多个。
基因组编辑
基因组编辑通常是指修饰基因组的核苷酸序列(优选以精确或预定的方式)的过程。本文所述的基因组编辑的方法的实例包括这样的方法，其使用定点核酸酶在基因组中精确的靶位置处切割脱氧核糖核酸(DNA)，从而在基因组内的特定位置产生单链或双链DNA断裂。此类断裂可以并且定期通过天然的内源性细胞过程(例如同源定向修复(HDR)和非同源末端连接(NHEJ))修复，如Cox等人,Nature Medicine 21(2),121-31(2015)中最近综述的那样。NHEJ直接连接由双链断裂产生的DNA末端，有时丢失或添加核苷酸序列，这可破坏或增强基因表达。HDR利用同源序列或供体序列作为模板以在断裂点***确定的DNA序列。同源序列可以在内源基因组中，例如姐妹染色单体。或者，供体可以是外源核酸，如质粒、单链寡核苷酸、双链寡核苷酸、双链体寡核苷酸或病毒，其具有与核酸酶切割的基因座高度同源的区域，但其还可以包含额外的序列或序列变化，包括可被整合入切割的靶基因座中的缺失。第三种修复机制可以是微同源性介导的末端连接(MMEJ)，也称为“替代性NHEJ”，其中遗传结果与NHEJ相似，因为在切割位点可以出现小的缺失和***。MMEJ可以利用DNA断裂位点侧翼的几个碱基对的同源序列以驱动更有利的DNA末端连接修复结果，最近的报道进一步阐明了该过程的分子机制；参见例如Cho和Greenberg,Nature 518,174-76(2015)；Kent等人,Nature Structural and Molecular Biology,Adv.Online doi:10.1038/nsmb.2961(2015)；Mateos-Gomez等人,Nature 518,254-57(2015)；Ceccaldi等人,Nature 528,258-62(2015)。在一些情况下，可基于对DNA断裂位点处的潜在微同源性的分析来预测可能的修复结果。
这些基因组编辑机制中的每一种都可以用于产生期望的基因组变化。基因组编辑方法中的一个步骤可以是：在尽可能接近想要突变的位点的靶基因座内产生一个DNA断裂或两个DNA断裂，后者的形式为双链断裂或两个单链断裂。这可以通过使用本文描述和说明的定点多肽来实现。
定点多肽(例如DNA核酸内切酶)可以在核酸(例如基因组DNA)中引入双链断裂或单链断裂。双链断裂可以刺激细胞的内源DNA修复途径(例如，同源依赖修复或非同源末端连接或替代性的非同源末端连接(A-NHEJ)或微同源性介导的末端连接)。NHEJ可以修复切割的靶核酸而不需要同源模板。这有时可在靶核酸中的切割位点处产生小的缺失或***(***缺失(indel))，并且可导致基因表达被破坏或改变。当同源修复模板或供体可用时，可发生HDR。同源供体模板可包含可以与靶核酸切割位点侧翼的序列同源的序列。姐妹染色单体可以被细胞用作修复模板。然而，为了实现基因组编辑的目的，可以以外源核酸的形式提供修复模板，所述外源性核酸例如质粒、双链体寡核苷酸、单链寡核苷酸、双链寡核苷酸或病毒核酸。利用外源供体模板，可以在同源的侧翼区之间引入另外的核酸序列(例如转基因)或修饰(例如单个或多个碱基变化或缺失)，从而使得另外的或变化的核酸序列也被整合入靶基因座中。MMEJ可以产生与NHEJ类似的遗传结果，因为在切割位点可以出现小的缺失和***。MMEJ可以利用切割位点侧翼的几个碱基对的同源序列以驱动有利的DNA末端连接修复结果。在某些情况下，可以基于对核酸酶靶区域中潜在的微同源性的分析来预测可能的修复结果。
因此，在某些情况下，可以利用同源重组将外源多核苷酸序列***靶核酸切割位点中。外源多核苷酸序列在本文中被称为供体多核苷酸(或供体或供体序列或多核苷酸供体模板)。可将供体多核苷酸、供体多核苷酸的部分、供体多核苷酸的拷贝或供体多核苷酸的拷贝的部分***靶核酸切割位点。供体多核苷酸可以是外源多核苷酸序列，即并非天然存在于靶核酸切割位点的序列。
归因于NHEJ和/或HDR的靶DNA修饰可导致例如突变、缺失、改变、整合、基因校正、基因置换、基因标记、转基因***、核苷酸缺失、基因破坏、易位和/或基因突变。缺失基因组DNA并将非天然核酸整合到基因组DNA中的过程是基因组编辑的例子。
CRISPR核酸内切酶***
可在许多原核生物(例如细菌和古细菌)的基因组中发现CRISPR(成簇的规律间隔的短回文重复)基因组基因座。在原核生物中，CRISPR基因座编码这样的产物，该产物作为一种免疫***起作用以帮助保护原核生物抵抗外来侵入物，例如病毒和噬菌体。CRISPR基因座功能有三个阶段：将新序列整合到CRISPR基因座，表达CRISPR RNA(crRNA)和使外来侵入核酸沉默。已经鉴定了五种类型的CRISPR***(例如，I型、II型、III型、U型和V型)。
CRISPR基因座包括许多被称为“重复”的短重复序列。表达时，重复可形成二级结构(例如发夹)和/或包含非结构化的单链序列。重复通常以簇的形式出现，并且在物种之间常常不同。重复被称为“间隔子”的独特间插序列规律地间隔开，从而产生重复-间隔子-重复基因座架构。间隔子与已知的外来侵入序列相同或具有高度同源性。间隔子-重复单元编码crisprRNA(crRNA)，crRNA被加工成间隔子-重复单元的成熟形式。crRNA包含参与靶向靶核酸的“种子”或间隔子序列(在原核生物中的天然存在形式中，间隔子序列靶向外来侵入核酸)。间隔子序列位于crRNA的5'末端或3'末端。
CRISPR基因座还包含编码CRISPR相关(Cas)基因的多核苷酸序列。Cas基因编码参与原核生物中crRNA功能的生物发生和干扰阶段的核酸内切酶。一些Cas基因包含同源的二级结构和/或三级结构。
II型CRISPR***
自然中的II型CRISPR***中的crRNA生物发生需要反式激活CRISPR RNA(tracrRNA)。tracrRNA可以被内源RNaseIII修饰，然后与crRNA前体阵列中的crRNA重复杂交。可以募集内源RNaseIII以切割crRNA前体。可以使经切割的crRNA经受核糖核酸外切酶修整以产生成熟的crRNA形式(例如5'修整)。tracrRNA可以保持与crRNA杂交，并且tracrRNA和crRNA与定点多肽(例如Cas9)缔合。crRNA-tracrRNA-Cas9复合体中的crRNA可以将复合体引导至crRNA可与之杂交的靶核酸。crRNA与靶核酸杂交可激活Cas9以进行靶向核酸切割。II型CRISPR***中的靶核酸被称为前间隔子邻近基序(PAM)。在自然中，PAM对于促使定点多肽(例如Cas9)与靶核酸结合是必不可少的。II型***(也称为Nmeni或CASS4)被进一步细分为II-A型(CASS4)和II-B(CASS4a)。Jinek等人,Science,337(6096):816-821(2012)显示：CRISPR/Cas9***可用于RNA可编程的基因组编辑，国际专利申请公开号WO2013/176772提供了许多CRISPR/Cas核酸内切酶***用于位点特异性基因编辑的实例和应用。
V型CRISPR***
V型CRISPR***与II型***有几个重要的区别。例如，Cpf1是单一RNA向导的核酸内切酶，与II型***相比缺乏tracrRNA。事实上，Cpf1相关的CRISPR阵列可被加工成成熟crRNA而不需要额外的反式激活tracrRNA。V型CRISPR阵列可被加工成长度为42-44个核苷酸的短成熟crRNA，其中每个成熟crRNA均从19个核苷酸的直接重复开始，随后是23-25个核苷酸的间隔子序列。相比之下，II型***中的成熟crRNA可以从20-24个核苷酸的间隔子序列开始，然后是约22个核苷酸的直接重复。此外，Cpf1可以利用富含T的前间隔子邻近基序，从而使得Cpf1-crRNA复合体有效地切割前面是短的富含T的PAM的靶DNA，这不同于II型***的靶DNA之后的富含G的PAM。因此，V型***在远离PAM的点处切割，而II型***在与邻近PAM的点处切割。另外，与II型***相比，Cpf1通过具有4或5个核苷酸5'悬挂序列的交错DNA双链断裂切割DNA。II型***通过平的(blunt)双链断裂进行切割。与II型***类似，Cpf1含有预测的RuvC样核酸内切酶结构域，但缺少第二HNH核酸内切酶结构域，这与II型***不同。
Cas基因/多肽和前间隔子邻近基序
示例性的CRISPR/Cas多肽包括Fonfara等人,Nucleic Acids Research,42:2577-2590(2014)的图1中的Cas9多肽。自从Cas基因被发现以来，CRISPR/Cas基因命名***经历了大量的重写。上述Fonfara的图5提供了来自多种物种的Cas9多肽的PAM序列。
定点多肽(Site-Directed Polypeptides)
定点多肽是用于基因组编辑中以切割DNA的核酸酶。定点多肽可以作为任一种以下形式施用于细胞或患者：一种或更多种多肽，或编码多肽的一种或更多种mRNA。
在CRISPR/Cas或CRISPR/Cpf1***的情况下，定点多肽可以与向导RNA结合，所述向导RNA进而指定所述多肽定向的靶DNA的位点。在本文公开的CRISPR/Cas或CRISPR/Cpf1***中，定点多肽可以是核酸内切酶，例如DNA核酸内切酶。
定点多肽可包含多个核酸切割(即核酸酶)结构域。两个或更多个核酸切割结构域可以通过接头连接在一起。例如，接头可以包括柔性接头。接头可以包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40或更多个氨基酸的长度。
天然存在的野生型Cas9酶包含两个核酸酶结构域：HNH核酸酶结构域和RuvC结构域。在本文中，“Cas9”是指天然存在的Cas9和重组Cas9二者。本文中考虑的Cas9酶可以包含HNH或HNH样核酸酶结构域，和/或RuvC或RuvC样核酸酶结构域。
HNH或HNH样结构域包含McrA样折叠。HNH或HNH样结构域包含两条反向平行的β-链和α-螺旋。HNH或HNH样结构域包含金属结合位点(例如二价阳离子结合位点)。HNH或HNH样结构域可以切割靶核酸的一条链(例如，crRNA靶向链的互补链)。
RuvC或RuvC样结构域包含RNaseH或RNaseH样折叠。RuvC/RNaseH结构域参与多种类别的基于核酸的功能，包括作用于RNA和DNA。RNaseH结构域包含被多个α-螺旋包围的5条β链。RuvC/RNaseH或RuvC/RNaseH样结构域包含金属结合位点(例如二价阳离子结合位点)。RuvC/RNaseH或RuvC/RNaseH样结构域可以切割靶核酸的一条链(例如，双链靶DNA的非互补链)。
定点多肽可以在核酸(例如基因组DNA)中引入双链断裂或单链断裂。双链断裂可以刺激细胞的内源性DNA修复途径(例如，同源依赖性修复(HDR)或非同源末端连接(NHEJ)或替代性的非同源末端连接(A-NHEJ)或微同源性介导的末端连接(MMEJ))。NHEJ可以修复被切割的靶核酸而不需要同源模板。这有时可以在靶核酸中的切割位点处产生小的缺失或***(***缺失)，并且可导致基因表达被破坏或改变。当同源修复模板或供体可用时，可发生HDR。同源供体模板可包含与靶核酸切割位点侧翼的序列同源的序列。姐妹染色单体可以被细胞用作修复模板。然而，为了实现基因组编辑的目的，可以以外源核酸的形式提供修复模板，所述外源核酸例如质粒、双链体寡核苷酸、单链寡核苷酸或病毒核酸。利用外源供体模板，可以在同源的侧翼区之间引入另外的核酸序列(例如转基因)或修饰(例如单个或多个碱基变化或缺失)，从而使得另外的或改变的核酸序列也被整合入靶基因座中。MMEJ可以产生与NHEJ类似的遗传结果，因为在切割位点可以出现小的缺失和***。MMEJ可以利用切割位点侧翼的几个碱基对的同源序列以驱动有利的DNA末端连接修复结果。在某些情况下，可以基于对核酸酶靶区域中潜在的微同源性的分析来预测可能的修复结果。
因此，在某些情况下，利用同源重组将外源多核苷酸序列***靶核酸切割位点中。外源多核苷酸序列在本文中被称为供体多核苷酸(或供体或供体序列)。可将供体多核苷酸、供体多核苷酸的部分、供体多核苷酸的拷贝或供体多核苷酸的拷贝的部分***靶核酸切割位点。供体多核苷酸可以是外源多核苷酸序列，即并非天然存在于靶核酸切割位点的序列。
归因于NHEJ和/或HDR的靶DNA修饰可导致例如突变、缺失、改变、整合、基因校正、基因置换、基因标记、转基因***、核苷酸缺失、基因破坏、易位和/或基因突变。缺失基因组DNA并将非天然核酸整合到基因组DNA中的过程是基因组编辑的例子。
所述定点多肽可以包含与野生型示例性定点多肽[例如，来自S.pyogenes的Cas9、US2014/0068797序列ID No.8或Sapranauskas等人,Nucleic Acids Res,39(21):9275-9282(2011)]和多种其他定点多肽具有至少10％，至少15％，至少20％，至少30％，至少40％，至少50％，至少60％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
所述定点多肽在10个连续的氨基酸上包含与野生型定点多肽(例如来自S.pyogenes的Cas9，如上所述)至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％的同一性。所述定点多肽可在10个连续的氨基酸上包含与野生型定点多肽(例如来自S.pyogenes的Cas9，如上所述)至多70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％的同一性。定点多肽可在所述定点多肽的HNH核酸酶结构域中的10个连续的氨基酸上包含与野生型定点多肽(例如来自S.pyogenes的Cas9，如上所述)至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％的同一性。定点多肽可在所述定点多肽的HNH核酸酶结构域中的10个连续的氨基酸上包含与野生型定点多肽(例如来自S.pyogenes的Cas9，如上所述)至多70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％的同一性。定点多肽可在所述定点多肽的RuvC核酸酶结构域中的10个连续的氨基酸上包含与野生型定点多肽(例如来自S.pyogenes的Cas9，如上所述)至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％的同一性。定点多肽可在所述定点多肽的RuvC核酸酶结构域中的10个连续的氨基酸上包含与野生型定点多肽(例如来自S.pyogenes的Cas9，如上所述)至多70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％的同一性。
定点多肽可以包含野生型示例性定点多肽的修饰形式。野生型示例性定点多肽的修饰形式可以包含降低定点多肽的核酸切割活性的突变。野生型示例性定点多肽的修饰形式可以具有野生型示例性定点多肽(例如来自S.pyogenes的Cas9，如上所述)的核酸切割活性的少于90％、少于80％、少于70％、少于60％、少于50％、少于40％、少于30％、少于20％、少于10％、少于5％或少于1％。定点多肽的修饰形式可以基本上不具有核酸切割活性。当定点多肽是基本上不具有核酸切割活性的修饰形式时，其在本文中被称为“无酶活性的”。
定点多肽的修饰形式可以包含突变，使得其可以在靶核酸上诱导单链断裂(SSB)(例如通过仅切割双链靶核酸的糖-磷酸酯骨架中的一个)。所述突变可以导致野生型定点多肽(例如来自S.pyogenes的Cas9，如上所述)的多个核酸切割结构域中的一个或更多个的核酸切割活性少于90％、少于80％、少于70％、少于60％、少于50％、少于40％、少于30％、少于20％、少于10％、少于5％或少于1％。所述突变可导致多个核酸切割结构域中的一个或更多个保留切割靶核酸的互补链的能力，但降低其切割靶核酸的非互补链的能力。突变可导致多个核酸切割结构域中的一个或更多个保留切割靶核酸的非互补链的能力，但降低其切割靶核酸的互补链的能力。例如，使野生型示例性S.pyogenes Cas9多肽中的残基(例如Asp10、His840、Asn854和Asn856)突变以使多个核酸切割结构域(例如，核酸酶结构域)中的一个或更多个失活。待突变的残基可对应于野生型示例性S.pyogenes Cas9多肽中的残基Asp10、His840、Asn854和Asn856(例如，如通过序列和/或结构比对所确定的)。突变的非限制性例子包括D10A、H840A、N854A或N856A。本领域技术人员会认识到除丙氨酸替换之外的突变可以是合适的。
D10A突变可以与H840A、N854A或N856A突变中的一种或更多种组合以产生基本上缺乏DNA切割活性的定点多肽。H840A突变可以与D10A、N854A或N856A突变中的一种或更多种相组合以产生基本上缺乏DNA切割活性的定点多肽。N854A突变可以与H840A、D10A或N856A突变中的一种或更多种组合以产生基本上缺乏DNA切割活性的定点多肽。N856A突变可以与H840A、N854A或D10A突变中的一种或更多种组合以产生基本上缺乏DNA切割活性的定点多肽。包含一个基本无活性的核酸酶结构域的定点多肽被称为“切口酶”。
RNA向导的核酸内切酶(例如Cas9)的切口酶变体可用于提高CRISPR介导的基因组编辑的特异性。野生型Cas9通常由单一向导RNA向导，所述向导RNA被设计为与靶序列(例如内源基因组基因座)中指定的个核苷酸的序列杂交。然而，向导RNA和靶基因座之间的几个错配是可以容忍的，这有效地将靶位点中所需同源性的长度减少至例如少至13nt的同源性，从而导致在靶基因组的其他地方结合以及通过CRISPR/Cas9复合体的双链核酸切割(也称为脱靶切割)的可能性提高。由于Cas9的切口酶变体各自仅切割一条链，因此为了产生双链断裂，需要使一对切口酶靠近地在靶核酸的相对链上结合，从而产生一对切口，其是双链断裂的等效物。这要求两种不同的向导RNA(每种切口酶一种)必须靠近地在靶核酸的相对链上结合。这一要求实质上使双链断裂发生所需的同源性的最小长度加倍，从而降低了双链断裂事件在基因组中其他地方发生的可能性，在所述其他地方两个向导RNA位点(如果存在的话)不太可能彼此足够接近以使得双链断裂能够形成。如本领域所述，切口酶还可用于促进HDR(相对于NHEJ)。通过使用有效介导期望变化的特定供体序列，HDR可用于将选择的变化引入基因组中的靶位点。用于基因编辑中的多种CRISPR/Cas***的描述可以在例如国际专利申请公开号WO2013/176772和Nature Biotechnology 32,347–355(2014)以及其中引用的参考文献中找到。
考虑的突变可以包括替换、添加和缺失，或其任何组合。所述突变将被突变的氨基酸转化为丙氨酸。所述突变将被突变的氨基酸转化为另一种氨基酸(例如甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、组氨酸、赖氨酸或精氨酸)。所述突变将被突变的氨基酸转化成天然氨基酸(例如硒代蛋氨酸)。所述突变将被突变的氨基酸转化为氨基酸模拟物(例如磷酸模拟物(phosphomimics))。所述突变可以是保守突变。例如，所述突变可以将被突变的氨基酸转化为与被突变的氨基酸的大小、形状、电荷、极性、构象和/或旋转异构体类似的氨基酸(例如半胱氨酸/丝氨酸突变、赖氨酸/天冬酰胺突变、组氨酸/苯丙氨酸突变)。所述突变可导致读码框发生移动和/或产生提前的终止密码子。所述突变可引起影响一个或更多个基因的表达的基因或基因座的调控区的改变。
定点多肽(例如，变体、突变的、无酶活性的和/或附条件无酶活性的定点多肽)可以靶向核酸。定点多肽(例如，变体、突变的、无酶活性的和/或附条件无酶活性的内切核糖核酸酶)可以靶向DNA。定点多肽(例如，变体、突变的、无酶活性的和/或附条件无酶活性的内切核糖核酸酶)可以靶向RNA。
定点多肽可以包含一种或更多种非天然序列(例如，定点多肽是融合蛋白)。
定点多肽可以包含与来自细菌(例如，S.pyogenes)的Cas9具有至少15％氨基酸同一性的氨基酸序列、核酸结合结构域和两个核酸切割结构域(即，HNH结构域和RuvC结构域)。
定点多肽可以包含与来自细菌(例如，S.pyogenes)的Cas9具有至少15％氨基酸同一性的氨基酸序列，和两个核酸切割结构域(即，HNH结构域和RuvC结构域)。
定点多肽可以包含与来自细菌(例如，S.pyogenes)的Cas9具有至少15％氨基酸同一性的氨基酸序列，和两个核酸切割结构域，其中所述核酸切割结构域中的一个或两个与来自细菌(例如，S.pyogenes)的Cas9的核酸酶结构域具有至少50％的氨基酸同一性。
定点多肽可以包含与来自细菌(例如，S.pyogenes)的Cas9具有至少15％氨基酸同一性的氨基酸序列、两个核酸切割结构域(即，HNH结构域和RuvC结构域)和非天然序列(例如核定位信号)或将定点多肽连接到非天然序列的接头。
定点多肽可以包含与来自细菌(例如，S.pyogenes)的Cas9具有至少15％氨基酸同一性的氨基酸序列，两个核酸切割结构域(即，HNH结构域和RuvC结构域)，其中所述定点多肽在所述核酸切割结构域中的一个或两个中包含突变，所述突变使所述核酸酶结构域的切割活性降低至少50％。
定点多肽可以包含与来自细菌(例如，S.pyogenes)的Cas9具有至少15％氨基酸同一性的氨基酸序列，和两个核酸切割结构域(即，HNH结构域和RuvC结构域)，其中一个核酸酶结构域包含天冬氨酸10的突变，和/或其中一个核酸酶结构域可以包含组氨酸840的突变，并且其中所述突变使核酸酶结构域的切割活性降低至少50％。
一种或更多种定点多肽(例如，DNA核酸内切酶)可以包含两种切口酶，其在基因组中的特定基因座处共同产生一个双链断裂；或者包含四种切口酶，其在基因组中的特定基因座处共同产生或导致两个双链断裂。或者，一种定点多肽(例如DNA核酸内切酶)可以在基因组中的特定基因座处产生或导致一个双链断裂。
基因组靶向核酸
本公开提供了基因组靶向核酸，其能够使相关多肽(例如，定点多肽)的活性指向靶核酸内的特定靶序列。基因组靶向核酸可以是RNA。基因组靶向RNA在本文中被称为“向导RNA”或“gRNA”。向导RNA可以至少包含与感兴趣的靶核酸序列杂交的间隔子序列，和CRISPR重复序列。在II型***中，gRNA还包含被称为tracrRNA序列的第二RNA。在II型向导RNA(gRNA)中，CRISPR重复序列和tracrRNA序列相互杂交以形成双链体。在V型向导RNA(gRNA)中，crRNA形成双链体。在这两个***中，双链体可以结合定点多肽，使得向导RNA和定点多肽形成复合体。基因组靶向核酸可以凭借其与定点多肽的关联为复合体提供靶向特异性。因此基因组靶向核酸可以指导定点多肽的活性。
示例性的向导RNA包括序列表中的间隔子序列，显示了其靶序列的基因组位置(所述靶序列在肌营养不良蛋白基因内或附近)以及相关的Cas9切割位点，其中所述基因组位置基于GRCh38/hg38人类基因组组装体。
可以将每种向导RNA设计为包括与其基因组靶序列互补的间隔子序列，所述基因组靶序列在肌营养不良蛋白基因内或附近。例如，可以将序列表中的每个间隔子序列置于单链向导RNA(sgRNA)(例如RNA嵌合体)或crRNA(连同相应的tracrRNA)中。参见Jinek等人,Science,337,816-821(2012)和Deltcheva等人,Nature,471,602-607(2011)。
基因组靶向核酸可以是双分子向导RNA。基因组靶向核酸可以是单分子向导RNA。
双分子向导RNA可以包含两条RNA链。第一链包含(在5’至3’方向上)任选的间隔子延伸序列、间隔子序列和最小CRISPR重复序列。第二链可包含最小tracrRNA序列(与最小CRISPR重复序列互补)、3’tracrRNA序列和任选的tracrRNA延伸序列。
II型***中的单分子向导RNA(sgRNA)可以包含(在5’至3’方向上)任选的间隔子延伸序列、间隔子序列、最小CRISPR重复序列、单分子向导接头、最小tracrRNA序列、3’tracrRNA序列和任选的tracrRNA延伸序列。任选的tracrRNA延伸可以包含赋予向导RNA额外功能(例如，稳定性)的元件。单分子向导接头可连接最小CRISPR重复和最小tracrRNA序列以形成发夹结构。任选的tracrRNA延伸可以包含一个或更多个发夹。
V型***中的单分子向导RNA(sgRNA)可以包含(在5’至3’方向上)最小CRISPR重复序列和间隔子序列。
作为示例性说明，CRISPR/Cas/Cpf1***中使用的向导RNA或其他较小的RNA可容易地通过化学手段合成，如下文所示和本领域中所述。虽然化学合成程序不断扩展，但通过诸如高效液相色谱法(HPLC，其避免使用凝胶诸如PAGE)的程序来纯化此类RNA随着多核苷酸长度增加到显著超过一百左右核苷酸而倾向于变得更具挑战性。用于生成更长长度的RNA的一种方法是产生两个或更多个连接在一起的分子。长得多的RNA(如编码Cas9或Cpf1核酸内切酶的RNA)更容易酶促产生。如本领域中所述，可以在化学合成和/或酶促生成RNA期间或之后引入各种类型的RNA修饰，例如提高稳定性、降低先天免疫应答的可能性或程度和/或增强其他属性的修饰。
间隔子延伸序列
在基因组靶向核酸的一些实例中，间隔子延伸序列可以更改活性，提供稳定性和/或提供基因组靶向核酸修饰的位置。间隔子延伸序列可以更改在靶或脱靶活性或特异性。在一些实例中，可以提供间隔子延伸序列。间隔子延伸序列的长度可以多于1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、220、240、260、280、300、320、340、360、380、400、1000、2000、3000、4000、5000、6000或7000或更多个核苷酸。间隔子延伸序列的长度可以少于1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、220、240、260、280、300、320、340、360、380、400、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000或更多个核苷酸。间隔子延伸序列的长度可以少于10个核苷酸。间隔子延伸序列的长度可以介于10-30个核苷酸之间。间隔子延伸序列的长度可以介于30-70个核苷酸之间。
间隔子延伸序列可以包含另一部分(moiety)(例如稳定性控制序列、内切核糖核酸酶结合序列、核酶)。该部分可以降低或提高核酸靶向核酸的稳定性。该部分可以是转录终止子区段(即转录终止序列)。该部分可以在真核细胞中起作用。该部分可以在原核细胞中起作用。该部分可以在真核细胞和原核细胞中都起作用。合适的部分的非限制性实例包括：5’帽(例如，7-甲基鸟苷酸帽(m7G))，核糖开关序列(例如以允许调控稳定性和/或调控对蛋白质和蛋白质复合体的可及性)，形成dsRNA双链体(即发夹)的序列，使RNA靶向亚细胞位置(例如核、线粒体、叶绿体等)的序列，提供示踪(例如与荧光分子直接缀合、与便于荧光检测的部分缀合、允许荧光检测的序列等)的修饰或序列，和/或提供蛋白质(例如，作用于DNA的蛋白质，包括转录激活物、转录阻遏物、DNA甲基转移酶、DNA脱甲基酶、组蛋白乙酰转移酶、组蛋白脱乙酰酶等)结合位点的修饰或序列。
间隔子序列
间隔子序列与感兴趣的靶核酸中的序列杂交。基因组靶向核酸的间隔子可以通过杂交(即碱基配对)以序列特异性方式与靶核酸相互作用。间隔子的核苷酸序列可以因感兴趣的靶核酸的序列而异。
在本文的CRISPR/Cas***中，可以将间隔子序列设计为与靶核酸杂交，所述靶核酸位于所述***中使用的Cas9酶的PAM的5’。间隔子可以完全匹配靶序列或可以具有错配。每种Cas9酶都具有其在靶DNA中识别的特定PAM序列。例如，S.pyogenes在靶核酸中识别包含序列5’-NRG-3’的PAM，其中R包含A或G，其中N是任何核苷酸，并且N紧邻间隔子序列所靶向的靶核酸序列的3’。
靶核酸序列可以包含20个核苷酸。靶核酸可以包含少于20个核苷酸。靶核酸可以包含多于20个核苷酸。靶核酸可以包含至少5、10、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30或更多个核苷酸。在一些实例中，靶核酸包含至多5、10、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30或更多个核苷酸。靶核酸序列可以包含紧邻PAM的第一核苷酸的5’的20个碱基。例如，在包含5'-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNRG-3'(SEQ ID NO.1,410,473)的序列中，靶核酸可以包含对应于N的序列，其中N是任何核苷酸，并且带下划线的NRG序列是S.Pyogenes PAM。
与靶核酸杂交的间隔子序列的长度可以为至少约6个核苷酸(nt)。间隔子序列可以为至少约6nt、至少约10nt、至少约15nt、至少约18nt、至少约19nt、至少约20nt、至少约25nt、至少约30nt、至少约35nt或至少约40nt、约6nt至约80nt、约6nt至约50nt、约6nt至约45nt、约6nt至约40nt、约6nt至约35nt、约6nt至约30nt、约6nt至约25nt、约6nt至约20nt、约6nt至约19nt、约10nt至约50nt、约10nt至约45nt、约10nt至约40nt、约10nt至约35nt、约10nt至约30nt、约10nt至约25nt、约10nt至约20nt、约10nt至约19nt、约19nt至约25nt、约19nt至约30nt、约19nt至约35nt、约19nt至约40nt、约19nt至约45nt、约19nt至约50nt、约19nt至约60nt、约20nt至约25nt、约20nt至约30nt、约20nt至约35nt、约20nt至约40nt、约20nt至约45nt、约20nt至约50nt或约20nt至约60nt。在一些实例中，间隔子序列可以包含20个核苷酸。间隔子序列可以包含19个核苷酸。
在一些实例中，间隔子序列与靶核酸之间的互补性百分比为至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％。在一些实例中，间隔子序列与靶核酸之间的互补性百分比为至多约30％、至多约40％、至多约50％、至多约60％、至多约65％、至多约70％、至多约75％、至多约80％、至多约85％、至多约90％、至多约95％、至多约97％、至多约98％、至多约99％或100％。在一些实例中，在靶核酸的互补链的靶序列的六个连续的最5’核苷酸上，间隔子序列与靶核酸之间的互补性百分比为100％。在约20个连续核苷酸上，间隔子序列与靶核酸之间的互补性百分比可以为至少60％。间隔子序列和靶核酸的长度可以相差1至6个核苷酸，其可以被认为是一个或多个凸出。
可以使用计算机程序来设计或选择间隔子序列。计算机程序可以使用变量，例如预测的解链温度、二级结构形成、预测的退火温度、序列同一性、基因组背景(genomiccontext)、染色质可及性、％GC、基因组事件(genomic occurrence)(例如，相同或相似但由于错配、***或缺失而在一个或更多个点处不同的序列)的频率、甲基化状态、SNP的存在等。
最小CRISPR重复序列
最小CRISPR重复序列是与参照CRISPR重复序列(例如来自S.pyogenes的crRNA)具有至少约30％、约40％、约50％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或100％的序列同一性的序列。
最小CRISPR重复序列可包含可与细胞中的最小tracrRNA序列杂交的核苷酸。最小CRISPR重复序列和最小tracrRNA序列可形成双链体，即碱基配对的双链结构。最小CRISPR重复序列和最小tracrRNA序列一起可以结合定点多肽。最小CRISPR重复序列的至少部分可以与最小tracrRNA序列杂交。最小CRISPR重复序列的至少部分可包含与最小tracrRNA序列至少约30％、约40％、约50％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或100％的互补。最小CRISPR重复序列的至少部分可包含与最小tracrRNA序列至多约30％、约40％、约50％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或100％的互补。
最小CRISPR重复序列的长度可以为约7个核苷酸至约100个核苷酸。例如，最小CRISPR重复序列的长度为约7个核苷酸(nt)至约50nt、约7nt至约40nt、约7nt至约30nt、约7nt至约25nt、约7nt至约20nt、约7nt至约15nt、约8nt至约40nt、约8nt至约30nt、约8nt至约25nt、约8nt约20nt、约8nt至约15nt、约15nt至约100nt、约15nt至约80nt、约15nt至约50nt、约15nt至约40nt、约15nt至约30nt或约15nt至约25nt。在一些实例中，最小CRISPR重复序列的长度为约9个核苷酸。最小CRISPR重复序列的长度可以为约12个核苷酸。
在至少6、7或8个连续核苷酸的一段上，最小CRISPR重复序列与参照最小CRISPR重复序列(例如来自S.pyogenes的野生型crRNA)可以至少约60％相同。例如，在至少6、7或8个连续核苷酸的一段上，最小CRISPR重复序列与参照最小CRISPR重复序列至少约65％相同、至少约70％相同、至少约75％相同、至少约80％相同、至少约85％相同、至少约90％相同、至少约95％相同、至少约98％相同、至少约99％相同或100％相同。
最小tracrRNA序列
最小tracrRNA序列可以是与参照tracrRNA序列(例如来自S.pyogenes的野生型tracrRNA)具有至少约30％、约40％、约50％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或100％的序列同一性的序列。
最小tracrRNA序列可包含与细胞中的最小CRISPR重复序列杂交的核苷酸。最小tracrRNA序列和最小CRISPR重复序列形成双链体，即碱基配对的双链结构。最小tracrRNA序列和最小CRISPR重复一起结合定点多肽。最小tracrRNA序列的至少部分可以与最小CRISPR重复序列杂交。最小tracrRNA序列可与最小CRISPR重复序列至少约30％、约40％、约50％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或100％互补。
最小tracrRNA序列的长度可以为约7个核苷酸至约100个核苷酸。例如，最小tracrRNA序列的长度可以为约7个核苷酸(nt)至约50nt、约7nt至约40nt、约7nt至约30nt、约7nt至约25nt、约7nt至约20nt、约7nt至约15nt、约8nt至约40nt、约8nt至约30nt、约8nt至约25nt、约8nt约20nt、约8nt至约15nt、约15nt至约100nt、约15nt至约80nt、约15nt至约50nt、约15nt至约40nt、约15nt至约30nt或约15nt至约25nt。最小tracrRNA序列的长度可以为约9个核苷酸。最小tracrRNA序列可以为约12个核苷酸。最小tracrRNA可以由上文的Jinek等人中所述的23-48nt的tracrRNA组成。
在至少6、7或8个连续核苷酸的一段上，最小tracrRNA序列与参照最小tracrRNA(例如来自S.pyogenes的野生型tracrRNA)可以至少约60％相同。例如，在至少6、7或8个连续核苷酸的一段上，最小tracrRNA序列与参照最小tracrRNA序列可以至少约65％相同、约70％相同、约75％相同、约80％相同、约85％相同、约90％相同、约95％相同、约98％相同、约99％相同或100％相同。
最小CRISPR RNA与最小tracrRNA之间的双链体可包含双螺旋。最小CRISPR RNA与最小tracrRNA之间的双链体可以包含至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10或更多个核苷酸。最小CRISPR RNA与最小tracrRNA之间的双链体可包含至多约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10或更多个核苷酸。
双链体可以包含错配(即，双链体的两条链不是100％互补的)。双链体可以包含至少约1、2、3、4或5个错配。双链体可以包含至多约1、2、3、4或5个错配。双链体可以包含不超过2个错配。
凸出(Bulges)
在某些情况下，最小CRISPR RNA与最小tracrRNA之间的双链体中可存在“凸出”。凸出是双链体内核苷酸的未配对区域。凸出可以有助于双链体与定点多肽的结合。凸出可以在双链体的一侧包含未配对的5'-XXXY-3'，其中X是任何嘌呤，Y包含可以与相反链上的核苷酸形成摆动配对(wobble pair)的核苷酸，并且在双链体的另一侧包含未配对的核苷酸区域。双链体的两侧上未配对核苷酸的数目可以不同。
在一个实例中，凸出可以在凸出的最小CRISPR重复链上包含未配对的嘌呤(例如腺嘌呤)。在一些实例中，凸出可以包含凸出的最小tracrRNA序列链的未配对的5'-AAGY-3'，其中Y包含可以与最小CRISPR重复链上的核苷酸形成摆动配对的核苷酸。
双链体的最小CRISPR重复侧的凸出可包含至少1、2、3、4或5或更多个未配对的核苷酸。双链体的最小CRISPR重复侧的突起可以包含至多1、2、3、4或5或更多个未配对的核苷酸。双链体的最小CRISPR重复侧的凸出可包含1个未配对的核苷酸。
双链体的最小tracrRNA序列侧的凸出可包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10或更多个未配对的核苷酸。双链体的最小tracrRNA序列侧的凸出可包含至多1、2、3、4、5、6、7、8、9或10或更多个未配对的核苷酸。双链体第二侧(例如双链体的最小tracrRNA序列侧)的凸出可包含4个未配对的核苷酸。
凸出可以包括至少一个摆动配对。在一些实例中，凸出包括至多一个摆动配对。在一些实例中，凸出可以包含至少一个嘌呤核苷酸。凸出可以包含至少3个嘌呤核苷酸。凸出序列可以包含至少5个嘌呤核苷酸。凸出序列可以包含至少一个鸟嘌呤核苷酸。凸出序列可以包含至少一个腺嘌呤核苷酸。
发夹
在多种实例中，一个或更多个发夹可位于最小tracrRNA的3’tracrRNA序列的3’。
发夹可以从最小CRISPR重复和最小tracrRNA序列双链体中的最后一个配对核苷酸3’的至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20或更多个核苷酸开始。发夹可以从最小CRISPR重复和最小tracrRNA序列双链体的最后一个配对核苷酸3’的至多约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10或更多个核苷酸开始。
发夹可以包含至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20或更多个连续的核苷酸。发夹可以包含至多约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或更多个连续的核苷酸。
发夹可以包含CC二核苷酸(即，两个连续的胞嘧啶核苷酸)。
发夹可包含双链核苷酸(例如，发夹中杂交在一起的核苷酸)。例如，发夹可以包含与3’tracrRNA序列的发夹双链体中的GG二核苷酸杂交的CC二核苷酸。
一个或更多个发夹可以与定点多肽的向导RNA相互作用区域相互作用。
在一些实例中，存在两个或更多个发夹；而在另一些实例中，存在三个或更多个发夹。
3’tracrRNA序列
3’tracrRNA序列可以包含与参照tracrRNA序列(例如来自S.pyogenes的tracrRNA)具有至少约30％、约40％、约50％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或100％序列同一性的序列。
3’tracrRNA序列的长度可以为约6个核苷酸至约100个核苷酸。例如，3’tracrRNA序列的长度可以为约6个核苷酸(nt)至约50nt、约6nt至约40nt、约6nt至约30nt、约6nt至约25nt的长度、约6nt至约20nt、约6nt至约15nt、约8nt至约40nt、约8nt至约30nt、约8nt至约25nt、约8nt约20nt、约8nt至约15nt、约15nt至约100nt、约15nt至约80nt、约15nt至约50nt、约15nt至约40nt、约15nt至约30nt或约15nt至约25nt。3’tracrRNA序列的长度可以为约14个核苷酸。
在至少6、7或8个连续核苷酸的一段上，3’tracrRNA序列与参照3’tracrRNA序列(例如来自S.pyogenes的野生型3’tracrRNA序列)可以至少约60％相同。例如，在至少6、7或8个连续核苷酸的一段上，3’tracrRNA序列与参照3’tracrRNA序列可以至少约60％相同、约65％相同、约70％相同、约75％相同、约80％相同、约85％相同、约90％相同、约95％相同、约98％相同、约99％相同或100％相同。
3’tracrRNA序列可以包含多于一个双链区(例如发夹、杂交区)。3’tracrRNA序列可以包含两个双链区。
3’tracrRNA序列可以包含茎环结构。3’tracrRNA中的茎环结构可以包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20或更多个核苷酸。3’tracrRNA中的茎环结构可以包含至多1、2、3、4、5、6、7、8、9或10或更多个核苷酸。茎环结构可以包含功能性部分。例如，茎环结构可包含适配子(aptamer)、核酶、蛋白质相互作用发夹、CRISPR阵列、内含子或外显子。茎环结构可以包含至少约1、2、3、4或5或更多个功能性部分。茎环结构可以包含至多约1、2、3、4或5或更多个功能性部分。
3’tracrRNA序列中的发夹可以包含P-结构域。在一些实例中，P-结构域可以包含发夹中的双链区。
tracrRNA延伸序列
无论tracrRNA是在单分子向导还是双分子向导的情况下，都可以提供tracrRNA延伸序列。tracrRNA延伸序列的长度可以为约1个核苷酸至约400个核苷酸。tracrRNA延伸序列的长度可以为多于1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、220、240、260、280、300、320、340、360、380或400个核苷酸。tracrRNA延伸序列的长度可以为约20至约5000或更多个核苷酸。tracrRNA延伸序列的长度可以为多于1000个核苷酸。tracrRNA延伸序列的长度可以为少于1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、220、240、260、280、300、320、340、360、380、400或更多个核苷酸。tracrRNA延伸序列的长度可以为少于1000个核苷酸。tracrRNA延伸序列的长度可以为少于10个核苷酸。tracrRNA延伸序列的长度可以为10-30个核苷酸。tracrRNA延伸序列的长度可以是30-70个核苷酸。
tracrRNA延伸序列可以包含功能性部分(例如稳定性控制序列、核酶、内切核糖核酸酶结合序列)。功能性部分可以包含转录终止子区段(即转录终止序列)。功能性部分的总长度可以为约10个核苷酸(nt)至约100个核苷酸、约10nt至约20nt、约20nt至约30nt、约30nt至约40nt、约40至约50nt、约50nt至约60nt、约60nt至约70nt、约70nt至约80nt、约80nt至约90nt、或约90nt至约100nt、约15nt至约80nt、约15nt至约50nt、约15nt至约40nt、约15nt至约30nt或约15nt至约25nt。功能性部分可以在真核细胞中起作用。功能性部分可以在原核细胞中起作用。功能性部分可以在真核细胞和原核细胞中都起作用。
合适的tracrRNA延伸功能性部分的非限制性实例包括3’-聚腺苷酸化尾巴，核糖开关序列(例如以允许调控稳定性和/或调控对蛋白质和蛋白质复合体的可及性)，形成dsRNA双链体(即发夹)的序列，使RNA靶向亚细胞位置(例如核、线粒体、叶绿体等)的序列，提供示踪(例如与荧光分子直接缀合、与便于荧光检测的部分缀合、允许荧光检测的序列等)的修饰或序列，和/或提供蛋白质(例如，作用于DNA的蛋白质，包括转录激活物、转录阻遏物、DNA甲基转移酶、DNA脱甲基酶、组蛋白乙酰转移酶、组蛋白脱乙酰酶等)结合位点的修饰或序列。tracrRNA延伸序列可以包含引物结合位点或分子指标(index)(例如信标序列)。tracrRNA延伸序列可以包含一个或更多个亲和标签。
单分子向导接头序列
单分子向导核酸的接头序列的长度可以为约3个核苷酸至约100个核苷酸。例如，在上文所述的Jinek等人中，使用了简单的4核苷酸“四环”(-GAAA-)，Science,337(6096):816-821(2012)。示例性的接头的长度为约3个核苷酸(nt)至约90nt、约3nt至约80nt、约3nt至约70nt、约3nt至约60nt、约3nt至约50nt、约3nt至约40nt、约3nt至约30nt、约3nt至约20nt、约3nt至约10nt。例如，接头的长度可以为约3nt至约5nt、约5nt至约10nt、约10nt至约15nt、约15nt至约20nt、约20nt至约25nt、约25nt至约30nt、约30nt至约35nt、约35nt至约40nt、约40nt至约50nt、约50nt至约60nt、约60nt至约70nt、约70nt至约80nt、约80nt至约90nt或约90nt至约100nt。单分子向导核酸的接头可以介于4个核苷酸至40个核苷酸之间。接头可以是至少约100、500、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500或7000或更多个核苷酸。接头可以是至多约100、500、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500或7000或更多个核苷酸。
接头可以包含多种序列中的任何，但在一些实例中，接头不包含与向导RNA的其他部分具有大区域的同源性的序列，其可引起分子内结合，这可干扰向导的其它功能区。在上文所述的Jinek等人中，使用了简单的4核苷酸序列-GAAA-，Science,337(6096):816-821(2012)，但也可以使用许多其他序列，包括更长的序列。
接头序列可以包含功能性部分。例如，接头序列可以具有一个或更多个特征，包括适配子、核酶、蛋白质相互作用发夹、蛋白质结合位点、CRISPR阵列、内含子或外显子。接头序列可以包含至少约1、2、3、4或5或更多个功能性部分。在一些实例中，接头序列可以包含至多约1、2、3、4或5或更多个功能性部分。
通过缺失(切除)、***或置换(缺失和***)一个或更多个外显子或异常内含子剪接受体或供***点来校正细胞的基因组工程策略
本公开的离体方法的步骤涉及利用基因组工程编辑/校正DMD患者特异性iPS细胞。同样地，本公开的体内方法的步骤涉及利用基因组工程编辑/校正DMD患者中的肌肉细胞。类似地，本公开的细胞方法中的步骤涉及通过基因组工程编辑/校正人类细胞中的肌营养不良蛋白基因。
DMD患者表现出多种多样的肌营养不良蛋白基因突变。因此，不同的患者通常需要不同的矫正策略。任何CRISPR核酸内切酶均可用于本公开的方法中，每种CRISPR核酸内切酶都具有其自身的相关PAM，所述PAM可以是或可以不是疾病特异性的。例如，已经在序列表的SEQ ID NO：1-467,030和1,410,430-1,410,472中鉴定了利用来自S.pyogenes的CRISPR/Cas9核酸内切酶靶向肌营养不良蛋白基因的gRNA间隔子序列。已经在序列表的SEQ ID NO：467,031-528,196中鉴定了利用来自S.aureus的CRISPR/Cas9核酸内切酶靶向肌营养不良蛋白基因的gRNA间隔子序列。已经在序列表的SEQ ID NO：528,197-553,198中鉴定了利用来自S.thermophilus的CRISPR/Cas9核酸内切酶靶向肌营养不良蛋白基因的gRNA间隔子序列。已经在序列表的SEQ ID NO：553,199-563,911中鉴定了利用来自T.denticola的CRISPR/Cas9核酸内切酶靶向肌营养不良蛋白基因的gRNA间隔子序列。已经在序列表的SEQID NO：563,912-627,854和1,410,400-1,410,402中鉴定了利用来自N.meningitides的CRISPR/Cas9核酸内切酶靶向肌营养不良蛋白基因的gRNA间隔子序列。已经在序列表的SEQID NO：627,855-1,410,399和1,410,403-1,410,429中鉴定了利用来自Acidominoccoccus、Lachnospiraceae和Franciscella Novicida的CRISPR/Cpf1核酸内切酶靶向肌营养不良蛋白基因的gRNA间隔子序列。
一种基因组工程策略涉及外显子缺失。靶向缺失特定外显子可以是用单一治疗混合物治疗大的患者子集的有吸引力的策略。据预测，单外显子缺失可治疗高达13％的患者，而多外显子缺失可通过重建肌营养不良蛋白读码框治疗高达62％的患者。虽然多外显子缺失可以作用于更多患者，但对于较大的缺失而言，缺失效率随着大小的增加而大幅降低。因此，优选缺失的大小可以在400-350,000个碱基对(bp)的范围内。例如，缺失的大小可以在400-1,000；1000-5000；5,000-10,000、10,000-25,000；25,000-50,000、50,000-100,000；100,000-200,000；或200,000-350,000个碱基对的范围内。
如前所述，DMD基因含有79个外显子。可以缺失79个外显子或异常内含子剪接受体或供***点中的任何一个或更多个以重建肌营养不良蛋白读码框。该方法提供了可用于缺失外显子2、8、43、44、45、46、50、51、52、53、70、45-53或45-55的gRNA对，因为这些是被预计作用于最大的患者子集的区域(参见表1和2；表2给出的百分比是文献报道的平均值)。
可以通过缺失和/或HDR来修复DMD基因的不同区域。在感兴趣的基因组区域内切割的某些gRNA组合可用于校正靶向的外显子中的突变。坐标基于GRch38/hg38基因组组装体(表1)。
表1
表2
所述方法提供了通过切割基因两次来缺失外显子2的gRNA对，一种gRNA在外显子2的5’端切割，另一种gRNA在外显子2的3’端切割。
所述方法提供了通过切割基因两次来缺失外显子8的gRNA对，一种gRNA在外显子8的5’端切割，另一种gRNA在外显子8的3’端切割。
所述方法提供了通过切割基因两次来缺失外显子43的gRNA对，一种gRNA在外显子43的5’端切割，另一种gRNA在外显子43的3’端切割。
所述方法提供了通过切割基因两次来缺失外显子44的gRNA对，一种gRNA在外显子44的5’端切割，另一种gRNA在外显子44的3’端切割。
所述方法提供了通过切割基因两次来缺失外显子45的gRNA对，一种gRNA在外显子45的5’端切割，另一种gRNA在外显子45的3’端切割。
所述方法提供了通过切割基因两次来缺失外显子46的gRNA对，一种gRNA在外显子46的5’端切割，另一种gRNA在外显子46的3’端切割。
所述方法提供了通过切割基因两次来缺失外显子50的gRNA对，一种gRNA在外显子50的5’端切割，另一种gRNA在外显子50的3’端切割。
所述方法提供了通过切割基因两次来缺失外显子51的gRNA对，一种gRNA在外显子51的5’端切割，另一种gRNA在外显子51的3’端切割。
所述方法提供了通过切割基因两次来缺失外显子52的gRNA对，一种gRNA在外显子52的5’端切割，另一种gRNA在外显子52的3’端切割。
所述方法提供了通过切割基因两次来缺失外显子53的gRNA对，一种gRNA在外显子53的5’端切割，另一种gRNA在外显子53的3’端切割。
所述方法提供了通过切割基因两次来缺失外显子70的gRNA对，一种gRNA在外显子70的5’端切割，另一种gRNA在外显子70的3’端切割。
所述方法提供了通过切割基因两次来缺失外显子45-53的gRNA对，一种gRNA在外显子45的5’端切割，另一种gRNA在外显子53的3’端切割。
所述方法提供了通过切割基因两次来缺失外显子45-55的gRNA对，一种gRNA在外显子45的5’端切割，另一种gRNA在外显子55的3’端切割。
另一种基因组工程策略涉及通过同源定向修复(HDR)(也称为同源重组(HR))来***或置换一个或更多个外显子或异常内含子剪接受体或供***点。同源定向修复是用于治疗由于小的***/缺失或点突变而具有提前的终止密码子的患者的一种策略。这种策略能够重建整个读码框并完全逆转患病状态，而不是进行将DMD表型转化为BMD表型的大基因组缺失。该策略需要基于患者的提前终止位置的更加定制化的方法。大多数肌营养不良蛋白外显子较小(<300bp)。这是有利的，因为HDR效率与供体分子的大小负相关。此外，预计供体模板能够装入尺寸有限的腺相关病毒(AAV)分子，所述AAV分子已显示出是供体模板递送的有效手段。
同源直接修复是修复双链断裂(DSB)的细胞机制。最常见的形式是同源重组。HDR还有其他途径，包括单链退火和替代性的HDR。基因组工程工具允许研究人员操纵细胞同源重组途径以对基因组产生位点特异性修饰。已经发现，细胞可以使用以反式提供的合成供体分子修复双链断裂。因此，通过在特定突变附近引入双链断裂并提供合适的供体，可以在基因组中产生靶向变化。相对于接受单独的同源供体的106个细胞中有1个的比率，特异性切割使HDR的比率提高了大于1000倍。特定核苷酸处的同源定向修复(HDR)率是与切割位点的距离的函数，因此选择重叠或最近的靶位点是重要的。基因编辑相较于基因添加提供了优势，因为原位校正使得基因组的其余部分不受干扰。
用于通过HDR编辑的所提供的供体明显不同，但可含有具有小或大侧翼同源臂的预定序列以允许与基因组DNA退火。引入的基因变化侧翼的同源区域可以为30bp或更小，或者大至可以含有启动子、cDNA等的数千碱基(multi-kilobase)盒。已经使用了单链寡核苷酸供体和双链寡核苷酸供体二者。这些寡核苷酸的大小范围可以从小于100nt至超过200nt，但也可以生成和使用更长的ssDNA。可以使用双链供体，包括PCR扩增子、质粒和微环。一般而言，已发现AAV载体可以是递送供体模板的非常有效的方式，但对单个供体的包装限制<5kb。供体的活性转录使HDR提高三倍，这表明包含启动子可以提高转化。相反，供体的CpG甲基化使基因表达和HDR降低。
除了野生型核酸内切酶(例如Cas9)之外，还存在切口酶变体，其可以具有失活的一个或另一个核酸酶结构域，从而导致仅切割一条DNA链。HDR可以由单独的Cas切口酶指导或者使用靶区域侧翼的切口酶对指导。供体可以是单链DNA、带切口的DNA或双链DNA。
供体DNA可以与核酸酶一起提供，或通过多种不同的方法独立提供，例如通过转染、纳米颗粒、微注射或病毒转导。已经提出了一系列拴系(tethering)选项来提高供体对HDR的可用性。实例包括：使供体附着于核酸酶，附着于在附近结合的DNA结合蛋白，或附着于参与DNA末端结合或修复的蛋白质。
修复途径选择可以通过一些培养条件(例如影响细胞周期的那些)或通过靶向DNA修复和相关蛋白来引导。例如，为了增加HDR，可以抑制关键的NHEJ分子，例如KU70、KU80或DNA连接酶IV。
如果不存在供体，则可以使用几种非同源修复途径将来自一种DNA断裂的末端或来自不同断裂的末端连接在一起，其中DNA末端在几乎没有或没有碱基配对的情况下在连接处连接。除了典型的NHEJ之外，还存在类似的修复机制，如alt-NHEJ。如果存在两个断裂，则可以缺失或反转介于中间的区段。NHEJ修复途径可导致连接处的***、缺失或突变。
在核酸酶切割之后，利用NHEJ将15-kb的诱导型基因表达盒***人类细胞系中的确定基因座中。Maresca,M.,Lin,V.G.,Guo,N.&Yang,Y.Obligate ligation-gatedrecombination(ObLiGaRe):custom-designed nuclease-mediated targetedintegration through nonhomologous end joining.Genome Res 23,539-546(2013)。
除了通过NHEJ或HDR的基因组编辑之外，还进行了使用NHEJ途径和HR两者的位点特异性基因***。组合方法可适用于某些设置，可能包括内含子/外显子边界。NHEJ可以证明有效用于内含子中的连接，而无错误的HDR可以更好地适用于编码区域。
如前所述，DMD基因含有79个外显子。可以修复79个外显子中的任何一个或更多个以校正突变和重建肌营养不良蛋白读码框。一些方法提供一种gRNA或一对gRNA，其可用于促使来自多核苷酸供体模板的新序列的整合以在外显子70中***或置换序列，因为数据显示外显子70可倾向于是肌营养不良蛋白基因中最多的提前终止密码子(Tuffery-Giraud,S.等人,Hum Mutat,2009.30(6):第934-45页)(Flanigan,K.M.等人,Hum Mutat,2009.30(12):第1657-66页)。为了使该方法适用于最大量的患者，该方法涉及可***或置换整个外显子70的供体模板。或者，该方法提供一个gRNA或一对gRNA，其可用于促使来自多核苷酸供体模板的新序列的整合以在外显子2、外显子8、外显子43、外显子44、外显子45、外显子46、外显子50、外显子51、外显子52、外显子53或外显子70中***或置换序列。参见表1。
为了确保在HDR之后mRNA前体被恰当地加工，重要的是保持周围的剪接信号完整。剪接供体和受体通常可以在相邻内含子的100个碱基对内。因此，在一些实例中，该方法可提供相对于外显子的内含子连接点切割约+/-0-3100bp的所有gRNA。
一些方法提供了通过切割基因两次来产生缺失的gRNA对，一种gRNA在外显子2的5’端切割，另一种gRNA在外显子2的3’端切割，其促使来自多核苷酸供体模板的新序列的整合以置换外显子2中序列。
或者，一些方法提供了来自前段的一种gRNA以产生一种双链切割，其促使来自多核苷酸供体模板的新序列的***以置换外显子2中序列。
所述方法的一些实例提供了通过切割基因两次来产生缺失的gRNA对，一种gRNA在外显子8的5’端切割，另一种gRNA在外显子8的3’端切割，其促使来自多核苷酸供体模板的新序列的整合以置换外显子8中序列。
或者，一些方法提供了来自前段的一种gRNA以产生一种双链切割，其促使来自多核苷酸供体模板的新序列的***以置换外显子8中序列。
一些方法提供了通过切割基因两次来产生缺失的gRNA对，一种gRNA在外显子43的5’端切割，另一种gRNA在外显子43的3’端切割，其促使来自多核苷酸供体模板的新序列的整合以置换外显子43中序列。
或者，一些方法提供了来自前段的一种gRNA以产生一种双链切割，其促使来自多核苷酸供体模板的新序列的***以置换外显子43中序列。
一些方法提供了通过切割基因两次来产生缺失的gRNA对，一种gRNA在外显子44的5’端切割，另一种gRNA在外显子44的3’端切割，其促使来自多核苷酸供体模板的新序列的整合以置换外显子44中序列。
或者，一些方法提供了来自前段的一种gRNA以产生一种双链切割，其促使来自多核苷酸供体模板的新序列的***以置换外显子44中序列。
一些方法提供了通过切割基因两次来产生缺失的gRNA对，一种gRNA在外显子45的5’端切割，另一种gRNA在外显子45的3’端切割，其促使来自多核苷酸供体模板的新序列的整合以置换外显子45中序列。
或者，一些方法提供了来自前段的一种gRNA以产生一种双链切割，其促使来自多核苷酸供体模板的新序列的***以置换外显子45中序列。
一些方法提供了通过切割基因两次来产生缺失的gRNA对，一种gRNA在外显子46的5’端切割，另一种gRNA在外显子46的3’端切割，其促使来自多核苷酸供体模板的新序列的整合以置换外显子46中序列。
或者，一些方法提供了来自前段的一种gRNA以产生一种双链切割，其促使来自多核苷酸供体模板的新序列的***以置换外显子46中序列。
一些方法提供了通过切割基因两次来产生缺失的gRNA对，一种gRNA在外显子50的5’端切割，另一种gRNA在外显子50的3’端切割，其促使来自多核苷酸供体模板的新序列的整合以置换外显子50中序列。
或者，一些方法提供了来自前段的一种gRNA以产生一种双链切割，其促使来自多核苷酸供体模板的新序列的***以置换外显子50中序列。
一些方法提供了通过切割基因两次来产生缺失的gRNA对，一种gRNA在外显子51的5’端切割，另一种gRNA在外显子51的3’端切割，其促使来自多核苷酸供体模板的新序列的整合以置换外显子51中序列。
或者，一些方法提供了来自前段的一种gRNA以产生一种双链切割，其促使来自多核苷酸供体模板的新序列的***以置换外显子51中序列。
一些方法提供了通过切割基因两次来产生缺失的gRNA对，一种gRNA在外显子52的5’端切割，另一种gRNA在外显子52的3’端切割，其促使来自多核苷酸供体模板的新序列的整合以置换外显子52中序列。
或者，一些方法提供了来自前段的一种gRNA以产生一种双链切割，其促使来自多核苷酸供体模板的新序列的***以置换外显子52中序列。
一些方法提供了通过切割基因两次来产生缺失的gRNA对，一种gRNA在外显子53的5’端切割，另一种gRNA在外显子53的3’端切割，其促使来自多核苷酸供体模板的新序列的整合以置换外显子53中序列。
或者，一些方法提供了来自前段的一种gRNA以产生一种双链切割，其促使来自多核苷酸供体模板的新序列的***以置换外显子53中序列。
一些方法提供了通过切割基因两次来产生缺失的gRNA对，一种gRNA在外显子70的5’端切割，另一种gRNA在外显子70的3’端切割，其促使来自多核苷酸供体模板的新序列的整合以置换外显子70中序列。
或者，一些方法提供了来自前段的一种gRNA以产生一种双链切割，其促使来自多核苷酸供体模板的新序列的***以置换外显子70中序列。
除了通过同源定向修复的单外显子置换之外，我们还描述了用于进行在DMD基因中发现的突变热点的部分cDNA敲入(knock-in)的方法。例如，修复外显子45-55的治疗能够治疗多达62％的患者。并非缺失或置换本文所述的外显子45-55，另一种治疗选择置换外显子45-55的整个基因组区域--其(包括内含子)跨越>350,000bp--cDNA只含有外显子45-55的编码区，跨越约1800bp。置换可以使用同源定向修复方法来实现。通过排除基因间区域，可以更容易地将外显子45-55的cDNA(而非整个基因组区域)与同源臂一起安置到本申请的标题为编码***组分的核酸的部分中描述的任何供体载体中。在这种方法中，从外显子45-55中移除基因组区域的两个gRNA和Cas9或Cpf1可以与供体构建体一起递送以用期望的cDNA敲入置换缺失的区域。
cDNA敲入方法可用于置换任何系列的外显子。
cDNA敲入序列可被优化以含有合成的内含子序列。可以在供体构建体中的外显子之间添加小于天然存在内含子的合成内含子以确保DMD基因座的正确表达和加工。
肌营养不良蛋白基因内的示例性修饰包括上文提到的肌营养不良蛋白基因座内或附近(例如在特定外显子的上游或下游小于3kb、小于2kb、小于1kb、小于0.5kb的区域内)的缺失、***或置换。鉴于肌营养不良蛋白基因中突变的变体相对宽泛，应该理解，上文提及的缺失、***或置换的许多变体(包括但不限于较大的和较小的缺失)预期会导致肌营养不良蛋白读码框的重建和肌营养不良蛋白活性的重建。
这种变体可包括在5’和/或3’方向上比所述特定外显子更大或在任一方向上更小的缺失、***或置换。因此，“靠近”或“接近”特定外显子缺失、***或置换旨在表示：与期望的缺失、***或置换边界(在本文中也称为端点)相关联的SSB或DSB基因座可以在距离所提到的参照基因座小于约3kb的区域内。SSB或DSB基因座可以更接近，在2kb内、1kb内、0.5kb内或0.1kb内。在小缺失的情况下，期望的端点可以位于或“邻近”参照基因座，这旨在表示端点可以距离参照基因座100bp内、50bp内、25bp内或小于约10bp至5bp。
复制或模拟通过外显子跳读和/或重建读码框而产生的产物对于DMD患者的一个优点是：已知其既安全又与DMD改善相关。包括更大或更小的缺失/***/置换的其他实例可以预期提供相同的益处，只要肌营养不良蛋白读码框被重建即可。因此，可以预期：本文描述和说明的缺失、***和置换的许多变体可有效地改善DMD。
靶序列选择
5’边界和/或3’边界的位置相对于特定参照基因座的偏移可用于促使或增强基因编辑的特定应用，这部分取决于选择用于编辑的核酸内切酶***，如本文进一步描述和说明的。
在这种靶序列选择的第一个非限制性实例中，许多核酸内切酶***具有能够指导切割的潜在靶位点的初始选择的规则或标准，例如在CRISPR II型或V型核酸内切酶的情况下，需要邻近DNA切割位点的特定位置处的PAM序列基序。
在靶序列选择或优化的另一非限制性实例中，靶序列和基因编辑核酸内切酶的特定组合的“脱靶”活性的频率(即发生在不同于所选靶序列的位点处的DSB的频率)可以相对于在靶(on-target)活性的频率进行评估。在某些情况下，已在期望的基因组处正确编辑的细胞相对于其他细胞可能具有选择性优势。选择性优势的说明性但非限制性的例子包括：获得属性，例如提高的复制率，持久性，对某些条件的抗性，提高的成功植入率或引入患者体内后在体内的持久性，以及与维持或提高这类细胞的数目或生存力相关的其他属性。在其他情况下，可通过一种或更多种用于鉴定、分类或以其他方式选择已正确编辑的细胞的筛选方法来正向选择已在期望的基因座处正确编辑的细胞。选择性优势和定向选择方法都可以利用与校正相关的表型。在某些情况下，可以编辑细胞两次或更多次以产生第二修饰，所述第二修饰产生新的表型，该表型被用于选择或纯化期望的细胞群体。可通过添加用于选择标记或筛选标记的第二gRNA来产生这种第二修饰。在某些情况下，可以使用含有cDNA和选择标记的DNA片段在期望的基因座处正确编辑细胞。
无论是任何选择性优势可应用还是在特定情况下应用任何定向选择，还可以通过考虑脱靶频率来指导靶序列选择，以提高应用的有效性和/或降低不同于期望靶标的位点处不期望改变的可能性。如本文和本领域中进一步描述和说明的，脱靶活性的发生可受多种因素影响，包括靶位点与各种脱靶位点之间的相似性和相异性，以及所用的特定核酸内切酶。可以获得帮助预测脱靶活性的生物信息学工具，并且通常这类工具还可用于鉴定脱靶活性的最可能位点，然后可以在实验设置中评估这些位点以评价脱靶活性与在靶活性的相对频率，从而允许选择具有较高相对在靶活性的序列。本文提供了这种技术的说明性例子，其他在本领域中是已知的。
靶序列选择的另一个方面涉及同源重组事件。共享同源区域的序列可以充当导致间插序列缺失的同源重组事件的焦点。这种重组事件发生在染色体和其他DNA序列的正常复制过程中，以及当合成DNA序列时的其他时间，例如在修复双链断裂(DSB)的情况下，DSB在正常细胞复制周期期间定期发生，但也可以通过发生各种事件(例如紫外线和DNA断裂的其他诱导物)的出现或某些剂(如各种化学诱导物)的存在而增强。许多这样的诱导物导致DSB在基因组中不加区分地发生，而DSB在正常细胞中可被定期诱导和修复。在修复过程中，原始序列可以被完全保真地重构，但是，在某些情况下，小的***或缺失(称为“***缺失”)被引入DSB位点。
也可在特定位置特异性诱导DSB，如在本文所述的核酸内切酶***的情况下，所述核酸内切酶***可用于在选择的染色***置处引起定向或优先的基因修饰事件。同源序列倾向于在DNA修复(以及复制)的背景下发生重组可以在许多情况下被利用，并且是基因编辑***(例如CRISPR)的一种应用的基础，其中利用同源定向修复将通过使用“供体”多核苷酸提供的感兴趣序列***到期望的染色***置中。
特定序列之间的同源性区域也可用于产生期望的缺失，所述区域可以是“微同源性”的小区域，其可包含少至十个碱基对或更少。例如，可以在展示出与附近序列的微同源性的位点处引入单个DSB。在这种DSB的正常修复过程中，伴随高频率出现的结果是间插序列的缺失，这是由于DSB促使的重组和伴随的细胞修复过程而导致的。
然而，在某些情况下，在同源性区域内选择靶序列也可以产生大得多的缺失，包括基因融合(当缺失在编码区中时)，考虑到特定情况，这可能是或可能不是期望的。
本文提供的实例进一步说明了用于产生DSB的各种靶区域的选择，所述DSB旨在诱导导致肌营养不良蛋白读码框重建的破坏、缺失或置换，以及所述区域内特定靶序列的选择，所述特定靶序列旨在最小化相对于在靶事件的脱靶事件。
核酸修饰
在某些情况下，引入细胞中的多核苷酸可包含一种或更多种修饰，所述修饰可单独使用或组合使用，例如以增强活性、稳定性或特异性，改变递送，减少宿主细胞中的先天免疫应答，或用于其他增强，如本文进一步描述的和本领域已知的。
在某些实例中，经修饰的多核苷酸可用于CRISPR/Cas9/Cpf1***中，在这种情况下，引入细胞中的向导RNA(单分子向导或双分子向导)和/或编码Cas或Cpf1核酸内切酶的DNA或RNA可以被修饰，如下文所描述和说明的。这种经修饰的多核苷酸可用于CRISPR/Cas9/Cpf1***中以编辑任何一个或更多个基因组基因座。
使用CRISPR/Cas9/Cpf1***时，为了非限制性说明这种用途，可以利用向导RNA的修饰来提高包含向导RNA以及Cas或Cpf1核酸内切酶的CRISPR/Cas9/Cpf1基因组编辑复合体的形成或稳定性，所述向导RNA可以是单分子向导或双分子。向导RNA的修饰可以另外或替代性地用于增强基因组编辑复合体与基因组中靶序列之间相互作用的起始、稳定性或动力学，这可用于例如增加在靶活性。向导RNA的修饰可以另外或替代性地用于提高特异性，例如在靶位点处的基因组编辑相较于其他(脱靶)位点处的效应的相对效率。
修饰可以另外或替代性地用于提高向导RNA的稳定性，例如通过提高其对细胞中存在的核糖核酸酶(RNase)所致降解的抗性，从而导致其在细胞中的半衰期增加。增强向导RNA半衰期的修饰在某些方面可能特别有用，其中将Cas或Cpf1核酸内切酶通过需要翻译以产生核酸内切酶的RNA引入要编辑的细胞中，因为增加与编码核酸内切酶的RNA同时引入的向导RNA的半衰期可以用于增加向导RNA和编码的Cas或Cpf1核酸内切酶在细胞中共存的时间。
修饰可以另外或替代性地用于降低引入细胞的RNA引发固有免疫应答的可能性或程度。已在RNA干扰(RNAi)(包括小干扰RNA(siRNA))的背景下得到良好表征的这种应答，如下文和本领域中所述，倾向于与RNA的半衰期缩短和/或引发与免疫应答相关的细胞因子或其他因子相关。
还可以对引入细胞中的编码核酸内切酶的RNA进行一种或更多种类型的修饰，所述修饰包括但不限于提高RNA稳定性的修饰(例如通过增加其由细胞中存在的RNAse所致的降解)，增强所得产物(即核酸内切酶)的翻译的修饰，和/或降低引入细胞的RNA引发先天免疫应答的可能性或程度的修饰。
修饰的组合(例如前述和其他)同样可以使用。例如，在CRISPR/Cas9/Cpf1的情况下，可以对向导RNA进行一种或更多种类型的修饰(包括上面例举的那些)，且/或可以对编码Cas核酸内切酶的RNA进行一种或更多种类型的修饰(包括上面例举的那些)。
作为说明，CRISPR/Cas/Cpf1***中使用的向导RNA或其他较小的RNA可容易地通过化学手段合成，从而使得容易并入许多修饰，如下文所示和本领域中所述。虽然化学合成程序不断扩展，但通过诸如高效液相色谱法(HPLC，其避免使用凝胶诸如PAGE)的程序来纯化此类RNA随着多核苷酸长度显著增加至超过一百个左右核苷酸而倾向于变得更具挑战性。可用于生成更长长度的化学修饰的RNA的一种方法是产生两个或更多个连接在一起的分子。长得多的RNA(如编码Cpf1核酸内切酶的Cas9的RNA)更容易酶促产生。虽然较少类型的修饰可用于酶促产生的RNA中，但仍存在可用于例如提高稳定性、降低先天免疫应答的可能性或程度和/或增强其他属性的修饰，如下文和本领域中进一步描述的；并且经常开发出新类型的修饰。
作为各种类型修饰(尤其是经常用于较小的化学合成的RNA的那些修饰)的说明，修饰可以包括一个或更多个在糖的2'位置修饰的核苷酸，在一些方面，2'-O-烷基、2'-O-烷基-O-烷基或2'-氟-修饰的核苷酸。在一些方面，RNA修饰可以包括嘧啶的核糖、无碱基残基或RNA的3'端的反向碱基上的2'-氟、2'-氨基或2'O-甲基修饰。这种修饰可以常规地并入寡核苷酸中，并且针对给定的靶标，这些寡核苷酸已经显示出具有比2'-脱氧寡核苷酸更高的Tm(即更高的靶结合亲和性)。
许多核苷酸和核苷修饰已显示出使得并入它们的寡核苷酸比天然寡核苷酸更耐核酸酶消化；这些经修饰的寡核苷酸比未修饰的寡核苷酸完整地存活更长时间。经修饰寡核苷酸的具体实例包括包含经修饰骨架的那些，所述经修饰骨架例如硫代磷酸酯、磷酸三酯、甲基膦酸酯、短链烷基或环烷基糖间键或短链杂原子或杂环糖间键。一些寡核苷酸是具有硫代磷酸酯骨架的寡核苷酸和具有杂原子骨架的寡核苷酸，特别是CH2-NH-O-CH2、CH,～N(CH3)～O～CH2(称为亚甲基(甲基亚氨基)或MMI骨架)、CH2--O--N(CH3)-CH2、CH2-N(CH3)-N(CH3)-CH2和O-N(CH3)-CH2-CH2骨架，其中天然磷酸二酯主链表示为O-P--O-CH,)；酰胺骨架[参见De Mesmaeker等人,Ace.Chem.Res.,28:366-374(1995)]；吗啉代骨架结构(参见Summerton和Weller，美国专利号5,034,506)；肽核酸(PNA)骨架(其中寡核苷酸的磷酸二酯骨架被聚酰胺骨架置换，核苷酸与聚酰胺骨架的氮杂氮原子直接或间接结合，参见Nielsen等人,Science 1991,254,1497)。含磷键包括但不限于硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、甲基膦酸酯和其他烷基膦酸酯(包括3'-亚烷基膦酸酯和手性膦酸酯)、次膦酸酯、磷酰胺酯(包括3'-氨基磷酰胺酯和氨基烷基磷酰胺酯)、硫代磷酰胺酯、硫代烷基膦酸酯、硫代烷基磷酸三酯和具有正常3'-5'键的硼烷磷酸酯，这些的2'-5'连接类似物和具有反转极性的那些，其中相邻的核苷单元对3'-5'到5'-3'或2'-5'到5'-2'连接；参见美国专利号3,687,808；4,469,863；4,476,301；5,023,243；5,177,196；5,188,897；5,264,423；5,276,019；5,278,302；5,286,717；5,321,131；5,399,676；5,405,939；5,453,496；5,455,233；5,466,677；5,476,925；5,519,126；5,536,821；5,541,306；5,550,111；5,563,253；5,571,799；5,587,361和5,625,050。
Braasch和David Corey,Biochemistry,41(14):4503-4510(2002)；Genesis,第30卷,第3期,(2001)；Heasman,Dev.Biol.,243:209-214(2002)；Nasevicius等人,Nat.Genet.,26:216-220(2000)；Lacerra等人,Proc.Natl.Acad.Sci.,97:9591-9596(2000)以及1991年7月23日发行的美国专利No.5,034,506中描述了基于吗啉代的寡聚化合物。
Wang等人,J.Am.Chem.Soc.,122:8595-8602(2000)中描述了环己烯基核酸寡核苷酸模拟物。
其中不包含磷原子的经修饰的寡核苷酸骨架具有通过短链烷基或环烷基核苷间键、混合杂原子和烷基或环烷基核苷间键或一个或更多个短链杂原子或杂环核苷间键形成的骨架。这些包括具有吗啉代键(部分由核苷的糖部分形成)的骨架；硅氧烷骨架；硫化物、亚砜和砜骨架；甲酰基(formacetyl)和硫代甲酰基(thioformacetyl)骨架；亚甲基甲酰基(methylene formacetyl)和硫代甲酰基(thioformacetyl)骨架；含烯烃骨架；氨基磺酸酯骨架；亚甲基亚氨基和亚甲基肼基骨架；磺酸酯和磺酰胺骨架；酰胺骨架；以及具有混合的N、O、S和CH2组分的其他骨架；参见美国专利号5,034,506；5,166,315；5,185,444；5,214,134；5,216,141；5,235,033；5,264,562；5,264,564；5,405,938；5,434,257；5,466,677；5,470,967；5,489,677；5,541,307；5,561,225；5,596,086；5,602,240；5,610,289；5,602,240；5,608,046；5,610,289；5,618,704；5,623,070；5,663,312；5,633,360；5,677,437和5,677,439，其中每一篇都通过引用并入本文。
还可以包括一个或更多个经取代的糖片段，例如在2'位置的以下之一：OH、SH、SCH3、F、OCN、OCH3OCH3、OCH3 O(CH2)n CH3、O(CH2)n NH2或O(CH2)n CH3，其中n为1至约10；C1-C10低级烷基、烷氧基烷氧基、经取代的低级烷基、烷芳基或芳烷基；Cl；Br；CN；CF3；OCF3；O-、S-或N-烷基；O-、S-或N-烯基；SOCH3；SO2CH3；ONO2；NO2；N3；NH2；杂环烷芳基；杂环芳烷基；氨基烷基氨基；聚烷基氨基；经取代的甲硅烷基；RNA切割基团；报告基团；嵌入剂；用于改善寡核苷酸的药代动力学性质的基团；或用于改善寡核苷酸的药效学性质的基团和具有相似性质的其他取代基。在一些方面，修饰包括2'-甲氧基乙氧基(2'-0-CH2CH2OCH3，也称为2'-O-(2-甲氧基乙基))(Martin等人,HeIv.Chim.Acta,1995,78,486)。其他修饰包括2'-甲氧基(2'-O-CH3)、2'-丙氧基(2'-OCH2CH2CH3)和2'-氟(2'-F)。也可以在寡核苷酸上的其他位置(特别是3'末端核苷酸上的糖的3'位置和5'末端核苷酸的5'位置)进行类似的修饰。寡核苷酸也可以具有糖模拟物(例如环丁基)代替戊呋喃糖基。
在一些实例中，核苷酸单元的糖和核苷间键(即骨架)都可以被新基团替代。可以保留碱基单元，用于与适当的核酸靶标化合物杂交。一种这样的寡聚化合物，即已显示出具有优异杂交性质的寡核苷酸模拟物，被称为肽核酸(PNA)。在PNA化合物中，寡核苷酸的糖骨架可以被含酰胺骨架(例如氨基乙基甘氨酸骨架)替代。核碱基可被保留并与骨架的酰胺部分的氮杂氮原子直接或间接结合。教导制备PNA化合物的代表性美国专利包括但不限于美国专利号5,539,082；5,714,331和5,719,262。PNA化合物的进一步教导可以在Nielsen等人,Science,254:1497-1500(1991)中找到。
向导RNA还可以额外或替代性地包括核碱基(本领域中通常简称为“碱基”)修饰或取代。在本文中使用时，“未修饰的”或“天然的”核碱基包括腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。经修饰的核碱基包括在天然核酸中仅很少或瞬时发现的核碱基，例如次黄嘌呤，6-甲基腺嘌呤，5-Me嘧啶，特别是5-甲基胞嘧啶(也称为5-甲基-2'-脱氧胞嘧啶，在本领域中通常被称为5-Me-C)，5-羟甲基胞嘧啶(HMC)，糖基HMC和龙胆二糖基素HMC，以及合成的核碱基，例如2-氨基腺嘌呤，2-(甲氨基)腺嘌呤，2-(咪唑基烷基)腺嘌呤，2-(氨基烷基氨基)腺嘌呤或其它杂取代的(heterosubstituted)烷基腺嘌呤，2-硫尿嘧啶，2-硫胸腺嘧啶，5-溴尿嘧啶，5-羟甲基尿嘧啶，8-氮杂鸟嘌呤，7-去氮鸟嘌呤，N6(6-氨基己基)腺嘌呤和2,6-二氨基嘌呤。Kornberg,A.,DNA Replication,W.H.Freeman&Co.,SanFrancisco,第75-77页(1980)；Gebeyehu等人,Nucl.Acids Res.15:4513(1997)。也可以包括本领域已知的“通用”碱基，例如肌苷。5-Me-C取代已显示出使核酸双链体稳定性提高0.6-1.2℃(Sanghvi,Y.S.在Crooke,S.T.和Lebleu,B.编,Antisense Research andApplications,CRC Press,Boca Raton,1993,第276-278页中)并且是碱基取代的方面。
经修饰的核碱基可包含其它合成的和天然的核碱基，例如5-甲基胞嘧啶(5-me-C)，5-羟甲基胞嘧啶，黄嘌呤，次黄嘌呤，2-氨基腺嘌呤，腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基和其他烷基衍生物，腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基和其他烷基衍生物，2-硫尿嘧啶，2-硫胸腺嘧啶和2-硫胞嘧啶，5-卤代尿嘧啶和胞嘧啶，5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶，6-偶氮尿嘧啶，胞嘧啶和胸腺嘧啶，5-尿嘧啶(假尿嘧啶)，4-硫尿嘧啶，8-卤代，8-氨基，8-硫醇，8-硫代烷基，8-羟基和其他8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤，5-卤代(特别是5-溴，5-三氟)甲基以及其他5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶，7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤，8-氮杂鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤，7-去氮鸟嘌呤和7-去氮腺嘌呤以及3-去氮鸟嘌呤和3-去氮腺嘌呤。
此外，核碱基可以包括美国专利号3,687,808中公开的那些，'The ConciseEncyclopedia of Polymer Science And Engineering',第858-859页,Kroschwitz,J.I.编John Wiley&Sons,1990中公开的那些，Englisch等人,Angewandle Chemie,International Edition',1991,30,第613页公开的那些和Sanghvi,Y.S.,第15章,Antisense Research and Applications',第289-302页,Crooke,S.T.和Lebleu,B.ea.,CRC Press,1993公开的那些。这些核碱基中的某些对于提高本发明寡聚化合物的结合亲和力特别有用。包括5-取代的嘧啶，6-氮杂嘧啶和N-2、N-6和O-6取代的嘌呤，包括2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶。5-甲基胞嘧啶取代已显示出使核酸双链体稳定性提高0.6-1.2℃(Sanghvi,Y.S.,Crooke,S.T.和Lebleu,B.编,'Antisense Researchand Applications',CRC Press,Boca Raton,1993,第276-278页)并且是碱基取代的方面，当与2'-O-甲氧基乙基糖修饰组合时更是如此。经修饰的核碱基描述于美国专利号3,687,808以及4,845,205；5,130,302；5,134,066；5,175,273；5,367,066；5,432,272；5,457,187；5,459,255；5,484,908；5,502,177；5,525,711；5,552,540；5,587,469；5,596,091；5,614,617；5,681,941；5,750,692；5,763,588；5,830,653；6,005,096和美国专利申请公开2003/0158403中。
因此，术语“经修饰的”是指并入向导RNA、核酸内切酶或向导RNA和核酸内切酶二者中的非天然糖、磷酸酯或碱基。没有必要对给定寡核苷酸中的所有位置一致修饰，事实上，可以将多于一个上述修饰并入单个寡核苷酸中，或者甚至寡核苷酸内的单个核苷中。
编码核酸内切酶的向导RNA和/或mRNA(或DNA)可以化学连接至增强寡核苷酸的活性、细胞分布或细胞摄取的一个或更多个片段或缀合物。这种片段包括但不限于脂质片段例如胆固醇片段[Letsinger等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86:6553-6556(1989)]；胆酸[Manoharan等人,Bioorg.Med.Chem.Let.,4:1053-1060(1994)]；硫醚，例如己基-S-三苯甲基硫醇[Manoharan等人,Ann.N.Y.Acad.Sci.,660:306-309(1992)和Manoharan等人,Bioorg.Med.Chem.Let.,3:2765-2770(1993)]；硫代胆固醇[Oberhauser等人,Nucl.AcidsRes.,20:533-538(1992)]；脂族链，例如十二烷二醇或十一烷基残基[Kabanov等人,FEBSLett.,259:327-330(1990)和Svinarchuk等人,Biochimie,75:49-54(1993)]；磷脂，例如二-十六烷基-外消旋-甘油或三乙基铵1,2-二-O-十六烷基-外消旋-甘油基-3-H-膦酸酯[Manoharan等人,Tetrahedron Lett.,36:3651-3654(1995)和Shea等人,Nucl.AcidsRes.,18:3777-3783(1990)]；多胺或聚乙二醇链[Mancharan等人,Nucleosides&Nucleotides,14:969-973(1995)]；金刚烷乙酸[Manoharan等人,Tetrahedron Lett.,36:3651-3654(1995)]；棕榈基片段[Mishra等人,Biochim.Biophys.Acta,1264:229-237(1995)]；或十八烷基胺或己基氨基羰基-t羟胆固醇片段[Crooke等人,J.Pharmacol.Exp.Ther.,277:923-937(1996)]。参见美国专利号4,828,979；4,948,882；5,218,105；5,525,465；5,541,313；5,545,730；5,552,538；5,578,717,5,580,731；5,580,731；5,591,584；5,109,124；5,118,802；5,138,045；5,414,077；5,486,603；5,512,439；5,578,718；5,608,046；4,587,044；4,605,735；4,667,025；4,762,779；4,789,737；4,824,941；4,835,263；4,876,335；4,904,582；4,958,013；5,082,830；5,112,963；5,214,136；5,082,830；5,112,963；5,214,136；5,245,022；5,254,469；5,258,506；5,262,536；5,272,250；5,292,873；5,317,098；5,371,241,5,391,723；5,416,203,5,451,463；5,510,475；5,512,667；5,514,785；5,565,552；5,567,810；5,574,142；5,585,481；5,587,371；5,595,726；5,597,696；5,599,923；5,599,928和5,688,941。
糖和其他部分可以用于使包含核苷酸的蛋白质和复合体(例如阳离子多核糖体和脂质体)靶向特定位点。例如，肝细胞定向转移可以通过脱唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)介导；参见例如Hu等人,Protein Pept Lett.21(10):1025-30(2014)。可以使用本领域已知的并且经常开发的其他***使本申请中使用的生物分子和/或其复合体靶向感兴趣的特定靶细胞。
这些靶向部分或缀合物可以包括与官能团(例如伯羟基或仲羟基)共价结合的缀合物基团。本发明的缀合物组包括嵌入剂、报道分子、多胺、聚酰胺、聚乙二醇、聚醚、增强低聚物的药效学性质的基团和增强低聚物的药代动力学性质的基团。典型的缀合物基团包括胆固醇、脂质、磷脂、生物素、吩嗪、叶酸、菲啶、蒽醌、吖啶、荧光素、罗丹明、香豆素和染料。在本公开的上下文中，增强药效学性质的基团包括改善摄取、增强对降解的抗性和/或加强与靶核酸的序列特异性杂交的基团。在本发明的上下文中，增强药代动力学性质的基团包括改善本发明化合物的摄取、分布、代谢或***的基团。1992年10月23日递交的国际专利申请号PCT/US92/09196和美国专利号6,287,860中公开了代表性缀合物基团。缀合物部分包括但不限于脂质部分例如胆固醇部分，胆酸，硫醚，例如己基-5-三苯甲基硫醇，硫代胆固醇，脂族链例如十二烷二醇或十一烷基残基，磷脂，例如二-十六烷基-外消旋甘油或三乙基铵1,2-二-O-十六烷基-外消旋-甘油基-3-H-膦酸酯，多胺或聚乙二醇链或金刚烷乙酸，棕榈基部分或十八烷基胺或己基氨基-羰基-氧基胆固醇部分。参见，例如，美国专利号4,828,979；4,948,882；5,218,105；5,525,465；5,541,313；5,545,730；5,552,538；5,578,717,5,580,731；5,580,731；5,591,584；5,109,124；5,118,802；5,138,045；5,414,077；5,486,603；5,512,439；5,578,718；5,608,046；4,587,044；4,605,735；4,667,025；4,762,779；4,789,737；4,824,941；4,835,263；4,876,335；4,904,582；4,958,013；5,082,830；5,112,963；5,214,136；5,082,830；5,112,963；5,214,136；5,245,022；5,254,469；5,258,506；5,262,536；5,272,250；5,292,873；5,317,098；5,371,241,5,391,723；5,416,203,5,451,463；5,510,475；5,512,667；5,514,785；5,565,552；5,567,810；5,574,142；5,585,481；5,587,371；5,595,726；5,597,696；5,599,923；5,599,928和5,688,941。
不太适合化学合成并且通常通过酶促合成产生的较长的多核苷酸也可以通过各种方式进行修饰。这种修饰可以包括，例如，在分子的5'端或3'端并入特定序列或其他片段，引入某些核苷酸类似物，以及其他修饰。作为说明，编码Cas9的mRNA约4kb长，并且可以通过体外转录合成。对mRNA的修饰可用于例如增加其翻译或稳定性(例如通过增加其对细胞降解的抗性)，或降低RNA引发先天免疫应答的倾向，所述先天免疫应答在引入外源RNA(特别是较长的RNA如编码Cas9的RNA)之后，经常在细胞中观察到。
本领域已经描述了许多这样的修饰，例如polyA尾巴，5'帽类似物(例如抗反向帽类似物(ARCA)或m7G(5’)ppp(5’)G(mCAP))，经修饰的5'或3'非翻译区(UTR)，使用经修饰的碱基(例如假-UTP、2-硫代-UTP、5-甲基胞苷-5'-三磷酸酯(5-甲基-CTP)或N6-甲基-ATP)或用磷酸酶处理以除去5'末端磷酸酯。这些和其他修饰是本领域已知的，并且经常开发RNA的新修饰。
存在许多经修饰RNA的商业供应商，包括例如TriLink Biotech、AxoLabs、Bio-Synthesis Inc.、Dharmacon和许多其他供应商。例如，如TriLink所述，可以使用5-甲基-CTP来赋予期望的特征，例如核酸酶稳定性提高，翻译增加或先天免疫受体与体外转录的RNA的相互作用减少。5-甲基胞苷-5'-三磷酸酯(5-甲基-CTP)、N6-甲基-ATP以及假-UTP和2-硫代-UTP也显示出在培养物中和体内降低先天免疫刺激，同时增加翻译，如下文提到的Kormann等人和Warren等人的出版物中所示。
已显示：在体内递送的经化学修饰的mRNA可用于实现改善的治疗效果；参见例如Kormann等人,Nature Biotechnology 29,154–157(2011)。例如，可以利用这种修饰来提高RNA分子的稳定性和/或降低其免疫原性。通过使用化学修饰例如假-U、N6-甲基-A、2-硫代-U和5-甲基-C，发现：用2-硫代-U和5-甲基-C分别替代尿苷和胞苷残基的仅四分之一会导致小鼠中mRNA的toll样受体(TLR)介导的识别显著降低。通过降低先天免疫***的激活，这些修饰可用于有效增加mRNA在体内的稳定性和寿命；参见例如Kormann等，如上所述。
还显示：重复施用包含修饰的合成信使RNA可将分化的人类细胞重编程至多能性，所述修饰被设计为绕过先天的抗病毒应答。参见例如Warren等人,Cell Stem Cell,7(5):618-30(2010)。充当初级重编程蛋白质的这种经修饰的mRNA可以是重编程多种人类细胞类型的有效手段。这种细胞被称为诱导性多能干细胞(iPSC)，并且发现并入5-甲基-CTP、假-UTP和抗反转帽类似物(ARCA)的酶促合成的RNA可用于有效避开细胞的抗病毒应答；参见例如Warren等人，如上所述。
本领域中描述的多核苷酸的另一些修饰包括例如使用polyA尾巴，添加5'帽类似物(例如m7G(5’)ppp(5’)G(mCAP))，修饰5'或3'非翻译区(UTRs)，或用磷酸酶处理以除去5'末端磷酸酯-并且经常开发出新方法。
已经开发出了许多适用于产生用于本文的经修饰RNA的组合物和技术，其涉及RNA干扰(RNAi)、包括小干扰RNA(siRNA)的修饰。siRNA在体内遇到特别的挑战，因为它们通过mRNA干扰对基因沉默的影响通常是短暂的，这可能需要重复施用。另外，siRNA是双链RNA(dsRNA)，而哺乳动物细胞具有已经进化至检测和中和dsRNA的免疫反应，dsRNA往往是病毒感染的副产物。因此，存在哺乳动物酶，例如PKR(dsRNA-应答性激酶)，和潜在的视黄酸诱导性基因I(RIG-I)，其可以介导对dsRNA的细胞应答，以及Toll样受体(诸如TLR3、TLR7和TLR8)，其可以触发响应于这些分子的细胞因子的诱导；参见例如Angart等人,Pharmaceuticals(Basel)6(4):440–468(2013)；Kanasty等人,Molecular Therapy 20(3):513–524(2012)；Burnett等人,Biotechnol J.6(9):1130-46(2011)；Judge和MacLachlan,Hum Gene Ther 19(2):111-24(2008)的综述；以及其中引用的参考文献。
如本文所述，多种修饰已被开发出并应用于提高RNA稳定性，降低先天免疫应答和/或获得与将多核苷酸引入人类细胞中有关的可能有用的其他益处；参见例如WhiteheadKA等人,Annual Review of Chemical and Biomolecular Engineering,2:77-96(2011)；Gaglione和Messere,Mini Rev Med Chem,10(7):578-95(2010)；Chernolovskaya等人,Curr Opin Mol Ther.,12(2):158-67(2010)；Deleavey等人,Curr Protoc Nucleic AcidChem Chapter 16:Unit 16.3(2009)；Behlke,Oligonucleotides 18(4):305-19(2008)；Fucini等人,Nucleic Acid Ther 22(3):205–210(2012)；Bremsen等人,Front Genet 3:154(2012)的综述。
如上所述，存在许多经修饰RNA的商业供应商，其中有许多专门研究旨在改善siRNA的效力的修饰。基于文献中报道的各种发现提供了各种方法。例如，Dharmacon指出，用硫(硫代磷酸酯，PS)代替非桥连氧已被广泛用于改善siRNA的核酸酶抗性，如Kole,Nature Reviews Drug Discovery 11:125-140(2012)所报道。据报道，核糖的2'-位置的修饰能够改善核苷酸间磷酸酯键的核酸酶抗性，同时提高双链体稳定性(Tm)，其也被证明能够提供不被免疫激活的保护。如Soutschek等人Nature 432:173-178(2004)所报道，中等PS骨架修饰与小的耐受良好的2'-取代(2'-O-甲基、2'-氟代、2'-氢)的组合与用于体内应用的高度稳定的siRNA相关联；并且据报道，2'-O-甲基修饰能够有效改善稳定性，如Volkov,Oligonucleotides 19:191-202(2009)所报道。关于降低先天免疫应答的诱导，已报道了用2'-O-甲基、2'-氟、2'-氢修饰特定序列以减少TLR7/TLR8相互作用，同时通常保留沉默活性；参见例如Judge等人,Mol.Ther.13:494-505(2006)以及Cekaite等人,J.Mol.Biol.365:90-108(2007)。另外的修饰(例如2-硫尿嘧啶、假尿嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-甲基尿嘧啶和N6-甲基腺苷)也已被证明能够使由TLR3、TLR7和TLR8介导的免疫效应最小化；参见例如Kariko,K.等人,Immunity 23:165-175(2005)。
许多缀合物在本领域中也是已知的并且可商购，其可被应用于本文中使用的多核苷酸(例如RNA)，其能够增强多核苷酸的递送和/或被细胞摄取，包括例如胆固醇、生育酚和叶酸、脂质、肽、聚合物、接头和适配子；参见例如Winkler,Ther.Deliv.4:791-809(2013)的综述以及其中引用的参考文献。
密码子优化
可根据本领域中的标准方法对编码定点多肽的多核苷酸进行密码子优化以在含有感兴趣的靶DNA的细胞中表达。例如，如果预期的靶核酸在人类细胞中，则考虑编码Cas9的人密码子优化的多核苷酸用于产生Cas9多肽。
基因组靶向核酸和定点多肽的复合体
基因组靶向核酸与定点多肽(例如核酸引导的核酸酶例如Cas9)相互作用，从而形成复合体。基因组靶向核酸将定点多肽引导至靶核酸。
RNP
定点多肽和基因组靶向核酸可各自分别施用到细胞或患者。另一方面，定点多肽可以与一种或更多种向导RNA或一种或更多种crRNA连同tracrRNA预先复合。然后可以将预复合物质施用到细胞或患者。这种预复合物质被称为核糖核蛋白颗粒(RNP)。
编码***组分的核酸
本公开提供了这样的核酸，其包含编码本公开的基因组靶向核酸、本公开的定点多肽和/或实施本公开方法的各方面所必需的任何核酸或蛋白质分子的核苷酸序列。
编码本公开的基因组靶向核酸、本公开的定点多肽和/或实施本公开方法的各方面所必需的任何核酸或蛋白质分子的核酸可以包含载体(例如，重组表达载体)。
术语“载体”是指能够运输与其连接的另一种核酸的核酸分子。一种类型的载体是“质粒”，其是指额外的核酸区段可以连接到其中的环状双链DNA环。另一种类型的载体是病毒载体，其中额外的核酸区段可以连接到病毒基因组中。某些载体能够在它们被引入的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和游离型哺乳动物载体)。其他载体(例如，非附加型哺乳动物载体)在引入宿主细胞后整合到宿主细胞的基因组中，从而与宿主基因组一起复制。
在一些实例中，载体能够指导与其可操作地连接的核酸的表达。这种载体在本文中被称为“重组表达载体”或更简单的“表达载体”，其提供等效的功能。
术语“可操作地连接”是指感兴趣的核苷酸序列与调控序列以允许核苷酸序列表达的方式连接。术语“调控序列”旨在包括例如启动子、增强子和其他表达调控元件(例如聚腺苷酸化信号)。这种调控序列在本领域中是公知的，并且描述于例如Goeddel；GeneExpression Technology:Methods in Enzymology 185,Academic Press,San Diego,CA(1990)中。调控序列包括在许多类型的宿主细胞中指导核苷酸序列的组成型表达的那些，以及仅在某些宿主细胞中指导核苷酸序列表达的那些(例如组织特异性调控序列)。本领域技术人员会理解，表达载体的设计可取决于诸如靶细胞的选择、期望的表达水平等的因素。
考虑的表达载体包括但不限于基于牛痘病毒的载体、基于脊髓灰质炎病毒的载体、基于腺病毒的载体、基于腺相关病毒的载体、基于SV40的载体、基于单纯疱疹病毒的载体、基于人免疫缺陷病毒的载体、基于逆转录病毒的载体(例如基于鼠白血病病毒的载体、基于脾坏死病毒的载体、以及源自逆转录病毒例如Rous肉瘤病毒、Harvey肉瘤病毒、禽白血病病毒、慢病毒、人免疫缺陷病毒、骨髓增殖性肉瘤病毒和乳腺肿瘤病毒的载体)的载体和其它重组载体。预期用于真核靶细胞的其他载体包括但不限于载体pXT1、pSG5、pSVK3、pBPV、pMSG和pSVLSV40(Pharmacia)。考虑用于真核靶细胞的额外载体包括但不限于载体pCTx-1、pCTx-2和pCTx-3，其描述于图1A至1C中。可以使用其他载体，只要它们与宿主细胞相容即可。
在一些实例中，载体可以包含一个或更多个转录和/或翻译控制元件。取决于所利用的宿主/载体***，可以在表达载体中使用许多合适的转录和翻译控制元件中的任何，包括组成型启动子和诱导型启动子、转录增强子元件、转录终止子等。载体可以是使病毒序列或CRISPR机制的组分或其他元件失活的自失活载体。
合适的真核启动子(即在真核细胞中有功能的启动子)的非限制性实例包括来自巨细胞病毒(CMV)即刻早期/单纯疱疹病毒(HSV)胸苷激酶/早期和晚期SV40的那些，来自逆转录病毒的长末端重复(LTR)，人延伸因子-1启动子(EF1)，包含与鸡β-肌动蛋白启动子(CAG)融合的巨细胞病毒(CMV)增强子的杂合构建体，鼠干细胞病毒启动子(MSCV)，磷酸甘油酸激酶-1基因座启动子(PGK)和小鼠金属硫蛋白-I。
为了表达与Cas核酸内切酶一起使用的小RNA(包括向导RNA)，各种启动子例如RNA聚合酶III启动子(包括例如U6和H1)可能是有利的。这种启动子的描述和用于增强这种启动子的使用的参数是本领域已知的，并且经常会描述额外的信息和方法；参见例如Ma,H.等人,Molecular Therapy-Nucleic Acids 3,e161(2014)doi:10.1038/mtna.2014.12。
表达载体还可以含有用于翻译起始的核糖体结合位点和转录终止子。表达载体还可以包含用于扩增表达的合适序列。表达载体还可以包括编码与定点多肽融合的非天然标签(例如，组氨酸标签、血细胞凝集素标签、绿色荧光蛋白等)的核苷酸序列，从而产生融合蛋白。
启动子可以是诱导型启动子(例如热休克启动子、四环素调节启动子、类固醇调节启动子、金属调节启动子、***受体调节启动子等)。启动子可以是组成型启动子(例如，CMV启动子、UBC启动子)。在某些情况下，启动子可以是空间受限和/或时间受限的启动子(例如组织特异性启动子、细胞类型特异性启动子等)。
编码本公开的基因组靶向核酸和/或定点多肽的核酸可以被包装到递送运载体中或包装在递送运载体的表面上以递送至细胞。预期的递送运载体包括但不限于纳米球、脂质体、量子点、纳米颗粒、聚乙二醇颗粒、水凝胶和胶束。多种靶向片段可用于增强这类载体与期望的细胞类型或位置的优先相互作用。
可通过病毒或噬菌体感染、转染、接合、原生质体融合、脂质转染、电穿孔、核转染、磷酸钙沉淀、聚乙烯亚胺(PEI)介导的转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂质体介导的转染、粒子枪技术、磷酸钙沉淀、直接微注射、纳米颗粒介导的核酸递送等将本公开的复合体、多肽和核酸引入细胞中。
递送
可以通过本领域已知的病毒或非病毒递送运载体递送向导RNA多核苷酸(RNA或DNA)和/或核酸内切酶多核苷酸(RNA或DNA)。或者，可以通过本领域已知的非病毒递送运载体递送核酸内切酶多肽，诸如电穿孔或脂质纳米例子。在另一替代性的方面，DNA核酸内切酶可作为一种或更多种多肽递送，单独地或与一种或更多种向导RNA、或一种或更多种crRNA连同tracrRNA预先复合。
多核苷酸可以通过非病毒递送运载体递送，包括但不限于纳米颗粒、脂质体、核糖核蛋白、带正电荷的肽、小分子RNA-缀合物、适配子-RNA嵌合体和RNA-融合蛋白复合体。Peer和Lieberman,Gene Therapy,18:1127–1133(2011)(其着重于也可用于递送其他多核苷酸的siRNA的非病毒递送运载体)中描述了一些示例性的非病毒递送运载体。
可以通过脂质纳米颗粒(LNP)将多核苷酸(例如向导RNA、sgRNA和编码核酸内切酶的mRNA)递送至细胞或患者。
LNP是指直径小于1000nm、500nm、250nm、200nm、150nm、100nm、75nm、50nm或25nm的任何颗粒。或者，纳米颗粒的尺寸范围可以为1-1000nm、1-500nm、1-250nm、25-200nm、25-100nm、35-75nm或25-60nm。
LNP可以由阳离子脂质、阴离子脂质或中性脂质制成。中性脂质(例如促使融合的磷脂DOPE或膜组分胆固醇)可作为“辅助脂质”包含在LNP中以提高转染活性和纳米颗粒稳定性。阳离子脂质的局限性包括由于稳定性差和清除速度快导致的低效力，以及炎性或抗炎反应的产生。
LNP也可以由疏水性脂质、亲水性脂质或疏水性和亲水性脂质二者组成。
本领域已知的任何脂质或脂质组合均可用于产生LNP。用于产生LNP的脂质的例子有：DOTMA、DOSPA、DOTAP、DMRIE、DC-胆固醇、DOTAP-胆固醇、GAP-DMORIE-DPyPE和GL67A-DOPE-DMPE-聚乙二醇(PEG)。阳离子脂质的例子有：98N12-5、C12-200、DLin-KC2-DMA(KC2)、DLin-MC3-DMA(MC3)、XTC、MD1和7C1。中性脂质的例子有：DPSC、DPPC、POPC、DOPE和SM。PEG修饰的脂质的例子有：PEG-DMG、PEG-CerC14和PEG-CerC20。
脂质可以以任意数字的摩尔比组合以产生LNP。另外，多核苷酸可以与脂质以广泛的摩尔比组合以产生LNP。
如前所述，定点多肽和基因组靶向核酸可各自分别施用到细胞或患者。另一方面，定点多肽可以与一种或更多种向导RNA，或一种或更多种crRNA连同tracrRNA预先复合。然后可将预复合物质施用到细胞或患者。这种预复合材料被称为核糖核蛋白颗粒(RNP)。
RNA能够与RNA或DNA形成特异性相互作用。虽然这种性质在许多生物学过程中被利用，但它也具有在富含核酸的细胞环境中混杂相互作用的风险。该问题的一个解决方法是形成核糖核蛋白颗粒(RNP)，其中RNA与核酸内切酶预先复合。RNP的另一个好处是保护RNA免受降解。
RNP中的核酸内切酶可以是经修饰的或未修饰的。同样，gRNA、crRNA、tracrRNA或sgRNA可以是经修饰的或未修饰的。本领域已知许多修饰，并且可以使用它们。
核酸内切酶和sgRNA可以以1:1的摩尔比组合。或者，核酸内切酶、crRNA和tracrRNA通常可以以1:1:1的摩尔比组合。然而，可以使用宽范围的摩尔比来产生RNP。
重组腺相关病毒(AAV)载体可以用于递送。用于产生rAAV颗粒的技术是本领域中的标准技术，其中将要包装的包含要递送的多核苷酸的AAV基因组、rep和cap基因以及辅助病毒功能提供给细胞。rAAV的产生通常要求以下组分存在于单个细胞(本文中表示为包装细胞)内：rAAV基因组，与rAAV基因组分开(即不在rAAV基因组中)的AAV rep和cap基因，以及辅助病毒功能。AAV rep和cap基因可以来自任何AAV血清型，重组病毒可以源自所述AAV血清型，并且可以来自与rAAV基因组ITR不同的AAV血清型，包括但不限于AAV血清型AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAV-6、AAV-7、AAV-8、AAV-9、AAV-10、AAV-11、AAV-12、AAV-13和AAV rh.74。假型rAAV的产生公开于例如国际专利申请公开号WO 01/83692中。见表3。
表3
AAV血清型 Genbank登记号
AAV-1 NC_002077.1
AAV-2 NC_001401.2
AAV-3 NC_001729.1
AAV-3B AF028705.1
AAV-4 NC_001829.1
AAV-5 NC_006152.1
AAV-6 AF028704.1
AAV-7 NC_006260.1
AAV-8 NC_006261.1
AAV-9 AX753250.1
AAV-10 AY631965.1
AAV-11 AY631966.1
AAV-12 DQ813647.1
AAV-13 EU285562.1
生成包装细胞的方法包括产生稳定表达AAV颗粒产生所需的所有组分的细胞系。例如，将包含缺乏AAV rep和cap基因的rAAV基因组，与rAAV基因组分开的AAV rep和cap基因以及选择标记(例如新霉素抗性基因)的一个质粒(或多个质粒)整合到细胞的基因组中。通过诸如GC加尾(Samulski等人,1982,Proc.Natl.Acad.S6.USA,79:2077-2081)、添加含有限制性内切酶切割位点的合成接头(Laughlin等人,1983,Gene,23:65-73)的程序，或通过直接的平端连接(Senapathy&Carter,1984,J.Biol.Chem.,259:4661-4666)将AAV基因组引入细菌质粒中。然后可用辅助病毒如腺病毒感染包装细胞系。这种方法的优点是：细胞是可选择的并且适合于大规模产生rAAV。合适方法的其他例子使用腺病毒或杆状病毒，而不是质粒，将rAAV基因组和/或rep和cap基因引入包装细胞中。
例如Carter,1992,Current Opinions in Biotechnology,1533-539和Muzyczka,1992,Curr.Topics in Microbial.and Immunol.,158:97-129)中综述了rAAV产生的一般原理。Ratschin等人,Mol.Cell.Biol.4:2072(1984)；Hermonat等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6466(1984)；Tratschin等人,Mo1.Cell.Biol.5:3251(1985)；McLaughlin等人,J.Virol.,62:1963(1988)；和Lebkowski等人,1988Mol.Cell.Biol.,7:349(1988)；Samulski等人(1989,J.Virol.,63:3822-3828)；美国专利号5,173,414；WO 95/13365和相应的美国专利号5,658.776；WO 95/13392；WO 96/17947；PCT/US98/18600；WO 97/09441(PCT/US96/14423)；WO 97/08298(PCT/US96/13872)；WO 97/21825(PCT/US96/20777)；WO 97/06243(PCT/FR96/01064)；WO 99/11764；Perrin等人(1995)Vaccine 13:1244-1250；Paul等人(1993)Human Gene Therapy 4:609-615；Clark等人(1996)Gene Therapy 3:1124-1132；美国专利号5,786,211；美国专利号5,871,982；和美国专利号6,258,595中描述了各种方法。
AAV载体血清型可以与靶细胞类型匹配。例如，以下示例性细胞类型可以通过所示的AAV血清型等来转导。见表4。
表4
经基因修饰的细胞
术语“经基因修饰的细胞”是指包含至少一种通过基因组编辑(例如，使用CRISPR/Cas***)引入的基因修饰的细胞。在本文的一些离体实例中，经基因修饰的细胞可以是经基因修饰的祖细胞。在本文的一些体内实例中，经基因修饰的细胞可以是经基因修饰的肌肉细胞或经基因修饰的肌肉前体细胞。本文考虑了包含外源基因组靶向核酸和/或编码基因组靶向核酸的外源核酸的经基因修饰的细胞。
术语“对照处理的群体”描述了：除了添加基因组编辑组分之外，已经用相同培养基、病毒诱导、核酸序列、温度、会合(confluency)、烧瓶大小、pH等处理的细胞群体。本领域已知的任何方法都可用于衡量肌营养不良蛋白读码框的重建，例如肌营养不良蛋白的Western印迹分析或对肌营养不良蛋白mRNA进行定量。
术语“经分离的细胞”是指已经从其最初被发现的生物体中移出的细胞或这种细胞的后代。任选地，所述细胞可以在体外培养，例如在确定的条件下或在其他细胞的存在下培养。任选地，所述细胞可以被随后引入到第二生物体中或重新引入到其(或其传(descend)自的细胞)分离自的生物体中。
关于经分离的细胞群体的术语“经分离的群体”是指已经从混合的或异质的细胞群体中移出并分离的细胞群体。在一些情况下，与细胞从其中分离或富集的异质群体相比，经分离的群体可以是基本上纯的细胞群体。在一些情况下，与包含人类祖细胞和人类祖细胞所源自的细胞的异质细胞群体相比，经分离的群体可以是经分离的人类祖细胞群体，例如基本上纯的人类祖细胞群体。
关于特定细胞群体的术语“基本上增加的”是指这样的细胞群体，其中特定类型细胞的出现相对于先已存在的水平或参照水平增加了至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少20倍、至少50倍、至少100倍、至少400倍、至少1000倍、至少5000倍、至少20000倍、至少100000倍或更多倍，这取决于例如用于改善DMD的这些细胞的期望水平。
关于特定细胞群体的术语“基本上富集的”是指相对于构成总细胞群体的细胞，至少约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％或更多的细胞群体。
关于特定细胞群体的术语“基本上纯的”是指相对于构成总细胞群体的细胞，至少约75％、至少约85％、至少约90％或至少约95％纯的细胞群体。也就是说，关于祖细胞群体的术语“基本上纯的”或“实质上纯化的”是指这样的细胞群体，其包含少于约20％、约15％、约10％、约9％、约8％、约7％、约6％、约5％、约4％、约3％、约2％、约1％或少于1％的不是本文的术语所限定的祖细胞的细胞。
使校正的iPSC分化成Pax7+肌祖细胞
本公开的离体方法的另一个步骤涉及使校正的iPSC分化成Pax7+肌祖细胞。分化步骤可以根据本领域已知的任何方法进行。例如，分化步骤可以包括使基因组被编辑的iPSC与特定培养基制剂(包括小分子药物)接触以使其分化成Pax7+肌祖细胞，如Chal,Oginuma等人2015中所示。或者，可以使用包括转基因过表达、血清饥饿和/或小分子药物的许多已确立的方法中的任何一种使iPSC、肌原性祖细胞和其他谱系的细胞分化成肌肉，如Tapscott,Davis等人1988,Langen,Schols等人2003,Fujita,Endo等人2010,Xu,Tabebordbar等人2013,Shoji,Woltjen等人2015的方法中所示。
将Pax7+肌祖细胞植入患者体内
本发明的离体方法的另一个步骤涉及将Pax7+肌祖细胞植入患者体内。该植入步骤可以使用本领域已知的任何植入方法来完成。例如，可经基因修饰的细胞直接注射到患者的肌肉中。
药学上可接受的运载体(carrier)
将祖细胞施用到本文考虑的受试者的离体方法涉及使用包含祖细胞的治疗组合物。
治疗组合物可含有生理上可耐受的运载体以及细胞组合物，和任选的溶解或分散在其中作为活性成分的至少一种如本文所述的额外的生物活性剂。在某些情况下，治疗组合物在为治疗目的而施用到哺乳动物或人类患者时基本上不具有免疫原性，除非有此需要。
通常，本文所述的祖细胞可以作为悬浮物与药学上可接受的运载体一起施用。本领域技术人员能够认识到，待用于细胞组合物中的药学上可接受的运载体不能包括实质上干扰待递送到受试者的细胞的生存力的量的缓冲剂、化合物、冷冻保存剂、防腐剂或其他剂。包含细胞的制剂可以包括例如允许维持细胞膜完整性的渗透缓冲剂，和任选的营养物以维持细胞生存力或在施用后增强植入。这样的制剂和悬浮物是本领域技术人员已知的且/或可以利用常规实验如本文所述被调节为适于与祖细胞一起使用。
细胞组合物也可以被乳化或呈现为脂质体组合物，前提条件是乳化程序不会不利地影响细胞生存力。细胞和任何其他活性成分可以与赋形剂混合，所述赋形剂是药学上可接受的且与活性成分相容，并且其量适合用于本文所述的治疗方法中。
包含在细胞组合物中的其他剂可以包括其中组分的药学上可接受的盐。药学上可接受的盐包括与无机酸(例如盐酸或磷酸)或有机酸(例如乙酸、酒石酸、扁桃酸等)形成的酸加成盐(与多肽的游离氨基形成的)。与游离羧基形成的盐也可以来源于无机碱，例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁，以及有机碱，例如异丙胺、三甲胺、2-乙氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等。
生理上可耐受的运载体在本领域中是公知的。示例性的液体运载体是无菌水性溶液，其不含除活性成分和水以外的任何物质，或者含有缓冲剂，例如生理pH值的磷酸钠、生理盐水或两者，例如磷酸盐缓冲盐水。另外，水性运载体可以含有多于一种缓冲盐，以及盐例如氯化钠和氯化钾，右旋糖，聚乙二醇和其他溶质。除了水之外，液体组合物还可以含有不含水的液相。这种额外液相的例子有甘油、植物油例如棉籽油和水-油乳液。对治疗特定障碍或病症有效的细胞组合物中使用的活性化合物的量可以取决于障碍或病症的性质，并且可以通过标准临床技术来确定。
施用&功效
在通过下述方法或途径将细胞(例如祖细胞)置于受试者中的语境中，术语“施用”、“引入”和“移植”可互换使用，所述方法或途径导致所引入的细胞至少部分定位在期望的位点(例如损伤或修复位点)，从而产生期望的效果。可以通过导致递送到受试者中的期望位置的任何适当的途径施用细胞(例如祖细胞或其分化的子代)，在所述位置处，至少部分植入的细胞或细胞组分保持存活。施用到受试者后，细胞的生存期可以短至几小时，例如二十四小时，至几天，至长达几年，甚至患者的寿命，即，长期植入。例如，在本文所述的一些方面，通过全身施用途径(例如腹膜内途径或静脉内途径)施用有效量的肌原性祖细胞。
术语“个体”、“受试者”、“宿主”和“患者”在本文中可互换使用，其是指期望诊断、治疗或疗法的任何受试者。在一些方面，受试者是哺乳动物。在一些方面，受试者是人。
当预防性提供时，可以在DMD的任何症状之前，例如在肌肉萎缩发展之前，将本文所述的祖细胞施用到受试者。因此，肌祖细胞群体的预防性施用可用于预防DMD。
当治疗性提供时，可以在DMD的症状或适应症发作时(或之后)，例如在肌肉萎缩发作后提供肌祖细胞。
根据本文所述的方法施用的肌祖细胞群体可以包含从一个或更多个供体获得的同种异体的肌祖细胞。“同种异体的”是指从同一物种的一种或更多种不同供体获得的肌祖细胞或包含所述肌祖细胞的生物样品，其中一个或更多个基因座处的基因不相同。例如，施用到受试者的肌祖细胞群体可以来自一个或更多个无关的供体受试者或来自一个或更多个不相同的兄弟姐妹。在某些情况下，可以使用同基因的肌祖细胞群体，例如从遗传上相同的动物或从同卵双胞胎获得的那些。肌祖细胞可以是自体细胞；也就是说，从受试者获得或分离肌祖细胞并将其施用到同一受试者，即供体和受体是相同的。
术语“有效量”是指预防或减轻DMD的至少一种或更多种病征或症状所需的祖细胞群体或其子代的量，其涉及充足量的组合物以提供期望的效果，例如治疗患有DMD的受试者。因此，术语“治疗有效量”是指当施用到典型的受试者(例如患有DMD或有DMD风险的受试者)时，足以促使特定效果的祖细胞或包含祖细胞的组合物的量。有效量还包括足以预防或延缓疾病症状发展、改变疾病症状进程(例如但不限于减缓疾病症状进展)或逆转疾病症状的量。应该理解，对于任何给定的情况，本领域普通技术人员可以利用常规实验来确定适当的“有效量”。
对于用于本文所述的各个方面，有效量的祖细胞包含至少102个祖细胞、至少5×102个祖细胞、至少103个祖细胞、至少5×103个祖细胞、至少104个祖细胞、至少5×104个祖细胞、至少105个祖细胞、至少2×105个祖细胞、至少3×105个祖细胞、至少4×105个祖细胞、至少5×105个祖细胞、至少6×105个祖细胞、至少7×105个祖细胞、至少8×105个祖细胞、至少9×105个祖细胞、至少1×106个祖细胞、至少2×106个祖细胞、至少3×106个祖细胞、至少4×106个祖细胞、至少5×106个祖细胞、至少6×106个祖细胞、至少7×106个祖细胞、至少8×106个祖细胞、至少9×106个祖细胞或其倍数。祖细胞可以源自一个或更多个供体，或者可以从自体来源获得。在本文所述的一些实例中，可以在施用到有此需要的受试者之前，在培养物中扩增祖细胞。
在DMD患者的细胞中表达的功能性肌营养不良蛋白的水平适度递增可能有益于改善疾病的一种或更多种症状，增加长期存活和/或减少与其他治疗相关的副作用。将此类细胞施用到人类患者后，产生提高水平的功能性肌营养不良蛋白的肌祖细胞的存在是有益的。在某些情况下，相对于所治疗受试者中的总肌营养不良蛋白，受试者的有效治疗导致至少约3％、5％或7％的功能性肌营养不良蛋白。在一些实例中，功能性肌营养不良蛋白为总肌营养不良蛋白的至少约10％。在一些实例中，功能性肌营养不良蛋白为总肌营养不良蛋白的至少约20％至30％。类似地，引入甚至相对有限的功能性肌营养不良蛋白水平显著提高的细胞亚群可能在各种患者中是有益的，因为在一些情况下，正常化的细胞相对于患病细胞具有选择性优势。然而，甚至适度水平的功能性肌营养不良蛋白水平升高的肌祖细胞也可能有益于改善患者的DMD的一个或更多个方面。在一些实例中，施用此类细胞的患者中约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或更多的肌祖细胞产生提高水平的功能性肌营养不良蛋白。
“施用”是指通过导致细胞组合物至少部分定位在期望位点的方法或途径将祖细胞组合物递送至受试者。可以通过导致受试者中的有效治疗的任何适当途径施用细胞组合物，即施用导致递送至受试者中的期望位置，在所述位置处，至少部分所递送的组合物(即至少1×104个细胞)被递送至期望的位点持续一段时间。施用模式包括注射、输注、滴注或摄入。“注射”包括但不限于静脉内、肌内、动脉内、鞘内、心室内、囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、被膜下、蛛网膜下、脊柱内、脊髓内和胸骨内注射和输液。在一些例子中，途径是静脉内的。为了递送细胞，可以通过注射或输注施用。
细胞被全身施用。短语“全身性施用”、“全身性施用”和“外周施用”是指不将祖细胞群体直接施用到靶位点、组织或器官，从而，相反，其进入受试者的循环***，因此经受代谢和其他类似的过程。
熟练的临床医生可以确定包含用于治疗DMD的组合物的治疗的功效。然而，如果功能性肌营养不良蛋白水平的任何一种或所有的病征或症状以有益的方式改变(例如提高至少10％)，或者其他临床上接受的症状或疾病标志物得到改善或改良，则认为治疗是“有效的治疗”。还可以通过未实现凭借住院治疗或需要医学干预所评估的个体恶化(例如肌肉萎缩减少，或疾病进展停止或至少减慢)来衡量功效。衡量这些指标的方法是本领域技术人员已知的和/或在本文中进行描述。治疗包括对个体或动物(一些非限制性实例包括人或哺乳动物)中的疾病的任何治疗，包括：(1)抑制疾病，例如阻止或减缓症状进展；或(2)缓解疾病，例如引起症状消退；和(3)预防或降低症状发展的可能性。
根据本公开的治疗可以通过增加个体中功能性肌营养不良蛋白的量来改善与DMD相关的一种或更多种症状。通常与DMD有关的早期病征包括例如步行延迟、腓肠肌增大(由于疤痕组织)和经常跌倒。随着疾病的发展，儿童会由于肌肉萎缩和疼痛而变得依靠轮椅。由于心脏和/或呼吸***并发症，该疾病变得威胁生命。
试剂盒
本公开提供了用于进行本文所述方法的试剂盒。试剂盒可以包括基因组靶向核酸、编码基因组靶向核酸的多核苷酸、定点多肽、编码定点多肽的多核苷酸和/或进行本文所述方法的各方面所必需的任何核酸或蛋白质分子中的一种或更多种，或其任何组合。
试剂盒可包含：(1)包含编码基因组靶向核酸的核苷酸序列的载体，和(2)定点多肽或包含编码定点多肽的核苷酸序列的载体，和(3)用于重构和/或稀释载体和/或多肽的试剂。
试剂盒可包含：(1)载体，其包含(i)编码基因组靶向核酸的核苷酸序列，和(ii)编码定点多肽的核苷酸序列，和(2)用于重构和/或稀释载体的试剂。
在一些试剂盒中，试剂盒可以包含单分子向导基因组靶向核酸。在任何上述试剂盒中，试剂盒可以包含双分子基因组靶向核酸。在任何试剂盒中，试剂盒可以包含两种或更多种双分子向导或单分子向导。试剂盒可以包含编码靶向核酸的核酸的载体。
在任何试剂盒中，试剂盒可以进一步包含待***以实现期望的遗传修饰的多核苷酸。
试剂盒的各组分可以在分开的容器中，或者组合在一个容器中。
任何试剂盒均可进一步包含一种或更多种额外的试剂，其中所述额外的试剂选自缓冲剂、用于将多肽或多核苷酸引入细胞中的缓冲剂、洗涤缓冲剂、对照试剂、对照载体、对照RNA多核苷酸、用于从DNA体外产生多肽的试剂、用于测序的连接物等。缓冲剂可以是稳定缓冲剂、重构缓冲剂、稀释缓冲剂等。试剂盒还可以包含一种或更多种可用于促使或增强在靶结合或通过内切核酸内切酶的DNA切割或提高靶向特异性的组分。
除了上述组分之外，试剂盒还可以包含使用试剂盒的各组分来实施所述方法的说明书。实施所述方法的说明书可以记录在合适的记录介质上。例如，说明书可以印刷在基材(例如纸或塑料等)上。说明书可作为包装***物(insert)存在于试剂盒中，可存在于试剂盒或其组分的容器的标签中(即，与包装或分包装相关)等。说明书可以作为存在于合适的计算机可读存储介质(例如CD-ROM、磁盘、闪存驱动器等)上的电子存储数据文件存在。在一些情况下，实际的说明书不存在于试剂盒中，但可以提供用于从远程源(例如通过因特网)获得说明书的方法。这种情况的一个例子是包含网址的试剂盒，可以在所述网址查看说明书和/或可以从所述网址下载说明书。与说明书一样，这种获得说明书的方法可以记录在合适的基材上。
向导RNA制剂
根据具体的施用模式和剂型，本公开的向导RNA可以与药学上可接受的赋形剂例如运载体、溶剂、稳定剂、佐剂、稀释剂等一起配制。向导RNA组合物可被配制为获得生理学相容的pH，取决于制剂和施用途径，pH范围为pH约3至pH约11，约pH 3至约pH 7。在一些情况下，可将pH调节至约pH 5.0至约pH 8的范围。在一些情况下，组合物可包含治疗有效量的至少一种如本文所述的化合物以及一种或更多种药学上可接受的赋形剂。任选地，组合物可以包含本文所述化合物的组合，或者可以包括可用于治疗或预防细菌生长的第二活性成分(例如但不限于抗细菌剂或抗微生物剂)，或可以包括本公开的试剂的组合。
合适的赋形剂包括例如运载体分子，其包括大的缓慢代谢的大分子例如蛋白质、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合氨基酸、氨基酸共聚物和失活病毒颗粒。其他示例性赋形剂可以包括抗氧化剂(例如但不限于抗坏血酸)、螯合剂(例如但不限于EDTA)、碳水化合物(例如但不限于糊精、羟烷基纤维素和羟烷基甲基纤维素)、硬脂酸、液体(例如但不限于油、水、盐水、甘油和乙醇)、润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。
另一些可行的治疗方法
可以使用被工程化以靶向特定序列的核酸酶进行基因编辑。迄今为止，有四种主要类型的核酸酶：大范围核酸酶及其衍生物、锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)和CRISPR-Cas9核酸酶***。各核酸酶平台在设计难度、靶向密度和作用方式上有所不同，特别是因为ZFN和TALEN的特异性是通过蛋白质-DNA相互作用，而RNA-DNA相互作用主要引导Cas9。Cas9切割也需要邻近基序PAM，其在不同的CRISPR***之间有所不同。来自Streptococcus pyogenes的Cas9利用NGG PAM切割，来自Neisseria meningitidis的CRISPR可以利用包含NNNNGATT、NNNNNGTTT和NNNNGCTT的PAM在位点处切割。许多其他Cas9直系同源物靶向邻近替代性PAM的前间隔子。
CRISPR核酸内切酶例如Cas9可以用于本公开的方法中。然而，本文所述的教导(例如治疗靶位点)可应用于其他形式的核酸内切酶，例如ZFN、TALEN、HE或MegaTAL，或者使用核酸酶的组合。然而，为了将本公开的教导应用于所述核酸内切酶，除其他之外，需要工程化针对特定靶位点的蛋白质。
额外的结合结构域可以与Cas9蛋白融合以提高特异性。这些构建体的靶位点映射(map)到鉴定的gRNA指定位点，但需要额外的结合基序，例如用于锌指结构域。在Mega-TAL的情况下，大范围核酸酶可以与TALE DNA结合结构域融合。大范围核酸酶结构域可以提高特异性并提供切割。类似地，失活或无活性的Cas9(dCas9)可以与切割结构域融合并且需要sgRNA/Cas9靶位点和用于融合的DNA结合结构域的邻近结合位点。这可能需要对dCas9进行某种蛋白质工程改造(除了催化失活之外)以减少结合，而不需要额外的结合位点。
锌指核酸酶
锌指核酸酶(ZFN)是由与II型核酸内切酶FokI的催化结构域连接的工程化锌指DNA结合结构域组成的模块化蛋白质。因为FokI仅作为二聚体发挥功能，所以必须设计一对ZFN以结合相反DNA链上的同类靶“半-位点”序列并且它们之间具有精确的间隔以使得催化活性的FokI二聚体能够形成。FokI结构域自身本身不具有序列特异性，在FokI结构域二聚化之后，在ZFN半-位点之间产生了DNA双链断裂，作为基因组编辑中的起始步骤。
每个ZFN的DNA结合结构域通常由丰富Cys2-His2结构的3-6个锌指构成，其中每个指主要识别靶DNA序列的一条链上的核苷酸三联体，但与第四核苷酸的交叉链相互作用也可能是重要的。改变与DNA进行关键接触的位置处的指的氨基酸会改变给定指的序列特异性。因此，四指锌指蛋白选择性识别12bp的靶序列，其中所述靶序列是由每个指贡献的三重偏好的组合，但三重偏好可被相邻指不同程度地影响。ZFN的一个重要方面是：简单地通过修饰单个指，可容易地使ZFN重新靶向到几乎任何基因组地址，但需要相当多的专业知识才能做到这一点。在ZFN的大多数应用中，使用4-6个指的蛋白质，所述指分别识别12-18bp。因此，一对ZFN通常识别24-36bp的组合靶序列，不包括半-位点之间典型的5-7bp间隔子。可以用更大的间隔子(包括15-17bp)进一步分开结合位点。假定在设计过程中排除了重复序列或基因同源物，那么该长度的靶序列在人类基因组中可能是独一无二的。尽管如此，ZFN蛋白质-DNA相互作用在其特异性方面并不是绝对的，因此脱靶结合和切割事件会发生，要么作为两个ZFN之间的异二聚体，要么作为ZFN中的一个或另一个的同二聚体。后一种可能性已通过下述方法被有效消除：工程化FokI结构域的二聚化界面以产生“正”和“负”变体(也被称为专性异二聚体变体)，所述变体只能彼此二聚，而不能与自己二聚。强制(forcing)专性异二聚体阻止了同二聚体的形成。这极大地增强了ZFN以及采用这些FokI变体的任何其他核酸酶的特异性。
本领域已经描述了多种基于ZFN的***，并经常报告其修饰，并且大量参考文献描述了用于指导ZFN设计的规则和参数；参见例如Segal等人,Proc Natl Acad Sci USA 96(6):2758-63(1999)；Dreier B等人,J Mol Biol.303(4):489-502(2000)；Liu Q等人,JBiol Chem.277(6):3850-6(2002)；Dreier等人,J Biol Chem 280(42):35588-97(2005)和Dreier等人,J Biol Chem.276(31):29466-78(2001)。
转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)
TALEN代表另一种形式的模块化核酸酶，其中与ZFN一样，工程化的DNA结合结构域与FokI核酸酶结构域相连，并且一对TALEN联合起作用以实现靶向DNA切割。与ZFN的主要区别在于DNA结合结构域的性质和相关的靶DNA序列识别性质。TALEN DNA结合结构域源自TALE蛋白，TALE蛋白最初在植物细菌病原体Xanthomonas sp中描述。TALE由33-35个氨基酸重复的串联阵列组成，其中每个重复识别靶DNA序列中的单个碱基对，所述靶DNA序列的长度通常达到20bp，从而总靶序列长度可达40bp。每个重复的核苷酸特异性由重复可变的二残基(RVD)决定，其仅包括位置12和13处的两个氨基酸。鸟嘌呤、腺嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶主要分别被四种RVD识别：Asn-Asn、Asn-Ile、His-Asp和Asn-Gly。这构成了比锌指的识别码简单得多的识别码，因此与锌指相比，其在核酸酶设计方面具有优势。尽管如此，与ZFN相同，TALEN的蛋白质-DNA相互作用在其特异性方面并不是绝对的，并且TALEN也得益于使用FokI结构域的专性异源二聚体变体来减少脱靶活性。
已经产生了催化功能失活的FokI结构域的其他变体。如果TALEN或ZFN对的一半含有无活性的FokI结构域，则在靶位点处仅发生单链DNA切割(切刻)，而非DSB。结果与使用CRISPR/Cas9/Cpf1“切口酶”突变体时相当，在所述突变体中，一个Cas9切割结构域已经失活。DNA缺刻可用于通过HDR驱动基因组编辑，但其效率低于DSB。主要优点是：可以快速准确地修复脱靶缺刻，而不像DSB那样倾向于NHEJ介导的错误修复。
本领域已经描述了各种基于TALEN的***，并经常报道其修饰；参见例如Boch,Science 326(5959):1509-12(2009)；Mak等人,Science 335(6069):716-9(2012)和Moscou等人,Science 326(5959):1501(2009)。许多组已经描述了基于“金门”平台或克隆方案的TALEN的使用；参见例如Cermak等人,Nucleic Acids Res.39(12):e82(2011)；Li等人,Nucleic Acids Res.39(14):6315-25(2011)；Weber等人,PLoS One.6(2):e16765(2011)；Wang等人,J Genet Genomics 41(6):339-47,Epub 2014 May 17(2014)和Cermak T等人,Methods Mol Biol.1239:133-59(2015)。
归巢核酸内切酶(homing Endonucleases)
归巢核酸内切酶(HE)是序列特异性核酸内切酶，其具有长的识别序列(14-44个碱基对)，并且以高特异性(通常在基因组中独特的位点处)切割DNA。根据HE的结构进行分类，存在至少六个已知的HE家族，包括LAGLIDADG(SEQ ID NO.1,410,474)、GIY-YIG、His-Cis盒、H-N-H、PD-(D/E)xK和Vsr-样(Vsr-like)，其源自广泛的宿主，包括真核生物、原生生物、细菌、古细菌、蓝细菌和噬菌体。与ZFN和TALEN一样，HE可用于在靶基因座处产生DSB，作为基因组编辑中的起始步骤。另外，一些天然HE和工程化HE仅切割DNA的一条链，从而起到位点特异性切口酶的作用。HE的大靶序列和它们提供的特异性使其成为产生位点特异性DSB的有吸引力的候选物。
本领域已经描述了各种基于HE的***，并经常报道其修饰；参见例如Steentoft等人,Glycobiology 24(8):663-80(2014)；Belfort和Bonocora,Methods Mol Biol.1123:1-26(2014)；Hafez和Hausner,Genome 55(8):553-69(2012)的综述；以及其中引用的参考文献。
MegaTAL/Tev-mTALEN/MegaTev
作为杂合核酸酶的另外的实例，MegaTAL平台和Tev-mTALEN平台使用TALE DNA结合结构域和催化活性HE的融合物，从而利用了TALE的特异性和可调的DNA结合以及HE的切割序列特异性；参见例如Boissel等人,NAR 42:2591-2601(2014)；Kleinstiver等人,G3 4:1155-65(2014)；以及Boisse和Scharenberg,Methods Mol.Biol.1239:171-96(2015)。
在另外的变体中，MegaTev架构是大范围核酸酶(Mega)与源自GIY-YIG寻靶核酸内切酶I-TevI(Tev)的核酸酶结构域的融合物。两个活性位点在DNA底物上相距～30bp，并产生两个具有不相容黏性末端的DSB；参见例如Wolfs等人,NAR 42,8816-29(2014)。预期现有的基于核酸酶的方法的其他组合将演化(evolve)并且可用于获得本文所述的靶向基因组修饰。
dCas9-FokI或dCpf1-Fok1和其他核酸酶
组合上述核酸酶平台的结构和功能特性提供了另一种基因组编辑方法，其可能能够克服一些固有缺陷。例如，CRISPR基因组编辑***通常使用一种Cas9内切酶来产生DSB。靶向的特异性由向导RNA中的20或24个核苷酸的序列驱动，所述序列与靶DNA(在来自S.pyogenes的Cas9的情况下，加上相邻的NAG或NGG PAM序列中的另外2个碱基)进行Watson-Crick碱基配对。这种序列足够长以使得在人类基因组中独一无二，但是RNA/DNA相互作用的特异性并不是绝对的，有时会容忍显著的***(promiscuity)，在靶序列的5'半部分中尤为如此，从而有效地减少驱动特异性的碱基的数目。对此的一种解决方案是使Cas9或Cpf1催化功能完全失活-仅保留RNA引导的DNA结合功能-并将FokI结构域与失活的Cas9融合；参见，例如Tsai等人,Nature Biotech 32:569-76(2014)和Guilinger等人,NatureBiotech.32:577-82(2014)。因为FokI必须要二聚化才能变得有催化活性，所以需要两个向导RNA来拴系两个极为接近的FokI融合体以形成二聚体并切割DNA。这实质上使组合的靶位点中碱基的数目加倍，从而提高了通过基于CRISPR***的靶向的严格性。
作为另一个的例子，TALE DNA结合结构域与有催化活性的HE(例如I-TevI)的融合利用了TALE的特异性和可调的DNA结合以及I-TevI的切割序列特异性，预期可以进一步减少脱靶切割。
本发明的方法和组合物
因此，本公开特别涉及以下非限制性发明：在第一方法(方法1)中，本公开提供了一种通过基因组编辑来编辑人类细胞中的肌营养不良蛋白基因的方法，所述方法包括以下步骤：向所述人类细胞中引入一种或更多种脱氧核糖核酸(DNA)核酸内切酶以在所述肌营养不良蛋白基因内或附近产生一个或更多个单链断裂(SSB)或双链断裂(DSB)，这导致所述肌营养不良蛋白基因内或附近的一个或更多个外显子或异常内含子剪接受体或供***点的永久性缺失、***或置换，以及导致所述肌营养不良蛋白的读码框重建和所述肌营养不良蛋白的蛋白活性重建。
在另一种方法(方法2)中，本公开提供了如方法1中所提供的通过基因组编辑来编辑人类细胞中的肌营养不良蛋白基因的方法，其中所述人类细胞是肌肉细胞或肌肉前体细胞。
在另一种方法(方法3)中，本公开提供了一种用于治疗患有杜氏肌营养不良症(DMD)的患者的离体方法，所述方法包括以下步骤：i)产生DMD患者特异性诱导性多能干细胞(iPSC)；ii)在所述iPSC的肌营养不良蛋白基因内或附近编辑；iii)使基因组编辑的iPSC分化成Pax7+肌祖细胞；和iv)将所述Pax7+肌祖细胞植入所述患者体内。
在另一种方法(方法4)中，本公开提供了如方法3中所提供的用于治疗患有DMD的患者的离体方法，其中所述产生步骤包括：a)从所述患者分离体细胞；和b)向所述体细胞内引入多能性相关基因的集合以诱导所述体细胞变成多能干细胞。
在另一种方法(方法5)中，本公开提供了如方法4中所提供的用于治疗患有DMD的患者的离体方法，其中所述体细胞是成纤维细胞。
在另一种方法(方法6)中，本公开提供了如方法4和5中所提供的用于治疗患有DMD的患者的离体方法，其中所述多能性相关基因的集合是一个或更多个选自OCT4、SOX2、KLF4、Lin28、NANOG和cMYC的基因。
在另一种方法(方法7)中，本公开提供了如方法3-6中任一种中所提供的用于治疗患有DMD的患者的离体方法，其中所述编辑步骤包括向所述iPSC中引入一种或更多种脱氧核糖核酸(DNA)核酸内切酶以在所述肌营养不良蛋白基因内或附近产生一个或更多个单链断裂(SSB)或双链断裂(DSB)，这导致所述肌营养不良蛋白基因内或附近的一个或更多个外显子或异常内含子剪接受体或供***点的永久性缺失、***或置换，以及导致所述肌营养不良蛋白的读码框重建和所述肌营养不良蛋白的蛋白活性重建。
在另一种方法(方法8)中，本公开提供了如方法3-7中任一种中所提供的用于治疗患有DMD的患者的离体方法，其中所述分化步骤包括以下一项或更多项以使所述基因组编辑的iPSC分化成Pax7+肌祖细胞：使所述基因组编辑的iPSC与特定培养基制剂接触，所述特定培养基制剂包括小分子药物；转基因过表达；或血清饥饿。
在另一种方法(方法9)中，本公开提供了如方法3-8中任一种中所提供的用于治疗患有DMD的患者的离体方法，其中所述植入步骤包括：通过局部注射到期望的肌肉中将所述Pax7+肌祖细胞植入所述患者体内。
在另一种方法(方法10)中，本公开提供了一种用于治疗患有DMD的患者的体内方法，所述方法包括编辑所述患者的细胞中的肌营养不良蛋白基因的步骤。
在另一种方法(方法11)中，本公开提供了如方法10中所提供的用于治疗患有DMD的患者的体内方法，其中所述编辑步骤包括：向所述患者的细胞中引入一种或更多种脱氧核糖核酸(DNA)核酸内切酶以在所述肌营养不良蛋白基因内或附近产生一个或更多个单链断裂(SSB)或双链断裂(DSB)，这导致所述肌营养不良蛋白基因内或附近的一个或更多个外显子或异常内含子剪接受体或供***点的永久性缺失、***或置换，以及导致所述肌营养不良蛋白的读码框重建和所述肌营养不良蛋白的蛋白活性重建。
在另一种方法(方法12)中，本公开提供了如方法11中所提供的用于治疗患有DMD的患者的体内方法，其中所述细胞是肌肉细胞或肌肉前体细胞。
在另一种方法(方法13)中，本公开提供了如方法1、7和11中任一种中所提供的用于治疗患有DMD的患者的体内方法，其中所述一种或更多种DNA核酸内切酶是Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9(也称为Csn1和Csx12)、Cas100、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4或Cpf1核酸内切酶；其同源物，其天然存在分子的重组体，其密码子优化版本，或其经修饰版本，以及它们的组合。
在另一种方法(方法14)中，本公开提供了如方法13中所提供的方法，其中所述方法包括：向所述细胞中引入编码所述一种或更多种DNA核酸内切酶的一种或更多种多核苷酸。
在另一种方法(方法15)中，本公开提供了如方法13中所提供的方法，其中所述方法包括：向所述细胞中引入编码所述一种或更多种DNA核酸内切酶的一种或更多种核糖核酸(RNA)。
在另一种方法(方法16)中，本公开提供了如方法14和15中所提供的方法，其中所述一种或更多种多核苷酸或一种或更多种RNA是一种或更多种经修饰的多核苷酸或一种或更多种经修饰的RNA。
在另一种方法(方法17)中，本公开提供了如方法13中所提供的方法，其中所述一种或更多种DNA核酸内切酶是一种或更多种蛋白质或多肽。
在另一种方法(方法18)中，本公开提供了如方法1-17中任一种中所提供的方法，其中所述方法还包括：向所述细胞中引入一种或更多种向导核糖核酸(gRNA)。
在另一种方法(方法19)中，本公开提供了如方法18中所提供的方法，其中所述一种或更多种gRNA是单分子向导RNA(sgRNA)。
在另一种方法(方法20)中，本公开提供了如方法18和19中所提供的方法，其中所述一种或更多种gRNA或一种或更多种sgRNA是一种或更多种经修饰的gRNA或一种或更多种经修饰的sgRNA。
在另一种方法(方法21)中，本公开提供了如方法18-20中任一种中所提供的方法，其中所述一种或更多种DNA核酸内切酶与一种或更多种gRNA或一种或更多种sgRNA预先复合。
在另一种方法(方法22)中，本公开提供了如方法1-21中任一种中所提供的方法，其中所述方法还包括：向所述细胞中引入包含野生型肌营养不良蛋白基因或cDNA的至少部分的多核苷酸供体模板。
在另一种方法(方法23)中，本公开提供了如方法22中所提供的方法，其中所述野生型肌营养不良蛋白基因或cDNA的至少部分包括外显子1、外显子2、外显子3、外显子4、外显子5、外显子6、外显子7、外显子8、外显子9、外显子10、外显子11、外显子12、外显子13、外显子14、外显子15、外显子16、外显子17、外显子18、外显子19、外显子20、外显子21、外显子22、外显子23、外显子24、外显子25、外显子26、外显子27、外显子28、外显子29、外显子30、外显子31、外显子32、外显子33、外显子34、外显子35、外显子36、外显子37、外显子38、外显子39、外显子40、外显子41、外显子42、外显子43、外显子44、外显子45、外显子46、外显子47、外显子48、外显子49、外显子50、外显子51、外显子52、外显子53、外显子54、外显子55、外显子56、外显子57、外显子58、外显子59、外显子60、外显子61、外显子62、外显子63、外显子64、外显子65、外显子66、外显子67、外显子68、外显子69、外显子70、外显子71、外显子72、外显子73、外显子74、外显子75、外显子76、外显子77、外显子78、外显子79、内含子区域、合成的内含子区域、片段、其组合或整个肌营养不良蛋白基因或cDNA的至少部分。
在另一种方法(方法24)中，本公开提供了如方法22中所提供的方法，其中所述野生型肌营养不良蛋白基因或cDNA的至少部分包括外显子1、外显子2、外显子3、外显子4、外显子5、外显子6、外显子7、外显子8、外显子9、外显子10、外显子11、外显子12、外显子13、外显子14、外显子15、外显子16、外显子17、外显子18、外显子19、外显子20、外显子21、外显子22、外显子23、外显子24、外显子25、外显子26、外显子27、外显子28、外显子29、外显子30、外显子31、外显子32、外显子33、外显子34、外显子35、外显子36、外显子37、外显子38、外显子39、外显子40、外显子41、外显子42、外显子43、外显子44、外显子45、外显子46、外显子47、外显子48、外显子49、外显子50、外显子51、外显子52、外显子53、外显子54、外显子55、外显子56、外显子57、外显子58、外显子59、外显子60、外显子61、外显子62、外显子63、外显子64、外显子65、外显子66、外显子67、外显子68、外显子69、外显子70、外显子71、外显子72、外显子73、外显子74、外显子75、外显子76、外显子77、外显子78、外显子79、内含子区域、合成的内含子区域、片段、其组合或整个肌营养不良蛋白基因或cDNA。
在另一种方法(方法25)中，本公开提供了如方法22-24中任一种中所提供的方法，其中所述供体模板是单链多核苷酸或双链多核苷酸。
在另一种方法(方法26)中，本公开提供了如方法1、7和11中任一种中所提供的方法，其中所述方法还包括：向所述细胞中引入一种或更多种向导核糖核酸(gRNA)，并且其中所述一种或更多种DNA核酸内切酶是一种或更多种Cas9或Cpf1核酸内切酶，其产生成对的单链断裂(SSB)或双链断裂(DSB)，第一个SSB或DSB断裂在5’基因座，且第二个SSB或DSB断裂在3’基因座，这导致所述肌营养不良蛋白基因内或附近的5’基因座和3’基因座之间的一个或更多个外显子或异常内含子剪接受体或供***点的永久性缺失或置换，以及导致所述肌营养不良蛋白的读码框重建和所述肌营养不良蛋白的蛋白活性重建。
在另一种方法(方法27)中，本公开提供了如方法26中所提供的方法，其中一种gRNA产生成对的SSB或DSB。
在另一种方法(方法28)中，本公开提供了如方法26中所提供的方法，其中一种gRNA包含与5’基因座、3’基因座或5’基因座与3’基因座之间的区段互补的间隔子序列。
在另一种方法(方法29)中，本公开提供了如方法26中所提供的方法，其中所述方法包括第一gRNA和第二gRNA，其中所述第一gRNA包含与5’基因座的区段互补的间隔子序列，并且所述第二gRNA包含与3’基因座的区段互补的间隔子序列。
在另一种方法(方法30)中，本公开提供了如方法26-29中任一种中所提供的方法，其中所述一种或更多种gRNA是一种或更多种单分子向导RNA(sgRNA)。
在另一种方法(方法31)中，本公开提供了如方法26-30中任一种中所提供的方法，其中所述一种或更多种gRNA或一种或更多种sgRNA是一种或更多种经修饰的gRNA或一种或更多种经修饰的sgRNA。
在另一种方法(方法32)中，本公开提供了如方法26-31中任一种中所提供的方法，其中所述一种或更多种DNA核酸内切酶与一种或更多种gRNA或一种或更多种sgRNA预先复合。
在另一种方法(方法33)中，本公开提供了如方法26-32中任一种中所提供的方法，其中在5’基因座和3’基因座之间存在染色体DNA的缺失。
在另一种方法(方法34)中，本公开提供了如方法26-33中任一种中所提供的方法，其中所述缺失是单外显子缺失。
在另一种方法(方法35)中，本公开提供了如方法34中所提供的方法，其中所述单外显子缺失是外显子2、外显子8、外显子43、外显子44、外显子45、外显子46、外显子50、外显子51、外显子52或外显子53的缺失。
在另一种方法(方法36)中，本公开提供了如方法34或35中所提供的方法，其中所述5’基因座邻近选自外显子2、外显子8、外显子43、外显子44、外显子45、外显子46、外显子50、外显子51、外显子52和外显子53的单外显子的5’边界。
在另一种方法(方法37)中，本公开提供了如方法34-36中任一种中所提供的方法，其中所述3’基因座邻近选自外显子2、外显子8、外显子43、外显子44、外显子45、外显子46、外显子50、外显子51、外显子52和外显子53的单外显子的3’边界。
在另一种方法(方法38)中，本公开提供了如方法34-37中任一种中所提供的方法，其中所述5’基因座邻近选自外显子2、外显子8、外显子43、外显子44、外显子45、外显子46、外显子50、外显子51、外显子52和外显子53的单外显子的5’边界且所述3’基因座邻近选自外显子2、外显子8、外显子43、外显子44、外显子45、外显子46、外显子50、外显子51、外显子52和外显子53的单外显子的3’边界。
在另一种方法(方法39)中，本公开提供了如方法36-38中任一种中所提供的方法，其中邻近所述外显子的边界包括周围的相邻内含子的剪接供体和受体。
在另一种方法(方法40)中，本公开提供了如方法26-33中任一种中所提供的方法，其中所述缺失是多外显子缺失。
在另一种方法(方法41)中，本公开提供了如方法40中所提供的方法，其中所述多外显子缺失是外显子45-53或外显子45-55的缺失。
在另一种方法(方法42)中，本公开提供了如方法40-41中任一种中所提供的方法，其中所述5’基因座邻近选自外显子45-53和外显子45-55的多外显子的5’边界。
在另一种方法(方法43)中，本公开提供了如方法40-42中任一种中所提供的方法，其中所述3’基因座邻近选自外显子45-53和外显子45-55的多外显子的3’边界。
在另一种方法(方法44)中，本公开提供了如方法40-43中任一种中所提供的方法，其中所述5’基因座邻近选自外显子45-53和外显子45-55的多外显子的5’边界且3’基因座邻近选自外显子45-53和外显子45-55的多外显子的3’边界。
在另一种方法(方法45)中，本公开提供了如方法42-44中任一种中所提供的方法，其中邻近所述外显子的边界包括周围的相邻内含子的剪接供体和受体。
在另一种方法(方法46)中，本公开提供了如方法26-32中任一种中所提供的方法，其中在5’基因座与3’基因座之间存在染色体DNA的置换。
在另一种方法(方法47)中，本公开提供了如方法26-32和46中任一种中所提供的方法，其中所述置换是单外显子置换。
在另一种方法(方法48)中，本公开提供了如方法26-32和46-47中任一种中所提供的方法，其中所述单外显子置换是外显子2、外显子8、外显子43、外显子44、外显子45、外显子46、外显子50、外显子51、外显子52、外显子53或外显子70的置换。
在另一种方法(方法49)中，本公开提供了如方法47-48中任一种中所提供的方法，其中所述5’基因座邻近选自外显子2、外显子8、外显子43、外显子44、外显子45、外显子46、外显子50、外显子51、外显子52、外显子53或外显子70的单外显子的5’边界。
在另一种方法(方法50)中，本公开提供了如方法47-49中任一种中所提供的方法，其中所述3’基因座邻近选自外显子2、外显子8、外显子43、外显子44、外显子45、外显子46、外显子50、外显子51、外显子52、外显子53或外显子70的单外显子的3’边界。
在另一种方法(方法51)中，本公开提供了如方法47-50中任一种中所提供的方法，其中所述5’基因座邻近选自外显子2、外显子8、外显子43、外显子44、外显子45、外显子46、外显子50、外显子51、外显子52、外显子53或外显子70的单外显子的5’边界且所述3’基因座邻近选自外显子2、外显子8、外显子43、外显子44、外显子45、外显子46、外显子50、外显子51、外显子52、外显子53或外显子70的单外显子的3’边界。
在另一种方法(方法52)中，本公开提供了如方法49-51中任一种中所提供的方法，其中邻近所述外显子的边界包括周围的相邻外显子或相邻内含子的剪接供体和受体。
在另一种方法(方法53)中，本公开提供了如方法26-32或46中任一种中所提供的方法，其中所述置换是多外显子置换。
在另一种方法(方法54)中，本公开提供了如方法53中任一种中所提供的方法，其中所述多外显子置换是外显子45-53或外显子45-55的置换。
在另一种方法(方法55)中，本公开提供了如方法53-54中任一种中所提供的方法，其中所述5’基因座邻近选自外显子45-53和外显子45-55的多外显子的5’边界。
在另一种方法(方法56)中，本公开提供了如方法53-55中任一种中所提供的方法，其中所述3’基因座邻近选自外显子45-53和外显子45-55的多外显子的3’边界。
在另一种方法(方法57)中，本公开提供了如方法53-56中任一种中所提供的方法，其中所述5’基因座邻近选自外显子45-53和外显子45-55的多外显子的5’边界且所述3’基因座邻近选自外显子45-53和外显子45-55的多外显子的3’边界。
在另一种方法(方法58)中，本公开提供了如方法55-57中任一种中所提供的方法，其中邻近所述外显子的边界包括周围的相邻内含子的剪接供体和受体。
在另一种方法(方法59)中，本公开提供了如方法46-58中任一种中所提供的方法，其中所述方法还包括：向所述细胞中引入包含野生型肌营养不良蛋白基因或cDNA的至少部分的多核苷酸供体模板，并且所述置换是通过同源定向修复(HDR)进行的。
在另一种方法(方法60)中，本公开提供了如方法59中任一种中所提供的方法，其中所述野生型肌营养不良蛋白基因或cDNA的至少部分包括外显子1、外显子2、外显子3、外显子4、外显子5、外显子6、外显子7、外显子8、外显子9、外显子10、外显子11、外显子12、外显子13、外显子14、外显子15、外显子16、外显子17、外显子18、外显子19、外显子20、外显子21、外显子22、外显子23、外显子24、外显子25、外显子26、外显子27、外显子28、外显子29、外显子30、外显子31、外显子32、外显子33、外显子34、外显子35、外显子36、外显子37、外显子38、外显子39、外显子40、外显子41、外显子42、外显子43、外显子44、外显子45、外显子46、外显子47、外显子48、外显子49、外显子50、外显子51、外显子52、外显子53、外显子54、外显子55、外显子56、外显子57、外显子58、外显子59、外显子60、外显子61、外显子62、外显子63、外显子64、外显子65、外显子66、外显子67、外显子68、外显子69、外显子70、外显子71、外显子72、外显子73、外显子74、外显子75、外显子76、外显子77、外显子78、外显子79、内含子区域、合成的内含子区域、片段、其组合或整个肌营养不良蛋白基因或cDNA的至少部分。
在另一种方法(方法61)中，本公开提供了如方法59中任一种中所提供的方法，其中所述野生型肌营养不良蛋白基因或cDNA的至少部分包括外显子1、外显子2、外显子3、外显子4、外显子5、外显子6、外显子7、外显子8、外显子9、外显子10、外显子11、外显子12、外显子13、外显子14、外显子15、外显子16、外显子17、外显子18、外显子19、外显子20、外显子21、外显子22、外显子23、外显子24、外显子25、外显子26、外显子27、外显子28、外显子29、外显子30、外显子31、外显子32、外显子33、外显子34、外显子35、外显子36、外显子37、外显子38、外显子39、外显子40、外显子41、外显子42、外显子43、外显子44、外显子45、外显子46、外显子47、外显子48、外显子49、外显子50、外显子51、外显子52、外显子53、外显子54、外显子55、外显子56、外显子57、外显子58、外显子59、外显子60、外显子61、外显子62、外显子63、外显子64、外显子65、外显子66、外显子67、外显子68、外显子69、外显子70、外显子71、外显子72、外显子73、外显子74、外显子75、外显子76、外显子77、外显子78、外显子79、内含子区域、合成的内含子区域、片段、其组合或整个肌营养不良蛋白基因或cDNA。
在另一种方法(方法62)中，本公开提供了如方法1、7或11中任一种中所提供的方法，其中所述方法还包括：向所述细胞中引入一种向导核糖核酸(gRNA)和包含野生型肌营养不良蛋白基因的至少部分的多核苷酸供体模板，并且其中所述一种或更多种DNA核酸内切酶是一种或更多种Cas9或Cpf1核酸内切酶，其在所述肌营养不良蛋白基因内或附近的基因座处产生一个单链断裂(SSB)或双链断裂(DSB)，从而促使在染色体DNA的所述基因座处***来自所述多核苷酸供体模板的新序列，这导致所述肌营养不良蛋白基因内或附近的一个或更多个外显子或异常内含子剪接受体或供***点的永久性***或校正，以及导致所述肌营养不良蛋白的读码框重建和所述肌营养不良蛋白的蛋白活性重建，并且其中所述gRNA包含与所述基因座的区段互补的间隔子序列。
在另一种方法(方法63)中，本公开提供了如方法1、7或11中任一种中所提供的方法，其中所述方法还包括：向所述细胞中引入一种或更多种向导核糖核酸(gRNA)和包含野生型肌营养不良蛋白基因的至少部分的多核苷酸供体模板，并且其中所述一种或更多种DNA核酸内切酶是一种或更多种Cas9或Cpf1核酸内切酶，其在所述肌营养不良蛋白基因内或附近产生成对的单链断裂(SSB)或双链断裂(DSB)，第一个在5’基因座，第二个在3’基因座，从而促使在染色体DNA的5’基因座和3’基因座之间***来自所述多核苷酸供体模板的新序列，这导致所述肌营养不良蛋白基因内或附近的5’基因座和3’基因座之间的一个或更多个外显子或异常内含子剪接受体或供***点的永久性***或校正，以及导致所述肌营养不良蛋白的读码框重建和所述肌营养不良蛋白的蛋白活性重建。
在另一种方法(方法64)中，本公开提供了如方法63中所提供的方法，其中一种gRNA产生成对的SSB或DSB。
在另一种方法(方法65)中，本公开提供了如方法63中所提供的方法，其中一种gRNA包含与5’基因座、3’基因座或5’基因座与3’基因座之间的区段互补的间隔子序列。
在另一种方法(方法66)中，本公开提供了如方法63中所提供的方法，其中所述方法包括第一gRNA和第二gRNA，其中所述第一gRNA包含与5’基因座的区段互补的间隔子序列，并且所述第二gRNA包含与3’基因座的区段互补的间隔子序列。
在另一种方法(方法67)中，本公开提供了如方法62或63中所提供的方法，其中所述一种或更多种gRNA是一种或更多种单分子向导RNA(sgRNA)。
在另一种方法(方法68)中，本公开提供了如方法62-63或67中所提供的方法，其中所述一种或更多种gRNA或一种或更多种sgRNA是一种或更多种经修饰的gRNA或一种或更多种经修饰的sgRNA。
在另一种方法(方法69)中，本公开提供了如方法62-63或67-68中任一种中所提供的方法，其中所述一种或更多种DNA核酸内切酶与一种或更多种gRNA或一种或更多种sgRNA预先复合。
在另一种方法(方法70)中，本公开提供了如方法62-69中任一种中所提供的方法，其中所述***是单外显子***。
在另一种方法(方法71)中，本公开提供了如方法70中所提供的方法，其中单外显子***是外显子2、外显子8、外显子43、外显子44、外显子45、外显子46、外显子50、外显子51、外显子52、外显子53或外显子70的***。
在另一种方法(方法72)中，本公开提供了如方法70-71中任一种中所提供的方法，其中所述基因座，5’基因座或3’基因座邻近选自外显子2、外显子8、外显子43、外显子44、外显子45、外显子46、外显子50、外显子51、外显子52、外显子53和外显子70的单外显子的边界。
在另一种方法(方法73)中，本公开提供了如方法72中所提供的方法，其中邻近所述外显子的边界包括周围的相邻外显子或相邻内含子的剪接供体和受体。
在另一种方法(方法74)中，本公开提供了如方法62-69中任一种中所提供的方法，其中所述***是多外显子***。
在另一种方法(方法75)中，本公开提供了如方法74中所提供的方法，其中所述多外显子***是外显子45-53或外显子45-55的***。
在另一种方法(方法76)中，本公开提供了如方法74-75中任一种中所提供的方法，其中所述基因座，5’基因座或3’基因座邻近选自外显子45-53或外显子45-55的多外显子的边界。
在另一种方法(方法77)中，本公开提供了如方法76中所提供的方法，其中邻近所述外显子的边界包括周围的相邻内含子的剪接供体和受体。
在另一种方法(方法78)中，本公开提供了如方法62或63中任一种中所提供的方法，其中所述野生型肌营养不良蛋白基因或cDNA的至少部分包括外显子1、外显子2、外显子3、外显子4、外显子5、外显子6、外显子7、外显子8、外显子9、外显子10、外显子11、外显子12、外显子13、外显子14、外显子15、外显子16、外显子17、外显子18、外显子19、外显子20、外显子21、外显子22、外显子23、外显子24、外显子25、外显子26、外显子27、外显子28、外显子29、外显子30、外显子31、外显子32、外显子33、外显子34、外显子35、外显子36、外显子37、外显子38、外显子39、外显子40、外显子41、外显子42、外显子43、外显子44、外显子45、外显子46、外显子47、外显子48、外显子49、外显子50、外显子51、外显子52、外显子53、外显子54、外显子55、外显子56、外显子57、外显子58、外显子59、外显子60、外显子61、外显子62、外显子63、外显子64、外显子65、外显子66、外显子67、外显子68、外显子69、外显子70、外显子71、外显子72、外显子73、外显子74、外显子75、外显子76、外显子77、外显子78、外显子79、内含子区域、合成的内含子区域、片段、其组合或整个肌营养不良蛋白基因或cDNA的至少部分。
在另一种方法(方法79)中，本公开提供了如方法62或63中任一种中所提供的方法，其中所述野生型肌营养不良蛋白基因或cDNA的至少部分包括外显子1、外显子2、外显子3、外显子4、外显子5、外显子6、
外显子7、外显子8、外显子9、外显子10、外显子11、外显子12、外显子13、外显子14、外显子15、外显子16、外显子17、外显子18、外显子19、外显子20、外显子21、外显子22、外显子23、外显子24、外显子25、外显子26、外显子27、外显子28、外显子29、外显子30、外显子31、外显子32、外显子33、外显子34、外显子35、外显子36、外显子37、外显子38、外显子39、外显子40、外显子41、外显子42、外显子43、外显子44、外显子45、外显子46、外显子47、外显子48、外显子49、外显子50、外显子51、外显子52、外显子53、外显子54、外显子55、外显子56、外显子57、外显子58、外显子59、外显子60、外显子61、外显子62、外显子63、外显子64、外显子65、外显子66、外显子67、外显子68、外显子69、外显子70、外显子71、外显子72、外显子73、外显子74、外显子75、外显子76、外显子77、外显子78、外显子79、内含子区域、合成的内含子区域、片段、其组合或整个肌营养不良蛋白基因或cDNA。
在另一种方法(方法80)中，本公开提供了如方法62-79中任一种中所提供的方法，其中所述***是通过同源定向修复(HDR)进行的。
在另一种方法(方法81)中，本公开提供了如方法62-80中任一种中所提供的方法，其中所述供体模板是单链多核苷酸或双链多核苷酸。
在另一种方法(方法82)中，本公开提供了如方法26-81中任一种中所提供的方法，其中将所述Cas9或Cpf1 mRNA、gRNA和供体模板各自配制成单独的脂质纳米颗粒或全部共配制成脂质纳米颗粒。
在另一种方法(方法83)中，本公开提供了如方法26-81中任一种中所提供的方法，其中将所述Cas9或Cpf1mRNA配制成脂质纳米颗粒，以及通过腺相关病毒(AAV)载体将所述gRNA和供体模板二者递送至所述细胞。
在另一种方法(方法84)中，本公开提供了如方法26-81中任一种中所提供的方法，其中将所述Cas9或Cpf1 mRNA配制成脂质纳米颗粒，以及通过电穿孔将所述gRNA递送至所述细胞以及通过腺相关病毒(AAV)载体将供体模板递送至所述细胞。
在另一种方法(方法85)中，本公开提供了如方法1-84中任一种中所提供的方法，其中所述肌营养不良蛋白基因位于染色体X上：31,117,228-33,344,609(基因组参***-GRCh38/hg38)。
在第一组合物(组合物1)中，本公开提供了用于编辑来自患有杜氏肌营养不良症(DMD)的患者的细胞中的肌营养不良蛋白基因的一种或更多种向导核糖核酸(gRNA)，所述一种或更多种gRNA包含选自以下的间隔子序列：序列表的SEQ ID NOs:1–1410472中的核酸序列。
在另一种组合物(组合物2)中，本公开提供了组合物1的一种或更多种gRNA，其中所述一种或更多种gRNA是一种或更多种单分子向导RNA(sgRNA)。
在另一种组合物(组合物3)中，本公开提供了组合物1或2的一种或更多种gRNA，其中所述一种或更多种gRNA或一种或更多种sgRNA是一种或更多种经修饰的gRNA或一种或更多种经修饰的sgRNA。
定义
术语“包含”或“包含”在涉及组合物、方法及其各自的组成时用来表达对于本发明而言是基本的，但还可以包含没有述及的要素，不论该要素是否是基本的。
术语“基本上由...组成”是指给定方面所需的那些要素。该术语允许对本发明的该方面的基本的和新颖的或功能性的特征没有实质性影响的额外要素存在。
术语“由……组成”是指本文描述的组合物、方法及其各自的组成，排除了该方面的该描述中未陈述的任何要素。
除非上下文中清楚指出，否则不使用数量词限定包括复数指代。
本说明书中陈述的任何数值范围均描述了包含在所陈述范围内的相同数值精度(即，具有相同数目指定数位)的所有子范围。例如，所陈述的“1.0至10.0”的范围描述了在所陈述的最小值1.0与所陈述的最大值10.0之间(并且包括该最小值和最大值)的所有子范围，例如“2.4至7.6”，即使在本说明书文本中没有明确陈述“2.4至7.6”的范围也是如此。因此，申请人保留修改本说明书(包括权利要求书)以明确陈述包含在本说明书中明确陈述的范围内的相同数值精度的任何子范围的权利。本说明书中固有地描述了所有此类范围，使得明确陈述任何子范围而做出的修改符合书面描述、描述的充分性和增加内容的要求(包括35 U.S.C.§112(a)和条款123(2)EPC的要求)。此外，除非明确指出或上下文需要，否则本说明书中描述的所有数值参数(例如表达值、范围、量、百分比等的数值参数)均可被视为好像以词语“约”开头，即使词语“约”并未明确出现在数字之前亦是如此。另外，本说明书中描述的数值参数应根据所报道的有效数位的数目、数值精度并且通过应用普通舍入技术来理解。还应理解，本说明书中描述的数值参数必然具有用于确定参数数值的基础测量技术的固有可变特性。
实施例
通过参照以下实施例能够更充分地理解本发明，所述实施例提供本发明的说明性非限制性方面。
实施例描述了使用CRISPR***作为说明性基因组编辑技术以在肌营养不良蛋白基因(DMD基因)中产生确定的治疗性基因组缺失、***或置换(统称为“基因组修饰”)，其导致来自基因组基因座的有问题的外显子的永久性缺失或校正，从而重建肌营养不良蛋白读码框以及重建肌营养不良蛋白活性。
选择跨越DMD基因的不同区域的单一gRNA并检测切割效率(表5)。gRNA靶向DMD基因中多个感兴趣区域的剪接受体、内含子和外显子。实施例中讨论的所有gRNA的命名约定是：#(对应于gRNA)-NN(Cas蛋白：SP-S.pyogenes，SA-S.aureus，NM-N.meningitides，ST-S.thermophiles，TD-T.denticola,Cpf1)-NN##(SA-剪接受体，E-外显子，I-内含子)。
表5
所有检测的gRNA均可用于基于HDR/校正的编辑方法。靶向剪接受体的单一gRNA可用于诱导外显子跳读以重建DMD基因的读码框。所选择的gRNA对可用于在DMD基因中产生缺失以重建读码框。所选择gRNA对可用于产生模拟患者突变的缺失，并可用于生成模型DMD突变系。
评估多种Cas直系同源物的切割。SP、NM、ST、SA和Cpf1 gRNA作为RNA递送，从质粒中的U6启动子表达，或从慢病毒中的U6启动子表达。将相应的Cas蛋白敲入感兴趣的细胞系并组成型表达，作为mRNA递送或作为蛋白质递送。使用TIDE分析或下一代测序在HEK293T细胞、K562细胞或诱导性多能干细胞(iPSC)中评估所有上述形式的gRNA的活性。
总体而言，确定了所检测的大多数gRNA诱导切割。然而，切割的量高度依赖于所检测的Cas蛋白。发现：通常，SP Cas9 gRNA诱导最高水平的切割，而SA Cas9 gRNA诱导第二高水平的切割。一般而言，选择具有尽可能高的切割效率的用于治疗应用的gRNA是有益的。但是，对于基于iPSC的疗法，切割效率没有那么重要。iPSC具有高度增殖性，从而使分离具有期望编辑的克隆细胞群体变得简单，即使编辑效率低于10％亦是如此。
如本文进一步描述和说明的，上述确定的治疗性修饰的引入代表了用于DMD的潜在改善的新颖治疗策略。
实施例1-肌营养不良蛋白基因的CRISPR/SPCas9靶位点
扫描肌营养不良蛋白基因的区域以寻找靶位点。扫描每个区以寻找具有序列NRG的前间隔子邻近基序(PAM)。鉴定了对应于PAM的gRNA20bp间隔子序列，如SEQ ID NO：1-467,030所示。鉴定了对应于PAM的gRNA 19bp间隔子序列，如序列表的SEQ ID NO：1,410,430至1,410,472所示。
实施例2-肌营养不良蛋白基因的CRISPR/SACas9靶位点
扫描肌营养不良蛋白基因的区域以寻找靶位点。扫描每个区以寻找具有序列NNGRRT的前间隔子邻近基序(PAM)。鉴定了对应于PAM的gRNA 20bp间隔子序列，如序列表的SEQ ID NO：467,031-528,196所示。
实施例3-肌营养不良蛋白基因的CRISPR/STCas9靶位点
扫描肌营养不良蛋白基因的区域以寻找靶位点。扫描每个区以寻找具有序列NNAGAAW的前间隔子邻近基序(PAM)。鉴定了对应于PAM的gRNA 24bp间隔子序列，如序列表的SEQ ID NOs：528,197-553,198所示。
实施例4-肌营养不良蛋白基因的CRISPR/TDCas9靶位点
扫描肌营养不良蛋白基因的区域以寻找靶位点。扫描每个区以寻找具有序列NAAAAC的前间隔子邻近基序(PAM)。鉴定了对应于PAM的gRNA 24bp间隔子序列，如序列表的SEQ ID NO：553,199-563,911所示。
实施例5-肌营养不良蛋白基因的CRISPR/NMCas9靶位点
扫描肌营养不良蛋白基因的区域以寻找靶位点。扫描每个区以寻找具有序列NNNNGHTT的前间隔子邻近基序(PAM)。鉴定了对应于PAM的gRNA 24bp间隔子序列，如序列表的SEQ ID NOs：563,912-627,854和1,410,400-1,410,402所示。
实施例6-肌营养不良蛋白基因的CRISPR/Cpf1靶位点
扫描肌营养不良蛋白基因的区域以寻找靶位点。扫描每个区以寻找具有序列YTN的前间隔子邻近基序(PAM)。鉴定了对应于PAM的gRNA 20-24bp间隔子序列，如序列表的SEQID NOs：627,855-1,410,399和1,410,403-1,410,429所示。
实施例7-靶向外显子2的说明性基因组编辑策略
几种方法提供了通过切割基因两次来缺失外显子2的gRNA对，一种gRNA在外显子2的5’端切割，另一种gRNA在外显子2的3’端切割。
实施例8-靶向外显子8的说明性基因组编辑策略
几种方法提供了通过切割基因两次来缺失外显子8的gRNA对，一种gRNA在外显子8的5’端切割，另一种gRNA在外显子8的3’端切割。
实施例9-靶向外显子43的说明性基因组编辑策略
几种方法提供了通过切割基因两次来缺失外显子43的gRNA对，一种gRNA在外显子43的5’端切割，另一种gRNA在外显子43的3’端切割。
实施例10-靶向外显子44的说明性基因组编辑策略
几种方法提供了通过切割基因两次来缺失外显子44的gRNA对，一种gRNA在外显子44的5’端切割，另一种gRNA在外显子44的3’端切割。
实施例11-靶向外显子45的说明性基因组编辑策略
几种方法提供了通过切割基因两次来缺失外显子45的gRNA对，一种gRNA在外显子45的5’端切割，另一种gRNA在外显子45的3’端切割。
实施例12-靶向外显子46的说明性基因组编辑策略
几种方法提供了通过切割基因两次来缺失外显子46的gRNA对，一种gRNA在外显子46的5’端切割，另一种gRNA在外显子46的3’端切割。
实施例13-靶向外显子50的说明性基因组编辑策略
几种方法提供了通过切割基因两次来缺失外显子50的gRNA对，一种gRNA在外显子50的5’端切割，另一种gRNA在外显子50的3’端切割。
实施例14-靶向外显子51的说明性基因组编辑策略
几种方法提供了通过切割基因两次来缺失外显子51的gRNA对，一种gRNA在外显子51的5’端切割，另一种gRNA在外显子51的3’端切割。
实施例15-靶向外显子52的说明性基因组编辑策略
几种方法提供了通过切割基因两次来缺失外显子52的gRNA对，一种gRNA在外显子52的5’端切割，另一种gRNA在外显子52的3’端切割。
实施例16-靶向外显子53的说明性基因组编辑策略
几种方法提供了通过切割基因两次来缺失外显子53的gRNA对，一种gRNA在外显子53的5’端切割，另一种gRNA在外显子53的3’端切割。
实施例17-靶向外显子70的说明性基因组编辑策略
几种方法提供了通过切割基因两次来缺失外显子70的gRNA对，一种gRNA在外显子70的5’端切割，另一种gRNA在外显子70的3’端切割。
实施例18-靶向外显子45-53的说明性基因组编辑策略
几种方法提供了通过切割基因两次来缺失外显子45-53的gRNA对，一种gRNA在外显子45的5’端切割，另一种gRNA在外显子53的3’端切割。
实施例19-靶向外显子45-55的说明性基因组编辑策略
几种方法提供了通过切割基因两次来缺失外显子45-55的gRNA对，一种gRNA在外显子45的5’端切割，另一种gRNA在外显子55的3’端切割。
实施例20-向导链的生物信息学分析
在涉及理论性结合和实验评估的活性二者的多步骤方法中筛选并选择候选向导。作为说明，可以使用如下文更详细描述和说明的可用于评估脱靶结合的多种生物信息学工具中的一种或更多种，评估具有与有邻近PAM的特定在靶位点(例如肌营养不良蛋白基因内或附近的位点)匹配的序列的候选向导在具有相似序列的脱靶位点处切割的潜能，以评估在不同于预期的染色***置处的作用的可能性。然后可以通过实验评估被预测具有相对较低的脱靶活性潜能的候选物，以衡量其在靶活性，然后衡量在各个位点的脱靶活性。优选的向导具有足够高的在靶活性以在所选择的基因座处实现期望水平的基因编辑，和相对较低的脱靶活性以降低其他染色体基因座处改变的可能性。在靶活性与脱靶活性之比通常被称为向导的“特异性”。
为了初步筛选所预测的脱靶活性，存在许多已知并可公开获得的生物信息学工具，其可用于预测最可能的脱靶位点；由于CRISPR/Cas9核酸酶***中与靶位点的结合由互补序列之间的沃森-克里克碱基配对所驱动，所以不相似度(以及因此降低的脱靶结合可能性)基本上与一级序列差异(错配和凸出，即变为非互补碱基的碱基，以及潜在脱靶位点中相对于靶位点的碱基的***或缺失)相关。被称为COSMID(具有错配、***和缺失的CRISPR脱靶位点)的示例性生物信息学工具(可在网上在crispr.bme.gatech.edu获得)编写了这样的相似性。其他生物信息学工具包括但不限于GUIDO、autoCOSMID和CCtop。
利用生物信息学来最小化脱靶切割以减少突变和染色体重排的有害影响。对CRISPR/Cas9***的研究表明了由于向导链与具有碱基对错配和/或凸出的DNA序列的非特异性杂交(特别是在远离PAM区域的位置处)导致的高脱靶活性的可能性。因此，拥有生物信息学工具非常重要，除了碱基对错配之外，该工具能够鉴定在RNA向导链和基因组序列之间具有***和/或缺失的潜在脱靶位点。基于生物信息学的工具COSMID(具有错配、***和缺失的CRISPR脱靶位点)因此被用于搜索基因组中潜在的CRISPR脱靶位点(可在网上在crispr.bme.gatech.edu获得)。COSMID输出基于错配的数目和位置对潜在脱靶位点的经排序的列表，从而允许对于选择靶位点有更多信息，并避免使用更可能脱靶切割的位点。
采用额外的生物信息学渠道，其对gRNA靶向区域中位点的估计的在靶活性和/或脱靶活性进行权衡。可用于预测活性的其他特征包括关于所讨论的细胞的类型、DNA可及性、染色质状态、转录因子结合位点、转录因子结合数据和其他CHIP-seq数据的信息。权衡预测编辑效率的其它因素，例如gRNA对的相对位置和方向、局部序列特征和微同源性。
实施例21-在细胞中检测优选向导的在靶活性
然后通过瞬时转染在源自人胚肾HEK 293T的上皮细胞中检测被预测具有最低脱靶活性的gRNA的在靶活性，并利用TIDE或下一代测序评估***缺失频率。TIDE是一种网络工具，其用于快速评估由向导RNA(gRNA或sgRNA)确定的靶基因座通过CRISPR-Cas9的基因组编辑。基于来自两个标准毛细管测序反应的定量序列跟踪数据，TIDE软件量化编辑效力并鉴定靶向细胞池的DNA中***和缺失(***缺失(indel))的主要类型。详细的解释和例子请参见Brinkman等人,Nucl.Acids Res.(2014)。下一代测序(NGS)也称为高通量测序，是用于描述一些不同的现代测序技术的笼统术语，所述测序技术包括：Illumina(Solexa)测序、Roche 454测序、离子流(Ion torrent):质子(Proton)/PGM测序和SOLiD测序。这些最近的技术允许比以前使用的Sanger测序快得多并且便宜得多地对DNA和RNA进行测序，因此使基因组学和分子生物学的研究发生了革命性变化。HEK 293T是用于iPSC中基因校正的良好模型***，因为已知这两种细胞类型都具有松散的染色质结构。
染色质通过卷绕成称为核小体的离散结构进行组织。这种卷绕影响基因组物质对转录机制的可及性。打开的基因组区域被称为常染色质，而紧密卷绕的区域被称为异染色质。普遍接受的范例是：干细胞具有通常松散的染色质构象，随着细胞分化成更专门化的细胞类型，基因组的某些区域变得封闭，从而形成异染色质(Sims,R.J.和D.Reinberg(2009)."Stem cells:Escaping fates with open states."Nature 460(7257):802-803)。
实施例22-在相关模型细胞系中进行检测
单独评估所有的向导RNA并鉴定出有效的gRNA之后，在相关模型细胞系中对所有gRNA的排列对修饰肌营养不良蛋白基因的DNA序列的能力进行检测，所述能力被预测能够重建肌营养不良蛋白读码框。生成具有与在患者样品中发现的修饰相似或相同的修饰的成肌细胞和iPSC细胞系。如果适用的话，利用不同的单独的和成对组合的gRNA和供体DNA模板处理细胞。然后可利用本领域技术人员已知的一种或更多种生物学方法，例如特异性识别肌营养不良蛋白的C末端(注意：截短的蛋白质不包含完整的C末端)的酶联免疫吸附测定(ELISA)，评估样品的肌营养不良蛋白表达的重建。然后可通过额外的生物技术(例如蛋白质印迹)进一步评估重建肌营养不良蛋白表达的gRNA对，以确认合适大小的肌营养不良蛋白的表达。
实施例23-检测用于HDR基因编辑的不同方法
检测gRNA的在靶活性和脱靶活性之后，检测HDR基因编辑的外显子校正和敲入策略。
对于外显子校正方法，以短单链寡核苷酸、短双链寡核苷酸(PAM序列完整/PAM序列突变)、长单链DNA分子(完整的PAM序列/PAM序列突变)或长双链DNA分子(PAM序列完整/PAM序列突变)的形式提供供体DNA模板。另外，通过AAV递送供体DNA模板。
对于DNA敲入方法，与Xp21.2基因座具有同源臂的单链DNA或双链DNA可包括肌营养不良蛋白基因第一靶外显子(第一编码外显子)的40nt或更多、肌营养不良蛋白基因的完整编码DNA序列(CDS)和肌营养不良蛋白基因的3’UTR以及下述内含子的至少40nt。与Xp21.2基因座具有同源臂的单链DNA或双链DNA可以包括肌营养不良蛋白基因的第一靶外显子(第一编码外显子)的80nt或更多、肌营养不良蛋白基因的完整编码DNA序列(CDS)和肌营养不良蛋白基因的3’UTR以及下述内含子的至少80nt。与Xp21.2基因座具有同源臂的单链DNA或双链DNA可以包括肌营养不良蛋白基因的第一靶外显子(第一编码外显子)的100nt或更多、肌营养不良蛋白基因的完整编码DNA序列(CDS)和肌营养不良蛋白基因的3’UTR以及下述内含子的至少100nt。与Xp21.2基因座具有同源臂的单链DNA或双链DNA可以包括肌营养不良蛋白基因的第一靶外显子(第一编码外显子)的150nt或更多、肌营养不良蛋白基因的完整编码DNA序列(CDS)和肌营养不良蛋白基因的3’UTR以及下述内含子的至少150nt。与Xp21.2基因座具有同源臂的单链DNA或双链DNA可以包括肌营养不良蛋白基因的第一靶外显子(第一编码外显子)的300nt或更多、肌营养不良蛋白基因的完整编码DNA序列(CDS)和肌营养不良蛋白基因的3’UTR以及下述内含子的至少300nt。与Xp21.2基因座具有同源臂的单链DNA或双链DNA可以包括肌营养不良蛋白基因的第一靶外显子(第一编码外显子)的400nt或更多、肌营养不良蛋白基因的CDS和肌营养不良蛋白基因的3’UTR以及下述内含子的至少400nt。或者，通过AAV递送DNA模板。
对于cDNA敲入方法，单链cDNA或双链cDNA可包括肌营养不良蛋白基因的单外显子靶标的40nt或更多。单链cDNA或双链cDNA可包括肌营养不良蛋白基因的单外显子靶标的80nt或更多。单链cDNA或双链cDNA可包括肌营养不良蛋白基因的单外显子靶标的100nt或更多。单链cDNA或双链cDNA可包括肌营养不良蛋白基因的单外显子靶标的150nt或更多。单链cDNA或双链cDNA可包括肌营养不良蛋白基因的单外显子靶标的300nt或更多。单链cDNA或双链cDNA可包括肌营养不良蛋白基因的单外显子靶标的400nt或更多。或者，通过AAV递送DNA模板。
对于cDNA敲入方法，单链cDNA或双链cDNA可包括肌营养不良蛋白基因的多外显子靶标的40nt或更多。单链cDNA或双链cDNA可包括肌营养不良蛋白基因的多外显子靶标的80nt或更多。单链cDNA或双链cDNA可包括肌营养不良蛋白基因的多外显子靶标的100nt或更多。单链cDNA或双链cDNA可包括肌营养不良蛋白基因的多外显子靶标的150nt或更多。单链cDNA或双链cDNA可包括肌营养不良蛋白基因的多外显子靶标的300nt或更多。单链cDNA或双链cDNA可包括肌营养不良蛋白基因的多外显子靶标的400nt或更多。或者，通过AAV递送DNA模板。
实施例24-再评估前导CRISPR-Cas9/DNA供体组合
检测不同策略的HDR基因编辑之后，在治疗相关细胞中再次评估前导CRISPR-Cas9/DNA供体组合的缺失的效率、重组效率和脱靶特异性。Cas9 mRNA或RNP被配制成脂质纳米颗粒用于递送，sgRNA被配制成纳米颗粒或以AAV的形式递送，供体DNA被配制成纳米颗粒或以AAV的形式递送。
实施例25-在相关动物模型中的体内检测
再次评估CRISPR-Cas9/DNA供体组合之后，在治疗相关小鼠模型中体内检测前导制剂。
如上所述，人类细胞中的培养允许直接检测人类靶标和背景人类基因组。
通过将经修饰的小鼠或人类细胞植入治疗相关的小鼠模型中可以观察到临床前功效和安全性评估。在植入后的数月内可以观察经修饰的细胞。
实施例26-靶向DMD基因中的外显子45、51、53、55和70的S.pyogenes gRNA的切割 效率
检测了靶向DMD基因中的外显子45、51、53、55和70的S.pyogenes(SP)gRNA(图3A-3B)。可以使用基于HDR/校正的方法来编辑外显子45、51、53、55和70中的每一个。
将SP gRNA克隆到共表达SPCas蛋白质的质粒中。使用lipofectamine 2000将质粒转染到HEK293T细胞中。转染48小时后收获细胞，分离基因组DNA，并利用TIDE分析评估切割效率。数据汇编自一个包含3-4个重复的实验(N＝3-4)的实验。数据被绘制为平均值和SEM。
来自图3A-3B的数据表明：大多数gRNA在HEK293T细胞中的切割效率高于50％。
实施例27-靶向DMD基因中的外显子43、44、45、46、50、51、52、53和55的剪接受体的 gRNA的切割效率
治疗DMD的可行选择是诱导外显子跳读以重建DMD基因的读码框。为了诱导外显子跳读，基因编辑方法必须移除内源剪接机制所识别的紧邻外显子上游的AG序列。当单一gRNA诱导双链断裂时，细胞将修复所述断裂。有时，内源修复机制会产生错误，在邻近切割位点***或缺失碱基。使AG序列突变的gRNA可能在该位点诱导外显子跳读，因为剪接机制不再能够将该位点识别为剪接受***点，并跳至相邻外显子的下一个剪接受体。
设计并检测靶向DMD基因中的外显子43、44、45、46、50、51、52、53和55的剪接受体的S.pyogenes(SP)、S.aureus(SA)、S.thermophiles(ST)、N.Meningitidis(NM)和Cpf1gRNA(图4A、4B和4C)。
设计SP gRNA以靶向DMD基因中9个外显子的剪接受体。gRNA是以***RNA gRNA的形式从Integrated DNA Technologies(IDT)订购的。根据制造商的说明使***gRNA与tracRNA退火。然后使用RNAiMax将退火的***gRNA转染到稳定表达SP Cas9蛋白细胞的HEK293T细胞中。转染后第48小时收获细胞，分离基因组DNA，并利用TIDE分析评估切割效率(图4A)。在两个独立的实验之间汇编数据，每个实验包含3个重复(N＝2-6)。数据被绘制为平均值和SEM。
设计NM、ST和SA gRNA以靶向9个外显子的剪接受体。将gRNA克隆到与相应的gRNA一起共表达感兴趣的Cas蛋白的质粒中。利用lipofectamine 2000将质粒转染到HEK293T细胞中。转染后第48小时收获细胞，分离基因组DNA，并利用TIDE分析评估切割效率(图4B)。在2-4个独立的实验之间汇编数据，每个实验包含3个重复(N＝6-12)。数据被绘制为平均值和SEM。
设计Cpf1 gRNA以靶向DMD基因中9个外显子的剪接受体。将gRNA克隆到表达gRNA的质粒中。利用lipofectamine 2000，用感兴趣的gRNA质粒和表达Cpf1的第二质粒共转染HEK293T。转染后第48小时收获细胞，分离基因组DNA，并利用TIDE分析评估切割效率(图4C)。在两个独立的实验之间汇编数据，每个实验包含3个重复(N＝3-6)。数据被绘制为平均值和SEM。
实施例28-靶向DMD基因中的外显子43、44、45、46、50、51、52、53和55的gRNA的切割 效率和剪接受体敲除效率
靶向剪接受体的许多gRNA在期望的剪接位点有效切割。为了评估gRNA是否有效敲除了期望的AG序列，对切割位点周围的PCR扩增子进行下一代测序。量化其中剪接受***点被移除的***缺失百分比读段(reads)(图5A-B和图6)。鉴定出了一些有希望的gRNA，包括但不限于：8-SA-SA55、3-SP-SA45、31-SP-SA50和40-SP-SA55，其移除了大比例的读段中的剪接受***点。
设计S.pyogenes gRNA以靶向DMD基因中9个外显子的剪接受体。gRNA是以***RNAgRNA的形式从IDT订购的。根据制造商的说明使***gRNA与tracRNA退火。使用RNAiMax将退火的***gRNA转染到稳定表达S.pyogenes Cas9蛋白细胞的HEK293T细胞中。转染后第48小时收获细胞，分离基因组DNA，并对期望的剪接受体周围期望的100-250bp PCR扩增子进行下一代测序。在两个独立的实验之间汇编数据，每个实验包含3个重复(N＝6)。平均值被展示为群体平均值(图5A-B)。
将N.meningitides(NM)、S.thermophiles(ST)和S.aureus(SA)gRNA设计为靶向9个外显子的剪接受体。将gRNA克隆到与相应的gRNA一起共表达感兴趣的Cas蛋白的质粒中。利用lipofectamine 2000将质粒转染到HEK293T细胞中。转染后第48小时收集细胞，分离基因组DNA，并对期望的剪接受体周围期望的100-250bp PCR扩增子进行下一代测序。在两个独立的实验之间汇编数据，每个实验包含3个重复(N＝6)。平均值被展示为群体平均值(图6)。
实施例29-靶向DMD基因的外显子44、45、52和54周围区域的gRNA的切割效率
为了有效评估编辑方法，取得患者细胞系是重要的以进行体外检测。但是，患者材料可难以取得，并且样本之间可存在大的患者间差异。因此，产生模拟常见患者突变的DMD突变细胞系是重要的。这允许研究者在相同背景下检测修复策略的功效，以确保编辑效率的变化不是患者特异性的。为了解决这个问题，设计了多种gRNA，其可以配对以产生在DMD患者中发现的常见缺失(Δ52、Δ44、Δ45和Δ54)。所产生的细胞系可以采用HDR或外显子跳读方法进行校正。重要的是，要注意，这些gRNA可用于产生模型系或基于HDR校正感兴趣的突变。
利用gRNA设计软件筛选区域(感兴趣外显子的上游和下游100bp-1kb)。在感兴趣外显子(例如DMD基因的外显子44、45、52和54)的每一侧选择基于最少的预测脱靶效应的最佳的6种gRNA。首先在HEK293T中评估gRNA的切割效率(图7A-7B)，然后在iPSC中证实gRNA的切割效率(图8A-8B)。
选择外显子44、45、52和54周围的单一S.pyogenes gRNA。gRNA是以***gRNA的形式从IDT订购的。利用制造商的说明使***gRNA与tracer序列退火。
利用RNAiMax将退火的gRNA转染到稳定表达SP Cas9蛋白细胞的HEK293T中。转染后第48小时收集细胞，分离基因组DNA，并利用TIDE分析评估切割效率(图7A-7B)。数据汇编自一个各包含3个重复的实验(N＝1-3)的实验。数据被绘制为平均值和SEM。
随后还使退火的gRNA与Cas9蛋白复合以形成核糖核蛋白复合体(RNP)。利用RNAiMax将RNP转染到iPSC(DiPS 1016SevA)中。转染后48小时收获细胞，分离基因组DNA，并利用TIDE分析评估切割效率(图8A-8B)。数据汇编自一个包含3个重复(N＝1-3)的实验。数据被绘制为平均值和SEM。
选择外显子44、45、52和54周围的单一S.pyogenes gRNA。gRNA是以***gRNA的形式从IDT订购的。利用制造商的说明使***gRNA与tracer序列退火。利用RNAiMax将gRNA转染到稳定表达SP Cas9蛋白细胞的HEK293T中。还使相同的gRNA与Cas9蛋白复合以形成核糖核蛋白复合体(RNP)。利用RNAiMax将RNP转染到iPSC(DiPS 1016SevA)中。转染后48小时收集细胞，分离基因组DNA，并利用TIDE分析评估切割。数据汇编自多个实验。只绘制了平均值。
HEK293T细胞和iPSC中的编辑效率之间存在高度相关，总体Pearson相关系数为0.51。因此，HEK293T细胞中的筛选被认为是我们感兴趣的治疗细胞系-iPSC的良好替代物(图9)。
实施例30-克隆缺失事件的克隆分析
在每个感兴趣的内含子(不包括内含子55)中鉴定iPSC中切割效率超过20％的gRNA。选择具有最佳切割效率的单一gRNA以产生期望的缺失。
使用两对gRNA来产生克隆Δ52细胞系(1-SP-I52+2-SP-I53和2-SP-I52+2-SP-I53)。在筛选的共261个克隆中，57个克隆具有期望的缺失，这是通过PCR分析获得的(图10A，10C)。
为了确认预期的Δ52缺失的存在，收获来自每个感兴趣克隆的基因组DNA。设计了缺失侧翼的PCR引物。由于缺失小(<900bp)，因此可以使用一对引物来检测缺失。这会导致更小的缺失条带(～500bp)或野生型(WT)条带(～1000bp)。图10A中显示了缺失(del)或野生型(WT)产物的代表性凝胶。
通过对缺失PCR产物进行Sanger测序，甚至在7个克隆中确认了缺失(7/7克隆具有有小***和缺失的预测缺失事件(图11A-B))。对来自7个克隆的缺失条带(图8A中产生的PCR)进行凝胶预备并进行Sanger测序。对使用gRNA 1-SP-I52和2-SP-I53产生的2个克隆进行测序并与预测的缺失产物进行比对(假设S.pyogenes Cas9从gRNA的3’端切割3BP(图11A)。对使用gRNA 2-SP-I52和2-SP-I53产生的5个克隆进行测序并与预测的缺失产物进行比对(假设S.pyogenes Cas9从gRNA的3’端切割3BP(图11B)。
类似地，使用两对gRNA来产生克隆Δ44细胞系(2-SP-I44+3-SP-I45和2-SP-I44+4-SP-I45)。在筛选的共256个克隆中，16个克隆具有期望的缺失，这是通过PCR分析获得的(图10B，10C)。
为了确认预期的Δ44缺失的存在，收获来自每个感兴趣克隆的基因组DNA。由于Δ44 gRNA与Δ52 gRNA相比产生更大的缺失，因此设计两对PCR引物以检测缺失条带或WT条带。预期的缺失条带为～400bp，预期的WT条带为～500bp。图10B中显示了缺失(del)、野生型产物(WT+)和利用野生型引物扩增的阴性样品(WT-)的代表性凝胶。
实施例31-慢病毒筛选
为了鉴定大量能够诱导外显子51跳读的gRNA对，我们进行了大规模慢病毒筛选。使用gRNA设计软件对内含子51和内含子52基因组序列进行分析。将所产生的gRNA列表缩小至邻近外显子51剪接受体的约3000个左侧gRNA和3000个右侧gRNA。基于序列的独特性(仅筛选在基因组中其他地方没有完美匹配的gRNA)和最低的预测的脱靶缩小列表。与右侧gRNA配对的左侧gRNA应诱导外显子51跳读。将6000个gRNA克隆到慢病毒载体中，该载体从U6启动子表达每个感兴趣的gRNA并赋予嘌呤霉素抗性。用病毒转导K562细胞，MOI为2，然后利用嘌呤霉素进行选择以获得表达感兴趣的gRNA的细胞群体。然后用Cas9mRNA核转染这些细胞以诱导短暂的切割期。7天后，使细胞沉淀并提取基因组DNA。利用杂交捕获，富集基因组DNA中外显子51周围的感兴趣区域。对富集的DNA进行下一代测序(图19A-19VV)。
实施例32-体外转录的(IVT)gRNA筛选
为了鉴定大量能够诱导外显子45跳读的gRNA对，进行体外转录的(IVT)gRNA筛选。使用gRNA设计软件对内含子45和内含子46基因组序列进行分析。基于序列的独特性(仅筛选在基因组中其他地方没有完美匹配的gRNA)和最低的预测脱靶，将所产生的gRNA列表缩小至约100个左侧gRNA和约100个右侧gRNA的列表。使这组gRNA在体外转录，然后利用信使Max转染到稳定表达Cas9的HEK293T细胞中。转染后48小时收获细胞，分离基因组DNA，并利用TIDE分析评估切割效率(图12A-E)。发现约18％所检测的gRNA诱导超过50％的切割效率。
实施例33-DMD基因的外显子45-55之间的部分cDNA敲入
校正DMD基因的另一种方法是部分cDNA敲入。作为原理验证，进行研究以置换DMD基因的区域外显子45-55(其可以治疗高达62％的DMD患者)。外显子45-55的cDNA是3.2kb。使用来自Trilink的两种固相合成的gRNA[外显子45中的一种(SEQ ID NO.1410449)和外显子55中的第二种(SEQ ID NO 114738)]用于切割。将两种trilink gRNA与Cas9蛋白复合并与质粒供体一起核转染到iPSC中。质粒供体被设计成具有3.2kb的盒(与期望的cDNA敲入大小相同)，所述盒组成型表达GFP，且每侧具有1kb同源臂以诱导整合到外显子45-55位点。追踪细胞23天。所有实验条件都以高效率(超过60％)进行核转染；然而，只有来自接受供体和gRNA的细胞的GFP表达经时间稳定，这指示HDR在约16％的细胞中发生(图13A)。分离来自这些样品的基因组DNA并检测供体构建体的位点特异性整合。利用对WT等位基因或期望的敲入等位基因具有特异性的引物扩增样品。如预期的那样，能够检测到WT等位基因和敲入等位基因(图13B)。
实施例34-内部缺失但仍有功能的肌营养不良蛋白
作为概念验证，证明了我们能够在iPSC中编辑，分离经编辑细胞的克隆群体，并使这些细胞向下分化成肌源性谱系以产生内部缺失但仍有功能的肌营养不良蛋白。
用于校正DMD基因的一种有吸引力的方法是产生Δ45-55缺失。这种缺失维持了DMD读码框，并且可以在约62％的DMD患者中重建肌营养不良蛋白的表达。为了产生期望的Δ45-55缺失，将两种公开的SP gRNA(CR6:SEQ ID NO:1,410,475和CR36:SEQ ID NO:91033)克隆到还表达SP Cas9 T2A橙色荧光蛋白(OFP)的质粒中。
gRNA gRNA序列 PAM
CR6 GGGGCTCCACCCTCACGAGT GGG
CR36 GCCTTCTTTATCCCCTATCG AGG
使用Mirus LT1转染试剂将这两种质粒共转染到iPSC中。两天后，利用荧光激活细胞分选(FACS)分离OFP表达所指示的表达Cas9的细胞。将细胞以低密度接种并使其生长7-10天，直至培养皿中出现单细胞克隆。在显微镜下手工挑取克隆并转移到96孔板中。一旦细胞达到汇合，便将样品以1:2传代并从剩余的细胞中分离基因组DNA。
为了鉴定具有期望缺失的克隆，设计了三引物PCR试验(图14A和14B)。该试验允许在同一PCR反应中检测野生型(WT)和缺失条带。利用该试验，我们鉴定了具有编辑事件的26/100个克隆(图14C)。
为了进一步证实克隆具有期望的Δ45-55缺失，对5个克隆进行Sanger测序。所有5个克隆都被确认具有期望的缺失事件。一个克隆具有***，一个克隆具有单碱基对缺失。其他三个克隆包含完美的缺失事件(图15)。
对被测序的所有5个克隆还进行核型分析，发现核型正常。此外，所有克隆均保持多能性，并且对于SSEA-4和TRA-160均为99％以上的阳性染色(图16A-B)。
然后将4个克隆使用公开的Chal等人的流程[Chal等人(2015)Differentiationof Pluripotent stem cells to muscle fiber to model Duchenne MuscularDystrophy.Nature Biotechnology]分化成肌管(mytotube)以诱导肌营养不良蛋白的表达。收获样品用于Western印迹和免疫组织化学。所有5个经编辑的克隆均诱导内部缺失的肌营养不良蛋白的表达(图17)。将尺寸与从转染了表达WT肌营养不良蛋白或Δ45-55肌营养不良蛋白的对照cDNA质粒的HEK293T细胞分离的蛋白进行比较。如肌球蛋白重链染色所证明的，分化的细胞表型地产生肌管。图18中显示了分化的克隆56的代表性图像。
关于说明性方面的注释
虽然本公开出于说明本发明的各个方面和/或其潜在应用的目的而提供了各个特定方面的描述，但应理解，本领域技术人员能够想到各种变化和修改。因此，本文描述的一项或多项发明应该被理解为至少与它们所要求保护的一样广泛，并且不应被理解为由本文提供的特定说明性方面更狭窄地限定。
除非另外指明，否则本文中所述的任何专利、公开或其他公开材料均通过引用整体并入本说明书中，但范围仅限于所并入的材料不与现有的描述、定义、陈述或本说明书中明确阐述的其他公开材料相冲突。因此，并且在必要的范围内，本说明书中所述的明确的公开内容代替通过引用并入的任何相冲突的内容。被认为通过引用并入本说明书中但与现有的定义、陈述或本文中所述的其他公开材料相冲突的任何材料或其部分仅在并入的材料与现有的公开材料之间不产生冲突的范围并入。申请人保留修改本说明书的权利，以明确陈述通过引用并入本文的任何主题或其部分。

Claims (88)

1.一种通过基因组编辑来编辑人类细胞中的肌营养不良蛋白基因的方法，所述方法包括以下步骤：向所述人类细胞中引入一种或更多种脱氧核糖核酸(DNA)核酸内切酶以在所述肌营养不良蛋白基因内或附近产生一个或更多个单链断裂(SSB)或双链断裂(DSB)，这导致所述肌营养不良蛋白基因内或附近的一个或更多个外显子或异常内含子剪接受体或供***点的永久性缺失、***或置换，以及导致所述肌营养不良蛋白的读码框重建和所述肌营养不良蛋白的蛋白活性重建。
2.权利要求1所述的方法，其中所述人类细胞是肌肉细胞或肌肉前体细胞。
3.一种用于治疗患有杜氏肌营养不良症(DMD)的患者的离体方法，所述方法包括以下步骤：
i)产生DMD患者特异性诱导性多能干细胞(iPSC)；
ii)在所述iPSC的肌营养不良蛋白基因内或附近编辑；
iii)使基因组编辑的iPSC分化成Pax7+肌祖细胞；和
iv)将所述Pax7+肌祖细胞植入所述患者体内。
4.权利要求3所述的方法，其中所述产生步骤包括：
a)从所述患者分离体细胞；和
b)向所述体细胞内引入多能性相关基因的集合以诱导所述体细胞变成多能干细胞。
5.权利要求4所述的方法，其中所述体细胞是成纤维细胞。
6.权利要求4所述的方法，其中所述多能性相关基因的集合是一个或更多个选自OCT4、SOX2、KLF4、Lin28、NANOG和cMYC的基因。
7.权利要求3-6中任一项所述的方法，其中所述编辑步骤包括：向所述iPSC中引入一种或更多种脱氧核糖核酸(DNA)核酸内切酶以在所述肌营养不良蛋白基因内或附近产生一个或更多个单链断裂(SSB)或双链断裂(DSB)，这导致所述肌营养不良蛋白基因内或附近的一个或更多个外显子或异常内含子剪接受体或供***点的永久性缺失、***或置换，以及导致所述肌营养不良蛋白的读码框重建和所述肌营养不良蛋白的蛋白活性重建。
8.权利要求3-7中任一项所述的方法，其中所述分化步骤包括以下一项或更多项以使所述基因组编辑的iPSC分化成Pax7+肌祖细胞：使所述基因组编辑的iPSC与特定培养基制剂接触，所述特定培养基制剂包括小分子药物；转基因过表达；或血清饥饿。
9.权利要求3-8中任一项所述的方法，其中所述植入步骤包括：通过局部注射到期望的肌肉中将所述Pax7+肌祖细胞植入所述患者体内。
10.一种用于治疗患有杜氏肌营养不良症(DMD)的患者的体内方法，所述方法包括编辑所述患者的细胞中的肌营养不良蛋白基因的步骤。
11.权利要求10所述的方法，其中所述编辑步骤包括：向所述患者的细胞中引入一种或更多种脱氧核糖核酸(DNA)核酸内切酶以在所述肌营养不良蛋白基因内或附近产生一个或更多个单链断裂(SSB)或双链断裂(DSB)，这导致所述肌营养不良蛋白基因内或附近的一个或更多个外显子或异常内含子剪接受体或供***点的永久性缺失、***或置换，以及导致所述肌营养不良蛋白的读码框重建和所述肌营养不良蛋白的蛋白活性重建。
12.权利要求11所述的方法，其中所述细胞是肌肉细胞或肌肉前体细胞。
13.权利要求1、7或11中任一项的方法，其中所述一种或更多种DNA核酸内切酶是Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9(也称为Csn1和Csx12)、Cas100、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4或Cpf1核酸内切酶；其同源物，其天然存在分子的重组体，其密码子优化版本，或其经修饰版本，以及它们的组合。
14.权利要求13所述的方法，其中所述方法包括：向所述细胞中引入编码所述一种或更多种DNA核酸内切酶的一种或更多种多核苷酸。
15.权利要求13所述的方法，其中所述方法包括：向所述细胞中引入编码所述一种或更多种DNA核酸内切酶的一种或更多种核糖核酸(RNA)。
16.权利要求14或15中任一项所述的方法，其中所述一种或更多种多核苷酸或一种或更多种RNA是一种或更多种经修饰的多核苷酸或一种或更多种经修饰的RNA。
17.权利要求13所述的方法，其中所述一种或更多种DNA核酸内切酶是一种或更多种蛋白质或多肽。
18.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法还包括：向所述细胞中引入一种或更多种向导核糖核酸(gRNA)。
19.权利要求18所述的方法，其中所述一种或更多种gRNA是单分子向导RNA(sgRNA)。
20.权利要求18或19所述的方法，其中所述一种或更多种gRNA或一种或更多种sgRNA是一种或更多种经修饰的gRNA或一种或更多种经修饰的sgRNA。
21.权利要求18-20中任一项所述的方法，其中所述一种或更多种DNA核酸内切酶与一种或更多种gRNA或一种或更多种sgRNA预先复合。
22.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法还包括：向所述细胞中引入包含野生型肌营养不良蛋白基因或cDNA的至少部分的多核苷酸供体模板。
23.权利要求22所述的方法，其中所述野生型肌营养不良蛋白基因或cDNA的至少部分包括外显子1、外显子2、外显子3、外显子4、外显子5、外显子6、外显子7、外显子8、外显子9、外显子10、外显子11、外显子12、外显子13、外显子14、外显子15、外显子16、外显子17、外显子18、外显子19、外显子20、外显子21、外显子22、外显子23、外显子24、外显子25、外显子26、外显子27、外显子28、外显子29、外显子30、外显子31、外显子32、外显子33、外显子34、外显子35、外显子36、外显子37、外显子38、外显子39、外显子40、外显子41、外显子42、外显子43、外显子44、外显子45、外显子46、外显子47、外显子48、外显子49、外显子50、外显子51、外显子52、外显子53、外显子54、外显子55、外显子56、外显子57、外显子58、外显子59、外显子60、外显子61、外显子62、外显子63、外显子64、外显子65、外显子66、外显子67、外显子68、外显子69、外显子70、外显子71、外显子72、外显子73、外显子74、外显子75、外显子76、外显子77、外显子78、外显子79、内含子区域、合成的内含子区域、片段、其组合或整个肌营养不良蛋白基因或cDNA的至少部分。
24.权利要求22所述的方法，其中所述野生型肌营养不良蛋白基因或cDNA的至少部分包括外显子1、外显子2、外显子3、外显子4、外显子5、外显子6、外显子7、外显子8、外显子9、外显子10、外显子11、外显子12、外显子13、外显子14、外显子15、外显子16、外显子17、外显子18、外显子19、外显子20、外显子21、外显子22、外显子23、外显子24、外显子25、外显子26、外显子27、外显子28、外显子29、外显子30、外显子31、外显子32、外显子33、外显子34、外显子35、外显子36、外显子37、外显子38、外显子39、外显子40、外显子41、外显子42、外显子43、外显子44、外显子45、外显子46、外显子47、外显子48、外显子49、外显子50、外显子51、外显子52、外显子53、外显子54、外显子55、外显子56、外显子57、外显子58、外显子59、外显子60、外显子61、外显子62、外显子63、外显子64、外显子65、外显子66、外显子67、外显子68、外显子69、外显子70、外显子71、外显子72、外显子73、外显子74、外显子75、外显子76、外显子77、外显子78、外显子79、内含子区域、合成的内含子区域、片段、其组合或整个肌营养不良蛋白基因或cDNA。
25.权利要求22-24中任一项所述的方法，其中所述供体模板是单链多核苷酸或双链多核苷酸。
26.权利要求1、7或11中任一项所述的方法，其中所述方法还包括：向所述细胞中引入一种或更多种向导核糖核酸(gRNA)，并且其中所述一种或更多种DNA核酸内切酶是一种或更多种Cas9或Cpf1核酸内切酶，其产生成对的单链断裂(SSB)或双链断裂(DSB)，第一个SSB或DSB断裂在5’基因座且第二个SSB或DSB断裂在3’基因座，这导致所述肌营养不良蛋白基因内或附近的5’基因座和3’基因座之间的一个或更多个外显子或异常内含子剪接受体或供***点的永久性缺失或置换，以及导致所述肌营养不良蛋白的读码框重建和所述肌营养不良蛋白的蛋白活性重建。
27.权利要求26所述的方法，其中一种gRNA产生成对的SSB或DSB。
28.权利要求26所述的方法，其中一种gRNA包含与5’基因座、3’基因座或5’基因座与3’基因座之间的区段互补的间隔子序列。
29.权利要求26所述的方法，其中所述方法包括第一gRNA和第二gRNA，其中所述第一gRNA包含与5’基因座的区段互补的间隔子序列，并且所述第二gRNA包含与3’基因座的区段互补的间隔子序列。
30.权利要求26-29中任一项所述的方法，其中所述一种或更多种gRNA是一种或更多种单分子向导RNA(sgRNA)。
31.权利要求26-30中任一项所述的方法，其中所述一种或更多种gRNA或一种或更多种sgRNA是一种或更多种经修饰的gRNA或一种或更多种经修饰的sgRNA。
32.权利要求26-31中任一项所述的方法，其中所述一种或更多种DNA核酸内切酶与一种或更多种gRNA或一种或更多种sgRNA预先复合。
33.权利要求26-32中任一项所述的方法，其中在5’基因座和3’基因座之间存在染色体DNA的缺失。
34.权利要求26-33中任一项所述的方法，其中所述缺失是单外显子缺失。
35.权利要求34的方法，其中所述单外显子缺失是外显子2、外显子8、外显子43、外显子44、外显子45、外显子46、外显子50、外显子51、外显子52或外显子53的缺失。
36.权利要求34-35中任一项所述的方法，其中所述5’基因座邻近选自外显子2、外显子8、外显子43、外显子44、外显子45、外显子46、外显子50、外显子51、外显子52和外显子53的单外显子的5’边界。
37.权利要求34-36中任一项所述的方法，其中所述3’基因座邻近选自外显子2、外显子8、外显子43、外显子44、外显子45、外显子46、外显子50、外显子51、外显子52和外显子53的单外显子的3’边界。
38.权利要求34-37中任一项所述的方法，其中所述5’基因座邻近选自外显子2、外显子8、外显子43、外显子44、外显子45、外显子46、外显子50、外显子51、外显子52和外显子53的单外显子的5’边界且所述3’基因座邻近选自外显子2、外显子8、外显子43、外显子44、外显子45、外显子46、外显子50、外显子51、外显子52和外显子53的单外显子的3’边界。
39.权利要求36-38中任一项所述的方法，其中邻近所述外显子的边界包括周围的相邻内含子的剪接供体和受体。
40.权利要求26-33中任一项所述的方法，其中所述缺失是多外显子缺失。
41.权利要求40所述的方法，其中所述多外显子缺失是外显子45-53或外显子45-55的缺失。
42.权利要求40-41中任一项所述的方法，其中所述5’基因座邻近选自外显子45-53和外显子45-55的多外显子的5’边界。
43.权利要求40-42中任一项所述的方法，其中所述3’基因座邻近选自外显子45-53和外显子45-55的多外显子的3’边界。
44.权利要求40-43中任一项所述的方法，其中所述5’基因座邻近选自外显子45-53和外显子45-55的多外显子的5’边界且3’基因座邻近选自外显子45-53和外显子45-55的多外显子的3’边界。
45.权利要求42-44中任一项所述的方法，其中邻近所述外显子的边界包括周围的相邻内含子的剪接供体和受体。
46.权利要求26-32中任一项所述的方法，其中在5’基因座与3’基因座之间存在染色体DNA的置换。
47.权利要求26-32或46中任一项所述的方法，其中所述置换是单外显子置换。
48.权利要求26-32或46-47中任一项所述的方法，其中所述单外显子置换是外显子2、外显子8、外显子43、外显子44、外显子45、外显子46、外显子50、外显子51、外显子52、外显子53或外显子70的置换。
49.权利要求47-48中任一项所述的方法，其中所述5’基因座邻近选自外显子2、外显子8、外显子43、外显子44、外显子45、外显子46、外显子50、外显子51、外显子52、外显子53或外显子70的单外显子的5’边界。
50.权利要求47-49中任一项所述的方法，其中所述3’基因座邻近选自外显子2、外显子8、外显子43、外显子44、外显子45、外显子46、外显子50、外显子51、外显子52、外显子53或外显子70的单外显子的3’边界。
51.权利要求47-50中任一项所述的方法，其中所述5’基因座邻近选自外显子2、外显子8、外显子43、外显子44、外显子45、外显子46、外显子50、外显子51、外显子52、外显子53或外显子70的单外显子的5’边界且所述3’基因座邻近选自外显子2、外显子8、外显子43、外显子44、外显子45、外显子46、外显子50、外显子51、外显子52、外显子53或外显子70的单外显子的3’边界。
52.权利要求49-51中任一项所述的方法，其中邻近所述外显子的边界包括周围的相邻外显子或相邻内含子的剪接供体和受体。
53.权利要求26-32或46中任一项所述的方法，其中所述置换是多外显子置换。
54.权利要求53所述的方法，其中所述多外显子置换是外显子45-53或外显子45-55的置换。
55.权利要求53-54中任一项所述的方法，其中所述5’基因座邻近选自外显子45-53和外显子45-55的多外显子的5’边界。
56.权利要求53-55中任一项所述的方法，其中所述3’基因座邻近选自外显子45-53和外显子45-55的多外显子的3’边界。
57.权利要求53-56中任一项所述的方法，其中所述5’基因座邻近选自外显子45-53和外显子45-55的多外显子的5’边界且所述3’基因座邻近选自外显子45-53和外显子45-55的多外显子的3’边界。
58.权利要求55-57中任一项所述的方法，其中邻近所述外显子的边界包括周围的相邻内含子的剪接供体和受体。
59.权利要求46-58中任一项所述的方法，其中所述方法还包括：向所述细胞中引入包含野生型肌营养不良蛋白基因或cDNA的至少部分的多核苷酸供体模板，并且所述置换是通过同源定向修复(HDR)进行的。
60.权利要求59所述的方法，其中所述野生型肌营养不良蛋白基因或cDNA的至少部分包括外显子1、外显子2、外显子3、外显子4、外显子5、外显子6、外显子7、外显子8、外显子9、外显子10、外显子11、外显子12、外显子13、外显子14、外显子15、外显子16、外显子17、外显子18、外显子19、外显子20、外显子21、外显子22、外显子23、外显子24、外显子25、外显子26、外显子27、外显子28、外显子29、外显子30、外显子31、外显子32、外显子33、外显子34、外显子35、外显子36、外显子37、外显子38、外显子39、外显子40、外显子41、外显子42、外显子43、外显子44、外显子45、外显子46、外显子47、外显子48、外显子49、外显子50、外显子51、外显子52、外显子53、外显子54、外显子55、外显子56、外显子57、外显子58、外显子59、外显子60、外显子61、外显子62、外显子63、外显子64、外显子65、外显子66、外显子67、外显子68、外显子69、外显子70、外显子71、外显子72、外显子73、外显子74、外显子75、外显子76、外显子77、外显子78、外显子79、内含子区域、合成的内含子区域、片段、其组合或整个肌营养不良蛋白基因或cDNA的至少部分。
61.权利要求59所述的方法，其中所述野生型肌营养不良蛋白基因或cDNA的至少部分包括外显子1、外显子2、外显子3、外显子4、外显子5、外显子6、外显子7、外显子8、外显子9、外显子10、外显子11、外显子12、外显子13、外显子14、外显子15、外显子16、外显子17、外显子18、外显子19、外显子20、外显子21、外显子22、外显子23、外显子24、外显子25、外显子26、外显子27、外显子28、外显子29、外显子30、外显子31、外显子32、外显子33、外显子34、外显子35、外显子36、外显子37、外显子38、外显子39、外显子40、外显子41、外显子42、外显子43、外显子44、外显子45、外显子46、外显子47、外显子48、外显子49、外显子50、外显子51、外显子52、外显子53、外显子54、外显子55、外显子56、外显子57、外显子58、外显子59、外显子60、外显子61、外显子62、外显子63、外显子64、外显子65、外显子66、外显子67、外显子68、外显子69、外显子70、外显子71、外显子72、外显子73、外显子74、外显子75、外显子76、外显子77、外显子78、外显子79、内含子区域、合成的内含子区域、片段、其组合或整个肌营养不良蛋白基因或cDNA。
62.权利要求1、7或11中任一项所述的方法，其中所述方法还包括：向所述细胞中引入一种向导核糖核酸(gRNA)和包含野生型肌营养不良蛋白基因的至少部分的多核苷酸供体模板，并且其中所述一种或更多种DNA核酸内切酶是一种或更多种Cas9或Cpf1核酸内切酶，其在所述肌营养不良蛋白基因内或附近的基因座处产生一个单链断裂(SSB)或双链断裂(DSB)，从而促使在染色体DNA的所述基因座处***来自所述多核苷酸供体模板的新序列，这导致所述肌营养不良蛋白基因内或附近的一个或更多个外显子或异常内含子剪接受体或供***点的永久性***或校正，以及导致所述肌营养不良蛋白的读码框重建和所述肌营养不良蛋白的蛋白活性重建，并且其中所述gRNA包含与所述基因座的区段互补的间隔子序列。
63.权利要求1、7或11中任一项所述的方法，其中所述方法还包括：向所述细胞中引入一种或更多种向导核糖核酸(gRNA)和包含野生型肌营养不良蛋白基因的至少部分的多核苷酸供体模板，并且其中所述一种或更多种DNA核酸内切酶是一种或更多种Cas9或Cpf1核酸内切酶，其在所述肌营养不良蛋白基因内或附近产生成对的单链断裂(SSB)或双链断裂(DSB)，第一个在5’基因座，第二个在3’基因座，从而促使在染色体DNA的5’基因座和3’基因座之间***来自所述多核苷酸供体模板的新序列，这导致所述肌营养不良蛋白基因内或附近的5’基因座和3’基因座之间的一个或更多个外显子或异常内含子剪接受体或供***点的永久性***或校正，以及导致所述肌营养不良蛋白的读码框重建和所述肌营养不良蛋白的蛋白活性重建。
64.权利要求63所述的方法，其中一种gRNA产生成对的SSB或DSB。
65.权利要求63所述的方法，其中一种gRNA包含与5’基因座、3’基因座或5’基因座与3’基因座之间的区段互补的间隔子序列。
66.权利要求63所述的方法，其中所述方法包括第一gRNA和第二gRNA，其中所述第一gRNA包含与5’基因座的区段互补的间隔子序列，并且所述第二gRNA包含与3’基因座的区段互补的间隔子序列。
67.权利要求62或63所述的方法，其中所述一种或更多种gRNA是一种或更多种单分子向导RNA(sgRNA)。
68.权利要求62-63或67中任一项所述的方法，其中所述一种或更多种gRNA或一种或更多种sgRNA是一种或更多种经修饰的gRNA或一种或更多种经修饰的sgRNA。
69.权利要求62-63或67-68中任一项所述的方法，其中所述一种或更多种DNA核酸内切酶与一种或更多种gRNA或一种或更多种sgRNA预先复合。
70.权利要求62-69中任一项所述的方法，其中所述***是单外显子***。
71.权利要求70所述的方法，其中所述单外显子***是外显子2、外显子8、外显子43、外显子44、外显子45、外显子46、外显子50、外显子51、外显子52、外显子53或外显子70的***。
72.权利要求70-71中任一项所述的方法，其中所述基因座，5’基因座或3’基因座邻近选自外显子2、外显子8、外显子43、外显子44、外显子45、外显子46、外显子50、外显子51、外显子52、外显子53和外显子70的单外显子的边界。
73.权利要求72所述的方法，其中邻近所述外显子的边界包括周围的相邻外显子或相邻内含子的剪接供体和受体。
74.权利要求62-69中任一项所述的方法，其中所述***是多外显子***。
75.权利要求74所述的方法，其中所述多外显子***是外显子45-53或外显子45-55的***。
76.权利要求74-75中任一项所述的方法，其中所述基因座，5’基因座或3’基因座邻近选自外显子45-53或外显子45-55的多外显子的边界。
77.权利要求76中任一项所述的方法，其中邻近所述外显子的边界包括周围的相邻内含子的剪接供体和受体。
78.权利要求62或63所述的方法，其中所述野生型肌营养不良蛋白基因或cDNA的至少部分包括外显子1、外显子2、外显子3、外显子4、外显子5、外显子6、外显子7、外显子8、外显子9、外显子10、外显子11、外显子12、外显子13、外显子14、外显子15、外显子16、外显子17、外显子18、外显子19、外显子20、外显子21、外显子22、外显子23、外显子24、外显子25、外显子26、外显子27、外显子28、外显子29、外显子30、外显子31、外显子32、外显子33、外显子34、外显子35、外显子36、外显子37、外显子38、外显子39、外显子40、外显子41、外显子42、外显子43、外显子44、外显子45、外显子46、外显子47、外显子48、外显子49、外显子50、外显子51、外显子52、外显子53、外显子54、外显子55、外显子56、外显子57、外显子58、外显子59、外显子60、外显子61、外显子62、外显子63、外显子64、外显子65、外显子66、外显子67、外显子68、外显子69、外显子70、外显子71、外显子72、外显子73、外显子74、外显子75、外显子76、外显子77、外显子78、外显子79、内含子区域、合成的内含子区域、片段、其组合或整个肌营养不良蛋白基因或cDNA的至少部分。
79.权利要求62或63所述的方法，其中所述野生型肌营养不良蛋白基因或cDNA的至少部分包括外显子1、外显子2、外显子3、外显子4、外显子5、外显子6、外显子7、外显子8、外显子9、外显子10、外显子11、外显子12、外显子13、外显子14、外显子15、外显子16、外显子17、外显子18、外显子19、外显子20、外显子21、外显子22、外显子23、外显子24、外显子25、外显子26、外显子27、外显子28、外显子29、外显子30、外显子31、外显子32、外显子33、外显子34、外显子35、外显子36、外显子37、外显子38、外显子39、外显子40、外显子41、外显子42、外显子43、外显子44、外显子45、外显子46、外显子47、外显子48、外显子49、外显子50、外显子51、外显子52、外显子53、外显子54、外显子55、外显子56、外显子57、外显子58、外显子59、外显子60、外显子61、外显子62、外显子63、外显子64、外显子65、外显子66、外显子67、外显子68、外显子69、外显子70、外显子71、外显子72、外显子73、外显子74、外显子75、外显子76、外显子77、外显子78、外显子79、内含子区域、合成的内含子区域、片段、其组合或整个肌营养不良蛋白基因或cDNA。
80.权利要求62-79中任一项所述的方法，其中所述***是通过同源定向修复(HDR)进行的。
81.权利要求62-80中任一项所述的方法，其中所述供体模板是单链多核苷酸或双链多核苷酸。
82.权利要求26-81中任一项所述的方法，其中将所述Cas9或Cpf1 mRNA、gRNA和供体模板各自配制成单独的脂质纳米颗粒或全部共配制成脂质纳米颗粒。
83.权利要求26-81中任一项所述的方法，其中将所述Cas9或Cpf1 mRNA配制成脂质纳米颗粒，以及通过腺相关病毒(AAV)载体将所述gRNA和供体模板二者递送至所述细胞。
84.权利要求26-81中任一项所述的方法，其中将所述Cas9或Cpf1 mRNA配制成脂质纳米颗粒，以及通过电穿孔将所述gRNA递送至所述细胞，以及通过腺相关病毒(AAV)载体将供体模板递送至所述细胞。
85.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述肌营养不良蛋白基因位于染色体X：31,117,228-33,344,609(基因组参***-GRCh38/hg38)。
86.一种或更多种向导核糖核酸(gRNA)，其用于编辑来自患有杜氏肌营养不良症的患者的细胞中的肌营养不良蛋白基因，所述一种或更多种gRNA包含选自以下的间隔子序列：序列表的SEQ ID NO:1–1410472中的核酸序列。
87.权利要求86所述的一种或更多种gRNA，其中所述一种或更多种gRNA是一种或更多种单分子向导RNA(sgRNA)。
88.权利要求86或87所述的一种或更多种gRNA或sgRNA，其中所述一种或更多种gRNA或一种或更多种sgRNA是一种或更多种经修饰的gRNA或一种或更多种经修饰的sgRNA。
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