本発明の主な実施形態は、生物学的活性と、HHALPC及び子孫HHALPCの表面上で、任意に細胞内で同定され得る、及び/又は細胞培養培地中に分泌され得るマーカーとの新規な組み合わせを特徴とするHHALPC及び子孫HHALPCを含む。これらの特徴は、形態学的及び機能的な特徴と併せて、かかる細胞を特徴づける陽性(又は陰性)基準を定義する、細胞培養条件でHHALPC及び子孫HHALPCを製造する方法と関連して特定された。特に、かかる方法は、
(a)成人肝臓又はその一部分を解離して、初代肝臓細胞集団を形成することと、
(b)(a)の初代肝臓細胞の調製物を生成することと、
(c)(b)の調製物に含まれる細胞を支持体上で培養し、支持体上に細胞を接着及び成長させ、細胞の集団を出現させることと、
(d)(c)の細胞を少なくとも1回継代することと、
(e)本発明の概要で特定されるマーカーに対して陽性である(d)の継代後に得られる細胞集団を単離することと、
を含む。
上記方法の工程(a)に関し、解離工程は、完全に分化した肝細胞と共に、HHALPCの産生に使用され得る或る量の初代細胞を含む、成人の肝臓又はその一部を得ることを含む。肝臓初代細胞は、成人肝臓から得られるヒト肝臓組織から優先的に単離される。
「肝臓」という用語は、肝臓の臓器を指す。「肝臓の一部」という用語は、一般的には、肝臓臓器の任意の部分に由来する組織試料を指し、起源の肝臓臓器の該部分又は領域の量に関して何らの限定もない。また、肝臓臓器に存在する全ての細胞型が、上記肝臓の一部となり得ることが好ましい。肝臓の一部の量は、少なくとも部分的に、本発明の方法を合理的に実施するのに十分な初代肝臓細胞を得るための要求に対する実際的な検討に従ってもよい。したがって、肝臓の一部は、肝臓臓器の割合(例えば、典型的には重量/重量で少なくとも1%、10%、20%、50%、70%、90%以上)を表し得る。他の非限定的な例では、肝臓の一部は重量によって規定され得る(例えば、少なくとも1 g、10 g、100 g、250 g、500 g以上)。例えば、肝臓の一部は、肝葉、例えば右葉若しくは左葉、又は分割肝臓手術(split liver operation)若しくは肝生検の間に切除される十分な細胞数を含む任意の区域若しくは組織試料であってもよい。
「成人肝臓」という用語は、出生後の、すなわち誕生後、好ましくは正期産後の任意の時点の、例えば誕生後少なくとも1日、1週間、1ヶ月、若しくは1ヶ月超、又は少なくとも1年、5年、10年以上の年齢であってもよい被験体の肝臓を指す。したがって、「成人肝臓」又は成熟した肝臓は、この用語でなければ「乳児」、「子供」、「青年」又は「成人」の従来の用語で記載され得るヒト被験体で見られ得る。肝臓又はその一部は、脊椎動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトを同義的に指す「被験体」又は「ドナー」から得られる。別の実施形態では、成人肝臓又はその一部は、非ヒト動物被験体、好ましくは非ヒト哺乳動物被験体(例えば、齧歯類又はブタ)に由来し得る。
ドナーは、「心肺」基準(循環機能及び呼吸機能の不可逆的停止を含む)又は「脳死」基準(脳幹を含む脳全体の全ての機能の不可逆的停止を含む)等の臨床上承認されている基準によって判定されるように、生存していても死亡していてもよい。採取は、生検、切除又は摘出等の既知の手順を含み得る。生存しているヒトドナーから肝臓組織を採取することは、ドナーの更なる生命の維持と適合性である必要があり得る。肝臓又はその一部は、循環の持続、例えば拍動する心臓、及び呼吸機能の持続、例えば呼吸している肺又は人工呼吸を有するドナー、特にヒトドナーから得られてもよい。肝臓の一部のみは、法的及び倫理的な基準によって要求される通り、適切なレベルの正常な肝機能がドナーにおいて維持されるように、典型的には生存しているヒトドナーから(例えば、生検又は切除によって)摘除され得る。
倫理的及び法的な基準を条件として、ドナーは脳死である必要がある、又はそうでなくてもよい場合がある(例えば、ヒトドナーの更なる生存と適合し得ない肝臓全体又はその一部の摘除は、脳死のヒトにおいて許可され得る)。組織が、通常虚血(循環の停止)に起因する実質的な無酸素(酸素供給を欠く)を経験することがないことから、かかるドナーから肝臓又はその一部を採取することは有利である。採取する際、組織は、人工呼吸がなければ、循環機能及び/又は呼吸機能が停止し得る。これらのドナーに由来する肝臓又はその一部は少なくとも或る程度の無酸素を経験する可能性があり、死体ドナーに由来する肝臓は、例えば、ドナーの循環が停止した後、約1時間、3時間、6時間、12時間、24時間以上のうちに細胞培養条件でHHALPCを得るため使用され得る。
上に示されるように採取される組織(外科的に切除された肝臓試料又は肝生検試料に由来する)は、およそ室温まで、又は室温より低い温度まで冷却され得るが、特にかかる凍結が核形成又は氷晶の成長をもたらし得る場合、通常、組織又はその一部の凍結は回避される。例えば、上記組織は約1℃又は約4℃〜室温の任意の温度で維持され得て、有利には約4℃、例えば氷上で維持され得る。組織は、虚血時間、すなわちドナーにおける循環の停止後の時間の全体又はその一部に亘って冷却され得る。すなわち、組織は、温虚血、冷虚血、又は温虚血と冷虚血の組み合わせに供され得る。採取された組織は、例えば処理の前の最長48時間に亘って、好ましくは24時間未満、例えば、より好ましくは12時間未満(例えば、6時間、3時間、又は1時間未満)に亘ってそのように維持され得る。採取された組織は、有利には、組織の更なる処理の前に、例えば完全に又は少なくとも部分的に好適な培地に浸漬されて維持されてもよいが必ずしもそうでなくてもよく、及び/又は好適な培地で灌流されてもよいが必ずしもそうでなくてもよい。当業者は、処理前の期間中、組織の細胞の生存を支持し得る好適な培地を選択することができる。
本発明の方法は、上に記載される成人肝臓組織を解離して、初代細胞の集団を形成することを含む。本明細書で使用される「解離する(diassociating)」という用語は、一般的には、組織又は臓器に由来する細胞の懸濁物(細胞集団)を得るため、組織又は臓器の細胞の構成を部分的に又は完全に破壊すること、すなわち、組織又は臓器の細胞と細胞成分との結び付きを部分的に又は完全に破壊することを指す。その懸濁液は、2以上の細胞のクラスタ又はクランプを形成するように物理的に付着した細胞と同様に、1個だけ(solitary)又は単一の細胞も含み得る。解離は、細胞生存率の減少をもたらさない、又は可能な限り小さい減少をもたらすことが好ましい。肝臓又はその一部を解離して、そこから初代細胞の集団(懸濁物)を得るのに好適な方法は、当該技術分野でよく知られている任意の方法であってもよく、限定されないが、酵素消化、機械的分離、濾過、遠心分離、及びそれらの組み合わせが挙げられる。特に、肝臓又はその一部を解離する方法は、肝臓細胞を解放する(release:遊離する)ための肝臓組織の酵素消化、及び/又は肝臓細胞を解放するための肝臓組織の機械的な破壊若しくは分離を含み得る。肝生検によって得られる肝臓組織の小さく薄い断片は、酵素的な又は機械的な破壊を伴わずに、下記工程(c)に従って細胞培養物を求めるため直接使用され得る。
上記の肝臓又はその一部を解離する方法は、全肝又は肝区域を用いて該方法を行うために様々に適合され、修飾される、2以上の工程にて幅広く使用されるコラゲナーゼ灌流技術として文献に記載される。肝臓組織は、37℃に予備加熱され、カチオンキレート剤(例えば、EDTA又はEGTA)を含む二価カチオン不含バッファー溶液によって灌流される。バッファー溶液は、塩溶液(例えば、HEPES、ウィリアムE培地)、又はとりわけ塩化ナトリウム若しくは塩化カリウム等の塩も含み得る任意の他の平衡塩溶液を含んでもよい。これは、細胞を結び付けるデスモソーム構造の破壊をもたらす。その後、組織を、Ca2+及びMg2+等の二価カチオン(複数の場合もある)、及び組織を消化するように作用するマトリクス分解酵素を含むバッファー溶液で灌流する。
初代肝臓細胞は、通常、細胞解離プロセスを完了するため、穏やかな機械的破壊及び/又はフィルタに圧迫して通すことによって解放される。かかるフィルタは、約0.1 mm、0.25 mm、0.50 mm、1 mm以上の細胞を通過させる篩サイズを有し得る。次第により小さな篩サイズを有するフィルタの連続は、徐々に組織を解離し、細胞を開放するために使用され得る。解離された細胞を、灌流プロセスで使用されるコラゲナーゼ及び他の酵素を不活性化するプロテアーゼ阻害剤、血清及び/又は血漿を含むバッファーで濯いだ後、低速遠心分離(例えば、10×g〜500×g)によって細胞をペレット化することにより混合物から分離する。全てではなくても、ほとんどの生存細胞がペレット化され得るが、死細胞及び細胞片は実質的に上清中に排除され、その後、細胞懸濁物を精製するため氷冷バッファー溶液で洗浄される。初代肝臓細胞の数及び質は、組織の質、使用される種々の溶液の組成、並びに酵素の種類及び濃度に応じて変化し得る。酵素は、しばしばコラゲナーゼであるが、プロナーゼ、トリプシン、ヒアルロニダーゼ、サーモリシン及びそれらの組み合わせも使用され得る。コラゲナーゼは、精製が不十分な酵素のブレンドからなる場合があり、及び/又はプロテアーゼ活性を示す場合があって、生存細胞の質及び量に影響を及ぼす望ましくない反応を引き起こす可能性があり、これは十分な純度及び質の酵素調製物を選択することによって回避され得る。初代肝臓細胞を採取する他の方法は、酵素消化技術を除外してもよく、スクロースを含む溶液で肝臓を灌流した後の機械的な破壊を含み得る。
上記方法の工程(b)に関して、肝臓組織の解離の後に得られる肝臓初代細胞の調製物は、典型的には肝臓の実質及び/又はその非実質に存在し得る、前駆細胞又は幹細胞を含む任意の肝臓構成細胞型に属する細胞を含む初代肝臓細胞の不均質な集団であってもよい。例示的な肝臓構成細胞型として、細胞培養条件で肝臓組織に存在し得る又はそれに由来し得る幹細胞又は前駆細胞に加えて、肝細胞、胆管細胞、クッパー細胞、肝星細胞、及び肝臓内皮細胞が挙げられる。
「肝細胞」という用語は、種々のサイズ又は倍数性(例えば二倍体、四倍体、八倍体)の肝細胞を含むがこれらに限定されない、上皮性の実質肝細胞を包含する。
「初代細胞」という用語は適切な技術によってかかる外植された組織又は臓器に存在する細胞を解離することによって、被験体の組織又は臓器、例えば肝臓から得られる細胞の懸濁物中に存在する細胞を含む。
本発明の方法は、細胞培養条件で所望の成人肝前駆細胞を得る範囲で、全てではなくても、ほとんどが肝臓細胞型を表す細胞集団から開始し得ることが好ましい。HHALPCを得るための好適な開始細胞集団は、任意の好適な技術を適用することにより、物理的特性(寸法、形態)、生存率、細胞培養条件、又は細胞表面マーカー発現に基づいて、肝臓を解離する方法及び/又は肝細胞及び/又は他の細胞型の初期の調製物を分画又は富化する任意の方法に従って、種々の割合(全細胞の0.1%、1%、10%以上)で肝細胞を含み得る。
肝臓(又はその一部)を解離させることによって本発明で定義され、得られる初代細胞の集団は、新鮮な初代肝臓細胞としてすぐに細胞培養物を樹立するために使用され得るか、又は好ましくはそれらの細胞の長期の保存のための一般的な技術を使用して初代肝臓細胞の凍結保存調製物として貯蔵され得る。実際、凍結保存細胞調製物の使用は、HHALPC及び子孫HHALPCがその後細胞培養物中に産生される効率に対して正の効果を有するようである。これらの試料中の細胞は、成長因子、血清、バッファー溶液、グルコース、アルブミン、エチレングリコール、スクロース、デキストロース、DMSO、又は任意の他の凍結保護剤等の他の化合物で補足される、又は補足されない、細胞培養培地中又は細胞若しくは臓器の保存用溶液(例えば、Viaspan、Cryostor、Celsior)中で凍結され得る。各凍結保存調製物は、試料を適切に解凍し、必要に応じて、残留する細胞培養培地又は細胞若しくは臓器の保存用溶液を除去するため、適切なバッファー又は細胞培養培地で細胞を洗浄した後、細胞培養条件でより多くの量のHHALPCを産生し単離する範囲で、1つの凍結保存バイアル又は袋当たり少なくとも103個、104個、105個、106個、107個、108個以上の細胞を含み得る。
上記方法の工程(c)に関して、肝臓初代細胞の調製物(肝生検によって得られる肝臓組織の細胞懸濁物として又はそのフラグメントとして)を、完全合成支持体(例えば、プラスチック製又は任意のポリマー製の物質)、又はフィーダー細胞、タンパク質抽出物、若しくは類似する初代細胞を接着及び増殖させ、所望のマーカーを有する成人肝前駆細胞の集団を出現させる生物起源の任意の他の材料で予め被覆された合成支持体上で直接培養することができ、かかるマーカーは、免疫組織化学検査、フローサイトメトリー、又は他の抗体系技術によって好ましくはタンパク質レベルで同定される。
上記基体に付着した初代細胞集団に由来する細胞は、少なくとも2日間以上、好ましくは7日間、少なくとも10日間、又は少なくとも12日間培養されることが好ましい。HHALPCを提供し得る生存可能な初代細胞に対して十分に富化される接着細胞の集団を得るため、初代細胞集団に由来する細胞は、7日間及び12日間培養されることがより好ましい。
「培養する(culturing)」という用語は、細胞培養物における細胞、特にHHALPC及び/又は子孫HHALPCの維持及び/又は成長のための条件を広く指す。細胞が培養され、細胞接着を可能とする(又は、必要な場合には懸濁物中での細胞クラスタの成長を可能とする)支持体、細部培養培地の組成、細胞が蒔かれ、維持される密度、O2及びCO2の濃度等の要素は、以下及び実施例に詳述されるHHALPC及び子孫HHALPCの培養に適合され得る。
「肝前駆細胞」という用語は、肝臓から単離される細胞を培養することによって産生される未分化の(unspecialized)増殖コンピテント(proliferation-competent)細胞を指し、それ又はその子孫が少なくとも1つの比較的より分化した細胞型を生じ得る。肝前駆細胞は、次第により分化した細胞(しかしながら、好ましくは肝細胞又は肝活性化細胞)を産生するため、1以上の系統に沿って分化し得る子孫を生じ、ここで、かかる子孫は、それら自体が前駆細胞である場合があるか、又は更には最終的に(terminally)分化した肝細胞(例えば、完全に分化した細胞、特にヒト肝細胞に類似する形態学的及び機能的な特徴を提示する細胞)を産生し得ることとなる。
HHALPCは、既にこの段階で(すなわち、工程(d)に示される細胞を継代する前に)関連するマーカーを検出することを可能とする技術によって更に特性評価され得て、また下記工程(e)に記載されるように、その後の段階で最初に特性評価された、GMP条件で生成された成人肝前駆細胞である。かかるマーカーを同定し、それらを陽性又は陰性と測定する技術のうち、この工程で利用可能なHHALPCの量が少なくてもタンパク質レベルでのマーカーの検出を可能とすることから、ウェスタンブロット、フローサイトメトリー、免疫細胞化学検査、又は細胞培養培地の分析が好ましい。
HHALPCは、かかる細胞の生存及び/又は成長を促進することができるin vitro環境内で細胞の接着を可能とする基体上に播種される肝臓細胞の初代集団から出現する。この環境は、(例えば、培養培地及び気体の一部又は全ての時々又は連続的な交換によって)培養容器間の連続的又は断続的な他の有用な成分の交換を可能とし得る一方で、該環境(すなわち細胞培養容器)と周囲との間の望ましくない物質の交換を(例えば実験室環境の汚染を回避することにより)防止し得る。
培養容器は、播種された細胞がこの基体に接触して維持される接着細胞培養物となり得るように、様々な形式であるが、細胞接着に適合性の1以上の基体表面を提示する、細胞培養フラスコ、ボトル、ウェルプレート、マルチトレーセルスタック、バイオリアクター及びディッシュであってもよい。一般に、細胞の接着を可能とする基体は、(市販材料のCellBindを使用することによって実施例で示されるように)一般的に、親水性の基体表面を提供するために成形され処理されることによって効果的な細胞付着の可能性を高める、ガラス又は合成ポリマー材料(ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリオルトエステル、ポリホスファゼン、ポリホスフェート、ポリエステル、ナイロン又はそれらの混合物等)の任意の実質的には親水性の基体であってもよい。表面処理は、表面被覆の形態をとってもよく、又は別の極性基への安定的な吸着を可能とするため水に対する普遍的な親和性を有するか、そうでなければ十分な極性を示すポリマー表面上に化学基を生成することを含んでもよい。これらの官能基は、親水性及び/又は表面酸素の増加をもたらし、そのように改変された基体表面上での細胞成長を増強すると認識される特性である。かかる化学基として、特定の波動周波数(specific wave frequency)に基づく技術で処理することによっても導入され得る、アミン基、アミド基、カルボニル基、カルボン酸基、エステル基、ヒドロキシル基又はスルフヒドリル基等の基が挙げられ得る。
細胞接着は、好適なマトリクスの層で処理されたプラスチック製表面を被覆することにより促進され得る。コーティングは、好適なポリカチオン(例えば、ポリオミチン(polyomithine)又はポリリジン)、又は好ましくはGMP製造に対して提供され得る細胞外マトリクスの1以上の成分、すなわちラミニン、非線維性/線維性コラーゲン(好ましくはI型コラーゲン)、グリコサミノグリカン(例えばヘパリン又はヘパラン硫酸)、又はフィブロネクチン、ゼラチン、ビトロネクチン、エラスチン、テネイシン、アグリカン、アグリン、硬骨サイアロプロテイン、軟骨基質タンパク質、フィブリノゲン、ムチン、又はカドヘリン若しくはコネキシンを含む細胞接着分子等のタンパク質を単独で又は様々な組み合わせで含み得る。好ましい例として、他の細胞外マトリクス成分を含む、又はそれを含まないコラーゲン組成物が挙げられ得る。代替的には、フラグメントである、そうでなければ上に列挙されるタンパク質に由来する合成ペプチド、ゲル、分子スキャフォルド、及び合成材料及び/又は生体物質から形成される他の三次元構造をこの範囲で使用することができる。
培養系から培地を捨てることにより、任意に接着細胞を1回又は繰り返し洗浄することにより、任意の非接着性物質(例えば、生育不能な細胞又は死細胞、及び細胞片)を培養系から除去する前に、初代細胞懸濁物を該初代肝臓細胞集団が接着性基体に付着するのに十分な時間(例えば、少なくとも2時間、4時間、6時間、12時間、24時間以上)に亘って接着性表面と接触させてもよい。その後、培養系に任意の好適な培地又は等張なバッファー(例えば、PBS)を提供する。それにより、表面に接着した初代肝臓細胞集団に由来する細胞は、更なる培養のため選択され、上記表面1 cm2当たりに播種された細胞の数(例えば、10細胞/cm2〜105細胞/cm2)として表され得る播種密度を評価するため計数され得る。
直接細胞を播種する際又は細胞を洗浄した後の初代細胞の調製物は、細胞の生存及び/又は細胞の成長を支持する液体培地中に維持される。培地は、細胞の導入の前、それと共に、又はその後に上記系に添加され得る。培地は新鮮(すなわち、細胞の培養に以前に使用されていない)であってもよく、培地での肝臓起源の(又は任意の他の起源の)細胞の事前培養によって順化された画分を少なくとも含み得る。特に、上記培地は、文献に記載される肝前駆細胞を培養するための任意の好適な培養培地であってもよく、また、同じ又は異なる特徴(例えば、組成、pH、又は酸化状態)を提示する新鮮な培地と定期的に(例えば、毎時間、3時間毎、12時間毎、24時間毎又はそれ以上で)交換され得る。培地の全容量が変更されてもよく、或いは細胞の先の培養によって順化された培地の画分が保持されるように、培地の一部のみが変更されてもよい。代替的には、培地は、細胞が別の培養容器に移されるまで交換されず、目的のものではない大半の細胞(例えば、肝細胞及び肝臓起源の他の完全に分化した細胞)が剥離され、死滅するように細胞の培養を延長し、単に新鮮な培地を定期的に添加してもよい。
接着性の初代細胞は、GMP要件に従って、ウシ、ヒト、又は他の動物の血清の添加を伴う(又は伴わない)規定の組成培地に基づく接着細胞の成長用の液体培養培地の存在下で培養される。有機化合物又は無機化合物の適切な混合物で補足され得るこれらの培地は、栄養素及び/又は成長促進物質を提供する以外にも、特定の細胞型の成長/接着又は排除/剥離を促進し得る。
基本培地調合物(例えば、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関(American Type Culture Collection)、ATCC又はカリフォルニア州カールスバッドのInvitrogenより入手可能)は、本発明において初代細胞を培養するために使用され得て、限定されないが、イーグル最少必須培地(MEM)、ダルベッコ変法イーグル培地(DMEM)、アルファ改変型最少必須培地(アルファ-MEM)、必須基本培地(BME:BasalMedium Essential)、イスコフ改変ダルベッコ培地(IMDM)、BGJb培地、F-12栄養混合物(Ham)、Liebovitz L-15、DMEM/F-12、必須改変型イーグル培地(EMEM:Essential Modified Eagle's Medium)、RPMI-1640、培地199、ウェイマウス(Waymouth's)MB 752/1又はウィリアムズ培地E、並びにそれらの改変物及び/又は組み合わせが挙げられる。培養される細胞に必要な培地及び/又は培地サプリメントの濃度を適合するためのこれらの基本培地の組成及び基準は、一般的に知られている。好ましい基本培地調合物は、成人肝臓細胞のin vitro培養を持続すると報告され、その細胞の適切な成長、増殖、所望のマーカーの維持、及び/又は生物学的活性、又は長期保存に対する増殖因子の混合物を含む、ウィリアム培地E、IMDM、又はDMEM等の商業的に入手可能なものの1つであってもよい。
かかる基本培地調合物は、無機塩(特にNa、K、Mg、Ca、Cl、P、及びおそらくはCu、Fe、Se及びZnを含む塩)、生理学的バッファー(例えば、HEPES、重炭酸塩)、ヌクレオチド、ヌクレオシド、及び/又は核酸塩基、リボース、デオキシリボース、アミノ酸、ビタミン、抗酸化剤(例えばグルタチオン)、並びに炭素源(例えばグルコース、ピルビン酸塩)等のそれら自身が既知の哺乳動物細胞の発生に必要な原料を含む。追加のサプリメントは、最適な成長及び増殖のため必要な微量元素及び物質を細胞に供給するために使用され得る。かかるサプリメントとして、インスリン、トランスフェリン、セレン塩、及びそれらの組み合わせが挙げられる。これらの成分は、ハンクス平衡塩類溶液(HBSS)、アールの塩溶液(Earle's Salt Solution)等の塩溶液中に含まれ得る。更なる抗酸化サプリメント、例えばβ-メルカプトエタノールが添加されてもよい。多くの基本培地が既にアミノ酸を含んでいるが、幾つかのアミノ酸、例えば、溶液中の場合それほど安定していないことが知られている、L-グルタミンは後で補足されてもよい。培地は、抗生物質及び/又は抗真菌の化合物、典型的には、ペニシリンとストレプトマイシン、及び/又は他の化合物との混合物等で更に補足され得る。最も重要なことは、細胞培養培地は、細胞の生存率及び増殖に必要な細胞性因子及び細胞成分を含み、或る特定の条件下で合成成分によって置き換えられ得る、哺乳動物の血漿又は血清で補足され得る。
従来定義される「血清」と言う用語は、最初に試料中で凝固を起こさせ、その後、適切な技術、典型的に遠心分離によって液体成分(血清)から血液試料のそのように形成された血塊及び細胞成分を分離することによって全血試料から得られる。不活性の触媒、例えばガラスのビーズ又は粉末は凝固を促進し得る。有利には、血清は、哺乳動物に対して不活性な触媒を含む、血清分離用容器(SST)を使用して調製され得る。
血清又は血漿は、商業的に、初代肝細胞が得られる種と同じ種の生物から得られ得る。ヒトの血清又は血漿は、初代ヒト肝臓細胞の培養に使用され得る。代替的には、培地は、ウシの血清又は血漿、好ましくはウシ胎児(子牛)の血清又は血漿、より好ましくはウシ胎児(子牛)血清(FCS又はFBS)を含む。培地は、約0.5%〜約40%(体積/体積)、好ましくは約5%〜20%(体積/体積)、例えば約5%〜15%(体積/体積)、例えば約10%(体積/体積)の血清若しくは血漿、又は血清の代用品を含む。ヒト肝臓細胞を培養するための培地は、ヒトの血漿又は血清、好ましくはヒト血清と、ウシの血漿又は血清、好ましくはウシ血清との混合物を含み得る。
貯蔵又は使用に先立って、血漿又は血清は、放射線照射(例えば、ガンマ線照射)され得る、又は熱不活性化され得る。熱不活性化は、主に補体を除去するために使用される。熱不活性化は、典型的には、30分間〜60分間、例えば30分間に亘り56℃で血漿又は血清を十分に混合しながらインキュベートすることを含み、その後、血漿又は血清を徐々に周囲温度まで冷却させる。また任意に、血漿又は血清を、貯蔵又は使用に先立って(例えば、1 μmよりも小さい孔径の1以上のフィルタを通す濾過によって)滅菌され得るか、又は治療的使用に対してヒト細胞を培養するための任意の該当する規制政策に従って処理され得る。
基本培地の(血清又は血漿の添加前の)通常成分、例えば、特に等張生理食塩水、バッファー、無機塩、アミノ酸、炭素源、ビタミン、抗酸化剤、pH指示薬、及び抗生物質は、当該技術分野では増殖因子又は分化因子とはみなされない。一方、血清又は血漿は、1以上のかかる増殖因子を含む可能性がある複雑な組成物である。
本明細書で使用される「増殖因子」という用語は、単独で、又は他の物質によって調節される場合のいずれかで様々な細胞型の増殖、成長、分化、生存、及び/又は遊走に影響を及ぼし、生物において発生、形態学、及び機能変化をもたらし得る、生物学的に活性な物質を指す。増殖因子は、典型的には、リガンドとして細胞に存在する受容体(例えば、表面又は細胞内の受容体)に結合することによって作用し得る。本明細書で増殖因子は、特に、1以上のポリペプチド鎖を含むタンパク質性の存在であってもよい。「増殖因子」と言う用語は、線維芽細胞増殖因子(FGF)ファミリー、骨形成タンパク質(BMP)ファミリー、血小板由来増殖因子(PDGF)ファミリー、トランスフォーミング増殖因子ベータ(TGFベータ)ファミリー、神経成長因子(NGF)ファミリー、表皮増殖因子(EGF)ファミリー、インスリン関連増殖因子(insulin related growth factor)(IGF)ファミリー、肝細胞増殖因子(HGF)ファミリー、インターロイキン6(IL-6)ファミリー(例えば、オンコスタチンM)、造血増殖因子(HeGF)、血小板由来内皮細胞増殖因子(PD-ECGF)、アンジオポエチン、血管内皮細胞増殖因子(VEGF)ファミリー、又はグルココルチコイドのメンバーを包含する。上記方法がヒト肝臓細胞に対して使用される場合、本発明の方法で使用される増殖因子はヒトの又は組み換えの増殖因子であってもよい。本発明の方法におけるヒトの及び組み換えの増殖因子の使用は、かかる増殖因子が細胞機能に対して望ましい作用を発揮すると予想されることから好ましい。
上記培地は、血清又は血漿と、好ましくは特定の増殖因子がin vitroで培養される細胞に対する作用を誘導し得る濃度の1以上の外因的に添加される上に定義される増殖因子との組み合わせを含み得る。例えば、培地は、EGFとインスリン、又はEGFとデキサメタゾン、又はインスリンとデキサメタゾン、又は各EGFとインスリンとデキサメタゾンとを含み得る。EGFは、典型的には、約0.1 ng/ml〜1 μg/ml、好ましくは1 ng/ml〜100 ng/mlの濃度で、例えば約25 ng/mlで使用されてもよく、インスリンは、典型的には約0.1 μg/ml〜1 mg/ml、好ましくは約1 μg/ml〜100 μg/ml、例えば、約10 μg/mlの濃度でされてもよく、デキサメタゾンは、典型的には、約1 mM〜1 μM、好ましくは約1 nM〜100 nM、例えば約10 nMの濃度で使用されてもよい。特定のGMP製造条件では、EGFは不在であってもよい。
また、ホルモン、例えばD-アルドステロン、ジエチルスチルベストロール(DES)、デキサメタゾン、インスリン、エストラジオール、ヒドロコルチゾン、プロラクチン、プロゲステロン、チロトロピン(thyrotropin)、チロキシン、及びL-チロニンも細胞培養で使用され得る。また、肝臓細胞は、トリヨードチロニン(triiodothyronine)、酢酸α-トコフェロール及びグルカゴンと共に培養することで利益を得る場合がある。脂質及び脂質担体も細胞培養培地を補足するために使用され得る。かかる脂質及び担体として、限定されないが、とりわけ、シクロデキストリン、コレステロール、アルブミンに複合化されたリノール酸、アルブミンに複合化されたリノール酸及びオレイン酸、複合化されていないリノール酸、アルブミンに複合化されたリノール酸−オレイン酸−アラキドン酸、アルブミンに複合化されていない及び複合化されたオレイン酸が挙げられる。アルブミンは脂肪酸不含製剤において同様に使用され得る。
実施例に記載されるHHALPCの形態学的な及び表現型の特徴は、初代肝臓細胞の凍結保存調製物が低いコロニー形成率を有する場合のみならず、種々の技術、条件及び/又は材料(例えば、合成ポリマー材料、細胞外マトリクスの成分(複数の場合もある)、細胞培養培地、インキュベーターの酸素及び/又はCO2の(of)量、洗浄バッファー等)を選択し、組み合わせることによって初代細胞の不均質な調製物から接着細胞を調製する既知の技術を試験し及び/又は適合させることによっても、かかる細胞を得ることを可能とし得る。特に、これらの他の要素の1以上の組み合わせと共に、(ミリモル又はより低濃度の抗酸化化合物を添加することによって得られる)低酸素条件での培養は、より多量に及び/又はより速くHHALPCを得るために適用され得る。
上に定義される初代肝臓細胞のこの培養工程は、培養物中のHHALPCの出現及び増殖に結び付き、HHALPCが十分に増殖するまで継続され得る。例えば、培養は、細胞集団が所定のコンフルエンスの程度(例えば、少なくとも50%、70%、又は少なくとも90%以上コンフルエント)に達するまで継続され得る。本明細書で使用される「コンフルエンス」という用語は、細胞が互いに接触し、実質的に成長に利用可能な全ての表面を覆う(すなわち、完全コンフルエント)培養細胞の密度を指す。
上記方法の工程(d)に関して、初代細胞は、細胞の接着、並びに少なくとも1回の継代の後のHHALPCについて次第に富化される均質な細胞集団の増殖及び出現を持続させる細胞培養培地中で培養される。HHALPCは、細胞倍化を48時間〜72時間以内に得ることができ、少なくとも2継代、3継代、4継代、5継代以上に亘って所望の特性を有する子孫HHALPCを維持しながら、所望の特性(例えば、所与の密度で及び/又は分化状態で、二次元接着細胞又は三次元細胞クラスタとして)を有する子孫HHALPCを得るため、十分な細胞を生成するように容易に増殖され得る。
継代される際、培養細胞は培養基体及び互いから剥離され、解離される。細胞の剥離及び解離は、当該技術分野で一般的に知られているように、例えば、タンパク質分解酵素(例えば、トリプシン、例えばI型、II型、III型又はIV型のコラゲナーゼ、ディスパーゼ、プロナーゼ、パパイン等から選択される)による酵素処理、二価イオンキレート剤(例えば、EDTA又はEGTA)による処理、若しくは機械的処理(例えば、小孔(small pore)のピペット又はピペットチップを通すピペッティングの繰り返し)、又はこれらの処理の任意の組み合わせによって行われ得る。
細胞の剥離及び分散の好適な方法は、培養物中の大部分の細胞を保存しながら、所望の程度の細胞の剥離及び分散を確実にするものとする。培養細胞の剥離及び解離は、単一の生存可能な細胞としてかなりの割合の細胞(例えば、少なくとも50%、70%、90%以上の細胞)を生じ得ることが好ましい。残りの細胞は、細胞クラスタに存在し得て、各々比較的少数の細胞を含む(例えば、平均で1個〜100個の細胞)。
次に、そのように剥離され解離された細胞(典型的には等張バッファー又は培地中の細胞懸濁物として)は、細胞の接着を可能とする基体に再播種され得て、その後、上に記載されるように、HHALPC及び子孫HHALPCの更なる増殖を持続させる培地中で培養される。その後、これらの細胞は、10細胞/cm2〜105細胞/cm2の密度で、分割比約1/16〜1/2、好ましくは約1/8〜1/2、より好ましくは約1/4〜1/2で再播種することにより培養され得る。分割比は、細胞が得られた容器と同じ表面積の空の(典型的には新しい)培養容器に蒔かれる継代細胞の割合を意味する。細胞を培養容器に接着させる表面、及び細胞培養培地と並んで、培養容器の種類は、最初に使用されたもの、及び上に記載されるものと同じであってもよく、又は異なってもよい。細胞は、CellBind又は細胞外マトリクスタンパク質(コラーゲン等、好ましくはI型コラーゲン)又はGMP条件で許容可能な合成ペプチドで被覆された任意の他の適切な支持体上で維持されることが好ましい。
上記工程(e)に関して、HHALPCの集団の単離は、列挙されるマーカーに対して陽性である細胞に適用され、更に上の工程(c)でHHALPCを最初に同定するが、継代後に利用可能なより多量の細胞を考慮すればより容易に確立され得る基準を更に検証する。
「単離する(isolating)」又は「単離」という用語は、細胞培養物の調査に基づく及び基準に対応する細胞の特性評価(また可能な場合及び望ましい場合物理的な分離)に基づく、又は抗原の有無及び/又は細胞サイズ(FACS等による)による自動化された細胞の選別のいずれかの適切な細胞生物学の技術を適用することによって行われ得る、細胞培養物又は生体試料からの細胞集団の物理的同定と単離の両方を指す。幾つかの実施形態では、「単離する」又は「単離」と言う用語は、特にフローサイトメトリーを実施することによる細胞の物理的分離及び/又は定量の更なる工程を含み得る。
「細胞集団」及び「細胞の集団」という用語は、一般的には、一群の細胞を指す。別段の指示がない限り、上記用語は、本明細書に定義される細胞から本質的になる、又はそれを含む細胞群を指す。細胞集団は、共通する表現型を有する細胞から本質的になってもよく、又は少なくとも共通する表現型を有する細胞の画分を含み得る。細胞は、これらに限定されないが、形態学的外観、或る特定の細胞成分又は生成物(例えばRNA又はタンパク質)の発現レベル、特定の生化学経路の活性、増殖能力及び/又は速度論、分化可能性及び/又は分化シグナルに対する反応、又はin vitro培養の間の挙動(例えば、接着又は単層成長(monolayergrowth))を含む1以上の証明可能な特徴において、細胞が実質的に類似又は同一である場合、共通の表現型を有すると言われる。したがって、かかる証明可能な性質は、細胞集団又はその画分を定義し得る。細胞集団は、細胞の実質的に大部分が共通の表現型を有する場合、「実質的に均質」となり得る。「実質的に均質な」細胞集団は、少なくとも60%、例えば少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は更には少なくとも99%のHHALPCに対して(又は子孫HHALPCに対して)特異的に言及される表現型等の共通の表現型を有する細胞を含み得る。さらに、細胞集団は、集団中に存在する任意の他の細胞が細胞集団全体の特性を変更しない、又はそれに対して重大な影響を有しない場合、HHALPCの表現型等の共通する表現型を有する細胞(すなわち、子孫HHALPC)から本質的になり得て、それが細胞株として定義され得る。
一般に、特定の細胞型に対する(例えば、間葉系、肝臓、造血、上皮、内皮のマーカー)、又は文献に公開される特異的な局在を有する(例えば、細胞内、細胞表面、又は分泌される)細胞マーカーを同定し、特性評価する任意の技術は、HHALPC及び子孫HHALPCの特性評価に適切とみなされ得る。かかる技術は、分析の間、細胞保全を維持することを可能とするもの、及びかかる細胞を使用して生成される抽出物(タンパク質、核酸、膜等を含む)に基づくものの2つのカテゴリーに分類され得る。実施例は、例えば、それらの特有の特徴及び生物学的活性を判断するため、他の肝前駆細胞又は成人肝臓初代細胞を用いるより詳細な比較分析を行う前に細胞表面抗原の存在の分析を行うことによって、どのようにしてかかる技術がHHALPC及び子孫HHALPCの特性評価に使用されてきたかに関するデータを含む。
タンパク質レベルでは、フローサイトメトリー又は免疫細胞化学検査等の技術は、抗体又は他のタンパク質特異的試薬を使用することによってHHALPC中の表面又は細胞内のタンパク質の有無を判定することを可能とする。フローサイトメトリーは、単染色又は多重染色の技術、及び/又はサイズ及び粒度の評価によって特定される、表面又は細胞内のマーカーの有無の組み合わせに従って、細胞集団を特性評価するための好ましい技術である。また、免疫細胞化学検査は、表面、細胞骨格、及び/又は他の細胞内のマーカーの有無の組み合わせと関連する形態学的特徴に関する情報を提供する。
特に、少なくとも1つの間葉系マーカー、1つの接着マーカー、1つのテトラスパニン、CD98、CD140b、及びβ2-ミクログロブリンから選択される1つのマーカー、並びに少なくとも1つの肝臓マーカーの存在は、フローサイトメトリー、免疫細胞化学検査、又は受容体を提示する細胞の割合を評価することを可能とする任意の他の技術(一般的には、抗体、レクチン、又は他のタンパク質を利用し、タンパク質又は核酸の抽出を必要としない)によって測定されなければならない。肝臓又は間葉系の特徴と厳密に関連するもの以外の追加の細胞表面マーカーに対する陽性(実施例において言及される陽性マーカー等)も同様に測定され得る。フローサイトメトリー及び免疫細胞化学検査による陽性は、本明細書では、(実施例に示されるように)少なくとも60%の細胞が所望のマーカー又は受容体を提示する場合に定義される。同様に、フローサイトメトリー及び免疫細胞化学検査による陰性は、本明細書では、(実施例に示されるように)20%未満の細胞が所与のマーカー又は受容体を提示する場合に定義される。幾つかの実施形態では、10%未満の細胞が所与の陰性マーカーを提示する。細胞表面マーカーを指す場合、陽性は透過処理されていない細胞において測定されることが好ましい。
幾つかの実施形態では所与のマーカーを測定する場合、上に定義されるマーカー又は細胞表面タンパク質の検出に使用される薬剤は、固相(例えば、ビーズ、プレート、又は生体材料)上に固定化され、標識化され(例えば、蛍光標識化され)、及び/又は標識化される別の化合物(例えば、二次抗体)によって認識される。標識が、外部手段によって、例えば望ましくは外観検査によって、又は電磁放射線、熱、及び化学試薬によって検出可能なシグナルを生じることができる多数の方法が存在する。また、標識又は他のシグナルを生じるシステムの構成要素は、化学的架橋等の当該技術分野で既知の任意の方法を使用して、又はビオチン−ストレプトアビジン系を使用して、特定の結合パートナー、すなわち別の分子に、又はビーズ等の支持体に結合され得る。標識は、直接シグナルを生じることができることから、シグナルを生じるための追加の成分は必要ではない。多数の有機分子、例えば、蛍光色素(FITC、PE、PC5、PC7、APC、又はフローサイトメトリーと適合することが知られている任意の他のもの等)は、紫外線及び可視光を吸収する。他の種類の標識は、放射性同位体及び色素等のシグナルを直接生じる。代替的には標識は、シグナルを生じるために他の成分を必要とし得て、そうしてシグナル生成システムは、基質、補酵素、金属イオン、又は酵素生成物と反応する物質(例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼの化学発光検出)を含み得る、測定可能なシグナルを生じるのに必要な全ての構成成分を含む。
HHALPCの肝臓特異的代謝活性は、一般的に肝臓細胞(また特に肝細胞)と関連する生物学的活性を含み、他の組織に存在する細胞から肝臓細胞を識別し、特に、文献及び実施例に記載されるタンパク質又は他の基質の結合、活性化、及び/又は分解に関わる活性を含む生物学的活性を含む。これらの生物学的活性は、タンパク質/薬物結合活性となり得る肝臓特異的代謝活性、より好ましくは所与の基質に対する酵素活性、若しくはブロッティング技術(ウェスタンブロット又はノーザンブロット)、シーケンシング、電点分画電気泳動法、ELISAによって検出される肝臓特異的分子と関連する酵素活性の検出、又は肝臓細胞内で特異的に輸送され代謝されることが知られている合成若しくは天然の化合物の内部移行の検出に基づいて確立される。肝臓の特徴に厳密に関連するもの以外の他の関連する酵素活性も同様に測定され得て、文献に記載される技術を使用して肝細胞又は他の細胞型において測定されるものと比較され得る。代替のアプローチ及び使用に応じて、内皮(例えば、このバリアを通過して組織へ到達することと関連して)又は血液(例えば、凝固と関連して)に関係する活性は、in vitroで、又は適切なin vivoモデルで測定され得る。
核酸レベルでは、全ゲノムシーケンシング、PCR、又はRT-qPCRを使用して、HHALPC又は子孫HHALPCを特性評価することができる。これにより、サイクル数に基づき、1以上の内因性対照について得られるサイクルに対して正規化して、リアルタイムPCRを調査中の遺伝子発現を定量するために使用することができる。特に、RT-PCR反応は、HHALPC及び適切なプライマー及びバッファーを使用して行われ得るが、シグナルを得るためのサイクル数は25サイクル、30サイクル、又は35サイクルを上回るべきではない。
活性レベルでは、肝臓特異的代謝活性の存在は、CYP450活性、解毒、グリコーゲン貯蔵、アルファ-1-アンチトリプシン又はアルブミンの分泌、胆汁産生、トロンボポイエチン産生、アンギオテンシノーゲン産生、アンモニアの尿素への変換、コレステロール合成、グリコーゲン分解、グリコーゲン生成、及び脂質生成の測定に対して(文献の支持により容易にそれを確立することができ、商業的に入手可能な製品であってもよいことから)特定の最終生成物の所与の検出限界を有する、肝臓特異的酵素の活性の存在及び/又はそのレベルを評価することを可能とするが、好ましくは実際の酵素活性をin vitroで定量することを可能とすべきである任意の適切な技術によって測定され得る。特に、少なくとも肝臓特異的代謝活性に対する陽性は、本明細書では、その活性が最終生成物の検出限界を統計学的に上回っている(検出限界よりも少なくとも2倍、5倍、又は10倍多い)、又は初代肝細胞の活性レベルに接近している(上回る、同一の、又は最大で10%、最大で25%、最大で50%、最大で75%、若しくは最大で90%低い)と測定される場合に定義される。
文献は、in vitroでのヒト肝細胞におけるシトクロムP450の活性を評価するための技術、特に、特異的に酵素活性を誘導する化合物、及びこれらの実験を行うため使用され得るフォーマットの幅広い記載を提供する(Gerets HH et al., 2012、Gomez-Lechon MJ etal., 2012)。種々の誘導物質のうち、これらの細胞における薬物代謝は、ミダゾラム、エトキシレゾルフィン、ベンゾキシレゾルフィン(benzoxyresorufin)、ブプロピオン、フェナセチン、ジクロフェナク、トルブタミド、フェノバルビタール、リファンピシン、カフェイン、ベータ−ナフトフラボン、オメプラゾール、デキストロメトルファン、3-メチルコラントレン、レパグリニド、又は文献(Bale S et al., 2014)に列挙されるプローブとしての他の既知の細胞/肝細胞傷害性化合物を使用して判断され得る。代謝産物の検出及び定量は、CYP1A2(パラキサンチン又はアセトアミノフェンの検出による)、CYP3A4(1-OHミダゾラム又はオメプラゾールスルホンの検出による)、CYP2C6(HO-ブプロピオンの検出による)、CYP2C9(4'HO-ジクロフェナクの検出による)、また同様にCYP1A2、CYP3A5、CYP3A7又はCYP7A1等の他の主要なシトクロムP450活性(単独で(singularly)又は適切な組み合わせで)等の特定の化合物に対する肝酵素の活性と関連づけることができる。
発現又は(好ましくは)活性がHHALPC及び子孫HHALPCにおいて確立され得る他の酵素は、UDP-グルクロノシルトランスフェラーゼ(UGT1A1、UGT2B4、UGT2B7等)、スルホトランスフェラーゼ(幾つかの薬理学的に重要な内因性分子と生体異物の硫酸抱合体を触媒する)、チロシントランスフェラーゼ、トリプトファン-2,3-ジオキシゲナーゼ(TD02又はTDO)、インドールアミン-2,3-ジオキシゲナーゼ(IDO1又はID02)、リシルオキシダーゼ(LOX)、グルタチオンS-トランスフェラーゼ(例えばGSTアルファ)、多剤耐性タンパク質(MDR又はMRP-1/-2/-3)、肝臓特異的トランスポーター(OATP1B1等)、及び他の第I相/第II相/第III相の生体内変換酵素である。さらに、アルブミン/尿素産生及び分泌、アンモニア代謝、グリコーゲン貯蔵、胆汁産生、トロンボポイエチン/アンギオテンシノーゲン産生、及びガラクトース/ソルビトールの排出速度もまた、十分確立したプロトコルの適用により測定され比較され得る。
HHALPCの調製物が本発明の方法によって得られる場合、この細胞集団は、分化せずに成長し倍化することを可能とする条件で維持され及び/又は増殖され得る。HHALPCは、更なるin vivo又はinvitroでの使用のため、細胞倍化の数が最適な条件を確立するために評価され得るように、培養において、未分化接着細胞として、2回以下、3回以下、4回以下、又は5回以下(no more than)で継代されることが好ましい。この状態での1回以上の継代の後、HHALPCは、肝細胞様細胞又は肝活性化細胞への分化が誘導され得る。いずれの場合も、得られる細胞は子孫HHALPCを提示する。第1の場合では、未分化の子孫HHALPCとしてHHALPCを維持するための条件は、利用可能な細胞の数を増加する目的でHHALPCの本来の集団を得るために使用されるものと同じであってもよい。
本発明の方法の工程(e)の後、任意の更なる工程(f)は、肝臓特異的活性を提示し、例えば肝細胞様細胞又は肝活性化細胞(すなわち、全てではないが、ほとんどの間葉系マーカーに対してそれらの陽性を失い、全てではないが、ほとんどの肝細胞の形態学的、生物学的、及び機能的な特徴に対して陽性である成人肝前駆細胞)である細胞へと分化させる細胞培養条件にHHALPCを維持することを含み得る。代替的には、子孫HHALPCは、特定のGMP製造プロセス、製剤、投与部位、又はin vivoでの他の化合物の同時使用と関係する肝臓及び他の組織特異的な特徴の組み合わせを提示する。これらの特性は、特に、ADHLSCに関する文献(非特許文献15、非特許文献16、非特許文献18)に記載される細胞表面に発現される又は分泌される免疫調節性の特徴を有するタンパク質に関係し得る。
追加の継代(例えば、細胞の剥離及び分散、再播種等)及び培養(例えば、コンフルエンスの後の培地の添加又は交換等)は、上に記載される第1の継代と実質的に同一若しくは類似する条件、又は文献において及び/又はHHALPC又は子孫HHALPCの特定の使用に対して示唆され得る修飾を含む条件で行われ得る。したがって、細胞培養物中でHHALPC又は子孫HHALPCを維持する及び/又は分化させるための条件は、肝細胞様細胞又は肝活性化細胞への分化のタイミング/培地、細胞懸濁液として三次元の細胞培養物を維持するためのシステム、特定の基質若しくはスキャフォルドの使用、低酸素症、細胞培養培地内の増殖因子及び化学物質の併用若しくは順次の添加、又は細胞密度等の種々の基準に従って更に最適化され得る。
かかる後の継代の間、子孫HHALPCの活性及び全体的な表現型は、特に、例えばシアリルルイスX基又はペプチドを付加することによって細胞の生着を改善する(Sarkar D et al., 2011、Wan X et al., 2013、Cheng H et al., 2012)ための遺伝子操作を行わずに曝露された細胞表面タンパク質及び/又はin vitroでのそれらのグリコシル化のレベルで細胞を操作することによって最終の貯蔵、製剤、及び/又は使用機能に対して更に適合及び/又は改善され得る。また、子孫HHALPCは、幾つかの特性が、例えば、細胞のより穏やかな放出を可能にする熱感受性ポリマー又は他の支持体上で培養することによってより良好に維持されるように、最終段階(使用又は貯蔵の直前)において特定の条件で培養され得る(Nash M et al., 2013、You J et al., 2013、Nagase K et al., 2015)。in vivo活性である細胞の生着を改善し得る、又はアポトーシスを減少し得る細胞培養培地の更なる修飾(抗酸化剤を含む低酸素条件下での培養、又はサイトカイン若しくはリコピン等の他の化合物の添加等)は、文献(Kavanagh D et al., 2014、Kim JY et al., 2015、Zeng W et al., 2015)に従って予備処理として適用され得る。
本発明の方法は、先に記載される成人前駆肝臓細胞において同定されたものと異なる、形態学的な、タンパク質発現の、及び機能的な特徴を提示するHHALPCを提供する。結果的に、上に定義される方法によって得られる又は得ることが可能なHHALPCは、本発明の更なる実施形態を表す。これらの方法は、高い割合(少なくとも30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%以上)の特定の細胞を含む細胞集団を提供することを可能とし、更なる生物学的活性を評価することを伴って若しくはそれを伴わずに、任意の適切な標準的方法、例えばフローサイトメトリー又は任意の他の免疫染色アプローチによって評価され得る実質的に均質な細胞集団さえも生じさせる。
HHALPC及び子孫HHALPCは、任意の即時使用に対する又は凍結保存された調製物として貯蔵される細胞培養物を樹立するために使用することができ、各々少なくとも103個、106個及び109個以上の細胞含み、調製物を適切に解凍した後、必要に応じて、HHALPC及び子孫HHALPCを工業規模で生産するため(例えば、バイオリアクター、メンブレン、ミクロスフェア、マイクロ流体技術、又は所望の細胞特性を維持しながら、バイオプロセッシング(bioprocessing)及び細胞増殖を改善するための任意の他の技術的解決策を使用して)、より多い量のHHALPC又は子孫HHALPCを生産する又は使用することを目的とする。HHALPC及び子孫HHALPCのいずれかに対応する細胞集団の試料は、血清含有又は血清不含の保存培地(例えば、商業的に入手可能な凍結保存製剤)中に、及び/又は凍結保護剤(例えば、適切な濃度のジメチルスルホキシド)の存在下で凍結保存され得る。子孫HHALPCは、安全性試験、病態生理学的研究、並びに薬物開発及び毒性学に対する他の細胞系マイクロ流体肝臓モデルにおいて、生体機能チップ(organ-on-a-chip)の適用に対して開発される市販のシステムと適合し得る(Alepee N et al., 2014、LinC et al., 2015)。
特に、所定数の細胞(例えば50000個、100000個、500000個、100万個、1000万個、1億個、10億個以上の細胞)を含むHHALPC及び子孫HHALPCの調製物は、1以上のバイアル中に提供され得て、その後かかるバイアル(又はマイクロ流体技術用途に使用されるもの等の他の適切な容器又はコンテナ)を備えるキットに含まれ得て、その後かかるバイアル、容器、マイクロ流体技術装置、及び任意の他の適切なデバイス、使い捨て材料(例えば、フィルター、シリンジ)、溶液(例えば、PBS、細胞培養培地、希釈剤)、化学物質(例えば、酵素基質、蛍光色素、薬物)、生物由来物質(例えば、増殖因子、抗体、プライマー)、及び/又は、適切に包装され、結果的に、in vivoで(例えば、患者又は動物への投与のため)又はin vitroで(例えば、候補薬物として化合物の毒性又は有効性を試験するため)HHALPC及び子孫HHALPCを使用するため顧客に送付され得るかかるキットの構成要素を使用するための指示書を備えるキットに含まれ得る。
細胞培養条件(又は動物モデル又は患者における移植の後)におけるHHALPC及び子孫HHALPCの維持、増殖、及び/又は分化は、所望の使用に対して必要に応じて行われ得る。文献は、肝前駆細胞を維持する、及び/又は肝前駆細胞から肝細胞様細胞若しくは肝活性化細胞を生成するための幾つかのプロトコルを提供する。実施例は、細胞培養条件でHHALPC及び子孫HHALPCを得るため、及び接着細胞の形態で又は三次元の細胞クラスタとして肝臓特異的活性を提示する細胞へと分化させるための手段を提供する。
この後者の場合、HHALPC及び子孫HHALPCは、文献によると、肝臓内又は肝臓外で投与される、化合物の肝毒性を試験するため使用される、凍結保存調製物として維持される、製造プロセスを拡大するためバイオリアクター若しくはマルチトレースタックで増殖される、又は肝臓アシスト装置で使用される場合に、細胞に対して生存率及び機能性における著しい改善を提供し得る、肝臓のスフェロイド又はオルガノイドに類似する三次元細胞クラスタとして所望の用途に対して提供され得る(Ebrahimkhani M et al., 2014、Lancaster MA etal., 2014、Massie I et al., 2011)。また、HHALPC及び子孫HHALPCは、合成の又は生物学的なマトリクス中に細胞を封入することにより得られてもよい。特に、肝臓の脱細胞化されたスキャフォルド又は細胞外マトリクスは、1以上の細胞型を培養するためのスキャフォルドとして、肝臓オルガノイドを生成するための二次元基体コーティング、及び三次元注射用ヒドロゲルプラットフォームとして使用され得る(Lee J et al. 2014、Caralt M et al., 2014)。
HHALPC及び子孫HHALPCの維持、増殖、及び/又は分化は、種々の起源の幹細胞、前駆細胞、又は間葉系細胞について当該技術分野でよく知られている技術的解決策を使用して細胞培養条件を適合させることにより改善され得る。例えば、非細胞損傷性の(non-cell damaging)低酸素雰囲気のex-vivoプロトコル及びin vitro微小環境を適合させるための他のアプローチは、生存、遺伝的安定性、増殖、生着後分化、肝臓におけるホーミング及び再増殖、パラクリン因子の分泌、並びにかかる細胞の全体的な治療可能性を促進し得る(Muscari C et al., 2013、Cigognini D et al.,2013)。或いは、臍帯血血清及び血小板溶解物等のヒト血液由来成分は、ウシ血清に対する非異種間の代用物である細胞培養成分として、質の変動、汚染のリスク及び望ましくない免疫化作用等の(such as)血清と関連する良く知られている課題を伴わずに、臨床的に細胞組成物を得るためGMPガイドラインを遵守したまま、試験され、開発される(Bieback K, 2013)。
投与されるか、そうでなければ使用される前に、HHALPC及び子孫HHALPCは、該細胞を異種性の生物製剤若しくは化学薬品に曝露することによって、又は細胞へと該薬剤を導入することによって、一時的に又は安定して修飾され得る。特に、HHALPC及び子孫HHALPCは、細胞を増殖因子で処理すること、及び/又は好ましくは特定の肝臓の特徴若しくは細胞培養を支援する(例えば、microRNAによる、又は増殖因子、若しくは肝臓の分化若しくは任意の他の細胞型への分化に影響することが知られている転写因子等の組み換えタンパク質を発現するレンチウイルスベクターによる細胞の形質導入、及び/又は治療的関心のあるタンパク質、又は蛍光タンパク質の産生による)特徴に対して、細胞の発現プロファイル全体に影響を及ぼす核酸を導入することにより、細胞培養において(例えば、それらの分化の前及び/又は後に)修飾され(又は適切なベクターによるそれらの形質転換の後に操作され)得る。
特にHHALPC及び子孫HHALPCは、結果的に、最大限の肝臓特異的活性を提示する細胞への分化の後及び/又は前に、in vivo及び/又はin vitroで改善された及び/又は追加の生物学的活性を提示し得る。HHALPC及び子孫HHALPCは任意の後のin vitroでの分化又はin vivoでの使用(肝臓の又は他のタイプの分化を意味してもよく、そうでなくてもよい)とは独立して、子孫HHALPCが改善された生物学的活性を有するため一貫して修飾されるように、分化される前に操作されることが好ましい。
化学薬品、細胞培養培地、及び/又は他の既知の肝前駆細胞/幹細胞の他の非肝細胞型(例えば、骨細胞、インスリン生産ベータ細胞、又は骨髄細胞)への分化を誘導することが知られている核酸ベクターによる子孫HHALPCの処理は、かかる非肝細胞型を等しく提供し得る。文献において知られているこれらの技術をHHALPC(又は子孫HHALPCの任意の特定の種類)に適用することによって得られる非肝細胞集団は、子孫HHALPCがかかる処理の結果として失った及び/又は得られた生物学的活性に従ってinvitro及び/又はin vivoで(特に治療的用途に)使用され得る(肝臓の分化を誘導するための細胞培養培地を使用することによって得られる)実施例に記載されるものよりも分化した更なる種類の子孫HHALPCである(例えば、インスリンを産生し分泌する分化した子孫HHALPCを糖尿病の治療に使用してもよい)。
マイクロインジェクション、電気穿孔、リン酸カルシウムによる共沈、リポソーム、又はウイルストランスフェクションを含む、肝前駆細胞に適用可能な従来の遺伝子導入法は、HHALPC及び子孫HHALPCに核酸を導入するために使用され得る。適切なベクターによるそれらの形質転換に続いて、HHALPC及び子孫HHALPCは、該細胞が、(例えば、遺伝子治療用の肝前駆細胞系モデルの樹立の範囲での)肝細胞様細胞若しくは肝活性化細胞への分化の後及び/又は前に、in vivo及び/又はin vitroで改善された及び/又は追加的な生物学的活性を果たすことを可能とする、組み換えタンパク質を発現し得る、又は核酸を含み得る。ベクターがウイルスベクター(例えばレンチウイルスベクター)である場合、最適な形質導入効率条件及び増殖速度を選択するため、並びにベクターの安全性と並んでそれらの発現プロファイルを分析するため、ベクターは力価の決定によって特徴づけられる。
肝臓は、血流への様々なタンパク質の効率的な放出を可能とするように、循環系と解剖学的につなげられる。したがって、有効性を更に改善するため、(特に、例えば静脈内、筋肉内又は腹腔内の注射によって全身投与された場合)、また同様にin vivoで投与された場合に生着及び維持のため、全身性の効果を有するタンパク質をコードする遺伝子は、(特に三次元の細胞クラスタを得るために培養される前に)HHALPC及び子孫HHALPCに挿入され得る。
例えば、ホルモン又は抗体をコードする様々な遺伝子は、循環へのそれらの遺伝子産物の分泌のため、本発明の肝臓細胞に挿入されてもよい。特に、HHALPC及び子孫HHALPCは、肝細胞によって正常に発現される(またおそらくは、かかる細胞によって既に発現された)が、患者においては欠損又は不在である(先天性肝臓代謝異常におけるように、患者の病理の根底をなすこの欠損)タンパク質を恒常的に又は一時的に過剰発現するように修飾され得た後、タンパク質の産生の回復を支援し、それによって患者の治療を支援する。かかるタンパク質の例は、リアーゼ、アルギナーゼ、グルコキナーゼ、オルニチントランスカルバミラーゼ、アルギノコハク酸シンテターゼ、アルギニノコハク酸カルバミルリン酸シンターゼ、N-アセチルグルタミン酸シンターゼ、グルタミンシンテターゼ、グリコーゲンシンテターゼ、グルコース-6-フォスファターゼ、アルカリフォスファターゼ、コハク酸デヒドロゲナーゼ、ピルビン酸キナーゼ、アセチルCoAカルボキシラーゼ、脂肪酸シンテターゼ、アラニンアミノトランスフェラーゼ、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、シトクロムP450酵素、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、及び/又はアルコールデヒドロゲナーゼ等の代謝酵素である。代替的には、HHALPC及び子孫HHALPCは、アルブミン、増殖因子又はホルモン、インスリン、トランスフェリン、補体タンパク質(補体C3等)、アルファ2-マクログロブリン、フィブリノゲンアルファ/ベータ/ガンマ鎖、凝固因子(第V因子、第VII因子、第VIII因子、第XI因子、第XIII因子、第IX因子)、アルファ-1-アンチトリプシン等の分泌血漿タンパク質をコードするDNAを導入することによって修飾され得る。
HHALPC及び子孫HHALPCを生成する際に得られる生体物質は、特定の用途、特に明らかな医学的適用を有し得る生物学的存在の同定のために更に使用され得る。これらの生体物質は、(実施例3及び実施例4において特定される)特異的なマーカー、活性、及び/又は形態を提示するHHALPC又は子孫HHALPCの亜集団(又は細胞株)のみならず、中間若しくは最終生成物として得られる任意の他の生物学的存在、例えば、順化細胞培養培地、並びに医学的関心のある細胞を検出するためのバイオマーカーとして、又は医学的関心のある活性若しくは分布を提示する化合物として使用され得るタンパク質、代謝産物、細胞小胞、及び/又は核酸を含むこれらの細胞及び培地の画分を含む。また追加の情報は、セクレトーム(secretome)、並びに特にHHALPC及び子孫HHALPCのパラクリン効果に関する関連情報を提供することができる(例えば、細胞培養上清の形態の)順化細胞培養培地の内容物を測定することによって決定され得る。
HHALPC又は子孫HHALPCの関連する生物学的特徴は、フローサイトメトリー、免疫細胞化学検査、質量分析、ゲル電気泳動、イムノアッセイ(例えば免疫ブロット、ウェスタンブロット、免疫沈降、ELISA)、核酸増幅、酵素活性、オーミクス技術(プロテオミクス、グリコミクス、トランスクリプトミクス、メタボロミクス)及び/又は他の生物学的活性等の技術を使用することにより同定され得る。特に、オーミクス技術は、幹細胞又は前駆細胞、特に肝前駆細胞に対して公表されるデータベース及び他のデータセットを使用して、HHALPC又は子孫HHALPCを比較するための追加の手段を提供し得る(Yu J, et al., 2012、Santamaria E, et al.,2012、Slany A, et al., 2010、Sison-YoungR et al., 2015)。これらの追加のマーカーは、(例えば、子孫HHALPCの工業生産されたバッチの比較及び検証のため、又は薬学的用途に対する適合性を評価するため)子孫HHALPCの調製の最初の工程の間、又はその後のいずれかで使用され得る。
これらのアプローチは、(例えば、その作製及び使用の前、その間、又はその後の細胞集団の量、質及び均質性を確立するため)in vivo又はin vitroのいずれかで成人肝前駆細胞に関連する新規のバイオマーカーを定義する手段を提供し得る。特に、バイオマーカーは、一般に生体試料中若しくは細胞培養物中の所与の細胞集団(HHALPC及び/又は子孫HHALPC)の濃縮によって、又は特定のタンパク質、脂質、酵素、リン脂質、及び/又はグリカンを提示する細胞の濃縮と組み合わせて定義され得る。かかるバイオマーカーは、ペプチド、タンパク質、リン脂質、脂質、核酸、グリカン、又はかかる要素の構成成分の任意の組み合わせに対応し得る。バイオマーカーは、特に、異なるドナーから得られた及び/又は異なる生産プロセスを適用することにより得られた子孫HHALPCを比較する場合、所与の用途(例えば、特定の肝疾患を治療すること、invitro分化又は化学薬品及び/又は核酸ベクターによる修飾の後に肝活性化細胞型を得ること、特定の化合物の代謝を判断すること)に対するHHALPC又は子孫HHALPCである細胞集団の適合性の判断に特異的であり得る。或いは、バイオマーカーは、どのドナー及び/又は試料が選択されるかを確立するため、所与の肝臓組織(又は新鮮な若しくは凍結保存された肝臓細胞の試料)が、(例えば肝臓組織のバンク、並びにタンパク質抽出物及びcDNAライブラリ等の他の肝臓起源の生体試料のライブラリをスクリーニングすることによって)より効率的にHHALPCを得るのに適しているかどうかを判断することを可能とする。
「バイオマーカー」又は「マーカー」という用語は、分子、パラメーター、性質、又は客観的に測定され、HHALPC及び/又は子孫HHALPCを特徴づけるように評価される存在を指す。特定の試料(組織又は体液等(such as))においてHHALPC及び/又は子孫HHALPCと関連するバイオマーカーの定量的評価は、全細胞の定量的評価、HHALPC及び/又は子孫HHALPCを生産し、単離し得る効率、特定のin vitro技術、又は特定の医学的用途若しくは患者の状態と関連し得る。
HHALPC及び子孫HHALPCは、再生医療、並びに一旦、in vivo若しくはin vitroのいずれかで分化すると、又はより多くの数の及び/又はより強い肝臓特異的活性を提示する細胞(すなわち、肝活性化細胞)への完全な分化を誘導する前であっても、所望の期間に亘って初代肝細胞について観察されたものにできるだけ類似する生物学的特徴(代謝活性若しくは酵素活性、抗原プロファイル又は他の表現型等)を提示する細胞を必要とする生物学的アッセイで使用され得る。また、HHALPC及び子孫HHALPCは、薬理学的又は毒性学的な研究等のin vitro適用(例えば、生物学的製剤又は化学薬品のスクリーニング及び特性評価)に使用され得る。HHALPC及び子孫HHALPCは、特に、肝疾患の診断、予防、及び/又は治療と結び付いて、毒性学、薬理学及び薬理遺伝学(様々な起源の前駆細胞又は幹細胞に由来する初代肝細胞及び肝細胞様細胞に対して広く説明される)のin vitro及び動物モデルを確立すること、又は医学的関心のある細胞集団をinvivo及び/又はin vitroで同定するためのバイオマーカーの同定を可能とする。
本明細書で使用される「in vitro」という用語は、動物又はヒトの身体の外側又は外部を意味する。本明細書で使用される「in vitro」という用語は、「ex vivo」を含むと理解されるべきである。「ex vivo」という用語は、典型的には、動物又はヒトの身体から取り除かれ、身体外、例えば培養容器又はバイオリアクターで維持又は増殖される組織又は細胞を指す。
HHALPC及び子孫HHALPCがin vivo適用に好ましく使用され得る場合、in vitroで分化される子孫HHALPCは、分化した肝細胞様細胞又は肝活性化細胞として創薬/検証に使用さ得ることが好ましい。
HHALPC及び子孫HHALPC(又はそれらを生成する際に得られる対応する生体物質)は、それらを含む組成物、特にin vivo投与(ヒト又は動物モデルにおいて)、又は新鮮細胞若しくは長期保存に適した細胞(例えば、凍結保存細胞)のいずれかとしてかかる細胞を含む組成物の形態のin vitro適用に対する治療方法で使用され得る医薬組成物として提供され得る。
HHALPC又は子孫HHALPCを含む組成物は、少なくとも103個、106個の又は109個以上の細胞(例えば、各用量又は投与に対して500万個〜5億個、又は500万個〜2億5000万個、又は5000万個〜5億個、又は5000万個〜2億5000万個、又は1億個〜5億個、又は1億個〜2億5000万個の細胞)を含み得ることが好ましい。また、かかる細胞系組成物は、更なる治療的効果、診断的効果、又はその他の有用な効果を提供し得る、生物起源(例えば、抗体又は増殖因子)、又は化学起源(例えば、薬物、細胞保存用又は標識用の化合物)の他の薬剤を含み得る。文献は、HHALPC及び子孫HHALPCと組み合わせる手段と並んで、更なる特定のバッファー、増殖因子、又はアジュバントを含み得る細胞系医薬組成物と適合性の任意の添加剤、賦形剤、ビヒクル、及び/又は担体の幾つかの例を提供し、ここで、その組成物の各成分の量(マイクログラム/ミリグラム、体積、又は割合の点から)が定義される。
HHALPC及び子孫HHALPCは、組成物の形態で投与してもよく、該組成物は、選択される投与方法に応じて、細胞の懸濁物、バイオ人工肝臓デバイス、天然若しくは合成のマトリクス、又は適切な場所(細胞のホーミング及び生着を支援するケモカインを発現する炎症又は組織の損傷の領域を含む)で細胞の生着及び機能性を可能とする他のシステムを含むin vitro及び/又はin vivoで細胞が成長し、分化することができるスポンジ又は他の三次元構造であってもよい。特に、HHALPC及び子孫HHALPCは、(また、静脈内又は動脈内のカテーテル投与を包含する)注射又は移植、例えば、局所的な注射、全身性の注射、脾臓内注射、関節内注射、腹腔内注射、門脈内注射、肝臓の髄(liver pulp)への、例えば肝臓被膜下の注射、非経口投与、又は胚若しくは胎児への子宮内の注射によって投与され得る。
局所ではなく全身的に注射される場合、HHALPC製品は、かかるHHALPCが血流にのって移動し、離れた場所(内部臓器又は関節等(such as))で生着するため、又はHHALPCによって分泌されるタンパク質が、血流のおかげで特定の細胞型に到達するためのいずれかにより、離れた場所で効果を有し得る。さらに、HHALPC及び子孫HHALPCは、強固なプラスチック製の外側シェルと、HHALPC又は子孫HHALPC(他の幹細胞、分化した肝細胞等の初代ヒト細胞、又は幹細胞に由来する細胞型等)が蒔かれる中空の半透膜ファイバーとを備える肝臓灌流又は肝臓アシスト装置等の解毒装置の生体成分として使用され得る。体液は、よく知られている手順に従って解毒装置を通るように灌流された後、患者に戻され得る。
HHALPC、子孫HHALPC、又はそれらを含む組成物は、(肝臓又は他の臓器及び組織の移植前の又はその後の免疫学的応答の調節を含む)肝臓内又は肝臓外の場所での肝細胞移植(LCT:liver cell transplantation)によって組織工学及び細胞治療に使用され得る。このアプローチを使用することにより、ヒト肝細胞に対する化合物の効果が、より効果的に評価され得て、動物モデルにおける効果と区別され得る動物において、ヒト起源のHHALPC、ヒト起源の子孫HHALPC、又はそれらを含む組成物を移植することによって、ヒト肝疾患の動物モデルを得ることもできる。
HHALPC、又は特定の子孫HHALPCを含む治療用組成物を投与する場合、該組成物は一般に、単位用量に製剤化され得る。いかなる場合も、例えば、生体ポリマー又は合成ポリマーへと細胞を組み込むことによってHHALPC又は子孫HHALPCの生存率を保証する患者に細胞を投与するため、薬剤を含む及び/又は既知の方法に適合させることが望ましい場合がある。好適な生体ポリマーの例として、限定されないが、フィブロネクチン、フィブリン、フィブリノゲン、トロンビン、コラーゲン、及びプロテオグリカンラミニン(proteoglycans laminins)、接着分子、プロテオグリカン、ヒアルロナン、グリコサミノグリカン鎖、キトサン、アルギン酸塩、天然の又は合成的に修飾されたかかるタンパク質に由来するペプチド、及び合成の生物分解性で生物学的適合のポリマーが挙げられる。これらの組成物は、サイトカイン、増殖因子を含む又は含まずに生産され得て、懸濁液又はその内部に包埋された細胞を含む三次元ゲルとして投与され得る。
本発明の方法は、HHALPC又は子孫HHALPCの生成のために肝臓組織の任意のドナーを使用することのみならず、HHALPCを産生し単離して、子孫HHALPC又はそれらを含む組成物を生成するために患者自身の肝臓組織を使用することも検討する。かかる細胞は患者に対して自己由来となり得て、患者に容易に投与され得る。或いは、HHALPCは患者自身のものではない組織から産生され単離されてもよい。かかる細胞の患者への投与が検討される場合、HHALPCを得るため本発明の方法に供される肝臓組織は、患者と投与される細胞との間の組織適合性を少なくとも達成可能な限界内で最大限とすることにより、患者の免疫系による投与された細胞の拒絶(例えば、移植片対宿主)の機会を減少するように選択されることが好ましい場合がある。
HHALPC及び子孫HHALPCの治療用途に関する問題は、最適な効果を達成するのに必要な細胞の量である。投与用量は変化してもよく、次の投与が後続する最初の投与を含んでもよく、本開示の教示を当てはめることによって当業者により確認され得る。典型的には、投与される用量(複数の場合もある)は、治療的有効量の細胞を提供し、投与される細胞の量の最適化を必要とする場合がある。したがって、投与される細胞の量は、治療される被験体に対して変化する(例えば、1サイクル中の各治療若しくは治療の全サイクル当たり102個〜1010個の細胞、例えば、1サイクル中の各治療当たり1×106細胞/被験体の体重kg〜1×107細胞/被験体の体重kg、若しくは2×106細胞/被験体の体重kg〜8×106細胞/被験体の体重kg、若しくは3×106細胞/被験体の体重kg〜5×106細胞/被験体の体重kg、又は治療の全サイクルに対して例えば1×106細胞/被験体の体重kg〜1×108細胞/被験体の体重kg、若しくは5×106細胞/被験体の体重kg〜5×107細胞/被験体の体重kg、若しくは1×107細胞/被験体の体重kg〜2×107細胞/被験体の体重kg)。しかしながら、治療的有効用量の正確な決定は、患者の大きさ、年齢、組織損傷の大きさ、及び損傷が生じてからの時間を含む各患者に対して個別の因子に基づいてもよい。
HHALPC又は特定の子孫HHALPCを含む組成物は、上に定義される実質的に均質な細胞集団を含まなくてはならず、結果的に各用量中の細胞の量は調整可能であることが好ましい。
投与後又は移植後のHHALPC又は子孫HHALPCの分布、分化、及び/又は増殖は、特定され得て、(異なる治療剤の投与の後/前のそれらの活性と同様に)ヒト被験体又は動物モデル(好ましくは齧歯類)において試験され得る。例えばHHALPC又は子孫HHALPCが脾臓内に移植されたSCIDマウスの肝臓の分析は、ヒトマーカーの検出により、これらの細胞が肝臓に生着して臓器を再構築し得て、またヒトアルブミン、又は任意の他の典型的なヒト肝臓特異的マーカー(又は投与されたHHALPC又は子孫HHALPC中の先にトランスフェクトされた組み換え遺伝子)の検出によって活性で成熟な肝細胞へと分化し得ることを実証し得る。
本発明の別の態様は、HHALPC、子孫HHALPC、又はそれらを含む組成物を、それを必要とする被験体に投与することを含む、肝疾患を予防する及び/又は治療する方法である。HHALPC及び子孫HHALPCは、肝疾患、特に、肝臓の質量及び/又は観察され異なるカテゴリーに分類され得る機能が喪失された場合に、文献によれば肝移植及び肝細胞移植、又は肝再生を必要とする被験体において、肝機能の永久的な(又は時間が限られた)再建を必要とする疾患の治療に対して使用され得る。
肝疾患を治療する方法は、HHALPC、又は所与の子孫HHALPC等のHHALPC製品、及び好ましくは組成物中のHHALPC製品を、それを必要とする被験体に投与することを含む。特に、それを必要とする患者における疾患の治療方法は、有効量のHHALPC製品を患者に投与することを含み、該疾患が好ましくは肝疾患又は遺伝性血液凝固障害である。
第1のカテゴリーの肝疾患は、アミノ酸代謝の異常(メープルシロップ尿症、フェニルケトン尿症、チロシン血症、プロピオン酸血症、有機酸尿症(Organic Aciduria)、及びアルギニノコハク酸尿症、カルバモイルリン酸シンターゼI欠損症、シトルリン血症、高アルギニン血症、及びオルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ欠損症を含む尿素サイクル障害等)、金属代謝の異常(ウィルソン病又はヘモクロマトーシス等)及び炭水化物代謝の異常(I型/II型糖原病、フルクトース血症又はガラクトース血症等)、リソソーム障害(ウォルマン病、ニーマンピック病等)、ペルオキシソーム障害(レフサム病等)、家族性高コレステロール血症及び他の脂質代謝障害、ミトコンドリア病(ピルビン酸カルボキシラーゼ欠損症等)、及び高ビリルビン血症(クリグラー−ナジャー症候群、ジルベール症候群又はデュビン−ジョンソン症候群等)に更に分類され得る肝臓代謝の先天異常に代表される。第2のカテゴリーは、凝固又は代謝の欠損と直接関連しない他の肝疾患に代表され、1型/2型/3型進行性家族性肝内胆汁鬱滞症、アルファ-1-アンチトリプシン欠損症、カロリー病、肝細胞トランスポーターの欠損、ポルフィリン症(急性間欠性ポルフィリン症等)、脂肪肝及び他の線維性肝疾患(NASH/NAFLD)、原発性胆汁性肝硬変症、硬化性胆管炎、肝臓変性疾患、又は急性若しくは慢性の肝不全(例えば、肝切除後、劇症性、ウイルス誘導性、慢性肝不全の急性増悪)、又は肝前駆細胞によって肝臓組織を置き換えることにより治療され得る他の種類の肝臓変性(liver degeneration)(例えば肝臓癌又は他の悪性腫瘍における)を含む。
遺伝性血液凝固障害に関して、疾患は、第V因子欠損症、第VII因子欠損症、第VIII因子欠損症、第IX因子欠損症、第XI因子欠損症、第XIII因子欠損症、及び他の凝固関連因子又はアルブミン若しくは組織因子等の肝臓によって特異的に発現され血流へと分泌される他のタンパク質の量が不十分なことによる他の欠損症等から選択され、この後者の生成物は、かかる細胞によって発現され(Stephenne X et al., 2012)、血液凝固障害と関連する或る種の症候群に対して潜在的に興味深い。
上で考察したように、HHALPC製品は、別の製品(薬物、治療剤、別の細胞型、又は他の生体物質等)と組み合わせて投与又は使用され得る。これは、本明細書に記載される投与及び治療的使用のいずれにも当てはまる。特に、他の治療用製品は、HHALPC製品と実質的に同時に投与されてもよく(同じ医薬組成物内で、又は別々の医薬組成物において)、又は異なる時点において(別々の医薬組成物において、任意の順又は回数で)投与され得る。他の治療用製品が別々に、又はHHALPC製品からではなく投与される場合、得られる効果は、予想される相加的な効果よりも優れる、相乗効果となる可能性があり、かかる成分のうちの1つの負の効果は軽減されるか、若しくは消滅され、及び/又はかかる成分のうちの1つの正の効果は、上記製品をより低量で若しくは少ない頻度で投与することによって得られる。
HHALPC製品が子孫HHALPCである場合、これらの細胞(in vitro条件で共培養されているか又は以前に共培養されていない)は、別の細胞型(例えば、初代ヒト肝細胞、ADHLSC細胞、又は国際公開第2006126219号に記載されるもの等の初代細胞、幹細胞、間葉系細胞、及び/又は前駆細胞である別のヒトの細胞型若しくは細胞集団、並びに肝臓起源の他の前駆細胞若しくは幹細胞)又は細胞培養上清の形態のその対応する順化細胞培養培地と組み合わせて投与され得る。HHALPCと別の細胞型との組み合わせは、ヒト体内での1及び/又は他の細胞型の治療有効性、生着、ホーミング、再増殖、増殖、及び/又は安定性を改善し得る。子孫HHALPCもまた、かかる別の細胞型を含む製剤の一部として投与され得るか、又は別々であるが、例えば(任意の順番で)順次若しくは同時に他の細胞型と組み合わせて投与され得る。2つの細胞型は、細胞の懸濁物若しくは共培養物として、又はバイオ人工肝臓デバイスを含む、細胞がin vitro及び/又はin vivoで成長し、増殖し、分化することができるスポンジ若しくは他の三次元構造物、並びにこれらの細胞のヒト体内での維持を持続させる天然若しくは合成のマトリクスにおいて投与され得る。HHALPCと別の細胞型の順化細胞培養培地との組み合わせは、他の細胞型の順化細胞培養培地の組成と関連する更に有用な特性と共に、又はそれを伴わずに、ヒト体内での治療有効性、生着、増殖、及び/又は安定性が改善されたHHALPC製品を提供し得る。
代替的には、HHALPC製品が子孫HHALPCの順化細胞培養培地である場合、この調製物は、別の細胞型(例えば、初代ヒト肝細胞、ADHLSC細胞、又は国際公開第2006126219号に記載されるもの等の初代細胞、幹細胞、間葉系細胞、及び/又は前駆細胞である別のヒトの細胞型若しくは細胞集団、及び肝臓起源の他の前駆細胞若しくは幹細胞)又はその対応する順化細胞培養培地と組み合わせて投与され得る。子孫HHALPCの順化細胞培養培地と別の細胞型との組み合わせは、この後者の細胞型のヒト体内での生着、安定性、ホーミング、増殖、再増殖、及び/又は安定性を改善し得る。ここでも、HHALPC製品は、かかる別の細胞型も含む製剤の一部として投与され得るか、又は別々であるが、例えば(任意の順番で)順次若しくは同時に他の細胞型と組み合わせて投与され得る。更に代替的には、子孫HHALPCの順化細胞培養培地と別の細胞型の順化細胞培養培地との組み合わせは、ここに含まれる分泌タンパク質の効果と潜在的に合わさった、改善された治療有効性による解決策を提供し得る。ここでも、子孫HHALPCの順化肝細胞培養培地は、かかる別の順化細胞培養培地も含む製剤の一部として投与されてもよく、又は別々であるが、例えば(任意の順番で)順次又は同時に他の培地と組み合わせて投与され得る。
また、HHALPC製品の投与又は治療的使用は、(国際公開第2015001124号に記載されるADHLSC細胞、又はADHLSC細胞の順化細胞培養培地の投与及び治療的使用と同様に)予想外の正の効果を提供する可能性がある。特に子孫HHALPC又は子孫HHALPCから得られた順化細胞培養培地の投与又は治療的使用は、代謝酵素(例えばオルニチントランスカルバミラーゼ又はUDP-グルクロノシルトランスフェラーゼ1A1)又は凝固因子(例えば第VIII因子、第IX因子又は第XI因子)等の先天性疾患を治療するのに特異的に必要とされるタンパク質の投与と組み合わせられ得る。かかるタンパク質又は凝固因子は、HHALPC製品によって(又はADHLSC細胞若しくは対応する順化細胞培養培地によって)提供され、同じ代謝経路又は生理機能(例えば血液凝固)に関与するタンパク質及び酵素と共に使用され得て、相乗効果を得られる可能性がある。したがって、HHALPC製品が、上に検討される別の製品と組み合わせて投与される、又は使用される場合、その他の製品は、代謝酵素又は凝固因子等の先天性疾患を治療するためのかかるタンパク質であってもよい。さらに、医薬組成物は、凍結保存バイアル内で直接に適切な希釈剤を用いて(分類された環境を必要とせず、またそれほどロジスティックスでない要件で)医薬組成物を再構成することにより解凍され、患者に投与される、HHALPC製品を高濃度(1000万/ml、5000万/ml、1億/ml以上、適切にはCryostor等の市販の溶液中)で凍結保存することによって生成され得る。
このアプローチは、酵素又は凝固因子の欠損症の治療に対して一般的に使用される単離された組み換えタンパク質の投与より長く及び/又は改善された治療効果を提供する医薬組成物を提供し得る。したがって、医薬組成物は、(a)子孫HHALPC又はその順化培養培地等の本明細書に記載されるHHALPC製品と、(b)薬物、治療剤、別の細胞型、若しくは他の生体物質、より具体的には代謝酵素(例えばオルニチントランスカルバミラーゼ又はUDP-グルクロノシルトランスフェラーゼ1A1)等の先天性疾患の治療に対するタンパク質、又は凝固因子(例えば、第VIII因子、第IX因子、又は第XI因子)等の本明細書に記載される別の製品と、(c)薬学的に許容可能な担体又は希釈剤とを含み得る。この範囲では、特定の種類のHHALPC製品及びADHLSC細胞(その亜集団、細胞株、及び画分等)は、所与の代謝経路又は生理機能(例えば血液凝固)に関与する一連のタンパク質に対して最適なレベルの生成物を(絶対値及び/又はかかるタンパク質間の比率として)提示するように、製造プロセス中に選択され得る。例えば、HHALPC又は子孫HHALPCの特定の亜集団(及び関連する製造プロセス)は、血友病(A型は因子欠損と関連し、B型は第IX因子欠損と関連し、C型は第XI因子欠損と関連する)等の異なる種類の血液凝固不全の1つに適切な複数の凝固因子(例えば、2以上の外因子、第V因子、第VII因子、及び第X因子、及び/又は2以上の内因子、第VIII因子、第XI因子、第XIII因子、第XII因子、及び第IX因子)のバランスのとれた発現を有する(細胞株として維持され得る、細胞調製物として寄託され得る、そうでなければ貯蔵され得る)細胞集団を提供するように選択され得る。
組成物内及び治療方法におけるHHALPC又は子孫HHALPCの使用は概して、上に列挙されるもののような肝疾患に対して治療効果を提供し得るが、初代肝細胞又は肝臓細胞株の代用におけるin vitro研究とも関連付けられ得る。特に、子孫HHALPCは、化合物(例えば、生物学的又は化学的な存在)の有効性(HHALPC製品が肝臓に特異的又は非特異的な疾患に対して可能性のある薬物標的を発現する場合)、代謝、安定性、及び/又は毒性を評価する(初期の)薬理学的及び毒性学的な方法において使用され得る。
かかるin vitro方法及び使用は、一般に、
(a)HHALPC製品(例えば、細胞の形態のHHALPC若しくは子孫HHALPC、又はHHALPC若しくは子孫HHALPCから得られた細胞抽出物若しくは順化培地)の調製物を準備する工程と、
(b)上記HHALPC製品を化学物質、タンパク質、核酸、脂質、糖、金属、塩、ウイルス、細菌、又は細胞から選択される1以上の外因性成分に曝露する工程と、
(c)HHALPC製品に対する上記1以上の外因性成分の効果を検出する、及び/又はHHALPC製品への曝露後の上記1以上の外因性成分の存在、局在、又は変更を検出する工程と、
を含まなくてはならない。
HHALPC及び子孫HHALPCは、既に登録されている薬物、まだ開発中及び肝臓特異的効果について前臨床で評価中の候補薬物である大半の化学物質、又は望ましくない(すなわち、肝毒性化合物)若しくは望ましい(HHALPC及び子孫HHALPCが、それ自体が癌等の肝臓特異的又は非特異的な疾患に対する候補化合物に対する標的となることが知られている酵素及び他の肝臓特異的タンパク質を発現する場合、化合物は、その後、かかる疾患の候補化合物とされ得る)とされ得る肝臓特異的効果を有すると思われる他の化学物質を代謝することが知られている、酵素及び他の肝特異タンパク質を高レベルで発現し得る。
一般に、HHALPC又は子孫HHALPCから得られた細胞、細胞抽出物、又は順化培地の形態のHHALPC製品は、細胞形態又は生存率(例えば、細胞傷害性試験における)等の一般的な特徴の分析による化学物質、無機化合物、生物製剤、細菌、ウイルス又は細胞の代謝、排除及び毒性を評価する上記工程(c)において評価され得る。しかしながら、肝臓特異的(又は非特異的)タンパク質の上方制御若しくは下方制御、又はHHALPC製品(例えば、HHALPC、子孫HHALPC、又はHHALPC若しくは子孫HHALPCから得られた細胞抽出物若しくは順化培地)中のタンパク質の任意の変更(例えば、分解、凝集、活性化、又は阻害)等の代替的な又は追加の基準が含まれ得る。
代替的には(又はHHALPC又は子孫HHALPC、及び派生した生体物質について評価される基準と組み合わせて)、工程(c)は、これらの1以上の外因性成分が、どのようにしてHHALPC又は子孫HHALPC、及び派生した生体物質によって内在化及び/又は修飾されたか、又は内在化及び/又は修飾されなかったかに関する分析を含み得る。これらの分析基準は、文献に記載される外因性成分の種類、例えば、分解、他のタンパク質との結合、細胞培養物中の持続、凝集、感染力(ウイルスについて)、又は分化若しくは生存率(細胞について)に応じて変化する。
細胞及び派生した生成物(すなわち、細胞抽出物、順化培地)に関するin vitroアッセイに関する文献は、どのようにして、細胞、組成物、及び派生した生体物質(すなわち、HHALPC製品)の形態のHHALPC又は子孫HHALPCを、工程(a)〜(c)に示されるようにin vitroで使用することができるかについて、例えば、濃度、タイミング、培養及びアッセイの条件、並びに分析技術に関する手引きを提供し得る。また同様のアッセイは、工程(a)において非ヒト動物等の動物においてHHALPC又は子孫HHALPCを誘導した後、1以上の外因性成分を工程(b)においてその動物に投与して、工程(c)で該1以上の成分がHHALPC又は子孫HHALPC(又は関連する生体物質)を修飾するかどうか、またどのように修飾するか、及び/又は該1以上の成分がこれらの動物においてHHALPC又は子孫HHALPCによって修飾されるかどうか、またどのように修飾されるかを判断することにより行われ得る。
特にHHALPC製品、HHALPC及び子孫HHALPCは、上に記載されるキット内に上に記載される化学物質又は生物製剤を含むin vivo(すなわち、かかる細胞の治療用途に対する)及びin vitro(例えば、薬物毒性学的用途に対する)の方法に対して使用され得る。特に、キットは、かかる細胞(又は派生した生体物質)に加えて、参照化合物、溶液、及び/又はHHALPC及び子孫HHALPCの使用を含むアッセイで観察される効果を比較し評価することを支援し得る他の細胞と並んで、該細胞が化合物のパネルに曝露される際に、細胞及びそれらの活性(構造中の少なくとも1つの変化、代謝産物、及び/又は検査される化合物の濃度から生じる)を使用する及び/又は検出することを可能とする更なる要素を備え得る。
したがって、HHALPC及び子孫HHALPCは、培養中及びバッチからバッチに経時的に安定した肝細胞様パターンの酵素中の可変性が制限された、継続して容易に入手可能な細胞を含むin vitroモデルを、特に「ADMET」(投与、分布、代謝、***、及び毒性)又は細胞毒性試験(すなわち、肝細胞生存率及び/又は機能的効率)における初代肝細胞に対する代替細胞として、提供することができる。
HHALPC及び子孫HHALPCは、肝臓感染症を治療する薬剤を試験する、又は特に肝臓及び肝細胞に感染するウイルスの効率的な複製を可能とする方法で使用され得る。HHALPC又は子孫HHALPCは、ウイルス(例えば、肝炎ウイルス)に曝露される前又はその後に分化され得る、及び/又は遺伝子修飾され得る。その後、感染細胞集団は、C型肝炎感染、肝線維症又は発癌と関連して他の肝前駆細胞について示されるように(Wu Xet al., 2012、Wang C et al., 2012、Torres DM and Harrison SA, 2012)、ウイルス粒子の精製に使用されるか、又はウイルス感染症の任意の可能性のあるin vivoの効果の判断に使用される任意の有用な(例えばウイルス複製に対する)効果を観察するために所定量の感染を治療する候補化合物に曝露され得る。
本明細書において具体的に引用される全ての参考文献の教示は、引用することにより本明細書の一部をなす。ここで、本発明を以下の実施例によって解説するが、実施例は本発明の範囲を何ら限定するものではない。
実施例1:HHALPC上の細胞表面タンパク質の分析
材料及び方法
細胞培養でのHHALPCの単離及び増殖
5名の別々のヒトドナーを使用し、別記される(非特許文献9)2工程コラゲナーゼ灌流法、濾過及び低速遠心分離の後に達成された肝臓の実質細胞画分の初代培養に続いて、HHALPCを回収した。かかる肝臓細胞を、ViaSpan溶液に調製されている凍結保存培地に懸濁した後、適切なバイアル、袋、又は他の長期保存用及びヒト細胞の保存用のシステムを使用することによって液体窒素中に維持する。凍結保存された肝臓細胞懸濁物を37℃で急速に解凍し、グルコース2.5 g/l、重炭酸塩0.084 g/l及びヘパリンLEO(商標)5000IE/UI/mlで補足した10倍容量の5%ヒトアルブミン中で上記懸濁物を2回洗浄することによって使用する。224 gで4℃にて10分間の遠心分離の後、細胞ペレットを必要な細胞培養培地中に懸濁する。
10%ウシ胎仔血清(Gibco)及び1%ペニシリン/ストレプトマイシン(Invitrogen)で補足したグルコース(Invitrogen)4.5 g/lを含むダルベッコ変法イーグル培地(DMEM)中、CellBIND(商標)フラスコ(Corning(商標))上で37℃にて十分に加湿して(5%CO2)HHALPCを培養した。80%コンフルエントに達した際に、細胞を0.05%トリプシン−EDTA(Invitrogen)でリフトし(lifted)、5000細胞/cm2の密度で再度播種した。追加の又は代替のGMPグレード試薬を活用することにより、医薬品の製造及び品質管理に関する実践規範に対する実際の必要量に培地及びバッファーの組成を適合させることができる。トリパンブルー色素排除試験法を使用して回収した細胞の生存率を評価した。
BD Lyoplate技術を使用するフローサイトメトリーによる細胞表面マーカースクリーニング
BDLyoplate(商標)ヒト細胞表面マーカースクリーニングパネル(カタログ番号560747;ドイツ国ハイデルベルグのBD Biosciences)を使用してHHALPCの特性を明らかにした。上記キットは、非特異的バックグラウンドを判断するためのアイソタイプ対照と並んで、細胞表面マーカーに対する242種の精製されたモノクローナル抗体を備える。使用前に、凍結乾燥抗体を含むプレートを300gで5分間遠心分離した。その後、抗体を110 μlの滅菌ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)中に再構成した。
製造業者の指示に従い、5名の各ドナーから生成されたHHALPCを用いてアッセイを行った。簡潔には、0.05%トリプシン−EDTAを使用して、5回目の継代でADHLSCを採取した。DPBSで洗浄した後、細胞を1.25×106細胞/mlの濃度で5mM EDTAを含むPharmingen染色バッファーに再懸濁した。その後、1ウェル当たり80マイクロリットルの細胞懸濁物を96ウェルプレートに移し、氷上で30分間、20 μlの特異的一次抗体で染色した。その後、5mM EDTAを含むPharmingen染色バッファーで細胞を2回洗浄し、氷上で30分間、Alexa Fluor647標識化抗マウス又は抗ラット二次抗体100 μl(5mM EDTAを含むPharmingen染色バッファー中に1:200で希釈した)で染色した。洗浄後、細胞をBD Cytofix固定バッファーで固定し、96ウェルプレートから単一のBD FACSチューブに移した。FACSDivaソフトウェアを使用して、10000個の細胞に対してBD FACS Canto II血球計算器により蛍光を測定した。分析のため、FlowJoソフトウェアを使用し、その適切なアイソタイプに基づいて各試料に対して手動でバックグラウンド蛍光を設定した。結果を、集団中の陽性細胞の割合又はメジアン蛍光強度(MFI:median fluorescence intensity)として表す。
他の抗体細胞を用いるフローサイトメトリーによるHHALPCの特性評価
細胞を採取し、PBSバッファー(カタログ番号SH30028.03、Thermo Fisher)中500個/μl〜1000個/μlの濃度で懸濁し、製造業者によって指定される、又はBD Lyoplateに含まれる抗体に対する指示に従う濃度で使用される、指定の抗原に特異的な以下の蛍光色素標識抗体と共に4℃で30分間インキュベートする。対応する対照アイソタイプ抗体を、モノクローナル抗体の非特異的結合を評価するために使用する。その後、細胞を洗浄し、BD Biosciences FACSCanto IIフローサイトメーターによる読取りのためPBS/BSAに懸濁する。
CXCR4(CD184)染色のため、最初に、肝臓細胞をDPBSウシ血清アルブミン(BSA)1.5%と共に4℃にて20分間インキュベートして、非特異的結合を防止した。次に、細胞を1.5%DPBS-BSAで洗浄し、5 μlのPEラット抗ヒトCXCR4/CD184、APCマウス抗ヒトCD90、又はそれらの各アイソタイプ(BD Biosciences)で氷上にて30分間染色した。最後に、細胞を洗浄し、安定化固定液(BD Biosciences)を使用して固定した。細胞内染色のため、4℃にて20分間、200 μlのcytofix/cytopermバッファー(BD Biosciences)で肝臓細胞を固定し、透過処理した。その後、細胞をperm/washバッファーで洗浄し、氷上で30分間perm/washで希釈したPEラット抗ヒトCD184又はそのアイソタイプで染色した。次に、細胞を2回洗浄し、安定化固定液(BD Biosciences)で固定した。FACSDivaソフトウェアを使用して、10000個の細胞に対してBD FACS Canto II血球計算器で蛍光を測定した。FlowJoソフトウェアを用いてデータ分析を行った。抗CD90抗体による対照染色は、これらの実験条件におけるプロトコルの正確さを確認するものであった。
リアルタイムPCR
全RNAはTriPure単離試薬(ドイツ国マンハイムのRoche)を使用して、製造業者の指示に従って、4名のドナーから抽出した。簡潔には、1.5x106個の細胞をTriPure試薬中でホモジナイズし、クロロホルムと混合し、15秒間激しく振蕩して、12000 gで4℃にて15分間遠心分離した。上部の水相中のRNAをイソプロパノールで沈澱させ、75%エタノールで洗浄し、風乾して、RNAaseを含まない水に溶解した。NanoDrop 2000分光光度計(Thermo Scientific)で定量後、RNA試料を-80℃で保管した。高性能キット(Applied Biosystems)を使用する逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)によって1 μgの全RNAからcDNAを合成した。その後、製造業者による指示の通り、TaqMan(商標)アレイヒト細胞外マトリクス及び接着分子(Invitrogen)の各ウェルに10 ngのRT生成物を堆積させた。Applied Biosystems製StepOnePlusリアルタイムPCRシステムを使用してプレートを読み取った。
結果
ADHLSC細胞とHHALPCはいずれも、(それぞれ非GMP及びGMPの条件下で)正常な成人ヒト肝臓を使用して産生される凍結保存されたヒト初代肝臓細胞の調製物に由来し得ると共に、ADHLSC細胞、HHALPC及び肝細胞に共通する或る特定のマーカー、並びに間葉系幹細胞/間質細胞としてHHALPCを識別する他のマーカー(非特許文献9)を持つ、肝細胞様の活性及び形態を有する細胞へとin vitroで分化され得る細胞集団である。
しかしながら、肝疾患を含む多くの疾患に対するADHLSC細胞及びHHALPC等の間葉系幹/間質細胞(MSC)の治療の恩恵は、実際の生着のレベルに対するそれらのGMP調製物の効果に強く依存する(dependson)。かかる細胞は、生着レベルと関連する受容体の少なくとも幾つかを発現し、ローリング、強固な接着、及び内皮を通る遊出に対する様々な受容体に依存して、傷害された臓器において生着するため白血球及び造血幹細胞と類似する機構を共有することが知られている。細胞継代培養及び条件は、ヒトの使用に対する細胞調製物中にかかる受容体がどのように実際に存在し機能的であるかに影響を及ぼし得る。
HHALPCは、凍結保存及び臨床使用に先立って、GMP条件に対するコンプライアンス、改善された増殖速度及び集団倍加レベル、並びに品質規格へのコンプライアンス等の特定の製造及び品質基準を必要とする(すなわち、細胞は、機能性肝細胞へと分化する能力を維持しながら、生存可能で未分化のままでなければならず、陽性の/陰性のマーカーの所与の組み合わせを提示しなければならない)。幾つかの細胞培養パラメーターの最適化を必要とするこのアップスケーリングのプロセスをマルチトレースタック(例えば、Corning製CellStack)で最初に遂行した後、マルチプレートバイオリアクター(例えば、PALL Xpansion 10)に移し、均質な品質及び量のHHALPC等の肝前駆細胞を工業規模で提供することができることを確認した(Egloff M et al., 2013)。HHALPCを、(EGFの不在下で、接着を促進するため処理した)CellBIND(商標)プラスチック上、大量培養条件で培養し、5回継代して増殖させた後、5名の異なる肝臓ドナーから生成されたHHALPC(表1)を使用して、共刺激分子、サイトカイン/ケモカインレ受容体等を包含する200個を超えるヒト細胞表面マーカーのパネルに対するGMP調製物の効果を明らかにするため、BD Lyoplate(商標)キットを使用するフローサイトメトリーによって細胞表面タンパク質レベルで包括的にスクリーニングした。
5名全員のドナーに由来する細胞は、接着特性と共に、細胞表面の一連の間葉系マーカー、一連のテトラスパニン(プラスモジウム感染に対する肝細胞寛容を担うことから、特に関心がもたれるCD81を含む;Yalaoui S et al., 2008)、CD98等のアミノ酸トランスポーター、及び特定のケモカイン受容体(PDGFRベータに対応するCD140b)のみに対して陽性と測定され、一方で他のサイトカイン受容体はいずれもHHALPC細胞表面に露出されていないようである。いくつかの接着マーカー(CD54、CD164、CD165及びCD166)を含む他のマーカー、細胞表面受容体(CD95)、及び補体関連のタンパク質(CD46、CD55及びCD59)はより低いレベルであるが、それでも全ドナーで一貫して検出された(表1)。シグナルの強度は、他の細胞系統(造血細胞、上皮細胞、及び/又は内皮細胞)に対してHHALPCが非常に低レベルでCD45、CD117、CD34又はHLA-DR等の細胞表面マーカーを発現することを確認した。さらに、CD13、また興味深いことにADHLSC細胞と比較した場合にCellBINDの上での培養後に細胞表面での発現が強く増加されるように見えるCD105(非特許文献9)を含む少数の他のMSC/多能性マーカーは一貫して全てのドナーに亘って強く発現されたとわかった。
ADHLSC細胞としてのHHALPCは、全てのドナーに亘り、免疫応答誘導及び免疫調節(CD1、CD7、CD70、HLA-/-DR、CD27、CD28、CD40、CD80又はCD112等)に対して主な受容体を発現せず、それらの乏しい免疫原性表現型を確認した。これらの細胞は、全ドナーにおいて様々なレベルで幾つかの接着マーカー(CD26、CD49a、CD49d、CD58、CD61、CD71、CD142、CD146、CD201、CD340及びHLA-A/-B/-Cを含む;表1)を発現する。HHALPCと可変的に関連する上に定義されるそれらのマーカーは、(治療的使用又は特定の患者の)細胞の最終用途に応じて、HHALPCに見られる場合、陽性マーカー又は陰性マーカーのいずれかとして有用とされ得る。
表1:BD Lyoplateによって特定されるHHALPCの一般的特徴
以前にADHLSC細胞に対して特性が明らかにされた細胞表面マーカー(CD34、CD45、CD117、及びHLA-DR等)、又はADHLSC細胞ではなく免疫応答に対して特性が明らかにされた細胞表面マーカー(CD28、CD30、CD200、CD229、CD275、CD279、CD300、及びCD357を含む)を含めて、アッセイに含まれる他の細胞表面マーカーは、非常に低レベルで発現される又は陰性であると特徴づけられた。
また、HHALPCは、細胞表面タンパク質と関係しない一連の他のマーカー及び活性に対して陽性と測定され得る。特定の臨床上の適応症、及び製造プロセスの最適化のためHHALPCを使用する見通しにおいて、最初の基準は、細胞品質を特性評価すること、及びかかるプロセスの全工程(すなわち、初代肝臓細胞の選択、細胞培養条件、製剤化、貯蔵、及び/又は患者の選択)を最適化することを可能とする(細胞表面タンパク質、分泌タンパク質であるか、又は酵素活性と関係する)追加のマーカーの同定により改善され得る。このデータセットによれば、HHALPC及びヒト初代肝細胞の試料全体の追加のプロテオミクス/トランスクリプトミクスに基づく比較は、(例えば、BD Lyoplate(商標)キットに含まれるもの以外の細胞表面マーカーに抗体を使用することによって)単一のマーカー分析又は複数の並行分析のいずれかのレベルで、フローサイトメトリー、ELISA又は他の市販のキットを使用する際に検査され得る更に関連するマーカーを示唆し得る。
BDLyoplateの陰性データは、CD162(PSGL-1)、フコシルトランスフェラーゼ(fucosyltransferase)IV(SSEA-1)、又はそれらの表面上でE-セレクチンを結合するために必要なPSGL-1の四糖成分であるシアリル−ルイスX(SLeX)等のいくつかのマーカーに対してmRNAのレベルで確認された。CD44等の受容体に接着関連の糖を提供するかかる酵素の不在は、かかる受容体が細胞表面に発現されたとしても、おそらくは接着タンパク質として機能しないようにする。VLA-2(CD49b、コラーゲンに結合する)、VLA-3(CD49c、ラミニンに結合する)、及びVLA-5(CD49e、フィブロネクチンに結合する)等の他の受容体は、mRNAレベル及びフローサイトメトリーによって高レベルで見られる(図1A)。同じ観察は、VLA-4(そのベータサブユニットCD29のみが強く発現されて、そのアルファサブユニットCD49dは発現されないか、又はその細胞外ドメインの一部の喪失に結び付く細胞調製中の操作により)及び通常重要なCXCR4/CD184について確認されない。
CXCR4発現は、HSC及びMSCの生着/ホーミングプロセスに関与する重要なタンパク質である。傷害部位では、CXCR4は、放出されたSDF-1を結合して、臓器への細胞遊走を促進する(Marquez-Curtis LA and A Janowska-Wieczorek, 2013)。細胞注入中のCXCR4アンタゴニストAMD3100の使用は、急性的に傷害された腎臓へのMSCの遊走を阻害することが示された(Liu N et al., 2013)。しかしながら、CXCR4発現はMSC単離の後、急速に減少し、数回の継代の後、非常に少ない割合の細胞だけがCXCR4を発現するか、又は全く発現しないことが報告されている(Wynn RF etal, 2004)。実際に、MSCのin vitro増殖は、それらの表面にCXCR4が残らなくなるまで細胞を培養条件に適合する方法としてCXCR4の進行性の内部移行を誘導する(Pelekanos RA et al., 2014)。したがって、CXCR4の表面発現は、フローサイトメトリーによって各継代で評価され、細胞を透過処理しない場合、試験した全てのドナーが非常に低い表面受容体の発現を示したことがわかった。しかしながら、細胞が透過処理されると、細胞集団の大部分がCXCR4を発現し、細胞集団の大部分が既にCXCR4を内部移行させ始めたことを示唆した(図1B)。
幾つかの研究グループは、MSCホーミングを増強するためのキーポイントであるMSC表面上のCXCR4の外部移行(externalization)を誘導することを決定した。CXCR4を上方制御するためにバルプロ酸(Gul H et al., 2009)、SDF-1(Jones GN et al., 2012)又はサイトカインカクテル(Shi M et al., 2007)の存在下で培養する等の種々の方法が使用されてきた。しかしながら、サイトカインカクテルもSDF-1によるプレインキュベーションも、CXCR4の外部移行に何らの効果もないようであり、改善された生着特性を有するHHALPCの開発に対して他の機会を残した。
種々のタンパク質カテゴリーを越えて限られた数の細胞表面マーカーに対するHHALPCの強い陽性は、質、純度の判断のため、及び/又はそれらを作製する間及び/又はそれらの使用に先立ってHHALPCを同定するために抗CD140b、抗CD105、抗CD9、抗CD47、抗CD49c、抗CD49e、抗CD29、抗CD147、抗CD73、抗CD81、抗CD151、及び/又は抗CD98等の抗体を使用することを可能とする。文献(非特許文献9)に列挙される他の基準、及び(利用可能な場合は)最初の初代肝臓細胞調製物を提供したヒト被験体に関する臨床情報と共に、上に列挙される細胞表面マーカーの検出は、最も適切な治療的使用を更に最適化すること、及び/又はヒト被験体にHHALPCを投与することを可能とし得る。
異なるドナー由来の別のHHALPC調製物においてBD Lyoplateを使用することによって得られた知見は、それらのin vitro又はin vivoの使用と並んで、どの追加のマーカー及び生物学的活性をHHALPCと関連させることができるかを特定し、その後、それらのGMP製造を改善するための手引きを提供する。しかしながら、HHALPCの生着に重要な幾つかの接着性タンパク質の発現のパターンは、培養プロセスに起因し得る。複数の細胞表面マーカーの同定は、酵素、増殖因子、及び機能的な肝細胞によって本来発現される他のタンパク質(関連する障害によって冒された患者の場合、凝固、肝硬変又は線維症に関するもの等)又は遺伝子改変されたHHALPCによって適切に発現される非肝臓タンパク質(癌、糖尿病又は炎症性障害等の種々様々な適応症の治療において有用となり得る抗体又はホルモン等)のいずれかを全身送達するためかかる細胞を使用する可能性と並んで、どのGMP細胞培養条件が細胞生着を改善し得るかを特定することを支援することによって、肝活性化細胞による(或る特定の先天性代謝性肝障害若しくは急性/外傷性の大きな肝傷害における、又は肝移植の代替として)ヒト肝臓の再増殖を必要とする医療用途に対するHHALPC適合性を改善する。肝臓再増殖及び再生に関してHHALPCの投与を検証するための追加の前臨床のモデル及びアプローチは、文献(書籍"Liver Regeneration Basic Mechanisms, Relevant Models andClinical Applications", Edit. : Udayan M. Apte, Elsevier 2015を参照されたい)において概説されている。
実施例2:HHALPCの治療特性の確認
材料及び方法
HHALPCの調製及び尿素サイクル障害に冒された患者への投与
実施例1に示されるように、HHALPCを健康なヒト肝臓細胞懸濁液から産生し、5回の継代で増殖させた後、採取して、CryoStor-10(10%ジメチルスルホキシド)中で凍結保存し、液体窒素中に貯蔵した。使用前、HHALPCを解凍し、アルブミン溶液中で洗浄した後、50 mlのビニール袋中の重炭酸ナトリウム0.084、5%ヒトアルブミン及び500 IUヘパリン中に250×106個の細胞を含む細胞懸濁物としてGMP施設の無菌環境で製剤化した。放射線及び超音波による誘導のもと、0.5 mL/分〜2 mL/分の流速で、脾腸間膜コンフルエント(splenomesenteric confluent)にて、主門脈に対して右/左門脈の直接経肝穿刺により、全身麻酔のもと挿入された経皮経肝門脈カテーテルを経由してHHALPCを静脈内注入した。ビバリルジンによる中程度の抗凝固処置(StephenneX et al., 2012)のもと各注入を行い、続いて併用療法(尿素サイクル障害に対する各患者の免疫抑制療法及び通常の治療)を行った。
かかる障害に対する標準プロトコルに従って患者をモニターした。さらに、文献(Yudkoff M et al., 2010)に記載されるように、酢酸ナトリウム形態で患者が摂取した13C標識化前駆物質からの血漿中の尿素への13Cの取り込みを測定することによって実際の尿素サイクル活性を評価するため、安定な非放射性同位元素を使用して、in vivo尿素生成を判断した。
HHALPCの調製及び血友病に冒された患者への投与
HHALPCを実施例1及び上に記載されるように産生したが、それらの最終製剤化の前に一部を111-インジウム(111In)を使用して放射性標識化し、投与した。簡潔には、2500万個のHHALPCを0.9%NaCl 5 mLに懸濁し、20 μCi/1×106細胞の濃度の111In-DTPAと共に、穏やかに振蕩しながら室温で15分間インキュベートした。その後、細胞を洗浄し、標識効率を用量較正器(Capintec Radioisotope Calibrator CRC12)で測定し、次の通り計算した:[細胞からの放射能]/[(上清+細胞)からの放射能]×100。標識効率は79%と推定された。
HHALPC(放射性同位体で標識された又は標識されていない)は、グルコース(0.025 g/L、Stereop)、6.5mg/mL重炭酸ナトリウム(B52 Braun)、10 UI/mLヘパリン(LeoPharma)及び0.78%Lysomucyl(Zambon)で補足された5%ヒトアルブミン(Hibumine、Baxter)中に製剤化された。前腕に留置された末梢静脈内カテーテルを経由して、インジウムで標識化された2500万個の細胞の最初の1回の注入、その後、2週間ごとの2億5000万個の細胞の4回の注入によりHHALPCを注入した。心肺機能及び凝固パラメーターの臨床のモニタリングは、細胞注入中及び注入後に行われた。この注入期間の間、組み換え第VIII因子による予防的治療と標準免疫抑制(メチルプレドニソロン及びタクロリムスによる)の両方が行われた。トロンボエラストグラムを含む血液第VIII因子の投薬レベル及び凝固プロファイルは、生化学反応評価パラメーターとして採取された。患者の第VIII因子必要量及び臨床的出血の特徴を評価した。
注入の全期間中の動態獲得、及び細胞注入後の指定の時間点での全身画像化の獲得は、SPECT画像診断によって行なわれた。111In-DTPAシグナルの肝臓保持は、PMOD分析プログラムにより全身取り込みに対する目的の領域の比率として計算された。
結果
HHALPC投与は、損傷した肝臓組織の再構築(例えば、ウイルス感染症に起因する慢性又は急性の侵襲、毒性化合物への曝露、線維性障害、又は癌の場合)又は細胞内レベルで(例えば代謝機能に対する)若しくは細胞外区画において(例えば、肝臓組織内で免疫調節性活性、又は血液循環によってかかるタンパク質が輸送される組織において他の活性を発揮する分泌タンパク質として)それらの活性を発揮する機能性タンパク質を発現する肝臓細胞を必要とする一連の先天性又は後天性の障害に対する治療的解決策となる。患者の障害及び状態に応じて、HHALPCは、別の適切なアプローチを使用して作製され、製剤化され、投与され得る。
HHALPCの治療的有用性を臨床状況で試験したところ、HHALPCは目的の複数の特性を有する細胞治療製品であり、種々の様式の投与及び適応症に適していることが実証された。
第1の例として、HHALPC投与は、著しい医学的合併症と関連する先天性代謝性疾患である尿素サイクル障害を患い、患者及び家族に対して負担が重い限定的で対症的な治療を伴う患者において尿素生成を増加させることができる。細胞系療法は、少なくとも同種異型肝移植が実現可能となるまで、臨床経過を弱めるために十分な代謝性肝機能を提供することができる。
特徴が明らかなHHALPCを含む、GMPにより生産された医薬組成物は、門脈経路を経て注入され得る。異なる疾患、体重及び年齢の小児患者を含む最初の研究では、HHALPCを種々の投薬量で投与し(12.5×106細胞/kg〜200×106細胞/kg、1日間〜4日間に亘って注入回数が変化する)、数ヶ月間、一連の代謝性及び安全性の基準を測定した。特に尿素回路機能性に対するHHALPCの代謝効果を、標識化尿素前駆物質を使用して、in vivo尿素生成を測定することにより評価した。この疾患関連生物学的活性は、HHALPC投与によって積極的に影響を受けたように見え、窒素捕捉剤のような慢性で長期的な支持療法のもと既に患者によって許容されている(図2)。
更なる例は、結果的に、予防的で周期的な静脈内注射によって患者に投与される、凝固VIII因子の欠乏によって引き起こされるX連鎖出血性疾患(X-linked bleeding disorder)である、血友病Aである。かかる現在の標準治療は、損なわれた有効性及び治療費の増加を伴って、数名の患者における中和抗第VIII因子抗体の開発と関係する(出血性障害及びそれらの治療的管理に関する概説についてKabelA, 2014を参照されたい)。内因性に、かつ局所的に第VIII因子を提供することを可能とし、患者により少ない合併症、より長い反応の持続時間を提供し得る細胞に基づく治療が進行中である。肝臓それ自体が第VIII因子合成の主な部位であり、間葉系幹細胞が血友病の動物モデルにおいて出血を制御すると示されたことから、HHALPCのようにヒト肝臓に生着し、免疫抗原性が低い肝臓起源の前駆細胞は、少なくとも組み換え外因性第VIII因子の投与を減少させるために第VIII因子を血友病A患者に提供するため使用され得る。
右踝の身体障害を引き起こす出血性関節症の再発症状を伴う重症の血友病Aを患う患者(多量の第VIII因子の予防的注入にもかかわらず)を、HHALPCの静脈内投与によって治療した。HHALPCのような第VIII因子を自然発現する細胞のこの臨床的な静脈内注入を、通常の第VIII因子投与と平行して行い、関連する組織における生体分布と分析の両方のレベルで、患者によって必要とされる第VIII因子に対する効果を追跡した(followed)(図3)。注入中の画像化は、標識化HHALPCは最初に肺に捕捉されたが、その後急速に、1時間以内に細胞は肺及び脾臓を十分上回るレベルで肝臓においても検出されたことを示した。また興味深いことに、注入の4時間後に、患者において度重なる出血性関節症の部位であった右踝にHHALPCを検出することができ、HHALPCがこの障害も軽減する可能性を提供し得ることを示唆した。実際、患者の第VIII因子要求量は、出血症状があった場合のみ注射された第VIII因子を含むHHALPCの注射が終わった後、15週間で激減した。この応答期間の間、生化学的マーカーはいかなる有意な変化も示さなかったが、患者は、一般的には同じ結果のため5000 IUを注射し得るのに対し、事前の予防的第VIII因子の注入を行わずに身体活動を試みている間であっても、消散(resolution)のため患者が1000 IUの第VIII因子を必要とした関節血症の1回の症状で、はるかに少ない出血症状を観察した。患者は、予防的な第VIII因子注射がない状態で、出血症状を伴わず、より過酷な身体活動に取り組むことができる主観的な感覚を抱いた。
したがって、HHALPCは、代謝性の肝臓関連活性のみならず、例えば関節内の種々の場所で凝固性又は免疫調節性の作用を発揮することができる第VIII因子(又は他のタンパク質)等のタンパク質の分泌に関係する治療的効果を達成するための種々のレジメン、処方、及び臨床状況に応じて使用され得る製剤を提供し、直接的又は間接的にかかる場所をターゲッティングする他の薬物の使用を減少させる。
更なる例では、忍容性及び可能性のある副作用をモニターするため、並びに注入後の肝臓におけるHHALPCの分布を探索するため、尿素サイクル障害を患う患者においてHHALPCの静脈内投与を行った。HHALPCのバッチをGMP条件で生産し、アンモニア及びグルタミンの血中レベルの上昇と、低い血中レベルのアルギニン及びシトルリンとの組み合わせを伴うOTC欠乏症を患う患者に投与した。
患者は、940×106個の前駆細胞(16.3×106細胞/体重kg)(1回の投与当たり235×106個の細胞)を受けた。細胞の生存率は、再構成直後に判断され、84%〜88%の範囲であった。HHALPCを末梢カテーテルにより静脈内に注入した。血栓症の予防手段としてのビバリルジン(1.75 mg/kg/時間)と平行して各注入処置の間に、静脈内グルコースを投与した。ACT測定(新鮮な全血に対して測定された活性化凝固時間)を各注入段階で収集したが、異常なACT値は注入中に記録されなかった(全てのACT値は350秒未満)。患者に与えられた免疫抑制治療は、1.5 mgの一日量のエベロリムス(Certican)を含んだ。
注入期間の直後、アンモニア血中レベルは2ヶ月の期間安定していた。その後、患者はより高い血漿レベルのアンモニアを示す傾向にあったが、グルタミン血中レベルはより長期に亘って正常化された(図4)。細胞注入後の臨床評価は、幾つかの臨床上の改善を明らかにした。最初の注入の5ヶ月後、研究者らによって、その患者はその女性患者自身によって報告された疲労症状の減少に対してより動的な(dynamic)反応を示すと評した。
したがって、HHALPCに基づく治療による臨床上の改善は、異なる病理に対して、また異なる投与方法、レジメン、及び投薬量の使用に対して示された。
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