JP2019213529A - 修飾ヘリカーゼ - Google Patents

Abstract

【課題】ポリヌクレオチドからの解離が低減している修飾ヘリカーゼの提供。【解決手段】１つまたは複数の単量体から形成され、少なくとも１つのコンホメーション状態において、それを通ってポリヌクレオチドがヘリカーゼから解離できる開口部を含むポリヌクレオチド結合ドメインを含むヘリカーゼであって、ヘリカーゼの同じ単量体内の２つ以上の部分が繋がれて開口部のサイズを低減するように修飾されており、ポリヌクレオチドの移動を制御する能力を保持しているヘリカーゼ。【選択図】なし

Description

本発明は、ポリヌクレオチドからの解離が低減している修飾ヘリカーゼに関する。ヘリ
カーゼはポリヌクレオチドの移動を制御するために使用でき、ポリヌクレオチドを配列決
定するために特に有用である。

迅速で安価なポリヌクレオチド（例えばＤＮＡまたはＲＮＡ）配列決定および同定技術
が、幅広い応用にわたって現在必要である。既存の技術は、主にそれらが、大量のポリヌ
クレオチドを生成するための増幅技術に依存し、シグナル検出のために多量の専門的な蛍
光化学物質を必要とするために、遅く高価である。

膜貫通ポア（ナノポア）は、ポリマーおよび種々の小分子のための直接的、電気的バイ
オセンサーとして大きな将来性を有する。特に、将来性のあるＤＮＡ配列決定技術として
ナノポアが近年注目されている。

電位がナノポア全体に印加される場合、ヌクレオチドなどの分析物が一定時間バレルに
一過的に存在する場合に電流が変化する。ヌクレオチドのナノポア検出は、既知のサイン
および持続時間での電流変化をもたらす。「鎖配列決定」法では、１本のポリヌクレオチ
ド鎖がポアを通り、ヌクレオチドのアイデンティティが得られる。鎖配列決定は、ポアを
通るポリヌクレオチドの移動を制御するためのヘリカーゼなどのヌクレオチドハンドリン
グタンパク質の使用を含み得る。

ヘリカーゼは、ポリヌクレオチドに結合し、移動を制御できる酵素である。Ｈｅｌ３０
８ヘリカーゼを含むいくつかのヘリカーゼは、少なくとも１つのコンホメーション状態で
、それを通ってポリヌクレオチドがヘリカーゼに結合または解離できる開口部を有するポ
リヌクレオチド結合ドメインを有する。それにより、ヘリカーゼがポリヌクレオチドの末
端に位置していない場合でも、ヘリカーゼがポリヌクレオチドから離れることが可能にな
る。

本発明者らは、ポリヌクレオチドの移動を制御するヘリカーゼの能力が、それを通って
ポリヌクレオチドが解離する開口部のサイズを低減させることによって改善できることを
驚くべきことに実証した。具体的にはポリヌクレオチドの移動を制御するヘリカーゼの能
力は、開口部を閉じることによって改善できる。本発明によれば、ヘリカーゼの少なくと
も２つの部分を繋ぐことにより、開口部のサイズは低減され、または開口部は閉鎖される
。

開口部のサイズの低減または開口部の閉鎖がヘリカーゼのポリヌクレオチドへの結合を
妨げないことから、この結果は驚くべきものである。本発明により修飾されたヘリカーゼ
がポリヌクレオチドに結合すると、解離することも離されることもなく全てではないが大
部分のポリヌクレオチドの移動を制御できる。具体的には本発明者らは、本発明により修
飾されたヘリカーゼが４００ヌクレオチド以上を含むポリヌクレオチドなどの長いポリヌ
クレオチドに強く結合し、全てではないが大部分のポリヌクレオチドの移動を制御するこ
とを驚くべきことに実証した。これは、ポリヌクレオチドの移動の有効な制御を、特に鎖
配列決定法の際に可能にする。

本発明者らは、ポリヌクレオチドの移動を制御するＨｅｌ３０８ヘリカーゼの能力が特
異的位置に１つもしくは複数のシステイン残基および／または１つもしくは複数の非天然
アミノ酸を導入することによって改善できることを驚くべきことに実証した。導入される
残基が繋がれているかどうかに関わらず、修飾Ｈｅｌ３０８ヘリカーゼは、解離するまた
は離されることなく全てではないが大部分のポリヌクレオチドの移動を制御できる。

したがって本発明は、１つまたは複数の単量体から形成され、少なくとも１つのコンホ
メーション状態において、それを通ってポリヌクレオチドがヘリカーゼから解離できる開
口部を含むポリヌクレオチド結合ドメインを含むヘリカーゼであって、ヘリカーゼの同じ
単量体内の２つ以上の部分が繋がれて開口部のサイズを低減するように修飾されており、
ポリヌクレオチドの移動を制御する能力を保持しているヘリカーゼを提供する。

本発明は、
− １つもしくは複数のシステイン残基および／または１つもしくは複数の非天然アミノ
酸がＨｅｌ３０８Ｍｂｕ（配列番号１０）中のＤ２７２、Ｎ２７３、Ｄ２７４、Ｇ２８１
、Ｅ２８４、Ｅ２８５、Ｅ２８７、Ｓ２８８、Ｔ２８９、Ｇ２９０、Ｅ２９１、Ｄ２９３
、Ｔ２９４、Ｎ３００、Ｒ３０３、Ｋ３０４、Ｎ３１４、Ｓ３１５、Ｎ３１６、Ｈ３１７
、Ｒ３１８、Ｋ３１９、Ｌ３２０、Ｅ３２２、Ｒ３２６、Ｎ３２８、Ｓ６１５、Ｋ７１７
、Ｙ７２０、Ｎ７２１およびＳ７２４に対応する位置の１つまたは複数に導入されている
Ｈｅｌ３０８ヘリカーゼであって、ポリヌクレオチドの移動を制御する能力を保持してい
るＨｅｌ３０８ヘリカーゼ；
− 本発明のヘリカーゼおよび追加的ポリヌクレオチド結合成分を含む構築物であって、
ヘリカーゼがポリヌクレオチド結合成分に付着しており、ポリヌクレオチドの移動を制御
する能力を有する構築物；
− ポリヌクレオチドの移動を制御する方法であって、ポリヌクレオチドを本発明のヘリ
カーゼまたは本発明の構築物と接触させ、それによりポリヌクレオチドの移動を制御する
ステップを含む方法；
− 標的ポリヌクレオチドを特性決定する方法であって、（ａ）標的ポリヌクレオチドを
膜貫通ポアおよび本発明のヘリカーゼまたは本発明の構築物と、ヘリカーゼまたは構築物
がポアを通る標的ポリヌクレオチドの移動を制御するように接触させるステップ、ならび
に（ｂ）ポリヌクレオチドがポアに関して移動するときに１つまたは複数の測定値を取る
ステップであって、測定値が標的ポリヌクレオチドの特性の１つまたは複数を示し、それ
により標的ポリヌクレオチドを特性決定するステップを含む方法；
− 標的ポリヌクレオチドを特性決定するためのセンサーを形成する方法であって、（ａ
）ポアと、（ｂ）本発明のヘリカーゼまたは本発明の構築物との間で複合体を形成し、そ
れにより標的ポリヌクレオチドを特性決定するためのセンサーを形成するステップを含む
方法；
− （ａ）ポアと、（ｂ）本発明のヘリカーゼまたは本発明の構築物との間の複合体を含
む、標的ポリヌクレオチドを特性決定するためのセンサー；
− ポアを通る標的ポリヌクレオチドの移動を制御するための本発明のヘリカーゼまたは
本発明の構築物の使用；
− （ａ）ポア、および（ｂ）本発明のヘリカーゼまたは本発明の構築物を含む、標的ポ
リヌクレオチドを特性決定するためのキット；
− （ａ）複数のポア、および（ｂ）複数の本発明のヘリカーゼまたは複数の本発明の構
築物を含む、試料中の標的ポリヌクレオチドを特性決定するための装置；
− 本発明のヘリカーゼを産生する方法であって、（ａ）１つまたは複数の単量体から形
成され、それを通ってポリヌクレオチドがヘリカーゼから解離できる開口部を含むポリヌ
クレオチド結合ドメインを含むヘリカーゼを提供するステップ、および（ｂ）ヘリカーゼ
の同じ単量体上の２つ以上の部分が繋がれて開口部のサイズを低減するようにヘリカーゼ
を修飾し、それにより本発明のヘリカーゼを産生するステップを含む方法；
− 本発明の修飾Ｈｅｌ３０８ヘリカーゼを産生する方法であって、（ａ）Ｈｅｌ３０８
ヘリカーゼを提供するステップ、ならびに（ｂ）１つもしくは複数のシステイン残基およ
び／または１つもしくは複数の非天然アミノ酸をＨｅｌ３０８Ｍｂｕ（配列番号１０）中
のＤ２７２、Ｎ２７３、Ｄ２７４、Ｇ２８１、Ｅ２８４、Ｅ２８５、Ｅ２８７、Ｓ２８８
、Ｔ２８９、Ｇ２９０、Ｅ２９１、Ｄ２９３、Ｔ２９４、Ｎ３００、Ｒ３０３、Ｋ３０４
、Ｎ３１４、Ｓ３１５、Ｎ３１６、Ｈ３１７、Ｒ３１８、Ｋ３１９、Ｌ３２０、Ｅ３２２
、Ｒ３２６、Ｎ３２８、Ｓ６１５、Ｋ７１７、Ｙ７２０、Ｎ７２１およびＳ７２４に対応
する位置の１つまたは複数に導入し、それにより本発明の修飾Ｈｅｌ３０８ヘリカーゼを
産生するステップを含む方法；ならびに
− 本発明の構築物を産生する方法であって、本発明のヘリカーゼを追加的ポリヌクレオ
チド結合成分に付着させ、それにより本発明の構築物を産生するステップを含む方法
も提供する。

Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃ）−ビスマレイミドＰＥＧ３反応混合物（ビスマレイミドＰＥＧ３リンカーによって繋がれ、変異Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃを有する配列番号１０）のクーマシー染色７．５％Ｔｒｉｓ−ＨＣｌゲル（Ｌａｅｍｍｌｉローディング緩衝液で添加された）を示す図である。レーンＸは適切なタンパク質ラダー（質量単位マーカーはゲルの左に示されている）を示す。レーンａ〜ｃは、２μＬ、５μＬまたは１０μＬの約２．５μＭ Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃ）単量体（変異Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃを有する配列番号１０）を含有する。レーンｄ〜ｆは２μＬ、５μＬまたは１０μＬの約２．５μＭ Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃ）−ビスマレイミドＰＥＧ３（ビスマレイミドＰＥＧ３リンカーによって繋がれ、変異Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃを有する配列番号１０、すなわち開口部が閉じられているヘリカーゼ）を含有し、ビスマレイミドＰＥＧ３リンカーを付着させる反応がほとんど１００％収率に進んだことはゲルから明らかであった。矢印１は、Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃ）単量体（変異Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃを有する配列番号１０）に対応し、矢印２はＨｅｌ３０８Ｍｂｕ（Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃ）−ビスマレイミドＰＥＧ３（ビスマレイミドＰＥＧ３リンカーによって繋がれ、変異Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃを有する配列番号１０、すなわち開口部が閉じられているヘリカーゼ）に対応する。 Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃ）−ｍａｌ−ｐｅｐ−ｍａｌ（ビスマレイミドペプチドリンカー（マレイミド−プロピル−ＳＲＤＦＷＲＳ（配列番号１０９）−（１，２−ジアミノエタン）−プロピル−マレイミド）によって繋がれ、変異Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃを有する配列番号１０）反応混合物のクーマシー染色７．５％ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌゲルを示す図である。レーンＸは適切なタンパク質ラダー（質量単位マーカーはゲルの左に示されている）を示す。レーンＡは５μＬの約１０μＭ Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃ）−ビスマレイミドＰＥＧ３（ビスマレイミドＰＥＧ３リンカーによって繋がれ、変異Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃを有する配列番号１０）を基準として含有する。上のバンド（２と標識）はＨｅｌ３０８Ｍｂｕ（Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃ）−ビスマレイミドＰＥＧ３に対応し、下のバンド（１と標識）はＨｅｌ３０８Ｍｂｕ（Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃ）（変異Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃを有する配列番号１０）に対応する。レーンＢは５μＬの約１０μＭ Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃ）−ｍａｌ−ｐｅｐ−ｍａｌ（ビスマレイミドペプチドリンカー（マレイミド−プロピル−ＳＲＤＦＷＲＳ−（１，２−ジアミノエタン）−プロピル−マレイミド）によって繋がれ、変異Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃを有する配列番号１０）を含有し、Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃ）−ｍａｌ−ｐｅｐ−ｍａｌ（ビスマレイミドペプチドリンカー（マレイミド−プロピル−ＳＲＤＦＷＲＳ−（１，２−ジアミノエタン）−プロピル−マレイミド）によって繋がれ、変異Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃを有する配列番号１０）（上のバンド）およびＨｅｌ３０８Ｍｂｕ（Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃ）（変異Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃを有する配列番号１０）（下のバンド）に対するバンドが観察されることから、ｍａｌ−ｐｅｐ−ｍａｌリンカーに付着する反応が完了まで進まなかったことはゲルから明らかであった。レーンＣはＨｅｌ３０８Ｍｂｕ（Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃ）（変異Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃを有する配列番号１０）を含有する。 開口部が閉鎖されている２つのＨｅｌ３０８Ｍｂｕヘリカーゼ（Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃ）−ビスマレイミドＰＥＧ１１（ビスマレイミドＰＥＧ１１リンカーによって繋がれ、変異Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃを有する配列番号１０）およびＨｅｌ３０８Ｍｂｕ（Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃ）−ビスマレイミドＰＥＧ３（ビスマレイミドＰＥＧ３リンカーによって繋がれ、変異Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃを有する配列番号１０））の酵素前進性（processivity）をＨｅｌ３０８Ｍｂｕ単量体（配列番号１０）のものと比較するために使用した蛍光アッセイを示す図である。通例の蛍光基質がハイブリダイズされたｄｓＤＮＡを置換するヘリカーゼの能力をアッセイするために用いられた。蛍光基質（最終５０ｎＭ）は３’ｓｓＤＮＡオーバーハングならびにハイブリダイズされたｄｓＤＮＡ（セクションＡ、配列番号１１０、１と標識）の８０および３３塩基対セクションを有する。主要な下部「テンプレート」鎖は、５’および３’末端でそれぞれカルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ、４と標識）およびブラックホールクエンチャー（ＢＨＱ−１、５と標識）塩基（配列番号１１２）で標識されている３’オーバーハングおよび３３ｎｔ蛍光プローブ（３と標識）に隣接して、８０ｎｔ「ブロッカー」鎖（配列番号１１１、２と標識）にハイブリダイズされる。ハイブリダイズされると、ＦＡＭはＢＨＱ−１から離れ、基質は基本的に蛍光を発する。セクションＢに示すとおり、ＡＴＰ（１ｍＭ）およびＭｇＣｌ_２（１０ｍＭ）の存在下でヘリカーゼ（６と標識、１０ｎＭ）は、基質の３’オーバーハング（配列番号１１０）に結合し、下鎖に沿って移動し８０ｎｔブロッカー鎖（配列番号１１１）を置換し始める。前進性の場合、ヘリカーゼは、蛍光プローブも置換する（セクションＣ、配列番号１１２、カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）で５’末端で、ブラックホールクエンチャー（ＢＨＱ−１）で３’末端で標識されている）。蛍光プローブは、その５’および３’末端が自己相補的であり、それにより一度置換されると動力学的に安定なヘアピンを形成しプローブのテンプレート鎖（セクションＤ）への再アニールを防ぐように設計される。ヘアピン産物の形成により、ＦＡＭはＢＨＱ−１の近傍に運ばれ、その蛍光は消光される。８０塩基長「ブロッカー」（配列番号１１１）および蛍光（配列番号１１２、カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）でその５’末端、ブラックホールクエンチャー（ＢＨＱ−１）でその３’末端で標識されている）鎖を置換できる前進性酵素は、したがって、蛍光の経時的な減少をもたらす。しかし酵素が８０ｎｔ未満の前進性を有する場合は、蛍光鎖（配列番号１１２、カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）でその５’末端で、ブラックホールクエンチャー（ＢＨＱ−１）でその３’末端で標識されている）を置換することができず、したがって「ブロッカー」鎖（配列番号１１１）は主要な下部鎖に再アニールする（セクションＥ）。 制御目的にも用いられた追加的な通例の蛍光基質を示す図である。陰性対照として使用された基質は、図３に記載のものと同一であったが、３’オーバーハングを欠失している（セクションＡ（配列番号１１１（図中２と標識）、１１２（図中３と標識の鎖、その５’末端をカルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ、図中４と標識）で、その３’末端をブラックホールクエンチャー（ＢＨＱ−１、図中５と標識）で標識されている）ならびに図中７と標識の１１３））。図３に記載のものに類似しているが８０塩基対セクション（配列番号１１２（図中３と標識の鎖、その５’末端をカルボキシフルオレセイン（図中４と標識のＦＡＭ）で、およびその３’末端をブラックホールクエンチャー（ＢＨＱ−１、図中５と標識）で標識されている）ならびに図中８と標識の１１４）を欠失している基質が活性だが前進性である必要はないヘリカーゼの陽性対照として用いられた（セクションＢ）。 Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ、Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃ）−ビスマレイミドＰＥＧ１１（ビスマレイミドＰＥＧ１１リンカーによって繋がれ、変異Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃを有する配列番号１０）およびＨｅｌ３０８Ｍｂｕ（Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃ）−ビスマレイミドＰＥＧ３（ビスマレイミドＰＥＧ３リンカーによって繋がれ、変異Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃを有する配列番号１０）を、緩衝溶液（４００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ８．０、１ｍＭ ＡＴＰ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、５０ｎＭ蛍光基質ＤＮＡ（配列番号１１０、１１１および１１２（その５’末端をカルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）で、およびその３’末端をブラックホールクエンチャー（ＢＨＱ−１）で標識された）中の図３に示す前進性基質に対して検査した際の時間依存性蛍光変化のグラフ（ｙ軸標識＝正規化された蛍光（無作為値）、ｘ軸標識＝時間（分））である。黒菱形で印を付けたデータ点は緩衝液ブランクに対応し、白四角データ点はＨｅｌ３０８Ｍｂｕ単量体（配列番号１０）に対応し、黒十字データ点はＨｅｌ３０８Ｍｂｕ（Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃ）−ビスマレイミドＰＥＧ１１（ビスマレイミドＰＥＧ１１リンカーによって繋がれ、変異Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃを有する配列番号１０）に対応し、および白丸データ点はＨｅｌ３０８Ｍｂｕ（Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃ）−ビスマレイミドＰＥＧ３（ビスマレイミドＰＥＧ３リンカーによって繋がれ、変異Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃを有する配列番号１０）に対応する。Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃ）−ビスマレイミドＰＥＧ１１（ビスマレイミドＰＥＧ１１リンカーによって繋がれ、変異Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃを有する配列番号１０）およびＨｅｌ３０８Ｍｂｕ（Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃ）−ビスマレイミドＰＥＧ３（ビスマレイミドＰＥＧ３リンカーによって繋がれ、変異Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃを有する配列番号１０）によって示された蛍光の減少は、Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ単量体（配列番号１０）と比較したこれらの複合体の前進性の増大を記す。 Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（配列番号１０）、Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃ）−ビスマレイミドＰＥＧ１１（ビスマレイミドＰＥＧ１１リンカーによって繋がれ、変異Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃを有する配列番号１０）およびＨｅｌ３０８Ｍｂｕ（Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃ）−ビスマレイミドＰＥＧ３（ビスマレイミドＰＥＧ３リンカーによって繋がれ、変異Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃを有する配列番号１０）を、緩衝溶液（４００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ８．０、１ｍＭ ＡＴＰ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、５０ｎＭ蛍光基質ＤＮＡ（配列番号１１２（その５’末端をカルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）で、およびその３’末端をブラックホールクエンチャー（ＢＨＱ−１）で標識された）および１１４））中の陽性対照前進性基質（図４セクションＢに示す、配列番号１１２（その５’末端をカルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）で、およびその３’末端をブラックホールクエンチャー（ＢＨＱ−１）で標識された）および６０）に対して検査した際の時間依存性蛍光変化のグラフ（ｙ軸標識＝正規化された蛍光（無作為値）、ｘ軸標識＝時間（分））である。黒菱形で印を付けたデータ点は緩衝液ブランクに対応し、白四角データ点はＨｅｌ３０８Ｍｂｕ単量体（配列番号１０）に対応し、黒十字データ点はＨｅｌ３０８Ｍｂｕ（Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃ）−ビスマレイミドＰＥＧ１１（ビスマレイミドＰＥＧ１１リンカーによって繋がれ、変異Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃを有する配列番号１０）に対応し、および白丸データ点はＨｅｌ３０８Ｍｂｕ（Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃ）−ビスマレイミドＰＥＧ３（ビスマレイミドＰＥＧ３リンカーによって繋がれ、変異Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃを有する配列番号１０）に対応する。この陽性対照は、全ての試料に対する蛍光減少によって示されたとおり、全ての複合体が実際に活性であることを実証した。 膜中のナノポアを通るポリヌクレオチドの酵素制御移行の模式図であって、酵素は印加された場の力とは反対にポリヌクレオチドの移動を制御する。模式図は、３’から５’酵素（Ａと標識）の例を示し、ポア中の５’末端でのポリヌクレオチドの捕捉は、印加された場の力とは反対のポリヌクレオチドの酵素制御移動（実施例４において使用されるポリヌクレオチド配列は配列番号１１５（図７においてＢと標識）、配列番号１１６（図７においてＣと標識）および配列番号１１７（図７においてＤと標識）である）を導く。ＤＮＡ捕捉の際にハイブリダイズされた鎖は開かれる。矢印１はナノポアを通るＤＮＡ移動の方向を記し、白矢印２はＤＮＡに沿った酵素移動の方向を記し、矢印３は印加された場の方向を記す。酵素がＤＮＡから解離しない限り膜のｃｉｓ側に最終的に放されるまで酵素は、ポアの外側にＤＮＡを引く。 膜中のナノポアを通るポリヌクレオチドの酵素制御移行の模式図であって、酵素は印加された場の力と同じ方向にポリヌクレオチドの移動を制御する。模式図は、３’から５’酵素（Ａと標識）の例を示し、ポア中の３’末端でのポリヌクレオチドの捕捉は、印加された場の力でのポリヌクレオチドの酵素制御移動を導く。矢印１はナノポアを通るＤＮＡ移動の方向を記し、白矢印２はＤＮＡに沿った酵素移動の方向を記し、矢印３は印加された場の方向を記す。酵素がＤＮＡから解離しない限り、膜のｔｒａｎｓ側に最終的に放されるまで酵素はポアを通してＤＮＡを供給する。 実施例４において使用されるＤＮＡ基質設計を示す図である。９００塩基長センス鎖（配列番号１１５）はＡと標識され、４塩基対少ないリーダー（配列番号１１６）であるアンチセンス鎖はＢと標識され、プライマー（配列番号１１７）はＣと標識される。プライマーはＤと標識される３’コレステロールタグを有する。 Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ単量体（２００ｎＭ、配列番号１０）を使用して、ヘリカーゼがＭｓｐＡナノポア（ＭＳ（Ｂ１−Ｇ７５Ｓ／Ｇ７７Ｓ／Ｌ８８Ｎ／Ｑ１２６Ｒ）８ＭｓｐＡ（変異Ｇ７５Ｓ／Ｇ７７Ｓ／Ｌ８８Ｎ／Ｑ１２６Ｒを有する配列番号２）を通るＤＮＡの移行を制御する場合に観察された電流トレース例を示す図である（＋１４０ｍＶ、４００ｍＭ ＮａＣｌ、１００ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ８．０、１０ｍＭフェロシアン化カリウム、１０ｍＭフェリシアン化カリウム、０．１ｎＭ ９００塩基長ＤＮＡ（配列番号１１５、１１６および１１７（配列の３’末端に２個のチミン残基に付着している６個のｉＳｐ１８スペーサーおよび３’コレステロールＴＥＧを有する））、１ｍＭ ＡＴＰ、１ｍＭ ＭｇＣｌ_２）。最も上の電気トレース（ｙ軸標識＝電流（ｐＡ）、ｘ軸標識＝時間（分））は、ＤＮＡが印加された電位（＋１４０ｍＶ）の力の下で捕捉された場合にオープンポア電流（約１２０ｐＡ）がＤＮＡレベル（２０〜５０ｐＡ）へ低下することを示す。酵素が付着しているＤＮＡは、酵素がＤＮＡをポアを通して移動させるときに電流における段階的変化を示す長期遮断を生じる。上のトレースは、Ａ〜Ｈと印を付けた一連の８個の別々のヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動を示す。トレースのこのセクションにおける全てのヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動は、酵素によって場とは反対に（ＤＮＡは５’を下に捕捉される）ナノポアを通って移動される（詳細は図７を参照されたい）。下は、ＤＮＡがナノポアを出たときの４個のヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動の最後のセクションの拡大である。このセクションにおける８個のヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動の内、１つ（Ｈ）だけが酵素がＤＮＡの末端に達し、ＤＮＡ基質の５０Ｔ５’−リーダーをポア（^＊と標識）を通して移動させたことを示す特徴的な長いポリＴレベルで終わっている。Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（配列番号１０）での完全な実行において、ヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動の約３０％がポリＴで終わることが見出された（ｎ＝１９ 本実験におけるヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動）。 Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃ）−ビスマレイミドＰＥＧ３（１０ｎＭ、ビスマレイミドＰＥＧ３リンカーによって繋がれ、変異Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃを有する配列番号１０）を使用して、ヘリカーゼがＭｓｐＡナノポア（ＭＳ（Ｂ１−Ｇ７５Ｓ／Ｇ７７Ｓ／Ｌ８８Ｎ／Ｑ１２６Ｒ）８ＭｓｐＡ（変異Ｇ７５Ｓ／Ｇ７７Ｓ／Ｌ８８Ｎ／Ｑ１２６Ｒを有する配列番号２）を通るＤＮＡの移行を制御する場合に観察された電流トレース例を示す図である（＋１４０ｍＶ、４００ｍＭ ＮａＣｌ、１００ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ８．０、１０ｍＭフェロシアン化カリウム、１０ｍＭフェリシアン化カリウム、０．０５ｎＭ ９００塩基長ＤＮＡ（配列番号１１５、１１６および１１７（配列の３’末端に２個のチミン残基に付着している６個のｉＳｐ１８スペーサーおよび３’コレステロールＴＥＧを有する））、２ｍＭ ＡＴＰ、２ｍＭ ＭｇＣｌ_２）。最も上の電気トレース（ｙ軸標識＝電流（ｐＡ）、ｘ軸標識＝時間（分））は、ＤＮＡが印加された電位（＋１４０ｍＶ）の力の下で捕捉された場合にオープンポア電流（約１１５ｐＡ）がＤＮＡレベル（１５〜４０ｐＡ）へ低下することを示す。酵素が付着しているＤＮＡは、酵素がＤＮＡをポアを通して移動させるときに電流における段階的変化を示す長期遮断を生じる。上のトレースは、Ａ〜Ｈと印を付けた一連の８個の別々のヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動を示す。トレースのこのセクションにおける全てのヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動は、酵素によって場とは反対に（ＤＮＡは５’を下に捕捉される）ナノポアを通って移動される（詳細は図７を参照されたい）。下は、ＤＮＡがナノポアを出たときの４個のヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動の最後のセクションの拡大である。このセクションにおける８個のヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動の内、どれもが酵素がＤＮＡの末端に達し、ＤＮＡ基質の５０Ｔ５’−リーダーをポア（^＊と標識）を通して移動させたことを示す特徴的な長いポリＴレベルで終わる。Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃ）−ビスマレイミドＰＥＧ３（ビスマレイミドＰＥＧ３リンカーによって繋がれ、変異Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃを有する配列番号１０）での完全な実行において、場と反対（５’が下）のヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動の約８５％がポリＴで終わることが見出された（ｎ＝２７ 本実験におけるヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動）。 Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃ）−ビスマレイミドＰＥＧ３（１０ｎＭ、ビスマレイミドＰＥＧ３リンカーによって繋がれ、変異Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃを有する配列番号１０）を使用して、ヘリカーゼがＭｓｐＡナノポア（ＭＳ（Ｂ１−Ｇ７５Ｓ／Ｇ７７Ｓ／Ｌ８８Ｎ／Ｑ１２６Ｒ）８ＭｓｐＡ（変異Ｇ７５Ｓ／Ｇ７７Ｓ／Ｌ８８Ｎ／Ｑ１２６Ｒを有する配列番号２）を通るＤＮＡの移行を制御する場合に観察された電流トレース例を示す図である（＋１４０ｍＶ、４００ｍＭ ＮａＣｌ、１００ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ８．０、１０ｍＭフェロシアン化カリウム、１０ｍＭフェリシアン化カリウム、０．０５ｎＭ ９００塩基長ＤＮＡ（配列番号１１５、１１６および１１７（配列の３’末端に２個のチミン残基に付着している６個のｉＳｐ１８スペーサーおよび３’コレステロールＴＥＧを有する））、２ｍＭ ＡＴＰ、２ｍＭ ＭｇＣｌ_２）。最も上の電気トレース（ｙ軸標識＝電流（ｐＡ）、ｘ軸標識＝時間（分））は、ＤＮＡが印加された電位（＋１４０ｍＶ）の力の下で捕捉された場合にオープンポア電流（約１２０ｐＡ）がＤＮＡレベル（１５〜４０ｐＡ）へ低下することを示す。酵素が付着しているＤＮＡは、酵素がＤＮＡをポアを通して移動させるときに電流における段階的変化を示す長期遮断を生じる。上のトレースは、Ａ〜Ｄと印を付けた一連の４個の別々のヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動を示す。トレースのこのセクションにおける全てのヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動は、酵素によって場に沿って（ＤＮＡは３’を下に捕捉される）ナノポアを通って移動される（詳細は図８を参照されたい）。下は、ＤＮＡがナノポアを出たときのヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動の最後のセクションの拡大である。３’が下のＤＮＡは、配列関係に対して異なる電流および異なる変動を伴って５’が下のＤＮＡとは特徴的に異なるサインを示す。このセクションにおける４個のヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動の内、どれもが酵素がＤＮＡの末端に達し、ＤＮＡ基質の５０Ｔ５’−リーダーをポア（^＊と標識）を通して移動させたことを示す特徴的な長いポリＴレベルで終わる。Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃ）−ビスマレイミドＰＥＧ３（ビスマレイミドＰＥＧ３リンカーによって繋がれ、変異Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃを有する配列番号１０）での完全な実行において、場に沿った（３’が下）のヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動の約８７％がポリＴで終わることが見出された（ｎ＝１５ 本実験におけるヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動）。 Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃ）−ｍａｌ−ｐｅｐ−ｍａｌ（ビスマレイミドペプチドリンカー（マレイミド−プロピル−ＳＲＤＦＷＲＳ（配列番号１０９）−（１，２−ジアミノエタン）−プロピル−マレイミド）によって繋がれ、変異Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃを有する配列番号１０）を使用して、ヘリカーゼがＭｓｐＡナノポア（ＭＳ（Ｂ１−Ｇ７５Ｓ／Ｇ７７Ｓ／Ｌ８８Ｎ／Ｑ１２６Ｒ）８ＭｓｐＡ（変異Ｇ７５Ｓ／Ｇ７７Ｓ／Ｌ８８Ｎ／Ｑ１２６Ｒを有する配列番号２）を通るＤＮＡの移行を制御する場合に観察された電流トレース例（上および下のトレースについてｙ軸＝電流（ｐＡ）、ｘ軸＝時間（秒））を示す図である（＋１２０ｍＶ、（６２５ｍＭ ＫＣｌ、１００ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、７５ｍＭフェロシアン化カリウム（ＩＩ）、２５ｍＭフェリシアン化カリウム（ＩＩＩ）、ｐＨ８．０、０．５ｎＭ ＤＮＡ（配列番号１２７、その３’末端が４つのｉＳｐＣ３スペーサーに、その最後が配列番号１２８の５’末端に付着している）１ｍＭ ＡＴＰ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２）。最も上の電気トレースは、ＤＮＡが印加された電位（＋１２０ｍＶ）の力の下で捕捉された場合にオープンポア電流（約４００ｐＡ）がＤＮＡレベル（２５０〜２２０ｐＡ）へ低下することを示す。酵素が付着しているＤＮＡは、酵素がＤＮＡをポアを通して移動させるときに電流における段階的変化を示す長期遮断を生じる。下のトレースは、上のトレースの領域を拡大したものである。 ＴｒｗＣ Ｃｂａ−Ｎ６９１Ｃ／Ｑ３４６Ｃ−ｍａｌ−ＰＥＧ１１−ｍａｌ（ビスマレイミドポリエチレングリコールリンカーによって繋がれ、変異Ｎ６９１Ｃ／Ｑ３４６Ｃを有する配列番号１２６）反応混合物のクーマシー染色７．５％Ｔｒｉｓ−ＨＣｌゲルを示す図である。ゲルの右のレーン（Ｍと標識）は適切なタンパク質ラダー（質量単位マーカーはゲルの右に示されている）を示す。レーン１は５μＬの約１０μＭ ＴｒｗＣ Ｃｂａ−Ｄ６５７Ｃ／Ｒ３３９Ｃ単独（変異Ｄ６５７Ｃ／Ｒ３３９Ｃを有する配列番号１２６）を基準として含有する。レーン２は５μＬの約１０μＭＴｒｗＣ Ｃｂａ−Ｎ６９１Ｃ／Ｑ３４６Ｃ−ビスマレイミドＰＥＧ１１（ビスマレイミドＰＥＧ１１リンカーによって繋がれ、変異Ｎ６９１Ｃ／Ｑ３４６Ｃを有する配列番号１２６）を含有する。レーン２に示されるとおり、上のバンドは二量体酵素分子種に対応し（Ａと標識）、中央のバンドは閉じた複合体（Ｂと標識）ＴｒａＩ−Ｃｂａ−Ｎ６９１Ｃ／Ｑ３４６Ｃ−ビスマレイミドＰＥＧ１１（ビスマレイミドＰＥＧ１１リンカーによって繋がれ、変異Ｎ６９１Ｃ／Ｑ３４６Ｃを有する配列番号１２６）に対応する。未修飾出発材料（Ｃと標識）ＴｒｗＣ Ｃｂａ−Ｎ６９１Ｃ／Ｑ３４６Ｃ（変異Ｎ６９１Ｃ／Ｑ３４６Ｃを有する配列番号１２６）に対するバンドが観察されることから、ｍａｌ−ＰＥＧ１１−ｍａｌリンカーに付着する反応が進まなかったことはゲルから明らかであった。 ｄｓＤＮＡ分子の代謝回転率（分^−１酵素^−１）を検査するための蛍光アッセイを示す図である。通例の蛍光基質がヘリカーゼ（ａ）のハイブリダイズｄｓＤＮＡを置換する能力をアッセイするために使用された。１）蛍光基質鎖（５０ｎＭ最終、配列番号１５１および１５２）は、３’および５’の両方のｓｓＤＮＡオーバーハングを有する。上部鎖（ｂ）はカルボキシフルオレセイン塩基（ｃ）を５’末端近く（カルボキシフルオレセインは配列番号１５１中の位置６の修飾チミンに付着している）に有し、ハイブリダイズされた相補物（ｄ）はブラックホールクエンチャー（ＢＨＱ−１）塩基（ｅ）を３’末端近く（ブラックホールクエンチャーは配列番号１５２中の位置８１の修飾チミンに付着される）に有する。ハイブリダイズされた場合、フルオレセインからの蛍光は局在ＢＨＱ−１によって消光され、基質は実質的に非蛍光性である。蛍光基質鎖の下部に部分的に相補的である捕捉鎖（ｆ、配列番号１５３）１μＭがアッセイに含まれる。２）ＡＴＰ（１ｍＭ）およびＭｇＣｌ_２（１０ｍＭ）の存在下で、基質に添加されたヘリカーゼ（１０ｎＭ）は、蛍光基質の３’尾部に結合し、上部鎖に沿って移動し、示されるとおり相補鎖（ｄ）を置換する。３）ＢＨＱ−１を有する相補鎖が完全に置換されると主要な鎖上のフルオレセインは蛍光を発する。４）置換された下部鎖（ｄ）は過剰量の捕捉鎖（ｆ）に優先的にアニールし、初期基質の再アニールおよび蛍光の消失を防ぐ。 多数のヘリカーゼ（Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（１と標識、配列番号１０）、Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ−Ｅ２８４Ｃ（２と標識、変異Ｅ２８４Ｃを有する配列番号１０）、Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ−Ｅ２８４Ｃ／Ｃ３０１Ａ（３と標識、変異Ｅ２８４Ｃ／Ｃ３０１Ａを有する配列番号１０）、Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ−Ｅ２８５Ｃ（４と標識、変異Ｅ２８５Ｃを有する配列番号１０）およびＨｅｌ３０８Ｍｂｕ−Ｓ２８８Ｃ（５と標識、変異Ｓ２８８Ｃを有する配列番号１０））に関して、緩衝液（４００ｍＭ ＫＣｌ、１００ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ８．０、１ｍＭ ＡＴＰ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、５０ｎＭ蛍光基質ＤＮＡ（配列番号１５１および１５２）、１μＭ捕捉ＤＮＡ（配列番号１５３））中でのｄｓＤＮＡ代謝回転（酵素^−１分^−１）を示すグラフである。Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ−Ｅ２８４Ｃ（変異Ｅ２８４Ｃを有する配列番号１０）、Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ−Ｅ２８４Ｃ／Ｃ３０１Ａ（変異Ｅ２８４Ｃ／Ｃ３０１Ａを有する配列番号１０）、Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ−Ｅ２８５Ｃ（変異Ｅ２８５Ｃを有する配列番号１０）およびＨｅｌ３０８Ｍｂｕ−Ｓ２８８Ｃ（変異Ｓ２８８Ｃを有する配列番号１０）は、Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（配列番号１０）と比較した場合にｄｓＤＮＡ分子の代謝回転速度（分^−１酵素^−１）の増加を示した。 多数のヘリカーゼ（Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（１と標識、配列番号１０）、Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ−Ｅ２８４Ｃ（２と標識、変異Ｅ２８４Ｃを有する配列番号１０）およびＨｅｌ３０８Ｍｂｕ−Ｄ２７４Ｃ（６と標識、変異Ｄ２７４Ｃを有する配列番号１０））に関して、緩衝液（４００ｍＭ ＫＣｌ、１００ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ８．０、１ｍＭ ＡＴＰ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、５０ｎＭ 蛍光基質ＤＮＡ（配列番号１５１および１５２）、１μＭ捕捉ＤＮＡ（配列番号１５３））中でのｄｓＤＮＡ代謝回転（酵素^−１分^−１）を示す図である。Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ−Ｅ２８４Ｃ（変異Ｅ２８４Ｃを有する配列番号１０）およびＨｅｌ３０８Ｍｂｕ−Ｄ２７４Ｃ（変異Ｄ２７４Ｃを有する配列番号１０）はＨｅｌ３０８Ｍｂｕ（配列番号１０）と比較した場合にｄｓＤＮＡ分子の代謝回転速度（分^−１酵素^−１）の増加を示した。 膜中のナノポアを通るポリヌクレオチドの酵素制御移行の模式図であって、酵素は印加された場の力とは反対にポリヌクレオチドの移動を制御する。模式図は、３’から５’酵素（Ａと標識）の例を示し、５’末端でのポア中のポリヌクレオチド（実施例９において使用するポリヌクレオチド配列は配列番号１５４（図１８においてＢと標識）、配列番号１５５（図１８においてＣと標識）および配列番１５６（図１８においてＤと標識）および、配列番号１１７（図１８においてＥと標識））の捕捉は、印加された場の力とは反対のポリヌクレオチドの酵素制御移動（印加された場の方向は矢印１により示される）を導く。ＤＮＡ捕捉の際にハイブリダイズされた鎖は、開かれる。矢印２はナノポアを通るＤＮＡ移動の方向を記し、矢印３はＤＮＡに沿った酵素移動の方向を記す。酵素がＤＮＡから解離しない限り、膜のｃｉｓ側に最終的に放されるまで酵素はポアの外側にＤＮＡを引く。 Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（配列番号１０）がＭｓｐＡナノポア（ＭＳ（Ｂ１−Ｇ７５Ｓ／Ｇ７７Ｓ／Ｌ８８Ｎ／Ｑ１２６Ｒ）８ＭｓｐＡ（変異Ｇ７５Ｓ／Ｇ７７Ｓ／Ｌ８８Ｎ／Ｑ１２６Ｒを有する配列番号２）を通るＤＮＡの移行（＋１２０ｍＶ、（９６０ｍＭ ＫＣｌ、２５ｍＭリン酸カリウム、３ｍＭフェロシアン化カリウム、１ｍＭフェリシアン化カリウム ｐＨ８．０、１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２および１ｍＭ ＡＴＰ）０．２ｎＭ ＤＮＡ（（その５’末端が４個のニトロインドールに、その最後が配列番号１５５の３’末端に付着している配列番号１５４）、配列番号１５６および配列番号１１７）を制御する場合に観察された電流トレース例（ｙ軸＝電流（ｐＡ）、ｘ軸＝時間（秒））を示す図である。電気トレースは、ＤＮＡが印加された電位（＋１２０ｍＶ）の力の下で捕捉された場合にオープンポア電流（約２５０ｐＡ）がＤＮＡレベル（約５０ｐＡ）へ低下することを示す。酵素が付着しているＤＮＡは、酵素がＤＮＡをポアを通して移動させるときに電流における段階的変化を示す長期遮断を生じる。 Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ−Ｅ２８４Ｃ（変異Ｅ２８４Ｃを有する配列番号１０）がＭｓｐＡナノポア（ＭＳ（Ｂ１−Ｇ７５Ｓ／Ｇ７７Ｓ／Ｌ８８Ｎ／Ｑ１２６Ｒ）８ＭｓｐＡ（変異Ｇ７５Ｓ／Ｇ７７Ｓ／Ｌ８８Ｎ／Ｑ１２６Ｒを有する配列番号２）を通るＤＮＡの移行（＋１２０ｍＶ、（９６０ｍＭ ＫＣｌ、２５ｍＭリン酸カリウム、３ｍＭフェロシアン化カリウム、１ｍＭフェリシアン化カリウムｐＨ８．０、１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２および１ｍＭ ＡＴＰ）０．２ｎＭ ＤＮＡ（（その５’末端が４個のニトロインドールに、その最後が配列番号１５５の３’末端に付着している配列番号１５４）、配列番号１５６および配列番号１１７）を制御する場合に観察された電流トレース例（両方のトレースについてｙ軸＝電流（ｐＡ）、ｘ軸＝時間（秒））を示す図である。上の電気トレースは、ＤＮＡが印加された電位（＋１２０ｍＶ）の力の下で捕捉された場合のＤＮＡレベル（約３５ｐＡ）を示す。酵素が付着しているＤＮＡは、酵素がＤＮＡをポアを通して移動させるときに電流における段階的変化を示す長期遮断を生じる。下のトレースは、上のトレースに示すヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動に関して拡大したものを示す。 Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ−Ｓ２８８Ｃ（変異Ｓ２８８Ｃを有する配列番号１０）がＭｓｐＡナノポア（ＭＳ（Ｂ１−Ｇ７５Ｓ／Ｇ７７Ｓ／Ｌ８８Ｎ／Ｑ１２６Ｒ）８ＭｓｐＡ（変異Ｇ７５Ｓ／Ｇ７７Ｓ／Ｌ８８Ｎ／Ｑ１２６Ｒを有する配列番号２）を通るＤＮＡの移行（＋１２０ｍＶ、（９６０ｍＭ ＫＣｌ、２５ｍＭリン酸カリウム、３ｍＭフェロシアン化カリウム、１ｍＭフェリシアン化カリウムｐＨ８．０、１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２および１ｍＭ ＡＴＰ）０．２ｎＭ ＤＮＡ（（その５’末端が４個のニトロインドールに、その最後が配列番号１５５の３’末端に付着している配列番号１５４）、配列番号１５６および配列番号１１７）を制御する場合に観察された電流トレース例（両方のトレースについてｙ軸＝電流（ｐＡ）、ｘ軸＝時間（秒））を示す図である。上の電気トレースは、ＤＮＡが印加された電位（＋１２０ｍＶ）の力の下で捕捉された場合のＤＮＡレベル（約４０ｐＡ）を示す。酵素が付着しているＤＮＡは、酵素がＤＮＡをポアを通して移動させるときに電流における段階的変化を示す長期遮断を生じる。下のトレースは、上のトレースに示すヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動に関して拡大したものを示す。 Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ−Ｅ２８４Ｆａｚ（変異Ｅ２８４Ｆａｚを有する配列番号１０）がＭｓｐＡナノポア（ＭＳ（Ｂ１−Ｇ７５Ｓ／Ｇ７７Ｓ／Ｌ８８Ｎ／Ｑ１２６Ｒ）８ＭｓｐＡ（変異Ｇ７５Ｓ／Ｇ７７Ｓ／Ｌ８８Ｎ／Ｑ１２６Ｒを有する配列番号２）を通るＤＮＡの移行（＋１２０ｍＶ、（９６０ｍＭ ＫＣｌ、２５ｍＭリン酸カリウム、３ｍＭフェロシアン化カリウム、１ｍＭフェリシアン化カリウムｐＨ８．０、１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２および１ｍＭ ＡＴＰ）０．２ｎＭ ＤＮＡ（（その５’末端が４個のニトロインドールに、その最後が配列番号１５５の３’末端に付着している配列番号１５４）、配列番号１５６および配列番号１１７）を制御する場合に観察された電流トレース例（両方のトレースについてｙ軸＝電流（ｐＡ）、ｘ軸＝時間（秒））を示す図である。上の電気トレースは、ＤＮＡが印加された電位（＋１２０ｍＶ）の力の下で捕捉された場合にＤＮＡレベル（約５０ｐＡ）を示す。酵素が付着しているＤＮＡは、酵素がＤＮＡをポアを通して移動させるときに電流における段階的変化を示す長期遮断を生じる。下のトレースは、上のトレースに示すヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動に関して拡大したものを示す。 熱処置Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ−Ｅ２８４Ｆａｚ（変異Ｅ２８４Ｆａｚを有する配列番号１０、酵素は５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０、３７５ｍＭ ＮａＣｌ、５％グリセロール緩衝液中４℃から５０℃、１０分間加熱され、次いでＢｉｏＲａｄ ＰＣＲブロックにおいて４℃に冷却された）がＭｓｐＡナノポア（ＭＳ（Ｂ１−Ｇ７５Ｓ／Ｇ７７Ｓ／Ｌ８８Ｎ／Ｑ１２６Ｒ）８ＭｓｐＡ（変異Ｇ７５Ｓ／Ｇ７７Ｓ／Ｌ８８Ｎ／Ｑ１２６Ｒを有する配列番号２）を通るＤＮＡの移行を（＋１２０ｍＶ、（９６０ｍＭ ＫＣｌ、２５ｍＭリン酸カリウム、３ｍＭフェロシアン化カリウム、１ｍＭフェリシアン化カリウムｐＨ８．０、１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２および１ｍＭ ＡＴＰ）０．２ｎＭ ＤＮＡ（（その５’末端が４個のニトロインドールに、その最後が配列番号１５５の３’末端に付着している配列番号１５４）、配列番号１５６および配列番号１１７）制御する場合に観察された電流トレース例（両方のトレースについてｙ軸＝電流（ｐＡ）、ｘ軸＝時間（秒））を示す図である。上の電気トレースは、ＤＮＡが印加された電位（＋１２０ｍＶ）の力の下で捕捉された場合に多数のヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動（各移動は１〜３と番号付けられている）に関してＤＮＡレベル（約５０ｐＡ）を示す。酵素が付着しているＤＮＡは、酵素がＤＮＡをポアを通して移動させるときに電流における段階的変化を示す長期遮断を生じる。下のトレースは、上のトレースで１と標識するヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動に関して拡大したものである。

配列表の記載
配列番号１は、ＭＳ−Ｂ１変異ＭｓｐＡ単量体をコードするコドン最適化ポリヌクレチ
ド配列を示す。この変異体は、シグナル配列を欠失しており、次の変異：Ｄ９０Ｎ、Ｄ９
１Ｎ、Ｄ９３Ｎ、Ｄ１１８Ｒ、Ｄ１３４ＲおよびＥ１３９Ｋを含む。

配列番号２は、ＭｓｐＡ単量体のＭＳ−Ｂ１変異体の成熟形態のアミノ酸配列を示す。
この変異体は、シグナル配列を欠失しており、以下の変異：Ｄ９０Ｎ、Ｄ９１Ｎ、Ｄ９３
Ｎ、Ｄ１１８Ｒ、Ｄ１３４ＲおよびＥ１３９Ｋを含む。

配列番号３は、α−ヘモリジン−Ｅ１１１Ｎ／Ｋ１４７Ｎ（α−ＨＬ−ＮＮ；Stoddart
ら、PNAS、2009;106(19):7702-7707）の１つの単量体をコードするポリヌクレオチド配列
を示す。

配列番号４は、α−ＨＬ−ＮＮの１つの単量体のアミノ酸配列を示す。

配列番号５から７は、ＭｓｐＢ、ＣおよびＤのアミノ酸配列を示す。

配列番号８は、Ｈｅｌ３０８モチーフのアミノ酸配列を示す。

配列番号９は、拡張Ｈｅｌ３０８モチーフのアミノ酸配列を示す。

配列番号１０から５８は、表１におけるＨｅｌ３０８ヘリカーゼのアミノ酸配列を示す
。

配列番号５９はＲｅｃＤ様モチーフＩを示す。

配列番号６０から６２は伸長されたＲｅｃＤ様モチーフＩを示す。

配列番号６３はＲｅｃＤモチーフＩを示す。

配列番号６４は好ましいＲｅｃＤモチーフＩ、すなわちＧ−Ｇ−Ｐ−Ｇ−Ｔ−Ｇ−Ｋ−
Ｔを示す。

配列番号６５から６７は伸長されたＲｅｃＤモチーフＩを示す。

配列番号６８はＲｅｃＤ様モチーフＶを示す。

配列番号６９はＲｅｃＤモチーフＶを示す。

配列番号７０から７７はＭｏｂＦモチーフＩＩＩを示す。

配列番号７８から８４はＭｏｂＱモチーフＩＩＩを示す。

配列番号８５はＴｒａＩ Ｅｃｏのアミノ酸配列を示す。

配列番号８６はＴｒａＩ ＥｃｏのＲｅｃＤ様モチーフＩを示す。

配列番号８７はＴｒａＩ ＥｃｏのＲｅｃＤ様モチーフＶを示す。

配列番号８８はＴｒａＩ ＥｃｏのＭｏｂＦモチーフＩＩＩを示す。

配列番号８９はＸＰＤモチーフＶを示す。

配列番号９０はＸＰＤモチーフＶＩを示す。

配列番号９１はＸＰＤ Ｍｂｕのアミノ酸配列を示す。

配列番号９２はＸＰＤ ＭｂｕのＸＰＤモチーフＶを示す。

配列番号９３はＸＰＤ ＭｂｕのＸＰＤモチーフＶＩを示す。

配列番号９４は好ましいＨｈＨドメインのアミノ酸配列を示す。

配列番号９５はｇｐ３２遺伝子によってコードされる、バクテリオファージＲＢ６９由
来ｓｓｂのアミノ酸配列を示す。

配列番号９６はｇｐ２．５遺伝子によってコードされるバクテリオファージＴ７由来ｓ
ｓｂのアミノ酸配列を示す。

配列番号９７はヘルペスウイルス１由来ＵＬ４２前進性因子のアミノ酸配列を示す。

配列番号９８はＰＣＮＡのサブユニット１のアミノ酸配列を示す。

配列番号９９はＰＣＮＡのサブユニット２のアミノ酸配列を示す。

配列番号１００はＰＣＮＡのサブユニット３のアミノ酸配列を示す。

配列番号１０１はＰｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列を示す。

配列番号１０２はヘルペスウイルス１由来ＵＬ４２前進性因子のアミノ酸配列（１から
３１９）を示す。

配列番号１０３はバクテリオファージＲＢ６９由来ｓｓｂのアミノ酸配列、すなわちＣ
末端が欠失している（ｇｐ３２ＲＢ６９ＣＤ）配列番号９５を示す。

配列番号１０４はバクテリオファージＴ７（ｇｐ２．５Ｔ７−Ｒ２１１Ｄｅｌ）由来の
ｓｓｂのアミノ酸配列（１から２１０）を示す。全長タンパク質は配列番号９６において
示されている。

配列番号１０５はＨｅｌ３０８Ｈｌａの第５ドメインのアミノ酸配列を示す。

配列番号１０６はＨｅｌ３０８Ｈｖｏの第５ドメインのアミノ酸配列を示す。

配列番号１０７は（ＨｈＨ）２ドメインのアミノ酸配列を示す。

配列番号１０８は（ＨｈＨ）２−（ＨｈＨ）２ドメインのアミノ酸配列を示す。

配列番号１０９は開口部が閉じられているヘリカーゼを形成するために使用されるペプ
チドリンカーのアミノ酸配列を示す。

配列番号１１０から１１７は実施例において用いられるポリヌクレオチド配列を示す。

配列番号１１８はヒトミトコンドリアＳＳＢ（ＨｓｍｔＳＳＢ）のアミノ酸配列を示す
。

配列番号１１９はＰｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ由来ｐ５タンパク質のアミノ酸配列
を示す。

配列番号１２０は大腸菌（E. coli）由来野生型ＳＳＢのアミノ酸配列を示す。

配列番号１２１は、ｇｐ３２遺伝子によってコードされるバクテリオファージＴ４由来
ｓｓｂのアミノ酸配列を示す。

配列番号１２２はＥｃｏＳＳＢ−ＣｔｅｒＡｌａのアミノ酸配列を示す。

配列番号１２３はＥｃｏＳＳＢ−ＣｔｅｒＮＧＧＮのアミノ酸配列を示す。

配列番号１２４はＥｃｏＳＳＢ−Ｑ１５２ｄｅｌのアミノ酸配列を示す。

配列番号１２５はＥｃｏＳＳＢ−Ｇ１１７ｄｅｌのアミノ酸配列を示す。

配列番号１２６はＴｒｗＣ Ｃｂａのアミノ酸配列を示す。

配列番号１２７は実施例５において使用されるポリヌクレオチド配列の一部を示す。こ
の配列の３’末端に付着しているのは４つのｉＳｐＣ３スペーサー単位であり、その最後
は配列番号１２８の５’末端に付着している。

配列番号１２８は実施例５において使用されるポリヌクレオチド配列の一部を示す。こ
の配列の５’末端に付着しているのは４つのｉＳｐＣ３スペーサー単位であり、その最後
は配列番号１２７の３’末端に付着している。

配列番号１２９はトポイソメラーゼＶ Ｍｋａ（メタノピュルス・カンドレリ（Methan
opyrus Kandleri））のアミノ酸配列を示す。

配列番号１３０はトポイソメラーゼＶ Ｍｋａ（メタノピュルス・カンドレリ（Methan
opyrus Kandleri））のドメインＨ−Ｌのアミノ酸配列を示す。

配列番号１３１から１３９は表３に示すＴｒａＩ配列のいくつかを示す。

配列番号１４０は変異体Ｓ（大腸菌（Escherichia coli））のアミノ酸配列を示す。

配列番号１４１はＳｓｏ７ｄ（スルホロブス・ソルファタリカス（Sufolobus solfatar
icus））のアミノ酸配列を示す。

配列番号１４２はＳｓｏ１０ｂ１（スルホロブス・ソルファタリカス（Sulfolobus sol
fataricus）Ｐ２）のアミノ酸配列を示す。

配列番号１４３はＳｓｏ１０ｂ２（スルホロブス・ソルファタリカス（Sulfolobus sol
fataricus）Ｐ２）のアミノ酸配列を示す。

配列番号１４４はトリプトファンリプレッサー（大腸菌（Escherichia coli））のアミ
ノ酸配列を示す。

配列番号１４５はラムダリプレッサー（腸内細菌（Enterobacteria）ファージラムダ）
のアミノ酸配列を示す。

配列番号１４６はＣｒｅｎ７（ヒストン・クレンアーキア（Histone crenarchaea）Ｃ
ｒｅｎ７ Ｓｓｏ）のアミノ酸配列を示す。

配列番号１４７はヒトヒストン（ヒト（Homo sapiens））のアミノ酸配列を示す。

配列番号１４８はｄｓｂＡ（腸内細菌ファージＴ４）のアミノ酸配列を示す。

配列番号１４９はＲａｄ５１（ヒト（Homo sapiens））のアミノ酸配列を示す。

配列番号１５０はＰＣＮＡスライディングクランプ（sliding clamp）（シトロミクロ
ビウム・バチオマリヌム（Citromicrobium bathyomarinum)ＪＬ３５４）のアミノ酸配列
を示す。

配列番号１５１は実施例７において使用される配列の１つを示す。この配列は、位置６
に位置付けられた修飾チミンに付着しているカルボキシフルオレセインを有する。

配列番号１５２は実施例７において使用される配列の１つを示す。この配列は、位置８
１に位置付けられた修飾チミンに付着しているブラックホールクエンチャー（ＢＨＱ−１
）を有する。

配列番号１５３は実施例７において使用される配列の１つを示す。

配列番号１５４は実施例９において使用される配列の１つを示す。この配列は、その５
’末端で４個のニトロインドールによって配列番号１５５の３’末端に付着されている。

配列番号１５５は実施例９において使用される配列の１つを示す。この配列は、４個の
ニトロインドールによってその３’末端で配列番号１５４の５’末端に付着されている。

配列番号１５６は実施例９において使用される配列の１つを示す。

発明の詳細な記載
本開示の生成物および方法のさまざまな応用が当技術分野における具体的な必要性に適
合され得ることは理解される。本明細書で用いられる用語は本発明の詳細な実施形態を記
載する目的のためのみであり、限定されることを意図しないことも理解される。

付加的に、本明細書および添付の特許請求の範囲で用いられる場合、単数形「ａ」、「
ａｎ」および「ｔｈｅ」は、内容が他を明確に記す場合を除いて複数の参照物を含む。し
たがって例えば、「ヘリカーゼ（a helicase）」を参照することは「ヘリカーゼ（helica
ses）」を含み、「開口部（an opening）」を参照することは２つ以上のそのような開口
部を含み、「膜貫通タンパク質ポア（a transmembrane protein pore）」を参照すること
は２つ以上のそのようなポアを含む、など。

本明細書に引用する全ての刊行物、特許および特許出願は（上記または下記に関わらず
）それら全体が参照により本明細書に組み込まれる。

２つ以上の部分が繋がれた修飾ヘリカーゼ
本発明は、ポリヌクレオチドの移動を制御するために有用である修飾ヘリカーゼを提供
する。修飾ヘリカーゼは、１つまたは複数の単量体を有する未修飾ヘリカーゼに基づく。
換言するとヘリカーゼは単量体またはオリゴマー／多量体であってよい。これは下でより
詳細に考察される。修飾ヘリカーゼは、ポリヌクレオチドがヘリカーゼから解離できる開
口部を少なくとも１つのコンホメーション状態で含むポリヌクレオチド結合ドメインを含
む未修飾ヘリカーゼに基づく。本発明によりヘリカーゼは、ヘリカーゼの同じ単量体上の
２つ以上の部分が繋がれて開口部のサイズを低減するように修飾される。開口部のサイズ
の低減は、ポリヌクレオチドへの結合についてヘリカーゼを妨げない。例えばヘリカーゼ
は、その１つの末端でポリヌクレオチドに結合できる。開口部のサイズの低減は、ポリヌ
クレオチドがへリカーゼから、特にポリヌクレオチドの内部ヌクレオチドから解離するま
たは離される能力を減少させる。これは下でより詳細に考察され、修飾ヘリカーゼを長時
間ポリヌクレオチドに結合したままにする。修飾ヘリカーゼは、ポリヌクレオチドの移動
を制御する能力を有する。修飾ヘリカーゼは、人工または非天然である。

ポリヌクレオチドに結合および解離するヘリカーゼの能力は、当技術分野において公知
の任意の方法を使用して決定できる。好適な結合／解離アッセイは、これだけに限らない
が、未変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）、蛍光偏光測定、熱量測定およ
び表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）など）を含む。ポリヌクレオチ
ドから解離するヘリカーゼの能力は、ヘリカーゼがポリヌクレオチドの移動を制御できる
時間を測定することによって当然決定できる。これも当技術分野において公知の任意の方
法を使用して決定できる。ポリヌクレオチドの移動を制御するヘリカーゼの能力は、下に
記載のものなどのナノポア系において典型的にはアッセイされる。ポリヌクレオチドの移
動を制御するヘリカーゼの能力は、実施例において記載のとおり決定できる。

本発明の修飾ヘリカーゼは、鎖配列決定法の際にポリヌクレオチドの移動を制御するた
めの有用な手段である。ポリヌクレオチド、特に、５００ヌクレオチド以上のものを配列
決定することにおいて生じる問題は、ポリヌクレオチドの移行を制御する分子モーターが
ポリヌクレオチドから離される場合があることである。これは、ポリヌクレオチドが印加
された場の方向に急速かつ制御されない様式でポアを通って引かれるようにする。本発明
の修飾ヘリカーゼは、配列決定されているポリヌクレオチドから解離または離されにくい
。修飾ヘリカーゼは、ナノポアを通るポリヌクレオチドの移動をそれらが制御することか
らポリヌクレオチドの読み取り長さの増大を提供できる。本発明の修飾ヘリカーゼの制御
下でポリヌクレオチド全体をナノポアを通して移動させる能力は、その配列などのポリヌ
クレオチドの特性を改善された確度でおよび公知の方法を超える速度で推定できるように
する。鎖長が長くなるにつれてこれはより重要になり、分子モーターは前進性の改善を必
要とする。発明の修飾ヘリカーゼは、５００ヌクレオチド以上、例えば１０００ヌクレオ
チド、５０００、１００００、２００００、５００００、１０００００またはそれ以上の
標的ポリヌクレオチドの移動を制御することにおいて特に有効である。

本発明の修飾ヘリカーゼは、等温ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のための有用な手段
でもある。そのような方法においては、２本鎖ＤＮＡの鎖は典型的には最初に本発明のヘ
リカーゼによって分離され、１本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）−結合タンパク質によってコー
トされる。第二ステップでは、２個の配列特異的プライマーが、典型的にはＤＮＡ鋳型の
各辺縁にハイブリダイズする。次いでＤＮＡポリメラーゼは鋳型にアニールしたプライマ
ーを、２本鎖ＤＮＡを産生するように伸長するために使用でき、２個の新たに合成された
ＤＮＡ産生物は、次いで本発明のヘリカーゼによって基質として使用され、次の回の反応
に入ることができる。したがって鎖反応が同時に進行し、選択された標的配列の指数関数
的増幅が生じる。

修飾ヘリカーゼは、ポリヌクレオチドの移動を制御する能力を有する。ポリヌクレオチ
ドの移動を制御するヘリカーゼの能力は、当技術分野において公知の任意の方法を使用し
てアッセイできる。例えばヘリカーゼは、ポリヌクレオチドに接触されてよく、ポリヌク
レオチドの位置は、標準的方法を使用して決定され得る。ポリヌクレオチドの移動を制御
する修飾ヘリカーゼの能力は、下に記載のものなどのナノポア系において、具体的には実
施例において記載のとおり典型的にはアッセイされる。

本発明の修飾ヘリカーゼは、単離、実質的に単離、精製または実質的に精製されていて
よい。ヘリカーゼは、それが脂質、ポリヌクレオチド、ポア単量体または他のタンパク質
などの任意の他の構成成分を完全に含まない場合に単離または精製されている。ヘリカー
ゼは、その目的の使用を妨害しない担体または希釈剤と混合されている場合に実質的に単
離されている。例えばヘリカーゼは、１０％未満、５％未満、２％未満または１％未満の
脂質、ポリヌクレオチド、ポア単量体または他のタンパク質などの他の構成成分を含む形
態で存在する場合に実質的に単離または実質的に精製されている。

本発明における使用のためのヘリカーゼは、ポリヌクレオチド結合ドメインを含む。ポ
リヌクレオチド結合ドメインは、ポリヌクレオチドに結合できるヘリカーゼの部分である
。ポリヌクレオチドは下に定義される。ポリヌクレオチドに結合するドメインの能力は、
当技術分野において公知の任意の方法を使用して決定できる。公知のヘリカーゼのポリヌ
クレオチド結合ドメインは、当技術分野において典型的には同定されている。ドメイン（
結合ポリヌクレオチドを有するまたは有さない）は、タンパク質モデリング、結晶状態に
おけるタンパク質のＸ線回折測定（Rupp B (2009). Biomolecular Crystallography: Pri
nciples、Practice and Application to Structural Biology. New York: Garland Scien
ce.）、溶液におけるタンパク質の核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光法（Mark Rance; Cavanagh
、John; Wayne J. Fairbrother; Arthur W. Hunt III; Skelton、NNicholas J. (2007).
Protein NMR spectroscopy: principles and practice (2nd ed.). Boston: Academic Pr
ess.）または凍結水和状態におけるタンパク質のクリオ電子顕微鏡（van Heel M、Gowen
B、Matadeen R、Orlova EV、Finn R、Pape T、Cohen D、Stark H、Schmidt R、Schatz M
、Patwardhan A (2000). ”Single-particle electron cryo-microscopy: towards atomi
c resolution.”. Q Rev Biophys. 33: 307-69を使用して同定できる。上に述べた方法に
よって決定されたタンパク質の構造情報は、タンパク質バンク（ＰＤＢ）データベースか
ら公開で入手可能である。

タンパク質モデリングは、相同体においてタンパク質構造がタンパク質配列よりも保存
されているという事実を活用する。それにより、タンパク質の原子分解モデルを作成する
ことは、クエリー配列の構造に類似していると考えられる１つまたは複数のタンパク質構
造の同定に依存する。タンパク質モデルを構築するための「鋳型」として使用するための
好適なタンパク質構造が存在するかどうかを評価するために、タンパク質データバンク（
ＰＤＢ）データベースの検索を実施する。タンパク質構造は、クエリー配列と合理的なレ
ベルの配列同一性を共有している場合に好適な鋳型であると考えられる。そのような鋳型
が存在する場合、次いで鋳型配列はクエリー配列と「配列比較」される、すなわちクエリ
ー配列中の残基が鋳型残基に位置付けられる。配列の配列比較および鋳型構造は、次いで
クエリー配列の構造モデルを作成するために使用される。そのためタンパク質モデルの品
質は、配列の配列比較および鋳型構造の品質に依存する。

ヘリカーゼなどのタンパク質は、常に運動している動的な構造である。タンパク質が動
ける（explore）コンホメーション空間は、さまざまなコンホメーションがそれらのエネ
ルギーに基づいて存在しており、相互変換の速度が状態間のエネルギー障壁に依存するエ
ネルギー地形によって記載されている（Vinson、Science、2009: 324(5924): 197）。ヘ
リカーゼは、したがって、単独であるまたはポリヌクレオチドの移動を制御しているかに
関わらずいくつかのコンホメーション状態で存在できる。少なくとも１つのコンホメーシ
ョン状態において、本発明における使用のための未修飾ヘリカーゼのポリヌクレオチド結
合ドメインは、それを通ってポリヌクレオチドがヘリカーゼから解離できる開口部を含む
。開口部は、ヘリカーゼの全てのコンホメーション状態において存在できるが、しかし必
ずではない。例えば全てのコンホメーション状態において、ポリヌクレオチド結合ドメイ
ンはそれを通ってポリヌクレオチドがヘリカーゼから解離できる開口部を含み得る。代替
的に、ヘリカーゼの１つまたは複数のコンホメーション状態ではポリヌクレオチド結合ド
メインは、開口部が小さすぎるためにそれを通ってポリヌクレオチド結合ドメインがヘリ
カーゼから解離できない開口部を含む場合がある。ヘリカーゼの１つまたは複数のコンホ
メーション状態ではポリヌクレオチド結合ドメインは、それを通ってポリヌクレオチドが
ヘリカーゼから解離できる開口部を含まない場合がある。

ポリヌクレオチド結合ドメインは、少なくとも１つのコンホメーション状態において、
それを通ってポリヌクレオチドの１つまたは複数の内部ヌクレオチドがヘリカーゼから解
離できる開口部を好ましくは含む。内部ヌクレオチドは、ポリヌクレオチド中の末端ヌク
レオチドではないヌクレオチドである。例えばそれは３’末端ヌクレオチドまたは５’末
端ヌクレオチドではない。環状ポリヌクレオチド中の全てのヌクレオチドは内部ヌクレオ
チドである。本発明による１つまたは複数の内部ヌクレオチドからの解離を低減または妨
げることは、ポリヌクレオチドの一方の末端に結合でき、全てではないが大部分のポリヌ
クレオチドの移動を制御でき、次いで他方の末端からから解離できる修飾ヘリカーゼを生
じ得ることから有利である。そのようなヘリカーゼは、鎖配列決定法のために特に有益で
ある。

ヘリカーゼから解離する１つまたは複数の内部ヌクレオチドの能力は、競合アッセイを
実行することによって決定できる。例えば対照ポリヌクレオチドＡから解離するヘリカー
ゼの能力は、末端ヌクレオチドに付着しているブロッキング基を含む同じポリヌクレオチ
ド（ポリヌクレオチドＢ）から解離する能力と比較される。ブロッキング基は、鎖Ｂの末
端ヌクレオチドでのいかなる解離も妨げ、それによりヘリカーゼの内部解離だけを可能に
する。代替的に、環状ポリヌクレオチドから解離するヘリカーゼの能力はアッセイできる
。解離は上に記載のとおりアッセイできる。

開口部は、ポリヌクレオチド結合ドメインにおける溝、ポケットまたは陥凹であってよ
い。

それを通ってポリヌクレオチドがヘリカーゼから解離できる開口部の存在は、当技術分
野において公知の任意の方法を使用して決定できる。開口部の存在は、上により詳細に考
察のとおり、ポリヌクレオチドから、具体的にはポリヌクレオチドの内部ヌクレオチドか
ら解離するヘリカーゼの能力を測定することによって決定できる。ポリヌクレオチドドメ
インにおける開口部は、上に考察したとおり、タンパク質モデリング、Ｘ線回折、ＮＭＲ
分光法またはクリオ電子顕微鏡を使用して同定できる。

本発明によりヘリカーゼは、ヘリカーゼの同じ単量体上の２つ以上の部分を繋ぐことに
よって修飾される。ヘリカーゼがオリゴマーまたは多量体である場合、２つ以上の部分は
異なる単量体上であることはできない。３つ、４つ、５つまたはそれ以上の部分などの任
意の数の部分を繋ぐことができる。２つ以上の部分を繋ぐ好ましい方法は下により詳細に
考察される。

２つ以上の部分は、本発明により繋がれた場合にそれらが開口部のサイズを低減させる
限り単量体上のどこに位置付けられてもよい。２つ以上の部分は、ポリヌクレオチドドメ
インまたは開口部にあってよいが、必ずではない。例えば、２つ以上の部分の１つ、両方
または全ては、ヘリカーゼの異なるドメインなどのポリヌクレオチド結合ドメインの外に
あってもよい。２つ以上の部分の間の最大距離は、ヘリカーゼの外周である。

２つ以上の部分は、好ましくは空間的に近接している。２つ以上の部分は、４０オング
ストローム（Å）未満離れている、３０Å未満離れている、２５Å未満離れている、２０
Å未満離れている、１０Å未満離れているまたは１０Å未満離れているなど好ましくは５
０Å未満離れている。

２つ以上の部分の少なくとも１つは、好ましくは開口部の部分を形成する、開口部に隣
接しているまたは開口部に近い。上に記載のとおり、開口部内のアミノ酸などの開口部の
部分を同定することは容易である。部分は、それらが開口部の隣にあるが部分を形成しな
い場合に開口部に隣接している。例えば、開口部の部分を形成するアミノ酸の隣に位置す
るがそれ自体は開口部の部分を形成しないアミノ酸は、開口部に隣接している。本発明の
内容では「隣にある」は、ヘリカーゼのアミノ酸配列において隣にあるまたはヘリカーゼ
の三次元構造において続く２つであることを意味する。部分は開口部の部分を形成するア
ミノ酸から１５Å未満、１０Å未満、５Å未満または２Å未満離れているなどの、開口部
の部分を形成するアミノ酸から２０Å未満である場合に典型的には開口部に近い。部分は
、ヘリカーゼのアミノ酸配列において開口部の部分を形成するアミノ酸の１、２、３、４
または５アミノ酸以内である場合に典型的には開口部に近い。そのようなアミノ酸は、上
に考察したとおり同定できる。

２つ以上の部分は、開口部の反対側にあってもよい。２つ以上の部分は、開口部の同じ
側にあってもよい。本実施形態ではヘリカーゼの２つ以上の部分は繋がれて、開口部のサ
イズを低減するループ、蓋、狭窄またはフラップを形成してもよい。

２つ以上の部分は、単量体の表面上、すなわちヘリカーゼの表面上に好ましくはある。
下により詳細に記載のとおり表面上の２つ以上の部分を繋ぐことは容易である。表面部分
は、上に考察したとおりタンパク質モデリング、Ｘ線回折、ＮＭＲ分光法またはクリオ電
子顕微鏡を使用して決定できる。

修飾ヘリカーゼは、ポリヌクレオチドの移動を制御する能力を保持している。ヘリカー
ゼのこの能力は、そのβ鎖およびαヘリックスによって典型的には提供されるその三次元
構造により典型的には提供される。αヘリックスおよびβ鎖は、ループ領域により典型的
には繋がれている。ポリヌクレオチドの移動を制御するヘリカーゼの能力に影響を与える
ことを回避するために、２つ以上の部分は好ましくは単量体のループ領域である。具体定
なヘリカーゼのループ領域は、上に考察したとおりタンパク質モデリング、Ｘ線回折、Ｎ
ＭＲ分光法またはクリオ電子顕微鏡などの当技術分野において公知の方法を使用して同定
できる。

Ｈｅｌ３０８ヘリカーゼ（配列番号１０、１３、１６、１９、２２、２５、２８、２９
、３２、３３、３４、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、
４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５および５８）に関して、β鎖は
２個のＲｅｃＡ様エンジン（RecA-like engine）ドメイン（ドメイン１および２）におい
てだけ見出すことができる。これらのドメインは、燃料ヌクレオチド（通常はＡＴＰ）の
加水分解と移動との連関に関与する。ポリヌクレオチドに沿って徐々に動かすための重要
なドメインは、ドメイン３および４であるが、中でもドメイン４である。興味深いことに
ドメイン３および４の両方はαヘリックスだけを含む。ドメイン４中にラチェットヘリッ
クスと称される重要なαヘリックスがある。結果として本発明のＨｅｌ３０８実施形態で
は、２つ以上の部分は好ましくはいずれのαヘリックスの中にもない。

開口部のサイズは、ヘリカーゼからのポリヌクレオチドの解離を低減する限り、任意の
程度に低減されてよい。これは上に考察したとおり決定できる。開口部のサイズを低減す
る方法は、下により詳細に考察される.

２つ以上の部分は、開口部を閉じるように好ましくは繋がれる。開口部が閉じられる場
合は、ポリヌクレオチドは開口部を通ってヘリカーゼから解離できない。ヘリカーゼは、
いかなるコンホメーション状態でも開口部を含まないようにより好ましくは修飾される。
ヘリカーゼのいかなるコンホメーション状態においても開口部が存在しない場合、ポリヌ
クレオチドは開口部を通ってヘリカーゼから解離できない。ヘリカーゼは、ポリヌクレオ
チド周囲に共有結合的に閉じた構造を形成できるように最も好ましくは修飾される。共有
結合的に閉じた構造が、例えばポリヌクレオチドの一方の末端でポリヌクレオチドに結合
すると、それが他方の末端に達するまで解離することなくポリヌクレオチドの移動を制御
できる。

接続
２つ以上の部分は、任意の方法で繋がれてよい。接続は一過的、例えば非供給的であっ
てよい。一過的接続でさえ開口部のサイズを低減し、開口部を通るヘリカーゼからのポリ
ヌクレオチドの解離を低減する。

２つ以上の部分は、親和性分子によって好ましくは繋がれる。好適な親和性分子は、当
技術分野において公知である。親和性分子は、好ましくは、（ａ）相補的ポリヌクレオチ
ド（国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ１０／０００１３２号（ＷＯ２０１０／０８６６０２として
公開）、（ｂ）抗体またはその断片および相補的エピトープ（Biochemistry 6thEd、W.H.
Freeman and co (2007) pp953-954）、（ｃ）ペプチドジッパー（O'Sheaら、Science 25
4 (5031): 539-544）、（ｄ）β−シート増強により相互作用できる（Remaut and Waksma
n Trends Biochem. Sci. (2006) 31 436-444）、（ｅ）水素結合、ｐｉ−スタッキングま
たは塩橋形成できる、（ｆ）ロタキサン（Xiang Ma and He Tian Chem. Soc. Rev.、2010
,39、70-80）、（ｇ）アプタマーおよび相補的タンパク質（James、W. in Encyclopedia
of Analytical Chemistry、R.A. Meyers (Ed.) pp. 4848-4871 John Wiley & Sons Ltd、
Chichester、2000）または（ｈ）ハーフキレーター（half-chelator）（Hammersteinら J
Biol Chem. 2011 April 22; 286(16): 14324-14334）である。（ｅ）に関して水素結合
は電気陰性原子に結合したプロトンと別の電気陰性原子との間に生じる。ｐｉ−スタッキ
ングは、環の平面が平行である場合に互いにスタックできる２つの芳香族環を必要とする
。塩橋は、それらの電子をいくつかの原子に非局在化できる基の間、例えばアスパラギン
酸とアルギニンとの間にある。

２つ以上の部分は、ヘキサｈｉｓタグまたはＮｉ−ＮＴＡによって一過的に繋がれる場
合がある。２つ以上の部分は、それらが一過的に相互に繋がれるように修飾されてもよい
。

２つ以上の部分は、好ましくは永久的に繋がれている。本発明の内容では、ヘリカーゼ
が使用されている間に破壊されないまたは−Ｓ−Ｓ−結合を開くための還元を使用するな
どの、使用者の部分への介入なしには破壊されない場合に接続は永久的である。

２つ以上の部分は好ましくは共有結合的に付着している。２つ以上の部分は、当技術分
野において公知の任意の方法を使用して共有結合的に付着されてよい。

２つ以上の部分は、システイン、スレオニン、セリン、アスパラギン酸、アスパラギン
、グルタミン酸およびグルタミンなどのそれらの天然に存在するアミノ酸を介して共有結
合的に付着してよい。天然に存在するアミノ酸は、付着を促進するために修飾されてよい
。例えば天然に存在するアミノ酸は、アシル化、リン酸化、グリコシル化またはファルネ
シル化によって修飾されてよい。他の好適な修飾は、当技術分野において公知である。天
然に存在するアミノ酸への修飾は、翻訳後修飾であってよい。２つ以上の部分は、それら
の配列に導入されるアミノ酸を介して付着してよい。そのようなアミノ酸は、好ましくは
置換によって導入される。導入されるアミノ酸は、システインまたは付着を促進する非天
然アミノ酸であってよい。好適な非天然アミノ酸は、これだけに限らないが、４−アジド
−Ｌ−フェニルアラニン（Ｆａｚ）、Liu C. C. and Schultz P. G.、Annu. Rev. Bioche
m.、2010、79、413-444の図１に含まれている１〜７１と番号付けられたアミノ酸のいず
れか１つまたは下に列挙するアミノ酸のいずれか１つを含む。導入されるアミノ酸は、上
に考察したとおり修飾されてよい。

好ましい実施形態では２つ以上の部分は、リンカーを使用して繋がれる。リンカー分子
は、下により詳細に考察される。接続の１つの好適な方法は、システイン連結である。こ
れは下でより詳細に考察される。２つ以上の部分は、好ましくは２つまたは３つなどの１
つまたは複数のリンカーを使用して繋がれる。１つまたは複数のリンカーは、上に考察し
たとおり開口部のサイズを低減するまたは閉じるように設計されてよい。１つまたは複数
のリンカーが上に考察したとおり開口部を閉じるために使用される場合、１つまたは複数
のリンカーの少なくとも部分は、ヘリカーゼに結合した際にポリヌクレオチドと平行では
ないように好ましくは方向付けられる。より好ましくは全てのリンカーは、この様式で方
向付けられる。１つまたは複数のリンカーが上に考察したとおり開口部を閉じるために使
用される場合、１つまたは複数のリンカーの少なくとも部分は、好ましくはヘリカーゼに
結合した際にポリヌクレオチドと平行ではない方向で開口部に交差している。より好まし
くは全てのリンカーがこの様式で開口部に交差している。これらの実施形態では１つまた
は複数のリンカーの少なくとも部分は、ポリヌクレオチドに垂直であってよい。そのよう
な方向は、ポリヌクレオチドが開口部を通ってヘリカーゼから解離できないように開口部
を効果的に閉じる。

各リンカーは、２個、３個または４個の機能末端などの２個以上の機能末端を有する場
合がある。リンカーにおける末端の好適な立体配置は当技術分野において十分公知である
。

１つまたは複数のリンカーの１つまたは複数の末端は、好ましくはヘリカーゼに共有結
合的に付着している。１つの末端が共有結合的に付着している場合、１つまたは複数のリ
ンカーは上に考察したとおり２つ以上の部分を一過的に繋ぎ得る。両方または全ての末端
が共有結合的に付着している場合、１つまたは複数のリンカーは２つ以上の部分を永久的
に繋ぐ。

２つ以上の部分の少なくとも１つは、１つまたは複数のリンカーの付着を促進するため
に好ましくは修飾される。任意の修飾が作製されてよい。リンカーは、２つ以上の部分に
おける１つまたは複数の反応性システイン残基、反応性リシン残基または非天然アミノ酸
に付着してよい。非天然アミノ酸は、上に考察した任意のものであってよい。非天然アミ
ノ酸は、好ましくは４−アジド−Ｌ−フェニルアラニン（Ｆａｚ）である。２つ以上の部
分における少なくとも１つのアミノ酸は、好ましくはシステインまたはＦａｚなどの非天
然アミノ酸で置換される。

１つまたは複数のリンカーは、好ましくはアミノ酸配列および／または化学的架橋剤で
ある。

ペプチドリンカーなどの好適なアミノ酸リンカーは、当技術分野において公知である。
アミノ酸またはペプチドリンカーの長さ、可動性および親水性は、開口部のサイズを低減
するが、ヘリカーゼの機能を妨害しないように典型的には設計される。好ましい可動性ペ
プチドリンカーは４、６、８、１０または１６などの２から２０のセリンおよび／または
グリシンアミノ酸のストレッチである。より好ましい可動性リンカーは（ＳＧ）_１、（Ｓ
Ｇ）_２、（ＳＧ）_３、（ＳＧ）_４、（ＳＧ）_５、（ＳＧ）_８、（ＳＧ）_１０、（ＳＧ）_１
５または（ＳＧ）_２０を含み、式中Ｓはセリンであり、Ｇはグリシンである。好ましい硬
いリンカーは、４、６、８、１６または２４などの２から３０のプロリンアミノ酸のスト
レッチである。より好ましい硬いリンカーは（Ｐ）_１２を含み、式中Ｐはプロリンである
。リンカーのアミノ酸配列は、好ましくはポリヌクレオチド結合成分を含む。そのような
成分およびそれらの使用に関連する有利点は、下に考察される。

好適な化学的架橋剤は、当技術分野において十分公知である。好適な化学的架橋剤は、
これだけに限らないが、次の官能基: マレイミド、活性エステル、サクシニミド、アジド
、アルキン（ジベンゾシクロオクチノール（ＤＩＢＯまたはＤＢＣＯ）、ジフルオロシク
ロアルカンおよび直鎖アルカンなど）、ホスフィン（無痕跡および無痕跡でないシュタウ
ディンガーライゲーションにおいて使用されるものなど）、ハロアセチル（ヨードアセト
アミドなど）、ホスゲン型試薬、スルホニルクロリド試薬、イソチオシアン酸、ハロゲン
化アシル、ヒドラジン、ジスルフィド、ビニルスルホン、アジリジンおよび光反応性試薬
（アリールアジド、ジアジリジンなど）を含むものを含む。

システイン／マレイミドなど、アミノ酸と官能基との間の反応は自発的であってよく、
またはアジドと直鎖状アルキンを連結するためのＣｕ（Ｉ）など、他の試薬を必要として
よい。

リンカーは、必要な距離にわたって伸びる任意の分子を含んでよい。リンカーは、炭素
１個（ホスゲン型リンカー）から多数のオングストロームに長さが変化できる。直鎖状分
子の例に含まれるのは、これだけに限らないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポ
リペプチド、多糖、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、トレオース
核酸（ＴＮＡ）、グリセロール核酸（ＧＮＡ）、飽和および不飽和炭化水素、ポリアミド
である。これらのリンカーは不活性または反応性であってよく、具体的にはそれらは、規
定の位置で化学的に切断可能であってよい、またはフルオロフォアもしくはリガンドでそ
れ自体が修飾されてよい。リンカーは、好ましくはジチオスレイトール（dithiothreitol
）（ＤＴＴ）に抵抗性である。

好ましい架橋剤は、２，５−ジオキソピロリジン−１−イル３−（ピリジン−２−イル
ジスルファニル）プロパノエート、２，５−ジオキソピロリジン−１−イル４−（ピリジ
ン−２−イルジスルファニル）ブタノエートおよび２，５−ジオキソピロリジン−１−イ
ル８−（ピリジン−２−イルジスルファニル）オクタノエート、ジ−マレイミドＰＥＧ
１ｋ、ジ−マレイミドＰＥＧ ３．４ｋ、ジ−マレイミドＰＥＧ ５ｋ、ジ−マレイミド
ＰＥＧ １０ｋ、ビス（マレイミド）エタン（ＢＭＯＥ）、ビス−マレイミドヘキサン（
ＢＭＨ）、１，４−ビス−マレイミドブタン（ＢＭＢ）、１，４ビス−マレイミジル−２
，３−ジヒドロキシブタン（ＢＭＤＢ）、ＢＭ［ＰＥＯ］２（１，８−ビス−マレイミド
ジエチレングリコール）、ＢＭ［ＰＥＯ］３（１，１１−ビス−マレイミドトリエチレン
グリコール）、トリス［２−マレイミドエチル］アミン（ＴＭＥＡ）、ＤＴＭＥジチオビ
スマレイミドエタン、ビスマレイミドＰＥＧ３、ビスマレイミドＰＥＧ１１、ＤＢＣＯ−
マレイミド、ＤＢＣＯ−ＰＥＧ４−マレイミド、ＤＢＣＯ−ＰＥＧ４−ＮＨ２、ＤＢＣＯ
−ＰＥＧ４−ＮＨＳ、ＤＢＣＯ−ＮＨＳ、ＤＢＣＯ−ＰＥＧ−ＤＢＣＯ ２．８ｋＤａ、
ＤＢＣＯ−ＰＥＧ−ＤＢＣＯ ４．０ｋＤａ、ＤＢＣＯ−１５原子−ＤＢＣＯ、ＤＢＣＯ
−２６原子−ＤＢＣＯ、ＤＢＣＯ−３５原子−ＤＢＣＯ、ＤＢＣＯ−ＰＥＧ４−Ｓ−Ｓ−
ＰＥＧ３−ビオチン、ＤＢＣＯ−Ｓ−Ｓ−ＰＥＧ３−ビオチン、ＤＢＣＯ−Ｓ−Ｓ−ＰＥ
Ｇ１１−ビオチン、（サクシニジミル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸（ＳＰＤ
Ｐ）およびマレイミド−ＰＥＧ（２ｋＤａ）−マレイミド（アルファ、オメガ−ビス−マ
レイミドポリ（エチレングリコール））を含む。最も好ましい架橋剤は、実施例において
使用されるマレイミド−プロピル−ＳＲＤＦＷＲＳ−（１，２−ジアミノエタン）−プロ
ピル−マレイミドである。

１つまたは複数のリンカーは、切断可能であってよい。これは下でより詳細に考察され
る。

２つ以上の部分は、相互に特異的である２つの異なるリンカーを使用して繋がれる場合
がある。リンカーの一方は、一方の部分に付着しており、他方は別の部分に付着している
。リンカーは、本発明の修飾ヘリカーゼを形成するように反応しなければならない。２つ
以上の部分は、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ１０／０００１３２号（ＷＯ２０１０／０８６６
０２として公開）に記載のハイブリダイゼーションリンカーを使用して繋がれてよい。具
体的には２つ以上の部分は、ハイブリダイズ可能な領域および共有結合を形成できる基を
それぞれ含む２つ以上のリンカーを使用して繋がれてよい。リンカーにおけるハイブリダ
イズ可能な領域は、２つ以上の部分にハイブリダイズし、連結する。連結された部分は、
次いで基の間の共有結合の形成を介してカップリングされる。国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ１
０／０００１３２号（ＷＯ２０１０／０８６６０２として公開）に開示の任意の特異的リ
ンカーは、本発明により使用できる。

２つ以上の部分は、修飾される場合があり、次いで２つの修飾に特異的である化学的架
橋剤を使用して付着されてよい。上に考察した任意の架橋剤は、使用できる。

リンカーは、標識されてよい。好適な標識は、これだけに限らないが、蛍光分子（Ｃｙ
３またはＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）５５５など）、放射性同位元素、例えば ^１
２５Ｉ、^３５Ｓ、酵素、抗体、抗原、ポリヌクレオチドおよび、ビオチンなどのリガンド
を含む。そのような標識は、リンカーの量を定量できるようにする。標識は、ビオチンな
どの切断可能な精製タグ、またはタンパク質自体には存在しないがトリプシン消化によっ
て遊離されるペプチドなどの同定方法において明らかになる特異的配列であってもよい。

２つ以上の部分を繋ぐ好ましい方法は、システイン連結を介する。これは、二機能性化
学的架橋剤により、または末端に存在するシステイン残基を有するアミノ酸リンカーによ
り調節できる。連結は、ヘリカーゼ中の天然システインを介して生じてよい。代替的にシ
ステインは、ヘリカーゼの２つ以上の部分に導入される場合がある。２つ以上の部分がシ
ステイン連結を介して繋がれる場合、１つまたは複数のシステインは、置換によって２つ
以上の部分に好ましくは導入される。

任意の二機能性リンカーの長さ、反応性、特異性、硬さおよび溶解度は、開口部のサイ
ズが十分に低減され、ヘリカーゼの機能が保持されることを確実にするように設計される
場合がある。好適なリンカーは、１，４−ビス（マレイミド）ブタン（ＢＭＢ）またはビ
ス（マレイミド）ヘキサンなどのビスマレイミド架橋剤を含む。特異的部位での付着が好
ましい場合に、表面の利用可能なシステイン残基への二機能性リンカーの結合は制御する
ことが困難である場合があり、基質結合または活性に影響を与える場合があることから、
二機能性リンカーを引き戻すものは、さらなる表面の利用可能なシステイン残基を含まな
いヘリカーゼの必要性である。ヘリカーゼがいくつかの利用可能なシステイン残基を含有
する場合は、修飾がヘリカーゼのフォールディングまたは活性に影響を与えないことを確
実にしながら、それらを除去するためにヘリカーゼの修飾が必要である場合がある。これ
は、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ１０／０００１３３号（ＷＯ２０１０／０８６６０３として
公開）において考察されている。システイン残基の反応性は隣接残基の、例えばペプチド
リンカー上の修飾によって増強できる。例えば近接するアルギニン、ヒスチジンまたはリ
シン残基の塩基性基は、システインチオール基のｐＫａをさらに反応性のＳ⁻基のものに
変化させる。システイン残基の反応性は、５，５’−ジチオビス−（２−ニトロ安息香酸
）（ｄＴＮＢ）などのチオール保護基によって保護できる。これらは、リンカーが付着す
る前にヘリカーゼの１つまたは複数のシステイン残基と反応できる。表面の利用可能なシ
ステインの選択的脱保護は、ビーズに固定した還元試薬（例えば固定化トリス（２−カル
ボキシエチル）ホスフィン、ＴＣＥＰ）を使用して可能である。２つ以上の部分のシステ
イン連結は、下により詳細に考察される。

２つ以上の部分を付着させる別の好ましい方法は、４−アジド−Ｌ−フェニルアラニン
（Ｆａｚ）連結を介する。これは、二機能性化学的リンカーによってまたは末端に存在す
るＦａｚ残基を有するポリペプチドリンカーによって調節できる。１つまたは複数のＦａ
ｚ残基は、置換によってヘリカーゼに好ましくは導入される。２つ以上のヘリカーゼのＦ
ａｚ連結は、下により詳細に考察される。

ヘリカーゼ
１つまたは複数の単量体で形成されており、少なくとも１つのコンホメーション状態に
おいて、それを通ってポリヌクレオチドがヘリカーゼから解離できる開口部を含むポリヌ
クレオチド結合ドメインを含む任意のヘリカーゼは、本発明により修飾されてよい。ヘリ
カーゼは、しばしばトランスロカーゼとして公知であり、２つの用語は互換的に使用でき
る。

好適なヘリカーゼは、当技術分野において十分公知である（M. E. Fairman-Williamsら
、Curr. Opin. Struct Biol.、2010、20 (3)、313-324、T. M. Lohmanら、Nature Review
s Molecular Cell Biology、2008、9、391-401）。

ヘリカーゼは、好ましくはスーパーファミリー１またはスーパーファミリー２のメンバ
ーである。ヘリカーゼは、より好ましくは次のファミリー：Ｐｉｆ１様、Ｕｐｆ１様、Ｕ
ｖｒＤ／Ｒｅｐ、Ｓｋｉ様、Ｒａｄ３／ＸＰＤ、ＮＳ３／ＮＰＨ−ＩＩ、ＤＥＡＤ、ＤＥ
ＡＨ／ＲＨＡ、ＲｅｃＧ様、ＲＥｃＱ様、Ｔ１Ｒ様、Ｓｗｉ／Ｓｎｆ様およびＲｉｇ−Ｉ
様の１つのメンバーである。これらのファミリーの最初の３個は、スーパーファミリー１
であり、次の１０個のファミリーはスーパーファミリー２である。ヘリカーゼは、より好
ましくは次のサブファミリー：ＲｅｃＤ、Ｕｐｆ１（ＲＮＡ）、ＰｃｒＡ、Ｒｅｐ、Ｕｖ
ｒＤ、Ｈｅｌ３０８、Ｍｔｒ４（ＲＮＡ）、ＸＰＤ、ＮＳ３（ＲＮＡ）、Ｍｓｓ１１６（
ＲＮＡ）、Ｐｒｐ４３（ＲＮＡ）、ＲｅｃＧ、ＲｅｃＱ、Ｔ１Ｒ、ＲａｐＡおよびＨｅｆ
（ＲＮＡ）の１つのメンバーである。これらのサブファミリーの最初の５個は、スーパー
ファミリー１であり、次の１１個のサブファミリーはスーパーファミリー２である。Ｕｐ
ｆ１、Ｍｔｒ４、ＮＳ３、Ｍｓｓ１１６、Ｐｒｐ４３およびＨｅｆサブファミリーのメン
バーは、ＲＮＡヘリカーゼである。残りのサブファミリーのメンバーはＤＮＡヘリカーゼ
である。

ヘリカーゼは、多量体またはオリゴマーヘリカーゼであってよい。換言するとヘリカー
ゼは、機能するために二量体などの多量体またはオリゴマーを形成する必要がある場合が
ある。そのような実施形態においては２つ以上の部分は、異なる単量体上であることはで
きない。ヘリカーゼは、好ましくは単量体である。換言するとヘリカーゼは、好ましくは
機能するために二量体などの多量体またはオリゴマーを形成する必要はない。Ｈｅｌ３０
８、ＲｅｃＤ、ＴｒａＩおよびＸＰＤヘリカーゼは、全て単量体ヘリカーゼである。これ
らは下により詳細に考察される。ヘリカーゼがオリゴマー／多量体性または単量体である
かどうかを決定するための方法は、当技術分野において公知である。例えば、ヘリカーゼ
を使用する放射線標識または蛍光標識ポリヌクレオチドの巻き戻しの動態は、調査できる
。代替的にヘリカーゼは、サイズ排除クロマトグラフィーを使用して分析できる。

単量体ヘリカーゼは、一緒に付着しているいくつかのドメインを含んでよい。例えばＴ
ｒａＩヘリカーゼおよびＴｒａＩサブグループヘリカーゼは２つのＲｅｃＤヘリカーゼド
メイン、レラクサーゼ（relaxase）ドメインおよびＣ末端ドメインを含有する場合がある
。ドメインは、オリゴマーを形成することなく機能できる単量体ヘリカーゼを典型的には
形成する。２つ以上の部分は、単量体ヘリカーゼの同じまたは異なるドメイン上に存在で
きる。本発明による修飾のために好適な未修飾ヘリカーゼは、好ましくは内部ヌクレオチ
ドで標的ポリヌクレオチドに結合できる。内部ヌクレオチドは上に定義されている。

一般に内部ヌクレオチドで結合できるヘリカーゼは、末端ヌクレオチドでも結合できる
が、いくつかのヘリカーゼについて内部ヌクレオチドで結合する傾向は、他よりも大きい
。本発明による修飾に好適な未修飾ヘリカーゼは、ポリヌクレオチドへのその結合の典型
的には少なくとも１０％が内部ヌクレオチドにである。典型的には、その結合の少なくと
も２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％または少なくとも５０％が内部ヌクレオ
チドにである。末端ヌクレオチドでの結合は、末端ヌクレオチドおよび隣接ヌクレオチド
の両方へ結合を同時に含み得る。本発明の目的のためにこれは、内部ヌクレオチドでの標
的ポリヌクレオチドへの結合ではない。換言すると本発明を使用する修飾のためのヘリカ
ーゼは、１つまたは複数の隣接内部ヌクレオチドとの組合せで末端ヌクレオチドに結合で
きるだけではない。ヘリカーゼは、末端ヌクレオチドに同時に結合することなく内部ヌク
レオチドに結合できる。

内部ヌクレオチドで結合できるヘリカーゼは、１個より多い内部ヌクレオチドに結合で
きる。典型的にはヘリカーゼは、少なくとも２個の内部ヌクレオチド、例えば少なくとも
３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも１０個または少なくとも１５個の内
部ヌクレオチドに結合する。典型的にはヘリカーゼは、少なくとも２個の隣接する内部ヌ
クレオチド、例えば少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも１０
個または少なくとも１５個の隣接する内部ヌクレオチドに結合する。少なくとも２個の内
部ヌクレオチドは、隣接または非隣接であってよい。

本発明による修飾が、内部ヌクレオチドからの解離が妨げられるように開口部を閉じる
場合、未修飾ヘリカーゼが末端ヌクレオチドに少なくともいくらか結合できることは好ま
しい。これは、修飾ヘリカーゼがポリヌクレオチドの一方の末端に結合し、その全長に沿
ったポリヌクレオチドの移動を解離することなく制御することを可能にする。最終的にヘ
リカーゼは、それが結合したのとは反対の末端でポリヌクレオチドから解離する。

内部ヌクレオチドでポリヌクレオチドに結合するヘリカーゼの能力は、競合アッセイを
実行することによって決定できる。対照ポリヌクレオチドＡに結合するヘリカーゼの能力
は、同じだが末端ヌクレオチドに付着しているブロッキング基を含むポリヌクレオチド（
ポリヌクレオチドＢ）に結合する能力と比較される。ブロッキング基は、鎖Ｂの末端ヌク
レオチドでのいかなる結合も妨げ、それによりヘリカーゼの内部結合だけを可能にする。
代替的に、内部ヌクレオチドに結合するヘリカーゼの能力は、環状ポリヌクレオチドを使
用してもアッセイできる。

内部ヌクレオチドで結合できるヘリカーゼの例は、これだけに限らないが、Ｈｅｌ３０
８Ｔｇａ、Ｈｅｌ３０８ＭｈｕおよびＨｅｌ３０８Ｃｓｙを含む。したがってヘリカーゼ
は、好ましくは（ａ）Ｈｅｌ３０８Ｔｇａ（すなわち配列番号３３）の配列もしくはその
変種または（ｂ）Ｈｅｌ３０８Ｃｓｙ（すなわち配列番号２２）の配列もしくはその変種
または（ｃ）Ｈｅｌ３０８Ｍｈｕ（すなわち配列番号５２）の配列もしくはその変種を含
む。これらの配列の変種は、下により詳細に考察される。変種は、上に考察したとおり付
着を促進するために１つもしくは複数の置換システイン残基および／または１つもしくは
複数の置換Ｆａｚ残基を好ましくは含む。

ヘリカーゼは、好ましくはＨｅｌ３０８ヘリカーゼである。本発明に従って、任意のＨ
ｅｌ３０８ヘリカーゼを使用し得る。Ｈｅｌ３０８ヘリカーゼはｓｋｉ２様ヘリカーゼと
しても公知であり、２つの用語は互換的に用いられ得る。好適なＨｅｌ３０８ヘリカーゼ
は、米国特許出願第６１，５４９，９９８号の表４および第６１／５９９，２４４ならび
に国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０１２／０５２５７９号（ＷＯ２０１３／０５７４９５とし
て公開）に開示されている。

Ｈｅｌ３０８ヘリカーゼは、アミノ酸モチーフＱ−Ｘ１−Ｘ２−Ｇ−Ｒ−Ａ−Ｇ−Ｒ（
本明細書以下でＨｅｌ３０８モチーフと称する；配列番号８）を典型的には含む。Ｈｅｌ
３０８モチーフは、典型的にはヘリカーゼモチーフＶＩの部分である（Tuteja and Tutej
a、Eur.J.Biochem.271 1849-1863(2004)）。Ｘ１は、Ｃ、ＭまたはＬであってよい。Ｘ１
は、好ましくはＣである。Ｘ２は、任意のアミノ酸残基であってよい。Ｘ２は、典型的に
は疎水性または中性残基である。Ｘ２は、Ａ、Ｆ、Ｍ、Ｃ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｐまた
はＲであってよい。Ｘ２は、好ましくはＡ、Ｆ、Ｍ、Ｃ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｓ、ＴまたはＰで
ある。Ｘ２は、より好ましくはＡ、ＭまたはＬである。Ｘ２は、最も好ましくはＡまたは
Ｍである。

Ｈｅｌ３０８ヘリカーゼは、好ましくはモチーフＱ−Ｘ１−Ｘ２−Ｇ−Ｒ−Ａ−Ｇ−Ｒ
−Ｐ（本明細書以下で伸張されたＨｅｌ３０８モチーフと称される；配列番号９）を含み
、式中Ｘ１およびＸ２は上に記載のとおり。

最も好ましいＨｅｌ３０８ヘリカーゼ、Ｈｅｌ３０８モチーフおよび伸張されたＨｅｌ
３０８モチーフは、下の表１に示される。

最も好ましいＨｅｌ３０８モチーフは、配列番号１７に示されている。最も好ましい伸
長されたＨｅｌ３０８モチーフは、配列番号１８に示されている。

Ｈｅｌ３０８ヘリカーゼは、配列番号１０、１３、１６、１９、２２、２５、２８、２
９、３２、３３、３４、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６
、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５もしくは５８の配列またはそ
の変種を好ましくは含む。

Ｈｅｌ３０８ヘリカーゼではポリヌクレオチドドメインおよび開口部は、ドメイン２（
ＡＴＰａｓｅドメインの１つ）とドメイン４（ラッチェットドメイン）の間およびドメイ
ン２とドメイン５（分子ブレーキ）の間に見出すことができる。本発明により繋がれてい
る２つ以上の部分は、好ましくは（ａ）ドメイン２中の任意のアミノ酸とドメイン４中の
任意のアミノ酸または（ｂ）ドメイン２中の任意のアミノ酸とドメイン５中の任意のアミ
ノ酸とである。種々のＨｅｌ３０８ヘリカーゼにおいてドメイン２、４および５を定義す
るアミノ酸残基は、下の表２に記載されている。

Ｈｅｌ３０８ヘリカーゼは、Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（すなわち配列番号１０）の配列また
はその変種を好ましくは含む。Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕではポリヌクレオチドドメインおよび
開口部は、ドメイン２（ＡＴＰａｓｅドメインの１つ）とドメイン４（ラッチェットドメ
イン）の間およびドメイン２とドメイン５（分子ブレーキ）の間に見出すことができる。
Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕの繋がれている２つ以上の部分は、好ましくは（ａ）ドメイン２中の
任意のアミノ酸とドメイン４中の任意のアミノ酸または（ｂ）ドメイン２中の任意のアミ
ノ酸とドメイン５中の任意のアミノ酸とである。Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕにおいてドメイン２
、４および５を定義するアミノ酸残基は、上の表２に記載されている。繋がれているＨｅ
ｌ３０８Ｍｂｕの２つ以上の部分は配列番号１０中の好ましくはアミノ酸２８４と６１５
とである。これらのアミノ酸は、それらがシステイン連結によって繋がれ得るように好ま
しくはシステインで置換されている（すなわちＥ２８４ＣおよびＳ６１５Ｃ）。

本発明は、Ｅ２８４およびＳ６１５が修飾されている配列番号１０の変種を含む変異体
Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕタンパク質も提供する。Ｅ２８４およびＳ６１５は好ましくは置換さ
れている。Ｅ２８４およびＳ６１５は、より好ましくはシステインで置換されている（す
なわちＥ２８４ＣおよびＳ６１５Ｃ）。変種は、Ｅ２８４およびＳ６１５が修飾されてい
る限りＥ２８４およびＳ６１５以外の位置で配列番号１０から異なっていてもよい。変種
は、下により詳細に考察されるとおりアミノ酸同一性に基づいて配列番号１０に好ましく
は少なくとも３０％相同性である。Ｅ２８４およびＳ６１５は繋がれていない。本発明の
変異体Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕタンパク質は、Ｅ２８４およびＳ６１５が繋がれている本発明
の修飾ヘリカーゼを形成するために使用できる。

Ｈｅｌ３０８ヘリカーゼは、より好ましくは（ａ）Ｈｅｌ３０８Ｔｇａの配列（すなわ
ち、配列番号３３）もしくはその変種、（ｂ）Ｈｅｌ３０８Ｃｓｙの配列（すなわち、配
列番号２２）もしくはその変種、または（ｃ）Ｈｅｌ３０８Ｍｈｕの配列（すなわち配列
番号５２）もしくはその変種を含む。

Ｈｅｌ３０８ヘリカーゼの変種は、野生型ヘリカーゼの配列から変化しているアミノ酸
配列を有し、ポリヌクレオチド結合活性を保持している酵素である。特に、配列番号１０
、１３、１６、１９、２２、２５、２８、２９、３２、３３、３４、３７、３８、３９、
４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５
３、５４、５５または５８の変種は、配列番号１０、１３、１６、１９、２２、２５、２
８、２９、３２、３３、３４、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５
、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５または５８の配列から
変化しているアミノ酸配列を有し、ポリヌクレオチド結合活性を保持している酵素である
。ポリヌクレオチド結合活性は、当技術分野において公知の任意の方法を使用して決定で
きる。好適な方法は、これだけに限らないが、蛍光偏光測定、トリプトファン蛍光および
電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）を含む。例えば１本鎖ポリヌクレオチドに結
合する変種の能力は、実施例に記載のとおり決定できる。

変種はヘリカーゼ活性を保持している。これは、種々の方法において測定できる、例え
ばポリヌクレオチドに沿って移行させる変種の能力は電気生理化学、蛍光アッセイまたは
ＡＴＰ加水分解を使用して測定され得る。

変種は、ヘリカーゼをコードするポリヌクレオチドの操作を促進するならびに／または
高塩濃度および／もしくは室温でのその活性を促進する修飾を含む場合がある。変種は、
上で考察したＨｅｌ３０８モチーフまたは伸張されたＨｅｌ３０８モチーフの外の領域に
おいて野生型ヘリカーゼとは典型的には異なる。しかし変種は、これらのモチーフ（複数
可）内に修飾を含む場合がある。

配列番号１０、１３、１６、１９、２２、２５、２８、２９、３２、３３、３４、３７
、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、
５１、５２、５３、５４、５５または５８のアミノ酸配列全長にわたって、変種は好まし
くは、アミノ酸同一性に基づいてその配列に対して少なくとも３０％相同である。より好
ましくは、変種ポリペプチドは、配列番号１０、１３、１６、１９、２２、２５、２８、
２９、３２、３３、３４、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４
６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５または５８のアミノ酸配列
に対して、配列全長にわたるアミノ酸同一性に基づいて、少なくとも４０％、少なくとも
４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、
少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくと
も９０％およびより好ましくは少なくとも９５％、９７％または９９％相同であってよい
。少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％ま
たは少なくとも９５％のアミノ酸同一性が１５０以上のストレッチ、例えば２００、３０
０、４００、５００、６００、７００、８００、９００または１０００以上の連続するア
ミノ酸にわたってあり得る（「高い相同性」）。相同性は上に記載のとおり決定される。
変種は配列番号２および４を参照して下に考察したいずれの方法においても野生型配列と
異なっていてよい。

配列番号１０、１３、１６、１９、２２、２５、２８、２９、３２、３３、３４、３７
、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、
５１、５２、５３、５４、５５または５８の変種は、上で表１に示されたとおり、野生型
配列のＨｅｌ３０８モチーフまたは伸張されたＨｅｌ３０８モチーフを好ましくは含む。
しかし変種は、異なる野生型配列由来のＨｅｌ３０８モチーフまたは伸長されたＨｅｌ３
０８モチーフを含む場合がある。例えば配列番号１０の変種は、Ｈｅｌ３０８モチーフま
たは配列番号１３から伸張されたＨｅｌ３０８モチーフ（すなわち配列番号１４または１
５）を含んでもよい。配列番号１０、１３、１６、１９、２２、２５、２８、２９、３２
、３３、３４、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、
４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５または５８の変種は、関連する野生型
配列のＨｅｌ３０８モチーフまたは伸長されたＨｅｌ３０８モチーフ内に修飾を含む場合
もある。Ｘ１およびＸ２での好適な修飾は、２つのモチーフを定義する際に上に考察され
ている。配列番号１０、１３、１６、１９、２２、２５、２８、２９、３２、３３、３４
、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、
５０、５１、５２、５３、５４、５５または５８の変種は、上に考察したとおり付着を促
進するために１つもしくは複数の置換システイン残基および／または１つもしくは複数の
置換Ｆａｚ残基を好ましくは含む。

配列番号１０の変種は、配列番号１０の最初の１９アミノ酸を欠失しているおよび／ま
たは配列番号１０の最後の３３アミノ酸を欠失している場合がある。配列番号１０の変種
は、配列番号１０のアミノ酸２０から２１１または２０から７２７にアミノ酸同一性に基
づいて少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少
なくとも９０％またはより好ましくは少なくとも９５％、少なくとも９７％もしくは少な
くとも９９％相同である配列を好ましくは含む。

配列番号１０（Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ）は５個の天然システイン残基を含有する。しかし
、これらの残基の全ては酵素のＤＮＡ結合グローブ（grove）内または周辺に位置付けら
れている。ＤＮＡ鎖が酵素内に結合されると、これらの天然システイン残基は、外からの
修飾に関して利用しにくくなる。これは、上に考察したとおり配列番号１０の特異的シス
テイン変異体の設計を可能にし、システイン連結を使用して成分に付着できるようにする
。配列番号１０の好ましい変種は、次の置換：Ａ２９Ｃ、Ｑ２２１Ｃ、Ｑ４４２Ｃ、Ｔ５
６９Ｃ、Ａ５７７Ｃ、Ａ７００ＣおよびＳ７０８Ｃの１つまたは複数を有する。これらの
位置の１つまたは複数でのシステイン残基の導入は、上に考察したとおりシステイン連結
を促進する。配列番号１０の他の好ましい変種は次の置換：Ｍ２Ｆａｚ、Ｒ１０Ｆａｚ、
Ｆ１５Ｆａｚ、Ａ２９Ｆａｚ、Ｒ１８５Ｆａｚ、Ａ２６８Ｆａｚ、Ｅ２８４Ｆａｚ、Ｙ３
８７Ｆａｚ、Ｆ４００Ｆａｚ、Ｙ４５５Ｆａｚ、Ｅ４６４Ｆａｚ、Ｅ５７３Ｆａｚ、Ａ５
７７Ｆａｚ、Ｅ６４９Ｆａｚ、Ａ７００Ｆａｚ、Ｙ７２０Ｆａｚ、Ｑ４４２Ｆａｚおよび
Ｓ７０８Ｆａｚの１つまたは複数を有する。これらの位置の１つまたは複数でのＦａｚ残
基の導入は、上に考察したとおりＦａｚ連結を促進する。

ヘリカーゼは、好ましくはＲｅｃＤヘリカーゼである。任意のＲｅｃＤヘリカーゼが本
発明により使用できる。ＲｅｃＤヘリカーゼの構造は、当技術分野において公知である（
FEBS J. 2008 Apr;275(8):1835-51. Epub 2008 Mar 9. ATPase activity of RecD is ess
ential for growth of the Antarctic Pseudomonas syringae Lz4W at low temperature.
Satapathy AK、Pavankumar TL、Bhattacharjya S、Sankaranarayanan R、Ray MK; EMS M
icrobiol Rev. 2009 May;33(3):657-87. The diversity of conjugative relaxases and
its application in plasmid classification. Garcillan-Barcia MP、Francia MV、de l
a Cruz F; J Biol Chem. 2011 Apr 8;286(14):12670-82. Epub 2011 Feb 2. Functional
characterization of the multidomain F plasmid TraI relaxase-helicase. Cheng Y、M
cNamara DE、Miley MJ、Nash RP、Redinbo MR）。

ＲｅｃＤヘリカーゼは、アミノ酸モチーフＸ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｇ−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−
Ｘ７（本明細書以下でＲｅｃＤ様モチーフＩと称する；配列番号５９）を典型的には含み
、式中Ｘ１はＧ、ＳまたはＡであり、Ｘ２は任意のアミノ酸であり、Ｘ３はＰ、Ａ、Ｓま
たはＧであり、Ｘ４はＴ、Ａ、Ｖ、ＳまたはＣであり、Ｘ５はＧまたはＡであり、Ｘ６は
ＫまたはＲおよびＸ７はＴまたはＳである。Ｘ１は好ましくはＧである。Ｘ２は好ましく
はＧ、Ｉ、ＹまたはＡである。Ｘ２はより好ましくはＧである。Ｘ３は好ましくはＰまた
はＡである。Ｘ４は好ましくはＴ、Ａ、ＶまたはＣである。Ｘ４は好ましくはＴ、Ｖまた
はＣである。Ｘ５は好ましくはＧである。Ｘ６は好ましくはＫである。Ｘ７は好ましくは
ＴまたはＳである。ＲｅｃＤヘリカーゼは、Ｑ−（Ｘ８）_{１６〜１８}−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３
−Ｇ−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７（本明細書以下で伸長されたＲｅｃＤ様モチーフＩと称す
る；配列番号６０、６１および６２）を好ましくは含み、式中Ｘ１からＸ７は上に定義の
とおりであり、Ｘ８は任意のアミノ酸である。好ましくは伸長されたＲｅｃＤ様モチーフ
Ｉ中に１６個のＸ８残基がある（すなわち（Ｘ８）_１６）（配列番号６０）。（Ｘ８）_１
６についての好適な配列は、米国特許出願第６１／５８１，３３２号の配列番号１４、１
７、２０、２３、２６、２９、３２、３５、３８、４１、４４、４７および５０ならびに
国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０１２／０５３２７４号（ＷＯ２０１２／０９８５６２として
公開）の配列番号１８、２１、２４、２５、２８、３０、３２、３５、３７、３９、４１
、４２および４４で同定できる。

ＲｅｃＤヘリカーゼは、アミノ酸モチーフＧ−Ｇ−Ｐ−Ｇ−Ｘａ−Ｇ−Ｋ−Ｘｂ（本明
細書以下でＲｅｃＤモチーフＩと称する；配列番号６３）を好ましくは含み、式中Ｘａは
Ｔ、ＶまたはＣであり、ＸｂはＴまたはＳである。Ｘａは好ましくはＴである。Ｘｂは好
ましくはＴである。ＲｅｃＤヘリカーゼは、配列Ｇ−Ｇ−Ｐ−Ｇ−Ｔ−Ｇ−Ｋ−Ｔ（配列
番号６４）を好ましくは含む。ＲｅｃＤヘリカーゼは、アミノ酸モチーフＱ−（Ｘ８）_{１
６〜１８}−Ｇ−Ｇ−Ｐ−Ｇ−Ｘａ−Ｇ−Ｋ−Ｘｂ（本明細書以下で伸長されたＲｅｃＤモ
チーフＩと称する；配列番号６５、６６および６７）をより好ましくは含み、式中Ｘａお
よびＸｂは上に定義のとおりであり、Ｘ８は任意のアミノ酸である。伸長されたＲｅｃＤ
モチーフＩ中に好ましくは１６個のＸ８残基がある（すなわち（Ｘ８）_１６）（配列番号
６５）。（Ｘ８）_１６についての好適な配列は、米国特許出願第６１／５８１，３３２号
の配列番号１４、１７、２０、２３、２６、２９、３２、３５、３８、４１、４４、４７
および５０ならびに国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０１２／０５３２７４号（ＷＯ２０１２／
０９８５６２として公開）の配列番号１８、２１、２４、２５、２８、３０、３２、３５
、３７、３９、４１、４２および４４で同定できる。

ＲｅｃＤヘリカーゼは、アミノ酸モチーフＸ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−（Ｘ６）_３
−Ｑ−Ｘ７（本明細書以下でＲｅｃＤ様モチーフＶと称する；配列番号６８）を典型的に
は含み、式中Ｘ１はＹ、ＷまたはＦであり、Ｘ２はＡ、Ｔ、Ｓ、Ｍ、ＣまたはＶであり、
Ｘ３は任意のアミノ酸であり、Ｘ４はＴ、ＮまたはＳであり、Ｘ５はＡ、Ｔ、Ｇ、Ｓ、Ｖ
またはＩであり、Ｘ６は任意のアミノ酸であり、Ｘ７はＧまたはＳである。Ｘ１は好まし
くはＹである。Ｘ２は好ましくはＡ、Ｍ、ＣまたはＶである。Ｘ２はより好ましくはＡで
ある。Ｘ３は好ましくはＩ、ＭまたはＬである。Ｘ３はより好ましくはＩまたはＬである
。Ｘ４は好ましくはＴまたはＳである。Ｘ４はより好ましくはＴである。Ｘ５は好ましく
はＡ、ＶまたはＩである。Ｘ５はより好ましくはＶまたはＩである。Ｘ５は最も好ましく
はＶである。（Ｘ６）_３は好ましくはＨ−Ｋ−Ｓ、Ｈ−Ｍ−Ａ、Ｈ−Ｇ−ＡまたはＨ−Ｒ
−Ｓである。（Ｘ６）_３はより好ましくはＨ−Ｋ−Ｓである。Ｘ７は好ましくはＧである
。ＲｅｃＤヘリカーゼは、アミノ酸モチーフＸａ−Ｘｂ−Ｘｃ−Ｘｄ−Ｘｅ−Ｈ−Ｋ−Ｓ
−Ｑ−Ｇ（本明細書以下でＲｅｃＤモチーフＶと称する；配列番号６９）を好ましくは含
み、式中ＸａはＹ、ＷまたはＦであり、ＸｂはＡ、Ｍ、ＣまたはＶであり、ＸｃはＩ、Ｍ
またはＬであり、ＸｄはＴまたはＳであり、ＸｅはＶまたはＩである。Ｘａは好ましくは
Ｙである。Ｘｂは好ましくはＡである。Ｘｄは好ましくはＴである。Ｘｄは好ましくはＶ
である。好ましいＲｅｃＤモチーフＩは米国特許出願第６１／５８１，３３２号の表５に
示されている。好ましいＲｅｃＤ様モチーフＩは米国特許出願第６１／５８１，３３２号
の表７および国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０１２／０５３２７４号（ＷＯ２０１２／０９８
５６２として公開）に示されている。好ましいＲｅｃＤ様モチーフＶは米国特許出願第６
１／５８１，３３２号の表５および７ならびに国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０１２／０５３
２７４号（ＷＯ２０１２／０９８５６２として公開）に示されている。

ＲｅｃＤヘリカーゼは、好ましくは米国特許出願第６１／５８１，３３２号の表４もし
くは５および国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０１２／０５３２７４号（ＷＯ２０１２／０９８
５６２として公開）に示されているヘリカーゼの１つまたはその変種である。変種は米国
特許出願第６１／５８１，３３２号および国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０１２／０５３２７
４号（ＷＯ２０１２／０９８５６２として公開）に記載されている。

ＲｅｃＤヘリカーゼは、好ましくはＴｒａＩヘリカーゼまたはＴｒａＩサブグループヘ
リカーゼである。ＴｒａＩヘリカーゼおよびＴｒａＩサブグループヘリカーゼは、２つの
ＲｅｃＤヘリカーゼドメイン、レラクサーゼドメインおよびＣ末端ドメインを含有する場
合がある。ＴｒａＩサブグループヘリカーゼは、好ましくはＴｒｗＣヘリカーゼである。
ＴｒａＩヘリカーゼまたはＴｒａＩサブグループヘリカーゼは、好ましくは米国特許出願
第６１／５８１，３３２号の表６および国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０１２／０５３２７４
号（ＷＯ２０１２／０９８５６２として公開）に示すヘリカーゼの１つまたはその変種で
ある。変種は、米国特許出願第６１／５８１，３３２号および国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２
０１２／０５３２７４号（ＷＯ２０１２／０９８５６２として公開）に記載されている。

ＴｒａＩヘリカーゼまたはＴｒａＩサブグループヘリカーゼは、上に定義のＲｅｃＤ様
モチーフＩ（配列番号５９）および／または上に定義のＲｅｃＤ様モチーフＶ（配列番号
６８）を典型的には含む。ＴｒａＩヘリカーゼまたはＴｒａＩサブグループヘリカーゼは
、ＲｅｃＤ様モチーフＩ（配列番号５９）およびＲｅｃＤ様モチーフＶ（配列番号６８）
の両方を好ましくは含む。ＴｒａＩヘリカーゼまたはＴｒａＩサブグループヘリカーゼは
、次の２つのモチーフの１つを典型的にはさらに含む：
− アミノ酸モチーフＨ−（Ｘ１）_２−Ｘ２−Ｒ−（Ｘ３）_５〜１２−Ｈ−Ｘ４−Ｈ（本
明細書以下でＭｏｂＦモチーフＩＩＩと称する；配列番号７０から７７）、式中Ｘ１およ
びＸ２は任意のアミノ酸であり、Ｘ２およびＸ４はＤ、Ｅ、ＫおよびＲを除く任意のアミ
ノ酸から独立に選択される。（Ｘ１）_２は当然ながらＸ１ａ−Ｘ１ｂである。Ｘ１ａおよ
びＸ１ｂは、同じまたは異なるアミノ酸であってよい。Ｘ１ａは、好ましくはＤまたはＥ
である。Ｘ１ｂは、好ましくはＴまたはＤである。（Ｘ１）_２は、好ましくはＤＴまたは
ＥＤである。（Ｘ１）_２は、最も好ましくはＤＴである。（Ｘ３）_５〜１２中の５から１
２個のアミノ酸は同じまたは異なっていてよい。Ｘ２およびＸ４はＧ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、
Ｉ、Ｍ、Ｃ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｈ、Ｑ、Ｎ、ＳおよびＴから独立に選択される。Ｘ２およびＸ
４は、好ましくは荷電していない。Ｘ２およびＸ４は、好ましくはＨではない。Ｘ２は、
より好ましくはＮ、ＳまたはＡである。Ｘ２は、最も好ましくはＮである。Ｘ４は、最も
好ましくはＦまたはＴである。（Ｘ３）_５〜１２は、好ましくは長さ６または１０残基で
ある。（Ｘ３）_５〜１２の好適な実施形態は、米国特許出願第６１／５８１，３３２号の
表７に示す配列番号５８、６２、６６および７０、ならびに国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０
１２／０５３２７４号（ＷＯ２０１２／０９８５６２として公開）の配列番号６１、６５
、６９、７３、７４、８２、８６、９０、９４、９８、１０２、１１０、１１２、１１３
、１１４、１１７、１２１、１２４、１２５、１２９、１３３、１３６、１４０、１４４
、１４７、１５１、１５２、１５６、１６０、１６４および１６８由来であってよい。
− アミノ酸モチーフＧ−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｈ−（Ｘ８）_{６
〜１２}−Ｈ−Ｘ９（本明細書以下でＭｏｂＱモチーフＩＩＩと称する；配列番号７８から
８４）、式中Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７およびＸ９はＤ、Ｅ、ＫおよびＲを除
く任意のアミノ酸から独立に選択され、Ｘ４はＤまたはＥであり、Ｘ８は任意のアミノ酸
である。Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７およびＸ９はＧ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ
、Ｃ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｈ、Ｑ、Ｎ、ＳおよびＴから独立に選択される。Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、
Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７およびＸ９は、好ましくは荷電していない。Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ５、
Ｘ６、Ｘ７およびＸ９は、好ましくはＨではない。（Ｘ８）_６〜１２中の６から１２個の
アミノ酸は、同じまたは異なっていてよい。好ましいＭｏｂＦモチーフＩＩＩは、米国特
許出願第６１／５８１，３３２号の表７および国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０１２／０５３
２７４号（ＷＯ２０１２／０９８５６２として公開）に示されている。

ＴｒａＩヘリカーゼまたはＴｒａＩサブグループヘリカーゼは、より好ましくは米国特
許出願第６１／５８１，３３２号の表６または７および国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０１２
／０５３２７４号（ＷＯ２０１２／０９８５６２として公開）に示すヘリカーゼの１つま
たはその変種である。ＴｒａＩヘリカーゼは、配列番号８５に示す配列またはその変種を
最も好ましくは含む。配列番号８５はＴｒａＩ Ｅｃｏ（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿０６
１４８３．１；Ｇｅｎｂａｎｋ ＡＡＱ９８６１９．１；配列番号８５）である。Ｔｒａ
Ｉ Ｅｃｏは、次のモチーフ：ＲｅｃＤ様モチーフＩ（ＧＹＡＧＶＧＫＴ；配列番号８６
）、ＲｅｃＤ様モチーフＶ（ＹＡＩＴＡＨＧＡＱＧ；配列番号８７）およびＭｏｂ Ｆモ
チーフＩＩＩ（ＨＤＴＳＲＤＱＥＰＱＬＨＴＨ；配列番号８８）を含む。

ＴｒａＩヘリカーゼまたはＴｒａＩサブグループヘリカーゼは、下の表３に示すヘリカ
ーゼの１つの配列、すなわち配列番号８５、１２６、１３４および１３８の１つまたはそ
の変種をより好ましくは含む。

繋がれているＴｒｗＣ Ｃｂａの２つ以上の部分は、好ましくは（ａ）配列番号１２６
中のアミノ酸６９１および３４６；（ｂ）配列番号１２６中のアミノ酸６５７および３３
９；（ｃ）配列番号１２６中のアミノ酸６９１および３５０；または（ｄ）配列番号１２
６中のアミノ酸６９０および３５０である。これらのアミノ酸は、それらがシステイン連
結で繋がれ得るように、システインで好ましくは置換されている。

本発明はアミノ酸６９１および３４６；６５７および３３９；６９１および３５０；ま
たは６９０および３５０が修飾されている配列番号１２６の変種を含む変異体ＴｒｗＣ
Ｃｂａタンパク質も提供する。アミノ酸は好ましくは置換されている。アミノ酸は、より
好ましくはシステインで置換されている。変種は、関連するアミノ酸が修飾されている限
り、６９１および３４６；６５７および３３９；６９１および３５０；または６９０およ
び３５０以外の位置で配列番号１２６とは異なっていてよい。変種は、下により詳細に考
察されるとおりアミノ酸同一性に基づいて配列番号１２６に好ましくは少なくとも１０％
相同性である。アミノ酸６９１および３４６；６５７および３３９；６９１および３５０
；または６９０および３５０は、繋がれていない。本発明の変異体ＴｒｗＣ Ｃｂａタン
パク質は、修飾されるアミノ酸が繋がれている本発明の修飾ヘリカーゼを形成するために
使用できる。

ＲｅｃＤヘリカーゼ、ＴｒａＩヘリカーゼまたはＴｒａＩサブグループヘリカーゼの変
種は、野生型ヘリカーゼのものから変化しているアミノ酸配列を有し、ポリヌクレオチド
結合活性を保持している酵素である。これは、上に記載のとおり測定され得る。具体的に
は配列番号８５、１２６、１３４または１３８の変種は、配列番号８５、１２６、１３４
または１３８のものから変化しているアミノ酸配列を有し、ポリヌクレオチド結合活性を
保持している酵素である。変種は、ヘリカーゼ活性を保持している。変種は、下に考察す
る２つのモードの少なくとも１つで作動しなければならない。好ましくは、変種は両方の
モードで作動する。変種は、ヘリカーゼをコードするポリヌクレオチドの操作を促進する
ならびに／または高塩濃度および／もしくは室温でのその活性を促進する修飾を含む場合
がある。変種は、上で考察したモチーフの外の領域において野生型ヘリカーゼとは典型的
には異なる。しかし変種は、これらのモチーフ（複数可）内に修飾を含む場合がある。

配列番号８５、１２６、１３４および１３８の任意の１つのアミノ酸配列の全長にわた
って、変種はアミノ酸同一性に基づいてその配列に好ましくは少なくとも１０％相同性で
ある。より好ましくは変種ポリペプチドは、配列全長にわたるアミノ酸同一性に基づいて
配列番号８５、１２６、１３４および１３８の任意の１つのアミノ酸配列に少なくとも２
０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少
なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも
７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％お
よびより好ましくは少なくとも９５％、９７％または９９％相同性であってよい。少なく
とも７０％、例えば少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少な
くとも９５％のアミノ酸同一性が１５０以上のストレッチ、例えば２００、３００、４０
０、５００、６００、７００、８００、９００または１０００以上の連続するアミノ酸に
わたってあり得る（「高い相同性」）。相同性は上に記載のとおり決定される。変種は配
列番号２および４を参照して上に考察したいずれの方法においても野生型配列と異なって
いてよい。

配列番号８５、１２６、１３４および１３８の任意の１つの変種は、野生型配列のＲｅ
ｃＤ様モチーフＩおよび／またはＲｅｃＤ様モチーフＶを好ましくは含む。しかし配列番
号８５、１２６、１３４または１３８の変種は、野生型配列とは異なるＲｅｃＤ様モチー
フＩおよび／または伸長されたＲｅｃＤ様モチーフＶを含んでよい。例えば変種は、米国
特許出願第６１／５８１，３３２号の表５および７ならびに国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０
１２／０５３２７４号（ＷＯ２０１２／０９８５６２として公開）に示す好ましいモチー
フの任意の１つを含んでよい。配列番号８５、１２６、１３４および１３８の変種は、野
生型配列のＲｅｃＤ様モチーフＩおよびＶ内に修飾を含んでよい。配列番号８５、１２６
、１３４または１３８の変種は、上に考察したとおり付着を促進するために１つもしくは
複数の置換システイン残基および／または１つもしくは複数の置換Ｆａｚ残基を好ましく
は含む。

ヘリカーゼは好ましくはＸＰＤヘリカーゼである。任意のＸＰＤヘリカーゼが本発明に
より使用できる。ＸＰＤヘリカーゼはＲａｄ３ヘリカーゼとしても公知であり、２つの用
語は互換的に使用できる。

ＸＰＤヘリカーゼの構造は、当技術分野において公知である（Cell. 2008 May 30;133(
5):801-12. Structure of the DNA repair helicase XPD. Liu H、Rudolf J、Johnson KA
、McMahon SA、Oke M、Carter L、McRobbie AM、Brown SE、Naismith JH、White MF）。
ＸＰＤヘリカーゼは、アミノ酸モチーフＸ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｇ−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｅ−
Ｇ（本明細書以下でＸＰＤモチーフＶと称する；配列番号８９）を典型的には含む。Ｘ１
、Ｘ２、Ｘ５およびＸ６はＤ、Ｅ、ＫおよびＲを除く任意のアミノ酸から独立に選択され
る。Ｘ１、Ｘ２、Ｘ５およびＸ６は、Ｇ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｃ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｈ
、Ｑ、Ｎ、ＳおよびＴから独立に選択される。Ｘ１、Ｘ２、Ｘ５およびＸ６は、好ましく
は荷電していない。Ｘ１、Ｘ２、Ｘ５およびＸ６は、好ましくはＨではない。Ｘ１は、よ
り好ましくはＶ、Ｌ、Ｉ、ＳまたはＹである。Ｘ５は、より好ましくはＶ、Ｌ、Ｉ、Ｎま
たはＦである。Ｘ６は、より好ましくはＳまたはＡである。Ｘ３およびＸ４は、任意のア
ミノ酸残基であってよい。Ｘ４は、好ましくはＫ、ＲまたはＴである。

ＸＰＤヘリカーゼは、アミノ酸モチーフＱ−Ｘａ−Ｘｂ−Ｇ−Ｒ−Ｘｃ−Ｘｄ−Ｒ−（
Ｘｅ）_３−Ｘｆ−（Ｘｇ）_７−Ｄ−Ｘｈ−Ｒ（本明細書以下でＸＰＤモチーフＶＩと称す
る；配列番号９０）を典型的には含む。Ｘａ、ＸｅおよびＸｇは任意のアミノ酸残基であ
ってよい。Ｘｂ、ＸｃおよびＸｄはＤ、Ｅ、ＫおよびＲを除く任意のアミノ酸から独立に
選択される。Ｘｂ、ＸｃおよびＸｄは、典型的にはＧ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｃ、Ｆ
、Ｙ、Ｗ、Ｈ、Ｑ、Ｎ、ＳおよびＴから独立に選択される。Ｘｂ、ＸｃおよびＸｄは、好
ましくは荷電していない。Ｘｂ、ＸｃおよびＸｄは、好ましくはＨではない。Ｘｂは、よ
り好ましくはＶ、Ａ、Ｌ、ＩまたはＭである。Ｘｃは、より好ましくはＶ、Ａ、Ｌ、Ｉ、
ＭまたはＣである。Ｘｄは、より好ましくはＩ、Ｈ、Ｌ、Ｆ、ＭまたはＶである。Ｘｆは
、ＤまたはＥであってよい。（Ｘｇ）_７はＸ_ｇ１、Ｘ_ｇ２、Ｘ_ｇ３、Ｘ_ｇ４、Ｘ_ｇ５、Ｘ
_ｇ６およびＸ_ｇ７である。Ｘ_ｇ２は、好ましくはＧ、Ａ、ＳまたはＣである。Ｘ_ｇ５は、
好ましくはＦ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ａ、ＷまたはＹである。Ｘ_ｇ６は、好ましくはＬ、Ｆ、
Ｙ、Ｍ、ＩまたはＶである。Ｘ_ｇ７は、好ましくはＡ、Ｃ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、ＭまたはＳであ
る。

ＸＰＤヘリカーゼは、ＸＰＤモチーフＶおよびＶＩを好ましくは含む。最も好ましいＸ
ＰＤモチーフＶおよびＶＩは、米国特許出願第６１／５８１，３４０号の表５および国際
出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０１２／０５３２７３号（ＷＯ２０１２／０９８５６１として公開
）に示されている。

ＸＰＤヘリカーゼは、硫化鉄（ＦｅＳ）コアを２つのウォーカーＡおよびＢモチーフ（
モチーフＩおよびＩＩ）の間に好ましくはさらに含む。ＦｅＳコアは、システイン残基の
スルフィド基の間に配位した鉄原子を典型的には含む。ＦｅＳコアは、典型的には四面体
である。

ＸＰＤヘリカーゼは、好ましくは米国特許出願第６１／５８１，３４０号の表４または
５および国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０１２／０５３２７３号（ＷＯ２０１２／０９８５６
１として公開）に示されているヘリカーゼの１つまたはその変種である。ＸＰＤヘリカー
ゼは、配列番号９１に示されている配列またはその変種を最も好ましくは含む。配列番号
９１は、ＸＰＤ Ｍｂｕ（メタノコッコイデス・ブルトニイ（Methanococcoides burtoni
i）；ＹＰ＿５６６２２１．１；ＧＩ：９１７７３５２９）である。ＸＰＤ Ｍｂｕは、
ＹＬＷＧＴＬＳＥＧ（モチーフＶ；配列番号９２）およびＱＡＭＧＲＶＶＲＳＰＴＤＹＧ
ＡＲＩＬＬＤＧＲ（モチーフＶＩ；配列番号９３）を含む。

ＸＰＤヘリカーゼの変種は、野生型ヘリカーゼのものから変化しているアミノ酸配列を
有し、ポリヌクレオチド結合活性を保持している酵素である。これは、上に記載のとおり
測定され得る。具体的には配列番号９１の変種は、配列番号９１のものから変化している
アミノ酸配列を有し、ポリヌクレオチド結合活性を保持している酵素である。変種は、ヘ
リカーゼ活性を保持している。変種は、下に考察する２つのモードの少なくとも１つで作
動しなければならない。好ましくは、変種は両方のモードで作動する。変種は、ヘリカー
ゼをコードするポリヌクレオチドの操作を促進するならびに／または高塩濃度および／も
しくは室温でのその活性を促進する修飾を含む場合がある。変種は、上で考察したＸＰＤ
モチーフＶおよびＶＩの外の領域において野生型ヘリカーゼとは典型的には異なる。しか
し変種は、これらのモチーフの１つまたは両方の内に修飾を含む場合がある。

配列番号９１のアミノ酸配列の全長にわたって、配列番号１０などの変種は、アミノ酸
同一性に基づいてその配列に好ましくは少なくとも１０％、好ましくは３０％相同性であ
る。より好ましくは変種ポリペプチドは、配列番号９１のアミノ酸配列に配列全体にわた
るアミノ酸同一性に基づいて少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、
少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくと
も７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％およびより好ましく
は少なくとも９５％、９７％または９９％相同性であってよい。少なくとも７０％、例え
ば少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％のア
ミノ酸同一性が１５０以上のストレッチ、例えば２００、３００、４００、５００、６０
０、７００、８００、９００または１０００以上の連続するアミノ酸にわたってあり得る
（「高い相同性」）。相同性は上に記載のとおり決定される。変種は配列番号２および４
を参照して上に考察したいずれの方法においても野生型配列と異なっていてよい。

配列番号９１の変種は、野生型配列のＸＰＤモチーフＶおよび／またはＸＰＤモチーフ
ＶＩを好ましくは含む。配列番号９１の変種は、配列番号９１のＸＰＤモチーフＶおよび
ＶＩの両方をより好ましくは含む。しかし、配列番号９１の変種は、野生型配列とは異な
るＸＰＤモチーフＶおよび／またはＶＩを含む場合がある。例えば、配列番号９１の変種
は、米国特許出願第６１／５８１，３４０号の表５および国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０１
２／０５３２７３号（ＷＯ２０１２／０９８５６１として公開）に示されている好ましい
モチーフの任意の１つを含む場合がある。配列番号９１の変種は、野生型配列のＸＰＤモ
チーフＶおよび／またはＸＰＤモチーフＶＩ内に修飾も含む場合がある。これらのモチー
フへの好適な修飾は、２つのモチーフを定義する際に上に考察されている。配列番号９１
の変種は、上に考察したとおり付着を促進するために１つもしくは複数の置換システイン
残基および／または１つもしくは複数の置換Ｆａｚ残基を好ましくは含む。

修飾Ｈｅｌ３０８ヘリカーゼ
本発明は、ポリヌクレオチドの移動を制御するために有用である修飾Ｈｅｌ３０８ヘリ
カーゼも提供する。本発明によりヘリカーゼは、Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（配列番号１０）中
のＤ２７２、Ｎ２７３、Ｄ２７４、Ｇ２８１、Ｅ２８４、Ｅ２８５、Ｅ２８７、Ｓ２８８
、Ｔ２８９、Ｇ２９０、Ｅ２９１、Ｄ２９３、Ｔ２９４、Ｎ３００、Ｒ３０３、Ｋ３０４
、Ｎ３１４、Ｓ３１５、Ｎ３１６、Ｈ３１７、Ｒ３１８、Ｋ３１９、Ｌ３２０、Ｅ３２２
、Ｒ３２６、Ｎ３２８、Ｓ６１５、Ｋ７１７、Ｙ７２０、Ｎ７２１およびＳ７２４に対応
する１つまたは複数の位置への１つもしくは複数のシステイン残基および／または１つも
しくは複数の非天然アミノ酸の導入によって修飾され、ここでヘリカーゼはポリヌクレオ
チドの移動を制御する能力を保持している。１つもしくは複数のシステイン残基および／
または１つもしくは複数の非天然アミノ酸は、好ましくは置換によって導入される。

これらの修飾は、ポリヌクレオチドへの結合についてヘリカーゼを妨げない。例えばヘ
リカーゼは、内部ヌクレオチドを介してまたはその末端の１つでポリヌクレオチドに結合
できる。これらの修飾は、ヘリカーゼから、特にポリヌクレオチドの内部ヌクレオチドか
ら解離するまたは離されるポリヌクレオチドの能力を減少させる。換言すると１つまたは
複数の修飾は、ポリヌクレオチド鎖からの離脱を妨げることによってＨｅｌ３０８ヘリカ
ーゼの前進性を増大させる。酵素の熱安定性も１つまたは複数の修飾によって増大され、
鎖配列決定法において有益である改善された構造的安定性をもたらす。本発明の修飾Ｈｅ
ｌ３０８ヘリカーゼは、上に考察した全ての有利点および使用を有する。

修飾Ｈｅｌ３０８ヘリカーゼは、ポリヌクレオチドの移動を制御する能力を有する。こ
れは、上に考察したとおり測定できる。修飾Ｈｅｌ３０８ヘリカーゼは人工または非天然
である。

本発明の修飾Ｈｅｌ３０８ヘリカーゼは、上に考察したとおり、単離、実質的に単離、
精製または実質的に精製されていてよい。

Ｈｅｌ３０８ヘリカーゼは、Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（配列番号１０）中のＤ２７２、Ｎ２
７３、Ｄ２７４、Ｇ２８１、Ｅ２８４、Ｅ２８５、Ｅ２８７、Ｓ２８８、Ｔ２８９、Ｇ２
９０、Ｅ２９１、Ｄ２９３、Ｔ２９４、Ｎ３００、Ｒ３０３、Ｋ３０４、Ｎ３１４、Ｓ３
１５、Ｎ３１６、Ｈ３１７、Ｒ３１８、Ｋ３１９、Ｌ３２０、Ｅ３２２、Ｒ３２６、Ｎ３
２８、Ｓ６１５、Ｋ７１７、Ｙ７２０、Ｎ７２１およびＳ７２４に対応する位置の１つま
たは複数に１つもしくは複数のシステイン残基および／または１つもしくは複数の非天然
アミノ酸を含む、上の表１に示すヘリカーゼの１つの変種を好ましくは含む。Ｈｅｌ３０
８ヘリカーゼは、Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（配列番号１０）中のＤ２７２、Ｎ２７３、Ｄ２７
４、Ｇ２８１、Ｅ２８４、Ｅ２８５、Ｅ２８７、Ｓ２８８、Ｔ２８９、Ｇ２９０、Ｅ２９
１、Ｄ２９３、Ｔ２９４、Ｎ３００、Ｒ３０３、Ｋ３０４、Ｎ３１４、Ｓ３１５、Ｎ３１
６、Ｈ３１７、Ｒ３１８、Ｋ３１９、Ｌ３２０、Ｅ３２２、Ｒ３２６、Ｎ３２８、Ｓ６１
５、Ｋ７１７、Ｙ７２０、Ｎ７２１およびＳ７２４に対応する位置の１つまたは複数に１
つもしくは複数のシステイン残基および／または１つもしくは複数の非天然アミノ酸を含
む、配列番号１０、１３、１６、１９、２２、２５、２８、２９、３２、３３、３４、３
７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０
、５１、５２、５３、５４、５５および５８の１つの変種を好ましくは含む。

Ｈｅｌ３０８ヘリカーゼは、Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（配列番号１０）中のＤ２７４、Ｅ２
８４、Ｅ２８５、Ｅ２８７、Ｓ２８８、Ｔ２８９、Ｇ２９０、Ｅ２９１、Ｎ３１６、Ｋ３
１９、Ｓ６１５、Ｋ７１７またはＹ７２０に対応する位置の１つまたは複数に１つもしく
は複数のシステイン残基および／または１つもしくは複数の非天然アミノ酸を含む、配列
番号１０、１３、１６、１９、２２、２５、２８、２９、３２、３３、３４、３７、３８
、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、
５２、５３、５４、５５および５８の１つの変種を好ましくは含む。

下の表４ａおよび４ｂは、Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（配列番号１０）中のＤ２７４、Ｅ２８
４、Ｅ２８５、Ｓ２８８、Ｓ６１５、Ｋ７１７、Ｙ７２０、Ｅ２８７、Ｔ２８９、Ｇ２９
０、Ｅ２９１、Ｎ３１６およびＫ３１９に対応する、他のＨｅｌ３０８ヘリカーゼにおけ
る位置を示す。例えば、Ｈｅｌ３０８ Ｈｖｏ（配列番号１６）では、Ｅ２８３はＨｅｌ
３０８ＭｂｕにおけるＤ２７４に対応し、Ｅ２９３はＨｅｌ３０８ＭｂｕにおけるＥ２８
４に対応し、Ｉ２９４はＨｅｌ３０８ＭｂｕにおけるＥ２８５に対応し、Ｖ２９７はＨｅ
ｌ３０８ＭｂｕにおけるＳ２８８に対応し、Ｄ６７１はＨｅｌ３０８ＭｂｕにおけるＳ６
１５に対応し、Ｋ７７５はＨｅｌ３０８ＭｂｕにおけるＫ７１７に対応し、およびＥ７７
８はＨｅｌ３０８ＭｂｕにおけるＹ７２０に対応する。別のＨｅｌ３０８ヘリカーゼにお
ける対応する位置の欠如は「−」と印を付ける。

Ｈｅｌ３０８ヘリカーゼは、Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（配列番号１０）中のＤ２７４、Ｅ２
８４、Ｅ２８５、Ｓ２８８、Ｓ６１５、Ｋ７１７およびＹ７２０に対応する位置の１つま
たは複数に１つもしくは複数のシステイン残基および／または１つもしくは複数の非天然
アミノ酸を含む、配列番号１０、１３、１６、１９、２２、２５、２８、２９、３２、３
３、３４、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８
、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５および５８の１つの変種をより好ましくは
含む。関連する位置は、上の表４ａのカラムＡからＧに示されている。

ヘリカーゼは、Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（配列番号１０）中のＤ２７４、Ｅ２８４、Ｅ２８
５、Ｓ２８８、Ｓ６１５、Ｋ７１７およびＹ７２０に対応する位置の１個、２個、３個、
４個、５個、６個または７個にシステイン残基を含んでよい。これらの位置の任意の組合
せは、システインで置換されてよい。例えば上の表４ａの各列について本発明のヘリカー
ゼは、列においてＡからＧと標識の位置の次の組合せのいずれにもシステインを含んでよ
い：｛Ａ｝、｛Ｂ｝、｛Ｃ｝、｛Ｄ｝、｛Ｇ｝、｛Ｅ｝、｛Ｆ｝、｛ＡおよびＢ｝、｛Ａ
およびＣ｝、｛ＡおよびＤ｝、｛ＡおよびＧ｝、｛ＡおよびＥ｝、｛ＡおよびＦ｝、｛Ｂ
およびＣ｝、｛ＢおよびＤ｝、｛ＢおよびＧ｝、｛ＢおよびＥ｝、｛ＢおよびＦ｝、｛Ｃ
およびＤ｝、｛ＣおよびＧ｝、｛ＣおよびＥ｝、｛ＣおよびＦ｝、｛ＤおよびＧ｝、｛Ｄ
およびＥ｝、｛ＤおよびＦ｝、｛ＧおよびＥ｝、｛ＧおよびＦ｝、｛ＥおよびＦ｝、｛Ａ
、ＢおよびＣ｝、｛Ａ、ＢおよびＤ｝、｛Ａ、ＢおよびＧ｝、｛Ａ、ＢおよびＥ｝、｛Ａ
、ＢおよびＦ｝、｛Ａ、ＣおよびＤ｝、｛Ａ、ＣおよびＧ｝、｛Ａ、ＣおよびＥ｝、｛Ａ
、ＣおよびＦ｝、｛Ａ、ＤおよびＧ｝、｛Ａ、ＤおよびＥ｝、｛Ａ、ＤおよびＦ｝、｛Ａ
、ＧおよびＥ｝、｛Ａ、ＧおよびＦ｝、｛Ａ、ＥおよびＦ｝、｛Ｂ、ＣおよびＤ｝、｛Ｂ
、ＣおよびＧ｝、｛Ｂ、ＣおよびＥ｝、｛Ｂ、ＣおよびＦ｝、｛Ｂ、ＤおよびＧ｝、｛Ｂ
、ＤおよびＥ｝、｛Ｂ、ＤおよびＦ｝、｛Ｂ、ＧおよびＥ｝、｛Ｂ、ＧおよびＦ｝、｛Ｂ
、ＥおよびＦ｝、｛Ｃ、ＤおよびＧ｝、｛Ｃ、ＤおよびＥ｝、｛Ｃ、ＤおよびＦ｝、｛Ｃ
、ＧおよびＥ｝、｛Ｃ、ＧおよびＦ｝、｛Ｃ、ＥおよびＦ｝、｛Ｄ、ＧおよびＥ｝、｛Ｄ
、ＧおよびＦ｝、｛Ｄ、ＥおよびＦ｝、｛Ｇ、ＥおよびＦ｝、｛Ａ、Ｂ、ＣおよびＤ｝、
｛Ａ、Ｂ、ＣおよびＧ｝、｛Ａ、Ｂ、ＣおよびＥ｝、｛Ａ、Ｂ、ＣおよびＦ｝、｛Ａ、Ｂ
、ＤおよびＧ｝、｛Ａ、Ｂ、ＤおよびＥ｝、｛Ａ、Ｂ、ＤおよびＦ｝、｛Ａ、Ｂ、Ｇおよ
びＥ｝、｛Ａ、Ｂ、ＧおよびＦ｝、｛Ａ、Ｂ、ＥおよびＦ｝、｛Ａ、Ｃ、ＤおよびＧ｝、
｛Ａ、Ｃ、ＤおよびＥ｝、｛Ａ、Ｃ、ＤおよびＦ｝、｛Ａ、Ｃ、ＧおよびＥ｝、｛Ａ、Ｃ
、ＧおよびＦ｝、｛Ａ、Ｃ、ＥおよびＦ｝、｛Ａ、Ｄ、ＧおよびＥ｝、｛Ａ、Ｄ、Ｇおよ
びＦ｝、｛Ａ、Ｄ、ＥおよびＦ｝、｛Ａ、Ｇ、ＥおよびＦ｝、｛Ｂ、Ｃ、ＤおよびＧ｝、
｛Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥ｝、｛Ｂ、Ｃ、ＤおよびＦ｝、｛Ｂ、Ｃ、ＧおよびＥ｝、｛Ｂ、Ｃ
、ＧおよびＦ｝、｛Ｂ、Ｃ、ＥおよびＦ｝、｛Ｂ、Ｄ、ＧおよびＥ｝、｛Ｂ、Ｄ、Ｇおよ
びＦ｝、｛Ｂ、Ｄ、ＥおよびＦ｝、｛Ｂ、Ｇ、ＥおよびＦ｝、｛Ｃ、Ｄ、ＧおよびＥ｝、
｛Ｃ、Ｄ、ＧおよびＦ｝、｛Ｃ、Ｄ、ＥおよびＦ｝、｛Ｃ、Ｇ、ＥおよびＦ｝、｛Ｄ、Ｇ
、ＥおよびＦ｝、｛Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＧ｝、｛Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥ｝、｛Ａ、Ｂ
、Ｃ、ＤおよびＦ｝、｛Ａ、Ｂ、Ｃ、ＧおよびＥ｝、｛Ａ、Ｂ、Ｃ、ＧおよびＦ｝、｛Ａ
、Ｂ、Ｃ、ＥおよびＦ｝、｛Ａ、Ｂ、Ｄ、ＧおよびＥ｝、｛Ａ、Ｂ、Ｄ、ＧおよびＦ｝、
｛Ａ、Ｂ、Ｄ、ＥおよびＦ｝、｛Ａ、Ｂ、Ｇ、ＥおよびＦ｝、｛Ａ、Ｃ、Ｄ、ＧおよびＥ
｝、｛Ａ、Ｃ、Ｄ、ＧおよびＦ｝、｛Ａ、Ｃ、Ｄ、ＥおよびＦ｝、｛Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｅおよ
びＦ｝、｛Ａ、Ｄ、Ｇ、ＥおよびＦ｝、｛Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＧおよびＥ｝、｛Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｇ
およびＦ｝、｛Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＥおよびＦ｝、｛Ｂ、Ｃ、Ｇ、ＥおよびＦ｝、｛Ｂ、Ｄ、Ｇ
、ＥおよびＦ｝、｛Ｃ、Ｄ、Ｇ、ＥおよびＦ｝、｛Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＧおよびＥ｝、｛Ａ
、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＧおよびＦ｝、｛Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＥおよびＦ｝、｛Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｇ、Ｅ
およびＦ｝、｛Ａ、Ｂ、Ｄ、Ｇ、ＥおよびＦ｝、｛Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｇ、ＥおよびＦ｝、｛Ｂ
、Ｃ、Ｄ、Ｇ、ＥおよびＦ｝、または｛Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｇ、ＥおよびＦ｝。

ヘリカーゼは、Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（配列番号１０）中のＤ２７４、Ｅ２８４、Ｅ２８
５、Ｓ２８８、Ｓ６１５、Ｋ７１７およびＹ７２０に対応する位置の１個、２個、３個、
４個、５個、６個または７個にＦａｚなどの非天然アミノ酸を含んでよい。これらの位置
の任意の組合せは、Ｆａｚなどの非天然アミノ酸で置換されてよい。例えば上の表４ａの
各列について本発明のヘリカーゼは、上にＡからＧと標識の位置の任意の組合せにＦａｚ
などの非天然アミノ酸を含んでよい。

ヘリカーゼは、Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（配列番号１０）中のＤ２７４、Ｅ２８４、Ｅ２８
５、Ｓ２８８、Ｓ６１５、Ｋ７１７およびＹ７２０に対応する位置の２つ以上に１つまた
は複数のシステインおよび１つまたは複数のＦａｚなどの非天然アミノ酸の組合せを含ん
でよい。１つまたは複数のシステイン残基および１つまたは複数のＦａｚなどの非天然ア
ミノ酸の任意の組合せが関連する位置に存在してよい。例えば上の表４ａおよび４ｂの各
列について本発明のヘリカーゼは、上にＡからＧと標識の位置の任意の組合せに１つまた
は複数のシステインおよび１つまたは複数のＦａｚなどの非天然アミノ酸を含んでよい。

Ｈｅｌ３０８ヘリカーゼは、Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（配列番号１０）中のＤ２７４、Ｅ２
８４、Ｅ２８５、Ｓ２８８およびＳ６１５に対応する位置の１つまたは複数に１つもしく
は複数のシステイン残基および／または１つもしくは複数の非天然アミノ酸を含む、配列
番号１０、１３、１６、１９、２２、２５、２８、２９、３２、３３、３４、３７、３８
、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、
５２、５３、５４、５５および５８の１つの変種をより好ましくは含む。関連する位置は
、上の表４ａのカラムＡからＥに示されている。

ヘリカーゼは、Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（配列番号１０）中のＤ２７４、Ｅ２８４、Ｅ２８
５、Ｓ２８８、Ｓ６１５、Ｋ７１７およびＹ７２０に対応する位置の１個、２個、３個、
４個または５個、６個または７個にシステイン残基を含んでよい。これらの位置の任意の
組合せは、システインで置換されてよい。例えば上の表４ａの各列について本発明のヘリ
カーゼは、その列にＡからＥと標識の位置の次の組合せ：｛Ａ｝、｛Ｂ｝、｛Ｃ｝、｛Ｄ
｝、｛Ｅ｝、｛ＡおよびＢ｝、｛ＡおよびＣ｝、｛ＡおよびＤ｝、｛ＡおよびＥ｝、｛Ｂ
およびＣ｝、｛ＢおよびＤ｝、｛ＢおよびＥ｝、｛ＣおよびＤ｝、｛ＣおよびＥ｝、｛Ｄ
およびＥ｝、｛Ａ、ＢおよびＣ｝、｛Ａ、ＢおよびＤ｝、｛Ａ、ＢおよびＥ｝、｛Ａ、Ｃ
およびＤ｝、｛Ａ、ＣおよびＥ｝、｛Ａ、ＤおよびＥ｝、｛Ｂ、ＣおよびＤ｝、｛Ｂ、Ｃ
およびＥ｝、｛Ｂ、ＤおよびＥ｝、｛Ｃ、ＤおよびＥ｝、｛Ａ、Ｂ、ＣおよびＤ｝、｛Ａ
、Ｂ、ＣおよびＥ｝、｛Ａ、Ｂ、ＤおよびＥ｝、｛Ａ、Ｃ、ＤおよびＥ｝、｛Ｂ、Ｃ、Ｄ
およびＥ｝または｛Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥ｝のいずれにもシステインを含んでよい。

ヘリカーゼは、Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（配列番号１０）中のＤ２７４、Ｅ２８４、Ｅ２８
５、Ｓ２８８、Ｓ６１５、Ｋ７１７およびＹ７２０に対応する位置の１個、２個、３個、
４個または５個にＦａｚなどの非天然アミノ酸を含んでよい。これらの位置の任意の組合
せは、Ｆａｚなどの非天然アミノ酸で置換されてよい。例えば上の表４ａの各列について
本発明のヘリカーゼは、上にＡからＥと標識の位置の任意の組合せにＦａｚなどの非天然
アミノ酸を含んでよい。

ヘリカーゼは、Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（配列番号１０）中のＤ２７４、Ｅ２８４、Ｅ２８
５、Ｓ２８８およびＳ６１５に対応する位置の２つ以上に１つまたは複数のシステインお
よび１つまたは複数のＦａｚなどの非天然アミノ酸の組合せを含んでよい。１つまたは複
数のシステイン残基および１つまたは複数のＦａｚなどの非天然アミノ酸の任意の組合せ
は、関連する位置に存在してよい。例えば上の表４ａの各列について本発明のヘリカーゼ
は、上にＡからＥと標識の位置の任意の組合せに１つまたは複数のシステインおよび１つ
または複数のＦａｚなどの非天然アミノ酸を含んでよい。

Ｈｅｌ３０８ヘリカーゼはＤ２７２、Ｎ２７３、Ｄ２７４、Ｇ２８１、Ｅ２８４、Ｅ２
８５、Ｅ２８７、Ｓ２８８、Ｔ２８９、Ｇ２９０、Ｅ２９１、Ｄ２９３、Ｔ２９４、Ｎ３
００、Ｒ３０３、Ｋ３０４、Ｎ３１４、Ｓ３１５、Ｎ３１６、Ｈ３１７、Ｒ３１８、Ｋ３
１９、Ｌ３２０、Ｅ３２２、Ｒ３２６、Ｎ３２８、Ｓ６１５、Ｋ７１７、Ｙ７２０、Ｎ７
２１およびＳ７２４に１つもしくは複数のシステイン残基および／または１つもしくは複
数の非天然アミノ酸を含むＨｅｌ３０８Ｍｂｕ（すなわち配列番号１０）の配列の変種を
好ましくは含む。変種は好ましくはＤ２７２Ｃ、Ｎ２７３Ｃ、Ｄ２７４Ｃ、Ｇ２８１Ｃ、
Ｅ２８４Ｃ、Ｅ２８５Ｃ、Ｅ２８７Ｃ、Ｓ２８８Ｃ、Ｔ２８９Ｃ、Ｇ２９０Ｃ、Ｅ２９１
Ｃ、Ｄ２９３Ｃ、Ｔ２９４Ｃ、Ｎ３００Ｃ、Ｒ３０３Ｃ、Ｋ３０４Ｃ、Ｎ３１４Ｃ、Ｓ３
１５Ｃ、Ｎ３１６Ｃ、Ｈ３１７Ｃ、Ｒ３１８Ｃ、Ｋ３１９Ｃ、Ｌ３２０Ｃ、Ｅ３２２Ｃ、
Ｒ３２６Ｃ、Ｎ３２８Ｃ、Ｓ６１５Ｃ、Ｋ７１７Ｃ、Ｙ７２０Ｃ、Ｎ７２１ＣまたはＳ７
２４Ｃを含む。変種は好ましくはＤ２７２Ｆａｚ、Ｎ２７３Ｆａｚ、Ｄ２７４Ｆａｚ、Ｇ
２８１Ｆａｚ、Ｅ２８４Ｆａｚ、Ｅ２８５Ｆａｚ、Ｅ２８７Ｆａｚ、Ｓ２８８Ｆａｚ、Ｔ
２８９Ｆａｚ、Ｇ２９０Ｆａｚ、Ｅ２９１Ｆａｚ、Ｄ２９３Ｆａｚ、Ｔ２９４Ｆａｚ、Ｎ
３００Ｆａｚ、Ｒ３０３Ｆａｚ、Ｋ３０４Ｆａｚ、Ｎ３１４Ｆａｚ、Ｓ３１５Ｆａｚ、Ｎ
３１６Ｆａｚ、Ｈ３１７Ｆａｚ、Ｒ３１８Ｆａｚ、Ｋ３１９Ｆａｚ、Ｌ３２０Ｆａｚ、Ｅ
３２２Ｆａｚ、Ｒ３２６Ｆａｚ、Ｎ３２８Ｆａｚ、Ｓ６１５Ｆａｚ、Ｋ７１７Ｆａｚ、Ｙ
７２０Ｆａｚ、Ｎ７２１ＦａｚまたはＳ７２４Ｆａｚを含む。

Ｈｅｌ３０８ヘリカーゼは、Ｄ２７４、Ｅ２８４、Ｅ２８５、Ｓ２８８、Ｓ６１５、Ｋ
７１７およびＹ７２０に１つもしくは複数のシステイン残基および／または１つもしくは
複数の非天然アミノ酸を含むＨｅｌ３０８Ｍｂｕ（すなわち配列番号１０）の配列の変種
を好ましくは含む。本発明のヘリカーゼは、上にＡからＧと標識の位置の任意の組合せに
１つまたは複数のシステイン、１つまたは複数のＦａｚなどの非天然アミノ酸またはこれ
らの組合せを含んでよい。

Ｈｅｌ３０８ヘリカーゼは、Ｄ２７４、Ｅ２８４、Ｅ２８５、Ｓ２８８およびＳ６１５
の１つまたは複数に１つもしくは複数のシステイン残基および／または１つもしくは複数
の非天然アミノ酸を含むＨｅｌ３０８Ｍｂｕ（すなわち配列番号１０）の配列の変種を好
ましくは含む。例えばＨｅｌ３０８Ｍｂｕ（配列番号１０）に関して、本発明のヘリカー
ゼは、位置の次の組合せ：｛Ｄ２７４｝、｛Ｅ２８４｝、｛Ｅ２８５｝、｛Ｓ２８８｝、
｛Ｓ６１５｝、｛Ｄ２７４およびＥ２８４｝、｛Ｄ２７４およびＥ２８５｝、｛Ｄ２７４
およびＳ２８８｝、｛Ｄ２７４およびＳ６１５｝、｛Ｅ２８４およびＥ２８５｝、｛Ｅ２
８４およびＳ２８８｝、｛Ｅ２８４およびＳ６１５｝、｛Ｅ２８５およびＳ２８８｝、｛
Ｅ２８５およびＳ６１５｝、｛Ｓ２８８およびＳ６１５｝、｛Ｄ２７４、Ｅ２８４および
Ｅ２８５｝、｛Ｄ２７４、Ｅ２８４およびＳ２８８｝、｛Ｄ２７４、Ｅ２８４およびＳ６
１５｝、｛Ｄ２７４、Ｅ２８５およびＳ２８８｝、｛Ｄ２７４、Ｅ２８５およびＳ６１５
｝、｛Ｄ２７４、Ｓ２８８およびＳ６１５｝、｛Ｅ２８４、Ｅ２８５およびＳ２８８｝、
｛Ｅ２８４、Ｅ２８５およびＳ６１５｝、｛Ｅ２８４、Ｓ２８８およびＳ６１５｝、｛Ｅ
２８５、Ｓ２８８およびＳ６１５｝、｛Ｄ２７４、Ｅ２８４、Ｅ２８５およびＳ２８８｝
、｛Ｄ２７４、Ｅ２８４、Ｅ２８５およびＳ６１５｝、｛Ｄ２７４、Ｅ２８４、Ｓ２８８
およびＳ６１５｝、｛Ｄ２７４、Ｅ２８５、Ｓ２８８およびＳ６１５｝、｛Ｅ２８４、Ｅ
２８５、Ｓ２８８およびＳ６１５｝または｛Ｄ２７４、Ｅ２８４、Ｅ２８５、Ｓ２８８お
よびＳ６１５｝のいずれにもシステインまたはＦａｚなどの非天然アミノ酸を含んでよい
。

ヘリカーゼは、（ａ）Ｅ２８４ＣおよびＳ６１５Ｃ、（ｂ）Ｅ２８４ＦａｚおよびＳ６
１５Ｆａｚ、（ｃ）Ｅ２８４ＣおよびＳ６１５Ｆａｚまたは（ｄ）Ｅ２８４Ｆａｚおよび
Ｓ６１５Ｃを含む配列番号１０の変種を好ましくは含む。

ヘリカーゼは、Ｅ２８４ＣおよびＳ６１５Ｃを含む配列番号１０に示される配列をより
好ましくは含む。

本発明における使用のための好ましい非天然アミノ酸は、これだけに限らないが４−ア
ジド−Ｌ−フェニルアラニン（Ｆａｚ）、４−アセチル−Ｌ−フェニルアラニン、３−ア
セチル−Ｌ−フェニルアラニン、４−アセトアセチル−Ｌ−フェニルアラニン、Ｏ−アリ
ル−Ｌ−チロシン、３−（フェニルセラニル）−Ｌ−アラニン、Ｏ−２−プロピン−１−
イル−Ｌ−チロシン、４−（ジヒドロキシボリル）−Ｌ−フェニルアラニン、４−［（エ
チルスルファニル）カルボニル］−Ｌ−フェニルアラニン、（２Ｓ）−２−アミノ−３−
｛４−［（プロパン−２−イルスルファニル）カルボニル］フェニル｝プロパン酸、（２
Ｓ）−２−アミノ−３−｛４−［（２−アミノ−３−スルファニルプロパノイル）アミノ
］フェニル｝プロパン酸、Ｏ−メチル−Ｌ−チロシン、４−アミノ−Ｌ−フェニルアラニ
ン、４−シアノ−Ｌ−フェニルアラニン、３−シアノ−Ｌ−フェニルアラニン、４−フル
オロ−Ｌ−フェニルアラニン、４−ヨード−Ｌ−フェニルアラニン、４−ブロモ−Ｌ−フ
ェニルアラニン、Ｏ−（トリフルオロメチル）チロシン、４−ニトロ−Ｌ−フェニルアラ
ニン、３−ヒドロキシ−Ｌ−チロシン、３−アミノ−Ｌ−チロシン、３−ヨード−Ｌ−チ
ロシン、４−イソプロピル−Ｌ−フェニルアラニン、３−（２−ナフチル）−Ｌ−アラニ
ン、４−フェニル−Ｌ−フェニルアラニン、（２Ｓ）−２−アミノ−３−（ナフタレン−
２−イルアミノ）プロパン酸、６−（メチルスルファニル）ノルロイシン、６−オキソ−
Ｌ−リシン、Ｄ−チロシン、（２Ｒ）−２−ヒドロキシ−３−（４−ヒドロキシフェニル
）プロパン酸、（２Ｒ）−２−アンモニオオクタノエート３−（２，２’−ビピリジン−
５−イル）−Ｄ−アラニン、２−アミノ−３−（８−ヒドロキシ−３−キノリル）プロパ
ン酸、４−ベンゾイル−Ｌ−フェニルアラニン、Ｓ−（２−ニトロベンジル）システイン
、（２Ｒ）−２−アミノ−３−［（２−ニトロベンジル）スルファニル］プロパン酸、（
２Ｓ）−２−アミノ−３−［（２−ニトロベンジル）オキシ］プロパン酸、Ｏ−（４，５
−ジメトキシ−２−ニトロベンジル）−Ｌ−セリン、（２Ｓ）−２−アミノ−６−（｛［
（２−ニトロベンジル）オキシ］カルボニル｝アミノ）ヘキサン酸、Ｏ−（２−ニトロベ
ンジル）−Ｌ−チロシン、２−ニトロフェニルアラニン、４−［（Ｅ）−フェニルジアゼ
ニル］−Ｌ−フェニルアラニン、４−［３−（トリフルオロメチル）−３Ｈ−ジアジレン
−３−イル］−Ｄ−フェニルアラニン、２−アミノ−３−［［５−（ジメチルアミノ）−
１−ナフチル］スルホニルアミノ］プロパン酸、（２Ｓ）−２−アミノ−４−（７−ヒド
ロキシ−２−オキソ−２Ｈ−クロメン−４−イル）ブタン酸、（２Ｓ）−３−［（６−ア
セチルナフタレン−２−イル）アミノ］−２−アミノプロパン酸、４−（カルボキシメチ
ル）フェニルアラニン、３−ニトロ−Ｌ−チロシン、Ｏ−スルホ−Ｌ−チロシン、（２Ｒ
）−６−アセトアミド−２−アンモニオヘキサノエート、１−メチルヒスチジン、２−ア
ミノノナン酸、２−アミノデカン酸、Ｌ−ホモシステイン、５−スルファニルノルバリン
、６−スルファニル−Ｌ−ノルロイシン、５−（メチルスルファニル）−Ｌ−ノルバリン
、Ｎ^６−｛［（２Ｒ，３Ｒ）−３−メチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピロール−２−イ
ル］カルボニル｝−Ｌ−リシン、Ｎ^６−［（ベンジルオキシ）カルボニル］リシン、（２
Ｓ）−２−アミノ−６−［（シクロペンチルカルボニル）アミノ］ヘキサン酸、Ｎ^６−［
（シクロペンチルオキシ）カルボニル］−Ｌ−リシン、（２Ｓ）−２−アミノ−６−｛［
（２Ｒ）−テトラヒドロフラン−２−イルカルボニル］アミノ｝ヘキサン酸、（２Ｓ）−
２−アミノ−８−［（２Ｒ，３Ｓ）−３−エチニルテトラヒドロフラン−２−イル］−８
−オキソオクタン酸、Ｎ^６−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−リシン、（２Ｓ）
−２−ヒドロキシ−６−（｛［（２−メチル−２−プロパニル）オキシ］カルボニル｝ア
ミノ）ヘキサン酸、Ｎ^６−［（アリルオキシ）カルボニル］リシン、（２Ｓ）−２−アミ
ノ−６−（｛［（２−アジドベンジル）オキシ］カルボニル｝アミノ）ヘキサン酸、Ｎ^６
−Ｌ−プロリル−Ｌ−リシン、（２Ｓ）−２−アミノ−６−｛［（プロパ−２−イン−１
−イルオキシ）カルボニル］アミノ｝ヘキサン酸およびＮ^６−［（２−アジドエトキシ）
カルボニル］−Ｌ−リシンを含む。

最も好ましい非天然アミノ酸は、４−アジド−Ｌ−フェニルアラニン（Ｆａｚ）である
。

上に考察したとおり、Ｈｅｌ３０８ヘリカーゼの変種は、野生型ヘリカーゼのものから
変化しているアミノ酸配列を有し、ポリヌクレオチド結合活性を保持している酵素である
。本発明のＨｅｌ３０８ヘリカーゼでは、配列番号１０、１３、１６、１９、２２、２５
、２８、２９、３２、３３、３４、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、
４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５および５８の１つ
の変種は、それがＨｅｌ３０８Ｍｂｕ（配列番号１０）中のＤ２７２、Ｎ２７３、Ｄ２７
４、Ｇ２８１、Ｅ２８４、Ｅ２８５、Ｅ２８７、Ｓ２８８、Ｔ２８９、Ｇ２９０、Ｅ２９
１、Ｄ２９３、Ｔ２９４、Ｎ３００、Ｒ３０３、Ｋ３０４、Ｎ３１４、Ｓ３１５、Ｎ３１
６、Ｈ３１７、Ｒ３１８、Ｋ３１９、Ｌ３２０、Ｅ３２２、Ｒ３２６、Ｎ３２８、Ｓ６１
５、Ｋ７１７、Ｙ７２０、Ｎ７２１およびＳ７２４に対応する位置の１つまたは複数に１
つもしくは複数のシステイン残基および／または１つもしくは複数の非天然アミノ酸を含
む限り追加的修飾を含んでよい。好適な修飾および変種は、２つ以上の部分の接続を伴う
実施形態を参照して上に考察されている。

変種は、Ｗｏｏｄｍａｎら（J. Mol. Biol. (2007)374、1139-1144）に開示のドメイン
５中に変異を含んでよい。これらの変異は、配列番号１０中のＲ６８５Ａ、Ｒ６８７Ａお
よびＲ６８９Ａに対応する。

本発明のＨｅｌ３０８ヘリカーゼの２つ以上の部分の接続
本発明において修飾されたＨｅｌ３０８ヘリカーゼは、ポリヌクレオチド結合ドメイン
を含む。ポリヌクレオチド結合ドメインは、上に定義されている。本発明における使用の
ための未修飾Ｈｅｌ３０８ヘリカーゼのポリヌクレオチド結合ドメインは、それを通って
ポリヌクレオチドがヘリカーゼから解離できる開口部を含む。

好ましい実施形態ではＨｅｌ３０８ヘリカーゼは、ヘリカーゼの２つ以上の部分が繋が
れて、それを通ってポリヌクレオチドがヘリカーゼから解離できるポリヌクレオチド結合
ドメイン中の開口部のサイズを低減するようにさらに修飾されている。２つ以上の部分は
、上に考察した方法のいずれで繋がれてもよい。

非接続
別の実施形態ではＨｅｌ３０８ヘリカーゼは、ヘリカーゼの２つ以上の部分が繋がれて
、それを通ってポリヌクレオチドがヘリカーゼから解離できるポリヌクレオチド結合ドメ
イン中の開口部のサイズを低減するように修飾されていない。好ましくは、１つまたは複
数のシステインまたは１つまたは複数の非天然アミノ酸はいずれもヘリカーゼ中の別のア
ミノ酸に繋がれない。好ましくは、ヘリカーゼ中の２つのアミノ酸は、それらの天然また
は非天然Ｒ基を介して併せて繋がれない。

構築物
本発明は、本発明のヘリカーゼおよび追加的ポリヌクレオチド結合成分を含む構築物で
あって、ヘリカーゼがポリヌクレオチド結合成分に付着しており、ポリヌクレオチドの移
動を制御する能力を有する構築物も提供する。ヘリカーゼは、追加的ポリヌクレオチド結
合成分に付着している。構築物は人工または非天然である。

本発明の構築物は、鎖配列決定法の際にポリヌクレオチドの移動を制御するための有用
な手段である。本発明の構築物は、本発明の修飾ヘリカーゼよりも配列決定されているポ
リヌクレオチドから離されにくい。構築物は、それがナノポアを通るポリヌクレオチドの
移行を制御することから、ポリヌクレオチドのさらに長い読み取り長を提供できる。

特異的ポリヌクレオチド配列に結合する標的化構築物も設計できる。下により詳細に考
察されるとおりポリヌクレオチド結合成分は、特異的ポリヌクレオチド配列に結合でき、
それにより構築物のヘリカーゼ部分を特異的配列に標的化できる。

構築物は、ポリヌクレオチドの移動を制御する能力を有する。これは、上に考察したと
おり決定できる。

本発明の構築物は、単離、実質的に単離、精製または実質的に精製されていてよい。構
築物は、それが脂質、ポリヌクレオチドまたはポア単量体などの任意の他の構成成分を完
全に含まない場合に単離または精製されている。構築物は、その目的の使用を妨害しない
担体または希釈剤と混合されている場合に実質的に単離されている。例えば構築物は、１
０％未満、５％未満、２％未満または１％未満の脂質、ポリヌクレオチドまたはポア単量
体などの他の構成成分を含む形態で存在する場合に実質的に単離または実質的に精製され
ている。

ヘリカーゼは、好ましくは共有結合的に追加的ポリヌクレオチド結合成分に付着してい
る。ヘリカーゼは、２個または３個などの１個以上の点で成分に付着していてよい。

ヘリカーゼは、当技術分野において公知の任意の方法を使用して成分に共有結合的に付
着できる。好適な方法は、２つ以上の部分を繋ぐことを参照して上に考察されている。

ヘリカーゼおよび成分は、別々に産生され、次いで一緒に付着されてよい。２つの構成
成分は、任意の立体配置で付着されてよい。例えばそれらは、それらの末端（すなわちア
ミノまたはカルボキシ末端）アミノ酸を介して付着してよい。好適な立体配置は、これだ
けに限らないが、成分のアミノ末端がヘリカーゼのカルボキシ末端に付着しているおよび
その逆を含む。代替的に２つの構成成分は、それらの配列内のアミノ酸を介して付着され
得る。例えば成分は、ヘリカーゼのループ領域中の１つまたは複数のアミノ酸に付着する
場合がある。好ましい実施形態では成分の末端アミノ酸は、ヘリカーゼのループ領域中の
１つまたは複数のアミノ酸に付着する。

好ましい実施形態ではヘリカーゼは、例えば上に考察した１つまたは複数のリンカー分
子を介して、成分に化学的に付着する。別の好ましい実施形態ではヘリカーゼは、成分に
遺伝子的に融合される。構築物全体が１本のポリヌクレオチド配列から発現される場合に
ヘリカーゼは、遺伝子的に成分に融合されている。ヘリカーゼおよび成分のコード配列は
、構築物をコードしている１本のポリヌクレオチド配列を形成するために任意の方法で組
み合わされてよい。核酸結合タンパク質へのポアの遺伝子的融合は、国際出願第ＰＣＴ／
ＧＢ０９／００１６７９号（ＷＯ２０１０／００４２６５として公開）において考察され
ている。

ヘリカーゼおよび成分は、任意の立体配置で遺伝的に融合され得る。ヘリカーゼおよび
成分は、それらの末端アミノ酸を介して融合され得る。例えば成分のアミノ末端はヘリカ
ーゼのカルボキシ末端に融合でき、逆も同様である。成分のアミノ酸配列は、ヘリカーゼ
のアミノ酸配列にインフレームで好ましくは付加される。換言すると成分は、ヘリカーゼ
の配列内に好ましくは挿入される。そのような実施形態ではヘリカーゼおよび成分は、２
つの点で、すなわち成分のアミノおよびカルボキシ末端アミノ酸を介して典型的には付着
される。成分がヘリカーゼの配列内に挿入される場合、成分のアミノおよびカルボキシ末
端アミノ酸が近接近にあり、ヘリカーゼまたはその変種の配列内の隣接アミノ酸にそれぞ
れ付着していることは好ましい。好ましい実施形態では成分は、ヘリカーゼのループ領域
に挿入される。

構築物は、ポリヌクレオチドの移動を制御するヘリカーゼの能力を保持している。ヘリ
カーゼのこの能力は、そのβ鎖およびαヘリックスによって典型的には提供されるその三
次元構造により典型的には提供される。αヘリックスおよびβ鎖は、ループ領域により典
型的には繋がれている。ポリヌクレオチドの移動を制御するヘリカーゼの能力に影響を与
えることを回避するために、成分は好ましくはヘリカーゼのいずれかの末端に遺伝子的に
融合される、またはヘリカーゼの表面露出ループに挿入される。特異的ヘリカーゼのルー
プ領域は、当技術分野において公知の方法を使用して同定できる。本発明のＨｅｌ３０８
実施形態では成分は、αヘリックスのいずれにも好ましくは遺伝子的に融合されない。

ヘリカーゼは、成分に直接付着され得る。ヘリカーゼは、上に考察したとおり２つまた
は３つなどの１つまたは複数のリンカーを使用して成分に好ましくは付着される。１つま
たは複数のリンカーは、成分の移動性を限定するように設計され得る。ヘリカーゼおよび
／または成分は、上に考察したとおり１つまたは複数のリンカーの付着を促進するように
修飾され得る。

切断可能なリンカーは、非付着構成成分からの構築物の分離への補助として使用でき、
合成反応をさらに制御するために使用できる。例えばヘテロ二機能性リンカーは、ヘリカ
ーゼと反応できるが、成分とはできない。ヘリカーゼタンパク質を表面に結合するために
リンカーの遊離末端が使用できる場合、最初の反応由来の未反応ヘリカーゼは混合物から
除去され得る。続いてリンカーは、成分と反応する基を露出させるために切断され得る。
付加的に、一連の連結反応に続いて、条件は最初にヘリカーゼへの反応のために、次いで
リンカーの切断後の成分への反応のために最適化され得る。第二の反応は、リンカーが既
に付着している領域に限定されることから、成分との正確な反応部位に向けてさらに方向
付けられる。

ヘリカーゼは、ヘリカーゼ／架橋剤複合体が成分に共有結合的に付着する前に、二機能
性架橋剤に共有結合的に付着されてよい。代替的に成分は、二機能性架橋剤／成分複合体
がヘリカーゼに付着する前に、二機能性架橋剤に共有結合的に付着してよい。ヘリカーゼ
および成分は、化学的架橋剤に同時に共有結合的に付着してよい。

ヘリカーゼの成分への付着の好ましい方法は、上に記載のとおりシステイン連結および
Ｆａｚ連結である。好ましい実施形態では反応性システインは、成分に遺伝子的に付着し
ているペプチドリンカー上に存在する。これは、成分から他の利用可能なシステイン残基
を除去するために追加的修飾が必ずしも必要ではないことを意味する。

ヘリカーゼまたは成分のそれ自体への交差結合は、リンカーの濃度をヘリカーゼおよび
／または成分の大過剰に維持することによって妨げることができる。代替的に「鍵と鍵穴
」配置は、２つのリンカーが使用される場合に使用できる。各リンカーの一方の末端だけ
が長いリンカーを形成するために併せて反応でき、リンカーの他方の末端は構築物の異な
る部分（すなわちヘリカーゼまたは成分）とそれぞれ反応する。これは下でより詳細に考
察される。

付着の部位は、構築物がポリヌクレオチドと接触する場合に、ヘリカーゼおよび成分の
両方がポリヌクレオチドに結合でき、その移動を制御できるように選択される。

付着は、ヘリカーゼおよび成分のポリヌクレオチド結合活性を使用して促進され得る。
例えば相補的ポリヌクレオチドは、ヘリカーゼおよび成分を、それらがハイブリダイズす
ることから、併せて運ぶために使用できる。ヘリカーゼは一方のポリヌクレオチドに結合
でき、成分は相補的ポリヌクレオチドに結合できる。次いで２つのポリヌクレオチドは、
相互にハイブリダイズできるようになる。これは、ヘリカーゼを成分と密接に接触するよ
うにして、連結反応をさらに効率的にする。これは、標的ポリヌクレオチドの移動を制御
するための正確な方向で２つ以上のヘリカーゼを付着させるために特に有益である。使用
できる相補的ポリヌクレオチドの一例は、下に示されている。

ヘリカーゼ−Ｐｈｉ２９構築物に関して、下のＤＮＡは使用され得る。

構築物の精製を容易にするためにタグが構築物に付加され得る。これらのタグは、次い
でそれらの除去が必要である場合に、化学的にまたは酵素的に切断除去され得る。フルオ
ロフォアまたはクロモフォアも含まれる場合があり、これらも切断可能であってよい。

構築物を精製するための簡単な方法は、各タンパク質（すなわちヘリカーゼおよび成分
）上に、ヘキサ−Ｈｉｓ−タグおよびＳｔｒｅｐ−タグ（登録商標）などの異なる精製タ
グを含むことである。２つのタンパク質が互いに異なる場合、この方法は特に有用である
。２つのタグの使用は、両方のタグを含む分子種だけが容易に精製されるようにする。

２つのタンパク質が２つの異なるタグを有さない場合、他の方法が使用できる。例えば
遊離表面システインを有するタンパク質または構築物を形成するために反応していない付
着リンカーを有するタンパク質は、例えばマレイミドリンカーに対するヨードアセトアミ
ドレジンを使用して除去され得る。

本発明の構築物は、未反応タンパク質から異なるＤＮＡ前進性特徴に基づいても精製さ
れ得る。具体的には本発明の構築物は、未反応タンパク質からポリヌクレオチドに対する
親和性の増大、既に結合したポリヌクレオチドから離れる可能性の低減および／またはナ
ノポアを通るポリヌクレオチドの移行を制御するときのポリヌクレオチドの読み取り長さ
の増大に基づいて精製され得る。

特異的ポリヌクレオチド配列に結合する標的化構築物も設計され得る。下により詳細に
考察されるとおりポリヌクレオチド結合成分は、特異的ポリヌクレオチド配列に結合でき
、それにより構築物のヘリカーゼ部分を特異的配列に標的化する。

ポリヌクレオチド結合成分
本発明の構築物は、ポリヌクレオチド結合成分を含む。ポリヌクレオチド結合成分は、
ポリヌクレオチドに結合できるポリペプチドである。成分は、規定のポリヌクレオチド配
列に好ましくは特異的結合できる。換言すると成分は、特異的ポリヌクレオチド配列に好
ましくは結合するが、少なくとも１０分の１の結合を異なる配列に、またはより好ましく
は少なくとも１００分の１の結合を異なる配列に、または最も好ましくは少なくとも１０
００分の１の結合を異なる配列に示す。異なる配列は無作為配列であってよい。いくつか
の実施形態では成分は、特異的ポリヌクレオチド配列に結合するが、異なる配列への結合
は測定できない。特異的配列に結合する成分は、そのような配列に標的化される構築物を
設計するために使用され得る。

成分は、典型的にはポリヌクレオチドの少なくとも１つの特徴と相互作用および改変す
る。成分は、個々のヌクレオチドまたは、ジまたはトリヌクレオチドなどのヌクレオチド
の短い鎖を形成するように切断することによってポリヌクレオチドを修飾できる。成分は
、ポリヌクレオチドを特異的位置に方向付けるまたは移動させること、すなわちその移動
を制御することによってそれを修飾できる。

核酸などのポリヌクレオチドは、２個以上のヌクレオチドを含む巨大分子である。ポリ
ヌクレオチドまたは核酸は、任意のヌクレオチドの任意の組合せを含み得る。ヌクレオチ
ドは、天然に存在するものまたは人工的であってよい。標的ポリヌクレオチド中の１つま
たは複数のヌクレオチドは、酸化またはメチル化され得る。標的ポリヌクレオチド中の１
つまたは複数のヌクレオチドは、損傷をうけ得る。例えばポリヌクレオチドは、ピリミジ
ン二量体を含む場合がある。そのような二量体は、紫外光による障害に典型的には関連し
、皮膚メラノーマの主原因である。標的ポリヌクレオチド中の１つまたは複数のヌクレオ
チドは、例えば標識またはタグで、修飾され得る。好適な標識は、上に記載されている。
標的ポリヌクレオチドは、１つまたは複数のスペーサーを含み得る。

ヌクレオチドは、典型的には、核酸塩基、糖および少なくとも１つのリン酸基を含有す
る。核酸塩基は典型的には複素環である。核酸塩基は、これだけに限らないがプリンおよ
びピリミジンならびにより具体的にはアデニン、グアニン、チミン、ウラシルおよびシト
シンを含む。糖は典型的には五炭糖である。ヌクレオチド糖は、これだけに限らないがリ
ボースおよびデオキシリボースを含む。ヌクレオチドは、典型的にはリボヌクレオチドま
たはデオキシリボヌクレオチドである。ヌクレオチドは典型的には一リン酸、二リン酸ま
たは三リン酸を含有する。リン酸は、ヌクレオチドの５’または３’側に付着できる。

ヌクレオチドは、これだけに限らないがアデノシン一リン酸（ＡＭＰ）、グアノシン一
リン酸（ＧＭＰ）、チミジン一リン酸（ＴＭＰ）、ウリジン一リン酸（ＵＭＰ）、シチジ
ン一リン酸（ＣＭＰ）、５−メチルシチジンモノホスフェート、５−メチルシチジンジホ
スフェート、５−メチルシチジントリホスフェート、５−ヒドロキシメチルシチジンモノ
ホスフェート、５−ヒドロキシメチルシチジンジホスフェート、５−ヒドロキシメチルシ
チジントリホスフェート、環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）、環状グアノシン一リン
酸（ｃＧＭＰ）、デオキシアデノシン一リン酸（ｄＡＭＰ）、デオキシグアノシン一リン
酸（ｄＧＭＰ）、デオキシチミジン一リン酸（ｄＴＭＰ）、デオキシウリジン一リン酸（
ｄＵＭＰ）およびデオキシシチジン一リン酸（ｄＣＭＰ）を含む。ヌクレオチドは、好ま
しくはＡＭＰ、ＴＭＰ、ＧＭＰ、ＣＭＰ、ＵＭＰ、ｄＡＭＰ、ｄＴＭＰ、ｄＧＭＰ、ｄＣ
ＭＰおよびｄＵＭＰから選択される。

ヌクレオチドは、塩基を持たない場合がある（すなわち核酸塩基を欠失している）。ヌ
クレオチドは、核酸塩基および糖も欠失している場合がある（すなわちＣ３スペーサーで
ある）。

ポリヌクレオチド中のヌクレオチドは、任意の様式で相互に付着されてよい。ヌクレオ
チドは、核酸においてと同様にそれらの糖およびリン酸基により典型的には付着されてい
る。ヌクレオチドは、ピリミジン二量体においてと同様にそれらの核酸塩基を介して繋が
れてよい。

ポリヌクレオチドは、１本鎖または２本鎖であってよい。ポリヌクレオチドの少なくと
も一部は、好ましくは２本鎖である。

ポリヌクレオチドは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）などの核
酸であってよい。標的ポリヌクレオチドは、ＤＮＡの１本鎖にハイブリダイズしたＲＮＡ
の１本鎖を含む場合がある。ポリヌクレオチドは、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、グリセロー
ル核酸（ＧＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）またはヌクレオ
チド側鎖を有する他の合成ポリマーなどの当技術分野において公知の任意の合成核酸であ
ってよい。

成分の三次構造が公知であることは好ましい。成分の三次元構造の知識は、本発明の構
築物におけるその機能を促進するために成分に修飾を作製できるようにする。

成分は、任意のサイズであってよく、任意の構造を有してよい。例えば成分は、二量体
または三量体などのオリゴマーである場合がある。成分は、好ましくは１つの単量体から
形成された小さな球状ポリペプチドである。そのような成分は操作が容易であり、ポリヌ
クレオチドの移動を制御するヘリカーゼの能力を、特にヘリカーゼの配列に融合または挿
入された場合に、干渉しにくい。

成分のアミノおよびカルボキシ末端は、好ましくは近接近にある。成分のアミノおよび
カルボキシ末端は、成分の同じ面により好ましくは存在する。そのような実施形態は、ヘ
リカーゼの配列中への成分の挿入を促進する。例えば成分のアミノおよびカルボキシ末端
が近接近にある場合、それぞれはヘリカーゼの配列中の隣接アミノ酸への遺伝子的融合に
よって付着され得る。

成分の活性部位の位置および機能が公知であることも好ましい。これは、成分の活性を
消滅させる活性部位に修飾が作製されることを防ぐ。これは成分がヘリカーゼに付着でき
るようにし、成分はポリヌクレオチドに結合し、その移動を制御する。成分がポリヌクレ
オチドに結合および方向付けられる方法の知識は、有効な構築物を設計できるようにする
。

本発明の構築物は鎖配列決定法において有用である。成分は、鎖配列決定法およびヌク
レオチドの識別に適合性である緩衝液バックグラウンドにおいてポリヌクレオチドに好ま
しくは結合する。成分は、１００ｍＭから２Ｍなどの通常の生理学的レベルを大幅に上回
る塩濃度において少なくとも残存活性を好ましくは有する。成分は、高塩濃度でのその活
性を増大させるためにより好ましくは修飾される。成分は、その前進性、安定性および有
効期間を改善するために修飾されてもよい。

好適な修飾は、好塩性、中度好塩性細菌、好熱性および中等度好熱性生物などの好極限
性細菌（extremphile）、ならびに中温性または好熱性エキソヌクレアーゼの耐塩性、安
定性および温度依存性を変更するための定向進化手法由来のポリヌクレオチド結合成分の
特性決定から決定され得る。

ポリヌクレオチド結合成分は、ヘリックス−ヘアピン−ヘリックス（helix-hairpin-he
lix）（ＨｈＨ）ドメイン、真核生物１本鎖結合タンパク質（single-stranded binding p
rotein）（ＳＳＢ）、細菌性ＳＳＢ、古細菌ＳＳＢ、ウイルス性ＳＳＢ、２本鎖結合タン
パク質、スライディングクランプ、前進性因子（processivity factor）、ＤＮＡ結合ル
ープ、複製開始タンパク質、テロメア結合タンパク質、リプレッサー、亜鉛フィンガーお
よび増殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen）（ＰＣＮＡ）から独立に選
択される１つまたは複数のドメインを好ましくは含む。

ヘリックス−ヘアピン−ヘリックス（ＨｈＨ）ドメインは、ＤＮＡに配列非特異的様式
で結合するポリペプチドモチーフである。それらは、ポリメラーゼに融合された場合に塩
安定性および前進性を付与し、それらの熱安定性を増大させることが示されている。好適
なドメインは、メタノピュルス・カンドレリ（Methanopyrus kandleri）由来のトポイソ
メラーゼＶ（配列番号１２９）由来のドメインＨ（残基６９６〜７５１）およびドメイン
ＨＩ（残基６９６〜８０２）を含む。下の考察のとおり、ポリヌクレオチド結合成分は、
配列番号１３０に示す配列番号１２９のドメインＨ〜Ｌであってよい。メタノピュルス・
カンドレリ（Methanopyrus kandleri）由来のトポイソメラーゼＶは、下に考察の２本鎖
結合タンパク質の一例である。

ＨｈＨドメインは、配列番号９４もしくは１０７もしくは１０８に示す配列またはその
変種を好ましくは含む。このドメインは、本発明の構築物において使用された場合にヘリ
カーゼの前進性および耐塩性を増大させる。配列番号９４もしくは１０７もしくは１０８
の変種は、配列番号９４または１０７または１０８のものから変化しているアミノ酸配列
を有し、ポリヌクレオチド結合活性を保持しているタンパク質である。これは、上に記載
のとおり測定され得る。変種は、アミノ酸同一性に基づいてその配列全体にわたって、配
列番号９４または１０７または１０８に少なくとも５０％相同性（またはヘリカーゼと関
連して上に考察した任意の％相同性）を典型的には有し、ポリヌクレオチド結合活性を保
持している。変種はヘリカーゼと関連して上にまたはポアと関連して下に考察したいずれ
の方法においても配列番号９４または１０７または１０８と異なっていてよい。変種は、
上に考察したとおりヘリカーゼへの付着を促進するために１つもしくは複数の置換システ
イン残基および／または１つもしくは複数の置換Ｆａｚ残基を好ましくは含む。

ＳＳＢは、高親和性で配列非特異的様式で１本鎖ＤＮＡに結合する。それらは、全ての
生き物に種々の形態で存在し、単量体または多量体としてＤＮＡに結合する。アミノ酸配
列の配列比較およびアルゴリズム（Ｈｉｄｄｅｎ Ｍａｒｋｏｖモデルなど）を使用して
、ＳＳＢはそれらの配列相同に従って分類され得る。Ｐｆａｍファミリー、ＰＦ００４３
６は、全てが公知のＳＳＢに配列類似性を示すタンパク質を含む。ＳＳＢのこの群は、次
いでタンパク質の構造分類（Structural Classification of Proteins）（ＳＣＯＰ）に
従ってさらに分類され得る。ＳＳＢは、次の系列に分けられる：クラス；全てのベータタ
ンパク質、フォールド；ＯＢ−フォールド、スーパーファミリー：核酸結合タンパク質、
ファミリー；１本鎖ＤＮＡ結合ドメイン、ＳＳＢ。このファミリー内でＳＳＢは、各サブ
ファミリー内でしばしば特性決定されるいくつかの型の分子種を含むサブファミリーに分
類され得る。

ＳＳＢは、ヒト、マウス、ラット、真菌、原虫または植物など由来の真核生物由来、細
菌および古細菌などの原核生物由来またはウイルス由来であってよい。

真核性ＳＳＢは、複製タンパク質Ａ（ＲＰＡ）として公知である。多くの場合それらは
、さまざまなサイズの単位から形成されたヘテ三量体である。大きな単位（例えばサッカ
ロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）のＲＰＡ７０）のいくつかは安定
であり、単量体形態でｓｓＤＮＡに結合する。

細菌性ＳＳＢは安定なホモ四量体（例えば大腸菌（E.coli）、マイコバクテリウム・ス
メグマチス（Mycobacterium smegmatis）およびヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter
pylori））またはホモ二量体（例えばディノコッカス・ラディオデュランス（Deinococcu
s radiodurans）およびサーモトガ・マリティマ（Thermotoga maritima））としてＤＮＡ
に結合する。古細菌ゲノム由来のＳＳＢは、真核ＲＰＡと関連すると考えられている。ク
レン古細菌門スルホロブス・ソルファタリカス（Sulfolobus solfataricus）によってコ
ードされるＳＳＢなどのそのいくつかは、ホモ四量体である。他の大部分の種由来のＳＳ
Ｂは、真核生物由来の複製タンパク質に密接に関連しており、ＲＰＡと称される。これら
の種のいくつかにおいて、それらは単量体であることが示されている（メタノコッカス・
ジャンナスキイ（Methanococcus jannaschii）およびメタノサーモバクター・サーモオー
トトロフィクカム（Methanothermobacter thermoautotrophicum）。さらに、アーケオグ
ロブス・フルギダス（Archaeoglobus fulgidus）およびメタノコッコイデス・ブルトニイ
（Methanococcoides burtonii）を含む古細菌の他の種は、ＲＰＡに配列類似性を有する
２つのオープンリーディングフレームをそれぞれ含有すると考えられている。タンパク質
レベルでの証拠はなく、それらのＤＮＡ結合能力またはオリゴマー状態に関する公表され
たデータもない。しかし、これらの各遺伝子中の２つのオリゴヌクレオチド／オリゴ糖（
oligonucleotide/oligosaccharide）（ＯＢ）フォールドの存在（Ｍ．ブルトニイ（M.bur
tonii）ＯＲＦの１つの場合にはＯＢフォールド３個）はそれらも１本鎖ＤＮＡに結合す
ることを示唆している。

ウイルス性ＳＳＢは、単量体としてＤＮＡに結合する。このことおよびそれらの比較的
小さなサイズは、それらを、例えば可動性ペプチドリンカーを介して他のタンパク質に遺
伝子的に融合しやすくする。代替的にＳＳＢは、別々に発現され、化学的方法（例えばシ
ステイン、非天然アミノ酸）によって他のタンパク質に付着される場合がある。これは下
でより詳細に考察される。

ＳＳＢは、好ましくは（ｉ）正味の負電荷を有さないカルボキシ末端（Ｃ末端）領域を
含むＳＳＢ（ｉｉ）Ｃ末端領域の正味の負電荷を減少させる１つまたは複数の修飾をその
Ｃ末端領域に含む修飾ＳＳＢのいずれかである。そのようなＳＳＢは、膜貫通ポアを遮断
せず、したがって標的ポリヌクレオチドの特性決定を可能にする。

正味の負電荷を有さないＣ末端領域を含むＳＳＢの例は、これだけに限らないが、ヒト
ミトコンドリアＳＳＢ（ＨｓｍｔＳＳＢ；配列番号１１８、ヒト複製タンパク質Ａ ７０
ｋＤａサブユニット、ヒト複製タンパク質Ａ １４ｋＤａサブユニット、オキシトリカ・
ノバ（Oxytricha nova）由来テロメア末端結合タンパク質アルファサブユニット、オキシ
トリカ・ノバ（Oxytricha nova）由来テロメア末端結合タンパク質ベータサブユニットの
コアドメイン、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）由来のテ
ロメアタンパク質１（Ｐｏｔ１）の保護、ヒトＰｏｔ１、マウスまたはラット由来ＢＲＣ
Ａ２のＯＢ−フォールドドメイン、ｐｈｉ２９由来のｐ５タンパク質（配列番号１１９）
またはこれらのタンパク質のいずれかの変種を含む。変種は、野生型タンパク質から変化
したアミノ酸配列を有し、１本鎖ポリヌクレオチド結合活性を保持しているタンパク質で
ある。ポリヌクレオチド結合活性は、当技術分野において公知の任意の方法を使用して決
定できる（上に記載のとおり）。例えば、１本鎖ポリヌクレオチドに結合する変種の能力
は、実施例に記載のとおり決定され得る。

配列番号１１８または１１９の変種は、アミノ酸同一性に基づいてその配列全体にわた
って、配列番号１１８または１１９に少なくとも５０％相同性（またはヘリカーゼと関連
して上に考察した任意の％相同性）を典型的には有し、１本鎖ポリヌクレオチド結合活性
を保持している。変種はヘリカーゼと関連して上に考察したいずれの方法においても配列
番号１１８または１１９と異なっていてよい。具体的には変種は、表８および９に示す１
つまたは複数の保存的置換を有する場合がある。

正味の負電荷を減少させる１つまたは複数の修飾をそれらのＣ末端領域に必要とするＳ
ＳＢの例は、これだけに限らないが、大腸菌（E. coli）のＳＳＢ（ＥｃｏＳＳＢ；配列
番号１２０、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Mycobacterium tuberculosis）の
ＳＳＢ、ディノコッカス・ラディオデュランス（Deinococcus radiodurans）のＳＳＢ、
サーマス・サーモフィラルス（Thermus thermophiles）のＳＳＢ、スルホロブス・ソルフ
ァタリカス（Sulfolobus solfataricus）由来ＳＳＢ、ヒト複製タンパク質Ａ ３２ｋＤ
ａサブユニット（ＲＰＡ３２）断片、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces ce
revisiae）由来ＣＤＣ１３ ＳＳＢ、大腸菌（E. coli）由来プライモソーム複製タンパ
ク質Ｎ（Primosomal replication protein N）（ＰｒｉＢ）、シロイヌナズナ（Arabidop
sis thaliana）由来ＰｒｉＢ、仮説タンパク質Ａｔ４ｇ２８４４０、Ｔ４由来ＳＳＢ（ｇ
ｐ３２；配列番号１２１）、ＲＢ６９由来ＳＳＢ（ｇｐ３２；配列番号９５）、Ｔ７由来
ＳＳＢ（ｇｐ２．５；配列番号９６）またはこれらの任意のタンパク質の変種を含む。し
たがって本発明の方法において使用されるＳＳＢは、これらのタンパク質のいずれかに由
来してよい。

Ｃ末端領域中の１つまたは複数の修飾に加えて、方法において使用されるＳＳＢはＣ末
端領域の外側にあるまたはＣ末端領域の正味の負電荷を減少させない追加的修飾を含んで
よい。換言すると本発明の方法において使用されるＳＳＢは、野生型タンパク質の変種に
由来する。変種は、野生型タンパク質のものから変化しているアミノ酸配列を有し、１本
鎖ポリヌクレオチド結合活性を保持しているタンパク質である。ポリヌクレオチド結合活
性は、上に考察したとおり決定され得る。

本発明において使用されるＳＳＢは、配列番号９５、９６、１２０または１２１の変種
に由来してよい。換言すると配列番号９５、９６、１２０または１２１の変種は、本発明
において使用されるＳＳＢのための出発点として使用できるが、実際に使用されるＳＳＢ
は、Ｃ末端領域の正味の負電荷を減少させる１つまたは複数の修飾をそのＣ末端領域にさ
らに含む。配列番号９５、９６、１２０または１２１の変種は、配列番号９５、９６、１
２０または１２１にアミノ酸同一性に基づいてその配列全体にわたって少なくとも５０％
相同性（またはヘリカーゼと関連して上に考察した任意の％相同性）を典型的には有し、
１本鎖ポリヌクレオチド結合活性を保持している。変種はヘリカーゼと関連して上に考察
したいずれの方法においても配列番号９５、９６、１２０または１２１と異なっていてよ
い。具体的には変種は、表８および９に示す１つまたは複数の保存的置換を有してよい。

通常のタンパク質ＮからＣへの命名法に従ってＳＳＢのＣ末端領域を同定することは容
易である。ＳＳＢのＣ末端領域は、ＳＳＢのＣ末端の最後の３分の１などの好ましくはＳ
ＳＢのＣ末端の最後の約３分の１である。ＳＳＢのＣ末端領域は、より好ましくはＳＳＢ
のＣ末端の最後の４分の１、５分の１または８分の１などのＳＳＢのＣ末端の最後の約４
分の１、５分の１または８分の１である。ＳＳＢの最後の３分の１、４分の１、５分の１
または８分の１は、アミノ酸の数を単位としてまたはＳＳＢタンパク質の一次構造の実際
の長さを単位として測定されてよい。ＮからＣ方向での種々のアミノ酸の長さは、当技術
分野において公知である。

Ｃ末端領域は、好ましくはＳＳＢのＣ末端の最後の約１０から最後の約６０アミノ酸で
ある。Ｃ末端領域は、より好ましくはＳＳＢのＣ末端の最後の約１５、最後の約２０、最
後の約２５、最後の約３０、最後の約３５、最後の約４０、最後の約４５、最後の約５０
または最後の約５５アミノ酸である。

Ｃ末端領域は、グリシンおよび／またはプロリンのリッチ領域を典型的には含む。この
プロリン／グリシンリッチ領域は、Ｃ末端領域に可動性を与え、Ｃ末端領域を同定するた
めに使用され得る。

正味の負電荷を減少させるための好適な修飾は、米国仮特許出願第６１／６７３，４５
７号（２０１２年７月１９日出願）、米国仮特許出願第６１／７７４，６８８号（２０１
３年３月８日出願）および本出願と同時に出願された国際出願に開示されている（Ｏｘｆ
ｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ Ｒｅｆ：ＯＮＴ ＩＰ ０３５）。ＳＳＢは、米国仮特許出
願および国際出願に開示されているいずれのＳＳＢであってもよい。

修飾ＳＳＢは、配列番号１０３、１０４、１２２から１２５に示されるものから選択さ
れる配列を最も好ましくは含む。

２本鎖結合タンパク質は高親和性で２本鎖ＤＮＡに結合する。好適な２本鎖結合タンパ
ク質は、これだけに限らないがミューテーターＳ（ＭｕｔＳ；ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿
４１７２１３．１；配列番号１４０）、Ｓｓｏ７ｄ（スルホロブス・ソルファタリカス（
Sufolobus solfataricus）Ｐ２；ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿３４３８８９．１；配列番号
１４１；Nucleic Acids Research、2004、Vol 32、No. 3、1197-1207）、Ｓｓｏ１０ｂ１
（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿３４２４４６．１；配列番号１４２）、Ｓｓｏ１０ｂ２（Ｎ
ＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿３４２４４８．１；配列番号１４３）トリプトファンリプレッサ
ー（Ｔｒｐリプレッサー；ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿２９１００６．１；配列番号１４４
）、ラムダリプレッサー（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿０４０６２８．１；配列番号１４５
）、Ｃｒｅｎ７（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿３４２４５９．１；配列番号１４６）、主な
ヒストンクラスＨ１／Ｈ５、Ｈ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３およびＨ４（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ
＿０６６４０３．２；配列番号１４７）、ｄｓｂＡ（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿０４９８
５８．１；配列番号１４８）、Ｒａｄ５１（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿００２８６６．２
；配列番号１４９）、スライディングクランプおよびトポイソメラーゼＶ Ｍｋａ（配列
番号１２９）またはこれらのタンパク質のいずれかの変種を含む。配列番号１２９、１４
０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８または１４９の
変種は、アミノ酸同一性に基づいてその配列全体にわたって、配列番号１２９、１４０、
１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８または１４９に少な
くとも５０％相同性（またはヘリカーゼと関連して上に考察した任意の％相同性）を典型
的には有し、１本鎖ポリヌクレオチド結合活性を保持している。変種は、ヘリカーゼと関
連して上に考察したいずれの方法においても配列番号１２９、１４０、１４１、１４２、
１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８または１４９と異なっていてよい。具
体的には変種は、表８および９に示す１つまたは複数の保存的置換を有する場合がある。
大部分のポリメラーゼは、スライディングクランプと相互作用することにより前進性を達
成している。一般にこれらは、ｄｓＤＮＡの周囲を囲む多量体タンパク質（ホモ二量体ま
たはホモ三量体）である。これらのスライディングクランプは、ＡＴＰ依存性プロセスで
それらをＤＮＡヘリックスの周囲に会合させるためにアクセサリータンパク質（クランプ
ローダー）を必要とする。それらもＤＮＡと直接接触せず、形態的テザーとして作用する
。スライディングクランプがポリメラーゼドメインを介する特異的様式で同族ポリメラー
ゼと相互作用することから、この断片はヘリカーゼのスライディングクランプへの動員刺
激のためにヘリカーゼに融合され得る。この相互作用は共有結合の作製によってさらに安
定化され得る（システインまたは非天然アミノ酸の導入）。

ＤＮＡスライディングクランプに関して前進性因子は、それらの同族ポリメラーゼをＤ
ＮＡに固着させるウイルス性タンパク質であり、作製される断片の長さの劇的な増大を導
く。それらは、単量体（単純ヘルペスウイルス（Herpes simplex virus）１由来ＵＬ４２
についての場合）または多量体（サイトメガロウイルス（Cytomegalovirus）由来ＵＬ４
４は二量体である）であってよく、それらはＤＮＡ鎖周囲に閉じた環を形成せず、それら
はＤＮＡに直接接触する。ＵＬ４２は、その対応するポリメラーゼの速度を低減すること
なく前進性を増大させることが示されており、それがＳＳＢとは異なるモードでＤＮＡと
相互作用することを示唆している。ＵＬ４２は、配列番号９７もしくは配列番号１０２に
示す配列またはその変種を好ましくは含む。配列番号９７または１０２の変種は、配列番
号９７または１０２のものから変化しているアミノ酸配列を有し、ポリヌクレオチド結合
活性を保持しているタンパク質である。これは、上に記載のとおり測定され得る。変種は
、アミノ酸同一性に基づいてその配列全体にわたって、配列番号９７または１０２に少な
くとも５０％相同性（またはヘリカーゼと関連して上に考察した任意の％相同性）を典型
的には有し、ポリヌクレオチド結合活性を保持している。変種はヘリカーゼと関連して上
にまたはポアと関連して下に考察したいずれの方法においても配列番号９７または配列番
号１０２と異なっていてよい。変種は、上に考察したとおりヘリカーゼへの付着を促進す
るために１つもしくは複数の置換システイン残基および／または１つもしくは複数の置換
Ｆａｚ残基を好ましくは含む。

ＵＬ４２をヘリカーゼに付着させることは、遺伝子的融合または化学的付着（システイ
ン、非天然アミノ酸）を介して行われ得る。ＵＬ４２に結合しているポリメラーゼポリペ
プチドが結晶構造において観察できることから、これらの３５アミノ酸（残基１２００〜
１２３５）はヘリカーゼのＣ末端に融合でき、このポリペプチドと前進性因子との間の天
然の親和性は複合体を形成するために使用される。相互作用は、共有結合相互作用（シス
テインまたは非天然アミノ酸）を導入することによって安定化され得る。選択肢の１つは
、ポリペプチド相互作用部位近くに位置付けられている天然ＵＬ４２システイン（Ｃ３０
０）を利用し、ポリメラーゼポリペプチドに点変異（例えばＬ１２３４Ｃ）を導入するこ
とである。

ポリメラーゼ前進性を増大する報告された方法は、大腸菌（E.coli）チオレドキシン（
Ｔｒｘ）とバクテリオファージＴ７ＤＮＡポリメラーゼのチオレドキシン結合ドメイン（
ＴＢＤ）（残基２５８〜３３３）との間の相互作用を活用することである。ＴｒｘからＴ
ＢＤへの結合は、ＤＮＡに結合するものへのコンホメーション変化をポリペプチドに生じ
させる。ＴＢＤは、ＤＮＡ鎖上に固定され、ポリメラーゼオフ速度を限定し、それにより
前進性を増大させると考えられている。キメラポリメラーゼは、ＴＢＤを非前進性ポリメ
ラーゼに転移することによって作製され、重合された断片長の１０００倍増加を生じる。
ＴＢＤを任意の他のクラスのタンパク質に付着させる試みはなかったが、ＴＢＤとＴｒｘ
との間の共有結合は操作され、相互作用を安定化するために使用できる。

いくつかのヘリカーゼは、前進性を達成するためにアクセサリータンパク質をｉｎ−ｖ
ｉｖｏで使用する（例えば大腸菌（E.coli）Ｒｅｐヘリカーゼに関して、ファージΦｘ１
７４由来ｃｉｓＡおよびファージＭ１３由来ｇｅｎｅ ＩＩタンパク質）。これらのタン
パク質のいくつかは、１つより多いヘリカーゼと相互作用することが示されている（例え
ばＭｕｔＬは同程度ではないがＵｖｒＤおよびＲｅｐの両方に作用する）。これらのタン
パク質は内在性ＤＮＡ結合能力を有し、それらのいくつかは特異的ＤＮＡ配列を認識する
。いくつかのこれらのアクセサリータンパク質のそれら自体を特異的ＤＮＡ配列に共有結
合的に付着させる能力は、ヘリカーゼ活性についての一連の開始点を作出するためにも使
用できる。

染色体の末端を保護するタンパク質は、テロメアｓｓＤＮＡ配列に高特異性の様式で結
合する。この能力は、そのまままたは配列特異性を消滅させる点変異を使用することによ
ってのいずれかで活用され得る。

小さなＤＮＡ結合モチーフ（ヘリックス−ターン−ヘリックスなど）は、特異的ＤＮＡ
配列を認識する。バクテリオファージ４３４リプレッサーの場合、６２残基断片が操作さ
れ、ＤＮＡ結合能力および特異性を保持していることが示されている。

真核生物タンパク質における豊富なモチーフ、亜鉛フィンガーは特異的様式でＤＮＡに
結合するおよそ３０アミノ酸からなる。典型的には各亜鉛フィンガーは３個のＤＮＡ塩基
だけを認識するが、マルチプルフィンガーはより長い配列を認識するために連結されてよ
い。

増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）は、ｄｓＤＮＡまたはｓｓＤＮＡを引き上げるおよび下げ
る非常に堅固なクランプ（ドーナツ）を形成する。クレン古細菌門（crenarchaeota）由
来ＰＣＮＡは、ヘテロ三量体になることが特有であり、それにより１つのサブユニットを
機能化し、活性を保持することが可能である。そのサブユニットは、配列番号９８、９９
および１００に示されている。ＰＣＮＡは、好ましくは配列番号９８、９９および１００
に示す配列またはその変種を含む三量体である。ＰＣＮＡスライディングクランプ（ＮＣ
ＢＩ参照配列：ＺＰ＿０６８６３０５０．１；配列番号１５０）は二量体を形成する。Ｐ
ＣＮＡは、好ましくは配列番号１５０またはその変種を含む二量体である。変種は、配列
番号９８、９９、１００または１５０から変化しているアミノ酸配列を有し、ポリヌクレ
オチド結合活性を保持しているタンパク質である。これは、上に記載のとおり測定され得
る。変種は、アミノ酸同一性に基づいてそれぞれその配列全体にわたって配列番号９８、
９９および１００に少なくとも５０％相同性を有する配列を含む典型的には三量体または
、配列番号１５０に少なくとも５０％相同性（またはヘリカーゼと関連して上に考察した
任意の％相同性）を有する配列を含む二量体であり、ポリヌクレオチド結合活性を保持し
ている。変種はヘリカーゼと関連して上にまたはポアと関連して下に考察したいずれの方
法においても配列番号９８、９９、１００または１５０と異なっている配列を含んでよい
。変種は、上に考察したとおりヘリカーゼへの付着を促進するために１つもしくは複数の
置換システイン残基および／または１つもしくは複数の置換Ｆａｚ残基を好ましくは含む
。好ましい実施形態では、クレン古細菌門（crenarchaeota）由来ＰＣＮＡのサブユニッ
ト１および２（すなわち配列番号９８および９９またはその変種）は、遺伝子的に融合さ
れるなど付着し、得られたタンパク質は本発明の構築物を形成するようにヘリカーゼに付
着される。構築物の使用の際にサブユニット３（すなわち配列番号１００またはその変種
）は、構築物がポリヌクレオチドに結合すると、ＰＣＮＡクランプ（またはドーナツ）を
完了するために付加される場合がある。好ましい実施形態では、ＰＣＮＡスライディング
クランプ（すなわち配列番号１５０またはその変種）の１つの単量体は、遺伝子的に融合
されているなど、本発明の構築物を形成するようにヘリカーゼに付着されている。構築物
の使用の際に第二の単量体（すなわち配列番号１５０またはその変種）は、構築物がポリ
ヌクレオチドに結合すると、ＰＣＮＡクランプ（またはドーナツ）を完了するために付加
される場合がある。

ポリヌクレオチド結合モチーフは、下の表５に示すもののいずれかから選択されてよい
。

ポリヌクレオチド結合成分は、ポリヌクレオチド結合酵素に好ましくは由来する。ポリ
ヌクレオチド結合酵素は、ポリヌクレオチドに結合でき、ポリヌクレオチドの少なくとも
１つの特徴と相互作用し、修飾するポリペプチドである。酵素は、個々のヌクレオチドま
たは、ジまたはトリヌクレオチドなどのヌクレオチドの短い鎖を形成するように切断する
ことによってポリヌクレオチドを修飾できる。酵素は、ポリヌクレオチドを特異的位置に
方向付けるまたは移動させることによってそれを修飾できる。ポリヌクレオチド結合成分
は、ポリヌクレオチドに結合でき、その移動を制御できる限り酵素活性を示す必要はない
。例えば成分は、その酵素活性を除去するように修飾されている酵素由来であってよく、
またはそれが酵素として作用することを妨げる条件下で使用されてよい。

ポリヌクレオチド結合成分は、好ましくは核酸分解酵素由来である。酵素は、より好ま
しくは酵素分類（ＥＣ）群３．１．１１、３．１．１３、３．１．１４、３．１．１５、
３．１．１６、３．１．２１、３．１．２２、３．１．２５、３．１．２６、３．１．２
７、３．１．３０および３．１．３１のいずれかのメンバー由来である。酵素は、国際出
願第ＰＣＴ／ＧＢ１０／０００１３３号（ＷＯ２０１０／０８６６０３として公開）に開
示のもののいずれかであってよい。

好ましい酵素は、エキソヌクレアーゼ、ポリメラーゼ、ヘリカーゼおよび、ジャイレー
スなどのトポイソメラーゼである。好適なエキソヌクレアーゼは、これだけに限らないが
、大腸菌（E. coli）由来エキソヌクレアーゼＩ、大腸菌（E. coli）由来エキソヌクレア
ーゼＩＩＩ酵素、高度好熱菌（T. thermophilus）由来ＲｅｃＪならびにバクテリオファ
ージラムダエキソヌクレアーゼおよびその変種を含む。

ポリメラーゼは、好ましくは成分分類（ＥＣ）群２．７．７．６、２．７．７．７、２
．７．７．１９、２．７．７．４８および２．７．７．４９のいずれかのメンバーである
。ポリメラーゼは、好ましくはＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポ
リメラーゼ、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼまたはＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼで
ある。ポリヌクレオチド結合成分は、好ましくはＰｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ（配列
番号１０１）由来である。成分は、配列番号１０１に示す配列またはその変種を含む場合
がある。配列番号１０１の変種は、配列番号１０１のものから変化しているアミノ酸配列
を有し、ポリヌクレオチド結合活性を保持している酵素である。これは、上に記載のとお
り測定され得る。変種は、ポリヌクレオチドの結合を促進するならびに／または高塩濃度
および／もしくは室温での活性を促進する修飾を含む場合がある。

配列番号１０１のアミノ酸配列の全長にわたって変種は、アミノ酸同一性に基づいてそ
の配列に好ましくは少なくとも５０％相同性である。より好ましくは変種ポリペプチドは
、アミノ酸同一性に基づいて配列の全長にわたって配列番号１０１のアミノ酸配列に少な
くとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７
５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％およびより好ましくは少
なくとも９５％、９７％または９９％相同性であってよい。少なくとも８０％、例えば少
なくとも８５％、９０％または９５％のアミノ酸同一性が２００以上のストレッチ、例え
ば２３０、２５０、２７０または２８０以上の連続するアミノ酸にわたってあり得る（「
高い相同性」）。相同性は下に記載のとおり決定される。変種は配列番号２および４を参
照して下に考察したいずれの方法においても野生型配列と異なっていてよい。

ヘリカーゼは、上に考察したもののいずれであってもよい。ヘリカーゼ二量体および多
量体は下に詳細に考察される。ポリヌクレオチド結合成分は、ヘリカーゼ由来のポリヌク
レオチド結合ドメインであってよい。例えばポリヌクレオチド結合成分は、配列番号１０
５または１０６に示す配列またはその変種を好ましくは含む。配列番号１０５または１０
６の変種は、配列番号１０５または１０６のものから変化しているアミノ酸配列を有し、
ポリヌクレオチド結合活性を保持しているタンパク質である。これは、上に記載のとおり
測定され得る。変種は、ポリヌクレオチドの結合を促進するならびに／または高塩濃度お
よび／もしくは室温での活性を促進する修飾を含む場合がある。

配列番号１０５または１０６のアミノ酸配列の全長にわたって変種は、アミノ酸同一性
に基づいてその配列に好ましくは少なくとも５０％相同性である。より好ましくは変種ポ
リペプチドは、アミノ酸同一性に基づいて配列番号１０５または１０６のアミノ酸配列の
配列の全長にわたって少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なく
とも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０
％およびより好ましくは少なくとも９５％、９７％または９９％相同性であってよい。少
なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、９０％または９５％のアミノ酸同一性が４０
以上のストレッチ、例えば５０、６０、７０または８０以上の連続するアミノ酸にわたっ
てあり得る（「高い相同性」）。相同性は下に記載のとおり決定される。変種は配列番号
２および４を参照して下に考察したいずれの方法においても野生型配列と異なっていてよ
い。

トポイソメラーゼは、好ましくは成分分類（ＥＣ）群５．９９．１．２および５．９９
．１．３のいずれかのメンバーである。

ポリヌクレオチド結合成分は、上に考察したいずれの酵素であってもよい。

成分は、明示用標識（revealing label）で標識されてよい。標識は、上に記載のもの
のいずれであってもよい。

成分は、大腸菌（E. coli）、Ｔ．サーモフィルス（T. thermophilus）またはバクテリ
オファージ、などの任意の成分産生生物から単離され得る、または合成的もしくは組換え
的手段によって作製できる。例えば成分は、下に記載のとおりｉｎ ｖｉｔｒｏ 翻訳お
よび転写によって合成出来る。成分は、下に記載のとおり大規模に産生されてよく、精製
が続く。

ヘリカーゼオリゴマー
上の考察から明らかであるとおり、ポリヌクレオチド結合成分は、ヘリカーゼに好まし
くは由来する。例えばそれは、ヘリカーゼ由来ポリヌクレオチドドメインであってよい。
成分は、１つまたは複数のヘリカーゼをより好ましくは含む。ヘリカーゼは、本発明のヘ
リカーゼを含む上に考察したもののいずれであってもよい。そのような実施形態では本発
明の構築物は、ヘリカーゼの少なくとも１つが本発明により修飾されており、互いに付着
している２個以上のヘリカーゼを当然ながら含む。構築物は、２つ、３つ、４つ、５つま
たはそれ以上のヘリカーゼを含んで良い。換言すると本発明の構築物は、ヘリカーゼ二量
体、ヘリカーゼ三量体、ヘリカーゼ四量体、ヘリカーゼ五量体などを含んでよい。

２つ以上のヘリカーゼは、任意の方向で互いに付着していてよい。同一または類似のヘ
リカーゼは、各ヘリカーゼ中の同一のアミノ酸位置または空間的に近接しているアミノ酸
位置を介して付着してよい。これは、「ヘッドトゥーヘッド」編成と呼ばれる。代替的に
同一または類似のヘリカーゼは、各ヘリカーゼの反対または異なる側の位置を介して付着
してよい。これは、「ヘッドトゥーテール」編成と呼ばれる。３つの同一のまたは類似の
ヘリカーゼを含むヘリカーゼ三量体は、ヘッドトゥーヘッドおよびヘッドトゥーテール編
成の両方を含む場合がある。

２つ以上のヘリカーゼは、互いに異なっていてよい（すなわち構築物はヘテロ二量体、
三量体、四量体または五量体などである）。例えば本発明の構築物は：（ａ）１つもしく
は複数のＨｅｌ３０８ヘリカーゼおよび１つもしくは複数のＸＰＤヘリカーゼ；（ｂ）１
つもしくは複数のＨｅｌ３０８ヘリカーゼおよび１つもしくは複数のＲｅｃＤヘリカーゼ
；（ｃ）１つもしくは複数のＨｅｌ３０８ヘリカーゼおよび１つもしくは複数のＴｒａＩ
ヘリカーゼ；（ｄ）１つもしくは複数のＸＰＤヘリカーゼおよび１つもしくは複数のＲｅ
ｃＤヘリカーゼ；（ｅ）１つもしくは複数のＸＰＤヘリカーゼおよび１つもしくは複数の
ＴｒａＩヘリカーゼ；または（ｆ）１つもしくは複数のＲｅｃＤヘリカーゼおよび１つも
しくは複数のＴｒａＩヘリカーゼを含む場合がある。構築物は、同じヘリカーゼの２つの
異なる変種を含む場合がある。例えば構築物は、各変種において異なる位置に導入された
１つまたは複数のシステイン残基またはＦａｚ残基を有する、上に考察したヘリカーゼの
内の１つの２つの変種を含む場合がある。この場合ヘリカーゼは、ヘッドトゥーテール編
成であってよい。好ましい実施形態では、Ｑ４４２Ｃを含む配列番号１０の変種はシステ
イン連結を介してＱ５５７Ｃを含む配列番号１０の変種に付着されてよい。Ｈｅｌ３０８
ＭｂｕのＣｙｓ変異体は、必要に応じてヘテロ二量体に作製されてもよい。この手法では
Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ−Ｑ４４２ＣおよびＨｅｌ３０８Ｍｂｕ−Ｑ５７７Ｃなどの２つの異
なるＣｙｓ変異体対は、ヘッドトゥーテール様式で連結されてよい。ヘテロ二量体は、２
つの可能な方法で形成されてもよい。第一は、上に考察したホモ二機能性リンカーの使用
を含む。ヘリカーゼ変種の１つは、１つのリンカーがタンパク質の１分子に付着されるよ
うに大過剰量のリンカーで修飾されてよい。このリンカー修飾変種は、次いで未修飾タン
パク質、潜在的ホモ二量体、および他のヘリカーゼ変種と反応する未反応リンカーから精
製されてよい。得られた二量体は、次いで他の分子種から精製されてよい。

第二は、ヘテロ二機能性リンカーの使用を含む。例えばヘリカーゼ変種の１つは、一方
の末端にマレイミドまたはヨードアセトアミド官能基および他方の末端にシクロオクチン
官能基（ＤＩＢＯ）を含有する第一のＰＥＧリンカーで修飾されてよい。この一例は下に
示される：

第二のヘリカーゼ変種は、一方の末端にマレイミドまたはヨードアセトアミド官能基お
よび他方の末端にアジド官能基を含有する第二のＰＥＧリンカーで修飾されてよい。一例
を下に示す：

２つの異なるリンカーを有する２つのヘリカーゼ変種は、次いで精製され、二量体を作
製するために合わせてクリック（銅フリークリックケミストリーを使用する）されてよい
。銅フリークリックケミストリーは、その望ましい特徴によりこれらの応用において使用
されている。例えばそれは、迅速、清潔およびタンパク質に無毒である。しかし他の好適
な生体直交型化学は、これだけに限らないが、シュタウディンガー化学、ヒドラジンまた
はヒドラジド／アルデヒドまたはケトン試薬（ＨｙＮｉｃ＋４ＦＢ化学、全てのＳｏｌｕ
ｌｉｎｋ（商標）試薬を含む）、ディール・アルダー試薬対およびボロン酸／サリチルヒ
ドロキサム酸試薬を含む。

同じヘリカーゼの２つの異なる変種を連結するこれらの２つの方法は、２つの異なるヘ
リカーゼの二量体およびヘリカーゼポリメラーゼ二量体などのヘリカーゼと成分とが互い
に異なっている上に考察した構築物のいずれについても有効である。

類似の方法がさまざまなＦａｚ変種を連結するために使用され得る。１つのＦａｚ変種
（Ｑ４４２Ｆａｚを含む配列番号１０など）は、１つのリンカーがタンパク質の１つの分
子に付着されるように大過剰量のリンカーで修飾されてよい。このリンカー修飾Ｆａｚ変
種は、次いで未修飾タンパク質、潜在的ホモ二量体、および第二のＦａｚ変種（Ｑ５７７
Ｆａｚを含む配列番号１０など）と反応する未反応リンカーから精製されてよい。得られ
た二量体は、次いで他の分子種から精製されてよい。

ヘテロ二量体は、同じヘリカーゼまたは異なるヘリカーゼのシステイン変種とＦａｚ変
種とを連結することによっても作製できる。例えば任意の上のシステイン変種（Ｑ４４２
Ｃを含む配列番号１０など）は、任意の上のＦａｚ変種（Ｑ５７７Ｆａｚを含む配列番号
１０など）と二量体を作製するために使用できる。一方の末端にマレイミドまたはヨード
アセトアミド官能性および他方の末端にＤＢＣＯ官能性を有するヘテロ二機能性ＰＥＧリ
ンカーは、この変異体の組合せにおいて使用できる。そのようなリンカーの一例は、下に
示されている（ＤＢＣＯ−ＰＥＧ４−マレイミド）：

リンカーの長さは、２つの官能基間のＰＥＧ単位の数を変えることによって変更できる
。

ヘリカーゼヘテロ三量体は、Ｈｅｌ３０８ヘリカーゼ、ＸＰＤヘリカーゼ、ＲｅｃＤヘ
リカーゼ、ＴｒａＩヘリカーゼおよびこれらの変種から選択される３種の異なる型のヘリ
カーゼを含んでよい。３個より多いヘリカーゼを含むオリゴマーについても同様である。
構築物中の２つ以上のヘリカーゼは、配列番号１０、２２、３３または５２の異なる変種
などの同じヘリカーゼの異なる変種であってよい。異なる変種は、異なる位置を介する付
着を促進するために異なる位置で修飾されてよい。ヘテロ三量体は、したがってヘッドト
ゥーテールおよびヘッドトゥーヘッド編成である場合がある。

本発明の構築物中の２つ以上のヘリカーゼは、互いに同じであってよい（すなわち構築
物はホモ二量体、三量体、四量体または五量体などである）。ホモオリゴマーは、２つ以
上のＨｅｌ３０８ヘリカーゼ、２つ以上のＸＰＤヘリカーゼ、２つ以上のＲｅｃＤヘリカ
ーゼ、２つ以上のＴｒａＩヘリカーゼまたは２つ以上の上に考察した任意の変種を含んで
よい。そのような実施形態ではヘリカーゼは、各ヘリカーゼ中の同じ位置を使用して好ま
しくは付着している。ヘリカーゼは、したがってヘッドトゥーヘッドで付着している。ヘ
リカーゼは、同じ位置でヘリカーゼに置換されているシステイン残基またはＦａｚ残基を
使用して連結されてよい。同一のヘリカーゼ変種中のシステイン残基は、マレイミドまた
はヨードアセトアミドなどのチオール反応性基を含有するホモ二機能性リンカーを使用し
て連結されてよい。これらの官能基は、次の例のとおりポリエチレングリコール（ＰＥＧ
）鎖の末端にあってよい：

リンカーの長さは、必要とされる応用に合わせて変更できる。例えばｎは、２、３、４
、８、１１、１２、１６またはそれ以上であってよい。ＰＥＧリンカーは、水溶性などの
好都合な特徴を有することから好適である。他の非ＰＥＧリンカーもシステイン連結にお
いて使用できる。

同様の手法を使用することによって同一のＦａｚ変種は、ホモ二量体に作製され得る。
ＤＩＢＯ官能基を有するホモ二機能性リンカーは、Ｃｕ^２＋フリークリック化学を使用し
てホモ二量体を作製するために、同じＦａｚ変種の２分子を連結するために使用できる。
リンカーの一例は下に示されている：

ＰＥＧリンカーの長さは、２、４、８、１２、１６またはそれ以上のＰＥＧ単位を含ん
で変化してよい。そのようなリンカーは、定量を容易にするために蛍光タグを組み込んで
作製されてもよい。そのような蛍光タグは、マレイミドリンカーにも組み込まれ得る。

本発明は、本発明のヘリカーゼおよび、配列番号１３０（メタノピュルス・カンドレリ
（Methanopyrus kandleri）由来トポイソメラーゼＶ由来Ｈ−Ｌドメイン；配列番号１２
９）を含むアミノ酸配列または配列番号１３０の配列全体にわたってアミノ酸同一性に基
づいて配列番号１３０に少なくとも８０％相同を有するその変種を含む構築物であって、
ヘリカーゼがアミノ酸配列に付着しており、ポリヌクレオチドの移動を制御する能力を有
する構築物も提供する。ヘリカーゼは上に考察した任意の方法でアミノ酸配列に付着して
よい。

本発明の好ましい構築物は、下の表６に示されている。各列は、左側のカラムのヘリカ
ーゼが右側のカラムの追加的ポリヌクレオチド結合成分に本発明により付着している好ま
しい構築物を示す。右側のカラムのポリヌクレオチド結合成分がヘリカーゼである場合、
それも本発明のヘリカーゼであり得る。

ポリヌクレオチド配列
本明細書に記載の任意のタンパク質は、当技術分野において公知の方法を使用して発現
され得る。ポリヌクレオチド配列は、当技術分野における標準的方法を使用して単離およ
び複製され得る。染色体ＤＮＡは、メタノコッコイデス・ブルトニイ（Methanococcoides
burtonii）などのヘリカーゼ産生生物からおよび／または大腸菌（E. coli）などのＳＳ
Ｂ産生生物から抽出され得る。目的の配列をコードしている遺伝子は、特異的プライマー
を伴うＰＣＲを使用して増幅され得る。増幅された配列は、次いでクローニングベクター
などの組換え複製可能ベクターに組み込まれてよい。ベクターは、適合性の宿主細胞にお
いてポリヌクレオチドを複製するために使用され得る。したがってポリヌクレオチド配列
は、目的の配列をコードしているポリヌクレオチドを複製可能ベクターに導入し、ベクタ
ーを適合性の宿主細胞に導入し、ベクターの複製をもたらす条件下で宿主細胞を増殖させ
ることによって作製され得る。ベクターは宿主細胞から回収され得る。ポリヌクレオチド
のクローニングのために好適な宿主細胞は、当技術分野において公知であり、下により詳
細に記載される。

ポリヌクレオチド配列は、好適な発現ベクターにクローニングされてよい。発現ベクタ
ーではポリヌクレオチド配列は、典型的には、宿主細胞によるコード配列の発現をもたら
すことができる制御配列に作動可能に連結される。そのような発現ベクターは構築物を発
現するために使用され得る。

用語「作動可能に連結する」は、記載される構成成分がそれらが意図する様式で機能す
る関係の近位にあることを指す。コード配列に「作動可能に連結される」制御配列は、コ
ード配列の発現が制御配列と適合性である条件下で達成されるような方法でライゲーショ
ンされる。同じまたは異なるポリヌクレオチドの複数のコピーは、ベクターに導入されて
よい。

発現ベクターは、次いで好適な宿主細胞に導入されてよい。それにより構築物は、構築
物をコードしているポリヌクレオチド配列を発現ベクターに挿入し、ベクターを適合性の
細菌宿主細胞に導入し、ポリヌクレオチド配列の発現をもたらす条件下で宿主細胞を増殖
させることによって産生され得る。

ベクターは、複製開始点、場合により前記ポリヌクレオチド配列の発現のためのプロモ
ーターおよび場合によりプロモーターのレギュレーターと共に提供される例えば、プラス
ミド、ウイルスまたはファージベクターであってよい。ベクターは、１つまたは複数の選
択可能マーカー遺伝子、例えばアンピリシン耐性遺伝子を含有してよい。プロモーターお
よび他の発現調節シグナルは、発現ベクターが設計された宿主細胞に適合性であるように
選択されてよい。Ｔ７、ｔｒｃ、ｌａｃ、ａｒａまたはλ_Ｌプロモーターは典型的には使
用される。

宿主細胞は、典型的には高いレベルで構築物を発現する。ポリヌクレオチド配列で形質
転換される宿主細胞は、細胞を形質転換するために使用される発現ベクターに適合性であ
るように選ばれる。宿主細胞は、典型的には細菌性、好ましくは大腸菌（E. coli）であ
る。λＤＥ３溶原菌を有する任意の細胞、例えばＣ４１（ＤＥ３）、ＢＬ２１（ＤＥ３）
、ＪＭ１０９（ＤＥ３）、Ｂ８３４（ＤＥ３）、ＴＵＮＥＲ、ＯｒｉｇａｍｉおよびＯｒ
ｉｇａｍｉ Ｂは、Ｔ７プロモーターを含むベクターを発現できる。

本発明の方法
本発明は、標的ポリヌクレオチドの移動を制御する方法を提供する。方法は、標的ポリ
ヌクレオチドを本発明のヘリカーゼまたは本発明の構築物と接触させ、それによりポリヌ
クレオチドの移動を制御するステップを含む。方法は、好ましくはポアに電位が印加され
て実行される。下により詳細に考察されるとおり、印加された電位は、ポアとヘリカーゼ
または構築物との複合体の形成を典型的には生じる。印加された電位は、電圧電位であっ
てよい。代替的に印加された電位は、化学電位であってよい。この一例は、両親媒性層全
体に塩勾配を用いている。塩勾配は、Holdenら、J Am Chem Soc. 2007 Jul 11;129(27):8
650-5に開示されている。

本発明は標的ポリヌクレオチドを特性決定する方法も提供する。方法は、
（ａ）標的ポリヌクレオチドを膜貫通ポアおよび本発明のヘリカーゼまたは本発明の構築
物に接触させて、ヘリカーゼまたは構築物がポアを通る標的ポリヌクレオチドの移動を制
御するステップを含む。方法は、（ｂ）ポリヌクレオチドがポアに関して移動するときに
１つまたは複数の測定値を取るステップであって、測定値が標的ポリヌクレオチドの１つ
または複数の特性の指標であり、それにより標的ポリヌクレオチドを特性決定するステッ
プも含む。

ステップ（ａ）および（ｂ）は、上に考察したとおり好ましくはポアに電位が印加され
て実行される。いくつかの場合では、ポリヌクレオチドがポアに関して移動するときにポ
アを通る電流が標的ポリヌクレオチドの配列を決定するために使用される。これは、鎖配
列決定法である。

本発明の方法は、標的ポリヌクレオチドを特性決定するためである。ポリヌクレオチド
は上に定義されている。

標的ポリヌクレオチドの全体または部分だけは、本方法を用いて特性付けられ得る。標
的ポリヌクレオチドは、任意の長さであってよい。例えばポリヌクレオチドは、長さ少な
くとも１０、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも１５０、少なくとも２００
、少なくとも２５０、少なくとも３００、少なくとも４００または少なくとも５００ヌク
レオチド対であってよい。ポリヌクレオチドは、１０００ヌクレオチド対以上、長さ５０
００ヌクレオチド対以上または長さ１０００００ヌクレオチド対以上であってよい。

標的ポリヌクレオチドは、任意の好適な試料中に存在する。本発明は、標的ポリヌクレ
オチドを含有することが公知であるまたは含有すると考えられる試料について典型的には
実行される。代替的に本発明は、１つまたは複数の標的ポリヌクレオチドの同一性を確認
するために試料中でのその存在が公知であるまたは期待される試料について実行され得る
。

試料は生物学的試料であってよい。本発明は、任意の生物または微生物から得られたま
たは抽出された試料についてｉｎ ｖｉｔｒｏで実行されてよい。生物または微生物は典
型的には古細菌のもの、原核性または真核性であり、典型的には五界：植物界、動物界、
菌界、モネラ界および原生生物界の１つに属する。本発明は、任意のウイルスから得られ
たまたは抽出された試料についてｉｎ ｖｉｔｒｏで実行されてよい。試料は、好ましく
は液体試料である。試料は典型的には、患者の体液を含む。試料は尿、リンパ液、唾液、
粘液または羊水であってよいが、好ましくは血液、血漿または血清である。典型的には試
料は、ヒト由来であるが、代替的に、ウマ、ウシ、ヒツジまたはブタなどの商業的に飼育
される動物由来などの別の哺乳動物由来であってもよく、代替的にネコまたはイヌなどの
愛玩動物であってもよい。代替的に植物由来の試料は、穀類、マメ、果実または野菜など
の商品作物（例えばコムギ、オオムギ、カラスムギ、セイヨウアブラナ、トウモロコシ、
ダイズ、イネ、バナナ、リンゴ、トマト、ジャガイモ、ブドウ、タバコ、マメ、レンズマ
メ、サトウキビ、ココア、ワタ）から典型的には得られる。

試料は、非生物学的試料であってよい。非生物学的試料は、好ましくは液体試料である
。非生物学的試料の例は、手術用液（surgical fluids）、水（飲料水、海水または河川
水など）および検査室検査のための試薬を含む。

試料は、典型的にはアッセイされる前に例えば遠心分離によってまたは、不要の分子ま
たは細胞（赤血球細胞など）をろ過して除く膜を通すことによって処理される。試料は採
取されてから直ちに測定されてよい。試料は、典型的にはアッセイの前に好ましくは−７
０℃より低くで、保存されてもよい。

膜貫通ポアは、ある程度膜を超える構造である。それは印加された電位によって駆動さ
れた水和イオンが膜を超えてまたは膜内に流れるようにする。膜貫通ポアは、典型的には
膜全体を超え、それにより水和イオンは膜の一方の側から膜の他方の側へ流れられる。し
かし膜貫通ポアは、膜を超えている必要はない。それは、一方の端で閉じていてもよい。
例えばポアは、水和イオンが膜に沿ってまたは膜内に流れ得る穴であってもよい。

任意の膜貫通ポアが本発明において使用され得る。ポアは、生物学的または人工であっ
てよい。好適なポアは、これだけに限らないが、タンパク質ポア、ポリヌクレオチドポア
およびソリッドステートポアを含む。

任意の膜が本発明により用いられ得る。好適な膜は、当技術分野において周知である。
膜は、好ましくは両親媒性層である。両親媒性層は、少なくとも１つの親水性の部分およ
び少なくとも１つの親油性または疎水性の部分の両方を有するリン脂質などの両親媒性分
子から形成される層である。両親媒性分子は合成または天然に存在するものでよい。天然
に存在しない両親媒性物質、および単層を形成する両親媒性物質は当技術分野において公
知であり、例えば７ｓ（Gonzalez-Perezら、Langmuir、2009、25、10447-10450）を含む
。ブロック共重合体は、２つ以上の単量体サブユニットが１本のポリマー鎖を作るように
併せて重合されている重合体材料である。ブロック共重合体は、典型的には各単量体サブ
ユニットによって寄与される特徴を有する。しかし、ブロック共重合体は、個々のサブユ
ニットから形成されたポリマーが有さない特有の特徴を有する場合がある。ブロック共重
合は、単量体サブユニットの１つが疎水性（すなわち親油性）である一方で他のサブユニ
ット（複数可）が水性媒体中では親水性であるように操作されてよい。この場合ブロック
共重合体は、両親媒性特徴を有する場合があり、生物学的膜を模倣する構造を形成できる
。ブロック共重合体は、ジブロック（２個の単量体サブユニットからなる）であってよい
が、両親媒性物質として振る舞うさらに複雑な配置を形成するために２個より多い単量体
サブユニットから構築されてもよい。共重合体はトリブロック、テトラブトックまたはペ
ンタブロック共重合体であってもよい。

両親媒性層は、単層または二重層であってよい。両親媒性層は、典型的には平面状脂質
二重層または支持された二重層である。

両親媒性層は典型的には、脂質二重層である。脂質二重層は細胞膜のモデルであり、さ
まざまな実験研究のための優れたプラットフォームとして役立つ。例えば、脂質二重層は
、単一チャネル記録による膜タンパク質のｉｎ ｖｉｔｒｏ調査のために用いられ得る。
代替的に脂質二重層は、さまざまな物質の存在を検出するためのバイオセンサーとして用
いられ得る。脂質二重層は、任意の脂質二重層であってよい。好適な脂質二重層は、これ
だけに限らないが平面状脂質二重層、支持された二重層またはリポソームを含む。脂質二
重層は好ましくは平面状脂質二重層である。好適な脂質二重層は、国際出願第ＰＣＴ／Ｇ
Ｂ０８／０００５６３号（ＷＯ２００８／１０２１２１として公開）、国際出願第ＰＣＴ
／ＧＢ０８／００４１２７号（ＷＯ２００９／０７７７３４として公開）および国際出願
第ＰＣＴ／ＧＢ２００６／００１０５７号（ＷＯ２００６／１００４８４として公開）に
開示されている。

脂質二重層を形成するための方法は、当技術分野において公知である。好適な方法は実
施例に開示する。脂質二重層は、脂質単層が水溶液／空気界面にその界面に垂直である開
口部のいずれかの端を通って運ばれる、モンタルおよびミューラーの方法（Proc.Natl.Ac
ad.Sci.USA.、1972;69:3561-3566）によって一般的には形成される。

モンタルおよびミューラーの方法は、タンパク質ポア挿入のために好適である良質な脂
質二重層を形成する対費用効果が高くて比較的簡単な方法であることから一般的である。
二重層形成の他の一般的方法は、チップディッピング、ペインティング二重層およびリポ
ソーム二重層のパッチクランピングを含む。

好ましい実施形態では、脂質二重層は国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ０８／００４１２７号（
ＷＯ２００９／０７７７３４として公開）に記載のとおり形成される。

別の好ましい実施形態では、膜は、ソリッドステート層である。ソリッドステート層は
生物由来ではない。換言すると、ソリッドステート層は、生物または細胞などの生物学的
環境由来でなく、またはそれから単離されず、生物学的に入手可能な構造の合成的に製造
されたバージョンでもない。ソリッドステート層は、これだけに限らないがミクロ電子材
料、Ｓｉ_３Ｎ_４、Ａ１_２０_３およびＳｉＯなどの絶縁材料、ポリアミドなどの有機および
無機ポリマー、Ｔｅｆｌｏｎ（登録商標）などのプラスチックまたは２要素添加硬化シリ
コンゴム（two-component addition-cure silicone rubber）などのエラストマーならび
にガラスを含む有機材料ならびに無機材料の両方から形成され得る。ソリッドステート層
は、グラフェン（graphene）などの一原子層からまたは数原子厚だけである層から形成さ
れ得る。好適なグラフェン（graphene）層は、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０１０
６３７号（ＷＯ２００９／０３５６４７として公開）に開示されている。

方法は、（ｉ）ポアを含む人工両親媒性層、（ｉｉ）ポアを含む単離された天然に存在
する脂質二重層、または（ｉｉｉ）挿入されたポアを有する細胞を用いて典型的には実行
される。方法は、人工脂質二重層などの人工両親媒性層を用いて典型的には実行される。
両親媒性層は、ポアに加えて他の膜貫通タンパク質および／または膜内タンパク質ならび
に他の分子を含んでもよい。好適な装置および条件は、下に考察される。本発明の方法は
、典型的にはｉｎ ｖｉｔｒｏで実行される。

ポリヌクレオチドは、膜にカップリングされ得る。これは、任意の公知の方法を用いて
され得る。膜が脂質二重層などの両親媒性層である場合は（下に詳細に考察されるとおり
）、ポリヌクレオチドは、膜に存在するポリペプチドまたは膜に存在する疎水性アンカー
を介して膜に好ましくはカップリングされる。疎水性アンカーは、好ましくは脂質、脂肪
酸、ステロール、カーボンナノチューブまたはアミノ酸である。

ポリヌクレオチドは膜に直接カップリングされ得る。ポリヌクレオチドは好ましくは膜
にリンカーを介してカップリングされる。好ましいリンカーは、これだけに限らないがポ
リヌクレオチド、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびポリペプチドなどのポリマー
を含む。ポリヌクレオチドが膜に直接カップリングされる場合、膜とヘリカーゼとの間の
距離のためにポリヌクレオチドの末端まで特性決定が継続できないことから、いくらかの
データが失われる。リンカーが用いられる場合、ポリヌクレオチドは完了まで処理され得
る。リンカーが用いられる場合、リンカーはポリヌクレオチドの任意の位置に付着され得
る。リンカーは、テールポリマーでポリヌクレオチドに典型的には付着される。

カップリングは、安定または一過的であってよい。ある種の応用に関してカップリング
の一過的な性質は好ましい。安定カップリング分子がポリヌクレオチドの５’末端または
３’末端のいずれかに直接付着された場合、二重層とヘリカーゼ活性部位との間の距離の
ためにポリヌクレオチドの末端まで特性決定が継続できないことから、いくらかのデータ
が失われる。カップリングが一過的である場合、カップリングされた端は無作為に二重層
から遊離し、ポリヌクレオチドは完了まで処理され得る。安定なまたは一過的連結を膜と
形成する化学基は、下により詳細に考察される。ポリヌクレオチドは、コレステロール（
cholesterol）または脂肪酸アシル鎖を用いて脂質二重層などの両親媒性層に一過的にカ
ップリングされ得る。ヘキサデカン酸などの長さ６から３０までの炭素原子を有する任意
の脂肪酸アシル鎖は用いられ得る。

好ましい実施形態では、ポリヌクレオチドは、両親媒性層にカップリングされる。合成
脂質二重層へのポリヌクレオチドのカップリングは、種々の異なるテザーリング戦略で既
に実行されている。これらを下の表７に要約する。

ポリヌクレオチドは、合成反応において修飾ホスホラミダイトを用いて官能基化される
ことができ、チオール、コレステロール（cholesterol）、脂質およびビオチン基などの
反応基の付加に容易に適合される。これらのさまざまな付着化学物質は、ポリヌクレオチ
ドに一連の付着選択肢をもたらす。さまざまな各修飾基は、わずかに異なる方法でポリヌ
クレオチドを繋ぎ止め、カップリングは常に永久的ではなく、二重層へのさまざまな残存
時間をポリヌクレオチドにもたらす。一過的カップリングの有利点は、上に考察される。

ポリヌクレオチドのカップリングは、反応基がポリヌクレオチドに付加され得る限り多
数の他の手段によっても達成され得る。ＤＮＡのいずれかの端への反応基の付加は既に報
告されている。チオール基はポリヌクレオチドキナーゼおよびＡＴＰγＳを用いてｓｓＤ
ＮＡの５’に付加され得る(Grant,G.P.およびP.Z.Qin (2007) "A facile method for att
aching nitroxide spin labels at the 5' terminus of nucleic acids." Nucleic Acids
Res 35(10):e77)。ビオチン、チオールおよびフルオロフォア（fluorophore）などの化
学基のより多様な選択は、修飾オリゴヌクレオチドをｓｓＤＮＡの３’に組み込むために
ターミナルトランスフェラーゼを用いて付加され得る(Kumar,A.,P.Tchenら、(1988)."Non
radioactive labeling of synthetic oligonucleotide probes with terminal deoxynucl
eotidyl transferase." Anal Biochem 169(2):376-82)。

代替的に反応基は、二重層に既にカップリングされたものに相補的なＤＮＡの短片の付
加のために考慮される場合があり、付着はハイブリダイゼーションを介して達成され得る
。ｓｓＤＮＡの短片のライゲーションは、Ｔ４ＲＮＡリガーゼＩを用いて報告されている
(Troutt,A.B.,M.G.McHeyzer-Williamsら、(1992)."Ligation-anchored PCR: a simple am
plification technique with single-sided specificity." Proc Natl Acad Sci U S A 8
9(20):9823-5)。代替的にｓｓＤＮＡまたはｄｓＤＮＡのいずれかは、天然ｄｓＤＮＡに
ライゲーションされることができ、次いで２本鎖は熱的または化学的変性によって分離さ
れた。天然ｄｓＤＮＡについて、ｓｓＤＮＡの１片を二重鎖の１つもしくは両方の端に、
またはｄｓＤＮＡを１つまたは両方の端へのいずれかで付加できる。次いで、二重鎖が融
解される際に、ｓｓＤＮＡが５’末端、３’末端もしくは両端でのライゲーションもしく
は修飾のために用いられ、ｄｓＤＮＡがライゲーションのために用いられた場合、各一重
鎖は５’または３’修飾のいずれかを有する。ポリヌクレオチドが合成鎖である場合、カ
ップリング化学はポリペプチドの化学合成の際に組み込まれ得る。ここ例えばポリヌクレ
オチドは、付着された反応基を有するプライマーを用いて合成され得る。

ゲノムＤＮＡのセクションの増幅のための一般的技術は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣ
Ｒ）を用いている。本明細書では、２個の合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いてＤ
ＮＡの同じセクションの多数の複製物が作製される場合があり、各複製物について二重鎖
中の各鎖の５’は合成ポリヌクレオチドである。コレステロール（cholesterol）、チオ
ール（thiol）、ビオチン（biotin）または脂質などの反応基を有するアンチセンスプラ
イマーを用いるステップによって、増幅された標的ＤＮＡの各複製物は、カップリングの
ための反応基を含有する。

膜貫通ポアは、好ましくは膜貫通タンパク質ポアである。膜貫通タンパク質ポアは、分
析物などの水和イオンが膜の一方の側から膜の他方の側へ流れるようにするポリペプチド
またはポリペプチドの集積物である。本発明では膜貫通タンパク質ポアは、水和イオンが
印加された電位によって膜の一方の側から他方へ流れるように駆動されるようにするポア
を形成できる。膜貫通タンパク質ポアは、ヌクレオチドなどの分析物が膜（脂質二重層な
ど）の一方の側から他方へ流れるように好ましくはする。膜貫通タンパク質ポアは、ＤＮ
ＡまたはＲＮＡなどのポリヌクレオチドがポアを通って移動されることを可能にする。

膜貫通タンパク質ポアは、単量体またはオリゴマーであってよい。ポアは、いくつかの
反復サブユニット（６、７、８または９サブユニット）から好ましくは作られる。ポアは
好ましくは六量体、七量体、八量体または九量体ポアである。

膜貫通タンパク質ポアは、イオンが通って流れることができるバレルまたはチャネルを
典型的には含む。ポアのサブユニットは、典型的には中央軸を取り囲み、膜貫通βバレル
もしくはチャネルまたは膜貫通αヘリックス束もしくはチャネルに鎖を供する。

膜貫通タンパク質ポアのバレルまたはチャネルは、ヌクレオチド、ポリヌクレオチドま
たは核酸などの分析物との相互作用を促進するアミノ酸を典型的には含む。これらのアミ
ノ酸は、バレルまたはチャネルの狭窄部付近に好ましくは位置する。膜貫通タンパク質ポ
アは、アルギニン、リシンもしくはヒスチジンなどの１つもしくは複数の正に荷電したア
ミノ酸またはチロシンもしくはトリプトファンなどの芳香族アミノ酸を典型的には含む。
これらのアミノ酸は、ポアとヌクレオチド、ポリヌクレオチドまたは核酸との間の相互作
用を典型的には促進する。

本発明による使用のための膜貫通タンパク質ポアは、β−バレルポアまたはα−ヘリッ
クス束ポアから生じ得る。β−バレルポアは、β−鎖から形成されるバレルまたはチャネ
ルを含む。好適なβ−バレルポアは、これだけに限らないが、α−ヘモリジン（hemolysi
n）、炭疽毒素およびロイコシジン（leukocidin）などのβ−毒素、スメグマ菌（Mycobac
terium smegmatis）ポリン（porin）（Ｍｓｐ）、例えばＭｓｐＡ、ＭｓｐＢ、ＭｓｐＣ
またはＭｓｐＤ、外膜ポリン（porin）Ｆ（ＯｍｐＦ）、外膜ポリン（porin）Ｇ（Ｏｍｐ
Ｇ）、外膜ホスホリパーゼＡおよびナイセリア（Neisseria）オートトランスポーターリ
ポタンパク質（ＮａｌＰ）などの細菌の外膜タンパク質／ポリン（porin）を含む。α−
ヘリックス束ポアは、α−ヘリックスから形成されたバレルまたはチャネルを含む。好適
なα−ヘリックス束ポアは、これだけに限らないが内膜タンパク質ならびに、ＷＺＡおよ
びＣｌｙＡ毒などのα外膜タンパク質を含む。膜貫通ポアは、Ｍｓｐ由来またはα−ヘモ
リジン（α−ＨＬ）由来である場合がある。

膜貫通タンパク質ポアは、好ましくはＭｓｐに由来し、好ましくはＭｓｐＡに由来する
。そのようなポアはオリゴマーであり、典型的にはＭｓｐ由来の７、８、９または１０個
の単量体を含む。ポアは、同一の単量体を含むＭｓｐ由来のホモオリゴマーポアであって
よい。代替的にポアは、少なくとも１個の他とは異なる単量体を含むＭｓｐ由来のヘテロ
オリゴマーポアであってもよい。好ましくはポアは、ＭｓｐＡまたはその相同体もしくは
パラログ由来である。

Ｍｓｐ由来の単量体は典型的には、配列番号２に示す配列またはその変種を含む。配列
番号２はＭｓｐＡ単量体のＭＳ−（Ｂ１）８変異体である。それは次の変異：Ｄ９０Ｎ、
Ｄ９１Ｎ、Ｄ９３Ｎ、Ｄ１１８Ｒ、Ｄ１３４ＲおよびＥ１３９Ｋを含む。配列番号２の変
種は、配列番号２のものから変化し、ポアを形成する能力を保持しているアミノ酸配列を
有するポリペプチドである。ポアを形成する変種の能力は、当技術分野において公知の任
意の方法を用いてアッセイされ得る。例えば変種は、他の適切なサブユニットと共に両親
媒性層に挿入されることができ、ポアを形成するためにオリゴマー化するその能力は測定
され得る。サブユニットを両親媒性層などの膜に挿入するための方法は、当技術分野にお
いて公知である。例えばサブユニットは、脂質二重層に拡散し、脂質二重層に結合するス
テップおよび機能的状態に会合するステップによって挿入されるように脂質二重層を含有
する溶液中に精製された形態で懸濁され得る。代替的にサブユニットは、M.A.Holden,H.B
ayley.J.Am.Chem.Soc.2005、127、6502-6503および国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２００６／０
０１０５７号（ＷＯ２００６／１００４８４として公開）に記載の「ピックアンドプレー
ス」法を用いて膜に直接挿入され得る。

配列番号２のアミノ酸配列の全長にわたって変種は、アミノ酸同一性に基づいてその配
列に好ましくは少なくとも５０％相同である。より好ましくは変種は、配列全体にわたっ
て配列番号２のアミノ酸配列にアミノ酸同一性に基づいて少なくとも５５％、少なくとも
６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、
少なくとも８５％、少なくとも９０％およびより好ましくは少なくとも９５％、９７％ま
たは９９％相同である。少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、９０％または９５
％のアミノ酸同一性が１００以上（例えば１２５、１５０、１７５もしくは２００または
それ以上）のストレッチの連続アミノ酸にわたってある場合がある（「高い相同性」）。

相同性を決定するために当技術分野における標準的方法が用いられ得る。例えばＵＷＧ
ＣＧパッケージは、相同性を算出するために用いられ得るＢＥＳＴＦＩＴプログラム（例
えばその初期設定で用いられる）を提供する（Devereuxら、(1984) Nucleic Acids Resea
rch 12、387-395頁）。ＰＩＬＥＵＰおよびＢＬＡＳＴアルゴリズムは、相同性を算出す
るためまたは配列を列挙するために（等価残基または対応する配列を同定するステップな
ど（典型的にはその初期設定で））用いられ得る、例えばAltschul S.F.(1993)J Mol Evo
l 36:290-300；Altschul,S.Fら、(1990) J Mol Biol 215:403-10に記載のとおり。ＢＬＡ
ＳＴ分析を実施するためのソフトウエアは、ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ
ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ
．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を通じて公開で入手可能である。

配列番号２は、ＭｓｐＡ単量体のＭＳ−（Ｂ１）８変異体である。変種は、ＭｓｐＡと
比較してＭｓｐＢ、ＣまたはＤ単量体中の任意の変異を含み得る。ＭｓｐＢ、ＣおよびＤ
の成熟形態は配列番号５から７に示される。詳細には変種は、ＭｓｐＢに存在する次の置
換：Ａ１３８Ｐを含む場合がある。変種は、ＭｓｐＣに存在する次の置換：Ａ９６Ｇ、Ｎ
１０２ＥおよびＡ１３８Ｐの１つまたは複数を含む場合がある。変種はＭｓｐＤに存在す
る次の置換：Ｇ１の欠失、Ｌ２Ｖ、Ｅ５Ｑ、Ｌ８Ｖ、Ｄ１３Ｇ、Ｗ２１Ａ、Ｄ２２Ｅ、Ｋ
４７Ｔ、Ｉ４９Ｈ、Ｉ６８Ｖ、Ｄ９１Ｇ、Ａ９６Ｑ、Ｎ１０２Ｄ、Ｓ１０３Ｔ、Ｖ１０４
Ｉ、Ｓ１３６ＫおよびＧ１４１Ａの１つまたは複数を含む場合がある。変種は、ＭｓｐＢ
、ＣおよびＤ由来の１つまたは複数の変異および置換の組合せを含み得る。変種は、好ま
しくは変異Ｌ８８Ｎを含む。配列番号２の変種は、ＭＳ−（Ｂ１）８の全変異に加えて変
異Ｌ８８Ｎを有し、ＭＳ−（Ｂ２）８と称される。本発明において用いられるポアは、好
ましくはＭＳ−（Ｂ２）８である。さらに好ましい変種は、変異Ｇ７５Ｓ／Ｇ７７Ｓ／Ｌ
８８Ｎ／Ｑ１２６Ｒを含む。配列番号２の変種は変異Ｇ７５Ｓ／Ｇ７７Ｓ／Ｌ８８Ｎ／Ｑ
１２６ＲをＭＳ−（Ｂ１）８の全ての変異に加えて含み、ＭＳ−（Ｂ２Ｃ）８と称される
。本発明において使用されるポアは、好ましくはＭＳ−（Ｂ２）８またはＭＳ−（Ｂ２Ｃ
）８である。

アミノ酸置換は、上に考察したものに加えて配列番号２のアミノ酸配列に作出され得る
（例えば１、２、３、４、５、１０、２０または３０置換まで）。保存的置換は、アミノ
酸を同様の化学構造、同様の化学的特性または同様の側鎖容積を有する他のアミノ酸で置
き換える。導入されるアミノ酸は、それらが置き換えるアミノ酸と同様の極性、親水性、
疎水性、塩基性度、酸性度、中性度または電荷を有してよい。代替的に保存的置換は、既
存の芳香族または脂肪族アミノ酸の代わりに芳香族または脂肪族である別のアミノ酸を導
入する場合がある。保存的アミノ酸変更は、当技術分野において周知であり、下の表８に
定義のとおり２０種の主なアミノ酸の特性に従って選択され得る。アミノ酸が同様の極性
を有する場合、これは表９におけるアミノ酸側鎖についてのハイドロパシースケールを参
照することによっても決定され得る。

配列番号２のアミノ酸配列の１つまたは複数のアミノ酸残基は、上に記載のポリペプチ
ドから追加的に欠失され得る。１、２、３、４、５、１０、２０または３０残基までまた
はそれ以上が欠失され得る。

変種は、配列番号２の断片を含み得る。そのような断片は、ポア形成活性を保持する。
断片は、長さ少なくとも５０、１００、１５０または２００アミノ酸であってよい。その
ような断片は、ポアを生成するために用いられ得る。断片は、配列番号２のポア形成ドメ
インを好ましくは含む。断片は、配列番号２の残基８８、９０、９１、１０５、１１８お
よび１３４の１つを含まなければならない。典型的には断片は、配列番号２の残基８８、
９０、９１、１０５、１１８および１３４の全てを含む。

１つまたは複数のアミノ酸は、上に記載のポリペプチドに代替的または追加的に付加さ
れ得る。伸長は、配列番号２のアミノ酸配列またはそのポリペプチド変種もしくは断片の
アミノ末端またはカルボキシ末端に与えられ得る。伸長は極めて短い（例えば長さ１から
１０アミノ酸）場合がある。代替的に伸長はより長くても（例えば５０または１００アミ
ノ酸まで）よい。担体タンパク質は、本発明によるアミノ酸配列に融合され得る。他の融
合タンパク質は、下により詳細に考察される。

上に考察したとおり変種は、配列番号２から変更され、ポアを形成する能力を保持して
いるアミノ酸配列を有するポリペプチドである。変種は、ポア形成に関与する配列番号２
の領域を典型的には含有する。β−バレルを含有するＭｓｐのポア形成能力は、各サブユ
ニットのβシートによって与えられる。配列番号２の変種は、β−シートを形成する配列
番号２中の領域を典型的には含む。１つまたは複数の修飾が、得られる変種がポアを形成
する能力を保持する限り、β−シートを形成する配列番号２の領域に作出され得る。配列
番号２の変種は、置換、付加または欠失などの１つまたは複数の修飾をα−ヘリックスお
よび／またはループ領域内に好ましくは含む。

Ｍｓｐ由来の単量体は、それらの同定または精製を支援するために、例えばヒスチジン
残基（ｈｉｓｔタグ）、アスパラギン酸残基（ａｓｐタグ）、ストレプトアビジンタグも
しくはフラッグタグの付加によって、または（細胞からのそれらの分泌を促進するための
シグナル配列の付加によってポリペプチドが天然でそのような配列を含有しない場合に）
修飾され得る。遺伝子タグを導入するための別法は、ポア上の天然のまたは操作された位
置にタグを化学的に反応させることである。この例は、ポアの外側に操作されたシステイ
ンにゲルシフト試薬を反応させることである。これは、ヘモリジンヘテロ−オリゴマーを
分離するステップのための方法として実証されている(Chem Biol.1997 Jul;4(7):497-505
)。

Ｍｓｐ由来の単量体は、明示標識（revealing label）で標識され得る。明示標識は、
ポアが検出されるようにする任意の好適な標識であってよい。好適な標識は、上に記載さ
れている。

Ｍｓｐ由来の単量体は、Ｄ−アミノ酸を用いても生成され得る。例えばＭｓｐ由来の単
量体は、Ｌ−アミノ酸とＤ−アミノ酸との混合物を含み得る。これは、そのようなタンパ
ク質またはペプチドを生成するための当技術分野における従来法である。

Ｍｓｐ由来の単量体は、ヌクレオチド識別を促進するために１つまたは複数の特異的修
飾を含有する。Ｍｓｐ由来の単量体は、他の非特異的な修飾をそれらがポア形成を干渉し
ない限り含有できる。多数の非特異的側鎖修飾が当技術分野において公知であり、Ｍｓｐ
由来の単量体の側鎖に作出され得る。そのような修飾は、例えばアルデヒドとの反応に続
くＮａＢＨ_４での還元によるアミノ酸の還元的アルキル化、メチルアセトイミデート（me
thylacetimidate）でのアミジン化または無水酢酸でのアシル化を含む。

Ｍｓｐ由来の単量体は、当技術分野において公知の標準的方法を用いて生成され得る。
Ｍｓｐ由来の単量体は、合成的にまたは組換え手段によって作出され得る。例えばポアは
ｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳および転写（ＩＶＴＴ）によって合成され得る。ポアを生成するた
めの好適な方法は、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ０９／００１６９０号（ＷＯ２０１０／００
４２７３として公開）、第ＰＣＴ／ＧＢ０９／００１６７９号（ＷＯ２０１０／００４２
６５として公開）または第ＰＣＴ／ＧＢ１０／０００１３３号（ＷＯ２０１０／０８６６
０３として公開）に考察されている。ポアを膜に挿入するための方法は考察されている。

膜貫通タンパク質ポアは、好ましくはα−ヘモリジン（α−ＨＬ）由来でもある。野生
型α−ＨＬポアは、７個の同一単量体またはサブユニットから形成される（すなわち七量
体である）。α−ヘモリジン−ＮＮの１個の単量体またはサブユニットの配列は配列番号
４に示されている。膜貫通タンパク質ポアは、配列番号４に示す配列またはその変種をそ
れぞれ含む７個の単量体を好ましくは含む。配列番号４のアミノ酸１、７から２１、３１
から３４、４５から５１、６３から６６、７２、９２から９７、１０４から１１１、１２
４から１３６、１４９から１５３、１６０から１６４、１７３から２０６、２１０から２
１３、２１７、２１８、２２３から２２８、２３６から２４２、２６２から２６５、２７
２から２７４、２８７から２９０および２９４はループ領域を形成する。配列番号４の残
基１１３および１４７はα−ＨＬのバレルまたはチャネルの狭窄の一部を形成する。

そのような実施形態では、配列番号４に示す配列またはその変種をそれぞれ含む７個の
タンパク質または単量体を含むポアは、本発明の方法において好ましくは用いられる。７
個のタンパク質は、同じ（ホモ七量体）または異なっていて（ヘテロ七量体）よい。

配列番号４の変種は、配列番号４のものから変化したアミノ酸配列を有し、ポア形成能
力を保持しているタンパク質である。ポアを形成する変種の能力は、当技術分野において
公知の任意の方法を用いてアッセイされ得る。例えば変種は、他の適切なサブユニットと
共に脂質二重層などの両親媒性層に挿入されることができ、ポアを形成するためにオリゴ
マー化するその能力は決定され得る。サブユニットを脂質二重層などの両親媒性層に挿入
するための方法は当技術分野において公知である。好適な方法は上に考察されている。

変種は、ヘリカーゼまたは構築物への共有結合付着または相互作用を促進する修飾を含
み得る。変種は、ヘリカーゼまたは構築物への付着を促進する１つまたは複数の反応性シ
ステイン残基を好ましくは含む。例えば変種は、配列番号４の位置８、９、１７、１８、
１９、４４、４５、５０、５１、２３７、２３９および２８７ならびに／またはアミノ末
端もしくはカルボキシ末端の１つまたは複数にシステインを含み得る。好ましい変種は、
配列番号４の位置８、９、１７、２３７、２３９および２８７の残基のシステインでの置
換を含む（Ａ８Ｃ、Ｔ９Ｃ、Ｎ１７Ｃ、Ｋ２３７Ｃ、Ｓ２３９ＣまたはＥ２８７Ｃ）。変
種は、好ましくは国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ０９／００１６９０号（ＷＯ２０１０／００４
２７３として公開）、第ＰＣＴ／ＧＢ０９／００１６７９号（ＷＯ２０１０／００４２６
５として公開）、または第ＰＣＴ／ＧＢ１０／０００１３３号（ＷＯ２０１０／０８６６
０３として公開）に記載の変種のいずれか１つである。

変種は、ヌクレオチドとの任意の相互作用を促進する修飾も含み得る。

変種は、生物（例えば細菌ブドウ球菌（Staphylococcus））によって天然で発現される
天然に存在する変種であってよい。代替的に変種は、大腸菌（Escherichia coli）などの
細菌によってｉｎ ｖｉｔｒｏでまたは組換え的に発現されてもよい。変種は、組換え技
術によって生成される天然に存在しない変種も含む。配列番号４のアミノ酸配列の全長に
わたって変種は、アミノ酸同一性に基づいてその配列に好ましくは少なくとも５０％相同
である。より好ましくは変種ポリペプチドは、配列全体にわたって配列番号４のアミノ酸
配列にアミノ酸同一性に基づいて少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５
％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少な
くとも９０％およびより好ましくは少なくとも９５％、９７％または９９％相同である。
少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、９０％または９５％のアミノ酸同一性が２
００以上（例えば２３０、２５０、２７０もしくは２８０またはそれ以上）のストレッチ
の連続アミノ酸にわたってある場合がある（「高い相同性」）。相同性は上に考察のとお
り決定され得る。

アミノ酸置換は、上に考察したものに加えて配列番号４のアミノ酸配列に作出され得る
（例えば１、２、３、４、５、１０、２０または３０置換まで）。保存的置換は、上に考
察の通り作出され得る。

配列番号４のアミノ酸配列の１つまたは複数のアミノ酸残基は、上に記載のポリペプチ
ドから追加的に欠失され得る。１、２、３、４、５、１０、２０または３０残基までまた
はそれ以上が欠失され得る。

変種は、配列番号４の断片であり得る。そのような断片はポア形成能力を保持する。断
片は、長さ少なくとも５０、１００、２００または２５０アミノ酸であってよい。断片は
、配列番号４のポア形成ドメインを好ましくは含む。断片は典型的には配列番号４の残基
１１９、１２１、１３５、１１３および１３９を含む。

１つまたは複数のアミノ酸は、上に記載のポリペプチドに代替的にまたは追加的に付加
され得る。伸長は、配列番号４のアミノ酸配列またはその変種もしくは断片のアミノ末端
またはカルボキシ末端に与えられ得る。伸長は極めて短い（例えば長さ１から１０アミノ
酸）場合がある。代替的に伸長は、より長くても（例えば５０または１００アミノ酸まで
）良い。担体タンパク質は、ポアまたは変種に融合されてもよい。

上に考察したとおり、配列番号４の変種は、配列番号４のものから変更され、ポアを形
成する能力を保持しているアミノ酸配列を有するサブユニットである。変種は、ポア形成
に関与する配列番号４の領域を典型的には含有する。β−バレルを含有するα−ＨＬのポ
ア形成能力は、各サブユニットのβシートによって与えられる。配列番号４の変種は、β
鎖を形成する配列番号４の領域を典型的には含む。β鎖を形成する配列番号４のアミノ酸
は上に考察されている。１つまたは複数の修飾が、得られる変種がポアを形成する能力を
保持する限りβ−鎖を形成する配列番号４の領域に作出され得る。配列番号４のβ鎖領域
に作られ得る具体的な修飾は、上に考察されている。

配列番号４の変種は、置換、付加または欠失などの１つまたは複数の修飾をα−ヘリッ
クスおよび／またはループ領域内に好ましくは含む。α−ヘリックスおよびループを形成
するアミノ酸は、上に考察されている。

変種は、上に考察のとおり、その同定または精製を支援するために修飾され得る。

α−ＨＬ由来のポアは、Ｍｓｐ由来のポアに関連して上に考察のとおり作出され得る。

いくつかの実施形態では膜貫通タンパク質ポアは、化学的に修飾される。ポアは、任意
の方法および任意の部位で化学的に修飾され得る。膜貫通タンパク質ポアは、１つもしく
は複数のシステインへの分子の付着（システイン連結）、１つもしくは複数のリシンへの
分子の付着、１つもしくは複数の非天然アミノ酸への分子の付着、エピトープの酵素修飾
または末端の修飾によって好ましくは化学的に修飾される。そのような修飾を実行するた
めの好適な方法は、当技術分野において周知である。膜貫通タンパク質ポアは、任意の分
子の付着によって化学的に修飾され得る。例えばポアは、色素またはフルオロフォアの付
着によって化学的に修飾され得る。

ポア中の任意の数の単量体は、化学的に修飾され得る。１つまたは複数（２、３、４、
５、６、７、８、９または１０個など）の単量体は、上に考察のとおり好ましくは化学的
に修飾される。

システイン残基の反応性は、隣接残基の修飾によって増強され得る。例えば近接アルギ
ニン、ヒスチジンまたはリシン残基の塩基性基は、システインチオール基のｐＫａをより
反応性のＳ⁻基のものに変化させる。システイン残基の反応性は、ｄＴＮＢなどのチオー
ル保護基によって保護され得る。これらは、リンカーが付着する前にポアの１つまたは複
数のシステイン残基と反応できる。

（ポアが化学的に修飾される）分子は、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ０９／００１６９０号
（ＷＯ２０１０／００４２７３として公開）、第ＰＣＴ／ＧＢ０９／００１６７９号（Ｗ
Ｏ２０１０／００４２６５として公開）または第ＰＣＴ／ＧＢ１０／０００１３３号（Ｗ
Ｏ２０１０／０８６６０３として公開）に開示のとおりポアに直接付着され得るか、また
はリンカーを介して付着され得る。

ヘリカーゼまたは構築物は、ポアに共有結合的に付着されていてもよい。ヘリカーゼま
たは構築物は、好ましくはポアに共有結合的に付着されていない。ポアおよびヘリカーゼ
または構築物への電圧の印加は、典型的には標的ポリヌクレオチドを配列決定できるセン
サーの形成を生じる。これは、下により詳細に考察される。

本明細書に記載の任意のタンパク質、すなわちヘリカーゼ、膜貫通タンパク質ポアまた
は構築物は、それらの同定または精製を支援するために、例えばヒスチジン残基（ｈｉｓ
タグ）、アスパラギン酸残基（ａｓｐタグ）、ストレプトアビジンタグ、フラッグタグ、
ＳＵＭＯタグ、ＧＳＴタグもしくはＭＢＰタグの付加によって、または、それらの細胞か
らの分泌を促進するために（ポリペプチドが天然でそのような配列を含有していない場合
に）シグナル配列の付加によって修飾され得る。遺伝子タグを導入するための別法は、ヘ
リカーゼ、ポアまたは構築物上の天然のまたは操作された位置にタグを化学的に反応させ
ることである。この例は、ポアの外側の操作されたシステインにゲルシフト試薬を反応さ
せることである。これは、ヘモリジンヘテロ−オリゴマーを分離するステップのための方
法として実証されている（Chem Biol.1997 Jul;4(7):497-505）。

ヘリカーゼ、ポアまたは構築物は明示標識（revealing label）で標識され得る。明示
標識は、ポアが検出されるようにする任意の好適な標識であってよい。好適な標識は、こ
れだけに限らないが蛍光分子、放射性同位元素（例えば¹²⁵I、³⁵S）、酵素、抗体、抗原
、ポリヌクレオチドおよびリガンド（ビオチンなど）を含む。

タンパク質は、合成的にまたは組換え手段によって作出され得る。例えばヘリカーゼ、
ポアまたは構築物は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳および転写（ＩＶＴＴ）によって合成され得
る。ヘリカーゼ、ポアまたは構築物のアミノ酸配列は、天然に存在しないアミノ酸を含む
ようにまたはタンパク質の安定性を増大させるように修飾され得る。タンパク質が合成的
手段によって生成される場合、そのようなアミノ酸は、生成の際に導入され得る。ヘリカ
ーゼ、ポアまたは構築物は、合成的にまたは組換え生成のいずれかに続いて変更され得る
。

ヘリカーゼ、ポアまたは構築物は、Ｄ−アミノ酸を用いても生成し得る。例えばポアま
たは構築物は、Ｌ−アミノ酸とＤ−アミノ酸との混合物を含み得る。これは、そのような
タンパク質またはペプチドを生成するための当技術分野における従来法である。

ヘリカーゼ、ポアまたは構築物は、他の非特異的修飾もそれらがポア形成またはヘリカ
ーゼまたは構築物機能を干渉しない限り含有できる。多数の非特異的側鎖修飾が当技術分
野において公知であり、タンパク質（複数可）の側鎖に作出され得る。そのような修飾は
、例えばアルデヒドとの反応に続くＮａＢＨ_４での還元によるアミノ酸の還元的アルキル
化、メチルアセトイミデート（methylacetimidate）でのアミジン化または無水酢酸での
アシル化を含む。

ヘリカーゼ、ポアおよび構築物は、当技術分野において公知の標準的方法を用いて生成
され得る。ヘリカーゼ、ポアまたは構築物をコードするポリヌクレオチド配列は、当技術
分野における標準的方法を用いて得られ、複製され得る。ヘリカーゼ、ポアまたは構築物
をコードするポリヌクレオチド配列は、当技術分野における標準的技術を用いて細菌宿主
細胞において発現され得る。ヘリカーゼ、ポアおよび／または構築物は、組換え発現ベク
ターからのポリペプチドの原位置での発現によって細胞において生成され得る。場合によ
り発現ベクターは、ポリペプチドの発現を制御するために誘導性プロモーターを保持する
。これらの方法は、Sambrook,J.and Russell,D.(2001).Molecular Cloning:A Laboratory
Manual、3rd Edition.Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、NY
に記載されている。

ヘリカーゼ、ポアおよび／または構築物は、大規模に生成されることができ、タンパク
質生成生物または組換え発現からの任意のタンパク質液体クロマトグラフィー系による精
製が続く。典型的なタンパク質液体クロマトグラフィー系は、ＦＰＬＣ、ＡＫＴＡ ｓｙ
ｓｔｅｍｓ、Ｂｉｏ−Ｃａｄ ｓｙｓｔｅｍ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ ＢｉｏＬｏｇｉｃ ｓｙ
ｓｔｅｍおよびＧｉｌｓｏｎ ＨＰＬＣ ｓｙｓｔｅｍを含む。

本発明の方法は、標的ポリヌクレオチドの１つまたは複数の特性を測定するステップを
含む。方法は、標的ポリヌクレオチドの２つ、３つ、４つまたは５つ以上の特性を測定す
るステップを含み得る。１つまたは複数の特性は、好ましくは（ｉ）標的ポリヌクレオチ
ドの長さ、（ｉｉ）標的ポリヌクレオチドの同一性、（ｉｉｉ）標的ポリヌクレオチドの
配列、（ｉｖ）標的ポリヌクレオチドの二次構造および（ｖ）標的ポリヌクレオチドが修
飾されているか否か、から選択される。（ｉ）から（ｖ）の任意の組合せは本発明により
測定され得る。

（ｉ）に関して、ポリヌクレオチドの長さは、例えば標的ポリヌクレオチドとポアとの
間の相互作用の数または標的ポリヌクレオチドとポアとの間の相互作用の持続時間を測定
することによって測定され得る。

（ｉｉ）に関して、ポリヌクレオチドの同一性は、多数の方法において測定され得る。
ポリヌクレオチドの同一性は、標的ポリヌクレオチドの配列の測定を伴ってまたは標的ポ
リヌクレオチドの配列の測定を伴わずに測定され得る。前者は、簡単であり、ポリヌクレ
オチドは配列決定され、それにより同定される。後者は、いくつかの方法で行われ得る。
例えばポリヌクレオチド中の具体的なモチーフの存在は（ポリヌクレオチドの残りの配列
を測定するステップを伴わずに）測定され得る。代替的に、方法における具体的な電気的
および／または光学的シグナルの測定は、標的ポリヌクレオチドを具体的な供給源由来で
あるとして同定できる。

（ｉｉｉ）に関して、ポリヌクレオチドの配列は、以前記載されたとおり決定され得る
。好適な配列決定方法、詳細には電気的測定を用いるものは、Stoddart Dら、Proc Natl
Acad Sci、12;106(19):7702-7、Lieberman KRら、J Am Chem Soc.2010;132(50):17961-72
および国際出願第ＷＯ２０００／２８３１２号に記載されている。

（ｉｖ）に関して、二次構造は、種々の方法において測定され得る。例えば方法が電気
的測定を含む場合、二次構造は残存時間における変化またはポアを通って流れる電流にお
ける変化を用いて測定され得る。これは、１本鎖と２本鎖のポリヌクレオチドの領域を区
別できるようにする。

（ｖ）に関して、任意の修飾の存在または非存在は、測定され得る。方法は、好ましく
は標的ポリヌクレオチドが、メチル化によって、酸化によって、損傷によって、１つまた
は複数のタンパク質でまたは１つまたは複数の標識、タグもしくはスペーサーで修飾され
ているかどうかを決定するステップを含む。具体的な修飾は、下に記載の方法を用いて測
定され得るポアとの特異的な相互作用を生じる。例えばメチルシトシンは、各ヌクレオチ
ドとのその相互作用の際にポアを通って流れる電流に基づいてシトシンから区別され得る
。

種々の異なる種類の測定が作出されてよい。これは、非限定的に:電気的測定および光
学的測定を含む。可能性のある電気的測定は、電流測定：インピーダンス測定、トンネル
測定（Ivanov APら、Nano Lett.2011 Jan 12;11(1):279-85）およびＦＥＴ測定（国際出
願第ＷＯ２００５／１２４８８８号）を含む。光学的測定は、電気的測定(Soni GVら、Re
v Sci Instrum. 2010 Jan;81(1):014301)と組み合わされ得る。測定は、ポアを通って流
れるイオン電流の測定などの膜貫通電流測定であってよい。

電気的測定は、Stoddart Dら、Proc Natl Acad Sci、12;106(19):7702-7、Lieberman K
Rら、J Am Chem Soc.2010;132(50):17961-72および国際出願第ＷＯ−２０００／２８３１
２号に記載の標準的単一チャネル記録機器を用いて作出され得る。代替的に電気的測定は
、例えば国際出願第ＷＯ−２００９／０７７７３４号および国際出願第ＷＯ−２０１１／
０６７５５９号に記載のマルチチャネル系を用いても作出され得る。

好ましい実施形態では、方法は、
（ａ）標的ポリヌクレオチドを膜貫通ポアおよび本発明のヘリカーゼまたは本発明の構築
物と、標的ポリヌクレオチドがポアを通って移動し、ヘリカーゼまたは構築物がポアを通
る標的ポリヌクレオチドの移動を制御するように接触させるステップ、ならびに
（ｂ）ポリヌクレオチドがポアに関して移動するときにポアを通る電流を測定するステッ
プであって、電流が標的ポリヌクレオチドの特性の１つまたは複数を示し、それにより標
的ポリヌクレオチドを特性決定するステップ
を含む。

方法は、ポアが膜内に存在している膜／ポア系を調べるのに好適である任意の装置を用
いて実行され得る。方法は、膜貫通ポアセンシングに好適である任意の装置を用いて実行
され得る。例えば装置は、水性溶液および、チャンバーを２つのセクションに分離する障
壁を含むチャンバーを含む。障壁は典型的にはポアを含有する膜が形成される開口部を有
する。代替的に障壁は、ポアが存在する膜を形成する。

方法は、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ０８／０００５６２号（ＷＯ２００８／１０２１２０
）に記載の装置を用いて実行され得る。

方法は、ポリヌクレオチドがポアに関して移動するときにポアを通る電流を測定するス
テップを含んでよい。したがって装置は、電位を印加でき、膜およびポアを通る電気シグ
ナルを測定できる電気回路も含む。方法は、パッチクランプまたは電圧クランプを用いて
も実行され得る。方法は、電圧クランプの使用を好ましくは含む。

本発明の方法は、ポリヌクレオチドがポアに関して移動するときにポアを通過する電流
の測定を含み得る。膜貫通タンパク質ポアを通るイオン電流を測定するための好適な条件
は、当技術分野において公知であり、実施例で開示される。方法は、膜およびポア全体に
印加される電圧と共に典型的には実行される。用いられる電圧は典型的には、＋２Ｖから
−２Ｖまで、典型的には−４００ｍＶから＋４００ｍＶまでである。好ましくは用いられ
る電圧は、−４００ｍＶ、−３００ｍＶ、−２００ｍＶ、−１５０ｍＶ、−１００ｍＶ、
−５０ｍＶ、−２０ｍＶおよび０ｍＶから選択される下限値および＋１０ｍＶ、＋２０ｍ
Ｖ、＋５０ｍＶ、＋１００ｍＶ、＋１５０ｍＶ、＋２００ｍＶ、＋３００ｍＶおよび＋４
００ｍＶから独立に選択される上限値を含む範囲内である。用いられる電圧は、より好ま
しくは１００ｍＶから２４０ｍＶまでの範囲内、最も好ましくは１２０ｍＶから２２０ｍ
Ｖまでの範囲内である。印加される電位を増加させることによってポアによるさまざまな
ヌクレオチド間の識別を向上させることは可能である。

方法は、金属塩（例えばアルカリ金属塩）、ハロゲン化塩（例えばアルカリ金属塩化物
塩などの塩化物塩）などの任意の電荷担体の存在下で典型的には実行される。電荷担体は
、イオン液体または有機塩、例えばテトラメチル塩化アンモニウム、トリメチルフェニル
塩化アンモニウム、フェニルトリメチル塩化アンモニウムもしくは１−エチル−３メチル
イミダゾリウムクロリド（1-ethyl-3-methyl imidazolium chloride）を含み得る。上に
考察した例示的装置では、塩はチャンバー中の水性溶液中に存在する。塩化カリウム（Ｋ
Ｃｌ）、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、塩化セシウム（ＣｓＣｌ）またはフェロシアン化
カリウムとフェリシアン化カリウムとの混合物が典型的には使用される。ＫＣｌ、ＮａＣ
ｌおよびフェロシアン化カリウムとフェリシアン化カリウムとの混合物は 好ましい。塩
濃度は飽和であってよい。塩濃度は、３Ｍ以下があり得、典型的には０．１から２．５Ｍ
まで、０．３から１．９Ｍまで、０．５から１．８Ｍまで、０．７から１．７Ｍまで、０
．９から１．６Ｍまでまたは１Ｍから１．４Ｍまでである。塩濃度は、好ましくは１５０
ｍＭから１Ｍまでである。Ｈｅｌ３０８、ＸＰＤ、ＲｅｃＤおよびＴｒａＩヘリカーゼは
、高塩濃度下で驚くべきことに作用する。方法は、少なくとも０．４Ｍ、少なくとも０．
５Ｍ、少なくとも０．６Ｍ、少なくとも０．８Ｍ、少なくとも１．０Ｍ、少なくとも１．
５Ｍ、少なくとも２．０Ｍ、少なくとも２．５Ｍまたは少なくとも３．０Ｍなどの少なく
とも０．３Ｍの塩濃度を用いて好ましくは実行される。高塩濃度は、高い信号対雑音比を
提供し、通常の電流変動のバックグラウンドに対してヌクレオチドの存在を示す電流が同
定されることを可能にする。

方法は、緩衝剤の存在下で典型的には実行される。上に考察した例示的装置では、緩衝
剤はチャンバー中の水性溶液に存在する。任意の緩衝剤が本発明の方法において用いられ
得る。典型的には、緩衝剤はＨＥＰＥＳである。別の好適な緩衝剤はＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩
衝剤である。方法は、４．０から１２．０まで、４．５から１０．０まで、５．０から９
．０まで、５．５から８．８まで、６．０から８．７までまたは７．０から８．８までま
たは７．５から８．５までのｐＨで典型的には実行される。用いられるｐＨは好ましくは
約７．５である。

方法は、０^ｏＣから１００^ｏＣまで、１５^ｏＣから９５^ｏＣまで、１６^ｏＣから９０^ｏ
Ｃまで、１７^ｏＣから８５^ｏＣまで、１８^ｏＣから８０^ｏＣまで、１９^ｏＣから７０^ｏＣ
までまたは２０^ｏＣから６０^ｏＣまでで実行され得る。方法は典型的には室温で実行され
る。方法は、約３７℃などの酵素機能を支持する温度で場合により実行される。

方法は、遊離ヌクレオチドまたは遊離ヌクレオチド類似物および／またはヘリカーゼも
しくは構築物の作用を促進する酵素補因子の存在下で実行されてもよい。方法は、遊離ヌ
クレオチドまたは遊離ヌクレオチド類似物の非存在下でおよび酵素補因子の非存在下で実
行されてもよい。遊離ヌクレオチドは、上に考察した個々のヌクレオチドの任意の１つま
たは複数であってよい。遊離ヌクレオチドは、これだけに限らないがアデノシン一リン酸
（ＡＭＰ）、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、グアノシ
ン一リン酸（ＧＭＰ）、グアノシン二リン酸（ＧＤＰ）、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）
、チミジン一リン酸（ＴＭＰ）、チミジン二リン酸（ＴＤＰ）、チミジン三リン酸（ＴＴ
Ｐ）、ウリジン一リン酸（ＵＭＰ）、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）、ウリジン三リン酸（
ＵＴＰ）、シチジン一リン酸（ＣＭＰ）、シチジン二リン酸（ＣＤＰ）、シチジン三リン
酸（ＣＴＰ）、環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）、環状グアノシン一リン酸（ｃＧＭ
Ｐ）、デオキシアデノシン一リン酸（ｄＡＭＰ）、デオキシアデノシン二リン酸（ｄＡＤ
Ｐ）、デオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）、デオキシグアノシン一リン酸（ｄＧＭ
Ｐ）、デオキシグアノシン二リン酸（ｄＧＤＰ）、デオキシグアノシン三リン酸（ｄＧＴ
Ｐ）、デオキシチミジン一リン酸（ｄＴＭＰ）、デオキシチミジン二リン酸（ｄＴＤＰ）
、デオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）、デオキシウリジン一リン酸（ｄＵＭＰ）、デ
オキシウリジン二リン酸（ｄＵＤＰ）、デオキシウリジン三リン酸（ｄＵＴＰ）、デオキ
シシチジン一リン酸（ｄＣＭＰ）、デオキシシチジン二リン酸（ｄＣＤＰ）およびデオキ
シチジン三リン酸（ｄＣＴＰ）を含む。遊離ヌクレオチドは、好ましくはＡＭＰ、ＴＭＰ
、ＧＭＰ、ＣＭＰ、ＵＭＰ、ｄＡＭＰ、ｄＴＭＰ、ｄＧＭＰまたはｄＣＭＰから選択され
る。遊離ヌクレオチドは、好ましくはアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）である。酵素補因子
は、ヘリカーゼまたは構築物を機能させる因子である。酵素補因子は、好ましくは二価金
属カチオンである。二価金属カチオンは好ましくはＭｇ^２＋、Ｍｎ^２＋、Ｃａ^２＋または
Ｃｏ^２＋である。酵素補因子は、最も好ましくはＭｇ^２＋である。

標的ポリヌクレオチドは、ヘリカーゼまたは構築物およびポアと任意の順序で接触され
得る。標的ポリヌクレオチドがヘリカーゼまたは構築物およびポアと接触される場合、標
的ポリヌクレオチドは最初にヘリカーゼまたは構築物と複合体を形成することは好ましい
。ポアに電圧が印加される場合、標的ポリヌクレオチド／ヘリカーゼまたは構築物複合体
は次いでポアと複合体を形成し、ポアを通るポリヌクレオチドの移動を制御する。

上に考察したとおり、ヘリカーゼは、ポアに関して２つのモードで作動できる。本発明
のヘリカーゼまたは本発明の構築物は、２つのモードでも作動できる。第一に、方法は、
印加された電圧から生じる場に沿ってポアを通って標的配列を移動させるようにヘリカー
ゼまたは構築物を用いて好ましくは実行される。このモードでは、ＤＮＡの３’末端が最
初にポア（３’から５’ヘリカーゼ）に捕捉され、標的配列が最終的に二重層のｔｒａｎ
ｓ側に移行されるまで場に沿ってポアを通るようにヘリカーゼまたは構築物は、ＤＮＡを
ポア中に移動させる（図８を参照されたい）。代替的に、方法は、印加された電圧から生
じる場とは反対にヘリカーゼまたは構築物が標的配列をポアを通して移動させるように好
ましくは実行される。このモードでは、ＤＮＡの５’末端が最初にポア（３’から５’ヘ
リカーゼ）に捕捉され、ヘリカーゼまたは構築物は、標的配列が最終的に二重層のｃｉｓ
側に戻って放されるまで印加された場とは反対にポアの外側へ引かれるようにＤＮＡをポ
アを通して移動させる（図７を参照されたい）。

他の方法
本発明は、標的ポリヌクレオチドを特性決定するためのセンサーの形成方法も提供する
。方法は、ポアと本発明のヘリカーゼまたは本発明の構築物との複合体を形成するステッ
プを含む。複合体は、ポアとヘリカーゼまたは構築物とを標的ポリヌクレオチドの存在下
で接触させ、次いで、ポアに電位を印加するステップによって形成され得る。印加される
電位は、上に記載のとおり化学電位または電圧電位であってよい。代替的に複合体は、ポ
アをヘリカーゼまたは構築物に共有結合的に付着するステップによっても形成され得る。
共有結合付着のための方法は、当技術分野において公知であり、例えば国際出願第ＰＣＴ
／ＧＢ０９／００１６７９号（ＷＯ２０１０／００４２６５として公開）および第ＰＣＴ
／ＧＢ１０／０００１３３号（ＷＯ２０１０／０８６６０３として公開）において開示さ
れている。複合体は、標的ポリヌクレオチドを特性決定するためのセンサーである。方法
は、Ｍｓｐ由来のポアと本発明のヘリカーゼまたは本発明の構築物との複合体を形成する
ステップを好ましくは含む。本発明の方法を参照して上に考察した任意の実施形態は、こ
の方法に等しく適用される。本発明は、本発明の方法を使用して産生されるセンサーも提
供する。

キット
本発明は、標的ポリヌクレオチドを特性決定するためのキットも提供する。キットは、
（ａ）ポアおよび（ｂ）本発明のヘリカーゼまたは本発明の構築物を含む。本発明の方法
に関連して上に考察された任意の実施形態は、キットに等しく適用する。

キットは、脂質二重層などの両親媒性層を形成するために必要なリン脂質などの膜の構
成成分をさらに含んでよい。

本発明のキットは、上に述べた任意の実施形態が実行されるようにする１つまたは複数
の他の試薬または器具を追加的に含んでよい。そのような試薬または器具は、次の：好適
な緩衝剤（複数可）（水性溶液）、対象から試料を得るための手段（容器もしくは、針を
含む器具など）、ポリヌクレオチドを増幅および／もしくは発現するための手段、上に定
義の膜または電圧もしくはパッチクランプ装置、の１つまたは複数を含む。試薬は、液体
試料が試薬を再懸濁するように乾燥状態でキット中に存在する場合がある。キットは、キ
ットが本発明の方法において用いられ得るようにする説明書、またはいずれの患者に方法
が用いられ得るかに関する詳細も場合により含む場合がある。キットは、場合によりヌク
レオチドを含み得る。

装置
本発明は、標的ポリヌクレオチドを特性決定するための装置も提供する。装置は、複数
のポアおよび複数の本発明のヘリカーゼまたは複数の本発明の構築物を含む。装置は、本
発明の方法を実行するための説明書を好ましくはさらに含む。装置は、アレイまたはチッ
プなどのポリヌクレオチド分析のための任意の従来装置であってよい。本発明の方法に関
連して上に考察された任意の実施形態は、本発明の装置に等しく適用可能である。

装置は、本発明の方法を実行するために好ましくはセットアップされている。

装置は、好ましくは：
複数のポアを支持でき、ポアおよび構築物を用いてポリヌクレオチド特性決定を実施する
ために作動可能であるセンサーデバイス；ならびに
特性決定を実施するための材料を保持するための少なくとも１つのリザーバー；
を含む。

装置は、好ましくは：
複数のポアを支持でき、ポアおよびヘリカーゼまたは構築物を用いてポリヌクレオチド特
性決定を実施するために作動可能であるセンサーデバイス；ならびに
特性決定を実施するための材料を保持するための少なくとも１つのリザーバー；
を含む。

装置は、
膜および複数のポアを支持でき、ポアおよびヘリカーゼまたは構築物を用いてポリヌクレ
オチド特性決定を実施するために作動可能であるセンサーデバイス；
特性決定を実施するための材料を保持するための少なくとも１つのリザーバー；
少なくとも１つのリザーバーからセンサーデバイスに材料を制御可能に供給するように構
成された流体系；および
各試料を受けるための１つまたは複数の容器を好ましくは含み、
流体系は、１つまたは複数の容器からセンサーデバイスに試料を選択的に供給するように
構成されている。装置は、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ０８／００４１２７号（ＷＯ２００９
／０７７７３４として公開）、第ＰＣＴ／ＧＢ１０／０００７８９号（ＷＯ２０１０／１
２２２９３として公開）、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ１０／００２２０６号（未公開）また
は国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ９９／２５６７９号（ＷＯ００／２８３１２として公開）にお
いて記載の任意のものであってよい。

本発明のヘリカーゼを産生する方法
本発明は、本発明のヘリカーゼを産生する方法も提供する。一実施形態では方法は、１
つまたは複数の単量体から形成され、それを通ってポリヌクレオチドがヘリカーゼから解
離できる開口部を含むポリヌクレオチド結合ドメインを含むヘリカーゼを提供するステッ
プを含む。上に考察した任意のヘリカーゼは、方法において使用できる。

方法は、ヘリカーゼの同じ単量体上の２つ以上の部分が繋がれて開口部のサイズを低減
するようにヘリカーゼを修飾するステップも含む。接続の部位および方法は、上に考察し
たとおり選択される。

別の実施形態では方法は、Ｈｅｌ３０８ヘリカーゼを提供するステップを含む。上に考
察した任意のＨｅｌ３０８ヘリカーゼは使用できる。

方法は、Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（配列番号１０）中のＤ２７２、Ｎ２７３、Ｄ２７４、Ｇ
２８１、Ｅ２８４、Ｅ２８５、Ｅ２８７、Ｓ２８８、Ｔ２８９、Ｇ２９０、Ｅ２９１、Ｄ
２９３、Ｔ２９４、Ｎ３００、Ｒ３０３、Ｋ３０４、Ｎ３１４、Ｓ３１５、Ｎ３１６、Ｈ
３１７、Ｒ３１８、Ｋ３１９、Ｌ３２０、Ｅ３２２、Ｒ３２６、Ｎ３２８およびＳ６１５
に対応する位置の１つまたは複数に１つもしくは複数のシステイン残基および／または１
つもしくは複数の非天然アミノ酸を導入するステップをさらに含む。

方法は、（ｃ）例えば５０℃、１０分間加熱することにより修飾ヘリカーゼを加熱する
ステップ、（ｄ）例えば修飾ヘリカーゼを高強度ＵＶ光に２５４ｎｍで約１０から約１５
分間曝露することによる修飾ヘリカーゼをＵＶ光に曝露するステップ、または（ｅ）フェ
ロシアン化カリウムおよびフェリシアン化カリウムなどのフェロシアン化物およびフェリ
シアン化物に修飾ヘリカーゼを曝露するステップを好ましくはさらに含む。ステップ（ｃ
）、（ｄ）および（ｅ）の任意の組合せ、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｃ）および（ｄ）
、（ｄ）および（ｅ）、（ｃ）および（ｅ）または（ｃ）、（ｄ）および（ｅ）などは実
施できる。

方法は、ヘリカーゼがポリヌクレオチドの移動を制御できるかどうかを決定するステッ
プを好ましくはさらに含む。これを行うためのアッセイは、上に記載されている。ポリヌ
クレオチドの移動が制御され得る場合、ヘリカーゼは正しく修飾されており、本発明のヘ
リカーゼが産生されている。ポリヌクレオチドの移動が制御され得ない場合、本発明のヘ
リカーゼは産生されていない。

本発明の構築物を産生する方法
本発明は、本発明の構築物を産生する方法も提供する。方法は、本発明のヘリカーゼを
追加的ポリヌクレオチド結合成分に付着、好ましくは共有結合的に付着させるステップを
含む。上に考察した任意のヘリカーゼおよび成分が方法において使用できる。共有結合的
付着の部位および方法は上に考察したとおり選択される。

方法は、構築物がポリヌクレオチドの移動を制御できるかどうかを決定するステップを
好ましくはさらに含む。これを行うためのアッセイは、上に記載されている。ポリヌクレ
オチドの移動が制御され得る場合、ヘリカーゼおよび成分は正しく付着され、本発明の構
築物が産生されている。ポリヌクレオチドの移動が制御され得ない場合、本発明の構築物
は産生されていない。

次の実施例は本発明を例示する。
実施例

本実施例は、Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃ）−ビスマレイミドＰＥＧ
３（ビスマレイミドＰＥＧ３リンカーによって繋がれ、変異Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃを有
する配列番号１０）を合成する方法を記載する。この場合、Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（配列番
号１０）の一次配列中の位置２８４および６１５のシステイン間の共有結合は、これらの
位置をビスマレイミドＰＥＧ３リンカー（長さおよそ３．７ｎｍ）と反応させることによ
って作製した。

詳細には、１Ｍ ＤＴＴ ６μｌをＨｅｌ３０８Ｍｂｕ（Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃ）（
変異Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃを有する配列番号１０、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ
８．０、４２１ｍＭ ＮａＣｌ、１０％グリセロール、１０ｍＭ ＤＴＴ中に保存）６０
０μＬに加え、混合物を室温、２０ｒｐｍで回転している１０”ホイールで３０分間イン
キュベートした。この混合物をＰｉｅｒｃｅ ２ｍＬ Ｚｅｂａ脱塩カラム７ｋ ＭＷＣ
Ｏを通して、１００ｍＭリン酸カリウム、５００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、０
．１％Ｔｗｅｅｎ−２０ ｐＨ８．０に緩衝液交換し、試料５５０μＬを得た。これにビ
スマレイミドＰＥＧ３（ＱｕａｎｔａＢｉｏｄｅｓｉｇｎ、製品番号＝１０２１５）５．
５μＬを加え、混合物を室温、２０ｒｐｍで回転している１０”ホイールで１２０分間イ
ンキュベートした。反応を止めるために、残っているマレイミドを消光するための１Ｍ
ＤＴＴ ５．５μＬを添加した。反応の分析は、７．５％ポリアクリルアミドゲルによっ
てまたは逆相ＨＰＬＣ（Ｊｕｐｉｔｅｒ Ｃ５ ３００Ａ ５μｍ １５０ｘ４．６ｍｍ
カラムでのクロマトグラフ、０．１％ ＴＦＡ中のアセトニトリルグラジエントを使用）
によってであった。図１は、Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃ）−ビスマレ
イミドＰＥＧ３（ビスマレイミドＰＥＧ３リンカーによって繋がれ、変異Ｅ２８４Ｃ／Ｓ
６１５Ｃを有する配列番号１０）反応混合物のクーマシー染色７．５％ Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌゲル（Ｌａｅｍｍｌｉローディング緩衝液で添加された）を示す。レーンＸは、適切な
タンパク質ラダー（質量単位マーカーはゲルの左に示されている）を示す。レーンａ〜ｃ
は、２μＬ、５μＬまたは１０μＬの約２．５μＭ Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（Ｅ２８４Ｃ／
Ｓ６１５Ｃ）単量体（Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃを有する配列番号１０）を含有する。レー
ンｄ〜ｆは２μＬ、５μＬまたは１０μＬの約２．５μＭ Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（Ｅ２８
４Ｃ／Ｓ６１５Ｃ）−ビスマレイミドＰＥＧ３（ビスマレイミドＰＥＧ３リンカーによっ
て繋がれ、変異Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃを有する配列番号１０）を含有し、ビスマレイミ
ドＰＥＧ３リンカーに付着させる反応がほとんど１００％収率に進んだことはゲルから明
らかであった。Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃ）−ビスマレイミドＰＥＧ
３（ビスマレイミドＰＥＧ３リンカーによって繋がれ、変異Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃを有
する配列番号１０）を次いで５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＤＴ
Ｔ、１０％グリセロールｐＨ８．０に緩衝液交換した。

本実施例は、Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃ）−ｍａｌ−ｐｅｐ−ｍａ
ｌ（ビスマレイミドペプチドリンカー（マレイミド−プロピル−ＳＲＤＦＷＲＳ−（１，
２−ジアミノエタン）−プロピル−マレイミドによって繋がれ、変異Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１
５Ｃを有する配列番号１０、配列番号１０９はペプチド配列ＳＲＤＦＷＲＳに対応する）
）を合成する方法を記載する。この場合Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（配列番号１０）の一次配列
中の位置２８４および６１５のシステイン間に共有結合を、これらの位置をビスマレイミ
ドペプチドリンカー（マレイミド−プロピル−ＳＲＤＦＷＲＳ−（１，２−ジアミノエタ
ン）−プロピル−マレイミド、配列番号１０９はペプチド配列ＳＲＤＦＷＲＳに対応する
）と反応させることによって作製した。

詳細には、１Ｍ ＤＴＴ ２μＬをＨｅｌ３０８Ｍｂｕ（Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃ）（
変異Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃを有する配列番号１０、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ
８．０、４２１ｍＭ ＮａＣｌ、１０％グリセロール、１０ｍＭ ＤＴＴ中に保存）２０
０μＬに加え、混合物を室温、２０ｒｐｍで回転している１０”ホイールで３０分間イン
キュベートした。混合物をＰｉｅｒｃｅ ２ｍＬ Ｚｅｂａ脱塩カラム７ｋ ＭＷＣＯを
通して、１００ｍＭリン酸カリウム、５００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１
％Ｔｗｅｅｎ−２０ ｐＨ８．０に緩衝液交換し、試料５４０μＬを得た。１００ｕｌの
一定分量に、１０ｍＭマレイミド−プロピル−ＳＲＤＦＷＲＳ−（１，２−ジアミノエタ
ン）−プロピル−マレイミド（ＰＰＲＬ、製品番号＝１６４５０）０．５ｕｌを添加し、
混合物を室温、２０ｒｐｍで回転している１０”ホールで１２０分間インキュベートした
。反応を止めるために、残っているマレイミドを消光するための１Ｍ ＤＴＴ １ｕＬを
添加した。反応の分析は７．５％ ポリアクリルアミドゲルによってまたは逆相ＨＰＬＣ
（Ｊｕｐｉｔｅｒ Ｃ５ ３００Ａ ５μｍ １５０ｘ４．６ｍｍカラムでのクロマトグ
ラフ、０．１％ＴＦＡ中のアセトニトリルグラジエントを使用）によってである。図２は
、Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃ）−ｍａｌ−ｐｅｐ−ｍａｌ（ビスマレ
イミドペプチドリンカー（マレイミド−プロピル−ＳＲＤＦＷＲＳ−（１，２−ジアミノ
エタン）−プロピル−マレイミド）によって繋がれ、変異Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃを有す
る配列番号１０）反応混合物のクーマシー染色７．５％ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌゲルを示す。
レーンＸは適切なタンパク質ラダー（質量単位マーカーはゲルの左に示されている）を示
す。レーンＡは５μＬの約１０μＭ Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃ）−
ビスマレイミドＰＥＧ３（ビスマレイミドＰＥＧ３リンカーによって繋がれ、変異Ｅ２８
４Ｃ／Ｓ６１５Ｃを有する配列番号１０）を基準として含有する。上のバンドはＨｅｌ３
０８Ｍｂｕ（Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃ）−ビスマレイミドＰＥＧ３に対応し、下のバンド
はＨｅｌ３０８Ｍｂｕ（Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃ）（変異Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃを有す
る配列番号１０）に対応する。レーンＢは５μＬの約１０μＭ Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（Ｅ
２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃ）−ｍａｌ−ｐｅｐ−ｍａｌ（ビスマレイミドペプチドリンカー（
マレイミド−プロピル−ＳＲＤＦＷＲＳ−（１，２−ジアミノエタン）−プロピル−マレ
イミド）によって繋がれ、変異Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃを有する配列番号１０）を含有し
、Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃ）−ｍａｌ−ｐｅｐ−ｍａｌ（ビスマレ
イミドペプチドリンカー（マレイミド−プロピル−ＳＲＤＦＷＲＳ−（１，２−ジアミノ
エタン）−プロピル−マレイミド）によって繋がれ、変異Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃを有す
る配列番号１０）（上のバンド）およびＨｅｌ３０８Ｍｂｕ（Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃ）
（変異Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃを有する配列番号１０）（下のバンド）に対するバンドが
観察されることから、ｍａｌ−ｐｅｐ−ｍａｌリンカーに付着する反応が完了まで進まな
かったことはゲルから明らかであった。レーンＣはＨｅｌ３０８Ｍｂｕ（Ｅ２８４Ｃ／Ｓ
６１５Ｃ）（変異Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃを有する配列番号１０）を含有する。

Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃ）−ｍａｌ−ｐｅｐ−ｍａｌ（ビスマレ
イミドペプチドリンカー（マレイミド−プロピル−ＳＲＤＦＷＲＳ−（１，２−ジアミノ
エタン）−プロピル−マレイミドによって繋がれ、変異Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃを有する
配列番号１０、配列番号１０９はペプチド配列ＳＲＤＦＷＲＳに対応する））を次いで５
０ｍＭ Ｔｒｉｓ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＤＴＴ、１０％グリセロールｐＨ８
．０に緩衝液交換した。

本実施例は、その開口部が閉じている２つのＨｅｌ３０８Ｍｂｕヘリカーゼ（Ｈｅｌ３
０８Ｍｂｕ（Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃ）−ビスマレイミドＰＥＧ１１（ビスマレイミドＰ
ＥＧ１１によって繋がれ、変異Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃを有する配列番号１０）およびＨ
ｅｌ３０８Ｍｂｕ（Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃ）−ビスマレイミドＰＥＧ３）（ビスマレイ
ミドＰＥＧ３リンカーによって繋がれ、変異Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃを有する配列番号１
０）の酵素前進性をＨｅｌ３０８Ｍｂｕ単量体（配列番号１０）のものと蛍光に基づくア
ッセイを使用して比較する。

材料および方法
配列番号１１０から１１４。配列番号１１２は５’末端にカルボキシフルオレセインを
、および３’末端にブラックホールクエンチャーを有する。

通例の蛍光基質をハイブリダイズされたｄｓＤＮＡを置換するヘリカーゼの能力をアッ
セイするために用いた（図３）。蛍光基質（最終５０ｎＭ）は、３’ｓｓＤＮＡオーバー
ハングならびにハイブリダイズされたｄｓＤＮＡの８０および３３塩基対セクション（図
３セクションＡ、配列番号１１０）を有する。主要な下部「テンプレート」鎖は、８０ｎ
ｔ「ブロッカー」鎖（配列番号１１１）にハイブリダイズされ、その３’オーバーハング
および３３ｎｔ蛍光プローブに隣接し、その５’および３’末端をカルボキシフルオレセ
イン（ＦＡＭ）およびブラックホールクエンチャー（ＢＨＱ−１）塩基でそれぞれ標識さ
れる（配列番号１１２）。ハイブリダイズされると、ＦＡＭはＢＨＱ−１から離れ、基質
は基本的に蛍光性である。ＡＴＰ（１ｍＭ）およびＭｇＣｌ_２（１０ｍＭ）の存在下でヘ
リカーゼ（１０ｎＭ）は、図３セクションＢに示すとおり基質の３’オーバーハング（配
列番号１１０）に結合し、下部鎖に沿って移動し、８０ｎｔブロッカー鎖（配列番号１１
１）を置換し始める。前進性である場合、ヘリカーゼは、蛍光プローブ（その５’末端を
カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）でおよびその３’末端をブラックホールクエンチャ
ー（ＢＨＱ−１）で標識された配列番号１１２）も置換する（図３セクションＣ）。蛍光
プローブは、その５’および３’末端が自己相補的であり、それにより一度置換されると
動力学的に安定なヘアピンを形成し、プローブのテンプレート鎖への再アニーリングを防
ぐように設計される（図３セクションＤ）。ヘアピン産物の形成ではＦＡＭはＢＨＱ−１
の近傍に運ばれ、その蛍光は消光される。８０塩基長「ブロッカー」（配列番号１１１）
および蛍光（その５’末端をカルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）でおよびその３’末端
をブラックホールクエンチャー（ＢＨＱ−１）で標識された配列番号１１２）鎖を置換で
きる前進性酵素は、したがって経時的な蛍光における減少をもたらす。しかし酵素が８０
ｎｔ未満の前進性を有する場合は、蛍光鎖（その５’末端をカルボキシフルオレセイン（
ＦＡＭ）でおよびその３’末端をブラックホールクエンチャー（ＢＨＱ−１）で標識され
た配列番号１１２）を置換することができず、それにより「ブロッカー」鎖（配列番号１
１１）は主要な下部鎖（図３セクションＥ、配列番号１１０）に再アニールする。

追加的な通例の蛍光基質を対照目的のためにも使用した。陰性対照として使用した基質
は、図３に記載のものと同一であったが、３’オーバーハング（図４セクションＡ（配列
番号１１１、１１２（その５’末端をカルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）で、その３’
末端をブラックホールクエンチャー（ＢＨＱ−１）で標識された）ならびに１１３））を
欠失している。図３に記載のものと同様だが８０塩基対セクションを欠失している基質を
活性だが前進性である必要はないヘリカーゼ（図４セクションＢ、（配列番号１１２（そ
の５’末端をカルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）で、その３’末端をブラックホールク
エンチャー（ＢＨＱ−１）で標識された）および１１４））の陽性対照として使用した。

図５は、緩衝溶液（４００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ８．０、１ｍ
Ｍ ＡＴＰ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、５０ｎＭ蛍光基質ＤＮＡ（配列番号１１０、１１１
および１１２（その５’末端をカルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）でおよびその３’末
端をブラックホールクエンチャー（ＢＨＱ−１）で標識された）中での図３に示す前進性
基質に対するＨｅｌ３０８Ｍｂｕ単量体（配列番号１０）、Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（Ｅ２８
４Ｃ／Ｓ６１５Ｃ）−ビスマレイミドＰＥＧ１１（ビスマレイミドＰＥＧ１１リンカーに
よって繋がれ、変異Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃを有する配列番号１０）およびＨｅｌ３０８
Ｍｂｕ（Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃ）−ビスマレイミドＰＥＧ３（ビスマレイミドＰＥＧ３
リンカーによって繋がれ、変異Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃを有する配列番号１０）の試験で
の時間依存性蛍光変化のグラフを示す。Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃ）
−ビスマレイミドＰＥＧ１１（ビスマレイミドＰＥＧ１１リンカーによって繋がれ、変異
Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃを有する配列番号１０）およびＨｅｌ３０８Ｍｂｕ（Ｅ２８４Ｃ
／Ｓ６１５Ｃ）−ビスマレイミドＰＥＧ３（ビスマレイミドＰＥＧ３リンカーによって繋
がれ、変異Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃを有する配列番号１０）によって示された蛍光の減少
は、Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ単量体（配列番号１０）と比較したこれらの複合体の前進性の増
大を示す。図６は、全ての試料に関して蛍光が減少したことから全てのヘリカーゼが実際
に活性であったことを実証する陽性対照を示す。

本実施例は、ナノポアを通るインタクトなＤＮＡ鎖（９００塩基長）の移動を制御する
Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ単量体（配列番号１０）の能力をＨｅｌ３０８Ｍｂｕ（Ｅ２８４Ｃ／
Ｓ６１５Ｃ）−ビスマレイミドＰＥＧ３（ビスマレイミドＰＥＧ３リンカーによって繋が
れ、次の変異Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃを有する配列番号１０）のものと比較する。図７に
場と反対および図８に場に沿ったＤＮＡ移行の制御のための一般的方法を示す。

材料および方法
５０−ポリＴ５’リーダーをＰｈｉＸ ｄｓＤＮＡの約９００塩基断片にライゲーショ
ンすることによって、ＤＮＡを形成した。リーダーは、ＤＮＡが二重層に挿入されるよう
にするために配列番号１１７（配列の３’末端に２個のチミン残基に付着している６個の
ｉＳｐ１８スペーサーおよび３’コレステロールＴＥＧを有する）がハイブリダイズされ
た相補性セクションも含有する。最後にＡＣＧＴの４ｎｔ ３’−オーバーハングを得る
ためにＰｈｉＸ ｄｓＤＮＡの３’末端をＡａｔＩＩ消化酵素で消化した（ＤＮＡ基質設
計の図に関して図９を参照されたい）。
Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕについて使用した緩衝溶液：４００ｍＭ ＮａＣｌ、１００ｍＭ Ｈ
ｅｐｅｓ、１０ｍＭ フェロシアン化カリウム、１０ｍＭフェリシアン化カリウムｐＨ８
．０、１ｍＭ ＡＴＰ、１ｍＭ ＭｇＣｌ_２，
Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃ）−ビスマレイミドＰＥＧ３について使用
した緩衝溶液： ４００ｍＭ ＮａＣｌ、１００ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、１０ｍＭフェロシア
ン化カリウム、１０ｍＭフェリシアン化カリウムｐＨ８．０、２ｍＭ ＡＴＰ、２ｍＭ
ＭｇＣｌ_２，
ナノポア：大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＳ（Ｂ１−Ｇ７５Ｓ／Ｇ７７Ｓ／Ｌ８８Ｎ／Ｑ１２
６Ｒ）８ＭｓｐＡ（変異Ｇ７５Ｓ／Ｇ７７Ｓ／Ｌ８８Ｎ／Ｑ１２６Ｒを有する配列番号２
）
酵素：Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（配列番号１０）は最終２００ｎＭで加え、Ｈｅｌ３０８Ｍｂ
ｕ（Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃ）−ビスマレイミドＰＥＧ３（ビスマレイミド３ＰＥＧリン
カーによって繋がれ、変異Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃを有する配列番号１０）は最終１０ｎ
Ｍで添加した。

１，２−ジフィタノイル−グリセロ−３−ホスホコリン脂質（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａ
ｒ Ｌｉｐｉｄｓ）二重層に挿入された単一のＭｓｐＡナノポアから電気計測値を得た。
二重層は、モンタル−ミューラー技術によって開口部直径約１００ｕｍ、厚さ２０ｕｍの
ＰＴＦＥフィルム（Ｄｅｌｒｉｎ ｃｈａｍｂｅｒｓ注文生産）で形成され、２個の１ｍ
Ｌ緩衝溶液に分けた。全ての実験は、上記の緩衝溶液中で実行した。単一チャネル電流を
１４４０Ａデジタイザーを備えたＡｘｏｐａｔｃｈ ２００Ｂ ａｍｐｌｉｆｉｅｒｓ（
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）で測定した。白金電極を緩衝溶液に繋ぎ、ｃｉｓ
コンパートメント（ナノポアおよび酵素／ＤＮＡの両方が添加されている）をＡｘｏｐａ
ｔｃｈ ｈｅａｄｓｔａｇｅのアースに繋ぎ、ｔｒａｎｓコンパートメントをｈｅａｄｓ
ｔａｇｅの探査電極に繋ぐ。

二重層中に単一ポアを達成後、ＤＮＡ複合体（配列番号１１５、１１６および１１７（
配列の３’末端に２個のチミン残基に付着している６個のｉＳｐ１８スペーサーおよび３
’コレステロールＴＥＧを有する））、ＤＮＡ＝Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ単量体（配列番号１
０）について０．１ｎＭおよびＨｅｌ３０８Ｍｂｕ（Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃ）−ビスマ
レイミドＰＥＧ３（ビスマレイミドＰＥＧ３リンカーによって繋がれ、変異Ｅ２８４Ｃ／
Ｓ６１５Ｃを有する配列番号１０）について０．０５ｎＭ、ＭｇＣｌ_２（２ｍＭ）ならび
にＡＴＰ（２ｍＭ）を電気生理化学チャンバーのｃｉｓコンパートメントに添加した。対
照実験を＋１４０ｍＶで行った。次いでヘリカーゼＨｅｌ３０８Ｍｂｕ単量体（配列番号
１０、２００ｎＭ）またはＨｅｌ３０８Ｍｂｕ（Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃ）−ビスマレイ
ミドＰＥＧ３（ビスマレイミドＰＥＧ３リンカーによって繋がれ、変異Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６
１５Ｃを有する配列番号１０、１０ｎＭ）をｃｉｓコンパートメントに添加した。実験は
、＋１４０ｍＶの一定電位で実行した。

結果および考察
図１０に示すとおり、ヘリカーゼ−単量体ＤＮＡ基質のＭｓｐＡナノポア（図７に示す
）への添加は、特徴的電流遮断を生じる。ヘリカーゼＨｅｌ３０８Ｍｂｕ単量体（配列番
号１０）は制御された様式でナノポアを通してＤＮＡを移動させることができ、ＤＮＡが
ナノポアを通って移動するときに電流に段階的変化を生じさせる。Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（
２００ｎＭ、配列番号１０）を使用して、ヘリカーゼがＭｓｐＡナノポア（ＭＳ（Ｂ１−
Ｇ７５Ｓ／Ｇ７７Ｓ／Ｌ８８Ｎ／Ｑ１２６Ｒ）８ＭｓｐＡ（変異Ｇ７５Ｓ／Ｇ７７Ｓ／Ｌ
８８Ｎ／Ｑ１２６Ｒを有する配列番号２）を通してＤＮＡの移行を制御するときに観察さ
れた電流トレース例（＋１４０ｍＶ、４００ｍＭ ＮａＣｌ、１００ｍＭ Ｈｅｐｅｓ
ｐＨ８．０、１０ｍＭフェロシアン化カリウム、１０ｍＭフェリシアン化カリウム、０．
１ｎＭ ９００塩基長ＤＮＡ（配列番号１１５、１１６および１１７（配列の３’末端に
２個のチミン残基に付着している６個のｉＳｐ１８スペーサーおよび３’コレステロール
ＴＥＧを有する））、１ｍＭ ＡＴＰ、１ｍＭ ＭｇＣｌ_２）を図１０に示す。最も上の
電気トレースは、ＤＮＡが印加された電位（＋１４０ｍＶ）の力の下で捕捉された場合に
オープンポア電流（約１２０ｐＡ）がＤＮＡレベル（２０〜５０ｐＡ）へ低下することを
示す。酵素が付着しているＤＮＡは、酵素がＤＮＡをポアを通して移動させるときに電流
における段階的変化を示す長期遮断を生じる。上のトレースは、Ａ〜Ｈと印を付けた一連
の８個の別々のヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動を示す（図１０を参照されたい）。トレースの
このセクションにおける全てのヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動は、酵素によって場とは反対に
（ＤＮＡは５’を下に捕捉される）ナノポアを通って移動される（詳細は図７を参照され
たい）。下は、ＤＮＡがナノポアを出たときの４個のヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動の最後の
セクションの拡大である。このセクションにおける８個のヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動の内
、１つ（Ｈ）だけが酵素がＤＮＡの末端に達し、ＤＮＡ基質の５０Ｔ５’−リーダーをポ
アを通して移動させることを示す特徴的な長いポリＴレベルで終わる。Ｈｅｌ３０８Ｍｂ
ｕ単量体（配列番号１０）での完全な実行において、ヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動の約３０
％がポリＴで終わることが見出された（ｎ＝１９ 本実験におけるヘリカーゼ制御ＤＮＡ
移動）。

Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃ）−ビスマレイミドＰＥＧ３（１０ｎＭ
、ビスマレイミドＰＥＧ３リンカーによって繋がれ、変異Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃを有す
る配列番号１０）は、場とは反対に制御された様式でナノポアを通してＤＮＡを移動させ
ることができ、ＤＮＡがナノポアを通って移動するときに電流に段階的変化を生じさせる
。Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃ）−ビスマレイミドＰＥＧ３リンカー（
１０ｎＭ、ビスマレイミドＰＥＧ３リンカーによって繋がれ、変異Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５
Ｃを有する配列番号１０）を使用して、ヘリカーゼがＭｓｐＡナノポア（ＭＳ（Ｂ１−Ｇ
７５Ｓ／Ｇ７７Ｓ／Ｌ８８Ｎ／Ｑ１２６Ｒ）８ＭｓｐＡ（変異Ｇ７５Ｓ／Ｇ７７Ｓ／Ｌ８
８Ｎ／Ｑ１２６Ｒを有する配列番号２）を通してＤＮＡの移行を制御するときに観察され
た電流トレース例（＋１４０ｍＶ、４００ｍＭ ＮａＣｌ、１００ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐ
Ｈ８．０、１０ｍＭフェロシアン化カリウム、１０ｍＭフェリシアン化カリウム、０．０
５ｎＭ ９００塩基長ＤＮＡ（配列番号１１５、１１６および１１７（配列の３’末端に
２個のチミン残基に付着している６個のｉＳｐ１８スペーサーおよび３’コレステロール
ＴＥＧを有する））、２ｍＭ ＡＴＰ、２ｍＭ ＭｇＣｌ_２）を図１１に示す。最も上の
電気トレースは、ＤＮＡが印加された電位（＋１４０ｍＶ）の力の下で捕捉された場合に
オープンポア電流（約１１５ｐＡ）がＤＮＡレベル（１５〜４０ｐＡ）へ低下することを
示す。酵素が付着しているＤＮＡは、酵素がＤＮＡをポアを通して移動させるときに電流
における段階的変化を示す長期遮断を生じる。上のトレースは、Ａ〜Ｈと印を付けた一連
の８個の別々のヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動を示す（図１１を参照されたい）。トレースの
このセクションにおける全てのヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動は、酵素によって場とは反対に
（ＤＮＡは５’を下に捕捉される）ナノポアを通って移動される（詳細は図７を参照され
たい）。下は、ＤＮＡがナノポアを出たときの４個のヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動の最後の
セクションの拡大である。このセクションにおける８個のヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動のど
れもが酵素がＤＮＡの末端に達し、ＤＮＡ基質の５０Ｔ５’−リーダーをポアを通して移
動させたことを示す特徴的な長いポリＴレベルで終わる。Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（Ｅ２８４
Ｃ／Ｓ６１５Ｃ）−ビスマレイミドＰＥＧ３（ビスマレイミドＰＥＧ３リンカーによって
繋がれ、変異Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃを有する配列番号１０）での完全な実行において、
場と反対（５’が下）のヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動の約８５％がポリＴで完了することが
見出され（ｎ＝２７ 本実験におけるヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動）、それにより未修飾Ｈ
ｅｌ３０８Ｍｂｕと比較して前進性の実質的な改善を実証している。この実験は、ヘリカ
ーゼ制御ＤＮＡ移動を観察するために酵素１０ｎＭだけを必要とする、しかしＨｅｌ３０
８Ｍｂｕ単量体（配列番号１０）実験は２００ｎＭ酵素を使用した。したがって、開口部
が閉じられているヘリカーゼのより低い酵素濃度が長い読み取り長を達成しながら使用で
きる。

Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃ）−ビスマレイミドＰＥＧ３（ビスマレ
イミドＰＥＧ３リンカーによって繋がれ、変異Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃを有する配列番号
１０）は印加された場の力に沿ってナノポアを通してＤＮＡを移動させることができる増
強された能力を示し（詳細は図８を参照されたい）、ＤＮＡがナノポアを通って移動する
ときに電流に段階的変化を生じさせる。Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃ）
−ビスマレイミドＰＥＧ３（１０ｎＭ、ビスマレイミドＰＥＧ３リンカーによって繋がれ
、変異Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃを有する配列番号１０）を使用して、ヘリカーゼがＭｓｐ
Ａナノポア（ＭＳ（Ｂ１−Ｇ７５Ｓ／Ｇ７７Ｓ／Ｌ８８Ｎ／Ｑ１２６Ｒ）８ＭｓｐＡ（変
異Ｇ７５Ｓ／Ｇ７７Ｓ／Ｌ８８Ｎ／Ｑ１２６Ｒを有する配列番号２）を通してＤＮＡの移
行を制御するときに観察された電流トレース例（＋１４０ｍＶ、４００ｍＭ ＮａＣｌ、
１００ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ８．０、１０ｍＭフェロシアン化カリウム、１０ｍＭフェ
リシアン化カリウム、０．０５ｎＭ ９００塩基長ＤＮＡ（配列番号１１５、１１６およ
び１１７（配列の３’末端に２個のチミン残基に付着している６個のｉＳｐ１８スペーサ
ーおよび３’コレステロールＴＥＧを有する））、２ｍＭ ＡＴＰ、２ｍＭ ＭｇＣｌ_２
）を図１２に示す。最も上の電気トレースは、ＤＮＡが印加された電位（＋１４０ｍＶ）
の力の下で捕捉された場合にオープンポア電流（約１２０ｐＡ）がＤＮＡレベル（１５〜
４０ｐＡ）へ低下することを示す。酵素が付着しているＤＮＡは、酵素がＤＮＡをポアを
通して移動させるときに電流における段階的変化を示す長期遮断を生じる。上のトレース
は、Ａ−Ｄと印を付けた一連の４個の別々のヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動を示す（図１２を
参照されたい）。トレースのこのセクションにおける全てのヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動は
、酵素によって場に沿って（ＤＮＡは３’を下に捕捉される）ナノポアを通って移動され
る（詳細は図８を参照されたい）。下は、ＤＮＡがナノポアを出たときのヘリカーゼ制御
ＤＮＡ移動の最後のセクションの拡大である。３’が下のＤＮＡは、配列に関連して異な
る電流および異なる変動を有して５’が下のＤＮＡとは特徴的に異なるサインを示す。こ
のセクションにおける４個のヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動のどれもが酵素がＤＮＡの末端に
達し、ＤＮＡ基質の５０Ｔ５’−リーダーをポアを通して移動させることを示す特徴的な
長いポリＴレベルで終わる。Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃ）−ビスマレ
イミドＰＥＧ３（ビスマレイミドＰＥＧ３リンカーによって繋がれ、変異Ｅ２８４Ｃ／Ｓ
６１５Ｃを有する配列番号１０）での完全な実行において、場に沿った（３’が下）ヘリ
カーゼ制御ＤＮＡ移動の約８７％がポリＴで完了することが見出された（ｎ＝１５ 本実
験におけるヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動）。比較して、３’が下のヘリカーゼ制御ＤＮＡ移
動は、Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ単量体（配列番号１０）を使用する場合にはほとんど観察され
ず、その場合移動は典型的には５０未満の状態が観察されて短く、この方向での高いレベ
ルでの酵素解離を示唆している。Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃ）−ビス
マレイミドＰＥＧ３（ビスマレイミドＰＥＧ３リンカーによって繋がれ、変異Ｅ２８４Ｃ
／Ｓ６１５Ｃを有する配列番号１０）での３’が下の長いリカーゼ制御ＤＮＡ移動は、３
’が下のモードでの前進性における驚くべき改善を示す。

本実施例は、Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃ）−ｍａｌ−ｐｅｐ−ｍａ
ｌ（ビスマレイミドペプチドリンカー（マレイミド−プロピル−ＳＲＤＦＷＲＳ（配列番
号１０９）−（１，２−ジアミノエタン）−プロピル−マレイミド）によって繋がれ、変
異Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃを有する配列番号１０）がナノポアを通るインタクトなＤＮＡ
鎖（その３’末端で４個のｉＳｐＣ３スペーサーに付着している配列番号１２７、その最
後は配列番号１２８の５’末端に付着している）の移動を制御する能力を有することを示
す。図７に場と反対におよび図８に場に沿った制御されたＤＮＡ移行のための一般的方法
を示す。

材料および方法
実験を設定する前に、ＤＮＡ（０．５ｎＭ、（その３’末端で４個のｉＳｐＣ３スペー
サーに付着している配列番号１２７、その最後は配列番号１２８の５’末端に付着してい
る）およびＨｅｌ３０８Ｍｂｕ（Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃ）−ｍａｌ−ｐｅｐ−ｍａｌ（
ビスマレイミドペプチドリンカー（マレイミド−プロピル−ＳＲＤＦＷＲＳ（配列番号１
０９）−（１，２−ジアミノエタン）−プロピル−マレイミド）によって繋がれ、変異Ｅ
２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃを有する配列番号１０）を合わせて１時間、予備インキュベートし
た。

緩衝液（６２５ｍＭ ＫＣｌ、１００ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、７５ｍＭフェロシアン化カリ
ウム（ＩＩ）、２５ｍＭフェリシアン化カリウム（ＩＩＩ）、ｐＨ８）中のブロック共重
合体に挿入された単一ＭｓｐＡナノポア（ＭＳ（Ｂ１−Ｇ７５Ｓ／Ｇ７７Ｓ／Ｌ８８Ｎ／
Ｑ１２６Ｒ）８ＭｓｐＡ（変異Ｇ７５Ｓ／Ｇ７７Ｓ／Ｌ８８Ｎ／Ｑ１２６Ｒを有する配列
番号２）から電気測定値を得た。ＭｇＣｌ_２（１０ｍＭ）およびＡＴＰ（１ｍＭ）を緩衝
液（６２５ｍＭ ＫＣｌ、１００ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、７５ｍＭフェロシアン化カリウム（
ＩＩ）、２５ｍＭフェリシアン化カリウム（ＩＩＩ）、ｐＨ８）と一緒に混合し、次いで
ＤＮＡ（その３’末端で４個のｉＳｐＣ３スペーサーに付着している配列番号１２７、そ
の最後は配列番号１２８の５’末端に付着している）、Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（Ｅ２８４Ｃ
／Ｓ６１５Ｃ）−ｍａｌ−ｐｅｐ−ｍａｌ（ビスマレイミドペプチドリンカー（マレイミ
ド−プロピル−ＳＲＤＦＷＲＳ（配列番号１０９）−（１，２−ジアミノエタン）−プロ
ピル−マレイミド）によって繋がれ、変異Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃを有する配列番号１０
）予備混合物と合わせて混合した。二重層中に単一ポアを達成した後、予備混合物を単一
ナノポア実験系に添加した。実験は、＋１２０ｍＶの一定電位で実行し、ヘリカーゼ制御
ＤＮＡ移動をモニターした。

結果および考察
ヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動を閉じた複合体Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５
Ｃ）−ｍａｌ−ｐｅｐ−ｍａｌ（ビスマレイミドペプチドリンカー（マレイミド−プロピ
ル−ＳＲＤＦＷＲＳ（配列番号１０９）−（１，２−ジアミノエタン）−プロピル−マレ
イミド）によって繋がれ、変異Ｅ２８４Ｃ／Ｓ６１５Ｃを有する配列番号１０）について
観察した。ヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動の一例を図１３に示す。

本実施例は、ＴｒｗＣ Ｃｂａ−Ｎ６９１Ｃ／Ｑ３４６Ｃ−ＰＥＧ１１（ＰＥＧ１１リ
ンカーによって繋がれ、変異Ｎ６９１Ｃ／Ｑ３４６Ｃを有する配列番号１２６）を合成す
る方法を記載する。この場合ＴｒｗＣ Ｃｂａ（配列番号１２６）の一次配列中の位置３
４６および６９１のシステイン間に共有結合を、これらの位置をＰＥＧ１１リンカーと反
応させることによって作製した。

材料および方法
詳細には、ＤＴＴ（２μｌ、１Ｍ）をＴｒｗＣ Ｃｂａ−Ｎ６９１Ｃ／Ｑ３４６Ｃ（２
００μｌ、変異Ｎ６９１Ｃ／Ｑ３４６Ｃを有する配列番号１２６、５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ
、１０％グリセロール、１０ｍＭ ＤＴＴ、６９２ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．５中に保存
）に添加し、混合物を室温、２０ｒｐｍで回転している１０”ホールで３０分間インキュ
ベートした。この混合物をＰｉｅｒｃｅ ２ｍＬ Ｚｅｂａ脱塩カラム７ｋ ＭＷＣＯを
通して、１００ｍＭリン酸カリウム、５００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１
％Ｔｗｅｅｎ−２０ ｐＨ８．０に緩衝液交換し、同じ緩衝液に希釈し、１０μＬ一定分
量の試料を得た。マレイミド−ＰＥＧ１１−マレイミド（５０ｕＭ最終濃度、Ｑｕａｎｔ
ａ Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ、製品番号１０３９７）を一定分量の１つに添加し、混合物を室
温、２０ｒｐｍで回転している１０”ホールで１２０分間インキュベートした。反応を止
めるために、残っているマレイミドを消光するためのＤＴＴ（１Ｍを１ｕｌ）を添加した
。反応の分析は７．５％ポリアクリルアミドゲルによってである。図１４は、ＴｒｗＣ
Ｃｂａ−Ｎ６９１Ｃ／Ｑ３４６Ｃ−ｍａｌ−ＰＥＧ１１−ｍａｌ（ビスマレイミドポリエ
チレングリコールリンカーによって繋がれ、変異Ｎ６９１Ｃ／Ｑ３４６Ｃを有する配列番
号１２６）反応混合物の７．５％Ｔｒｉｓ−ＨＣｌゲルのクーマシー染色を示す。ゲルの
右側のレーン（Ｍと標識）は適切なタンパク質ラダー（質量単位マーカーはゲルの右に示
されている）を示す。レーン１は、およそ１０μＭ ＴｒｗＣ Ｃｂａ−Ｄ６５７Ｃ／Ｒ
３３９Ｃ単独（変異Ｄ６５７Ｃ／Ｒ３３９Ｃを有する配列番号１２６）の５μＬを基準と
して含有する。レーン２は、およそ１０μＭ ＴｒｗＣ Ｃｂａ−Ｎ６９１Ｃ／Ｑ３４６
Ｃ−ビスマレイミドＰＥＧ１１（ビスマレイミドＰＥＧ１１リンカーによって繋がれ、変
異Ｎ６９１Ｃ／Ｑ３４６Ｃを有する配列番号１２６）の５μＬを含有する。レーン２に示
すとおり、上のバンドは二量体酵素分子種（Ａと標識）に対応する、中央のバンドは閉じ
た複合体（Ｂと標識）ＴｒａＩ−Ｃｂａ−Ｎ６９１Ｃ／Ｑ３４６Ｃ−ビスマレイミドＰＥ
Ｇ１１（ビスマレイミドＰＥＧ１１リンカーによって繋がれ、変異Ｎ６９１Ｃ／Ｑ３４６
Ｃを有する配列番号１２６）に対応する。未修飾出発材料（Ｃと標識）ＴｒｗＣ Ｃｂａ
−Ｎ６９１Ｃ／Ｑ３４６Ｃ（変異Ｎ６９１Ｃ／Ｑ３４６Ｃを有する配列番号１２６）に対
するバンドが観察されたことから、ｍａｌ−ＰＥＧ１１−ｍａｌリンカーに付着する反応
が完了まで進まなかったことはゲルから明らかであった。

ＴｒｗＣ Ｃｂａ−Ｎ６９１Ｃ／Ｑ３４６Ｃ−ＰＥＧ１１（ＰＥＧ１１リンカーによっ
て繋がれ、変異Ｎ６９１Ｃ／Ｑ３４６Ｃを有する配列番号１２６）を次いで５０ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＤＴＴ、ｐＨ８．０に緩衝液交換した。

本実施例において記載したものと類似の手順を使用して、下の表１０に列挙する次の閉
じた複合体を作製できる。

本実施例は多数のヘリカーゼ（Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（配列番号１０）、Ｈｅｌ３０８Ｍ
ｂｕ−Ｅ２８４Ｃ（変異Ｅ２８４Ｃを有する配列番号１０）、Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ−Ｅ２
８４Ｃ／Ｃ３０１Ａ（変異Ｅ２８４Ｃ／Ｃ３０１Ａを有する配列番号１０）、Ｈｅｌ３０
８Ｍｂｕ−Ｅ２８５Ｃ（変異Ｅ２８５Ｃを有する配列番号１０）、Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ−
Ｓ２８８Ｃ（変異Ｓ２８８Ｃを有する配列番号１０）およびＨｅｌ３０８Ｍｂｕ−Ｄ２７
４Ｃ（変異Ｄ２７４Ｃを有する配列番号１０）を蛍光アッセイを使用してｄｓＤＮＡ分子
の代謝回転速度（分^−１酵素^−１）について調査した場合に、検査した変異体ヘリカーゼ
（Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ−Ｅ２８４Ｃ（変異Ｅ２８４Ｃを有する配列番号１０）、Ｈｅｌ３
０８Ｍｂｕ−Ｅ２８４Ｃ／Ｃ３０１Ａ（変異Ｅ２８４Ｃ／Ｃ３０１Ａを有する配列番号１
０）、Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ−Ｅ２８５Ｃ（変異Ｅ２８５Ｃを有する配列番号１０）、Ｈｅ
ｌ３０８Ｍｂｕ−Ｓ２８８Ｃ（変異Ｓ２８８Ｃを有する配列番号１０）およびＨｅｌ３０
８Ｍｂｕ−Ｄ２７４Ｃ（変異Ｄ２７４Ｃを有する配列番号１０））がＨｅｌ３０８Ｍｂｕ
（配列番号１０）と比較してｄｓＤＮＡ分子の増大した代謝回転速度（分^−１酵素^−１）
を有することを例示する。

材料および方法
通例の蛍光基質を多数のＨｅｌ３０８Ｍｂｕヘリカーゼ（Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ−Ｅ２８
４Ｃ（変異Ｅ２８４Ｃを有する配列番号１０）、Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ−Ｅ２８４Ｃ／Ｃ３
０１Ａ（変異Ｅ２８４Ｃ／Ｃ３０１Ａを有する配列番号１０）、Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ−Ｅ
２８５Ｃ（変異Ｅ２８５Ｃを有する配列番号１０）、Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ−Ｓ２８８Ｃ（
変異Ｓ２８８Ｃを有する配列番号１０）およびＨｅｌ３０８Ｍｂｕ−Ｄ２７４Ｃ（変異Ｄ
２７４Ｃを有する配列番号１０））のハイブリダイズされたｄｓＤＮＡを置換する能力を
アッセイするために使用した。図１５の１）に示すとおり、蛍光基質鎖（最終５０ｎＭ）
は３’および５’ｓｓＤＮＡオーバーハングの両方、ならびにハイブリダイズされたｄｓ
ＤＮＡの４４塩基セクションを有する。３’ｓｓＤＮＡオーバーハングを含有する上部鎖
は、カルボキシフルオレセイン塩基（カルボキシフルオレセイン（図１５においてｃと標
識）が配列番号１５１中の位置６でチミンに付着している）を５’末端に有し、ハイブリ
ダイズされた相補物は、ブラックホールクエンチャー（ＢＨＱ−１、図１５においてｅと
標識）塩基（ブラックホールクエンチャーは配列番号１５２中の位置８１でチミンに付着
している）を３’末端に有する。２本の鎖がハイブリダイズされると、フルオレセインか
らの蛍光は局在ＢＨＱ−１によって消光され、基質は実質的に非蛍光性である。さらに下
の蛍光基質鎖に部分的に相補的である捕捉鎖（配列番号１５３）１μＭはアッセイに含ま
れる。２）に示すとおりＡＴＰ（１ｍＭ）およびＭｇＣｌ_２（１ｍＭ）の存在下で、基質
に添加された適切なヘリカーゼ（１０ｎＭ）は、蛍光基質の３’尾部に結合し、上部鎖に
沿って移動し、相補鎖を置換する。３）に示すとおりＢＨＱ−１を有する相補鎖が完全に
置換されると主要な鎖上のフルオレセインは蛍光を発する。４）に示すとおり置換された
鎖は過剰量の捕捉鎖に優先的にアニールし、初期基質の再アニールおよび蛍光の消失を防
ぐ。

結果および考察
図１６および１７のグラフは、多数のヘリカーゼ（Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（図１６および
１７で１と標識、配列番号１０）、Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ−Ｅ２８４Ｃ（図１６および１７
で２と標識、変異Ｅ２８４Ｃを有する配列番号１０）、Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ−Ｅ２８４Ｃ
／Ｃ３０１Ａ（図１６で３と標識、変異Ｅ２８４Ｃ／Ｃ３０１Ａを有する配列番号１０）
、Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ−Ｅ２８５Ｃ（図１６で４と標識、変異Ｅ２８５Ｃを有する配列番
号１０）、Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ−Ｓ２８８Ｃ（図１６で５と標識、変異Ｓ２８８Ｃを有す
る配列番号１０）ならびにＨｅｌ３０８Ｍｂｕ−Ｄ２７４Ｃ（図１７で６と標識、変異Ｄ
２７４Ｃを有する配列番号１０））について緩衝液（４００ｍＭ ＫＣｌ、１００ｍＭ
Ｈｅｐｅｓ ｐＨ８．０、１ｍＭ ＡＴＰ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、５０ｎＭ蛍光基質Ｄ
ＮＡ（配列番号１５１および１５２）、１μＭ捕捉ＤＮＡ（配列番号１５３））中でのｄ
ｓＤＮＡ代謝回転（酵素^−１分^−１）を示す。調査した塩濃度（４００ｍＭ ＫＣｌ）で
は、次のヘリカーゼＨｅｌ３０８Ｍｂｕ−Ｅ２８４Ｃ（図１６および１７で２と標識、変
異Ｅ２８４Ｃを有する配列番号１０）、Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ−Ｅ２８４Ｃ／Ｃ３０１Ａ（
図１６で３と標識、変異Ｅ２８４Ｃ／Ｃ３０１Ａを有する配列番号１０）、Ｈｅｌ３０８
Ｍｂｕ−Ｅ２８５Ｃ（図１６で４と標識、変異Ｅ２８５Ｃを有する配列番号１０）、Ｈｅ
ｌ３０８Ｍｂｕ−Ｓ２８８Ｃ（図１６で５と標識、変異Ｓ２８８Ｃを有する配列番号１０
）およびＨｅｌ３０８Ｍｂｕ−Ｄ２７４Ｃ（図１７で６と標識、変異Ｄ２７４Ｃを有する
配列番号１０）は、対照Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（図１６および１７で１と標識、配列番号１
０）よりも高いｄｓＤＮＡ代謝回転速度を示した（図１６および１７を参照されたい）。
これは、調査した条件下でＨｅｌ３０８Ｍｂｕ対照（配列番号１０）と比較した場合にこ
れらの酵素がｄｓＤＮＡ分子の増大した代謝回転速度（分^−１酵素^−１）を示すことを示
唆している。

本実施例は、Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ−Ｅ２８４Ｆａｚ（変異Ｅ２８４Ｆａｚを有する配列
番号１０）およびＨｅｌ３０８Ｍｂｕ−Ｓ２８８Ｆａｚ（変異Ｓ２８８Ｆａｚを有する配
列番号１０）の光処置のための２つの手順を記載する。

手順１−ＵＶ光への曝露
保存緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０、４℃、ＮａＣｌ（３６０〜３９０ｍＭ
）および５％グリセロール）中のＨｅｌ３０８Ｍｂｕ−Ｅ２８４Ｆａｚ（変異Ｅ２８４Ｆ
ａｚを有する配列番号１０）またはＨｅｌ３０８Ｍｂｕ−Ｓ２８８Ｆａｚ（変異Ｅ２８８
Ｆａｚを有する配列番号１０）をＰＣＲチューブ（Ｆｉｓｈｅｒ ０．２ｍＬ ｔｈｉｎ
ｗａｌｌチューブ）にピペットで取った。試料を氷上に置き、２５４ｎｍの高強度ＵＶ
光（Ｓｐｅｃｔｒｏｌｉｎｅ Ｌｏｎｇｌｉｆｅ Ｆｉｌｔｅｒ ｌａｍｐ（２５４ｎｍ
および３６５ｎｍ）に４．５ｃｍの距離で上から曝露した。Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ−Ｅ２８
４Ｆａｚ（変異Ｅ２８４Ｆａｚを有する配列番号１０）試料を１５分間曝露し、Ｈｅｌ３
０８Ｍｂｕ−Ｓ２８８Ｆａｚ（変異Ｅ２８８Ｆａｚを有する配列番号１０）試料を１０分
間曝露した。次いであらゆる沈殿タンパク質を除去するために両方の試料を５分間、１６
０００ｇで遠心分離した。可溶性画分を不溶性沈殿からピペットで慎重に除去した。

手順２−白色光への曝露（ＬＥＤ源）
保存緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０、４℃、ＮａＣｌ（３７０ｍＭ）および
５％グリセロール）中のＨｅｌ３０８Ｍｂｕ−Ｓ２８８Ｆａｚ（変異Ｅ２８８Ｆａｚを有
する配列番号１０）を微量遠心管（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、１．５ｍＬ、Ｐｒｏｔｅｉｎ
Ｌｏ Ｂｉｎｄ）にピペットで取った。試料を（キャップを開けて）氷上に置き、ＬＥＤ
光源（Ｓｃｈｏｔｔ Ａ２０９６０．１）に全出力で３ｃｍの距離で上から曝露した。Ｈ
ｅｌ３０８Ｍｂｕ−Ｓ２８８Ｆａｚ（変異Ｅ２８８Ｆａｚを有する配列番号１０）試料を
３時間曝露した。

手順３−白色光（ＬＥＤ源）への曝露および加熱
保存緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０、４℃、ＮａＣｌ（３７０ｍＭ）および
５％グリセロール）中のＨｅｌ３０８Ｍｂｕ−Ｓ２８８Ｆａｚ（変異Ｅ２８８Ｆａｚを有
する配列番号１０）を微量遠心管（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、１．５ｍＬ、Ｐｒｏｔｅｉｎ
Ｌｏ Ｂｉｎｄ）にピペットで取った。試料を（キャップを開けて）氷上に置き、ＬＥＤ
光源（Ｓｃｈｏｔｔ Ａ２０９６０．１）に全出力で１ｃｍの距離で上から曝露した。Ｈ
ｅｌ３０８Ｍｂｕ−Ｓ２８８Ｆａｚ（変異Ｅ２８８Ｆａｚを有する配列番号１０）試料を
１時間曝露した。試料をＰＣＲチューブ（Ｆｉｓｈｅｒ ０．２ｍＬ ｔｈｉｎ ｗａｌ
ｌチューブ）に移し、４℃にする前に５０℃で１０分間加熱し、次いであらゆる沈殿タン
パク質を除去するために５分間、１６０００ｇで遠心分離した。可溶性画分を不溶性沈殿
からピペットで慎重に除去した。

本実施例は、ナノポアを通るインタクトなＤＮＡ鎖（３．６ｋｂ）の移動を制御するＨ
ｅｌ３０８Ｍｂｕ（配列番号１０）の能力を、多数のＨｅｌ３０８Ｍｂｕ変異体（Ｈｅｌ
３０８Ｍｂｕ−Ｅ２８４Ｃ（変異Ｅ２８４Ｃを有する配列番号１０）、Ｈｅｌ３０８Ｍｂ
ｕ−Ｓ２８８Ｃ（変異Ｓ２８８Ｃを有する配列番号１０）、Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ−Ｅ２８
４Ｆａｚ（変異Ｅ２８４Ｆａｚを有する配列番号１０）および熱処置Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ
−Ｅ２８４Ｆａｚ（変異Ｅ２８４Ｆａｚを有する配列番号１０、酵素は５０ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ ｐＨ８．０、３７５ｍＭ ＮａＣｌ、５％グリセロール緩衝液中で４℃から５０℃で
１０分間加熱され、次いでＢｉｏＲａｄ ＰＣＲブロックで４℃に冷却された））のもの
と比較する。図１８に場と反対の制御されたＤＮＡ移行のための一般的方法を示す。

材料および方法
実験を設定する前に、ＤＮＡ（０．２ｎＭ、（その５’末端で４個のニトロインドール
に付着している配列番号１５４（図１８においてｘと標識）、その最後は配列番号１５５
の３’末端に付着している）、配列番号１５６および配列番号１１７）ならびに適切なヘ
リカーゼ（Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（１００ｎＭ、配列番号１０）、Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ−Ｅ
２８４Ｃ（１００ｎＭ、変異Ｅ２８４Ｃを有する配列番号１０）、Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ−
Ｓ２８８Ｃ（１００ｎＭ、変異Ｓ２８８Ｃを有する配列番号１０）、Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ
−Ｅ２８４Ｆａｚ（１００ｎＭ、変異Ｅ２８４Ｆａｚを有する配列番号１０）および熱処
置Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ−Ｅ２８４Ｆａｚ（５００ｎＭ、変異Ｅ２８４Ｆａｚを有する配列
番号１０、酵素は５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０、３７５ｍＭ ＮａＣｌ、５％グリセ
ロール緩衝液中で４℃から５０℃で１０分間加熱され、次いでＢｉｏＲａｄ ＰＣＲブロ
ックで４℃に冷却された））を緩衝液（９６０ｍＭ ＫＣｌ、２５ｍＭリン酸カリウム、
３ｍＭフェロシアン化カリウム、１ｍＭフェリシアン化カリウムｐＨ８．０、１０ｍＭ
ＭｇＣｌ_２および１ｍＭ ＡＴＰ）中に溶解した。

緩衝液（９６０ｍＭ ＫＣｌ、２５ｍＭリン酸カリウム、３ｍＭフェロシアン化カリウ
ム、１ｍＭフェリシアン化カリウムｐＨ８．０）中のブロック共重合体に挿入された単一
ＭｓｐＡナノポア（ＭＳ（Ｂ１−Ｇ７５Ｓ／Ｇ７７Ｓ／Ｌ８８Ｎ／Ｑ１２６Ｒ）８Ｍｓｐ
Ａ（変異Ｇ７５Ｓ／Ｇ７７Ｓ／Ｌ８８Ｎ／Ｑ１２６Ｒを有する配列番号２）から電気測定
値を得た。ブロック共重合体中に単一ポアを達成した後、次いで緩衝液（３ｍＬ ９６０
ｍＭ ＫＣｌ、２５ｍＭリン酸カリウム、３ｍＭフェロシアン化カリウム、１ｍＭフェリ
シアン化カリウムｐＨ８．０）を系を通して流した。最終に、予備混合物（上に記載）を
単一ナノポア実験系に添加した。実験は、＋１２０ｍＶの一定電位で実行し、ヘリカーゼ
制御ＤＮＡ移動をモニターした。

結果および考察
検査した全ての酵素、Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（配列番号１０）、Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ−Ｅ
２８４Ｃ（変異Ｅ２８４Ｃを有する配列番号１０）、Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ−Ｓ２８８Ｃ（
変異Ｓ２８８Ｃを有する配列番号１０）、Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ−Ｅ２８４Ｆａｚ（変異Ｅ
２８４Ｆａｚを有する配列番号１０）および熱処置Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ−Ｅ２８４Ｆａｚ
（変異Ｅ２８４Ｆａｚを有する配列番号１０、酵素は５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０、
３７５ｍＭ ＮａＣｌ、５％グリセロール緩衝液中で４℃から５０℃で１０分間加熱され
、次いでＢｉｏＲａｄ ＰＣＲブロックで４℃に冷却された）からヘリカーゼ制御ＤＮＡ
移動を観察した。ヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動を示す電流トレース例を図１９〜２３に示す
。しかし変異体Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕヘリカーゼ（Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ−Ｅ２８４Ｃ（変異
Ｅ２８４Ｃを有する配列番号１０）、Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ−Ｓ２８８Ｃ（変異Ｓ２８８Ｃ
を有する配列番号１０）、Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ−Ｅ２８４Ｆａｚ（変異Ｅ２８４Ｆａｚを
有する配列番号１０）および熱処置Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ−Ｅ２８４Ｆａｚ（変異Ｅ２８４
Ｆａｚを有する配列番号１０、酵素は５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０、３７５ｍＭ Ｎ
ａＣｌ、５％グリセロール緩衝液中で４℃から５０℃で１０分間加熱され、次いでＢｉｏ
Ｒａｄ ＰＣＲブロックで４℃に冷却された））はＨｅｌ３０８Ｍｂｕ（配列番号１０）
と比較して増大した前進性を示した、表１１を参照されたい。実験において観察されたヘ
リカーゼ制御ＤＮＡ移動の内、鎖の末端（ポリＴ領域に）まで全てＤＮＡを処理した移動
の％は変異体ヘリカーゼ（Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ−Ｅ２８４Ｃ（変異Ｅ２８４Ｃを有する配
列番号１０）、Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ−Ｓ２８８Ｃ（変異Ｓ２８８Ｃを有する配列番号１０
）、Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ−Ｅ２８４Ｆａｚ（変異Ｅ２８４Ｆａｚを有する配列番号１０）
および熱処置Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ−Ｅ２８４Ｆａｚ（変異Ｅ２８４Ｆａｚを有する配列番
号１０、酵素は５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０、３７５ｍＭ ＮａＣｌ、５％グリセロ
ール緩衝液中で４℃から５０℃で１０分間加熱され、次いでＢｉｏＲａｄ ＰＣＲブロッ
クで４℃に冷却された））についてＨｅｌ３０８Ｍｂｕ（配列番号１０）と比較した場合
に顕著に高かった。

本発明はまた以下を提供する。
［１］ １つまたは複数の単量体から形成され、少なくとも１つのコンホメーション状態において、それを通ってポリヌクレオチドがヘリカーゼから解離できる開口部を含むポリヌクレオチド結合ドメインを含むヘリカーゼであって、ヘリカーゼの同じ単量体内の２つ以上の部分が繋がれて開口部のサイズを低減するように修飾されており、ポリヌクレオチドの移動を制御する能力を保持しているヘリカーゼ。
［２］ ２つ以上の部分が開口部を閉じるように繋がれている、［１］に記載のヘリカーゼ。
［３］ いかなるコンホメーション状態でも開口部を含まないように修飾されている、［１］または［２］に記載のヘリカーゼ。
［４］ ポリヌクレオチド周囲の共有結合的に閉じた構造を形成できるように修飾されている、［１］から［３］のいずれか一項に記載のヘリカーゼ。
［５］ ２つ以上の部分が一過的に繋がれている、［１］から［３］のいずれか一項に記載のヘリカーゼ。
［６］ ポリヌクレオチド結合ドメインが、少なくとも１つのコンホメーション状態において、それを通ってポリヌクレオチドの内部ヌクレオチドがヘリカーゼから解離できる開口部を含む、前記のいずれか一項に記載のヘリカーゼ。
［７］ ２つ以上の部分の少なくとも１つが開口部の部分を形成する、開口部に隣接しているまたは開口部に近い、前記のいずれか一項に記載のヘリカーゼ。
［８］ 開口部の部分を形成するまたは開口部に隣接している２つ以上アミノ酸を連結することによって修飾されている、前記のいずれか一項に記載のヘリカーゼ。
［９］ ２つ以上の部分が親和性分子によって繋がれている、前記のいずれか一項に記載のヘリカーゼ。
［１０］ 親和性分子が、（ａ）相補的ポリヌクレオチド、（ｂ）抗体またはその断片および相補的エピトープ、（ｃ）ペプチドジッパー、（ｄ）β−シート増強により相互作用できる、（ｅ）水素結合、ｐｉ−スタッキングまたは塩橋形成できる、（ｆ）ロタキサン、（ｇ）アプタマーおよび相補的タンパク質または（ｈ）ハーフキレーターである、［９］に記載のヘリカーゼ。
［１１］ ２つ以上の部分が１つまたは複数のリンカーを使用して繋がれている、前記のいずれか一項に記載のヘリカーゼ。
［１２］ １つもしくは複数のリンカーがアミノ酸配列および／または１つもしくは複数の化学的架橋剤である、［１１］に記載のヘリカーゼ。
［１３］ アミノ酸配列がポリヌクレオチド結合成分を含む、［１２］に記載のヘリカーゼ。
［１４］ １つまたは複数のリンカーの一方の末端または両方の末端がヘリカーゼに共有結合的に付着されている、［１１］から［１２］のいずれか一項に記載のヘリカーゼ。
［１５］ ２つ以上の部分の少なくとも１つが、１つまたは複数のリンカーの付着を促進するために修飾されている、［１１］から［１３］のいずれか一項に記載のヘリカーゼ。
［１６］ ２つ以上の部分の少なくとも１つのアミノ酸がシステインまたは非天然アミノ酸で置換されている、［１５］に記載のヘリカーゼ。
［１７］ 非天然アミノ酸が４−アジド−Ｌ−フェニルアラニン（Ｆａｚ）である、［１６］に記載のヘリカーゼ。
［１８］ ２つ以上の部分が、単量体の表面上にあるおよび／または単量体のループ領域である、前記のいずれか一項に記載のヘリカーゼ。
［１９］ ２つ以上の部分が単量体中で空間的に近接している、前記のいずれか一項に記載のヘリカーゼ。
［２０］ スーパーファミリー１またはスーパーファミリー２由来である、前記のいずれか一項に記載のヘリカーゼ。
［２１］ Ｈｅｌ３０８ヘリカーゼ、ＲｅｃＤヘリカーゼ、Ｔｒａｌヘリカーゼ、Ｔｒａｌサブグループヘリカーゼ、ＸＰＤヘリカーゼまたはその変種である、前記のいずれか一項に記載のヘリカーゼ。
［２２］ Ｈｅｌ３０８ヘリカーゼが表１に示すヘリカーゼの１つもしくはその変種である、またはＴｒａＩヘリカーゼが表３に示すヘリカーゼの１つもしくはその変種である、［２１］に記載のヘリカーゼ。
［２３］ １つもしくは複数のシステイン残基および／または１つもしくは複数の非天然アミノ酸がＨｅｌ３０８Ｍｂｕ（配列番号１０）中のＤ２７２、Ｎ２７３、Ｄ２７４、Ｇ２８１、Ｅ２８４、Ｅ２８５、Ｅ２８７、Ｓ２８８、Ｔ２８９、Ｇ２９０、Ｅ２９１、Ｄ２９３、Ｔ２９４、Ｎ３００、Ｒ３０３、Ｋ３０４、Ｎ３１４、Ｓ３１５、Ｎ３１６、Ｈ３１７、Ｒ３１８、Ｋ３１９、Ｌ３２０、Ｅ３２２、Ｒ３２６、Ｎ３２８、Ｓ６１５、Ｋ７１７、Ｙ７２０、Ｎ７２１およびＳ７２４に対応する位置の１つまたは複数に導入されているＨｅｌ３０８ヘリカーゼであって、ポリヌクレオチドの移動を制御する能力を保持している、Ｈｅｌ３０８ヘリカーゼ。
［２４］ ヘリカーゼの２つ以上の部分が繋がれて、それを通ってポリヌクレオチドがヘリカーゼから解離できるポリヌクレオチド結合ドメイン中の開口部のサイズを低減するようにさらに修飾されている、［２３］に記載のヘリカーゼ。
［２５］ ヘリカーゼの２つ以上の部分が繋がれて、それを通ってポリヌクレオチドがヘリカーゼから解離できるポリヌクレオチド結合ドメイン中の開口部のサイズを低減するように修飾されていない、［２４］に記載のヘリカーゼ。
［２６］ １つもしくは複数のシステイン残基および／または１つもしくは複数の非天然アミノ酸が、（ａ）Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（配列番号１０）中のＤ２７４、Ｅ２８４、Ｅ２８５、Ｓ２８８、Ｓ６１５、Ｋ７１７、Ｙ７２０、Ｅ２８７、Ｔ２８９、Ｇ２９０、Ｅ２９１、Ｎ３１６およびＫ３１９に対応する位置の１つもしくは複数に、（ｂ）Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（配列番号１０）中のＤ２７４、Ｅ２８４、Ｅ２８５、Ｓ２８８、Ｓ６１５、Ｋ７１７およびＹ７２０に対応する位置の１つもしくは複数にまたは（ｃ）Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（配列番号１０）中のＤ２７４、Ｅ２８４、Ｅ２８５、Ｓ２８８およびＳ６１５に対応する位置の１つまたは複数に導入されている、［２３］から［２５］のいずれか一項に記載のヘリカーゼ。
［２７］ 配列番号１０、１３、１６、１９、２２、２５、２８、２９、３２、３３、３４、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５および５８のいずれか１つに示す配列の変種を含み、Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（配列番号１０）中のＤ２７４、Ｅ２８４、Ｅ２８５、Ｓ２８８、Ｓ６１５、Ｋ７１７、Ｙ７２０、Ｅ２８７、Ｔ２８９、Ｇ２９０、Ｅ２９１、Ｎ３１６およびＫ３１９に対応する位置が表４ａおよび４ｂに示されている、［２６］に記載のヘリカーゼ。
［２８］ （ａ）位置Ｌ２６５、Ｅ２７５、Ｌ２７６、Ｓ２７９、Ｐ５８５、Ｋ６９０およびＥ６９３の１つまたは複数に１つもしくは複数のシステイン残基および／または１つもしくは複数の非天然アミノ酸を含む配列番号１３（Ｈｅｌ３０８Ｐｆｕ）に示す配列の変種；
（ｂ）位置Ｅ２８３、Ｅ２９３、Ｉ２９４、Ｖ２９７、Ｄ６７１、Ｋ７７５およびＥ７７８の１つまたは複数に１つもしくは複数のシステイン残基および／または１つもしくは複数の非天然アミノ酸を含む配列番号１６（Ｈｅｌ３０８Ｈｖｏ）に示す配列の変種；
（ｃ）位置Ｅ２８３、Ｅ２９３、Ｉ２９４、Ｇ２９７、Ｄ６６８、Ｒ７７５およびＥ７７８の１つまたは複数に１つもしくは複数のシステイン残基および／または１つもしくは複数の非天然アミノ酸を含む配列番号１９（Ｈｅｌ３０８Ｈｌａ）に示す配列の変種；
（ｄ）位置Ｄ２８０、Ｋ２９０、Ｉ２９１、Ｓ２９４、Ｐ５８９、Ｔ６９４およびＮ６９７の１つまたは複数に１つもしくは複数のシステイン残基および／または１つもしくは複数の非天然アミノ酸を含む配列番号２２（Ｈｅｌ３０８Ｃｓｙ）に示す配列の変種；
（ｅ）位置Ｌ２８１、Ｋ２９１、Ｑ２９２、Ｄ２９５、Ｄ５９６、Ｋ７０２およびＱ７０５の１つまたは複数に１つもしくは複数のシステイン残基および／または１つもしくは複数の非天然アミノ酸を含む配列番号２５（Ｈｅｌ３０８Ｓｓｏ）に示す配列の変種；
（ｆ）位置Ｈ２６４、Ｅ２７２、Ｋ２７３、Ａ２７６、Ｇ５７６、Ｋ６７８およびＥ６８１の１つまたは複数に１つもしくは複数のシステイン残基および／または１つもしくは複数の非天然アミノ酸を含む配列番号２８（Ｈｅｌ３０８Ｍｆｒ）に示す配列の変種；
（ｇ）位置Ｓ２７９、Ｌ２８９、Ｓ２９０、Ｄ２９３、Ｐ６４９、Ｋ７５３およびＲ７５６の１つまたは複数に１つもしくは複数のシステイン残基および／または１つもしくは複数の非天然アミノ酸を含む配列番号２９（Ｈｅｌ３０８Ｍｏｋ）に示す配列の変種；
（ｈ）位置Ｙ２７６、Ｌ２８６、Ｓ２８７、Ｄ２９０、Ｐ５７９、Ｋ６７９およびＫ６８２の１つまたは複数に１つもしくは複数のシステイン残基および／または１つもしくは複数の非天然アミノ酸を含む配列番号３２（Ｈｅｌ３０８Ｍｉｇ）に示す配列の変種；
（ｉ）位置Ｌ２６６、Ｓ２７６、Ｌ２７７、Ｑ２８０、Ｐ５８３、Ｋ６８９およびＤ６９２の１つまたは複数に１つもしくは複数のシステイン残基および／または１つもしくは複数の非天然アミノ酸を含む配列番号３３（Ｈｅｌ３０８Ｔｇａ）に示す配列の変種；
（ｊ）位置Ｌ２８７、Ｅ２９７、Ｌ２９８、Ｓ３０１、Ｓ６０４、Ｋ７１０およびＥ７１３の１つまたは複数に１つもしくは複数のシステイン残基および／または１つもしくは複数の非天然アミノ酸を含む配列番号３４（Ｈｅｌ３０８Ｔｂａ）に示す配列の変種；
（ｋ）位置Ｌ２８９、Ｑ２９９、Ｌ３００、Ｇ３０３、Ｎ６０６、Ｇ７１２およびＥ７１５の１つまたは複数に１つもしくは複数のシステイン残基および／または１つもしくは複数の非天然アミノ酸を含む配列番号３７（Ｈｅｌ３０８Ｔｓｉ）に示す配列の変種；
（ｌ）位置Ｅ２７４、Ｄ２８４、Ｅ２８５、Ｅ２８８、Ｓ５８９、Ｋ６９１およびＤ６９４の１つまたは複数に１つもしくは複数のシステイン残基および／または１つもしくは複数の非天然アミノ酸を含む配列番号３８（Ｈｅｌ３０８Ｍｂａ）に示す配列の変種；
（ｍ）位置Ｅ２７４、Ｄ２８４、Ｅ２８５、Ｅ２８８、Ｐ５９０、Ｋ６９２およびＥ６９５の１つまたは複数に１つもしくは複数のシステイン残基および／または１つもしくは複数の非天然アミノ酸を含む配列番号３９（Ｈｅｌ３０８Ｍａｃ）に示す配列の変種；
（ｎ）位置Ｈ２７２、Ｌ２８２、Ｓ２８３、Ｄ２８６、Ｐ６２１、Ｋ７２５およびＫ７２８の１つまたは複数に１つもしくは複数のシステイン残基および／または１つもしくは複数の非天然アミノ酸を含む配列番号４０（Ｈｅｌ３０８Ｍｍａｈ）に示す配列の変種；
（ｏ）位置Ｅ２７４、Ｄ２８４、Ｅ２８５、Ｅ２８８、Ｐ５９０、Ｋ６９２およびＥ６９８の１つまたは複数に１つもしくは複数のシステイン残基および／または１つもしくは複数の非天然アミノ酸を含む配列番号４１（Ｈｅｌ３０８Ｍｍａｚ）に示す配列の変種；
（ｐ）位置Ａ２６９、Ｌ２７９、Ａ２８０、Ｌ２８３、Ｈ５７５、Ｋ６７７およびＥ６８０の１つまたは複数に１つもしくは複数のシステイン残基および／または１つもしくは複数の非天然アミノ酸を含む配列番号４２（Ｈｅｌ３０８Ｍｔｈ）に示す配列の変種；
（ｑ）位置Ｈ２７４、Ｑ２８４、Ｅ２８５、Ｅ２８８、Ｐ５９６、Ｋ６９９およびＱ７０２の１つまたは複数に１つもしくは複数のシステイン残基および／または１つもしくは複数の非天然アミノ酸を含む配列番号４３（Ｈｅｌ３０８Ｍｚｈ）に示す配列の変種；
（ｒ）位置Ｇ２７４、Ｅ２８４、Ｅ２８５、Ｅ２８８、Ｔ５９０、Ｋ６９１およびＹ６９４の１つまたは複数に１つもしくは複数のシステイン残基および／または１つもしくは複数の非天然アミノ酸を含む配列番号４４（Ｈｅｌ３０８Ｍｅｖ）に示す配列の変種；
（ｓ）位置Ｈ２７２、Ｌ２８２、Ｓ２８３、Ｄ２８６、Ｐ６２１、Ｋ７２５およびＫ７２８の１つまたは複数にシステイン残基または非天然アミノ酸を含む配列番号４５（Ｈｅｌ３０８Ｍｍａ）に示す配列の変種；
（ｔ）位置Ｇ２７７、Ｔ２８７、Ｅ２８８、Ｅ２９１、Ｄ６３４、Ｋ７３７およびＥ７４０の１つまたは複数に１つもしくは複数のシステイン残基および／または１つもしくは複数の非天然アミノ酸を含む配列番号４６（Ｈｅｌ３０８Ｎｍａ）に示す配列の変種；
（ｕ）位置Ａ２７０、Ｅ２７７、Ｒ２７８、Ｅ２８１、Ｓ５８３、Ｇ６８５およびＥ６８８の１つまたは複数に１つもしくは複数のシステイン残基および／または１つもしくは複数の非天然アミノ酸を含む配列番号４７（Ｈｅｌ３０８Ｍｂｏ）に示す配列の変種；
（ｖ）位置Ｑ２６４、Ｆ２６７、Ｅ２６８、Ｅ２７１、Ｐ５５９、Ｋ６６３およびＫ６６６の１つまたは複数に１つもしくは複数のシステイン残基および／または１つもしくは複数の非天然アミノ酸を含む配列番号４８（Ｈｅｌ３０８Ｆａｃ）に示す配列の変種；
（ｗ）位置Ｒ２７５、Ｌ２８５、Ｓ２８６、Ｅ２８９、Ｐ５７６、Ｋ６７６およびＫ６７９の１つまたは複数に１つもしくは複数のシステイン残基および／または１つもしくは複数の非天然アミノ酸を含む配列番号４９（Ｈｅｌ３０８Ｍｆｅ）に示す配列の変種；
（ｘ）位置Ｉ２７３、Ｌ２８３、Ｓ２８４、Ｅ２８７、Ｐ５７４、Ｋ６７４およびＫ６７７の１つまたは複数に１つもしくは複数のシステイン残基および／または１つもしくは複数の非天然アミノ酸を含む配列番号５０（Ｈｅｌ３０８Ｍｊａ）に示す配列の変種；
（ｙ）位置Ｒ２５７、Ｌ２６７、Ｓ２６８、Ｄ２７１、Ｐ５５４、Ｋ６５１およびＫ６５４の１つまたは複数に１つもしくは複数のシステイン残基および／または１つもしくは複数の非天然アミノ酸を含む配列番号５１（Ｈｅｌ３０８Ｍｉｎ）に示す配列の変種；
（ｚ）位置Ｓ２６９、Ｑ２７７、Ｅ２７８、Ｒ２８１、Ｓ５８３、Ｇ６８５およびＲ６８８の１つまたは複数にシステイン残基または非天然アミノ酸を含む配列番号５２（Ｈｅｌ３０８Ｍｈｕ）に示す配列の変種；
（ａａ）位置Ｋ２６８、Ｋ２７７、Ａ２７８、Ｅ２８１、Ｄ５７５、Ｒ６７７およびＥ６８０の１つまたは複数に１つもしくは複数のシステイン残基および／または１つもしくは複数の非天然アミノ酸を含む配列番号５３（Ｈｅｌ３０８Ａｆｕ）に示す配列の変種；
（ａｂ）位置Ｄ２７７、Ｄ２８７、Ｄ２８８、Ｄ２９１、Ｄ６２６、Ｋ７２９およびＥ７３２の１つまたは複数に１つもしくは複数のシステイン残基および／または１つもしくは複数の非天然アミノ酸を含む配列番号５４（Ｈｅｌ３０８Ｈｔｕ）に示す配列の変種；
（ａｃ）位置Ｄ２７６、Ｄ２８６、Ｑ２８７、Ｄ２９０、Ｄ５９５、Ｋ７０７およびＥ７１０の１つまたは複数に１つもしくは複数のシステイン残基および／または１つもしくは複数の非天然アミノ酸を含む配列番号５５（Ｈｅｌ３０８Ｈｐａ）に示す配列の変種；
（ａｄ）位置Ｅ２８６、Ｅ２９６、Ｉ２９７、Ｖ３００、Ｄ６３３、Ａ７３７およびＥ７４０の１つまたは複数に１つもしくは複数のシステイン残基および／または１つもしくは複数の非天然アミノ酸を含む配列番号５８（Ｈｅｌ３０８Ｈｓｐ（ｓｋｉ２様ヘリカーゼ））に示す配列の変種；または
（ａｅ）Ｄ２７４、Ｅ２８４、Ｅ２８５、Ｓ２８８、Ｓ６１５、Ｋ７１７およびＹ７２０の１つまたは複数に１つもしくは複数のシステイン残基および／または１つもしくは複数の非天然アミノ酸を含む配列番号１０に示す配列の変種
を含む、［２６］に記載のヘリカーゼ。
［２９］ １つまたは複数の非天然アミノ酸が、４−アジド−Ｌ−フェニルアラニン（Ｆａｚ）、４−アセチル−Ｌ−フェニルアラニン、３−アセチル−Ｌ−フェニルアラニン、４−アセトアセチル−Ｌ−フェニルアラニン、Ｏ−アリル−Ｌ−チロシン、３−（フェニルセラニル）−Ｌ−アラニン、Ｏ−２−プロピン−１−イル−Ｌ−チロシン、４−（ジヒドロキシボリル）−Ｌ−フェニルアラニン、４−［（エチルスルファニル）カルボニル］−Ｌ−フェニルアラニン、（２Ｓ）−２−アミノ−３−｛４−［（プロパン−２−イルスルファニル）カルボニル］フェニル｝プロパン酸、（２Ｓ）−２−アミノ−３−｛４−［（２−アミノ−３−スルファニルプロパノイル）アミノ］フェニル｝プロパン酸、Ｏ−メチル−Ｌ−チロシン、４−アミノ−Ｌ−フェニルアラニン、４−シアノ−Ｌ−フェニルアラニン、３−シアノ−Ｌ−フェニルアラニン、４−フルオロ−Ｌ−フェニルアラニン、４−ヨード−Ｌ−フェニルアラニン、４−ブロモ−Ｌ−フェニルアラニン、Ｏ−（トリフルオロメチル）チロシン、４−ニトロ−Ｌ−フェニルアラニン、３−ヒドロキシ−Ｌ−チロシン、３−アミノ−Ｌ−チロシン、３−ヨード−Ｌ−チロシン、４−イソプロピル−Ｌ−フェニルアラニン、３−（２−ナフチル）−Ｌ−アラニン、４−フェニル−Ｌ−フェニルアラニン、（２Ｓ）−２−アミノ−３−（ナフタレン−２−イルアミノ）プロパン酸、６−（メチルスルファニル）ノルロイシン、６−オキソ−Ｌ−リシン、Ｄ−チロシン、（２Ｒ）−２−ヒドロキシ−３−（４−ヒドロキシフェニル）プロパン酸、（２Ｒ）−２−アンモニオオクタノエート３−（２，２’−ビピリジン−５−イル）−Ｄ−アラニン、２−アミノ−３−（８−ヒドロキシ−３−キノリル）プロパン酸、４−ベンゾイル−Ｌ−フェニルアラニン、Ｓ−（２−ニトロベンジル）システイン、（２Ｒ）−２−アミノ−３−［（２−ニトロベンジル）スルファニル］プロパン酸、（２Ｓ）−２−アミノ−３−［（２−ニトロベンジル）オキシ］プロパン酸、Ｏ−（４，５−ジメトキシ−２−ニトロベンジル）−Ｌ−セリン、（２Ｓ）−２−アミノ−６−（｛［（２−ニトロベンジル）オキシ］カルボニル｝アミノ）ヘキサン酸、Ｏ−（２−ニトロベンジル）−Ｌ−チロシン、２−ニトロフェニルアラニン、４−［（Ｅ）−フェニルジアゼニル］−Ｌ−フェニルアラニン、４−［３−（トリフルオロメチル）−３Ｈ−ジアジレン−３−イル］−Ｄ−フェニルアラニン、２−アミノ−３−［［５−（ジメチルアミノ）−１−ナフチル］スルホニルアミノ］プロパン酸、（２Ｓ）−２−アミノ−４−（７−ヒドロキシ−２−オキソ−２Ｈ−クロメン−４−イル）ブタン酸、（２Ｓ）−３−［（６−アセチルナフタレン−２−イル）アミノ］−２−アミノプロパン酸、４−（カルボキシメチル）フェニルアラニン、３−ニトロ−Ｌ−チロシン、Ｏ−スルホ−Ｌ−チロシン、（２Ｒ）−６−アセトアミド−２−アンモニオヘキサノエート、１−メチルヒスチジン、２−アミノノナン酸、２−アミノデカン酸、Ｌ−ホモシステイン、５−スルファニルノルバリン、６−スルファニル−Ｌ−ノルロイシン、５−（メチルスルファニル）−Ｌ−ノルバリン、Ｎ ^６ −｛［（２Ｒ，３Ｒ）−３−メチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピロール−２−イル］カルボニル｝−Ｌ−リシン、Ｎ ^６ −［（ベンジルオキシ）カルボニル］リシン、（２Ｓ）−２−アミノ−６−［（シクロペンチルカルボニル）アミノ］ヘキサン酸、Ｎ ^６ −［（シクロペンチルオキシ）カルボニル］−Ｌ−リシン、（２Ｓ）−２−アミノ−６−｛［（２Ｒ）−テトラヒドロフラン−２−イルカルボニル］アミノ｝ヘキサン酸、（２Ｓ）−２−アミノ−８−［（２Ｒ，３Ｓ）−３−エチニルテトラヒドロフラン−２−イル］−８−オキソオクタン酸、Ｎ ^６ −（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−リシン、（２Ｓ）−２−ヒドロキシ−６−（｛［（２−メチル−２−プロパニル）オキシ］カルボニル｝アミノ）ヘキサン酸、Ｎ ^６ −［（アリルオキシ）カルボニル］リシン、（２Ｓ）−２−アミノ−６−（｛［（２−アジドベンジル）オキシ］カルボニル｝アミノ）ヘキサン酸、Ｎ ^６ −Ｌ−プロリル−Ｌ−リシン、（２Ｓ）−２−アミノ−６−｛［（プロパ−２−イン−１−イルオキシ）カルボニル］アミノ｝ヘキサン酸およびＮ ^６ −［（２−アジドエトキシ）カルボニル］−Ｌ−リシンから選択される、［２３］から［２８］のいずれか一項に記載のヘリカーゼ。
［３０］ ［１］から［２９］のいずれか一項に記載のヘリカーゼおよび追加的ポリヌクレオチド結合成分を含む構築物であって、ヘリカーゼがポリヌクレオチド結合成分に付着しており、ポリヌクレオチドの移動を制御する能力を有する構築物。
［３１］ ポリヌクレオチドの移動を制御する方法であって、ポリヌクレオチドを［１］から［２９］のいずれか一項に記載のヘリカーゼまたは［３０］に記載の構築物と接触させ、それによりポリヌクレオチドの移動を制御するステップを含む方法。
［３２］ 標的ポリヌクレオチドを特性決定する方法であって
（ａ）標的ポリヌクレオチドを膜貫通ポアおよび［１］から［２９］のいずれか一項に記載のヘリカーゼまたは［３０］に記載の構築物と、ヘリカーゼまたは構築物がポアを通る標的ポリヌクレオチドの移動を制御するように接触させるステップ；ならびに
（ｂ）ポリヌクレオチドがポアに関して移動するときに１つまたは複数の測定値を取るステップであって、測定値が標的ポリヌクレオチドの特性の１つまたは複数を示し、それにより標的ポリヌクレオチドを特性決定するステップ
を含む方法。
［３３］ １つまたは複数の特性が、（ｉ）標的ポリヌクレオチドの長さ、（ｉｉ）標的ポリヌクレオチドの同一性、（ｉｉｉ）標的ポリヌクレオチドの配列、（ｉｖ）標的ポリヌクレオチドの二次構造および（ｖ）標的ポリヌクレオチドが修飾されているか否か、から選択される、［３２］に記載の方法。
［３４］ 標的ポリヌクレオチドがメチル化によって、酸化によって、損傷によって、１つまたは複数のタンパク質でまたは１つまたは複数の標識、タグもしくはスペーサーで修飾されている、［３３］に記載の方法。
［３５］ 標的ポリヌクレオチドの１つまたは複数の特性が電気的測定および／または光学的測定によって測定される、［３２］から［３４］のいずれか一項に記載の方法。
［３６］ 電気的測定が電流測定、インピーダンス測定、トンネル測定または電界効果トランジスタ（ＦＥＴ）測定である、［３５］に記載の方法。
［３７］ （ａ）標的ポリヌクレオチドを膜貫通ポアおよび［１］から［２９］のいずれか一項に記載のヘリカーゼまたは［３０］に記載の構築物に接触させて、ヘリカーゼまたは構築物がポアを通る標的ポリヌクレオチドの移動を制御するようにするステップ；および
（ｂ）ポリヌクレオチドがポアに関して移動するときにポアを通過する電流を測定するステップであって、電流が標的ポリヌクレオチドの１つまたは複数の特性を示し、それにより標的ポリヌクレオチドを特性決定するステップ
を含む、［３５］に記載の方法。
［３８］ ポアに電圧を印加して、ポアとヘリカーゼとの複合体を形成するステップをさらに含む、［３２］から［３７］のいずれか一項に記載の方法。
［３９］ ポリヌクレオチドの少なくとも一部が２本鎖である、［３２］から［３８］のいずれか一項に記載の方法。
［４０］ ポアが、膜貫通タンパク質ポアまたはソリッドステートポアである、［３２］から［３９］のいずれか一項に記載の方法。
［４１］ 膜貫通タンパク質ポアが、ヘモリジン（hemolysin）、ロイコシジン（leukocidin）、スメグマ菌（Mycobacterium smegmatis）ポリン（porin）Ａ（ＭｓｐＡ）、ＭｓｐＢ、ＭｓｐＣ、ＭｓｐＤ、外膜ポリン（porin）Ｆ（ＯｍｐＦ）、外膜ポリン（porin）Ｇ（ＯｍｐＧ）、外膜ホスホリパーゼＡ、ナイセリア（Neisseria）オートトランスポーターリポタンパク質（ＮａｌＰ）およびＷＺＡ由来である、［４０］に記載の方法。
［４２］ 膜貫通タンパク質が、（ａ）配列番号２に示す８個の同一のサブユニットから形成されている、または（ｂ）８個のサブユニットの１つもしくは複数が配列全体にわたるアミノ酸同一性に基づいて配列番号２に対して少なくとも５０％の相同性を有し、ポア活性を保持しているその変種である、［４１］に記載の方法。
［４３］ 膜貫通タンパク質が、（ａ）配列番号４に示す７個の同一サブユニットから形成されているα−ヘモリジンである、または（ｂ）７個のサブユニットの１つまたは複数が配列全体にわたるアミノ酸同一性に基づいて配列番号４に対して少なくとも５０％の相同性を有し、ポア活性を保持しているその変種である、［４１］に記載の方法。
［４４］ （ａ）ポアと、（ｂ）［１］から［２９］のいずれか一項に記載のヘリカーゼまたは［３０］に記載の構築物との複合体を形成し、それにより標的ポリヌクレオチドを特性決定するためのセンサーを形成するステップを含む、標的ポリヌクレオチドを特性決定するためのセンサーの形成方法。
［４５］ 複合体が、（ａ）標的ポリヌクレオチドの存在下でポアとヘリカーゼまたは構築物とを接触させるステップおよび（ａ）ポアに電位を印加するステップによって形成される、［４４］に記載の方法。
［４６］ 電位が、電圧電位または化学電位である、［４５に記載の方法。
［４７］ 複合体が、ポアをヘリカーゼまたは構築物に共有結合的に付着するステップによって形成される、［４５］に記載の方法。
［４８］ （ａ）ポアと、（ｂ）［１］から［２９］のいずれか一項に記載のヘリカーゼまたは［３０］に記載の構築物との間の複合体を含む、標的ポリヌクレオチドを特性決定するためのセンサー。
［４９］ ポアを通る標的ポリヌクレオチドの移動を制御するための［１］から［２９］のいずれか一項に記載のヘリカーゼまたは［３０］に記載の構築物の使用。
［５０］ （ａ）ポアおよび（ｂ）［１］から［２９］のいずれか一項に記載のヘリカーゼまたは［３０］に記載の構築物を含む、標的ポリヌクレオチドを特性決定するためのキット。
［５１］ 両親媒性膜を含むチップをさらに含む、［５０］に記載のキット。
［５２］ （ａ）複数のポア、および（ｂ）［１］から［２９］のいずれか一項に記載の複数のヘリカーゼまたは［３０］に記載の複数の構築物を含む、試料中の標的ポリヌクレオチドを特性決定するための装置。
［５３］ 複数のポアを支持でき、ポアおよび構築物を使用してポリヌクレオチド特性決定を実施するために作動可能であるセンサーデバイス；ならびに
特性決定を実施するための材料を保持するための少なくとも１つのリザーバー
を含む、［５２］に記載の装置。
［５４］ 複数のポアを支持でき、前記ポアおよびヘリカーゼまたは構築物を用いてポリヌクレオチド特性決定を実施するために作動可能であるセンサーデバイス；
特性決定を実施するための材料を保持するための少なくとも１つのリザーバー；
前記少なくとも１つのリザーバーから前記センサーデバイスに材料を制御可能に供給するように構成された流体系；および
各試料を受けるための１つまたは複数の容器
を含み、前記流体系が１つまたは複数の容器から前記センサーデバイスに前記試料を選択的に供給するように構成されている、［５２］または［５３］に記載の装置。
［５５］ ［１］から［２２］または［２４］のいずれか一項に記載のヘリカーゼを産生する方法であって、
（ａ）１つまたは複数の単量体から形成され、それを通ってポリヌクレオチドがヘリカーゼから解離できる開口部を含むポリヌクレオチド結合ドメインを含むヘリカーゼを提供するステップ、ならびに
（ｂ）ヘリカーゼの同じ単量体内の２つ以上の部分が繋がれて開口部のサイズを低減するようにヘリカーゼを修飾し、それにより［１］から［２２または２４］のいずれか一項に記載のヘリカーゼを産生するステップ
を含む方法。
［５６］ ［２３］に記載のヘリカーゼを産生する方法であって、
（ａ）Ｈｅｌ３０８ヘリカーゼを提供するステップ；ならびに
（ｂ）Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（配列番号１０）中のＤ２７２、Ｎ２７３、Ｄ２７４、Ｇ２８１、Ｅ２８４、Ｅ２８５、Ｅ２８７、Ｓ２８８、Ｔ２８９、Ｇ２９０、Ｅ２９１、Ｄ２９３、Ｔ２９４、Ｎ３００、Ｒ３０３、Ｋ３０４、Ｎ３１４、Ｓ３１５、Ｎ３１６、Ｈ３１７、Ｒ３１８、Ｋ３１９、Ｌ３２０、Ｅ３２２、Ｒ３２６、Ｎ３２８、Ｓ６１５、Ｋ７１７、Ｙ７２０、Ｎ７２１およびＳ７２４に対応する位置の１つまたは複数に１つもしくは複数のシステイン残基および／または１つもしくは複数の非天然アミノ酸を導入し、それにより［２３に記載のヘリカーゼを産生するステップを含む方法。
［５７］ （ｃ）得られたヘリカーゼがポリヌクレオチドの移動を制御できるかどうかを決定するステップをさらに含む、［５５］または［５６］に記載の方法。
［５８］ ［３０］に記載の構築物を産生する方法であって、［１］から［２９］のいずれか一項に記載のヘリカーゼを追加的ポリヌクレオチド結合成分に付着させ、それにより本発明の構築物を産生するステップを含む方法。
［５９］ 得られた構築物がポリヌクレオチドの移動を制御できるかどうかを決定するステップをさらに含む、［５８］に記載の方法。

Claims (59)

1. １つまたは複数の単量体から形成され、少なくとも１つのコンホメーション状態におい
   て、それを通ってポリヌクレオチドがヘリカーゼから解離できる開口部を含むポリヌクレ
   オチド結合ドメインを含むヘリカーゼであって、ヘリカーゼの同じ単量体内の２つ以上の
   部分が繋がれて開口部のサイズを低減するように修飾されており、ポリヌクレオチドの移
   動を制御する能力を保持しているヘリカーゼ。
2. ２つ以上の部分が開口部を閉じるように繋がれている、請求項１に記載のヘリカーゼ。
3. いかなるコンホメーション状態でも開口部を含まないように修飾されている、請求項１
   または２に記載のヘリカーゼ。
4. ポリヌクレオチド周囲の共有結合的に閉じた構造を形成できるように修飾されている、
   請求項１から３のいずれか一項に記載のヘリカーゼ。
5. ２つ以上の部分が一過的に繋がれている、請求項１から３のいずれか一項に記載のヘリ
   カーゼ。
6. ポリヌクレオチド結合ドメインが、少なくとも１つのコンホメーション状態において、
   それを通ってポリヌクレオチドの内部ヌクレオチドがヘリカーゼから解離できる開口部を
   含む、前記請求項のいずれか一項に記載のヘリカーゼ。
7. ２つ以上の部分の少なくとも１つが開口部の部分を形成する、開口部に隣接しているま
   たは開口部に近い、前記請求項のいずれか一項に記載のヘリカーゼ。
8. 開口部の部分を形成するまたは開口部に隣接している２つ以上アミノ酸を連結すること
   によって修飾されている、前記請求項のいずれか一項に記載のヘリカーゼ。
9. ２つ以上の部分が親和性分子によって繋がれている、前記請求項のいずれか一項に記載
   のヘリカーゼ。
10. 親和性分子が、（ａ）相補的ポリヌクレオチド、（ｂ）抗体またはその断片および相補
    的エピトープ、（ｃ）ペプチドジッパー、（ｄ）β−シート増強により相互作用できる、
    （ｅ）水素結合、ｐｉ−スタッキングまたは塩橋形成できる、（ｆ）ロタキサン、（ｇ）
    アプタマーおよび相補的タンパク質または（ｈ）ハーフキレーターである、請求項９に記
    載のヘリカーゼ。
11. ２つ以上の部分が１つまたは複数のリンカーを使用して繋がれている、前記請求項のい
    ずれか一項に記載のヘリカーゼ。
12. １つもしくは複数のリンカーがアミノ酸配列および／または１つもしくは複数の化学的
    架橋剤である、請求項１１に記載のヘリカーゼ。
13. アミノ酸配列がポリヌクレオチド結合成分を含む、請求項１２に記載のヘリカーゼ。
14. １つまたは複数のリンカーの一方の末端または両方の末端がヘリカーゼに共有結合的に
    付着されている、請求項１１から１２のいずれか一項に記載のヘリカーゼ。
15. ２つ以上の部分の少なくとも１つが、１つまたは複数のリンカーの付着を促進するため
    に修飾されている、請求項１１から１３のいずれか一項に記載のヘリカーゼ。
16. ２つ以上の部分の少なくとも１つのアミノ酸がシステインまたは非天然アミノ酸で置換
    されている、請求項１５に記載のヘリカーゼ。
17. 非天然アミノ酸が４−アジド−Ｌ−フェニルアラニン（Ｆａｚ）である、請求項１６に
    記載のヘリカーゼ。
18. ２つ以上の部分が、単量体の表面上にあるおよび／または単量体のループ領域である、
    前記請求項のいずれか一項に記載のヘリカーゼ。
19. ２つ以上の部分が単量体中で空間的に近接している、前記請求項のいずれか一項に記載
    のヘリカーゼ。
20. スーパーファミリー１またはスーパーファミリー２由来である、前記請求項のいずれか
    一項に記載のヘリカーゼ。
21. Ｈｅｌ３０８ヘリカーゼ、ＲｅｃＤヘリカーゼ、Ｔｒａｌヘリカーゼ、Ｔｒａｌサブグ
    ループヘリカーゼ、ＸＰＤヘリカーゼまたはその変種である、前記請求項のいずれか一項
    に記載のヘリカーゼ。
22. Ｈｅｌ３０８ヘリカーゼが表１に示すヘリカーゼの１つもしくはその変種である、また
    はＴｒａＩヘリカーゼが表３に示すヘリカーゼの１つもしくはその変種である、請求項２
    １に記載のヘリカーゼ。
23. １つもしくは複数のシステイン残基および／または１つもしくは複数の非天然アミノ酸
    がＨｅｌ３０８Ｍｂｕ（配列番号１０）中のＤ２７２、Ｎ２７３、Ｄ２７４、Ｇ２８１、
    Ｅ２８４、Ｅ２８５、Ｅ２８７、Ｓ２８８、Ｔ２８９、Ｇ２９０、Ｅ２９１、Ｄ２９３、
    Ｔ２９４、Ｎ３００、Ｒ３０３、Ｋ３０４、Ｎ３１４、Ｓ３１５、Ｎ３１６、Ｈ３１７、
    Ｒ３１８、Ｋ３１９、Ｌ３２０、Ｅ３２２、Ｒ３２６、Ｎ３２８、Ｓ６１５、Ｋ７１７、
    Ｙ７２０、Ｎ７２１およびＳ７２４に対応する位置の１つまたは複数に導入されているＨ
    ｅｌ３０８ヘリカーゼであって、ポリヌクレオチドの移動を制御する能力を保持している
    、Ｈｅｌ３０８ヘリカーゼ。
24. ヘリカーゼの２つ以上の部分が繋がれて、それを通ってポリヌクレオチドがヘリカーゼ
    から解離できるポリヌクレオチド結合ドメイン中の開口部のサイズを低減するようにさら
    に修飾されている、請求項２３に記載のヘリカーゼ。
25. ヘリカーゼの２つ以上の部分が繋がれて、それを通ってポリヌクレオチドがヘリカーゼ
    から解離できるポリヌクレオチド結合ドメイン中の開口部のサイズを低減するように修飾
    されていない、請求項２４に記載のヘリカーゼ。
26. １つもしくは複数のシステイン残基および／または１つもしくは複数の非天然アミノ酸
    が、（ａ）Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（配列番号１０）中のＤ２７４、Ｅ２８４、Ｅ２８５、Ｓ
    ２８８、Ｓ６１５、Ｋ７１７、Ｙ７２０、Ｅ２８７、Ｔ２８９、Ｇ２９０、Ｅ２９１、Ｎ
    ３１６およびＫ３１９に対応する位置の１つもしくは複数に、（ｂ）Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ
    （配列番号１０）中のＤ２７４、Ｅ２８４、Ｅ２８５、Ｓ２８８、Ｓ６１５、Ｋ７１７お
    よびＹ７２０に対応する位置の１つもしくは複数にまたは（ｃ）Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（配
    列番号１０）中のＤ２７４、Ｅ２８４、Ｅ２８５、Ｓ２８８およびＳ６１５に対応する位
    置の１つまたは複数に導入されている、請求項２３から２５のいずれか一項に記載のヘリ
    カーゼ。
27. 配列番号１０、１３、１６、１９、２２、２５、２８、２９、３２、３３、３４、３７
    、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、
    ５１、５２、５３、５４、５５および５８のいずれか１つに示す配列の変種を含み、Ｈｅ
    ｌ３０８Ｍｂｕ（配列番号１０）中のＤ２７４、Ｅ２８４、Ｅ２８５、Ｓ２８８、Ｓ６１
    ５、Ｋ７１７、Ｙ７２０、Ｅ２８７、Ｔ２８９、Ｇ２９０、Ｅ２９１、Ｎ３１６およびＫ
    ３１９に対応する位置が表４ａおよび４ｂに示されている、請求項２６に記載のヘリカー
    ゼ。
28. （ａ）位置Ｌ２６５、Ｅ２７５、Ｌ２７６、Ｓ２７９、Ｐ５８５、Ｋ６９０およびＥ６
    ９３の１つまたは複数に１つもしくは複数のシステイン残基および／または１つもしくは
    複数の非天然アミノ酸を含む配列番号１３（Ｈｅｌ３０８Ｐｆｕ）に示す配列の変種；
    （ｂ）位置Ｅ２８３、Ｅ２９３、Ｉ２９４、Ｖ２９７、Ｄ６７１、Ｋ７７５およびＥ７７
    ８の１つまたは複数に１つもしくは複数のシステイン残基および／または１つもしくは複
    数の非天然アミノ酸を含む配列番号１６（Ｈｅｌ３０８Ｈｖｏ）に示す配列の変種；
    （ｃ）位置Ｅ２８３、Ｅ２９３、Ｉ２９４、Ｇ２９７、Ｄ６６８、Ｒ７７５およびＥ７７
    ８の１つまたは複数に１つもしくは複数のシステイン残基および／または１つもしくは複
    数の非天然アミノ酸を含む配列番号１９（Ｈｅｌ３０８Ｈｌａ）に示す配列の変種；
    （ｄ）位置Ｄ２８０、Ｋ２９０、Ｉ２９１、Ｓ２９４、Ｐ５８９、Ｔ６９４およびＮ６９
    ７の１つまたは複数に１つもしくは複数のシステイン残基および／または１つもしくは複
    数の非天然アミノ酸を含む配列番号２２（Ｈｅｌ３０８Ｃｓｙ）に示す配列の変種；
    （ｅ）位置Ｌ２８１、Ｋ２９１、Ｑ２９２、Ｄ２９５、Ｄ５９６、Ｋ７０２およびＱ７０
    ５の１つまたは複数に１つもしくは複数のシステイン残基および／または１つもしくは複
    数の非天然アミノ酸を含む配列番号２５（Ｈｅｌ３０８Ｓｓｏ）に示す配列の変種；
    （ｆ）位置Ｈ２６４、Ｅ２７２、Ｋ２７３、Ａ２７６、Ｇ５７６、Ｋ６７８およびＥ６８
    １の１つまたは複数に１つもしくは複数のシステイン残基および／または１つもしくは複
    数の非天然アミノ酸を含む配列番号２８（Ｈｅｌ３０８Ｍｆｒ）に示す配列の変種；
    （ｇ）位置Ｓ２７９、Ｌ２８９、Ｓ２９０、Ｄ２９３、Ｐ６４９、Ｋ７５３およびＲ７５
    ６の１つまたは複数に１つもしくは複数のシステイン残基および／または１つもしくは複
    数の非天然アミノ酸を含む配列番号２９（Ｈｅｌ３０８Ｍｏｋ）に示す配列の変種；
    （ｈ）位置Ｙ２７６、Ｌ２８６、Ｓ２８７、Ｄ２９０、Ｐ５７９、Ｋ６７９およびＫ６８
    ２の１つまたは複数に１つもしくは複数のシステイン残基および／または１つもしくは複
    数の非天然アミノ酸を含む配列番号３２（Ｈｅｌ３０８Ｍｉｇ）に示す配列の変種；
    （ｉ）位置Ｌ２６６、Ｓ２７６、Ｌ２７７、Ｑ２８０、Ｐ５８３、Ｋ６８９およびＤ６９
    ２の１つまたは複数に１つもしくは複数のシステイン残基および／または１つもしくは複
    数の非天然アミノ酸を含む配列番号３３（Ｈｅｌ３０８Ｔｇａ）に示す配列の変種；
    （ｊ）位置Ｌ２８７、Ｅ２９７、Ｌ２９８、Ｓ３０１、Ｓ６０４、Ｋ７１０およびＥ７１
    ３の１つまたは複数に１つもしくは複数のシステイン残基および／または１つもしくは複
    数の非天然アミノ酸を含む配列番号３４（Ｈｅｌ３０８Ｔｂａ）に示す配列の変種；
    （ｋ）位置Ｌ２８９、Ｑ２９９、Ｌ３００、Ｇ３０３、Ｎ６０６、Ｇ７１２およびＥ７１
    ５の１つまたは複数に１つもしくは複数のシステイン残基および／または１つもしくは複
    数の非天然アミノ酸を含む配列番号３７（Ｈｅｌ３０８Ｔｓｉ）に示す配列の変種；
    （ｌ）位置Ｅ２７４、Ｄ２８４、Ｅ２８５、Ｅ２８８、Ｓ５８９、Ｋ６９１およびＤ６９
    ４の１つまたは複数に１つもしくは複数のシステイン残基および／または１つもしくは複
    数の非天然アミノ酸を含む配列番号３８（Ｈｅｌ３０８Ｍｂａ）に示す配列の変種；
    （ｍ）位置Ｅ２７４、Ｄ２８４、Ｅ２８５、Ｅ２８８、Ｐ５９０、Ｋ６９２およびＥ６９
    ５の１つまたは複数に１つもしくは複数のシステイン残基および／または１つもしくは複
    数の非天然アミノ酸を含む配列番号３９（Ｈｅｌ３０８Ｍａｃ）に示す配列の変種；
    （ｎ）位置Ｈ２７２、Ｌ２８２、Ｓ２８３、Ｄ２８６、Ｐ６２１、Ｋ７２５およびＫ７２
    ８の１つまたは複数に１つもしくは複数のシステイン残基および／または１つもしくは複
    数の非天然アミノ酸を含む配列番号４０（Ｈｅｌ３０８Ｍｍａｈ）に示す配列の変種；
    （ｏ）位置Ｅ２７４、Ｄ２８４、Ｅ２８５、Ｅ２８８、Ｐ５９０、Ｋ６９２およびＥ６９
    ８の１つまたは複数に１つもしくは複数のシステイン残基および／または１つもしくは複
    数の非天然アミノ酸を含む配列番号４１（Ｈｅｌ３０８Ｍｍａｚ）に示す配列の変種；
    （ｐ）位置Ａ２６９、Ｌ２７９、Ａ２８０、Ｌ２８３、Ｈ５７５、Ｋ６７７およびＥ６８
    ０の１つまたは複数に１つもしくは複数のシステイン残基および／または１つもしくは複
    数の非天然アミノ酸を含む配列番号４２（Ｈｅｌ３０８Ｍｔｈ）に示す配列の変種；
    （ｑ）位置Ｈ２７４、Ｑ２８４、Ｅ２８５、Ｅ２８８、Ｐ５９６、Ｋ６９９およびＱ７０
    ２の１つまたは複数に１つもしくは複数のシステイン残基および／または１つもしくは複
    数の非天然アミノ酸を含む配列番号４３（Ｈｅｌ３０８Ｍｚｈ）に示す配列の変種；
    （ｒ）位置Ｇ２７４、Ｅ２８４、Ｅ２８５、Ｅ２８８、Ｔ５９０、Ｋ６９１およびＹ６９
    ４の１つまたは複数に１つもしくは複数のシステイン残基および／または１つもしくは複
    数の非天然アミノ酸を含む配列番号４４（Ｈｅｌ３０８Ｍｅｖ）に示す配列の変種；
    （ｓ）位置Ｈ２７２、Ｌ２８２、Ｓ２８３、Ｄ２８６、Ｐ６２１、Ｋ７２５およびＫ７２
    ８の１つまたは複数にシステイン残基または非天然アミノ酸を含む配列番号４５（Ｈｅｌ
    ３０８Ｍｍａ）に示す配列の変種；
    （ｔ）位置Ｇ２７７、Ｔ２８７、Ｅ２８８、Ｅ２９１、Ｄ６３４、Ｋ７３７およびＥ７４
    ０の１つまたは複数に１つもしくは複数のシステイン残基および／または１つもしくは複
    数の非天然アミノ酸を含む配列番号４６（Ｈｅｌ３０８Ｎｍａ）に示す配列の変種；
    （ｕ）位置Ａ２７０、Ｅ２７７、Ｒ２７８、Ｅ２８１、Ｓ５８３、Ｇ６８５およびＥ６８
    ８の１つまたは複数に１つもしくは複数のシステイン残基および／または１つもしくは複
    数の非天然アミノ酸を含む配列番号４７（Ｈｅｌ３０８Ｍｂｏ）に示す配列の変種；
    （ｖ）位置Ｑ２６４、Ｆ２６７、Ｅ２６８、Ｅ２７１、Ｐ５５９、Ｋ６６３およびＫ６６
    ６の１つまたは複数に１つもしくは複数のシステイン残基および／または１つもしくは複
    数の非天然アミノ酸を含む配列番号４８（Ｈｅｌ３０８Ｆａｃ）に示す配列の変種；
    （ｗ）位置Ｒ２７５、Ｌ２８５、Ｓ２８６、Ｅ２８９、Ｐ５７６、Ｋ６７６およびＫ６７
    ９の１つまたは複数に１つもしくは複数のシステイン残基および／または１つもしくは複
    数の非天然アミノ酸を含む配列番号４９（Ｈｅｌ３０８Ｍｆｅ）に示す配列の変種；
    （ｘ）位置Ｉ２７３、Ｌ２８３、Ｓ２８４、Ｅ２８７、Ｐ５７４、Ｋ６７４およびＫ６７
    ７の１つまたは複数に１つもしくは複数のシステイン残基および／または１つもしくは複
    数の非天然アミノ酸を含む配列番号５０（Ｈｅｌ３０８Ｍｊａ）に示す配列の変種；
    （ｙ）位置Ｒ２５７、Ｌ２６７、Ｓ２６８、Ｄ２７１、Ｐ５５４、Ｋ６５１およびＫ６５
    ４の１つまたは複数に１つもしくは複数のシステイン残基および／または１つもしくは複
    数の非天然アミノ酸を含む配列番号５１（Ｈｅｌ３０８Ｍｉｎ）に示す配列の変種；
    （ｚ）位置Ｓ２６９、Ｑ２７７、Ｅ２７８、Ｒ２８１、Ｓ５８３、Ｇ６８５およびＲ６８
    ８の１つまたは複数にシステイン残基または非天然アミノ酸を含む配列番号５２（Ｈｅｌ
    ３０８Ｍｈｕ）に示す配列の変種；
    （ａａ）位置Ｋ２６８、Ｋ２７７、Ａ２７８、Ｅ２８１、Ｄ５７５、Ｒ６７７およびＥ６
    ８０の１つまたは複数に１つもしくは複数のシステイン残基および／または１つもしくは
    複数の非天然アミノ酸を含む配列番号５３（Ｈｅｌ３０８Ａｆｕ）に示す配列の変種；
    （ａｂ）位置Ｄ２７７、Ｄ２８７、Ｄ２８８、Ｄ２９１、Ｄ６２６、Ｋ７２９およびＥ７
    ３２の１つまたは複数に１つもしくは複数のシステイン残基および／または１つもしくは
    複数の非天然アミノ酸を含む配列番号５４（Ｈｅｌ３０８Ｈｔｕ）に示す配列の変種；
    （ａｃ）位置Ｄ２７６、Ｄ２８６、Ｑ２８７、Ｄ２９０、Ｄ５９５、Ｋ７０７およびＥ７
    １０の１つまたは複数に１つもしくは複数のシステイン残基および／または１つもしくは
    複数の非天然アミノ酸を含む配列番号５５（Ｈｅｌ３０８Ｈｐａ）に示す配列の変種；
    （ａｄ）位置Ｅ２８６、Ｅ２９６、Ｉ２９７、Ｖ３００、Ｄ６３３、Ａ７３７およびＥ７
    ４０の１つまたは複数に１つもしくは複数のシステイン残基および／または１つもしくは
    複数の非天然アミノ酸を含む配列番号５８（Ｈｅｌ３０８Ｈｓｐ（ｓｋｉ２様ヘリカーゼ
    ））に示す配列の変種；または
    （ａｅ）Ｄ２７４、Ｅ２８４、Ｅ２８５、Ｓ２８８、Ｓ６１５、Ｋ７１７およびＹ７２０
    の１つまたは複数に１つもしくは複数のシステイン残基および／または１つもしくは複数
    の非天然アミノ酸を含む配列番号１０に示す配列の変種
    を含む、請求項２６に記載のヘリカーゼ。
29. １つまたは複数の非天然アミノ酸が、４−アジド−Ｌ−フェニルアラニン（Ｆａｚ）、
    ４−アセチル−Ｌ−フェニルアラニン、３−アセチル−Ｌ−フェニルアラニン、４−アセ
    トアセチル−Ｌ−フェニルアラニン、Ｏ−アリル−Ｌ−チロシン、３−（フェニルセラニ
    ル）−Ｌ−アラニン、Ｏ−２−プロピン−１−イル−Ｌ−チロシン、４−（ジヒドロキシ
    ボリル）−Ｌ−フェニルアラニン、４−［（エチルスルファニル）カルボニル］−Ｌ−フ
    ェニルアラニン、（２Ｓ）−２−アミノ−３−｛４−［（プロパン−２−イルスルファニ
    ル）カルボニル］フェニル｝プロパン酸、（２Ｓ）−２−アミノ−３−｛４−［（２−ア
    ミノ−３−スルファニルプロパノイル）アミノ］フェニル｝プロパン酸、Ｏ−メチル−Ｌ
    −チロシン、４−アミノ−Ｌ−フェニルアラニン、４−シアノ−Ｌ−フェニルアラニン、
    ３−シアノ−Ｌ−フェニルアラニン、４−フルオロ−Ｌ−フェニルアラニン、４−ヨード
    −Ｌ−フェニルアラニン、４−ブロモ−Ｌ−フェニルアラニン、Ｏ−（トリフルオロメチ
    ル）チロシン、４−ニトロ−Ｌ−フェニルアラニン、３−ヒドロキシ−Ｌ−チロシン、３
    −アミノ−Ｌ−チロシン、３−ヨード−Ｌ−チロシン、４−イソプロピル−Ｌ−フェニル
    アラニン、３−（２−ナフチル）−Ｌ−アラニン、４−フェニル−Ｌ−フェニルアラニン
    、（２Ｓ）−２−アミノ−３−（ナフタレン−２−イルアミノ）プロパン酸、６−（メチ
    ルスルファニル）ノルロイシン、６−オキソ−Ｌ−リシン、Ｄ−チロシン、（２Ｒ）−２
    −ヒドロキシ−３−（４−ヒドロキシフェニル）プロパン酸、（２Ｒ）−２−アンモニオ
    オクタノエート３−（２，２’−ビピリジン−５−イル）−Ｄ−アラニン、２−アミノ−
    ３−（８−ヒドロキシ−３−キノリル）プロパン酸、４−ベンゾイル−Ｌ−フェニルアラ
    ニン、Ｓ−（２−ニトロベンジル）システイン、（２Ｒ）−２−アミノ−３−［（２−ニ
    トロベンジル）スルファニル］プロパン酸、（２Ｓ）−２−アミノ−３−［（２−ニトロ
    ベンジル）オキシ］プロパン酸、Ｏ−（４，５−ジメトキシ−２−ニトロベンジル）−Ｌ
    −セリン、（２Ｓ）−２−アミノ−６−（｛［（２−ニトロベンジル）オキシ］カルボニ
    ル｝アミノ）ヘキサン酸、Ｏ−（２−ニトロベンジル）−Ｌ−チロシン、２−ニトロフェ
    ニルアラニン、４−［（Ｅ）−フェニルジアゼニル］−Ｌ−フェニルアラニン、４−［３
    −（トリフルオロメチル）−３Ｈ−ジアジレン−３−イル］−Ｄ−フェニルアラニン、２
    −アミノ−３−［［５−（ジメチルアミノ）−１−ナフチル］スルホニルアミノ］プロパ
    ン酸、（２Ｓ）−２−アミノ−４−（７−ヒドロキシ−２−オキソ−２Ｈ−クロメン−４
    −イル）ブタン酸、（２Ｓ）−３−［（６−アセチルナフタレン−２−イル）アミノ］−
    ２−アミノプロパン酸、４−（カルボキシメチル）フェニルアラニン、３−ニトロ−Ｌ−
    チロシン、Ｏ−スルホ−Ｌ−チロシン、（２Ｒ）−６−アセトアミド−２−アンモニオヘ
    キサノエート、１−メチルヒスチジン、２−アミノノナン酸、２−アミノデカン酸、Ｌ−
    ホモシステイン、５−スルファニルノルバリン、６−スルファニル−Ｌ−ノルロイシン、
    ５−（メチルスルファニル）−Ｌ−ノルバリン、Ｎ^６−｛［（２Ｒ，３Ｒ）−３−メチル
    −３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピロール−２−イル］カルボニル｝−Ｌ−リシン、Ｎ^６−［
    （ベンジルオキシ）カルボニル］リシン、（２Ｓ）−２−アミノ−６−［（シクロペンチ
    ルカルボニル）アミノ］ヘキサン酸、Ｎ^６−［（シクロペンチルオキシ）カルボニル］−
    Ｌ−リシン、（２Ｓ）−２−アミノ−６−｛［（２Ｒ）−テトラヒドロフラン−２−イル
    カルボニル］アミノ｝ヘキサン酸、（２Ｓ）−２−アミノ−８−［（２Ｒ，３Ｓ）−３−
    エチニルテトラヒドロフラン−２−イル］−８−オキソオクタン酸、Ｎ^６−（ｔｅｒｔ−
    ブトキシカルボニル）−Ｌ−リシン、（２Ｓ）−２−ヒドロキシ−６−（｛［（２−メチ
    ル−２−プロパニル）オキシ］カルボニル｝アミノ）ヘキサン酸、Ｎ^６−［（アリルオキ
    シ）カルボニル］リシン、（２Ｓ）−２−アミノ−６−（｛［（２−アジドベンジル）オ
    キシ］カルボニル｝アミノ）ヘキサン酸、Ｎ^６−Ｌ−プロリル−Ｌ−リシン、（２Ｓ）−
    ２−アミノ−６−｛［（プロパ−２−イン−１−イルオキシ）カルボニル］アミノ｝ヘキ
    サン酸およびＮ^６−［（２−アジドエトキシ）カルボニル］−Ｌ−リシンから選択される
    、請求項２３から２８のいずれか一項に記載のヘリカーゼ。
30. 請求項１から２９のいずれか一項に記載のヘリカーゼおよび追加的ポリヌクレオチド結
    合成分を含む構築物であって、ヘリカーゼがポリヌクレオチド結合成分に付着しており、
    ポリヌクレオチドの移動を制御する能力を有する構築物。
31. ポリヌクレオチドの移動を制御する方法であって、ポリヌクレオチドを請求項１から２
    ９のいずれか一項に記載のヘリカーゼまたは請求項３０に記載の構築物と接触させ、それ
    によりポリヌクレオチドの移動を制御するステップを含む方法。
32. 標的ポリヌクレオチドを特性決定する方法であって
    （ａ）標的ポリヌクレオチドを膜貫通ポアおよび請求項１から２９のいずれか一項に記載
    のヘリカーゼまたは請求項３０に記載の構築物と、ヘリカーゼまたは構築物がポアを通る
    標的ポリヌクレオチドの移動を制御するように接触させるステップ；ならびに
    （ｂ）ポリヌクレオチドがポアに関して移動するときに１つまたは複数の測定値を取るス
    テップであって、測定値が標的ポリヌクレオチドの特性の１つまたは複数を示し、それに
    より標的ポリヌクレオチドを特性決定するステップ
    を含む方法。
33. １つまたは複数の特性が、（ｉ）標的ポリヌクレオチドの長さ、（ｉｉ）標的ポリヌク
    レオチドの同一性、（ｉｉｉ）標的ポリヌクレオチドの配列、（ｉｖ）標的ポリヌクレオ
    チドの二次構造および（ｖ）標的ポリヌクレオチドが修飾されているか否か、から選択さ
    れる、請求項３２に記載の方法。
34. 標的ポリヌクレオチドがメチル化によって、酸化によって、損傷によって、１つまたは
    複数のタンパク質でまたは１つまたは複数の標識、タグもしくはスペーサーで修飾されて
    いる、請求項３３に記載の方法。
35. 標的ポリヌクレオチドの１つまたは複数の特性が電気的測定および／または光学的測定
    によって測定される、請求項３２から３４のいずれか一項に記載の方法。
36. 電気的測定が電流測定、インピーダンス測定、トンネル測定または電界効果トランジス
    タ（ＦＥＴ）測定である、請求項３５に記載の方法。
37. （ａ）標的ポリヌクレオチドを膜貫通ポアおよび請求項１から２９のいずれか一項に記
    載のヘリカーゼまたは請求項３０に記載の構築物に接触させて、ヘリカーゼまたは構築物
    がポアを通る標的ポリヌクレオチドの移動を制御するようにするステップ；および
    （ｂ）ポリヌクレオチドがポアに関して移動するときにポアを通過する電流を測定するス
    テップであって、電流が標的ポリヌクレオチドの１つまたは複数の特性を示し、それによ
    り標的ポリヌクレオチドを特性決定するステップ
    を含む、請求項３５に記載の方法。
38. ポアに電圧を印加して、ポアとヘリカーゼとの複合体を形成するステップをさらに含む
    、請求項３２から３７のいずれか一項に記載の方法。
39. ポリヌクレオチドの少なくとも一部が２本鎖である、請求項３２から３８のいずれか一
    項に記載の方法。
40. ポアが、膜貫通タンパク質ポアまたはソリッドステートポアである、請求項３２から３
    ９のいずれか一項に記載の方法。
41. 膜貫通タンパク質ポアが、ヘモリジン（hemolysin）、ロイコシジン（leukocidin）、
    スメグマ菌（Mycobacterium smegmatis）ポリン（porin）Ａ（ＭｓｐＡ）、ＭｓｐＢ、Ｍ
    ｓｐＣ、ＭｓｐＤ、外膜ポリン（porin）Ｆ（ＯｍｐＦ）、外膜ポリン（porin）Ｇ（Ｏｍ
    ｐＧ）、外膜ホスホリパーゼＡ、ナイセリア（Neisseria）オートトランスポーターリポ
    タンパク質（ＮａｌＰ）およびＷＺＡ由来である、請求項４０に記載の方法。
42. 膜貫通タンパク質が、（ａ）配列番号２に示す８個の同一のサブユニットから形成され
    ている、または（ｂ）８個のサブユニットの１つもしくは複数が配列全体にわたるアミノ
    酸同一性に基づいて配列番号２に対して少なくとも５０％の相同性を有し、ポア活性を保
    持しているその変種である、請求項４１に記載の方法。
43. 膜貫通タンパク質が、（ａ）配列番号４に示す７個の同一サブユニットから形成されて
    いるα−ヘモリジンである、または（ｂ）７個のサブユニットの１つまたは複数が配列全
    体にわたるアミノ酸同一性に基づいて配列番号４に対して少なくとも５０％の相同性を有
    し、ポア活性を保持しているその変種である、請求項４１に記載の方法。
44. （ａ）ポアと、（ｂ）請求項１から２９のいずれか一項に記載のヘリカーゼまたは請求
    項３０に記載の構築物との複合体を形成し、それにより標的ポリヌクレオチドを特性決定
    するためのセンサーを形成するステップを含む、標的ポリヌクレオチドを特性決定するた
    めのセンサーの形成方法。
45. 複合体が、（ａ）標的ポリヌクレオチドの存在下でポアとヘリカーゼまたは構築物とを
    接触させるステップおよび（ａ）ポアに電位を印加するステップによって形成される、請
    求項４４に記載の方法。
46. 電位が、電圧電位または化学電位である、請求項４５に記載の方法。
47. 複合体が、ポアをヘリカーゼまたは構築物に共有結合的に付着するステップによって形
    成される、請求項４５に記載の方法。
48. （ａ）ポアと、（ｂ）請求項１から２９のいずれか一項に記載のヘリカーゼまたは請求
    項３０に記載の構築物との間の複合体を含む、標的ポリヌクレオチドを特性決定するため
    のセンサー。
49. ポアを通る標的ポリヌクレオチドの移動を制御するための請求項１から２９のいずれか
    一項に記載のヘリカーゼまたは請求項３０に記載の構築物の使用。
50. （ａ）ポアおよび（ｂ）請求項１から２９のいずれか一項に記載のヘリカーゼまたは請
    求項３０に記載の構築物を含む、標的ポリヌクレオチドを特性決定するためのキット。
51. 両親媒性膜を含むチップをさらに含む、請求項５０に記載のキット。
52. （ａ）複数のポア、および（ｂ）請求項１から２９のいずれか一項に記載の複数のヘリ
    カーゼまたは請求項３０に記載の複数の構築物を含む、試料中の標的ポリヌクレオチドを
    特性決定するための装置。
53. 複数のポアを支持でき、ポアおよび構築物を使用してポリヌクレオチド特性決定を実施
    するために作動可能であるセンサーデバイス；ならびに
    特性決定を実施するための材料を保持するための少なくとも１つのリザーバー
    を含む、請求項５２に記載の装置。
54. 複数のポアを支持でき、前記ポアおよびヘリカーゼまたは構築物を用いてポリヌクレオ
    チド特性決定を実施するために作動可能であるセンサーデバイス；
    特性決定を実施するための材料を保持するための少なくとも１つのリザーバー；
    前記少なくとも１つのリザーバーから前記センサーデバイスに材料を制御可能に供給する
    ように構成された流体系；および
    各試料を受けるための１つまたは複数の容器
    を含み、前記流体系が１つまたは複数の容器から前記センサーデバイスに前記試料を選択
    的に供給するように構成されている、請求項５２または５３に記載の装置。
55. 請求項１から２２または２４のいずれか一項に記載のヘリカーゼを産生する方法であっ
    て、
    （ａ）１つまたは複数の単量体から形成され、それを通ってポリヌクレオチドがヘリカー
    ゼから解離できる開口部を含むポリヌクレオチド結合ドメインを含むヘリカーゼを提供す
    るステップ、ならびに
    （ｂ）ヘリカーゼの同じ単量体内の２つ以上の部分が繋がれて開口部のサイズを低減する
    ようにヘリカーゼを修飾し、それにより請求項１から２２または２４のいずれか一項に記
    載のヘリカーゼを産生するステップ
    を含む方法。
56. 請求項２３に記載のヘリカーゼを産生する方法であって、
    （ａ）Ｈｅｌ３０８ヘリカーゼを提供するステップ；ならびに
    （ｂ）Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（配列番号１０）中のＤ２７２、Ｎ２７３、Ｄ２７４、Ｇ２８
    １、Ｅ２８４、Ｅ２８５、Ｅ２８７、Ｓ２８８、Ｔ２８９、Ｇ２９０、Ｅ２９１、Ｄ２９
    ３、Ｔ２９４、Ｎ３００、Ｒ３０３、Ｋ３０４、Ｎ３１４、Ｓ３１５、Ｎ３１６、Ｈ３１
    ７、Ｒ３１８、Ｋ３１９、Ｌ３２０、Ｅ３２２、Ｒ３２６、Ｎ３２８、Ｓ６１５、Ｋ７１
    ７、Ｙ７２０、Ｎ７２１およびＳ７２４に対応する位置の１つまたは複数に１つもしくは
    複数のシステイン残基および／または１つもしくは複数の非天然アミノ酸を導入し、それ
    により請求項２３に記載のヘリカーゼを産生するステップ
    を含む方法。
57. （ｃ）得られたヘリカーゼがポリヌクレオチドの移動を制御できるかどうかを決定する
    ステップをさらに含む、請求項５５または５６に記載の方法。
58. 請求項３０に記載の構築物を産生する方法であって、請求項１から２９のいずれか一項
    に記載のヘリカーゼを追加的ポリヌクレオチド結合成分に付着させ、それにより本発明の
    構築物を産生するステップを含む方法。
59. 得られた構築物がポリヌクレオチドの移動を制御できるかどうかを決定するステップを
    さらに含む、請求項５８に記載の方法。