JP2019109340A - 画像取得装置及び画像取得方法 - Google Patents

Abstract

【課題】光学調整を容易に行うことができる画像取得装置及び画像取得方法を提供する。【解決手段】画像取得装置は、ステージ２と、ステージ駆動部５５と、ＡＦ用照射光学系２０と、スキャン用照射光学系１０と、ビームスプリッタ７と、瞳分割素子３３と、結像レンズ３５と、ＡＦ用撮像素子３０と、画像処理部６１と、駆動制御部６２と、結像レンズ４１と、スキャン用撮像素子４０と、を備え、ＡＦ用照射光学系２０による第１の照射光の照射範囲は、スキャン用撮像素子４０によって撮像される第２の撮像領域を含み、第２の撮像領域は、スキャン方向において、焦点制御用の第１の撮像領域よりも後方に位置し、駆動制御部６２は、スキャン用撮像素子４０による第２の撮像領域の撮像前に、焦点情報に基づいて対物レンズ３の焦点位置を制御する。【選択図】図１

Description

本発明は、画像取得装置及び画像取得方法に関する。

画像取得装置として、試料の撮像領域を予め複数の領域に分割し、各分割領域を高倍率で撮像した後、これらを合成するバーチャル顕微鏡装置がある。例えば、特許文献１に記載された画像取得装置は、第１の撮像手段が撮像する領域よりも手前の領域を撮像する第２の撮像手段と、第２の撮像手段で撮像された画像に基づいて、第１の撮像手段の撮像位置での対物レンズの合焦位置を調整する自動合焦制御手段と、分割領域間の距離と試料の移動速度とに応じて、分割領域が第２の撮像手段の撮像位置から第１の撮像手段の撮像位置まで移動するタイミングと第２の撮像手段で撮像された分割領域の結像位置を第１の撮像手段の撮像面に位置させるタイミングとを揃えるタイミング制御手段と、を備えている。

特開２０１１−０８１２１１号公報

上記の画像取得装置は、対物レンズからの光を第１の撮像手段に向かう第１の光路と、第２の撮像手段に向かう第２の光路とに分岐する光路分岐手段を有している。そして、光路分岐手段の光学面が所定の角度で傾斜していることにより、第２の撮像手段で撮像される領域が第１の撮像手段で撮像される領域に対してスキャン方向の手前側となるように調整されている。これにより、焦点位置の画像がスキャンに先行して取得されている。

しかしながら、このような構成では、光路分岐手段を形成する光学面の調整が困難である。特に、スキャン方向が可変である場合には、スキャン方向が変更されるたびに光学面の調整を行う必要があり、光学調整がより困難となるおそれがある。また、上記の画像取得装置は、第２の光路を第３の光路及び第４の光路に分岐する光路差光学系を有している。そして、第２の撮像手段は、光路差光学系を経た光を撮像する。しかし、光路差光学系がハーフミラー及びミラーで構成されているので、光路差光学系を経た光は第２の撮像手段の撮像面に収まり難いと考えられる。

本発明の一側面は、光学調整を容易に行うことができる画像取得装置及び画像取得方法を提供することを目的とする。

一側面の画像取得装置は、対物レンズに対峙するように試料が載置されるステージと、対物レンズに対するステージの相対的な位置を対物レンズの光軸に交差するスキャン方向に移動させる駆動部と、試料に照射される第１の照射光を出射する第１の照射光学系と、試料に照射される第２の照射光を出射する第２の照射光学系と、対物レンズによって導光された第１の照射光及び第２の照射光を焦点制御用の第１の光路と画像取得用の第２の光路とに分岐するビームスプリッタと、第１の光路における試料の光像を第１の光像と第２の光像とに分割する瞳分割素子と、第１の光像と第２の光像とをそれぞれ結像する第１の結像レンズと、複数の画素が２次元に配列された撮像面を有し、第１の結像レンズによって結像された第１の光像と第２の光像の少なくとも一部をサブアレイ読み出しして、第１の画像データを取得する第１の撮像素子と、第１の画像データを解析し、試料の第１の撮像領域における焦点位置を求める解析部と、解析部による解析結果に基づいて対物レンズの焦点位置を制御する焦点制御部と、第２の光路における試料の光像を結像する第２の結像レンズと、第２の結像レンズによって結像された試料の光像を撮像し、試料の画像を形成するための第２の画像データを取得する第２の撮像素子と、を備え、第１の照射光学系による第１の照射光の照射範囲は、第２の撮像素子によって撮像される第２の撮像領域を含んでおり、第２の撮像領域は、スキャン方向において第１の撮像素子によってサブアレイ読み出しされる第１の撮像領域よりも後方に位置し、焦点制御部は、第１の撮像素子による第２の撮像領域の撮像前に、解析結果に基づいて対物レンズの焦点位置を制御する。

このような画像取得装置では、対物レンズによって導光された試料の光像が、ビームスプリッタによって、第１の光路と第２の光路とに分岐されている。第１の光路は焦点制御用として利用され得る。第２の光路は画像取得用として利用され得る。第１の光路では、第１の照射光が試料に照射されたときの光像が第１の撮像素子によって撮像される。この光像は、瞳分割素子によって第１の光像と第２の光像とに分割されている。第１の撮像素子では、第１の結像レンズによって結像された第１の光像と第２の光像の一部がサブアレイ読み出しによって撮像され、第１の撮像領域における第１の画像データが取得される。解析部は、第１の画像データを解析することによって、第１の撮像領域における対物レンズの焦点位置を求める。一方、第２の光路では、第２の照射光が試料に照射されたときの光像が第２の撮像素子によって撮像される。ここで、第２の撮像素子によって撮像される第２の撮像領域は、第１の撮像素子のサブアレイ読み出しによって撮像される第１の撮像領域よりもスキャン方向において後方である。そのため、第１の撮像領域であった領域は、ステージの移動に伴って第２の撮像領域まで移動し得る。第２の撮像領域が第１の撮像領域まで移動しているときに、解析部の解析結果に基づいて対物レンズの焦点位置が制御されていることによって、適切な焦点位置で第２の画像データが取得される。上述の通り、画像取得装置では、サブアレイ読み出しによって第１の撮像領域の画像を取得している。第１の照射光の照射範囲が第２の撮像領域を含むように広く設定されていることによって、第１の照射光の照射範囲に第２の撮像領域が含まれた状態で第１の撮像領域の画像データを取得することができる。したがって、例えば第１の照射光学系と第２照射光学系との光軸を一致させることができ、光学調整を容易に行うことができる。

また、瞳分割素子は、瞳分割プリズムと、瞳分割プリズムの屈折率とは異なる屈折率を有する色消しプリズムと、を含んでいてよい。この構成では、瞳分割プリズムで発生する色収差を補正することができる。

また、第１の結像レンズは、第２の結像レンズの倍率よりも小さい倍率を有してもよい。この構成では、第１の結像レンズによって結像された光像の範囲を第２の結像レンズによって結像された光像の範囲よりも大きくし易い。

また、第２の光路における対物レンズの瞳の位置に第１の光像及び第２の光像をそれぞれ通過させるマスクを更に有する。この構成では、対物レンズの開口数（ＮＡ）を制限することができる。

また、第２の光路において、ビームスプリッタと瞳分割素子との間に配置された対物レンズの瞳をリレーするリレー光学系を更に備えてもよい。この場合、マスクは、リレー光学系によってリレーされた対物レンズの瞳の位置に配置されてもよい。この構成でも、対物レンズの開口数を制限することができる。

また、リレー光学系における一次結像面に配置される視野絞りを更に備えてもよい。この構成では、第１の結像レンズによって結像された第１の光像と第２の光像とが互いに干渉することが抑制される。

また、第１の照射光及び第２の照射光は、互いに異なるタイミングで照射される瞬間光であってよい。この構成では、第２の照射光が照射された際の光像に対する第２の照射光の影響を排除できる。

また、第１の照射光学系は、対物レンズの瞳と共役な位置に暗視野用マスクを更に備えてもよい。この構成では、例えば、蛍光試料の観察を好適に行うことができる。

また、一側面の画像取得方法は、対物レンズに対峙した試料に所定の照射範囲で第１の照射光を照射する第１の照射ステップと、対物レンズによって導光された試料の光像を瞳分割によって第１の光像と第２の光像とに分割する瞳分割ステップと、複数の画素が２次元に配列された撮像面を有する第１の撮像素子を用いて、第１の光像と第２の光像とのそれぞれの少なくとも一部をサブアレイ読み出しして、第１の画像データを取得する第１の画像取得ステップと、第１の画像データを解析し、サブアレイ読み出しによって撮像される第１の撮像領域における対物レンズの焦点情報を求める解析ステップと、解析ステップによって求められた焦点情報に基づいて、対物レンズの焦点位置を制御する焦点制御ステップと、第２の撮像素子を用いて、第１の照射光とは異なる第２の照射光が照射された試料の光像を撮像し、第２の画像データを取得する第２の画像取得ステップと、を備え、所定の照射範囲は、第２の撮像素子によって撮像される第２の撮像領域を含んでおり、少なくとも第１の画像取得ステップと第２の画像取得ステップとの間には、スキャン動作によって第２の撮像領域が第１の撮像領域まで移動しており、解析ステップ及び焦点制御ステップが行われている。

このような画像取得方法では、サブアレイ読み出しによって第１の撮像領域の画像を取得している。第１の照射光の照射範囲が第２の撮像領域を含むように広く設定されていることによって、第１の照射光の照射範囲に第２の撮像領域が含まれた状態で第１の撮像領域の画像データを取得することができる。したがって、例えば第１の照射光と第２照射光との光軸を一致させることができ、光学調整を容易に行うことができる。

また、第１の画像取得ステップでは、分割された第１の光像及び第２の光像の色収差を補正してもよい。

また、第１の画像取得ステップでは、第２の画像取得ステップで取得される第２の画像データの倍率よりも小さい倍率で第１の画像データを取得してもよい。この構成では、第１の照射光による照射範囲を撮像視野範囲よりも大きくし易い。

また、第１の画像取得ステップでは、対物レンズの瞳の位置に配置されたマスクによって第１の光像及び第２の光像を通過させてもよい。この構成では、対物レンズの開口数を制限することができる。

また、第１の画像取得ステップでは、第１の光像及び第２の光像の視野が視野絞りによって制限されてもよい。この構成では、第１の光像と第２の光像とが互いに干渉することが抑制される。

また、第２の画像取得ステップでは、第１の照射光の照射が停止されていてもよい。この場合、第１の照射光及び第２の照射光は、いずれも瞬間光であってよい。この構成では、第２の照射光が照射された際の光像に対する第２の照射光の影響を排除できる。

また、第１の照射ステップでは、第１の照射光の一部を暗視野用マスクによって遮ってもよい。この構成では、例えば、蛍光試料の観察を好適に行うことができる。

本発明の一側面によれば、光学調整を容易に行うことができる画像取得装置及び画像取得方法を提供することができる。

一実施形態に係る画像取得装置の構成を示す図である。 視野絞りの開口の形状を示す図である。 マスクの形状を示す図である。 瞳分割素子を示す断面図である。 フォーカシング用光学系の構成を示す図である。 画像取得装置によるレーンスキャンを説明するための図である。 撮像視野領域と照射光の照射範囲との関係を説明する図である。 サブアレイ領域と第１の光像及び第２の光像との関係を説明する図である。 画像取得方法を示すフローチャートである。 画像取得装置の動作を説明するためのタイミングチャートである。 他の実施形態に係る画像取得装置の構成を示す図である。 暗視野用マスクを示す図である。

以下、本発明に係る実施の形態について図面を参照しながら具体的に説明する。便宜上、実質的に同一の要素には同一の符号を付し、その説明を省略する場合がある。

図１は、本実施形態に係る画像取得装置の構成を示す図である。図１に示すように、画像取得装置１は、試料Ｓが保持されるステージ２と、ステージ２上の試料Ｓと対峙するように配置された対物レンズ３と、試料Ｓに向けて光を照射する照射光学系５と、対物レンズ３によって導光された光像を撮像する撮像素子６とを備えている。

ステージ２には、対物レンズ３に対峙するように試料Ｓが載置される。本実施形態では、試料Ｓは、組織細胞などの生体サンプルであってよい。試料Ｓは、例えばスライドガラスに密封された状態でステージ２に載置される。対物レンズ３に対するステージ２の相対的な位置は、対物レンズ３の光軸に交差するスキャン方向に移動可能となっている。対物レンズ３の倍率は、例えば、２０倍、４０倍、１００倍等の高倍率であってよい。

照射光学系５は、画像を撮像するためのスキャン用照射光学系（第２の照射光学系）１０と、オートフォーカス（ＡＦ）を制御するためのＡＦ用照射光学系（第１の照射光学系）２０とを有する。スキャン用照射光学系１０は、スキャン用の光源１１から出射された光（第２の照射光）Ｌ１をステージ２に配置された試料Ｓに照射する。光源１１は、照明光として白色光を出力する光源であり、ステージ２の底面側に配置されている。光源１１としては、例えばレーザダイオード（ＬＤ）、発光ダイオード（ＬＥＤ）、スーパールミネッセントダイオード（ＳＬＤ）、キセノンフラッシュランプといったフラッシュランプ方式光源などが用いられる。

スキャン用照射光学系１０は、コレクタレンズ１２、一対のリレーレンズ１３，１４、及びコンデンサレンズ１５を有している。コレクタレンズ１２とリレーレンズ１３との間には、視野絞り１６が配置されている。一対のリレーレンズ１３，１４の間には、ビームスプリッタ１７及びミラー１８が配置されている。スキャン用の光源１１から出射された光Ｌ１は、コレクタレンズ１２に入力される。一対のリレーレンズ１３，１４は、コレクタレンズ１２から出力された光Ｌ１をコンデンサレンズ１５にリレーする。コンデンサレンズ１５は、スキャン用の光源１１から出射された光Ｌ１を試料Ｓに照射する。スキャン用照射光学系１０の開口数（ＮＡ）は、変更可能となっている。

ＡＦ用照射光学系２０は、ＡＦ用の光源２１から出射された光（第１の照射光）Ｌ２をステージ２に配置された試料Ｓに照射する。ＡＦ用の光源２１は、ステージ２の底面側に配置されている。光源２１としては、例えばレーザダイオード（ＬＤ）、発光ダイオード（ＬＥＤ）、スーパールミネッセントダイオード（ＳＬＤ）、キセノンフラッシュランプといったフラッシュランプ方式光源などが用いられる。照明光は、白色光であってよい。また、照射光は、近赤外光のような赤外光であってもよい。光源１１及び光源２１は、後述する駆動制御部（制御部）６２からの制御信号を受けて照明光を出力する。

ＡＦ用照射光学系２０は、コレクタレンズ２２、一対のリレーレンズ２３，１４、及びコンデンサレンズ１５を有している。コレクタレンズ２２とリレーレンズ２３との間には、視野絞り２６が配置されている。ＡＦ用照射光学系２０の視野絞り２６及びスキャン用照射光学系１０の視野絞り１６によって、ＡＦ用照射光学系２０の照射範囲は、スキャン用照射光学系１０による照射範囲を含み、より広い範囲を照明できるように設定されている。一対のリレーレンズ２３，１４の間には、ビームスプリッタ１７及びミラー１８が配置されている。このビームスプリッタ１７及びミラー１８と後段のリレーレンズ１４及びコンデンサレンズ１５とは、スキャン用照射光学系１０と共通している。すなわち、ＡＦ用の光源２１からコレクタレンズ２２に入力されて前段のリレーレンズ２３から出力された光Ｌ２は、ビームスプリッタ１７によって反射され、後段のリレーレンズ１４に入力される。ＡＦ用の光源２１から出射された光Ｌ２は、最終的にスキャン用照射光学系１０と同じ光路を辿り、コンデンサレンズ１５から出力される。すなわち、スキャン用照射光学系１０とＡＦ用照射光学系２０とは、ビームスプリッタ１７の後段において同じ光軸を有している。

撮像素子６は、対物レンズ３によって導光された試料Ｓの光像を撮像する。なお、試料Ｓの光像とは、明視野照明の場合は透過光による像、暗視野照明の場合は散乱光による像、発光観察（蛍光観察）の場合は発光（蛍光）による像である。撮像素子６は、複数の画素列を有する撮像素子である。撮像素子６としては、例えばＣＣＤイメージセンサやＣＭＯＳイメージセンサが挙げられる。

本実施形態では、撮像素子６として、ＡＦ用撮像素子（第１の撮像素子）３０と、スキャン用撮像素子（第２の撮像素子）４０とが用いられる。ＡＦ用撮像素子３０は、ＡＦ用の光源２１からの光が試料Ｓに照射されたときの試料Ｓの光像を撮像する。スキャン用撮像素子４０は、スキャン用の光源１１からの光が試料Ｓに照射されたときの試料Ｓの光像を撮像する。画像取得装置１では、図示されるように、対物レンズ３と撮像素子６との間にビームスプリッタ７が配置されている。このビームスプリッタ７によって、対物レンズ３を導光された試料Ｓの光像（すなわち光Ｌ１、Ｌ２）は、ＡＦ用光路（第１の光路）Ｋ１とスキャン用光路（第２の光路）Ｋ２とに分岐する。ビームスプリッタ７は、例えば、ハーフミラー、ダイクロイックミラー、偏光ビームスプリッタ等によって構成されている。

スキャン用撮像素子４０は、スキャン用光路Ｋ２において、スキャン用の結像レンズ（第２の結像レンズ）４１によって結像された試料Ｓの光像を撮像し、画像データ（第２の画像データ）を取得する。すなわち、結像レンズ４１は、対物レンズ３と光学的に結合しており、ビームスプリッタ７で分割されたスキャン用光路Ｋ２の光像をスキャン用撮像素子４０に結像する。

ＡＦ用光路Ｋ１には、ビームスプリッタ７の後段に、リレー光学系３１、マスク３２、瞳分割素子３３、結像レンズ（第１の結像レンズ）３５及びＡＦ用撮像素子３０が配置されている。図５は、ＡＦ用光路の構成を示す図である。リレー光学系３１は、ビームスプリッタ７と瞳分割素子３３との間に配置されており、対物レンズ３の瞳をリレーする。リレー光学系３１は、一対のリレーレンズ３１Ａ，３１Ｂによって構成されている。リレー光学系３１における一次結像面には、視野絞り３６が配置されている。図２は、視野絞り３６の形状の一例を示す図である。例えば、視野絞り３６は、円形と矩形とを組み合わせた形状であってよい（図２の（ａ）参照）。換言すると、視野絞り３６は、矩形の対向する一対の辺３６ａ，３６ｂが矩形の対角線を直径とする円弧となっている形状であってよい。また、視野絞り３６は、図２の（ｂ）に示すように、矩形であってもよい。

マスク３２は、リレー光学系３１によってリレーされた対物レンズ３の瞳の位置に配置されており、対物レンズ３のＮＡ成分を制限する。図示例では、マスク３２は、リレー光学系３１によってリレーされた対物レンズ３の瞳の位置に配置されている。図３は、マスク３２の形状を示す図である。図３に示されるように、本実施形態では、マスク３２は、第１の光像Ｐ１を透過させる開口３２ａと、第２の光像Ｐ２を透過させる開口３２ｂとを有している。開口３２ａと開口３２ｂとは、マスク３２の中心３２ｃから等距離の位置に形成されており、互いに同じ径を有している。マスク３２の中心３２ｃは、ＡＦ用光路Ｋ１の光軸に一致している。なお、図３において、ハッチングで描かれている領域は遮光性を有している。なお、マスク３２は、対物レンズ３の瞳の位置に直接配置されてもよい。

瞳分割素子３３は、ＡＦ用の光源２１から出射された光Ｌ２が試料Ｓに照射されたときのＡＦ用光路Ｋ１における試料Ｓの光像を第１の光像Ｐ１と第２の光像Ｐ２とに分割する。本実施形態では、瞳分割素子３３はマスク３２の後段に配置されており、マスク３２の開口３２ａ，３２ｂを透過した第１の光像Ｐ１と第２の光像Ｐ２とを分割する。図４は、瞳分割素子３３の例を示す断面図である。図示のように、瞳分割素子３３は、瞳分割プリズム３３ａと色消しプリズム３３ｂとが組み合わされて構成されている。本実施形態では、図４の（ａ）、図４の（ｂ）、及び図４の（ｃ）に示されるいずれの瞳分割素子３３を用いてもよい。いずれの瞳分割素子３３においても、瞳分割プリズム３３ａは、中央から外側にかけて厚さが徐々に小さくなっている。また、色消しプリズム３３ｂは、中央から外側にかけて厚さが徐々に大きくなっている。色消しプリズム３３ｂは、瞳分割プリズム３３ａによって発生する色収差を抑制するように、瞳分割プリズム３３ａの屈折率と異なる屈折率を有する。

結像レンズ３５は、第１の光像Ｐ１と第２の光像Ｐ２とをそれぞれ結像する。結像レンズ３５は、結像レンズ４１における結像倍率より低い結像倍率を有する。結像レンズ３５は、リレー光学系３１を介して、対物レンズ３と光学的に結合している。結像レンズ３５は、瞳分割素子３３によって分離された第１の光像Ｐ１及び第２の光像Ｐ２をそれぞれＡＦ用撮像素子３０の撮像面３０ａに結像する。撮像面３０ａは、２次元に配列された複数の画素を有している。ＡＦ用撮像素子３０は、結像された第１の光像Ｐ１及び第２の光像Ｐ２に含まれる範囲に対応する撮像面３０ａの複数の画素をサブアレイ読み出しにより撮像することができる。サブアレイ読み出しとは、撮像素子の撮像面を構成する複数の画素のうちの、設定された複数の画素が構成するサブアレイ領域を読み出す撮像素子の読み出し方法である。なお、ＡＦ用撮像素子３０のサイズによっては、結像レンズ３５は、必ずしも結像レンズ４１における結像倍率より低い結像倍率を有する必要はない。

また、画像取得装置１は、試料Ｓに対する対物レンズ３の焦点位置を変更させる対物レンズ駆動部５０と、試料Ｓを対物レンズ３の光軸に交差する方向（スキャン方向）に所定速度で移動させるステージ駆動部５５と、画像取得装置１の動作を統括するコンピュータ６０とを備えている。

対物レンズ駆動部５０は、例えばステッピングモータ（パルスモータ）といったモータやピエゾアクチュエータなどのアクチュエータによって構成されている。対物レンズ駆動部５０は、後述する駆動制御部６２による制御に基づき、対物レンズ３を対物レンズ３の光軸に沿ったＺ方向に駆動する。これにより、試料Ｓに対する対物レンズ３の焦点位置が移動する。

ステージ駆動部５５は、例えばステッピングモータ（パルスモータ）といったモータやピエゾアクチュエータなどのアクチュエータによって構成されている。ステージ駆動部５５は、後述する駆動制御部６２による制御に基づき、ステージ２を対物レンズ３の光軸の直交面に対して所定の角度（例えば９０度）を有する面についてＸＹ方向に駆動する。これにより、ステージ２に保持された試料Ｓが対物レンズ３の光軸に対して移動し、試料Ｓに対する対物レンズ３の視野位置が移動することとなる。また、ステージ駆動部５５は、ステージ２の位置を検出し得る。例えば、ステージ駆動部５５は、ステージ２に取り付けられたリニアエンコーダによって、ステージ２のＸＹ座標を検出する。ステージ駆動部５５は、検出結果を示す位置情報を生成し、コンピュータ６０に出力する。

コンピュータ６０は、物理的には、ＲＡＭ、ＲＯＭ等のメモリ、及びＣＰＵ等のプロセッサ（演算回路）、通信インターフェイス、ハードディスク等の格納部、ディスプレイ等の表示部を備えて構成されている。かかるコンピュータ６０としては、例えばパーソナルコンピュータ、マイクロコンピュータ、クラウドサーバ、スマートデバイス（スマートフォン、タブレット端末など）などが挙げられる。

コンピュータ６０は、画像処理部（解析部）６１と駆動制御部６２とを有している。画像処理部６１は、スキャン用撮像素子４０から出力される画像データに基づいて、試料Ｓのバーチャルスライド画像を作成する。また、画像処理部６１は、ＡＦ用撮像素子３０から出力されるサブアレイデータに基づいて、試料Ｓ上の焦点制御領域３９における合焦点位置（焦点情報の一例）を算出する。駆動制御部６２は、解析結果に基づいて対物レンズ３の焦点位置が合焦点位置になるように対物レンズ駆動部５０を制御する。

本実施形態では、いわゆる位相差方式のフォーカシングによって合焦点位置の算出が行われる。位相差方式のフォーカシングでは、瞳分割プリズム３３ａによって分離された第１の光像Ｐ１のサブアレイデータと第２の光像Ｐ２のサブアレイデータとの結像位置の距離ＰＬに基づいて、合焦点位置を算出する。結像位置の距離ＰＬは、例えば、ＳＡＤ（Ｓｕｍ ｏｆ Ａｂｓｏｌｕｔｅ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ）法、ＳＳＤ（Ｓｕｍ ｏｆ Ｓｑｕａｒｅｄ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ）法、ＮＣＣ（正規化相互相関：Ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ Ｃｒｏｓｓ Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ）法、ＺＮＣＣ（正規化相互相関：Ｚｅｒｏ−ｍｅａｎ Ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ Ｃｒｏｓｓ Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ）法、ＰＯＣ（位相限定相関：Ｐｈａｓｅ Ｏｎｌｙ Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ）法等を利用して算出され得る。

例えば、ＳＡＤ法では、第１の光像Ｐ１と第２の光像Ｐ２との同じ位置の画素における輝度値の差の絶対値の合計を用い、この値が小さい位置を求めることによって、距離ＰＬを導出し得る。ＳＳＤ法では、同じ位置の画素における輝度値の差の２乗の合計を用い、この値が小さい位置を求めることによって、距離ＰＬを導出し得る。ＮＣＣ法及びＺＮＣＣ法では、正規化相互相関を画像の類似度として、類似度する位置を求めることによって、距離ＰＬを導出し得る。ＰＯＣ法では、位相限定相関データの重心位置を求めることによって、距離ＰＬを導出し得る。

また、結像位置の距離ＰＬは、ピクセル位置を計算することによって算出されてもよい。駆動制御部６２では、結像位置の距離ＰＬと合焦点位置との関係を示すテーブル、又は、結像位置の距離ＰＬから合焦点位置を導出する導出式によって、合焦点位置が導出され得る。

また、駆動制御部６２は、ステージ駆動部５５の動作を制御することによって、ステージ２の移動を制御する。さらに、駆動制御部６２は、スキャン用の光源１１及びＡＦ用の光源２１に制御信号を出力し、スキャン用の光源１１及びＡＦ用の光源２１による光の出射を制御する。コンピュータ６０は、画像処理部６１及び駆動制御部６２によって、光源１１，２１、ステージ駆動部５５、及び撮像素子６によるレーンスキャンの実行を制御する。以下、レーンスキャンについて説明する。

上述のとおり、２０倍、４０倍、１００倍等といった高倍率を有する対物レンズ３の視野は、試料Ｓの大きさに対して小さい範囲となっている。そのため、一回の撮像で画像を取得できる領域も試料Ｓに対して小さくなる。したがって、試料Ｓの全体を撮像するためには、対物レンズ３の視野を試料Ｓに対して移動させる必要がある。そこで、画像取得装置１では、試料Ｓを保持するスライドガラスに対して試料Ｓを含むように画像取得領域が設定され、画像取得領域に対するレーンスキャンが実行される。

図６は、画像取得装置によるレーンスキャンを説明するための図である。本実施形態では、予め設定された画像取得領域７１に対してスキャン用撮像素子４０の撮像視野領域の大きさを割り当てることで、画像取得領域７１に複数の撮像位置がマトリクス状に設定される。図６に示す例では、画像取得領域７１には、Ｘ方向に第１〜第ｎまでの複数のレーンが設定され、各レーンには、Ｙ方向（スキャン方向）に第１〜第ｍまでの複数の撮像位置７３が設定されている。

レーンスキャンでは、ステージ２をＸＹ方向に移動させながら、瞬間光によって試料Ｓの一部をストロボ撮影する。画像取得装置１は、撮像位置７３に対応する試料Ｓの一部をスキャン用撮像素子４０によって撮像することで、撮像位置７３に対応するタイル画像Ｔをそれぞれ取得する。撮像視野が次に撮像する撮像位置７３に移動した後、再び撮像を行って次のタイル画像Ｔを取得する。以降、画像取得装置１では、レーン毎に撮像位置７３を順次撮像する動作が繰り返し実行され、複数のタイル画像列Ｒからなる画像データの取得が行われる。取得された画像データが画像処理部６１によって合成され、試料Ｓ全体を示す画像が形成される。

ステージ駆動部５５による対物レンズ３の視野位置の移動方式には、例えば図６に示すように、隣り合うレーン間でスキャン方向が反転する双方向スキャン（Ｂｉ−ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ ｓｃａｎｎｉｎｇ）が採用される。対物レンズ３の視野位置の移動方式には、双方向スキャンに限られず、各レーンでスキャン方向が同方向となる一方向スキャン（Ｕｎｉ−ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ ｓｃａｎｎｉｎｇ）を採用してもよい。図６では、画像取得領域７１に対する対物レンズ３の相対的な移動方向が二点鎖線の矢印によって示されている。

図７は、撮像視野領域とＡＦ用照射光の照射範囲との関係を説明する図である。図７では、試料Ｓ上における撮像視野領域（第２の撮像領域）４０Ａと焦点制御領域（第１の撮像領域）３９との範囲の関係が模式的に示されている。なお、撮像視野領域４０Ａは、スキャン用撮像素子４０によって撮像される領域であって、タイル画像Ｔを構成する領域である。焦点制御領域３９は、合焦点位置の算出がなされる領域である。

図７に示すように、ＡＦ用照射光学系２０による照射光の照射範囲２１Ａは、スキャン用撮像素子４０の撮像視野領域４０Ａを含んでいる。また、本実施形態では、上述のとおり双方向スキャンが採用されているため、撮像視野領域４０Ａの一方側及び他方側に隣接してそれぞれ焦点制御領域３９が設定され得る（図７参照）。図７の例では、第１スキャン方向にステージ２が移動される場合の焦点制御領域３９Ａと、第２スキャン方向にステージ２が移動される場合の焦点制御領域３９Ｂとが示されている。このように、撮像視野領域４０Ａは、スキャン方向において焦点制御領域３９よりも後方である。

図８は、ＡＦ用撮像素子のサブアレイ領域と第１の光像及び第２の光像の関係を説明する図である。図８では、第１の光像Ｐ１及び第２の光像Ｐ２は、ＡＦ用撮像素子３０の撮像面３０ａに結像されている。これら第１の光像Ｐ１及び第２の光像Ｐ２には、試料Ｓの焦点制御領域３９の光像である部分領域３９ａ及び部分領域３９ｂがそれぞれ含まれている。ＡＦ用撮像素子３０では、これらの部分領域３９ａ及び部分領域３９ｂが含まれるようにサブアレイ領域３８が設定されている。そのため、ＡＦ用撮像素子３０は、焦点制御に必要な画像データを高速に取得することができる。なお、ＡＦ用撮像素子３０の撮像面３０ａでは、瞳分割素子３３によって分割された第１の光像Ｐ１と第２の光像Ｐ２とが互いに離間している。また、第１の光像Ｐ１と第２の光像Ｐ２とは、視野絞りの形状と同じ形状をなしている。

続いて、画像取得装置１の動作について説明する。図９は、画像取得装置１の動作を示すフローチャートである。図９のフローチャートでは、画像取得方法の一例として、焦点制御から画像取得までの基本的な流れが示されている。本実施形態では、事前に、対物レンズ３に対峙するように試料Ｓがステージ２に載置される（準備ステップ）。続いて、ステージ駆動部５５の駆動によって、対物レンズ３に対してステージ２の位置がスキャン方向に沿って移動する（ステップＳ１：移動ステップ）。本実施形態では、ステージ２がスキャン方向に一定の速度で移動することによって、対物レンズ３がステージ２に対してスキャン方向と反対側に相対的に移動する。

続いて、対物レンズ３に対峙した試料ＳにＡＦ用の光源２１からの照射光が照射される（ステップＳ２：第１の照射ステップ）。試料Ｓに照射された照射光は、対物レンズ３によって導光される。試料Ｓの光像は、瞳分割によって第１の光像Ｐ１と第２の光像Ｐ２とに分割されて（瞳分割ステップ）、ＡＦ用撮像素子３０によって撮像される。本実施形態では、ＡＦ用撮像素子３０では、第１の光像Ｐ１と第２の光像Ｐ２との一部の領域である部分領域３９ａ、３９ｂが含まれるようにサブアレイ領域３８が設定されている。そのため、ＡＦ用撮像素子３０は、サブアレイ領域３８をサブアレイ読み出しすることにより、試料Ｓにおける焦点制御領域３９を撮像することができる。撮像されたデータは第１の画像データとして取得される（ステップＳ３：第１の画像取得ステップ）。取得された第１の画像データは、画像処理部６１によって解析され、焦点制御領域における合焦点位置が算出される（ステップＳ４：解析ステップ）。この算出結果に基づいて対物レンズ駆動部５０が駆動されることで、試料Ｓに対する対物レンズ３の焦点位置が制御される（ステップＳ５：焦点制御ステップ）。

続いて、対物レンズ３の焦点位置が制御された状態において、スキャン用の光源１１からの照射光が照射され（ステップＳ６）、スキャン用撮像素子４０によって撮像視野領域における試料Ｓの光像が撮像される。すなわち、スキャン用撮像素子４０による撮像視野領域の撮像前に対物レンズ３の焦点位置が制御されている。これにより、タイル画像Ｔである第２の画像データが取得される（ステップＳ７：第２の画像取得ステップ）。ステップＳ１におけるステージ２の移動は継続的に行われており、ステップＳ３からステップＳ６までの間に、ステップＳ３で撮像された焦点制御領域はステップＳ６における焦点制御領域まで移動している。すなわち、第２の画像取得ステップでは、スキャン動作によって撮像視野領域を焦点制御領域まで移動させた状態で第２の画像データが撮像される。

続いて、駆動制御部６２によって、当該レーンにおいて次のタイル画像Ｔがあるか否かが判定される（ステップＳ８）。次のタイル画像Ｔがあると判定された場合、再びステップＳ２に戻る。一方、次のタイル画像Ｔがないと判定された場合には、当該レーンにおける画像の取得が終了する。なお、次のレーンがある場合には、ステージ２がＸ方向に移動されることによって、ステージ２に対する対物レンズ３の位置が次のレーンの位置に移動する。そして、スキャン方向が逆向きに設定された状態で、ステップＳ１から処理が再開される。

図１０は、画像取得装置１の動作を説明するためのタイミングチャートである。図１０は、一つのレーンの画像を取得する際のタイミングチャートである。画像取得装置１による撮像動作が実行されている場合、図１０に示すように、ステージ２は、Ｙ軸方向をスキャン方向として、一定の速度で移動する。駆動制御部６２によってステージ２のＹ座標の位置がタイル画像Ｔの撮像位置まで移動したことが検出されると、駆動制御部６２は、スキャン用撮像素子４０の露光開始を指示するトリガ信号をスキャン用撮像素子４０に出力する。これと同時に、駆動制御部６２は、スキャン用の光源１１による瞬間光の照射を指示するトリガ信号を光源に出力する。

さらに、露光開始トリガ信号によるスキャン用撮像素子４０の露光終了のタイミングで、駆動制御部６２は、ＡＦ用撮像素子３０の露光開始を指示するトリガ信号をＡＦ用撮像素子３０に出力する。これと同時に、駆動制御部６２は、ＡＦ用の光源２１による瞬間光の照射を指示するトリガ信号をＡＦ用の光源２１に指示する。ＡＦ用撮像素子３０によって撮像される焦点制御領域は、スキャン用撮像素子４０によって次に撮像される予定の領域である。駆動制御部６２は、ＡＦ用撮像素子３０から出力されたデータを基にオートフォーカス演算（ＡＦ演算）を行い、ＡＦ演算の結果に基づいて対物レンズ３をＺ軸方向に沿って移動させる。Ｚ軸方向における対物レンズ３の移動は、次のタイル画像Ｔを取得する位置にステージ２が移動するまでに終了する。そのため、次のタイル画像Ｔを取得する時点では、合焦点状態になっている。そして、駆動制御部６２によってステージ２のＹ座標の位置が次のタイル画像Ｔの撮像位置まで移動したことが検出されると、上述の通り、トリガ信号が出力される。この制御はレーンスキャンが終了するまで繰り返し行われる。第ｎレーンスキャンが終了すると、第ｎ＋１レーンスキャンを開始するために、ステージ２は、Ｘ方向に沿って移動する。なお、本実施形態では、各レーンにおいてタイル画像一つ分だけ撮像領域よりも外側から撮像処理が開始される。そのため、図１０のタイミングチャートにおける最初に取得されるタイル画像は撮像領域の外側となっている。

以上説明したように、画像取得装置１では、対物レンズ３によって導光された試料Ｓの光像が、ビームスプリッタによって、ＡＦ用光路Ｋ１とスキャン用光路Ｋ２とに分岐されている。ＡＦ用光路Ｋ１では、光Ｌ２が試料Ｓに照射されたときの光像がＡＦ用撮像素子３０によって撮像される。この光像は、瞳分割素子３３によって第１の光像Ｐ１と第２の光像Ｐ２とに分割されている。ＡＦ用撮像素子３０では、結像レンズ３５によって結像された第１の光像Ｐ１の部分領域３９ａと第２の光像Ｐ２の部分領域３９ｂとをサブアレイ読み出しして、第１の画像データを取得している。画像処理部６１では、第１の画像データを解析することによって、試料Ｓの焦点制御領域における合焦点位置を算出する。そのため、対物レンズ駆動部５０によって、スキャン用撮像素子４０による撮像視野領域４０Ａの撮像前に、解析結果に基づく対物レンズ３の焦点位置の制御が可能となる。

一方、スキャン用光路Ｋ２では、光Ｌ１が試料Ｓに照射されたときの光像がスキャン用撮像素子４０によって撮像される。ここで、スキャン用撮像素子４０の撮像視野領域は、スキャン方向において焦点制御領域よりも後方であるため、焦点制御領域であった領域は、ステージ２の移動に伴って撮像視野領域まで移動し得る。撮像視野領域が焦点制御領域まで移動しているときに、対物レンズ３の焦点位置が制御されていることによって、適切な焦点位置で第２の画像データが取得される。上述の通り、画像取得装置１では、サブアレイ読み出しによって焦点制御領域の画像を取得している。光Ｌ２の照射範囲が撮像視野領域を含むように広く設定されていることによって、光Ｌ２の照射範囲に撮像視野領域が含まれた状態で焦点制御領域の画像データを取得することができる。したがって、例えばスキャン用照射光学系１０とＡＦ用照射光学系２０との光軸を一致させることができ、光学調整を容易に行うことができる。

また、瞳分割素子３３は、瞳分割プリズム３３ａと、瞳分割プリズム３３ａの屈折率とは異なる屈折率を有する色消しプリズム３３ｂと、を含んでいてよい。この構成では、瞳分割プリズム３３ａで発生する色収差を色消しプリズム３３ｂによって補正することができる。

また、結像レンズ３５は、結像レンズ４１の倍率よりも小さい倍率を有してもよい。この構成では、結像レンズ３５によって結像された光像の範囲を結像レンズ４１によって結像された光像の範囲よりも大きくし易い。

また、対物レンズ３の瞳の位置に第１の光像Ｐ１及び第２の光像Ｐ２をそれぞれ通過させるマスク３２を更に有する。この構成では、対物レンズ３の瞳の位置に直接、もしくはリレー光学系３１でリレーされた対物レンズ３の瞳の位置にマスク３２を配置できるので、対物レンズ３の開口数（ＮＡ）を制限することができる。

また、リレー光学系３１における一次結像面に視野絞り３６が配置されているので、結像レンズ３５によって結像された第１の光像Ｐ１と第２の光像Ｐ２とが互いに干渉することが抑制される。

また、光Ｌ１及び光Ｌ２は、互いに異なるタイミングで照射される瞬間光なので、光Ｌ２が照射されるタイミングでは、光Ｌ１の照射は停止されている。これにより、光Ｌ２が照射された際の光像に対する光Ｌ１の影響を排除できる。

［第２実施形態］
本実施形態に係る画像取得装置１は、暗視野用マスクを更に備えている点で第１実施形態の画像取得装置１と相違している。以下、主として第１実施形態と相違する点について説明し、同一の要素や部材については同一の符号を付して詳しい説明を省略する。

図１１に示すように、画像取得装置１０１は、第１実施形態における画像取得装置１の構成に加えて、更に暗視野用マスクを有している。暗視野用マスクは、対物レンズ３の瞳と共役な位置に配置されている。本実施形態では、ＡＦ用の光源２１とコレクタレンズ２２との間に暗視野用マスク１０６が配置されている。図１２は、暗視野用マスクの形状を示す図である。暗視野用マスク１０６の形状は、マスク３２と相補的な関係を有している。すなわち、暗視野用マスク１０６は、マスク３２における第１の光像Ｐ１を透過させる開口３２ａ、及び、第２の光像Ｐ２を透過させる開口３２ｂの位置に対応する位置のみに遮光部１０６ａ，１０６ｂが設けられている。暗視野用マスク１０６における遮光部１０６ａ，１０６ｂ以外の部分は、光を透過する。

暗視野照明を実現するためには、対物レンズ３のＮＡより高いＮＡで照射光を試料Ｓに照射する必要がある。高いＮＡで試料Ｓを照明しようとすると、一般に、照射用のレンズ等の構造が大きくなってしまう。暗視野用マスク１０６を使用することによって、対物レンズ３よりも高いＮＡで照明する必要がなくなり、照射用のレンズを大きくする必要がない。よって、試料Ｓが蛍光試料であっても、観察を好適に行うことができる。

以上、本発明の実施の形態について図面を参照して詳述したが、具体的な構成はこの実施形態に限られない。

例えば、上記実施形態では、撮像視野領域と焦点制御領域とが隣接する例を示したがこれに限定されない。焦点制御領域は、次回以降に撮像が予定されるタイル画像に相当する領域であればよい。

１…画像取得装置、２…ステージ、３…対物レンズ、７…ビームスプリッタ、１０…スキャン用照射光学系（第２の照射光学系）、２０…ＡＦ用照射光学系（第１の照射光学系）、３０…ＡＦ用撮像素子（第１の撮像素子）、３３…瞳分割素子、３５…結像レンズ（第１の結像レンズ）、３９…焦点制御領域（第１の撮像領域）、４０…スキャン用撮像素子（第２の撮像素子）、４０Ａ…撮像視野領域（第２の撮像領域）、４１…結像レンズ（第２の結像レンズ）、５５…ステージ駆動部（駆動部）、６１…画像処理部（解析部）、６２…駆動制御部（制御部）。

Claims (16)

1. 対物レンズに対峙するように試料が載置されるステージと、
   前記対物レンズに対する前記ステージの相対的な位置を前記対物レンズの光軸に交差するスキャン方向に移動させる駆動部と、
   前記試料に照射される第１の照射光を出射する第１の照射光学系と、
   前記試料に照射される第２の照射光を出射する第２の照射光学系と、
   前記対物レンズによって導光された前記第１の照射光と前記第２の照射光とを焦点制御用の第１の光路と画像取得用の第２の光路とにそれぞれ分岐するビームスプリッタと、
   前記第１の光路における前記試料の光像を第１の光像と第２の光像とに分割する瞳分割素子と、
   前記第１の光像と前記第２の光像とをそれぞれ結像する第１の結像レンズと、
   複数の画素が２次元に配列された撮像面を有し、前記第１の結像レンズによって前記撮像面に結像された前記第１の光像と前記第２の光像とのそれぞれの少なくとも一部をサブアレイ読み出しして、第１の画像データを取得する第１の撮像素子と、
   前記第１の画像データを解析し、前記サブアレイ読み出しによって撮像される第１の撮像領域における前記対物レンズの焦点情報を求める解析部と、
   前記解析部によって求められた前記焦点情報に基づいて、前記対物レンズの焦点位置を制御する制御部と、
   前記第２の光路における前記試料の光像を結像する第２の結像レンズと、
   前記第２の結像レンズによって結像された前記試料の光像を撮像し、前記試料の画像を形成するための第２の画像データを取得する第２の撮像素子と、を備え、
   前記第１の照射光学系による前記第１の照射光の照射範囲は、前記第２の撮像素子によって撮像される第２の撮像領域を含み、
   前記第２の撮像領域は、前記スキャン方向において、前記第１の撮像領域よりも後方に位置し、
   前記制御部は、前記第２の撮像素子による前記第２の撮像領域の撮像前に、前記焦点情報に基づいて前記対物レンズの焦点位置を制御する、画像取得装置。
2. 前記瞳分割素子は、瞳分割プリズムと、前記瞳分割プリズムの屈折率とは異なる屈折率を有する色消しプリズムと、を含む、請求項１に記載の画像取得装置。
3. 前記第１の結像レンズは、前記第２の結像レンズの倍率よりも小さい倍率を有する、請求項１又は２に記載の画像取得装置。
4. 前記第２の光路における前記対物レンズの瞳の位置に前記第１の光像及び前記第２の光像をそれぞれ通過させるマスクを更に有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の画像取得装置。
5. 前記第２の光路において前記対物レンズの瞳をリレーするリレー光学系を更に備え、
   前記マスクは、前記リレー光学系によってリレーされた前記対物レンズの瞳の位置に配置されている、請求項４に記載の画像取得装置。
6. 前記リレー光学系における一次結像面に配置される視野絞りを更に備える、請求項５に記載の画像取得装置。
7. 前記第１の照射光及び前記第２の照射光は、互いに異なるタイミングで照射される瞬間光である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の画像取得装置。
8. 前記第１の照射光学系は、前記対物レンズの瞳と共役な位置に暗視野用マスクを更に備える、請求項１〜７のいずれか一項に記載の画像取得装置。
9. 対物レンズに対峙した試料に所定の照射範囲で第１の照射光を照射する第１の照射ステップと、
   前記対物レンズによって導光された前記試料の光像を瞳分割によって第１の光像と第２の光像とに分割する瞳分割ステップと、
   複数の画素が２次元に配列された撮像面を有する第１の撮像素子を用いて、前記第１の光像と前記第２の光像とのそれぞれの少なくとも一部をサブアレイ読み出しして、第１の画像データを取得する第１の画像取得ステップと、
   前記第１の画像データを解析し、前記サブアレイ読み出しによって撮像される第１の撮像領域における前記対物レンズの焦点情報を求める解析ステップと、
   前記解析ステップによって求められた焦点情報に基づいて、前記対物レンズの焦点位置を制御する焦点制御ステップと、
   第２の撮像素子を用いて、前記第１の照射光とは異なる第２の照射光が照射された前記試料の光像を撮像し、第２の画像データを取得する第２の画像取得ステップと、を備え、
   前記所定の照射範囲は、前記第２の撮像素子によって撮像される第２の撮像領域を含んでおり、
   少なくとも前記第１の画像取得ステップと前記第２の画像取得ステップとの間には、スキャン動作によって前記第２の撮像領域が前記第１の撮像領域まで移動しており、前記解析ステップ及び前記焦点制御ステップが行われている、画像取得方法。
10. 前記第１の画像取得ステップでは、分割された前記第１の光像及び前記第２の光像の色収差を補正する、請求項９に記載の画像取得方法。
11. 前記第１の画像取得ステップでは、前記第２の画像取得ステップで取得される第２の画像データの倍率よりも小さい倍率で第１の画像データを取得している、請求項９又は１０に記載の画像取得方法。
12. 前記第１の画像取得ステップでは、前記対物レンズの瞳の位置に配置されたマスクによって前記第１の光像及び前記第２の光像を通過させている、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の画像取得方法。
13. 前記第１の画像取得ステップでは、第１の光像及び第２の光像の視野が視野絞りによって制限されている、請求項９〜１２のいずれか一項に記載の画像取得方法。
14. 前記第２の画像取得ステップでは、前記第１の照射光の照射が停止されている、請求項９〜１３のいずれか一項に記載の画像取得方法。
15. 前記第１の照射光及び前記第２の照射光は、いずれも瞬間光である、請求項１４に記載の画像取得方法。
16. 前記第１の照射ステップでは、第１の照射光の一部を暗視野用マスクによって遮っている、請求項９〜１５のいずれか一項に記載の画像取得方法。
    
    

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