JP2019000001A - 細胞培養装置 - Google Patents
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Abstract
【課題】現在、大量生産を目的とした、浮遊培養に適した細胞塊の直径制御方法は存在しない。そこで、本発明は、上述したような実情に鑑み、細胞塊の直径を制御する方法、当該制御方法を適用した細胞培養装置を提供することを目的とする。【解決手段】本発明に係る培養装置は、培養液中に浮遊する中で比較的に大きい細胞塊に超音波付与を行うことで、細胞塊の直径を制御する。【選択図】 図1
Description
本発明は、人工多能性細胞のような細胞を培養する細胞培養装置に関する。
動物細胞は、主に医療や医薬品等の産業で利用される。動物細胞の一種である幹細胞(人工多能性細胞など)は、様々な細胞に分化することが可能である。近年、幹細胞は損傷した臓器などを治療する、再生医療用の細胞性医薬品として利用され始めている。細胞性医薬品の生産は、幹細胞を培養し、増殖させることで得ることができる。
従来、再生医療で用いられる動物細胞の培養方法には接着培養が用いられてきた。接着培養は細胞を培養容器に接着させ培養する方法である。今まで、再生医療は細胞シートなど接着培養を用いた少量生産で行われてきた。幹細胞の一種である人工多能性細胞は、細胞塊を形成して増殖する。その細胞塊の直径は人工多能性細胞の特性(未分化状態、生存率)に影響を与える。そのため、人工多能性細胞など一部の細胞では、細胞塊の直径制御が必要である。この直径制御は細胞塊に物理的な力を加えて行われる。ここで言う物理的な力とは、ピペッティング操作で細胞に加えられるせん断応力などである。少量生産を目的とした接着培養では、人工多能性細胞の細胞塊への力の加え方に手作業によるピペッティングが用いられてきた。
一般的に再生医療によって心疾患などを治療する場合は、幹細胞から心筋細胞に分化させた細胞が109個必要になる。現在幹細胞の培養で主に用いられている接着培養の場合、一般的に用いられる直径10cmの培養皿1枚に、107個程度の幹細胞を培養するのが限界である。もし接着培養で109個の細胞を生産する場合、100枚の培養皿が必要となる。100枚の培養皿の培養、維持には多大な労力がかかってしまうため、接着培養は大量生産に向かない。
大量培養技術の1つとして、浮遊系培養技術の適用が検討されている。浮遊系培養でも、人工多能性細胞の場合細胞塊の直径が特性の維持に関わる。そのため、人工多能性細胞では、浮遊培養でも細胞塊の直径制御が必要である。人工多能性細胞の浮遊培養では、効率的に大量の細胞塊の直径を制御する必要がある。
従来技術では、浮遊培養において、細胞塊の直径を制御する方法として、メッシュを適応している。この制御方法は、一度に多くの細胞塊に適応可能だが、メッシュの目詰まりが問題になってしまう。実用化した際、メッシュの交換作業により、コストと作業効率が悪くなる可能性が高い。
細胞塊に物理的な力を加える手段として、超音波を細胞に照射する手法が考えられる。従来の細胞に対する超音波の処理例は以下の通りである。特許文献1では、培養槽と攪拌翼と超音波照射手段を有する細胞培養装置が記載され、超音波を培養槽壁面に付着した細胞に照射することで、細胞を剥離する方法が開示されている。しかし、この方法は培養槽内の細胞全体に超音波を当ててしまうため、細胞によっては余分な物理的ストレスを受ける。
また超音波を細胞に照射する例として、特許文献2には、容器に付着した接着培養に対して局所的に超音波を与え、所望の細胞を培養容器から剥離する方法が記載されている。この超音波照射方法は、局所的な超音波付与が可能で、細胞に余分なストレスを与えることは無い。しかし、特許文献1と同様に、付着した細胞を剥すことを目的とした有効な技術であり、培養液中に浮遊する特定の細胞のみに超音波を照射することはできない。
現在、大量生産を目的とした、浮遊培養に適した細胞塊の直径制御方法は存在しない。そこで、本発明は、上述したような実情に鑑み、細胞塊の直径を制御する方法、当該制御方法を適用した細胞培養装置を提供することを目的とする。
本発明に係る培養装置は、培養液中に浮遊する中で比較的に大きい細胞塊に超音波付与を行うことで、細胞塊の直径を制御する。
培養時に細胞塊の直径を容易に制御可能な細胞培養装置を提供できる。
以下、本実施形態に係る細胞培養装置を、図面を参照して詳細に説明する。本実施形態に係る細胞培養装置は、例えば、細胞自体が医薬品となる細胞の培養に適用できる。また、培養対象の細胞は、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、細菌、酵母、真菌及び藻類などをあげることができる。特に、iPS細胞などの細胞塊を凝集して培養する細胞が好ましい。
図1に本実施形態に係る細胞培養装置の一例を模式的に示す。細胞培養装置20は容器本体1を備える。容器本体1は、大きさが異なる複数の細胞の凝集体である細胞塊を含む培養液3と、培養液3を攪拌する攪拌手段2と、超音波を発信する端子である超音波発信端子4とを有する。超音波発信端子4は培養液3の液面に接し、かつ蓋体8に配設されている。
容器本体1の外部には、超音波を照射する超音波照射手段5と、超音波のサイズ等を計測する計測装置6と、細胞を観察する細胞観察手段7を備える。
細胞塊が細胞観察手段7により撮影され、撮影画像を取得する。計測装置6でその撮影画像の解析が行われ、解析結果を基に撮影画像に写された細胞塊が超音波発信端子4からの超音波を受ける位置にあるとき、超音波照射手段5に計測装置6からシグナルが送られ、超音波発信端子4から超音波を発信する。
細胞観察手段7は、容器本体1の外部に配設したCCD素子を用いたカメラのなどで構成する。超音波発信端子4の先端の定められた領域に存在する細胞もしくは細胞塊を撮影し、画像データを取得する。
細胞観察手段7は予め定められた領域を撮影するように固定しても良い。攪拌手段2により培養液3は攪拌され周回するので、細胞観察手段7を固定していても、培養液に含まれる各細胞塊を定期的に観察することができる。
また、細胞観察手段7を固定せずに可動可能な形態としても良い。その際は培養液3の中にサイズの大きな細胞塊が生成されたらすぐに発見できるように、細胞観察手段7を細胞塊全体について観察可能な位置に配置する。
計測装置6は、細胞塊を認識し、さらにその直径を計測する機能を持った、画像解析ソフトを搭載したコンピュータである。細胞観察手段7と超音波照射手段5と接続しており、細胞観察手段7が撮影した画像データを受信し、画像データ中の細胞塊の直径を計測し、あらかじめ定められた大きさを超えた細胞塊を発見したとき、超音波照射手段5にシグナルを送り、超音波照射手段5を作動させる。
超音波照射手段5は計測装置6と超音波発信端子4と接続している。超音波照射手段5は圧電セラミックスを用いた方法をとる。また、超音波の出力は培養槽の一部にのみ超音波が届く程度の出力を用いる。もしくは、超音波発信端子4に反射器を取り付け局所的に超音波が伝達するようにしても良い。
このように、培養液全体のうち閾値を超えた細胞塊は超音波照射手段5による超音波の照射範囲に含まれ、閾値を超えない細胞塊は超音波照射手段5による超音波の照射範囲に含まれない構成とする。超音波を照射された細胞塊はストレスを受けるので、サイズが閾値を超えない細胞塊に対して超音波を照射せず余分な物理的ストレスを与えないようにする。
超音波照射手段5が照射する超音波の周波数は20Hz〜10GHzであることが望ましい。この周波数は所望の細胞塊が細分化するのに適切である。また超音波が培養槽の一部にのみ伝達される範囲を用いるのがさらに望ましい。細胞塊の細分化に必要な時間は、主に超音波の周波数に関係しているので、所望の細胞塊の大きさに合わせて決定することができる。
容器本体1は、一部もしくは全てが透明容器であり、ガラスやプラスチックなどを用いる。さらに、超音波の影響を最小限に留めるために、図4のように流路15を取り付けても良いし、図5のようにプラスチック製の支柱17と、プラスチック製の壁18を取り付けても良い。流路16はガラスやプラスチックなど透明な材質を用いる。
なお、図1に示した細胞培養装置20は、回分培養(一回毎に新たな培地を用意し、そこへ株を植えて収穫まで培地を加えない方法)に適した構成となっているが、当該構成に限定されるものではない。流加培養(培養中に、培地自体や培地中の特定の成分を添加し、培養終了時までその生成物を抜き取らない方法)を適応する場合は添加培地装置を加えて構成することもできる。連続培養(一定の速度で培養系に培地を供給し、同時に同量の培養液を抜き取る方法)を適応する場合は、培養液抜き出しようのラインを設けても良いし、エアリフト型の培養装置に超音波照射手段と超音波発信端子と培養液観察手段を備えても良い。
<実施例1>
図1の培養装置を市販の温度調節用のヒーター上で使用し、本実施形態を回分培養に適応したものが実施例1である。容器本体1を小規模のスピナーフラスコまたはガラス製の容器で構成する。
図1の培養装置を市販の温度調節用のヒーター上で使用し、本実施形態を回分培養に適応したものが実施例1である。容器本体1を小規模のスピナーフラスコまたはガラス製の容器で構成する。
攪拌手段2として平羽根型の翼を用いて、回転数30rpmで培養液の攪拌を行った。細胞として市販の人工多能性細胞を用いた。また、細胞の培養液は、市販のDMEM/F12培地を主成分とする培地を用いた。
外部に培養液観察手段7として、拡大撮影機能のついたデジタル顕微鏡を用いた。容器本体1の外部に設置され、培養液3中の細胞を撮影する。培養液観察手段7で録画された細胞塊の拡大画像をもとに、計測手段6により細胞塊の大きさを計測した。計測装置6としてコンピュータと市販の画像解析ソフトを用いた。取得した画像を市販の画像解析ソフトで二値化し、細胞塊を認識した。細胞が密集している部分を細胞塊とし、単体の細胞のみ検出された部分は細胞塊とはみなさなかった。細胞塊と認識した部分の直径を計測し、規定外に大きいか否かを判断した。細胞塊が規定外に大きい場合は超音波照射手段5を作動させ、細胞塊の細分化を行った。
細胞培養装置20は、超音波照射手段5と、超音波発信端子4によって細胞塊に超音波を付与し細分化する。超音波発信端子4は培養液3に先端が接するように設置されている。またその先端は、培養液観察手段7で得られた動物細胞の拡大画像データを計測装置6が処理し、超音波付与を行うか否か決定した時に、処理した画像データ上にある細胞が、超音波が届く位置に流れる場所に位置する。攪拌されている培養液中の細胞は約0.3m/sで移動しており、培養液観察手段7から攪拌翼の回転方向に3秒後に超音波が照射されるため、約10cm離れた所に1つ設置する。超音波照射手段5が用いる周波数は20Hz〜10GHzである。
この装置に50mLの市販の培地を入れ、人工多能性細胞を7日間培養した。7日間で、3×105cellsから7×107cellsまで細胞が増殖した。
培養開始前、細胞塊の直径は50〜100μmである。培養を開始すると、細胞塊は大きくなるが、大きくなり過ぎると細胞の特性(未分化状態、生存率)に悪い影響を与えるため、直径が閾値を超えた細胞塊に超音波照射手段5で超音波を照射する。この閾値は例えば300μmとする。超音波を照射された細胞塊は細分化され、培養終了時は200μm〜300μmになった。
<実施例2>
図2は実施例2に係る細胞培養装置を示す。実施例2は細胞培養装置を流加培養に適応したものである。蓋体8に5ng/mL線維芽細胞増殖因子を添加物用管路9と、添加物用管路9に接続された添加物を無菌的に保存するためのガラス瓶を取り付けたものである。5ng/mL線維芽細胞増殖因子は1日毎添加した。この装置に50mLの市販の培地を入れ、人工多能性細胞を7日間培養した。3×105cellsから7.4×107cellsまで細胞が増殖した。
図2は実施例2に係る細胞培養装置を示す。実施例2は細胞培養装置を流加培養に適応したものである。蓋体8に5ng/mL線維芽細胞増殖因子を添加物用管路9と、添加物用管路9に接続された添加物を無菌的に保存するためのガラス瓶を取り付けたものである。5ng/mL線維芽細胞増殖因子は1日毎添加した。この装置に50mLの市販の培地を入れ、人工多能性細胞を7日間培養した。3×105cellsから7.4×107cellsまで細胞が増殖した。
実施例1と同様に超音波照射手段5で細胞塊のサイズを制御したところ、細胞塊細胞塊の直径は、培養開始時の50〜100μmから、培養終了時は200μm〜300μmになった。さらに、流加培養に装置を適応したことで、細胞の維持のために毎日行っていた繊維芽細胞増殖因子の添加作業をする必要が無くなり、労働効率が良くなった。
<実施例3>
図3は本実施形態を連続培養に適応した実施例3を概略的にあらわしたものである。蓋体8に新鮮培地用管路11と、新鮮培地用管路11に接続した新鮮培地を無菌状態で保存できる新鮮培地保存用容器14と、廃液用管路12と、廃液用ガラス容器13を設置した。新鮮培地用管路11と廃液用管路12には除菌フィルター10を設置した。24時間毎に20分間培養装置の攪拌をとめ、細胞塊を培養液の底に沈めた。さらに上澄みを廃液用管路12で吸引し、新しい培地を新鮮培地用管路11で入れた。この装置に50mLの市販の培地を入れ、人工多能性細胞を7日間培養した。3×105cellsから6.5×107cellsまで細胞が増殖した。
図3は本実施形態を連続培養に適応した実施例3を概略的にあらわしたものである。蓋体8に新鮮培地用管路11と、新鮮培地用管路11に接続した新鮮培地を無菌状態で保存できる新鮮培地保存用容器14と、廃液用管路12と、廃液用ガラス容器13を設置した。新鮮培地用管路11と廃液用管路12には除菌フィルター10を設置した。24時間毎に20分間培養装置の攪拌をとめ、細胞塊を培養液の底に沈めた。さらに上澄みを廃液用管路12で吸引し、新しい培地を新鮮培地用管路11で入れた。この装置に50mLの市販の培地を入れ、人工多能性細胞を7日間培養した。3×105cellsから6.5×107cellsまで細胞が増殖した。
実施例1と同様に超音波照射手段5で細胞塊のサイズを制御したところ、細胞塊の直径は、培養開始時の50〜100μmから、培養終了時は200μm〜300μmになった。さらに、連続培養に装置を適応したことで、細胞の維持に必要な培地交換をする必要が無くなり、労働効率が良くなった。
<実施例4>
図4は本実施形態における実施例4を概略的にあらわしたものである。容器本体1に流路15を取り付け、培養液観察手段7を流路15の外部に取り付け、超音波発信端子4を流路15に取り付ける。この装置に50mLの市販の培地を入れ、人工多能性細胞を7日間培養した。3×105cellsから7.5×107cellsまで細胞が増殖した。
図4は本実施形態における実施例4を概略的にあらわしたものである。容器本体1に流路15を取り付け、培養液観察手段7を流路15の外部に取り付け、超音波発信端子4を流路15に取り付ける。この装置に50mLの市販の培地を入れ、人工多能性細胞を7日間培養した。3×105cellsから7.5×107cellsまで細胞が増殖した。
実施例1と同様に超音波照射手段5で細胞塊のサイズを制御したところ、細胞塊の直径は、培養開始時の50〜100μmから、培養終了時は200μm〜300μmになった。培養液中に含まれる細胞塊のうちで一部の細胞塊が流路15を流れる。
流路15を取り付けたことで、取り付けない時より一部の細胞にのみ超音波が照射され易くなり、細胞への影響を最小限に抑えることができた。
<実施例5>
図5は本実施形態における実施例5を概略的にあらわしたものである。容器本体1の内部に5cmの長さをもつ支柱16を用いて容器本体1と10cm2の正方形の板17を取り付けた。超音波発信端子4を板17と容器本体1の壁面に設置した。この装置に50mLの市販の培地を入れ、人工多能性細胞を7日間培養した。3×105cellsから8.0×107cellsまで細胞が増殖した。
図5は本実施形態における実施例5を概略的にあらわしたものである。容器本体1の内部に5cmの長さをもつ支柱16を用いて容器本体1と10cm2の正方形の板17を取り付けた。超音波発信端子4を板17と容器本体1の壁面に設置した。この装置に50mLの市販の培地を入れ、人工多能性細胞を7日間培養した。3×105cellsから8.0×107cellsまで細胞が増殖した。
実施例1と同様に超音波照射手段5で細胞塊のサイズを制御したところ、細胞塊の直径は、培養開始時の50〜100μmから、培養終了時は200μm〜300μmになった。
1…容器本体、2…攪拌手段、3…培養液、4…超音波発信端子、
5…超音波照射手段、6…計測装置、7…培養液観察手段、
8…蓋体、9…添加物用管路、10…除菌フィルター、
11…新鮮培地用管路、12…廃液用管路、13…廃液用ガラス容器、
14…新鮮培地保存用容器、15…流路、16…支柱、17…板
5…超音波照射手段、6…計測装置、7…培養液観察手段、
8…蓋体、9…添加物用管路、10…除菌フィルター、
11…新鮮培地用管路、12…廃液用管路、13…廃液用ガラス容器、
14…新鮮培地保存用容器、15…流路、16…支柱、17…板
Claims (7)
- 細胞を培養する細胞培養装置であって、
培養液を有する容器と、
複数の細胞塊を含む前記培養液の画像を取得する細胞観察手段と、
前記細胞観察手段により取得された画像に基づき、細胞塊のサイズを計測する計測手段と、
前記計測手段により計測した細胞塊のサイズが閾値を超えた場合に、当該閾値を超えた細胞塊に対し超音波を照射する超音波照射手段と、を有することを特徴とする細胞培養装置。 - 請求項1に記載の細胞培養装置において、
前記培養液を攪拌する攪拌手段を有し、
前記細胞観察手段は前記攪拌手段により攪拌された培養液の画像を取得することを特徴とする細胞培養装置。 - 請求項2に記載の細胞培養装置において、
前記細胞観察手段は予め定められた領域を撮影するように固定されていることを特徴とする細胞培養装置。 - 請求項1乃至3のいずれか一項に記載の細胞培養装置において、
前記計測手段は計測する細胞塊のサイズは、細胞塊の直径であることを特徴とする細胞培養装置。 - 請求項1乃至4のいずれか一項に記載の細胞培養装置において、
前記培養液全体のうち前記閾値を超えた細胞塊は、前記超音波照射手段による超音波の照射範囲に含まれ、
前記培養液全体のうち前記閾値を超えない細胞塊は、前記超音波照射手段による超音波の照射範囲に含まれないことを特徴とする細胞培養装置。 - 請求項1乃至5のいずれか一項に記載の細胞培養装置において、
前記培養液の一部を循環させる流路を有し、
前記流路を流れる培養液の画像を取得することを特徴とする細胞培養装置。 - 請求項1乃至6のいずれか一項に記載の細胞培養装置において、
前記容器の一部または全体が透明であることを特徴とする細胞培養装置。
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