JP2018536393A - 抗wt1/hla特異的抗体 - Google Patents
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Abstract
Description
MGSDVRDLNALLPAVPSLGGGGGCALPVSGAAQWAPVLDFAPPGASAYGSLGGPAPPPAPPPPPPPPPHSFIKQEPSWGGAEPHEEQCLSAFTVHFSGQFTGTAGACRYGPFGPPPPSQASSGQARMFPNAPYLPSCLESQPAIRNQGYSTVTFDGTPSYGHTPSHHAAQFPNHSFKHEDPMGQQGSLGEQQYSVPPPVYGCHTPTDSCTGSQALLLRTPYSSDNLYQMTSQLECMTWNQMNLGATLKGVAAGSSSSVKWTEGQSNHSTGYESDNHTTPILCGAQYRIHTHGVFRGIQDVRRVPGVAPTLVRSASETSEKRPFMCAYPGCNKRYFKLSHLQMHSRKHTGEKPYQCDFKDCERRFSRSDQLKRHQRRHTGVKPFQCKTCQRKFSRSDHLKTHTRTHTGKTSEKPFSCRWPSCQKKFARSDELVRHHNMHQRNMTKLQLAL(配列番号2)。
(a)配列番号3の可変重鎖DNA配列および配列番号4の可変軽鎖DNA配列;
(b)配列番号13の可変重鎖DNA配列および配列番号14の可変軽鎖DNA配列;
(c)配列番号23の可変重鎖DNA配列および配列番号24の可変軽鎖DNA配列;
(d)配列番号33の可変重鎖DNA配列および配列番号34の可変軽鎖DNA配列;
(e)配列番号43の可変重鎖DNA配列および配列番号44の可変軽鎖DNA配列;
(f)配列番号53の可変重鎖DNA配列および配列番号54の可変軽鎖DNA配列の少なくとも1つを含んでなる、核酸分子に関する。
1つの核酸分子は配列番号3のDNA配列を含んでなり、第2の核酸分子は配列番号4のDNA配列を含んでなり;
1つの核酸分子は配列番号13のDNA配列を含んでなり、第2の核酸分子は配列番号14のDNA配列を含んでなり;
1つの核酸分子は配列番号23のDNA配列を含んでなり、第2の核酸分子は配列番号24のDNA配列を含んでなり;
1つの核酸分子は配列番号33のDNA配列を含んでなり、第2の核酸分子は配列番号34のDNA配列を含んでなり;
1つの核酸分子は配列番号43のDNA配列を含んでなり、第2の核酸分子は配列番号44のDNA配列を含んでなり;
1つの核酸分子は配列番号53のDNA配列を含んでなり、第2の核酸分子は配列番号54のDNA配列を含んでなる。
抗体選択のための標的として、RMF/HLA複合体を使用した。標的は、Dao et al.(Sci Transl Med.2013 March 13;5(176):176ra33)に記載されるようにして作製した。ビオチン化WT1/HLA−A0201およびRHAMM−R3/HLA_A0201複合体は、免疫学部において、(小さな修正を加えてAltman,et al.1996.Phenotypic analysis of antigen specific T lymphocytes.Science 274:94、およびJung,G.,Ledbetter,J.A.,and Muller−Eberhard,H.J.(1987).Induction of cytotoxicity in resting human T lymphocytes bound to tumor cells by antibody heteroconjugates.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,84(13),4611−4615に記載されるようにして)組換えHLA−A2およびs2−ミクログロブリンと共にペプチドを再折りたたみすることによって合成した。
6つのRMF/HLA複合体結合抗体は、国際公開第2012/135854号パンフレット(Memorial Sloan−Kettering)に記載されている。これらの6つの抗体のうちの5つもまた、Dao et al.(上記参照)に記載される。Refmab#18(下記参照)のみが、Dao et al.(2013)に記載されていない。
この実験では、参照抗体の特異性を調べた。ビオチン化ペプチド/HLA複合体をニュートラアビジンプレート上に、50nMでコーティングした。実施例2の単離された参照抗体を抗原上で滴定した:結合は、APコンジュゲートヤギ抗ヒトIgG二次抗体を使用するELISAで試験した。
無傷細胞上に提示された場合、単離された抗原への結合は必ずしも抗原への結合と一致しないので、対照抗体もまたこの抗原を発現する細胞上のRMF/HLA複合体に結合するかどうかを調べた。
抗体作製のために、Ylanthia(登録商標)ライブラリー(MorphoSys AG,Germany)を用いて、WT1/HLA複合体に対するFabフラグメントを選択した。Ylanthia(登録商標)ライブラリー(Tiller et al.mAbs 5:3,1−26;May/June(2013)および米国特許第8,728,981号明細書)は、市販のファージミドライブラリーであり、ファージ表面におけるFab提示のためにCysDisplay(登録商標)技術を採用する((Lohning et al.,国際公開第2001/05950号パンフレット)。
結合体は、詳細な特性決定に供した。それらは、実施例3に記載されるようなニュートラアビジンプレートを使用するELISAアッセイにおいて、先行技術の抗体と直接比較した。選択された参照抗体および本発明の結合体について、EC50を判定した。結果は表3に要約される。「++」は10nM未満のEC50での結合を示し、「+」は10nMを超えるEC50での結合を示し、「−−−」は結合しないことを示す。
この実験では、本開示の抗体の特異性を実施例3に記載されるようにして調べた。結果は、図4〜6に示される。
本開示の結合体および先行技術の結合体について、EL50値を判定した(ELISAはニュートラアビジンプレート上で実施した)。結果は、表4に要約される。「++」は10nM未満のEC50での結合を示し、「+」は10nMを超えるEC50での結合を示し、「−−−」は結合しないことを示す。
本開示の抗体を用いて、実施例4を繰り返し、すなわち、RNF/HLA陽性SET2細胞(DSMZ番号ACC608)およびBV173細胞(DSMZ番号ACC20)への結合をフローサイトメトリーによって試験した。EC50値が判定された。結果は、表5に示される。「++」は10nM未満のEC50での結合を示し、「+」は10nMを超えるEC50での結合を示し、「−−−」は細胞上の標的に結合しないことを示す。
本発明の結合体は、原発性AML細胞上のRMFエピトープを検出するそれらの能力について調べられる。結合体は、患者のAML芽球に結合することが予期される。結果は、フローサイトメトリー分析によって確認される。結果は、白血病細胞の表面上のRMF/HLA−A0201のレベルが、本発明の結合体との反応性を可能にするのに十分であることを確認する。この結果はまた、陰性の健常細胞上の標的分子のレベルが、重要でないことも確認する。
本発明の結合体はまた、ヒトにおける治療用抗体の主要なエフェクター機序の1つであるADCCを媒介する、それらの可能性についても調査される。ヒトPBMCの存在下では、結合体は、RMFペプチドを負荷されたT2細胞(抗原プロセシング欠損細胞株、例えば、国際公開第2012/135854号パンフレットを参照されたい)に対して、用量依存性PBMC ADCCを媒介するが、T2細胞単独または対照ペプチドでパルス処理されたT2細胞に対しては媒介しない。結合体はまた、中皮腫細胞株、JMN、および白血病細胞株BV173などの腫瘍細胞上でHLA−A0201分子によって自然に提示されたRMFエピトープに対しても、ADCCを媒介できるが、MSTOまたはHL−60などのHLA−A2陰性細胞に対しては媒介できない。これらの結果は、結合体が、RMFおよびHLA−A0201複合体を生理学的レベルで天然に発現する細胞に対して、ならびに細胞株上で、特異的ADCCを媒介することを実証する。
本発明の結合体は、生体内NOD SCIDγ(NSG)マウス異種移植モデルにおいてさらに調べられる。マウスは、BV173 bcr/abl陽性急性リンパ芽球性白血病で、6日前に静脈内に異種移植される。治療の時点で、マウスは、肝臓、脾臓、およびBMにおいて、ルシフェラーゼイメージングによって可視化される白血病を発症した。本発明の結合体は、少なくとも30日間にわたり、腫瘍負荷を劇的に減少させる。結果は、抗体の用量を滴定することによって確認される。
Claims (17)
- 細胞表面で、配列番号1のペプチドとHLA−A0201の複合体に特異的に結合する、単離された抗体またはその断片。
- 前記抗体またはその断片が、配列番号64のペプチドとHLA−A0201の複合体に対するEC50よりも少なくとも10倍低いEC50で、配列番号1のペプチドとHLA−A0201の複合体に結合する、請求項1に記載の抗体またはその断片。
- 前記抗体または抗体断片が、配列番号64のペプチドとHLA−A0201の複合体に結合しない、請求項1〜2のいずれか一項に記載の抗体またはその断片。
- 前記抗体またはその断片が、Fab形態および免疫グロブリン形態で10nM未満のEC50を有する、請求項1〜3のいずれか一項に記載の抗体またはその断片。
- 前記細胞が、配列番号1のペプチドとHLA−A0201の前記複合体を発現する細胞である、請求項1〜4のいずれか一項に記載の抗体またはその断片。
- 配列番号1のペプチドとHLA−A0201の前記複合体を発現する前記細胞が、がん細胞である、請求項5に記載の抗体またはその断片。
- 前記抗体またはその断片が、
(a)配列番号7のHCDR1領域、配列番号8のHCDR2領域、配列番号9のHCDR3領域、配列番号10のLCDR1領域、配列番号11のLCDR2領域、および配列番号12のLCDR3領域;
(b)配列番号17のHCDR1領域、配列番号18のHCDR2領域、配列番号19のHCDR3領域、配列番号20のLCDR1領域、配列番号21のLCDR2領域、および配列番号22のLCDR3領域;
(c)配列番号27のHCDR1領域、配列番号28のHCDR2領域、配列番号29のHCDR3領域、配列番号30のLCDR1領域、配列番号31のLCDR2領域、および配列番号32のLCDR3領域;
(d)配列番号37のHCDR1領域、配列番号38のHCDR2領域、配列番号39のHCDR3領域、配列番号40のLCDR1領域、配列番号41のLCDR2領域、および配列番号42のLCDR3領域;
(e)配列番号47のHCDR1領域、配列番号48のHCDR2領域、配列番号49のHCDR3領域、配列番号50のLCDR1領域、配列番号51のLCDR2領域、および配列番号52のLCDR3領域;
(f)配列番号57のHCDR1領域、配列番号58のHCDR2領域、配列番号59のHCDR3領域、配列番号60のLCDR1領域、配列番号61のLCDR2領域、および配列番号62のLCDR3領域
を含んでなる、請求項1〜3のいずれか一項に記載の抗体またはその断片。 - 前記抗体またはその断片が、
(a)配列番号5の可変重鎖と配列番号6の可変軽鎖;
(b)配列番号15の可変重鎖と配列番号16の可変軽鎖;
(c)配列番号25の可変重鎖と配列番号26の可変軽鎖;
(d)配列番号35の可変重鎖と配列番号36の可変軽鎖;
(e)配列番号45の可変重鎖と配列番号46の可変軽鎖;
(f)配列番号55の可変重鎖と配列番号56の可変軽鎖
を含んでなる、請求項1〜4のいずれか一項に記載の抗体またはその断片。 - 配列番号1のペプチドとHLA−A0201の複合体に特異的に結合し、請求項7または8に記載の抗体と少なくとも95%相同的である、抗体またはその断片。
- 請求項7〜9のいずれか一項に記載の抗体またはその断片と交差競合する、抗体またはその断片。
- 医療で使用するための請求項1〜10のいずれか一項に記載の抗体またはその断片。
- 前記使用が、がんなどのWT1陽性疾患治療である、請求項11に記載の抗体またはその断片。
- 請求項7〜9のいずれか一項に記載の抗体またはその断片をコードする、単一の核酸配列または複数核酸配列を含んでなる核酸組成物。
- 請求項13に記載の単一の核酸配列または複数の核酸配列を含んでなる、単一のベクターまたは複数のベクターを含んでなるベクター組成物。
- 請求項13に記載の核酸組成物または請求項14に記載のベクター組成物を含んでなる、宿主細胞。
- 請求項1〜10のいずれか一項に記載の抗体またはその断片と薬学的に許容できる担体と、および/または賦形剤とを含んでなる、医薬組成物。
- (a)複数の抗体または抗体断片を含んでなる抗体ライブラリーを配列番号64のペプチドとHLA−A0201の複合体に混合するステップと、
(b)配列番号64のペプチドとHLA−A0201の前記複合体に結合しなかった抗体または抗体断片を抗体ライブラリーから除去するステップと、
(c)ステップ(b)の枯渇抗体ライブラリーを配列番号1のペプチドとHLA−A0201の複合体に混合するステップと、
(d)配列番号1のペプチドとHLA−A0201の前記複合体に結合する、抗体またはその断片を同定するステップと
を含んでなる、請求項1〜10のいずれか一項に記載の抗体またはその断片を同定する方法。
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