JP2018527025A - 抗炎症活性を有する酵素画分 - Google Patents

Abstract

粗ブロメライン抽出物の或る特定の成分がブロメラインの抗炎症利益を支持せず、又は妨げることが驚くべきことに見出された。この好ましくない成分を除去することにより、残りの成分（複数の場合もある）の抗炎症有効性が増大した。
【選択図】図２Ａ

Description

政府所有権：
なし。

関連出願：
本願は、２０１５年８月２０日付で出願された米国仮特許出願第６２／２０７５７０号の優先権を主張するものであり、その内容が引用することにより本明細書の一部をなす。

共同研究契約の当事者
該当なし。

配列表
本願では提出された機械可読配列表ファイルが引用することにより本明細書の一部をなす。

本発明者による先開示
なし。

パイナップルは、南アメリカ及び中央アメリカの先住民の間で薬用植物としての長い伝統を有する。パイナップルの果実からの最初のブロメラインの単離は、ベネズエラの化学者であるVicente Marcanoによって１８９１年に記録されている。１８９２年には、Russell Henry ChittendenがElliott P. Joslin及びFrank Sherman Mearaの支援の下でこの物質の十分な調査を行い、「ブロメリン」と名付けた。後に「ブロメライン」という用語が提唱され、当初はこの用語がパイナップル科植物の任意の成員に由来する任意のプロテアーゼに適用された。

ブロメラインは民間及び現代医薬用途の長い歴史を有し、代替医療における潜在的治癒剤としての探究が続けられている。ブロメラインは植物療法薬としても広く認められている。ブロメラインは１９５７年に初めて治療補助剤として導入された。ブロメラインに対する研究は初めハワイで行われたが、ここ最近ではアジア、欧州及びラテンアメリカの国々で行われている。近年ではドイツの研究者がブロメライン研究に大きな関心を持っている。現在、ブロメラインはドイツにおいて１３番目に広く使用されている植物薬である。

ブロメラインの治療利益の一部は血小板凝集の可逆的阻害、狭心症の可逆的阻害、気管支炎及び副鼻腔炎の可逆的阻害、外科手術による外傷、血栓性静脈炎及び腎盂腎炎の治療である。ブロメラインは、外科手術又は外傷後に特に鼻及び副鼻腔の腫脹（炎症）を低減するためにも使用することができる。ブロメラインは激しい運動の後の筋肉痛の予防にも使用される。ブロメラインが腫瘍細胞の成長を妨げ、血液凝固を遅らせることも報告されている。ブロメラインは花粉症、腫脹及び潰瘍（潰瘍性大腸炎）を含む腸病態の治療、火傷後の壊死組織及び損傷組織の除去（デブリードマン）、肺における水の蓄積（肺水腫）の予防、筋肉の弛緩、筋収縮の刺激、抗生物質の吸収の改善、癌の予防、労働の短縮、また身体の脂肪を落とすのを補助するためにも使用されている。食品調製物においては、ブロメラインは食肉軟化剤として、またビールの清澄化に使用されている。

全身酵素療法（ブロメライン、トリプシン、キモトリプシン及びパパイン等のタンパク質分解酵素の組合せからなる）が乳癌、結腸直腸癌及び形質細胞腫患者の治療に対して欧州で調査されている。実験的大腸炎を有するマウスでは、パイナップルの茎又は新鮮果汁に由来する６ヶ月間の飼料ブロメラインが結腸炎症の重症度を減少させ、結腸における癌性病変の数を低減した。

ブロメラインは潜在的抗炎症剤として関節炎、アレルギー性気道疾患及び多発性硬化症の治療に有用であり得るが、ヒト研究ではこの用途について確認されておらず、アメリカ食品医薬品局又は欧州食品安全機関によるかかる作用についての健康強調表示も認可されていない。自然薬品総合データベース（Natural Medicines Comprehensive Database）によると、ブロメラインはトリプシン（異なるプロテアーゼ）及びルチン（ソバ中に見られる物質）と併せて使用した場合に、骨関節炎の管理において幾つかの処方鎮痛薬と同様に効果的であることが示唆されている。ブロメラインをトリプシン及びルチンと組み合わせた製品（ＷＯＢＥＮＺＹＭＥ（商標））が市販されており、骨関節炎患者において疼痛を低減し、膝機能を改善するようである。しかしながら、アメリカ国立衛生研究所は、「ブロメラインがその他の用途のいずれについても効果的であるか否かを決定するのに十分な科学的証拠はない」と指摘している。

当該技術分野ではブロメラインの全粗抽出物の使用が教示されている。しかしながら、粗ブロメラインが粗ブロメラインの所望の有効性に悪影響をもたらす成分を含むことが驚くべきことに見出された。このため、ブロメライン粗抽出物を各々が特定の酵素及び他の成分を含有する多数の別個の画分へと分離した。次いで、これらの画分の各々を系統的に試験し、どの画分がどの作用をもたらすかを特定した。これにより、各々が或る特定の用途に適切な別個の画分へとブロメライン粗抽出物を分離することでその有用性を改善する方法を見出した。

ブロメラインを様々な成分の画分へと分離するプロセスの概略フローチャートである。 Ａ）画分２（Ｆ２）及び画分３（Ｆ３）、並びにピークＣＣＹ、ＣＣＷ及びＣＣＳを同定するブロメライン抽出物のイオン交換クロマトグラフィースペクトル、並びにＢ）粗抽出物のＣＣＹ、ＣＣＷ及びＣＣＳ画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥによって同定された主要タンパク質種を示す図である。 純粋なアナナインを得るためのＣＣＳ画分のサイズ排除クロマトグラフィープロファイル及び金属アフィニティークロマトグラフィープロファイル（Ａ、Ｂ）、並びにＳＤＳ−ＰＡＧＥによるアナナインタンパク質のサイズ（Ｃ）を示す図である。 本明細書で単離された或る特定のポリペプチドのアミノ末端の比較を示す図である。 抗ＣＤ３ ｍＡｂ投与の２時間又は６時間後のマウスにおけるサイトカインレベルに対するアナナインの作用を示す図である。 抗ＣＤ３ ｍＡｂ投与の２時間又は６時間後のマウスにおけるサイトカインレベルに対するブロメラインの作用を示す図である。 ｍＡｂを投与した（＋ｍＡｂ）又はｍＡｂ抗体を投与しない（−ｍＡｂ）マウスにおける２時間又は６時間後のサイトカインレベルに対するＦ１の作用を示す図である。

ブロメライン及びその成分
「ブロメライン」はパイナップル植物（アナナス・コモスス（Ananas comosus））から得られる粗タンパク質分解抽出物の総称である。新鮮パイナップル果実から得られる果実ブロメライン及びこの植物の茎から得られる茎ブロメラインという２つの形態のブロメラインが知られている。ブロメラインの主な商業的供給源は茎ブロメラインであるため、「ブロメライン」及び「茎ブロメライン」という用語は区別なく用いられることが多い。

茎ブロメライン
ブロメライン内の主要タンパク質分解酵素は、茎ブロメラインと呼ばれるプロテアーゼＣＡＳ ３７１８９−３４−７（ＥＣ３．４．２２．３２）である。このプロテアーゼ酵素は、システイン側鎖の遊離スルフヒドリル基が機能に必要されることからスルフヒドリルプロテアーゼと称される。茎ブロメラインはタンパク質の切断について広い特異性を有し、小分子基質内のＺ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−｜−ＮＨＭｅｃに対して強い選好性を有する。

果実ブロメライン
果実ブロメライン抽出物内の主要プロテアーゼは、果実ブロメライン（ＥＣ３．４．２２．３３）と呼ばれる。このプロテアーゼ酵素は、システイン側鎖の遊離スルフヒドリル基が機能に必要されることからスルフヒドリルプロテアーゼと称される。果実ブロメラインは、Ｂｚ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−｜−ＮＨＭｅｃに対して強い選好性を有する。

アナナイン
アナナイン（ＥＣ３．４．２２．３１）はパイナップル植物の茎から単離することができる。アナナインは、ニワトリシスタチンによって阻害されるという点で茎ブロメライン及び果実ブロメラインとは異なる。アナナインはタンパク質の加水分解を触媒し、ペプチド結合について広い特異性を有する。アナナインは果実ブロメラインよりも広い特異性を有するが、最もよく報告されている小分子基質はＢｚ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−｜−ＮＨＭｅｃである。

コモサイン
コモサインはパイナップル植物の茎から単離することができる。最もよく報告されているコモサインの小分子基質はＺ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＮＨ−Ｍｅｃである。コモサインは、Ｎ末端に２０アミノ酸配列ＶＰＱＳＩ ＤＷＲＮＹ ＧＡＶＴＳ ＶＫＮＱＧを有する。コモサインは一残基を除いてアナナインと相同である。

ＣＣＳ、ＣＣＷ及びＣＣＹ、並びにＦ２及びＦ３の製造
例示的な製造プロセスを概説するフローチャートを図１に示す。

試薬
粗ブロメライン（タンパク質分解活性、１５４１ｎｍｏｌ／分／ｍｇ）は、Solvay Inc.（Germany）から入手した。ＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰは、GE Healthcare（Sydney，Australia）から入手した。Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５媒体及びＨｉ−Ｔｒａｐ Ｍｅｔａｌ Ａｆｆｉｎｉｔｙ ＦＦ ｃｈｅｌａｔｉｎｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅは、Amersham Biosciencesから入手した。Ｐｒｅｃａｓｔ ４−１２％ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ ＮｕＰＡＧＥアクリルアミドゲルは、Invitrogen（Sydney，Australia）から入手した。広範囲分子量マーカーはBio-Rad Laboratories（Sydney，Australia）から、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）ウエスタンブロット膜はRoche Diagnostics GmbH（Castle Hill，Australia）から入手した。Ｐｒｅｃａｓｔ １２％アクリルアミドミニゲルは、Novex-Electrophoresis（Frankfurt，Germany）から入手した。Ｐｈａｒｍａｌｙｔｅ ３〜１０（商標）、Ａｍｐｈｏｌｉｎｅ ９−１１、Ｒｅａｄｙ Ｍｉｘ ＩＥＦ（アクリルアミド、ビスアクリルアミド）及びＬＥＦマーカーはPharmacia Biotechから入手した。他の全ての試薬は分析グレードであり、Sigma Chemical Coから入手した。

ブロメラインの調製
以下の全工程は常温（２０℃〜２５℃）で行った。４５０ｍｇのブロメライン粉末を、０．１ｍＭ ＥＤＴＡナトリウムを含有する１５ｍｌの２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）に溶解することによってブロメラインの溶液（３０ｍｇ／ｍｌ）を調製した。次いで、溶液を１３０００×ｇで１０分間遠心分離し、不溶性物質を除去した。透明な上清をクロマトグラフィーに使用した。

イオン交換クロマトグラフィーによる分離
Ｆａｓｔ ｆｌｏｗ Ｓ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムを、２５ｍｌの媒体をＸＫ １６／２０（商標）カラム（Pharmacia Biotech）に充填することによって準備し、ＦＰＬＣシステムで０．１ｍＭ ＥＤＴＡを含有する２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）により３ｍｌ／分で平衡化した。５ｍｌのブロメライン溶液をカラムに注入した。非結合タンパク質を回収し、カラムを１００ｍｌの酢酸緩衝液で洗浄した。カラムに結合したタンパク質を、３００ｍｌにわたる酢酸緩衝液中０→０．８ＭのＮａＣｌの線形勾配により溶出させた。勾配全体を通して５ｍｌの画分を回収した。

図２Ａに、この手順により得た粗ブロメラインから得られる様々なピークの典型的なＵ．Ｖ．クロマトグラムを示す。

Ｕ．Ｖ．プロファイルから同定された対象のＣＣＹ、ＣＣＷ、ＣＣＳピーク、又はＦ２及びＦ３画分をプールし、公称分子量カットオフが１０ｋＤａの限外濾過膜を有するｆｉｌｔｒｏｎ撹拌セルを用いた限外濾過によって濃縮した。次いで、ＰＤ１０カラム（Pharmacia Biotech）を用いて画分を等張生理食塩水（０．９％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ）へと緩衝液交換し、滅菌濾過し（０．２ｕｍ）、タンパク質含量及びタンパク質分解活性を調整した。次いで、サンプルを必要とされるまで−８０℃で凍結した。

図２Ｂに「ＣＣＷ」及び「ＣＣＹ」（茎ブロメラインプロテアーゼを含有する）と称するピーク、並びにピーク「ＣＣＳ」（アナナインを含有する）のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。

ＣＣＹピークは５番目の主要タンパク質ピークとしてカラムから溶出し（３０％の緩衝液Ｂ、４５分〜５０分時点）、ＣＣＷは６番目の主要タンパク質ピークとして溶出する（３５％の緩衝液Ｂ；５０分〜５７分時点）。ＣＣＳはカラムからの最後の二重ピーク（すなわちピーク８）であり、６５分〜７５分時点（６０％の緩衝液Ｂ）で溶出する。

Ｆ２画分はピーク５（ＣＣＹ）、ピーク６（ＣＣＷ）及びピーク７から構成され、４５分〜６５分（３５％〜６０％の緩衝液Ｂ）に溶出する一画分として回収される。Ｆ３画分はＣＣＳピーク及び付随（trailing）ピーク９を含み、６５分〜８５分時点（６０％〜８０％の緩衝液Ｂ）で溶出する一画分として回収される。

製品は純粋なＡＰＩ、又はより粗製の形態、及びＦ２とＦ３との組合せのいずれかを使用して開発することができる。

非常に効果的な抗下痢剤としては、以下のものを挙げることができる：
医薬品 − アナナインと組み合わせた茎ブロメラインプロテアーゼ、すなわち純粋な物質。
より規制の少ない製品。ＣＣシリーズ、すなわち部分的に純粋な画分ＣＣＹ、ＣＣＷ及びＣＣＳ
より規制の少ない製品。Ｆシリーズ、すなわち粗画分。ブロメラインのＦ２＆Ｆ３画分（炎症誘発性成分を除いたブロメラインの抗分泌及び抗炎症画分）。
製品は天然源（すなわちブロメライン）に由来するか、又はピキア（酵母）発現系において発現されるものであってもよい。
よりＦ３：Ｆ２の比率が高い（すなわち抗炎症活性がより高い）製品は、天然ブロメラインに見られる比率よりも効果的である可能性が高い。

ａ）タンパク質アッセイ：
タンパク質濃度を、ＢＣＡ（商標） Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙキット（Pierce，Rockford，USA）を用いて決定した。サンプルを、必要に応じて０．９％生理食塩水又は２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）中で調製したウシ血清アルブミン標準（０〜１．５ｍｇ／ｍｌ）と比較した。

ｂ）プロテイナーゼアッセイ：
様々なクロマトグラフィー画分及び純粋なプロテアーゼの比活性を、ペプチド−ｐ−ニトロアニリド（ｐＮＡ）基質Ｚ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ｐＮＡ（Bachem，Saffron Walden，UK）からのｐ−ニトロアニリンの放出をNapper et al in Biochem. J., 301, 727-735, (1994)に記載のようにモニタリングすることによって決定した。このアッセイは、Filippova et al in Anal. Biochem., 143, 293-297 (1984)の記載に基づくものであった。全てのアッセイを、９６ウェルプレートにおいて３０℃でｉＥＭＳ反応速度プレートリーダー（Life Sciences International，Basingstoke，UK）を用いて行った。最大反応速度をＧｅｎｅｓｙｓ（商標）ソフトウェア（Life Sciences International，Basingstoke，UK）によって決定し、結果をｎｍｏｌ／分の変換された基質として表す。

ｃ）ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）：
サンプルを、プレキャスト４％〜２０％Ｔ勾配ゲルでのＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。サンプルを３００ｕｌのＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液（１０％（ｖ／ｖ）グリセロール、２％（ｗ／ｖ）ドデシル硫酸ナトリウム及び４０ｍＭジチオスレイトールを含有する６２．５ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ６．８））に溶解し、水浴内において９５℃で加熱した。

ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液で２０倍に希釈したＳＤＳ−ＰＡＧＥ広範囲分子量標準を同様に処理し、サンプルと共に泳動した。ゲルをｍｉｎｉ Ｐｒｏｔｅａｎ ＩＩ（商標）電気泳動システムにおいて、Bio-Radのプロトコルに従って２４０Ｖで色素先端がゲルの端に達するまで（３０分〜４５分間）泳動した。

電気泳動後に、分離したタンパク質を軌道混合（orbital mixing）しながら１．５％（ｖ／ｖ）リン酸、１１．２５％（ｗ／ｖ）硫酸アンモニウム及び２５％（ｖ／ｖ）メタノールを含有する０．０７５％（ｗ／ｖ）コロイド状ブリリアントブルーＧ−２５０の溶液中で一晩染色した。明瞭なバックグラウンドを得るために、２５％（ｖ／ｖ）メタノール及び１０％（ｖ／ｖ）酢酸の溶液中でゲルを脱染色した。

ＳＥＣ及びＩＭＡＣによる分離
アナナインを単離するために、分画プロトコルによる「ＣＣＳ」ピークを単離し、サイズ排除クロマトグラフィー及び固定化金属アフィニティークロマトグラフィーを用いて純粋なアナナインを得るための更なる加工に使用した。

サイズ排除クロマトグラフィー。ＣＣＳピークを緩衝液Ｂ（０．１Ｍ酢酸ナトリウム、１ｍＭ二ナトリウムＥＤＴＡ、０．２５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ５．０）で予め平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ ７５ ＨＲ １０／３０カラムにアプライし、成分を１ｍｌ／分の流速で溶出させた。画分（０．５ｍｌ）を回収し、吸光度ピークと関連するものをプールした。これらのプールを、Ｚ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ｐＮＡ基質に対する比活性について分析した。

固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）。最後に溶出するピークを緩衝液Ｃ（２０ｍＭリン酸ナトリウム、１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７）へと緩衝液交換し、透析濾過（５０００Ｄａの公称分子量カットオフのスピン濃縮器）によって濃縮した。Ｈｉ−Ｔｒａｐ Ｍｅｔａｌ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｃｏｌｕｍｎ（１ｍｌ）を用いて成分を更に分離し、以下のように調製した：初めに、カラムにＣｕ^２＋（０．５ｍｌの０．１Ｍ硫酸銅）をロードし、１０カラム容量の緩衝液Ｄ（２０ｍＭリン酸ナトリウム、１Ｍ ＮａＣｌ、２Ｍ ＮＨ_４Ｃｌ、ｐＨ７）で洗浄した後、緩衝液Ｃで平衡化した。次いで、濃縮されたタンパク質サンプル（５ｍｇ／ｍｌ）をカラムに１ｍｌ／分の流速でアプライし、結合した成分を０→２ＭのＮＨ_４Ｃｌの線形勾配によって溶出させた。画分（１ｍｌ）を緩衝液Ｅ（０．２Ｍ酢酸ナトリウム、１ｍＭ二ナトリウムＥＤＴＡ、ｐＨ５、０．５ｍｌ）の入ったチューブに回収した。画分を吸光度ピークに従ってプールした。次いで、各ピークを等張生理食塩水（０．９％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ）へと緩衝液交換した。全てのピークを比活性について検査した。

図３Ａにサイズ排除クロマトグラフィー後のＣＣＳピークの典型的なＵ．Ｖ．クロマトグラムを示す。図３Ｂ及び図３Ｃに、ＩＭＡＣにより得られるアナナインのクロマトグラム及びＳＤＳ−ＰＡＧＥによって観察される純度を示す。

同一性の確認
ａ）等電点フォーカシング
サンプル（０．５ｍｇ／ｍｌ〜１．０ｍｇ／ｍｌ）を脱イオン水で３倍に希釈し、ｐＨ３〜１１の勾配ゲル上で泳動した。Ｒｅａｄｙ Ｍｉｘ ＩＥＦ（商標）を用いてゲルをキャスティングし、１０％（ｖ／ｖ）グリセロール、５．０％Ｐｈａｒｍａｌｙｔｅ ３−１０（商標）及び２．５％Ａｍｐｈｏｌｉｎｅ ９〜１１（商標）を含有する５．５％Ｔ、３％Ｃポリアクリルアミドゲルを得た。簡潔に述べると、７００Ｖでのプレフォーカシング後に１０ｕｌのサンプル及び高ｐＩマーカーをゲル上にロードした。サンプルエントリは５００Ｖで１０分間、フォーカシングは２５００Ｖで１．５時間、バンド鮮明化は３０００Ｖで１０分間とした。電気泳動の後、タンパク質を２０％（ｗ／ｖ）ＴＣＡ溶液により３０分間固定し、脱染色液（destain）中で３０分間洗浄してＴＣＡを除去し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥについて記載したようにブリリアントブルーＧ−２５０で染色した（上記を参照されたい）。

ｂ）タンパク質シークエンシング
単離されたポリペプチドの同一性を確認するために、アミノ末端をシークエンシングした。ＮＨ_２末端シークエンシングのために、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離したタンパク質をＰＶＤＦ膜に電気ブロットし（electroblotted）、４０％（ｖ／ｖ）メタノール中の０．０２５％（ｗ／ｖ）クマシーブルーＲ−２５０で染色し、５０％（ｖ／ｖ）メタノール中で脱染色した。次いで、膜を風乾し、オンラインフェニルチオヒダントインアミノ酸アナライザーを備える気相シークエンサー（Applied Biosystems，Foster City，USA）を用いた自動化エドマン分解によってタンパク質をシークエンシングした。

結果：
クロマトグラフィー後に得られる成分の概要、算出されたそれらの分子量、合成ペプチドＺ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ｐＮＡに対するタンパク質分解活性及び等電点を表１に示す。

図４では、ＣＣＹ及びＣＣＷに由来する茎ブロメラインプロテアーゼ、ＣＣＳに由来するアナナイン及びコモサインの最初の２１個のＮＨ２末端アミノ酸を比較する。１０位の下線付きのＳがアナナインと他のブロメラインプロテアーゼとの間に１つのアミノ酸差しか存在しないことを示すことに留意されたい。全てのタンパク質が配列相同性を共有することが図４に示される。アナナイン及びコモサインは、茎ブロメラインプロテアーゼと比較した場合に２０個のアミノ酸のうち２個が異なる。コモサインはアナナインと２個のアミノ酸が異なる。これらのタンパク質は構造的に関連していることが明らかであるが、全て異なっており、互いに相違を示す。

異なる画分は異なる活性を有する
異なるブロメライン画分は異なる生物学的活性を示す
１． 背景
従来技術から、ブロメラインが相反する様々な生理的作用を有することが明らかである。ブロメラインは免疫系を刺激するように作用する場合もあれば、免疫系を阻害する場合もある。当然ながら、一種の作用を誘導するために投与されるブロメラインが正反対の望ましくない作用を誘導するのであれば、これは大きな欠点となる。

したがって、副作用の可能性を低くするために望ましくない作用を生じるブロメラインの個々の成分を除去することができれば有益であり得る。多様な生物学的作用に関与する粗ブロメラインの活性画分が今回同定された。これらの画分は単一タンパク質ではないが、ごく少数の成分から構成されているため、患者に投与した場合の副作用の可能性は粗ブロメラインと比較して大幅に低減する。

ｉｉ． 研究の概略
この一連の研究では、ブロメライン及びその成分の生物学的作用を調査するために免疫活性化モデルを用いた。ここでは、抗ＣＤ３ε ｍＡｂと呼ばれるモノクローナル抗体（ｍＡｂ）がＴ細胞及びナチュラルキラー（ＮＫ）Ｔ細胞上のＣＤ３（Ｔ細胞受容体）に結合する。次いで、このＴ細胞受容体の結合によりＴ細胞及び他の免疫細胞が活性化し、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）及びインターフェロン（ＩＦＮ）γ、並びに他の炎症誘発性サイトカインを含むサイトカインの全身放出が誘導される。ＴＮＦ等の炎症誘発性サイトカインのレベルの上昇は、マウス及びヒトにおいて自己限定性の下痢を誘導する。

ａ． ブロメラインの分画
ブロメラインをカラムクロマトグラフィーによって分画することで、上記のように、但しはるかに大きな規模でＦ１、Ｆ２及びＦ３画分を得た。すなわち、２０ｇの天然ブロメラインをＸＫ３０／５０カラム上にロードし、はるかに大量の物質を得た。Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３画分を膜透析によって緩衝液交換した。

カラムはロードした全タンパク質のおよそ６６％を保持していた。カラムから溶出した各画分の容量及びタンパク質含量は以下のとおりであった。
Ｆ１：４．１ｍｇ／ｍｌで９８０ｍＬ＝４０１８ｍｇ
Ｆ２：６．２ｍｇ／ｍｌで１２７０ｍＬ＝７８７４ｍｇ
Ｆ３：１．６ｍｇ／ｍｌで８７５ｍＬ＝１４００ｍｇ

Ｆ３のサブサンプルを更に分画し、アナナインを得た。

Ｆ２（１２．７０ｍＬ）及びＦ３（８．７５ｍＬ）の更なるサブサンプルを再び合わせ、イオン交換クロマトグラフィー後に残る６６％のブロメラインポリペプチドに見られるものと同じ割合（８５：１５）でのＦ２＆Ｆ３を得た。

同様の実験において、Ｆ２（１ｍＬ）及びＦ３（４ｍＬ）の更なるサブサンプルを再び合わせ、より多量のＦ３が存在する新たなＦ２＆Ｆ３混合物を得た。

このようにして得られた「Ｆ２＆Ｆ３」混合物を、天然に存在する混合物と以下のように比較する。

上述のように、果実ブロメラインはＢｚ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−｜−ＮＨＭｅｃに対して強い選好性を有する。Ｆ１画分を除去することでＢｚ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−｜−ＮＨＭｅｃ消化が最小限に抑えられると予想される。

次いで、これらの画分を免疫活性について調査した。

ｂ． ｉｎ ｖｉｖｏ Ｔ細胞刺激の抗ＣＤ３εモデル
簡潔に述べると、６週齢〜１０週齢Ｃ５７ＢＬ６雌性マウスにブロメライン、Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３、Ｆ２とＦ３との組合せ、及びアナナインを強制経口投与（１０ｍｌ／ｋｇで４０ｍｇ／ｋｇ）により投与した。続いて２時間後にマウスに０．３μｇ（０．０１５ｍｇ／ｋｇ）の抗ＣＤ３ε ｍＡｂ（ｉｖ）を０．９％パイロジェンフリー生理食塩水中、マウス１匹当たり２００μｌ（１０ｍｌ／ｋｇ）の割合で投与した。

眼窩血サンプルを抗体投与の２時間後にマウスから回収した。末梢血サンプルを抗体投与の６時間後に心穿刺により回収した。２つの時点でサイトカインレベルについて判定したが、一部のサイトカインが血清中で急速に産生され（例えばＴＮＦ、ＩＬ−２及びＩＬ４）、他のサイトカイン（例えばＩＦＮγ）は遅発する。血清を凝固血サンプルから回収し、Ｔｈ１／Ｔｈ２サイトカインキット（BD）及びＦＡＣＳ分析を用いて血清サイトカインレベル（ｐｇ／ｍＬ）について検査した。

ｃ． サイトカインレベルの判定
血清サイトカイン濃度を、Ｔｈ１／Ｔｈ２ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ Ｂｅａｄ Ａｒｒａｙ Ａｎａｌｙｓｉｓを製造業者（BD Biosciences，North Ryde，Australia）の推奨通りに用いて定量化した。

ｄ． 統計分析
統計比較を独立スチューデントｔ検定、又は必要に応じてダネット事後検定による一元配置ＡＮＯＶＡを用いて行った。各群には全てのマウスからの値を含めた。

ｉｉｉ． 結果
図５〜図７にサイトカインレベルに対するアナナイン、ブロメライン及びＦ１の作用の結果を示す。
図５ − 抗ＣＤ３ ｍＡｂ投与の２時間後又は６時間後のマウスにおけるサイトカインレベルに対するアナナインの作用。
図６ − 抗ＣＤ３ ｍＡｂ投与の２時間後又は６時間後のマウスにおけるサイトカインレベルに対するブロメラインの作用。
図７ − ｍＡｂを投与した（＋ｍＡｂ）又はｍＡｂ抗体を投与しない（−ｍＡｂ）マウスにおける２時間又は６時間後のサイトカインレベルに対するＦ１の作用。

ｉｎ ｖｉｖｏでのサイトカインレベルに対するアナナインの作用
本発明者らはアナナインの免疫抑制作用について以前に記載している（Mynott et al.による特許である国際出願ＰＣＴ／ＧＢ９８／００５９０号）。このため、この免疫活性化モデルにおいてアナナインがサイトカイン産生を阻害し得ることを初めに確認した。

アナナインの単回経口投与によりインターロイキン（ＩＬ）−２（ｐ＝０．００３７）、ＩＬ−４（ｐ＜０．０００１）、並びにＴＮＦ（ｐ＝０．００２）及びＩＦＮγ（ｐ＝０．０１５３）を含む幾つかの異なるサイトカインの産生が用量依存的に妨げられることが図５に示される。最低の用量レベル（２００ｕｇ）のアナナインもＩＬ−６産生を阻害した。これらのデータからアナナインが抗炎症剤であることが確認される。

ｉｎ ｖｉｖｏでのサイトカインレベルに対するブロメラインの作用
ブロメラインがアナナインとは異なるサイトカインレベルに対する作用を有することが図６に示される。アナナインと同様、ブロメラインはＩＬ−２（ｐ＜０．０５）及びＩＦＮγ（ｐ＜０．０４）の産生を減少させた。しかしながら、アナナインとは対照的に、ブロメラインはＴＮＦ及びＩＬ−６産生を強く刺激した（ＩＬ−６のデータは示さない）。

ＴＮＦ及びＩＬ−６は強力な炎症誘発性サイトカインである
ＴＮＦの主な役割は免疫細胞を調節することである。ＴＮＦは発熱、悪液質（身体の衰弱）及び炎症を誘導する可能性がある。ＴＮＦ産生レベルの増大は、大鬱病及び炎症性腸疾患（ＩＢＤ）を含む様々なヒト疾患に関連付けられている。

ＩＬ−６は、糖尿病、アテローム性動脈硬化症、鬱病、全身性エリテマトーデス及び関節リウマチ等の多くの疾患における炎症過程及び自己免疫過程を刺激する。

したがって、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＭＡＰキナーゼシグナル伝達を妨げ、サイトカインレベルを減少させるブロメラインの能力（Mynott et al., 1999）にもかかわらず、ブロメラインはｉｎ ｖｉｖｏでサイトカイン産生に対してアナナインとは異なる（多くの場合、逆の）作用を有する。アナナインはｉｎ ｖｉｖｏでサイトカイン産生を一貫して阻害するが、ブロメラインはｉｎ ｖｉｖｏでサイトカイン産生を同時に刺激及び阻害し得る。

ｉｎ ｖｉｖｏでのサイトカインレベルに対するＦ３の作用
アナナインはブロメラインのＦ３画分に由来するため、免疫活性化マウスモデルにおけるその免疫抑制作用を次に調査した。

アナナインのようなＦ３の単回経口投与がＩＬ−２、ＩＬ−４及びＴＮＦを含む幾つかの異なるサイトカインの産生を妨げることが表２に示される。

ｉｎ ｖｉｖｏでのサイトカインレベルに対するＦ２の作用
ブロメラインのＦ２画分が、この免疫活性化マウスモデルにおけるサイトカイン産生に対して無視することができる程の作用しか有しないことが表３に示される。この画分は免疫抑制成分であるアナナインを含有しない。

ｉｎ ｖｉｖｏでのサイトカインレベルに対するＦ１の作用
ブロメラインのＦ１抽出物がサイトカイン産生を刺激することが図７に示される。この免疫刺激作用は、ブロメラインのＦ２又はＦ３画分においては観察されなかった。Ｆ１は抗ＣＤ３ ｍＡｂ投与の２時間後にＩＦＮγの産生を強く刺激するが、ＩＦＮγは通常、抗体投与の少なくとも６時間後までこれらの高いレベルで観察されない（図５及び図６を参照されたい）。Ｆ１が単独で抗ＣＤ３ ｍＡｂを投与していないマウスにおいてサイトカイン産生を刺激する（ｐ＜０．０２）ことも観察された。すなわち、Ｆ１は既に刺激されている免疫系（すなわち、免疫応答を刺激するために抗ＣＤ３が使用されている）においてサイトカインレベルを増大するだけでなく、Ｆ１それ自体が免疫刺激剤として作用する。

したがって、ブロメラインサンプルにおけるＦ１の存在は、ブロメライン投与の目的が免疫応答を抑制することである場合に問題となり得る。すなわち、Ｆ１の存在は免疫応答を更に刺激又は悪化させるという望ましくない作用を有し得る。

ｉｎ ｖｉｖｏでのサイトカインレベルに対するＦ２とＦ３との組合せの作用
サイトカイン産生に対するＦ１画分を除いたブロメラインの作用を次に調査した。

抗体投与の２時間後にＦ２＆Ｆ３の組合せ（ｐ＜０．０５）がＩＬ−２レベルを減少させ、ＩＦＮγに対して中程度の阻害作用を有していたことが表４に示される。ブロメラインもＩＬ−２及びＩＦＮγを低減することが先に認められている（図６）。しかしながら、ブロメラインとは異なり、Ｆ２／Ｆ３の組合せはＴＮＦ産生を刺激しなかった。これは強力なＴＮＦ刺激能を有する免疫刺激成分Ｆ１が画分中にもはや存在していないためであった。

ブロメラインのＦ２＆Ｆ３画分の組合せは、Ｆ３画分及び免疫抑制成分であるアナナインを含有することから阻害活性を有すると予想された。そのため、この組合せがＴＮＦに対して阻害作用を有しないことは驚くべきことであった。ＩＦＮγに対する有効性の低減及びＴＮＦに対する作用の非存在は、少量のＦ３又はアナナインしかＦ２＆Ｆ３画分中に存在していないためであり得る。すなわち、使用されたＦ２＆Ｆ３画分は天然ブロメラインに通常見られる相対的割合（８５：１５というＦ２：Ｆ３の比率）を有していた。すなわち、Ｆ３画分は全Ｆ２＆Ｆ３画分の１５％しか占めていなかった。

したがって、Ｆ２に対するＦ３（ひいてはアナナイン）の割合がより高いＦ２／Ｆ３画分はより大きな免疫抑制作用を有すると予想され得る。

ｉｎ ｖｉｖｏでのサイトカインレベルに対する新たなＦ２＆Ｆ３混合物の作用
Ｆ２に対してより高い割合のＦ３を含有する（Ｆ１画分を除いた）新たなＦ２＆Ｆ３混合物のｉｎ ｖｉｖｏでのサイトカインレベルに対する作用を次に調査した（ｎ＝１群当たり６匹の動物）。先に述べたように強力な炎症性サイトカインであるＴＮＦに対するその作用を調査した。加えて、幾つかの炎症性障害の病因に関連付けられている主要な炎症性ケモカインである単球走化性タンパク質−１（ＭＣＰ−１／ＣＣＬ２）に対するその作用を調査した。

抗体投与の２時間及び６時間後に新たなＦ２＆Ｆ３混合物がＴＮＦ及びＭＣＰ−１レベルを２０％減少させたことが表５に示される。対照的に、Ｆ２及びＦ３はいずれも最小限の作用（先の表４に示される）しか有さず、又は実際にサイトカイン産生を増大させた。Ｆ３は、予想の通りにＴＮＦ及びＭＣＰ−１をそれぞれ３５％及び４０％低減した。

異なる割合の活性Ｆ３を含むＦ２：Ｆ３画分を効率的に作製する方法の１つは、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）等の発現系において活性アナナインを発現させることであり得る。Ｐ．パストリスは組み換えタンパク質を発現させるためによく使用されている。Ｐ．パストリスは生育速度が速く、市販の発酵槽において安価な培地上で大規模に成長させることが可能である。

Ｆ２及びＦ３を発現するクローンを異なる発酵槽において別個に作製し、所望の割合で再構成するか、又は１つの発酵槽で同時に共発現させることができる。

要約すると、Ｆ３はサイトカイン産生を阻害し、Ｆ１はサイトカインを刺激する逆の作用を有し、Ｆ２は作用を有さず、試験したブロメライン画分内の成分の異なる生物学的活性が反映される。

デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）により誘導される潰瘍性大腸炎（炎症性腸疾患）のネズミモデルの２つの研究において、ブロメライン、ＣＣＳ及びアナナインはビヒクル対照群と比較して結腸の長さを増大するという主要エンドポイントを満たした。これらの研究の１番目は予防研究であり、２番目は治療研究であった。結腸直腸の出血の低減、体重の増加及び下痢の低減を含む疾患の他の臨床的指標の顕著な改善も見られた。このモデルはヒト炎症性腸疾患、特に大腸炎の臨床的特徴の多くを再現することが広く認められ、治療作用を実証するのが非常に困難なモデルであると考えられている。ブロメライン及びアナナインはまた、ＩＦＮγ及びＴＮＦを含む多数の主要な炎症性サイトカインの産生を減少させた。

まとめると、これらのデータから、粗ブロメラインの幾つかの異なる成分が実際に異なる活性を有することが示される。抗分泌活性は、イオン交換クロマトグラフィーにおいてピーク「ＣＣＹ」及び「ＣＣＷ」として同定可能な２つの異なるプロテアーゼの各々によってもたらされる。これらのピークはどちらも画分Ｆ２に生じるため、「茎ブロメライン」粗抽出物の一部であると考えることができる。

対照的に、抗炎症活性はイオン交換クロマトグラフィー分離において画分Ｆ３に生じる「ＣＣＳ」ピークとして同定可能なアナナインによってもたらされる。

対照的に、本発明の試験では、画分Ｆ１はいかなる抗炎症活性ももたらさないようであり、残りの画分の抗炎症作用を妨げる可能性がある。

離乳時の炎症を予防し、消化管の健康を改善し、飼料摂取を増大するための茎ブロメラインプロテアーゼ＆アナナインであるＦ２＆Ｆ３の使用
異なる活性を考慮して種々の画分を同定したが、全粗ブロメライン抽出物ではなく、その特定の画分、すなわち画分Ｆ２若しくは画分Ｆ３、又は代替的には画分Ｆ１を除去した全粗抽出物を使用することによって従来技術のブロメライン製品を改善することができる。より具体的には画分Ｆ３のＣＣＳ部分を使用することができ、より具体的には精製アナナインを使用することができる。

画分Ｆ２若しくは画分Ｆ３、又は画分Ｆ１を除去した全粗抽出物、又は画分Ｆ３のＣＣＳ部分、又は精製アナナインを粗ブロメライン抽出物の代わりに使用して、下痢を予防する哺乳仔ブタの予防的治療に好適な投薬量を得ることができる。下痢の（予防ではなく）治療への使用には異なる用量が必要とされ得るが、当業者は容易に適切な用量を導き出すことが可能である。同様に、成体ブタ又はヒトの治療への使用にはより多くの用量が必要とされ得るが、当業者は容易に適切な用量を導き出すことが可能である。必要とされる活性成分（画分Ｆ２若しくは画分Ｆ３、又は画分Ｆ１を除去した全粗抽出物、又は画分Ｆ３のＣＣＳ部分、又は精製アナナイン）の量は、特定の種類の活性成分（画分３よりも少ない質量の精製アナナインが必要とされる）及びその酵素（複数の場合もある）の活性に応じて異なるが、いずれにしても粗ブロメライン抽出物の同等酵素活性に必要とされるよりも少ない質量であるものとする。

本発明の配合物を経口飲薬、例えば水による再構成を必要とする粒状粉末として与えることができる。離乳後下痢を予防するためには、本発明の配合物は離乳日（予想される下痢の発症の１日又は２日前）に単回経口用量として与えることができる。離乳前下痢を予防するためには、単回経口投与を特定の農場の問題期間に応じて２日齢〜５日齢の時点で行うことができる。反復投与が３日〜７日後に必要とされ得る。治療としては、本発明の配合物を疾患の症状が生じた時点で即座に投与することができる。

本発明の配合物は、例えばブタ飼料に添加され得る粒状粉末として調製される飼料添加物として与えることができる。製品の完全な分散を確実にするために、初めに好適な量の飼料成分と混合した後、最終ミックスに組み入れるものとする。本発明の配合物はプレミックスとしてのみ、又は最終ミックスに組み入れたプレミックスとして供給することができる。推奨用量レベルは、従来技術の全ブロメライン組成物に用いられるものと少なくとも同等の酵素活性をもたらし、およそ１４日間連続で毎日供給することができ、又は水に添加され得る。

代替的には、本発明の配合物は錠剤及びカプセル、またヒトに適切な他の投与形態で与えることができる。

当業者は本発明の配合物を種々の適応症に対して調整することができる。例えば、配合物は生産動物（ウシ、ブタ等）における下痢及びヒトにおける下痢の予防及び治療に使用することができる。配合物は、炎症を低減することによる消化管の健康の改善にも使用することができる。代替的には、配合物は生産動物の飼料摂取の増大を促進し、それにより体重増加及び飼料転換効率を促進するために配合してもよい。配合物は、動物飼料における抗生物質及びヒトへの急性投与の必要性を低減するために使用することができる。配合物は、ヒトにおける炎症性腸疾患を改善するためにも使用することができる。

概要
本明細書における本発明の開示を考慮して、容易に或る特定の変形物及び代替物を作製することができる。このため、本特許の法上の範囲は本明細書に列挙した具体例ではなく、法上の特許請求の範囲及び許容可能なその均等物によって限定されることが意図される。

Claims (13)

1. ａ． イオン交換カラムを準備することと、次いで、
   ｂ． 約５のｐＨを有し、約０．１ｍＭのＥＤＴＡを含有する緩衝液を前記カラムにロードすることと、次いで、
   ｃ． ブロメラインを含むポリペプチドを前記カラムにロードすることと、次いで、
   ｄ． 前記カラムを緩衝液で洗浄して、非結合ポリペプチドを除去することと、次いで、
   ｅ． 結合ポリペプチドを前記カラムから緩衝液中約０→約１ＭのＮａＣｌの勾配により溶出させて、溶出液を得ることと、次いで、
   ｆ． 図２Ａに示すピーク１〜４を含有する溶出液を図２Ａに示すピーク５〜９を含有する溶出液から分離して、図２Ａに示すピーク１〜４を含有する第１の画分及び図２Ａに示すピーク５〜９を含有する残りの画分を得ることと、
   を含むプロセスによって得られるポリペプチド画分。
2. 請求項１に記載のプロセスによって調製される、請求項１に記載のポリペプチド画分。
3. 前記イオン交換カラムがＳ−セファロースカラムである、請求項１に記載のポリペプチド画分。
4. 前記緩衝液が酢酸緩衝液を含む、請求項１に記載のポリペプチド画分。
5. 前記プロセスが、
   ｇ． 図２Ａに示すピーク５〜７を含有する溶出液を図２Ａに示すピーク８及び９を含有する溶出液から分離して、図２Ａに示すピーク５〜７を含有する第２の画分並びに図２Ａに示すピーク８及び９を含有する第３の画分を得ること、
   を更に含む、請求項１に記載のポリペプチド画分。
6. 抗分泌有効量の前記第２の画分を与える経口投与形態である、請求項５に記載の第２の画分。
7. 約０．２３：１の相対ｗ／ｗ比での請求項５に記載の第２の画分及び請求項５に記載の第３の画分から本質的になるポリペプチド画分。
8. 相対重量比が２：１未満である、請求項５に記載のポリペプチド画分。
9. 前記相対重量比が１：１未満である、請求項８に記載のポリペプチド画分。
10. 前記相対重量比が０．５：１未満である、請求項９に記載のポリペプチド画分。
11. 前記相対重量比が０．２５：１未満である、請求項１０に記載のポリペプチド画分。
12. 図２Ａのピーク番号１〜４のポリペプチドを実質的に含まないブロメラインポリペプチドから本質的になる組成物。
13. 抗炎症有効量の前記ブロメラインポリペプチドを与える経口投与形態である、請求項１２に記載の組成物。