JP2018527025A - 抗炎症活性を有する酵素画分 - Google Patents
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Abstract
【選択図】図2A
Description
なし。
本願は、2015年8月20日付で出願された米国仮特許出願第62/207570号の優先権を主張するものであり、その内容が引用することにより本明細書の一部をなす。
該当なし。
本願では提出された機械可読配列表ファイルが引用することにより本明細書の一部をなす。
なし。
「ブロメライン」はパイナップル植物(アナナス・コモスス(Ananas comosus))から得られる粗タンパク質分解抽出物の総称である。新鮮パイナップル果実から得られる果実ブロメライン及びこの植物の茎から得られる茎ブロメラインという2つの形態のブロメラインが知られている。ブロメラインの主な商業的供給源は茎ブロメラインであるため、「ブロメライン」及び「茎ブロメライン」という用語は区別なく用いられることが多い。
ブロメライン内の主要タンパク質分解酵素は、茎ブロメラインと呼ばれるプロテアーゼCAS 37189−34−7(EC3.4.22.32)である。このプロテアーゼ酵素は、システイン側鎖の遊離スルフヒドリル基が機能に必要されることからスルフヒドリルプロテアーゼと称される。茎ブロメラインはタンパク質の切断について広い特異性を有し、小分子基質内のZ−Arg−Arg−|−NHMecに対して強い選好性を有する。
果実ブロメライン抽出物内の主要プロテアーゼは、果実ブロメライン(EC3.4.22.33)と呼ばれる。このプロテアーゼ酵素は、システイン側鎖の遊離スルフヒドリル基が機能に必要されることからスルフヒドリルプロテアーゼと称される。果実ブロメラインは、Bz−Phe−Val−Arg−|−NHMecに対して強い選好性を有する。
アナナイン(EC3.4.22.31)はパイナップル植物の茎から単離することができる。アナナインは、ニワトリシスタチンによって阻害されるという点で茎ブロメライン及び果実ブロメラインとは異なる。アナナインはタンパク質の加水分解を触媒し、ペプチド結合について広い特異性を有する。アナナインは果実ブロメラインよりも広い特異性を有するが、最もよく報告されている小分子基質はBz−Phe−Val−Arg−|−NHMecである。
コモサインはパイナップル植物の茎から単離することができる。最もよく報告されているコモサインの小分子基質はZ−Arg−Arg−NH−Mecである。コモサインは、N末端に20アミノ酸配列VPQSI DWRNY GAVTS VKNQGを有する。コモサインは一残基を除いてアナナインと相同である。
例示的な製造プロセスを概説するフローチャートを図1に示す。
粗ブロメライン(タンパク質分解活性、1541nmol/分/mg)は、Solvay Inc.(Germany)から入手した。SP−Sepharose HPは、GE Healthcare(Sydney,Australia)から入手した。Superdex 75媒体及びHi−Trap Metal Affinity FF chelating Sepharoseは、Amersham Biosciencesから入手した。Precast 4−12% Bis−Tris NuPAGEアクリルアミドゲルは、Invitrogen(Sydney,Australia)から入手した。広範囲分子量マーカーはBio-Rad Laboratories(Sydney,Australia)から、ポリフッ化ビニリデン(PVDF)ウエスタンブロット膜はRoche Diagnostics GmbH(Castle Hill,Australia)から入手した。Precast 12%アクリルアミドミニゲルは、Novex-Electrophoresis(Frankfurt,Germany)から入手した。Pharmalyte 3〜10(商標)、Ampholine 9−11、Ready Mix IEF(アクリルアミド、ビスアクリルアミド)及びLEFマーカーはPharmacia Biotechから入手した。他の全ての試薬は分析グレードであり、Sigma Chemical Coから入手した。
以下の全工程は常温(20℃〜25℃)で行った。450mgのブロメライン粉末を、0.1mM EDTAナトリウムを含有する15mlの20mM酢酸緩衝液(pH5.0)に溶解することによってブロメラインの溶液(30mg/ml)を調製した。次いで、溶液を13000×gで10分間遠心分離し、不溶性物質を除去した。透明な上清をクロマトグラフィーに使用した。
Fast flow S−sepharoseカラムを、25mlの媒体をXK 16/20(商標)カラム(Pharmacia Biotech)に充填することによって準備し、FPLCシステムで0.1mM EDTAを含有する20mM酢酸緩衝液(pH5.0)により3ml/分で平衡化した。5mlのブロメライン溶液をカラムに注入した。非結合タンパク質を回収し、カラムを100mlの酢酸緩衝液で洗浄した。カラムに結合したタンパク質を、300mlにわたる酢酸緩衝液中0→0.8MのNaClの線形勾配により溶出させた。勾配全体を通して5mlの画分を回収した。
医薬品 − アナナインと組み合わせた茎ブロメラインプロテアーゼ、すなわち純粋な物質。
より規制の少ない製品。CCシリーズ、すなわち部分的に純粋な画分CCY、CCW及びCCS
より規制の少ない製品。Fシリーズ、すなわち粗画分。ブロメラインのF2&F3画分(炎症誘発性成分を除いたブロメラインの抗分泌及び抗炎症画分)。
製品は天然源(すなわちブロメライン)に由来するか、又はピキア(酵母)発現系において発現されるものであってもよい。
よりF3:F2の比率が高い(すなわち抗炎症活性がより高い)製品は、天然ブロメラインに見られる比率よりも効果的である可能性が高い。
タンパク質濃度を、BCA(商標) Protein Assayキット(Pierce,Rockford,USA)を用いて決定した。サンプルを、必要に応じて0.9%生理食塩水又は20mM酢酸緩衝液(pH5.0)中で調製したウシ血清アルブミン標準(0〜1.5mg/ml)と比較した。
様々なクロマトグラフィー画分及び純粋なプロテアーゼの比活性を、ペプチド−p−ニトロアニリド(pNA)基質Z−Arg−Arg−pNA(Bachem,Saffron Walden,UK)からのp−ニトロアニリンの放出をNapper et al in Biochem. J., 301, 727-735, (1994)に記載のようにモニタリングすることによって決定した。このアッセイは、Filippova et al in Anal. Biochem., 143, 293-297 (1984)の記載に基づくものであった。全てのアッセイを、96ウェルプレートにおいて30℃でiEMS反応速度プレートリーダー(Life Sciences International,Basingstoke,UK)を用いて行った。最大反応速度をGenesys(商標)ソフトウェア(Life Sciences International,Basingstoke,UK)によって決定し、結果をnmol/分の変換された基質として表す。
サンプルを、プレキャスト4%〜20%T勾配ゲルでのSDS−PAGEによって分析した。サンプルを300ulのSDS−PAGEサンプル緩衝液(10%(v/v)グリセロール、2%(w/v)ドデシル硫酸ナトリウム及び40mMジチオスレイトールを含有する62.5mMトリス−HCl(pH6.8))に溶解し、水浴内において95℃で加熱した。
アナナインを単離するために、分画プロトコルによる「CCS」ピークを単離し、サイズ排除クロマトグラフィー及び固定化金属アフィニティークロマトグラフィーを用いて純粋なアナナインを得るための更なる加工に使用した。
a)等電点フォーカシング
サンプル(0.5mg/ml〜1.0mg/ml)を脱イオン水で3倍に希釈し、pH3〜11の勾配ゲル上で泳動した。Ready Mix IEF(商標)を用いてゲルをキャスティングし、10%(v/v)グリセロール、5.0%Pharmalyte 3−10(商標)及び2.5%Ampholine 9〜11(商標)を含有する5.5%T、3%Cポリアクリルアミドゲルを得た。簡潔に述べると、700Vでのプレフォーカシング後に10ulのサンプル及び高pIマーカーをゲル上にロードした。サンプルエントリは500Vで10分間、フォーカシングは2500Vで1.5時間、バンド鮮明化は3000Vで10分間とした。電気泳動の後、タンパク質を20%(w/v)TCA溶液により30分間固定し、脱染色液(destain)中で30分間洗浄してTCAを除去し、SDS−PAGEについて記載したようにブリリアントブルーG−250で染色した(上記を参照されたい)。
単離されたポリペプチドの同一性を確認するために、アミノ末端をシークエンシングした。NH2末端シークエンシングのために、SDS−PAGEによって分離したタンパク質をPVDF膜に電気ブロットし(electroblotted)、40%(v/v)メタノール中の0.025%(w/v)クマシーブルーR−250で染色し、50%(v/v)メタノール中で脱染色した。次いで、膜を風乾し、オンラインフェニルチオヒダントインアミノ酸アナライザーを備える気相シークエンサー(Applied Biosystems,Foster City,USA)を用いた自動化エドマン分解によってタンパク質をシークエンシングした。
クロマトグラフィー後に得られる成分の概要、算出されたそれらの分子量、合成ペプチドZ−Arg−Arg−pNAに対するタンパク質分解活性及び等電点を表1に示す。
異なるブロメライン画分は異なる生物学的活性を示す
1. 背景
従来技術から、ブロメラインが相反する様々な生理的作用を有することが明らかである。ブロメラインは免疫系を刺激するように作用する場合もあれば、免疫系を阻害する場合もある。当然ながら、一種の作用を誘導するために投与されるブロメラインが正反対の望ましくない作用を誘導するのであれば、これは大きな欠点となる。
この一連の研究では、ブロメライン及びその成分の生物学的作用を調査するために免疫活性化モデルを用いた。ここでは、抗CD3ε mAbと呼ばれるモノクローナル抗体(mAb)がT細胞及びナチュラルキラー(NK)T細胞上のCD3(T細胞受容体)に結合する。次いで、このT細胞受容体の結合によりT細胞及び他の免疫細胞が活性化し、腫瘍壊死因子(TNF)及びインターフェロン(IFN)γ、並びに他の炎症誘発性サイトカインを含むサイトカインの全身放出が誘導される。TNF等の炎症誘発性サイトカインのレベルの上昇は、マウス及びヒトにおいて自己限定性の下痢を誘導する。
ブロメラインをカラムクロマトグラフィーによって分画することで、上記のように、但しはるかに大きな規模でF1、F2及びF3画分を得た。すなわち、20gの天然ブロメラインをXK30/50カラム上にロードし、はるかに大量の物質を得た。F1、F2、F3画分を膜透析によって緩衝液交換した。
F1:4.1mg/mlで980mL=4018mg
F2:6.2mg/mlで1270mL=7874mg
F3:1.6mg/mlで875mL=1400mg
簡潔に述べると、6週齢〜10週齢C57BL6雌性マウスにブロメライン、F1、F2、F3、F2とF3との組合せ、及びアナナインを強制経口投与(10ml/kgで40mg/kg)により投与した。続いて2時間後にマウスに0.3μg(0.015mg/kg)の抗CD3ε mAb(iv)を0.9%パイロジェンフリー生理食塩水中、マウス1匹当たり200μl(10ml/kg)の割合で投与した。
血清サイトカイン濃度を、Th1/Th2 Cytokine Cytometric Bead Array Analysisを製造業者(BD Biosciences,North Ryde,Australia)の推奨通りに用いて定量化した。
統計比較を独立スチューデントt検定、又は必要に応じてダネット事後検定による一元配置ANOVAを用いて行った。各群には全てのマウスからの値を含めた。
図5〜図7にサイトカインレベルに対するアナナイン、ブロメライン及びF1の作用の結果を示す。
図5 − 抗CD3 mAb投与の2時間後又は6時間後のマウスにおけるサイトカインレベルに対するアナナインの作用。
図6 − 抗CD3 mAb投与の2時間後又は6時間後のマウスにおけるサイトカインレベルに対するブロメラインの作用。
図7 − mAbを投与した(+mAb)又はmAb抗体を投与しない(−mAb)マウスにおける2時間又は6時間後のサイトカインレベルに対するF1の作用。
本発明者らはアナナインの免疫抑制作用について以前に記載している(Mynott et al.による特許である国際出願PCT/GB98/00590号)。このため、この免疫活性化モデルにおいてアナナインがサイトカイン産生を阻害し得ることを初めに確認した。
ブロメラインがアナナインとは異なるサイトカインレベルに対する作用を有することが図6に示される。アナナインと同様、ブロメラインはIL−2(p<0.05)及びIFNγ(p<0.04)の産生を減少させた。しかしながら、アナナインとは対照的に、ブロメラインはTNF及びIL−6産生を強く刺激した(IL−6のデータは示さない)。
TNFの主な役割は免疫細胞を調節することである。TNFは発熱、悪液質(身体の衰弱)及び炎症を誘導する可能性がある。TNF産生レベルの増大は、大鬱病及び炎症性腸疾患(IBD)を含む様々なヒト疾患に関連付けられている。
アナナインはブロメラインのF3画分に由来するため、免疫活性化マウスモデルにおけるその免疫抑制作用を次に調査した。
ブロメラインのF2画分が、この免疫活性化マウスモデルにおけるサイトカイン産生に対して無視することができる程の作用しか有しないことが表3に示される。この画分は免疫抑制成分であるアナナインを含有しない。
ブロメラインのF1抽出物がサイトカイン産生を刺激することが図7に示される。この免疫刺激作用は、ブロメラインのF2又はF3画分においては観察されなかった。F1は抗CD3 mAb投与の2時間後にIFNγの産生を強く刺激するが、IFNγは通常、抗体投与の少なくとも6時間後までこれらの高いレベルで観察されない(図5及び図6を参照されたい)。F1が単独で抗CD3 mAbを投与していないマウスにおいてサイトカイン産生を刺激する(p<0.02)ことも観察された。すなわち、F1は既に刺激されている免疫系(すなわち、免疫応答を刺激するために抗CD3が使用されている)においてサイトカインレベルを増大するだけでなく、F1それ自体が免疫刺激剤として作用する。
サイトカイン産生に対するF1画分を除いたブロメラインの作用を次に調査した。
F2に対してより高い割合のF3を含有する(F1画分を除いた)新たなF2&F3混合物のin vivoでのサイトカインレベルに対する作用を次に調査した(n=1群当たり6匹の動物)。先に述べたように強力な炎症性サイトカインであるTNFに対するその作用を調査した。加えて、幾つかの炎症性障害の病因に関連付けられている主要な炎症性ケモカインである単球走化性タンパク質−1(MCP−1/CCL2)に対するその作用を調査した。
異なる活性を考慮して種々の画分を同定したが、全粗ブロメライン抽出物ではなく、その特定の画分、すなわち画分F2若しくは画分F3、又は代替的には画分F1を除去した全粗抽出物を使用することによって従来技術のブロメライン製品を改善することができる。より具体的には画分F3のCCS部分を使用することができ、より具体的には精製アナナインを使用することができる。
本明細書における本発明の開示を考慮して、容易に或る特定の変形物及び代替物を作製することができる。このため、本特許の法上の範囲は本明細書に列挙した具体例ではなく、法上の特許請求の範囲及び許容可能なその均等物によって限定されることが意図される。
Claims (13)
- a. イオン交換カラムを準備することと、次いで、
b. 約5のpHを有し、約0.1mMのEDTAを含有する緩衝液を前記カラムにロードすることと、次いで、
c. ブロメラインを含むポリペプチドを前記カラムにロードすることと、次いで、
d. 前記カラムを緩衝液で洗浄して、非結合ポリペプチドを除去することと、次いで、
e. 結合ポリペプチドを前記カラムから緩衝液中約0→約1MのNaClの勾配により溶出させて、溶出液を得ることと、次いで、
f. 図2Aに示すピーク1〜4を含有する溶出液を図2Aに示すピーク5〜9を含有する溶出液から分離して、図2Aに示すピーク1〜4を含有する第1の画分及び図2Aに示すピーク5〜9を含有する残りの画分を得ることと、
を含むプロセスによって得られるポリペプチド画分。 - 請求項1に記載のプロセスによって調製される、請求項1に記載のポリペプチド画分。
- 前記イオン交換カラムがS−セファロースカラムである、請求項1に記載のポリペプチド画分。
- 前記緩衝液が酢酸緩衝液を含む、請求項1に記載のポリペプチド画分。
- 前記プロセスが、
g. 図2Aに示すピーク5〜7を含有する溶出液を図2Aに示すピーク8及び9を含有する溶出液から分離して、図2Aに示すピーク5〜7を含有する第2の画分並びに図2Aに示すピーク8及び9を含有する第3の画分を得ること、
を更に含む、請求項1に記載のポリペプチド画分。 - 抗分泌有効量の前記第2の画分を与える経口投与形態である、請求項5に記載の第2の画分。
- 約0.23:1の相対w/w比での請求項5に記載の第2の画分及び請求項5に記載の第3の画分から本質的になるポリペプチド画分。
- 相対重量比が2:1未満である、請求項5に記載のポリペプチド画分。
- 前記相対重量比が1:1未満である、請求項8に記載のポリペプチド画分。
- 前記相対重量比が0.5:1未満である、請求項9に記載のポリペプチド画分。
- 前記相対重量比が0.25:1未満である、請求項10に記載のポリペプチド画分。
- 図2Aのピーク番号1〜4のポリペプチドを実質的に含まないブロメラインポリペプチドから本質的になる組成物。
- 抗炎症有効量の前記ブロメラインポリペプチドを与える経口投与形態である、請求項12に記載の組成物。
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