JP2018519813A - アルコールの製造方法 - Google Patents

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Abstract

少なくとも１種の高級アルコールを産生することができる微生物細胞が提供され、この場合、当該細胞は、その野生型細胞と比べて、少なくとも１種のアシル−ＣｏＡレダクターゼ（Ｅ１１）の増加した発現を有するように遺伝子操作される。

Description

本発明の分野
本発明は、炭素源から高級アルコールを製造するバイオテクノロジー的方法に関する。特に、当該方法は、炭素源から高級アルコールを製造するために、遺伝子組み換え細胞を使用する。
本発明の背景
ブタノールおよび高級アルコールは、燃料としての使用を含むいくつかの用途を有する。例えば、ブタノールはガソリンとエネルギー含有量がほぼ同じであるため、将来、ブタノールは、ガソリンに取って代わり得る。さらに、代替燃料としてのブタノールは、例えばエタノールと比較して、いくつかの他の優れた特性を有する。そのようなものとしては、ブタノールは、エタノールと比較して、より高いエネルギー含有量を有し、より「蒸発」し難く、容易に輸送可能であることが挙げられる。ブタノールは、ガソリンと比較して、より「蒸発」し難いことでも知られている。これらの理由などから、ブタノールおよび／または関連する高級アルコールに対する、既存の潜在的市場が既に存在している。ブタノールおよび他の高級アルコールは、工業用溶媒としても使用される。高級アルコールは、香水および化粧品産業においても使用される。例えば、ヘキサノールは、香水産業において一般的に使用されている。
現在、ブタノールおよび他の高級アルコールは、主に、石油から製造される。これらの化合物は、環境に悪いガソリンまたは石油を分解することによって得られる。さらに、これらの出発材料のコストは、石油の価格にリンクしているであろうから、将来、石油価格の上昇が予想される中、石油価格における上昇に伴って、ブタノールおよび他の高級アルコールの価格も上昇するかもしれない。したがって、当技術分野において、高級アルコール製造の代替源を見出すことが求められている。
歴史的に（１９００年代〜１９５０年代）、バイオブタノールは、発酵プロセスにおいて、トウモロコシおよび糖蜜から製造されており、当該発酵プロセスは、アセトンおよびメタノールも製造し、典型的にはある特定のブタノール産生性細菌、例えば、クロストリジウム・アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）およびクロストリジウム・ベイジェリンキイ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ）など、によるＡＢＥ（アセトン、ブタノール、エタノール）発酵としても知られていた。この方法は、新たに高まったグリーンエネルギーへの関心により、最近、再び人気を獲得した。しかしながら、当該「コーンスターチブタノール製造」プロセスは、農業トウモロコシ栽培、トウモロコシ穀粒収穫、トウモロコシ穀粒でんぷん処理、およびでんぷん−糖−ブタノール発酵などの多くのエネルギー消費工程を必要とする。「コーンスターチブタノール製造」プロセスは、おそらく、その製造物のブタノールのエネルギー値と同じくらい多くのエネルギーを必要とするかもしれない。
Ａｌｆｏｌ（登録商標）アルコールプロセスは、有機アルミニウム触媒を使用してエチレンから高級アルコールを製造するために使用される方法である。当該反応は、直鎖状の長鎖第一級アルコール（Ｃ２〜Ｃ２８）を生成する。当該プロセスは、エチレンをオリゴマー化するためにアルミニウム触媒を使用し、結果として得られるアルキル基を酸素化させる。しかしながら、この方法は、広範囲のアルコールを生み出し、その分布パターンは維持される。この変わらないパターンは、最も高い需要があるかまたは最も経済的価値のある特定のアルコール範囲のみを製造する製造者の能力を制限する。さらに、当該反応において必要なガスは、非常にクリーンでなければならず、反応を首尾よく行うためには、明確な組成のガスが必要である。
国際公開第２００９１００４３４号にも、炭水化物からブタノールおよびヘキサノールを製造する間接的方法が記載されている。当該方法は、酢酸中間体を製造するためのホモ酢酸生成発酵を含み、当該中間体は、次いで、エタノールへと化学的に転化される。当該エタノールおよび酢酸中間体の残りの部分は、次いで、酪酸およびカプロン酸中間体を製造するために酸発性発酵における基質として使用され、次いで、当該中間体は、ブタノールおよびヘキサノールへと化学的に転化される。しかしながら、この方法は、高価な原材料、例えば、炭水化物などを使用し、２つの追加のプロセス工程である、エステルの形成および当該エステルの化学的水素化を有し、これらの工程は、当該方法をより長くするだけでなく、結果として、進行中に有用な材料の損失を生じる。
Ｐｅｒｅｚ，Ｊ．Ｍ．，２０１２には、クロストリジウム・リュングダリイ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ）の使用により、合成ガスの存在下において短鎖カルボン酸をそれらの対応するアルコールへと転化させる方法が開示されている。しかしながら、対応する高級アルコールへの転化のための基質として、短鎖カルボン酸を加えなければならない。
そのため、現在利用可能な高級アルコール製造方法は、発酵液への当該ガス状基質の物質移動、低い生産性、および結果として生成物の精製のための高いエネルギーコストを生じる、最終生成物の低濃度、といった限界を有している。
したがって、環境への影響も少ないバイオテクノロジー的手段によるブタノールおよび他の高級アルコール製造のための出発材料として、純粋に石油をベースとする供給源またはトウモロコシをベースとする供給源以外の、より持続可能な原材料を見出すことは望ましい。特に、持続可能な原材料からの、ブタノールおよび他の高級アルコールのシンプルで効率的なワンポットバイオテクノロジー的製造が求められている。
本発明の説明
本発明は、少なくとも１種の高級アルコールを産生するように遺伝子操作された細胞を提供する。特に、当該細胞は、エタノールおよび／または酢酸塩を少なくとも１種の高級アルコールへと転化させることが可能であり得る。すなわち、当該細胞は、野生型細胞に比べて、より高い発現レベルにおいてアシル−ＣｏＡレダクターゼを発現するように遺伝子操作され得る。これは、非石油ベースの供給源、例えば、エタノールおよび／または酢酸など、から高級アルコールを製造するために単一の細胞を使用することができるので、有利である。さらに、遺伝子組み換え細胞を使用することは、高級アルコールの製造方法をより効率的にする。
本発明の一態様により、少なくとも１種の高級アルコールを産生することができる微生物細胞が提供され、この場合、当該細胞は、その野生型と比べて、少なくとも１種のアシル−ＣｏＡレダクターゼ（Ｅ１１）（ＥＣ．１．２．１．１０）の増加した発現を有するように遺伝子操作される。
実施例３のプラスミドバックボーンｐＳＯＳ９５の図である。
語句「野生型」は、細胞または微生物に関連して本明細書において使用される場合、野生において自然に見られるような形態のゲノム構成を有する細胞を意味し得る。当該用語は、全細胞または個別の遺伝子の両方に対して適用可能であり得る。したがって、用語「野生型」は、他の態様において（すなわち、１つまたは複数の遺伝子に関して）遺伝子操作されているが関心対象の遺伝子に関しては遺伝子操作されていない細胞も含み得る。したがって、用語「野生型」は、関心対象の特定の遺伝子の遺伝子配列が人によって組み換え手法を用いて少なくとも部分的に変えられているような細胞または遺伝子を包含しない。したがって、本発明のいずれかの態様による野生型細胞は、全ゲノムおよび／または特定の遺伝子に関して遺伝子的変異を有さない細胞を意味する。したがって、一例として、酵素Ｅ１に関する野生型細胞は、当該細胞における酵素Ｅ１の自然な／変更されていない発現を有する細胞を意味する。酵素Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４、Ｅ５、Ｅ６、Ｅ７、Ｅ８、Ｅ９、Ｅ１０、Ｅ１１、Ｅ１２ａ、Ｅ１２ｂ、Ｅ１３、などに関する野生型細胞も同様に解釈することができ、当該細胞における、それぞれ、酵素Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４、Ｅ５、Ｅ６、Ｅ７、Ｅ８、Ｅ９、Ｅ１０、Ｅ１１、Ｅ１２ａ、Ｅ１２ｂ、Ｅ１３、などの自然な／変更されていない発現を有する細胞を意味し得る。
当業者は、当技術分野において既知の任意の方法を使用して、細胞または微生物を遺伝子操作することができるであろう。本発明の任意の態様により、遺伝子操作された当該細胞は、定義された時間間隔において、２時間以内、特に８時間以内または２４時間以内において、野生型細胞よりも、少なくとも２倍、とりわけ少なくとも１０倍、少なくとも１００倍、少なくとも１０００倍、または少なくとも１００００倍、アセトアセテートおよび／または３−ヒドロキシブチレートを形成するように、遺伝子操作され得る。産生物の形成における増加は、例えば、本発明の任意の態様による細胞と野生型細胞とをそれぞれ別々に同じ条件下において（同じ細胞密度、同じ栄養素培地、同じ培養条件）、特定の時間間隔で、好適な栄養素培地において培養し、次いで当該栄養素培地における標的産生物（高級アルコール）の量を特定することによって、特定することができる。
遺伝子操作された当該細胞または微生物は、野生型の細胞または微生物とは遺伝的に異なり得る。本発明の任意の態様により遺伝子操作された微生物と野生型の微生物との間の遺伝子的差異は、野生型の微生物には存在し得ない、遺伝子操作された微生物における完全遺伝子、アミノ酸、ヌクレオチドなどの存在下にあり得る。一例として、本発明の任意の態様による遺伝子操作された微生物は、当該微生物に高級アルコールを産生させることができる酵素を含み得る。本発明の遺伝子操作された微生物と比べて、野生型の微生物は、遺伝子操作された微生物に少なくとも１種の高級アルコールを産生させることができるような酵素、またはその酵素の検出可能な活性を全く有し得ない。本明細書において使用される場合、用語「遺伝子操作された微生物」は、用語「遺伝子操作された細胞」と相互互換的に使用され得る。本明細書の任意の態様による遺伝子操作は、当該微生物の細胞において実施され得る。
本発明の任意の態様による細胞は、当技術分野において既知の任意の方法により、遺伝子的に形質転換される。特に、当該細胞は、国際公開第２００９／０７７４６１号において開示される方法に従って作り出すことができる。
語句「遺伝子操作された細胞は、その野生型と比べて、酵素における増加した活性を有する」は、本明細書において使用される場合、少なくとも２倍、特に少なくとも１０倍、その中でも特に少なくとも１００倍、さらにその中でも特に少なくとも１０００倍、さらにその中でも特に少なくとも１００００倍増加した、それぞれの酵素の活性を意味する。
語句「酵素の増加した活性」は、本明細書において使用される場合、増加した細胞内活性として理解されるべきである。基本的に、酵素活性の増加は、当該酵素をコードする遺伝子配列のコピー数を増加させること、強いプロモーターを使用すること、増加した活性を有する対応する酵素をコードする遺伝子もしくはアレルを用いることによって、ならびに任意選択によりこれらの手段を組み合わせることによって、達成することができる。本発明による方法において使用される遺伝子操作された細胞は、例えば、所望の遺伝子、当該遺伝子のアレル、またはその一部を含むベクターと、当該遺伝子の発現を可能にするベクターとを用いた、形質転換、形質移入、あるいはこれらの方法の併用または組み合わせによって作り出すことができる。異種発現は、特に、当該細胞または染色体外複製型ベクターの染色体における遺伝子またはアレルの統合によって達成される。「酵素の増加した活性」は、酵素の過剰発現と相互互換的に使用され得る。
本発明のいずれかの態様により使用される細胞は、エタノール−カルボキシレート発酵経路を行うことが可能であり得る微生物に由来し得る。本発明のいずれかの態様による細胞は、エタノール−カルボキシレート発酵経路を行うことができ、ならびにエタノールおよび／または酢酸塩を、対応する高級酸に転化させることが可能であり得る。当該エタノール−カルボキシレート発酵経路は、少なくともＳｅｅｄｏｒｆ，Ｈ．ら，２００８に詳細に記載されている。特に、当該微生物は、クロストリジウム・クライベリ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｋｌｕｙｖｅｒｉ）、Ｃ．カルボキシディボランス（Ｃ．ｃａｒｂｏｘｉｄｉｖｏｒａｎｓ）などからなる群から選択され得る。これらの微生物は、それらの野生型形態ではエタノール−カルボキシレート発酵経路を有さないが遺伝子操作の結果としてこの特色を獲得しているような微生物を包含する。特に、当該微生物は、クロストリジウム・クライベリであり得る。
一例として、当該微生物は、Ｅ１からＥ１０より選択される少なくとも１種の酵素を発現する野生型有機体であり得、この場合、Ｅ１は、アルコールデヒドロゲナーゼ（ａｄｈ）であり、Ｅ２は、アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ａｌｄ）であり、Ｅ３は、アセトアセチル−ＣｏＡチオラーゼ（ｔｈｌ）であり、Ｅ４は、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ｈｂｄ）であり、Ｅ５は、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドラターゼ（ｃｒｔ）であり、Ｅ６は、ブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ｂｃｄ）であり、Ｅ７は、電子移動フラビンタンパク質サブユニット（ｅｔｆ）であり、Ｅ８は、コエンザイムＡトランスフェラーゼ（ｃａｔ）であり、Ｅ９は、酢酸キナーゼ（ａｃｋ）であり、およびＥ１０は、ホスホトランスアセチラーゼ（ｐｔａ）である。特に、本発明のいずれかの態様による野生型微生物は、少なくともＥ２、Ｅ３、およびＥ４を発現し得る。さらにその中でも特に、本発明のいずれかの態様による野生型微生物は、少なくともＥ４を発現し得る。
別の実施例において、本発明のいずれかの態様による微生物は、野生型微生物と比べて、Ｅ１からＥ１０より選択される少なくとも１種の酵素の増加した発現を有する、遺伝子操作された有機体であり得、この場合、Ｅ１は、アルコールデヒドロゲナーゼ（ａｄｈ）であり、Ｅ２は、アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ａｌｄ）であり、Ｅ３は、アセトアセチル−ＣｏＡチオラーゼ（ｔｈｌ）であり、Ｅ４は、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ｈｂｄ）であり、Ｅ５は、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドラターゼ（ｃｒｔ）であり、Ｅ６は、ブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ｂｃｄ）であり、Ｅ７は、電子移動フラビンタンパク質サブユニット（ｅｔｆ）であり、Ｅ８は、コエンザイムＡトランスフェラーゼ（ｃａｔ）であり、Ｅ９は、酢酸キナーゼ（ａｃｋ）であり、およびＥ１０は、ホスホトランスアセチラーゼ（ｐｔａ）である。特に、本発明のいずれかの態様による遺伝子操作された微生物は、少なくとも酵素Ｅ２、Ｅ３、およびＥ４を発現し得る。さらにその中でも特に、本発明のいずれかの態様による遺伝子操作された微生物は、少なくともＥ４を発現し得る。酵素Ｅ１からＥ１０は、クロストリジウム・クライベリから単離され得る。
本発明のいずれかの態様によれば、Ｅ１は、エタノールデヒドロゲナーゼであり得る。特に、Ｅ１は、アルコールデヒドロゲナーゼ１、アルコールデヒドロゲナーゼ２、アルコールデヒドロゲナーゼ３、アルコールデヒドロゲナーゼＢ、およびそれらの組み合わせからなる群より選択され得る。その中でも特に、Ｅ１は、ＣＫＬ＿１０７５、ＣＫＬ＿１０７７、ＣＫＬ＿１０７８、ＣＫＬ＿１０６７、ＣＫＬ＿２９６７、ＣＫＬ＿２９７８、ＣＫＬ＿３０００、ＣＫＬ＿３４２５、およびＣＫＬ＿２０６５からなる群より選択されるポリペプチドに対して少なくとも５０％の配列同一性を有し得る。さらにその中でも特に、Ｅ１は、ＣＫＬ＿１０７５、ＣＫＬ＿１０７７、ＣＫＬ＿１０７８、およびＣＫＬ＿１０６７からなる群より選択されるポリペプチドに対して、少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９４％、９５％、９８％、または１００％の配列同一性を有するポリペプチドを含み得る。
本発明のいずれかの態様によれば、Ｅ２は、アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼであり得る。特に、Ｅ２は、アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ１、アルコールデヒドロゲナーゼ２、およびそれらの組み合わせからなる群より選択され得る。特に、Ｅ２は、ＣＫＬ＿１０７４、ＣＫＬ＿１０７６などからなる群より選択されるポリペプチドに対して少なくとも５０％の配列同一性を有し得る。その中でも特に、Ｅ２は、ＣＫＬ＿１０７４、およびＣＫＬ＿１０７６からなる群より選択されるポリペプチドに対して、少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９４％、９５％、９８％、または１００％の配列同一性を有するポリペプチドを含み得る。
本発明のいずれかの態様によれば、Ｅ３は、アセトアセチル−ＣｏＡチオラーゼＡ１、アセトアセチル−ＣｏＡチオラーゼＡ２、アセトアセチル−ＣｏＡチオラーゼＡ３、およびそれらの組み合わせからなる群より選択され得る。特に、Ｅ３は、ＣＫＬ＿３６９６、ＣＫＬ＿３６９７、ＣＫＬ＿３６９８などからなる群より選択されるポリペプチドに対して少なくとも５０％の配列同一性を有し得る。その中でも特に、Ｅ３は、ＣＫＬ＿３６９６、ＣＫＬ＿３６９７、およびＣＫＬ＿３６９８からなる群より選択されるポリペプチドに対して、少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９４％、９５％、９８％、または１００％の配列同一性を有するポリペプチドを含み得る。
本発明のいずれかの態様によれば、Ｅ４は、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ１、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ２などであり得る。特に、Ｅ４は、ＣＫＬ＿０４５８、ＣＫＬ＿２７９５などのポリペプチドに対して少なくとも５０％の配列同一性を有し得る。その中でも特に、Ｅ４は、ＣＫＬ＿０４５８またはＣＫＬ＿２７９５のポリペプチドに対して、少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９４％、９５％、９８％、または１００％の配列同一性を有するポリペプチドを含み得る。
本発明のいずれかの態様によれば、Ｅ５は、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドラターゼ１、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドラターゼ２、およびそれらの組み合わせであり得る。特に、Ｅ５は、ＣＫＬ＿０４５４、ＣＫＬ＿２５２７などからなる群より選択されるポリペプチドに対して少なくとも５０％の配列同一性を有し得る。その中でも特に、Ｅ５は、ＣＫＬ＿０４５４およびＣＫＬ＿２５２７からなる群より選択されるポリペプチドに対して、少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９４％、９５％、９８％、または１００％の配列同一性を有するポリペプチドを含み得る。
本発明のいずれかの態様によれば、Ｅ６は、ブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ１、ブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ２などからなる群より選択され得る。特に、Ｅ６は、ＣＫＬ＿０４５５、ＣＫＬ＿０６３３などからなる群より選択されるポリペプチドに対して少なくとも５０％の配列同一性を有し得る。その中でも特に、Ｅ６は、ＣＫＬ＿０４５５およびＣＫＬ＿０６３３からなる群より選択されるポリペプチドに対して、少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９４％、９５％、９８％、または１００％の配列同一性を有するポリペプチドを含み得る。
本発明のいずれかの態様によれば、Ｅ７は、電子移動フラビンタンパク質αサブユニット１、電子移動フラビンタンパク質αサブユニット２、電子移動フラビンタンパク質βサブユニット１、および電子移動フラビンタンパク質βサブユニット２からなる群より選択され得る。特に、Ｅ７は、ＣＫＬ＿３５１６、ＣＫＬ＿３５１７、ＣＫＬ＿０４５６、ＣＫＬ＿０４５７などからなる群より選択されるポリペプチドに対して少なくとも５０％の配列同一性を有し得る。その中でも特に、Ｅ７は、ＣＫＬ＿３５１６、ＣＫＬ＿３５１７、ＣＫＬ＿０４５６、およびＣＫＬ＿０４５７からなる群より選択されるポリペプチドに対して、少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９４％、９５％、９８％、または１００％の配列同一性を有するポリペプチドを含み得る。
本発明のいずれかの態様によれば、Ｅ８は、コエンザイムトランスフェラーゼ（ｃａｔ）であり得る。特に、Ｅ８は、ブチリル−ＣｏＡ：酢酸ＣｏＡトランスフェラーゼ、スクシニル−ＣｏＡ：コエンザイムＡトランスフェラーゼ、４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ：コエンザイムＡトランスフェラーゼなどからなる群より選択され得る。その中でも特に、Ｅ８は、ＣＫＬ＿３５９５、ＣＫＬ＿３０１６、ＣＫＬ＿３０１８などからなる群より選択されるポリペプチドに対して少なくとも５０％の配列同一性を有し得る。その中でも特に、Ｅ８は、ＣＫＬ＿３５９５、ＣＫＬ＿３０１６、およびＣＫＬ＿３０１８からなる群より選択されるポリペプチドに対して、少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９４％、９５％、９８％、または１００％の配列同一性を有するポリペプチドを含み得る。
本発明のいずれかの態様によれば、Ｅ９は、酢酸キナーゼＡ（ａｃｋ Ａ）であり得る。特に、Ｅ９は、ＣＫＬ＿１３９１などのポリペプチド配列に対して少なくとも５０％の配列同一性を有し得る。その中でも特に、Ｅ９は、ＣＫＬ＿１３９１のポリペプチドに対して、少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９４％、９５％、９８％、または１００％の配列同一性を有するポリペプチドを含み得る。
本発明のいずれかの態様によれば、Ｅ１０は、ホスホトランスアセチラーゼ（ｐｔａ）であり得る。特に、Ｅ１０は、ＣＫＬ＿１３９０などのポリペプチド配列に対して少なくとも５０％の配列同一性を有し得る。その中でも特に、Ｅ１０は、ＣＫＬ＿１３９０のポリペプチドに対して、少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９４％、９５％、９８％、または１００％の配列同一性を有するポリペプチドを含み得る。
一例として、野生型または遺伝子操作された当該微生物は、Ｅ１〜Ｅ１０を発現する。特に、本発明のいずれかの態様による微生物は、野生型の微生物と比べて、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４、Ｅ５、Ｅ６、Ｅ７、Ｅ８、Ｅ９、Ｅ１０、またはそれらの組み合わせの増加した発現を有し得る。一例として、遺伝子操作された微生物は、野生型の微生物と比べて、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４、Ｅ５、Ｅ６、Ｅ７、Ｅ８、Ｅ９、およびＥ１０の増加した発現を有する。その中でも特に、酵素Ｅ１〜Ｅ１０のいずれかの組み合わせは、有機体に存在することにより、少なくとも１種のカルボン酸を産生できるようにし得る。一例として、本発明のいずれかの態様により使用される遺伝子操作された有機体は、酵素Ｅ１〜Ｅ１０のいずれかによる組み合わせを含み得、それらの酵素は、当該有機体が同時に少なくとも１つのタイプ、または２つのタイプ、または３つのタイプのカルボン酸を産生できるようにする。例えば、当該微生物は、同時に、ヘキサン酸、酪酸、および／または酢酸を産生することができ得る。同様に、当該微生物は、酵素Ｅ１〜Ｅ１０の組み合わせを発現するように遺伝子操作され得、それらは、当該有機体が単一のタイプのカルボン酸かまたは様々なカルボン酸のどちらかを産生できるようにする。上記の全ての場合において、当該微生物は、その野生型の形態か、または遺伝子操作された形態であり得る。
一例として、本発明のいずれかの態様による遺伝子操作された微生物は、野生型の微生物と比べて、ヒドロゲナーゼ成熟タンパク質および／または電子輸送複合タンパク質の増加した発現を有する。特に、ヒドロゲナーゼ成熟タンパク質（ｈｙｄ）は、ｈｙｄＥ、ｈｙｄＦ、またはｈｙｄＧからなる群より選択され得る。特に、当該ｈｙｄは、ＣＫＬ＿０６０５、ＣＫＬ＿２３３０、ＣＫＬ＿３８２９などからなる群より選択されるポリペプチドに対して少なくとも５０％の配列同一性を有し得る。その中でも特に、本発明のいずれかの態様により使用される当該ｈｙｄは、ＣＫＬ＿０６０５、ＣＫＬ＿２３３０、およびＣＫＬ＿３８２９からなる群より選択されるポリペプチドに対して、少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９４％、９５％、９８％、または１００％の配列同一性を有するポリペプチドを含み得る。
この明細書全体全体を通して、特に明記されない限り、全てのデータベースコードは、ＮＣＢＩデータベース、より詳細には、２０１４年６月１２日にオンラインされたバージョン、から利用可能な配列を意味し、ならびに、そのような配列がヌクレオチド配列の場合、前者を翻訳することによって得られるポリペプチド配列を包含する。
本発明のいずれかの態様による細胞は、少なくとも１種の高級アルコールを産生することが可能であり得、その場合、当該細胞は、その野生型細胞と比べて、少なくとも１種のアシル−ＣｏＡレダクターゼ（Ｅ１１）の増加した発現を有するように遺伝子操作される。アシル−ＣｏＡレダクターゼは、脂肪酸レダクターゼとも呼ばれ得る。アシル−ＣｏＡレダクターゼは、多数の種類の有機体、例えば、これらに限定されるわけではないが、細菌、植物、菌類、藻類、哺乳動物、昆虫類、甲殻類、および蠕虫類など、において生じることが分かっている。そのようなアシル−ＣｏＡレダクターゼは、多くの場合、「アルコール形成性脂肪族アシル−ＣｏＡレダクターゼ」とも呼ばれ、反応［１］に示されるように、２段階還元によって直接的に脂肪アルコールを産生する。
アシル−ＣｏＡ＋２ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ→脂肪アルコール＋２ＮＡＤ（Ｐ）＋ 反応［１］
特に、Ｅ１１は、それぞれ、ブチリル−ＣｏＡおよび／またはヘキサニル−ＣｏＡからブタノールおよび／またはヘキサノールへの転化を触媒することが可能であり得る。Ｅ１１の発現は、少なくともＬｉｎ， ２０１３またはＳｃｈｉｒｍｅｒ Ａ， ２０１０において開示される方法を使用して測定することができる。別の実施例において、「アルコール形成性脂肪酸アシル−ＣｏＡレダクターゼ」は、二官能性アルコール−／アルデヒド−デヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ／ＡｌｄＤＨ）（ＥＣ１．１．１．１＋１．２．１．１０）も含み得る。この実施例において、Ｅ１１は、Ｃ．アセトブチリクムＤＳＭ ７９２（Ｑ９ＡＮＲ５）、Ｃ．アセトブチリクムＤＳＭ ７９２（Ｐ３３７４４）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ−１２（Ｐ０Ａ９Ｑ７）、エンタモエバ・ヒストリティカ（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ）（Ｑ２４８０３）、ロイコノストック・メセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）ＡＴＣＣ ８２９３（Ｑ０３ＺＳ６）、およびＣ．カルボキシディボランスＰ７（Ｃ６ＰＺＶ５）からなる群より選択される微生物に由来する酵素ＡｄｈＥ２またはＡｄｈＥであり得る。
別の実施例において、本発明のいずれかの態様による細胞は、反応［２］に示されるような２段階プロセスを使用して、脂肪アルコールを産生することが可能であり得る。反応［２］は、反応（２ａ）、（２ｂ）、または２（ｃ）と、反応２（ｄ）との組み合わせであり得る。一例として、本発明のいずれかの態様による細胞は、反応（２ｄ）に示されるようなブタノールの製造のための出発物質として使用されるであろう野生型細胞と比べて、反応（２ａ）、（２ｂ）、および／または２（ｃ）を増加させることでブタナールの産生を増加させることを可能にする酵素の組み合わせを含み得る。
反応［２］
・２（ａ）アシル−ＣｏＡレダクターゼ（ＡＣＲ） （Ｅ１１）
ブチリル−ＣｏＡ＋ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ−＞ブタナール＋ＣｏＡ＋ＮＡＤ（Ｐ）＋
または
・２（ｂ）カルボン酸レダクターゼ（Ｅ１２ａ）
ブチラート＋ＡＴＰ＋ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ−−＞ブタナール＋ＡＤＰ＋Ｐｉ＋ＮＡＤ（Ｐ）＋
または
・２（ｃ）フェレドキシンオキシドレダクターゼ（ＡＯＲ）（Ｅ１２ｂ）
ブチラート＋フェレドキシンｒｅｄ−−＞ブタナール＋フェレドキシンｏｘ
ならびに
・２（ｄ）単官能性ブタノールデヒドロゲナーゼ（ＢＤＨ）（Ｅ１３）
ブタナール＋ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ−−＞ブタノール＋ＮＡＤ（Ｐ）＋
したがって、本発明のいずれかの態様による細胞は、野生型細胞と比べて、酵素Ｅ１１、Ｅ１２ａおよび／またはＥ１２ｂ、ならびにＥ１３の発現の増加を有し得る。Ｅ１１、Ｅ１２ａ、Ｅ１２ｂ、およびＥ１３の例を表１に提供する。
Figure 2018519813
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Ｅ１１は、植物ホホバ（Ｓｉｍｍｏｎｄｓｉａ ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）由来のアシル−ＣｏＡレダクターゼＪｊＦＡＲ（Ｍｅｔｚら，２０００）、動物のアシル−ＣｏＡレダクターゼ、例えば、ネズミ、ヒト、および寄生線虫由来のものなど（ＣｈｅｎｇおよびＲｕｓｓｅｌ，２００４、Ｍｏｔｏら，２００３）からなる群より選択され得る。その中でも特に、Ｅ１１１は、配列番号１に対して５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。特に、Ｅ１１は、配列番号１のアミノ酸配列を含み得る。Ｅ１１は、配列番号２のヌクレオチド配列を含み得る。その中でも特に、Ｅ１１は、配列番号１に対して５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列および／または配列番号２に対して５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み得る。
当該高級アルコールは、ヘキサノール、オクタノール、ノナノール、デカノールなどからなる群より選択され得る。一例として、当該高級アルコールは、１−ヘキサノール、２−ヘキサノール、３−ヘキサノール、１−ヘプタノール、２−ヘプタノール、３−ヘプタノール、４−ヘプタノール、オクタノール、ノナノール、デカノールなどからなる群より選択され得る。
本発明の別の態様により、高級アルコールを製造する方法であって、
（ｂ）本発明のいずれかの態様による遺伝子組み換え微生物細胞を、炭素源Ａを含む培地に接触させる工程
を含む方法が提供される。
用語「接触させる」は、本明細書において使用される場合、本発明のいずれかの態様による細胞と炭素源を含む培地との間の直接的な接触を生じさせることを意味する。例えば、当該細胞と、炭素源を含む当該培地とは、異なるコンパートメントにあってもよい。特に、当該炭素源は、ガス状態であってもよく、それを、本発明のいずれかの態様による細胞を含む培地に加えてもよい。
当該炭素源Ａは、エタノールおよび／または酢酸塩であり得る。一例として、本発明のいずれかの態様による方法は、（ａ）酢酸生成細胞を、炭素源Ｂを含む培地と接触させることにより、炭素源Ａのエタノールおよび／または酢酸塩を産生させる工程であって、当該炭素源ＢがＣＯおよび／またはＣＯ２を含む、第１の工程を含み得る。
用語「酢酸生成細菌」は、本明細書において使用される場合、Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路を実施することができ、その結果として、ＣＯ、ＣＯ２、および／または水素を酢酸塩へと転化させることができる、微生物を意味する。これらの微生物は、それらの野生型形態ではＷｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路を有さないが遺伝子的変更の結果としてこの特色を獲得している微生物を包含する。そのような微生物としては、これらに限定されるわけではないが、大腸菌細胞が挙げられる。これらの微生物は、カルボキシド栄養性細菌としても知られ得る。現在、当技術分野において、２１の異なる属の酢酸生成細菌が知られており（Ｄｒａｋｅら，２００６）、これらは、いくつかのクロストリジウム菌も含み得る（Ｄｒａｋｅ ＆ Ｋｕｓｅｌ，２００５）。これらの細菌は、エネルギー源としての水素と共に、炭素源として二酸化炭素または一酸化炭素を使用することができる（Ｗｏｏｄ，１９９１）。さらに、アルコール、アルデヒド、カルボン酸、ならびに多数のヘキソースも、炭素源として使用することができる（Ｄｒａｋｅら，２００４）。酢酸塩の形成を生じる還元経路は、アセチル−ＣｏＡ経路またはＷｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路と呼ばれる。
特に、当該酢酸生成細菌は、アセトアンアエロビウム・ノテラ（Ａｃｅｔｏａｎａｅｒｏｂｉｕｍ ｎｏｔｅｒａ）（ＡＴＣＣ ３５１９９）、アセトネマ・ロングム（Ａｃｅｔｏｎｅｍａ ｌｏｎｇｕｍ）（ＤＳＭ ６５４０）、アセトバクテリウム・カービノリカム（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｒｂｉｎｏｌｉｃｕｍ）（ＤＳＭ ２９２５）、アセトバクテリウム・マリクム（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍａｌｉｃｕｍ）（ＤＳＭ ４１３２）、アセトバクテリウム種ｎｏ．４４６（Ｍｏｒｉｎａｇａら，１９９０）、アセトバクテリウム・ウィリンガエ（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｗｉｅｒｉｎｇａｅ）（ＤＳＭ １９１１）、アセトバクテリウム・ウッディ（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｗｏｏｄｉｉ）（ＤＳＭ １０３０）、アルカリバクルム・バッキ（Ａｌｋａｌｉｂａｃｕｌｕｍ ｂａｃｃｈｉ）（ＤＳＭ ２２１１２）、アーキオグロブス・フルギダス（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓ）（ＤＳＭ ４３０４）、ブラウティア・プロダクタ（Ｂｌａｕｔｉａ ｐｒｏｄｕｃｔａ）（ＤＳＭ ２９５０、以前はルミノコッカス・プロダクタス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｐｒｏｄｕｃｔｕｓ）、以前はペプトストレプトコッカス・プロダクツス（Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｒｏｄｕｃｔｕｓ））、ブチリバクテリウム・メチロトロフィカム（Ｂｕｔｙｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ）（ＤＳＭ ３４６８）、クロストリジウム・アセティクム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｉｃｕｍ）（ＤＳＭ １４９６）、クロストリジウム・オートエタノゲナム（ＤＳＭ １００６１、ＤＳＭ １９６３０、およびＤＳＭ ２３６９３）、クロストリジウム・カルボキシディボランス（ＤＳＭ １５２４３）、クロストリジウム・コスカッティ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃｏｓｋａｔｉｉ）（ＡＴＣＣ ｎｏ．ＰＴＡ−１０５２２）、クロストリジウム・ドラケイ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｒａｋｅｉ）（ＡＴＣＣ ＢＡ−６２３）、クロストリジウム・フォルミコアセチカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｆｏｒｍｉｃｏａｃｅｔｉｃｕｍ）（ＤＳＭ ９２）、クロストリジウム・グリコリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｇｌｙｃｏｌｉｃｕｍ）（ＤＳＭ １２８８）、クロストリジウム・リュングダリイ（ＤＳＭ １３５２８）、クロストリジウム・リュングダリイＣ−０１（ＡＴＣＣ ５５９８８）、クロストリジウム・リュングダリイＥＲＩ−２（ＡＴＣＣ ５５３８０）、クロストリジウム・リュングダリイＯ−５２（ＡＴＣＣ ５５９８９）、クロストリジウム・マヨムベイ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｍａｙｏｍｂｅｉ）（ＤＳＭ ６５３９）、クロストリジウム・メトキシベンゾボランス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｍｅｔｈｏｘｙｂｅｎｚｏｖｏｒａｎ）（ＤＳＭ １２１８２）、クロストリジウム・ラグスダレイ（ＤＳＭ １５２４８）、クロストリジウム・スカトロゲネス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｃａｔｏｌｏｇｅｎｅｓ）（ＤＳＭ ７５７）、クロストリジウム種ＡＴＣＣ ２９７９７（Ｓｃｈｍｉｄｔら，１９８６）、デスルホトマクルム・クズネツォビイ（Ｄｅｓｕｌｆｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ ｋｕｚｎｅｔｓｏｖｉｉ）（ＤＳＭ ６１１５）、デスルファトマクラム・サーモベンゾイカム亜種サーモシントロフィカム（Ｄｅｓｕｌｆｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ ｔｈｅｒｍｏｂｅｚｏｉｃｕｍ ｓｕｂｓｐ． ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｔｒｏｐｈｉｃｕｍ）（ＤＳＭ １４０５５）、ユーバクテリウム・リモサム（ＤＳＭ ２０５４３）、メタノサルシナ・アセチボランス（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ａｃｅｔｉｖｏｒａｎｓ）Ｃ２Ａ（ＤＳＭ ２８３４）、モーレラ属ＨＵＣ２２−１（Ｓａｋａｉら，２００４，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔ．，Ｖｏｌ．２９，ｐ．１６０７−１６１２）、ムーレラ・サーモアセチカ（ＤＳＭ ５２１、以前はクロストリジウム・サーモアセチカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃｕｍ））、モーレラ・サーモオートトロフィカ（Ｍｏｏｒｅｌｌａ ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃａ）（ＤＳＭ １９７４）、オキソバクター・フェニジイ（Ｏｘｏｂａｃｔｅｒ ｐｆｅｎｎｉｇｉｉ）（ＤＳＭ ３２２）、スポロミュサ・アエリボランス（Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ ａｅｒｉｖｏｒａｎｓ）（ＤＳＭ １３３２６）、スポロミュサ・オバータ（Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ ｏｖａｔａ）（ＤＳＭ ２６６２）、スポロミュサ・シルバセティカ（Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ ｓｉｌｖａｃｅｔｉｃａ）（ＤＳＭ １０６６９）、スポロミュサ・スフェロイデス（Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）（ＤＳＭ ２８７５）、スポロミュサ・ターミティダ（Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ ｔｅｒｍｉｔｉｄａ）（ＤＳＭ ４４４０）、およびサーモアナエロバクター・キブイ（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｋｉｖｕｉ）（ＤＳＭ ２０３０、以前はアセトゲニウム・キブイ（Ａｃｅｔｏｇｅｎｉｕｍ ｋｉｖｕｉ））からなる群より選択され得る。その中でも特に、クロストリジウム・カルボキシディボランスの当該菌株ＡＴＣＣ ＢＡＡ−６２４が使用され得る。さらにその中でも特に、例えば、米国特許出願公開第２００７／０２７５４４７号および米国特許出願公開第２００８／００５７５５４号に記載されているような、クロストリジウム・カルボキシディボランスの「Ｐ７」および「Ｐ１１」で標識された細菌株が使用され得る。
別の特に好適な細菌は、クロストリジウム・リュングダリイであり得る。特に、クロストリジウム・リュングダリイＰＥＴＣ、クロストリジウム・リュングダリイＥＲＩ２、クロストリジウム・リュングダリイＣＯＬ、およびクロストリジウム・リュングダリイＯ−５２からなる群より選択される菌株は、合成ガスをヘキサン酸へと転化させるのに使用され得る。これらの菌株は、例えば、国際公開第９８／００５５８号、国際公開第００／６８４０７号、ＡＴＣＣ ４９５８７、ＡＴＣＣ ５５９８８、およびＡＴＣＣ ５５９８９に記載されている。一例として、酢酸生成細菌および本発明のいずれかの態様による細胞の両方が、炭素源から高級アルコールを作り出すために使用され得る。
一例として、当該酢酸生成細胞は、第１の発酵装置（発酵装置１）に存在し得、ならびに本発明のいずれかの態様による細胞は、第２の発酵装置（発酵装置２）に存在し得る。発酵装置１において、当該酢酸生成細胞は、炭素源Ｂと接触して、酢酸塩および／またはエタノールを産生する。エタノールおよび／または酢酸塩は炭素源Ａであり、次いで、これを、本発明のいずれかの態様による細胞に接触させ、少なくとも１種の高級アルコールを産生する。次いで、当該アルコールは収集されて発酵装置２から分離され得る。発酵装置１において産生された酢酸塩および／またはエタノールは、定期的に発酵装置２へと供給され得、発酵装置２における当該酢酸塩および／またはエタノールは、発酵装置２において高級アルコールへと転化され得るというサイクルが作り出すことができる。
別の実施例において、当該培地は、発酵装置１および２の間でリサイクルされる。結果として、発酵装置１において産生されたエタノールおよび／または酢酸塩は、発酵装置２へと供給され得、高級アルコールへと転化され得る。
さらなる実施例において、酢酸生成細胞と本発明のいずれかの態様による細胞とは、同じ発酵装置に存在し得る。
本発明の別の態様により、高級アルコールの製造のための本発明のいずれかの態様による細胞の使用が提供される。
当業者には理解されるであろうように、前述において説明した好ましい実施形態は、本発明の請求の範囲から逸脱することなく、設計、構成、または操作において変形または変更を加えることができる。例えば、これらの変形は、本発明の請求の範囲によって網羅されることが意図される。
実施例１
高級アルコールの形成のための遺伝子操作されたクロストリジウム・クライベリの生成
Ｃ．ベイジェリンキイＡＴＴＣ ３５７０２由来のアシル−ＣｏＡレダクターゼ（ＡＣＲ）の遺伝子は、クロストリジウム・クライベリに対して最適化されたコドンであり、これをｐＮＷ３３Ｎ（ＡＹ２３７１２２．１）に挿入した。当該ベクターを、プラスミドｐＢ６を産生するように遺伝子操作した。すなわち、ＰＣＲは、グラム陽性複製起点、グラム陰性複製起点、およびベクターｐＮＷ３３Ｎの抗生物質マーカーを増幅した。グラム陽性複製起点およびグラム陰性複製起点の両方をプラスミドにおいて交換した。グラム陰性複製起点は、ｐＵＣ１９であった。ＣＡＴ遺伝子（黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）プラスミドｐＣ１９４由来；Ｈｏｒｉｎｏｕｃｈｉ Ｓ．，１９８２）を、クロストリジウム・クライベリのための抗生物質マーカーとして使用した。Ｃ．クライベリの形質転換は、Ｌｅａｎｇら，２０１３を手本にした。これらの配列を、ｐｔｂプロモーターによって制御されるように形質転換させた。作り出したベクターをｐＢ６−ＡＣＲ＿Ｃｂ（ＣｏＣｌ）と命名した。次いで、当該ベクターｐＢ６−ＡＣＲ＿Ｃｂ（ＣｏＣｌ）を使用して、Ｌｅａｎｇら，２０１３を比較した方法を用いてＣ．クライベリを遺伝子操作した。
遺伝子操作したＣ．クライベリ菌株をＣ．クライベリｐＢ６−ＡＣＲ＿Ｃｂ（ＣｏＣｌ）と命名した。
実施例２
遺伝子操作されたクロストリジウム・クライベリによる酢酸塩およびエタノールからのブタノールの形成
エタノールおよび酢酸塩からブタノールへの生体内変化のために、細菌クロストリジウム・クライベリｐＢ６−ＡＣＲ＿Ｃｂ（ＣｏＣｌ）を使用した。全ての培養工程は、嫌気性条件下において、ブチルゴム栓によって気密密閉された耐圧ガラス瓶内において実施した。
ブタノール生産培養のために、１００ｍｌのＤＭＳＺ ５２培地（ｐＨ＝７．０；１０ｇ／Ｌの酢酸カリウム、０．３１ｇ／ＬのＫ２ＨＰＯ４、０．２３ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、０．２５ｇ／ｌのＮＨ４Ｃｌ、０．２０ｇ／ｌのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１ｇ／Ｌの酵母抽出物、０．５０ｍｇ／Ｌのリザズリン、１０μｌ／ｌのＨＣｌ（２５％、７．７Ｍ）、１．５ｍｇ／ＬのＦｅＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、７０μｇ／ＬのＺｎＣｌ２・７Ｈ２Ｏ、１００μｇ／ＬのＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、６μｇ／ＬのＨ３ＢＯ３、１９０μｇ／ＬのＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、２μｇ／ＬのＣｕＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、２４μｇ／ＬのＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、３６μｇ／ＬのＮａ２ＭＯ４・２Ｈ２Ｏ、０．５ｍｇ／ＬのＮａＯＨ、３μｇ／ＬのＮａ２ＳｅＯ３・５Ｈ２Ｏ、４μｇ／ＬのＮａ２ＷＯ４・２Ｈ２Ｏ、１００μｇ／ＬのビタミンＢ１２、８０μｇ／Ｌのｐ−アミノ安息香酸、２０μｇ／ＬのＤ（＋）ビオチン、２００μｇ／Ｌのニコチン酸、１００μｇ／ＬのＤ−Ｃａ−パントテネート、３００μｇ／Ｌの塩酸ピリドキシン、２００μｇ／ｌのチアミン−ＨＣｌ・２Ｈ２Ｏ、２０ｍｌ／Ｌのエタノール、２．５ｇ／ＬのＮａＨＣＯ３、０．２５ｇ／Ｌのシステイン−ＨＣｌ・Ｈ２Ｏ、０．２５ｇ／ＬのＮａ２Ｓ・９Ｈ２Ｏ）および７．５ｍｇ／Ｌのチアムフェニコールを２５０ｍｌ瓶において、クロストリジウム・クライベリｐＢ６−ＡＣＲ＿Ｃｂ（ＣｏＣｌ）の５ｍｌの凍結培養物と共に植菌した。
この増殖培養物を、嫌気的に３７℃において２３７時間インキュベートした。当該培養期間の開始時および終了時に試料を採取した。光学濃度、ｐＨ、様々な検体（ＮＭＲで分析）のために、これらを試験した。
結果は、酢酸塩の量が１０ｇ／ｌから２ｇ／ｌに減少し、ならびにエタノールの量が１５．８ｇ／ｌから８．６ｇ／ｌに減少したことを示した。さらに、酪酸の濃度は、０ｇ／ｌから２．４ｇ／ｌに増加し、ならびにヘキサン酸の濃度は、０ｇ／ｌから６．３ｇ／ｌに増加した。Ｃ．クライベリｐＢ６を有する空ベクター（対照菌株）とは異なり、Ｃ．・クライベリｐＢ６−ＡＣＲ＿Ｃｂ（ＣｏＣｌ）は、０．０６ｇ／Ｌのブタノールおよび０．０８ｇ／Ｌのヘキサノールも産生した。
実施例３
高級アルコールの形成のための遺伝子操作されたクロストリジウム・クライベリの生成
Ｃ．ベイジェリンキイＡＴＴＣ ３５７０２に由来するアシル−ＣｏＡレダクターゼ（ＡＣＲ）の遺伝子は、クロストリジウム・クライベリに対して最適化されたコドンであり、これをベクターｐＥｍｐｔｙに挿入する。このプラスミドは、プラスミドバックボーンｐＳＯＳ９５をベースとしている（図１）。ベクターｐＳＯＳ９５をＢａｍＨＩおよびＫａｓＩで消化する。これは、オペロンｃｔｆＡ−ｃｔｆＢ−ａｄｃを除去するが、ａｄｃのｔｈｌプロモーターおよびｒｈｏ非依存性ターミネーターは残す。作成されたベクターをｐＮＷ９５−ＡＣＲ＿Ｃｂ（ＣｏＣｌ）と命名する。次いで、ベクターｐＮＷ９５−ＡＣＲ＿Ｃｂ（ＣｏＣｌ）を使用して、Ｌｅａｎｇら，２０１３において教示される方法を用いてＣ．クライベリを遺伝子操作する。当該遺伝子操作されたＣ．クライベリ菌株をＣ．クライベリｐＮＷ９５−ＡＣＲ＿Ｃｂ（ＣｏＣｌ）と命名する。
実施例４
酢酸塩およびエタノールからブタノールを形成する遺伝子操作されたクロストリジウム・クライベリ
エタノールおよび酢酸塩からブタノールへの生体内変化のために、細菌クロストリジウム・クライベリｐＮＷ９５−ＡＣＲ＿Ｃｂ（ＣｏＣｌ）を使用する。全ての培養段階は、嫌気性条件下において、ブチルゴム栓によって気密密閉することができる耐圧性ガラス瓶中において行う。
ブタノール生産培養のために、１００ｍｌのＤＭＳＺ ５２培地（ｐＨ＝７．０；１０ｇ／Ｌの酢酸カリウム、０．３１ｇ／ＬのＫ２ＨＰＯ４、０．２３ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、０．２５ｇ／ｌのＮＨ４Ｃｌ、０．２０ｇ／ｌのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１ｇ／Ｌの酵母抽出物、０．５０ｍｇ／Ｌのリザズリン、１０μｌ／ｌのＨＣｌ（２５％、７．７Ｍ）、１．５ｍｇ／ＬのＦｅＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、７０μｇ／ＬのＺｎＣｌ２・７Ｈ２Ｏ、１００μｇ／ＬのＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、６μｇ／ＬのＨ３ＢＯ３、１９０μｇ／ＬのＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、２μｇ／ＬのＣｕＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、２４μｇ／ＬのＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、３６μｇ／ＬのＮａ２ＭＯ４・２Ｈ２Ｏ、０．５ｍｇ／ＬのＮａＯＨ、３μｇ／ＬのＮａ２ＳｅＯ３・５Ｈ２Ｏ、４μｇ／ＬのＮａ２ＷＯ４・２Ｈ２Ｏ、１００μｇ／ＬのビタミンＢ１２、８０μｇ／Ｌのｐ−アミノ安息香酸、２０μｇ／ＬのＤ（＋）ビオチン、２００μｇ／Ｌのニコチン酸、１００μｇ／ＬのＤ−Ｃａ−パントテン酸、３００μｇ／Ｌの塩酸ピリドキシン、２００μｇ／ｌのチアミン−ＨＣｌ・２Ｈ２Ｏ、２０ｍｌ／Ｌのエタノール、２．５ｇ／ＬのＮａＨＣＯ３、０．２５ｇ／Ｌのシステイン−ＨＣｌ・Ｈ２Ｏ、０．２５ｇ／ＬのＮａ２Ｓ・９Ｈ２Ｏ）および７．５ｍｇ／Ｌのチアムフェニコールを２５０ｍｌ瓶において、クロストリジウム・クライベリｐＮＷ９５−ＡＣＲ＿Ｃｂ（ＣｏＣｌ）の５ｍｌの凍結培養物と共に植菌する。
この増殖培養物を、３７℃で２３７時間、嫌気的にインキュベートする。培養期間の開始時および終了時に、試料を採取する。光学濃度、ｐＨ、および異なる検体（ＮＭＲで分析）のために、これらを試験した。
結果は、酢酸塩およびエタノールの量が減少するのを示している。さらに、酪酸およびヘキサン酸の濃度も増加する。空ベクター（対照菌株）を有するＣ．クライベリｐＥｍｐｔｙと比べて、Ｃ．クライベリｐＮＷ９５−ＡＣＲ＿Ｃｂ（ＣｏＣｌ）は、ブタノールおよびヘキサノールを産生する。

Claims (15)

  1. 少なくとも１種の高級アルコールを産生することができる微生物細胞であって、野生型細胞と比べて、少なくとも１種のアシル−ＣｏＡレダクターゼ（Ｅ１１）の増加した発現を有するように遺伝子操作され、ならびに、エタノール−カルボキシレート発酵を使用してカルボン酸および／またはそのエステルを産生することができる、細胞。
  2. アルコールデヒドロゲナーゼＥ１、アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼＥ２、アセトアセチル−ＣｏＡチオラーゼＥ３、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼＥ４、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドラターゼＥ５、ブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼＥ６、電子移動フラビンタンパク質サブユニットＥ７、コエンザイムＡトランスフェラーゼＥ８、酢酸キナーゼＥ９、ホスホトランスアセチラーゼＥ１０からなる群より選択される少なくとも１種の酵素を発現する、請求項１に記載の細胞。
  3. クロストリジウム・クライベリ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｋｌｕｙｖｅｒｉ）およびＣ．カルボキシディボランス（Ｃ．ｃａｒｂｏｘｉｄｉｖｏｒａｎｓ）からなる群より選択される微生物に由来する、請求項１または２に記載の細胞。
  4. アシル−ＣｏＡレダクターゼ（Ｅ１１）が、以下の反応１および／または反応２（ａ）：
    反応１：アシル−ＣｏＡ＋２ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ→脂肪アルコール
    反応２（ａ）：ブチリル−ＣｏＡ＋ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ−＞ブタナール＋ＣｏＡ＋ＮＡＤ（Ｐ）＋
    を触媒することができる、請求項１から３のいずれか一項に記載の細胞。
  5. Ｅ１１が、クロストリジウム・ベイジェリンキイ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ）に由来する、請求項１から４のいずれか一項に記載の細胞。
  6. Ｅ１１が、配列番号１に対して６０％の配列同一性を有する、請求項１から５のいずれか一項に記載の細胞。
  7. さらに、その野生型細胞と比べて、単官能性ブタノール−デヒドロゲナーゼ（ＢＤＨ）（Ｅ１３）の増加した発現を有するように遺伝子操作された、請求項１から６のいずれか一項に記載の細胞。
  8. さらに、その野生型細胞と比べて、カルボン酸レダクターゼ（Ｅ１２ａ）、フェレドキシンオキシドレダクターゼ（ＡＯＲ）（Ｅ１２ｂ）、および／または単官能性ブタノール−デヒドロゲナーゼ（ＢＤＨ）（Ｅ１３）の増加した発現を有するように遺伝子操作された、請求項７に記載の細胞。
  9. ヒドロゲナーゼ成熟タンパク質および／または電子輸送複合タンパク質を発現する、請求項１から８のいずれか一項に記載の細胞。
  10. 野生型細胞に比べて、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４、Ｅ５、Ｅ６、Ｅ７、Ｅ８、Ｅ９、Ｅ１０、ヒドロゲナーゼ成熟タンパク質および／または電子輸送複合タンパク質からなる群より選択される少なくとも１種の酵素の増加した発現を有するように遺伝子操作された、請求項１から９のいずれか一項に記載の細胞。
  11. 前記高級アルコールは、ブタノールおよび／またはヘキサノールである、請求項１から１０のいずれか一項に記載の細胞。
  12. 高級アルコールを製造する方法であって、
    （ｂ）請求項１から１１のいずれか一項に記載の遺伝子組み換え微生物細胞を、炭素源Ａを含む培地に接触させる工程であって、該炭素源Ａは、エタノールおよび／または酢酸塩を含む工程を含む、方法。
  13. （ａ）酢酸生成細胞を、炭素源Ｂを含む培地と接触させることにより、前記炭素源Ａの前記エタノールおよび／または酢酸塩を産生させる工程であって、該炭素源Ｂは、ＣＯおよび／またはＣＯ２を含む工程をさらに含む、請求項１２に記載の方法。
  14. 前記高級アルコールは、１−ヘキサノール、２−ヘキサノール、３−ヘキサノール、１−ヘプタノール、２−ヘプタノール、３−ヘプタノール、４−ヘプタノール、オクタノール、ノナノール、デカノールからなる群より選択される、請求項１２または１３に記載の方法。
  15. 高級アルコールの製造のための、請求項１から１１のいずれか一項に記載の細胞の使用。
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